ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΣΘΕΝΩΝ ΝΟΣΗΛΕΥΟΜΕΝΩΝ ΣΤΟ Π.Γ.Ν.Θ. ΑΧΕΠΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΤΟΞΙΝΗ Α. ΤΟΥ Clostridium difficile

Transcript

1 ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΣΘΕΝΩΝ ΝΟΣΗΛΕΥΟΜΕΝΩΝ ΣΤΟ Π.Γ.Ν.Θ. ΑΧΕΠΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΤΟΞΙΝΗ Α ΤΟΥ Clostridium difficile ΠΑΠΑΓΕΩΡΓΙΟΥ Β.ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ Ειδικευόμενος Ιατρικής Βιοπαθολογίας/Μικροβιολογίας Διπλωματική εργασία Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ. «Ιατρική Ερευνητική Μεθοδολογία» Επιβλέπουσα: Καθηγήτρια Μικροβιολογίας Αλεξίου-Δανιήλ Στέλλα Θεσσαλονίκη, Οκτώβριος 2006

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ - ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΓΕΝΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ Μορφολογία Βιοχημικές ιδιότητες Καλλιεργητικοί χαρακτήρες Επιδημιολογία Clostridium difficile Περιγραφή Βιοχημικές Ιδιότητες Καλλιεργητικοί χαρακτήρες Παθογένεια Κλινική εικόνα Παράγοντες κινδύνου Επιδημιολογία (δεξαμενές, μετάδοση και επίπτωση λοίμωξης από C. difficile) Εργαστηριακή Διάγνωση Τυποποίηση Πρόληψη Θεραπεία...64

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 2 3. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΥΛΙΚΟ ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...103

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ - ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ 3 1. ΠΡΟΛΟΓΟΣ - ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Το Clostridium difficile εδώ και περίπου 30 χρόνια έχει αναγνωρισθεί ως το κύριο αίτιο του διαρροϊκού συνδρόμου που σχετίζεται με λήψη αντιβιοτικών. Η παθογόνος δράση του μικροοργανισμού οφείλεται κυρίως στην παραγωγή των τοξινών του, οι οποίες προκαλούν αύξηση της διαπερατότητας του εντέρου, με συνακόλουθη απώλεια υγρών και διάρροια. Το φάσμα των κλινικών εκδηλώσεων της λοίμωξης από C. difficile είναι ευρύ και οι πάσχοντες είναι δυνατόν να εμφανίσουν από ελαφρά διάρροια μέχρι απειλητική για τη ζωή ψευδομεμβρανώδη κολίτιδα. Η νόσος εμφανίζεται τόσο με τη μορφή σποραδικών κρουσμάτων όσο και με τη μορφή νοσοκομειακών επιδημιών. Ποσοστό μεγαλύτερο από 90% των λοιμώξεων από C. difficile εκδηλώνονται μετά ή κατά τη διάρκεια θεραπείας με αντιβιοτικά. Τα τελευταία μεταβάλλουν τη φυσιολογική χλωρίδα του εντέρου και επιτρέπουν στο κλωστηρίδιο, είτε ενδογενούς είτε εξωγενούς προέλευσης, να πολλαπλασιάζεται σε μεγάλους αριθμούς. Έχει βρεθεί ότι σχεδόν όλα τα αντιβιοτικά ευθύνονται για την πρόκληση λοίμωξης από C. difficile, όμως συχνότερα ενοχοποιούνται η αμπικιλλίνη, οι κεφαλοσπορίνες β γενιάς και η κλινδαμυκίνη, δηλαδή αντιβιοτικά με ευρύ φάσμα που χορηγούνται από το στόμα. Στην εμφάνιση της νόσου συμβάλλουν και προδιαθεσικοί παράγοντες από την πλευρά του ασθενούς, όπως ηλικία >65 ετών, σοβαρή υποκείμενη νόσος, χειρουργικές ή μη επεμβάσεις στο γαστρεντερικό σύστημα, μακρά διάρκεια νοσηλείας, νοσηλεία σε Μονάδα Εντατικής Θεραπείας κ.α.

5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ - ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ 4 Η σημασία του C. difficile, ως αιτιολογικού παράγοντα διαρροϊκού συνδρόμου, έχει εκτενώς μελετηθεί κυρίως σε νοσοκομειακούς ασθενείς, μεταξύ των οποίων μεταδίδεται σε υψηλά ποσοστά. Έχει βρεθεί ότι το C. difficile αποτελεί το μείζον μικροβιακό αίτιο ενδονοσοκομειακού διαρροϊκού συνδρόμου, στον αναπτυγμένο κόσμο. Απομονώνεται από ποσοστό 8-10% ασθενών με διάρροια, αρκετά συχνότερα δηλαδή από άλλα κοινά εντερικά παθογόνα όπως η Salmonella, η Shigella και το Campylobacter, και πρέπει να αναζητείται συστηματικά. Σχετικά με την κλινική επίπτωση της λοίμωξης από το C. difficile, αναφέρεται ότι αν και η θνητότητα είναι μάλλον μικρή, εντούτοις η διάρκεια νοσηλείας παρατείνεται κατά μέσο όρο για 8 ημέρες, και σε γηριατρικούς ασθενείς για 36 ημέρες. Αναφορικά δε στις οικονομικές επιπτώσεις, εκτιμάται ότι το επιπλέον κόστος μιας λοίμωξης από C. difficile αγγίζει τα Σκοπός της διπλωματικής αυτής εργασίας είναι ο προσδιορισμός της συχνότητας της λοίμωξης από C. difficile καθώς και η επιδημιολογική διερεύνησή της, σε ασθενείς με διαρροϊκό σύνδρομο, στο Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης ΑΧΕΠΑ. Η μελέτη περιλαμβάνει γενικό και ειδικό μέρος. Στο πρώτο αναπτύσσονται εισαγωγικά στοιχεία γενικά για τα κλωστηρίδια, τις βιοχημικές τους ιδιότητες και τους καλλιεργητικούς χαρακτήρες τους, καθώς και την επιδημιολογία τους. Ακολουθεί λεπτομερής περιγραφή του Clostridium difficile, των παθογενετικών χαρακτηριστικών του, των κλινικών εκδηλώσεων που προκαλεί, της επιδημιολογίας του και της διαγνωστικής του και θεραπευτικήςπροληπτικής του προσπέλασης. Ιδιαίτερη έμφαση δίνεται στα κεφάλαια της

6 ΠΡΟΛΟΓΟΣ - ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ 5 παθογένειας και κυρίως της εργαστηριακής διάγνωσης των λοιμώξεων από C. difficile. Στο ειδικό μέρος περιγράφεται λεπτομερώς ο σκοπός της μελέτης, παρατίθενται με ακρίβεια το υλικό, η εφαρμοζόμενη μεθοδολογία και τα αποτελέσματα της μελέτης και έπεται η συζήτηση και τα προκύπτοντα συμπεράσματα. Αισθάνομαι την ανάγκη να ευχαριστήσω ιδιαίτερα, για τη συμβολή τους στην εκπόνηση αυτής της εργασίας, τους παρακάτω: Την Καθηγήτρια Μικροβιολογίας και Διευθύντρια του Εργαστηρίου Μικροβιολογίας του Νοσοκομείου ΑΧΕΠΑ κ. Αλεξίου-Δανιήλ Στέλλα, επιβλέπουσα της διπλωματικής εργασίας, για τη σπουδαία βοήθεια και υποστήριξή της σε όλα τα στάδια της μελέτης. Με ενθάρρυνε στην επιλογή του θέματος και με παρότρυνε να μη διστάσω να ασχοληθώ με έναν μικροοργανισμό νέο για το εργαστήριό μας, όπως το Clostridium difficile. Μου επέτρεψε με αυτό τον τρόπο να υλοποιήσω την ιδιαίτερη, πλην όμως θεωρητική, αδυναμία που από καιρό είχα στην Αναερόβια Βακτηριολογία και ιδιαίτερα στα Κλωστηρίδια. Επιπλέον, μου έδειξε απεριόριστη εμπιστοσύνη κατά τη διάρκεια της πραγματοποίησης του πειραματικού σκέλους της μελέτης, το οποίο όμως ταυτόχρονα αποτέλεσε και μέρος της καθημερινής εργασίας του Εργαστηρίου Μικροβιολογίας του Νοσοκομείου ΑΧΕΠΑ, όπου εργάζομαι. Με καθοδήγησε προσεκτικά ως την ολοκλήρωση της μελέτης, η διαβεβαίωσή της δε ότι «όποιος ψάχνει, βρίσκει!» είναι πλέον και δική μου πεποίθηση. Τον Καθηγητή Παθολογίας-Λοιμωξιολογίας κ. Νικολαΐδη Παύλο και τον Καθηγητή Χειρουργικής και Διευθυντή της Α Προπαιδευτικής Χειρουργικής

7 ΠΡΟΛΟΓΟΣ - ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ 6 Κλινικής του Α.Π.Θ. κ. Χαρλαύτη Νικόλαο, για την τιμή που μου έκαναν να συμμετάσχουν στην τριμελή επιτροπή της διπλωματικής εργασίας και τις εύστοχες παρατηρήσεις τους. Ελπίζω τα συμπεράσματα αυτή της μελέτης να αποδειχθούν χρήσιμα στον καθημερινό τους αγώνα για τη βελτίωση της υγείας των συνανθρώπων μας. Τον Επίκουρο Καθηγητή Υγιεινής και Κοινωνικής Ιατρικής κ. Δαρδαβέση Θεόδωρο και την κ. Κοντοδήμου Αγγελική, για την πολύτιμη συμβολή τους στην παρασκευή ορισμένων από τα θρεπτικά υλικά που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη. Η βοήθεια που μου παρείχαν ήταν γνήσια και ειλικρινής. Την εταιρεία biomérieux, και ιδιαιτέρως τον κ. Καλαμπαλίκα Ιωάννη, για την ευγενική δωρεά αντιδραστηρίων απαραίτητων για την πραγματοποίηση του πειραματικού σταδίου της εργασίας. Επίσης, την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Υγιεινής κ. Αρβανιτίδου-Βαγιωνά Μαλαματένια, για τις χρήσιμες συμβουλές της στο σχεδιασμό της μελέτης και ειδικά του σκέλους της επιδημιολογικής διερεύνησης της λοίμωξης από το C. difficile. Η εμπειρία της με βοήθησε σημαντικά. Τη φίλη και συνάδερφο κ. Ορφανίδου Μαρία, Μικροβιολόγο, Επιμελήτρια Β του ΕΣΥ στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας του Γ.Ν.Α. Αθηνών «Γ. Γεννηματάς» καθώς και την άμισθη Επίκουρη Καθηγήτρια Μικροβιολογίας και Διευθύντρια του Εργαστηρίου Μικροβιολογίας του Γ.Ν.Α. Αθηνών «Γ. Γεννηματάς» κ. Μαλάμου-Λαδά Ελένη, για την ουσιαστική βοήθεια και τις γνώσεις που φιλότιμα μου παρείχαν από τα αρχικά στάδια της ενασχόλησής μου με το Clostridium difficile. Οι συμβουλές και η εμπειρία τους συνέβαλαν θεμελιωδώς στην αρτιότερη εμφάνιση της διπλωματικής μου εργασίας. Δεν θα ξεχάσω την ιδιαίτερα εποικοδομητική εβδομάδα που πέρασα στο Εργαστήριο

8 ΠΡΟΛΟΓΟΣ - ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ 7 Μικροβιολογίας του Γ.Ν.Α. Αθηνών «Γ. Γεννηματάς», και η οποία ενίσχυσε επιπλέον το κίνητρό μου να σχεδιάσω και να ολοκληρώσω αυτή τη μελέτη. Τις τεχνολόγους-βοηθούς εργαστηρίου κ. Βήτου Λεμονιά, Γεωργαντά Μαρία και Κρέτσαβου Μαρία, που ανήκουν στο προσωπικό του τμήματος Καλλιεργειών του Εργαστηρίου Μικροβιολογίας του Νοσοκομείου ΑΧΕΠΑ, για τη σημαντική συνδρομή τους στην παρασκευή των θρεπτικών υλικών, που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη. Η προθυμία και η διάθεσή τους να με βοηθήσουν υπήρξε καταλυτική. Την Μικροβιολόγο κ. Τσιακίρη Ελένη, Αναπληρώτρια Διευθύντρια του ΕΣΥ, και τους συναδέρφους ειδικευόμενους Ιατρούς του Εργαστηρίου Μικροβιολογίας του Νοσοκομείου ΑΧΕΠΑ, για τη βοήθειά τους στη συλλογή των εξεταστέων δειγμάτων κοπράνων καθώς και τις χρήσιμες συμβουλές και παρατηρήσεις τους στη φάση της συγγραφής των δοκιμίων της εργασίας. Τέλος και ιδιαιτέρως τη σύζυγό μου κ. Γανίτη Ειρήνη για την ηθική και ψυχολογική συμπαράσταση και κατανόηση, που έδειξε όλο το διάστημα της εκπόνησης και συγγραφής της διπλωματικής εργασίας, και τη βοήθειά της στη φάση συγγραφής των τελικών δοκιμίων, καθώς επίσης και τις κόρες μου για την έμπνευση και το κίνητρο που μου πρόσφεραν ώστε να περατώσω ακόμα μια δοκιμασία!

9 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ 8 2. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το γένος Clostridium περιλαμβάνει είδη αναερόβιων, σπορογόνων, Gram(+) βακτηρίων. Μερικά είδη είναι κατεξοχήν παθογόνα για τον άνθρωπο, πολλά είναι δυνητικά παθογόνα και αρκετά ακόμη είδη είναι σαπροφυτικά. Το γένος είναι από τα μεγαλύτερα και πλέον ετερογενή γένη βακτηρίων (γεγονός που επιβεβαιώθηκε και με μελέτες, στις οποίες εφαρμόστηκαν μοριακές μέθοδοι) και μπορεί να διαιρεθεί σε αρκετές φυλογενετικές ομάδες (clusters). Η αναλογία βάσεων G+C έχει πολύ μεγάλο εύρος (22-55 mol%) [Hatheway, 1990]. Χαρακτηριστικό των κλωστηριδίων είναι η ικανότητα παραγωγής ισχυρών εξοτοξινών. Αυτές ευθύνονται σε μεγάλο βαθμό για την εκδήλωση των συμπτωμάτων των λοιμώξεων, που προκαλούν τα κλωστηρίδια στον άνθρωπο [Voth and Ballard, 2005]. Οι κλωστηριδιακές λοιμώξεις διακρίνονται σε ενδογενείς (πηγή η χλωρίδα του ασθενούς) και σε εξωγενείς (πηγή το περιβάλλον). Ειδικά οι λοιμώξεις που προκαλούνται από το Clostridium difficile χαρακτηρίζονται ως μικτές (ενδο-εξωγενείς), επειδή το συγκεκριμένο είδος αφενός ανευρίσκεται στην εντερική χλωρίδα και αφετέρου μπορεί με τους σπόρους του να μεταδοθεί από ασθενή σε ασθενή, όπως έχει παρατηρηθεί κατά τη διάρκεια νοσοκομειακών επιδημιών διάρροιας ή ψευδομεμβρανώδους κολίτιδας [Kim et al, 1981].

