ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΕΛΑΦΡΩΝ ΑΛΥΣΕΩΝ ΣΤΟΝ ΟΡΟ ΚΑΙ ΣΤΑ ΟΥΡΑ. Χρυσούλα Νικολάου

Transcript

1 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΕΛΑΦΡΩΝ ΑΛΥΣΕΩΝ ΣΤΟΝ ΟΡΟ ΚΑΙ ΣΤΑ ΟΥΡΑ Χρυσούλα Νικολάου

2 Μονοκλωνικές ελεύθερες ελαφρές αλύσεις Οι μονοκλωνικές ελεύθερες ελαφρές αλύσεις οι οποίες είναι γνωστές ως πρωτεΐνη Bence Jones, είναι ομοιογενείς πληθυσμοί κάπα (κ) ή λάμδα (λ) ελαφρών αλύσεων ανοσοσφαιρινών, οι οποίες παράγονται από παθολογικούς κλώνους Β-κυττάρων (νεοπλασματικά πλασματοκύτταρα ). Dr. Henry Bence Jones English physician and chemist ( ) 1848: protein Bence Jones first biochemical tumor marker

3 Σημασία των ελεύθερων ελαφρών αλύσεων Οι μονοκλωνικές ελεύθερες ελαφρές αλύσεις αποτελούν σημαντικό δείκτη για τη διάγνωση και παρακολούθηση ασθενών με πολλαπλό μυέλωμα ελαφρών αλύσεων (LCMM), ασθενών με μη εκκριτικό μυέλωμα (NSMM) ασθενών με αμυλοείδωση ελαφρών αλύσεων (AL) καθώς και ασθενών με άλλες μονοκλωνικές γαμμαπάθειες.

4 Πως παράγονται οι ελεύθερες ελαφρές αλύσεις? κ λ κ κ λ

5 Ανοσοσφαιρίνες και Μονοκλωνικές Πρωτεΐνες Οι ανοσοσφαιρίνες (και οι μονοκλωνικές πρωτεΐνες) παράγονται από διάφορους τύπους πλασματοκυτάρων.

6 Ανοσοσφαιρίνες και Μονοκλωνικές Πρωτεΐνες Κάθε τύπος πλασματοκυττάρων παράγει μόνο μια τάξη ανοσοσφαιρινών (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE). Κάθε μόριο μιας ανοσοσφαιρίνης αποτελείται από δύο βαριές και δύο ελαφρές αλύσεις

7 Κάθε πλασματοκύτταρο παράγει μόνο ένα τύπο βαριάς και ένα τύπο ελαφράς αλύσου. Οι βαριές και οι ελαφρές αλύσεις δημιουργούνται ξεχωριστά μέσα στο πλασματοκύτταρο και στη συνέχεια διαμορφώνεται ολόκληρο το μόριο της ανοσοσφαιρίνης.

8 Ελαφρές αλύσεις συνδεδεμένες και ελεύθερες Οι ελαφρές αλύσεις όταν συνδέονται με τις βαριές ονομάζονται συνδεδεμένες. Όταν όμως δεν συνδέονται με τις βαριές αλύσεις ονομάζονται ελεύθερες ελαφρές αλύσεις.

9 Ελεύθερες ελαφρές αλύσεις Για άγνωστους λόγους τα πλασματοκύτταρα παράγουν περισσότερες ελαφρές αλύσεις από αυτές που απαιτούνται ώστε να δημιουργηθεί ένα ολοκληρωμένο μόριο ανοσοσφαιρίνης ή μια μονοκλωνική πρωτεΐνη. Η περίσσεια των ελαφρών αλύσεων εισέρχεται στο αίμα όπου και κυκλοφορούν σαν ελεύθερες ελαφρές αλύσεις σε φυσιολογικά άτομα και σε ασθενείς με μυέλωμα και όσες δεν καταβολίζονται στα εγγύς νεφρικά σωληνάρια αποβάλλονται με τα ούρα. Φυσιολογικά FLC -κ: mg/l FL-λ: mg/l Λόγος: κ/λ Επίπεδα Ορός 3,3-19,4 5,7-26,3 0,26-1,65 Ούρα 0,41-15,1 0,8-10,1 0,46-400

10 Προσδιορισμός και κλινική αξία ελεύθερων ελαφρών αλύσεων Η παρουσία μονοκλωνικών ελεύθερων ελαφρών αλύσεων αποτελεί αξιόλογο δείκτη για τη διάγνωση και παρακολούθηση ασθενών με πολλαπλό μυέλωμα ελαφρών αλύσεων (LCMM), με αμυλοείδωση ελαφρών αλύσεων (AL), με μη εκκριτικό μυέλωμα (NSMM) καθώς και ασθενών με πολλαπλό μυέλωμα ολόκληρης ανοσοσφαιρίνης.

