Διπλωματική Εργασία. Ατσοπάρδη Κορίνα ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΝΘΡΩΠΟΥ & ΖΩΩΝ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΝΘΡΩΠΟΥ & ΖΩΩΝ Διπλωματική Εργασία Μελέτη της επίδρασης εκχυλίσματος της πόας Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca σε συμπεριφορικούς και βιοχημικούς δείκτες εγκεφαλικών περιοχών ενήλικων και γηραιών μυών ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ: ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Ατσοπάρδη Κορίνα Πάτρα Φεβρουάριος 2017

2 Τριμελής Επιτροπή Μαριγούλα Μαργαρίτη (Επιβλέπουσα Καθηγήτρια) Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Φυσιολογίας Ανθρώπου και Ζώων, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών Γρηγόριος Ιατρού Ομότιμος Καθηγητής του τμήματος Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών Φωτεινή Λάμαρη Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Φαρμακολογίας, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών [i]

3 [ii] Αφιερωμένο στην οικογένεια μου

4 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η ιστορία της παρούσας διπλωματικής εργασίας ξεκινά δύο χρόνια πριν, στον τρίτο όροφο του τμήματος Βιολογίας, σε ένα μικρό αλλά γεμάτο ζωντάνια γραφείο παντού διακοσμημένο με τον γνωστό μας άγνωστο.τον εγκέφαλο μας. Σε αυτό το γραφείο μετά από μια συνάντηση με την κ.μαργαρίτη, Αναπληρώτρια του Τμήματος Βιολογίας ξεκίνησε ένα καινούριο ταξίδι στον κόσμο των Νευροεπιστημών. Σε αυτό το ταξίδι πολύτιμη ήταν η παρουσία του κ. Γρ. Ιατρού, Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας και φυσικά της κ. Φ. Λάμαρη, Επίκουρη καθηγήτρια του Τμήματος Φαρμακευτικής. Με την παρούσα εργασία αυτό το ταξίδι φτάνει στο τέλος του, αλλά θα αφήσει πίσω του τις αναμνήσεις και τις γνώσεις που απλόχερα μου πρόσφερε. Ο δρόμος για την πραγματοποίηση αυτού το ταξιδιού ήταν γεμάτος όμορφα συναισθήματα, πολύ δουλειά ευκολίες αλλά και δυσκολίες. Γνώρισα και συνεργάστηκα με σπουδαίους ανθρώπους τους οποίους πολύ θα ήθελα να ευχαριστήσω από την καρδιά μου γιατί ο καθένας με τον τρόπο του βοήθησε ώστε αυτό το ταξίδι να βρει τον προορισμό του. Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω την Καθηγήτρια μου κα. Μαριγούλα Μαργαρίτη, όχι μόνο γιατί μου έδωσε την ευκαιρία και τα εφόδια να ξεκινήσω το ταξίδι μου στον πολύπλοκο κόσμο των Νευροεπιστημών αλλά και για την παρουσία της σε αυτό. Μια παρουσία που ήταν συνεχώς δίπλα μου σαν καθηγήτρια και σαν άνθρωπος, μου παρείχε ακούραστα την πολύτιμη βοήθειά της καθ όλη τη διάρκεια του ταξιδιού μου (σπουδές, πειράματα, αναλύσεις, συνέδρια κ.α.) και με την ενέργεια της έκανε αυτό το ταξίδι ακόμα πιο όμορφο, χαρούμενο και ενδιαφέρον. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Γρηγόρη Ιατρού και την κα. Φωτεινή Λάμαρη για τη βοήθεια, τη συμπαράσταση, τις συμβουλές, τις εύστοχες παρατηρήσεις, τα αξιόλογα σχόλια και την άψογη συνεργασία μας καθ όλη τη διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών. Δεν θα μπορούσα να παραλείψω να ευχαριστήσω και τον κύριο Νίκο Παναγόπουλο, ο οποίος και αυτό σε όλη τη διάρκεια του ταξιδιού μου ήταν πάντα εκεί στο εργαστήριο για να βοηθήσει με κάθε δυνατό τρόπο. Θα ήταν παράλειψη να μην ευχαριστήσω και όλους τους συναδέλφους του Εργαστηρίου Φυσιολογίας Ανθρώπου και Ζώων για το άριστο κλίμα, την ευχάριστη ατμόσφαιρα που δημιουργούσαν καθημερινά στο εργαστήριο. Πιο συγκεκριμένα θα ήθελα να ευχαριστήσω πρώτα τον Αλέξανδρο Κοκκόση που ακόμα και αν έφυγε [iii]

5 γρήγορα από το εργαστήριο μας για να συνεχίσει το δικό του λαμπρό ταξίδι στο εξωτερικό, ήταν εκεί να βοηθήσει σε ότι χρειαστεί. Βέβαια η ατμόσφαιρα στο εργαστήριο δεν θα ήταν η ίδια χωρίς την παρουσία τριών κοριτσιών που έφεραν και αυτές τη ζωντάνια τους και τη διάθεση τους για δουλεία και γνώση στην ομάδα και πραγματικά δέσαμε σαν ομάδα. Αυτά τα τρία κορίτσια όταν και οι τρεις παρουσίασαν άψογα τις πτυχιακές τους εργασίες με αποκάλεσαν εργαστηριακή τους «μαμά» και με έκαναν περήφανη με την πορεία τους! Αριάν(ν)α, Ναταλία και Χαρά σας ευχαριστώ για την άψογη συνεργασία και τις όμορφες αναμνήσεις που θα με συνοδεύουν μια ζωή. Ένα σημαντικό κομμάτι του ταξιδιού μου, που δεν θα ήταν το ίδιο αν δεν υπήρχε, είναι οι φίλοι μου που ο καθένας με το δικό του μοναδικό και ιδιαίτερο χαρακτήρα συνέθεσαν ένα υπέροχο πάζλ που με γέμισε χαρά και δύναμη ώστε να αντιμετωπίσω οποιαδήποτε δυσκολία. (Καλλιόπη, Χριστίνα, Ρίλια, Σουζάνα, Μαριάννα, Κώστα, Χρύσα, Άρη, Νατάσα, Γιάννη σας ευχαριστώ) Το πιο βασικό κομμάτι βέβαια του ταξιδιού μου αλλά και όλων όσων πέρασαν και θα έρθουν ανήκει στην οικογένεια μου. Θα ήθελα μέσα από την καρδιά μου να ευχαριστήσω τους γονείς μου που είναι δίπλα μου σε κάθε μου βήμα και με την ανιδιοτελή αγάπη τους και συμπαράσταση μου δίνουν ώθηση να πραγματοποιήσω όλους τους στόχους και τα όνειρα μου. Ακόμα θα ήθελα να ευχαριστήσω και τον Θύμιο που είναι δίπλα μου και με στηρίζει πάντα. Σας ευχαριστώ πολύ όλους.. Ατσοπάρδη Κορίνα [iv]

