ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΙΚΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΑΣΦΑΛΕΙΑ ΧΟΡΗΓΗΣΗΣ ΤΗΣ ΡΙΦΑΜΠΙΚΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΤΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ ΜΕ ΤΗΝ EHRLICHIA CANIS

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΙΚΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΑΣΦΑΛΕΙΑ ΧΟΡΗΓΗΣΗΣ ΤΗΣ ΡΙΦΑΜΠΙΚΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΤΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ ΜΕ ΤΗΝ EHRLICHIA CANIS ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑ ΘΕΟΔΩΡΟΥ ΚΤΗΝΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ ΜΑΡΤΙΟΣ 2016

2 [2]

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΙΚΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΑΣΦΑΛΕΙΑ ΧΟΡΗΓΗΣΗΣ ΤΗΣ ΡΙΦΑΜΠΙΚΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΤΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ ΜΕ ΤΗΝ EHRLICHIA CANIS ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑ ΘΕΟΔΩΡΟΥ, ΚΤΗΝΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΟΥ ΕΚΠΟΝΗΘΗΚΕ ΣΤΗ ΜΟΝΑΔΑ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ, ΤΗΣ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΖΩΩΝ ΣΥΝΤΡΟΦΙΑΣ, ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ, ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ Α.Π.Θ. ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Αναπληρωτής καθηγητής Ματθαίος Μυλωνάκης Επιβλέπων Επίκουρος καθηγήτρια Βικτωρία Σιάρκου Μέλος της επιτροπής Αναπληρωτής καθηγητής Γεώργιος Μπατζίας Μέλος της επιτροπής [3]

4 [4]

5 ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Μ. Μυλωνάκης, Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήμα Κτηνιατρικής, ΑΠΘ Γ. Μπατζίας, Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήμα Κτηνιατρικής, ΑΠΘ Β. Σιάρκου, Επίκουρος Καθηγήτρια Τμήμα Κτηνιατρικής, ΑΠΘ Λ. Λεοντίδης, Καθηγητής Τμήμα Κτηνιατρικής, ΠΘ Τ. Ράλλης, Καθηγητής Τμήμα Κτηνιατρικής, ΑΠΘ Μ. Κριτσέπη, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήμα Κτηνιατρικής, ΑΠΘ Χ. Κουτίνας, Επίκουρος Καθηγητής Τμήμα Κτηνιατρικής, ΑΠΘ [5]

6 [6]

7 Στην οικογένεια μου, τους φίλους και τους δασκάλους μου που άντεξαν να μείνουν δίπλα μου σε όλη τη διαδρομή Στους «ασθενείς» μου που όταν χάνω το δρόμο μου, μου υπενθυμίζουν γιατί επέλεξα αυτή την επιστήμη [7]

8 [8]

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΚΑΙ ΑΓΓΛΙΚΟΙ ΟΡΟΙ.13 ΠΡΟΛΟΓΟΣ...15 ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ: ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ Η ερλιχίωση του σκύλου Η μονοκυτταρική ερλιχίωση του σκύλου (ΜΕΣ, Εhrlichia canis) Επιδημιολογία της ΜΕΣ Παθογένεια της ΜΕΣ Κλινική εικόνα της ΜΕΣ Αιματολογικές και βιοχημικές διαταραχές της ΜΕΣ Εργαστηριακή Διάγνωση της ΜΕΣ Μέθοδοι επιβεβαίωσης της ενεργού μόλυνσης από την Ε. canis Μέθοδοι διαπίστωσης της έκθεσης στην Ε. canis Ειδική Θεραπεία της ΜΕΣ...34 ΜΕΡΟΣ ΥΤΕΡΟ: Η ΔΙΚΗ ΜΑΣ ΕΡΕΥΝΑ...39 Α) ΣΤΟΧΟΙ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ.39 Β) ΟΡΙΣΜΟΙ...39 Γ) ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Πειραματικός πληθυσμός, τόπος και χρόνος διεξαγωγής της μελέτης και διαχείριση των σκύλων μετά την ολοκλήρωσή της Κριτήρια ένταξης των σκύλων στη μελέτη Ομαδοποίηση των σκύλων της μελέτης Πειραματική μόλυνση των σκύλων με την E. canis 41 [9]

10 5. Θεραπευτικό πρωτόκολλο Φαρμακοκινητική μελέτη του σκευάσματος και του δοσολογικού σχήματος της ριφαμπικίνης που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη Μέθοδος προσδιορισμού των επιπέδων ριφαμπικίνης στο αίμα Φαρμακοκινητική ανάλυση Κλινική εξέταση Αιματολογική εξέταση Βιοχημικές εξετάσεις στον ορό του αίματος Ανάλυση των ούρων Ορολογικές εξετάσεις Μυελοκέντηση και παρακέντηση του σπλήνα Δοκιμές της Αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης Nested PCR Real-time PCR Στατιστική ανάλυση...58 ΜΕΡΟΣ ΤΡΙΤΟ: ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ..61 Α)ΦΑΡΜΑΚΟΚΙΝΗΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ 61 Β) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΡΙΦΑΜΠΙΚΙΝΗΣ Κλινική εικόνα Αιματολογικές εξετάσεις Μεταβολές του αιματοκρίτη Μεταβολές του αριθμού των λευκών αιμοσφαιρίων Μεταβολές του αριθμού των αιμοπεταλίων...72 [10]

11 3. Κινητική του τίτλου των IgG αντισωμάτων έναντι της E. canis Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης.78 Β) ΑΣΦΑΛΕΙΑ ΤΗΣ ΧΟΡΗΓΗΣΗΣ ΤΗΣ ΡΙΦΑΜΠΙΚΙΝΗΣ ΣΕ ΣΚΥΛΟΥΣ ΜΟΛΥΣΜΕΝΟΥΣ ΜΕ ΤΗΝ E. CANIS Κλινική εξέταση κατά τη διάρκεια της χορήγησης της ριφαμπικίνης στην ομάδα Α Αιματολογική εξέταση κατά τη διάρκεια της χορήγησης της ριφαμπικίνης στην ομάδα Α Βιοχημική εξέταση στον ορό του αίματος κατά τη διάρκεια της χορήγησης της ριφαμπικίνης στην ομάδα Α Ανάλυση των ούρων...93 Γ) ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΤΩΝ ΤΡΙΩΝ ΙΣΤΩΝ ΚΑΙ ΕΠΙΠΕΔΟ ΣΥΜΦΩΝΙΑΣ ΤΩΝ ΔΥΟ ΜΕΘΟΔΩΝ PCR ΣΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΟΥ DNA ΤΗΣ E. CANIS 95 ΜΕΡΟΣ ΤΕΤΑΡΤΟ: ΣΥΖΗΤΗΣΗ...97 Α) Αποτελεσματικότητα της ριφαμπικίνης και παρακολούθηση μετά τη θεραπεία...97 B) Ασφάλεια της χορήγησης της ριφαμπικίνης.105 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΡΟΤΑΣΕΙΣ ΓΙΑ ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΕΣ ΕΡΕΥΝΕΣ 115 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 117 ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY [11]

12 [12]

13 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΚΑΙ ΑΓΓΛΙΚΟΙ ΟΡΟΙ Α.Π.Θ.: Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Κ.Ζ.Σ.: Κλινική Ζώων Συντροφιάς ΗΜΕ: Ημέρα μετά τον ενοφθαλμισμό Κ.Φ.Τ.: Κατώτερη φυσιολογική τιμή ΜΕΣ: Μονοκυτταρική ερλιχίωση του σκύλου ΜΟ: Μυελός των οστών ALP (Alkaline Phosphatase): αλκαλική φωσφατάση ALT (Alanine Aminotransferase): αλανινοαμινοτρανφεράση BC (Βuffy coat): στοιβάδα των λευκών αιμοσφαιρίων-αιμοπεταλίων της στήλης του αιματοκρίτη BID: κάθε 12 ώρες BUN (Blood Urea Nitrogen): ουρεϊκό άζωτο DNA (Deoxyribonucleic Acid): δεοξυριβονουκλεϊνικό οξύ DNA sequencing: ανάλυση της αλληλουχίας των βάσεων του DNA EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid): αιθυλενο-διαμινο-τετραοξικό κάλιο E. canis: Ehrlichia canis E. chaffeensis: Ehrlichia chaffeensis E. ewingii: Ehrlichia ewingii E. muris: Ehrlichia muris E. ruminantium: Ehrlichia ruminantium ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay): ενζυμική ανοσοαπορρόφηση HCT (Hematocrit): αιματοκρίτης [13]

14 Hg (Hemoglobin): αιμοσφαιρίνη IFA (Indirect Immunofluorescence Antibody Assay): έμμεσος ανοσοφθορισμός IFN: Ιντερφερόνη IL: Ιντερλευκίνη MCHC (Mean Cell Hemoglobin Concentration): μέση πυκνότητα αιμοσφαιρίνης MCV (Mean Cell Volume): μέσος όγκος ερυθρού αιμοσφαιρίου MIC (Minimum Inhibitory Concentration): ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση Nested PCR: διπλή αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης PCR (Polymerase Chain Reaction): αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης PLT (Platelets): αιμοπετάλια RT-PCR (Real-time PCR): αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης πραγματικού χρόνου SID: κάθε 24 ώρες WBC (White Blood Cells): λευκά αιμοσφαίρια [14]

15 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η μονοκυτταρική ερλιχίωση του σκύλου (Ehrlichia canis, ΜΕΣ) αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα κροτωνογενή νοσήματα του σκύλου σε ολόκληρο τον κόσμο, το οποίο απασχολεί ιδιαίτερα συχνά τον κτηνίατρο στην καθημερινή κλινική πράξη, ιδιαίτερα στις ενδημικά προσβεβλημένες χώρες, όπως είναι η Ελλάδα. Μέχρι σήμερα, η θεραπευτική αντιμετώπιση του νοσήματος βασίζεται κυρίως στη χορήγηση δοξυκυκλίνης. Με βάση το γεγονός ότι πολλές πρόσφατες μελέτες δείχνουν πως η δοξυκυκλίνη συχνά αποτυγχάνει να εκριζώσει τη μόλυνση από την E. canis, σε συνδυασμό με τη σχετικά συχνή εμφάνιση παρενεργειών, όπως και τον ενδεχόμενο κίνδυνο η ευρεία χρήση αυτού του αντιμικροβιακού να οδηγήσει στην ανάπτυξη αντοχής του μικροοργανισμού, ο προσανατολισμός της έρευνας για την αξιολόγηση εναλλακτικών θεραπευτικών ουσιών για τη ΜΕΣ κρίνεται εύλογος. Βιβλιογραφικά δεδομένα που αφορούν στον άνθρωπο αλλά και το σκύλο υποδεικνύουν τη ριφαμπικίνη ως μία ελπιδοφόρο εναλλακτική ουσία της δοξυκυκλίνης, αποτελώντας το έναυσμα για την παρούσα ερευνητική μελέτη. Η έρευνα αυτή διενεργήθηκε στη Μονάδα Παθολογίας, της Κλινικής των Ζώων Συντροφιάς (Κ.Ζ.Σ.) του Τμήματος Κτηνιατρικής (Σχολή Επιστημών Υγείας), του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (Α.Π.Θ.) από τον Ιούνιο 2009 ως και το Φεβρουάριο Σε όλη τη διάρκεια της διδακτορικής μου διατριβής ο πιο σημαντικός συνεργάτης μου υπήρξε ο αναπληρωτής καθηγητής και επιβλέπων της διατριβής κ. Ματθαίος Μυλωνάκης, ο οποίος εκτός από την επιλογή του θέματος, τη σχεδίαση της έρευνας και την προσωπική του συμμετοχή σε όλα τα στάδια της ερευνητικής διαδικασίας και της συγγραφής, μου προσέφερε απλόχερα την καθοδήγηση, ενθάρρυνση και συμπαράστασή του, όποτε και αν τη χρειάστηκα. Για τους παραπάνω λόγους, καθώς και για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε αναθέτοντάς μου την ερευνητική αυτή προσπάθεια θα ήθελα να του απευθύνω τις θερμότατες ευχαριστίες μου. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω ιδιαιτέρως: [15]

16 - τον καθηγητή κ. Αλέξανδρο Κουτίνα, μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής από το 2009 μέχρι τη συνταξιοδότησή του το 2011, για τη συμμετοχή στο σχεδιασμό της έρευνας και τις πολύτιμες συμβουλές του. - την επίκουρο καθηγήτρια κ. Βικτωρία Σιάρκου, μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, για τη συμμετοχή στο σχεδιασμό της έρευνας, για την καθοδήγηση προς εμένα και την προσωπική της συμβολή κατά τη διεξαγωγή των μοριακών εξετάσεων της διατριβής, καθώς και για τις πολύτιμες παρατηρήσεις της κατά τη συγγραφή. - τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Γιώργο Μπατζία, ο οποίος με προθυμία ανέλαβε τη θέση του κ. Κουτίνα ως μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, για τη συμμετοχή τόσο στο σχεδιασμό της έρευνας με τη διεξαγωγή της αρχικής φαρμακοκινητικής μελέτης, όσο και στη συγγραφή της διατριβής. - τον καθηγητή κ. Λεωνίδα Λεοντίδη, του Τμήματος Κτηνιατρικής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας, για την ανεκτίμητη συμβολή του στη στατιστική επεξεργασία και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων της διδακτορικής διατριβής. - τον καθηγητή Dr. Shimon Harrus (the Koret School of Veterinary Medicine, the Hebrew University of Jerusalem, Israel), για την ευγενική παραχώρηση του στελέχους «611» της E. canis που χρησιμοποιήθηκε για την πειραματική μόλυνση των σκύλων, για τη διεξαγωγή της real-time PCR στα δείγματα της μελέτης και για τις εποικοδομητικές συζητήσεις σε πολλές φάσεις της διατριβής. - τον επίκουρο καθηγητή κ. Χρήστο Κουτίνα, για την πολύ σημαντική βοήθειά του κατά τη διάρκεια του πειραματισμού καθώς και τη συνεχή υποστήριξη που μου προσέφερε μέχρι την ολοκλήρωση της διατριβής. - την αναπληρώτρια καθηγήτρια κ. Μαρία Κριτσέπη-Κωνσταντίνου για τη διεξαγωγή των εργαστηριακών εξετάσεων της μελέτης στο Διαγνωστικό Εργαστήριο του Τμήματος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ. Επίσης, για τις εποικοδομητικές παρατηρήσεις της ως μέλους της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής. - τον καθηγητή κ. Τιμολέων Ράλλη για την κάθε είδους διευκόλυνση που μου παρείχε για την πραγματοποίηση της μελέτης, ως Διευθυντής του Διαγνωστικού Εργαστηρίου κατά την περίοδο της έναρξης της διδακτορικής διατριβής, αλλά και τις [16]

17 πολύτιμες παρατηρήσεις του κατά τη φάση της αξιολόγησης της διδακτορικής διατριβής. - τον επίκουρο καθηγητή κ. Γιώργο Καζάκο για την επιλογή του αναισθητικού πρωτοκόλλου που χρησιμοποιήθηκε κατά τις δειγματοληψίες της μελέτης. -την συνάδελφο κ. Ευγενία Φλουράκη, υποψήφια διδάκτορα στη Μονάδα Αναισθησιολογίας, για την αναισθησιολογική κάλυψη του πειραματισμού, και τον κ. Κωνσταντίνο Τσαφά, μετεκπαιδευόμενο στη Μονάδα Παθολογίας, για την ανεκτίμητη βοήθειά τους κατά τη διεξαγωγή των δειγματοληψιών της μελέτης. - τον συνάδελφο κ. Θεόδωρο Πετανίδη για τη βοήθεια του στις δειγματοληψίες, αλλά και τη συνεχή του υποστήριξη κατά τη διάρκεια της διατριβής. Πολλές ευχαριστίες θα ήθελα να απευθύνω στους ζωοκόμους της Κ.Ζ.Σ., κ. Στέλιο Ζησόπουλο, κ. Νίκο Ζησόπουλο και κ. Γιώργο Γραμμένο για τη βοήθεια τους στη φροντίδα των ζώων, όπως και στους μετεκπαιδευόμενους και μεταπτυχιακούς της Μονάδας Παθολογίας για τη βοήθειά τους, όποτε τους χρειάστηκα. Τις θερμότατες ευχαριστίες μου θα ήθελα να εκφράσω και στον επίκουρο καθηγητή και πρωτίστως συνεργάτη και φίλο μου, κ. Νεκτάριο Σούμπαση, για τη στήριξη που μου προσέφερε κατά τη διάρκεια της μελέτης, καθώς και στις συναδέλφους και φίλες μου κ. Φλώρα Καλτσογιάννη, κ. Ίρις Καλλή, κ. Βασιλεία Κούτη και κ. Έττυ Λεβή που ήταν πάντα δίπλα μου. Ιδιαίτερα σημαντική στη διεξαγωγή της μελέτης ήταν η συμβολή της Κλινικής Ζώων Συντροφιάς, του τμήματος Κτηνιατρικής Α.Π.Θ., η οποία παρείχε την οικονομική κάλυψη του πειραματισμού και παραχώρησε τις εγκαταστάσεις που φιλοξένησαν τον πειραματικό πληθυσμό των σκύλων, καθώς και του Εργαστηρίου Βακτηριολογίας, Ιολογίας και Λοιμωδών Νοσημάτων και του Εργαστηρίου της Παρασιτολογίας του τμήματος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ. για την παραχώρηση του εξοπλισμού για τη διενέργεια των μοριακών εξετάσεων. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένεια και τους φίλους μου, χωρίς την αγάπη, την υπομονή και τη στήριξη των οποίων δεν θα είχα καταφέρει να ολοκληρώσω τη διατριβή αυτή. [17]

18 [18]

19 ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ 1. Η ΕΡΛΙΧΙΩΣΗ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ Η ερλιχίωση του σκύλου οφείλεται σε υποχρεωτικά ενδοκυτταρικά, Gramαρνητικά βακτήρια του γένους Ehrlichia (Τάξη: Rickettsiales, Οικογένεια: Anaplasmataceae) (Harrus et al. 2012, Sykes 2014, Sainz et al. 2015). Η βελτιστοποίηση των διαγνωστικών μεθόδων και ιδιαίτερα η συνεχώς αυξανόμενη χρησιμοποίηση της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (polymerase chain reaction, PCR) και της ανάλυσης της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων του DNA (DNA sequencing) των μικροοργανισμών συνέβαλε στην ορθότερη ταξινόμηση των ειδών της τάξης Rickettsiales και ειδικότερα των ειδών του γένους Ehrlichia (Ehrlichia spp.) και στην καλύτερη μελέτη της επιδημιολογίας της ερλιχίωσης (Dumler et al. 2001). Η μόλυνση των σκύλων γίνεται με διάφορα είδη κροτώνων (Πίνακας 1) ή με τη μετάγγιση μολυσμένου αίματος (Sykes 2014). Οι μικροοργανισμοί των Ehrlichia spp παρουσιάζουν τροπισμό στα λευκά αιμοσφαίρια των σκύλων (Πίνακας 1), σχηματίζοντας συμπαγή ή χαλαρά συσσωματώματα που ονομάζονται "μορίδια" (morulae) μέσα σε κυτταροπλασματικά κενοτόπια που περιβάλλονται από μεμβράνη με δομή παρόμοια με αυτή του κυττάρου-στόχου (Mylonakis 2001). Πέντε τουλάχιστον είδη του γένους Ehrlichia μπορούν να μολύνουν και να προκαλέσουν κλινική νόσο στο σκύλο (Πίνακας 1). Η παθογόνος δράση της Ehrlichia canis στο σκύλο τεκμηριώθηκε για πρώτη φορά το 1935 στην Αλγερία (Donatien and Lestoguard 1935) και σήμερα αποτελεί το συχνότερο και πιο σημαντικό αίτιο της μονοκυτταρικής ερλιχίωσης στο ζωικό αυτό είδος παγκοσμίως (Neer et al. 2002, Little 2010, Harrus et al. 2012). Η E. chaffeensis, η οποία αποτελεί το αίτιο της μονοκυτταρικής ερλιχίωσης του ανθρώπου (Πίνακας 1), σπάνια μόνο προκαλεί νόσο στο σκύλο, η κλινική και αιματολογική εικόνα της οποίας παρουσιάζει πολλές ομοιότητες με αυτή της μόλυνσης από την E. canis (Breitschwerdt et al. 1998b, Kordick et al. 1999, Nair et al. 2016). Η E. ewingii αποτελεί το αίτιο της κοκκιοκυτταρικής ερλιχίωσης του σκύλου και του ανθρώπου και όπως στην περίπτωση της E. chaffeensis, η γεωγραφική εντόπισή της περιορίζεται κυρίως στην Αμερικανική Ήπειρο (Πίνακας 1) (Breitschwerdt et al. 1998b, Goodman et al. 2003). H E. ruminantium (παλαιότερη ταξινόμηση ως Cowdria ruminantium), οποία [19]