11 Πολλαπλό μυέλωμα (ΠΜ) Το πολλαπλό μυέλωμα οφείλεται σε κακοήθεια των πλασματοκυττάρων του μυελού των οστών. Ενας κλώνος πλασματοκυττάρων αναπαράγεται συνεχώς με αποτέλεσμα την υπερπαραγωγή ενός τύπου ανοσοσφαιρίνης η οποία αναφέρεται ως μονοκλωνική πρωτεϊνη ή Μ-πρωτεϊνη ή παραπρωτεϊνη

12 Πολλαπλό μυέλωμα (ΠΜ) Το ΠΜ προσβάλλει κυρίως άτομα ηλικίας >65 ετών, (μόνο 15% είναι <50 ετών). Φυσιολογικά, τα πλασματοκύτταρα του μυελού είναι <4%, ενώ στους ασθενείς με ΠΜ συνήθως υπερβαίνουν το 30%. Όταν τα πλασματοκύτταρα του μυελού είναι <30% η ανίχνευση ελεύθερων ελαφρών αλυσίδων στα ούρα είναι δυνατόν να μη συνοδεύεται από την παρουσία μονοκλωνικής πρωτεΐνης στον ορό (13%). Ασθενείς με πρωτεϊνουρία Bence-Jones (>1 g/24 h), κατά κανόνα, πάσχουν από μυέλωμα. Σπανίως (2%), το μυέλωμα είναι δυνατόν να μη συνοδεύεται από την εμφάνιση μονοκλωνικής πρωτεΐνης στο ορό ή στα ούρα (μη εκκριτικό μυέλωμα).

13 Εργαστηριακός έλεγχος ασθενών με ΠΜ Mayo Clinic serum urine Ο κλασικός τρόπος ανίχνευσης παραπρωτεΐνης στον ορό ή/και στα ούρα γίνεται με SPE/IFE και αποτελεί πρώιμο δείκτη κακοήθειας και βασικό στοιχείο διάγνωσης και παρακολούθησης ασθενών.

14 Ανίχνευση ολόκληρου μορίου μονοκλωνικής aνοσοσφαιρίνης σε ασθενείς με ΠΜ Αν με την ηλεκτροφόρηση και ανοσοκαθήλωση δεν ανιχνευθεί ολόκληρο μόριο μονοκλωνικής ανοσοσφαιρίνης αλλά ανιχνευθούν μόνο μονοκλωνικές ελαφρές αλύσεις (D) τότε ακολουθεί περαιτέρω έλεγχος. normal

15 Ανίχνευση ελεύθερων ελαφρών αλύσεων στον ορό Ο έλεγχος αυτός γίνεται με τη χρήση αντιορών για IgD και IgE καθώς και FLC-κ και FLC-λ : SPE G A M free-κ free-λ D E Αν δεν ανιχνευθεί παραπρωτεΐνη IgD ή IgE και και ένας εκ των δύο αντιορών FLC-κ ή FLC-λ εμφανίσει μονοκλωνική ζώνη τίθεται η διάγνωση ΠΜ ελεύθερων ελαφρών αλύσεων

16 Ανίχνευση ελεύθερων ελαφρών αλύσεων στα ούρα Η ανίχνευση ελεύθερων ελαφρών αλύσεων στα ούρα γίνεται με ηλεκτροφόρηση/ ανοσοκαθήλωση (ευαισθησία σε συμπυκνωμένα ούρα 5-30mg/L) Μειονεκτήματα Συλλογή ούρων 24ώρου Συμπύκνωση πριν τη δοκιμασία Εκτέλεση χρονοβόρα Αποτέλεσμα όχι πάντα σαφές

17 Ανίχνευση ελεύθερων ελαφρών αλύσεων στα ούρα * Επιπρόσθετα θα πρέπει να εκτιμηθεί ότι τα νεφρικά σωληνάρια μπορούν να καταβολίσουν >30g/ημέρα FLC και αυτό έχει αρνητικό αντίκτυπο στη μέτρηση των FLC στα ούρα όταν η σύνθεση τους είναι χαμηλή. Τα μειονεκτήματα αυτά έδειξαν ότι ο προσδιορισμός των FLC στον ορό είναι προτιμότερος αλλά οι μεθοδολογίες SPE και IFE δεν είναι τόσο ευαίσθητες ώστε να ανιχνεύουν τις FLC σε όλους τους ασθενείς.

