ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΑΝΑΕΡΟΒΙΑΣ ΕΠΩΑΣΗΣ ΚΑΙ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ. Ορφανίδου Μαρία Επιμελήτρια Β Βιοπαθολόγος Γ.Ν.Α. «Γ. Γεννηματάς»

Transcript

1 ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΑΝΑΕΡΟΒΙΑΣ ΕΠΩΑΣΗΣ ΚΑΙ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ Ορφανίδου Μαρία Επιμελήτρια Β Βιοπαθολόγος Γ.Ν.Α. «Γ. Γεννηματάς»

2 ΑΝΑΕΡΟΒΙΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ ΑΡΧΗ: Αερόβια βακτήρια τελικός δέκτης ηλεκτρονίων το Ο2 Αναερόβια βακτήρια τελικός δέκτης ηλεκτρονίων οι οργανικές ουσίες

3 ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ 1) Παρουσία Ο2 2) Οξειδοαναγωγικό δυναμικό

4 ΟΞΥΓΟΝΟ Έκθεση σε Ο2 βιολογικές οξειδώσεις ηλεκτρόνια+ φλαβινονουκλεοτίδια+ο2 παραγωγή Ο 2, Η 2 Ο 2 Η 2 Ο+Η 2 Ο 2 +Ο 2 ΟΗ Προστατευτικά ένζυμα: Καταλάση 2Η 2 Ο 2 2Η 2 Ο+Ο 2 Δισμουτάση του υπεροξειδικού ανιόντος Ο 2 +Ο 2 +2Η Η 2 Ο 2 +Ο 2 Υπεροξειδάσες διάσπασηη 2 Ο 2 +οξείδωση οργανικών ουσιών

5 ΟΞΕΙΔΟΑΝΑΓΩΓΙΚΟ ΔΥΝΑΜΙΚΟ Οξειδοαναγωγικό δυναμικό= η τάση ενός συστήματος να δέχεται ηλεκτρόνια (μονάδες V ή mv, σύμβολο Eh) Eh για την ανάπτυξη αναερόβιων βακτηρίων -100 έως -250mV Χαμηλό Eh: -απουσία Ο 2 -παρουσία αναγωγικών ουσιών (κυστεϊνη) -σύσταση ατμόσφαιρας ΗαπουσίαΟ2 είναι πολύ σημαντικότερη από το χαμηλό Eh (Walden WC, HentgesDJ.Appl Microbiol,1975)

6 ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΑΝΑΕΡΟΒΙΑΣ ΕΠΩΑΣΗΣ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ Υγρά θρεπτικά υλικά: CO 2 + tryptic soy broth/ thiol broth/ Columbia broth/ trypticase soy broth/ thioglycolate medium 135C/ Septi-Chek/ Wilkins Chalgren broth/ τροποποιημένος Schaedler broth Αυτόματα συστήματα: BACTEC (φθορισμός): βακτήρια παραγωγή CO 2 ελάττωση ph αλλαγή φθορισμού BacT/Alert (ημιδιαπερατή μεμβράνη+χρωματισμένος αισθητήρας CO 2 ): βακτήρια παραγωγή CO 2 διάχυση στη μεμβράνη αντίδραση με αισθητήρα παραγωγή ιόντων Η 2 ελάττωση ph αλλαγή χρώματος αισθητήρα από μπλε-πράσινο σε κίτρινο λυχνία LED

7 ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΑΝΑΕΡΟΒΙΑΣ ΕΠΩΑΣΗΣ Φιάλες αναερόβιων συνθηκών Σύστημα μιας χρήσης αναερόβιων συνθηκών (πλαστικές σακούλες) Θάλαμοι αναερόβιων συνθηκών * Επιθυμητή ατμόσφαιρα για την ανάπτυξη των αναεροβίων: 80-90% N2, 5-10% H2 και 5-10% CO2

8 ΦΙΑΛΕΣ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ (Jars & Boxes) 1. Φιάλες χωρίς αντικατάσταση αερίων Φάκελος με ειδικό μίγμα ουσιών (νατριούχο βοροϋβρίδιο) και καταλύτη (χλωριούχο κοβάλτιο) + Η 2 Ο 10ml Φακελάκι με ειδικό μίγμα ουσιών (ασκορβικό οξύ) χωρίς καταλύτη και προσθήκη Η 2 Ο Δείκτης αναερόβιων συνθηκών: κυανούν του μεθυλενίου ή ρεζαζουρίνη αποχρωματισμός Χωρητικότητα: τρυβλία

9 ΦΙΑΛΕΣ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ 2. Φιάλες με αντικατάσταση του αέρα με μίγμα αερίων Ψυχρός καταλύτης Δείκτης: Fildes & McIntoh (γλυκόζη, NaOH, μπλε του μεθυλενίου) άχροος αναερόβιες συνθήκες μπλε αερόβιες συνθήκες Anoxomat = αυτόματο σύστημα αφαίρεσης του αέρα και αντικατάσταση αυτού με μίγμα αερίων

