ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΛΛΥΝΤΙΚΩΝ ΝΑΝΟΓΑΛΑΚΤΩΜΑΤΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΣΤΑΘΕΡΟΠΟΙΗΣΗ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΩΝ ΒΙΤΑΜΙΝΩΝ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Εργαστήριο Φαρμακευτικής Τεχνολογίας ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΛΛΥΝΤΙΚΩΝ ΝΑΝΟΓΑΛΑΚΤΩΜΑΤΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΣΤΑΘΕΡΟΠΟΙΗΣΗ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΩΝ ΒΙΤΑΜΙΝΩΝ ΠΑΠΑΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ ΜΑΡΙΑ ΧΗΜΙΚΟΣ Πάτρα, 216

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Εργαστήριο Φαρμακευτικής Τεχνολογίας ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΛΛΥΝΤΙΚΩΝ ΝΑΝΟΓΑΛΑΚΤΩΜΑΤΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΣΤΑΘΕΡΟΠΟΙΗΣΗ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΩΝ ΒΙΤΑΜΙΝΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΠΑΠΑΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ ΜΑΡΙΑ ΧΗΜΙΚΟΣ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Αυγουστάκης κωνσταντίνος Καθηγητής, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστημίου Πατρών (ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ) Χατζηαντωνίου Σοφία Επίκουρη Καθηγήτρια, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστημίου Πατρών Κλεπετσάνη Παύλος Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιου Πατρών

3 Περιεχόμενα Εισαγωγή... 1 Κεφάλαιο 1: Το δέρμα Ιστολογία του δέρματος Επιδερμίδα Χόριο ή κυρίως δέρμα Υποδόριος Ιστός Φυσιολογικές λειτουργίες του δέρματος Προασπιτική λειτουργία Θερμορυθμιστική λειτουργία Αισθητική λειτουργία Φραγμός δέρματος Απεκκριτική λειτουργία Μεταβολικές λειτουργίες Ανοσοποιητική λειτουργία Χημική σύσταση δέρματος Χημικές ουσίες δέρματος... 9 Κεφάλαιο 2: Αντιοξειδωτικά Ελεύθερες ρίζες Οξειδωτικό stress Σχηματισμός και αντιδράσεις ελευθέρων ριζών Οξείδωση λιπιδίων μέσω ελευθέρων ριζών Μηχανισμός οξείδωσης λιπιδίων Αντιοξειδωτικά και δράση Βιταμίνη Α Χημική δομή βιταμίνης Α Προέλευση βιταμίνης Α Μέθοδοι παρασκευής βιταμίνης Α Δράσεις βιταμίνης Α και δέρμα Τοξικότητα βιταμίνης Α Έλλειψη βιταμίνης Α Βιταμίνη Ε Χημικές δομές βιταμίνης Ε... 2 i

4 2.3.3 Δράσεις βιταμίνης Ε και δέρμα Τοξικότητα βιταμίνης Ε Έλλειψη βιταμίνης Ε Κεφάλαιο 3: Νανοτεχνολογία Ορισμός νανοτεχνολογίας Νανομεταφορείς μεταφοράς και ελεγχόμενης αποδέσμευσης Κεφάλαιο 4: Συστήματα διασποράς Γαλακτώματα Γαλακτωματοποιητές Κατηγορίες γαλακτωματοποιητών Κοσμητολογικές εφαρμογές και ιδιότητες Σταθεροποιητές Μέθοδος παρασκευής γαλακτωμάτων Μηχανισμοί αποσταθεροποίησης γαλακτωμάτων Κρεμοποίηση - Καθίζηση (Creaming) Κροκίδωση (Flocculation) Συνένωση- Συγχώνευση (Coalescence) Αναστροφή φάσεων (Phase inversion) Φυσικοχημικός χαρακτηρισμός γαλακτωμάτων Μέθοδοι ελέγχου τύπου γαλακτώματος Τεχνικές φυσικοχημικού χαρακτηρισμού γαλακτωμάτων και νανογαλακτωμάτων Οπτική μικροσκοπία (Optical microscopy) Στατική σκέδαση φωτός (Static Ligth Scattering, SLS) Δυναμική σκέδαση φωτός (Dynamic Light Scattering, DLS) Ηλεκτροφορητική σκέδαση φωτός (Electrophoretic Light Scattering) Υγρή Χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού (molecular exclusion liquid chromatography) Έλεγχος σταθερότητας αντιοξειδωτικών Φασματοφωτομετρία Υπεριώδους - Ορατού (UV Vis) Νανογαλακτώματα Φυσικές ιδιότητες νανογαλακτωμάτων Σχηματισμός νανογαλακτωμάτων Έλεγχος χαρακτηριστικών των νανοσωματιδίων Εφαρμογές των νανογαλακτωμάτων στα καλλυντικά ii

5 Σκοπός εργασίας Πειραματικο μέρος Υλικά Οργανoλογία Παρασκευή γαλακτωμάτων και νανογαλακτωμάτων Παρασκευή γαλακτωμάτων Παρασκευή νανογαλακτωμάτων Μέθοδοι χαρακτηρισμού γαλακτωμάτων και νανογαλακτωμάτων Οπτική μικροσκοπία Προσδιορισμός μεγέθους σταγονιδίων σε γαλακτώματα Προσδιορισμός μεγέθους σταγονιδίων σε νανογαλακτώματα Προσδιορισμος ζ-δυναμικού σε νανογαλακώματα Προσδιορισμός εγκλωβισμού του β-καροτενίου σε νανογαλακτώματα Μέθοδοι χαρακτηρισμού αντιοξειδωτικών βιταμινών Προσδιορισμός της συγκέντρωσης της οξικής τοκοφερόλης σε γαλακτώματα και νανογαλακτώματα Προσδιορισμός της συγκέντρωσης του β-καροτενίου σε γαλακτώματα και νανογαλακτώματα Μελέτη σταθερότητας γαλακτωμάτων και νανογαλακτωμάτων Μελέτη φυσικής σταθερότητας γαλακτωμάτων και νανογαλακτωμάτων Μελέτη σταθερότητας αντιοξειδωτικών βιταμινών σε γαλακτώματα και νανογαλακτώματα ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Χαρακτηρισμός μεγέθους σωματιδίων Οπτικό μικροσκόπιο Προσδιορισμός μεγέθους σταγονιδίων των γαλακτωμάτων Προσδιορισμός μεγέθους σταγονιδίων και ζ-δυναμικού των νανογαλακτωμάτων Μελέτη φυσικοχημικής σταθερότητας γαλακτωμάτων και νανογαλακτωμάτων Φυγοκέντρηση γαλακτωμάτων Φυγοκέντρηση νανογαλακτωμάτων Επιταχυνόμενη γήρανση γαλακτωμάτων Επιταχυνόμενη γήρανση νανογαλακτωμάτων Αποθήκευση σε διάφορες συνθήκες Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων διεσπαρμένης φάσης γαλακτωμάτων με τον χρόνο αποθήκευσης iii

6 Μεταβολή μεγέθους και ζ-δυναμικού σωματιδίων διεσπαρμένης φάσης των νανογαλακτωμάτων με τον χρόνο αποθήκευσης Εγκλωβισμός β-καροτενίου σε νανογαλακτώματα Φυγοκέντρηση νανογαλακτωμάτων Επιταχυνόμενη γήρανση νανογαλακτωμάτων Αποθήκευση σε διάφορες συνθήκες Μελέτη χημικής σταθερότητας αντιοξειδωτικών βιταμινών σε γαλακτώματα και νανογαλακτώματα Φυγοκέντρηση γαλακτωμάτων Φυγοκέντρηση νανογαλακτωμάτων Επιταχυνόμενη γήρανση γαλακτωμάτων Επιταχυνόμενη γήρανση νανογαλακτωμάτων Αποθήκευση σε διάφορες συνθήκες ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Περαιταίρω μελέτες Βιβλιογραφία Παράρτημα Περίληψη Summary iv

7 Περιεχόμενα Εικόνων Εικόνα 1. Η δομή του δέρματος Εικόνα 2. Οι επιμέρους στιβάδες της επιδερμίδας Εικόνα 3. Η χημική δομή της ρετινόλης Εικόνα 4. Η χημική δομή του β-καροτενίου Εικόνα 5. Η βιοσύνθεση της βιταμίνης Ε και συνθετικά παράγωγα της Εικόνα 7. Κυκλική διάδοση λιποειδικής υπεροξείδωσης Εικόνα 8. Οξειδωαναγωγικό σύστημα ανακύκλωσης της α-τοκοφερόλης Εικόνα 9. Η σχετική αναλογία των νανοσυσκευών με βιολογικές δομές - νανοκλίμακα Εικόνα 1. Σχηματική απεικόνιση των μηχανισμών αποσταθεροποίησης των γαλακτωμάτων Εικόνα 12. Τυπικό διάγραμμα Zimm Εικόνα 13. Εικόνα 13. Διάταξη που χρησιμοποιήθηκε για την στατική σκέδαση του φωτός: 1) Laser, 2) κυψελίδα, 3) γωνιόμετρο, 4) ανιχνευτής, 5) φωτοπολλαπλασιαστής, 6) μετρητής φωτονίων, 7) υπολογιστής και 8) εκτυπωτής.. 42 Εικόνα 14. Σχηματική απεικόνιση της διασποράς των ιόντων του διαλύματος γύρω από ένα φορτισμένο σωματίδιο Εικόνα 15. Σχηματική αναπαράσταση μιας πειραματικής διάταξης μέτρησης του ζ- δυναμικού. Τα σωματίδια κινούνται προς τα αντίθετα φορτισμένα ηλεκτρόδια και με μια δέσμη laser μετράται η ταχύτητά τους Εικόνα 11. Χημικοί τύποι φωσφατιδικού οξέος, φωσφατιδυλοχολίνης και φωσφατιδυλοαιθανολαμίνης Εικόνα 16. Οπτικό Mικροσκόπιο Leica Εικόνα 17. Συσκευή Μastersizer S (Malvern, UK) Εικόνα 17. Συσκευή Μastersizer S (Malvern, UK) Εικόνα 18. Συσκευή Zetasizer Nano-ZS (Malvern, UK) Εικόνα 19. Συσκευή Uv-18 shimadzu spectrophotometer Εικόνα 2. Aπεικόνιση των σωματιδίων της διεσπαρμένης φάσης συμβατικών γαλακτωμάτων. [1: SL γαλάκτωμα με β-καροτένιο, 2: SL γαλάκτωμα με οξική τοκοφερόλη, 3: LL γαλάκτωμα με β- καροτένιο, 4: LL γαλάκτωμα με οξική τοκοφερόλη] Εικόνα 21. Φωτογραφία γαλακτωμάτων αμέσως μετά από την φυγοκέντρηση Εικόνα 22. Φωτογραφία των νανογαλακτωμάτων αμέσως μετά από την φυγοκέντρηση Εικόνα 23. Φωτογραφία γαλακτωμάτων μετά από επιτυχανόμενη γήρανση Εικόνα 24. Φωτογραφία νανογαλακτωμάτων μετά από επιταχυνόμενη γήρανση Εικόνα 25. Φωτογραφία γαλακτωμάτων αμέσως μετά την παρασκευή τους Εικόνα 26. Φωτογραφία γαλακτωμάτων που εμφάνισαν διαχωρισμό φάσεων στους 25 ο C v

8 Εικόνα 27. Φωτογραφία γαλακτωμάτων μετά από 6 ημέρες στους 4ο C. Το (LL) γαλάκτωμα του β-καροτενίου εμφάνισε διαχωρισμό φάσων στις 3 ημέρες στους 4 ο C Εικόνα 28. Φωτογραφίες νανογαλακτώματων αμέσως μετά την παρασκευή τους Εικόνα 29. Φωτογραφίες νανογαλακτωμάτων σε διάστημα 6 ημερών στους 25 ο C.. 99 vi

9 Περιεχόμενα πινάκων Πίνακας 1. Εύρος τιμών ΗLB και αντίστοιχη εφαρμογή γαλακτωματοποιητών. [1]. 31 Πίνακας 2. Δοκιμαστική αναλογία γαλακτώματος με οξική τοκοφερόλη... 6 Πίνακας 3. Συνταγές γαλακτωμάτων που μελετήθηκαν (%w/w) Πίνακας 4. Μέσο μέγεθος σωματιδίων γαλακτωμάτων μετά από μία μέρα παρασκευής Πίνακας 5. Μέσο μέγεθος σωματιδίων και ζ-δυναμικού νανογαλακτωμάτων μετά από μία μέρα παρασκευής Πίνακας 6. Χαρακτηριστικά μεγέθους γαλακτωμάτων μετά από φυγοκέντρηση Πίνακας 7. Χαρακτηριστικά μεγέθους και ζ-δυναμικού νανογαλακτωμάτων μετά από φυγοκέντρηση Πίνακας 8. Επίδραση επιταχυνόμενης γήρανσης στα χαρακτηριστικά μεγέθους των συμβατικών γαλακτωμάτων Πίνακας 9. Επίδραση επιταχυνόμενης γήρανσης στα χαρακτηριστικά μεγέθους και στο ζ-δυναμικό των νανογαλακτωμάτων Πίνακας 1. Σταθερότητα συμβατικών blank γαλακτωμάτων (μεταβολή μεγέθους με τον χρόνο αποθήκευσης σε διαφορετικές θερμοκρασίες) Πίνακας 11. Σταθερότητα συμβατικών γαλακτωμάτων με οξική τοκοφερόλη (μεταβολή μεγέθους με τον χρόνο αποθήκευσης σε διαφορετικές θερμοκρασίες) Πίνακας 12. Σταθερότητα συμβατικών γαλακτωμάτων με β-καροτένιο (μεταβολή μεγέθους με τον χρόνο αποθήκευσης σε διαφορετικές θερμοκρασίες) Πίνακας 13. Σταθερότητα blank νανογαλακτωμάτων (μεταβολή μεγέθους και ζ- δυναμικού σωματιδίων με τον χρόνο αποθήκευσης) Πίνακας 14. Σταθερότητα blank νανογαλακτωμάτων (μεταβολή μεγέθους και ζ- δυναμικού σωματιδίων με τον χρόνο αποθήκευσης) Πίνακας 15. Σταθερότητα νανογαλακτωμάτων οξικής τοκοφερόλης (μεταβολή μεγέθους και ζ-δυναμικού σωματιδίων με τον χρόνο αποθήκευσης) Πίνακας 16. Σταθερότητα νανογαλακτωμάτων με οξική τοκοφερόλη (μεταβολή μεγέθους και ζ-δυναμικού σωματιδίων με τον χρόνο αποθήκευσης) Πίνακας 17. Σταθερότητα νανογαλακτωμάτων με β-καροτένιο (μεταβολή μεγέθους και ζ-δυναμικού σωματιδίων με τον χρόνο αποθήκευσης) Πίνακας 18. Σταθερότητα νανονανογαλακτωμάτων με β-καροτένιο (μεταβολή μεγέθους και ζ-δυναμικού σωματιδίων με τον χρόνο αποθήκευσης) Πίνακας 19. Μέσο ποσοστό εγκλωβισμού β-καροτενίου στα νανογαλακτώματα μετά από μία ημέρα παρασκευής Πίνακας 2. Ποσοστό εγκλωβισμού β-καροτενίου μετά την φυγοκέντρηση νανογαλακτωμάτων Πίνακας 21. Επίδραση της επιταχυνόμενης γήρανσης νανογαλακτωμάτων στο ποσοστό εγκλωβισμού του β-καροτένιου Πίνακας 22. Μεταβολή ποσοστού εγκλωβισμού β καροτενίου σε νανογαλακτώματα με τον χρόνο αποθήκευσης vii

10 Πίνακας 23. Μέσες συγκεντρώσεις αντιοξειδωτικών βιταμινών στα γαλακτώματα και στα νανογαλακτώματα μετά από μία ημέρα παρασκευής Πίνακας 24. Συγκέντρωση βιταμινών στα γαλακτώματα μετά από φυγοκέντριση.. 18 Πίνακας 25. Συγκέντρωση βιταμινών στα νανογαλακτώματα μετά από φυγοκέντριση Πίνακας 26. Επίδραση της επιταχυνόμενης γήρανσης γαλακτωμάτων στην συγκέντρωση των βιταμινών Πίνακας 27. Επίδραση της επιταχυνόμενης γήρανσης νανογαλακτωμάτων στην συγκέντρωση των βιταμινών Πίνακας 28. Μεταβολή συγκέντρωσης της οξικής τοκοφερόλης στα γαλακτώματα με τον χρόνο αποθήκευσης Πίνακας 29. Μεταβολή συγκέντρωσης της οξικής τοκοφερόλης στα νανογαλακτώματα με τον χρόνο αποθήκευσης Πίνακας 3. Μεταβολή συγκέντρωσης του β-καροτενίου στα γαλακτώματα με τον χρόνο αποθήκευσης Πίνακας 31. Μεταβολή συγκέντρωσης του β-καροτενίου στα νανογαλακτώματα με τον χρόνο αποθήκευσης viii

11 Περιεχόμενα διαγραμμάτων Διάγραμμα 1. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων blank (SL και LL) γαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 4 ο C Διάγραμμα 2. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων blank (SL και LL) γαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 25 ο C Διάγραμμα 3. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL και LL) γαλακτωμάτων οξικής τοκοφερόλης με τον χρόνο, στους 4 ο C Διάγραμμα 4. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL και LL) γαλακτωμάτων οξικής τοκοφερόλης με τον χρόνο, στους 25 ο C Διάγραμμα 5. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL και LL) γαλακτωμάτων β καροτενίου με τον χρόνο, στους 4 ο C Διάγραμμα 6. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL και LL) γαλακτωμάτων β καροτενίου με τον χρόνο, στους 25 ο C Διάγραμμα 7. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL) γαλακτωμάτων, blank, οξικής τοκοφερόλης και β-καροτενίου με τον χρόνο, στους 4 ο C Διάγραμμα 8. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL) γαλακτωμάτων, blank, οξικής τοκοφερόλης και β-καροτενίου με τον χρόνο, στους 25 ο C Διάγραμμα 9. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (LL) γαλακτωμάτων, blank, οξικής τοκοφερόλης και β-καροτενίου με τον χρόνο, στους 4 ο C Διάγραμμα 1. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (LL) γαλακτωμάτων, blank, οξικής τοκοφερόλης και β-καροτενίου με τον χρόνο, στους 25 ο C Διάγραμμα 11. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL και LL) blank νανογαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 4 ο C Διάγραμμα 12. Μεταβολή ζ-δυναμικού (SL και LL) blank νανογαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 4 ο C Διάγραμμα 13. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL και LL) blank νανογαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 25 ο C Διάγραμμα 14. Μεταβολή ζ-δυναμικού (SL και LL) blank νανογαλακτωμάτων με τον χρόνο στους, 25 ο C Διάγραμμα 15. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL και LL) νανογαλακτωμάτων οξικής τοκοφερόλης με τον χρόνο, στους 4 ο C Διάγραμμα 16. Μεταβολή ζ-δυναμικού (SL και LL) νανογαλακτωμάτων οξικής τοκοφερόλης με τον χρόνο, στους 4 ο C Διάγραμμα 17. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL και LL) νανογαλακτωμάτων οξικής τοκοφερόλης με τον χρόνο, στους 25 ο C Διάγραμμα 18. Μεταβολή ζ-δυναμικού (SL και LL) νανογαλακτωμάτων οξικής τοκοφερόλης με τον χρόνο, στους 25 ο C Διάγραμμα 19. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL και LL) νανογαλακτωμάτων β- καροτενίου με τον χρόνο, στους 4 ο C Διάγραμμα 2. Μεταβολή ζ-δυναμικού (SL και LL) νανογαλακτωμάτων β- καροτενίου με τον χρόνο, στους 4 ο C Διάγραμμα 21. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL και LL) νανογαλακτωμάτων β- καροτενίου με τον χρόνο, στους 25 ο C ix

12 Διάγραμμα 22. Μεταβολή ζ-δυναμικού (SL και LL) νανογαλακτωμάτων β- καροτενίου με τον χρόνο, στους 25 ο C Διάγραμμα 23. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL) νανογαλακτωμάτων, blank,οξικής τοκοφερόλης και β-καροτενίου με τον χρόνο, στους 4 ο C Διάγραμμα 24. Μεταβολή ζ-δυναμικού (SL) νανογαλακτωμάτων, blank, οξικής τοκοφερόλης και β-καροτενίου με τον χρόνο, στους 4 ο C Διάγραμμα 25. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL) νανογαλακτωμάτων, blank,οξικής τοκοφερόλης και β-καροτενίου με τον χρόνο, στους 25 ο C Διάγραμμα 26. Μεταβολή ζ-δυναμικού (SL) νανογαλακτωμάτων, blank, οξικής τοκοφερόλης και β-καροτενίου με τον χρόνο, στους 25 ο C Διάγραμμα 27. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (LL) νανογαλακτωμάτων, blank,οξικής τοκοφερόλης και β-καροτενίου με τον χρόνο, στους 4 ο C Διάγραμμα 28. Μεταβολή ζ-δυναμικού ( LL) νανογαλακτωμάτων, blank, οξικής τοκοφερόλης και β-καροτενίου με τον χρόνο, στους 4 ο C Διάγραμμα 29. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (LL) νανογαλακτωμάτων, blank,οξικής τοκοφερόλης και β-καροτενίου με τον χρόνο, στους 25 ο C Διάγραμμα 3. Μεταβολή ζ-δυναμικού ( LL) νανογαλακτωμάτων, blank, οξικής τοκοφερόλης και β-καροτενίου στους 25 ο C Διάγραμμα 31. Μεταβολή ποσοστού εγκλωβισμού β-καροτενίου (SL) και (LL) νανογαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 4 ο C Διάγραμμα 32. Μεταβολή ποσοστού εγκλωβισμού β-καροτενίου (SL) και (LL) νανογαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 25 ο C Διάγραμμα 33. Καμπύλη αναφοράς διαλυμάτων γνωστών συγκεντρώσεων οξικής τοκοφερόλης Διάγραμμα 34. Μεταβολή συγκέντρωσης οξικής τοκοφερόλης (SL) γαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 4 ο C και 25 ο C Διάγραμμα 35. Μεταβολή συγκέντρωσης οξικής τοκοφερόλης (SL) νανογαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 4 ο C και 25 ο C Διάγραμμα 36. Μεταβολή συγκέντρωσης οξικής τοκοφερόλης (LL) γαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 4 ο C και 25 ο C Διάγραμμα 37. Μεταβολή συγκέντρωση οξικής τοκοφερόλης (LL) νανογαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 4 ο C και 25 ο C Διάγραμμα 38. Μεταβολή συγκέντρωσης οξικής τοκοφερόλης (SL) γαλακτώματος και (SL) νανογαλακτώματος με τον χρόνο, στους 4 ο C Διάγραμμα 39. Μεταβολή συγκέντρωση οξικής τοκοφερόλης (SL) γαλακτώματος και (SL) νανογαλακτώματος με τον χρόνο, στους 25 οc Διάγραμμα 4. Μεταβολή συγκέντρωσης οξικής τοκοφερόλης (LL) γαλακτώματος και (LL) νάνογαλακτωματος με τον χρόνο, στους 4 ο C Διάγραμμα 41. Μεταβολή συγκέντρωσης οξικής τοκοφερόλης (LL) γαλακτώματος και (LL) νάνογαλακτωματος με τον χρόνο, στους 25 ο C Διάγραμμα 42. Καμπύλη αναφοράς διαλυμάτων γνωστών συγκεντρώσεων β- καροτενίου Διάγραμμα 43. Μεταβολή συγκέντρωσης β-καροτενίου (SL) γαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 4 ο C και 25 ο C x

13 Διάγραμμα 44. Μεταβολή συγκέντρωσης β-καροτενίου (SL) νανογαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 4 ο C και 25 ο C Διάγραμμα 45. Μεταβολή συγκέντρωσης β-καροτενίου (LL) γαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 4 ο C και 25 ο C Διάγραμμα 46. Μεταβολή συγκέντρωσης β-καροτενίου (LL) νανογαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 4 ο C και 25 ο C Διάγραμμα 47. Μεταβολή συγκέντρωσης (SL) γαλακτώματος και (SL) νανογαλακτώματος με τον χρόνο, στους 4 ο C Διάγραμμα 48. Μεταβολή συγκέντρωσης β-καροτενίου (SL) γαλακτώματος και (SL) νανογαλακτώματος με τον χρόνο, στους 25 ο C Διάγραμμα 49. Μεταβολή συγκέντρωσης β-καροτενίου (LL) γαλακτώματος και (LL) νανογαλακτώματος με τον χρόνο, στους 4 ο C Διάγραμμα 5. Μεταβολή συγκέντρωσης β-καροτενίου (LL) γαλακτώματος και (LL) νανογαλακτώματος με τον χρόνο, στους 25 ο C Διάγραμμα 51. Μεταβολή συγκέντρωσης β-καροτενίου (SL) και (LL) νανογαλακτωμάτων με τον χρόνο στους 4 ο C Διάγραμμα 52. Μεταβολή συγκέντρωσης β-καροτενίου (SL) και (LL) νανογαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 25 ο C Διάγραμμα 53. Μεταβολή συγκέντρωσης β-καροτενίου (SL) και (LL) γαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 4 ο C Διάγραμμα 54. Μεταβολή συγκέντρωσης β-καροτενίου (SL) και (LL) γαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 25 ο C xi

14 Συντμήσεις-Ξενόγλωσσοι όροι O/W, oil in water, έλαιο σε νερό. W/O, water in oil, νερό σε έλαιο. W/O/W, water in oil in water, νερό σε έλαιο σε νερό. O/W/O, oil in water in oil, έλαιο σε νερό σε έλαιο. HLB, hydrophilic-lipophilic balance, υδρόφιλη-λιπόφιλη ισορροπία. DLS, dynamic light scattering, δυναμική σκέδαση φωτός. UV, ultraviolet, υπεριώδες. VIS, visible, ορατό NMF, natural moisturizing factors, φυσικοί ενυδατικοί παράγοντες. ELS, electrophilic light scattering, ηλεκτροφορητική σκέδαση φωτός. WFI, water for injection, ενέσιμο ύδωρ. PI, polydispercity index, δείκτης πολυδιασποράς. SLS, static light scattering, στατική σκέδαση φωτός. SL, solid lipids, στερεά τριγλυκερίδια Toc ac, tocopheryl acetate, οξική τοκοφερόλη Βeta car, beta-carotene, β-καροτένιο LL, liguid lipids, υγρά τριγλυκερίδια Blank, φορέας e, emulsion γαλάκτωμα n, nanoemulsion νανογαλάκτωμα U, uniformity PI, polydispersity index W, width (mv) xii

15 Ευχαριστίες Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Φαρμακευτικής Τεχνολογίας του τμήματος της Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στις ''Φαρμακευτικές Επιστήμες και την Τεχνολογία'', με κατεύθυνση «Βιομηχανική Φαρμακευτική-Καλλυντικά» κατά τα έτη Φτάνοντας στο τέλος, αισθάνομαι την ανάγκη να ευχαριστήσω ιδιαίτερα κάποιους ανθρώπους που μου έδωσαν τη δυνατότητα να την ξεκινήσω, με στήριξαν κατά τη διάρκεια της εκπόνησής της και με βοήθησαν να τη φέρω εις πέρας. Θα ήθελα πρωτίστως να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Αυγουστάκη, Καθηγητή του τμήματος Φαρμακευτικής, αρχικά για την ευκαιρία, που μου έδωσε να ενταχθώ στην ερευνητική του ομάδα, για τη βοήθεια και την καθοδήγηση, που μου προσέφερε, καθώς και για την άψογη συνεργασία, που είχαμε. Tην επιβλέπουσα καθηγήτρια κα Σοφία Χατζηαντωνίου, Επίκουρη Καθηγήτρια του τμήματος Φαρμακευτικής, για την σημαντική βοήθειά της σε ερευνητικό και εκπαιδευτικό επίπεδο και για την υποστήριξή και την συμβολή της στην ολοκλήρωση της εργασίας μου. Τον κ. Παύλο Κλεπετσάνη, Επίκουρο Καθηγητή του τμήματος Φαρμακευτικής, για την τεχνική υποστήριξη και τις πολύτιμες συμβουλές του καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών μου. Ακόμα, θα ήθελα να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου της Φαρμακευτικής Τεχνολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, τους αγαπητούς μεταπτυχιακούς φοιτητές, Μύρια Παπαχριστοδούλου, Αθηνά Λιασκώνη, Δήμητρα Βεσκούκη, Κωνσταντίνα Φλέκκα, Χρύσα Χαμαλάκη, τις υποψήφιες διδάκτορες Αγγελική Λιακοπούλου και Ευσταθία Βούλγαρη και την μεταδιδάκτορα Αθηνά Αγγελοπούλου, τόσο για την άψογη συνεργασία μας όσο και για το ευχάριστο κλίμα συνεργασίας. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά μου για την ηθική στήριξη και την κατανόηση, που έδειξαν όλο αυτόν τον καιρό και που με βοήθησαν και εξακολουθούν να με βοηθούν στην προσπάθεια υλοποίησης των στόχων μου. xiii

16 Εισαγωγή Κεφάλαιο 1: Το δέρμα Το δέρμα είναι από τα σπουδαιότερα όργανα του σώματος. Πρόκειται για ένα ιδιαίτερα σύνθετο όργανο το οποίο καλύπτει σχεδόν ολόκληρη την επιφάνεια του σώματος και συνέχεται με τους βλεννογόνους περιγράφοντας έτσι τις οπές του σώματος(στοματική κοιλότητα,πρωκτός κ.λπ). Το βάρος του είναι ίσο με το 15% του συνολικού βάρους του ανθρώπινου σώματος και στον ενήλικα η ελέυθερη επιφάνεια του παρουσιάζει έκταση 1,2-2,3 m2 [1,2] Το δέρμα αντικατοπτρίζει την υγεία των εσωτερικών οργάνων του ανθρώπου και αποτελεί το μέσο επικοινωνίας με το περιβάλλον. Επίσης συμβάλλει στην αντιμετώπιση εξωτερικών παραγόντων όπως η υγρασία, οι επικίνδυνες χημικές ουσίες και η ακτινοβολία [3] 1.1 Ιστολογία του δέρματος Το δέρμα αποτελείται από τρια επιμέρους τμήματα (Εικόνα 1): Α) την επιδερμίδα Β)το χόριο του δέρματος ή δερμίδα που αποτελεί στρώμα συνδετικού ιστού. Γ) το υπόδρμα ή υποδόριο ιστό. Στην επιφάνεια του δέρματος επίσης εντοπίζονται τρίχες,πόροι,δερματικές θηλές, δερματικές ακρολοφίες(γραμμές που υπάρχουν κυρίως στα πέλματα και τις παλάμες των χερίων) και οι γραμμές Langer (που προέρχονται απο τη φορά τάσης του δέρματος λόγω της ελαστικότητας των ινών) [4] Εικόνα 1. Η δομή του δέρματος. [5] 1