18 Σύγκριση μεθόδων για τον προσδιορισμό ελεύθερων ελαφρών αλύσεων Ηλεκτροφόρηση Ορού Ηλεκτροφόρηση Ούρων Ανοσοκαθήλωση Ορού/Ούρων Τριχοειδική Ηλεκτροφόρηση Μέτριση ολικών κ/λ αλύσεων Πλεονεκτήματα Απλή ημιαυτόματη μέθοδος Ορατές μονοκλωνικές ζώνες Ποσοτικά αποτελέσματα με scanning Απλή ημιαυτόματη μέθοδος Ορατές μονοκλωνικές ζώνες Ευαισθησία σε συμπυκνωμένα ούρα (10-20 mg/l) Καλή ευαισθησία στον ορό πολύ καλή σε συμπυκνωμένα ούρα (5-30 mg/l) Νέα αυτοματοποιημένη τεχνολογία. Ποσοτικά αποτελέσματα Αυτοματοποιημένη ανοσομέθοδος Μειονεκτήματα Μικρή ευαισθησία ( mg/l). Ανιχνεύει FLC όταν έχει συγκέντρωση 50 φορές > φυσιολογικά επίπεδα. Υποκειμενική εκτίμηση. Συλλογή 24ώρου. Συμπύκνωση. Ψευδείς ζώνες από συμπύκνωση. Σε βαριά πρωτεϊνουρία ασαφή αποτελέσματα Όχι ποσοτική. Ευαισθησία ορού 150 mg/l. Ανιχνεύει FLC 15 φορές > φυσιολογικά επίπεδα. Ευαισθησία 400 mg/l χαμηλότερη από την IFE ορού. Ανιχνεύει το 5% των θετικών Ευαισθησία >1000 mg/l ανεπαρκής για προσδιορισμό ΠΜ FLC

19 Ποσοτικός προσδιορισμός ελεύθερων ελαφρών αλύσεων στον ορό Τα τελευταία χρόνια χρησιμοποιούνται εναλλακτικά αυτοματοποιημένες ανοσομέθοδοι βασισμένες στη θολοσιμετρία και νεφελομετρία για τον ποσοτικό προσδιορισμό των FLC στον ορό. Σήμερα οι μέθοδοι αυτές έχουν αξιολογηθεί για την ευαισθησία και την ακρίβειά τους και εφαρμόζονται σε πολλά κλινικά εργαστήρια με τη χρήση διάφορων αναλυτών (Immage, BN II, Hitachi, Olympus). Ευαισθησία FLC-κ FLC-λ Εκτίμηση κλωνικότητας SPE mg/l mg/l Ζώνες στη γέλη IFE mg/l mg/l Ζώνες στη γέλη FLC serum 1.0 mg/l 2.0 mg/l Αριθμητικός λόγος: κ/λ

20 Ποσοτικός προσδιορισμός ελεύθερων ελαφρών αλύσεων στον ορό με αυτοματοποιημένη ανοσομέθοδο Είναι δυνατή η ανίχνευση FLC σε συγκεντρώσεις χαμηλότερες των φυσιολογικών επίπεδων. Γεγονός που επιτρέπει την ανίχνευσή των FLC σε πρώιμα στάδια του ΠΜ όπου ακόμη δεν προσδιορίζονται με SPE και IFE.

