Γενικές αρχές απομόνωσης και ταυτοποίησης αναερόβιων μικροβίων

Transcript

1 Γενικές αρχές απομόνωσης και ταυτοποίησης αναερόβιων μικροβίων Κανελλοπούλου Μαρία Αν. διευθύντρια Εργαστηρίου Κλινικής Μικροβιολογίας Σισμανόγλειο Γενικό Νοσοκομείο

2 είγμα Άμεση εξέταση Υγρό θρεπτικό υλικό ΤΒ, CM Μακροσκοπική Μικροσκοπική Gram Στερεά θρεπτικά υλικά Επώαση O 2 MacConkey * προαιρετικά Επώαση αναερόβια BBE, KVLB, PEA, BA, EYA * Επώαση CO 2 (10 %) BA, PEA, Choc *

3 Μακροσκοπική εξέταση Άσχημη μυρωδιά - προϊόντα μεταβολισμού : πτητικά λιπαρά οξέα, αμίνες, υδρόθειο Κόκκινος φθορισμός - Pigmented Porphyromonas ή Prevotella Μαύρο χρώμα - Pigmented Gram - bacteria Κοκκία θείου Πύον Αίμα

4 Επεξεργασία δείγματος Ανάδευση πυώδους υλικού σε Vortex Ομογενοποίηση ιστού σε 1 ml TB Εκχύλιση (Swab) σε ο,5 ml TB υγρό δείγμα ιαδικασία σε αναερόβιες συνθήκες ή εναλλακτικά σε 15 λεπτά, O 2

5 Μικροσκοπική εξέταση (Από 1 σταγόνα σε 2-3 πλακάκια) Χρωματισμένα παρασκευάσματα κλασσική Gram ή εναλλακτικά ο,1 % βασική φουξίνη αντί σαφρανίνης Νωπά παρασκευάσματα Phase contrast ή σκοτεινόπεδίο Dialister pneumosintes (G K μικροί δεν βάφονται) Κινητικότητα (Campylobacter) Σπόροι (Clostridium) Σπειροχαίτες (δεν καλλιεργούνται)

6 Eμβολιασμός σε θρεπτικά υλικά Με πιπέττα Pasteur - 1 σταγόνα σε κάθε τρυβλίο (πυώδες) - 2 σταγόνες σε κάθε τρυβλίο (μη πυώδες) - υπόλοιπο υλικό σε ΤΒ ή ζωμό κρέατος Cooked meat (εμπλουτισμός)

7 Θρεπτικά υλικά * ΒΑ : Brucella agar + 5 % αίμα + Κ1 (1μg / ml) + αιμίνη (5 μg / ml) BBE : Bacteroides Bile Esculin agar (Bacteroides, Bilophila) KVLB : Kanamycin (100 μg / ml) + Vancomycin (7,5 mg / ml) + 5 % Lysed Blood Prevotella, Bacteroides PEA : Phenylethyl alcohol sheep blood Agar G B (O 2 ), Proteus, Clostridium TB : Θειογλυκολικός ζωμός με ή χωρίς δείκτη + Κ1 + αιμίνη + τρίμματα μαρμάρου ή Cooked Meat EYA : Egg Yolk Agar (προαιρετικά) CCFA : Cyclocerin Cefoxitin Fructose Agar (προαιρετικά) * Φρέσκα ή προανηγμένα : υγρά βρασμός, στερεά διατήρηση σε αναερόβιες * Αίμα : προβάτου, ίππου, κουνελιού συνθήκες. PRAS (Prereduced Anaerobically Sterilized)

8 Επώαση Ανάγνωση αναερόβιων καλλιεργειών Jars 48h (όχι νωρίτερα)

9 Επώαση Ανάγνωση αναερόβιων καλλιεργειών Αναερόβιος θάλαμος Επισκόπηση ανά 24h Σακουλάκια Επισκόπηση ανά 24h