20 αποτελεί το αίτιο της νόσου της υδατοειδούς καρδιάς (heartwater) των μηρυκαστικών στη Νότια Αφρική, έχει ανιχνευτεί μοριακά και συνδεθεί με νόσο σε σκύλους με συμπτωματολογία και εργαστηριακές διαταραχές συμβατές με την ερλιχίωση, χωρίς ωστόσο τα ζώα αυτά να παρουσιάζονται θετικά στην E. canis εφαρμόζοντας ορολογικές και μοριακές τεχνικές (Allsopp and Allsopp 2001). Τέλος, ένας μικροοργανισμός με τα γενετικά χαρακτηριστικά της E. muris, του αιτίου της μονοκυτταρικής ερλιχίωσης των τρωκτικών, έχει ανιχνευτεί με την εφαρμογή μοριακών τεχνικών σε έναν ασθενή σκύλο όπως και σε ανθρώπους στις Ηνωμένες Πολιτείες (Hegarty et al. 2012). Πρόσφατα, ανιχνεύτηκε μοριακά ένα νέο είδος Ehrlichia (Panola Mountain Ehrlichia sp.) σε σκύλο, ο οποίος αν και κλινικά υγιής παρουσίαζε εργαστηριακές διαταραχές, όπως θρομβοκυτταροπενία, άτυπη μορφολογία των λεμφοκυττάρων και κλωνικό πολλαπλασιασμό των Τ λεμφοκυττάρων, που υποχώρησαν με τη χορήγηση δοξυκυκλίνης (Qurollo et al. 2013). Πίνακας 1: Είδη του γένους Ehrlichia που προκαλούν την ερλιχίωση του σκύλου, κυτταρικός τροπισμός τους, κρότωνες φορείς τους και θηλαστικά που θεωρούνται ως δεξαμενές τους. (Harrus et al. 2012, τροποποιημένος) Είδος Ehrlichia Κυτταρικός τροπισμός Κρότωνας φορέας * Κύριο θηλαστικό-δεξαμενή E. canis Μονοκύτταρα, μακροφάγα, λεμφοκύτταρα Rhipicephalus sanguineous Dermacentor variabilis Σκύλος E. chaffeensis Μονοκύτταρα, μακροφάγα, λεμφοκύτταρα Amblyomma americanum Dermacentor variabilis Ελάφι + E. ewingii Κοκκιοκύτταρα Amblyomma americanum Dermacentor variabilis Rhipicephalus sanguineous Ελάφι + E. ruminantium ** Ενδοθηλιακά κύτταρα, μονοκύτταρα, μακροφάγα Amblyomma hebraeum Μηρυκαστικά ++ E. muris ** Άγνωστος Ixodes scapularis Τρωκτικά +++ * Επιβεβαιωμένος ή ισχυρά ύποπτος, ** Πιθανά παθογόνο για το σκύλο + Λευκόουρο ελάφι (Odocoileus virginianis), ++ Οικόσιτα βοοειδή (Bos taurus), οικόσιτα αιγοπρόβατα (Carpa aegarus, Ovis aries), +++ Αρουραίος (Microtilus arnalis) [20]

21 2. Η ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΕΡΛΙΧΙΩΣΗ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ (ΜΕΣ, EHRLICHIA CANIS) 2.1 ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΜΕΣ Η μετάδοση της E. canis γίνεται με τον κρότωνα Rhipicephalus sanguineus (Dantas-Torres 2008, Stich et al. 2008, Fourie et al. 2013), ενώ πειραματικά έχει επιτευχθεί και με τον Dermacentor variabilis (Johnson et al. 1998). Ο σκύλος αποτελεί τον κύριο ξενιστή του R. sanguineous, ενώ υπάρχουν αναφορές παρασιτισμού από το συγκεκριμένο κρότωνα άγριων μελών της οικογένειας Canidae, της γάτας, του ανθρώπου και των τρωκτικών (Stich et al. 2008). Η μόλυνση των κροτώνων μπορεί να γίνει κατά το στάδιο της προνύμφης, της νύμφης ή του ενήλικου, με την απομύζηση αίματος από ένα μολυσμένο σκύλο, ο οποίος συνήθως βρίσκεται στην οξεία και λιγότερο συχνά στην υποκλινική ή τη χρόνια φάση της λοίμωξης (Harrus et al. 1998c). H μετάδοση της E. canis στους κρότωνες μπορεί να είναι διασταδιακή (προνύμφη νύμφη ενήλικο), αλλά όχι διωοθηκική (αυγό προνύμφη), ενώ έχει αποδειχθεί και η δυνατότητα ενδοσταδιακής μετάδοσης μεταξύ των ενηλίκων αρσενικών κροτώνων (Bremer et al. 2005). Οι ενήλικοι κρότωνες μπορούν να μεταδώσουν την E. canis για τουλάχιστον 155 ημέρες από τη μόλυνσή τους (Lewis et al. 1977), διευκολύνοντας τη διαχείμαση του μικροοργανισμού στον κρότωνα και τη μετάδοσή του στην αρχή της Άνοιξης (Harrus et al. 1997b). H πλειονότητα των περιστατικών της οξείας ΜΕΣ στην Ελλάδα παρατηρείται την εαρινή και τη θερινή περίοδο που συμπίπτει με την κορύφωση της δραστηριότητας των κροτώνων (Papadopoulos et al. 1996), ενώ δεν φαίνεται να υπάρχει εποχικότητα στην εμφάνιση της χρόνιας βαριάς ερλιχίωσης (Mylonakis et al. 2004). Η μετάδοση της E.canis πραγματοποιείται με τον ενοφθαλμισμό του σιαλώδους εκκρίματος των κροτώνων, κατά τη διάρκεια της αιμομύζησης και σύμφωνα με μία πρόσφατη μελέτη μπορεί να συμβεί μέσα στις 3-6 ώρες από την προσκόλληση του μολυσμένου κρότωνα (Fourie et al. 2013). Λιγότερο συχνά η μετάδοση της E. canis μπορεί να γίνει κατά τη μετάγγιση μολυσμένου αίματος, εξαιτίας της δυνατότητας επιβίωσης της E. canis σε συντηρημένο αίμα (Little 2010), γεγονός που υπαγορεύει τον έλεγχο των υποψήφιων αιμοδοτών για τoν συγκεκριμένο λοιμώδη παράγοντα (Wardrop et al. 2005). [21]

22 Ο ρόλος του R. sanguineus στη γεωγραφική εξάπλωση της E. canis είναι ιδιαίτερα σημαντικός. Η ΜΕΣ εμφανίζει παγκόσμια γεωγραφική εξάπλωση, με πολυάριθμες ορολογικές ή/και μοριακές μελέτες να επιβεβαιώνουν την ενδημική προσβολή από την E. canis περιοχών της Ευρώπης, της Ασίας, της Αφρικής και της Αμερικής (Magnarelli and Anderson 1993, Suksawat et al. 2000, Suksawat et al. 2001, Amusategui et al. 2008, Matjila et al. 2008, Bowman et al. 2009, Pantchev et al. 2009, Davoust et al. 2013, Tanikawa et al. 2013). Το 2001 αναφέρθηκε το πρώτο επιβεβαιωμένο περιστατικό στην Ιαπωνία (Suto et al. 2001), ενώ η ήπειρος της Ωκεανίας φαίνεται να μην είναι ενδημικά προσβεβλημένη, εφόσον έχουν εντοπιστεί μόνο λίγοι οροθετικοί σκύλοι (Mason et al. 2001). Στην Ελλάδα, η ΜΕΣ διαπιστώθηκε για πρώτη φορά το 1989 (Koutinas et al. 1989). 2.2 ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ ΤΗΣ ΜΕΣ Μετά τον ενοφθαλμισμό της E. canis και την περίοδο επώασης διάρκειας περίπου 8-20 ημερών, εκδηλώνεται η οξεία (μη μυελοκατασταλτική) μορφή της ΜΕΣ που διαρκεί 2-4 εβδομάδες (Harrus et al. 2012). Η κλινική ίαση αποτελεί τη συνηθέστερη κατάληξη της οξείας ΜΕΣ, ανεξάρτητα από το αν θα εκριζωθεί η μόλυνση (χορήγηση θεραπείας ή αυτοΐ αση) ή ο σκύλος παραμείνει φορέας της E. canis. Στην τελευταία περίπτωση, ακολουθεί η υποκλινική μορφή, η οποία χαρακτηρίζεται κατά κανόνα από ήπιες μόνο αιματολογικές και ενδεχομένως βιοχημικές διαταραχές με συνηθέστερες τη θρομβοκυτταροπενία και την υπερσφαιριναιμία (Codner and Farris-Smith 1986, Waner et al. 1997). Κατά τη διάρκεια του σταδίου αυτού που κυμαίνεται από λίγους μήνες έως αρκετά χρόνια, ένα ποσοστό ανοσοεπαρκών σκύλων μπορεί να εκριζώσει τη μόλυνση (Codner and Farris-Smith 1986, Breitschwerdt et al. 1998b, Harrus et al. 1998b). Ένα μη προβλέψιμο ποσοστό σκύλων, εμφανίζει τη χρόνια βαριά (μυελοκατασταλτική) ΜΕΣ που στην τυπική της μορφή χαρακτηρίζεται από απλαστική παγκυτταροπενία και πολύ υψηλή θνησιμότητα ως αποτέλεσμα σηψαιμίας ή/και σοβαρής αιμορραγικής διάθεσης (Mylonakis et al. 2010a, Mylonakis 2012). Οι παράγοντες που συνδέονται με την εμφάνιση της μυελοκατασταλτικής φάσης της ΜΕΣ παραμένουν σε σημαντικό βαθμό αδιευκρίνιστοι. Σε μια σχετική μελέτη, τα στελέχη της E. canis που εμπλέκονταν σε περιστατικά οξείας και χρόνιας ΜΕΣ δεν διέφεραν ως προς το γονίδιο 16S rrna, υποδηλώνοντας ότι το στέλεχος της E. canis δεν φαίνεται να συνδέεται με την εμφάνιση της μυελοκατασταλτικής μορφής της ΜΕΣ (Siarkou et al. [22]

23 2007). Αντίθετα, υπάρχουν βάσιμες ενδείξεις ότι η σοβαρότητα της κλινικής εικόνας σχετίζεται με τη φύση της ανοσολογικής ανταπόκρισης του μολυσμένου σκύλου (ανοσολογική αντίδραση τύπου Th1 ή Th2) και τον τύπο των κυτταροκινών που επάγονται μετά τη μόλυνση (Day 2011). Για παράδειγμα, η αύξηση της συγκέντρωσης της ιντερφερόνης-γ (IFN-γ) συνδέεται με την εμφάνιση ήπιας νόσου, σε αντίθεση με την αύξηση των ιντερλευκινών (IL) IL-1β και IL-8 που συνδέεται με την εκδήλωση σοβαρής νόσου (Tajima and Rikihisa 2005, Unver et al. 2006). Αντίθετα με την κυτταρική, η χυμική ανοσία δεν φαίνεται να έχει προστατευτικό ρόλο στη ΜΕΣ, αφού δεν αποτρέπει τη μόλυνση ακόμα και σε σκύλους με υψηλούς τίτλους αντισωμάτων έναντι της E. canis (Breitschwerdt et al. 1998a). Στην πραγματικότητα, η χυμική ανοσία μπορεί να είναι επιζήμια για το μολυσμένο ζώο αφού οι ανοσοσφαιρίνες IgG είναι δυνατόν να διευκολύνουν την είσοδο της E. canis στα μονοκύτταρα-μακροφάγα με το σχηματισμό συμπλόκων (IgG-E. canis) και τη βοήθεια του παράγοντα C 3 b του συμπληρώματος (Ristic and Holland 1993, Harrus et al. 2012). Σε μια σχετική πειραματική μελέτη, μολυσμένοι σκύλοι της φυλής German Shepherd εμφάνιζαν σοβαρότερη κλινική εικόνα και μειωμένη δραστηριότητα της κυτταρικής ανοσίας σε σχέση με σκύλους της φυλής Beagle, χωρίς να εμφανίζουν διαφορά ως προς τη χυμική ανοσία. Το γεγονός αυτό υπογραμμίζει την ευαισθησία της συγκεκριμένης φυλής απέναντι στο συγκεκριμένο νόσημα και τη σημαντική συμβολή της κυτταρικής ανοσίας στην αντιμετώπιση της ΜΕΣ. Σε άλλες μελέτες, διαπιστώθηκε πως η ανεπάρκεια του μυελού των οστών στη μυελοκατασταλτική ΜΕΣ δεν συνδεόταν με συνυπάρχοντα λοιμώδη νοσήματα ή με την εμφάνιση μυελοΐ νωσης (Mylonakis et al. 2004, Mylonakis et al. 2010a). Μετά τον ενοφθαλμισμό, η E. canis πολλαπλασιάζεται με διαίρεση μέσα σε κυτταροπλασματικά κενοτόπια (μορίδια) των κυττάρων του μονοπύρηνοφαγοκυτταρικού συστήματος (π.χ. σπλήνας, ήπαρ, λεμφογάγγλια, μυελός των οστών). Η ανάπτυξη του μικροοργανισμού εντός κενοτοπίων εξασφαλίζει την προστασία του από τη δράση των λυσοσωματικών ενζύμων και του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή. Η διασπορά του μικροοργανισμού πραγματοποιείται μετά την ολοκλήρωση της ανάπτυξης του μοριδίου, μέσω της ρήξης της κυτταρικής μεμβράνης του κυττάρου-στόχου και την είσοδό τους σε γειτονικά κύτταρα (Harrus et al. 2012, Mylonakis 2012). H προσκόλληση και η είσοδος στα γειτονικά κύτταρα φαίνεται να διευκολύνεται από την ύπαρξη στην επιφάνεια της E. canis ειδικών [23]

24 πρωτεϊνικών μορίων που καλούνται προσκολλητίνες (Mavromatis et al. 2006). Η διασπορά του μικροοργανισμού μέσω της αιματικής και λεμφικής κυκλοφορίας στα παρεγχυματικά όργανα οδηγεί στην πρόκληση γενικευμένης ήπιας αγγειΐτιδας από ανοσοσύμπλοκα (Harrus et al. 1997b). Η παθογένεια της ΜΕΣ, τουλάχιστον στην οξεία και υποκλινική φάση, είναι σε σημαντικό βαθμό ανοσολογικής φύσης (Mylonakis 2001). Σε αυτό συντείνουν η έντονη περιαγγειακή λεμφοκυτταρικήπλασμοκυτταρική διήθηση κυρίως στους πνεύμονες, το σπλήνα, τους νεφρούς, τις μήνιγγες, τους οφθαλμούς και άλλα όργανα (Hildebrandt et al. 1973, Reardon and Pierce 1981b, Mylonakis et al. 2006, Mylonakis et al. 2011a), η διαπίστωση κυτταροτοξικής δράσης των λεμφοκυττάρων απέναντι στα μακροφάγα (Kakoma et al. 1977), η ηπιότερη κλινική εικόνα της νόσου σε περίπτωση μερικής αδρανοποίησης των παραγόντων του συμπληρώματος (Lovering et al. 1980), εκλεκτικής ανοσοκαταστολής (Reardon and Pierce 1981a) ή σπληνεκτομής (Harrus et al. 1998d), η υπερσφαιριναιμία (Burghen et al. 1971, Harrus et al. 1996a) και η παραγωγή αντιαιμοπεταλιακών αντισωμάτων (Waner et al. 1995, Harrus et al. 1996c, Grindem et al. 1999, Waner et al. 2000). Η παραγωγή των τελευταίων, αποδίδεται στην παρουσία κοινών αντιγόνων μεταξύ της E. canis και των αιμοπεταλίων, στη μαζική απελευθέρωση διαφόρων αιμοπεταλιακών αντιγόνων, ή στην υπερπαραγωγή αντισωμάτων που έχουν αυξημένο χημικό προσανατολισμό στα αιμοπετάλια (Avrameas 1991, Ristic and Holland 1993, Waner et al. 2001). Αντίθετα, η παρουσία αντιπυρηνικών αντισωμάτων δε φαίνεται να εμπλέκεται στην παθογένεια (Harrus et al. 2001). Η αιμορραγική διάθεση, η πιο τυπική (αν και όχι η συχνότερη) κλινική εκδήλωση της ερλιχίωσης, συνδέεται με διαταραχές της πρωτογενούς αιμόστασης και οφείλεται συνηθέστερα στη θρομβοκυτταροπενία και λιγότερο συχνά στη θρομβοκυτταροπάθεια, την αγγειΐτιδα ή σε συνδυασμούς τους (Perille and Matus 1991, Harrus et al. 1996b, Mylonakis 2001). Η δευτερογενής αιμόσταση διαταράσσεται σπάνια στη ΜΕΣ (Shipov et al. 2008). Η θρομβοκυτταροπενία, που αποτελεί τη συχνότερη αιματολογική διαταραχή της ΜΕΣ, αποδίδεται μεμονωμένα ή συνδυαστικά στην ανοσολογική καταστροφή των αιμοπεταλίων, όπως δείχνει η χρονική σύμπτωση του υψηλότερου τίτλου αντιαιμοπεταλιακών αντισωμάτων στο αίμα με το χαμηλότερο αριθμό αιμοπεταλίων (Harrus et al. 1996c), στην υπερκατανάλωση των αιμοπεταλίων λόγω αγγειΐτιδας, στον εγκλωβισμό τους στο [24]

25 σπλήνα, στον παράγοντα αναστολής της μετανάστευσής τους (platelet migration inhibition factor) και στη μειωμένη παραγωγή τους από τον υποπλαστικό μυελό των οστών στη χρόνια βαριά ΜΕΣ (Smith et al. 1974, Pierce et al. 1977, Kakoma et al. 1978, Lovering et al. 1980, Waner et al. 1995, Harrus et al. 1997b, Harrus et al. 1998a, Mylonakis et al. 2004, Mylonakis et al. 2006). Είναι ακόμα ενδιαφέρον, πως σε μελέτη στην οποία τα αιμοπετάλια σημάνθηκαν με ραδιοϊσότοπα, ο χρόνος ζωής των αιμοπεταλίων μειώθηκε από τις 9 στις 4 ημέρες, 2-4 ημέρες μετά τον ενοφθαλμισμό των σκύλων με την E. canis (Smith et al. 1975). Η παρουσία υπερσφαιριναιμίας αποτελεί συχνό εύρημα στη ΜΕΣ και είναι συνήθως πολυκλωνική, ενώ δε φαίνεται να συσχετίζεται με την παραγωγή των ειδικών έναντι της Ε. canis IgG αντισωμάτων, αφού μετά τη θεραπεία, η συγκέντρωση των σφαιρινών μειώνεται πολύ νωρίτερα σε σχέση με τον τίτλο των αντισωμάτων (Weisiger et al. 1975, Perille and Matus 1991, Waner et al. 2001, Mylonakis et al. 2012). Ωστόσο, σπάνια είναι δυνατή η εμφάνιση μονοκλωνικής γάμμα-σφαιρινοπάθειας, με πιθανότητα πρόκλησης του συνδρόμου του υπεριξώδους και συμπτώματα όπως η αιφνίδια απώλεια της όρασης εξαιτίας της αποκόλλησης του αμφιβληστροειδούς χιτώνα (Hoskins et al. 1983, Breitschwerdt et al. 1987). 2.3 ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ ΤΗΣ ΜΕΣ Η ΜΕΣ αποτελεί πολυσυστηματικό νόσημα, η κλινική σοβαρότητα του οποίου κυμαίνεται από ήπια (μη μυελοκατασταλτική ΜΕΣ) μέχρι πολύ σοβαρή (μυελοκατασταλτική ΜΕΣ) (Mylonakis et al. 2010c, Waner and Harrus 2013). Ένα άγνωστο ποσοστό σκύλων παραμένει ασυμπτωματικό μετά τη μόλυνση, ενώ, η συνύπαρξη άλλων κροτωνογενών (π.χ. αναπλάσμωση, πιροπλάσμωση) ή μη (π.χ. λεϊσμανίωση) νοσημάτων, μπορεί να περιπλέξει την κλινική εικόνα (Kordick et al. 1999, Mekuzas et al. 2009, Mylonakis 2012). Οι σκύλοι της φυλής German Shepherd φαίνεται να παρουσιάζουν προδιάθεση στην εμφάνιση της ΜΕΣ, ιδιαίτερα της μυελοκατασταλτικής μορφής (Nyindo et al. 1980). Τα συχνότερα συμπτώματα που παρατηρούνται στη ΜΕΣ είναι η ανορεξία, ο πυρετός, η κατάπτωση/λήθαργος, η απώλεια σωματικού βάρους, η περιφερική λεμφογαγγλιομεγαλία, η σπληνομεγαλία, η ωχρότητα των βλεννογόνων και η αιμορραγική διάθεση, ενώ ο παρασιτισμός από κρότωνες είναι συχνότερος στην οξεία ΜΕΣ (Troy et al. 1980, Kuehn and Gaunt 1985, Waddle and Littman 1988, Harrus et al. 1997a, Frank and Breitschwerdt 1999, Mylonakis et al. 2004, Shipov et al. 2008, Mylonakis et al. 2011b, Sainz et al. 2015). [25]