17 1.1.1 Επιδερμίδα Η επιδερμίδα χαρακτηρίζεται από πολύστιβο κερατινοποιημένο πλακώδες επιθήλιο. (Εικόνα 2) Η εικόνα που δίνεται απο το μικροσκόπιο είναι αυτη του μωσαικού αποτελούμενο από στιβάδες. [6] Τα κερατινοκύτταρα, παίρνουν συνεχώς μέρος σε μορφολογικές και βιοχημικές μεταβολές που καλούνται κερατινοποίηση. [5] Η επιδερμίδα αποτελείται από συνολικά 5 στιβάδες κερατινοκυττάρων από το χόριο προς τα έξω που είναι: Η βασική ή μητρική στιβάδα (Stratum Basale) Η μαλπιγιανή ή ακανθωτή στιβάδα (Stratum Basale) Η κοκκιώδης ή κοκκώδης στιβάδα (Stratum granulosum) Διαυγής στιβάδα (stratum lucidum) Κεράτινη στοιβάδα (stratum corneum) Εικόνα 2. Οι επιμέρους στιβάδες της επιδερμίδας. [5] Η βασική ή μητρική στιβάδα: αποτελείται από ένα στίχο κυλινδρικών κυττάρων, τα οποία διατάσσονται κάθετα στη βασική μεμβράνη όπωςοι πάσσαλοι σε ένα φράχτη. Τα κύτταρα έχουν υπερχρωματικούς πυρήνες και βασεόφιλο κυτταρόπλασμα και εμφανίζουν μιτώσεις σε ένα ποσοστό 5%. Τα κύτταρα της στιβάδας αυτής πολλαπλασιάζονται συνεχώς και τροφοδοτούν την επιδερμίδα με νέα κύτταρα. Τα θυγατρικά αυτά κύτταρα ανέρχονται προς την επιφάνεια της επιδερμίδας, σχηματίζουν την κερατίνη στιβάδα και τελικώς αποπίπτουν. Η διαδικασία διαφοροποίησης των κυττάρων της βασικής στιβάδας στα κύτταρα της κερατίνης στιβάδας ονομάζεται κερατινοποίηση. Ο χρόνος ζωής ενός κερατινοκυττάραου απο τη στιγμή που θα σχηματιστεί στη βασική στιβάδα μέχρι την απόπτωσή του είναι περίπου 28 ημέρες. 2

18 Η ακανθωτή η μαλπιγιανή στιβάδα: είναι η παχύτερη στιβάδα της επιδερμίδας, αποτελείται απο 4-12 σειρές πολυγωνικών κυττάρων τα οποία, όσο ανεβάινουν προς την επιφάνεια, γίνονται περισσότερο αποπεπλατυσμένα. Το κυτταρόπλασμα τους είναι εξεόφιλο και οι πυρήνες τους χρωματίζονται ασθενέστερα, σε σχέση με τους πυρήνες της βασικής στιβάδας. Τα κύτταρα της στιβάδας αυτή εμφανίζουν ένα εκτεταμένο δίκτυο τονικών ινιδίων και συνδέονται μεταξύ τους στα δεσμοσωμάτια με ισχυρούς δεσμούς. Κατά τη διαδικασία μονιμοποίησης των ιστολογικών τομών του δέρματος, τα κύτταρα συρρικνώνονται και οι περιοχές σύνδεσης των κυττάρων στα δεσμοσωμάτια μοιάζουν με ακάνθες για αυτό η στιβάδα αυτή ονομάζεται ακανθωτή. [7] Κοκκιώδης στιβάδα (Stratum granulosum): (3 5 στίχοι) περιλαμβάνει αποπλατυσμένα πολυγωνικά κύτταρα, των οποίων ο πυρήνας είναι γεμάτος από αδρά βασίφιλα κοκκία που δεν περιβάλλονται από μεμβράνη, τα κοκκία κερατου αλίνης. [2] Η κερατινοποίηση θεωρείται πως αφορά στο συνδυασμό των τονοι νιδίων και των στοιχείων κερατου αλίνης προς σχηματισμό του ώριμου συμπλέγματος κερατίνης. [8] Μια άλλη δομή χαρακτηριστική αυτής της στοιβάδας είναι τα πεταλιώδη κοκκία. Πρόκειται για μικρές δομές, ωοειδείς ή ραβδοειδείς, που περιέχουν δίσκους σχηματιζόμενους από λιπιδική διπλοστοιβάδα, οι οποίοι απελευθερούμενοι στα μεσοκυττάρια διαστήματα δρουν ως φραγμός στη διείσδυση ξένων ουσιών και προσφέρουν στο δέρμα ένα πολύ σημαντικό στεγανοποιητικό αποτέλεσμα. Ο σχηματισμός αυτού του φραγμού, ο οποίος πρωτοεμφανίστηκε στα ερπετά, ήταν ένα από τα σημαντικά γεγονότα της εξέλιξης που επέτρεψαν την ανάπτυξη της ζωής στη γη. [2] Διαυγής στιβάδα: εντοπίζεται στο παχύ δέρμα στις παλάμες και στα πέλματα. Είναι λεπτή διαφανής στιβάδα από πεπλατυσμένα κύτταρα. Οι πυρήνες και τα οργανίδια των κυττάρων δεν είναι σαφή. Το κυτταρόπλασμα αποτελειται από ελαιοειδίνη πρόδρομος της κεράτινης. [9] Κεράτινη στοιβάδα (stratum corneum): Η τελική εξωτερική στιβάδα, τέλος, είναι η κεράτινη στοιβάδα η οποία αποτελείται πλέον από επιπεδωμένα, απύρηνα κύτταρα (πετάλια), με κεραμωτή αλληλουχία. Τα κύτταρα της κεράτινης στιβάδας, συνενώνονται σταθερά μεταξύ τους και δημιουργούν φραγμό προς το περιβάλλον και προσδίδουν στο δέρμα μία σημαντική ιδιότητα, την αδιαπερατότητα. Το SC ή κεράτινη στοιβάδα αποτελείται από κερατινοκύτταρα ενσωματωμένα σε ένα στρώμα λιπιδικών διπλοστοιβάδων, που σχηματίζουν 3

19 αλληλο- επικαλυπτώμενα στρώματα. Υπάρχουν περίπου 2 στρώματα κυττάρων στο SC, κάθε ένα από τα οποία έχει περίπου,5 μm πάχος. Τα κερατινοκύτταρα αλλάζουν ως προς τη δομή, τη σύσταση και τη λειτουργία, κατά τη διάρκεια της μετακίνησής τους προς την εξωτερική επιφάνεια του δέρματος. Η κεράτινη στοιβάδα θεωρείται συνήθως ως ένας «τοίχος με τούβλα», με τα πλήρως διαφοροποιημένα κερατινοκύτταρα να αποτελούν τα «τούβλα», ενσωματωμένα στη «λάσπη» που σχηματίζουν τα διακυτταρικά λιπίδια. Τα τελευταία, σε αντίθεση σχεδόν με όλες τις άλλες βιομεμβράνες, δεν περιέχουν φωσφολιπίδια, αλλά ένα ισομοριακό σχεδόν μείγμα κεραμιδίων, χοληστερόλης και ελεύθερων λιπαρών οξέων. Αυτά τα μη πολικά και αρκετά άκαμπτα συστατικά του «τσιμέντου» του SC, παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στη λειτουργία του φραγμού. Το ενδιάμεσο SC έχει τη μεγαλύτερη συγκέντρωση αμινοξέων και ακολούθως είναι ικανό να δεσμεύει νερό με μεγαλύτερη ικανότητα απ ότι τα κυτταρικά στρώματα του κατώτερου ή ανώτερου SC. Το κατώτερο SC έχει τη χαμηλότερη ικανότητα δέσμευσης νερού, αλλά την υψηλότερη περιεκτικότητα σε νερό απ όλες τις περιοχές του SC. Συνοπτικά, κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης, τα κερατινοκύτταρα αλλάζουν σε μέγεθος (γίνονται πεπλατυσμένα), αυξάνουν σε διάμετρο (από 6μm γίνονται μm στην εξωτερική στοιβάδα), χάνουν οργανίδια, σχηματίζουν ινώδης πρωτεϊ νες, αφυδατώνονται και αποκτούν αρκετά πυκνές κυτταρικές μεμβράνες. [1] Η επιδερμίδα αποτελείται από 3 ακόμα είδη κυττάρων σε μικρότερη αναλογία: Τα μελανινοκύτταρα ή μελανοκύτταρα Τα κύτταρα Langerhans Τα κύτταρα του Merkel. Τα μελανοκύτταρα Τα Μελανοκύτταρα Τα μελανοκύτταρα βρίσκονται μεταξύ και κάτω από τα κύτταρα της βασικής στιβάδας και ειναι υπεύθυνα για την παραγωγή τησ μελανίνης. Η ποσοτική τους σχέση με τα κύτταρα της βασικής στιβάδας ειναι 1:5. Τα μελανοκύτταρα είναι κύτταρα νευρογενούς προέλευσης και φέρουν δενδρίτες που διακλαδίζονται μεταξύ των επιθηλιακών κυττάρων. Οι δενδρίτες είναιι γεμάτοι από μελανοσώματα(κοκκία που περιέχουν μελανίνη προερχόμενη από τη διαδικασία 4

20 της μελανογένεσης), ο αριθμός των μελανοκυττάρων είναι ο ίδιος σε όλες τις φυλές, διαφέρουν όμως στον αριθμό και το μέγεθος των μελανοσωμάτων. Τα μελανοσώματα που βρίσκονται στους δενδρίτες των μελανοκυττάρων, φαγοκυτταρώνονται από τα επιθηλιακά κύτταρα και περιβάλλουν τον πυρήνα τους, προστατεύοντας τα έτσι από την υπεριώδη ακτινοβολία. Κάθε μελανοκύτταρο, όπως φαίνεται και από την αναλογία τους ως προς τα επιθηλιακά κύτταρα, τροφοδοτεί αρκετά επιθηλιακά κύτταρα με μελανοσώματα. [11] Τα κύτταρα του Langerhans Τα κύτταρα του Langerhans είναι δενδριτικά κύτταρα που βρίσκονται πάνω από τη βασική στιβάδα και μετά την ενηλικίωση αποτελούν το 3-8% του επιδερμικού πληθυσμού κυττάρων. Τα κύτταρα αυτά συμμετέχουν στην ανοσολογική λειτουργία και είναι υπεύθυνα για την αναγνώριση και παρουσίαση των αλλεργιογόνων ςτα λεμφοκύτταρα. Τα κύτταρα του Langerhans προέρχονται από το μυελό των οστών και μεταναστεύουν στην επιδερμίδα μας κατά τη 12-14βδομάδα της κύησης. [12] Τα κύτταρα Merkel Τα κύτταρα του Merkel είναι νευροενδοκρινικά κύτταρα προέρχονται από την νευρική ακρολοφία, τα οποία αποτελούν το περιφερικότερο άκρο του νευρικού συστήματος και παράγουν ορμόνες. [13] Επίσης είναι υπεύθυνα για την αισθητική λειτουργία του δέρματος και είναι άφθονα σε περιοχές όπου δεν παρατηρείται τριχοφυϊ α. [12] Χόριο ή κυρίως δέρμα Το χόριο χωρίζεται από την επιδερμίδα με την βασική μεμβράνη και διακρίνεται σε δύο μοίρες, την θηλώδη και την δικτυωτή και περιλαμβάνει κυτταρικά στοιχεία και ίνες του συνδετικου ιστού. Το υποθηλώδες αγγειακό δίκτυο συνιστά το φυσικό όριο μεταξύ της θηλώδους και της δικτυωτής μοίρας. Η θηλώδης μοίρα του χορίου διαφέρει από την δικτυωτή ως προς την μορφολογία και την κατανομή στον χώρο του αγγειακού και του νευρικού δικτύου, την πυκνότητα των κυττάρων και ως προς την μορφολογία και την οργάνωση των ινών του συνδετικού ιστού. [13] 5

21 Το χόριο συνδέεται με την επιδερμίδα μέσω καταδύσεων της επιδερμίδας και αντίστοιχες αναδύσεις του χορίου οι οποίες ονομάζονται θήλες. Η βασική μεμβράνη, η μεμβράνη δηλαδή που χωρίζει το χόριο από την επιδερμίδα αποτελείται από δύο πέταλα διακριτά από το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Τα πέταλα αυτά είναι το διαυγές πέταλο (Lamina Lucida) που έρχεται σε επαφή με τη βασική στιβάδα και το πυκνό πέταλο (Lamina Densa) το οποίο έρχεται σε επαφή με το χόριο. Το πυκνό πέταλο είναι πλούσιο σε ινίδια κολλαγόνου (achoring fibrils) τα οποία δένουν την επιδερμίδα με το χόριο. Η ένωση αυτή εξαςφαλίζει μηχανική υποστήριξη της επιδερμίδας και λειτουργεί και ωςημιδιαπερατό φίλτρο το οποίο ρυθμίζει τη δίοδο των ουσίων από την επιδερμίδα στο χόριο και αντίστροφα. [11] Στο χόριο επίσης ανευρίσκονται : ρίζες των τριχών, αδένες, λείες μυι κές ίνες, αγγεία με αίμα ή λέμφο και νεύρα. [9] Και οι δύο στιβάδες του χορίου αποτελούνται από συνδετικό ιστό, ο οποίος απαρτίζεται από: α) τη μεσοκυττάρια ουσία, δηλαδή : ίνες-κολλαγόνες, ελαστικές, δικτυωτές βασική ή θεμελιακή ουσία. [6] β) τα κύτταρα του συνδετικού ιστού, δηλαδή: o Ινοβλάστες (συνδετικά κύτταρα), o Ιστιοκύτταρα. o Πλασμοκύτταρα. o Πολυμορφοπύρηνα (Ηωσινόφιλα και Ουδετερόφιλα) o Σιτευτικά κύτταρα (Μαστοκύτταρα). [4] Υποδόριος Ιστός Ο υποδόριος ιστός (γνωστός και ως επιπολής περιτονία - superficial fascia) συνιστά την εν τω βάθει συνέχεια του χορίου, αποτελείται από χαλαρό συνδετικό ιστό ο οποίος στερεώνει το δέρμα πάνω στα υποκείμενα όργανα και περιέχει λιποκύτταρα σε ποικίλους αριθμούς ανάλογα με την περιοχή του σώματος και με μέγεθος ανάλογο με τη θρεπτική κατάσταση του ατόμου. [2] Η σύνθεση του υποδορίου ιστού επιτρέπει στο δέρμα να έχει κινητικότητα και να διολισθαίνει πάνω στα υποκείμενα όργανα ενώ ο λιπώδης ιστός που περιέχει συμβάλλει στη 6

22 θερμομόνωση του οργανισμού, παρέχει μηχανική προστασία και λειτουργεί ως αποθήκη ενέργειας. [14] 1.2 Φυσιολογικές λειτουργίες του δέρματος Προασπιτική λειτουργία Το δέρμα λειτουργεί ασκεί προστασία σε: μηχανικές κακώσεις, χημικές και θερμικές επιδράσεις, ηλιακή ακτινοβολία, μικροβιακές και παρασιτικές προσβολές. [15] Θερμορυθμιστική λειτουργία Για την διατήρηση της θερμοκρασίας σε σταθερές τιμές το δέρμα έχει σημαντική λειτουργία. Αυτό μέσω της παραγωγής και της εξάτμισης του ιδρώτα και της διαστολής και της συστολή των αγγείων καταφέρνει παρά τις συνεχείς μεταβολές του περιβάλλοντος να εξισορροπεί τη θερμοκρασία. [16] Αισθητική λειτουργία Το δέρμα εξασφαλίζει τις παρακάτω αισθήσεις: Η αίσθηση της αφής και της πίεσης. Η αίσθηση του θερμού και του ψυχρού. Η αίσθηση του πόνου. Κνησμός. [16] Φραγμός δέρματος Το δέρμα αποτελεί τον φραγμό για την εισβολή και την έξοδο διαφόρων ουσιών. Η κεράτινη στιβάδα αποτελεί τον πρώτο φραγμό που συναντάει μία ουσία. Αν η ουσία εισβάλει στην κεράτινη στιβάδα τότε η απορρόφηση της από τις υπολοιπες στιβάδες είναι πολύ πιο εύκολη. Στην περίπτωση της καταστροφή της κεράτινης στιβάδας η διαπερατότητας της αυξάνεται. [3] 7

23 Οι ουσίες που μπορούν να απορροφηθούν δια μέσου του δέρματος είναι: μικρές ποσότητες οξυγόνου οι υδατοδιαλυτές ουσίες και ειδικά το νερό απορροφούνται ελάχιστα καθώς τις εμποδίζει το σμήγμα της επιφάνειας της κεράτινης στιβάδας. Απορροφώνται όμως λίγο περισσότερο από τους τριχοσμηγματικούς θύλακες. οι λιποδιαλυτές ουσίες απορροφούνται ευκολότερα μέσω των μεμβρανών των κυττάρων της επιδερμίδας. [12] Απεκκριτική λειτουργία Το δέρμα έχει την ικανότητα μέσω των ιδρωτοποιών και σμηγματογόνων αδένων να αποβάλλει τον ιδρώτα και το σμήγμα. Ειδικότερα με τον ιδρώτα αποβάλλονται μερικές από τις παρακάτω ουσίες όπως άλατα,ουρία,ουρικό οξύ,κρετατινίνη και τοξικές ουσίες. Η έκκριση του σμήγματος περιλαμβάνει λιπαρά οξέα και λιποειδή, βιταμίνη Α, καροτίνη και προβιταμίνη D και συμμετέχει στην δημιουργία προστατευτικού λιπαρού υμένα με τον οποίο επιτυγχάνεται η φυσιολογική λιπαρότητα της επιδερμίδα και των τριχών. [11] Μεταβολικές λειτουργίες Στο δέρμα πραγματοποιούνται μεταβολικές λειτουργίες. Αυτές έχουν σχέση με τα λευκώματα, τους υδατάνθρακες, τα λίπη, τις βιταμίνες, τους ηλεκτρολύτες και το νερό. Τα ένζυμα, οι βιταμίνες και τα μέταλλα συμμετέχουν στην ολοκλήρωση της μεταβολικής λειτουργίας του δέρματος. [12] Ανοσοποιητική λειτουργία Το δέρμα παίρνει μέρος στις ανοσοποιητικές λειτουργίες του οργανισμού με ποικίλους τρόπους. Εξαιτίας του μεγάλου μεγέθους του, το δέρμα διακατέχειται από έναν μεγάλο αριθμό λεμφοκυττάρων και κυττάρων που παρουσιάζουν αντιγόνα (κύτταρα Langerhans) και λόγω της θέσης του είναι σε στενή επαφή με πολλά αντιγονικά μόρια. 8

24 Για την παραγωγή αντισωμάτων συμμετέχουν τα λεμφοκύτταρα και τα πλασμοκύτταρα του δέρματος. Από τα λεμφοκύτταρα σχηματίζονται τα αντισώματα κατά το μηχανισμό της κυτταρικής ανοσίας. Από τα πλασμοκύτταρα σχηματίζονται οι ανοσοσφαιρίνες κατά το μηχανισμό της χημικής ανοσίας. [17] 1.3 Χημική σύσταση δέρματος Χημικές ουσίες δέρματος Εκτός από το Νερό, οι σπουδαιότερες ουσίες που περιέχονται στο δέρμα είναι: -Υδατάνθρακες Οι υδατάνθρακες απαντώνται υπό μορφή γλυκόζης, γλυκογόνου και σύνθετων γλυκιδίων. Το γλυκογόνο παίρνει μέρος στην κερατινιποίηση. -Λίπη Τα λίπη βρίσκονται μέσα ή μεταξύ των κυττάρων. Η χοληστερόλη και τα φωσφολιπίδια έχουν βιολογική σημασία καθώς αποτελούν συστατικά των πλασματικών μεμβρανών των ζωικών κυττάρων. -Πρωτεϊ νες Οι πρωτεϊ νες βρίσκονται τόσο ενδοκυτταρικά όσο και εξωκυτταρικά. Οι Πιο σημαντικές πρωτεϊ νες που βρίσκονται στο δέρμα είναι οι δομικές πρωτεϊ νες. Αυτές συμβάλλουν στην αρχιτεκτονική ακεραιότητα της δομής που εντοπίζονται. Αποτελούν ινώδη μόρια και σε αυτές συμπεριλαμβάνονται οι εξής δομικές πρωτεϊ νες των μεμβρανών: το κολλαγόνο, η ελαστίνη και οι κερατίνες των τριχών και των νυχιών. Κολλαγόνο Το κολλαγόνο αποτελεί ένα σύνολο δομικών πρωτει νών οι οποίες εντοπίζονται σε εξωκυττάριους χώρους. Ένα από τα αμινοξέα που απαντάται πάντα στα κολλαγόνα είναι η γλυκίνη. Εκτός από την γλυκίνη συχνά βρίσκονται η προλίνη η αλανίνη και σε ελάχιστες ποσότητες η τυροσύνη. Η κυστείνη και η τρυπτοφάνη δεν εντοπίζονται καθόλου. Το κολλαγόνο τύπου Ι, είναι το πιο άφθονο στη φύση. Αυτό έχει τη δομή ινωδών μορφωμάτων τα οποία στηρίζουν το δέρμα. 9

25 Ελαστίνη Η ελαστίνη είναι η βασική ουσία στις ελαστικές ίνες του χορίου και αποτελεί την πιο σημαντική δομική πρωτεινη μετά το κολλαγόνο. Κερατίνες Οι κερατίνες βρίσκονται στα κεράτινα σημεία του δέρματος όπως οι τρίχες και τα νύχια και στην κεράτινη στιβάδα του δέρματος. Είναι πρωτείνες με ινώδη μορφή με μεγάλη περιεκτικότητα σε κυστείνη και με μικρή σε μεθειονίνη, ιστιδίνη και τρυπτοφάνη. επίσης πρωτεϊ νες του δέρματος αποτελούν οι: Μελανίνη Η μελανίνη παράγεται από την τυροσίνη με την βοήθεια του ενζύμου τυροσινάση και είναι το χρωμοφόρο συστατικό του δέρματος και των τριχών. Δικτύνη Η δικτύνη βρίσκεται στις δικτυωτές ίνες του χορίου. Ηπαρίνη Η ηπαρίνη βρίσκεται στα κοκκία των σιτευτικών κυττάρων τα οποία υπάρχουν κατά μήκος των μικρών αγγείων. Κάποια ακόμα στοιχεία που εντοπίζονται στο δέρμα είναι: Θείο Το θείο που βρίσκεται σε μεγάλο ποσά στην κυστεϊ νη και την μεθειονίνη και συμβάλλει στην κερατινοποίηση. Ασβέστιο Το ασβέστιο ρυθμίζει την λειτουργία πολλών ενζύμων τα οποία συμμετέχουν σε πολλές λειτουργίες, όπως η διάσπαση του γλυκογόνου. Ηλεκτρολύτες Οι ηλεκτρολύτες εμφανίζονται υπό μορφή χλωριούχων αλάτων. Εξωκυττάρια βρίσκεται το χλωριούχο νάτριο ενώ ενδοκυττάρια το χλωριούχο κάλιο και το χλωριούχο μαγνήσιο. Στην περίπτωση των φλεγμονών σημείωνεται αύξηση της ποσότητας του χλωριούχο νατρίου ενώ μείωνεται το χλωριούχο κάλιο Καροτένιο (προβιταμίνη Α) Το καροτένιο βρίσκεται στο λίπος της υποδερμίδας. [16] 1

26 Κεφάλαιο 2: Αντιοξειδωτικά 2.1 Ελεύθερες ρίζες Ο όρος ελεύθερη ρίζα περιλαμβάνει ένα άτομο ή σύνολο ατόμων με ένα ή περισσότερα αζευγάρωτα ηλεκτρόνια στην εξωτερική τροχιά τους. Οι βιολογικά ελεύθερες ρίζες είναι το οξυγόνο, τον άνθρακα, το άζωτο και το χλώριο στο μόριό τους. Τα σημεία παραγωγής ριζών μέσα στο κύτταρο είναι: η κυτταρική μεμβράνη, τα μιτοχόνδρια, τα υπεροξεισωμάτια, το ενδοπλασματικό δίκτυο και το κυτταρόπλασμα. Η συνεχής αυτή παραγωγή των ελευθέρων ριζών βρίσκεται, υπό φυσιολογικές συνθήκες, κάτω από έλεγχο από το αντιοξειδωτικό αμυντικό σύστημα του οργανισμού. [18] Οξειδωτικό stress Ως οξειδωτικό stress ορίζεται το χημικό stress που είναι αποτελέσμα είτε υπερβολικής παραγωγή ελευθέρων ριζών είτε αδυναμίας του αντιοξειδωτικού συστήματος να ανταποκριθεί σωστά. Ο πνεύμονας αποτελεί το κύριο όργανο που προσβάλλεται από το οξειδωτικό stress λόγω της άμεσης έκθεσής του σε υψηλές πιέσεις οξυγόνου. Μεγάλος αριθμός πνευμονικών παθήσεων συνδέεται με τις ελεύθερες ρίζες, όπως οι αποφρακτικές παθήσεις, οι διάμεσες πνευμονοπάθειες, η σαρκοείδωση και άλλες κοκκιωματώδεις νόσοι, η αμιάντωση και ο καρκίνος του πνεύμονα. Για την τελευταία νόσο, έχει αποδειχθεί ότι οι ενεργείς ρίζες του οξυγόνου συνδέονται τόσο με την καρκινογένεση όσο και με την ανάπτυξη του καρκίνου. [18] Σχηματισμός και αντιδράσεις ελευθέρων ριζών. Η δραστικότητα των ελευθέρων ριζών καθορίζεται από ποικίλους παράγοντες όπως τις υπόλοιπες ρίζες που υπάρχουν στο περιβάλλον, καθώς και από τη φύση του εκάστοτε περιβάλλοντος. Οι ελεύθερες ρίζες είναι ικανές να σχηματιστούν με τους παρακάτω τρόπους: 1. Απόσπαση ηλεκτρονίου από μόρια ή άτομα: Χ e - + X + 2. Λήψη ενός ηλεκτρονίου από μόρια ή άτομα: Y + e - Y - 3. Ομολυτική σχάση ομοιοπολικού δεσμού: Α:Β Α + Β 11

27 Οι αντιδράσεις που οδηγούν στον σχηματισμό της δραστικής ελεύθερης ρίζας υδροξυλίου είναι: 1. Αντίδραση Fenton: Fe(II) + H2O2 Fe(III) + OH + OH - 2. Αντίδραση Haber-Weiss: O2 - + H2O2 O2 + OH + OH - Το O2 - είναι ικανό να ανάγει τον τρισθενή σίδηρο σε δισθενή με αποτέλεσμα να εξελίσσεται η αντίδραση Fenton. Fe(III) + O2 - O2 + Fe(II) Οι ελεύθερες ρίζες αντιδρούν ως εξής: 1. Προσθετικώς, όταν η ελεύθερη ρίζα αντιδρά με ένα μόριο ή άτομο (π.χ. προσθήκη της ρίζας ΟΗ στη βάση γουανίνη του DNA): Χ +Υ [Χ-Υ ] 2. Αναγωγικώς, όταν η ελεύθερη ρίζα, δίνει το ασύζευκτό ηλεκτρόνιο της σε ένα μόριο ή άτομο: Χ +Υ Χ + Y - 3. Οξειδωτικώς, όταν η ελεύθερη ρίζα δέχεται ένα ηλεκτρόνιο από ένα μόριο ή άτομο : X + Y X - + Y + 4. Αφαιρετικώς, όταν η ελεύθερη ρίζα δεσμεύει ένα άτομο υδρογόνου από μία οργανική ένωση. Η αντίδραση των πλευρικών αλυσίδων λιπαρών οξέων από την ελεύθερη ρίζα υδροξυλίου αποτελεί παράδειγμα. Με αυτό τον τρόπο ξεκινάει μία σειρά αντιδράσεων της υπεροξείδωσης των λιπιδίων. [19] C H + OH C + H2O Οξείδωση λιπιδίων μέσω ελευθέρων ριζών Η οξείδωση των λιπιδίων περιλαμβάνει την αντίδραση των λιπιδίων με το οξυγόνο, με αποτέλεσμα την αποδόμησή τους και ως συνέπεια την ποιοτική υποβάθμιση. Μία σειρά αλυσιδωτών αντιδράσεων ελευθέρων ριζών παίρνουν μέρος. Η θερμική ενέργεια, η κατάλυση από μέταλλα ή ενζυμικά συστήματα ή ρίζες οξυγόνου επηρεάζουν τις αντιδράσεις αυτές. Τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα υφίστανται αυτοοξείδωση με αποτέλεσμα την παραγωγή ελευθέρων ριζών μέσω μιας αντίδρασης που καταλύεται από θερμότητα, φως, ίχνη μετάλλων ή ένζυμα. Οι ελεύθερες ρίζες που δημιουργούνται συμβάλλουν στην διατήρηση της αυτοοξείδωσης. Ο λόγος είναι ότι αντιδρούν με οξυγόνο και σχηματίζουν υδρου περοξείδια, τα οποία καταλύουν αντιδράσεις προς παραγωγή νέων 12