6 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το φυτό Sideritis, γνωστό και ως τσάι του βουνού καταναλώνεται παραδοσιακά στην Ελλάδα ως ένα παραδοσιακό ελληνικό τσάι με πληθώρα ευεργετικών ιδιοτήτων. Το γένος Sideritis ανήκει στην οικογένεια Lamiaceae και περιλαμβάνει περίπου 150 είδη τα οποία εντοπίζονται κυρίως στην περιοχή της Μεσογείου. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν είναι να διερευνηθεί η επίδραση του εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτού Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca στην αγχώδη συμπεριφορά και στην ενεργότητα των δύο ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης εγκεφαλικών περιοχών ενηλίκων και γηραιών, αρσενικών και θηλυκών μυών. Αρχικά ερευνήθηκε ο συμπεριφορικός δείκτης άγχος/φόβος με τη δοκιμασία ανοιχτού πεδίου σε 8 ηλικιακές ομάδες: ημερών, ημερών, νεαρά (30 ημερών), ενήλικα (3-4μηνών), ενήλικα (5-6μηνών), μεσήλικα (9-10μηνών), γηραιά (12-13μηνών), γηραιά (15-16μηνών). Τα αποτελέσματα έδειξαν κλιμακούμενη μείωση του δείκτη άγχος/φόβος στις πρώτες 6 ηλικιακές ομάδες και στα δύο φύλα, ενώ στους γηραιούς μυς παρατηρήθηκε αύξηση του δείκτη. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα επιλέχτηκαν οι ενήλικες (3-4μηνών) και γηραιοί μύες (15-16μηνών) στους οποίους χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκώς το φυτικό εκχύλισμα (30 και 100 mg/kg βάρους σώματος) για 3 συνεχείς μέρες. Μετά την πάροδο 24 ωρών από την τελευταία δόση πραγματοποιήθηκε εκ νέου η δοκιμασία ανοιχτού πεδίου και παρατηρήθηκε αγχολυτική δράση του εκχυλίσματος μόνο στη δόση των 100mg/kg και στις δύο ηλικίες και φύλα. Οι μύες που τους χορηγήθηκε η συγκεκριμένη δόση επιλέχθηκαν για τη μελέτη της ενεργότητας των δύο ισομορφών (G1 και G4) της ακετυλοχολινεστεράσης (χρωματομετρική μέθοδο του Ellman) σε επιλεγμένες εγκεφαλικές τους περιοχές (παρεγκεφαλίδα, εγκεφαλικό φλοιό, ιππόκαμπο και ραβδωτό). Η χορήγηση του φυτικού εκχυλίσματος μείωσε στατιστικώς σημαντικά την ενεργότητα των δύο ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης σε παρεγκεφαλίδα και ραβδωτό και στις δύο ηλικίες ανεξαρτήτως φύλου. Ακόμα παρατηρήθηκε σημαντική μείωση της ενεργότητας των ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης στους γηραιούς μυς σε σύγκριση με τους ενήλικους. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το εκχύλισμα του οξικού αιθυλεστέρα του φυτού Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca προκαλεί αγχολυτική συμπεριφορά σε ενήλικους και γηραιούς μύες και των δύο φύλων και αναστέλλει με ιστοειδικό τρόπο την ενεργότητα της AChE εγκεφαλικών τους περιοχών. [v]

7 ABSTRACT The plant Sideritis, known as Mountain tea, has been traditionally consumed in Greece as Greek traditional tea with numerous beneficial properties. The genus Sideritis (Lamiaceae) comprises about 150 species distributed in the Mediterranenan region. The aim of the present study is to investigate the effect of the ethylacetate extract of the plant Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca on anxiety behavior and on the activity of two isoforms of acetylcholinesterase in the brain regions of adults and aged, male and female mice. Initially the behavioral index of anxiety/fear was studied with the open field test in eight age groups: a)infants (13-14 days old), b)juveniles (22-23 days old), c)early adult 1 month old, d)adult (3-4 months old), e)adult (5-6 months old), f) middle-aged (9-10 months old) and g)aged (15-16 months old). The results showed a gradient attenuation of anxiety/fear in the first five groups in both sexes, also aged mice appeared to be highly anxious. Based on the above results, the adult group (3-4 months old) and the aged group (15-16 months old) of both sexes were selected to be administered intraperitoneally of the plant extract (30 and 100 mg/kg body weight) for three consecutive days. After a 24h period of the last dose administration the open field test was repeated and anxiolytic activity of the extract was noticed only in the 100mg/kg dose in both age groups, in both sexes. The mice that were administered the specific dose were selected so as to study the activity of the two isoforms (G1 and G4) of acetylcholinesterase (Ellman s colorimetric method) in specific brain regions (cerebellum, cerebral cortex, hippocampus and striatum). The administration of the plant extract significantly reduced the activity of both isoforms of acetylcholinesterase as much in the cerebellum as in the striatum in both age groups and sexes. The results also exhibited the activity of the isoforms of acetylcholinesterase in aged mice to be significantly inhibited compared to adult mice of both sexes. In conclusion the results showed that the ethylacetate extract of the plant Sideritis clandestine subsp. peloponnesiaca provokes anxiolytic behavior in adult and aged mice of both sexes and inhibits with a tissue-specific manner the acetylcholinesterase activity of the brain regions. [vi]

8 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΤΟ ΓΗΡΑΣ... 1 Θεωρίες γήρανσης... 2 Οξειδωτικό στρες... 6 Οξειδωτικό στρες και εγκέφαλος... 8 Γήρας και εγκέφαλος ΤΟ ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Εγκέφαλος Οπίσθιος εγκέφαλος Μέσος εγκέφαλος Πρόσθιος εγκέφαλος Η Παρεγκεφαλίδα O Εγκεφαλικός φλοιός O Ιππόκαμπος Το ραβδωτό ΣΥΝΑΨΕΙΣ Οι νευροδιαβιβαστές Χολινεργικό σύστημα Ακετυλοχολίνη (ACh) Χολινεργικοί υποδοχείς Χολινεργικοί πυρήνες Ακετυλοχολινεστεράση (AChE) Λόγος των ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης Χολινεργικό σύστημα και γήρας Η ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ Εγκέφαλος και συμπεριφορά Άγχος Φόβος Διαφορές άγχους και φόβου Μοντέλο μελέτης των καταστάσεων άγχος-φόβος Άγχος, εγκέφαλος και νευροδιαβιβαστικά συστήματα [vii]

9 Άγχος και χολινεργικό σύστημα Άγχος και η σχέση του με την ηλικία και το φύλο ΑΡΩΜΑΤΙΚΑ ΦΥΤΙΚΑ ΕΙΔΗ Γενικά χαρακτηριστικά του γένους Sideritis Η χημική ανάλυση του γένους Sideritis ΣΚΟΠΟΣ ΤΑ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Πειραματόζωα Μελέτη συμπεριφορικής κατάστασης άγχους/φόβου - δοκιμασία ανοιχτού πεδίου Προσδιορισμός της ενεργότατης του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση Στατιστική ανάλυση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Α ΜΕΡΟΣ Μελέτη της επίδρασης της ηλικίας και του φύλου στη συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος, στην κινητικότητα και της ενεργότατης της ακετυλοχολινεστεράσης σε επιλεγμένες εγκεφαλικές περιοχές α) Επίδραση της ηλικίας και του φύλου στη συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος 90 β) Επίδραση της ηλικίας και του φύλου στην κινητικότητα γ) Επίδραση της ηλικίας στη ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης δ) Επίδραση του φύλου στην ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης Συμπεράσματα του Α μέρους Β ΜΕΡΟΣ Επίδραση εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτού sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca στη συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος, στην κινητικότητα και στην ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης α) Επίδραση εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτού Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca στη συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος και στην κινητικότητα. 117 β) Επίδραση εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτού Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca στην ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης γ) Επίδρασης του εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτού Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca στο λόγο SS/DS Συμπεράσματα του Β μέρους ΣΥΖΗΤΗΣΗ Α ΜΕΡΟΣ Μελέτη της επίδρασης της ηλικίας και του φύλου στη συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος, στην κινητικότητα και στην ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης επιλεγμένων εγκεφαλικών περιοχών [viii]