26 Η αιμορραγική διάθεση που αποτελεί το πιο τυπικό κλινικό εύρημα της ΜΕΣ χαρακτηρίζεται κυρίως από την εμφάνιση πετεχειών και εκχυμώσεων στο δέρμα και στους βλεννογόνους, επίσταξη, ουλορραγία, ύφαιμα, μέλαινα, αιματουρία και παρατεταμένη αιμορραγία στα σημεία φλεβοκέντησης (Harrus et al. 1997a, Mylonakis et al. 2004, Mylonakis et al. 2008). Οφθαλμικές εκδηλώσεις παρατηρούνται σχετικά συχνά στη ΜΕΣ και μπορεί ενίοτε να αποτελούν την αποκλειστική αιτία προσκόμισης στον κτηνίατρο. Η πρόσθια ή οπίσθια ραγοειδίτιδα αποτελεί τη συνηθέστερη εκδήλωση, ενώ λιγότερο συχνά έχει αναφερθεί η εμφάνιση οφθαλμικού εκκρίματος, επιπεφυκίτιδας, εξέλκωσης του κερατοειδή, νεκρωτικής σκληρίτιδας, δευτερογενούς γλαυκώματος, αιμορραγίας ή/και αποκόλλησης του αμφιβληστροειδούς (Gould et al. 2000, Leiva et al. 2005, Komnenou et al. 2007). Οι κλινικές εκδηλώσεις στη μυελοκατασταλτική ΜΕΣ δεν διαφέρουν γενικά από αυτές της μη μυελοκατασταλτικής, κάποιες ωστόσο είναι πιο συχνές και σοβαρές, όπως η αιμορραγική διάθεση (Mylonakis et al. 2011b). Λιγότερο συχνά, μπορεί να εμφανιστούν νευρολογικές διαταραχές (π.χ. αταξία, επιληπτικές κρίσεις, μυϊκός τρόμος, αιθουσαίο ή παρεγκεφαλιδικό σύνδρομο) (Leiva et al. 2005, Hongo and Bloch 2006, Foley et al. 2007, Komnenou et al. 2007, Kaewmongkol et al. 2015). Μέχρι σήμερα, δεν έχει αποδειχτεί ο αιτιολογικός ρόλος της E. canis στην πρόκληση πολυαρθρίτιδας στο σκύλο (Theodorou et al. 2015). Τέλος, η αυξημένη συγκέντρωση της τροπονίνης Ι σε σκύλους με οξεία ΜΕΣ, καθώς και η εμφάνιση διαταραχών στο ηλεκτροκαρδιογράφημα σε ένα σκύλο με ΜΕΣ, οι οποίες υποχώρησαν μετά από τη θεραπεία με δοξυκλίνη, αποτελούν ενδείξεις πρόκλησης μυοκαρδιοπάθειας από την E. canis (Diniz et al. 2008, Waner and Ohad 2008). Ωστόσο, σε μία άλλη μελέτη, αν και διαπιστώθηκε υψηλή συχνότητα αύξησης της τροπονίνης Ι σε σκύλους με οξεία ή χρόνια ΜΕΣ, δεν υπήρξε συσχετισμός με την κλινική έκβαση της ΜΕΣ (ίαση ή θάνατος), γεγονός που υποδηλώνει πως οι καρδιακές βλάβες δεν αποτελούν σημαντικό παράγοντα κινδύνου για την αύξηση της θνησιμότητας στη ΜΕΣ (Koutinas et al. 2012). Η υποκλινική μορφή χαρακτηρίζεται από την απουσία ή την περιοδική εκδήλωση ήπιων και μη ειδικών συμπτωμάτων (π.χ. σπληνομεγαλία) που δεν γίνονται εύκολα αντιληπτά από τους ιδιοκτήτες, ενώ συνηθέστερα εντοπίζονται κατά τις περιοδικές προληπτικές κλινικές και εργαστηριακές εξετάσεις από τον κτηνίατρο (Harrus et al. 2012). [26]

27 2.4 ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΚΕΣ ΚΑΙ ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ ΤΗΣ ΜΕΣ Η συχνότερη αιματολογική διαταραχή στη ΜΕΣ, ανεξάρτητα από τη φάση της νόσου, είναι η θρομβοκυτταροπενία που εμφανίζεται στο % των μολυσμένων σκύλων (Kuehn and Gaunt 1985, Codner and Farris-Smith 1986, Waddle and Littman 1988, Harrus et al. 1997c, Mylonakis et al. 2011b, Sainz et al. 2015). Η σοβαρότητά της ποικίλλει ανάλογα με τη φάση της νόσου, με τους μικρότερους αριθμούς αιμοπεταλίων να παρατηρούνται στην οξεία και ιδιαίτερα στη χρόνια βαριά ΜΕΣ, σε αντίθεση με την υποκλινική φάση στην οποία διαπιστώνεται ήπια θρομβοκυτταροπενία (> /μl) (Harrus et al. 1997c, Harrus et al. 2012). Η θρομβοκυτταροπενία επιβάλλει την ορολογική ή/και μοριακή εξέταση ενός σκύλου για την ανίχνευση της E. canis, ωστόσο, δεν αποτελεί ειδικό αιματολογικό εύρημα της ΜΕΣ, ενώ η απουσία της δεν αποκλείει τη ΜΕΣ (Harrus et al. 1997c, Bulla et al. 2004, Macieira et al. 2005, Mylonakis 2012). Κατά την οξεία φάση, η θρομβοκυτταροπενία συνήθως συνοδεύεται από αύξηση του μέσου όγκου των αιμοπεταλίων και αυξημένο αριθμό (>2%) γιγαντοαιμοπεταλίων στο αίμα, χαρακτηριστικό ενδεικτικό αντισταθμιστικής αυξημένης θρομβοκυτταροποίησης (Harrus et al. 1996c). Άλλες αιματολογικές διαταραχές είναι η αναιμία (συνήθως ήπια μη αναγεννητική), η λευκοκυτταροπενία (πολύ σπανιότερα λευκοκυττάρωση), η λεμφοκυτταροπενία και η εωσινοπενία. Αν και η λεμφοκυτταροπενία είναι συχνότερη από τη λεμφοκυττάρωση (Harrus et al. 1997c, Mylonakis et al. 2011b), ενίοτε είναι δυνατή η παρατήρηση σημαντικής λεμφοκυττάρωσης ( /μl) που μπορεί να χαρακτηρίζεται από την παρουσία άτυπων κοκκωδών λεμφοκυττάρων (Weiser et al. 1991, Heeb et al. 2003, Avery and Avery 2007, Qurollo et al. 2013). Για το λόγο αυτό η ΜΕΣ θα πρέπει να περιλαμβάνεται στη διαφορική διάγνωση της εμμένουσας λεμφοκυττάρωσης του σκύλου (Avery and Avery 2007). Στην υποκλινική φάση της νόσου, η κύρια και ενδεχομένως αποκλειστική αιματολογική διαταραχή είναι η ήπια θρομβοκυτταροπενία, η οποία όμως δεν αποτελεί σταθερό εύρημα (Harrus et al. 1997b, Harrus et al. 1997c). Η χρόνια (μυελοκατασταλτική) ΜΕΣ χαρακτηρίζεται από την παρουσία σοβαρής παγκυτταροπενίας, εξαιτίας της σοβαρής υποπλασίας όλων των κυτταρικών σειρών του μυελού των οστών (MO) (Mylonakis et al. 2004). Σημειώνεται, πως παγκυτταροπενία παρατηρείται σε ποσοστό περίπου 10-15% και στα περιστατικά της οξείας ΜΕΣ, η οποία, ωστόσο, χαρακτηρίζεται από φυσιολογική [27]

28 κυτταρικότητα στο MO και ανταποκρίνεται σχετικά εύκολα στη θεραπεία (Mylonakis 2001). Η υπερσφαιριναιμία, η υπολευκωματιναιμία και η αύξηση της δραστηριότητας της αλκαλικής φωσφατάσης (ALP) και της αλανινοαμινοτρανσφεράσης (ALT), αποτελούν τις συχνότερες βιοχημικές διαταραχές του αίματος (Codner and Farris- Smith 1986, Harrus et al. 1996a, Harrus et al. 1997b, Waner et al. 1997, Frank and Breitschwerdt 1999, Mylonakis et al. 2010b, Mylonakis et al. 2011b). Η υπερσφαιριναιμία είναι πολυκλωνική και σπανιότερα ολιγοκλωνική ή μονοκλωνική (Harrus et al. 1998a, Frank and Breitschwerdt 1999, Heeb et al. 2003). Η αύξηση της δραστηριότητας των ηπατικών ενζύμων στη ΜΕΣ αποδίδεται σε πρωτογενή (άμεση ηπατοπαθογόνο δράση της E. canis) ή σε δευτερογενή ηπατική νόσο (π.χ. ηπατοκυτταρική βλάβη λόγω υποξίας, αιμορραγίας ή σηψαιμίας στη μυελοκατασταλτική ΜΕΣ) (Hildebrandt et al. 1973, de Castro et al. 2004, Mylonakis et al. 2010b). Τέλος, η παρουσία πρωτεϊνουρίας, λόγω σπειραματονεφρίτιδας από ανοσοσύμπλοκα έχει αναφερθεί σε ένα ποσοστό σκύλων με ΜΕΣ (Troy et al. 1980, Waddle and Littman 1988, Harrus et al. 1997c, Frank and Breitschwerdt 1999, Mylonakis et al. 2004). Στη ΜΕΣ διαπιστώνονται σημαντικές μεταβολές των πρωτεϊνών της οξείας φάσης. Έτσι, σε πειραματικά και φυσικά μολυσμένους σκύλους, που βρίσκονται τόσο στην οξεία όσο και στη χρόνια, όχι όμως στην υποκλινική ΜΕΣ, οι συγκεντρώσεις της C-αντιδρώσας πρωτεΐνης, της απτοσφαιρίνης, του Α-αμυλοειδούς και της α1- όξινης γλυκοπρωτεΐνης αυξάνονται (θετικές πρωτεΐ νες της οξείας φάσης), ενώ της λευκωματίνης μειώνεται (αρνητική πρωτεΐ νη της οξείας φάσης) (Rikihisa et al. 1994, Shimada et al. 2002, Mylonakis et al. 2011b, Rudoler et al. 2015, Karnezi et al. 2016). Σε μία μελέτη φυσικών περιστατικών ΜΕΣ, ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της C-αντιδρώσας πρωτεΐνης, της απτοσφαιρίνης και του Α- αμυλοειδούς κατά την προσκόμιση των ασθενών σκύλων, ήταν χρήσιμη στη σταδιοποίηση της νόσου (οξεία ή χρόνια), δεν είχε όμως προγνωστική χρησιμότητα για την τελική κλινική έκβαση (επιβίωση ή θάνατος του ζώου) (Mylonakis et al. 2011b). [28]

29 2.5 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗΣ ΤΗΣ ΕΝΕΡΓΟΥ ΜΟΛΥΝΣΗΣ ΑΠΟ ΤΗΝ E. CANIS Σε αυτές συμπεριλαμβάνονται η κυτταρολογική εξέταση, η PCR και η καλλιέργεια του μικροοργανισμού. Κυτταρολογική εξέταση Με την κυτταρολογική εξέταση ανιχνεύονται τα μορίδια της E. canis στο κυτταρόπλασμα των μονοκυττάρων και των λεμφοκυττάρων του αίματος ή των μακροφάγων και των λεμφοκυττάρων άλλων προσβεβλημένων ιστών, όπως ο σπλήνας, το ήπαρ, ο MO, τα λεμφογάγγλια, ο πνεύμονας και το εγκεφαλονωτιαίο υγρό (Meinkoth et al. 1998, Mylonakis et al. 2003, Mylonakis et al. 2010b, Faria et al. 2011, Harrus and Waner 2011, Mylonakis et al. 2011a, Harrus et al. 2012, Allison and Little 2013, Sainz et al. 2015). Σε μία μελέτη κατά την οποία συγκρίθηκε η διαγνωστική ευαισθησία της κυτταρολογικής εξέτασης επιχρισμάτων του περιφερικού αίματος, της στοιβάδας των λευκών αιμοσφαιρίων-αιμοπεταλίων (buffy coat, BC), του οπού λεμφογαγγλίου και του υλικού παρακέντησης του ΜΟ σε σκύλους με φυσική οξεία ΜΕΣ, διαπιστώθηκε ότι η εξέταση 1000 οπτικών πεδίων (μεγέθυνση 1000x), σε επιχρίσματα από το BC, 500 οπτικών πεδίων σε επιχρίσματα οπού λεμφογαγγλίου ή ο συνδυασμός τους είχαν διαγνωστική ευαισθησία της τάξης του 66%, 61% και 74%, αντίστοιχα (Mylonakis et al. 2003). Σε μια άλλη μελέτη, η διαγνωστική ευαισθησία της κυτταρολογικής εξέτασης του σπλήνα σε σκύλους φυσικά μολυσμένους με την E. canis ήταν 49% (Faria et al. 2010). Στα πλεονεκτήματα της κυτταρολογικής εξέτασης είναι το χαμηλό κόστος, η δυνατότητα επιβεβαίωσης συνυπαρχόντων μολύνσεων (π.χ. Babesia spp., Leishmania infantum, Hepatozoon canis), το γεγονός πως η ανεύρεση των μοριδίων των Ehrlichia spp. σε ενδημικά προσβεβλημένες περιοχές (στις οποίες δεν υπάρχουν άλλα μονοκυτταροτρόπα είδη) είναι επιβεβαιωτική της ενεργού μόλυνσης και τέλος, το ότι στην οξεία ΜΕΣ είναι δυνατόν το αποτέλεσμα της κυτταρολογικής εξέτασης να είναι θετικό πριν από την εμφάνιση οροθετικότητας έναντι της E. canis (Mylonakis et al. 2010a). Στα μειονεκτήματα της μεθόδου περιλαμβάνονται η ιδιαίτερα χαμηλή ευαισθησία της στην υποκλινική και τη χρόνια φάση της νόσου, ο χρονοβόρος χαρακτήρας της (50-60 λεπτά για τον έλεγχο 1000 οπτικών πεδίων), η αδυναμία [29]

30 διαφοροποίησης των μονοκυτταροτρόπων ειδών (π.χ. E. canis και E. chaffeensis) και η στενή συνάρτηση του αποτελέσματος με την εμπειρία του εξεταστή για τη διάκριση των μοριδίων έναντι άλλων ενδοκυτταρικών εγκλείστων, όπως τα φαγοκυτταρωμένα αιμοπετάλια, το πυρηνικό υλικό ή τα κυτταροπλασματικά αζουρόφιλα κοκκία των λεμφοκυττάρων (Woody and Hoskins 1991, Breitschwerdt et al. 1998b, Mylonakis et al. 2003, Mylonakis et al. 2004). Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης Η PCR αποτελεί σημαντική μέθοδο για την ανίχνευση του γενετικού υλικού της E. canis (McBride et al. 1996, Rikihisa 2000, Harrus and Waner 2011, Sainz et al. 2015). Η υψηλή διαγνωστική ευαισθησία και ειδικότητα της μεθόδου επιτρέπουν την πρώιμη διάγνωση της νόσου, την εντόπιση των ζώων-φορέων, την επιβεβαίωση μικτών κροτωνογενών μολύνσεων και την εκτίμηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας (Iqbal and Rikihisa 1994, Wen et al. 1997, Breitschwerdt et al. 1998b, a, Kordick et al. 1999). Ωστόσο, η διαγνωστική ευαισθησία της PCR στη χρόνια (μυελοκατασταλτική) ΜΕΣ φαίνεται να είναι χαμηλότερη σε σχέση με την οξεία ΜΕΣ (Harrus et al. 2004, Mylonakis et al. 2004). Το γενετικό υλικό του μικροοργανισμού μπορεί να ανιχνευτεί 4-10 ημέρες μετά τον πειραματικό ενοφθαλμισμό, χρονικό διάστημα που προηγείται της εμφάνισης ανιχνεύσιμου τίτλου αντισωμάτων στο μολυσμένο σκύλο (Iqbal et al. 1994, Mylonakis et al. 2009). Ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα μπορούν να προκύψουν εξαιτίας της τεχνικής δυσκολίας στην εκχύλιση του DNA, τεχνικών σφαλμάτων ή ακαταλληλότητας του δείγματος. Αντίθετα, η αναπαραγωγή μη ειδικών τμημάτων του DNA και η επιμόλυνση του δείγματος συνιστούν σημαντικές αιτίες ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων (Iqbal et al. 1994, Harrus et al. 2012). Τα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί αρκετές τεχνικές PCR, οι οποίες στοχεύουν σε διαφορετικά γονίδια του DNA της E. canis, όπως τα γονίδια που κωδικοποιούν το 16S rrna (16S rdna) ή σημαντικές πρωτεΐνες (p28, p30, dsb, VirB9 γονίδια). Οι PCR που στοχεύουν στο 16S rdna και το p30 έχουν χρησιμοποιηθεί περισσότερο (Harrus and Waner 2011). Σε προηγούμενη μελέτη, η PCR που βασίζεται στην ανίχνευση του γονιδίου p30 φαίνεται να έχει σημαντικά μεγαλύτερη διαγνωστική ευαισθησία (περίπου 100 φορές) σε σχέση με τη διπλή (nested) PCR που ανιχνεύει το 16S rdna. Η αυξημένη ευαισθησία της μεθόδου [30]

31 αποδίδεται στο γεγονός ότι στο γενετικό υλικό της E. canis περιέχονται πολυάριθμα αντίγραφα του γονιδίου p30 σε σύγκριση με το γονίδιο 16S rrna (Stich et al. 2002). Αυξημένη ευαισθησία σε σχέση με τις συμβατικές τεχνικές της PCR φαίνεται να έχει η PCR πραγματικού χρόνου (real time PCR, RT-PCR). Πλεονεκτήματα της τελευταίας μεθόδου αποτελούν η δυνατότητα ποσοτικού προσδιορισμού του μικροβιακού φορτίου, η μικρότερη πιθανότητα επιμολύνσεων καθώς και η δυνατότητα εντοπισμού τους εφόσον αυτές συμβούν με την ανάλυση της καμπύλης τήξης (Baneth et al. 2009). Η PCR συνήθως εφαρμόζεται στο ολικό αίμα καθώς και σε οποιονδήποτε από τους προσβεβλημένους ιστούς. Δεν υπάρχουν σήμερα πολλά δεδομένα σχετικά με τη συγκριτική ευαισθησία των ιστών που εξετάζονται με την PCR για τη διάγνωση της ΜΕΣ και την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας (εκρίζωση της μόλυνσης). Με βάση δύο προηγούμενες μελέτες, τα δείγματα σπλήνα ίσως είναι καταλληλότερα σε σχέση με το μυελό των οστών και το ολικό αίμα για την επιβεβαίωση της υποκλινικής μόλυνσης (Harrus et al. 1998c) και την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας (Harrus et al. 1998c, Harrus et al. 2004). Ωστόσο, σε άλλες μελέτες, η ευαισθησία του σπλήνα υπολειπόταν αυτής άλλων ιστών (Iqbal and Rikihisa 1994, Gal et al. 2008). Σε περίπτωση που δεν υπάρχει διαθέσιμο ολικό αίμα ή άλλο κατάλληλο υλικό για την εφαρμογή της PCR, η τελευταία είναι δυνατό να πραγματοποιηθεί σε ορό αίματος. Σε μια προηγούμενη μελέτη σε σκύλους με φυσική οξεία ΜΕΣ, η διαγνωστική ευαισθησία της PCR σε δείγματα ορού αίματος ήταν 63% (Mylonakis et al. 2009). Καλλιέργεια και απομόνωση της E. canis Ως υποχρεωτικά ενδοκυτταρικός μικροοργανισμός η E. canis καλλιεργείται προς απομόνωση σε αρκετές κυτταρικές σειρές (π.χ. μακροφάγων ποντικού, ενδοθηλιακών κυττάρων ανθρώπου), συνηθέστερα όμως χρησιμοποιείται η συνεχής κυτταρική σειρά μακροφάγων του σκύλου DH82. Η καλλιέργεια της E. canis στη συγκεκριμένη κυτταρική σειρά έχει συμβάλλει σημαντικά στην έρευνα για τη ΜΕΣ και ιδιαίτερα στην παραγωγή αντιγόνου για την ανάπτυξη των ορολογικών μεθόδων (Lovering et al. 1980). Αν και η απομόνωση της E. canis σε κυτταροκαλλιέργεια επιβεβαιώνει την ενεργή μόλυνση, η απαίτηση εξειδικευμένου εργαστηρίου, η τεχνική πολυπλοκότητα της μεθόδου, ο απαιτούμενος χρόνος που μπορεί να φτάσει [31]