10 Ταυτοποίηση αναερόβιων Μικροβίων Προκαταρκτική Τελική

11 Προκαταρκτική ταυτοποίηση Μυρωδιά Περιγραφή της αποικίας Χρώση Gram οκιμασία αεροβιώσεως οκιμασία ειδικής συγκέντρωσης αντιβιοτικών οκιμασία αναγωγής NO 3 οκιμασία καταλάσης οκιμασία παραγωγής ινδόλης οκιμασία παραγωγής ουρεάσης οκιμασία παραγωγής λιπάσης λεκιθινάσης οκιμασία αντοχής στη χολή 20% οκιμασία ευαισθησίας στο SPS

12 Σημεία κλειδιά ύπαρξης αναερόβιων στην καλλιέργεια Ι Α)Θρεπτικός ζωμός Cooked Meat Θόλωση μετά από 48h μικροβιακή ανάπτυξη Πρωτεόλυση - μαύρη ή γκρίζα βλεννώδης περιοχή στον πυθμένα του Universal - ελάττωση της ποσότητας του κρέατος - οσμή σάπιου κρέατος - μάζες κρυστάλλων τυροσίνης που μεγαλώνουν όσο μένουν στην καλλιέργεια χιονισμένη επιφάνεια π.χ. C. histolyticum - αέριο Σακχαρόλυση - αέριο - αλλαγή χρώματος (ροζέ) λόγω αναγωγής της αιματίνης Λιπόλυση - βουτυρώδης αφρός στην επιφάνεια του ζωμού

13 Σημεία κλειδιά ύπαρξης αναερόβιων μικροβίων ΙΙ Β) Άσχημη μυρωδιά με το άνοιγμα της jar Γ) Παρατήρηση στα στερεά υλικά πολλοί μορφολογικοί τύποι στο ΒΑ (αν) / ΒΑ (CO 2 ) ανάπτυξη στα εκλεκτικά υλικά κόκκινος φθορισμός μαύρες αποικίες στο KVLB ή BA

14 Περιγραφή αποικιών αναερόβιων μικροβίων - Μέγεθος - Όψη - Επιπλέον χαρακτηριστικά (χρωστική,φθορισμός, αιμόλυση,οσμή) - xρήση φακού

15 Χρώση Gram οκιμασία KOH 3 % Halebian et al. J Clin Microbiol 1981, 13 : 444.

16

17 Ταυτοποίηση αναερόβιων με δίσκους ειδικής συγκέντρωσης αντιβιοτικών Μεθοδολογία α) Παραμονή των δισκίων σε Θ (x15 min) β) Μεταφορά μέρους της αποικίας σε ΒΑ. Στρώσιμο στο α τεταρτημόριο αρκετές φορές πλούσιο κ/μα υπόλοιπα τεταρτημόρια γ) Τοποθέτηση colistin (10 μg), kanamycin (1 mg), vancomycin (5 μg) στο πρώτο τεταρτημόριο δ) Αναερόβια επώαση x 48h / 35o C ε) Ανάγνωση : 10mm R, 10mm S

18 H 2 O 2 15 % 2H 2 O 2 catalase 2H 2 O + O 2

19

20

21

22 Λεκιθινάση (+) C. perfringens, C. bifermentans, C. sordelli, C. novyi, Cl. barati, C. botulinum, C. sporogenes

23 Ουδέτερο λίπος λιπάση γλυκερόλη + λιπαρά οξέα Λιπάση (+) : C. sporogenes, C. botulinum, C. novyi type A, F. necrophorum

24 Τελική ταυτοποίηση Μεταβολική διάσπαση σακχάρων + (ινδόλη, ουρία, καταλάση, εσκουλίνη, ζελατίνη) Παρουσία ενζύμων Συνδυασμό των ανωτέρω Προσδιορισμό λιπαρών οξέων κυτταρικού τοιχώματος Προσδιορισμό λιπαρών οξέων-τελικών προϊόντων μεταβολισμού Προσδιορισμό τοξινών