10 α) Επίδραση της ηλικίας και του φύλου στη συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος 145 β) Επίδραση της ηλικίας και του φύλου στην κινητικότητα γ) Επίδραση της ηλικίας και του φύλου στην ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης Β ΜΕΡΟΣ Μελέτη της επίδρασης του εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτού Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca στη συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος, στην κινητικότητα και στην ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης α) Επίδραση του εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτού Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca στη συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος και στην κινητικότητα β) Επίδραση εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτού Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca στη ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [ix]

11 1. ΤΟ ΓΗΡΑΣ Με τη γέννηση του ο ανθρώπινος οργανισμός εισέρχεται στη βρεφική ηλικία, την ακολουθεί η παιδική ηλικία και στη συνέχεια φτάνει στην ωριμότητα για να καταλήξει προοδευτικά στη φάση του γήρατος. Παρά το ότι όλοι μπορούμε να αναγνωρίσουμε ένα ηλικιωμένο άτομο σε σχέση με τα άτομα νεότερης ή μέσης ενήλικης ζωής, είναι συχνά δύσκολο να δοθεί ένας επιστημονικός ορισμός της γήρανσης και του γήρατος. Καθώς η γήρανση συνδέεται με σειρά μεταβολών στα άτομα, σε συνάρτηση με το χρόνου που εκδηλώνονται τόσο σε βιολογικό επίπεδο, όσο και σε επίπεδο συμπεριφοράς, τρόπου ζωής και κοινωνικών ρόλων. Η γήρανση χαρακτηρίζεται σαν μια σύνθετη διαδικασία μη αναστρέψιμων μεταβολών που τελούνται σε επίπεδο κυττάρων και επέρχονται προοδευτικά με την πάροδο του χρόνου (Cauley et al. 1996) Το γήρας είναι μία έννοια χρονολογική με έναρξη συμβατικά καθορισμένη και διαφορετική στις διάφορες εποχές. Ο Πυθαγόρας ξεχώριζε τη ζωή σε τέσσερις περιόδους, διάρκειας 20 χρόνων η κάθε μία, αντίστοιχες με τις εποχές: η παιδική ηλικία ή άνοιξη από 0-20 ετών, η εφηβεία ή καλοκαίρι από ετών, η νεότητα ή φθινόπωρο από ετών και τα γηρατειά ή χειμώνας από ετών, ενώ ο Αριστοτέλης εντοπίζει τη φυσική ωριμότητα στα 35 και την πνευματική στα 49. Η Παγκόσμια Συνέλευση του Γήρατος, που πραγματοποιήθηκε το 1982 στη Βιέννη, ύστερα από απόφαση της Γενικής Συνέλευσης του Ο.Η.Ε., υιοθέτησε την ηλικία των 60 ετών και άνω, ως όριο για την καταγραφή των ατόμων που ανήκουν στην Τρίτη ηλικία. Αντίθετα, διάφοροι επιστήμονες έχουν εκλάβει ως αντίστοιχο όριο, την ηλικία των 65 ετών και άνω, ενώ ορισμένοι προτιμούν το διαχωρισμό του συνόλου των υπερηλίκων σε υποσύνολα ηλικιών. Οι τελευταίοι στηρίζουν αυτή την άποψη στο ότι με την πρόοδο της ηλικίας εμφανίζονται προβλήματα (ψυχοσωματικά, κοινωνικά και οικονομικά) που διαφοροποιούν την εξέλιξη του γήρατος στα άτομα. Οι βασικοί παράγοντες που ασκούν καθοριστική επίδραση στη διαδικασία της γήρανσης είναι η κληρονομικότητα, το κοινωνικό και οικογενειακό περιβάλλον, η κοινωνική προσαρμογή και η συμπεριφορά, η ψυχοσύνθεση του ατόμου και τέλος η [1]

12 υγιεινή διαβίωση. Επί των ημερών μας, έχει επικρατήσει, διεθνώς, η ηλικία των 65 ετών, η οποία ταυτίζεται με την ηλικία της συνταξιοδότησης, ως το όριο πάνω από το οποίο ένα άτομο θεωρείται και αντιμετωπίζεται ως γηραιό (Kostaridou 1999). Οι περισσότεροι επιστήμονες που ασχολούνται με τη φυσιολογία και τη βιολογία της γήρανσης συμφωνούν ότι, κατά πάσα πιθανότητα, δεν υφίσταται μια και μόνο θεωρία που να ερμηνεύει πλήρως το φαινόμενο της γήρανσης. Θεωρίες γήρανσης Η γήρανση έχει οριστεί ως μια «προοδευτική επιδείνωση» όλων των βιολογικών διεργασιών του οργανισμού, που παρατηρείται μετά το πέρας της ωριμότητας, με αποτέλεσμα την περιορισμένη λειτουργικότητα και τη μειωμένη ομοιόσταση, αλλαγές οι οποίες σχετίζονται και με τις διαδοχικές αλλαγές που συνοδεύουν παθολογίες που σχετίζονται με την ηλικία όπως η νόσος του Parkinson και η γεροντική άνοια. Τα φυσικά συστήματα παρουσιάζουν αλλαγές που συσχετίζονται με την ηλικία, ενώ το Κεντρικό Νευρικό Σύστημα (ΚΝΣ) υφίσταται αλλαγές που παίζουν καθοριστικό ρόλο σε πολυάριθμες κινητικές (Kluger et al. 1997) διανοητικές και συμπεριφορικές αλλαγές που συνοδεύουν τη γήρανση (Bartus 1990). Ακόμα οι αλλαγές αυτές μπορεί να εμφανίζονται τόσο στη νευρωνική μορφολογία με τη συσσώρευση χρωστικών ουσιών «φθοράς λόγω χρήσης» (wear & tear), όπως είναι η λιποφουσκίνη, με την απώλεια μυελίνης και γενικώς με την κυτταρική συρρίκνωση και το κυτταρικό θάνατο όσο και στη δραστηριότητα των διάφορων νευροδιαβιβαστικών συστημάτων, και πιο συγκεκριμένα της ντοπαμίνης, της νοραδρεναλίνης, της σεροτονίνης, της ακετυλοχολίνης (ACh) και του γ αμινοβουτυρικού οξέος (Kubanis et al. 1981). Για το ποιο νευροδιαβιβαστικό σύστημα είναι αυτό που υφίσταται τις πιο δραματικές αλλαγές υπάρχουν πολλές απόψεις αλλά και αντιφάσεις κυρίως εξαιτίας της συσχέτισης των δυσλειτουργιών του ΚΝΣ και της γνωστικής βλάβης (Advokat & Pellegrin 1992). Πιθανότερη όλων είναι η διαταραχή του χολινεργικού νευροδιαβιβαστικού συστήματος όπως μπορεί να συμπεράνει κάποιος από το γεγονός του ότι τα γνωστικά ελλείμματα που παρατηρούνται λόγω της χρήσης χολινεργικών [2]