32 τις 10 εβδομάδες για την ανάπτυξη του μικροοργανισμού in vitro και την εκτίμηση του αποτελέσματος και η αδυναμία της κυτταροκαλλιέργειας να διαφοροποιήσει τα μονοκυτταροτρόπα Ehrlichia spp. χωρίς τη χρήση ειδικών ανοσο-ορών, αποκλείουν την κλινική χρήση της μεθόδου και την καθιστούν κατά κύριο λόγο ένα ερευνητικό εργαλείο (Iqbal and Rikihisa 1994, Gaunt et al. 1996, McBride et al. 1996, Harrus and Waner 2011) ΜΕΘΟΔΟΙ ΔΙΑΠΙΣΤΩΣΗΣ ΤΗΣ ΕΚΘΕΣΗΣ ΣΤΗΝ E. CANIS Οι ορολογικές εξετάσεις αποτελούν τη συχνότερη μέθοδο διάγνωσης της έκθεσης στην E. canis στην κλινική πράξη. Ο έμμεσος ανοσοφθορισμός (IFA) και οι πραγματοποιήσιμες στο χώρο του κτηνιατρείου φορητές ορολογικές δοκιμές (ανοσοενζυμικές [ELISA] ή ανοσοχρωματογραφικές), είναι οι περισσότερο διαδεδομένες ορολογικές μέθοδοι (Harrus and Waner 2011, Mylonakis et al. 2012). Η IFA αποτελεί την ορολογική εξέταση αναφοράς για την ανίχνευση και τιτλοποίηση (ποσοτικός προσδιορισμός) των IgG αντισωμάτων έναντι της Ε. canis. Ωστόσο, οι εμπορικές μέθοδοι έχουν κατά βάση ποιοτικό (θετικό ή αρνητικό αποτέλεσμα) ή ημιποσοτικό χαρακτήρα. Ανιχνεύσιμος τίτλος των ανοσοσφαιρινών IgG εμφανίζεται συνήθως 7-35 ημέρες μετά τη μόλυνση και αυξάνεται προοδευτικά μέχρι την 80 η ημέρα (Ristic et al. 1972, Weisiger et al. 1975). Ο τίτλος IgG αυξάνεται νωρίτερα (7-15 ημέρες) μετά τον ενδοφλέβιο, σε σύγκριση με τον υποδόριο ή ενδοδερμικό ενοφθαλμισμό (15-35 ημέρες) (Gaunt et al. 1996, McBride et al. 2003). Το γεγονός ότι στις φυσικές μολύνσεις όλες οι παραπάνω οδοί ενοφθαλμισμού είναι πιθανές, εξηγεί εν μέρει τη διακύμανση του χρόνου εμφάνισης ανιχνεύσιμου τίτλου αντισωμάτων στην κλινική πράξη (Mylonakis et al. 2012). Σημειώνεται πως η παραγωγή και η κινητική του τίτλου των ανοσοσφαιρινών IgM δεν είναι προβλέψιμη και για το λόγο αυτό η μέτρηση του τίτλου των IgM έχει περιορισμένη χρησιμότητα στη διάγνωση της ΜΕΣ (McBride et al. 2003). Το θετικό ορολογικό αποτέλεσμα συνήθως δηλώνει τη μόλυνση του σκύλου από την E. canis κατά το πρόσφατο ή το απώτερο παρελθόν (Harrus and Waner 2011) και δεν υποδηλώνει απαραίτητα ενεργό μόλυνση, ενώ δεν συσχετίζεται με την κλινική φάση της ΜΕΣ ή τη σοβαρότητα της κλινικής εικόνας (Waner et al. 2001, Neer et al. 2002, Hegarty et al. 2009). Σε σκύλους με υποψία ΜΕΣ η αύξηση του τίτλου των IgG (IFA) κατά 4 φορές σε εξέταση ζεύγους ορών σε μεσοδιάστημα 2-3 εβδομάδων, αποτελεί ισχυρή ένδειξη οξείας ΜΕΣ (Bartsch and Greene 1996). Η διαγνωστική ευαισθησία της ορολογικής [32]

33 εξέτασης στην οξεία ΜΕΣ είναι σχετικά χαμηλή, αφού είναι δυνατόν οι κλινικές και αιματολογικές διαταραχές να προηγηθούν της εμφάνισης ανιχνεύσιμου τίτλου αντισωμάτων (Waner et al. 2001, Gaunt et al. 2010, Mylonakis et al. 2010c). Το πρόβλημα στην τελευταία περίπτωση είναι εντονότερο με τις φορητές ορολογικές δοκιμές, η διαγνωστική ευαισθησία των οποίων μειώνεται σε τίτλους <1/320 (O'Connor et al. 2006, Harrus and Waner 2011). Επιπλέον, η κινητική του τίτλου των αντισωμάτων μετά τη θεραπευτική εκρίζωση της μόλυνσης είναι μάλλον απρόβλεπτη και σημαντική μείωση μπορεί να παρατηρηθεί μόνο μετά την παρέλευση μηνών ή ετών, γεγονός που μειώνει τη χρησιμότητα των ορολογικών εξετάσεων για τη μεταθεραπευτική παρακολούθηση των ζώων (Bartsch and Greene 1996, Lappin 2000). Επιπρόσθετα, συχνά παρατηρούνται διασταυρούμενες αντιδράσεις της E. canis με άλλα Ehrlichia spp. (π.χ. E. chaffeensis και E. ewingii) και λιγότερο συχνά άλλων συγγενών ειδών (π.χ. Anaplasma phagocytophilum), γεγονός που επηρεάζει αρνητικά τη διαγνωστική ειδικότητα των ορολογικών μεθόδων που παράγουν ποιοτικά ή ποσοτικά αποτελέσματα (Perille and Matus 1991, Rikihisa 1991, Waner et al. 1998, Waner et al. 2001). Για τους παραπάνω λόγους, η ερμηνεία των αποτελεσμάτων των ορολογικών δοκιμών θα πρέπει να γίνεται συνεκτιμώντας τόσο την κλινική και αιματολογική εικόνα του ζώου, όσο και τα αποτελέσματα άλλων διαγνωστικών εξετάσεων, όπως η PCR και η ανοσοαποτύπωση κατά Western (Western Immunoblotting), όταν αυτό είναι εφικτό (Hegarty et al. 2009). Με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης κατά Western ανιχνεύονται αντισώματα έναντι αντιγόνων διαφόρου μοριακού βάρους της E. canis (Nyindo et al. 1991, Brouqui et al. 1992, Rikihisa et al. 1994, Hegarty et al. 1997, Suksawat et al. 2000). Η κύρια χρησιμότητα της μεθόδου έγκειται στη διαφοροποίηση μεταξύ των Ehrlichia spp. και στην επιβεβαίωση της ειδικότητας του ορολογικού αποτελέσματος σε υποψία ψευδώς θετικού αποτελέσματος (Mylonakis et al. 2004). Με την ίδια μέθοδο επιχειρήθηκε να διαπιστωθεί η αντιγονική ετερογένεια μεταξύ των στελεχών της E. canis που προέρχονταν από διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές, στην προσπάθεια να εξηγηθούν εν μέρει οι διαφορές ως προς το είδος και τη βαρύτητα των παρατηρούμενων συμπτωμάτων (Hegarty et al. 1997). Μειονεκτήματα της μεθόδου αποτελούν η ανάγκη ειδικού εργαστηρίου για την πραγματοποίηση της εξέτασης και η αδυναμία χρησιμοποίησής της για τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας της θεραπείας (Breitschwerdt et al. 1998b). [33]

34 2.6 ΕΙΔΙΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΗΣ ΜΕΣ Οι τετρακυκλίνες αποτελούν εδώ και δεκαετίες τα φάρμακα εκλογής για τη θεραπεία της ΜΕΣ (Neer et al. 2002). Ωστόσο, από τις τετρακυκλίνες, μόνο η δοξυκυκλίνη έχει μελετηθεί συστηματικά για την αποτελεσματικότητά της in vitro, καθώς και σε φυσικές και πειραματικές μολύνσεις. Τα αποτελέσματα των in vitro μελετών στηρίζουν την αποτελεσματικότητα της δοξυκυκλίνης έναντι των Ehrlichia spp. (E. canis, E. chaffeensis) και Neorickettsia spp. (Ν. risticii, N. sennetsu, πρώην E. risticii και E. sennetsu) (Rikihisa and Jiang 1988, Brouqui and Raoult 1990, 1992, Klein et al. 1997, Branger et al. 2004). Ωστόσο, τα αποτελέσματα αρκετών μελετών υποδηλώνουν ότι η χορήγηση δοξυκυκλίνης τόσο στην οξεία όσο και στην υποκλινική ΜΕΣ, αν και επιφέρει σημαντική κλινική και αιματολογική βελτίωση, δεν επιτυγχάνει την εκρίζωση της μόλυνσης σε ένα σημαντικό ποσοστό μολυσμένων σκύλων. Στην πειραματική οξεία ΜΕΣ, η χορήγηση δοξυκυκλίνης στη δόση των 5 mg/kg από το στόμα (po), κάθε 12 ώρες (BID) για 14 ημέρες (Breitschwerdt et al. 1998a) ή 10 mg/kg, po, κάθε 24 ώρες (SID) για 16 ημέρες (Harrus et al. 2004) είχε σαν αποτέλεσμα την εκρίζωση της μόλυνσης σε ποσοστό 100%, με βάση τα αποτελέσματα της PCR στο αίμα και στον σπλήνα (Harrus et al. 2004), ή της PCR στο αίμα, την καλλιέργεια αίματος για την απομόνωση της E. canis, και τον ενοφθαλμισμό μη μολυσμένων σκύλων-μαρτύρων με αίμα των αρχικά μολυσμένων σκύλων που είχαν ολοκληρώσει την θεραπευτική αγωγή με δοξυκυκλίνη (Breitschwerdt et al. 1998a). Ωστόσο, σε μια πρόσφατη πειραματική μελέτη, διαπιστώθηκε πως αν και η χορήγηση δοξυκυκλίνης (10 mg/kg, po, SID, για 4 εβδομάδες) οδήγησε μετά το τέλος της θεραπείας σε κλινική και αιματολογική ίαση και σε μη ανίχνευση του DNA με την εφαρμογή της PCR στο αίμα, με την εφαρμογή της μεθόδου της ξενοδιάγνωσης (τοποθέτηση κροτώνων R. sanguineus στους σκύλους μετά την ολοκλήρωση της φαρμακευτικής αγωγής) σε συνδυασμό με τον ενοφθαλμισμό μη μολυσμένων σκύλων-μαρτύρων, σημαντικό ποσοστό των αρνητικών στην PCR σκύλων ήταν σε θέση να μολύνουν τόσο τους κρότωνες όσο και τους σκύλους-μάρτυρες, ανεξάρτητα από την κλινική φάση της μόλυνσης (οξεία, υποκλινική ή χρόνια) (McClure et al. 2010). Επίσης, η χορήγηση δοξυκυκλίνης (10 mg/kg, po, SID, για 20 ημέρες) σε σκύλους με πειραματική οξεία ΜΕΣ απέτυχε να εκριζώσει τη μόλυνση στην πλειοψηφία των σκύλων (Fourie et al. 2015). Στην πειραματική υποκλινική ΜΕΣ, η χορήγηση δοξυκυκλίνης στη δόση των 10 mg/kg, [34]

35 po, SID για 7 ημέρες (Iqbal and Rikihisa 1994), 2 εβδομάδες (Schaefer et al. 2007), 4 εβδομάδες (McClure et al. 2010) ή 6 εβδομάδες (Harrus et al. 1998b) απέτυχε να εκριζώσει τη μόλυνση σε ποσοστό %, με βάση τα αποτελέσματα της PCR, της καλλιέργειας ή/και της ξενοδιάγνωσης μετά το τέλος της θεραπείας. Αντίθετα, σε άλλες πειραματικές μελέτες με υποκλινική ΜΕΣ, η χορήγηση δοξυκυκλίνης στη δόση των 5 mg/kg, po, BID για 3-4 εβδομάδες (Eddlestone et al. 2007) ή 10 mg/kg, po, SID για 4 εβδομάδες (Schaefer et al. 2008, Gaunt et al. 2010) εκρίζωσε τη μόλυνση στο σύνολο των ζώων. Πιθανοί παράγοντες που θα μπορούσαν να σχετίζονται με τα αντικρουόμενα αποτελέσματα των πειραματικών μελετών ως προς την αποτελεσματικότητα της δοξυκυκλίνης στην εκρίζωση της οξείας ή υποκλινικής ΜΕΣ, είναι 1) η επιλογή διαφορετικών θεραπευτικών πρωτοκόλλων, 2) η εφαρμογή διαφορετικών μεθόδων για την μεταθεραπευτική παρακολούθηση των σκύλων (nested PCR, p30 PCR, ξενοδιάγνωση, απομόνωση της E. canis) και 3) οι διαφορετικές χρονικές στιγμές αλλά και οι διαφορετικοί ιστοί που ελέγχθηκαν με PCR μετά την ολοκλήρωση της θεραπευτικής αγωγής. Εξάλλου, σε μελέτες με φυσικά μολυσμένους σκύλους, η θεραπεία με δοξυκυκλίνη (αδιευκρίνιστο δοσολογικό σχήμα και κλινική φάση κατά την έναρξη της αγωγής) για χρονικό διάστημα έως και 24 συνεχείς μήνες δεν εκρίζωσε τη μόλυνση σε 43/86 (50%) σκύλους, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της PCR στο αίμα μετά το τέλος της θεραπείας (Wen et al. 1997). Επιπλέον, σε μία μελέτη 12 σκύλων με φυσική ΜΕΣ, έγινε σύγκριση της αποτελεσματικότητας της χορήγησης δοξυκυκλίνης ως μονοθεραπείας στη δόση των 10 mg/kg, po, BID για 2 εβδομάδες με τη χορήγηση του συνδυασμού δοξυκυκλίνης στην ίδια δόση και χλωροκίνης, ενός φαρμάκου που έχει χρησιμοποιηθεί κατά της ελονοσίας του ανθρώπου, στη δόση των 2,5 mg/kg, po, BID για το ίδιο χρονικό διάστημα. Και οι δύο ομάδες εμφάνισαν σημαντική κλινική και αιματολογική βελτίωση, χωρίς ωστόσο να εκτιμηθεί η εκρίζωση της μόλυνσης λόγω της μη πραγματοποίησης PCR μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας (Aysul et al. 2012). Επιπλέον, η χρήση της δοξυκυκλίνης συνοδεύεται σχετικά συχνά από παρενέργειες όπως ανορεξία, ναυτία, έμετος, διάρροια και αυξημένη δραστηριότητα των ηπατικών ενζύμων, ενώ, η χορήγηση της δοξυκυκλίνης σε ζώα που βρίσκονται σε κυοφορία θα πρέπει να γίνεται με προσοχή λόγω της πιθανής πρόκλησης σκελετικών ανωμαλιών ή δυσχρωμίας των δοντιών στα έμβρυα, παρενέργειες που συνδέονται συχνότερα με τη χορήγηση των κλασσικών τετρακυκλινών (Plumb 2002b). Ιδιαίτερη, τέλος, σημασία παρουσιάζει η ευρεία μη ενδεδειγμένη χρήση της [35]

36 δοξυκυκλίνης στην κλινική πράξη (π.χ. σκύλοι στους οποίους η «διάγνωση» της ερλιχίωσης στερείται τεκμηρίωσης), γεγονός που αυξάνει τον κίνδυνο ανάπτυξης ανθεκτικών στη δοξυκυκλίνη στελεχών του μικροοργανισμού (Goodman 1999, Neer et al. 2002). Συνεπώς, κρίνεται σκόπιμη η συστηματική μελέτη φαρμάκων που θα μπορούσαν να αποτελέσουν εναλλακτικές της δοξυκυκλίνης θεραπευτικές επιλογές. Λίγες μόνο εναλλακτικές φαρμακευτικές ουσίες έχουν συστηματικά αξιολογηθεί για τη θεραπεία της ΜΕΣ. Η διπροπιονική ιμιδοκάρβη χρησιμοποιήθηκε για δεκαετίες στη θεραπεία της ΜΕΣ. Παρόλο που αρχικά θεωρήθηκε αποτελεσματική με βάση κλινικά κυρίως κριτήρια (Price and Dolan 1980, Matthewman et al. 1994, Sainz et al. 2000), νεότερα δεδομένα που βασίζονται στην εφαρμογή της PCR μετά τη θεραπεία απέδειξαν ότι η ουσία αυτή δεν επιτυγχάνει την εκρίζωση της οξείας φυσικής ή πειραματικής μόλυνσης από την E. canis (Van Heerden and Van Heerden 1981, Kleiter et al. 2001, Eddlestone et al. 2006). Ως εκ τούτου, η συνδυαστική χορήγηση της διπροπιονικής ιμιδοκάρβης με τη δοξυκυκλίνη ενδείκνυται μόνο σε μικτές μολύνσεις της E. canis με τη Babesia vogeli (Mylonakis 2012). Οι φθοριοκινολόνες, οι οποίες θεωρήθηκαν ελπιδοφόρες εναλλακτικές θεραπευτικές επιλογές (Kontos and Athanasiou 1998), αποδείχθηκαν αναποτελεσματικές έναντι του μικροοργανισμού αυτού σε in vitro και σε πειραματικές κλινικές μελέτες (Neer et al. 1999, Maurin et al. 2003, Branger et al. 2004). Η αντοχή της E. canis και της E. chaffeensis έναντι των φθοριοκινολονών φαίνεται να συνδέεται με την παρουσία σημειακών μεταλλάξεων στην QRDR περιοχή του gyra γονιδίου των συγκεκριμένων ειδών (Maurin et al. 2001). Τέλος, η χορήγηση αζιθρομυκίνης (7 mg/kg, po, SID, x 7 ημέρες) σε 4 σκύλους με οξεία πειραματική ΜΕΣ δεν οδήγησε σε κλινική ή αιματολογική ύφεση στα μολυσμένα ζώα (Rudoler et al. 2012). Η ριφαμπικίνη, αποτελεί ένα ημισυνθετικό παράγωγο της ριφαμυκίνης Β, το οποίο αναστέλλει τη Β υπομονάδα της DNA-εξαρτώμενης RNA πολυμεράσης (Boothe 2001). Αν και το αντιμικροβιακό φάσμα της ριφαμπικίνης περιλαμβάνει πρωτίστως θετικούς κατά Gram μικροοργανισμούς, σε in vitro μελέτες, υπήρξε ιδιαίτερα αποτελεσματική σε χαμηλές ελάχιστες ανασταλτικές συγκεντρώσεις (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) έναντι της E. canis (MIC: 0,03μg/ml) και της E. chaffeensis (MIC: 0,125μg/ml ή 0,03μg/ml) (Brouqui and Raoult 1992, Branger et al. 2004). Ο λιποφιλικός χαρακτήρας του φαρμάκου διευκολύνει την [36]

37 διείσδυσή του στα φαγοκύτταρα και την επίτευξη ενδοκυτταρικών συγκεντρώσεων πολλαπλάσιων αυτών του ορού του αίματος (Dowling 2006). Στον άνθρωπο, με βάση κυρίως την εμπειρία από μεμονωμένα κλινικά περιστατικά, η ριφαμπικίνη προτείνεται ως εναλλακτικό της δοξυκυκλίνης φάρμακο για την κοκκιοκυτταρική αναπλάσμωση (Anaplasma phagocytophilum) και τη μονοκυτταρική ερλιχίωση (E. chaffeensis), επιτυγχάνοντας ταχεία κλινική ίαση, αν και η αποτελεσματικότητά της στην εκρίζωση της μόλυνσης δεν έχει μελετηθεί (Krause et al. 2003, Branger et al. 2004, Dumler et al. 2007). Τα αντίστοιχα δεδομένα στο σκύλο είναι περιορισμένα. Σε μια πρόσφατη πειραματική μελέτη η ριφαμπικίνη, χορηγούμενη στη δόση των 15 mg/kg, po, BID για 7 ημέρες, υπήρξε εξίσου αποτελεσματική με τη δοξυκυκλίνη στην εκρίζωση της μόλυνσης από την E. canis στην υποκλινική φάση της ΜΕΣ (Schaefer et al. 2008). Η τελευταία αυτή μελέτη πραγματοποιήθηκε σε μικρό αριθμό σκύλων (n=2) και ο έλεγχος των ζώων μετά το τέλος της θεραπείας στηρίχθηκε μόνο στην εφαρμογή της PCR στο αίμα. Σε άλλη μελέτη το ίδιο δοσολογικό σχήμα που εφαρμόστηκε μετά από προηγούμενη θεραπευτική αποτυχία της δοξυκυκλίνης σε δύο πειραματικά μολυσμένους σκύλους με υποκλινική ΜΕΣ, εκρίζωσε τη μόλυνση στον ένα σκύλο και μείωσε σημαντικά το επίπεδο της ερλιχιαιμίας στον άλλο (McClure et al. 2010). Τέλος, σε μια πρόσφατη μελέτη επιχειρήθηκε η σύγκριση της αποτελεσματικότητας της δοξυκυκλίνης (10 mg/kg, po, SID για 4 εβδομάδες) και της ριφαμπικίνης (15 mg/kg, po, BID για 7 ημέρες) στην υποκλινική μορφή της ΜΕΣ. Στη μελέτη συμμετείχαν 10 σκύλοι με πιθανή φυσική μόλυνση. Αν και οι συγγραφείς κατέληξαν στο συμπέρασμα πως η δοξυκυκλίνη και η ριφαμπικίνη δε διέφεραν ως προς την αιματολογική και βιοχημική βελτίωση που επέφεραν στους σκύλους, στη μελέτη αυτή δεν κατέστη δυνατό να επιβεβαιωθεί η μόλυνση των σκύλων με την E. canis (π.χ. με την PCR) τόσο πριν όσο και μετά το πέρας των θεραπειών, με αποτέλεσμα να μην είναι δυνατή η εξαγωγή βάσιμων συμπερασμάτων σχετικά με την εκρίζωση της μόλυνσης (Akhtardanesh et al. 2011). Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχουν τεκμηριωμένα δεδομένα σχετικά με την αποτελεσματικότητα της ριφαμπικίνης στην οξεία ΜΕΣ, όπως και για τις πιθανές παρενέργειες από τη χορήγησή της στο σκύλο. Αν και το αντιμικροβιακό αυτό είναι γενικά καλά ανεκτό, ανέκδοτες και περιορισμένες βιβλιογραφικές αναφορές συνδέουν τη χρήση της ριφαμπικίνης στο σκύλο με την εμφάνιση μεταβολής της χροιάς των ούρων, των δακρύων ή του σάλιου, γαστρεντερικών διαταραχών, αύξησης της δραστηριότητας των ηπατικών ενζύμων, ίκτερου και ανοσολογικής αιμολυτικής αναιμίας ή θρομβοκυτταροπενίας [37]