28 ελευθέρων ριζών. Η αντίδραση λαμβάνει τέλος με τη παραγωγή σταθερών ενώσεων μέσω διμερισμού των ελευθέρων ριζών. [2] Μηχανισμός οξείδωσης λιπιδίων Η οξείδωση των λιπιδίων αποτελεί αλυσιδωτή αντίδραση ελευθέρων ριζών μεταξύ ακόρεστων λιπών και οξυγόνου. Ο μηχανισμός της οξείδωσης των λιπιδίων χαρακτηρίζεται από τρία στάδια: Α) Εναρξη και σχηματισμός των ελευθέρων ριζών. Β)Διάδοση με τις αλυσιδωτές αντιδράσεις των ελευθέρων ριζών. Καινούριες ελεύθερες ρίζες σχηματίζονται από την αντίδραση των ελευθέρων ριζών με τα μη ριζικά μόρια. Οι αντιδράσεις των ελευθέρων ριζών είναι αλυσιδωτές με αποτέλεσμα να δημιουργούνται νέα άτομα ή ενώσεις με ασύζευκτα ηλεκτρόνια. Γ)Τερματισμός και σχηματισμός μη ριζικών προι όντων. Η αντίδραση λαμβάνει τέλος όταν όλες οι ελεύθερες ρίζες αντιδράσουν προς προι όντα που δεν αποτελούν νέες ελεύθερες ρίζες. 7 Το σχήμα για το μηχανισμό των ελευθέρων ριζών περιγράφεται με τις παρακάτω αντιδράσεις. [21] Έναρξη: In*+ LH InH + L* In*: (εκκινητής, π.χ. Ο2) L* : (αλκυλο-ρίζα) Διάδοση: L*+ O2 LOO* LOO*+ LH LOOH + L* LOO* : (περοξυλική ρίζα) LOOH : (υδρου περοξείδιο λιπιδίου) Τερματισμός: LOO*+ LOO* LOOL + O2 L*+ LOO* LOOL L*+ L* LL Στάδιο έναρξης Ένας εκκινητής (In*) αφαιρεί ένα υδρογόνο από το λιπαρό οξύ προς σχηματισμό μίας ρίζας οξέος (αλκυλο-ρίζα L*). Στη συνέχεια, το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο οδηγείται πάνω στο διπλό δεσμό με αποτέλεσμα την μετατόπιση του τελευταίου. Όσο μεγαλύτερη η ακορεστότητα τόσο ευκολότερα σχηματίζονται οι ρίζες αλκυλίου σε λιπαρά οξέα. 13

29 Στάδιο διάδοσης Ένα μόριο οξυγόνου προστίθεται στην αλκυλιο-ρίζα. Αποτέλεσμα αυτής της αντίδρασης είναι η παραγαγωγή της περοξυλικής ρίζας (LOO*) με υψηλότερη ενέργεια από το αλκύλιο. Αυτή έχει την ικανότητα αφαίρεσης υδρογόνου από διαφορετικό αυτή την φορά ακόρεστο λιπαρό οξύ και παραγωγής ενός υδρου περοξείδιου λιπιδίου (LOOH) και μίας καινούριας ρίζας αλκυλίου. Τερματισμός Αντίδραση των δύο ελεύθερων ριζών προς σχηματισμό μη ριζικών ειδών. [21] Αντιοξειδωτικά και δράση Τα αντιοξειδωτικά είναι χημικές ουσίες που αλληλεπιδρούν και εξουδετερώνουν τις ελεύθερες ρίζες εμποδίζοντας να δράσουν. Το σώμα παράγει κάποια από τα αντιοξειδωτικά ώστε να εξουδετερώσουν τις ελεύθερες ρίζες. [21,22] Διάφορα αντιοξειδωτικά υπάρχουν σε μεγάλη περιοχή συγκεντρώσεων στα σωματικά υγρά και τους ιστούς, με κάποια όπως η γλουταθειόνη να υπάρχει κυρίως εντός των κυττάρων, ενώ άλλα όπως το ουρικό οξύ είναι πιο ομοιόμορφα κατανεμημένα. [24] Ωστόσο το σώμα βασίζεται σε εξωγενείς παράγοντες για να ληφθεί το υπόλοιπο των αντιοξειδωτικών που χρειάζεται. Αυτά τα εξωγενή αντιοξειδωτικά ονομάζονται διατητικά αντιοξειδωτικά. [22,23] Παραδείγματα διαιτητικών αντιοξειδωτικών είναι το β καροτένιο, το λυκοπένιο οι βιταμίνες Α, C και Ε(α-τοκοφερόλη). [25] Eνώ ανόργανα στοιχεία, όπως ο ψευδάργυρος ή το σελήνιο, αποτελούν συστατικά-κλειδιά των αντιοξειδωτικών ενζύμων του σώματος. [26,27] Τα αντιοξειδωτικά ταξινομούνται σε δύο ευρεί κατηγορίες, ανάλογα με το αν είναι διαλυτά στο νερό(υδρόφιλα) ή στα λιπίδα (λιπόφιλα). Τα υδατοδιαλυτά αντιοξειδωτικά αντιδρούν με οξειδωτικά στο κυτταρόπλασμα και στο πλάσμα του αίματος, ενώ τα λιποδιαλυτά προστατεύουν τις κυτταρικές μεμβράνες από την υπεροξείδωση των λιπιδίων. [28] Η παραγωγή συμπλόκων μετάλλων με τα αντιοξειδωτικά, εμποδίζει την δράση των πρώτων ως υποκινητών της αντίδρασης οξείδωσης. Επίσης το στάδιο της διάδοση της αλυσιδωτής αντίδρασης της οξείδωσης μειώνεται με τη προσφορά ενός ατόμου υδρογόνου από τα αντιοξειδωτικά. [29] 14

30 Η αντίδραση ενός αντιοξειδωτικού (ΑΗ) μ' ένα υπόστρωμα ελεύθερης ρίζας R, περιγράφεται από τις αντιδράσεις : α) R. + ΑΗ RH + Α. β) RO. + ΑΗ ROH +Α. γ) ROO. + ΑΗ ROOH + Α. [3] 2.2 Βιταμίνη Α Χημική δομή βιταμίνης Α Η ρετινόλη (Εικόνα 3), είναι η ενεργός μορφή της βιταμίνης Α με μοριακό τύπο C2H3O. Πρακτικά είναι αδιάλυτη στο νερό ή τη γλυκερόλη, ενώ είναι διαλυτή σε οργανικούς διαλύτες, όπως καθαρή αλκοόλη, μεθανόλη, χλωροφόρμιο, αιθέρας, σε λίπη και έλαια. [31] Τα διαλύματα ελαίου της ρετινόλης είναι αρκετά σταθερά, όμως το υπεριώδες φως την αδρανοποιεί. Δεν χαρακτηρίζεται θερμοευαίσθητη, αλλά οξειδώνεται εύκολα και είναι λιγότερο σταθερή σε όξινο από ότι σε αλκαλικό περιβάλλον. [32] Εικόνα 3. Η χημική δομή της ρετινόλης. [33] Προέλευση βιταμίνης Α Ουσίες που είναι απαραίτητες για την σύνθεση της βιταμίνης Α είναι τα καροτενοειδή και συγκεκριμένα το β-καροτένιο (Εικόνα 4). Τα καροτενοειδή είναι μία ομάδα βοηθητικών λιποδιαλυτών χρωστικών στις οποίες αποδίδεται το κίτρινο και το κόκκινο χρώμα του φυτικού και του ζωικού βασιλείου. [34] Στα φυτά τα καροτενοειδή εντοπίζονται στους χλωροπλάστες και τους χρωμοπλάστες και διακρίνονται σε δύο κατηγορίες τα καροτένια, κύριος εκπρόσωπος των οποίων είναι το β-καροτένιο που υδρολύεται σε 2 μόρια 15

31 βιταμίνης Α, και τις ξανθοφύλλες, οι οποίες είναι οξυγονομένα παράγωγα τους. [34] Το χρώμα των καροτενοειδών καλύπτεται από αυτό της χλωροφύλλης, ενώ το φθινόπωρο, όταν η αυτή διασπάται, γίνεται ορατό το χρώμα τους και έτσι εμφανίζεται το κιτρίνισμα των φύλλων. Εκτός από τους φυτικούς οργανισμούς τα καροτενοειδή συναντώνται τόσο σε θαλάσσιους οργανισμούς (ψάρια, ανεμώνες, αστερίες) καθώς και σε άλλους φωτοσυνθετικούς μικροοργανισμούς όπως βακτήρια και μύκητες. [35] Τα ζώα λαμβάνουν τα καροτένια, και συγκεκριμένα το β-καροτενιο από διαιτητικούς παράγοντες και ακολούθως το υδρολύουν σε δύο μόρια βιταμίνης Α. [36] Εικόνα 4. Η χημική δομή του β-καροτενίου. [37] Από χημικής άποψης τα καροτενοειδή ανήκουν στην κατηγορία των τερπενίων, μία σειρά δηλαδή ενώσεων που συναντώνται στη φύση με κοινή βιοσυνθετική πορεία και αποτελούνται από ενότητες ισοπρενίου CH2=C(CH3)- CH=CH2. [34] Πιο συγκεκριμένα τα καροτενοειδή είναι τετρατερπένια με μοριακό τύπο C4H56, διαθέτουν δηλαδή 8 ενότητες ισοπρενίου. Η υδρογονανθρακική τους αλυσίδα είναι μακριά ευθύγραμμη και συζυγιακή. Τα άκρα της αλυσίδας μπορεί είτε να είναι ανοικτά (λυκοπένιο) είτε να διαθέτουν δακτυλίους στο ένα ή και στα δύο άκρα. Βιοσύνθεση καροτενοειδών Οι ανθρακικοί σκελετοί των καροτενοειδών (C4) ανοικοδομούνται διαδοχικά με την προσθήκη μονάδων C5 (πυροφωσφορικό ισοπεντενύλιο) για τον σχηματισμό πυροφωσφορικού γερανυλογερανυλίου, ενα ενδιάμεσο με 2 άτομα άνθρακα, το οποίο ακολούθως συμπυκνώνεται με άλλο ένα μόριο πυροφωσφορικού γερανυλογερανυλίου. 16

32 Το προι όν αυτής της συμπύκνωσης, το φυτοένιο C4, είναι η μητρική ουσία των καροτενοειδών. Αφυδροονώνεται ενζυματικά και παράγεται λυκοπένιο. Ακολούθως το λυκοπένιο κυκλοποιείται σχηματίζοντας β-καροτένιο. [38] Βιοσύνθεση ρετινόλης Η ρετινόλη, λοιπόν, προκύπτει βιοσυνθετικά από το β-καροτένιο. Αρχικά δημιουργείται ένα εποξείδιο από την διάσπαση του κεντρικού διπλού δεσμού. Αυτό το εποξείδιο στη συνέχεια λαμβάνοντας νερό δημιουργεί δύο ομάδες υδροξυλίου στο κέντρο της δομής. Η διάσπαση λαμβάνει χώρα όταν οι εν λόγω αλκοόλες ανάγονται προς τις αλδευ δες χρησιμοποιώντας NADH. Αυτή η ένωση ονομάζεται ρετιναλδεύδη. Η ρετιναλδεύδη στη συνέχεια ανάγεται σε ρετινόλη από το ένζυμο δευ δρογονάση της ρετινόλης Μέθοδοι παρασκευής βιταμίνης Α Μία μέθοδος παραγωγής της βιταμίνης Α είναι η απομόνωση της από φυσικές πρώτες ύλες, όπως ιχθυέλαια με εκχύλιση υγρού-υγρού, μοριακή απόσταξη, και HPLC. [39] Άλλη μέθοδος παρασκευής της σε βιομηχανική κλίμακα είναι μέσω αντίδρασης αναγωγής αλκυνιών με τη χρήση του καταλύτη Lindar. Αυτή η μέθοδος ακολουθείται μάλιστα από την εταιρία Hoffmann-LaRoche. Με την αναγωγή του αλκενίου προκύπτει η 7-cis-ρετινόλη η οποία μετά από θέρμανση μετατρέπεται σε trans ισομερές. [4] Δράσεις βιταμίνης Α και δέρμα Το β- καροτένιο και άλλα καροτενεοειδή παρέχουν αντιοξειδωτική προστασία στους πλούσιους λιπόδεις ιστούς. Έρευνες δείχνουν ότι το β-καροτενίο δρα συνεργετικά με την βιταμίνη Ε. [41] Η βιταμίνη Α διαδραματίζει σημαντικό ρόλο σε διάφορες λειτουργίες ανάλογα στην μορφή την οποία βρίσκεται. Η ρετιναλδεύδη (ρετινάλη) σχετίζεται άμεσα με την όραση σε μειωμένο φως. Στον ανθρώπινο οφθαλμό η ρετινάλη απαντά σε δύο τύπους κυτταρικών υποδοχέων τα ραβδία, που ευθύνονται για την όραση σε ελαττωμένο φως και τα κωνία, που είναι υπεύθυνα για την όραση σε έντονο φως και την διάκριση των 17

33 λαμπερών χρωμάτων. Στα ραβδία η ρετινάλη μετατρέπεται σε ροδοψίνη, μια φωτοευαίσθητη ουσία που σχηματίζεται από την πρωτείνη οψίνη και την ρετινάλη. Όταν λοιπόν τα ραβδία έλθουν σε επαφή με το φως παράγεται η trans-ροδοψίνη (meta-ροδοψίνη ΙΙ) που οδηγεί στην πρόκληση νευρικού παλμού και αποστολή ερεθίσματος στον εγκέφαλο, που είναι αντιληπτο σαν όραση. [4] Το ρετινοι κού οξύ, δρα στην μεταγραφή των γονιδίων. Η φυσιολογική μορφή του (all-trans-ρετινοι κό οξύ) ρυθμίζει την γονιδιακή μεταγραφή με σύνδεση στους πυρηνικούς υποδοχείς, οι οποίοι είναι γνωστοί ως υποδοχείς ρετινοι κού οξέος (RARs). [42] Άλλες δράσεις της βιταμίνης Α που μελετώνται αφορούν την ικανότητα της να προλαμβάνει την απώλεια μνήμης λόγω ηλικίας. Σε αυτή την μελέτη συμπέραναν ότι η χορήγηση συμπληρωμάτων από τη μέση ηλικία θα μπορούσε να είναι μια καλή στρατηγική για τη διατήρηση της πλαστικότητας και των λειτουργιών του ιππόκαμπου. [43] Η δράση της βιταμίνης Α όμως είναι πολύ σημαντική και στον τομέα της δερματολογίας. Η βιταμίνη Α, και πιο συγκεκριμένα, το ρετινοι κό οξύ, φαίνεται να διατηρεί την κανονική υγεία του δέρματος με την ενεργοποίηση γονιδίων και διαφοροποίηση των κερατινοκυττάρων (ανώριμα κύτταρα του δέρματος) σε ώριμα επιδερμικά κύτταρα. [44] Στην δερματολογία χρησιμοποιούνται κυρίως τα ρετινοειδή, τα οποία είναι είναι τα δομικά και λειτουργικά ανάλογα της βιταμίνης Α. Έχουν πολλαπλή δράση, κυρίως σε επίπεδο κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικής διαφοροποίησης. Η δράση τους επηρεάζει την κερατινοποίηση, τη αντισμηγματορροι κή και η αντιακνει κή δραστηριότητα. Πολλές αντικνεικές θεραπείες βασίζονται στα ρετινοειδή, με κυριους εκπροσώπους την τρετινοίνη και την ισοτρετινοίνη. Αξιόλογη όμως είναι και η δράση της ρετινόλης στην αντιμετώπιση της φωτογήρανσης. Η φωτογήρανση είναι η προκληθείσα ζημιά στην ενδογενή γήρανση από την υπέρθεση σε χρόνιας υπεριώδη ακτινοβολία (UV). Σχετίζεται με τις αλλαγές στην εμφάνιση του δέρματος. Πυροδοτείται με ενεργοποίηση υποδοχέων, μιτοχονδριακές βλάβες και οξείδωση πρωτει νών. Το δέρμα που εμφανίζει μεταβλητό πάχος της επιδερμίδας, δερματική ελάστωση, μειωμένα επίπεδα κολλαγόνου, αύξηση των μεταλλοπρωτει νασών καθώς και φλεγμονώδεις διηθήσεις. [45] 18

34 2.2.5 Τοξικότητα βιταμίνης Α Η κατάσταση που προκαλείται από την τοξικότητα της βιταμίνης Α καλείται υπερβιταμίνωση Α. Οφείλεται στην υπερκατανάλωση προσχηματισμένης βιταμίνης Α και όχι καροτενοειδών. Η προσχηματισμένη βιταμίνη Α απορροφάται γρήγορα και απομακρύνεται αργά από το δέρμα. Eπομένως, η προκαλούμενη από την προσχηματισμένη βιταμίνη Α οξεία τοξικότητα μπορεί να συμβεί από μία έκθεση σε υψηλή δόση για ένα μικρό χρονικό διάστημα ή ακόμη μπορεί να προκληθεί χρόνια τοξικότητα σε βάθος χρόνου με πρόσληψη χαμηλότερων από την υψηλή δόση ποσοτήτων. [46] Η οξεία τοξικότητα βιταμίνης Α είναι σχετικά σπάνια και τα συμπτώματα περιλαμβάνουν ναυτία, πονοκέφαλο, κόπωση, απώλεια της όρεξης, ζαλάδα, ξηροδερμία, ξεφλούδισμα του δέρματος και εγκεφαλικό οίδημα. Τα συμπτώματα χρόνιας τοξικότητας περιλαμβάνουν ξηρό δέρμα, κνησμό, ξεφλούδισμα του δέρματος, ανορεξία, απώλεια βάρους, πονοκέφαλο, εγκεφαλικό οίδημα, ηπατομεγαλία, αναιμία, καθώς και πόνο στα οστά και στις αρθρώσεις. Σοβαρές περιπτώσεις υπερβιταμίνωσης Α μπορεί να προκαλέσουν ηπατική νέκρωση, αιμορραγία και κώμα. [47] Έλλειψη βιταμίνης Α Η έλλειψη βιταμίνης Α συναντάται συνήθως σε υποανάπτυκτες χώρες, αλλά σπανιότερα εμφανίζεται και σε πιο ανεπτυγμένες χώρες. Η νυκταλωπία είναι ένα από τα πρώτα συμπτώματα της έλλειψης αυτής. Η ξηροφθαλμία, η κερατομαλάκυνση και η ολική τύφλωση μπορούν επίσης να προκύψουν, καθώς η βιταμίνη Α παίζει κύριο ρόλο στη φωτομετατροπή. Ακόμη, η έλλειψη βιταμίνης Α αποτελεί την κύρια αιτία της παιδικής τύφλωσης, ενώ επίσης καταστέλλει την ικανότητα αντιμετώπισης μολύνσεων. [48] Επιπλέον, η έλλειψη βιταμίνης Α οδηγεί σε κερατινοποίηση του γαστρεντερικού, του αναπνευστικού καθώς και του δέρματος, μιας και τα κύτταρα γεμίζουν κερατίνη, μια σκληρή και ινώδη πρωτεϊ νη αδιάλυτη στο νερό. [49] Η αντιμετώπιση της έλλειψης βιταμίνης Α μπορεί να πραγματοποιηθεί με χορηγούμενες από το στόμα καθώς και με ενέσιμες μορφές παλμιτικής βιταμίνης Α. [5] 19

35 2.3 Βιταμίνη Ε Χημικές δομές βιταμίνης Ε H βιταμίνη Ε αποτελεί τον κυριότερο λιποδιαλυτό αντιοξειδωτικό παράγοντα του αντιοξειδωτικού συστήματος άμυνας των κυττάρων και λαμβάνεται μέσω της τροφής. Ο όρος βιταμίνη Ε αναφέρεται σε μία οικογένεια οκτώ φυσικών ομολόγων (τεσσάρων τοκοφερολών και τεσσάρων τοκοτριενολών), τα οποία συντίθενται στα φυτά από το ομογεντισικό οξύ. Τα παραπάνω είναι παράγωγα της 6- χρωμανόλης [51] καθώς χαρακτηρίζονται από ένα δακτύλιο χρωμανίου, ο οποίος περιέχει μία υδροξυλομάδα που μπορεί να προσφέρει το ένα άτομο υδρογόνου της για να μειώσει τις ελεύθερες ρίζες, όπως επίσης και μία υδρόφοβη πλευρική αλυσίδα η οποία επιτρέπει τη διείσδυση στις βιολογικές μεμβράνες. [52] Οι τοκοφερόλες και οι τοκοτριενόλες συναντώνται εξίσου σε α (alpha), β (beta), γ (gamma) και δ (delta) μορφές, ανάλογα με τον αριθμό και τη θέση των μεθυλ-ομάδων στο δακτύλιο χρωμανίου. [52,53] Στην (Εικόνα 5), παρουσιάζονται οι δομές των α-, β-, γ-, και δ- τοκοφερολών και των τοκοτριενολών αντιστοίχως Οι τοκοφερόλες (d-α-, d-β-, d-γ-, and d-δ-) έχουν μία κορεσμένη φυτυλπλευρική αλυσίδα 16 ατόμων άνθρακα, ενώ οι τοκοτριενόλες (d-α-, d-β-, d-γ-, and d- δ-) έχουν τρεις διπλούς δεσμούς στην πλευρική τους αλυσίδα. Aκόμη, οι τοκοφερόλες και οι τοκοτριενόλες διαφέρουν στον αριθμό και στη θέση των μεθυλομάδων τους πάνω στη δομή του δακτυλίου. [54] 2

36 Εικόνα 5. Η βιοσύνθεση της βιταμίνης Ε και συνθετικά παράγωγα της. [55] Η βιοσύνθεση των τοκοφερολών πραγματοποιείται μέσω σύζευξης του διφωσφορικού εστέρα της φυτόλης και του ομογεντισικού οξέος. Αυτή παίρνει μέρος στους χλωροπλάστες. Το αμινοξύ τυροσίνη αποτελεί την πρόδρομο ένωση και οξειδώνεται προς p-υδροξυ-φαινυλο-πυροσταφυλικό οξύ. Το τελευταίο μέσω του ενζύμου-υδροφαινυλο-πυροφωσφορική διοξυγενάση μετατρέπεται σε ομογεντισικό οξύ με. Στη συνέχεια το ομογεντισικό οξύ μέσω του ενζύμου πρενυλοτρανσφεράση συζεύγνυται με τον πυροφωσφορικό εστέρα της φυτόλης και παράγεται η ένωση 2-μεθυλο-6-φυτυλο-1,4-διυδροξυ-βενζόλιο, που υπόκειται σε μεθυλίωση προς 2,3-διμεθυλο-6-φυτυλο-1,4-δι-υδροξυβενζόλιο μέσω της μεθυλοτρανσφεράσης. Η τελευταία παίρνει μέρος σε διαδικασία κυκλοποίησης μέσω της κυκλάσης της τοκοφερόλης για την παραγωγή της γ-τοκοφερόλης. Η γ-τοκοφερόλη υφίσταται μεθυλίωση δίνοντας την α-τοκοφερόλη. Με αλλαγές των αντιδράσεων σχηματίζονται αντίστοιχα οι β- και δ-τοκοφερόλες. Για την παραγωγή των τοκοτριενολών ακολουθούνται σχεδόν οι ίδιες αντιδράσεις με την διαφορά ότι χρησιμοποιείται ο πυροφωσφορικός εστέρας της γερανυλογερανόλης αντί του πυροφωσφορικού εστέρα της φυτόλης. Αξιόλογη σημασία όσον αφορά στις τοκοφερόλες δίνεται στην d-ατοκοφερόλη, η οποία είναι απαραίτητη για τη σταθεροποίηση των βιολογικών μεμβρανών. Αποτελεί ισχυρό αντιοξειδωτικό παράγοντα που αναστέλλει μη αντιστρεπτά τη δραστηριότητα της κυκλοοξυγενάσης, οδηγώντας σε μείωση της παραγωγής προσταγλανδινών. [55] 21

37 Συνθετικά παράγωγα της βιταμίνης Ε dl-α- τοκοφερόλη Αρχικά, πέρα από τις φυσικές μορφές της βιταμίνης Ε, υπάρχει μία ευρέως διαδεδομένη συνθετική μορφή, η dl-α- τοκοφερόλη, η οποία παρασκευάζεται με το συνδυασμό της τριμεθυλουδροκινόνης με την ισοφυτόλη. Η dl-α- τοκοφερόλη αποτελεί ένα μίγμα από οκτώ στερεοι σομερή σε περίπου ίσες ποσότητες. Αυτά τα ισομερή διαφοροποιούνται με βάση τις περιστροφές της φυτυλ-αλυσίδας σε ποικίλες κατευθύνσεις που δεν τις συναντάμε φυσιολογικά. [52] Η φυσική μορφή της α- τοκοφερόλης είναι πιο δραστική από την περιγραφόμενη συνθετική ένωση (ρακεμικό μίγμα) [55]. Εστέρες της α-τοκοφερόλης Αξίζει να σημειωθεί ότι η α-τοκοφερόλη διατίθεται επίσης με τη μορφή εστέρων οι οποίοι προκύπτουν με τη χρήση οξικού (acetate acid) ή ηλεκτρικού οξέος (succinic acid), δηλαδή ως οξικός και ηλεκτρικός εστέρας της α-τοκοφερόλης αντίστοιχα. Οι εστεροποιημένες μορφές της. τοκοφερόλης είναι πιο σταθερές ως προς την οξείδωση και για το λόγο αυτό προστίθενται σε διάφορα καλλυντικά (κυρίως φροντίδας δέρματος) και αντηλιακά σκευάσματα (ζελέ, αλοιφές, λάδια). Απορροφούνται εύκολα από το δέρμα και στη συνέχεια υπόκεινται σε υδρόλυση απελευθερώνοντας τη δραστική τοκοφερόλη. [56,57] Δράσεις βιταμίνης Ε και δέρμα Η προστασία των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (PUFAs), των συστατικών των κυτταρικών μεμβρανών και ειδικά της λιποπρωτεϊ νης χαμηλής πυκνότητας (LDL) από την οξείδωσή που προκαλείται από τις ελεύθερες ρίζες, αποτελούν τον βιολογικό ρόλο της βιταμίνης Ε. Οι διπλοστιβάδες φωσφολιποειδών των κυτταρικών μεμβρανών αποτελούνται από μόρια της βιταμίνης. [58] Η υπεροξείδωση των PUFAs οδηγεί σε προι όντα τα οποία προκαλούν πλήθος ασθενειών. Η βιταμίνη Ε παρέχει μέγιστη προστασία PUFAs αποτρέπονας της υπεροξείδωση τους [6]. Η βιταμίνη Ε βρίσκεται κυρίως στις μεμβράνες των κυττάρων και των κυτταρικών οργανιδίων και έχει αποδειχθεί ότι ένα μόριο βιταμίνης είναι ικανό να προστατεύσει δύο χιλιάδες μόρια φωσφολιπιδίων. Η μεγάλη αυτή παροχή 22

38 προστασίας μας οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η βιταμίνη Ε αφού ολοκληρώσει την αντίδρασή της με τις ελεύθερες ρίζες, ανασυντίθεται από άλλες αντιοξειδωτικές ουσίες. [59] Ο μηχανισμός οξείδωσης των λιπαρών οξέων από τις ελεύθερες ρίζες και η δράση της τοκοφερόλης περιγράφεται με έναν κύκλο αντιδράσεων που καλείται κυκλική διάδοση λιποειδικής υπεροξείδωσης (Εικόνα 7). Η ελεύθερη ρίζα αντιδρά με το λιποειδές LH και αποσπάται ένα άτομο υδρογόνου, προς σχηματισμού της ρίζας του λιποειδούς (αντίδραση 1). Από τη στιγμή αυτή ξεκινάει ο καταστροφικός κύκλος (αντιδράσεις 2 και 3). Η ρίζα του λιποειδούς αντιδρά με μόρια οξυγόνου και σχηματίζεται η υπεροξυ-ρίζα του λιποειδούς (αντίδραση 2). Η τελευταία αντιδρά με ένα καινούριο μόριο λιποειδούς (LH) και δίνει υπεροξυ-παράγωγο του λιποειδούς (LOOH), που είναι η πλέον κατεστραμμένη μορφή του. Ταυτόχρονα η ρίζα του λιποειδούς ξανασχηματίζεται (αντίδραση 3), προκαλώντας ξανά το καταστρεπτικό της έργο. Η αντίδραση 4 αποτελώντας το άθροισμα των δύο προηγούμενων αντιδράσεων, υποδυκνείει ότι προκαλείται η καταστροφική οξείδωση του λιποειδούς από το οξυγόνο. Η αντίδραση 4 πραγματοποιείται μέσω της παρουσία της ρίζας, η οποία είναι το αποτέλεσμα μιας ελεύθερης ρίζας που οδήγησε στην έναρξη του κύκλου αντιδράσεων υπεροξείδωσης. Ο κύκλος θα συνεχιστεί μέχρι την εμφάνιση κάποιας αντιοξειδωτικής ουσίας, όπως είναι η τοκοφερόλη (ΤΟΗ). Η τοκοφερόλη έχει την ικανότητα να δεσμεύσει την υπεροξυ-ρίζα του λιποειδούς και να οδηγήσει στον σχηματισμό της αντίστοιχης ρίζας η οποία είναι σταθερή, είτε μετασχηματίζεται σε μια σταθερή οξειδωμένη μορφή του αντιοξειδωτικού, είτε σχηματίζεται σε τοκοφερόλη με τη βοήθεια κάποιας άλλης αναγωγικής ουσίας. Να σημειωθεί ότι η ελεύθερη ρίζα είναι δυνατόν να δευσμευτεί από την αρχή από την τοκοφερόλη ( + ΤΟΗ RH + ). [6] Εικόνα 6. Κυκλική διάδοση λιποειδικής υπεροξείδωσης. [6] 23