10 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ Τα κλωστηρίδια υπάγονται ταξινομικά στο γένος Clostridium, το οποίο κατατάσσεται στην οικογένεια Clostridiaceae, της τάξης Clostridiales, των προκαρυωτικών μικροοργανισμών. Στο γένος έχουν προς το παρόν ταξινομηθεί 202 είδη και υποείδη [ τα οποία φαίνονται αναλυτικά στον πίνακα Γ1. Πίνακας Γ1. Είδη και υποείδη του γένους Clostridium. C. absonum C. cylindrosporum C. limosum C. sardiniense C. aceticum C. difficile C. litorale C. sardiniensis C. acetireducens C. diolis C. lituseburense C. sartagoforme C. acetobutylicum C. disporicum C. ljungdahlii C. sartagoformum C. acidisoli C. drakei C. lortetii C. scatologenes C. acidiurici C. durum C. lundense C. schirmacherense C. acidurici C. estertheticum C. magnum C. scindens C. aerotolerans C. estertheticum subsp. estertheticum C. malenominatum C. septicum C. akagii C. estertheticum subsp. Laramiense C. mangenotii C. sordellii C. aldrichii C. fallax C. mayombei C. sphenoides C. algidicarnis C. felsineum C. methoxybenzovorans C. spiroforme C. algidixylanolyticum C. fervidum C. methylpentosum C. sporogenes C. alkalicellulosi C. fervidus C. neopropionicum C. sporosphaeroides C. aminophilum C. fimetarium C. nexile C. stercorarium C. aminovalericum C. formicaceticum C. novyi C. stercorarium subsp. leptospartum C. amygdalinum C. formicoaceticum C. oceanicum C. stercorarium subsp. stercorarium C. arcticum C. frigidicarnis C. orbiscindens C. stercorarium subsp. hermolacticum C. argentinense C. frigoris C. oroticum C. sticklandii C. aurantibutyricum C. ganghwense C. oxalicum C. straminisolvens C. barati C. gasigenes C. papyrosolvens C. subterminale C. baratii C. ghoni C. paradoxum C. symbiosum C. barkeri C. ghonii C. paraperfringens C. termitidis C. bartlettii C. glycolicum C. paraputrificum C. tertium C. beijerinckii C. grantii C. pascui C. tetani C. bifermentans C. haemolyticum C. pasteurianum C. tetanomorphum C. bolteae C. halophilum C. peptidivorans C. thermaceticum C. botulinum C. hastiforme C. perenne C. thermautotrophicum C. bowmanii C. hathewayi C. perfringens C. thermoaceticum C. bryantii C. herbivorans C. pfennigii C. thermoalcaliphilum C. butyricum C. hiranonis C. phytofermentans C. thermoautotrophicum C. cadaveris C. histolyticum C. piliforme C. thermobutyricum C. caminithermale C. homopropionicum C. polysaccharolyticum C. thermocellum C. carboxidivorans C. hungatei C. populeti C. thermocopriae C. carnis C. hydroxybenzoicum C. propionicum C. thermohydrosulfuricum C. celatum C. hylemonae C. proteoclasticum C. thermolacticum C. celerecrescens C. indolis C. proteolyticum C. thermopalmarium C. cellobioparum C. innocuum C. psychrophilum C. thermopapyrolyticum C. cellulofermentans C. intestinale C. puniceum C. thermosaccharolyticum C. cellulolyticum C. intestinalis C. purinilyticum C. thermosuccinogenes C. cellulosi C. irregulare C. purinolyticum C. thermosulfurigenes C. cellulovorans C. irregularis C. putrefaciens C. thermosulfurogenes C. chartatabidum C. isatidis C. putrificum C. thiosulfatireducens C. chauvoei C. jejuense C. quercicolum C. tyrobutyricum C. clostridiiforme C. josui C. quinii C. uliginosum C. clostridioforme C. kluyveri C. ramosum C. ultunense C. coccoides C. lactatifermentans C. rectum C villosum C. cochlearium C. lacusfryxellense C. roseum C. vincentii C. cocleatum C. laramiense C. saccharobutylicum C. viride C. colicanis C. lentocellum C. saccharolyticum C. xylanolyticum C. colinum C. lentoputrescens C. accharoperbutylacetonicum C. xylanovorans C. collagenovorans C. leptum

11 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ 10 Ωστόσο, ο αριθμός των ειδών που ενοχοποιούνται για την πρόκληση λοιμώξεων στον άνθρωπο είναι σχετικά μικρός (πίνακας Γ2). Τα περισσότερα από τα κλωστηρίδια με ιατρικό ενδιαφέρον έχουν τοποθετηθεί στην ομάδα Ι του γένους Clostridium. Πίνακας Γ2. Είδη Clostridium που προκαλούν λοιμώξεις στον άνθρωπο. C. perfringens C. difficile C. clostridioforme C. innocuum C. ramosum C. butiricum C. cadaveris C. bifermentans C. sporogenes C. glycolicum C. septicum C. tetrium C. sordellii C. subterminale C. paraputrificum C. symbiosum C. baratii C. novyi

12 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΓΕΝΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ ΓΕΝΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ Μορφολογία Τα κλωστηρίδια είναι συνήθως μεγάλα βακτηρίδια, μήκους 3-8μm και πλάτους μm, που έχουν την ικανότητα να παράγουν σπόρους. Μορφολογικά λοιπόν διακρίνονται οι βλαστικές (ή φυτικές) μορφές και οι σπόροι αυτών. Η βλαστική μορφή στα περισσότερα κλωστηρίδια έχει σχήμα ευθέος ή κεκαμμένου βακτηριδίου, που ποικίλει από κοκκοβακτηρίδιο μέχρι μακρύ νηματοειδές. Τα βακτηρίδια έχουν παράλληλες πλευρές και τα άκρα τους μπορεί να λεπτύνονται βαθμιαία, να είναι αποστρογγυλεμένα ή ορθογώνια. Μερικά είναι τόσο πολύμορφα που η ταυτοποίησή τους με βάση τα μορφολογικά κριτήρια είναι σχεδόν αδύνατη. Η μορφολογία ενός στελέχους μπορεί να παραλλάσσει όχι μόνο στην ίδια καλλιέργεια αλλά και από καλλιέργεια σε καλλιέργεια. Εμφανίζονται μονήρη, σε ζεύγη ή σε αλυσίδες με ποικίλο μήκος. Σε μερικά είδη, όπως τα C. cocleatum και C. spiroforme, αρκετά βακτηρίδια συνδέονται σε συμπαγείς ελικοειδείς και σπειροειδείς σχηματισμούς [Cato et al, 1986]. Τα περισσότερα είδη χρωματίζονται θετικά κατά Gram, κατά τη διάρκεια του πρώιμου σταδίου ανάπτυξης. Ωστόσο, κάποια είδη (όπως τα C. ramosum και C. clostridiforme) σχεδόν πάντοτε εμφανίζονται ως Gram(-), μετά από 24ωρη επώαση. Μερικά είδη (συμπεριλαμβανομένου του C. tetani) εμφανίζονται ως Gram(-) όταν έχουν αναπτυχθεί οι σπόροι.

13 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΓΕΝΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ 12 Σχεδόν όλα τα είδη είναι κινητά, με τη βοήθεια περίτριχων βλεφαρίδων (flagella). Τα μη κινητά είδη που απομονώνονται από κλινικά δείγματα, είναι τα C. perfringens, C. ramosum και C. innocuum. Οι σπόροι των κλωστηριδίων έχουν σχήμα που ποικίλει από σφαιρικό έως ωοειδές και εμφανίζονται με τη μορφή διόγκωσης στο σώμα του βακτηριδίου. Οι σπόροι αναπτύσσονται σε διάφορες θέσεις του μικροβιακού κυττάρου, ανάλογα με το είδος. Μπορεί να είναι τελικοί (στο άκρο του βακτηριακού σώματος), υποτελικοί (σε μικρή απόσταση από το άκρο) ή κεντρικοί, δίνοντας διάφορα σχήματα στα κλωστηρίδια. Έτσι παρατηρούνται μορφές σχήματος τυμπάνου (C. tetani), λεμονιού (C. novyi, C. septicum) κλπ. Τα είδη C. perfringens και C. butiricum φέρουν έλυτρο [Λεγάκης και Χριστάκης, 1997, Onderdonk and Allen, 1995].

14 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΓΕΝΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ Βιοχημικές ιδιότητες Οι βιοχημικές ιδιότητες των κλωστηριδίων είναι ιδιαίτερα χρήσιμες στην ταυτοποίησή τους σε επίπεδο είδους. Αναφέρονται ακολούθως οι σπουδαιότερες από αυτές. Η δοκιμασία καταλάσης είναι σπάνια θετική (και σ αυτές τις περιπτώσεις είναι ασθενώς θετική). Ακόμη, επειδή τα κλωστηρίδια στερούνται συστήματος κυττοχρωμάτων, η δοκιμασία οξειδάσης είναι αρνητική. Μερικά κλωστηρίδια συνθέτουν δισμουτάση του υπεροξειδικού ανιόντος. Τα είδη Clostridium συνήθως είναι είτε ζυμωτικά (σακχαρολυτικά), όπως τα C. novyi, C. perfringens και C. septicum, είτε πρωτεολυτικά, όπως τα C. histolyticum και C. sporogenes. Ο διαχωρισμός όμως αυτός δεν είναι απόλυτος. Κάποια είδη εμφανίζουν και τα δύο χαρακτηριστικά. Έτσι, το πρωτεολυτικό C. sporogenes εμφανίζει μικρή σακχαρολυτική δραστηριότητα, ενώ το σακχαρολυτικό C. perfringens είναι και ελαφρώς πρωτεολυτικό. Τέλος, υπάρχουν είδη που είναι αζυμωτικά και μη πρωτεολυτικά. Αρκετά κλωστηρίδια παράγουν μια ποικιλία λιπαρών οξέων βραχείας αλύσου (π.χ. οξεικό και βουτυρικό), όταν αναπτύσσονται σε θρεπτικό υλικό που περιέχει πεπτόνες, εκχύλισμα ζύμης και γλυκόζη. Παράγουν επίσης αρκετά άλλα προϊόντα ζύμωσης, όπως ακετόνη, βουτανόλη και άλλες αλκοόλες [Λεγάκης και Χριστάκης, 1997, Onderdonk and Allen, 1995]. Στους πίνακες Γ3 και Γ4 φαίνονται μερικές χαρακτηριστικές ιδιότητες καθώς και οι κυριότερες βιοχημικές αντιδράσεις αντίστοιχα, ειδών κλωστηριδίων που εμφανίζουν ιατρικό ενδιαφέρον.

15 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΓΕΝΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ Καλλιεργητικοί χαρακτήρες Παρά το γεγονός ότι η πλειονότητα των κλωστηριδίων είναι υποχρεωτικά αναερόβια βακτήρια, υπάρχει σημαντική διαφοροποίηση από είδος σε είδος σχετικά με την ικανότητά τους να αναπτύσσονται παρουσία οξυγόνου. Κάποια είδη, όπως τα C. haemolyticum και C. novyi τύπου Β είναι αυστηρά αναερόβια και αδυνατούν να αναπτυχθούν ακόμη και παρουσία ελάχιστου οξυγόνου (>0.05%). Άλλα είδη αντιθέτως είναι ανθεκτικά στον αέρα (C. tetrium, C. carnis, C. histolyticum και ορισμένα στελέχη του C. perfringens) και παρουσιάζουν περιορισμένη ανάπτυξη σε στερεά θρεπτικά υλικά, μετά από επώαση σε ατμόσφαιρα 5-10% CO 2. Βασικό θρεπτικό υλικό για την καλλιέργεια των κλωστηριδίων είναι το αναερόβιο αιματούχο άγαρ (ΑΑΑ), ενώ αναλόγως του είδους αναπτύσσονται και σε εκλεκτικά υγρά ή στερεά θρεπτικά υλικά. Ειδικότερα, για την απομόνωση του C. difficile χρησιμοποιούνται τα εκλεκτικά υλικά CCFA (cycloserin cefoxitin fructose agar) και CCEY (cycloserin cefoxitin egg yolk agar). Στο ΑΑΑ, μετά από επώαση ωρών, τα κλωστηρίδια εμφανίζουν αποικίες συνήθως κυκλικές, με ομαλά, ακανόνιστα ή ριζοειδή χείλη, αδιαφανείς ή διαφανείς και με διάμετρο που ποικίλει (2-8 mm, ανάλογα με το είδος). Το χρώμα των αποικιών επίσης κυμαίνεται από άσπρο-γκρι μέχρι γκριζοκίτρινο. Τα C. novyi τύπου Α και Β, C. tetani και C. septicum εμφανίζουν ερπυσμό στο υλικό. Σε ότι αφορά τη δημιουργία αιμόλυσης, τα C. sordellii, C. innocuum και C. novyi τύπου D εμφανίζουν β-αιμόλυση, ενώ το C. sporogenes ψευδή αιμόλυση. Το C. tetani εμφανίζει α-αιμόλυση, η οποία με την πάροδο του χρόνου μετατρέπεται σε β-αιμόλυση, λόγω παραγωγής οξυγονοευαίσθητης αιμολυσίνης (τετανοσπασμίνη). Το C. novyi τύπου Α και Β

16 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΓΕΝΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ 15 δίνει αιμόλυση που επιτείνεται όταν τα τρυβλία τοποθετηθούν στο ψυγείο, καθώς οι υπεύθυνες για τη δημιουργία αιμόλυσης β, γ και δ τοξίνες είναι ψυχρολυσίνες. Τέλος, το C. perfringens παράγει γύρω από τις αποικίες μια εσωτερική ζώνη πλήρους αιμόλυσης (θ τοξίνη) και μια εξωτερική ζώνη ατελούς αιμόλυσης (α τοξίνη). Η ιδανική θερμοκρασία ανάπτυξης των κλωστηριδίων είναι 37 ο C και κατάλληλο ph είναι το Κάτω από υπεριώδη ακτινοβολία μεγάλου μήκους κύματος οι αποικίες του C. difficile στο CCEY άγαρ εκπέμπουν κιτρινοπράσινο φθορισμό. Παρομοίου χρώματος φθορισμό παράγουν και τα είδη C. innocuum, C. novyi τύπου A, C. cadaveris και C. scatologenes [Λεγάκης και Χριστάκης, 1997, Onderdonk and Allen, 1995].