38 (Plumb 2002a, Greene et al. 2006), χωρίς όμως να προσδιορίζεται η συχνότητα εμφάνισής τους ή το δοσολογικό σχήμα που οδήγησε στις παρενέργειες αυτές. Σε μία πρόσφατη αναδρομική μελέτη με 344 σκύλους στους οποίους χορηγήθηκε ριφαμπικίνη για την αντιμετώπιση δερματολογικών προβλημάτων, σε διάφορα δοσολογικά σχήματα και για διαφορετικά χρονικά διαστήματα, παρενέργειες παρατηρήθηκαν σε ποσοστό 16,3%, με κυριότερες την εμφάνιση εμέτου, ανορεξίας, λήθαργου και αυξημένης δραστηριότητας της ALT. Η εμφάνιση παρενεργειών συσχετίστηκε με τη διάρκεια της χορήγησης και όχι με τη χορηγούμενη δόση, ενώ σε μεγάλο βαθμό αποδόθηκε σε ιδιοσυγκρασιακούς παράγοντες ή σε συγχορηγούμενες φαρμακευτικές αγωγές (Frank 1990, Bajwa et al. 2013). Η ασφαλής θεραπευτική δόση για τη ριφαμπικίνη στο σκύλο δεν έχει προσδιοριστεί ακόμα, ωστόσο, σύμφωνα με τα τρέχοντα δεδομένα, η ημερήσια δόση δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τα 5-10 mg/kg (Frank 1990, Branger et al. 2004, Dowling 2006, Greene et al. 2006, Papich 2007). Συνοψίζοντας τα παραπάνω κλινικά και πειραματικά δεδομένα, μπορεί βάσιμα να υποστηριχτεί ότι 1) η δοξυκυκλίνη, που αποτελεί την κλασσική θεραπευτική επιλογή έναντι της μόλυνσης από την E. canis στο σκύλο, σε ένα ποικίλο αλλά σημαντικό ποσοστό μολυσμένων ζώων δεν είναι αποτελεσματική ως προς την εκρίζωση της, ανεξάρτητα της κλινικής φάσης της ΜΕΣ, γεγονός που δικαιολογεί την αναζήτηση και αξιολόγηση εναλλακτικών φαρμακευτικών επιλογών και 2) η ριφαμπικίνη, με βάση τα διαθέσιμα μέχρι σήμερα ενθαρρυντικά βιβλιογραφικά δεδομένα, τόσο στον άνθρωπο όσο και στο σκύλο, εμφανίζεται ως η φαρμακευτική ουσία που μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως εναλλακτική ή συμπληρωματική θεραπεία της δοξυκυκλίνης στη ΜΕΣ. Επομένως, η συστηματική αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας και της ασφάλειάς της στην ΜΕΣ, προβάλλει ως βάσιμο ερευνητικό ζητούμενο. [38]

39 ΜΕΡΟΣ ΥΤΕΡΟ Η ΔΙΚΗ ΜΑΣ ΕΡΕΥΝΑ Α) ΣΤΟΧΟΙ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Η διερεύνηση της αποτελεσματικότητας της ριφαμπικίνης στην επίτευξη κλινικής και αιματολογικής βελτίωσης και στην εκρίζωση της οξείας πειραματικής μόλυνσης από την E. canis. Η διερεύνηση των πιθανών κλινικών παρενεργειών και των αιματολογικών και βιοχημικών διαταραχών που σχετίζονται με τη χορήγηση της ριφαμπικίνης στη δόση και τη διάρκεια της θεραπευτικής αγωγής που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη. Η σύγκριση της διαγνωστικής ευαισθησίας της PCR εφαρμοσμένης σε τρείς διαφορετικούς ιστούς (αίμα, ΜΟ και σπλήνας) για την ανίχνευση του DNA της E. canis στην οξεία μονοκυτταρική ερλιχίωση. Β) ΟΡΙΣΜΟΙ Στην παρούσα μελέτη έχουν υιοθετηθεί οι παρακάτω ορισμοί: Οξεία φάση της μόλυνσης από την E. canis: ο συνδυασμός της εμφάνισης θρομβοκυτταροπενίας, θετικού τίτλου αντισωμάτων IgG έναντι της E. canis και της ανίχνευσης του DNA της E. canis σε τουλάχιστον έναν από τους εξεταζόμενους ιστούς (αίμα, ΜΟ, σπλήνας), με ή χωρίς την ταυτόχρονη εκδήλωση κλινικών συμπτωμάτων. Εκρίζωση της μόλυνσης από την E. canis: Η μη ανίχνευση του DNA της E. canis με δύο διαφορετικές μεθόδους PCR και στους τρεις εξεταζόμενους ιστούς. [39]

40 Γ) ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 1. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΣ ΠΛΗΘΥΣΜΟΣ, ΤΟΠΟΣ ΚΑΙ ΧΡΟΝΟΣ ΔΙΕΞΑΓΩΓΗΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΚΑΙ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗ ΤΩΝ ΣΚΥΛΩΝ ΜΕΤΑ ΤΗΝ ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ Στη μελέτη περιλήφθηκαν 16 σκύλοι φυλής Beagle, 7 αρσενικοί και 9 θηλυκοί, ηλικίας 5-70 μηνών (διάμεση τιμή: 11 μήνες). Οι σκύλοι αγοράστηκαν από ειδικά αδειοδοτημένη εκτροφή πειραματικών σκύλων της φυλής Beagle, του Τμήματος Κτηνιατρικής, του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας. Η πειραματική φάση της παρούσας μελέτης έλαβε χώρα στον αδειοδοτημένο για τη διεξαγωγή πειραματικών μελετών χώρο της Κ.Ζ.Σ., του Τμήματος Κτηνιατρικής, του Α.Π.Θ. (Κ.Ζ.Σ.-Α.Π.Θ.), από τον Φεβρουάριο μέχρι το Δεκέμβριο του Πριν την έναρξη της μελέτης, όλοι οι σκύλοι είχαν εμβολιαστεί πλήρως έναντι του παρβοϊού-2, του αδενοϊού-2, του ιού της νόσου του Carré, της λεπτοσπείρωσης (Leptospira icterohaemorrhagiae/leptospira canicola) και της λύσσας, ενώ πριν αλλά και σε όλη τη διάρκεια της μελέτης οι σκύλοι λάμβαναν τακτική ενδοπαρασιτοκτόνο (κάθε 2 μήνες) και εξωπαρασιτοκτόνο (κάθε μήνα) αγωγή. Επίσης, πριν την έναρξη της μελέτης προηγήθηκε περίοδος εγκλιματισμού των ζώων, διάρκειας τουλάχιστον ενός μήνα (ανάλογα με την ημερομηνία άφιξης των σκύλων στην Κ.Ζ.Σ.-Α.Π.Θ.). Κατά την περίοδο εγκλιματισμού και σε όλη τη διάρκεια της μελέτης, οι σκύλοι διέμεναν σε ατομικούς κλιματιζόμενους κλωβούς, διατρέφονταν με εμπορική ξηρή τροφή και είχαν κατά βούληση πρόσβαση σε νερό. Η διεξαγωγή της μελέτης έγινε σύμφωνα με την Ευρωπαϊκή οδηγία 86/609/EEC και την Ελληνική νομοθεσία, ενώ εγκρίθηκε από τη Γενική Συνέλευση του Τμήματος Κτηνιατρικής (συνεδρίαση 458/ ) και από τη Διεύθυνση Κτηνιατρικής Θεσσαλονίκης (αριθμός έγκρισης 13/3152, ). Κατά τη διάρκεια της μελέτης δεν πέθανε και δεν υποβλήθηκε σε ευθανασία κανένας σκύλος. Μετά την ολοκλήρωσή της μελέτης, όλοι οι σκύλοι δόθηκαν για υιοθεσία σε φιλόζωους, μετά από την ενημέρωσή τους για την προηγούμενη χρήση των σκύλων και την έγγραφη συγκατάθεσή τους για την αποδοχή της υιοθεσίας (τα ενυπόγραφα δελτία υιοθεσίας βρίσκονται στο αρχείο της Κ.Ζ.Σ.-Α.Π.Θ.). 2. ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΕΝΤΑΞΗΣ ΤΩΝ ΣΚΥΛΩΝ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ Πριν από την έναρξη της πειραματικής μελέτης, οι σκύλοι πληρούσαν τις παρακάτω προϋποθέσεις: [40]

41 Ήταν κλινικά υγιείς. Ήταν πλήρως εμβολιασμένοι και σε τακτικό αντιπαρασιτικό πρόγραμμα σε όλη τη διάρκεια της μελέτης (παράγραφος Γ1). Δεν παρουσίαζαν αιματολογικές ή βιοχημικές διαταραχές. Ήταν οροαρνητικοί έναντι της E. canis κατά την εξέταση ζεύγους ορών, 14 ημέρες πριν και την ημέρα του ενοφθαλμισμού τους με την E. canis. Ήταν αρνητικοί ως προς την ανίχνευση του DNA της E. canis κατά την εξέταση με την PCR δειγμάτων αίματος και υλικού παρακέντησης από το σπλήνα και το ΜΟ. Ήταν οροαρνητικοί ως προς τη Dirofilaria immitis, τη Leishmania infantum και τη Babesia canis. Επίσης, η κυτταρολογική εξέταση επιχρισμάτων από τη στοιβάδα του BC ήταν αρνητική για το Hepatozoon canis. Δεν είχαν λάβει φαρμακευτικές ουσίες, πέραν αυτών για την αντιπαρασιτική αγωγή ρουτίνας, κατά τους τελευταίους τουλάχιστον 2 μήνες πριν την έναρξη της μελέτης. 3. ΟΜΑΔΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΣΚΥΛΩΝ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Οι σκύλοι ομαδοποιήθηκαν με τη χρήση πίνακα με τυχαίους αριθμούς σε 3 ομάδες: Ομάδα Α: 5 σκύλοι (# 3, 5, 7, 8 και 11), οι οποίοι ενοφθαλμίστηκαν με την E. canis και στους οποίους χορηγήθηκε ριφαμπικίνη κατά την οξεία φάση της μόλυνσης. Ομάδα Β: 9 σκύλοι (# 1, 2, 6, 9, 12, 13, 14, 15, 16), οι οποίοι ενοφθαλμίστηκαν με την E. canis και στους οποίους δε χορηγήθηκε θεραπεία (μολυσμένοι μάρτυρες). Ομάδα Γ: 2 σκύλοι (#4 και 10), οι οποίοι δε μολύνθηκαν (μη μολυσμένοι μάρτυρες). 4. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΟΛΥΝΣΗ ΤΩΝ ΣΚΥΛΩΝ ΜΕ ΤΗΝ E. CANIS Για τον ενοφθαλμισμό των σκύλων χρησιμοποιήθηκε το Ισραηλινό στέλεχος "611" της E. canis (Gen Bank accession number U26740), το οποίο καλλιεργήθηκε και διατηρήθηκε σε κυτταροκαλλιέργεια DH82 (Keysary et al. 1996). Το στέλεχος αυτό παραχωρήθηκε ευγενώς από τον Καθηγητή Dr. Shimon Harrus (The Koret School of Veterinary Medicine, The Hebrew University of Jerusalem, Israel) και [41]

42 αποστάλθηκε στην Κ.Ζ.Σ.-Α.Π.Θ. σε φιάλη κυτταροκαλλιέργειας (κυτταρική σειρά DH82) με ειδικό υλικό συντήρησης. Για την επεξεργασία της κυτταροκαλλιέργειας, ώστε να προκύψει το τελικό ενοφθάλμισμα, χρησιμοποιήθηκε το ρυθμιστικό διάλυμα HSC (Hepes/Sucrose/Cation Buffer). Το διάλυμα αυτό αποτελούνταν από 10 mm Hepes, ph 7,35, 1mM MgCl 2 (0,101 g), 90 mm NaCl (2,63 g), 0,15 mm CaCl 2 (0,011 g), 0,2 M Sucrose (34,2 g) και δισαπεσταγμένο νερό μέχρι τελικού όγκου 500 ml και διηθείτο από ηθμό διαμέτρου πόρου 0,2 μm με σκοπό την αποστείρωσή του. Από τη φιάλη που περιείχε τη μολυσμένη με το "611" στέλεχος της E. canis κυτταροκαλλιέργεια, απορρίφθηκε το υλικό συντήρησης και προστέθηκαν 5 ml του διαλύματος HBS και αποστειρωμένα γυάλινα σφαιρίδια. Με ήπιες κινήσεις αποκολλήθηκαν τα κύτταρα και το εναιώρημα κυττάρων μεταφέρθηκε σε σωλήνα φυγοκέντρησης. Ο αριθμός των εμπύρηνων κυττάρων από το παραπάνω υγρό υπολογίστηκε στις /ml, μετά την εξέτασή του σε αιμοκυτταρόμετρο (Improved Neubauer, Marienfeld, Germany), με τη μέθοδο Unopette (Neubauer, Becton Dickinson, USA). Τα σφαιρίδια ξεπλύθηκαν με 5 ml HSC και η τελική ποσότητα του εναιωρήματος (περίπου 10 ml) υποβλήθηκε στην επίδραση υπερήχων (Heat Systems-Ultrasonics, INC, W185D) 100W για 2 περιόδους των 30sec η κάθε μία με διάλειμμα 10 sec μεταξύ τους. Κατά τη διάρκεια της επίδρασης υπερήχων το εναιώρημα διατηρούνταν μέσα σε δοχείο που περιβαλλόταν από πάγο. Το εναιώρημα των λυθέντων κυττάρων φυγοκεντρήθηκε σε 200g για 10 min στους 4 o C. Στη συνέχεια λήφθηκε το υπερκείμενο υγρό και φυγοκεντρήθηκε σε 13000g για 45 min σε θερμοκρασία 4 o C. Μετά από την απομάκρυνση του υπερκείμενου υγρού, προστέθηκαν στο ίζημα 2ml HSC και ακολούθησε ισχυρή ανάδευση σε ειδική συσκευή (vortex) για sec με τη βοήθεια γυάλινων σφαιριδίων, με σκοπό την επαναιώρηση των μοριδίων της E. canis. Το εναιώρημα αυτό χρησιμοποιήθηκε για τον αρχικό ενοφθαλμισμό ενός υγιούς Beagle (#1). Την 19 η ημέρα μετά τον ενοφθαλμισμό (ΗΜΕ), ο μολυσμένος σκύλος πληρούσε όλα τα κριτήρια της οξείας φάσης της μόλυνσης (βλέπε Β, "Ορισμοί"), με την εμφάνιση 1) συμβατών κλινικών συμπτωμάτων (λεμφογαγγλιομεγαλία και πετέχειες στο βλεννογόνο της στοματικής κοιλότητας), 2) θρομβοκυτταροπενίας (αριθμός αιμοπεταλίων /μl, τιμές αναφοράς /μl), 3) θετικού τίτλου αντισωμάτων έναντι της E. canis (τίτλος αντισωμάτων με IFA: 1/1600, τιμή αναφοράς 1/100), και 4) θετικής PCR στα δείγματα του ολικού αίματος και του σπλήνα. Επιπλέον, σε επιχρίσματα από BC διαπιστώθηκαν μορίδια τυπικά των Ehrlichia spp. στα μονοπύρηνα κύτταρα του [42]

43 αίματος. Από το σκύλο αυτό, συλλέχθηκε αίμα για τη μόλυνση των υπολοίπων 13 σκύλων της μελέτης. Κάθε ένα από τα 13 ζώα των ομάδων Α και Β ενοφθαλμίστηκε ενδοφλεβίως με 5ml ηπαρινισμένου (Heparin, Leo, Ελλάδα, 5U/ml) ολικού αίματος από το αρχικά μολυσμένο ζώο (#1). Με τη χρήση ειδικής για την E. canis ποσοτικής PCR, (real-time PCR) εκτιμήθηκε ότι κάθε σκύλος ενοφθαλμίστηκε περίπου με 12, αντίγραφα του 16S rdna. Ο αρχικά μολυσμένος σκύλος εντάχθηκε στον πληθυσμό της ομάδας Β. Οι 2 σκύλοι της ομάδας Γ, οι οποίοι αποτέλεσαν τους μη μολυσμένους μάρτυρες, ενοφθαλμίστηκαν με 5 ml ηπαρινισμένου ολικού αίματος από ένα υγιές Beagle (πριν να ενοφθαλμιστεί από τον σκύλο #1). Το 24ωρο που ακολούθησε τον ενοφθαλμισμό, όλοι οι σκύλοι βρίσκονταν υπό διαρκή κλινική παρακολούθηση, χωρίς να παρατηρηθεί οποιαδήποτε κλινική διαταραχή. 5. ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΟ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ Η θεραπεία των σκύλων της ομάδας Α περιελάμβανε τη χορήγηση ριφαμπικίνης (Rifadin, Ι.Φ.Ε.Τ., Ελλάδα) στη δόση των 10mg/kg, SID, για 21 ημέρες. Το φάρμακο χορηγούνταν με τη μορφή σιροπιού, σε νηστικά ζώα, 1 ώρα πριν την παράθεση του γεύματος. Η έναρξη της θεραπευτικής αγωγής έγινε την 21 η ΗΜΕ, όταν όλα τα ζώα της ομάδας Α πληρούσαν τα κριτήρια της οξείας φάσης της μόλυνσης (βλέπε Β, "Ορισμοί") και ολοκληρώθηκε την 42 η ΗΜΕ. Επιπλέον, 15 ημέρες μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας με τη ριφαμπικίνη, στα ζώα της ομάδας Α χορηγήθηκε νατριούχος δεξαμεθαζόνη (Dexamethasone G.A.P., G.A. Pharmaceuticals, Ελλάδα) σε δόση 0.5mg/kg, άπαξ, ως εναυσματικός παράγοντας για την πρόκληση υποτροπής πιθανής λανθάνουσας μόλυνσης από την E. canis (Eddlestone et al. 2007). Το δοσολογικό σχήμα της παρούσας μελέτης επιλέχθηκε με βάση τα δεδομένα της βιβλιογραφίας (Frank 1990, Anonymous 2007) και τα αποτελέσματα μιας προκαταρκτικής φαρμακοκινητικής μελέτης που διενεργήθηκε στην Κ.Ζ.Σ.- Α.Π.Θ. σε συνεργασία με το Εργαστήριο Φαρμακολογίας του Τμήματος Κτηνιατρικής, Α.Π.Θ., 2 μήνες πριν από την πειραματική μόλυνση. [43]

44 6. ΦΑΡΜΑΚΟΚΙΝΗΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΔΟΣΟΛΟΓΙΚΟΥ ΣΧΗΜΑΤΟΣ ΤΗΣ ΡΙΦΑΜΠΙΚΙΝΗΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΜΕΛΕΤΗ Στη μελέτη αυτή συμμετείχαν 8 Beagle από τα 16 της παρούσας μελέτης, στα οποία μετρήθηκε η συγκέντρωση της ριφαμπικίνης στο πλάσμα του αίματος σε δείγματα που λήφθηκαν 0,5, 1, 2, 4, 8, 12 και 24 ώρες μετά από μία άπαξ χορήγηση από το στόμα ριφαμπικίνης στη δόση των 10 mg/kg. Η διαδικασία επαναλήφθηκε μετά από 1 εβδομάδα, μετά από ενδοφλέβια χορήγηση του φαρμάκου στην ίδια δόση. Επικουρικά, πραγματοποιήθηκε φαρμακοκινητική μελέτη της ριφαμπικίνης κατά τη διάρκεια της μελέτης σε 4/5 σκύλους της ομάδας Α κατά το χρονικό διάστημα που λάμβαναν θεραπεία (21 η, 28 η, 35 η και 42 η ΗΜΕ) με την ίδια διαδικασία της αρχικής μελέτης. Σε κάθε χρονική στιγμή λήφθηκε από τον κάθε σκύλο ποσότητα 5 ml ολικού αίματος, σε περιέκτη με αντιπηκτική ουσία το αιθυλενο-διαμινο-τετραοξικό κάλιο (Eurotubo K3-EDTA, Deltalab, Rubi, Barcelona, Spain). Το πλάσμα αποχωρίστηκε με φυγοκέντρηση στις 1600 g για 15 λεπτά και αποθηκεύτηκε σε συνθήκες κατάψυξης (-20 o C) μέχρι την εξέτασή του. 6.1 Μέθοδος προσδιορισμού των επιπέδων ριφαμπικίνης στο αίμα Η εκτίμηση των επιπέδων της ριφαμπικίνης στο αίμα πραγματοποιήθηκε μέσω μιας τροποποιημένης χρωματογραφικής μεθόδου των Pargal και Rani (Pargal and Rani 2001). Εν συντομία, η κινούμενη φάση αποτελούνταν από ένα μίγμα ακετονιτριλίου και φωσφορικού διαλύματος το οποίο περιείχε 0,01Μ KH 2 PO 4 σε αναλογία 45:65 ό/ό. Η ρύθμιση του ph του φωσφορικού διαλύματος σε 6,5 πραγματοποιούνταν με 1Ν φωσφορικό οξύ. Το παραπάνω διάλυμα φωσφορικών αλάτων διηθούνταν με φίλτρο Nylon 0,2 μm, 47 mm (Alltech Ass. Inc., Deerfield, IL, USA) και απαερωνόταν με ήλιο (He). Όλα τα αντιδραστήρια ήταν του οίκου Merck (Merck, Darmstadt, Germany), ενώ η ριφαμπικίνη ήταν του οίκου Sigma (Sigma- Aldrich Inc, Germany). Η κινούμενη φάση διοχετευόταν στο σύστημα με ταχύτητα ροής 1,0 ml/min, θερμοκρασία στήλης 30 ο C, ενώ ο φασματοφωτομετρικός ανιχνευτής ρυθμιζόταν στα 334 nm. [44]