21 Κλινική σημασία του ποσοτικού προσδιορισμού ελεύθερων ελαφρών αλύσεων στον ορό με αυτοματοποιημένη ανοσομέθοδο Ταξινόμηση 1026 ασθενών με πολλαπλό μυέλωμα με βάση την τυποποίηση της ανοσοσφαιρίνης Mayo Clinic

22 Κλινική σημασία του ποσοτικού προσδιορισμού ελεύθερων ελαφρών αλύσεων στον ορό με αυτοματοποιημένη ανοσομέθοδο * * Διάγνωση ασθενών με χαμηλά επίπεδα μονοκλωνικής πρωτεΐνης (π.χ. παραγωγή ελαφρών αλύσεων σε ασθενείς με υπογαμμασφαιριναιμία). Παρακολούθηση της ενεργότητας της νόσου. Πρώιμη ένδειξη απάντησης στη θεραπεία ή πρώιμη ένδειξη υποτροπής

23 Κλινική σημασία της ποσοτικής μέτρησης ελεύθερων ελαφρών αλύσεων στον ορό ασθενών με ΠΜ Διάγνωση ασθενών με μη εκκριτικό ΠΜ (NSMM) (3%) όταν όλες οι άλλες δοκιμασίες SPE/IFE στον ορό ή στα ούρα δεν ανιχνεύουν μονοκλωνικές πρωτεΐνες. Αυξημένες τιμές FLC στον ορό θέτουν τη διάγνωση ασθενών με ΠΜ ελαφρών αλύσεων (LCMM) (15%) χωρίς να είναι απαραίτητες δοκιμασίες ούρων. Αλλά και ασθενείς με ΠΜ ολόκληρου μορίου μονοκλωνικής ανοσοσφαιρίνης παρουσιάζουν κατά 95% αυξημένες τιμές FLC σε ποσοτική μέτρηση του ορού.

24 Κλινική σημασία της ποσοτικής μέτρησης ελεύθερων ελαφρών αλύσεων στον ορό ασθενών με ΠΜ Συνεχόμενες μετρήσεις των FLC του ορού μπορούν να είναι χρήσιμες σε όλους τους ασθενείς με ΠΜ σε ότι αφορά την απάντηση στη θεραπεία. Γιατί η ημίσεια ζωή των FLC του ορού είναι πιο πολύ σύντομη (2-4 ώρες) από ότι το ολόκληρο μόριο της παραπρωτεϊνης π.χ. (IgG =3 εβδομάδες) έτσι η απάντηση στη θεραπεία μπορεί να προσδιορισθεί σε ώρες ή ημέρες και όχι σε εβδομάδες.

25 Κλινική σημασία της ποσοτικής μέτρησης ελεύθερων ελαφρών αλύσεων στον ορό ασθενών με ΑL αμυλοείδωσης Αμυλοείδωση ελαφρών αλύσεων (Al Αmyloidosis). Μονοκλωνικές ελεύθερες ελαφρές αλύσεις που ευκαιριακά μπορεί να σχηματίσουν πολυμερή καθιζάνουν στους ιστούς προκαλώντας αμυλοείδωση. Οι ασθενείς έχουν μέσο όρο επιβίωσης 12 μήνες και ο θάνατος οφείλεται σε ανεπάρκεια της καρδιά, των νεφρών ή του ήπατος. Οι FLC προέρχονται συνήθως από κυτταροπλασματικό κλώνο που έχει αργή ανάπτυξη και η μονοκλωνική ζώνη μπορεί να μην ανιχνεύεται από τη συμβατική ηλεκτροφόρηση στο 10-30% των ασθενών. Η ποσοτική μέτρηση των FLC μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση της κατάστασης του ασθενούς, ενώ η μείωση των επιπέδων FLC στον ορό είναι ο καλύτερος δείκτης μακροπρόθεσμης επιβίωσης.

26 Κλινική σημασία της μέτρησης FLC στον ορό ασθενών με ακαθόριστης σημασίας μονοκλωνική γαμμαπάθεια (MGUS) Η πλειονότητα των μονοκλωνικών γαμμαπαθειών με ολόκληρο μόριο ανοσοσφαιρίνης που διαγιγνώσκονται ηλεκτροφορητικά είναι ακαθόριστης κλινικής σημασίας. Σ αυτούς τους ασθενείς ο κίνδυνος εξέλιξης σε ΠΜ, ή άλλες δυσκρασίες των Β κυττάρων είναι περίπου 1% το χρόνο, και 30 φορές περισσότερο από ότι στα φυσιολογικά άτομα. Άτομα με μονοκλωνική πρωτεΐνη 30 g/l έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα να αναπτύξουν ΠΜ από ότι άτομα με χαμηλές συγκεντρώσεις. Οι ελαφρές ελεύθερες αλύσεις στη MGUS δεν έχει προσδιοριστεί αν προκαλούν ΠΜ ελαφρών αλύσεων. Το γεγονός αυτό εξηγείται από το ότι οι συγκεντρώσεις των FLC αλύσεων του ορού σε FLC MGUS είναι χαμηλές και απορροφούνται από τα νεφρικά σωληνάρια με αποτέλεσμα να μην εμφανίζονται στα ούρα.