17 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΓΕΝΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ 16 Πίνακας Γ3. Χαρακτηριστικές ιδιότητες των κλινικά σημαντικών κλωστηριδίων [Λεγάκης και Χριστάκης, 1997]. Είδος Μορφολογία Διάταξη Σπόροι 1 Κινητικότητα 2 Φθορισμός Αιμόλυση 3 Λεκιθινάση 4 Λιπάση 4 C. perfringens 4-8 μm, έλυτρο, ενίοτε Gram(-), ανώμαλες μορφές μονήρες, σωροί, παράλληλη διάταξη Ω, Υ (-) (-) β/α (+) (-) C. botulinum 4-6 μm, ποικιλομορφία στη χρώση Gram μονήρες, σωροί Ω, Υ/Τα (+) (-) β (-) (+) C. tetani 4-6 μm, Gram(-) σε παλιές καλλιέργειες, πλήκτρο τυμπάνου μονήρες Σ, T (+) (-) β (-) (-) C. difficile 6-8 μm, Gram(-) σε παλιές καλλιέργειες μονήρες Ω, Υ (+) (+) (-) (-) (-) C. ramosum 2-5 μm, συχνά Gram(-) ζεύγη, αλύσεις, σχηματισμοί V ή Y μορφής Σ/Ω, T (-) (-) (-) (-) (-) C. sporogenes 3-6 μm, Gram(-) σε παλιές καλλιέργειες, νηματοειδείς μορφές μονήρες, ζεύγη, ομάδες Ω, Υ (+) (-) (-) (-) (+) C. cadaveris μm, λεπτό βακτηρίδιο μονήρες Ω, T (+) (+) (-) (-) (-)

18 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΓΕΝΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ 17 Είδος Μορφολογία Διάταξη Σπόροι 1 Κινητικότητα 2 Φθορισμός Αιμόλυση 3 Λεκιθινάση 4 Λιπάση 4 C. novyi A μm, Gram(-) σε παλιές καλλιέργειες, νηματοειδείς μορφές μονήρες, ζεύγη, αλύσεις Ω, Υ (+) (+) β (+) (+) C. novyi B μm, Gram(-) σε παλιές καλλιέργειες, νηματοειδείς μορφές μονήρες, ζεύγη, αλύσεις Ω, Υ (+) (-) β (+) (-) C. septicum 2-6 μm, Gram(-) σε παλιές καλλιέργειες, μορφές ατρακτοειδείς/νηματοειδείς μονήρες, ζεύγη, αλύσεις Ω, Υ (+) (-) β (-) (-) C. sordellii μm μονήρες Ω, Υ/Κ (+) (-) (-)/β (+) (-) C. innocuum 2-6 μm, συχνά Gram(-) μονήρες Ω, T (-) (+) (-)/β (-) (-) C. butyricum 3-4 μm, έλυτρο μονήρες, ζεύγη το ένα μετά το άλλο Ω, Υ (+) (-) (-) (-) (-) Υπόμνημα 1. Ω: ωοειδής, Υ: υποτελικός, Τ: τελικός, Σ: σφαιρικός, Κ: κεντρικός 2. (-): ακίνητο, (+): κινητό 3. (-): απουσία αιμόλυσης, α: α-αιμόλυση, β: β-αιμόλυση 4. (-): αρνητική αντίδραση, (+): θετική αντίδραση

19 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΓΕΝΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ 18 Πίνακας Γ4. Οι κυριότερες βιοχημικές αντιδράσεις των κλινικά σημαντικών κλωστηριδίων [Λεγάκης και Χριστάκης, 1997]. Είδος Ζύμωση σακχάρων Γλυκόζη Μανιτόλη Λακτόζη Σουκρόζη Μαλτόζη Σαλικίνη Αναγωγή νιτρικών Παραγωγή ινδόλης Υδρόλυση εσκουλίνης Υδρόλυση ζελατίνης Πέψη γάλακτος C. perfringens (+) (-) (+) (+) (+) (+) Π (-) Π (+) (+) C. botulinum (+) (-) (-) Π Π (-) (-) (-) Π (+) Π C. tetani (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (-) (+) (-) C. difficile (+) (+) (-) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (+) (-) C. ramosum (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (-) (+) (-) (-) C. sporogenes (+) (-) (-) (-) (+) Π (-) (-) (+) (+) (+) C. cadaveris (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (-) (+) (+) C. novyi A (+) (-) (-) (-) Π (-) (-) (-) (-) (+) (-) C. novyi B (+) (-) (-) (-) Π (-) (-) (-) (-) (+) (+) C. septicum (+) (-) (+) (-) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) C. sordellii (+) (-) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (+) (+) C. innocuum (+) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) C. butyricum (+) (-) (+) (+) (+) (+) Π (-) (+) (-) (-) Υπόμνημα (-): αρνητική αντίδραση, (+): θετική αντίδραση, Π: ποικίλη αντίδραση

20 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΓΕΝΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ Επιδημιολογία Αν και τα είδη των κλωστηριδίων βρίσκονται παντού στη φύση, οι κύριες δεξαμενές τους είναι το έδαφος και ο πεπτικός σωλήνας αρκετών ζώων και του ανθρώπου [Smith and Williams, 1984]. Τα είδη που συχνότερα απομονώνονται από το έδαφος είναι τα C. subterminale, C. sordellii, C. sporogenes, C. indolis, C. bifermentans, C. mangenotii και C. perfringens [Smith, 1975]. Άλλα κλωστηρίδια, που έχουν επίσης βρεθεί σε δείγματα εδάφους αν και σπανιότερα, είναι τα C. botulinum και C. tetani [Smith, 1978]. Ειδικά στην περίπτωση του C. perfringens, η εκτεταμένη του διασπορά στο έδαφος συνεπάγεται τη συχνή του παρουσία σε επιφάνειες και αντικείμενα που εκτίθενται στη σκόνη, συμπεριλαμβανομένων των τροφίμων [Smith and Williams, 1984]. Η ημερήσια λήψη πάντως από τον άνθρωπο του C. perfringens με την τροφή είναι μικρή και δεν ξεπερνά τα 500 βακτήρια [Smith and Williams, 1984]. Κλωστηρίδια απομονώνονται συχνά από τα κόπρανα νεογνών, κατά τη διάρκεια της πρώτης εβδομάδας της ζωής τους, ιδιαίτερα σε όσα δεν θηλάζουν και τρέφονται με τεχνητό γάλα. Κόπρανα βρεφών ηλικίας 6-20 μηνών περιέχουν σχεδόν το ίδιο μικροβιακό φορτίο C. perfringens με τους ενηλίκους ( CFU/gr) [Stark and Lee, 1982]. Επίσης, το C. difficile ανευρίσκεται συχνότατα στα κόπρανα βρεφών, αν και απομονώνεται σπάνια από ασυμπτωματικούς ενήλικες σε συχνότητα που δεν ξεπερνά το 3-4% [George and Finegold, 1985]. Αρκετά ακόμη είδη κλωστηριδίων, όπως τα C. innocuum, C. ramosum, C. paraputrificum, C. sporogenes, C. tetrium, C. bifermentans και C. butyricum, εδράζονται στο κατώτερο τμήμα του εντερικού

21 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΓΕΝΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ 20 σωλήνα του ανθρώπου, αποτελούντα μέλη της φυσιολογικής του χλωρίδας. Με λίγες εξαιρέσεις, τα περισσότερα είδη αποτελούν σαπρόφυτα. Η γεωγραφική κατανομή των κλωστηριδίων ποικίλει. Κάποια εμφανίζονται σε όλα τα μέρη του κόσμου (C. tetani) [Hatheway, 1990], ενώ άλλα σε ορισμένες μόνο γεωγραφικές περιοχές (C. argentinense) [Suen et al, 1988]. Η οικολογική κατανομή τους σχετίζεται με διάφορες παραμέτρους, όπως ο αντιγονικός τύπος του κλωστηριδίου, η ηλικία του ξενιστή και το περιβάλλον. Το C. perfringens τύπου A είναι διαδεδομένο στο περιβάλλον και τον εντερικό σωλήνα ανθρώπου και ζώων [Λεγάκης και Χριστάκης, 1997] ενώ στελέχη C. perfringens τύπων B, C, D και E είναι υποχρεωτικά παράσιτα οικιακών ζώων, και μόνο περιστασιακά του ανθρώπου. Σπόροι του C. tetani έχουν βρεθεί σε αίθουσες χειρουργείων, διαδρόμους χειρουργικών κλινικών και χειρουργικά ράμματα [Λεγάκης και Χριστάκης, 1997, Lowbury and Lilly, 1958]. Το C. difficile αναφέρθηκε ότι αποικίζει σε μεγάλο ποσοστό τον εντερικό σωλήνα των βρεφών [Allen and Baron, 1991] και των ενδονοσοκομειακών ασθενών (20-46%) [Varki and Aquino, 1982, George et al, 1982]. Η ευρεία οικολογική διασπορά των κλωστηριδίων έχει ως συνέπεια να μολύνονται τραύματα και τρόφιμα και να προκαλούνται σοβαρές νόσοι είτε από τους ίδιους τους μικροοργανισμούς είτε από τις τοξίνες που παράγουν. Νοσήματα προκαλούμενα από κλωστηρίδια εξωγενούς προέλευσης (αλλαντίαση, τέτανος, γάγγραινα κλπ.) είναι μεγάλης κλινικής σημασίας και είναι γνωστά από τους ιστορικούς χρόνους. Επίσης, έχουν καταγραφεί επιδημίες ενδονοσοκομειακής διάρροιας από στελέχη C. dificille [Kato et al, 2001, Samore, 1999]. Εντούτοις, είναι συχνότερες οι ενδογενείς λοιμώξεις, στις οποίες εμπλέκονται είδη κλωστηριδίων της φυσιολογικής χλωρίδας του

22 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΓΕΝΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ 21 ξενιστή. Όπως και στην περίπτωση άλλων ενδογενών αναερόβιων λοιμώξεων (ενδοκαρδίτιδα, εγκεφαλικό απόστημα, πνευμονία από εισρόφηση, ενδοκοιλιακό απόστημα), οι κλωστηριδιακές λοιμώξεις αναπτύσσονται κάτω από ειδικές συνθήκες. Στους συνήθεις προδιαθεσικούς παράγοντες περιλαμβάνονται τραυματισμοί, χειρουργικές επεμβάσεις, αγγειακή στάση, αποφράξεις, θεραπεία με ανοσοκατασταλτικά ή χημειοθεραπευτικά, θεραπεία με αντιβιοτικά και παρουσία υποκείμενης νόσου (νεοπλασίας, σακχαρώδους διαβήτη κλπ.) [Lorber, 2000]. Υπό συγκεκριμένες προϋποθέσεις, τα κλωστηρίδια μπορούν να διεισδύσουν και να πολλαπλασιαστούν σχεδόν σε οποιονδήποτε ιστό.

23 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile Clostridium difficile Περιγραφή Το 1935 οι Hall και O Toole αναγνώρισαν ένα μέχρι τότε άγνωστο αναερόβιο βακτηρίδιο σε κόπρανα νεογνών, στο οποίο έδωσαν το όνομα Bacillus difficilis [Hall and O Toole, 1935]. Σχεδόν 4 δεκαετίες αργότερα, μετά την αυξανόμενη εμφάνιση μιας σχετικά σπάνιας αλλά επικίνδυνης νόσου που είχε συσχετιστεί με τη λήψη αντιβιοτικών, της ψευδομεμβρανώδους κολίτιδας (Pseudomembranous Colitis, PMC), οι Bartlett και συν. αναγνώρισαν ως αιτιολογικό παράγοντα το Clostridium difficile [Bartlett et al, 1978]. Από τότε έχουν δημοσιευθεί εκατοντάδες μελέτες και μονογραφίες σχετικές με το μικροοργανισμό αυτό, που δεν είναι τόσο «δύσκολος» στην ανίχνευση και την απομόνωσή του όσο υποδηλώνει το όνομά του. Το Clostridium difficile έχει τους γενικούς χαρακτήρες του γένους των κλωστηριδίων, είναι δηλαδή ένα αναερόβιο, Gram(+), σπορογόνο βακτηρίδιο. Είναι κινητό με τη βοήθεια βλεφαρίδων και έχει διαστάσεις περίπου 1.5 μm πλάτος και 3-16 μm μήκος. Ο σπόρος του είναι ωοειδής, υποτελικός και δεν αναπτύσσεται στις πρωτοκαλλιέργειες, αλλά μόνο σε δυσμενείς καλλιεργητικές συνθήκες.

24 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile Βιοχημικές Ιδιότητες Το σύνολο σχεδόν των στελεχών Clostridium difficile διασπά τη γλυκόζη και αρκετά στελέχη (>80%) και τη μανιτόλη με παραγωγή άφθονου αερίου. Κανένα C. difficile δεν παράγει ινδόλη, πολλά στελέχη προκαλούν υδρόλυση της ζελατίνης και αρκετά παράγουν H 2 S διασπώντας την εσκουλίνη. Δεν διασπά τα λίπη και τη λεκιθίνη (δεν παράγει δηλαδή λιπάση και λεκιθινάση) [Λεγάκης και Χριστάκης, 1997, Onderdonk and Allen, 1995]. Από το μεταβολισμό του παράγεται μίγμα διαφόρων λιπαρών οξέων βραχείας αλύσου, η σύσταση του οποίου είναι μοναδική σε επίπεδο είδους και επομένως διαγνωστική εφόσον αναλυθεί με αέρια-υγρή χρωματογραφία [Johnson et al, 1989].

25 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile Καλλιεργητικοί χαρακτήρες Για την απομόνωση του C. difficile από τα κόπρανα χρησιμοποιήθηκε τα τελευταία χρόνια το εκλεκτικό θρεπτικό υλικό CCFA (cycloserin cefoxitin fructose agar), συνήθως εμπλουτισμένο με αίμα αλόγου ή κρόκο αυγού [George et al, 1979]. Από τη Βρετανική Μονάδα Αναφοράς Αναεροβίων Μικροβίων, προτείνεται η χρήση του υλικού CCEY άγαρ (cycloserin cefoxitin egg yolk agar), που φαίνεται ότι παρουσιάζει ορισμένα πλεονεκτήματα σε σχέση με το CCFA [Brazier, 1993]. Στο συγκεκριμένο υλικό, το C. difficile σχηματίζει μετά από ώρες αναερόβιας επώασης γκρι, αδιαφανείς, μη αιμολυτικές αποικίες. Λίγα στελέχη μπορούν να εμφανίσουν α-αιμόλυση, που εκδηλώνεται ως πρασίνισμα του υλικού. Μετά από ώρες επώασης, το κέντρο των αποικιών μπορεί να πάρει ανοικτότερο χρώμα (ανοικτό γκρι ή άσπρο), γεγονός που σχετίζεται με τη σπορογονία του μικροβίου. Η κατεργασία του δείγματος κοπράνων, πριν την καλλιέργεια, με αλκοόλη (alcohol shock ή treatment) καθώς και ο εμβολιασμός του κατεργασμένου δείγματος, εκτός από το CCEY, σε ζωμό cooked meat εμπλουτισμένο με κυκλοσερίνη, κεφοξιτίνη και ταυροχολικό νάτριο ή σάκχαρα, αυξάνει τη συχνότητα απομόνωσης του C. difficile. Η διαδικασία αυτή είναι απαραίτητη, ειδικά όταν δεν ανιχνεύονται οι κλωστηριδιακές τοξίνες στα κόπρανα και οι βλαστικές μορφές του μικροβίου έχουν καταστραφεί, όπως συνήθως συμβαίνει μετά από χορήγηση αντιβιοτικών [Buchanan, 1984, Brazier, 1993]

26 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile Παθογένεια Το Clostridium difficile είναι ένας συνήθης απομονούμενος μικροοργανισμός από δείγματα κοπράνων ατόμων οποιασδήποτε ηλικίας. Συχνά, ιδιαίτερα στα νεογνά, η παρουσία του δεν προκαλεί νόσηση (ασυμπτωματική φορεία). Αντίθετα, σε μεγαλύτερης ηλικίας άτομα κατά κανόνα σχετίζεται με κλινική νόσο, τη διάρροια από Clostridium difficile, πάθηση με ευρύ φάσμα που ποικίλει από ήπιο και αυτοπεριοριζόμενο διαρροϊκό σύνδρομο μέχρι νόσο απειλητική για τη ζωή. Μετά την έκθεση του εντερικού βλεννογόνου στα αντιβιοτικά, που αποτελούν τον προεξάρχοντα παράγοντα κινδύνου, η εντερική μικροβιακή χλωρίδα καταστρέφεται και η αντίσταση αποικισμού διαταράσσεται. Το έντερο συνεπώς γίνεται ευάλωτο στον αποικισμό του από το C. difficile [Bartlett, 1992]. Στις περισσότερες περιπτώσεις ο μικροοργανισμός προέρχεται από κάποια εξωτερική πηγή (εξωγενής μόλυνση), που μπορεί να είναι ένα άλλο πάσχον άτομο, το μολυσμένο ιατρικό και νοσηλευτικό προσωπικό ή και απευθείας το μολυσμένο περιβάλλον. Μετά την πρόσληψή του, το C. difficile διαφεύγει της ανοσιακής απάντησης του ξενιστή, πολλαπλασιάζεται στο έντερο, παράγει τις τοξίνες του και εκδηλώνει την παθογόνο δράση του [Borriello, 1998, Farrell and LaMont, 2000]. Ο κύριος λοιμογόνος παράγοντας του C. difficile είναι οι τοξίνες που παράγει και οι οποίες διαδραματίζουν καίριο ρόλο στην ανάπτυξη της παθογόνου δράσης του. Καλύτερα μελετημένες είναι οι τοξίνες Α και Β, οι οποίες αναφέρονται και ως εντεροτοξίνη και κυτταροτοξίνη, αντίστοιχα. Η ονομασία τους προέκυψε από την παθογόνο επίδραση που παρατηρήθηκε πως είχαν, δηλαδή συσσώρευση υγρών σε πειραματικά μοντέλα εντέρου η