45 Η παραλαβή της ριφαμπικίνης από το πλάσμα του αίματος πραγματοποιούνταν ως εξής: 0,5 ml πλάσματος μεταφερόταν σε δοκιμαστικό σωλήνα και προσθέτονταν 50 μl υδατικού διαλύματος ασκορβικού οξέος (β/ό 10 μg/ml) και 1 ml ακετονιτρίλιου. Στη συνέχεια ακολουθούσε καλή ανάμειξη με ανατάραξη με τη βοήθεια κυκλομείκτη για 15 sec, και φυγοκέντρηση για 5 min στις 3500 rpm, στους 4 0 C. Η υπερκείμενη στιβάδα παραλαμβανόταν και μεταφερόταν σε άλλο δοκιμαστικό σωλήνα όπου προσθέτονταν 5 ml διχλωρομεθάνιου και το περιεχόμενο αναμειγνυόταν με ανατάραξη με τη βοήθεια κυκλομείκτη για 1 min. Ακολουθούσε φυγοκέντρηση για 10 min στις 2000 rpm, στους 4 0 C. Τέσσερα ml από την υπερκείμενη στιβάδα αναρροφούνταν και μεταφέρονταν σε καινούριο δοκιμαστικό σωλήνα όπου εξατμίζονταν στους 40 C με ρεύμα αζώτου. Το υπόλειμμα διαλυόταν με 0,5 ml κινούμενης φάσης, που περιείχε 50 mg/l ασκορβικό οξύ, και αναμιγνυόταν με ανατάραξη με τη βοήθεια κυκλομείκτη για 15 sec. Η προσθήκη του ασκορβικού οξέος γινόταν για τη σταθερότητα του μορίου της ριφαμπικίνης. Στο διάλυμα αυτό πραγματοποιούνταν ποσοτικός προσδιορισμός της ριφαμπικίνης μετά την αναρρόφηση 50 μl από τον υγροχρωματογράφο υψηλής απόδοσης LC Shimadzu LC- 10A (Shimatzu Corporation, Kyoto, Japan). Το λειτουργικό σύστημα του υγροχρωματογράφου ήταν Class-LC10 program (Version 1,41, Shimadzu). Η χρωματογραφική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν MZ-Analyzentechnik (Mainz, Germany) και η στατική φάση που περιείχε ήταν Spherisorb ODS-2 (250 4 mm i.d., 5 μm). Ο χρόνος κατακράτησης της ριφαμπικίνης ήταν ~ 9,9 min. 6.2 Φαρμακοκινητική ανάλυση Τα δεδομένα που αφορούσαν στη συγκέντρωση ριφαμπικίνης στο πλάσμα σε σχέση με το χρόνο αναλύθηκαν με τη χρήση του προγράμματος ανάλυσης φαρμακοκινητικών και φαρμακοδυναμικών δεδομένων TOPFIT 2,0 (Gustav Fischer Verlag, Stuttgard, Germany). Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη μη διαμερισματική μέθοδο, η οποία βασίζεται στη θεωρία των ροπών (Gibaldi 1991). Η σταθερά ταχύτητας απομάκρυνσης (λ z ), υπολογίστηκε με βάση τη λογαριθμική-γραμμική παλινδρόμηση, χρησιμοποιώντας τα 4 τελευταία σημεία της καμπύλης συγκέντρωσηςχρόνου, ήταν ίση με την αρνητική τιμή της κλίσης της ευθείας γραμμής της καμπύλης παλινδρόμησης κατά τη φάση της απομάκρυνσης, και οδήγησε στην εκτίμηση του χρόνου ημίσειας ζωής (t 1/2z = ln(2) / λ z ). Η περιοχή κάτω από την καμπύλη συγκέντρωσης-χρόνου (AUC) και η περιοχή κάτω από την καμπύλη συγκέντρωσης επί [45]

46 το χρόνο προς το χρόνο (AUMC) προσδιορίστηκαν σύμφωνα με τον κανόνα του τραπεζίου (Gabrielsson and Weiner 2000) προς καθορισμό του όγκου της κατανομής σε συνθήκες ψευδο-ισορροπίας (V z =Δόση/AUC λ z ), του μέσου χρόνου παραμονής (MRT=AUMC/AUC) και της ολικής απομάκρυνσης (CL=Δόση/AUC). Η βιοδιαθεσιμότητα της ριφαμπικίνης μετά την από το στόμα χορήγηση υπολογίστηκε με τον ακόλουθο τύπο: F = AUC p.o/auc iv x100. Και οι 8 σκύλοι εμφάνισαν υψηλές συγκεντρώσεις ριφαμπικίνης στο αίμα (μέση μέγιστη συγκέντρωση 16,39 ± 1,85 μg/ml και μέση συγκέντρωση ± mg/l μετά από 24 ώρες) (Πίνακας 2) μετά από μία άπαξ από το στόμα χορήγηση του σκευάσματος ριφαμπικίνης που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη, στη δόση των 10 mg/kg ( Μπατζίας και συν. αδημοσίευτα δεδομένα). Πίνακας 2. Φαρμακοκινητικές παράμετροι της ριφαμπικίνης μετά από ενδοφλέβια και από το στόμα χορήγησή της στη δόση των 10 mg/kg σ.β. σε οκτώ (8) σκύλους. (μέσος όρος ±τυπική απόκλιση) Ενδοφλέβια χορήγηση Από το στόμα χορήγηση C max (μg/ml) ±1.85 T max (h) 1-3 t 1/2β (h) ± ± 1.74 AUC 0- (μg x h/ml) ± ±31.96 MRT (h) ± ±2.36 Vz (L/kg) 0.74 ± ± 0.10 Cl (ml/min/kg) 0.66 ± ± 0.06 Vss (L/kg) 0.73 ±0.29 F % ± Cmax: μέγιστη συγκέντρωση στο αίμα,,t max : χρόνος επίτευξης της μέγιστη συγκέντρωση στο αίμα, t 1/2β : χρόνος ημίσειας ζωής της απομάκρυνσης, AUC 0- :περιοχή κάτω από τη καμπύλη συγκέντρωσης-χρόνο, MRT: μέσος χρόνος απομάκρυνσης, Vz: φαινομενικός όγκος κατανομής, Cl: ολική σωματική απομάκρυνση, Vss: όγκος κατανομής στη σταθερή κατάσταση, F%: βιοδιαθεσιμότητα [46]

47 7. ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ Οι κλινικές εξετάσεις γίνονταν από 2 κλινικούς κτηνίατρους (Μ. Μυλωνάκης, Χ. Κουτίνας), οι οποίοι αγνοούσαν την ομάδα στην οποία ανήκαν οι σκύλοι. Η εξέταση γινόταν από έναν εξεταστή κάθε φορά, με τυχαία επιλογή του εξεταστή σε κάθε χρονική στιγμή. Πριν από τον ενοφθαλμισμό, τα ζώα εξετάστηκαν ταυτόχρονα από τους δύο εξεταστές σε δύο χρονικές στιγμές, ώστε να διασφαλιστεί, κατά το δυνατόν, η ενιαία εκτίμηση των φυσιολογικών κλινικών ευρημάτων των σκύλων μεταξύ τους. Κατά την περίοδο που προηγήθηκε του ενοφθαλμισμού, όλοι οι σκύλοι εξετάστηκαν την 30 η, 14 η, 8 η, 6 η, 4 η και 2 η ημέρα πριν, καθώς και την ημέρα του ενοφθαλμισμού (ημέρα 0). Στη συνέχεια, κλινικές εξετάσεις πραγματοποιούνταν κάθε 2 ημέρες ως την 42 η ημέρα μετά τον ενοφθαλμισμό (ΗΜΕ) και σε εβδομαδιαία διαστήματα ως την 98 η ΗΜΕ. Κατά την εξέταση συμπληρωνόταν ειδικό δελτίο κλινικής αξιολόγησης, το οποίο περιελάμβανε την καταγραφή της παρουσίας ή απουσίας (0: απουσία, 1: παρουσία) των συμβατών με την ΜΕΣ κλινικών συμπτωμάτων. Για κάθε σκύλο υπολογιζόταν η αθροιστική κλινική βαθμολόγηση μετά από κάθε κλινική εξέταση, η οποία αποτελούσε το άθροισμα των κλινικών συμπτωμάτων που εμφάνιζε κάθε σκύλος τη χρονική στιγμή της εξέτασης (εύρος τιμής της αθροιστικής κλινικής βαθμολόγησης σε κάθε κλινική εξέταση: 0-13). Τα κλινικά συμπτώματα που καταγράφονταν ήταν: Ανορεξία (μερική ή πλήρης) Απώλεια σωματικού βάρους Κατάπτωση/λήθαργος Πυρετός (>39,5 o C) Λεμφογαγγλιομεγαλία Αιμορραγική διάθεση (π.χ. πετέχειες/εκχυμώσεις στο δέρμα ή/και τους βλεννογόνους) Ωχρότητα βλεννογόνων Ψηλαφήσιμη σπληνομεγαλία Ψηλαφήσιμη ηπατομεγαλία Οφθαλμολογικές αλλοιώσεις (π.χ. επιπεφυκίτιδα, ιριδοκυκλίτιδα, οφθαλμικό έκκριμα) Ρινικό έκκριμα [47]

48 Χωλότητα Αναπνευστική δυσχέρεια Άλλα συμπτώματα Η εκτίμηση της όρεξης γινόταν από την υπεύθυνη κτηνίατρο του πειραματισμού και της φροντίδας των σκύλων της μελέτης (Κ. Θεοδώρου). 8. ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ Από κάθε σκύλο λαμβάνονταν περίπου 10 ml αίματος μετά από παρακέντηση της σφαγίτιδας ή της κεφαλικής φλέβας με κοινή σύριγγα και βελόνα ή πεταλούδα 21G. Περίπου 2 ml ολικού αίματος μεταγγίζονταν άμεσα σε 2 περιέκτες (περίπου 1 ml/περιέκτη) με αντιπηκτική ουσία το αιθυλενο-διαμινο-τετραοξικό κάλιο (Eurotubo K3-EDTA, Deltalab, Rubi, Barcelona, Spain), ενώ η υπόλοιπη ποσότητα μεταφερόταν σε περιέκτες χωρίς αντιπηκτικό (Eurotubo Serum Separation, Deltalab, Rubi, Barcelona, Spain) και φυγοκεντρούνταν (1600 g x 15 min) για το διαχωρισμό του ορού από το πήγμα του αίματος. Το ένα φιαλίδιο άπηκτου αίματος χρησιμοποιούνταν για την γενική αιματολογική εξέταση και την παρασκευή απλών επιχρισμάτων και επιχρισμάτων από το buffy coat, ενώ το άλλο αποθηκευόταν σε συνθήκες κατάψυξης (-20 o C) μέχρι την εξέτασή του με την PCR για την E. canis. Ο ορός του αίματος αποθηκευόταν σε θερμοκρασία ψύξης μέχρι την πραγματοποίηση των βιοχημικών εξετάσεων (πλην των χολικών οξέων, βλέπε Γ9) και σε θερμοκρασία κατάψυξης (-20 ο C) μέχρι την πραγματοποίηση της μέτρησης της συγκέντρωσης των χολικών οξέων και των ορολογικών εξετάσεων (βλέπε Γ11). Οι γενικές εξετάσεις αίματος διενεργήθηκαν στον αιματολογικό αναλυτή Advia (Advia 120 Hematology System, Bayer, League City, TX), στο Διαγνωστικό Εργαστήριο του Τμήματος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ. Οι εξετάσεις ολοκληρώνονταν μέσα σε 6 ώρες από τη δειγματοληψία. Από τις γενικές εξετάσεις αίματος καταγράφηκαν ο αιματοκρίτης (HCT), η αιμοσφαιρίνη (Hg), ο μέσος όγκος ερυθρού αιμοσφαιρίου (MCV), η μέση πυκνότητα αιμοσφαιρίνης (MCHC), ο απόλυτος αριθμός των λευκών αιμοσφαιρίων (WBC) και των αιμοπεταλίων (PLT) καθώς και ο λευκοκυτταρικός τύπος σε κάθε χρονική στιγμή. Εξαίρεση αποτέλεσε η δειγματοληψία που έγινε στην ομάδα Α την 56 η ΗΜΕ, τα δείγματα της οποίας εξετάστηκαν στον κτηνιατρικό αναλυτή Sysmex poch-100iv Diff (Sysmex Europe [48]

49 GmbH, Hamburg, Germany) σε ιδιωτική κτηνιατρική κλινική. Από τις εξετάσεις αυτές καταγράφηκαν οι τιμές του αιματοκρίτη και του απόλυτου αριθμού των λευκών αιμοσφαιρίων και των αιμοπεταλίων, ενώ δεν υπήρχε δυνατότητα εκτίμησης του λευκοκυτταρικού τύπου. Όλα τα ζώα εξετάστηκαν αιματολογικά 2 εβδομάδες πριν και την ημέρα του ενοφθαλμισμού. Ακολούθως, οι σκύλοι της ομάδας Α εξετάστηκαν την 7 η, 14 η, 21 η, 28 η, 35 η, 42 η, 56 η, 70 η, 84 η και 98 η ΗΜΕ και της ομάδας Β την 7 η, 14 η, 21 η, 28 η, 35 η, 42 η, 70 η, 84 η και 98 η ΗΜΕ, ενώ οι μη μολυσμένοι μάρτυρες (ομάδα Γ) εξετάστηκαν την 7 η, 14 η, 35 η, 70 η και 98 η ΗΜΕ. Σε περίπτωση ένδειξης θρομβοκυτταροπενίας με βάση τα αποτελέσματα του αιματολογικού αναλυτή, εξετάζονταν βαμμένα απλά επιχρίσματα αίματος (Giemsa, Merck, Germany) για την αναζήτηση πιθανών συσσωματωμάτων αιμοπεταλίων (Mylonakis et al. 2008). Επιχρίσματα από τη στοιβάδα του BC εξετάστηκαν για τροφοζωΐτες της Babesia sp., γαμετοκύτταρα του Hepatozoon sp. και μορίδια των γενών Ehrlichia sp. και Anaplasma sp. με μικροσκοπικό έλεγχο μέχρι 1000 οπτικών πεδίων (συνολική μεγέθυνση 1000) κατά τις δειγματοληψίες ολικού αίματος πριν τον ενοφθαλμισμό και έως την επιβεβαίωση της μόλυνσης από την E. canis για τον σκύλο #1. Η διαδικασία παρασκευής, χρώσης και εξέτασης των επιχρισμάτων αίματος (απλών και BC) έχει περιγραφεί σε προηγούμενες μελέτες (Mylonakis 2001, Mylonakis et al. 2008). 9. ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΣΤΟΝ ΟΡΟ ΤΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ Οι βιοχημικές εξετάσεις πραγματοποιούνταν σε βιοχημικό αναλυτή υγρής χημείας (Vital Lab Flexor E, Spankeren, The Netherlands), στο Διαγνωστικό Εργαστήριο του Τμήματος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ, μέσα σε 48 ώρες από τη δειγματοληψία. Η μέτρηση της συγκέντρωσης των ολικών πρωτεϊνών (ολικά στερεά) προσδιορίζονταν σε ιατρικό διαθλασίμετρο (Clinical refractometer, ΑTAGO Co LTD, Japan). Μετά από δωδεκάωρη νηστεία, οι βιοχημικές παράμετροι που προσδιορίζονταν σε κάθε δείγμα ορού αίματος ήταν οι ακόλουθες: ολικές πρωτεΐνες (ολικά στερεά), λευκωματίνες, ουρεϊκό άζωτο, κρεατινίνη, ολική χολερυθρίνη, ALT, ALP, γλυκόζη, ολικό ασβέστιο και φωσφόρος. Σε επιλεγμένες χρονικές στιγμές, πραγματοποιούνταν δειγματοληψίες για τη μέτρηση της συγκέντρωσης των χολικών οξέων, σε ζεύγος δειγμάτων ορού αίματος. Για τη διαδικασία αυτή, χρησιμοποιούνταν περίπου 0,5 ml ορού αίματος πριν και 2 ώρες μετά την [49]

50 κατανάλωση μικρού γεύματος κονσέρβας. Τα δείγματα των ορών αποθηκεύονταν σε συνθήκες κατάψυξης (-20 o C) και εξετάστηκαν μετά την ολοκλήρωση της μελέτης σε εξειδικευμένο κτηνιατρικό ενδοκρινολογικό εργαστήριο και εκτιμήθηκαν με βάση τις τιμές αναφοράς του συγκεκριμένου εργαστηρίου (Cambridge Specialist Laboratory Services, UK). Αιμοληψίες για τη διενέργεια βιοχημικών εξετάσεων (εκτός των χολικών οξέων) στον ορό του αίματος έγιναν από όλους τους σκύλους την 10 η ημέρα πριν την πειραματική μόλυνση, ενώ στη συνέχεια, για την ομάδα Α την 7 η, 14 η, 21 η, 28 η, 35 η, 42 η, 56 η, 70 η, 84 η και 98 η ΗΜΕ, για την ομάδα Β την 7 η, 21 η, 35 η, 56 η, 84 η και 98 η ΗΜΕ και τέλος για την ομάδα Γ την 7 η και 70 η ΗΜΕ. Για τη μέτρηση των χολικών οξέων, δειγματοληψίες έγιναν από όλους τους σκύλους 15 ημέρες πριν την πειραματική μόλυνση και στη συνέχεια από την ομάδα Α τη 10 η, 20 η, 35 η, 56 η, 70 η και 84 η ΗΜΕ, από την ομάδα Β τη 10 η, 35 η και 84 η ΗΜΕ και από την ομάδα Γ τη 10 η και 70 η ΗΜΕ. 10. ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΟΥΡΩΝ Γενική ανάλυση ούρων διενεργήθηκε σε δείγματα ούρου (5-10ml) που λήφθησαν με κυστοκέντηση. Η ανάλυση περιελάμβανε τον προσδιορισμό του ειδικού βάρους με ιατρικό διαθλασίμετρο (Clinical refractometer, ΑTAGO Co LTD, Japan), την εξέταση με χρωματομετρική ταινία εμβάπτισης (Medi-Test Combi 10 VET, Macherey-Nagel, Germany) για την μέτρηση του ph και την εκτίμηση της παρουσίας γλυκοζουρίας, κετονουρίας και πρωτεϊνουρίας, τον ημιποσοτικό προσδιορισμό των πρωτεϊνών με τη χρήση της θολοσιμετρικής μεθόδου με διάλυμα πυκνού νιτρικού οξέος (Heller s test) και τη μικροσκοπική εξέταση του ιζήματος (Hurley and Vaden 1995). Για την εκτίμηση του ιζήματος, πoσότητα ούρου περίπου 5ml υποβάλλονταν σε φυγοκέντρηση (1500g για 5 λεπτά) και μετά την απόρριψη του υπερκείμενου υγρού ακολουθούσε μικροσκόπηση του ιζήματος για τον εντοπισμό τυχόν κυλινδρουρίας (κύλινδροι >1/οπτικό πεδίο, 100), πυουρίας (λευκά αιμοσφαίρια >6/οπτικό πεδίο, 400), αιματουρίας (ερυθρά αιμοσφαίρια >6/οπτικό πεδίο, 400). Η τυχόν παρουσία βακτηριουρίας ελεγχόταν τόσο σε νωπό ίζημα ούρου ( 400), όσο και σε βαμμένο με Giemsa επίχρισμα ιζήματος ούρου ( 400) (Chew et al. 2011). Όλοι οι σκύλοι (ομάδες Α, Β και Γ) εξετάστηκαν πριν τον ενοφθαλμισμό και κάθε 6 εβδομάδες σε όλη τη διάρκεια της μελέτης. [50]

51 11. ΟΡΟΛΟΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Ο προσδιορισμός των ειδικών έναντι της E. canis IgG αντισωμάτων έγινε με τη μέθοδο του έμμεσου ανοσοφθορισμού (IFA) (Ελληνικά Κτηνιατρικά Εργαστήρια, Αθήνα) όπως περιγράφεται σε προηγούμενη μελέτη (Mylonakis et al. 2003) με μικρές τροποποιήσεις. Εν συντομία, σε ειδική αντικειμενοφόρο πλάκα των 10 βοθρίων τοποθετούνταν 10 μl εναιωρήματος αντιγόνου E. canis (Fluo EHRLICHIA CANIS; Agrolabo, Italy) σε κάθε βοθρίο, το οποίο μονιμοποιούνταν με διάλυμα ακετόνης σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Κάθε δείγμα ορού αραιωνόταν διαδοχικά (υποδιπλάσιες αραιώσεις) με απιονισμένο PBS (Biochrom) με αρχική αραίωση 1/50. Κάθε βοθρίο πληρούταν με 10 μl της αντίστοιχης αραίωσης και οι πλάκες επωάζονταν σε κλίβανο με αυξημένη σχετική υγρασία στους 37 o C για 30 λεπτά. Στη συνέχεια γινόταν έκπλυση των πλακών με διπλή εμβάπτιση σε PBS για 5 λεπτά κάθε φορά και στο τέλος με απεσταγμένο νερό και αφήνονταν να στεγνώσουν σε θερμοκρασία δωματίου. Στο επόμενο στάδιο, 20 μl συζεύγματος ανοσοσφαιρίνης κουνελιού έναντι των ανοσοσφαιρινών-g του σκύλου με φλουοροσκεΐνη (anti-dog IgG; Agrolabo, Italy), τοποθετούνταν σε κάθε βοθρίο και ακολουθούσε η ίδια διαδικασία επώασης, έκπλυσης και ξήρανσης. Τέλος, μετά την προσθήκη γλυκερίνης και την κάλυψη των πλακών με κατάλληλες καλυπτρίδες, ακολουθούσε μικροσκόπηση σε σκοτεινό θάλαμο, με μικροσκόπιο υπεριώδους ακτινοβολίας ( 400). Ως τίτλος του κάθε δείγματος λαμβανόταν η μεγαλύτερη αραίωση στην οποία το αντιγόνο εμφάνιζε σαφή φθορισμό. Τίτλος IgG μεγαλύτερος ή ίσος του 1/100 θεωρούνταν θετικός, ενώ η μέγιστη αραίωση (τελικός τίτλος) που εκτιμήθηκε στην παρούσα μελέτη ήταν το 1/1600. Για τη βελτιστοποίηση της ευαισθησίας της μεθόδου και την ελαχιστοποίηση της υποκειμενικότητας της εκτίμησης των αποτελεσμάτων, η εξέταση όλων των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε από τον ίδιο εξεταστή. Με τη μέθοδο αυτή εξετάστηκαν ζεύγη ορών (14 ημέρες πριν και την ημέρα του ενοφθαλμισμού) από όλους τους σκύλους της μελέτης. Μετά την πειραματική μόλυνση, οι σκύλοι των ομάδων Α και Β εξετάστηκαν την 7 η, 14 η, 42 η, 70 η και 98 η ΗΜΕ, ενώ οι μη μολυσμένοι μάρτυρες εξετάστηκαν την 7 η, 70 η και 98 η ΗΜΕ. Την 21 η ΗΜΕ εξετάστηκαν μόνο 4 σκύλοι της ομάδας Β που ήταν οροαρνητικοί την 14 η ΗΜΕ. Με την ίδια τεχνική εξετάστηκαν πριν τον ενοφθαλμισμό όλοι οι σκύλοι της μελέτης και βρέθηκαν οροαρνητικοί έναντι της Babesia canis (Fluo BABESIA CANIS, Agrolabo, Italy, θετικός τίτλος IgG >100) και της Leishmania infantum [51]

52 (FluoLeish, BVT, Virbac, France, θετικός τίτλος IgG >100). Επιπλέον, όλοι οι σκύλοι εξετάστηκαν με ανοσοενζυμική μέθοδο ELISA σύμφωνα με τις οδηγίες της παρασκευάστριας εταιρείας (Snap 3Dx; IDEXX, Westbrook, ME, USA) και βρέθηκαν οροαρνητικοί έναντι του αντιγόνου της Dirofilaria immitis, καθώς και για αντισώματα IgG έναντι της E. canis και της Borrelia burgdorferi. 12. ΜΥΕΛΟΚΕΝΤΗΣΗ ΚΑΙ ΠΑΡΑΚΕΝΤΗΣΗ ΤΟΥ ΣΠΛΗΝΑ Παρακέντηση του ΜΟ (μυελοκέντηση) και του σπλήνα (σπληνοκέντηση) πραγματοποιούνταν σε επιλεγμένες χρονικές στιγμές με σκοπό την εξέταση των δειγμάτων με τη μέθοδο PCR (βλέπε Γ12) για την ανίχνευση του DNA της E.canis. Σε κάθε περίπτωση η δειγματοληψία γινόταν υπό γενική αναισθησία βραχείας διάρκειας (15-30 min). Η εγκατάσταση της αναισθησίας γινόταν με την ενδοφλέβια χορήγηση ακετυλοπρομαζίνης (Acetylopromazine, Agrosede, Greece) στη δόση των 0,05 mg/kg και νατριούχου θειοπεντάλης (Pentothal, Abbott, Italy) στη δόση των 5 mg/kg. Για τη διατήρηση της γενικής αναισθησίας χορηγούνταν επιπλέον δόσεις νατριούχου θειοπεντάλης. Σε κάθε περίπτωση, η εγκατάσταση και η συντήρηση της αναισθησίας πραγματοποιούνταν υπό τη συνεχή επίβλεψη αναισθησιολόγου. Για τη λήψη των δειγμάτων του ΜΟ, ο σκύλος τοποθετούνταν σε πρηνή θέση ή πλάγια κατάκλιση για την παρακέντηση της λαγόνιας ακρολοφίας ή της έξω επιφάνειας του άνω άκρου του βραχιόνιου οστού, αντίστοιχα. Η δειγματοληψία πραγματοποιούνταν με τη χρήση ειδικής ακίδας μυελοκέντησης τύπου Rosenthal, διαμέτρου 15G και μήκους 4,5 cm (MEDAX Perfectus, Italy), όπως έχει περιγραφεί σε προηγούμενες μελέτες (Grindem et al. 2002). Συνοπτικά, πριν την παρακέντηση, πραγματοποιούνταν κούρεμα και χειρουργική αντισηψία της περιοχής και χορηγούνταν τοπική αναλγησία με υποδόρια και υποπεριοστική έγχυση διαλύματος λιδοκαΐ νης 2% (Xylocaine, Astra Zeneka, Sweden), στη δόση του 1ml/10kg. Μετά από πολύ μικρή τομή του δέρματος στο σημείο εισόδου με λεπίδα Νο11, η ακίδα προωθούνταν με συνεχή περιστροφική κίνηση μέχρι τη σταθεροποίησή της στη σπογγώδη ουσία του οστού. Η αναρρόφηση του ΜΟ (ποσότητα 0,5-1ml) γινόταν με σταθερή άσκηση αρνητικής πίεσης με σύριγγα των 10 ml που είχε διαβραχεί με περίπου 0,1 ml διαλύματος EDTA 1%. Αμέσως μετά τη δειγματοληψία, παρασκευάζονταν με τη μέθοδο της σύνθλιψης ανάμεσα σε δύο αντικειμενοφόρες πλάκες 2-4 επιχρίσματα και το υπόλοιπο υλικό μεταγγιζόταν σε φιαλίδιο με EDTA, [52]

53 το οποίο αποθηκευόταν σε συνθήκες κατάψυξης (-20 o C) μέχρι την πραγματοποίηση της PCR. Για την παρακέντηση του σπλήνα ο σκύλος τοποθετούνταν σε δεξιά πλάγια κατάκλιση. Μετά το κούρεμα και την αντισηψία ευρείας περιοχής του αριστερού πλάγιου κοιλιακού τοιχώματος, ακολουθούσε η ψηλάφηση (του πάντοτε διογκωμένου λόγω της γενικής αναισθησίας οργάνου) και η μετατόπισησταθεροποίηση της θέσης του οργάνου σε επαφή με το αριστερό πλάγιο κοιλιακό τοίχωμα. Η παρακέντηση του σπλήνα γινόταν με βελόνα διαμέτρου 23G, η οποία ήταν προσαρμοσμένη σε σύριγγα 5 ml μέσω της οποίας ασκούνταν ήπια αρνητική πίεση (MacWilliams 2008). Από το δείγμα του σπληνικού ιστού (0,5-1ml) παρασκευάζονταν με τον ίδιο τρόπο όπως στο ΜΟ 2-3 επιχρίσματα και το υπόλοιπο υλικό τοποθετούνταν σε φιαλίδιο με EDTA, το οποίο αποθηκευόταν σε συνθήκες κατάψυξης (-20 o C) μέχρι τη διενέργεια της PCR. Τα κυτταρολογικά επιχρίσματα του ΜΟ και του σπλήνα εξετάζονταν μετά το τέλος της δειγματοληψίας για την ικανοποιητική ποιότητα του ληφθέντος υλικού, προκειμένου σε αντίθετη περίπτωση να επαναληφθεί η δειγματοληψία. Σε καμία χρονική στιγμή δεν χρειάστηκε η επανάληψη της μυελοκέντησης, ενώ σε δύο σκύλους χρειάστηκε η επανάληψη της δειγματοληψίας του σπλήνα το επόμενο εικοσιτετράωρο με υπερηχοτομογραφική καθοδήγηση. Δειγματοληψίες του ΜΟ και του σπλήνα διενεργήθηκαν σε όλους τους σκύλους 2 ημέρες πριν την πειραματική μόλυνσή τους και στη συνέχεια στους σκύλους των ομάδων Α και Β την 7 η, 21 η, 42 η, 70 η και 98 η ΗΜΕ, ενώ στους μη μολυσμένους σκύλους την 42 η και 98 η ΗΜΕ. 13. ΔΟΚΙΜΕΣ ΤΗΣ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ Για την ανίχνευση του DNA της E. canis, προκειμένου να επιβεβαιωθεί η επίτευξη της μόλυνσης και να εκτιμηθεί η αποτελεσματικότητα της θεραπείας με τη ριφαμπικίνη ως προς την εκρίζωσή της, εξετάστηκαν δείγματα ολικού αίματος, ΜΟ και σπλήνα με δύο διαφορετικές τεχνικές PCR: i) μια μέθοδος διπλής (επάλληλης) PCR (nested PCR) για την ανίχνευση τμήματος, μεγέθους 389 bp, του 16S rdna της E. canis, η οποία πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Λοιμωδών Νοσημάτων, Τμήμα Κτηνιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Α.Π.Θ. και ii) μια PCR [53]

54 πραγματικού χρόνου (real-time PCR), για την ανίχνευση τμήματος, μεγέθους 123 bp, του 16S rdna της E. canis, η οποία πραγματοποιήθηκε στην Κτηνιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου της Ιερουσαλήμ (Koret School of Veterinary Medicine, The Hebrew University of Jerusalem). Οι εξετάσεις σε κάθε εργαστήριο πραγματοποιήθηκαν χωρίς να είναι γνωστή η χρονική στιγμή στην οποία αντιστοιχούσαν τα εξεταζόμενα δείγματα. Και για τις δύο μεθόδους χρησιμοποιήθηκε ολικό γενωμικό DNA που εκχυλίστηκε με την εφαρμογή εμπορικής μεθόδου (Nucleopsin Tissue kit, Macherey- Nagel, Dueren, Germany) από δείγματα ολικού αίματος (200 μl), ΜΟ (50 μl) και σπληνικού ιστού (50 μl). Τα δείγματα υφίσταντο την επεξεργασία των σταδίων λύσης των κυττάρων, δέσμευσης του γενωμικού DNA σε μικροστήλες, έκπλυσης και αποδέσμευσής του ακολουθώντας τις συστηνόμενες οδηγίες. Συγκεκριμένα, σε αποστειρωμένο φιαλίδιο τύπου eppendorf τοποθετούνταν το προς εξέταση δείγμα με 180 μl κυτταρολυτικού διαλύματος και 25 μl πρωτεϊνάσης Κ. Μετά από μικρής διάρκειας ανάδευση σε ειδική συσκευή (vortex), το φιαλίδιο τοποθετούνταν σε υδατόλουτρο με θερμοκρασία 56 o C για 3 ώρες, με περιοδική ανάδευση. Στη συνέχεια, μετά την προσθήκη δεύτερου κυτταρολυτικού διαλύματος και την εκ νέου ανάδευση του δείγματος, τοποθετούνταν σε υδατόλουτρο με θερμοκρασία 70 o C για 10 min, για την ολοκλήρωση της κυτταρρολυτικής φάσης. Aκολουθούσε ανάδευση του μίγματος, προσθήκη 210 μl διαλύματος αιθανόλης (96-100%), ομοιογενοποίηση του μίγματος με έντονη ανάδευση (vortex) και μεταφορά του σε ειδική στήλη που ήταν τοποθετημένη σε φιαλίδιο και έφερε μεμβράνη πυριτίου (silica membrane) για τη δέσμευση του DNA. Μετά από φυγοκέντρηση ( g για 1 min) και απόρριψη του υλικού που διήλθε από τη μεμβράνη, η στήλη ξανατοποθετούνταν στο φιαλίδιο. Ακολουθούσαν δύο στάδια έκπλυσης με την προσθήκη 500 μl και 600 μl από 2 διαφορετικά ρυθμιστικά διαλύματα έπλυσης, αντίστοιχα, φυγοκέντρηση ( g για 1 min) και απόρριψη του υλικού που διερχόταν από τη μεμβράνη. Μετά από ακόμα μία φυγοκέντρηση ( g για 1 min), ακολουθούσε η τοποθέτηση της στήλης σε αποστειρωμένο eppendorf, η προσθήκη 100 μl ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης, προθερμασμένου στους 70 o C, η παραμονή του σε θερμοκρασία δωματίου για 1 λεπτό και η εκ νέου φυγοκέντρηση ( g για 1 min). Μετά από απόρριψη της ειδικής στήλης, το υλικό (υγρό) που περιεχόταν στο eppendorf αποτελούσε το [54]

55 γενωμικό DNA, το οποίο εξεταζόταν αμέσως ή αποθηκευόταν στους -20 o C μέχρι την εξέτασή του με PCR Nested PCR Η συγκεκριμένη μέθοδος πραγματοποιήθηκε ως ειδική για την ανίχνευση τμήματος, μεγέθους 389 bp, του 16S rdna της E. canis στο ολικό αίμα, το ΜΟ και το σπληνικό ιστό των σκύλων της μελέτης, και διενεργήθηκε, με μικρές διαφορές, σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες (Wen et al. 1997, Harrus et al. 1998c, Siarkou et al. 2007, Mylonakis et al. 2009). Για την 1 η αντίδραση της PCR χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές οι ECC (5 -AGAAGCAACGCTGGCGGCAAGCC-3 ) και ECB (5 - CGTATTACCGCGGCTGCTGGCA-3 ) ενώ για τη 2 η αντίδραση οι εκκινητές canis (5 -CAATTATTTATAGCCTCTGGCTATAGGA-5 ) και HE3 (5 - TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAT-3 ). Στην 1 η αντίδραση, χρησιμοποιήθηκαν μg DNA σε τελικό όγκο αντίδρασης 50μl, που περιείχε 5μl 10x PCR buffer, 5μl 50mM MgCl 2, 1μl 10mM μίγματος τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοτιδίων (dntp s, Invitrogen TM, Carlsbad, USA), 2 pmol από τον κάθε εκκινητή (ECC, ECB) και 1.25 U της Taq πολυμεράσης. Στην διεξαγωγή αυτής της μελέτης χρησιμοποιήθηκε η Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen TM, Carlsbad, USA) με σκοπό την ενίσχυση της αντίδρασης.η αντίδραση πραγματοποιούνταν σε θερμοκυκλοποιητή (Peltier Thermar, μοντέλο PTC 0200, Bio-Rad Laboratories, Inc). Οι συνθήκες ενίσχυσης του DNA ήταν: ένας κύκλος αρχικής αποδιάταξης του DNA στους 94 o C για 5 min και 40 κύκλοι που ο καθένας περιελάμβανε τρία στάδια: i) αποδιάταξη στους 94 ο C για 1 min, ii) πρόσδεση των εκκινητών στο DNA στόχο στους 60 o C για 1 min, και iii) επιμήκυνση των εκκινητών στους 72 ο C για 1 min. Από το προϊόν της 1 ης αντίδρασης, 1 μl αποτελούσε το χρησιμοποιούμενο DNA για τη 2 η αντίδραση, η οποία πραγματοποιούταν με τις ίδιες συνθήκες με μόνη διαφορά ως προς τους χρησιμοποιούμενους εκκινητές ( canis και HE3). Σε κάθε αντίδραση χρησιμοποιούνταν νερό ελεύθερο νουκλεασών για τον έλεγχο τυχόν επιμόλυνσης, ενώ επιβεβαιωμένα θετικά δείγματα ΜΟ και ολικού αίματος από έναν μολυσμένο σκύλο, χρησιμοποιούνταν ως θετικοί μάρτυρες. Τα προϊόντα της PCR αναλυόταν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης. Για την παρασκευή της πηκτής χρησιμοποιούταν διάλυμα ΤΑΕ 1Χ και αγαρόζη υψηλής [55]

56 καθαρότητας (HT Biotechnology Ltd, UK) σε αναλογία 1,5% (w/v). Αρχικά, παρασκευαζόταν διάλυμα ΤΑΕ 50Χ με την παρακάτω σύνθεση: Tris Base 48,4g (Ultra Pure TM, Invitrogen TM ), Glacial acetic acid 11,42ml, 0,5M EDTA (PH 8) 20ml και απεσταγμένο νερό 120,18ml. Το διάλυμα 0,5Μ EDTA παρασκευαζόταν με τη χρησιμοποίηση EDTA 3,72g (Ultra Pure TM, Invitrogen TM ), ταμπλετών NaOH 10g (Merck) και απεσταγμένο νερό 20ml. Γινόταν ρύθμιση του PH και συμπλήρωση με απεσταγμένο νερό μέχρι τον όγκο των 200ml. Για την παρασκευή του τελικού διαλύματος ΤΑΕ 1Χ πριν από τη χρήση του γινόταν διάλυμα 2% με δισαπεσταγμένο νερό. Στις θέσεις υποδοχής της πηκτής τοποθετούνταν 9 μl προϊόντος της 2ης αντίδρασης της nested PCR αφού είχε προηγηθεί η ανάμιξή του με 4μl χρωστικής κυανού της βρωμοφαινόλης. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιούνταν σε συσκευή οριζόντιας ηλεκτροφόρησης (Bio-Rad Laboratories, Inc), με σταθερή τάση λειτουργίας 110V για 30 min. Τέλος, η πηκτή αγαρόζης χρωματιζόταν για 30 min σε διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου ( , Invitrogen TM ). Ακολουθούσε έκθεση της πηκτής αγαρόζης σε υπεριώδη ακτινοβολία σε τράπεζα φθορισμού (White/ UV transluminator, UPV) και ψηφιακή αποτύπωσή της με σύστημα ανάλυσης εικόνας UV Foto/Phoresis I (Fotodyne, USA). Ο προσδιορισμός του μεγέθους των προϊόντων γινόταν με τη χρήση του DNA Ladder μοριακού βάρους 1500 bp, αναλυόμενο σε κλάσματα των 100bp ( , TrackIt TM, Invitrogen TM ). Κάθε δείγμα θεωρούνταν θετικό όταν το μοριακό βάρος του προϊόντος της PCR ήταν ίδιο με εκείνο του DNA των θετικών μαρτύρων (389 bp). Η ταυτότητα των προϊόντων επιβεβαιώθηκε με την ανάλυση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων, που πραγματοποιήθηκε και στις δύο έλικες του DNA, και διεξήχθη με τη χρήση των εκκινητών της 2ης αντίδρασης της PCR, από εξειδικευμένο εργαστήριο (VBC-BIOTECH Service GmbH, Vienna, Austria). Οι αλληλουχίες των νουκλεοτιδίων που προέκυψαν συγκρίθηκαν με τις αλληλουχίες του στελέχους 611 (GenBank accession number U26740) με τη χρήση του προγράμματος CrustalW (Conway Institute, Dublin, Ireland). Όλοι οι σκύλοι εξετάστηκαν με τη συγκεκριμένη PCR πριν από τον ενοφθαλμισμό, ενώ στη συνέχεια τα ζώα των ομάδων Α και Β κατά την 7 η, 21 η, 42 η, 70 η και 98 η ΗΜΕ και οι μη μολυσμένοι μάρτυρες την 42 η και 98 η ΗΜΕ. [56]

57 13.2 Real-time PCR Την 21 η, 42 η, 70 η και 98 η ΗΜΕ για τους σκύλους των ομάδων Α και Β και την 42 η, και 98 η ΗΜΕ για τους μη μολυσμένους μάρτυρες, παράλληλα με τη nested PCR, πραγματοποιήθηκε και real-time PCR για την ανίχνευση τμήματος μεγέθους 123 bp του 16S rdna της E.canis. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι Ec-16S-F 5 -TCGCTATTAGATGAGCCTACGT και Ec-16S-R 5 - GAGTCTGGACCGTATCTCAG, ενώ για τις αντιδράσεις χρησιμοποιήθηκαν επίσης το Thermo Start Μaster Mix (Thermo Scientific, Germany) και η φθορίζουσα χρωστική SYTO 9 (Thermo Scientific, Germany) σε θερμοκυκλοποιητή Corbett Research Rotor-Gene 6000 (Corbett Research Pty Ltd, Sydney, Australia). Χρησιμοποιήθηκε το πρωτόκολλο που περιγράφεται σε προηγούμενη μελέτη των Peleg et. al (Peleg et al. 2010) με μικρές διαφορές. Συγκεκριμένα, οι συνθήκες ενίσχυσης του DNA ήταν: ένας κύκλος αρχικής αποδιάταξης του DNA στους 95 o C για 15 λεπτά (αντί για τα 7 λεπτά του αρχικού πρωτοκόλλου) και 40 κύκλοι που ο καθένας περιελάμβανε τρία στάδια: i) 93 ο C για 10 sec, ii) 61 o C για 30 sec, καταγραφή αποτελεσμάτων, και iii) 72 ο C για 1 sec και καταγραφή αποτελεσμάτων. Μετά την ολοκλήρωση των κύκλων, ακολουθούσε περίοδος επώασης στους 61 o C για 1 min και η διαμόρφωση της καμπύλης τήξης από τους 65 o C έως τους 95 o C και καταγραφή αποτελεσμάτων κάθε 1 o C για 1 sec. Η ανάλυση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων και η σύγκρισή τους με το στέλεχος "611" έγιναν με τη χρησιμοποίηση του εκκινητή Ec-16S-F και πραγματοποιήθηκε σε ειδικό εργαστήριο αλληλούχισης (Hebrew University Sequencing Core). Οι αλληλουχίες αναλύθηκαν με το πρόγραμμα ChromasPro software version 1.33 και συγκρίθηκαν με τα στοιχεία που έχουν κατατεθεί στην επίσημη βάση δεδομένων GenBank με τη βοήθεια του προγράμματος BLAST ( Στην παρούσα μελέτη, τα αποτελέσματα της real-time PCR καταγράφηκαν ως θετικά ή αρνητικά, χωρίς να γίνει ποσοτικοποίηση του βακτηριακού φορτίου. [57]