39 Η μετατροπή της τοκοφερόλης σε ρίζα (αντίδραση 5) δεν οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η τοκοφερόλη δεν διαδραματίζει πια κανένα ρόλο σε αντιδράσεις. Η ρίζα είναι δυνατό να αναχθεί από άλλες αναγωγικές ουσίες που απαντώνται στον οργανισμό, όπως το ασκορβικό οξύ και η γλουταθειόνη. Συνεπώς προκύπτει ο επανασχηματισμός της τοκοφερόλης ΤΟΗ η οποία λαμβάνει την προστατευτική της δράση (Εικόνα 8): (1) δέσμευση της υπεροξυρίζας του λιποειδούς και σχηματισμός τη ρίζας της α-τοκοφερόλης. (2) Επανασχηματισμός της α-τοκοφερόλης από αναγωγικές ουσίες και σχηματισμός των αντίστοιχων ριζών ή της οξειδωμένης μορφής της γλουταθειόνης (GSSG). (3) Επανασχηματισμός της γλουταθειόνης και του ασκορβικού οξέος από την ανηγμένη μορφή του συνενζύμου NADP (φωσφορυλιωμένο β-νικοτιναμιδο-αδενινοδινουκλεοτίδιο). [61] Εικόνα 7. Οξειδωαναγωγικό σύστημα ανακύκλωσης της α-τοκοφερόλης. [61] Η βιταμίνη Ε είναι μοναδική, διότι οι ρόλοι της είναι πολλαπλοί. Εκτός από ένα ισχυρό αντιοξειδωτικό είναι και μια εξαιρετική μαλακτική ουσία, όπου εμποδίζει τη διαεπιδερμιδική απώλεια ύδατος, κι έτσι συχνά περιλαμβάνεται σε ενυδατικά προι όντα. Επίσης, είναι μια καταπραυ ντική αντιφλεγμονώδης ουσία. Η βιταμίνη Ε σταθεροποιείται στο νερό, έτσι μπορεί να χρησιμοποιηθεί εύκολα μέσα στα καλλυντικά. Είναι τόσο σταθερή που συχνά χρησιμοποιείται σε καλλυντικά για να διασφαλίσει την ακεραιότητα άλλων ευαίσθητων συστατικών. [62] Οι αντιοξειδωτικές ουσίες του δέρματος το προστατεύουν από την οξειδωτική καταστροφή που προκαλεί η UV ακτινοβολία. [63,64] Το L-ασκορβικό οξύ είναι το κύριο υδατοδιαλυτό αντιοξειδωτικό, η γλουταθειόνη προστατεύει τα ενδοκυττάρια διαμερίσματα και η βιταμίνη Ε τις κυτταρικές μεμβράνες. [65] Στο γηρασμένο δέρμα, καθώς και στο δέρμα στο οποίο έχει επέλθει φωτογήρανση, παρατηρείται σημαντική 24

40 μείωση των επιπέδων L-ασκορβικού οξέος και α-τοκοφερόλης σε ποσοστά περίπου 6%-7%. Η UV ακτινοβολία οδηγεί σε εξάντληση των αποθεμάτων των αντιοξειδωτικών ουσιών [66]. Οι αντιοξειδωτικές ουσίες συνεργούν για να ασκήσουν τη δράση τους. Μετά την επερχόμενη οξείδωση, τα λιποδιαλυτά αντιοξειδωτικά (ουβικινόνη, βιταμίνη Ε) αναγεννώνται από το L-ασκορβικό οξύ, το οποίο με τη σειρά του αναγεννάται από τη γλουταθειόνη. [64,67,68] Ειδικότερα, οι ισομορφές της βιταμίνης Ε εντοπίζονται σε όλα τα στρώματα του δέρματος και αποτελούν αναπόσπαστο κομμάτι των αμυντικών αντιοξειδωτικών συστημάτων που δρουν ενάντια στους περιβαλλοντικούς οξειδωτικούς παράγοντες. [67] Αναλυτικότερα, η βιταμίνη Ε είναι άφθονη κυρίως στην κεράτινη στοιβάδα του δέρματος. [68] Όσον αφορά στην τοπική εφαρμογή της βιταμίνης Ε στο δέρμα, όπως ακριβώς το σμήγμα παρέχει ένα μηχανισμό μεταφοράς της στην κεράτινη στοιβάδα, έτσι και οι τοπικές εφαρμογές της βιταμίνης Ε επιτρέπουν την εισχώρησή της στην επιδερμίδα και στη δερμίδα. [69,7] Ο βαθμός της διαδερμικής απορρόφησης της βιταμίνης Ε και οι παράγοντες που επηρεάζουν τη διείσδυσή της στο δέρμα σε ό,τι αφορά στους ανθρώπους είναι κατά κύριο λόγο άγνωστοι, με ένα μεγάλο εύρος συγκεντρώσεων και χρονικών στιγμών να έχουν χρησιμοποιηθεί σε ποικίλες μελέτες. Είναι γενικά αποδεκτό ότι τα διαλύματα της βιταμίνης Ε με συγκεντρώσεις τόσο χαμηλές όσο,1% μπορούν να αυξήσουν τα επίπεδα της βιταμίνης αυτής στο δέρμα. [71] Αναλυτικότερα, τα επίπεδα της βιταμίνης Ε στη δερμίδα αυξάνονται σε πολύ μεγάλο βαθμό μετά την τοπική εφαρμογή, καθώς είναι πολύ πιθανή η συσσώρευσή της στους σμηγματογόνους αδένες. [7] Όμως, παρόλο που η συγκέντρωση της βιταμίνης Ε αυξάνεται μετά από την τοπική εφαρμογή, στη δερμίδα είναι χαμηλότερη απ ότι στην κεράτινη στοιβάδα. Στο δέρμα που παρέχεται βιταμίνη Ε μόνο από την τροφή συναντώνται κυρίως η α- και η γ- τοκοφερόλη. [72,73,74] Αντίθετα, στο δέρμα που παρέχεται τοπικά συνθετική βιταμίνη Ε συναντάται ένα μίγμα διαφορετικών τοκοφερολών ή/και τοκοτριενολών. [7,74] Αξίζει να σημειωθεί ότι η σταθεροποίηση των τοπικών εφαρμογών της βιταμίνης Ε είναι πολύ σημαντική. Tα προι όντα που περιέχουν βιταμίνη Ε και βιταμίνη C έχουν επιδείξει μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα στη φωτοπροστασία από ότι ένα αντιοξειδωτικό μόνο του. 25

41 Η σταθεροποίηση των τοπικά εφαρμοζόμενων διαλυμάτων της βιταμίνης Ε μπορεί επίσης να αυξηθεί με τη χρήση παραγώγων βιταμίνης Ε. Τα παράγωγα αυτά είναι συνήθως εστέρες της τοκοφερόλης (παρόλο που έχουν παρασκευαστεί και εστέρες τοκοτριενόλης) ανθεκτικοί στην οξείδωση, αλλά ταυτόχρονα ικανοί να διεισδύουν τα στρώματα του δέρματος. [71,76,77,78,79] Κάποιες μορφές της βιταμίνης Ε και κυρίως οι εστέρες της έχουν οδηγήσει σε δυσμενείς αντιδράσεις του δέρματος συμπεριλαμβανομένης της δερματίτιδας και του ερυθήματος αλλεργικής αιτιολογίας που συμβαίνουν εξ επαφής. Παρόλο που τέτοιες αντιδράσεις μπορεί να οφείλονται σε παραπροι όντα της οξείδωσης, τα γαλακτώματα που χρησιμοποιούνται τοπικά για την τοπική μεταφορά των συστατικών μπορεί επίσης να οδηγούν σε αυτά τα αποτελέσματα. [79] Τοξικότητα βιταμίνης Ε Παρόλο που η βιταμίνη Ε θεωρείται σχετικά ασφαλής σε σύγκριση με άλλες λιποδιαλυτές βιταμίνες, [81] μία αύξηση στη θνησιμότητα σε υψηλές δόσεις βιταμίνης Ε είναι βιολογικώς δυνατόν να συμβεί. Στην πραγματικότητα, κάποιοι ερευνητές προειδοποίησαν έναντι στην μακροχρόνια χορήγηση μεγάλων δόσεων βιταμίνης Ε, επειδή πιθανώς να συνδέεται με πολλές δυσμενείς επιπτώσεις. [82] Υψηλές δόσεις βιταμίνης Ε μπορεί να μετακινήσουν άλλες λιποδιαλυτές αντιοξειδωτικές ουσίες (για παράδειγμα, τη γ-τοκοφερόλη), [83] διαταράσσοντας τη φυσική ισορροπία των αντιοξειδωτικών συστημάτων και αυξάνοντας τη πιθανότητα οξειδωτικής καταστροφής. H βιταμίνη Ε μπορεί επίσης να αναστείλλει την ανθρώπινη κυτοσολική S-τρανσφεράση της γλουταθειόνης, η οποία βοηθά στην αποτοξίκωση φαρμάκων και ενδογενών τοξινών. [84] Έλλειψη βιταμίνης Ε Η έλλειψη βιταμίνης Ε μπορεί να προκαλέσει προβλήματα στο νευρικό σύστημα, εξαιτίας του ότι οδηγεί σε προβλήματα στη μετάδοση των ηλεκτρικών ώσεων κατά μήκος των νευρώνων, λόγω των αλλαγών που προκαλεί στη δομή και στη λειτουργία των νευρωνικών μεμβρανών. Στις ενδείξεις έλλειψης βιταμίνης Ε περιλαμβάνονται τα εξής: νευρομυι κά προβλήματα, νευρολογικά προβλήματα, αναιμία, ρετινοπάθεια καθώς και εξασθένιση 26

42 του ανοσοποιητικού συστήματος. Eπιπρόσθετα, υπάρχουν κάποια εργαστηριακά δεδομένα που υποστηρίζουν ότι από την έλλειψη της βιταμίνης αυτής είναι δυνατόν να προκληθεί ανδρική υπογονιμότητα. [85,86,87] Η έλλειψη της βιταμίνης Ε μπορεί να προκληθεί σε πρόωρα, πολύ χαμηλού βάρους νεογνά, σε περιπτώσεις σπάνιων διαταραχών μεταβολισμού των λιπών και τέλος, σε καταστάσεις δυσαπορρόφησης των λιπών. [88] Η αντιμετώπιση της έλλειψης αυτής μπορεί να περιλαμβάνει από του στόματος ή παρεντερική χορήγηση συμπληρωμάτων βιταμίνης Ε και πρέπει να είναι σχεδιασμένη κατά τέτοιο τρόπο που να αντιμετωπίζει και την υποβόσκουσα αιτία της έλλειψης. [89] Κεφάλαιο 3: Νανοτεχνολογία 3.1 Ορισμός νανοτεχνολογίας Η ευρωπαική επιτροπή ορίζει ως νανοτεχνολογία την επιστήμη που σχεδιάζει, χρησιμοποιεί δομές στις διαστάσεις βρίσκονται στην περιοχή των 1nm (Εικόνα 9). Τα νανοσωματίδια διαθέτουν ξεχωριστές ιδιότητες από τα αντίστοιχα συμβατικά σωματίδια και για τον λόγο αυτό βρίσκουν πληθώρα εφαρμογών. Πιο συγκεκριμένα η νανοτεχνολογία έχει ενταχθεί στην βιολογία στη φυσική τη χημεία ενώ χρησιμοποιείται και στον κλάδο της υγείας, των φαρμάκων και στην τεχνολογογία των επικοινωνιών και της πληροφορικής. [9] Χάρη της τεχνολογίας έχουν επιτευχθεί αρκετές τεχνολογικές πρόοδοι σχετικά με τον χαρακτηρισμό και τον σχεδιασμό συσκευών και συστημάτων καθώς η μορφή και το μέγεθος τους ελέγχονται στην νανοκλίμακα. Η χρήση της τεχνολογίας στα καλλυντικά προιόντα στοχεύει στην καλύτερη σταθερότητα και δράσης τους και στην βελτιστοποίηση της υφής και του χρώματος τους. [91,992] 27

43 Εικόνα 8. Η σχετική αναλογία των νανοσυσκευών με βιολογικές δομές - νανοκλίμακα. [91] 3.2 Νανομεταφορείς μεταφοράς και ελεγχόμενης αποδέσμευσης. Η νανοτεχνολογία χρησιμοποιήθηκε σε καλλυντικό προιόν το Από τότε λόγω των ερευνών που διεξάγονται για την μεταφορά φαρμακευτικών βιομορίων έχει εξελιχθεί αρκετά. Αποτέλεσμα της εξέλιξης ήταν η δημιουργία σημαντικών εργαλείων που καθιστούν ευκολότερη τόσο την στοχευμένη μεταφορά όσο και την ελεγχόμενη αποδέσμευση των εγκλωβισμένων ουσιών. Ο εγκλωβισμός σε νανοσωματίδια διαφόρων μορίων εξασφαλίζει υψηλή χημική σταθερότητα, εξαιτίας της προστασίας τους από το φως, το οξυγόνο και την αλληλεπίδραση τους με συστατικά του προιόντος. Επίσης ο εγκλωβισμός συμβάλει στην ρύθμιση της συστημικής απορρόφησης αυξάνοντας την βιοδιαθεσιμότητα τους. [93] Τα νανοσωματίδια εναποτίθενται στην κεράτινη στοιβάδα δίνοντας χώρο για την είσοδο του εγκλωβισμένου συστατικούς στις βαθύτερες στοιβάδες της επιδερμίδας με τον καθορισμένο κάθε φορά ρυθμό. Ο ρυθμος διείσδυσης μπορεί να ρυθμιστεί ώστε να είναι αργός και συνεχής αυξάνοντας την αποτελεσματικότητα και ελαχιστοποιώντας ανεπιθυμήτες ενέργειες όπως ο ερεθισμός του δέρματος. [94] Τα λιπιδικά νανοσωματίδια έχουν την ιδιότητα δημιουργίας ενός προστατευτικού στρώματος στο δέρμα αποτρέποντας την απώλεια νερού. Αποτέλεσμα της δράσης είναι η αυξημένη ενυδάτωση της επιδερμίδας. [95] 28

44 Κεφάλαιο 4: Συστήματα διασποράς 4.1 Γαλακτώματα Ως γαλάκτωμα (emulsion) ορίζεται ένα θερμοδυναμικώς ασταθές σύστημα, το οποίο αποτελείται από τουλάχιστον δύο μη αναμιγνυόμενες υγρές φάσεις, η μία εκ των οποίων διασπείρεται με τη μορφή σφαιριδίων (εσωτερική ή διεσπαρμένη φάση) στο υγρό διασποράς (εξωτερική ή συνεχής φάση). Τα συστήματα αυτά σταθεροποιούνται με την παρουσία γαλακτωματοποιητών. [96] Ανάλογα με την φύση της εσωτερικής και της εξωτερικής φάσης διακρίνονται σε δύο κύριους τύπους: o/w: oil in water: σταγονίδια ελαίου διεσπαρμένα σε υδατική φάση w/o: water in oil: σταγονίδια νερού διεσπαρμένα σε συνεχή ελαιώδη φάση Εκτός όμως των παραπάνω συμβατικών τύπων είναι δυνατή η παρασκευή πολλαπλών γαλακτωμάτων, τα οποία αποτελούν συστήματα διασποράς τριών η περισσότερων φάσεων, πχ o/w/o, w/o/w. Τα πολλαπλά γαλακτώματα χρησιμοποιούνται συνήθως ως ενδιάμεσες φάσεις παρασκευής νεώτερων φαρμακομορφών όπως λιποσώματα και νανο-σωματίδια. [97] Τα καλλυντικά γαλακτώματα τα οποία είναι ημιστερεά όπως οι κρέμες ή υγρα όπως τα πλυματα παρέχουν τα εξής πλεονεκτήματα: 1. Εύκολη και ομοιομόρφη εφαρμογή στο δέρμα 2. Παρέχουν την δυνατότητα ενσωματώσης στο σκεύασμα υδατοδιαλυτών και ελαιοδιαλυτών φαρμάκων 3. Ο γαλακτωματοποιητής βοηθάει την είσοδο των συστατικών στο δέρμα 4. Δίνουν λίγοτερη αίσθηση λιπαρότητας σε σχέση με τις αλοιφές και τα άνυδρα σκευάσματα. [98] 4.2 Γαλακτωματοποιητές Η παρουσία του γαλακτωματοποιητή είναι απαραίτητη κατά την παρασκευή κάθε γαλακτώματος. Αυτός αποτελείται από δύο αντίθετες περιοχές συγγένειας ως προς ένα διάλυμα. Για παράδειγμα σε υδατικό διάλυμα μπορεί να αποτελείται από υδρόφιλο και υδρόφοβο τμήμα, τα οποία σχηματίζουν μικκυλία όταν βρεθούν σε τιμές πάνω από δεδομένη συγκέντρωση η οποία ονομάζεται 29

45 κρίσιμη μικκυλιακή συγκέντρωση (critical micelle concentration, CMC). Κάθε μικκύλιο περιέχει τουλάχιστον 5 μόρια επιφανειοδραστικού, ενώ το υδρόφιλο τμήμα του μικκυλίου κατευθύνεται προς την υδατική φάση και το υδρόφοβο προς το εσωτερικό της σφαιρικής δομής ώστε να αποφεύγεται η επαφή του με το νερό. Οι επιφανειοδραστικές ουσίες μέσω της ελαττώσης της διεπιφανειακής τάσης καθιστούν ευκολότερο τον σχηματισμό του γαλακτώματος και με την συσσώρευση τους στην διεπιφάνεια ως συνεχή ισχυρή στοιβάδα,αποτρέπουν την συσσωματώση των σταγονιδίων και οδηγούν στην σταθερότητα του γαλακτώματος. Επίσης η σταθερότητα του γαλακτώματος εξαρτάται από το μέγεθος του φορτίου στον γαλακτωματοποιητή. Για παράδειγμα οι απωστικές δυνάμεις που δημιουργούνται από τα φορτισμένα σταγονίδια λόγω των φορτίων των επιφανειοδραστικών, μειώνουν τις πιθανότητες σύγκρουσης των σταγονιδίων και ως αποτέλεσμα την συσσωμάτωση τους. [99] Η αποτελεσματικότητα ενός γαλακτωματοποιητή σχετίζεται κυρίως με τη διαλυτότητά του στις δύο φάσεις. Η διαλυτότητα κάθε επιφανειακά ενεργού παράγοντα χαρακτηρίζεται από την υδρόφιλη-λιπόφιλη ισορροπία του (HLB - Hydrophilic-Lipophilic-Balance) (Πίνακας 1). Η τιμή HLΒ κάθε γαλακτωματοποιητή υπολογίζεται από την παρακάτω εξίσωση (1): HLB = 7 + Σ(Αριθμού Υδρόφιλων Ομάδων) - Σ(Αριθμού Υδρόφοβων Ομάδων)(1) Οι τιμές HLB μίγματος γαλακτωματοποιητών υπολογίζονται από την εξίσωση (2): HLBmix= HLB1W1% + HLB2W2% +..., (2) όπου W% είναι το κατά βάρος ποσοστό του κάθε γαλακτωματοποιητή. Οι τιμές HLB των γαλακτωματοποιητών παίρνουν τιμές από 1-2. Χαμηλές τιμές αντιστοιχούν σε λιπόφιλους ενώ υψηλές τιμές σε πιο υδρόφιλους γαλακτωματοποιητές. [1,11] Ένας γαλακτωματοποιητής με τιμές HLB μεταξύ 4-6, είναι υδρόφοβος, διαλύεται στη λιπαρή φάση και σταθεροποιεί τα γαλακτώματα τύπου W/O. Ένας γαλακτωματοποιητής με πιο ψηλές τιμές HLB, δηλαδή 8-18, είναι κυρίως υδρόφιλος, διαλύεται στην υδατική φάση και σταθεροποιεί τα γαλακτώματα τύπου O/W. Οι γαλακτωματοποιητές με ενδιάμεσες τιμές (6-8) δεν 3

46 παρουσιάζουν ιδιαίτερη προτίμηση για την υδατική ή λιπαρή φάση, ενώ με τιμές μικρότερες του 4 ή υψηλότερες του 18 είναι ελάχιστα επιφανειοδραστικοί. [12] Πίνακας 1. Εύρος τιμών ΗLB και αντίστοιχη εφαρμογή γαλακτωματοποιητών. [12] Κατηγορίες γαλακτωματοποιητών Δύο είναι οι κυρίες κατηγορίες των γαλακτωματοποιητών: α. Τα μακρομόρια, δηλαδή πρωτείνες β. Οι γαλακτωματοποιητές μικρού μοριακού βάρους(surfactants) α. Αρκετές πρωτείνες χρησιμοποιούνται ως γαλακτωματοποιητές καθώς δίνουν κατάλληλες φυσικοχημικές ιδιότητες σε O/W γαλακτώματατα και συμβάλλουν στη σταθερότητα τους. Αυτές έχουν την ικανότητα να προσροφώνται στην επιφάνεια των λιποσφαιρίων που έχουν σχηματιστεί από την ομογενοποίηση ελαίου,νερού και πρωτείνης και να ελαττώνουν την διεπιφανειακή τάση με αποτέλεσμα (την διάσπαση του ελαίου σε σταγονίδια;). [13] β. Η ιδιότητα αυτών των γαλακτωματοποιητών στηρίζεται στον αμφίφιλο χαρακτήρα των μορίων τους, ο οποίος περιέχει ένα πολικό και ένα μη πολικό τμήμα. Το πολικό περιαμβάνει υδρόφιλες πολικές ομάδες όπως το υδροξύλιο, καρβοξύλιο κ.ά., ενώ το μη πολικό από υδρόφοβες μη πολικές ομάδες όπως οι μεγάλες υδρογονανθρακικές αλυσίδες. [14] 31

47 Οι γαλακτωματοποιητές αυτοί διαχωρίζονται με βάση την ιονική συμπεριφορά όταν βρεθούν σε υδατικό διάλυμα. Οι κατηγορίες είναι: Ανιονικές επιφανειδραστικές ουσίες: οι ουσίες αυτές στο υδρόφιλο τμήμα τους έχουν αρνητικό φορτίο. Αυτές περιέχουν το λιγότερο μία υδρόφοβη υδρογανθρακική αλυσίδα. Κατιονικές επιφανειοδραστικές ουσίες: περιέχουν το λιγότερο μία υδρόφοβη υδρογονανθρακική άλυσο (R). [15] Επαμφοτερίζουσες επιφανειοδραστικές ουσίες ή αμφολύτες: αυτές διαθέτουν κατιονικές και ανιονικές λειτουργικές ομάδες και το καθαρό φορτίο τους εξαρτάται από το ph. [16] Μη ιονικές επιφανειοδραστικές ουσίες: ξεχωρίζουν από τις υπόλοιπες κατηγορίες καθώς δεν αποτελούν φορτισμένα μόρια. [15] Κατά κύριο λόγο ως γαλακτωματοποιητές χρησιμοποιούνται ανιονικά επιφανειοδραστικά όπως SDS, λόγω χαμηλού κόστους και λιγότερα κατιονικά επιφανειοδραστικά δίνοντας μεγέθη σωματιδίων παραπλήσια των ανιονικών. Συχνά χρησιμοποιούνται μη ιονικοί γαλακτωματοποιητές όπως τα Tweens και τα Spans και η πολυβινυλική αλκόολη τα οποία έχουν ηπιότητα δράσης και δεν παρουσιάζουν προβλήματα ασυμβατότητας με φορτισμένα συστατικά του γαλακτώματος που ποιθανά παρουσιάζουν οι φορτισμένοι γλακτωματοποιητές. [17] Κοσμητολογικές εφαρμογές και ιδιότητες Στη βιομηχανία των καλλυντικών οι κατιονικές επιφανειοδραστικές ουσίες χρησιμοποιούνται περισσότερο ως μαλακτικοί παράγοντες παρά ως γαλακτωματοποιητές. Συγκεκριμένα βάση αυτής της ιδιότητας περιέχονται σε μαλακτικές κρέμες μαλλιών και σαμπουάν, ενώ λόγω των αντιμικροβιακών τους ιδιοτήτων χρησιμοποιούνται σε αποσμητικά, σε στοματικά διαλύματα και σε προιόντα που χρησιμοποιούνται για μετά το ξύρισμα. [15] Οι ανιονικές επιφανειοδραστικές ουσίες λόγω των κοσμητολογικών τους ιδιοτήτων χρησιμοποιούνται σε μεγάλο πλήθος καλλυντικών προιόντων. Πιο συγκεκρίμενα περίεχονται ως ααπορρυπαντικοί παράγοντες σε σαμπουάν και 32

48 αφρόλουτρα καθώς είναι ικανές να διαβρέχουν και να διαλυτοποιούν τις λιπαρές ουσίες και να σχηματίζουν αφρό. [14] Οι αμφολυτικές επιφανειοδραστικές ουσίες έχουν τόσο γαλακτωματοποιητικές όσο και διαβρεκτικές ιδιότητες. Επισης μπορούν να χρησιμοποιηθούν με ανιονικές επιφανειοδραστικές ουσίες και να συμβάλλουν στην παραγωγή αφρού. Πιο συγκεκριμένα βρίσκουν εφαρμογή σε προιόντα περιποίησης μαλλιών σε ενυδατικά σκευάσματα και σε αφρόλουτρα. [18] 4.3 Σταθεροποιητές Αν και οι γαλακτωματοποιητές συμβάλουν στη παρασκευή και την σταθεροποίηση των γαλακτωμάτων, συνήθως είναι αναγκαία και η παρουσία των σταθεροποιητών τα οποία αποτελούν πολυμερή και προστίθενται με σκοπό την βελτίωση της σταθερότητας του γαλακτώματος. Πολυμερή που χρησιμοποιούνται είναι κόμμεα όπως ξανθάνη, γκουάρ, καρραγενάνη. [19] 4.4 Μέθοδος παρασκευής γαλακτωμάτων Η γενική πορεία παρασκευής των γαλακτωμάτων είναι η εξής: 1. Θέρμανση της λιπαρής και της υδατικής φάσης ξεχωριστά στην θερμοκρασία τήξης των λιπαρών συστατικών(συνίσταται η θέρμαση σε 5-1 ο C πάνω από το σήμειο τήξης του λιπαρού συστατικό με το υψηλότερο σημείο τήξης). 2. Προσθήκης της εσωτερικής στην εξωτερική φάση υπό συνεχή ανάδευση. 3. Αργή ψήξη περίπου μέχρι τους 35 ο C και προσθήκη θερμοευαίσθητων ή πτητικών ουσιών. [98] Η διαδικασία κατά την οποία μειώνεται η διάμετρος των σταγονιδίων του γαλακτώματος και η διασπορά του μεγέθους ονομάζεται ομογενοποίηση. Η τεχνική γαλακτωματοποίησης μπορεί να είναι απλώς μία μορφή ανάμιξης. Ο σχηματισμός του γαλακτώματος πρου ποθέτει ότι η ενέργεια που μεταδίδεται στο σύστημα ξεπερνά την αντίσταση από τη δημιουργία των νέων επιφανειών, η οποία προκύπτει από τη διεπιφανειακή τάση των συστατικών. Θεωρητικά, το έργο που απαιτείται για να παραχθεί ένα γαλάκτωμα είναι ισοδύναμο προς το γινόμενο της διεπιφανειακής τάσης των επιφανειών και της νεο- 33

49 σχηματιζόμενης επιφάνειας. Η παρασκευή γίνεται με την υποβολή και των δύο φάσεων σε βίαιη ανατάραξη (διάτμηση), με σκοπό τα μεγάλα σταγονίδια της εσωτερικής φάσης να ωθηθούν σε διάσπαση. Σε εργαστηριακές μελέτες, τα περισσότερα γαλακτώματα παρασκευάζονται πιο αποτελεσματικά και εύκολα με μία διαδικασία δύο σταδίων: το πρώτο στάδιο είναι η μετατροπή ενός ''χονδροειδούς γαλακτώματος'' με ανάμειξη της υδατικής και της λιπαρής φάσης με αρκετά μεγάλο μέγεθος σταγονιδίων και στη συνέχεια η μείωση της διαμέτρου των σταγονιδίων του γαλακτώματος με χρήση ομογενοποιητών [11] Σταθερό γαλάκτωμα σχηματίζεται με την χρήση σωστής ποσότητας και σωστού τύπου γαλακτωματοποιητή στην βέλτιστη θερμοκρασία σε επαρκή χρόνο. Οι παραπάνω παράγοντες επηρεάζουν την προσρόφηση του γαλακτωματοποιητή στην μεσεπιφάνεια Στην πραγματικότητα, τα (προ) γαλακτώματα παρασκευάζονται κυρίως από μία συσκευή ανάμιξης. [111] 4.5 Μηχανισμοί αποσταθεροποίησης γαλακτωμάτων Ο όρος σταθερότητα των γαλακτωμάτων χρησιμοποιείται για να αποδώσει την ικανότητα στην αντίσταση των αλλαγών των χαρακτηριστικών και των ιδιοτήτων τους κατά τη διάρκεια του χρόνου. Ένα γαλάκτωμα χαρακτηρίζεται ασταθές εξαιτίας φυσικών και χημικών φαινομένων. Η φυσική αστάθεια χαρακτηρίζεται από αλλαγή της κατανομής του χώρου ή της δομής των σωματιδίων του γαλακτώματος, ενώ η χημική αστάθεια από μετατροπή της χημικής δομής του γαλακτώματος. Φυσική αστάθεια αποτελούν η κρεμοποίηση, η κροκίδωση, η συνένωση (Εικόνα 1). Η οξείδωση και η υδρόλυση αποτελούν χημική αστάθεια. [112] 34

50 Εικόνα 9. Σχηματική απεικόνιση των μηχανισμών αποσταθεροποίησης των γαλακτωμάτων Κρεμοποίηση - Καθίζηση (Creaming) Στα γαλακτώματα τα σταγονίδια ελαίου έχουν διαφορετική πυκνότητα από την υδατική φάση που τα περιβάλλει. Eάν τα σταγονίδια ελαίου έχουν μικρότερη πυκνότητα από την υδατική φάση που τα περικλύει τότε αυτά έχουν την τάση να ανεβαίνουν προς τα πάνω και το φαινομενο ονομάζεται κρεμοποίηση. Αντιθέτως αν έχουν υψηλότερη πυκνότητα από την υδατική φάση τότε αυτά κινούνται προς τα κάτω και το φαινόμενο ονομάζεται καθίζηση. Η κρεμοποίηση παρατηρείται στα o/w γαλακτώματα ενώ η καθίζηση στα w/o. Η κρεμοποίηση συμβάλλει στην ποιότητα των γαλακτώματων αρνητικά. Τα γαλακτώματα αποκτούν ανομοιογένεια η οποία δεν είναι αρεστή από τους καταναλωτές. Επίσης το ιξώδες και ως αποτέλεσμα η υφή των γαλακτωμάτων εξαρτώνται από το φαινόμενο αυτό καθώς η φάση που περιέχει μεγαλύτερο ποσοστό λιπιδίων δίνει ιξώδες αρκετά μεγάλο ενώ η φάση που είναι φτωχότερη σε λιπιδία εμφανίζει χαμηλότερο ιξώδες. Επιπλέον φαινόμενα που μπορούν να εμφανιστούν όταν τα λιπιδία παραμένουν αρκετό καιρό σε επαφή κατά τον βαρυτικό διαχωρισμό είναι η κροκίδωση και τελικά η συνένωση. [113,114,115,112, 116,117] Σύμφωνα με την φυσική ερμηνεία του βαρυτικού διαχωρισμού(νόμος του Stokes) κατά την κρεμοποίηση οι δυνάμεις που δρούν σε ένα σφαιρικό σωματίδιο καθορίζουν την ταχύτητα με την οποία αυτό πορεύεται ανοδικά στο γαλάκτωμα (Εικ.2.6). Στην περίπτωση που το σωματίδιο αυτό έχει πυκνότητα χαμηλότερη από αυτή της συνεχής φάσης τότε η δύναμη Fg καθορίζει την ανοδική του τάση. [118,116] Όπου: 35