13 αναστολέων ή/και τραυμάτων των χολινεργικών πυρήνων, είναι παρόμοια με εκείνα που παρατηρούνται τόσο κατά τη γήρανση όσο και στην άνοια (Dawson & Wallace 1992; McEntee & Crook 1992). Αυτό το φαινόμενο είναι γνωστό και ως «χολινεργική υπόθεση», η οποία δηλώνει ουσιαστικά ότι η απώλεια της χολινεργικής λειτουργίας στο κεντρικό νευρικό σύστημα συνεισφέρει σημαντικά στη μείωση της γνωστικής λειτουργίας που σχετίζεται με την προχωρημένη ηλικία και τη νόσος του Alzheimer (AD) (Bartus 2000). Η «χολινεργική υπόθεση» της γηριατρικής δυσλειτουργίας της μνήμης, έχει κερδίσει ιδιαίτερη υποστήριξη τελευταίως, από τα πειράματα εκείνα που συσχετίζουν τις αλλαγές που παρατηρούνται στους διάφορους νευροχημικούς δείκτες του χολινεργικού συστήματος με τις αλλαγές που σχετίζονται με την ηλικία σε τρωκτικά και ανθρώπους. Πολλές θεωρίες έχουν προταθεί για να εξηγήσουν την διαδικασία της γήρανσης, αλλά καμία από αυτές δεν είναι πλήρως ικανοποιητική (Davidovic et al. 2010). Οι παραδοσιακές θεωρίες της γήρανσης υποστηρίζουν ότι η γήρανση δεν είναι μια προσαρμογή ούτε είναι γενετικά προγραμματισμένη. Οι σύγχρονες βιολογικές θεωρίες της γήρανσης στον άνθρωπο εμπίπτουν σε δύο κύριες κατηγορίες: α) στις θεωρίες προγραμματισμού (Programmed theories) και β) στις θεωρίες βλάβης ή λάθους (Damage or Error theories) (Jin 2010). Οι θεωρίες προγραμματισμού υποδηλώνουν ότι η γήρανση ακολουθεί ένα βιολογικό χρονοδιάγραμμα, ίσως τη συνέχεια αυτού που ρυθμίζει την ανάπτυξη και την εξέλιξη της παιδικής ηλικίας. Ο ορισμός αυτός θα μπορούσε να βασιστεί σε αλλαγές στην έκφραση γονιδίων που επηρεάζουν τα συστήματα που είναι υπεύθυνα για τις ανταποκρίσεις για τη συντήρηση, την επισκευή και την άμυνα του οργανισμού. Οι θεωρίες βλάβης ή λάθους τονίζουν περιβαλλοντικές προσβολές σε ζώντες οργανισμούς που προκαλούν συσωρευτικές ζημιές σε διάφορα επίπεδα ως αιτία της γήρανσης του πληθυσμού. Η θεωρία προγραμματισμού διακρίνεται σε 3 υποκατηγορίες, την προγραματισμένη μακροβιότητα (Programmed Longevity), την ενδοκρινή θεωρία (Endocrine Theory) και την ανοσολογική θεωρία (Immunological Theory) (Jin 2010). [3]

14 Η θεωρία της προγραμματισμένης μακροβιότητας υποστηρίζει ότι η γήρανση είναι το αποτέλεσμα μιας διαδοχικής ενεργοποίησης και απενεργοποίησης ορισμένων γονιδίων και ως γήρανση ορίζεται ο χρόνος που τα συνδεδεμένα με την ηλικία ελλείμματα εκδηλώνονται. Κατά τη θεωρία του ενδοκρινικού συστήματος τα βιολογικά ρολόγια δρουν μέσω ορμονών για να ελέγξουν το ρυθμό της γήρανσης του πληθυσμού. Τα επίπεδα ορισμένων ορμονών όπως η αυξητική ορμόνη (GH), μειώνεται με την ηλικία (Ho et al. 1987). Στα τρωκτικά, ο περιορισμός των θερμίδων έχει συσχετισθεί με ορμονικές αλλαγές, όπως μείωση της ινσουλίνης στο πλάσμα (Masoro et al. 1992) και των επιπέδων της IGF-1(Breese et al. 1991). Πρόσφατες μελέτες επιβεβαιώνουν ότι η γήρανση ρυθμίζεται ορμονικά και ότι η εξελικτικά συντηρημένη οδός σηματοδότησης ινσουλίνη/igf-1 (insulin/igf-1 signaling, IIS) παίζει ένα ρόλο κλειδί στην ορμονική ρύθμιση της γήρανσης (van Heemst 2010). Με βάση την Ανοσολογική Θεωρία το ανοσοποιητικό σύστημα είναι προγραμματισμένο να μειώνεται με το χρόνο, γεγονός που οδηγεί σε αυξημένη ευπάθεια σε μολυσματικές ασθένειες και κατά συνέπεια τη γήρανση και τον θάνατο. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η αποτελεσματικότητα του ανοσοποιητικού συστήματος κορυφώνεται κατά την εφηβεία μειώνεται βαθμιαία με την πρόοδο της ηλικίας. Για παράδειγμα, καθώς κάποιος μεγαλώνει, τα αντισώματα χάνουν την αποτελεσματικότητά τους, και όλο και λιγότερες νέες ασθένειες μπορούν να καταπολεμηθούν αποτελεσματικά από τον οργανισμό, το οποίο έχει ως αποτέλεσμα την πρόκληση κυτταρικού στρες και τελικά το θάνατο (Cornelius 1972). Η δυσρυθμισμένη ανοσοαπόκριση έχει συνδεθεί με την καρδιαγγειακή νόσο, τη φλεγμονή, τη νόσο του Alzheimer και τον καρκίνο. Αν και δεν έχει τεκμηριωθεί κάποια άμεση σχέση το ανοσοποιητικό σύστημα εμπλέκεται τουλάχιστον έμμεσα με αυτές τις αρνητικές εκβάσεις (Rozemuller et al. 2005). Η θεωρία βλάβης ή λάθους περιλαμβάνει 5 υποκατηγορίες τη θεωρία περί φθοράς (Wear and tear theory), τη θεωρία «ρυθμού-διαβίωσης» (Rate-of-Living theory), τη θεωρία Διασταύρωσης (Cross-linking theory), τη θεωρία βλάβης του [4]