27 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 26 πρώτη και κυτταροπαθογόνο δράση σε καλλιέργειες κυττάρων η δεύτερη. Οι αρχικές αυτές έρευνες είχαν πραγματοποιηθεί πριν γίνει καλά κατανοητός ο μηχανισμός δράσης των τοξινών σε μοριακό επίπεδο. Ωστόσο, σήμερα είναι γνωστό ότι και οι δυο τοξίνες συνεισφέρουν από κοινού στην παθογένεια της νόσου [Voth and Ballard, 2005]. Η πλειονότητα των τοξινογόνων στελεχών C. difficile παράγουν τόσο Α όσο και Β τοξίνη. Σε γενικές γραμμές, ο τρόπος δράσης τους είναι παραπλήσιος: ενδοκυτταρώνονται από τα κύτταρα του εντερικού επιθηλίου και παραβλάπτουν τον κυτταροσκελετό ακτίνης [Thelestam and Chaves-Olarte, 2000]. Τα προσβεβλημένα κύτταρα εμφανίζουν ελάττωση των κυτταρικών λειτουργιών και αποστρογγυλοποιούνται, γεγονός που οφείλεται σε αποσύνθεση των ινιδίων της F-ακτίνης και την αύξηση των ινιδίων της G-ακτίνης [Dillon et al, 1995]. Για την αλλαγή του σχήματος των κυττάρων αρκεί η παρουσία πολύ λίγων μορίων των τοξινών. Μια δεύτερη επίδραση των τοξινών Α και Β, είναι η αποσταθεροποίηση των σφικτών συνδέσεων (tight junctions). Τα παραπάνω οδηγούν στο θάνατο των κυττάρων και την κατάργηση του εντερικού φραγμού, με συνέπεια την αύξηση της διαπερατότητας του βλεννογόνου και τις υδαρείς διάρροιες, οι οποίες αποτελούν τυπικό χαρακτηριστικό της νόσου από C. difficile. Στη φλεγμονώδη απάντηση και στο σχηματισμό των ψευδομεμβρανών συνεισφέρουν η παραγωγή TNFa και προφλεγμονωδών κυτταροκινών, που επάγεται από τις τοξίνες [Souza et al, 1997, Linevsky et al, 1997]. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τις τοξίνες Α και Β καλούνται cdta ή toxa και cdtb ή toxb, αντίστοιχα, και εδράζονται σε μια νησίδα παθογονικότητας (pathogenicity locus, PaLoc) του γονιδιώματος του C. difficile, μεγέθους

28 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 27 περίπου 19kb. Στην ίδια περιοχή βρίσκονται και τα γονίδια tcdc, tcdd και tcde [Moncrief and Wilkins, 2000]. Η λειτουργία του πρώτου σχετίζεται με μειορύθμιση (down regulation) της παραγωγής των τοξινών Α και Β [Voth and Ballard, 2005], ενώ των άλλων δυο παραμένει προς το παρόν άγνωστη [Rupnik, 2000]. Τα προϊόντα μεταγραφής και μετάφρασης της PaLoc είναι πεπτίδια μεγάλου μεγέθους (308 kda για την τοξίνη Α και 270 kda για την τοξίνη Β), που αποτελούνται από μια μόνο πολυπεπτιδική άλυσο, με ομοιότητα περίπου 50% σε επίπεδο αμινοξέων και παρόμοια πρωτοταγή (primary) δομή [Aktories and Just, 1995]. Στην εικόνα Γ1 φαίνεται το τμήμα της νησίδας παθογονικότητας του C. difficile, στο οποίο βρίσκονται τα γονίδια των τοξινών Α και Β. 2001]. ΕΙΚΟΝΑ Γ1. Η νησίδα παθογονικότητας του C. difficile [Poxton et al, Οι δυο τοξίνες διαθέτουν τρεις δραστικές περιοχές (εικόνα Γ2). Οι Hoffman και συν. ανακάλυψαν ότι και στις δυο τοξίνες η ενζυμική και η κυτταροτοξική δραστηριότητα οφείλεται στη διαμόρφωση του αμινοτελικού άκρου (Ν-άκρου) [Hofmann et al, 1997]. Στο ενδιάμεσο τμήμα των μορίων βρίσκεται μια διαμεμβρανική περιοχή, για την οποία υπάρχουν ενδείξεις ότι σχετίζεται με τις

29 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 28 διεργασίες ενδοκυττάρωσης των τοξινών [Just et al, 2000]. Το καρβοξυτελικό άκρο (C-άκρο) των τοξινών αποτελεί το σημείο σύνδεσης με τους υποδοχείς των επιθηλιακών κυττάρων και συντίθεται από επαναλαμβανόμενες πεπτιδικές ακολουθίες. 2001]. ΕΙΚΟΝΑ Γ2. Η δομή των τοξινών Α και Β του C. difficile [Poxton et al, Σχετικά πρόσφατα έχει περιγραφεί μια ακόμη τοξίνη, η διμερής (bipartite) ή δυαδική (binary) ADP-ριβοσυλική (ADP-ribosylating) τοξίνη [Perelle et al, 1997]. Ανήκει στην οικογένεια των δυαδικών τοξινών που παράγονται και από άλλα είδη του γένους Clostridium, όπως τα C. perfringens (τοξίνη iota), C. spiroforme και C. botulinum (τοξίνη C2). Αποτελείται από δυο ανεξάρτητες πεπτιδικές αλύσους με διαφορετική λειτουργία. Η πρώτη είναι η CDTb άλυσος που συνδέεται με ειδικούς υποδοχείς στην επιφάνεια των κυττάρων του ξενιστή και βοηθά στην ενδοκύττωση της δεύτερης αλύσου, της CDTa. Αυτή

30 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 29 επιτελεί ενζυματική δράση, καταλύοντας την ADP-ριβοσυλίωση της ακτίνης και αποδιοργανώνοντας με αυτό τον τρόπο τον κυτταρικό σκελετό. Όπως όλες οι δυαδικές τοξίνες, έτσι και αυτή του C. difficile εμπλέκεται παθογενετικά στην εκδήλωση της κλινικής συμπτωματολογίας, ιδιαίτερα σε στελέχη τα οποία δεν παράγουν τις τοξίνες Α και Β [Rupnik, 2001, Gonçalves et al, 2004]. Ο ρόλος των άλλων λοιμογόνων παραγόντων του C. difficile είναι περισσότερο θεωρητικός. Οι προσκολλητίνες (adhesins), ο ρόλος των οποίων είναι γνωστός στην παθογένεια άλλων βακτηρίων, έχουν ενοχοποιηθεί, ωστόσο η ακριβής τους ταυτότητα και η παρουσία τους στο έντερο δεν έχουν ακόμη επιβεβαιωθεί. Το C. difficile παράγει αρκετά εξωκυττάρια ένζυμα, των οποίων η συμβολή στην παθογένεια της νόσου είναι ασαφής, αν και βρέθηκε να έχουν in vitro δράση. Ενδέχεται αυτά τα ένζυμα να παίζουν κάποιο ρόλο σε φυσιολογικές συνθήκες και να σχετίζονται με την επιβίωση του κλωστηριδίου, όμως ίσως ευνοούν την αύξησή του όταν η φυσιολογική μικροβιακή χλωρίδα διαταράσσεται, μετά τη χορήγηση αντιβιοτικών [Borriello, 1998]. Τέλος, το C. difficile έχει την ιδιαιτερότητα να διαθέτει ένα εξωτερικό κυτταρικό περίβλημα, που καλείται S-μεμβράνη (S-layer) και αποτελείται από δυο πολυπεπτίδια. Αυτά συνδέονται και σχηματίζουν ένα συμπαγές, κρυσταλλικό κάλυμμα, γύρω από ολόκληρη την επιφάνεια του μικροβίου. Η S- μεμβράνη, αποτελεί πιθανόν έναν ακόμη λοιμογόνο παράγοντα [McCoubrey and Poxton, 2001].

31 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile Κλινική εικόνα Το C. difficile αποτελεί τον αιτιολογικό παράγοντα της νοσολογικής οντότητας, που είναι γνωστή ως κολίτιδα από Clostridium difficile (Clostridium difficile associated diarrhea, CDAD), και που ποικίλει από ελαφράς μορφής αυτοπεριοριζόμενο διαρροϊκό σύνδρομο μέχρι σοβαρή νόσο με δυνητικά απειλητικές για τη ζωή επιπλοκές [Kelly et al, 1994]. Ο κλινικός ορισμός της CDAD περιλαμβάνει: παρουσία διάρροιας (τουλάχιστον 5 υγρών ή ασχημάτιστων κενώσεων τις τελευταίες 36 ώρες), λήψη αντιμικροβιακών φαρμάκων τις τελευταίες 8 εβδομάδες, ανίχνευση των τοξινών του C. difficile, κλινική ύφεση μετά από την ενδεικνυόμενη θεραπεία και αποκλεισμό άλλων αιτίων διάρροιας. Το φάσμα των κλινικών εκδηλώσεων της νόσου ποικίλει από ήπια διάρροια μέχρι απειλητική για τη ζωή ψευδομεμβρανώδη κολίτιδα με τοξικό μεγάκολο [Hurley and Nguyen, 2002]. Η σοβαρότητα της νόσου εξαρτάται από παράγοντες του ξενιστή (ηλικία, ανοσολογικό status) και παράγοντες του C. difficile (ποσότητα ενοφθαλμίσματος, παθογονικότητα στελέχους). Η συνήθης συμπτωματολογία ασθενών με CDAD περιλαμβάνει: κοιλιακή δυσφορία (malaise), κοιλιακές συσπάσεις ή πόνο, ναυτία, έμετο, υδαρείς διαρροϊκές κενώσεις και πυρετό. Κατά τον εργαστηριακό έλεγχο συχνά ανευρίσκεται λευκοκυττάρωση, η οποία μπορεί να είναι εκσεσημασμένη [Bartlett, 2000, Bulusu et al, 2000, Wanahita et al, 2002]. Μάλιστα, αναφέρεται ότι το C. difficile αποτελεί ένα από τα συχνότερα αίτια λευκοκυττάρωσης αγνώστου προέλευσης, σε νοσοκομειακούς ασθενείς [Wanahita et al, 2002]. Άλλα εργαστηριακά ευρήματα περιλαμβάνουν υπολευκωματιναιμία και παρουσία λευκοκυττάρων στα κόπρανα [Manabe et al, 1995]. Η ενδοσκοπική

32 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 31 εξέταση του εντέρου συνήθως αποκαλύπτει διάχυτο ή κατά τόπους ερύθημα [Kelly and LaMont, 1998]. Η ψευδομεμβρανώδης κολίτιδα εξελίσσεται στο 25% των σοβαρότερων περιπτώσεων λοίμωξης από C. difficile και χαρακτηρίζεται από την παρουσία λευκοκίτρινων πλακών μεγέθους 2-10 mm, οι οποίες μπορεί να βρίσκονται σε οποιοδήποτε σημείο του παχέος εντέρου [Kelly and LaMont, 1998]. Η ανίχνευση των ψευδομεμβρανών είναι εύρημα υψηλότατης ειδικότητας, σχεδόν παθογνωμονικό της CDAD [Bartlett, 1992, Fekety and Shah, 1993]. Σε ποσοστό περίπου 20% των ασθενών οι αλλοιώσεις ανευρίσκονται στο ανώτερο τμήμα του παχέος εντέρου και είναι δύσκολο να αποκαλυφθούν. Για το λόγο αυτό η ενδοσκόπηση θεωρείται εξέταση χαμηλής ευαισθησίας και τα αρνητικά ευρήματα δεν αποκλείουν τη διάγνωση. Η συμμετοχή του λεπτού εντέρου είναι σπάνια [Hurley and Nguyen, 2002]. Σε λίγες περιπτώσεις η CDAD εκδηλώνεται ως κεραυνοβόλος κολίτιδα. Σε μια μελέτη υπολογίστηκε ότι η επίπτωση της απειλητικής για τη ζωή κολίτιδας από C. difficile είναι % του συνόλου της CDAD [Dallal et al, 2002]. Σε αυτούς τους ασθενείς κατά κανόνα απαιτείται κολεκτομή, και όχι σπάνια κατάληξη είναι ο θάνατος (μέχρι και σε ποσοστό 57%). Παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη αυτών των σοβαρών μορφών της νόσου είναι το ιστορικό χειρουργικής επέμβασης και η ανοσοκαταστολή. Ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε μεταμόσχευση πνεύμονος βρέθηκε ότι είχαν 46 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο ανάπτυξης CDAD γενικώς και 8 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο ανάπτυξης σοβαρής νόσου [Dallal et al, 2002]. Μια χαρακτηριστική διαφορά στην κλινική συμπτωματολογία που μερικές φορές παρατηρείται στις σοβαρότερες μορφές λοίμωξης από C. difficile είναι η απουσία διάρροιας,

33 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 32 σημείο που συσχετίσθηκε με φτωχή πρόγνωση καθώς είναι συνέπεια ανάπτυξης τοξικού μεγακόλου. Αυτή η ομάδα ασθενών μπορεί να εμφανίσει ασκίτη, λόγω της έντονης υπολευκωματιναιμίας, ενώ έχουν ακόμη περιγραφεί εντερική διάτρηση, περιτονίτιδα και θάνατος. Η διενέργεια κολονοσκόπησης είναι ιδιαίτερα επισφαλής και αντενδείκνυται γιατί υπάρχει κίνδυνος διάτρησης του εντέρου [Kelly and LaMont, 1998, Hurley and Nguyen, 2002]. Αξίζει να σημειωθεί ότι συχνά η διάγνωση τίθεται μετά θάνατον [Brazier, 1998, Bartlett, 2002]. Υποτροπές παρατηρούνται σε ποσοστό περίπου 20-25% των ασθενών [Wilcox et al, 1998, Alonso et al, 2001, Mylonakis et al, 2001]. Κατά κανόνα μάλιστα είναι ιδιαίτερα δύσκολη η αντιμετώπισή τους. Οι λόγοι για τους οποίους συμβαίνουν αυτές οι υποτροπές δεν είναι απόλυτα διευκρινισμένοι. Κάποιοι ερευνητές υποστηρίζουν ότι η πιθανότητα ανάπτυξης υποτροπής είναι αντιστρόφως ανάλογη της αποτελεσματικότητας της ανοσολογικής απόκρισης στην αρχική προσβολή, και ειδικότερα της ανάπτυξης αντισωμάτων έναντι της τοξίνης Α του C. difficile [Kyne et al, 2001]. Σχετικά με τη διαφορική διάγνωση της CDAD, η κύρια νοσολογική οντότητα από την οποία πρέπει να διακρίνεται είναι η διάρροια από χρήση αντιβιοτικών. Στη δεύτερη περίπτωση υπάρχει συσχέτιση με το είδος και τη δόση του χορηγούμενου αντιβιοτικού, οι κλινικές εκδηλώσεις είναι ηπιότερες, οι ασθενείς είναι κάθε ηλικίας και παρατηρείται σπανίως λευκοκυττάρωση και σπανιότατα τοξικό μεγάκολο. Η δοκιμασία ανίχνευσης των τοξινών του C. difficile είναι προφανώς αρνητική και θεραπευτικά αρκεί η διακοπή χρήσης του υπεύθυνου αντιβιοτικού [Bartlett, 2002].