51 g: επιτάχυνση της βαρύτητας r: ακτίνα σφαιρικού σταγονιδίου ρ: πυκνότητα Οι δείκτες 1 και 2 αντιστοιχούν στη συνεχή φάση και στο σταγονίδιο, αντίστοιχα. Το σωματίδιο καθώς πορεύεται στο άνω τμήμα του γαλακτώματος αναπτύσσεται στην επιφάνεια του μία δύναμη αντίστασης Ff ως προς τη κίνηση του που προκύπτει από τη συνεχή φάση u: ταχύτητα κρεμοποίησης n1: ιξώδες διάτμησης Ο συνδοιασμός των παραπάνω εξισώσεων θα δώσει την ταχύτητα κρεμοποίησης του γαλακτώματος (νόμος Stokes) η οποία αποτελεί την σταθερή ταχύτητα του σταγονιδίου κατά την ανοδική κατεύθυνση του. Η ίδια σχέση ισχύει και στην περίπτωση που ο βαρυτικός διαχωρισμός γίνεται μέσω του φαινομένου της καθίζησης αν και στις περισσότερες περιπτώσεις αυτός πραγματοποιείται μέσω της κρεμοποίησης. Το πρώτο στάδιο της κρεμοποίησης είναι η κίνηση των σταγονιδίων στο ανώτερο τμήμα του γαλακτώματος λόγω της μικρής συγκέντρωσης των σταγονιδίων με αποτέλεσμα τα πιο χαμηλά στρώματα να εμφανίζονται πιο διαυγή. Στην συνέχεια τα σωματίδια καθώς πλησιάζουν όλο και περισσότερο το ένα το άλλο σχηματίζουν κρεμώδες στρώμα, του οποίου το πάχος καθορίζεται από το πόσο τα σταγονίδια πλησιάζουν μεταξύ τους και από την συγκέντρωση τους. Μικρό πάχος στοιβάδων δημιουργούν τα σωματίδια που πλησιάζουν μεταξύ τους σχηματίζοντας ισχυρά συσσωματώματα, ενώ μεγαλύτερο πάχος στρώματος δημιουργούν τα σωματίδια που οι μεταξύ τους απόσταση είναι σαφώς μεγαλύτερη και σχηματίζουν χαλαρά συσσωματώματα. Κατά την κρεμοποιήση το γαλάκτωμα είναι δυνατόν να επανέλθει στην αρχική του μορφή με ελαφριά ανάδευση, με την πάροδο του χρόνου όμως το φαινόμενο της κρεμοποίησης θα επανεμφανιστεί. [119] 36

52 4.5.2.Κροκίδωση (Flocculation) Στα αραιά γαλακτώματα ο βαρυτικός διαχωρισμός επέρχεται γρηγορότερα με το φαινόμενο της κροκίδωσης το οποίο μειώνει την σταθερότητα τους. Κατά την κροκίδωση τα σταγονίδια ελαίου συσσωματώνονται και δημιουργούν χαλαρά συσσωματώματα, στα οποία αυτά χαρακτηρίζονται από την διατήρηση της ακεραιότητας τους. Συνέπειες της κροκίδωσης για το γαλάκτωμα είναι η αύξηση του ιξώδους του και η δημιουργία πηκτής. Οι κροκίδες που σχηματίζονται στο γαλάκτωμα είναι δυνατόν να διασπαστούν με ανάδευση και το γαλακτώμα να αποκτήσει την αρχική του μορφή. Κατά την κίνηση brown τα λιποσφαίρια που είναι ελαφρώς συνδεδεμένα μεταξύ τους με ελκτικές δυνάμεις συγκρούονται σε αυξημένη συχνότητα με αποτέλεσμα να συσσωματώνονται σε μεγαλύτερο βαθμό. Οι δυνάμεις που κυριαρχούν σ αυτή την συσσωμάτωση είναι οι δυνάμεις Van der Waals που δημιουργούνται από τα προσροφημένα μόρια των γαλακτωματοποιητών. [116] Συνένωση- Συγχώνευση (Coalescence) Ο μη αντιστρεπτός διαχωρισμός των δύο φάσεων επέρχεται με το φαινόμενο της συγχώνευσης. Τα σταγονίδια ελαίου συνδέονται μεταξύ τους προς σχηματισμό μεγαλύτερων σταγονιδίων κατά την αποσύνθεση του διεπιφανειακού υμενίου. Ο διαχωρισμός των δύο φάσεων γίνεται αντιληπτός με τον σχηματισμό της ελαιώδους φάσης στο άνω μέρος τους γαλακτώματος. Η συγχώνευση παρουσιάζεται κυρίως όταν τα λιποσφαιρίδια είναι συσσωματωμένα για μεγάλη χρονικά διαστήματα. [116] Αναστροφή φάσεων (Phase inversion) Κατά την αναστροφή φάσεων ένα σύστημα μετατρέπεται από γαλάκτωμα τύπου έλαιο-σε-νερό σε γαλάκτωμα τύπου νερό-σε-έλαιο, ή αντίστροφα. Αυτή προκαλείται από κάποια μεταβολή στη σύνθεση του γαλακτώματος ή στις συνθήκες του συστήματος, όπως για παράδειγμα η αναλογία 37

53 των δύο φάσεων, τον τύπο και τη συγκέντρωση του γαλακτωματοποιητή τη θερμοκρασία ή μετά από μηχανική ανάδευση. [19] 4.6 Φυσικοχημικός χαρακτηρισμός γαλακτωμάτων Μέθοδοι ελέγχου τύπου γαλακτώματος Ο προσδιορισμός του τύπου ενός γαλακτώματος μπορεί να γίνει με τους παρακάτω τρόπους: Μικροσκοπικά: Με την προσθήκη χρωστικής στο διάλυμα. Εάν επιλέξουμε υδατοδιαλυτή χρωστική και το γαλάκτωμα αποκτήσει ομοιόμορφο χρώμα τότε το γαλάκτωμα είναι τύπου O/W, ενώ αν προκύψουν έγχρωμες κοιλίδες τότε το γαλάκτωμα είναι W/O Μακροσκοπικά: Με την προσθήκη νερού στο γαλάκτωμα. Εάν έπειτα από ήπια ανάδευση το νερό ενσωματωθεί στο γαλάκτωμα τότε πρόκειται για τύπο O/W, ενώ αν δεν ενσωματωθεί τότε το γαλάκτωμα είναι W/O. Επίσης εάν η μεταβολή της αγωγιμότητας μετά την προσθήκη NaCl είναι αυξημένη τότε το γαλάκτωμα είναι O/W. [118] Τεχνικές φυσικοχημικού χαρακτηρισμού γαλακτωμάτων και νανογαλακτωμάτων Οπτική μικροσκοπία (Optical microscopy) Ως οπτικά αναφέρονται τα μικροσκόπια που χρησιμοποιούν το τμήμα του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος που είναι ορατό, δηλαδή από 38-76nm. Ανάλογα με τη διάταξη των φακών και τον τρόπο παρατήρησης τα οπτικά μικροσκόπια διακρίνονται σε μικροσκόπια φωτεινού πεδίου, σκοτεινού πεδίου ή αντίθεσης φάσεως.το φως διαδίδεται με δύο κύματα, το ηλεκτρικό και το μαγνητικό, που είναι άρρηκτα συνδεδεμένα μεταξύ τους, και κάθετα το ένα στο άλλο, έχοντας την ίδια φάση και την ίδια ταχύτητα. [12] Το μικροσκόπιο αποτελείται από ένα μεγεθυντικό σύστημα μέσω του οποίου ο παρατηρητής βλέπει το πρώτο είδωλο με ένα φακό που παράγει ένα δεύτερο πραγματικό είδωλο σε μεγέθυνση. Ένα φωτεινό πεδίο αναφέρεται στη σκοτεινή εμφάνιση ενός τεχνητά ή φυσικά χρωματισμένου δείγματος, διαφανούς ή αδιαφανούς, σε σχέση με ένα φωτεινό άσπρο υπόστρωμα. Οι ακτίνες που 38

54 αντανακλώνται κάθετα προς το δείγμα δείχνουν την περιοχή φωτεινή ενώ οι ακτίνες που ανακλώνται πλάγιαδείχνουν την περιοχή σκοτεινή. Οι σκοτεινές και φωτεινές περιοχές μαζί μας δίνουν στοιχεία για το δείγμα μας Στατική σκέδαση φωτός (Static Ligth Scattering, SLS) Στην τεχνική της στατικής σκέδασης φωτός ο µέσος όρος της σκεδαζόµενης έντασης µελετάται συναρτήσει της γωνίας σκέδασης. Με αυτό τον τρόπο καθίσταται δυνατό να υπολογίσουµε τη µέση µοριακή µάζα κατά βάρος Μw του µορίου, το τετράγωνο της γυροσκοπικής ακτίνας Rg, και τον δεύτερο συντελεστή virial Α2. [121] Οι αρχικές έρευνες σκέδασης του φωτός από διαλύματα πραγματοποιήθηκαν από τον Faraday, καθώς μελετούσε κολλοειδείς διασπορές του χρυσού. [122] Ο Tyndall που μελετούσε το φαινόµενο το 1871, διαπίστωσε ότι τα αποτελέσµατα ήταν εντονότερα όταν χρησιµοποιούσε το µπλε φως αντί για το κόκκινο. Αργότερα την πορεία του Tyndall ακολούθησε ο Rayleigh, ο οποίος μελέτησε και αυτός την σκέδαση του φωτός. Λαµβάνοντας υπόψην την τυχαία κατανοµή των µορίων στον χώρο βρήκε χρησιµοποιώντας και την θεωρία Maxwell της ηλεκτροδυναµικής την σχέση που σήµερα ονοµάζεται λόγος του Rayleigh της σκεδαζόµενης έντασης. Η ένταση της προσπίπτουσας ακτινοβολίας δίδεται από την σχέση (3): R(θ) = (Ιr 2 /Io) = (8π 2 /λo 4 ) Νκακ 2 (1+cos 2 θ) R(θ): λόγος του Rayleigh ως συνάρτηση της σκεδαζόµενης γωνίας θ Ι: ένταση της σκεδαζόµενης ακτινοβολίας Ιο: ένταση της προσπίπτουσας ακτινοβολίας r: απόσταση µεταξύ ανιχνευτή και σκεδάζοντα όγκου λο: µήκος κύµατος της προσπίπτουσας ακτινοβολίας στο κενό Νκ: αριθµός των σκεδαζόντων κέντρων ακ: πολωσιµότητα του σκεδάζοντος κέντρου κ θ: γωνία µεταξύ προσπίπτουσας και σκεδαζόµενης ακτινοβολίας 39

55 Οι Einstein και Smoluchowski εξέλιξαν την παραπάνω θεωρία. Αυτοί θεώρησαν ότι η διακύµανση της πολωσιµότητας α σε ένα υγρό ή διάλυµα περιγράφεται ως παράγοντας διακύµανσης της πυκνότητας και της συγκέντρωσης εξαιτίας των θερµικών κινήσεων των µορίων. Η σκέδαση είναι δυνατόν να πραγματοποιηθεί εφόσον υπάρχουν διαφορές µεταξύ του δείκτη διάθλασης του στοιχειώδους όγκου συγκρινόµενος µε τον όγκο του γειτονικού. Αυτόι κατέληξαν στην εξίσωση (4): Κc/R(θ) = (1/Μ + 2Α2c + 3Α3c 2 + ) (4) µε Κ = [(4π 2 nο 2 )/(λο 4 ΝΑ)] (dn/dc) 2 ΝΑ: σταθερά Avogardro n,nο: δείκτης διάθλασης του διαλύµατος και του διαλύτη αντίστοιχα c: συγκέντρωση της διαλυµένης ουσίας (dn/dc): διαφορικός δείκτης διάθλασης Μ: µοριακό βάρος της διαλυµένης ουσίας Η εξίσωση αυτή ισχύει για µόρια µικρού µεγέθους που είναι τυχαία κατανεµηµένα στον χώρο και συμπεριφέρονται σαν σηµειακά δίπολα. Λαµβάνοντας υπόψην και το µέγεθος των µορίων καταλήγουμε στην σχέση του Zimm (5): Κc/R(θ) = 1/Mw(1 + 1/3 q 2 <Rg 2 >z) + 2A2c + (5) φτιάχνοντας την γραφική παράσταση του Κc/R(θ) συναρτήσει του παράγοντα q 2 + kc µπορούµε να επεκτείνουµε για c και q 2 (Εικόνα 12). Από την τοµή λόγω της εξάρτησης από την συγκέντρωση c και του κυµαταρίθµου q 2 βρίσκουμε την µέση µοριακή µάζα κατά βάρος Μw και από την κλίση βρίσκουμε το τετράγωνο της γυροσκοπικής ακτίνας <Rg 2 >z και τον δεύτερο συντελεστή virial Α2. [121] 4

56 Εικόνα 1. Τυπικό διάγραμμα Zimm. [121] Φυσικοί όπως οι Clebsch, Lorenz, Debye και Mie ανέπτυξαν πιο σύνθετες θεωρίες με σκοπό να συμπεριλάβουν σωματίδια με μεγαλύτερο μέγεθος στα μοντέλα τους και ευρύτερα πεδία δεικτών διάθλασης, όπως και να υπολογίσουν την απορρόφηση του φωτός εκτός από την σκέδαση του. Η πιο πλήρης θεωρία ήταν αυτή του Gustav Mie (198). Βάση αυτής της θεωρίας καθίσται σήμερα ικανός ο υπολογισμός του μεγέθους των σωματιδίων από την σκέδαση του φωτός. Οι σημερινοί υπολογιστές είναι ικανοί να αντεπεξέλθουν στις μεγάλες υπολογιστικές απαιτήσεις της θεωρίας του Mie. Στην περίπτωση που το μέγεθος των σωματιδίων είναι πολύ μικρό, οι εξισώσεις του Mie ανάγονται σε εξισώσεις του Raylight. Ενώ για αρκετά μεγαλύτερα σωματίδια προτιμάται από την θεωρία του Mie η θεωρία του Fraunhofer, η οποία εφαρμόζεται για σωματίδια μεγαλύτερα από 1μm. [124] Όργανα που χρησιμοποιούνταν στο παρελθόν καθώς και ορσμένα σημερινά στηρίζονται μόνο στην θεωρία του Fraunhofer η οποία αναφέρει ότι: Το σωματίδιο είναι αρκετά μεγαλύτερο από το μήκος κύματος του φωτός που υπάρχει(το ISO1332 ορίζει αυτό να είναι μεγαλύτερο από 4λ π.χ. 25μm, όταν χρησιμοποιείται λέιζερ τύπου He-Ne). Όλα τα σωματίδια ανεξαρτήτου μεγέθους σκεδάζονται με την ίδια ικανότητα. Τα σωματίδια είναι αδιαφανή και δεν μεταφέρουν φως. Αυτές οι θεωρίες δεν εφαρμόζονται για όλα τα υλικά, ενώ για μικρά υλικά το ποσοστό σφαλμάτων πλησιάζει 3%. Όταν το μέγεθος σωματιδίου είναι κοντά σ το μήκος κύματος του φωτός τότε η σκέδαση θα μετατραπεί σε μία σύνθετη διαδικασία με μέγιστα και ελάχιστα. Οι σύγχρονοι εξοπλισμοί (π.χ. Mastersizer 2, Malvern instruments) στηρίζονται στην θεωρία του Mie, η οποία βρίσκει λύση σε όλες τις εξισώσεις αλληλεπίδρασης του φωτός. Η θεωρία του Mie στηρίζεται 41

57 στην υπόθεση του όγκου του σωματιδίου ενώ η θεωρία του Fraunhofer αποτελεί πρόβλεψη προβαλλόμενης περιοχής. Προυπόθεση για αυτήν την ακρίβεια είναι ότι οι δείκτες διάθλασης για το υλικό και το μέσο πρέπει να είναι γνωστά όπως επίσης και το κομμάτι απορρόφησης του δείκτη διάθλασης θα πρέπει να είναι γνωστό ή να το θεωρήσουμε εμείς. [124] Στη στατική σκέδαση φωτός (static light scattering), μια πολωμένη ακτίνα laser οδηγείται προς το δείγμα. (Εικόνα 13). Πίσω από αυτό, βρίσκονται φωτοευαίσθητοι ανιχνευτές οι οποί είναι τοποθετημένοι ως ομόκεντροι κύκλοι και καταγράφουν την ένταση του φωτός υπό ορισμένες γωνίες. Με αυτό τον τρόπο κατασκευάζεται ένα διάγραμμα έντασης του φωτός γωνίας σκέδασης. Τα μήκη κύματος και οι δείκτες διάθλασης αποτελούν δεδομένα για την εφαρμογή της θεωρίας του Mie, μετατρέποντας τα αρχικά δεδομένα έντασης γωνίας σκέδασης σε ένα διάγραμμα κατανομής μεγεθών σωματιδίων. Για να ελαχιστοποιηθούν τυχόν προβλήματα που προκύπτουν από την πολλαπλή σκέδαση του φωτός από πολλά σωματίδια, η απόσταση μεταξύ τους μεγαλώνει με αύξηση της αραίωσης. Εικόνα 11. Εικόνα 13. Διάταξη που χρησιμοποιήθηκε για την στατική σκέδαση του φωτός: 1) Laser, 2) κυψελίδα, 3) γωνιόμετρο, 4) ανιχνευτής, 5) φωτοπολλαπλασιαστής, 6) μετρητής φωτονίων, 7) υπολογιστής και 8) εκτυπωτής. [122] Η εύρεση της κατανομής μεγέθους σταγονιδίων εξασφαλίζεται από την μέτρηση της διαμέτρου των σταγόνων μέσω της σκέδασης του φωτός με ακτίνες 42

58 laser. Ο τρόπος συλλογής και ανάλυσης των δεδομένων της κατανομής μεγέθους των σταγονιδίων, ορίζει μέσες τιμές που διαφέρουν μεταξύ τους. Κάποιοι από τους ευρέως χρησιμοποιούμενους είναι οι εξής: Ο μέσος αριθμός μήκους ή αριθμητικός μέσος (D[1,]) λαμβάνεται υπόψη για τον αριθμό των σταγονιδίων και υπολογίζεται μόνο όταν είναι γνωστός ο ολικός αριθμός τους στο δείγμα. Υπολογίζεται σύμφωνα με την εξίσωση (6): D[1,] = [ Σnidi ]/[ Σni] (6) Η μέση διάμετρος όγκου σταγονιδίων (D[4,3]), αντιπροσωπεύει το μέγεθος των σταγονιδίων που αποτελούν τον κύριο όγκο της ποσότητας του δείγματος. Εξίσωση (7) : D[4,3] = [ Σnidi 4 ]/[ Σnidi 3 ] (7) Η μέση διάμετρος επιφανειακού εμβαδού σταγονιδίων ή μέση διάμετρος Sauter (Sauter mean diameter) (D[3,2]) χρησιμοποιείται σε εφαρμογές που το ειδικό επιφανειακό εμβαδό (specific surface area) καθίσται σημαντικό. Είναι περισσότερη ευαίσθητη για μικρά σταγονιδία στην κατανομή μεγέθους. Θεωρείται και ως η μέση διάμετρος της πρωτογενούς κατανομής μεγέθους σταγονιδίων. Εξίσωση (8): D[3,2] = [ Σnidi 3 ]/[ Σnidi 2 ] (8) Σε όλες τις μέσες τιμές, niείναι το πλήθος των σταγονιδίων και di η διάμετρός τους. [125] Δυναμική σκέδαση φωτός (Dynamic Light Scattering, DLS) H δυναμική σκέδαση ονομάζεται αλλιώς φασματοσκοπία συσχέτισης φωτονίων (photon correlation spectroscopy, PCS). Η τεχνική της δυναμικής σκέδασης του φωτός αποτελεί καθιερωμένη τεχνική μέτρησης του συντελεστή διάχυσης (μεταφοράς και περιστροφής) σε αραιά διαλύματά τους, όπως 43

59 επίσης και του μεγέθους, του σχήματος των σωματιδίων, των χρόνων χαλάρωσης και της πολυδιασποράς του συστήματος. [122] Είναι γρήγορη, μη-καταστρεπτική τεχνική και χρειάζεται ελάχιστη προετοιμασία του δείγματος. Στηρίζεται στο ότι τα σωματίδια (μακρομόρια, νανοσωματίδια) κινούνται διαρκώς τυχαία μέσα στο μέσο διασποράς, εξαιτίας της θερμικής ενέργειας, που μεταφέρεται σε αυτά μέσω των συγκρούσεων με τα μόρια του διαλύτη (κίνηση Brown). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα η ένταση της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας από το διάλυμα να συνδέεται ποσοτικά με την κίνηση των σωματιδίων. Η σκέδαση της μονοχρωματικής ακτινοβολίας από το διάλυμα είναι φαινόμενο των διακυμάνσεων, που προέρχονται από την κίνηση Brown και η έντασή της μεταβάλλεται με το χρόνο. [126,127] Η μέθοδος DLS βρίσκει εφαρμογή στον υπολογισμό της υδροδυναμικής ακτίνας Rh των σταγονιδίων στο διάλυμα. Πιο συγεκριμένα χρησιμοποιείται μονοχρωματική ακτινοβολία και πραγματοποιείται μέτρηση, υπό συγκεκριμένη γωνία, τη χρονικής διακύμανσης της έντασης της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας υπό γωνία θ. Η χρονική διακύμανση παρουσιάζεται καθώς η ένταση του σκεδαζόμενου φωτός στον ανιχνευτή προκύπτει από την συμβολή της ακτινοβολίας σωματιδίων, τα οποία κινούνται λόγω θερμικής κίνησης προς όλες τις κατευθύνσεις. [128] Η κίνηση αυτή, εκτός από το μέγεθος των νανοσωματιδίων, επηρεάζεται επίσης και από το ιξώδες του διαλύτη, το οποίο και αυτό εξαρτάται από τη θερμοκρασία. Επομένως προκειμένου να πραγαματοποιηθεί η μέτρηση της κινητικότητας των σωματιδίων μέσα σε ένα διάλυμα κρίσιμη προυπόθεση είναι οι μετρήσεις πραγματοποιούνται υπό καθορισμένη και σταθερή θερμοκρασία. Η ταχύτητα της θερμικής κίνησης των νανοσωματιδίων μπορεί να αποδωθεί με τον μεταφορικό συντελεστή διάχυσης των σωματιδίων στο διάλυμα. [129] Στην περίπτωση που στον όγκο σκέδασης βρίσκονται αρκετοί σκεδαστές, τότε το σκεδαζόμενο πεδίο χαρακτηρίζεται από την κατανομή Gauss και η κανονικοποιημένη συνάρτηση αυτοσυσχέτισης της σκεδαζόμενης έντασης, g (2) (t), σχετίζεται με την κανονικοποιημένη συνάρτηση αυτοσυσχέτησης του πεδίου, g(1)(t) με τη σχέση (9) του Sieggert: g (2) (t) = 1 + ǀg (1) (t)ǀ 2 (9) 44

60 Για τα μη σφαιρικά σωματίδια που είναι μικρά σε σχέση με το αντίστροφο του διανύσματος σκέδασης, q, καθώς και για τα αραιά διαλύματα μονοδιάσπαρτων σφαιρικών σωματιδίων, η συνάρτηση αυτοσυσχέτησης δίνεται από την την σχέση (1): ǀg (1) (t)ǀ = exp(-γ t) (1) Όπου Γ = Dq 2 και q το διάνυσμα σκέδασης. Εξίσωση(11) : q = (4πn/λ)*sin(θ/2) (11) Ως D ορίζεται ο μεταφορικός συντελεστής διάχυσης των σωματιδίων που αντιπροσωπεύει την υδροδυναμική τους ακτίνα (Rh).Εξίσωση των Stokes-Einstein: (12) D = (KBT)/(6πηRh) (12) όπου ΚΒ, Τ και η αντιπροσωπεύουν αντίστοιχα τη σταθερά Boltzmann, την απόλυτη θερμοκρασία και το ιξώδες του διαλύτη. Στα σφαιρικά σωματίδια η υδροδυναμική ακτίνα (Rh) ισοδυναμεί με τη γεωμετρική ακτίνα R. Για μη σφαιρικά ισοδυναμεί με τη διάμετρο ιδεατής σφαίρας, που έχει τον ίδιο συντελεστή διάχυσης με το σωματίδιο. [122] Η διάταξη DLS αποτελείται από έξι κύρια τμήματα (Εικόνα 7) : Πηγή φωτός (Laser He-Ne, λ = 633nm), που η δέσμη της περνάει μέσα από το δείγμα. Φίλτρα (φακούς) για την ρύθμιση της έντασης της ακτινοβολίας. Κυψελίδα με τοποθετημένο το δείγμα. Φωτοανιχνευτής, ο οποίος υπολογίζει τη σκεδαζόμενη ακτινοβολία. Ψηφιακή πλατφόρμα επεξεργασίας του σήματος της έντασης της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας (correlator). Ηλεκτρονικός υπολογιστής, ο οποίος δέχεται την προηγούμενη πληροφορία και όπου αναλύονται τα δεδομένα με το κατάλληλο κάθε φορά λογισμικό, παρέχοντας πληροφορίες για το μέγεθος των σωματιδίων. [129] 45

61 Ηλεκτροφορητική σκέδαση φωτός (Electrophoretic Light Scattering) Η επιφάνεια των σωματιδίων χαρακτηρίζεται από την ύπαρξη μεγάλης συγκέντρωσης αντισταθμιστικών ιόντων. Αυτό οφείλεται στο καθαρό φορτίο που υπάρχει στα κολλοειδή σωματίδια το οποίο συμβάλλει στην κατανομή των ιόντων κοντά στην επιφάνεια του σωματιδίου. Ως αποτελέσμα αυτού του φαινομένου είναι η παρουσία μιας ηλεκτρικής διπλοστιβάδας στην διεπιφάνεια σωματιδίουυγρού. Η στοιβάδα αυτή περιέχει δύο ξεχωριστές περιοχές: Ένα εσωτερικό τμήμα που ονομάζεται στοιβάδα Stern,στην οποία τα ιόντα είναι ισχυρά δεσμευμένα με την φορτισμένη περιοχή και ένα εξωτερικό τμήμα την στοιβάδα Gouy-Chapman.η στοιβάδα αυτή χαρακτηρίζεται από την ιοσορροπία των ηλεκτροστατικών δυνάμεων και της τυχαίας θερμικής κίνησης. Η ισορροπία αυτή καθορίζει την κατανομή των αντισταθμιστικών ιόντων. Η ύπαρξη φορτισμένων σωματιδίων σε ηλεκτρικό πεδίο οδηγεί σε κίνηση ως ενιαίο σώμα των σωματιδίων αυτών με τα κοντινά τους αντισταθμισιτκά ιόντα(στοιβάδα Stern) προς ηλεκτρόδιο αντίθετης πολικότητας. Η στοιβάδα που σχηματίζουν τα αντισταθμιστικά ιόντα που κινούνται με το φορτισμένο σωματίδιο ονομάζεται και επίπεδο διάτμησης ή ολίσθησης. Ζ-δυναμικό ορίζεται ως το δυναμικό που εμφανίζεται μεταξύ της στοιβάδας Stern(εσωτερική στοιβάδα) και της εξωτερικής στοιβάδας (Εικόνα 14). Το δυναμικό που αναπτύσσεται στην επιφάνεια των φορτισμένων σωματιδίων είναι αυτό που θα καθορίσει το πρόσημα του ζ-δυναμικού το οποίου σε αντίθεση με το πρώτο δεν είναι εύκολη η πειραματική μέτρηση του. Ο έλεγχος της σταθερότητας των κολλοειδών συστήματων περιλαμβάνει την μέτρηση του ζ- δυναμικού. Απαραίτητο κριτήριο για την σταθερότητα των συστημάτων αποτελεί η υπερνίκηση των ηλεκτροστατικών απωστικών δυνάμεων μεταξύ των σωματιδίων έναντι των ελκτικών δυνάμεων Van der Walls που αναπτύσσεται στα όμοια σωματίδια. Έτσι όταν η τιμή του ζ-δυναμικού πλησιάζει στο μηδέν τότε παρατηρείται αυξημένη συσσωμάτωση μεταξύ των σωματιδίων και η καταβυθίση τους ενώ όταν η απόλυτη τιμή του ζ δυναμικού είναι μεγαλύτερη απο 3mv τότε το σύστημα χαρακτηρίζεται από σταθερότητα καθώς αναπτύσσονται ισχυρές αμοιβαίες ηλεκτροσταστικές απώσεις μεταξύ των σωματιδίων. Επομένως επαληθεύεται ότι ένα πολύ σημαντικό κριτήριο για τον χαρακτηρισμό των κολλοειδών συστημάτων είναι η τιμή του ζ δυναμικού. Η αρχή της μέτρησης του 46