15 σωματικού DNA (Somatic DNA damage theory) και τη θεωρία ελευθέρων ριζών (Free radicals theory) (Jin 2010). Η θεωρία περί φθοράς υποστηρίζει ότι τα κύτταρα και οι ιστοί έχουν ζωτικά μέρη που φθείρονται με αποτέλεσμα τη γήρανση. Η θεωρία αυτή της γήρανσης εισήχθη για πρώτη φορά το 1882 από τον Dr. August Weismann, ένα Γερμανό βιολόγο, η οποία ακούγεται απολύτως λογική σε πολλούς ανθρώπους ακόμα και σήμερα, επειδή αυτό είναι κάτι που συμβαίνει με τα περισσότερα γνωστά πράγματα γύρω μας. Μια πιθανή εξήγηση για το πώς και γιατί τα είδη ηλικιώνονται, δόθηκε, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω της υπόθεσης «ρυθμού-διαβίωσης», η οποία δηλώνει ότι η διάρκεια της ζωής είναι αυστηρώς αντιστρόφως ανάλογη της λειτουργίας κατανάλωσης οξυγόνου ή του ρυθμού μεταβολισμού (mass-specific metabolic rate) και ότι η γήρανση προκαλείται από την απώλεια μερικών ουσιών ζωτικής σημασίας, όπως το ύδωρ ή οι ορμόνες. Δηλαδή όσο μεγαλύτερο είναι το ποσοστό κατανάλωσης του οξυγόνου ή του ρυθμού του βασικού μεταβολισμου ενός οργανισμού, τόσο μικρότερη είναι η διάρκεια ζωής του (Brys et al. 2007). Η θεωρία αυτή ενώ είναι χρήσιμη δεν είναι απολύτως επαρκής για να εξηγήσει τη μέγιστη διάρκεια ζωής (Hulbert et al. 2007). Η υπόθεση διασταύρωσης της γήρανσης προτάθηκε από τον Johan Björksten το 1968 (Bjorksten 1968). Σύμφωνα με τη θεωρία αυτή παρατηρείται ότι με την ηλικία οι πρωτεΐνες, το DNA καθώς και άλλα δομικά μόρια αναπτύσσουν ακατάλληλες σταυρωτές συνδέσεις μεταξύ τους (Bjorksten & Tenhu 1990). Η συσσώρευση των συνδέσεων αυτών καταστρέφουν τα κύτταρα και τους ιστούς, επιβραδύνοντας σωματικές διεργασίες που προκύπτουν κατά τη γήρανση. Η θεωρία βλάβης του σωματικού DNA της γήρανσης προϋποθέτει ότι η συσσώρευση μεταλλάξεων στο γενετικό υλικό των σωματικών κυττάρων ως συνάρτηση του χρόνου έχει σαν αποτέλεσμα τη μείωση της κυτταρικής λειτουργίας. Ειδικότερα, η συσσώρευση των τυχαίων μεταλλάξεων απενεργοποιεί τα γονίδια που είναι σημαντικά για τη λειτουργία των σωματικών κυττάρων των διαφόρων [5]

16 συστημάτων των οργάνων του ενήλικα, η οποία οδηγεί σε μείωση της λειτουργίας των οργάνων. Όταν η λειτουργία των οργάνων μειώνεται κάτω από ένα κρίσιμο επίπεδο, επέρχεται ο θάνατος. Έρευνες έχουν δείξει ότι σωματικές μεταλλάξεις παίζουν σημαντικό ρόλο στη γήρανση και σε ένα αριθμό παθολογικών καταστάσεων που σχετίζονται με την ηλικία (Kennedy et al. 2012). Η θεωρία ελευθέρων ριζών εισήχθη για πρώτη φορά από το Dr.Gerschman το 1954(Gerschman et al. 1954), αλλά αναπτύχθηκε από τον Dr.Denham Harmant το 1956 (Harman, 1956). Ο Harmant προτείνει ότι ο κύριος υπαίτιος για τη διαδικασία της γήρανσης είναι η συσσώρευση βλαβών στις πρωτεΐνες και σε άλλα κυτταρικά συστατικά, λόγω των βλαβερών υπoπαραγόντων του μεταβολισμού των ελευθέρων ριζών. Παράγονται από διάφορες μεταβολικές διεργασίες αλλά και ιονίζουσες ακτινοβολίες, το όζον ή χημικές τοξικές ουσίες όπως τα εντομοκτόνα. Τα μακρομόρια όπως νουκλεϊκά οξέα, λιπίδια, σάκχαρα και πρωτεΐνες είναι επιρρεπείς σε επιθέσεις των ελεύθερων ριζών. Επιρρεπείς στις επιθέσεις είναι επίσης και τα μιτοχόνδρια. Ο κεντρικός ρόλος των μιτοχονδρίων στην οξειδοαναγωγική ικανότητα του κυττάρου υποδηλώνεται από πειράματα σε τρωκτικά αλλά και σε πρωτεύοντα, τα οποία είχαν υποβληθεί σε θερμιδικό περιορισμό. Παρατηρήθηκε ότι προάγονται σημαντικές αυξήσεις του μέσου όρου ζωής, με το να μειώνεται ο ρυθμός παραγωγής των ελευθέρων ριζών από τα μιτοχόνδρια (Sohal & Weindruch 1996). Οξειδωτικό στρες Τα τελευταία 50 χρόνια, η θεωρία ελευθέρων ριζών του Harmant αναπροσαρμόστηκε έτσι ώστε να περιλαμβάνει όχι μόνο τις ελεύθερες ρίζες, αλλά και άλλες μορφές ενεργοποιημένου οξυγόνου, όπως τα υπεροξείδια και οι αλδεΰδες. Το γεγονός αυτό οδήγησε στην μετονομασία της θεωρίας των ελευθέρων ριζών της γήρανσης, σε θεωρία του «οξειδωτικού στρες» (Beckman & Ames 1998). Οξειδωτικό στρες μπορεί να προκληθεί ακόμη και κάτω από φυσιολογικές συνθήκες στα κύτταρα των αερόβιων οργανισμών, όταν υπάρξει ανισορροπία μεταξύ της παραγωγής των ελευθέρων ριζών οξυγόνου, ο οποίες σχηματίζονται ενδογενώς από τις φυσιολογικές μεταβολικές διαδικασίες που χρησιμοποιούν οξυγόνο και των αντιοξειδωτικών αμυντικών συστημάτων που διαθέτει ο οργανισμός (ενζυμικών και [6]

17 μη). Στην παραπάνω παρατήρηση βασίστηκε η τροποποίηση της θεωρίας ελευθέρων ριζών. Σε πολλές μελέτες υποστηρίζεται η έννοια του αυξανόμενου οξειδωτικού στρες στον γηραιό εγκέφαλο (Siqueira et al. 2005; Keller et al. 2004). Ακόμα παραμένει ασαφής ο λόγος της συσχέτισης της ηλικίας με την αύξηση του οξειδωτικού στρες κατά το γήρας. Διάφορες μελέτες έχουν αποδώσει αυτές τις αλλαγές: α) στην αύξηση της παραγωγής υπεροξειδίου του υδρογόνου, από τα μιτοχόνδρια (Sohal & Dubey 1994) β) στην μείωση των επιπέδων της υπεροξειδικής δισμουτάσης, της ενεργότητας της καταλάσης και στην ενεργοποίηση των προ-αποπτωτικών μορίων (Sadoul 1998) γ) στις αλλαγές του μικρο-αγγειακού συστήματος του εγκεφάλου (Floyd et al. 1994) δ) στις αλλαγές του μικρό- περιβάλλοντος και της δομής των μεμβρανών (Joseph et al. 1998) ε) στις αλλαγές της ευπάθειας των υποδοχέων των νευροδιαβιβαστών στο οξειδωτικό στρες (Joseph et al. 1998) στ) στις αλλαγές της ικανότητας ρύθμισης της ενεργότητας του ασβεστίου (Foster & Kumar 2002) ζ) στις αλλαγές των μονοπατιών κυτταρικής σηματοδότησης (Dalton et al. 1999) και η) στις αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης (Hughes & Reynolds 2005) Ακόμα κατά τον Andersen το οξειδωτικό στρες συνδέεται με την λανθασμένη αναδίπλωση των νευρωνικών πρωτεϊνών, τη μεμβρανική δυσλειτουργία, τον κυτταρικό θάνατο και την ενεργοποίηση των γλοίων κυττάρων που συνδέονται, εκτός από την κανονική γήρανση, με ορισμένες νευροεκφυλιστικές ασθένειες (Andersen 1998). Η ενεργοποίηση των μικρογλοιακών κυττάρων παρέχει ένα μέτρο σύνδεσης μεταξύ του οξειδωτικό στρες και της φλεγμονής που μπορεί επίσης να θεωρηθεί ως ένας ακόμη συνεισφέρων παράγοντας στις νευρωνικές και συμπεριφοριστικές [7]