34 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 33 Λοιμώξεις σε σημεία εκτός του πεπτικού οφειλόμενες στο C. difficile συμβαίνουν σπανιότατα (περίπου 4 περιστατικά ανά ). Στις περισσότερες περιπτώσεις πρόκειται για ενδοκοιλιακές λοιμώξεις (περιτονίτιδες, ενδοκοιλιακά αποστήματα), οι οποίες προέκυψαν από ενδοκοιλιακή, κατά συνέχεια ιστού επέκταση λοιμώξεων αρχικά εντοπισμένων στο έντερο. Εντούτοις, αναφέρονται στη βιβλιογραφία και περιπτώσεις ασθενών με ηπατικά αποστήματα, βακτηριαιμίες και λοιμώξεις κάτω άκρων [Garcia-Lechuz et al, 2001]. Συνήθως, οι λοιμώξεις εκτός πεπτικού είναι πολυμικροβιακές, δεν συνοδεύονται από διάρροια, δε σχετίζονται με ιστορικό λήψης αντιβιοτικών και οφείλονται σε μη τοξινογόνα στελέχη.

35 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile Παράγοντες κινδύνου Όπως προαναφέρθηκε, μείζων παράγοντα κινδύνου λοίμωξης από C. difficile συνιστά η χορήγηση αντιβιοτικών ευρέος φάσματος. Προς το παρόν, όλα τα αντιμικροβιακά χημειοθεραπευτικά, με εξαίρεση τις ενδοφλεβίως χορηγούμενες αμινογλυκοσίδες, έχουν ενοχοποιηθεί για την ανάπτυξη CDAD. Σε μια σχετικά πρόσφατη μετα-ανάλυση, ο Bignardi [Bignardi, 1998] επιχείρησε να κατατάξει τα διάφορα αντιβιοτικά, σε σχέση με τον κίνδυνο ανάπτυξης λοίμωξης από C. difficile. Διαπιστώθηκε ότι κατά κύριο λόγο υπεύθυνα ήταν τα από του στόματος χορηγούμενα, ευρέος φάσματος αντιμικροβιακά και ειδικότερα οι β-λακτάμες (πενικιλλίνες, κεφαλοσπορίνες), οι συνδυασμοί β-λακταμών και αναστολέων των β-λακταμασών και η κλινδαμυκίνη [McFarland et al, 1990]. Ο συνδυασμός διαφορετικών ομάδων αντιβιοτικών και η μακρά διάρκεια χορήγησης αποδείχθηκε ότι αυξάνει τον κίνδυνο ανάπτυξης της νόσου. Λοίμωξης από C. difficile μπορεί να αναπτυχθεί ακόμη και μετά τη χορήγηση αντιβιοτικών, έναντι των οποίων το C. difficile παρουσιάζει in vitro ευαισθησία. Το παράδοξο αυτό φαινόμενο πιστεύεται ότι οφείλεται στην ταχύτερη και μεγαλύτερη ανάπτυξη του C. difficile, σε σχέση με την υπόλοιπη εντερική χλωρίδα (λόγω της παρουσίας ανθεκτικών σπορίων του μικροβίου), κατά τη φάση αποκατάστασης μετά τη διακοπή λήψης του αντιβιοτικού [Barbut and Petit JC, 2001]. Στον πίνακα Γ5 καταγράφεται η συχνότητα, με την οποία τα συνήθη αντιβιοτικά προκαλούν CDAD.

36 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 35 Πίνακας Γ5. Αντιμικροβιακοί παράγοντες που σχετίζονται με CDAD [Bouza et al, 2005] Πολύ συχνά Συχνά Σπάνια Κλινδαμυκίνη Άλλες πενικιλλίνες Αμινογλυκοσίδες Αμπικιλλίνη Σουλφοναμίδες Βακιτρακίνη Αμοξυκιλλίνη Ερυθρομυκίνη Μετρονιδαζόλη Κεφαλοσπορίνες Χλωραμφενικόλη Βανκομυκίνη Τετρακυκλίνες Τεϊκοπλανίνη Τριμεθοπρίμη Ριφαμπικίνη Κινολόνες Κοτριμοξαζόλη Αρκετές ακόμη έρευνες αποκάλυψαν διάφορους ανεξάρτητους προδιαθεσικούς παράγοντες της CDAD [McFarland et al, 1990, Brown et al, 1990, Barbut et al, 1997, Thibault et al, 1991, Hutin et al, 1993, Watanakunakorn et al, 1996, Talon et al, 1995]. Σχετίστηκαν με τη νόσο η ηλικία άνω των 65 ετών, η παρουσία σοβαρής υποκείμενης νόσου και η διενέργεια μη χειρουργικών ιατρικών πράξεων και χειρισμών στο πεπτικό (όπως η τοποθέτηση ρινογαστρικού καθετήρα, τα ενέματα και η υπακτική θεραπεία). Κοινό χαρακτηριστικό αρκετών εκ των προαναφερθέντων είναι η παρεμπόδιση/κατάργηση της λειτουργίας της φυσιολογικής χλωρίδας του εντέρου, η οποία λειτουργεί ως φραγμός στην ανάπτυξη του C. difficile. Άλλοι παράγοντες κινδύνου, όπως η μεγάλη διάρκεια νοσηλείας και η νοσηλεία σε μονάδα εντατικής θεραπείας μάλλον σχετίζονται με μεγαλύτερη έκθεση στο C. difficile. Η θεραπεία με αντινεοπλασματικούς χημειοθεραπευτικούς παράγοντες δεν έχει αποδειχθεί ότι αποτελεί ανεξάρτητο παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη CDAD, εντούτοις αναφορές αρκετών περιστατικών (case reports) υποδεικνύουν ότι πιθανόν και αυτή προδιαθέτει σε λοίμωξη από C.

37 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 36 difficile [Anand and Glatt, 1993]. Οι προδιαθεσικοί παράγοντες της CDAD φαίνονται στον πίνακα Γ6. Πίνακας Γ6. Παράγοντες κινδύνου για ανάπτυξη λοίμωξης από C. difficile [Barbut and Petit, 2001]. Ερευνητής/ Έτος μελέτης Brown και συν McFarland και συν Barbut και συν Thibault και συν Hutin και συν Watanakunakorn και συν Talon και συν Αριθμός ασθενών Παράγοντες κινδύνου Odds ratio (CI 95%) Ηλικία > ( ) 37 Παραμονή σε ΜΕΘ 39.2 ( ) ΑΤΒ > 10 ημέρες 16.1 ( ) Μη χειρουργικοί Χειρισμοί στο ΓΕΣ 23.2 ( ) Κεφαλοσπορίνες 3 ης γενιάς 2.07 ( ) 399 Ενέματα 3.26 ( ) Υπακτικά 1.74 (1.02-3) Πενικιλλίνες 3.41 ( ) CD4 < 50/mm ( ) 34 Κλινδαμυκίνη 5 ( ) Πενικιλλίνες 4.6 ( ) 26 Αριθμός ΑΤΒ 1.6 ( ) Εγχείρηση στο ΓΕΣ 4.7 (1-21) 19 Κλινδαμυκίνη 42 (2-813) Διάρκεια νοσηλείας 3.6/εβδ. (1-13) 91 Κεφαλοσπορίνες 4.2 ( ) β-λακταμικά 4.92 ( ) 21 Πριστιναμυκίνη 7.95 ( ) Εντερική σίτιση 19.7 ( )

38 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile Επιδημιολογία (δεξαμενές, μετάδοση και επίπτωση λοίμωξης από C. difficile) Η κύρια δεξαμενή του C. difficile στα νοσοκομεία είναι οι ασθενείς που πάσχουν από CDAD και οι ασυμπτωματικοί φορείς. Οι ασθενείς με κλινική νόσο μολύνουν σε μεγάλο βαθμό το άμεσο περιβάλλον τους με σπόρους του μικροοργανισμού, οι οποίοι μπορούν να επιβιώσουν για αρκετούς μήνες σε επιφάνειες. Είναι χαρακτηριστικό ότι σπόροι του C. difficile ανιχνεύθηκαν και σε θαλάμους χωρίς ασθενείς με CDAD, παρά τη συνήθη, τακτική καθαριότητα. Βρέθηκε ότι η διασπορά του κλωστηριδίου εξαρτάται από την κλινική κατάσταση του ασθενούς. Συγκεκριμένα, ασθενείς με διάρροια μολύνουν το περιβάλλον περισσότερο, συγκριτικά με τους ασυμπτωματικούς φορείς [McFarland et al, 1989]. Η μετάδοση του C. difficile πιστεύεται ότι ακολουθεί την κοπρανοστοματική οδό. Η τυποποίηση στελεχών, που απομονώθηκαν κατά τη διάρκεια νοσοκομειακών επιδημιών, υποδεικνύει ότι ο μικροοργανισμός μεταφέρεται από ασθενή σε ασθενή με τα χέρια του προσωπικού. Έχει βρεθεί ότι το C. difficile ανευρίσκεται σε ποσοστό γύρω στο 59% στα χέρια του προσωπικού, που έχει επιφορτισθεί με τη φροντίδα ασθενών πασχόντων από CDAD [McFarland et al, 1989]. Η μετάδοση μπορεί επίσης να γίνει μετά από άμεση επαφή με μολυσμένες επιφάνειες, ενώ κάποια μελέτη αναφέρει πιθανή μετάδοση με απευθείας ενοφθαλμισμό του κλωστηριδίου στο έντερο, μετά από χρήση μολυσμένων ορθικών θερμομέτρων [Brooks et al, 1992]. Παράγοντες που πιθανόν διευκολύνουν τη μετάδοση του C. difficile είναι: i) η ανθεκτικότητα των σπόρων στα περισσότερα κοινά χρησιμοποιούμενα απολυμαντικά και αντισηπτικά (όπως το οινόπνευμα), ii) η ευρεία χρήση

39 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 38 αντιβιοτικών στους νοσοκομειακούς ασθενείς, που διαταράσσει τη φυσιολογική τους χλωρίδα και άρα την αντίσταση αποικισμού και iii) η απουσία λήψης απλών μέτρων υγιεινής από ασθενείς και νοσηλευτικό προσωπικό. Η μη ανίχνευση και η επαναεισαγωγή στο νοσοκομείο ασθενών που φέρουν το C. difficile συμβάλλει στη διατήρηση των στελεχών και τη διασπορά τους σε άλλους ασθενείς ή στο περιβάλλον. Οι Clabots και συν., χρησιμοποιώντας μοριακές μεθόδους τυποποίησης απέδειξαν ότι ποσοστό περίπου 84% των στελεχών του C. difficile που απομονώνονται στα νοσοκομεία είναι παρόμοια με στελέχη τα οποία είχαν πριν λίγο ανευρεθεί σε ασυμπτωματικούς φορείς [Clabots et al, 1992]. Σε ότι αφορά την επίπτωση της CDAD μεταξύ νοσοκομειακών αρρώστων, έχει βρεθεί να κυμαίνεται μεταξύ 0.1 και 2% [Bowen et al, 1995, Olson et al, 1994, Tabaqchali and Wilks, 1992]. Σε αυτό το ποσοστό περιλαμβάνονται τόσο ασθενείς με οξύ διαρροϊκό σύνδρομο από C. difficile, το οποίο ήταν η κύρια αιτία νοσηλείας (δηλαδή λοίμωξη εξωνοσοκομειακής προέλευσης), όσο και ασθενείς στους οποίους η CDAD εμφανίστηκε μετά την εισαγωγή τους στο νοσοκομείο (ενδονοσοκομειακή λοίμωξη). Η δεύτερη κατηγορία αναφέρεται ότι αφορά ποσοστό περίπου 70 και κατ άλλους ως και 93% του συνόλου των λοιμώξεων από C. difficile [Olson et al, 1994, Barbut and Petit JC, 2001]. Γενικά, η επίπτωση είναι αυξημένη σε μονάδες εντατικής θεραπείες, σε αιματολογικά και ογκολογικά τμήματα καθώς και σε τμήματα μεταμοσχεύσεων. Η επίπτωση της λοίμωξης από C. difficile στο νοσοκομειακό περιβάλλον φαίνεται εκ πρώτης θεώρησης σχετικά χαμηλή, οπωσδήποτε όμως πολύ

40 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 39 σημαντικό είναι το πρόβλημα της μετάδοσης και της φορείας του μικροβίου. Πολλοί ερευνητές έχουν προσπαθήσει να εκτιμήσουν τα ποσοστά ενδονοσοκομειακής μετάδοσης του C. difficile, ελέγχοντας συστηματικά τους ασθενείς κατά την εισαγωγή τους στο νοσοκομείο και κατόπιν μια ή δυο φορές ανά εβδομάδα (πίνακας Γ7) [McFarland et al, 1989, Tabaqchali and Wilks, 1992, Samore et al, 1994, Clabots et al, 1992, Delmée et al, 1987]. Πίνακας Γ7. Εκτίμηση του ποσοστού φορείας και μετάδοσης του C. difficile [Barbut and Petit, 2001]. Ερευνητής/ Έτος McFarland και συν Tabaqchali και συν Samore και συν Clabots και συν Delmée και συν Κλινική Διάρκεια Αριθμός Ποσοστό εξετασθέντων μελέτης εξετασθέντων φορείας (%) Ποσοστό μετάδοσης (%) Παθολογική 11 μήνες * Γηριατρική μήνες Αιματολογική Παθολογική, Χειρουργική, 5 μήνες ** ΜΕΘΑ Παθολογική, Χειρουργική 9 μήνες *** Αιματολογική 6 μήνες * :ασυμπτωματικός αποικισμός 63% ** : ασυμπτωματικός αποικισμός 73.5% ***: ασυμπτωματικός αποικισμός 95% Όπως φαίνεται στις παραπάνω μελέτες, το ποσοστό φορείας κατά την εισαγωγή κυμαινόταν μεταξύ 6.6 και 11%. Τα ποσοστά αυτά είναι αρκετά υψηλότερα από το περίπου 3-4%, που αναφέρεται σε υγιείς ενήλικες, και πιθανόν οφείλεται σε προηγούμενη χρήση αντιβιοτικών ή στην μετάδοση του C. difficile κατά τη διάρκεια προηγούμενων νοσηλειών. Βέβαια, δεν είναι