25 Ταυτοποιητικά συστήματα Α) Βιοχημικές διαδικασίες (σάκχαρα, ινδόλη, ουρία, ζελατίνη) - ΑΡΙ 20Α (BioMerieux, Inc.) - Minitek (BD Biosciencens) Προβλήματα 1) Αναερόβια επώαση του strip (24 48h) 2) Στα βραδέως αναπτυσσόμενα / απαιτητικά (Porphyromonas), ασακχαρολυτικά (F. nucleatum, Peptostreptococcus) 3) Αντίδραση ινδόλης ψευδώς θετική 4) Απαιτούνται επιπλέον δοκιμασίες (bile, EY, καταλάση ) 5) Ορισμένα σακχαρολυτικά αλλοιώνουν τους δείκτες δυσκολία στην ανάγνωση

26 Β) Ενζυματικά συστήματα ταυτοποίησης αναερόβιων Anaerobe ANI card (BioMerieux, Inc.) Rapid ID 32A (BioMerieux, Inc.) Rapid Anaerobe ID (Dade MicroScan, Inc.) Crystal Anaerobe ID kit (BD Biosciences) RapID ANA (Remel, Inc.)

27 Ενζυματικά συστήματα Πλεονεκτήματα 1) εν απαιτούν μικροβιακή ανάπτυξη 2) Επώαση σε συνηθισμένο αερόβιο κλίβανο 3) Ταυτοποίηση σε 4h (δυνατή) 4) Καλή ταυτοποίηση απαιτητικών / ασακχαρολυτικών 5) Πολλά στελέχη ταυτοποιούνται χωρίς PRAS βιοχημικές Μειονεκτήματα 1) Αναερόβια μη κλινικής σημασίας?? 2) Αναερόβια στοματικής κοιλότητας?? 3) εν υπάρχουν database σε νεότερες ταξινομήσεις?? 4) Μερικές αντιδράσεις??

28 Αέρια υγρά χρωματογραφία Αρχή μεθόδου Τα αναερόβια μικρόβια μεταβολίζουν τη γλυκόζη και άλλα θρεπτικά στοιχεία σε οργανικά λιπαρά οξέα βραχέων αλύσεων και αλκοόλες ειδικές / κα για γένη και μερικά είδη.

29 Συσκευή αέριας υγράς χρωματογραφίας Λεγάκης Ν.Ι., Χριστάκης Γ.Β. Αναερόβιες λοιμώξεις και αναερόβια μικρόβια

30 Στάδια λειτουργίας αέριας υγράς χρωματογραφίας 1) Έγχυση διαλύματος (PYG) 2) Εξαέρωση 3) Μετακίνηση με τη βοήθεια αδρανούς αερίου (Ν 2, Η 2, Ηe) 4) Ανίχνευση αερίου (ανιχνευτής), μετατροπή σε ηλεκτρικό ρεύμα 5) Αποτύπωση στον καταγραφέα

31 Fatty Acids Methyl Ester (FAME) Analysis Αρχή μεθόδου Προσδιορίζονται μακρές αλύσεις λιπαρών οξέων (9 20 Carbons) που βρίσκονται στο κυτταρικό τοίχωμα των μικροβίων. Η παρουσία και η ποσότητα αυτών των οξέων παράγει αποτυπώματα μοναδικά για γένη και πολλά είδη αναεροβίων.

32 Στάδια λειτουργίας FAME 1) Ανάπτυξη μικροβίου σε PRAS PYG (48h) 2) Φυγοκέντρηση, σαπωνοποίησηση (ΝαΟΗ) 3) Αποχωρισμός λιπαρών οξέων 4) Εκχύλιση με Methyl Ester 5) Έγχυση στον αναλυτή 6) Καταγραφή αποτυπώματος, σύγκριση με πρότυπα στελέχη

33 Προσδιορισμός τοξινών Τοξίνη Α C. difficile (ELISA, ανοσοχρωματική) Τοξίνες Α και Β C. difficile (ELISA, ανοσοχρωματική) Τοξίνη Β C. difficile (κυτταροκαλλιέργεια) Τοξίνες Α,Β, ιαδική (PCR) Τοξίνες C. botulinum (PCR)

34 6η Ημερίδα Κλινικής Μικροβιολογίας Μικροβιολογία Αναεροβίων Λοιμώξεων 28 / 01 / 2006