18 αλλαγές που παρατηρούνται κατά το γήρας, όπως υποδεικνύεται από την επαγωγή διάφορων προ-φλεγμονωδών μορίων όπως ο IL- 1β και ο TNFα (Conde & Streit 2006; Casolini et al. 2002). Οξειδωτικό στρες και εγκέφαλος Όπως έχει ήδη αναφερθεί αιτία της εμφάνισης του οξειδωτικού στρες στο νευρικό σύστημα αποτελούν οι ενεργές μορφές οξυγόνου και αζώτου. Η ενεργοποιημένη μικρογλοία και τα κατεστραμμένα μιτοχόνδρια είναι η κύρια πηγή ενεργών μορφών οξυγόνου σε φλεγμονώδεις καταστάσεις. Σημαντικό ρόλο μεταξύ των μηχανισμών θανάτου των νευρώνων είναι η απόπτωση και η επαγόμενη τοξικότητα (Emerit et al. 2004) Οι ενεργές αυτές μορφές του οξυγόνου και του αζώτου εμπλέκονται τόσο στην απόπτωση όσο και στη διεγειρόμενη τοξικότητα (excitotoxicity). Κατά την απόπτωση ένα βιοχημικό μονοπάτι ενεργοποιεί πρωτεάσες, οι οποίες καταστρέφουν μόρια που απαιτούνται για τη κυτταρική επιβίωση και ακόμα ενεργοποιούνται και κάποια άλλα μόρια που μεσολαβούν σε μια προγραμματισμένη κυτταρική αυτοκαταστροφή. Σε αυτή τη διαδικασία τα μιτοχόνδρια παίζουν σημαντικό ρόλο. Τέλος με το φαινόμενο της διεγειρόμενη τοξικότητας, παρουσιάζεται γλουταμινεργική υπερδιέγερση που οδηγεί σε υψηλό φορτίο ασβεστίου εντός των νευρώνων, και εν συνεχεία σε απόπτωση. Το γλουταμινικό οξύ είναι ο κυριότερος διεγερτικός νευροδιαβιβαστής και η αλληλεπίδρασή του με ειδικούς μεμβρανικούς υποδοχείς είναι υπεύθυνη για πολλές νευρολογικές λειτουργίες όπως, η συνείδηση, η μνήμη και η αίσθηση. Σε νευροεκφυλιστικές διαταραχές, η υπερβολική ενεργοποίηση των γλουταμικών υποδοχέων, μπορεί να οδηγήσει σε βλάβη ή θάνατο των νευρώνων (Emerit et al. 2004). Από την υπερβολική ενεργοποίηση γλουταμικών ιονοτρόπων υποδοχέων διεγείρονται τα κανάλια ιόντων και προκαλείται υπερβολική εισροή ασβεστίου στους νευρώνες. Η αύξηση του ασβεστίου των νευρώνων, μπορεί να ενεργοποιήσει μια σειρά από ένζυμα όπως, την πρωτεϊνική κινάση C, πρωτεάσες, φωσφατάσες και φωσφολιπάσες. Τελικά, λόγω της διαμεσολαβούμενης δράσης των υποδοχέων του γλουταμινικού στον ενδοκυττάριο χώρο παρατηρείται υπερβολική απόκριση. Αυτές οι ενδοκυττάριες αποκρίσεις, οδηγούν σε υπερπαραγωγή πρωτεολυτικών ενζύμων, σε [8]

19 υπεροξείδωση λιπιδίων και σε σχηματισμό ενεργών μορφών οξυγόνου και αζώτου. Αυτές οι αλλάγές έχουν σαν συνέπεια το προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο, απόπτωση του κυττάρου, που αποτελεί έναν από τους κύριους μηχανισμούς κυτταρικού θανάτου σε περιπτώσεις νευρολογικών ασθενειών. Στους μηχανισμούς απόπτωσης, εκτός από τη τοξικότητα που προκαλείται από περίσσεια του γλουταμινικού οξέος, εμπλέκονται και τα μιτοχόνδρια. Πολλά αποπτωτικά μονοπάτια προέρχονται από τα μιτοχόνδρια. Τα κύρια μόρια που απελευθερώνουν τα μιτοχόνδρια και οδηγούν σε απόπτωση είναι (Emerit et al. 2004). 1. το κυτόχρωμα c, το οποίο όταν απελευθερώνεται από τα μιτοχόνδρια στο κυτταρόπλασμα, ενεργοποιεί την αλυσίδα των κασπασών (Emerit et al. 2004) 2. τα μόρια Smac/Diablo (Adrain et al. 2001) 3. ο παράγοντας επαγωγής της απόπτωσης (Emerit et al. 2004) 4. κάποιες προκασπασες (2,3 και 9) (Emerit et al. 2004) 5. η ενδονουκλεάση G (Li et al. 2001) Όταν τα επίπεδα των ενεργών μορφών οξυγόνου αυξηθούν τόσο ώστε τα μιτοχονδρια και το κύτταρο να μην έχουν τη δυνατότητα να τα εξουδετερώσουν, το επακόλουθο οξειδωτικό στρες, μπορεί να ενεργοποιήσει ειδικούς μιτοχονδριακούς πόρους μετάβασης (mitochondrial permeability transition pore, mtptp). Η ενεργοποίηση αυτών των πόρων δημιουργεί ένα ανοιχτό κανάλι, κατά μήκος της μιτοχονδριακής εσωτερικής και εξωτερικής μεμβράνης, το οποίο επιτρέπει το ελεύθερο πέρασμα μορίων, μικρότερων από 1500 Da, μεταξύ του εσωτερικού του μιτοχονδρίου και του κυτταροπλάσματος (Emerit et al. 2004). Αυτό οδηγεί στη κατάρρευση της διαμεμβρανικής ηλεκτροχημικής κλίσης και στη διόγκωση των μιτοχονδρίων, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c, της προκασπάσης 2,3 και 9, του παράγοντα έναρξης της απόπτωσης και της ενεργοποιούμενης από κασπάση DNάσης. Δεδομένης της επίπτωσης του οξειδωτικού στρες και της φλεγμονής στον γηραιό εγκέφαλο, με τα κινητικά και γνωστικά ελλείμματα που προκύπτουν, αποτελεί [9]