41 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 40 απόλυτα ξεκαθαρισμένο αν η φορεία σχετίζεται με παροδική, βραχυχρόνια παρουσία του C. difficile στον εντερικό σωλήνα ή αν υποδηλώνει τη συμμετοχή του μικροβίου στη μόνιμη χλωρίδα του εντέρου. Το ποσοστό μετάδοσης του C. difficile επίσης ποικίλει ανάλογα με τα χαρακτηριστικά του πληθυσμού μελέτης, τη χρήση ή όχι αντιβιοτικών και την πιθανή παρουσία επιδημικής εμφάνισης του μικροβίου στο νοσοκομείο, την περίοδο της μελέτης. Σε περίπτωση που δεν υπάρχει επιδημία κυμαίνεται από 8.5 μέχρι 21% (και από αυτές τις περιπτώσεις περίπου οι 2 στις 3 παραμένουν ασυμπτωματικές). Αντίθετα, σε περίπτωση που εξελίσσεται κάποια επιδημία, αναφέρεται ότι το ποσοστό μετάδοσης μπορεί να φτάσει το 32% [Delmée et al, 1987]. Τα παραπάνω καταδεικνύουν τη δυνατότητα του C. difficile να διασπείρεται με εκρηκτικούς ρυθμούς στο ενδοσοκομειακό περιβάλλον. Πρακτικά, μετά τη νοσηλεία ενός μόνο ασθενούς με CDAD είναι δυνατόν να ξεσπάσουν επιδημικές εξάρσεις λοίμωξης από C. difficile σε θαλάμους, όπου συννοσηλεύονται ασθενείς με αυξημένους παράγοντες κινδύνου. Η χρήση μοριακών μεθόδων τυποποίησης των απομονούμενων στελεχών επιβεβαίωσε τη συχνή μετάδοση του μικροοργανισμού από ασθενή σε ασθενή [Barbut et al, 1994]. Από διάφορες μελέτες υποστηρίζεται ότι το C. difficile αποτελεί το μείζον μικροβιακό αίτιο ενδονοσοκομειακού διαρροϊκού συνδρόμου σε ενήλικες, στο δυτικό κόσμο [Fan et al, 1993, Barbut et al, 1995, Rohner et al, 1997]. Η συχνότητα παρουσίας του μικροβίου ή των τοξινών του σε κόπρανα ασθενών με διάρροια που εμφανίστηκε τουλάχιστον 3 ημέρες μετά την εισαγωγή τους στο νοσοκομείο (και συνεπώς μπορεί να θεωρηθεί ως ενδονοσοκομειακή λοίμωξη) φαίνεται στον πίνακα 8. Το C. difficile ή οι τοξίνες του ανευρέθησαν

42 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 41 σε ποσοστό %, σε αντίθεση με τα υπόλοιπα κοινά εντερικά παθογόνα (Salmonella, Shigella, Campylobacter και Yersinia). Τα δεδομένα αυτά έκαναν την Αμερικανική Μικροβιολογική Εταιρεία (American Society for Microbiology) να εκδώσει συστάσεις για τις καλλιέργειες κοπράνων, σύμφωνα με τις οποίες σε ασθενείς με ενδονοσοκομειακό διαρροϊκό σύνδρομο δεν είναι απαραίτητο να αναζητούνται τα κοινά εντερικά παθογόνα (εκτός φυσικά αν υπάρχουν ειδικές κλινικές ή επιδημιολογικές ενδείξεις). Αντιθέτως, σε αυτή την ομάδα ασθενών απαραίτητη είναι η συστηματική αναζήτηση του C. difficile [Knoop et al, 1993]. Πίνακας Γ8. Ανεύρεση του C. difficile ή των τοξινών του σε ασθενείς με ενδονοσοκομειακό διάρροϊκό σύνδρομο [Barbut and Petit, 2001]. Ερευνητής/ Έτος Fan και συν Barbut και συν Rohner και συν Ποσοστό (%) απομόνωσης κοινών εντερικών παθογόνων Ποσοστό (%) απομόνωσης του C. difficile Ποσοστό (%) ανίχνευσης των τοξινών του C. difficile 0 (0/567) 7.7 (14/182) 1.5 (5/344) 10.2 (35/344) 1.4 (110/8052) 9.8 (248/2531) Τέλος, αναφορικά με τις κλινικές και οικονομικές επιπτώσεις της λοίμωξης από C. difficile στα νοσοκομεία, υπολογίζεται ότι η μέση διάρκεια νοσηλείας αυξάνεται κατά 8 ημέρες (και περίπου κατά 36 ημέρες σε γηριατρικούς ασθενείς) [McFarland et al, 1989, Spencer, 1998]. Μια μελέτη στο Ηνωμένο Βασίλειο αναφέρει ότι το επιπρόσθετο κόστος ενός και μόνο περιστατικού CDAD ξεπερνά τις (ήτοι περίπου ) [Wilcox et al, 1996], ενώ μια άλλη συντηρητική εκτίμηση του κόστους της νόσου στις ΗΠΑ, κάνει λόγο

43 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 42 για ετήσια επιβάρυνση γύρω στο 1.1 δισεκατομμύριο $ [Kyne et al, 2002]. Περίπου το 94% του προαναφερθέντος ποσού προκύπτει από τη μεγάλη παράταση του χρόνου νοσηλείας. Αξίζει να σημειωθεί πως δεν ελήφθησαν υπόψη και μερικές ακόμη παράμετροι, που συνεισφέρουν στην οικονομική (και όχι μόνο) επιβάρυνση του συστήματος υγείας αλλά είναι δύσκολο να αποτιμηθούν με ακρίβεια, όπως η πιθανή εκκένωση ολόκληρων θαλάμων και η απώλεια των νοσηλευτικών κλινών ή το κόστος λήψης μέτρων ελέγχου της λοίμωξης, σε περιπτώσεις επιδημιών. Ο ρόλος του C. difficile, ως πιθανό αίτιο διαρροϊκού συνδρόμου κοινότητας, έχει υποτιμηθεί καθώς οι περισσότερες μελέτες σχετικές με τις νόσους που προκαλεί πραγματοποιήθηκαν σε νοσοκομεία ή άλλα νοσηλευτικά ιδρύματα. Η επίπτωση της λοίμωξης από C. difficile σε επίπεδο κοινότητας εκτιμάται σε 8 περιστατικά ανά άτομα ανά έτος [Hirschhorn et al, 1994]. Σε μια προοπτική έρευνα στη Γαλλία [Beaugerie et al, 2001] υπολογίστηκε ότι μεταξύ των ασθενών που βρισκόταν υπό θεραπεία με αντιβιοτικά και παρακολουθούνταν από γενικούς ιατρούς ποσοστό περίπου 17.5% εμφάνισε διάρροια. Από τους ασθενείς αυτούς, καλλιέργεια κοπράνων θετική για τοξινογόνο στέλεχος C. difficile έδωσε ποσοστό 8.7% (στατιστικά σημαντικό συγκρινόμενο με το ποσοστό 1.4% θετικής καλλιέργειας ασθενών χωρίς διάρροια). Αν και πρόκειται για μια μόνο έρευνα, με όχι πολύ μεγάλο αριθμό συμμετεχόντων, μπορεί αδρά κανείς να συμπεράνει ότι το C. difficile είναι υπεύθυνο περίπου για το 1.5% των διαρροιών μετά από λήψη αντιβιοτικών σε επίπεδο κοινότητας (ποσοστό καθόλου ευκαταφρόνητο, λαμβανομένου υπόψη του γεγονότος της ευρύτατης χρήσης των αντιβιοτικών στις μέρες μας).

44 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile Εργαστηριακή Διάγνωση Η εργαστηριακή διάγνωση της λοίμωξης από C. difficile στηρίζεται στις εξής δοκιμασίες: 1. τοξινογόνος καλλιέργεια, 2. ανοσοενζυμική μέθοδος (ΕΙΑ), για ανίχνευση των τοξινών και της γλουταμικής δεϋδρογενάσης (ενός ενζύμου που παράγεται ειδικά από το C. difficile), 3. κυτταροκαλλιέργεια, για ανίχνευση της κυταροτοξίνης Β και 4. μοριακές μέθοδοι με χρήση PCR, για ανίχνευση των γονιδίων των κλωστηριδιακών τοξινών. Καθεμία από τις παραπάνω μεθόδους χρησιμοποιείται για έλεγχο διαφορετικών χαρακτηριστικών, επομένως δεν υπόκεινται σε άμεση σύγκριση. Ο συνδυασμός τους όμως αυξάνει την ακρίβεια και την ταχύτητα διάγνωσης. Όπως αναφέρθηκε σε άλλο σημείο της εργασίας, υπάρχουν άτομα που φέρουν το C. difficile στα κόπρανά τους χωρίς να εμφανίζουν το παραμικρό σύμπτωμα (υγιείς ασυμπτωματικοί φορείς). Είναι επομένως σημαντικό κάθε εργαστήριο να έχει ορίσει συγκεκριμένα κριτήρια για τη συλλογή και τον έλεγχο των δειγμάτων, ώστε να μεγιστοποιείται η ειδικότητα των αποτελεσμάτων. Παιδιά μικρότερα του ενός έτους (τα οποία έχουν σχετικά υψηλό ποσοστό φορείας, ακόμη και τοξινογόνων στελεχών C. difficile) δεν θα έπρεπε να ελέγχονται σε επίπεδο ρουτίνας, με εξαίρεση τις περιπτώσεις όπου η κλινική εικόνα επιβάλλει τον εργαστηριακό έλεγχο. Φυσικά, το εργαστήριο πρέπει να έχει την ευελιξία προσαρμογής των διαγνωστικών του πρωτοκόλλων ανάλογα με τις ανάγκες των κλινικών.

45 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 44 Συλλογή δείγματος Προτείνεται ο έλεγχος για C. difficile να γίνεται μόνο σε ασχημάτιστα κόπρανα. Η συλλογή του δείγματος πρέπει να γίνεται σε υδατοστεγές δοχείο και η μεταφορά στο εργαστήριο πρέπει να είναι άμεση. Δεν πρέπει να υπάρχει επιμόλυνση με ούρα. Αν ο έλεγχος των κοπράνων δεν πρόκειται να γίνει εντός 2 ωρών, το δείγμα πρέπει να ψύχεται, οπότε μπορεί να διατηρηθεί μέχρι 2 ημέρες, ή να καταψύχεται στους -20 ο C, οπότε διατηρείται για μεγαλύτερο διάστημα. Έχει παρατηρηθεί πρωτεολυτική αδρανοποίηση των κλωστηριδιακών τοξινών, όταν το δείγμα παρέμεινε για ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, σε ποσοστό μέχρι και 20% των θετικών στην καλλιέργεια δειγμάτων [Brazier, 1993]. 1. Καλλιέργεια. Η μέθοδος της καλλιέργειας έχει γενικά μικρή ειδικότητα και προτείνεται να μην χρησιμοποιείται διαγνωστικά από μόνη της, χωρίς την ανίχνευση τοξινών. Αντίθετα, η τοξινογόνος καλλιέργεια (δηλαδή η καλλιέργεια του δείγματος κοπράνων στα ειδικά θρεπτικά υλικά που ακολουθείται από in vitro προσδιορισμό της τοξινογόνου ικανότητας των θετικών αποικιών, με κυτταροκαλλιέργεια ή ανοσοενζυμική μέθοδο, [Peterson et al, 1996]) έχει τη μεγαλύτερη ευαισθησία και ειδικότητα στη διάγνωση πιθανής νόσου από C. difficile. (Barbut et al, 1993, Fedorko et al, 1999, Lozniewski et al, 2001, Staneck et al, 1996). Θεωρείται δε ότι συμβάλλει τόσο καθοριστικά στη διάγνωση, που υπολογίστηκε ότι ποσοστό μέχρι και 30% των περιπτώσεων CDAD θα μπορούσαν να διαφύγουν, αν για τη διάγνωση χρησιμοποιούνταν μόνο η ανίχνευση τοξίνης. Ένα ακόμη σπουδαίο πλεονέκτημα της

46 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 45 καλλιέργειας είναι ότι κατά τη διάρκεια επιδημιών είναι η μόνη μέθοδος που δίνει τη δυνατότητα απομόνωσης στελεχών C. difficile. Τα στελέχη αυτά ακολούθως μπορούν να τυποποιηθούν μοριακά και να ελεγχθούν για επιδημιολογικές συσχετίσεις [Peterson et al, 1996]. Το άγαρ με φρουκτόζη και προσθήκη κυκλοσερίνης και κεφοξιτίνης (σε συγκεντρώσεις 500 μg/ml και 16 μg/ml, αντίστοιχα) (Cycloserine Cefoxitin Fructose Agar, CCFA), είναι ένα εκλεκτικό στερεό θρεπτικό υλικό που αναπτύχθηκε από τους George και συν. [George et al, 1979], και συστήνεται για καλλιέργειες του C. difficile σε τρυβλία. Στο υλικό αυτό αναστέλλεται η ανάπτυξη των περισσότερων μικροβίων, χωρίς να επηρεάζεται το C. difficile. Η φρουκτόζη προστίθεται γιατί μεταβολίζεται από το C. difficile ταχύτερα από τη γλυκόζη, ενώ το ουδέτερο ερυθρό (neutral red) δρα ως δείκτης ανίχνευσης πρωτεόλυσης στο υλικό. Οι αποικίες του C. difficile διασπούν τις πρωτεΐνες του θρεπτικού υλικού, με αποτέλεσμα την παραγωγή αλκαλικών τελικών προϊόντων και τη μετατροπή του ουδέτερου ερυθρού σε κίτρινο. Ένα εναλλακτικό υλικό [Brazier, 1993], που περιέχει τη μισή ποσότητα των προστιθέμενων αντιβιοτικών και χολικά άλατα είναι το CCEY άγαρ (Cycloserine Cefoxitin Egg Yolk Agar). Φαίνεται πως αυτό το υλικό για διάφορους λόγους πλεονεκτεί του CCFA. Καταρχήν έχει αποδειχθεί ότι ο δείκτης ουδέτερο του ερυθρού που περιέχεται στο CCFA φθορίζει σε αναερόβιες συνθήκες, με αποτέλεσμα όλες οι αναπτυσσόμενες αποικίες (ακόμη και αυτές που είναι διάφορες του C. difficile) να δίνουν κίτρινο φθορισμό. Επίσης, η ζύμωση της φρουκτόζης δεν είναι διαφοροδιαγνωστικό χαρακτηριστικό των κλωστηριδίων και επιπλέον τα αντιβιοτικά κυκλοσερίνη και κεφοξιτίνη, στις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται στο CCFA,

47 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 46 αναστέλλουν ενίοτε και ορισμένα στελέχη C. difficile [Mundy et al, 1995]. Η προσθήκη ταυροχολικού ή χολικού νατρίου σε συγκέντρωση 1 gr/lit, βρέθηκε ότι διευκολύνει τη βλάστηση των σπόρων και αυξάνει την ευαισθησία και την απόδοση της καλλιέργειας [Brazier, 1993, Bliss et al, 1997]. Σε αρκετά εργαστήρια εφαρμόζεται η δοκιμασία εμπλουτισμού του δείγματος με αλκοόλη (alcohol shock ή treatment), κατά την οποία προκαλείται παραγωγή σπόρων από το C. difficile και ταυτόχρονα εξάλειψη της υπόλοιπης μικροβιακής χλωρίδας των κοπράνων, πριν το δείγμα ενοφθαλμισθεί στο θρεπτικό υλικό. Το υλικό που ενδείκνυται να χρησιμοποιείται μετά την επιλογή των σπόρων είναι το CCEY άγαρ, το οποίο περιέχει όπως αναφέρθηκε μικρότερη συγκέντρωση αντιβιοτικών, σε σχέση με το CCFA, και επιπλέον i) χολικά άλατα, για διευκόλυνση της βλάστησης των σπόρων μετά την επίστρωση, ii) π-υδροξυφαινυλοξεικό οξύ, για την παραγωγή της π-κρεσόλης, στην οποία οφείλεται η τυπική οσμή των αποικιών και iii) αίμα, για υποβοήθηση της ανάπτυξης. Τόσο η συνταγή που περιγράφηκε για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία όσο και αρκετές παραλλαγές της είναι διαθέσιμες, από διάφορους κατασκευαστές. Η αποθήκευση των υλικών συνιστάται να γίνεται σε πλαστικές σακούλες στους 2-8 ο C για σχετικά βραχύ διάστημα (μέχρι 1 εβδομάδα για το CCEY άγαρ). Τρυβλία με τα θρεπτικά μέσα είναι εμπορικά διαθέσιμα, αλλά όπως στα περισσότερα αναερόβια υλικά, ιδανικά είναι τα φρέσκα ή τα παρασκευασμένα και αποθηκευμένα σε αναερόβιες συνθήκες υλικά (prepared and stored, PRAS). Οι Peterson και συν. αναφέρουν ότι το CCFA, προανηγμένο τουλάχιστον για 4 ώρες σε αναερόβια ατμόσφαιρα, ευνοεί την