62 ζ-δυναμικού περιλαμβάνει την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου με την εμβάπτιση ηλεκτροδίων σε δείγμα κολλοειδούς. Εξαιτίας του πεδίου τα σωματίδια θα κινηθούν προς το αντίθετα φορτισμένο ηλεκτρόδιο. Η κίνηση αυτή όμως επιβραδύνεται από τις ιξώδεις δυνάμεις που αναπτύσσονται στο σωματίδιο με αποτέλεσμα να επιτυγχάνεται ισορροπία μεταξύ του ιξώδους και της ηλεκτροστατικής έλξης. Αποτέλεσμα της ισορροπίας αυτής είναι τα σωματίδια να κινούνται εν τέλη με μία σταθερή ταχύτητα η οποία είναι εξαρτώμενη από την διηλεκτρική σταθερά και το ιξώδες του μέσου,τα οποία είναι γνωστά, την εφαρμοσμένη ένταση του ηλεκτρικού πεδίου και το ζ δυναμικό. Συνεπώς για τον υπολογισμό του ζ δυναμικού είναι απαραίτητη η μέτρηση της ταχύτητας των σωματιδίων. Η μέτρηση του ζ-δυναμικού περιλαμβάνει αρχικά την τοποθέτηση του δείγματος του κολλοειδούς σε μία κυψελίδα η οποία με τη βοήθεια των δύο ηλεκτροδίων θα υποστεί ηλεκτροφόρηση. Στη συνέχεια μία δέσμη μονοχρωματικής ακτινοβολίας (laser) θα προσπέσει στο δείγμα έτσι ώστε να αναπτυχθεί σκεδαζόμενη ακτινοβολία η οποία συλλέγεται στον ανιχνευτή (εικόνα 15). Η μεταβολής των συχνοτήτων της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας εξαρτάται από την ταχύτητα που θα αναπτύξουν τα σωματίδια κατά την κίνηση τους. Όσο μεγαλύτερη είναι η ταχύτητα τους τόσο μεγαλύτερες θα είναι και η μεταβολές της συχνότητας (φαινόμενο Doppler). Με την βοήθεια ενός διαχωριστή(splitter) ένας μέρος της ακτινοβολίας(laser) δεν καταφέρνει να φτάσει στο δείγμα και έτσι κατευθύνεται ανέπαφο προς τον ανιχνευτή. Οι δύο αυτές διαφοροτικές ακτινοβολίες που καταφτάνουν στον ανιχνευτή,συσχετίζονται,με σκοπό μέσω του φαινομένου Doppler, να προσδιοριστεί η ταχύτητα των σωματιδίων του κολλοειδούς. Ένα σταθερό ηλεκτρικό πεδίο αναπτύσσεται μέσω των ηλεκτροδίων που είναι τοποθετημένα μέσα στο δείγμα. Αποτέλεσμα του ηλεκτρικού πεδίου είναι η κίνηση των σωματιδίων προς την κατεύθυνση που βρίσκεται το ηλεκτρόδιο με την αντίθετη πολικότητα. Αρκετά σύντομα επιτυγχάνεται μια ισορροπία μεταξύ των φαινομένων της ηλεκτροστατικής έλξης και του ιξώδους μέσου, λόγω των ιξώδων δυνάμεων που αναπτύσσονται στο σωματίδιο. Αποτέλεσμα της ισορροπία είναι τα σωματίδια να αποκτούν σταθερή ταχύτητα η οποία εξαρτάται από την ένταση του ηλεκτρικού πεδίου, τη διηλεκτρική σταθερά και το ιξώδες του μέσου και το ζ- δυναμικό. Το ιξώδες και η διηλεκτρική σταθερά αποτελούν γνωστές παραμέτρους 47

63 για ένα υδατικό αιώρημα με αποτέλεσμα το μόνο που χρειάζεται για την εύρεση του ζ-δυναμικού των σωματιδίων είναι η ταχύτητα με την οποία κινούνται. [129] Εικόνα 12. Σχηματική απεικόνιση της διασποράς των ιόντων του διαλύματος γύρω από ένα φορτισμένο σωματίδιο. [13] Εικόνα 13. Σχηματική αναπαράσταση μιας πειραματικής διάταξης μέτρησης του ζ- δυναμικού. Τα σωματίδια κινούνται προς τα αντίθετα φορτισμένα ηλεκτρόδια και με μια δέσμη laser μετράται η ταχύτητά τους. [129] Υγρή Χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού (molecular exclusion liquid chromatography) Στην υγρή χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού (molecular exclusion liquid chromatography), τα μόρια των συστατικών (συνήθως μεγαλομόρια) ενός μείγματος, μετακινούμενα με τη βοήθεια μιας υγρής κινητής φάσεως μέσα από το πορώδες δίκτυο της στατικής φάσεως, διαχωρίζονται με βάση το μέγεθος τους, χωρίς άλλη αλληλεπίδραση, σε ιδανικές συνθήκες, με τη στατική φάση. Ανόργανα (φυσικοί και συνθετικοιί ζεόλιθοι) και οργανικά (μη ιονικά διακλαδούμενα πολυμερή) υλικά σχηματίζουν ένα δικτυωτό σύμπλεγμα μοριακών διαστάσεων, με 48

64 μέγθειος πόρων που βρίσκεται μέσα σε μία ορισμένη περιοχή τιμών. Το δικτυωτό αυτό σύμπλεγμα, λειτουργώντας ως μοριακό κόσκινο, επιτρέπει την είσοδο στο εσωτερικό του μόνο των ιόντων και μορίων, που έχουν μέγεθος μικροτερο από το μέγεθος των πόρων του. Ουσίες μεγαλύτερου μεγέθους αποκλείονται από το να εισέλθουν στο δίκτυο και παρασυρόμενς από την κινητή φάση εκλούονται πρώτες. Οι υπόλοιπες ουσίες, ανάλογα με το μέγεθος τους, περιπλανώνται λιγότερο ή περισσότερο στο δικτυωτό σύμπλεγμα της στατικής φάσεων και εκλούονται κατά σειρά μεγέθους. Ως στατικές φάσεις χρησιμοποιούνται κυρίως υδρόφιλες πηκτές(γέλες,gels), από διακλαδούμενα πολυμερής τες δεξτράνης (Sephadex G) σε συνδυασμό με υδατική κινητή φάση(η τεχνική αυτή λέγεται και διήθηση πηκτής (gel filtration). Στο εμπόριο διατίθενται υλικά παρασκευής πηκτών με ποικιλία μεγέθους πόρων,που καθορίζει και την περιοχή μοριακών βαρών των ουσιών για αποδοτικό διαχωρισμό. Για παράδειγμα η πηκτή Sephadex G-25 με περιοχή κλασματώσεωνς 1-5 κατακρατεί υπερβολικά ουσίες με ΜΒ<1, αποκλείει την είσοδο στο πορώδες σύμπλεγμα της ουσιών με ΜΒ>5 που επομένως εκλούονται ταχύτατα, και διαχωρίζει αποδοτικά (κλασματώνει) ουσίες με ΜΒ=1-5. [131] Έλεγχος σταθερότητας αντιοξειδωτικών Φασματοφωτομετρία Υπεριώδους - Ορατού (UV Vis) Σημαντική εφαρμογή της φασματοσκοπίας απορρόφησης αποτελεί ο ποσοτικός προσδιορισμός μεγάλου αριθμού οργανικών και ανόργανων ουσιών. Η τεχνική στηρίζεται στην απορρόφηση της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας σε μήκη κύματος:78-16nm και περιλαμβάνει την μέτρηση του ποσού απορρόφησης ή της διαπερατότητας των διαλυμάτων που είναι τοποθετημένα σε διαφανείς κυψελίδες. Στον χώρο της κυψελίδας δημιουργούνται ανακλάσεις τόσο στις δύο διεπιφάνειες μεταξύ αέρα και τοίχωμα κυψελίδας όσο και στις δύο διεπιφάνειες τοίχωμα κυψελίδας/διάλυμα. Ωστόσο η εξασθένιση μιας δέσμης είναι δυνατόν να προκύψει είτε από τη σκέδαση που προκαλείται από μεγάλα σωματίδια,είτε από την απορρόφηση από τα τοιχώματα της κυψελίδας. Γι αυτό τον λόγο η τεχνική στηρίζεται στην συγκρίσης της ισχύς της δέσμης όταν αυτή διαπερνά το δείγμα με 49

65 την ισχύ της δέσμης που διαπερνά μόνο τον διαλύτη. Ο νόμος του Beer μας δίνει την γραμμική σχέση που προκύπτει ανάμεσα στην συγκέντρωση του δείγματος που απορροφά και της απορρόφησης [7]: A= log(p/p) = -logt = αbcg/lt = εbcmol/lt [7] όπου Α η απορρόφηση του δείγματος,ρ η ισχύς της προσπίπτουσας ακτινοβολίας, Ρ η τελική ισχύς της ακτινοβολίας ύστερα από την διέλευση της μέσα από το δειγμα, Τ η διαπερατότητα, α η απορροφητικότητα και αποτελεί σταθερά, b το μήκος της διαδρομής που διένυσε η ακτινοβολία μέσα στο διάλυμα, ε ονομαζέται η μοριακή απορροφητικότητα και αποτελεί σταθερά και c η συγκέντρωση της ουσίας που απορροφά στο διάλυμα. Πολύ συχνά παρουσιάζονται αποκλίσεις μεταξύ της απορρόφησης και της συγκέντρωσης της ουσίας που απορροφά και πιο σπάνια μεταξύ της απορρόφησης και της οπτικής διαδρομής. Κάποιες φορές οι αποκλίσεις αυτές αποτελούν πραγματικούς περιορισμούς του νόμου, ωστόσο κάποιες από τις αποκλίσεις είναι είτε οργανοληπτικές που οφείλονται στον τρόπο μέτρησης της απορρόφησης είτε χημικές που προκαλούνται απο χημικές μεταβολές οι οποίες επηρέαζουν την συγκέντρωση των ουσιών. Πραγματικοί περιορισμοί Ο νόμος του Beer ισχύει για σχετικά μικρές συγκεντρώσεις του αναλυτή. Σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από,1μ η κατανομή του φορτίου μεταξύ των γειτονικών μορίων επηρεάζεται καθώς μείωνεται η απόσταση μεταξύ τους. Η κατάσταση αυτή μπορεί να προκαλέσει μεταβολή της απορρόφησης των μορίων σε συγκεκριμένο μήκος κύματος. Το ποσό της αλληλεπίδρασης μεταξύ των φορτίων των απορροφούντων μορίων εξαρτάται από την συγκέντρωση οπότε το φαινόμενο αυτό προκαλεί αποκλίσεις μεταξύ της γραμμικής σχέσης της απορρόφησης και της συγκέντρωσης. Φαινομενικές Χημικές αποκλίσεις Οι αποκλίσεις οφείλονται σε προβλήματα που προκύπτουν από τον αναλυτή. Όταν ο διαλύτης διίσταται,είναι ικανός να αντιδράσει ή να συζευχθεί με τον αναλυτή τότε τα διαφορετικά προιόντα που προκύπτουν δίνουν διαφορετικό φάσμα από τον αναλυτή Φαινομενικές οργανολογικές αποκλίσεις που οφείλονται σε πολυχρωματική ακτινοβολία. Ο νόμος του Beer μπορεί να εφαρμοστεί μόνο στην περίπτωση ύπαρξης μονοχρωματικής ακτινοβολίας. Στην πράξη όμως, είναι αδύνατον να επιτευχθεί 5

66 ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος καθώς οι συσκευές δίνουν συνήθως μήκη κύματος τα οποία είναι συμμετρικά γύρω από μία ορισμένη τιμή. Οργανολογικές αποκλίσεις που προκύπτουν από παράσιτη ακτινοβολία Η παράσιτη ακτινοβολία είναι διαφορετική από την κύρια ακτινοβολία του μονοχρωμάτωρα καθώς δεν διέρχεται από το δείγμα στην κυψελίδα και έχει διαφορετικό μήκος κύματος. Η ακτινοβολία του μονοχρωμάτορα πορεύεται συνήθως με μικρέ ποσότητες παράσιτης ακτινοβολίας ή σκέδασης. Οι αποκλίσεις αυτές δίνουν πάντα αρνητικά σφάλματα απορρόφησης. Τα τμήματα τα οποία χαρακτήριζουν τα όργανα μέτρησης της απορρόφησης είναι τα εξής: (α) η πηγή, (β) επιλογείς μήκους κύματος, (γ) ο υποδοχέας των δειγμάτων, (δ) οι μεταλλάκτες της ακτινοβολίας και (ε) οι επεξεργαστές σημάτων και ανάγνωσης των μετρήσεων. Πηγές Απαιτέιται η χρήση πηγής που είναι ικανή να παράγει συνεχές φάσμα εκπομπής του οποίου η ισχύς θα είναι όσο το δυνατόν σταθερότερη για μεγάλες ζώνες μήκους κύματος. Η αρχή της παραγωγής ενός συνεχού φάσματος στηρίζεται στην δημιουργία ενός διεγερμένου μοριακού σωματιδίου με ηλεκτρική διέγερση συνήθως δευτερίου ή υδρογόνου. Αυτό στην πορεία διίσταται σε δύο ατομικά σωματίδια με αποτελέσμα να εκπέμπεται φωτόνιο στην υπεριώδη περιοχή. Η πιο χρησιμοποιημένη πηγή ορατής και εγγύς-υπέρυθρης ακτινοβολίας είναι η λυχνία νήματος βολφραμιου. Yποδοχέας δειγμάτων Οι κυψελίδες που φιλοξενούν το δείγμα ή το διαλύτη πρέπει να επιτρέπουν την διέλευση της ακτινοβολίας άρα πρέπει να είναι κατασκευάσμενες από το κατάλληλο υλικό σε κάθε περίσταση. Όταν εργαζόμαστε σε περιοχές με μήκη κύματος κάτω από 35nm τότε είναι απαράιτητη η χρήση κυψελίδων που είναι κατασκευασμένες από χαλαζία ή τηγμένη πυριτία και οι οποίες επιτρέπουν την διέλευση της ορατής και υπέρυθρης ακτινοβολίας. Για περιοχές εργασία 35-2nm χρησιμοποείται συνήθως απλή πυριτική ύαλος ενώ για τις ορατές περιοχές μπορεί να χρησιμοποιηθεί κυψελίδα από πλαστικό. Η οπτική διαδρομή στο υπεριώδφες και ορατό είναι 1 cm, ενώ για να αποφεύγονται οι απώλειες από τις ανακλάσεις τα παράθυρα των κυψελίδων είναι κάθετα προς την πορεία της δέσμης. 51

67 Ανιχνευτές. Οι ανιχνευτές είναι κατασκευασμένοι με επίστρωση από στρώμα ημιαγωγού Si πάνω σε ηλεκτρόδιο Cu ή Fe για αυτό και ονομάζονται φωτοδίοδοι πυριτίου. Ο ημιαγωγός περιλαμβάνει στην επιφάνεια του μεταλλικό στρώμα Ag που αποτελεί δεύτερο ηλεκτρόδιο. Ροή ηλεκτρονίων με κατευθυνση από τον αγωγό προς το μεταλλικό στρώμα δημιουργείται όταν προσπέσει ακτινοβολία στον ημιαγωγό. Το μεταλλικό στρώμα διαθέτει εξωτερικό αγωγό και έτσι το κύκλωμα διαπερνάται από ασθενές ρεύμα. [132] 4.7 Νανογαλακτώματα Τα νανογαλακτώματα αποτελούν διασπορές σταγονιδίων στη νανοκλίμακα. Αυτά σχηματίζονται συνήθως με διάσπαση μεγαλύτερων σταγονιδίων που προκαλέιται με υψηλή διάτμηση. Η πλειοψηφία των σταγονιδίων έχουν ακτίνες λιγότερες από 1nm. Παρ όλο που το μέγεθος των νανογαλακτωμάτων βρίσκεται στην νανοκλίμακα, δεν είναι δυνατή η παρασκευή νανογαλακτώματος με μέγεθος χαμηλότερο από αυτό ενός επιφανειοδραστικού μικκυλίου. [133] Η επιστημονική κοινότητα πριν αρκετά χρόνια είχε υιοθετήσει τον όρο μινι-γαλακτώματα, για τα γαλακτώματα που τα σταγονίδια τους βρίσκονται στην υπομικρομετρική κλίμακα. Τα περισσότερα από τα μινι-γαλακτώματα αποτελούνται απο σταγονίδια που το μέγεθος τους κυμαίνεται από 1nm-1μm. Επομένως τα νανογαλακτώματα αντιστοιχούν στο χαμηλότερο όριο των μινιγαλακτωμάτων. [14] Οι πληροφορίες που υπάρχουν για τις φυσικές ιδιότητες των μινιγαλακτώματων, αν και έχουν επεκταθεί στην περιοχή μεγέθους των νανογαλακτωμάτων, είναι περιορισμένες Φυσικές ιδιότητες νανογαλακτωμάτων Η κύρια διαφορά των γαλακτωμάτων από τα νανογαλακτώματα είναι ότι τα πρώτα ενώ εμφανίζουν κινητική σταθερότητα ειναι θερμοδυναμικά ασταθή και οδηγούνται στο διαχωρισμό των φάσεων σε σύγκριση με τα νανογαλακτώματα που είναι θερμοδυναμικά σταθερά συστήματα. [134] 52

68 Επίσης τα νανογαλακτώματα είναι διαφανή και άχρωμα σε σύγκριση με τα γαλακτώματα τα οποία είναι θολά. Η διαφορά αυτή οφείλεται στην πολλαπλή ισχυρή σκέδαση του φωτός που συμβαίνει στα γαλακτώματα με αποτελέσμα να εμφανίζεται το λευκό χρώμα. Πιο συγκεκριμένα στα γαλακτώματα το φως διέρχεται και διαθλάται πολλές φορές μεσά από τα σταγονίδια προκαλώντας μεταβολή του δείκτη διάθλασης μεταξύ των διεσπαρμένων σταγονιδίων και της συνεχούς φάσης. Το φαινόμενο αυτό είναι αδύνατο να συμβεί στα νανογαλακτώματα καθώς το μέγεθος των σταγονιδίων είναι μικρότερο από τα μήκη κύματος του ορατού φωτός. [133] Σχηματισμός νανογαλακτωμάτων Παράγοντες σχηματισμού Για την παρασκευή ενός σταθερού γαλακτώματος με τέτοιο τρόπο, ώστε να επιτυγχάνεται το ίδιο αποτέλεσμα κάθε φορά που παρασκευάζεται, πρέπει να ελέγχεται αυστηρά ένας μεγάλος αριθμός παραγόντων. Σε αυτούς περιλαμβάνονται: η επιλογή κατάλληλης σύνθεσης ο έλεγχος της σειράς προσθήκης των συστατικών η εφαρμογή διάτμησης κατά τρόπο που θραύει αποτελεσματικά τα σταγονίδια. Ειδικότερα όμως για το σχηματισμό των νανογαλακτωμάτων υπάρχουν επιπλέον παράμετροι που παίζουν σημαντικό ρόλο κατά την παρασκευή τους. Καταρχάς, τα διασπαρμένα σταγονίδια πρέπει να είναι αδιάλυτα στη συνεχή φάση έτσι, ώστε η ωρίμανση Ostwald να μην συμβεί γρήγορα, παρά τις υψηλές πιέσεις Laplace. Η καταστολή της ωρίμανσης Ostwald μπορεί να γίνει και με άλλες μεθόδους, όμως ο ευκόλοτερος τρόπος είναι η κατάλληλη επιλογή της υγρής φάσης, ώστε τα διασπαρμένα μόρια να παραμένουν αδιάλυτα. Επίσης σημαντικό ρόλο παίζει η επιλογή των συστατικών, ειδικά των επιφανειοδραστικών, που δεν πρέπει να οδηγεί σε σχηματισμό λυοτροπικών υγρών κρυσταλικών φάσεων μικρογαλακτωμάτων. Τέτοιες ανεπιθύμητες φάσεις είναι γνωστό πως σχηματίζονται σε συστήματα που περιέχουν βραχείας αλυσίδας αλκάνια, αλκόολες και επιφανειοδραστικά. [135] 53

69 Τεχνικές σχηματισμού Αν και υψηλοί ρυθμοί διάτμησης μπορούν να επιτευχθούν από ορισμένες συσκευές, αυτή συμβαίνει κοντά στα «άκρα κοπής» (blade edges) και η μεταφορά όλων των σταγονιδίων σε αυτά τα σημεία είναι σχεδόν αδύνατη. Εξαιτίας λοιπόν της δυσκολίας κατάτμησης και διασποράς των σταγονιδίων χρησιμοποιούνται άλλοι μέθοδοι. Μία αποτελεσματική μέθοδος παρασκευής νανογαλακτωμάτων αποτελεί η εφαρμογή υπερήχων σε ήδη προετοιμασμένα μικρογαλακτώματα. Τα μικρογαλάκτωμα αναδεύονται με τη βοήθεια υπερήχων σε συχνότητες γύρω στα 2KHz εφαρμώζοντας υψηλή ισχύ για την διάτμηση των σταγονιδίων. Μία δεύτερη μέθοδος που χρησιμοποείται είναι η εφαρμοφή συσκευών μικρορευστοποίησης (microfluidic) υψηλής πίεσης με σκοπό την διάτμηση των σταγονιδίων του γαλακτώματος. Τα ρεύματα που προκαλούνται από το προαναμεμειγμένο γαλάκτωμα ρέουν μέσω διαύλων που έχουν κατασκευαστεί από ανοξείδωτο χάλυβα, οδηγώντας σε μία δυνατή εκτατική ροή. Σημειώνεται ότι στο προαναμεμειγμένο γαλάκτωμα το μέγεθος των σταγονιδίων είναι μικρότερο από 1μm, και οι δίαυλοι έχουν μέγεθος περίπου 1μm. Στη συνέχεια αέρας υψηλής πίεσης, εφαρμόζεται μέσω εμβόλου με παλμικό τρόπο λειτουργίας, οδηγώντας στη δημιουργία υγρού υψηλής πίεσης που φτάνει έως και τα 323 psi. Το πλεονέκτημα της μέθοδου είναι οι υψηλές τιμές του ρυθμού διάτμησης. [133] Έλεγχος χαρακτηριστικών των νανοσωματιδίων Ο καθορισμός των χαρακτηριστικών των νανοσωματιδίων όπως το μέγεθος, το ζ-δυναμικό και το ποσοστο εγκλωβισμού του πραγματοποιείται με την μεταβολή σημαντικών παραμέτρων κατά την διαδικασία παρασκευής του. Ο πρώτος τρόπος μείωσης τους μεγέθους των σωματιδίων είναι η αύξηση του προστιθέμενου ποσοστού γαλακτωματοποιητή. Ο γαλακτωματοποιητής βοηθάει στην σταθεροποίηση της διασποράς δηλαδή στην μη συνένωση των σταγονιδίων. Ο δεύτερος τρόπος περιλαμβάνει την χρησιμοποίηση συσκευών ομογενοποίησης (υψηλής πίεσης) οι οποίες θα εξασφαλίζουν ισχυρή ανάδευση, ώστε να επιτευχθεί σημαντική μείωση του μέγεθους των σωματιδίων και να εξφασφαλίστει η σταθερότητα του γαλακτώματος. [136] 54

70 4.7.4 Εφαρμογές των νανογαλακτωμάτων στα καλλυντικά Ο όρος "καλλυντικό προι όν" νοείται "κάθε ουσία ή μείγμα που προορίζεται να έλθει σε επαφή με τα εξωτερικά μέρη του ανθρώπινου σώματος (επιδερμίδα, τριχωτά μέρη του σώματος και της κεφαλής, τα νύχια, τα χείλη και τα εξωτερικά γεννητικά όργανα) ή με τα δόντια και τους βλεννογόνους της στοματικής κοιλότητας, με αποκλειστικό ή κύριο σκοπό τον καθαρισμό τους, τον αρωματισμό τους, τη μεταβολή της εμφάνισής τους, την προστασία τους, τη διατήρησή τους σε καλή κατάσταση ή τη διόρθωση των σωματικών οσμών. [137] Οι ιδιότητες των νανογαλακτωμάτων δηλαδή το χαμηλό τους ιξώδες, το μέγεθος των σταγονιδίων που βρίσκεται κάτω από τα 2nm, η διαφάνεια και η μεγάλη επιφάνεια τους τα καθιστούν ιδανικά για εφαρμογή σε καλλυντικά αφού επιτρέπουν την αποτελεσματική μεταφορά δραστικών συστατικών στο δέρμα. Τα νανογαλακτώματα χρησιμοποιούνται σε καλλυντικά σκευάσματα καθώς αποφεύγονται φαινόμενα αποσταθεροποίησης όπως η κρεμοποίηση, η καθίζηση και η κροκίδωση ή συνένωση που εμφανίζονται στα συμβατικά γαλακτώματα. O/W νανοσκευάσματα που που θα εξασφαλίζουν ελαχιστοποίηση της διαδερμικής απώλειας ύδατος, ενισχυμένη προστασία του δέρματος και διείσδυση του δραστικού συστατικού θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως προιόντα φροντίδας από την ηλιακή ακτινοβολία και ως ενυδατικές και αντιγηραντικές κρέμες. [135] 55

71 Σκοπός εργασίας Η παρούσα εργασία είχε ως σκοπό την παρασκευή νανογαλακτωμάτων ως καλλυντικών φορέων αντιοξειδωτικών βιταμινών, με στόχο την αύξηση της φυσικοχημικής σταθερότητας της διασποράς, την αύξηση του ποσοστού του εγκλωβισμένου μορίου και την βελτίωση της σταθερότητας των αντιοξειδωτικών βιταμινών. Για τον σκοπό αυτό επιλέχθηκαν τα αντιοξειδωτικά: οξική τοκοφερόλη και β- καροτένιο. Στη συνέχεια παρασκευάστηκαν συμβατικά γαλακτώματα και νανογαλακτώματα τύπου Ο/W δύο διαφορετικών συνταγών. Η μία συνταγή περιείχε στερεά στην θερμοκρασία δωματίου τριγλυκερίδια στην ελαιώδη φάση ενώ η άλλη υγρά τριγλυκερίδια. Για κάθε μία από τις συνταγές εγκλωβίστηκαν οι αντιοξειδωτικές βιταμίνες ενώ παρασκευάστηκαν και blank νανογαλακτώματα (χωρίς βιταμίνη). Μελετήθηκε η φυσικοχημική σταθερότητα, η ικανότητα εγκλωβισμού των βιταμινών και η σταθερότητα των βιταμινών στα νανογλακτώματα σε σύγκριση με τα συμβατικά γαλακτώματα. 56

72 Πειραματικο μέρος 1.Υλικά Βιταμίνες Β-καροτένιο (Sigma-aldrich) Βιταμίνη Ε (οξική τοκοφερόλη) (Chemco by syndesmos) Eνέσιμο ύδωρ (Fresenius Kabi, Hellas) / κεκαθαρμένο ύδωρ (Farmalabor, Chemco by syndesmos) Επιφανειοδραστικές ουσίες Macrogol 15 Hydroxystearate (Basf, Germany) Υποκίτρινη πάστα που μετατρέπεται σε υγρό σε θερμοκρασία 3 ο C. Χρησιμοποιείται ως παράγοντας γαλακτωματοποίησης και ως μη ιονικός παράγοντας διαλυτοποίησης. Παρασκευάζεται από 15 moles αιθυλενοξειδίου με 1 mole του 12-υδροξυ στεατικού οξέος. Το λιπόφιλο μερος του αποτελείται κυρίως από πολυγλυκόλη μονο- και δι-εστέρων του 12-υδροξυστεατικού οξέος ενώ το υδρόφιλο τμήμα από 3% λεύθερης πολυαιθυλενογλυκόλης. Είναι διαλυτό σε νερό,αιθανόλη και 2 προανόλη δίνοντας διαυγή διαλύματα. επίσης ειναι αδιάλυτο σε υγρή παραφίνη ενώ με αύξηση της θερμοκρασίας η διαλυτότητα του στο νερό μειώνεται. Η παραμονή του σε υψηλά ποσά θερμότητας επιφέρει τον διαχωρισμό του σε μια στερεή και σε μια υγρή φάση μετά την ψύξη. Το φαινόμενο είναι δυνατόν να αναστραφεί με ομογενοποίηση. [137] Λεκιθίνη (Cargill, Lucas Meyer Cosmetics, France) Αποτελεί συστατικό των κυτταρικών μεμβρανών σε όλους τους οργανισμούς. Στην ουσία αποτελεί φυσικής προέλευσης μίγμα ενώσεων που είναι γνωστές ως φωσφατίδια ή φωσφολιπίδια (Εικόνα 11). Πηγή προελεύσεως τους είναι η σόγια και λαμβάνονται κυρίως ως υποπροιόντα κατά την παραγωγή του σογιέλαιου. Τα λιπαρά οξέα και το είδος των αμινομάδων είναι αυτά που καθορίζουν την διαφορετικότητα της κάθε λεκιθίνης. Αυτή αποτελείται από μία γλυκερόλη εστεροποιημένη με δύο λιπαρά οξέα και φωσφορικό οξύ. Στο φωσφορικό οξύ 57

73 μπορεί να είναι συνδεδεμένη μία αμινομάδα όπως αιθανολαμίνη, χολίνη, σερίνη κ.ά. [18] Οι φυσικές λικιθίνες είναι αδιάλυτες στο νερό και διαλυτές σε έλαια και γι αυτό το λόγο αποτελούν γαλακτωματοποιητές W/O. [15] Εικόνα 14. Χημικοί τύποι φωσφατιδικού οξέος, φωσφατιδυλοχολίνης και φωσφατιδυλοαιθανολαμίνης. [139] Στερεό τριγλυκερίδιο Softisan 1 (παραγωγός) Αποτελεί μίγμα τριγλυκεριδίων φυτικών λιπαρών οξέων με C1-C18. Είναι στερεό λίπος και έχει μορφή λευκής μάζας με ουδέτερη οσμή και γεύση. Είναι ελεύθερο από αντιοξειδωτικά και σταθεροποιητές. Χαρακτηρίζεται από εξαιρετική σκληρότητα σε θερμοκρασία δωματίου και απότομη περιοχή της τήξης του. Το μικρό διάστημα μεταξύ των σημείων τήξης και στεροποίησης του επιτρέπει την ταχεία και οικονομική επεξεργασία του. Το Softisan έχει ένα εύρος σημείου τήξης από 33,5 ο C έως 35,5 ο C ενώ μπορεί να επεξεργαστεί σε θερμοκρασία μέχρι 1 ο C. Είναι ιδανικό για χρήση σε καλλυντικά, στην φροντίδα των χειλιών, την περιποίηση του δέρματος και την φροντίδα από τον ήλιο. [138] Υγρό τριγλυκερίδιο Miglyol 812 (παραγωγός) Είναι μίγμα τριγλυκεριδίων κλασματοποιημένα από φυτικά λιπαρά οξέα(έλαιο καρύδας και φοινικέλαιο) C8 και C1. Αυτό βρίσκει εφαρμογή στα καλλυντικά σκευάσματα καθώς αποτελεί μαλακτική ουσία και έχει την ικανότητα να αντιστέκεται στην απώλεια υγρασία της επιδερμίδας. [14] Η αξία αυτού του συστατικού για το δέρμα γίνεται μεγαλύτερη καθώς αποτελεί μη ευαισθητοποιητικό για την επιδερμίδα. [141] 58