20 ύψιστης σημασίας η καθυστέρηση ή η αναστροφή της έναρξης των καταστρεπτικών αυτών παραγόντων, προκειμένου να αυξηθεί όχι μόνο η «υγιής» μορφή γήρανσης, αλλά και να δημιουργηθούν ευνοϊκοί όροι για την επίτευξη ενός «μερίσματος μακροζωίας» (longevity dividend) τόσο σε οικονομικούς, όσο και σε ανθρώπινους όρους. Γήρας και εγκέφαλος Ο εγκέφαλος είναι ένα από τα βασικότερα όργανα του ανθρώπου αλλά και όλων των ζωικών οργανισμών και βρίσκεται σε μία συνεχή διαδικασία λειτουργίας και παραγωγής. Αυτό τον καθιστά ευάλωτο και κάποια στιγμή με το πέρας της ηλικίας επέρχεται η φθορά. Το βάρος του εγκεφάλου ενός ενήλικα ανθρώπου είναι κατά μέσο όρο g και παραμένει σταθερό σε όλο τη διάρκεια της ενήλικης ζωής μέχρι και τη μεσήλικη ζωή. Μετά τα 65 χρόνια, στη γηραιή ζωή, ο όγκος του αρχίζει και μειώνεται δηλαδή παρατηρείται εγκεφαλική ατροφία. Δομικές ανωμαλίες που σχετίζονται με την εγκεφαλική ατροφία έχουν παρατηρηθεί σε μελέτες που έχουν γίνει μεταθανάτια σε γηραιούς ασθενείς. Ο γηραιός εγκέφαλος χαρακτηρίζεται από πλήθος νευροχημικών, συμπεριφορικών και δομικών αλλαγών. Οι αλλαγές αυτές που έχουν παρατηρηθεί σχετίζονται με μεταβολές σε δομικό, κυτταρικό και μοριακό επίπεδο. Όσον αφορά το δομικό επίπεδο οι καλύτερα μελετημένες αλλαγές είναι οι αλλαγές στις συνάψεις των νευρικών κυττάρων στον εγκέφαλο με τις παρατηρήσεις να δείχνουν μείωση του αριθμού των συνάψεων σε συνδυασμό με αύξηση του συναπτικού μεγέθους καθώς και μείωση της δενδριτικής διακλάδωσης (Kelly et al. 2006). Ακόμα καλά μελετημένες είναι και οι αλλαγές στη λευκή ουσία και στο αγγειακό σύστημα του εγκεφάλου με μείωση του όγκου και της εγκεφαλικής ροής του αίματος. Ενώ σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο οι αλλαγές μπορεί να οφείλονται σε μεταβολές στη νευροδιαβιβαστική σηματοδότηση, σε αύξηση του οξειδωτικού στρες καθώς και σε αυξημένη φλεγμονώδη σηματοδότηση. Για παράδειγμα η υπερβολική σηματοδότηση γλουταμικού καθώς και η μείωση των επιπέδων της ντοπαμίνης χαρακτηρίζουν τη [10]

21 γήρανση ειδικά σε διαταραχές που σχετίζονται με την ηλικία. Ακόμα σε μελέτες, σε γηραιά υγιή άτομα, έχει παρατηρηθεί αύξηση του παράγοντα TNF-a καθώς και των ιντερλευκινών IL-1 και IL-6, αύξηση που έχει συνδεθεί με την ανάπτυξη νευρωνικής δυσλειτουργίας και νευροπαθολογίας στον εγκέφαλο των ατόμων (Spulber & Schultzberg 2010; Patterson 1995). Γεγονός αποτελεί ότι η χρονολογική γήρανση επιδρά στον εγκέφαλο με ένα γενικευμένο φαινότυπο γήρανσης. Επίσης την ίδια στιγμή παρατηρείται σημαντική μεταβλητότητα στο ποσοστό αλλά και στη σοβαρότητα των αλλοιώσεων (Uranga et al. 2010). Κατά την προχωρημένη ηλικία έχει διαπιστωθεί από μελέτες σε ανθρώπους ότι υπάρχει σημαντική μεταβλητότητα σε σχέση με την επιδείνωση των γνωστικών επιδόσεων που παρατηρούνται (Zhu et al. 2006; Pradhan 1980). [11]

22 2. ΤΟ ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Το νευρικό σύστημα αποτελεί ένα δίκτυο επικοινωνίας που επιτρέπει σε έναν οργανισμό να αλληλεπιδρά κατάλληλα με το περιβάλλον. Ένα σύστημα που ρυθμίζει και ελέγχει την λειτουργία όλων των οργάνων του ανθρωπίνου σώματος, καθώς επίσης και την μεταξύ τους αρμονική συνεργασία. Θεωρείται ίσως το πιο πολύπλοκο σύστημα και συνδέετε άμεσα με την ανθρωπινή συμπεριφορά. Ένας από τους βασικότερους στόχους των νευροεπιστημών είναι η περιγραφή του νευροανατομικού και νευροπαθοφυσιολογικού υπόβαθρου διαφόρων συμπεριφορών καθώς και διαταραχών. Το νευρικό σύστημα είναι από τα πιο πολύπλοκα συστήματα που υπάρχουν στο σώμα και για τον λόγο αυτό η μελέτη του προϋποθέτει την διαίρεσή του σε επιμέρους συστήματα. Στον άνθρωπο, όπως και στα υπόλοιπα θηλαστικά, μπορεί να διαιρεθεί σε Κεντρικό Νευρικό Σύστημα (ΚΝΣ) και Περιφερειακό Νευρικό Σύστημα (ΠΝΣ). Το Κεντρικό Νευρικό Σύστημα αποτελείται από τον εγκέφαλο και τον νωτιαίο μυελό. Ο εγκέφαλος και ο νωτιαίος μυελός είναι τα κύρια κέντρα όπου γίνεται η διαπλοκή, η συσχέτιση και η ολοκλήρωση των νευρικών πληροφοριών και για τον λόγο αυτό αποτελεί το πιο προστατευμένο τμήμα του ανθρώπινου σώματος. Το ΚΝΣ παίζει το βασικότερο ρόλο στην επεξεργασία της πληροφορίας που λαμβάνεται από τις αισθήσεις του οργανισμού, στη ρύθμιση πολλών από τις λειτουργίες του, στην εκδήλωση της σκέψης και της λογικής κ.α. β) Το Περιφερικό Νευρικό Σύστημα περιλαμβάνει τους νευρώνες και τα τμήματα που αλληλεπιδρούν με την περιφέρεια, τα αισθητήρια όργανα ή τα εσωτερικά όργανα. Εγκέφαλος Ο εγκέφαλος υποδιαιρείτε σε 3 κύρια μέρη όπου κατά ανιούσα διάταξη από το νωτιαίο μυελό έχουμε: τον οπίσθιο εγκέφαλο (ή ρομβοειδή), τον μέσο εγκέφαλο και τον πρόσθιο εγκέφαλο. Ο ρομβοειδής ή οπίσθιος εγκέφαλος περιλαμβάνει τη γέφυρα (ή μετεγκέφαλο) και την παρεγκεφαλίδα και τον προμήκη μυελό (ή μυελεγκέφαλο). Ο μέσος εγκέφαλος περιλαμβάνει την καλύπτρα και το τετράδυμο πέταλο (άνω και κάτω διδύμια). Ο πρόσθιος εγκέφαλος περιλαμβάνει τον διάμεσο εγκέφαλο (θάλαμο, υποθάλαμο, επίφυση) και τον τελικό εγκέφαλο (εγκεφαλικά ημισφαίρια, βασικά γάγγλια, μεταιχμιακό σύστημα) (Snell 1995). [12]