10 ΣΑΚΟΥΛΕΣ ΜΙΑΣ ΧΡΗΣΗΣ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ (Pouch) Πλαστικές διαφανείς σακούλες Αμπούλες έκλυση Η 2 & καταλύτης (παλλάδιο) Φακελάκια (ασκορβικό οξύ) Δείκτης: μπλετουμεθυλενίουήρεζαζουρίνη Χωρητικότητα: 4-5 τρυβλία

11 ΘΑΛΑΜΟΙ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ (Chamber) 1. Συνεχή ροή μίγματος Ν 2 (85%), Η 2 (5%) και CO 2 (10%) Μέσα στο θάλαμο υπάρχει θετική πίεση 2. Καταλύτης από παλλάδιο 3. Δείκτης: χημικός (κυανούν του μεθυλενίου ή ρεζαζουρίνη) ή βιολογικός (Simmons+Pseudomonas sp) 4. Έλεγχος υγρασίας: κρύσταλλοι από gel σιλικόνης 5. Καθημερινή αλλαγή καταλύτη

12

13 ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΑΣ ΕΠΩΑΣΗΣ ΦΙΑΛΕΣ ΣΑΚΟΥΛΕΣ ΘΑΛΑΜΟΙ Αρχικό κόστος Κόστος χρήσης Χρόνος Χώρος ± Απομόνωση Πλεονεκτήματα εύχρηστο εύχρηστο, επισκόπηση όχι έκθεση σε Ο 2, επισκόπηση Μειονεκτήματα έκθεση σε Ο 2 έκθεση σε Ο 2, μικρή χωρητικότητα μεγάλος χώρος, υψηλό αρχικό κόστος, συντήρηση, χρονοβόρο

14 ΣΥΝΗΘΗ ΣΦΑΛΜΑΤΑ Χρήση ελαττωματικών αναερόβιων φιαλών: ρωγμές, μη ερμητικό κλείσιμο της φιάλης, ανοιχτά συστήματα εξαερισμού Χρήση αδρανών καταλυτών: οι καταλύτες πρέπει να επανενεργοποιούνται μετά από κάθε χρήση με θέρμανση στους 160 C για 2h Χρήση ακατάλληλων δεικτών αναερόβιων συνθηκών Σφάλμα στη συγκέντρωση CO 2 ( η παρουσία CO 2 είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη μερικών αναερόβιων βακτηρίων)

15 ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Εμπλουτιστικά Μη εκλεκτικά Εκλεκτικά Διαφοροποιητικά

16 ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Παρουσία αιμίνης (5 μg/ml) και βιταμίνης Κ (1μg/ml) Ιδανικά υλικά τα λιγότερο εκτεθειμένα σε Ο 2 φρέσκα, προανηγμένα

17 ΜΗ ΕΚΛΕΚΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ BHI blood agar Brucella blood agar CDC anaerobe agar Columbia blood agar TSA blood agar Schaedler blood agar

18 ΕΚΛΕΚΤΙΚΑ - ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΤΙΚΑ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ A. KVLB ή LKV (Kanamycin-Vancomycin-Laked- Blood agar) B. PEA (Phenylethyl alcohol agar) C. BBE (Bacteroides bile esculin agar) D. CCFA (Cycloserine-cefoxitin fructose agar)* E. EYA (Egg yolk agar)* * Σε επιλεγμένες περιπτώσεις

19 ΕΜΠΛΟΥΤΙΣΤΙΚΑ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ Ζωμοί: THIO (θειογλυκολικός) Cooked meat-glucose Cooked meat-carbohydrate

20 A. Brucella blood agar Εμπλουτιστικό, μη εκλεκτικό υλικό (πεπτόνες, γλυκόζη, εκχύλισμα μυκήτων, NaCl, αιμίνη 1%, βιταμίνη Κ 1%, L-κυστεϊνη, αίμα προβάτου 5%, άγαρ /L) QC: Clostridium perfrigens ATCC (ανάπτυξη), Bacteroides fragilis ATCC (ανάπτυξη), Fusobacterium nucleatum ATCC (ανάπτυξη) Διάρκεια ζωής: 1 εβδομάδα στους 2-8 C

21 A. Brucella blood agar Αναπτύσσονται: όλα τα κλινικώς σημαντικά αναερόβια

22 Β. KVLB ή LKV (Kanamycin-Vancomycin- Laked-Blood agar) Εκλεκτικό υλικό (πεπτόνες, γλυκόζη, εκχύλισμα μυκήτων, NaCl, αιμίνη 1%, βιταμίνη Κ 1%, L-κυστεϊνη, άγαρ, καναμυκίνη 75mg, βανκομυκίνη 7,5mg, αιμολυμένο αίμα προβάτου /L) QC: Bacteroides fragilis ATCC (ανάπτυξη), Clostridium perfrigens ATCC (όχι ανάπτυξη), Escherichia coli ATCC (όχι ανάπτυξη) Διάρκεια ζωής: 2 εβδομάδες στους 2-8 C