27 Κλινική σημασία του λόγου κ/λ Όταν τα επίπεδα FLC-κ ή FLC λ είναι πολύ υψηλά, και ο λόγος δεν είναι φυσιολογικός, αυτό αφορά παρουσία μυελώματος. Έάν τα επίπεδα FLC-κ και FLC λ είναι και τα δύο αυξημένα τότε ο λόγος μπορεί να είναι φυσιολογικός. Αυτό δείχνει ότι τα επίπεδα είναι αυξημένα λόγω έκπτωσης της νεφρικής λειτουργίας με συνέπεια τη διατήρηση και των δύο τύπων ελαφρών αλύσεων μέσα στον ορό. Αυτό από μόνο του δεν συνηγορεί για παρουσία ενεργού μυέλωματος. Αντίθετα εάν τα FLC-κ και FLC λ είναι και τα δύο σε φυσιολογικά επίπεδα και ο λόγος δεν είναι φυσιολογικός, αυτό δείχνει ότι υπάρχει παρουσία χαμηλής ενεργότητας μυελώματος με παραγωγή ελεύθερης ελαφράς αλυσίδας. Εάν ο λόγος γίνεται φυσιολογικός, μετά από θεραπεία, αυτό απεικονίζει ιδιαίτερα καλή ύφεση της νόσου που μπορεί να συσχετιστεί με μακροχρόνια εξάλειψη.

28 Κλινική σημασία επιπέδων κ,λ και λόγου κ/λ

29 Πλεονεκτήματα ποσοτικής μέτρησης FLC στον ορό στη θεραπεία ασθενών με μυέλωμα 1. Η σύντομη ημίσεια ζωή των FLC ορού (2-6 ώρες) έναντι των 21 ημερών της IgG, έχει σαν αποτέλεσμα οι ασθενείς που ελέγχονται με IgG να παρουσιάζουν πιο αργή απάντηση της παραπρωτεΐνης στη θεραπεία από τους ασθενείς που ελέγχονται με FLC. 2. Δεδομένου ότι δεν υπάρχει κανένας συσχετισμός μεταξύ των ποσοστών παραγωγής των διαφορετικών μορίων, μερικοί ασθενείς παράγουν αρκετά υψηλά επίπεδα FLC αλλά σχετικά μικρές ποσότητες των ολόκληρων ανοσοσφαιρινών. Σε αυτούς τους ασθενείς, οι FLC του ορού μπορεί να μετρηθούν ευκολότερα και ακριβέστερα, σε σύγκριση με τις αχνές IgG ζώνες στα πηκτώματα ηλεκτροφόρησης. 3. Μερικοί ασθενείς δεν έχουν παθολογικά ευρήματα με τις συμβατικές δοκιμασίες ηλεκτροφόρησης αλλά έχουν αυξημένες συγκεντρώσεις FLC στον ορό οι οποίες αποτελούν ένδειξη για περαιτέρω θεραπεία.

30 Πρωτόκολλα προσδιορισμού ελεύθερων ελαφρών αλύσεων

31 Συμπέρασμα Ο προσδιορισμός των ελεύθερων ελαφρών αλύσεων γίνεται με τις κλασικές μεθόδους SPE/IFE ορού και ούρων. Παράλληλα θα πρέπει να εκτελείται ο ποσοτικός προσδιορισμός των επιπέδων των ελεύθερων ελαφρών αλύσεων του ορού και του λόγου κ/λ διότι έχει σημαντική αξία στη διαγνωστική προσέγγιση του μυελώματος FLC, ενώ παράλληλα αποτελεί πρώιμη ένδειξη απάντησης στη θεραπεία ή πρώιμη ένδειξη υποτροπής.