74 2. Οργανoλογία Ζυγός Ακριβείας, Mettler AE166 Rotary Evaporator, Buchi Rotevapor R-114 Ακίδα Υπερήχων (Probe Sonicator), Ultrasonic Processor Απλό θερμόμετρο Θερμικός/Μαγνητικός αναδευτήρας (ARE, Velp Scientifica) Φυγόκεντρος (Z32HK, Germany) Οπτικό μικροσκόπιο (Leica, Germany) Ψυγείο Κλίβανος Μετρητής μεγέθους σταγονιδίων (nm) και ζ-δυναμικού (Zetasizer Nano-ZS, Malvern, UK) Μετρητής μεγέθους σταγονιδίων (μm) (Mastersizer S, Malvern, UK Uv-18 shimadzu spectrophotometer Σκεύη εργαστηρίου: Γυάλινα φιαλίδια αποθήκευσης (4, 12, 25, 4ml) Ποτήρια ζέσεως (25, 5, 1, 25ml) Ογκομετρικοί κύλινδροι (5, 1ml) Πιπέττες μίας χρήσης (πλαστικές) Πιπέττες Pasteur μίας χρήσης (γυάλινες) Πιπέττες αυτόματες (1P, 2P, 1P) Πλαστικοί περιέκτες (epedorf, falcon) Γυάλινες κυψελίδες Μεταλλικές σπάτουλες Λαβίδες Μαγνήτες Ταινία Parafilm Γάντια Latex Ετικέτες 59

75 3. Παρασκευή γαλακτωμάτων και νανογαλακτωμάτων Παρασκευάστηκαν Ο/W γαλακτώματα δύο διαφορετικών συνταγών. Η μία σύνταγη περιείχε στην ελαιώδη φάση στερεά στη θερμοκρασία δωματίου τριγλυκερίδιαενώ η άλλη υγρά τριγλυκερίδια. Τα γαλακτώματα με τα στερά τριγλυκερίδια ονομάστηκαν SL, ενώ τα γαλακτώματα με τα υγρά τριγλυκερίδια ονομάστηκαν LL. Για κάθε μία από τις δύο συνταγές εγκλωβίστηκε οξική τοκοφερόλη και β-καροτένιο. Επίσης παρασκευάστηκαν φορείς (blank) γαλακτώματα χωρίς βιταμίνες και για τις δύο συνταγές. 3.1 Παρασκευή γαλακτωμάτων Παρασκευή blank γαλακτωμάτων Παρασκευάστηκαν 2 ml γαλακτώματος για κάθε συνταγή. Για την τήξη της λιπαρής φάση χρησιμοποιηθήκε υδατολούτρο σε θεροκρασία 65-7 ο C. Αμέσως μετά την τήξη της λιπαρής φάσης ακολούθησε ανάδευση μεχρί ομογενοποιήσης για 5. Η υδατική φάση θερμάνθηκε στην ίδια θερμοκρασία και προστέθηκε στάγδην στην ελαίωδη υπό μαγνητική ανάδευση. Η ανάδευση συνεχίστηκεμέχρι το γαλακτώμα να αποκτήσει θερμοκρασία περιβάλλοντος. Όλα τα γαλακτώματα αποθηκεύτηκαν στο ψυγείο στους θ=4 ο C για 24h. Παρασκευή γαλακτωμάτων με αντιοξειδωτικές βιταμίνες Παρασκευάστηκαν, ως ανωτέρω, 2 ml γαλακτώματος για κάθε συνταγή προσθέτοντας στην τηγμένη λιπαρή φάση την αντιοξειδωτική βιταμίνη. Δοκιμάστηκε η συνταγή του Πίνακα 2 και η συνταγή του Πίνακα 3. Πίνακας 2. Δοκιμαστική αναλογία γαλακτώματος με οξική τοκοφερόλη Ελαιώδη φάση Softisan 1 Miglyol 812 Solutol HS 15 Λεκιθίνη σόγιας Οξική τοκοφερόλη basf INCI Hydrogenated Coco- Caprylic/Capric triglyceride lecithin Tocopheryl acetate Glycerides (% w/w) 3 1,44 3,37 6

76 Ελαιώδη φάση Softisan 1 Miglyo 812 Solutol HS 15 BASF Λεκιθίνη σόγιας Οξική τοκοφερό λη Β- καροτένι ο Η συγκεκριμένη αναλογία (Πίνακας 2) έδωσε σταθερό γαλάκτωμα το οποίο στη συνέχεια όμως δεν μετασχηματίστηκε επιτυχώς σε νανογαλάκτωμα. Οι αναλογίες που χρησιμοποιήθηκαν και έδωσαν σταθερό γαλάκτωμα και νανογαλάκτωμα δίνονται στον Πίνακα 3. INCI Hydrogenated Coco- Glycerides Caprylic/Capri c triglyceride Πίνακας 3. Συνταγές γαλακτωμάτων που μελετήθηκαν (%w/w) Γαλακτώματα με οξική τοκοφερόλη Γαλακτώματα με β- καροτένιο Blank γαλακτώμτα Macrogol 15 Hydroxysteara te, Polyoxyl 15 Hydroxysteara te 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 lecithin Tocopheryl acetate,35,25,53 Beta-carotene 3.2 Παρασκευή νανογαλακτωμάτων Παρασκευάστηκαν 1ml νανογαλακτώματος για κάθε αντίστοιχο συμβατικό γαλάκτωμα. Από τα 2ml κάθε αρχικού συμβατικού γαλακτώματος, τα 1 ml διαμοιράστηκαν σε 2 γυάλινους δοκιμαστικού σωλήνες (5ml γαλακτώματος σε κάθε δωκιμαστικό σωλήνα). Ο κάθε δοκιμαστικός σωλήνας υποβλήθηκε σε υπερήχηση, σε ακίδα υπερήχων με Αmp1= 83% για 2 κύκλους του 1min. Ανάμεσα στους δύο κύκλους ο κάθε σωλήνας αναδεύτηκε σε αναδευτήρα (Vortex), για 61

77 περίπου 1min (μέχρι να αποκτήσει θερμοκρασία περιβάλλοντος) σε max στροφές. Όλα τα νανογαλακτώματα αποθηκέυτηκαν στο ψυγείο θ=4 ο C 4. Μέθοδοι χαρακτηρισμού γαλακτωμάτων και νανογαλακτωμάτων 4.1 Οπτική μικροσκοπία Οπτικό μικροσκόπιο (Leica, Germany) (Εικόνα 16) χρησιμοποιήθηκε για την πορεία της γαλακτωματοποίσης κάθε συμβατικού γαλακτώματος. Προκειμένου να παρατηρηθεί κάθε δείγμα αραιώθηκε σε περιέκτες epedorf (1 σταγόνα δείγματος σε 7μl ενέσιμο ύδωρ). Εικόνα 15. Οπτικό Mικροσκόπιο Leica 4.2 Προσδιορισμός μεγέθους σταγονιδίων σε γαλακτώματα Η συσκευή Mastersizer S (Malvern, UK) (Εικόνα 17), χρησιμοποιήθηκε για την μελέτης της διασποράς του μεγέθους των σωματιδίων της διεσπαρμένης φάσης κάθε συμβατικού γαλακτώματος για το διάστημα των 6 ημερών. Κάθε δείγμα αραιώθηκε σε κυψελίδα με ενέσιμο ύδωρ μέχρι η θολερότητα του να φτάσει την τιμή μεταξύ 12-3%. Οι τιμές που χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των δειγμάτων είναι αυτές της μέσης διαμέτρου σφαίρας ισοδύναμου όγκου (D[4,3]) και της ομοιομορφίας (Uniformity). 62

78 Εικόνα 16. Συσκευή Μastersizer S (Malvern, UK). Εικόνα 17. Συσκευή Μastersizer S (Malvern, UK). 4.3 Προσδιορισμός μεγέθους σταγονιδίων σε νανογαλακτώματα Χρησιμοποιήθηκε η συσκευή Zetasizer Nano-ZS (Malvern, UK) (Εικόνα 18), για τον προσδιορισμό του μεγέθους και της κατανομής του μεγέθους των διεσπαρμένων σωματιδίων στα νανογαλακτώματα για το διάστημα των 6 ημερών.η αρχή της μεθόδου είναι ο δυναμικός σκεδασμος του φωτός (Dynamic Light Scattering, DLS) Εικόνα 18. Συσκευή Zetasizer Nano-ZS (Malvern, UK) Τα βήματα που ακολουθήθηκαν για την μέτρηση της υδροδυναμικής διαμέτρου είναι τα εξής: 1 μl κάθε νανογαλακτώματος αραιώθηκε με 6μl ενέσιμο ύδωρ και τοποθετήθηκε σε ειδική κυψελίδα 63

79 Ως δείκτης διάθλασης (Refractive Index, RI) λήφθηκε ο δείκτης διάθλασης του νερού,όσον αφορά τις ρυθμίσεις του οργάνου. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν στους 25 ο C Για κάθε δείγμα ολοκληρώθηκαν 3 μετρήσεις, ενώ καταγράφηκαν η μέση τιμή του μεγέθους και του εύρους της κατανομής (pdi). Η μέθοδος δεν είναι καταστροφική για το δείγμα 4.4 Προσδιορισμος ζ-δυναμικού σε νανογαλακώματα. Η συσκευή Zetasizer Nano-ZS (Malvern, UK) χρησιμοποιήθηκε και σε αυτή την περίπτωση για τον προσδιορισμό του ζ-δυναμικού των διεσπαρμένων σωματιδίων σε κάθε νανογαλάκτωμα. Η τεχνική που χρησιμοποιήθηκε είναι του ηλεκτροφορητικού σκεδασμού του φωτός (Electrophoretic Light Scattering). Τα βήματα που εφαρμόστηκαν για την μέτρηση του ζ-δυναμικού είναι τα εξής: 1μl κάθε νανογαλακώματος αραιώθηκαν με 6μl ενέσιμου ύδωρ και τοποθετήθηκαν σε ειδική κυψελίδα. Ως δείκτης διάθλασης λήφθηκε ο δείκτης διάθλασης του νερού όσον αφορά στις ρυθμίσεις του οργάνου. Για κάθε δείγμα ολοκληρώθηκα 3 μετρήσεις, ενώ καταγράφηκαν η μέση τιμή του ζ-δυναμικού (zeta-potential) και του εύρους της κατανομής (width). Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν στους 25 ο C. 4.5 Προσδιορισμός εγκλωβισμού του β-καροτενίου σε νανογαλακτώματα Οι μετρήσεις που πραγματοποιήθηκαν στα νανογαλακτώματα του β- καροτενίου αμέσως μετά από την φυγοκέντρηση έδειξαν εγκλωβισμό όλης της ποσότητας της αντιοξειδωτικής βιταμίνης. Προκειμένου να προσδιοριστεί το ποσοστό εγκλωβισμού του β- καροτενίου στα νανογαλακτώματα έγινε χρήση της χρωματογραφίας μοριακού αποκλεισμού. Ως στατική φάση χρησιμοποιήθηκε η πηκτή Sephadex (Sigma- Aldrich), ενώ ως κινητή κεκαθαρμένο ύδωρ (Farmalabor, Chemco by syndesmos). Η παράμετρος που μετρήθηκε για τον προσδιορισμό του εγκλωβισμού είναι η απορρόφηση του β-καροτενίου σε νανογαλάκτωμα περασμένο από τη στήλη 64

80 (Αεγκλωβισμένου β-καροτενίου) και η απορρόφηση του σε αρχικό νανογαλάκτωμα (Απροστιθέμενου β-καροτενίου), σε συγκεκρίμενο μήκος κύματος του ορατού φωτός με σκοπό τον υπολογισμό των συγκεντρώσεων τους. Οι μετρήσεις των δειγμάτων πραγματοποιήθηκαν με την χρήση της φασματοσκοπίας απορρόφησης υπεριώδους-ορατού(uv-vis) και συγκεκριμένα με φασματοφωτόμετρο Uv-18 Shimadzu spectrophotometer (Εικόνα 19.). Πιο συγκεκριμένα για κάθε νανογαλάκτωμα τα βήματα που ακολουθήθηκαν είναι τα εξής: 3μl κάθε νανογαλακτώματος εισήχθησαν στην στήλη και ελήφθησαν κλάσματα. Τα συλλεχθέντα κλάσματα αραιώθηκαν με αιθανόλη μέχρι τα 3ml. 3μl αρχικού νανογαλακτώματος χωρίς να περάσουν από την στήλη, αραιώθηκαν επίσης σε αιθανόλη μέχρι τα 3ml. Τοποθέτηση των δειγμάτων σε γυάλινη κυψελίδα και λήψη φάσματος στα 5-2nm. Η μέγιστη απορρόφηση των δειγμάτων χωρίς να περαστούν από τη στήλη παρατηρήθηκε στα 452nm, ενώ αυτά που περάστηκαν έδωσαν μέγιστη απορρόφηση στα 459nm. Παρασκευή 5 πρότυπων διαλυμάτων β-καροτενίου γνωστών συγκεντρώσεων με διαλύτη αιθανόλη και τελικό όγκο 3ml. Η μέτρηση τους πραγματοποιήθηκε στα 5-2nm. Η μέγιστη απορρόφηση κάθε πρότυπου διαλύματος παρατηρήθηκε στα 452nm. Δημιουργία καμπύλης αναφοράς χρησιμοποιώντας τις συγκεντρώσεις και τις μέγιστες απορροφήσεις των πρότυπων διαλυμάτων και υπολογισμός της εξίσωσης που προκύπτει. Η εξίσωση κάθε καμπύλης έχει την μορφή Υ=αΧ+β. Γνωρίζοντας τις παραμέτρους α και β και αντικαθιστώντας στη θέση του Υ τη μέγιστη απορρόφηση κάθε δείγματος προκύπτει η αντίστοιχη συγκέντρωση του β- καροτενίου για το κάθε δείγμα. Η εξίσωση που δίνει το ποσοστό το εγκλωβισμένου β-καροτενίου είναι η εξής: Cεγκλωβισμένου β καροτενίου Ποσοστό εγκλωβισμού β καροτενίου = Χ1 (%) Cπροστιθέμενου β καροτενίου 65

81 Εικόνα 19. Συσκευή Uv-18 shimadzu spectrophotometer Μέθοδοι χαρακτηρισμού αντιοξειδωτικών βιταμινών Προσδιορισμός της συγκέντρωσης της οξικής τοκοφερόλης σε γαλακτώματα και νανογαλακτώματα. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της οξικής τοκοφερόλης πραγματοποιήθηκε με την βοήθεια της φασματοσκοπίας απορρόφησης υπεριώδους-ορατού(uv-vis) και συγκεκριμένα με φασματοφωτόμετρο Uv-18 shimadzu spectrophotometer (Εικόνα 19). Παρασκευάστηκαν πρότυπα διαλύματα γνωστής συγκέντρωσης οξικής τοκοφερόλης τα οποία φασματομετρήθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για την δημιουργία καμπύλης αναφοράς(συγκέντρωση συναρτήσει απορρόφησης). Αιθανόλη χρησιμοποήθηκε ως διαλύτης για κάθε δείγμα και για την παρασκευή των πρότυπων διαλυμάτων. Τα βήματα που ακολουθήθηκαν είναι τα εξής: 6μl κάθε γαλακτώματος και νανογαλακτώματος διαλύθηκαν μέχρι τα 3ml με αιθανόλη και τοποθετήθηκαν σε γυάλινη κυψελίδα Η μέτρηση κάθε δείγματος πραγματοποήθηκε στα 5-2nm. Η μέγιστη απορρόφηση κάθε δείγματος παρατηρήθηκε στα 284nm. Παρασκευή 5 πρότυπων διαλυμάτων οξικής τοκοφερόλης γνωστών συγκεντρώσεων με διαλύτη αιθανόλη και τελικό όγκο 3ml. Η μέτρηση τους πραγματοποιήθηκε στα 5-2nm. Η μέγιστη απορρόφηση κάθε πρότυπου διαλύματος παρατηρήθηκε στα 284nm. Δημιουργία καμπύλης αναφοράς χρησιμοποιώντας τις συγκεντρώσεις και τις μέγιστες απορροφήσεις των πρότυπων διαλυμάτων και υπολογισμός της 66

82 εξίσωσης που προκύπτει από την καμπύλη αναφοράς. Η εξίσωση κάθε καμπύλης έχει την μορφή Υ=αΧ+β. Γνωρίζοντας τις παραμέτρους α και β από την εξίσωση και αντικαθιστώντας στη θέση του Υ τη μέγιστη απορρόφηση κάθε δείγματος προκύπτει η αντίστοιχη συγκέντρωση της οξικής τοκοφερόλης για το κάθε δείγμα Προσδιορισμός της συγκέντρωσης του β-καροτενίου σε γαλακτώματα και νανογαλακτώματα Η ποσοτικοποίηση του β-καροτενίου πραγματοποιήθηκε με την βοήθεια της φασματοσκοπίας απορρόφησης υπεριώδους-ορατού(uv-vis) και συγκεκριμένα με φασματοφωτόμετρο Uv-18 shimadzu spectrophotometer (Εικόνα 19). Παρασκευάστηκαν πρότυπα διαλύματα γνωστής συγκέντρωσης της βιταμίνης τα οποία φασματομετρήθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για την δημιουργία καμπύλης αναφοράς (συγκέντρωση συναρτήσει απορρόφησης). Αιθανόλη χρησιμοποήθηκε ως διαλύτης για κάθε δείγμα και για την παρασκευή των πρότυπων διαλυμάτων. Τα βήματα που ακολουθήθηκαν είναι τα εξής: 3μl κάθε γαλακτώματος και νανογαλακτώματος διαλύθηκαν μέχρι τα 3ml με αιθανόλη και τοποθετήθηκαν σε γυάλινη κυψελίδα. Η μέτρηση κάθε δείγματος πραγματοποήθηκε στα 5-2nm. Η μέγιστη απορρόφηση κάθε δείγματος παρατηρήθηκε στα 452nm. Παρασκευή 5 πρότυπων διαλυμάτων β-καροτενίου γνωστών συγκεντρώσεων με διαλύτη αιθανόλη και τελικό όγκο 3ml. Η μέτρηση τους πραγματοποιήθηκε στα 5-2nm. Η μέγιστη απορρόφηση κάθε πρότυπου διαλύματος παρατηρήθηκε στα 452nm. Δημιουργία καμπύλης αναφοράς χρησιμοποιώντας τις συγκεντρώσεις και τις μέγιστες απορροφήσεις των πρότυπων διαλυμάτων. Υπολογισμός της εξίσωσης που προκύπτει από την καμπύλη αναφοράς. Η εξίσωση κάθε καμπύλης έχει την μορφή Υ=αΧ+β. Γνωρίζοντας τις παραμέτρους α και β από την εξίσωση και αντικαθιστώντας στη θέση του Υ τη μέγιστη απορρόφηση κάθε δείγματος 67

83 προκύπτει η αντίστοιχη συγκέντρωση του β-καροτενίου για το κάθε δείγμα. 5. Μελέτη σταθερότητας γαλακτωμάτων και νανογαλακτωμάτων 5.1 Μελέτη φυσικής σταθερότητας γαλακτωμάτων και νανογαλακτωμάτων Φυγοκέντρηση Αμέσως μετά την παρασκευή τους, όλα τα δείγματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση. 2ml από κάθε δείγμα τοποθετήθηκε σε περιέκτες ependorf και φυγοκεντρήθηκαν σε θερμοκρασία 22 ο C, με ταχύτητα 2rpm για 3min. Παρατηρήθηκε η φυσική κατάσταση όλων των δειγμάτων στο τέλος της διαδικασίας. Αποθήκευση (σταθερότητα με το χρόνο αποθήκευσης σε διαφορετικές θερμοκρασίες) Με σκοπό τον έλεγχο της επίδρασης των συνθηκών αποθήκευσης στη σταθερότητα κάθε γαλακτώματος, 3ml από κάθε δείγμα αποθηκεύτηκαν σε γυάλινους περιέκτες με βιδωτό πώμα στους 25 ο C και 4 ο C για 6 ημέρες. Επιταχυνόμενη γήρανση Τέλος, όλα τα δείγματα (ομοίως 2ml από κάθε δείγμα) υποβλήθηκαν σε επιταχυνόμενη γήρανση (τρεις κύκλοι θέρμανσης στους 45 o C και ψύξης στους 25 o C). Οι παράμετροι που μετρήθηκαν για την αξιολόγηση της σταθερότητας των δειγμάτων ήταν το μέγεθος, η κατανομή του μεγέθους, και το ζ-δυναμικό των διασπορών σε προκαθορισμένα χρονικά διαστήματα (1, 8, 15, 22, 3 και 6 ημέρες). Η επίδραση των συνθηκών αποθήκευσης, στο ποσοστό εγκλωβισμού του β-καροτενίου, μελετήθηκε στα νανογαλακτώματα β-καροτενίου που διαχωρίστηκαν για την μελέτη της σταθερότητας τους. Επομένως η μελέτη υποβλήθηκε για την σταθερότητα στους 4 ο και 25 ο C σε προκαθορισμένα χρονικά διαστήματα (1, 8, 15, 22, 3 και 6 ημέρες) και για την διαδικασία της επιταχυνόμενης γήρανσης (τρεις κύκλοι θέρμανσης στους 45 o C και ψύξης στους 25 o C). 68

84 5.2 Μελέτη σταθερότητας αντιοξειδωτικών βιταμινών σε γαλακτώματα και νανογαλακτώματα. Οι μετρήσεις που πραγματοποιήθηκαν στα γαλακτώματα και στα νανογαλακτώματα των αντιοξειδωτικών βιταμινών αμέσως μετά από την φυγοκέντρηση έδειξαν χημική σταθερότητα των βιταμινών. Η επίδραση των συνθηκών αποθήκευσης, στην σταθερότητα των βιταμινών, μελετήθηκε σε όλα τα δείγματα που διαχωρίστηκαν για την μελέτη σταθερότητας των γαλακτωμάτων. Επομένως η μελέτη υποβλήθηκε για την σταθερότητα στους 4 ο και 25 ο C και για την διαδικασία της επιταχυνόμενης γήρανσης. (τρεις κύκλοι θέρμανσης στους 45 ο C και ψύξης στους 25 ο C). Η παράμετρος που μετρήθηκε για την αξιολόγηση της σταθερότητας των βιταμινών είναι η απορρόφηση τους σε συγκεκριμένο μήκος κύματος σε προκαθορισμένα χρονικά διαστήματα (1, 8, 15, 22, 3 και 6 ημέρες) με σκοπό τον υπολογισμό των συγκεντρώσεων τους. 69

85 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 6.1 Χαρακτηρισμός μεγέθους σωματιδίων Οπτικό μικροσκόπιο Από την μελέτη των σωματιδίων της διεσπαρμένης φάσης των γαλακτωμάτων στο οπτικό μικροσκόπιο προέκυψε ότι η δομή τους τείνει να είναι σφαιρική.(εικόνα 2) Εικόνα 2. Aπεικόνιση των σωματιδίων της διεσπαρμένης φάσης συμβατικών γαλακτωμάτων. [1: SL γαλάκτωμα με β-καροτένιο, 2: SL γαλάκτωμα με οξική τοκοφερόλη, 3: LL γαλάκτωμα με β- καροτένιο, 4: LL γαλάκτωμα με οξική τοκοφερόλη] Προσδιορισμός μεγέθους σταγονιδίων των γαλακτωμάτων Το μέγεθος των σωματιδίων της διεσπαρμενης φάσης των γαλακτωμάτων με στερεά τριγλυκερίδια (μετά από μία ημέρα παρασκευής) κυμάνθηκε από 7,35 έως 1,25 μm, (Uniformity:,66-1,58) ανάλογα και με την αντιοξειδωτική βιταμίνη που χρησιμοποιήθηκε (Πίνακας 4). Ενώ παρατηρήσαμε ότι γαλακτώματα με υγρά τριγλυκερίδια είχαν μεγαλύτερο μέγεθος που κυμαινόταν από 46,95 έως 115,8 μm, (Uniformity:,55-,85) (Πίνακας 4). 7

86 Πίνακας 4. Μέσο μέγεθος σωματιδίων γαλακτωμάτων μετά από μία μέρα παρασκευής SL παρασκευές LL παρασκευές 1 Day D[4,3] Uniformity D[4,3] Uniformity e. Beta car 1,25 ± 1,11,89 115,8 ± 9,42,85 e. Toc ac 9,18 ± 4,8,66 46,95 ± 3,11,66 e. Blank 7,35 ± 1,34 1,58 91,63 ± 2,11, Προσδιορισμός μεγέθους σταγονιδίων και ζ-δυναμικού των νανογαλακτωμάτων Το μέγεθος των σωματιδίων της διεσπαρμένης φάσης των νανογαλακτωμάτων με στερεά τριγλυκερίδια (μετά από μία ημέρα παρασκευής) κυμάνθηκε μεταξύ 94,1 έως 129,9 nm ανάλογα και με το εγκλωβισμένο μόριο. (Πίνακας 5). Όταν τα στερεά τριγλυκερίδια αντικαταστάθηκαν με υγρά το μέγεθος των σωματιδίων της διεσπαρμενης φάσης των νανογαλακτωμάτων κυμάνθηκε μεταξύ 83,2 έως 93,5 nm. Ο δείκτης πολυδιασποράς σε καμία περίπτωση δεν ξεπεράσε το,363. Ενώ το ζ-δυναμικό των σωματιδίων ήταν υψηλό και με τιμές που κυμαίνονταν περίπου από -43,4 έως 57,4 (Πίνακας 5). Πίνακας 5. Μέσο μέγεθος σωματιδίων και ζ-δυναμικού νανογαλακτωμάτων μετά από μία μέρα παρασκευής SL παρασκευές LL παρασκευές 1 Day Mean Size ζ-δυναμικό Width Mean Size ζ-δυναμικό Width PI PI (nm) (mv) (mv) (nm) (mv) (mv) n.beta 129,9 ±,99,363-52,8 ± 8,485 7,12 86,9 ± 3,868,31-53,9 ± 3,536 8,3 car n.toc ac 94,1 ± 3,953,278-55,3 ± 2,34 8,74 83,2 ± 3,75,287-51,4 ± 1,182 7, n.blank 118,1 ± 1,414,268-57,4 ± 2,14 7,93 93,5 ± 3,762,286-43,4± 2,33 7,44 71

87 6.2 Μελέτη φυσικοχημικής σταθερότητας γαλακτωμάτων και νανογαλακτωμάτων Φυγοκέντρηση γαλακτωμάτων Τα έξι δείγματα των γαλακτωμάτων υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση και κανένα από αυτά δεν εμφάνισε τάση διαχωρισμού των φάσεων (μετά από μία ημέρα παρασκευής). (Πίνακας 6), (Εικόνα 21.) Πίνακας 6. Χαρακτηριστικά μεγέθους γαλακτωμάτων μετά από φυγοκέντρηση Δείγμα D[4,3] SD Uniformity (μm) e.blank (SL) Πριν 7,35 1,34 1,58 Μετά 12,86 1,4 1,32 e.blank (LL) Πριν 91,63 2,11,55 Μετά 94,8 2,3,53 e.toc ac (SL) Πριν 9,18 4,8,66 Μετά 9,2 4,15,61 e.toc ac (LL) Πριν 46,95 13,11,66 Μετά 41,52 5,84 1,8 e.beta car (SL) Πριν 1,25 1,11,89 Μετά 11,53,6,66 e.beta car (LL) Πριν 115,8 9,42,85 Μετά 134,78 5,56,93 72

88 Εικόνα 21. Φωτογραφία γαλακτωμάτων αμέσως μετά από την φυγοκέντρηση Φυγοκέντρηση νανογαλακτωμάτων Κανένα από τα έξι δείγματα των νανογαλακτωμάτων μετά από φυγοκέντρηση δεν εμφάνισε τάση διαχωρισμού των φάσεων (μετά από μία μέρα παρασκευής). (Πίνακας 7), (Εικόνα 22 ). Πίνακας 7. Χαρακτηριστικά μεγέθους και ζ-δυναμικού νανογαλακτωμάτων μετά από φυγοκέντρηση Δείγμα Mean Size (nm) Polydispersity Index (PI) ζ-potential (mv) Width (mv) n.blank (SL) Πριν 118,1 ± 1,414,268-57,4 ± 2,14 7,93 Μετά 121,4 ±,529,266-57, ± 1,22 8,28 n.blank (LL) Πριν 93,5 ± 3,762,286-43,4± 2,33 7,44 Μετά 72,8 ± 1,647,36-69,1 ±,513 8,68 n.toc ac (SL) Πριν 94,1 ± 3,953,278-55,3 ± 2,34 8,74 Μετά 91, ± 5,49,279-45,7 ± 1,496 8,47 n.toc ac (LL) Πριν 83,2 ± 3,75,287-51,4 ± 1,182 7, Μετά 89,9 ± 3,769,288-52,7 ± 17,395 5,85 73