48 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 47 άριστη ανάπτυξη και απομόνωση του C. difficile από δείγματα κοπράνων ασθενών με CDAD [Peterson et al, 1996]. Οι αποικίες του C. difficile στο CCFA είναι διαμέτρου γύρω στα 4 mm, κίτρινου χρώματος, με εμφάνιση διαθλαστικού γυαλιού (ground glass) όταν τις παρατηρεί κανείς από κοντά με μεγεθυντικό φακό, κυκλικές με ελαφρώς ινώδη περιφέρεια και επίπεδες έως λίγο προεξέχουσες από την επιφάνεια του υλικού. Το αρχικό κίτρινο-ροζ χρώμα του θρεπτικού υλικού συχνά μετατρέπεται σε κίτρινο σε απόσταση 2-3 mm γύρω από τις αποικίες. Το C. difficile παράγει μια χαρακτηριστική οσμή στάβλου αλόγων, η οποία είναι ανιχνεύσιμη από τη πρωτογενή καλλιέργεια, είναι όμως ιδιαίτερα έντονη σε καθαρή ανακαλλιέργεια. Στο CCEY άγαρ οι αποικίες του C. difficile είναι γκριζωπές, με κέντρο το οποίο ασπρίζει, παράγουν κίτρινο-πράσινο φθορισμό σε λάμπα υπεριώδους φωτός και έχουν έντονη οσμή, εξαιτίας της παραγωγής π-κρεσόλης. Στο CCFA μπορούν ενίοτε να αναπτύσσονται και άλλα είδη κλωστηριδίων, όπως το C. innocuum, τα οποία διαφοροδιαγιγνώσκονται με τις ειδικές δοκιμασίες που περιγράφονται στη συνέχεια. Στη Gram χρώση το C. difficile έχει τη μορφή ευθέων, Gram(+) βακτηριδίων, με υποτελικούς ωοειδείς σπόρους. Οι σπόροι συνήθως δεν παρατηρούνται στα εκλεκτικά υλικά, αλλά είναι χαρακτηριστικά σε ανακαλλιέργειες σε μη εκλεκτικά υλικά. Προς την κατεύθυνση της οριστικής ταυτοποίησης του C. difficile μπορούν να εφαρμοστούν οι ακόλουθες δοκιμασίες. Εφόσον υπάρχει αρκετή ποσότητα μεμονομένων αποικιών στο εκλεκτικό θρεπτικό υλικό, γίνεται έλεγχος παραγωγής των τοξινών Α και Β (τοξινογόνος καλλιέργεια). Επίσης, σε

49 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 48 μεμονωμένες αποικίες από το εκλεκτικό υλικό διενεργείται η δοκιμασία της αμινοπεπτιδάσης της L-προλίνης, ενζύμου η παραγωγή του οποίου αποτελεί διαφοροδιαγνωστικό χαρακτηριστικό του C. difficile. Δίσκοι εμποτισμένοι με L- προλίνη-β-ναφθυλαμίδη (το υπόστρωμα του ενζύμου) έρχονται σε επαφή με τις αποικίες. Σε παρουσία του ενζύμου οι δίσκοι χρώνυνται έντονα ροζ ως κόκκινοι. Το C. difficile δίνει θετική αντίδραση, ενώ το C. innocuum αρνητική. Άλλα βακτήρια, συμπεριλαμβανομένων κάποιων κλωστηριδίων (C. sordellii, C. bifermentans κλπ.) μπορούν να δώσουν θετικά αποτελέσματα, ιδιαίτερα σε αποικίες από μη εκλεκτικά υλικά, οπότε η διάκρισή τους από το C. difficile γίνεται βάσει άλλων βιοχημικών και μορφολογικών κριτηρίων, όπως οι δοκιμασίες ινδόλης, λιπάσης και λεκιθινάσης και η ανάπτυξη στα εκλεκτικά θρεπτικά μέσα [Fedorko and Willems, 1997]. Χρήσιμη είναι ακόμη η ανίχνευση παραγωγής γλουταμικής δεϋδρογενάσης από ύποπτες αποικίες στο CCFA ή το CCEY άγαρ, η οποία γίνεται με ανοσοεζυμικές δοκιμασίες (ΕΙΑ) ή με δοκιμασίες συγκόλλησης με latex. Το C. difficile δίνει θετική αντίδραση, ενώ το C. innocuum αρνητική. Η ευαισθησία αυτών των μεθόδων δεν είναι υψηλή (περίπου 80%) και όπως ακριβώς και στη δοκιμασία της αμινοπεπτιδάσης της L-προλίνης υπάρχουν και άλλα είδη κλωστηριδίων που δίνουν θετικές αντιδράσεις. Ωστόσο, η προσθήκη του ενζύμου προσδίδει εξαιρετική αρνητική προγνωστική αξία [Barbut et al, 2000, Alfa et al, 2002]. Τέλος, σε εργαστήρια που διαθέτουν τη σχετική υποδομή μπορεί να εφαρμοσθεί υγρή-αέρια χρωματογραφία για έλεγχο πτητικών λιπαρών οξέων από ύποπτες αποικίες (που αφαιρούνται από το υλικό μαζί με ποσότητα υποκείμενου άγαρ). Μια θετική κορυφή στην περιοχή του ισοκαπροϊκού οξέος είναι διαγνωστική του C. difficile [Johnson et al, 1989].

50 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 49 Σε κάθε εργαστήριο πρέπει να διατηρείται ένα πρότυπο στέλεχος C. difficile (ATCC 9689 ή ATCC 17858), το οποίο ανακαλλιεργείται περιοδικά για ποιοτικό έλεγχο των υλικών, αλλά και όποτε υπάρχουν αμφιβολίες κατά την ταυτοποίηση των απομονούμενων στελεχών. Πρέπει να έχει κανείς υπόψη του ότι ένα στέλεχος εγκλιματισμένο στο εργαστήριο μπορεί να αναπτύσσεται καλύτερα στα θρεπτικά υλικά από τα νέα στελέχη. Συνεπώς η ανάπτυξη του πρότυπου στελέχους προσφέρει αδρή μόνον εκτίμηση της ποιότητας των υλικών. 2. Προσδιορισμός των τοξινών (και/ή κυτταρικών αντιγόνων) του C. difficile με ανοσοενζυμική μέθοδο. Η συγκεκριμένη μέθοδος εφαρμόζεται τόσο σε δείγματα κοπράνων όσο και επί των αποικιών, οι οποίες αναπτύχθηκαν στα εκλεκτικά θρεπτικά υλικά. Κυκλοφορούν αρκετά εμπορικά kit ανίχνευσης των κλωστηριδιακών τοξινών που στηρίζονται σε ανοσοενζυμικές μεθόδους (συστήματα μεμβράνης ή συμβατική EIA), με μικρές διαφορές μεταξύ τους. Σε αυτές τις δοκιμασίες σε γενικές γραμμές χρησιμοποιούνται πολυκλωνικά αντισώματα αιγός έναντι των τοξινών Α και Β (και ενίοτε και της γλουταμικής δεϋδρογενάσης). Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι οι συγκεκριμένες μέθοδοι, αν και έχουν ελαφρώς χαμηλότερη ευαισθησία, διαθέτουν ειδικότητα συγκρίσιμη με αυτή της κυτταροτοξικότητας (η οποία θεωρείται το gold standard) (Barbut et al, 1993, Vanpoucke et al, 2001, Bentley et al, 1998, Jacobs et al, 1996, Fedorko et al, 1999, Barbut et al, 1997). Λόγω της ταχύτητας και της απλότητάς τους μπορούν να χρησιμεύσουν ως δοκιμασίες screening, ειδικά σε μικρού μεγέθους εργαστήρια. Πρέπει όμως να συνδυάζονται πάντα με καλλιέργεια,

51 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 50 και όταν αυτή είναι θετική ενώ η αναζήτηση τοξινών αρνητική, να επαναλαμβάνονται με δείγμα τη δεύτερη φορά τις αποικίες που απομονώθηκαν. Ένας τρόπος διάκρισης των στελεχών του C. difficile βασίζεται στο είδος της τοξίνης που παράγουν. Στελέχη που παράγουν και τις δύο τοξίνες (TcdA + /TcdB + ) είναι κυτταροτοξικά και ευθύνονται για την πλειονότητα των περιστατικών κλινικής νόσου, στα ζώα και τον άνθρωπο. Στο παρελθόν θεωρούνταν ότι μόνο αυτά τα στελέχη ήταν παθογόνα. Ωστόσο, σχετικά πρόσφατα έγινε γνωστό ότι στελέχη που παράγουν μόνο την τοξίνη Β (TcdA - /TcdB + ), επίσης εμπλέκονται σε περιπτώσεις ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων, λοιμώξεων παιδιατρικών ασθενών και λοιμώξεων ανοσοκατασταλμένων [Al- Barrak et al, 1999, Kader et al, 1998, Limaye et al, 2000]. Τα μη τοξινογόνα στελέχη (TcdA - /TcdB - ) είναι μη κυτταροτοξικά και μη παθογόνα, αλλά όπως αποδείχθηκε με μοριακές μεθόδους μπορούν να περιέχουν τμήματα των γονιδίων των τοξινών. Κάποια στελέχη παράγουν και μια τρίτη τοξίνη, την δυαδική (binary) τοξίνη [Rupnik, 2000, Stubbs et al, 2000]. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα TcdA - /TcdB + στελέχη δεν είναι δυνατόν να αναγνωρισθούν με ανοσοενζυμικές μεθόδους που ανιχνεύουν μόνο την τοξίνη Α (όπως αρκετά εμπορικώς διαθέσιμα kit) [Lylerly et al, 1998]. Καθώς αυτά τα στελέχη αποτελούν ως και το 10% των κλινικά απομονούμενων στελεχών C. difficile [Kato et al, 1998, Alfa et al, 2000] και ενδεχομένως >40% σε παιδιατρικούς ασθενείς, είναι σαφές πως εργαστήρια που στηρίζονται μόνο στην ανίχνευση τοξινών θα πρέπει ίσως να επαναξιολογήσουν τις διαγνωστικές τους επιλογές.

52 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 51 Οι διαγνωστικές μέθοδοι που περιγράφονται στη συνέχεια απαιτούν την ύπαρξη εμπειρίας και υποδομών που ξεπερνούν τα επίπεδα ενός κοινού μικροβιολογικού εργαστηρίου, με αποτέλεσμα να εφαρμόζονται κυρίως σε εργαστήρια αναφοράς. 3. Μέθοδος κυτταροτοξικότητας. Η μέθοδος της κυτταροτοξικότητας συνίσταται σε ενοφθαλμισμό ενός διηθήματος του εξεταστέου δείγματος κοπράνων σε καλλιέργεια κυττάρων και παρακολούθηση της κυτταροπαθογόνου δράσης (cytopathic effect, CPE), που εκδηλώνεται με καταστροφή του κυτταροσκελετού και στρογγύλεμα των κυττάρων. Η δράση αυτή επάγεται κυρίως μέσω της τοξίνης Β, η οποία είναι 1000 φορές πιο κυτταροτοξική από την τοξίνη Α, και εξουδετερώνεται από ειδική αντιτοξίνη. Σχεδόν όλες οι κυτταρικές σειρές, που χρησιμοποιούνται στην κλινική ιολογία, μπορούν να χρησιμοποιηθούν και στην παραπάνω μέθοδο (π.χ. κύτταρα Vero, Hep2, ινοβλάστες, CHO, HeLa). Τα κύτταρα Vero θεωρούνται τα πιο ευαίσθητα [Delmée, 2001]. Το διήθημα ενοφθαλμίζεται σε μονοστοιβάδα κυττάρων και το κυτταροτοξικό αποτέλεσμα ελέγχεται μετά από ώρες. Σε μερικές πολύ σοβαρές περιπτώσεις CDAD το κυτταροπαθολογικό αποτέλεσμα εμφανίζεται ακόμη και μετά από 4-6 ώρες. Επιβεβαίωση της ειδικότητας της μεθόδου πραγματοποιείται με σύγχρονη εφαρμογή της δοκιμασίας, αφού προστεθεί και ειδικός αντιορός έναντι του C. difficile (αλλά και του C. sordelli, το οποίο παράγει τις ίδιες τοξίνες). Συνοπτικά, όταν παρατηρείται κυτταροπαθογόνος δράση, η οποία αδρανοποιείται από την αντιτοξίνη, συμπεραίνεται η παρουσία κυτταροτοξίνης Β του C. difficile. Σε περίπτωση που δεν

53 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 52 παρατηρείται CPE, η παρουσία του C. difficile μπορεί να αποκλεισθεί σχεδόν με βεβαιότητα, καθώς η μέθοδος ανιχνεύει ακόμη και ελάχιστες ποσότητες της τοξίνης Β. Σε αυτές τις περιπτώσεις, η δοκιμασία πρέπει να επαναλαμβάνεται, μετά από αραίωση του αρχικού δείγματος. Όταν παρατηρείται CPE τόσο στο εξεταστέο δείγμα όσο και στο δείγμα με την αντιτοξίνη, τότε είναι πιθανόν ότι εκδηλώνεται μη ειδική κυτταροπαθογόνος δράση, οπότε η δοκιμασία επίσης επαναλαμβάνεται με μεγαλύτερες αραιώσεις του αρχικού δείγματος [Jousimies-Somer et al, 2002]. Ο αλγόριθμος της ερμηνείας των αποτελεσμάτων περιγράφεται στον πίνακα Γ9. Πίνακας Γ9. Αλγόριθμος ερμηνείας αποτελεσμάτων μεθόδου κυτταροτοξικότητας Εξεταστέο δείγμα Εξεταστέο δείγμα + αντιτοξίνη Ερμηνεία CPE (+) Φυσιολογική μονοστιβάδα Παρουσία κυτταροτοξίνης Φυσιολογική μονοστιβάδα Φυσιολογική μονοστιβάδα Απουσία κυτταροτοξίνης CPE (+) CPE (+) Μη ειδική κυταροτοξικότητα Επανάληψη της δοκιμασίας, με αραιώσεις Η μέθοδος της κυτταροτοξικότητας έχει αρκετά πλεονεκτήματα: είναι ειδική και ευαίσθητη και μπορεί να ανιχνεύσει όλες τις κλωστηριδιακές τοξίνες, ακόμη και σε ελάχιστες ποσότητες. Εντούτοις, είναι σχετικά χρονοβόρος και σε ποσοστό περίπου 2% δίνει το μη ειδικό θετικό κυτταροπαθολογικό αποτέλεσμα που προαναφέρθηκε. Επιπλέον, η διατήρηση κυτταρικών σειρών είναι ασύμφορη σε χρόνο και κόστος, ιδιαίτερα όταν ο αριθμός των