23 Β. KVLB ή LKV (Kanamycin- Vancomycin-Laked-Blood agar) Αναπτύσσονται: Bactreroides fragilis-group Prevotella sp(εμφάνιση χρωστικής) Bilophila wadsworthia βακτήρια ανθεκτικά στην καναμυκίνη και την βανκομυκίνη Αναστέλλονται: τα περισσότερα αερόβια και αναερόβια ευαίσθητα στην καναμυκίνη και την βανκομυκίνη (Porphyromonas sp)

24 C. PEA (Phenylethyl alcohol agar) Εκλεκτικό υλικό (πεπτόνες, γλυκόζη, εκχύλισμα μυκήτων, NaCl, αιμίνη 1%, βιταμίνη Κ 1%, L- κυστεϊνη, άγαρ, αίμα προβάτου, phenylethyl alcohol /L) QC: Bacteroides fragilis ATCC (ανάπτυξη), Proteus mirabilis ATCC (ανάπτυξη και αναστολή ερπυσμού) Escherichia coli ATCC (όχι ανάπτυξη) Διάρκεια ζωής: 2 εβδομάδες στους 2-8 C

25 C. PEA (Phenylethyl alcohol agar) Aναπτύσσονται: τα περισσότερα Gramθετικά και Gram-αρνητικά αναερόβια βακτήρια Aναστέλλονται: -δυνητικά αναερόβια Gram(-) βακτηρίδια (Εντεροβακτηριακά) - ερπυσμός του Proteus και των Clostridium(C. septicum)

26 D. BBE (Bacteroides bile esculin agar) Εκλεκτικό και διαφοροποιητικό υλικό (TSA, χολή βοός 20%, εσκουλίνη, εναμμώνιο κιτρικούχο σίδηρο, διάλυμα αιμίνης, γενταμικίνη 100μg/ml /L) QC: Bacteroides fragilis ATCC (ανάπτυξημαύρες αποικίες), Fusobacterium necrophorum ATCC (όχι ανάπτυξη), Escherichia coli ATCC (όχι ανάπτυξη) Διάρκεια ζωής: 3 μήνες στους 2-8 C

27 D. BBE (Bacteroides bile esculin Aναπτύσσονται: Bacteroides fragilis-group (καφέ-μαύρες αποικίες), Bilophila wadsworthia (διαφανείς με μαύρο κέντρο, «μάτι ψαριού»), μερικά Fusobacterium, ανθεκτικά στη γενταμυκίνη Εντεροβακτηριακά, εντερόκοκκοι, σταφυλόκοκκοι Aναστέλλονται: τα περισσότερα αερόβια και αναερόβια agar)

28 Ε. CCFA (Cycloserine-cefoxitin fructose agar) Εκλεκτικό και διαφοροποιητικό υλικό (πεπτόνες, φωσφορικά άλατα, φρουκτόζη, άγαρ, ουδέτερο ερυθρό, κυκλοσερίνη 500mg, κεφοξιτίνη 16mg /L) QC: Clostridium difficile ATCC 9689 (ανάπτυξη), Bacteroides fragilis ATCC (όχι ανάπτυξη), Escherichia coli ATCC (όχι ανάπτυξη) Διάρκεια ζωής: 8 εβδομάδες στους 2-8 C

29 Ε. CCFA (Cycloserine-cefoxitin Aναπτύσσονται: Clostridium difficile (κίτρινες υαλοειδείς αποικίες με ανώμαλη περιφέρεια), C. innocuum, μύκητες και εντερόκοκκοι fructose agar) Aναστέλλονται: τα περισσότερα αερόβια και αναερόβια

30 F. EYA (Egg yolk agar) Εκλεκτικό και διαφοροποιητικό υλικό (πεπτόνες, φωσφορικά άλατα, NaCl, θειικό μαγνήσιο, γλυκόζη, βιταμίνη Κ, αιμίνη, άγαρ, διάλυμα από κρόκο αυγού /L) QC: Clostridium perfrigens ATCC (θετική λεκιθινάση), Fusobacterium necrophorum ATCC (θετική λιπάση) Bacteroides fragilis ATCC (ανάπτυξη αλλά όχι πρωτεολυτική δράσηαρνητικό control) Διάρκεια ζωής: 1 εβδομάδα στους 2-8 C

31 F. EYA (Egg yolk agar) Aναπτύσσονται: Clostridium sp, Prevotella intermedia/nigrescens, Fusobacterium necrophorum Λεκιθινάση λευκή, αδιαφανής κάτω και γύρω από την αποικία Λιπάση ιριδίζουσα επιφάνεια Πρωτεόλυση διαυγής άλως γύρω από την αποικία

32 Εμπλουτιστικά θρεπτικά υλικά που υποβοηθούν την ανάπτυξη των αναερόβιων Αποτελούν πηγή για ανακαλλιέργειες (όταν τα πρωτοκαλλιεργήματα αποτύχουν) G. ΖΩΜΟΙ (BROTHS) THIO-Cooked meat Βοηθούν στον πολλαπλασιασμό των μικροβίωνότανοαριθμόςτους είναι μικρός ή όταν η ανάπτυξή τους αναστέλλεται Οργανισμοί που αναπτύσσονται: όλοι Οργανισμοί που αναστέλλονται: κανένας

33 Ευχαριστώ πολύ