58 14. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Το τεστ των Wilcoxon-Mann-Whitney χρησιμοποιήθηκε 1) για τη σύγκριση των διάμεσων τιμών της αθροιστικής κλινικής βαθμολόγησης μεταξύ των ομάδων Α και Β κατά την περίοδο πριν από την έναρξη της θεραπείας (1 η -21 η ΗΜΕ), κατά τη διάρκεια της θεραπείας (22 η 42 η ΗΜΕ) και από την ολοκλήρωση της θεραπείας μέχρι το πέρας της μελέτης (43 η 98 η ΗΜΕ), καθώς και για τη σύγκριση της αθροιστικής κλινικής βαθμολόγησης κατά την ημέρα έναρξης της θεραπευτικής αγωγής (21 η ΗΜΕ), την ημέρα ολοκλήρωσης της θεραπείας (42 η ΗΜΕ) και την ημέρα περάτωσης της μελέτης (98 η ΗΜΕ), 2) για τη σύγκριση της διάμεσης τιμής του αιματοκρίτη και του αριθμού των λευκών αιμοσφαιρίων και των αιμοπεταλίων μεταξύ των ομάδων Α και Β, πριν από τη μόλυνση (ημέρα 0), κατά την έναρξη της θεραπευτικής αγωγής (21 η ΗΜΕ), κατά την ολοκλήρωσή της (42 η ΗΜΕ) και στο τέλος της μελέτης (98 η ΗΜΕ), 3) για τη σύγκριση του διάμεσου τίτλου των αντισωμάτων IgG έναντι της E. canis μεταξύ των ομάδων Α και Β στις 21, 42 η και 98 η ΗΜΕ και 4) για τη σύγκριση της διάμεσης τιμής της συγκέντρωσης των χολικών οξέων (πριν και μετά την κατανάλωση γεύματος) και της δραστηριότητας της ALP μεταξύ των ομάδων Α και Β στην 35 η ΗΜΕ. Η σύγκριση της συχνότητα της θρομβοκυτταροπενίας μεταξύ των ομάδων Α και Β στις 42 η και 98 η ΗΜΕ πραγματοποιήθηκε με το ακριβές τεστ του Fisher. Η καμπύλη Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση της πιθανότητας ανάταξης της θρομβοκυτταροπενίας κατά τη διάρκεια της θεραπείας με ριφαμπικίνη μεταξύ των σκύλων της ομάδας Α και Β. Οι καμπύλες που προέκυψαν συγκρίθηκαν με το log-rank τεστ. Η σύγκριση της διάμεσης τιμής του αιματοκρίτη, των λευκών αιμοσφαιρίων και των αιμοπεταλίων μεταξύ της χρονικής στιγμής πριν από τη μόλυνση (ημέρα 0) και της 21 ης, 42 ης και 98 ης ΗΜΕ για τους σκύλους της ομάδας Α και η αντίστοιχη σύγκριση για τους σκύλους της ομάδας Β, πραγματοποιήθηκε με το Wilcoxon Signed Rank τεστ. Η σύγκριση της μέσης συγκέντρωσης της κρεατινίνης και της ολικής χολερυθρίνης, καθώς και της δραστηριότητας της ALT και της ALP στον ορό του αίματος των σκύλων της ομάδας Α κατά τη διάρκεια της θεραπείας με ριφαμπικίνη [58]

59 (21 η -42 η ΗΜΕ) σε σχέση με τις αντίστοιχες τιμές των παραμέτρων αυτών πριν από τον ενοφθαλμισμό και κατά την περίοδο μετά τον ενοφθαλμισμό αλλά πριν την έναρξη της θεραπείας (1 η -21 η ΗΜΕ), έγινε με το paired-t-τεστ. Επιπρόσθετα, σε ότι αφορά στην ALP, με την ίδια μέθοδο συγκρίθηκε η δραστηριότητά της κατά τη διάρκεια της θεραπευτικής αγωγής σε σχέση με την περίοδο μετά την ολοκλήρωση της αγωγής (42 η -98 η ΗΜΕ). Η σύγκριση της συγκέντρωσης των χολικών οξέων των σκύλων της ομάδας Α κατά τη διάρκεια της θεραπείας με ριφαμπικίνη (21 η -42 η HME) με τις περιόδους πριν την πειραματική μόλυνση, μετά τον ενοφθαλμισμό αλλά πριν την έναρξη της θεραπείας (1 η -21 η ΗΜΕ) και μετά το τέλος της θεραπευτικής αγωγής (42 η -98 η ΗΜΕ) πραγματοποιήθηκε με το Wilkoxon Signed Rank τεστ. Οι αναλύσεις έγιναν ξεχωριστά για κάθε ένα από τα δύο δείγματα χολικών οξέων (πριν και μετά την κατανάλωση γεύματος). Τα τεστ Cohen s Kappa και MacNemar χ 2 χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση της συμφωνίας των αποτελεσμάτων των δύο μεθόδων PCR που εφαρμόστηκαν στη μελέτη, τόσο ως προς το είδος του εξεταζόμενου ιστού (ολικό αίμα, ΜΟ, σπλήνας) όσο και σε επίπεδο σκύλου (ανεξάρτητα από τον εξεταζόμενο ιστό). Η σύγκριση της διαγνωστικής ευαισθησίας (η συχνότητα θετικών αποτελεσμάτων κατά τη διάρκεια της μελέτης) των τριών ιστών (αίμα, ΜΟ, σπλήνας), ανεξάρτητα από την μέθοδο PCR με την οποία εξετάστηκαν, πραγματοποιήθηκε με τα τεστ Cochran s Q και MacNemar. Όλες οι αναλύσεις έγιναν με το πρόγραμμα Stata Statistical Software Release 9.2 (College Station, TX, USA; StataCorp LP, 2006) και το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο 5%. Λόγω των μικρών μεγεθών δείγματος όλες οι τιμές p υπολογίστηκαν με ακριβείς και όχι προσεγγιστικές μεθόδους. [59]

60 [60]

61 ΜΕΡΟΣ ΤΡΙΤΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Α) ΦΑΡΜΑΚΟΚΙΝΗΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ Η συγκέντρωση της ριφαμπικίνης στο πλάσμα του αίματος στους 4 σκύλους της ομάδας Α που εξετάστηκαν κατά τη διάρκεια της θεραπευτικής αγωγής διατηρήθηκε σε όλες τις χρονικές στιγμές (21 η, 28 η, 35 η και 42 η ΗΜΕ) πάνω από τη μέση ανασταλτική συγκέντρωση για την E. canis (Πίνακες 3 και 4). Πίνακας 3. Συγκεντρώσεις [(Cmax -Cmin(24h)] μg/ml της ριφαμπικίνης σε 4 μολυσμένους σκύλους κατά τη διάρκεια της θεραπευτικής αγωγής της μελέτης. ΣΚΥΛΟΣ 1 ΣΚΥΛΟΣ 2 ΣΚΥΛΟΣ 3 ΣΚΥΛΟΣ 4 21 η HME 12,34 (3,02) 12,73 (2,81) 15,33 (4,56) 12,46 (4,65) 28 η HME 17,11 (3,97) 15,03 (5,65) 21,55 (6,52) 19,66 (6,67) 35 η HME 21,65 (3,02) 18,60 (3,06) 22,32 (5,67) 21,94 (6,26) 42 η HME 19,11 (3,55) 19,22 (3,74) 21,73 (4,41) 24,13 (6,75) Cmax: μέγιστη συγκέντρωση στο αίμα, Cmin (24h): ελάχιστη συγκέντρωση στο αίμα (24 ώρες μετά τη χορήγηση), HME: Ημέρα μετά τον ενοφθαλμισμό *21 η ΗΜΕ: Έναρξη θεραπείας με ριφαμπικίνη Πίνακας 4. Συγκεντρώσεις Cmax (μg/ml, Μ.Ο±Τ.Α.) της ριφαμπικίνης σε 4 σκύλους μολυσμένους κατά τη διάρκεια της θεραπευτικής αγωγής της μελέτης. 21 η HME 28 η HME 35 η HME 42 η HME Cmax (μg/ml) 13,10 ±1,18 18,31±2,81 20,26 ± 2,11 20,55 ± 2,40 Cmin (μg/ml) 3.79± ± ± ±1.47 Cmax: μέγιστη συγκέντρωση στο αίμα, Cmin (24h): ελάχιστη συγκέντρωση στο αίμα (24 ώρες μετά τη χορήγηση), HME: Ημέρα μετά τον ενοφθαλμισμό *21 η ΗΜΕ: Έναρξη θεραπείας με ριφαμπικίνη [61]

62 Β) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΡΙΦΑΜΠΙΚΙΝΗΣ 1. ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ Μετά την πειραματική μόλυνση και μέχρι την 21 η ΗΜΕ, οι 14 μολυσμένοι σκύλοι εμφάνισαν συμπτώματα συμβατά με τη ΜΕΣ (διάμεση τιμή αθροιστικής κλινικής βαθμολόγησης: 3, εύρος: 2-4). Συγκεκριμένα, τα κλινικά συμπτώματα που παρατηρήθηκαν ήταν πυρετός (13/14, 92,9%), ψηλαφήσιμη σπληνομεγαλία (10/14, 71,4%), περιφερική λεμφογαγγλιομεγαλία (8/14, 57,1%), ανορεξία (4/14, 28,6%), κατάπτωση (4/14, 28,6%), ωχρότητα των βλεννογόνων (2/14, 14,3%) και παρουσία πετεχειών στο στοματικό βλεννογόνο (1/14, 7,1%). Tα συμπτώματα που εμφάνισαν οι σκύλοι των ομάδων Α και Β καθώς και οι διάμεσες τιμές της αθροιστικής κλινικής βαθμολόγησης που προέκυψαν κατά τη διάρκεια της μελέτης παρατίθενται αναλυτικά στους Πίνακες 5 και 6. Οι δύο σκύλοι που δε μολύνθηκαν (Ομάδα Γ) παρέμειναν κλινικά υγιείς σε όλο το χρονικό διάστημα της μελέτης (διάμεση τιμή αθροιστικής βαθμολόγησης 0, εύρος τιμών 0-1). Δεν διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στις ομάδες Α και Β ως προς την αθροιστική κλινική βαθμολόγηση, κατά τις χρονικές περιόδους μετά τον ενοφθαλμισμό και πριν την έναρξη της θεραπευτικής αγωγής με ριφαμπικίνη (1 η -21 η ΗΜΕ, p=0,6381), κατά τη διάρκεια της χορήγησης της ριφαμπικίνης στην ομάδα Α (22 η -42 η ΗΜΕ, p= 0,1011) όσο και μετά το τέλος της θεραπείας ως την ολοκλήρωση της μελέτης (43 η -98 η ΗΜΕ, p=0,1291). Η κλινική βαθμολόγηση δεν διέφερε επίσης μεταξύ των ίδιων ομάδων, κατά τις χρονικές στιγμές της έναρξης της θεραπείας (21 η ΗΜΕ, p=0,4211), της ολοκλήρωσης της θεραπείας (42 η ΗΜΕ, p=0,0892) και της ολοκλήρωσης της μελέτης (98 η ΗΜΕ, p=0,1605). [62]

63 Πίνακας 5: Ευρήματα της κλινικής εξέτασης των 14 μολυσμένων σκύλων (Ομάδα Α και Β) κατά τη διάρκεια της μελέτης Σύμπτωμα Xρονική περίοδος*/ Συχνότητα εμφάνισης σε κάθε ομάδα** 1 η -21 η ΗΜΕ 21 η ΗΜΕ 22 η -42 η ΗΜΕ 42 η ΗΜΕ 43 η -98 η ΗΜΕ 98 η ΗΜΕ Α Β Α Β Α Β Α Β Α Β Α Β Ανορεξία 2/5 2/9 1/5 1/9 0/5 0/9 0/5 0/9 0/5 0/9 0/5 0/9 Κατάπτωση 1/5 3/9 0/5 2/9 0/5 0/9 0/5 0/9 0/5 0/9 0/5 0/9 Πυρετός 5/5 8/9 0/5 2/9 0/5 2/9 0/5 0/9 1/5 2/9 0/5 0/9 Λεμφογαγγλιομεγαλία 2/5 6/9 1/5 3/9 1/5 2/9 0/5 0/9 0/5 0/9 0/5 0/9 Αιμορραγική διάθεση 0/5 1/9 0/5 0/9 0/5 0/9 0/5 0/9 0/5 0/9 0/5 0/9 Ωχρότητα 1/5 1/9 0/5 0/9 0/5 0/9 0/5 0/9 0/5 1/9 0/5 0/9 βλεννογόνων Σπληνομεγαλία 5/5 5/9 4/5 5/9 1/5 6/9 1/5 2/9 1/5 5/9 0/5 3/9 * 1 η -21 η ημέρα μετά τον ενοφθαλμισμό (ΗΜΕ): πριν την έναρξη της θεραπείας με ριφαμπικίνη, 21 η ΗΜΕ: Έναρξη της θεραπευτικής αγωγής, 22 η -42 η ΗΜΕ: κατά τη διάρκεια της θεραπείας, 42 η ΗΜΕ: τέλος θεραπευτικής αγωγής, 43 η -98 η ΗΜΕ: περίοδος παρακολούθησης μετά το τέλος της θεραπείας, 98 η ΗΜΕ: τέλος της μελέτης. **Ομάδα Α: Μολυσμένοι σκύλοι στους οποίους χορηγήθηκε θεραπεία με ριφαμπικίνη (n=5), Ομάδα Β: Μολυσμένοι μάρτυρες (n=9). Οι δύο μη μολυσμένοι μάρτυρες (ομάδα Γ) παρέμειναν κλινικά υγιείς σε όλη τη διάρκεια της μελέτης. Πίνακας 6: Αθροιστική κλινική βαθμολόγηση των 14 μολυσμένων σκύλων (Ομάδα Α και Β) κατά τη διάρκεια της μελέτης Διάμεση τιμή της αθροιστικής κλινικής βαθμολόγησης (εύρος τιμών) ΗΜΕ* Ομάδα Α** (n=5) Ομάδα Β** (n=9) 1 η -21 η 7 (6-13) 9 (4-12) 7 η 0 (0-1) 0 (0-2) 14η 1 (0-1) 1 (0-2) 21 η 1(1-2) 1 (0-4) 22 η -42 η 0 (0-3) 1 (0-9) 42 η 0 (0-0) 0 (0-1) 43 η -98 η 0 (0-2) 1 (0-11) 98 η 0 (0-0) 0 (0-1) *1 η -21 η ημέρα μετά τον ενοφθαλμισμό (ΗΜΕ): πριν την έναρξη της θεραπείας με ριφαμπικίνη, 21 η ΗΜΕ: Έναρξη της θεραπευτικής αγωγής, 22 η -42 η ΗΜΕ: κατά τη διάρκεια της θεραπείας, 42 η ΗΜΕ: τέλος θεραπευτικής αγωγής, 43 η -98 η ΗΜΕ: περίοδος παρακολούθησης μετά το τέλος της θεραπείας, 98 η ΗΜΕ: τέλος της μελέτης. **Ομάδα Α: Μολυσμένοι σκύλοι στους οποίους χορηγήθηκε θεραπεία με ριφαμπικίνη (n=5), Ομάδα Β: Μολυσμένοι μάρτυρες (n=9). Οι δύο μη μολυσμένοι μάρτυρες (Ομάδα Γ) παρέμειναν κλινικά υγιείς σε όλη τη διάρκεια της μελέτης. [63]

64 2. ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ 2.1 Μεταβολές του αιματοκρίτη Η διάμεση τιμή του αιματοκρίτη πριν από τον ενοφθαλμισμό και κατά τη διάρκεια της μελέτης καθώς και η συχνότητα εμφάνισης αναιμίας στους σκύλους των 3 ομάδων παρουσιάζονται στον Πίνακα 7 και το Διάγραμμα 1. Πίνακας 7: Διάμεση τιμή του αιματοκρίτη και συχνότητα της αναιμίας στους σκύλους των 3 ομάδων κατά τη διάρκεια της μελέτης Χρονική στιγμή Ημέρα 0 48,9 (46,5-50,8) 7 η ΗΜΕ 41,1 (39,5-45,1) 14 η ΗΜΕ 33,4 (28,6-38,4) 21 η ΗΜΕ 42,9 (39,2-43,5) 28 η ΗΜΕ 40,6 (37,9-47,9) 35 η ΗΜΕ 46,3 (43,6-49,9) 42 η ΗΜΕ 49,9 (45,5-50,8) 56 η ΗΜΕ 50 (46-52,7) 70 η ΗΜΕ 46,4 (43-50,2) 84 η ΗΜΕ 45,2 (43-50,2) 98 η ΗΜΕ 50,8 (48,8-52,7) Διάμεση τιμή του αιματοκρίτη (εύρος τιμών) (%)* Συχνότητα αναιμίας (%) Ομάδα Α Ομάδα Β Ομάδα Γ 43,5 (34,5-49,8) 44,8 (39,2-50,4) 0/9 (22,2%) 0/2 (0%) 40,2 (37,5-48,3) 46,95 (42,5-51,4) 0/9 (0%) 0/2 (0%) 34,9 (30,2-38,8) 43,65 (38,4-48,9) 4/5 (80%) 8/9 (88,9%) 0/2 (0%) 35,2 (30,2-42,7) 5/9 (55,6%) 40,7 (35,6-45,6) 1/9 (11,1%) 44,2 (38,7-51,2) 47,45 (47,2-47,7) 0/9 (0%) 0/2 (0%) 45,5 (39,4-51) 0/9 (0%) 44,3 (35-52,5) 46,3 (42,7-49,9) 1/9 (11,1%) 0/2 (0%) 39,3 (35,6-47,1) 3/9 (33,3%) 45,2 (43-48,6) 0/9 (0%) 49,75 (49,5-50) 0/2 (0%) Ομάδα Α: Μολυσμένοι σκύλοι στους οποίους χορηγήθηκε θεραπεία με ριφαμπικίνη (n=5), Ομάδα Β: Μολυσμένοι μάρτυρες (n=9), Ομάδα Γ: Μη μολυσμένοι μάρτυρες (n=2). Ημέρα 0: Πριν τον ενοφθαλμισμό, 21 η ημέρα μετά τον ενοφθαλμισμό (ΗΜΕ): έναρξη θεραπείας με ριφαμπικίνη της ομάδας Α, 42 η ΗΜΕ: τέλος της θεραπευτικής αγωγής *Εύρος φυσιολογικών τιμών: 37,1-55% (> 30% για σκύλους ηλικίας <4 μηνών), : Δεν έγιναν εξετάσεις. [64]

65 Αιματοκρίτης (%) Διάγραμμα 1: Διακύμανση της διάμεσης τιμής του αιματοκρίτη των 3 ομάδων κατά τη διάρκεια της μελέτης * * * Ομάδα Α Ομάδα Β Ομάδα Γ Κ.Φ.Τ Χρονική στιγμή (εβδομάδες μετά τον ενοφθαλμισμό) Ομάδα Α: Μολυσμένοι σκύλοι στους οποίους χορηγήθηκε θεραπεία με ριφαμπικίνη (n=5), Ομάδα Β: Μολυσμένοι μάρτυρες (n=9), Ομάδα Γ: Μη μολυσμένοι μάρτυρες (n=2). Κ.Φ.Τ.: Κατώτερη φυσιολογική τιμή του αιματοκρίτη σε σκύλους ηλικίας > 4 μηνών. *Στατιστικά σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ των ομάδων Α και B. H διάμεση τιμή του αιματοκρίτη πριν την πειραματική μόλυνση, διέφερε σημαντικά ανάμεσα στις ομάδες των μολυσμένων σκύλων (p=0,019), με την ομάδα Α να εμφανίζει υψηλότερες τιμές (διάμεση 48,9%, εύρος 46,5-50,8%) σε σχέση με την ομάδα Β (διάμεση 43,5%, εύρος 34,5-49,8%). Στο χρονικό διάστημα από τον ενοφθαλμισμό μέχρι τη 14 η ΗΜΕ, 12/14 (86%) από τους μολυσμένους σκύλους (4 σκύλοι της ομάδας Α και 8 της ομάδας Β) εμφάνισαν ήπιου ως μέτριου βαθμού αναιμία. Την 21 η ΗΜΕ, 5 μόνο σκύλοι που ανήκαν στην ομάδα Β παρέμεναν αναιμικοί. Όλοι οι σκύλοι της ομάδας Α διατήρησαν φυσιολογικές τιμές του αιματοκρίτη από την 21 η ΗΜΕ μέχρι το τέλος της μελέτης. Αντίθετα, από τους σκύλους της ομάδας Β, 4 σκύλοι εμφάνισαν αναιμία σε κάποιες χρονικές στιγμές της ίδιας χρονικής περιόδου, ωστόσο, κανείς από αυτούς τους σκύλους δεν παρέμενε αναιμικός στο τέλος της μελέτης (98 η HME). Σε κάθε περίπτωση, η αναιμία ήταν ορθοκυτταρική και ορθόχρωμη. Ο αιματοκρίτης των σκύλων της ομάδας Γ ήταν εντός των φυσιολογικών ορίων σε όλη τη διάρκεια της μελέτης. Κατά τη σύγκριση [65]