54 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 53 μελετούμενων δειγμάτων είναι μικρός. Μερικοί ακόμη περιορισμοί της μεθόδου είναι ότι η τοξίνη Β είναι δυνατόν να αδρανοποιηθεί, αν τα κόπρανα παραμείνουν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος [Brazier, 1993], και ότι η ευαισθησία των διάφορων κυτταρικών σειρών ποικίλει, ανάλογα με τον ιστό από τον οποίο προέρχονται, γεγονός που ενδεχομένως καθιστά τη μέθοδο λιγότερο ευαίσθητη, σε σχέση με την τοξινογόνο καλλιέργεια [Peterson et al, 1996]. Η αναζήτηση κυτταροπαθογόνου δράσης εναιωρήματος κοπράνων σε καλλιέργειες κυττάρων θεωρείται από αρκετούς ερευνητές, ιδίως στις ΗΠΑ, ως η ιδανική μέθοδος διάγνωσης ( gold standard ), ωστόσο τόσο η καλλιέργεια όσο και η ανίχνευση τοξινών είναι απαραίτητες για την πλήρη διαγνωστική προσέγγιση. Όλα τα θετικά καθώς και τα προκαταρκτικά αρνητικά αποτελέσματα πρέπει να αναφέρονται μετά τις πρώτες 24 ώρες, η επώαση όμως συνεχίζεται για ακόμη 24 ώρες, ώστε να αποκαλυφθεί η όψιμη κυτταροτοξικότητα. 4. Μοριακές μέθοδοι. Η χρήση μοριακών μεθόδων για τη διάγνωση της CDAD έχει μελετηθεί σε αρκετά μικρότερο βαθμό από ότι σε άλλες λοιμώδεις νόσους. Αυτό πιθανόν οφείλεται στα σχετικώς ικανοποιητικά αποτελέσματα των συμβατικών μεθόδων αλλά και στη δυσκολία εφαρμογής τέτοιων τεχνικών σε δείγματα κοπράνων (που ως γνωστό παρουσιάζουν προβλήματα στην ενίσχυσή τους). Αρκετές μέθοδοι, οι οποίες βασίζονται στην ενίσχυση τμήματος του γονιδίου της τοξίνης Α με PCR, έχουν χρησιμοποιηθεί στη διάκριση μη

55 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 54 τοξινογόνων από τοξινογόνα στελέχη, χωρίς ωστόσο να έχουν σοβαρά πλεονεκτήματα έναντι των εργαστηριακών μεθόδων ρουτίνας. Η απευθείας ανίχνευση γονιδίων του C. difficile σε κόπρανα έχει επίσης δοκιμαστεί. Οι Green και συν. σχεδίασαν ολιγονουκλεοτιδικά probes για ανίχνευση της τοξίνης Β, με ευαισθησία και ειδικότητα παρόμοια με αυτήν των ανοσοενζυμικών μεθόδων (Green et al, 1994). Άλλοι ερευνητές χρησιμοποίησαν ζεύγη ιχνηθετών για να ανιχνεύσουν με PCR σε κόπρανα ταυτόχρονα τις τοξίνες Α και Β (Kato et al, 1993, Gumerlock et al, 1993, Arzese et al, 1995, Wolfhagen et al, 1994). Όλες οι τεχνικές περιλαμβάνουν ένα προκαταρκτικό στάδιο, κατά το οποίο αφαιρούνται διάφοροι αναστολείς. Μέχρι στιγμής πάντως, εφαρμόστηκαν σε μικρό αριθμό δειγμάτων και δεν είχαν αποτελέσματα σημαντικά καλύτερα, σε σύγκριση με τις κλασικές μεθόδους. Συνοψίζοντας, κατά τη διάγνωση της λοίμωξης από C. difficile σε ένα μικροβιολογικό εργαστήριο ρουτίνας συνιστάται να εφαρμόζεται ο εξής αλγόριθμος, που στηρίζεται στην καλλιέργεια και την ανίχνευση τοξινών: σε κάθε δείγμα κοπράνων πρέπει να γίνεται και καλλιέργεια και ανίχνευση τοξινών. Όταν και οι δυο δοκιμασίες είναι αρνητικές (όπως συμβαίνει περίπου στο 87% των περιπτώσεων), η διάγνωση της CDAD αποκλείεται. Αν και οι δυο δοκιμασίες είναι θετικές, τεκμηριώνεται η CDAD και απαιτούνται θεραπεία και λήψη μέτρων ελέγχου της διασποράς της λοίμωξης στο νοσοκομείο. Όταν δεν ανιχνεύεται τοξίνη στα κόπρανα αλλά η καλλιέργεια είναι θετική, πρέπει να γίνεται απευθείας αναζήτηση παραγωγής τοξίνης σε απομονωμένες αποικίες, ώστε να διευκρινιστεί αν το στέλεχος είναι τοξινογόνο ή όχι. Στην τελευταία περίπτωση δεν απαιτείται θεραπεία της CDAD. Εφόσον όμως ανιχνευθεί

56 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 55 τοξίνη στην καλλιέργεια η διάγνωση της CDAD είναι πολύ πιθανή, οπότε πρέπει να λαμβάνονται μέτρα. Στις ελάχιστες περιπτώσεις όπου η καλλιέργεια είναι αρνητική παρά την ανίχνευση τοξίνης στο δείγμα (0.2%), συνιστάται η επανάληψη της καλλιέργειας σε νέο δείγμα κοπράνων, με χρήση CCFA με ταυροχολικό. Συνήθως η δεύτερη καλλιέργεια αποβαίνει θετική [Delmeé, 2001]. Τα παραπάνω φαίνονται στον πίνακα Γ10. Πίνακας Γ10. Αλγόριθμος διάγνωσης της λοίμωξης από C. difficile [Delmeé, 2001]. Αρχικές δοκιμασίες καλλιέργεια κοπράνων ανίχνευση τοξίνης στα κόπρανα Πρόσθετη δοκιμασία ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ (-) (-) απουσία CDAD (+) (+) CDAD (+) (-) ανίχνευση τοξίνης στην καλλιέργεια (+) πιθανή CDAD (-) (+) (-) επανάληψη καλλιέργειας φορεία μη τοξινογόνου στελέχους C. difficile πιθανή CDAD Κάποιοι ερευνητές ισχυρίζονται ότι η ύπαρξη τοξινογόνων στελεχών σε χαμηλή ποσότητα, τέτοια που να παράγονται μη ανιχνεύσιμα επίπεδα τοξινών, υποδηλώνει φορεία μάλλον παρά λοίμωξη από C. difficile. Παρόλα αυτά οι ασθενείς που φέρουν τοξινογόνα στελέχη, όταν έχουν διάρροια

57 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 56 μπορούν να τα διασπείρουν και να μολύνουν το περιβάλλον. Αυτός ο λόγος και μόνον είναι αρκετός ώστε να δικαιολογεί τη διενέργεια καλλιέργειας.

58 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile Τυποποίηση Για την τυποποίηση του C. difficile έχουν χρησιμοποιηθεί φαινοτυπικές και μοριακές μέθοδοι. Φαινοτυπικές μέθοδοι Οι πρώιμες μέθοδοι τυποποίησης του Clostridium difficile ήταν κατ ανάγκη βασισμένες σε φαινοτυπικές ιδιότητες του μικροοργανισμού, όπως το αντιβιόγραμμα. Σε μια από πρώτες απόπειρες διερεύνησης μιας επιδημίας από C. difficile, ο Burdon διαπίστωσε ότι στελέχη, που απομονώθηκαν από χειρουργικούς θαλάμους διέφεραν από στελέχη του υπολοίπου νοσοκομείου, καθώς παρουσίαζαν διαφορετικό αντιβιόγραμμα, με αντοχή σε συγκεκριμένα αντιβιοτικά [Burdon, 1982]. Μετά την απλή και ατελή αυτή προσέγγιση, άλλοι ερευνητές, χρησιμοποιώντας μεθόδους όπως η πλασμιδιακή ανάλυση, η ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών του C. difficile σε γέλη πολυακρυλαμίδης (PAGE) και η ανοσοηλεκτροφόρηση εξωκυττάριων αντιγόνων κατόρθωσαν να πραγματοποιήσουν τις πρώτες επιδημιολογικές συσχετίσεις [Wüst et al, 1982]. Ακόμη, χρησιμοποιήθηκαν (χωρίς όμως ιδιαίτερα καλά αποτελέσματα) η τυποποίηση με βακτηριοσίνες και βακτηριοφάγους [Sell et al, 1983] και η αποτύπωση (fingerprinting) κυτταρικών εκχυλισμάτων [Poxton and Byrne, 1981]. Το 1981 οι Nakamura και συν. επιχείρησαν για πρώτη φορά την ορολογική τυποποίηση του C. difficile, διακρίνοντας 4 ορότυπους του μικροβίου [Nakamura et al, 1981], ενώ αργότερα με βελτίωση αυτού του μεθοδολογικού συστήματος έγινε δυνατή η διάκριση 19 ορολογικών ομάδων [Delmée, 1985]. Μάλιστα, η συγκεκριμένη μέθοδος συχνά χρησιμοποιείται ως πρότυπο, με το οποίο συγκρίνονται άλλες μέθοδοι τυποποίησης.

59 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 58 Όλες οι παραπάνω μέθοδοι τυποποίησης αναπτύχθηκαν με σκοπό την κατανόηση της επιδημιολογίας του C. difficile σε τοπικό επίπεδο και σε αρκετές περιπτώσεις βρέθηκαν ενδείξεις εμπλοκής ενός και μοναδικού στελέχους σε ενδονοσοκομειακές επιδημίες, επιβεβαιώνοντας την υποψία ότι ένα αρχικό στέλεχος C. difficile είναι ικανό να διασπείρεται. Έγινε όμως σύντομα προφανές ότι, παρότι τα προαναφερθέντα σχήματα ήταν αποτελεσματικά σε τοπικό επίπεδο, υπήρχε ανάγκη ανάπτυξης μεθόδων με ευρύτερη εφαρμογή. Οι Mulligan και συν., μετά από σύγκριση των διαφόρων σχημάτων τυποποίησης, διαπίστωσαν ότι γενικά υπάρχει ικανοποιητική συσχέτιση μεταξύ των αποτελεσμάτων της πλασμιδιακής ανάλυσης, της οροτυπίας, της PAGE και της ανοσοαποτύπωσης και πρότεινε την εφαρμογή μιας παραλλαγής της PAGE με χρήση δωδεκυλο-θειϊκού νατρίου (Sodium dodecyl sulphate, SDS-PAGE), με την οποία μπορεί να γίνει πολύ ικανοποιητικά η τυποποίηση των διαφόρων στελεχών [Mulligan et al, 1988]. Άλλη μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε με επιτυχία είναι η πυρολυτική φωτομετρία μάζας (pyrolysis mass spectrometry, PMS), με πλεονέκτημα την εξαιρετική διακριτική ικανότητα των μελετούμενων στελεχών αλλά με μειονέκτημα το υψηλό κόστος της και την αδυναμία της να τυποποιήσει σταθερά και μόνιμα ένα στέλεχος [Magee et al, 1993]. Μοριακές μέθοδοι Για την τυποποίηση του C. difficile έχουν δοκιμαστεί αρκετές μοριακές μέθοδοι, οι οποίες βασίζονται στη μελέτη του γενετικού υλικού του βακτηριδίου και γενικά θεωρούνται ανώτερες των φαινοτυπικών, λόγω της

60 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 59 μεγαλύτερης ακρίβειας και σταθερότητας αλλά και του μεγαλύτερου φάσματος τυποποίησης. Η πλασμιδιακή ανάλυση (δηλαδή η κατηγοριοποίηση των κλωστηριδίων ανάλογα με το είδος των πλασμιδίων που φέρουν) αποδείχθηκε απόλυτα ανεπιτυχής μέθοδος, καθώς τα εξωχρωμοσωμικά αυτά γενετικά στοιχεία παρουσιάζουν ευρεία και ανομοιόμορφη κατανομή σε επίπεδο είδους. Χρήσιμη αποδείχθηκε όμως η ανάλυση του χρωμοσωμικού DNA του C. difficile, μετά την κατεργασία του με περιοριστικά ένζυμα, μέθοδο με την οποία έγινε δυνατή η επιδημιολογική συσχέτιση στελεχών που απομονώθηκαν από ασθενείς με CDAD [Kuijper et al, 1987]. Μια άλλη γονοτυπική μέθοδος, στην οποία επίσης χρησιμοποιείται κατεργασία του DNA με ενδονουκλεάσες περιορισμού, είναι ο πολυμορφισμός μήκους θραύσματος (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP). Και οι 2 προηγούμενες μέθοδοι χαρακτηρίζονται από υψηλή διακριτική ικανότητα και επαναληψιμότητα, είναι όμως τεχνικά απαιτητικές και δύσκολο να εφαρμοστούν σε μεγάλο αριθμό στελεχών. Η μοριακή μέθοδος, που μετά την εισαγωγή της σχεδόν αντικατέστησε τις προηγούμενες τεχνικές, είναι η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (polymerase chain reaction, PCR), με τις διάφορες παραλλαγές της (Arbitrarily Primed PCR, AP-PCR, Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD κλπ.) [Barbut et al, 1993]. Η ριβοτυπία με PCR, που πρωτοεφαρμόστηκε στο C. difficile από τον Gurtler, χρησιμοποιώντας εκκινητές συμπληρωματικούς αλληλουχιών του οπερονίου RNA του κλωστηριδίου πετυχαίνει να μεγεθύνει περιοχές μεταξύ των 16S και 23S τμημάτων. Βρέθηκε ότι το C. difficile έχει πολλαπλά

61 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Clostridium difficile 60 αντίγραφα των γονιδίων του rrna, ο αριθμός των οποίων ποικίλει σημαντικά σε επίπεδο στελέχους (αλλά και με διαφορές στο μήκος αυτών των αντιγράφων ακόμη και στο ίδιο γονιδίωμα) [Gurtler, 1993]. Άλλοι ερευνητές βελτίωσαν τη μέθοδο, ξεπερνώντας κάποια μειονεκτήματα προηγούμενων εφαρμογών όπως τη φτωχή επαναληψιμότητα, την αστάθεια των δεικτών (markers) και την εξάρτηση της απόδοσης της μεθόδου από την ποσότητα του εξεταζόμενου DNA [Cartwright et al, 1995]. Απλοποιήθηκε επίσης η διαδικασία εκχύλισης του μικροβιακού DNA [O Neill et al, 1996]. Η μέθοδος συγκρίθηκε με τη μέθοδο αναφοράς της ορολογικής τυποποίησης και έδωσε διαφορετικό προφίλ για κάθε ένα από τους 19 ορότυπους του C. difficile. Μάλιστα, από το 1995 χρησιμοποιείται ως τεχνική ρουτίνας στο Βρετανικό Κέντρο Αναφοράς Αναεροβίων Μικροβίων, έχοντας μέχρι τώρα πετύχει να διακρίνει τουλάχιστον 116 διαφορετικούς ριβότυπους του C. difficile, σε σύνολο περισσοτέρων από 3000 εξετασθέντων στελεχών [Stubbs et al, 1999] (εικόνα Γ3). ΕΙΚΟΝΑ Γ3. Παράδειγμα ηλεκτροφόρησης προϊόντων PCR ριβοτυπίας [Brazier, 2001].