89 n.beta car (SL) Πριν 129,9 ±,99,363-52,8 ± 8,485 7,12 Μετά 117,2 ± 1,914,35-46,9 ± 2,88 7,6 n.beta car (LL) Πριν 86,9 ± 3,868,31-53,9 ± 3,536 8,3 Μετά 82,4 ± 1,523,37-56,1 ± 3,28 7,63 Εικόνα 22. Φωτογραφία των νανογαλακτωμάτων αμέσως μετά από την φυγοκέντρηση Επιταχυνόμενη γήρανση γαλακτωμάτων Η επιταχυνόμενη γήρανση (τρεις κύκλοι θέρμανσης στους 45 o C και ψύξης στους 25 o C) έδειξε σταθερότητα σε όλα τα γαλακτώματα (Πίνακας 8), (Εικόνα 23). Πίνακας 8. Επίδραση επιταχυνόμενης γήρανσης στα χαρακτηριστικά μεγέθους των συμβατικών γαλακτωμάτων Δείγμα Days D[4,3] (μm) SD Uniformity e.blank (SL) 1 7,35 1,34 1,58 7 6,99 2,64 1,96 e.blank (LL) 1 91,63 2,11,55 7 9,2 3,4,55 e.toc ac (SL) 1 9,18 4,8,66 7 5,47 4,88 1,83 74

90 e.toc ac (LL) 1 46,95 13,11, ,8 14,13,63 e.beta car (SL) 1 1,25 1,11,89 7 3,2 2,4 2,87 e.beta car (LL) 1 115,8 9,42, ,68 4,48,93 Εικόνα 23. Φωτογραφία γαλακτωμάτων μετά από επιτυχανόμενη γήρανση Επιταχυνόμενη γήρανση νανογαλακτωμάτων Η επιταχυνόμενη γήρανση (τρεις κύκλοι θέρμανσης στους 45 o C και ψύξης στους 25 o C) έδειξε σταθερότητα σε όλα τα νανογαλακτώματα (Πίνακας 9), (Εικόνα 24). Πίνακας 9. Επίδραση επιταχυνόμενης γήρανσης στα χαρακτηριστικά μεγέθους και στο ζ- δυναμικό των νανογαλακτωμάτων Δείγμα Days Mean Size (nm) Polydispersity Index (PI) ζ-potential (mv) Width (mv) e.blank (SL) 1 118,1 ± 1,414,268-57,4 ± 2,14 7, ,8 ± 1,99,286-55,9 ±,721 3,46 e.blank (LL) 1 93,5± 3,762,286-43,4 ± 2,33 7, ,3 ±,277,549-55,8 ± 4,28 7,64 75

91 e.toc ac (SL) 1 94,1 ± 3,953,278-55,3 ± 8,485 8, ,8 ± 1,51,28-49,4 ± 6,1 7,11 e.toc ac (LL) 1 83,2 ± 3,75,287-51,4 ± 1,182 7, 7 94,7 ±,877,298-49,3 ± 13,11 8,58 e.beta car (SL) 1 129,9 ±,99,363-52,8 ± 8,485 7, ,6 ±,924,295-57,9 ± 2,63 5,78 e.beta car (LL) 1 86,9 ± 3,868,31-53,9 ± 3,536 8,3 7 73,2 ± 2,254,312-53,5 ± 4,3 9,81 Εικόνα 24. Φωτογραφία νανογαλακτωμάτων μετά από επιταχυνόμενη γήρανση Αποθήκευση σε διάφορες συνθήκες Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων διεσπαρμένης φάσης γαλακτωμάτων με τον χρόνο αποθήκευσης Οι μετρήσεις κατανομής μεγεθών σωματιδίων διεσπαρμένης φάσης για κάθε ένα από τα έξι δείγματα έγιναν σε καθορισμένα χρονικά διαστήματα. Συγκεκριμένα το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε περιελάμβανε μετρήσεις μετά από διάστημα 1, 8, 15, 22, 3 και 6 ημερών. Οι παρασκευές των δειγμάτων, όπως και οι αντίστοιχες μετρήσεις αυτών πραγματοποιήθηκαν δύο φορές. 76

92 Για τον χαρακτηρισμό των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκαν οι τιμές της μέσης διαμέτρου σφαίρας ισοδύναμου όγκου (D[4,3]) καθώς και της ομοιομορφίας των δειγμάτων (Uniformity). Οι τιμές των αποτελεσμάτων επεξεργάστηκαν με τη στατιστική δοκιμή t- student για την αξιολόγηση της στατιστικής σημαντικότητας της διαφοράς μεταξύ των δειγμάτων. Τα αποτελέσματα για κάθε γαλάκτωμα παρουσιάζονται στους Πίνακες 1-12 και στα Διαγράμματα 1-1. Πίνακας 1. Σταθερότητα συμβατικών blank γαλακτωμάτων (μεταβολή μεγέθους με τον χρόνο αποθήκευσης σε διαφορετικές θερμοκρασίες) Δείγμα Day 4 ο C 25 ο C s D[4,3](μm) SD Uniformity D[4,3](μm) SD Uniformity e.(sl) 1 7,35 1,34 1,58 7,25 1,48 1,58 8 8,39 1,61 1,4 3,77,38 1, ,4,8 1,38 2,98,43 1, ,86,81,75 3,4,6 1,16 3 4,58 1,53,69 5,34,63 1,3 6 7,77 1,92, e.(ll) 1 91,63 2,11,55 91,12 2,83,55 8 9,91 2,83,53 88,31 4,24, ,89 2,1,53 84,37 3,54, ,4 2,12,53 82,69 2,12, ,56 1,41, ,35 2,24,

93 D [4,3] (μm) T days Uniformity e.blank(sl) e.blank(ll) U-e.blank(SL) U-e.blank(SL) Διάγραμμα 1. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων blank (SL και LL) γαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 4 ο C D [4,3] (μm) Uniformity e.blank(sl) e.blank(ll) U-e.blank(SL) U-e.blank(LL) T days Διάγραμμα 2. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων blank (SL και LL) γαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 25 ο C. 78

94 Πίνακας 11. Σταθερότητα συμβατικών γαλακτωμάτων με οξική τοκοφερόλη (μεταβολή μεγέθους με τον χρόνο αποθήκευσης σε διαφορετικές θερμοκρασίες). Δείγμα Day 4 ο C 25 ο C s D[4,3](μm) SD Uniformity D[4,3](μm) SD Uniformity e.(sl) 1 9,18 2,18,42 9,18 4,8,66 8 9,24 2,95,68 8,57 3,95, ,78,64,8 8,19 3,41 1,3 22 7,8 1,81,6 1,8,24,58 3 7,22,76,59 11,75 4,14,65 6 7,77 1,96, e.(ll) 1 46,95 13,11,86 46,95 13,11, ,37 1,39,82 3,32 6,6, ,61 8,63,64 37,34 7,55, ,97 8,56,79 23,24 16,2, ,93 16,86, ,62 14,24, D [4,3] (μm) T days Uniformity e.toc ac(sl) e.toc ac(ll) U-e.Toc ac(ll) U-e.Toc ac(sl) Διάγραμμα 3. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL και LL) γαλακτωμάτων οξικής τοκοφερόλης με τον χρόνο, στους 4 ο C. 79

95 D [4,3] (μm) Uniformity e.toc ac(sl) e.toc ac(ll) U-e.Toc ac(ll) U-e.Toc ac(sl) T days Διάγραμμα 4. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL και LL) γαλακτωμάτων οξικής τοκοφερόλης με τον χρόνο, στους 25 ο C. Πίνακας 12. Σταθερότητα συμβατικών γαλακτωμάτων με β-καροτένιο (μεταβολή μεγέθους με τον χρόνο αποθήκευσης σε διαφορετικές θερμοκρασίες). Δείγμα Day s 4 ο C 25 ο C D[4,3](μm) SD Uniformity D[4,3](μm) SD Uniformity e.(sl) 1 1,25 1,11,89 1,25 1,11,89 8 1,26 2,9,63 1,21 3,72, ,3 3,49,74 9,42,8, ,94,1,58 8,47,18,57 3 9,9,35, ,35 3,75, e.(ll) 1 115,8 9,42,85 115,8 9,42, ,5 7,3,7 114,5 11,26, ,6 4,16,85 91,31 7,56, ,8 2,5,82 93,15 8,87,

96 D [4,3] (μm) Uniformity e.βeta car(sl) e.βeta car(ll) U-e.Βeta car(ll) U-e.Βeta car(sl) T days Διάγραμμα 5. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL και LL) γαλακτωμάτων β καροτενίου με τον χρόνο, στους 4 ο C. D [4,3] (μm) T days Uniformity e.βeta car(sl) e.βeta car(ll) U-e.Βeta car(ll) U-e.Βeta car(sl) Διάγραμμα 6. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL και LL) γαλακτωμάτων β καροτενίου με τον χρόνο, στους 25 ο C Σύγκριση σταθερότητας βάση ρευστότητας λιπιδίων Σε όλα τα δείγματα, σε κάθε συνθήκη, το μέγεθος σωματιδίων της διεσπαρμένης φάσης των LL γαλακτωμάτων ήταν στατιστικά μεγαλύτερο από αυτό των SL γαλακτωμάτων γεγονός που φάνηκε να αποσταθεροποιεί πιο γρήγορα τα LL γαλακτώματα. Εξαίρεση ως προς τη διαφορά του μεγέθους των σωματιδίων αποτέλεσαν τα SL και LL γαλακτώματα της οξικής τοκοφερόλης στους 4 ο και τους 25 ο C. (Πίνακες 1-12 και Διαγράμματα 1-6). Πιο συγκεκριμένα: 81

97 Blank γαλακτώματα. -Στους 4 ο C: Όλα τα γαλακτώματα παρέμειναν σταθερά σε διάστημα 6 ημερών -Στους 25 ο C Το SL γαλάκτωμα εμφάνισε διαχωρισμό φάσεων στις 6 ημέρες, ενώ το LL γαλάκτωμα στις 3 ημέρες. Γαλακτώματα οξικής τοκοφερόλης -Στους 4 ο C: Όλα τα γαλακτώματα παρέμειναν σταθερά σε διάστημα 6 ημερών. -Στους 25 ο C: Το SL γαλάκτωμα εμφάνισε διαχωρισμό φάσεων στις 6 ημέρες και το LL στις 3 ημέρες. Γαλακτώματα β-καροτενίου -Στους 4 ο C: Το SL γαλάκτωμα παρέμεινε σταθερό σε διάστημα 6 ημερών, ενώ το LL έμεινε σταθερό για διάστημα 22 ημερών. -Στους 25 ο C: Και τα δύο γαλακτώματα υπέστησαν θραύση στις 3 ημέρες. 82

98 Εικόνα 25. Φωτογραφία γαλακτωμάτων αμέσως μετά την παρασκευή τους. Εικόνα 26. Φωτογραφία γαλακτωμάτων που εμφάνισαν διαχωρισμό φάσεων στους 25 ο C. 83

99 Εικόνα 27. Φωτογραφία γαλακτωμάτων μετά από 6 ημέρες στους 4ο C. Το (LL) γαλάκτωμα του β-καροτενίου εμφάνισε διαχωρισμό φάσων στις 3 ημέρες στους 4 ο C. D [4,3] (μm) T days Uniformity e.blank(sl) e.toc ac(sl) e.βeta car(sl) U-e.blank(SL) Διάγραμμα 7. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL) γαλακτωμάτων, blank, οξικής τοκοφερόλης και β-καροτενίου με τον χρόνο, στους 4 ο C. 84

100 D [4,3] (μm) T days Uniformity e.blank(sl) e.toc ac(sl) e.βeta car(sl) U-e.blank(SL) U-e.Βeta car(sl) U-e.Toc ac(sl) Διάγραμμα 8. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL) γαλακτωμάτων, blank, οξικής τοκοφερόλης και β-καροτενίου με τον χρόνο, στους 25 ο C. D [4,3] (μm) T days Uniformity e.blank(ll) e.toc ac(ll) e.βeta car(ll) U-e.blank(SL) U-e.Toc ac(ll) U-e.Βeta car(ll) Διάγραμμα 9. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (LL) γαλακτωμάτων, blank, οξικής τοκοφερόλης και β-καροτενίου με τον χρόνο, στους 4 ο C. 85

101 D [4,3] (μm) T days Uniformity e.blank(ll) e.toc ac(ll) e.βeta car(ll) U-e.blank(LL) U-e.Toc ac(ll) U-e.Βeta car(ll) Διάγραμμα 1. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (LL) γαλακτωμάτων, blank, οξικής τοκοφερόλης και β-καροτενίου με τον χρόνο, στους 25 ο C. Σύγκριση σταθερότητας γαλακτωμάτων βάση χημικής δομής που εγκλωβίζεται. Τα SL γαλακτώματα του β-καροτενίου έδειξαν να αποσταθεροποιούνται γρηγορότερα από ότι τα αντίστοιχα blank γαλακτώματα και αυτά της οξικής τοκοφερόλης στους 25 ο C, ενώ τα LL γαλακτώματα του β-καροτενίου αποσταθεροποιήθηκαν γρηγορότερα στους 4 ο C από τα αντίστοιχα blank γαλακτώματα και αυτά της οξικής τοκοφερόλης. (Διαγράμματα 7-1). Πιο συγκεκριμένα: SL γαλακτώματα -Στους 4 ο C: Όλα τα SL γαλακτώματα παρέμειναν σταθερά σε διάστημα 6 ημερών. Το μέγεθος των σωματιδίων μεταξύ των SL γαλακτωμάτων δεν παρουσίασε στατιστικά σημαντικά διαφορές (p>.5). -Στους 25 ο C: Το SL blank γαλάκτωμα και το γαλάκτωμα της οξικής τοκοφερόλης έμειναν σταθερά σε διάστημα 3 ημερών σε αντίθεση με αυτό του β-καροτενίου που παρουσίασε διαχωρισμό φάσεων στις 3 ημέρες. Από την 15 η ημέρα το μέγεθος των σωματιδίων του γαλακτώματος του β- καροτενίου ήταν στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερο απο εκείνο του blank γαλακτώματος, ενώ το γαλάκτωμα της οξικής τοκοφερόλης την 22 η ημέρα, 86

102 παρουσίασε μεγαλύτερος μέγεθος σωματιδίων διεσπαρμένης φάσης απο αυτό του blank γαλακτώματος. LL γαλακτώματα -Στους 4 ο C: Όλα τα LL γαλακτώματα παρέμειναν σταθερά σε διάστημα 6 ημερών με εξαίρεση αυτό του β καροτενίου που παρουσίασε διαχωρισμό φάσεων στις 3 ημέρες. Το LL γαλάκτωμα του β-καροτενίου από την 8 η ημέρα μέχρι την αποσταθεροποίηση του, παρουσίασε στατιστικά μεγαλύτερο μέγεθος σωματιδίων της διεσπαρμένης φάσης από αυτό της οξικής τοκοφερόλης. Η οξική τοκοφερόλη έδειξε στατιστικά σημαντικά μικρότερο μέγεθος σωματιδίων και από τα δύο γαλακτώματα από την 8 η μέχρι την 22 η ημέρα. -Στους 25 ο C: Και τα 3 LL γαλακτώματα παρέμειναν σταθερά μέχρι τις 22 ημέρες. Την 15 η και την 22 η ημέρα το μέγεθος των σωματιδίων της διεσπαρμένης φάσης του γαλακτώματος της οξικής τοκοφερόλης είχε μικρότερη μέγεθος και από τα δύο γαλακτώματα. Το blank γαλάκτωμα με το γαλάκτωμα του β-καροτενίου δεν είχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές όσο αφορά στο μέγεθος των σωματιδίων τους σε καμία από τις μέρες που μελετήθηκαν Μεταβολή μεγέθους και ζ-δυναμικού σωματιδίων διεσπαρμένης φάσης των νανογαλακτωμάτων με τον χρόνο αποθήκευσης. Οι μετρήσεις κατανομής μεγεθών σωματιδίων διεσπαρμένης φάσης για κάθε ένα από τα έξι νανογαλακτώματα έγιναν στα ίδια χρονικά διαστήματα με αυτά που ακολουθήθηκαν για τα συμβατικά γαλακτώματα. Οι παρασκευές των δειγμάτων, όπως και οι αντίστοιχες μετρήσεις αυτών πραγματοποιήθηκαν δύο φορές. Στη συγκεκριμένη περίπτωση οι παράμετροι που καταγράφηκαν ήταν οι τιμές του μέσου μεγέθους σωματιδίων (Mean size), του δείκτη πολυδιασποράς (PI, Polydispercityindex), του ζ-δυναμικού (zeta-potential) και του εύρους της κατανομής (width). 87

103 Οι τιμές των αποτελεσμάτων επεξεργάστηκαν με τη στατιστική δοκιμή t- student για την αξιολόγηση της στατιστικής σημαντικότητας της διαφοράς μεταξύ των δειγμάτων. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στους Πίνακες 13-18, και στα Διαγράμματα 11-3 Πίνακας 13. Σταθερότητα blank νανογαλακτωμάτων (μεταβολή μεγέθους και ζ-δυναμικού σωματιδίων με τον χρόνο αποθήκευσης) Δείγμα Days 4 ο C Mean Polydispersity Size(nm) Index(PI) ζ-potential(mv) Width(mV) n.(sl) 1 129,4 ±,23,268-57,4 ± 2,14 7, ,7 ± 1,153,282-54,1 ±,6 8, ,3 ± 2,438,279-53,9 ±,577 7, ,9 ± 1,286,288-54,4 ± 1,25 8, ,6 ± 1,799,287-55,9 ± 1,8 6, ,6 ± 4,151,289-53, ± 1,9 7,94 n.(ll) 1 93,5±3,762,286-43,4 ± 2,33 7, ,2± 1,633,36-49,8 ± 1,42 9, ,1± 2,694,37-54,2 ± 8,24 7, ,9± 2,744,31-57,8 ± 3,5 6, ,6± 2,242,282-59,3 ± 3,9 6, ,2± 1,655,278-5,4 ± 2,84 6,52 Πίνακας 14. Σταθερότητα blank νανογαλακτωμάτων (μεταβολή μεγέθους και ζ-δυναμικού σωματιδίων με τον χρόνο αποθήκευσης) Δείγμα Days 25 ο C Mean Polydispersity ζ-potential(mv) Width(mV) Size(nm) Index(PI) n.(sl) 1 118,1 ± 1,414,268-57,4 ± 2,14 7, ,1 ± 1,414,285-55,3 ±,153 9, ,8 ±,424,291-54,4 ± 2,3 1, ,1 ± 2,899,295-52,3 ± 1,17 7,39 88

104 3 123,5 ±,919,284-55,6 ± 1,4 5, ,5 ± 1,22,341-48,1 ±,5 1,7 n.(ll) 1 93,5 ± 3,762,286-43,4 ± 2,33 7, ,6 ±,49,287-43,8 ± 1,21 9, ,9 ± 2,828,286-45,9 ±,95 6, ,3 ± 3,79,269-41,9 ±,44 6, ,1 ± 1,273,282-39,6 ± 1,99 6, ,6 ± 4,243,259-37,9 ± 2,32 7,2 Mean size (nm) T days PI n.blank(sl) n.blank(ll) PI-n.blank(SL) PI -n.blank(ll) Διάγραμμα 11. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL και LL) blank νανογαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 4 ο C. ζ-potentional (mv) T days WIDTH (mv) n.blank(sl) n.blank(ll) W-n.blank(SL) W-n.blank(LL) Διάγραμμα 12. Μεταβολή ζ-δυναμικού (SL και LL) blank νανογαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 4 ο C. 89

105 Mean size (nm) T days PI n.blank(sl) n.blank(ll) PI-n.blank(SL) PI-n.blank(LL) Διάγραμμα 13. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL και LL) blank νανογαλακτωμάτων με τον χρόνο, στους 25 ο C. ζ-potentional (mv) T days WIDTH (mv) n.blank(sl) n.blank(ll) W-n.blank(SL) W-n.blank(LL) Διάγραμμα 14. Μεταβολή ζ-δυναμικού (SL και LL) blank νανογαλακτωμάτων με τον χρόνο στους, 25 ο C. 9

106 Πίνακας 15. Σταθερότητα νανογαλακτωμάτων οξικής τοκοφερόλης (μεταβολή μεγέθους και ζ-δυναμικού σωματιδίων με τον χρόνο αποθήκευσης) Δείγμα Days 4 ο C Mean Polydispersit ζ-potential(mv) Width(mV) Size(nm) y Index(PI) n.(sl) 1 94,1 ± 3,953,278-55,3 ± 8,485 8, ,5 ±,77,278-48,6 ± 5,162 8, ,9 ± 1,22,296-52,9 ± 1,1 7, ,9 ± 1,414,321-53,9 ±,495 6, ,5 ± 1,344,336-48,9 ± 2,97 6, ,1 ± 6,647,267-41,8 ± 13,364 4,93 n.(ll) 1 83,2 ± 3,75,287-51,4 ± 1,182 7, 8 88,1 ± 3,338,297-53,1 ± 13,11 6, ,7 ±,7,313-64,2 ± 1,36 6, ,1 ±,926,296-61,3 ± 1,414 1,7 3 93,7 ± 2,69,291-59,4 ±,77 8, ,3 ± 8,542,289-52,1 ± 13,22 7,5 Πίνακας 16. Σταθερότητα νανογαλακτωμάτων με οξική τοκοφερόλη (μεταβολή μεγέθους και ζ-δυναμικού σωματιδίων με τον χρόνο αποθήκευσης) Δείγμα Days 25 ο C Mean Polydispersit ζ-potential(mv) Width(mV) Size(nm) y Index(PI) n.(sl) 1 94,1 ± 3,953,278-55,3 ± 8,485 8, ,4 ±,438,289-4,8 ± 1,41 7, 15 96,3 ±,7,285-51,3 ± 1,344 7, ,9 ± 1,735,287-51, ±,778 8,4 3 92,5 ± 2,226,287-51, ± 2,333 8, , ±,76,287-51,1 ±,577 7,63 n.(ll) 1 83,2 ± 1,429,287-51,4 ± 1,182 7, 8 94,4 ±,963,288-55,6 ± 8,485 7, ,3 ±,491,35-6, ± 1,36 6,19 91

107 22 93,3 ±,732,34-58,6 ±,354 7, ,3 ± 2,325,32-59,9 ±,424 7,1 6 84,9 ±,491,31-63,4 ± 2,95 6,53 Mean size (nm) T days PI n.toc ac(sl) n.toc ac(ll) PI -n.toc ac(ll) PI-n.Toc ac(sl) Διάγραμμα 15. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL και LL) νανογαλακτωμάτων οξικής τοκοφερόλης με τον χρόνο, στους 4 ο C. ζ-potentional (mv) T days WIDTH (mv) n.toc ac(sl) n.toc ac(ll) Διάγραμμα 16. Μεταβολή ζ-δυναμικού (SL και LL) νανογαλακτωμάτων οξικής τοκοφερόλης με τον χρόνο, στους 4 ο C. 92

108 Mean size (nm) T days PI n.toc ac(sl) n.toc ac(ll) PI-n.Toc ac(ll) PI-n.Toc ac(sl) Διάγραμμα 17. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL και LL) νανογαλακτωμάτων οξικής τοκοφερόλης με τον χρόνο, στους 25 ο C. ζ-potentional (mv) T days WIDTH (mv) n.toc ac(sl) n.toc ac(ll) W-n.Toc ac(ll) W-n.Toc ac(sl) Διάγραμμα 18. Μεταβολή ζ-δυναμικού (SL και LL) νανογαλακτωμάτων οξικής τοκοφερόλης με τον χρόνο, στους 25 ο C 93

109 Πίνακας 17. Σταθερότητα νανογαλακτωμάτων με β-καροτένιο (μεταβολή μεγέθους και ζ- δυναμικού σωματιδίων με τον χρόνο αποθήκευσης) Δείγμα Days 4 ο C Mean Polydispersity ζ-potential(mv) Width(mV) Size(nm) Index(PI) n.(sl) 1 129,9 ±,99,363-52,8 ± 8,485 7, ,4 ±,283,346-52,1 ± 3,748 7, ,6 ±,551,384-45,3 ±,529 8, ,6 ± 2,214,33-54,1 ± 6,93 7, ,6 ±,495,36-53,5 ±,849 7, ,6 ± 3,453,376-52,9 ± 16,476 7,44 n.(ll) 1 86,9 ± 3,868,31-53,9± 3,536 8,3 8 88,2 ± 7,396,333-54, ± 3,111 7, 15 92,4 ± 2,331,336-46,3 ± 1,53 6, ,8 ±,799,34-56,8 ±,919 8, ,4 ± 2,1,431-57,6 ± 7,283 6, , ± 15,266,365-55, 2 ± 5,94 1,8 Πίνακας 18. Σταθερότητα νανονανογαλακτωμάτων με β-καροτένιο (μεταβολή μεγέθους και ζ-δυναμικού σωματιδίων με τον χρόνο αποθήκευσης) Δείγμα Days 25 ο C Mean Polydispersity ζ-potential(mv) Width(mV) Size(nm) Index(PI) n.(sl) 1 129,9 ±,99,363-52,8 ± 8,485 7, ,4 ± 2,214,33-49,3 ±,77 7, ,4 ± 5,75,34-49,9 ±,919 6, ,6 ± 1,252,282-46,8 ± 5,162 7, ,1 ± 1,88,276-43,4 ±,424 9,27 6 9, ± 1,168,265-4,2 ± 1,32 6,36 n.(ll) 1 86,9 ± 3,868,31-53,9 ± 3,536 8,3 8 82,6 ±,976,292-59,2 ± 7,18 6, ,1 ± 3,946,362-53,9 ± 2,333 7,69 94

110 22 89,3 ± 16,9,43-52,5 ± 1,768 6, ,9 ± 2,153,418-49,9 ± 8,485 6, ,4 ± 1,218,271-53,3 ± 4,9 6,63 Mean size (nm) PI n. Βeta car(sl) n. Βeta car(ll) PI-n. Βeta car(ll) PI-n. Βeta car(sl) T days Διάγραμμα 19. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL και LL) νανογαλακτωμάτων β-καροτενίου με τον χρόνο, στους 4 ο C. ζ-potentional (mv) T days WIDTH (mv) n. Βeta car(sl) n.βeta car(ll) W-n. Βeta car(ll) W-n.Βeta car(sl) Διάγραμμα 2. Μεταβολή ζ-δυναμικού (SL και LL) νανογαλακτωμάτων β- καροτενίου με τον χρόνο, στους 4 ο C. 95

111 Mean size (nm) T days PI n. Βeta car(sl) n.βeta car(ll) PI-n.Βeta car(ll) PI-n. Βeta car(sl) Διάγραμμα 21. Μεταβολή μεγέθους σωματιδίων (SL και LL) νανογαλακτωμάτων β-καροτενίου με τον χρόνο, στους 25 ο C. ζ-potentional (mv) T days WIDTH (mv) n. Βeta car(sl) n. Βeta car(ll) W-n. Βeta car(ll) W- n. Βeta car(sl) Διάγραμμα 22. Μεταβολή ζ-δυναμικού (SL και LL) νανογαλακτωμάτων β- καροτενίου με τον χρόνο, στους 25 ο C. 96

112 Σύγκριση νανογαλακτωμάτων βάση ρευστότητας λιπιδίων. Όλα τα νανογαλακτώματα παρέμειναν σταθερά στους 4 ο και στους 25 ο C σε διάστημα 6 ημερών, ανεξάρτητα από την ρευστότητα των λιπιδίων (Πίνακες και Διαγράμματα 11-22). Πιο συγκεκριμένα: Βlank νανογαλακτώματα -Στους 4 ο C: Το μέγεθος των σωματιδίων της διεσπαρμένης φάσης, των SL νανογαλακτωμάτων ήταν μεγαλύτερο από αυτό των LL νανογαλακτωμάτων σε διάστημα 6 ημερών. Ο δείκτης πολυδιασποράς δεν ξεπέρασε την τιμή,31 ενώ το ζ-δυναμικό κυμάνθηκε από -43,4 έως -59,3 (mv). -Στους 25 ο C: Το μέγεθος των σωματιδίων της διεσπαρμένης φάσης, των SL νανογαλακτωμάτων ήταν μεγαλύτερο από αυτό των LL νανογαλακτωμάτων σε διάστημα 6 ημερών. Ο δείκτης πολυδιασποράς δεν ξεπέρασε την τιμή,341 και το ζ-δυναμικό κυμάνθηκε από -37,9 έως -57,4 (mv). Νανογαλακτώματα οξικής τοκοφερόλης -Στους 4 ο C: Το μέγεθος της διεσπαρμένης φάσης των σωματιδίων των SL νανογαλακτωμάτων ήταν μεγαλύτερο από αυτό των LL νανογαλακτωμάτων σε διάστημα 6 ημερών. Ο δείκτης πολυδιασποράς δεν ξεπέρασε το,336 ενώ η τιμή του ζ-δυναμικού κυμάνθηκε από -48,6 έως -64,2 (mv) -Στους 25 ο C: Τα SL και LL νανογαλακτώματα δεν είχαν στατιστικά σημαντική διαφορά ως προς μέγεθος της διεσπαρμένης φάσης των σωματιδίων τους. Ο δείκτης πολυδιασποράς δεν ξεπέρασε σε καμία περίπτωση το,31 και η τιμή του ζ- δυναμικού κυμάνθηκε από -4,8 έως -63,4 (mv). 97

113 Νανογαλακτώματα β-καροτενίου -Στους 4 ο C: Το μέγεθος των σωματιδίων τω SL νανογαλακτωμάτων ήταν μεγαλύτερο από αυτό των LL νανογαλακτωμάτων σε διάστημα 6 ημερών. Ο δείκτης πολυδιασποράς για τα SL νανογαλακτώματα δεν ξεπέρασε το,376 ενώ για τα LL το,431. Η τιμή του ζ-δυναμικού κυμάνθηκε από -45,3 έως 57,6 (mv). -Στους 25 ο C: Το μέγεθος των σωματιδίων τω SL νανογαλακτωμάτων ήταν μεγαλύτερο απο αυτό των LL νανογαλακτωμάτων μέχρι και τις 3 ημέρες. Ο δείκτης πολυδιασποράς των SL γαλακτωμάτων δεν ξεπέρασε το,363 ενώ τον LL το,43. Η τιμή του ζ-δυναμικού κυμάνθηκε από -4,2 έως -59,2 (mv). Εικόνα 28. Φωτογραφίες νανογαλακτώματων αμέσως μετά την παρασκευή τους. 98

114 Εικόνα 29. Φωτογραφίες νανογαλακτωμάτων σε διάστημα 6 ημερών στους 25 ο C. Εικόνα Φωτογραφίες νανογαλακτωμάτων σε διάστημα 6 ημερών στους 4 ο C. 99