23 Οπίσθιος εγκέφαλος Ο ρομβοειδής ή οπίσθιος εγκέφαλος περιλαμβάνει τον προμήκη μυελό (μυελεγκέφαλος), τη γέφυρα (μετεγκέφαλος) και την παρεγκεφαλίδα (Snell 1995). Ο προμήκης μυελός είναι η δομή που συνδέει το νωτιαίο μυελό με τη γέφυρα. Στην πρόσθια επιφάνεια του εμφανίζει την πρόσθια μέση αύλακα και εκατέρωθεν από μία διόγκωση την πυραμίδα του προμήκους. Πλάγια και πίσω από κάθε πυραμίδα υπάρχει η ελαία του προμήκους όπου πίσω από αυτές είναι τα κάτω παρεγκεφαλιδικά σκέλη. Ελέγχει ένα σημαντικό αριθμό ζωτικών λειτουργιών μέσω των κρανιακών νεύρων, όπως ο καρδιακός ρυθμός, η αναπνοή, η πέψη κ.ά. Η γέφυρα βρίσκεται μπροστά από την παρεγκεφαλίδα, κάτω από το μέσο εγκέφαλο και πάνω από τον προμήκη μυελό. Η πρόσθια επιφάνειά της συνδέει μεταξύ τους, σαν γέφυρα, τα δυο ημισφαίρια της παρεγκεφαλίδας από όπου πήρε και το όνομά της. Η παρεγκεφαλίδα βρίσκεται πίσω από τη γέφυρα και τον προμήκη μυελό στον οπίσθιο κρανιακό βόθρο. Η παρεγκεφαλίδα, θα παρουσιαστεί αναλυτικότερα παρακάτω, καθώς αποτελεί μία από τις υπο μελέτη εγκεφαλικές περιοχές Μέσος εγκέφαλος Ο μέσος εγκέφαλος συνδέει την γέφυρα με τον πρόσθιο εγκέφαλο. Κατά μήκος του μέσου εγκεφάλου διέρχεται ένας στενός δίαυλος ο υδραγωγός του εγκεφάλου (του Sylvius) μέσω του οποίου μεταφέρεται το εγκεφαλονωτιαίο υγρό από την Τρίτη στην τέταρτη κοιλία (Snell 1995). Το τετράδυμο πέταλο είναι το τμήμα του μέσου εγκεφάλου, πίσω (ραχιαία) από τον υδραγωγό και διακρίνεται στα 2 άνω ή πρόσθια και στα 2 κάτω ή οπίσθια διδύμια. Το τμήμα μπροστά από τον υδραγωγό αποτελεί τα σκέλη του εγκεφάλου. Το κάθε ένα από τα δύο σκέλη εμφανίζει μια χρωστικοφόρο ταινία φαιάς ουσίας, την μέλαινα ουσία, που χωρίζει το σκέλος σε μια πρόσθια μοίρα, η βάση του σκέλους, και σε μια οπίσθια μοίρα, την καλύπτρα του σκέλους. Στην καλύπτρα κάθε σκέλους υπάρχει μια μεγάλη ωοειδής μάζα κυττάρων, ο ερυθρός πυρήνας (Snell 1995). [13]

24 Πρόσθιος εγκέφαλος Ο πρόσθιος εγκέφαλος περιλαμβάνει τον διάμεσο εγκέφαλο (θάλαμο, υποθάλαμο, επίφυση) και τον τελικό εγκέφαλο (εγκεφαλικά ημισφαίρια, βασικά γάγγλια κ.α.) (Snell 1995). Διάμεσος εγκέφαλος Ο διάμεσος εγκέφαλος βρίσκεται μεταξύ του μεσεγκεφάλου και των εγκεφαλικών ημισφαιρίων από όπου πήρε και το όνομα του. Κατά τον Snell (Snell 1995) αποτελείται από δύο μεγάλες περιοχές το θάλαμο και τον υποθάλαμο και δυο μικρότερες περιοχές, τον επιθάλαμο και την υποθαλάμια περιοχή. Ο θάλαμος είναι μια μεγάλη ωοειδής μάζα φαιάς ουσίας. Βρίσκεται στο ραχιαίο τμήμα του διάμεσου εγκέφαλου καταλαμβάνοντας το μεγαλύτερο τμήμα του. Επιτελεί σημαντικό λειτουργικό ρόλο αφού αποτελεί συναπτικό σταθμό αναμετάδοσης όλων των ανιουσών αισθητικών οδών (εκτός της οσφρητικής) που κατευθύνονται από την περιφέρεια προς το φλοιό του εγκεφάλου (Guyton & Hall 1996). Στην ουσία πρόκειται για ένα σύμπλεγμα πυρήνων, τους πυρήνες της μέσης γραμμής, τους έσω, τους πρόσθιους, τους έξω (ραχιαίους και κοιλιακούς) και τα γονατώδη σώματα. Συμμετέχει επίσης στο εξωπυραμυδικό σύστημα καθώς παρεμβάλλεται στην οδό που ξεκινά από την παρεγκεφαλίδα και καταλήγει στο φλοιό και στην οδό που ξεκινά από το φλοιό και περνώντας από το ραβδωτό των βασικών γαγγλίων καταλήγει πάλι σε αυτόν (Snell 1995). Ο υποθάλαμος βρίσκεται ακριβώς κάτω από το θάλαμο. Επιφανειακά και από μπροστά προς τα πίσω εμφανίζει της ακόλουθες δομές: το οπτικό χίασμα, το φαιό φύμα, τη χοάνη, τα μαστία και την οπίσθια διάτρητη ουσία. Αν και καταλαμβάνει μόλις το 0,15% του συνολικού εγκεφαλικού όγκου, είναι τεράστιας λειτουργικής σημασίας καθώς οι πυρήνες του ελέγχουν και αλληλοσυσχετίζουν τις λειτουργίες του αυτόνομου νευρικού συστήματος και του ενδοκρινικού διαδραματίζοντας σημαντικό ρόλο στην ομοιόσταση. Μέσω μιας χοάνης συνδέεται με την υπόφυση και συνεργάζεται μαζί της για την έκκριση των υποφυσικών ορμονών. [14]

25 Ο επιθάλαμος περιλαμβάνει την επίφυση και τον πυρήνα της ηνίας. Στον άνθρωπο η επίφυση έχει αντιγοναδοτρόπο δράση μέχρι την ήβη και εμποδίζει την ανάπτυξη των γονάδων πριν από αυτήν (Guyton & Hall 1996). Η υποθαλάμια περιοχή βρίσκεται κάτω και πίσω από το θάλαμο και ο πιο σημαντικός πυρήνας της είναι αυτός του Luys που έχει σημαντικές συνδέσεις με το ραβδωτό σώμα (Guyton & Hall 1996). Τελικός εγκέφαλος Ο τελικός εγκέφαλος, το μεγαλύτερο τμήμα του εγκεφάλου, αποτελείται από τα δύο εγκεφαλικά ημισφαίρια τα οποία συνδέονται με το μεσολόβιο (Snell 1995). Η επιφανειακή στιβάδα κάθε ημισφαιρίου, ο φλοιός των ημισφαιρίων, αποτελείται από φαιά ουσία. Μετά το φλοιό, τα εγκεφαλικά ημισφαίρια αποτελούνται από λευκή ουσία. Τα ημισφαίρια απαρτίζονται εκτός από το φλοιό και την υποκείμενη λευκή ουσία και από τρεις εν τω βάθει δομές, τα βασικά γάγγλια, την αμυγδαλή και ο ιππόκαμπος. Όπως είναι γνωστό ο ιππόκαμπος, η αμυγδαλή και κάποιες περιοχές του διάμεσου εγκέφαλου απαρτίζουν το μεταιχμιακό σύστημα. Ο φλοιός τον εγκεφαλικών ημισφαιρίων και ο ιππόκαμπος θα παρουσιαστούν αναλυτικότερα παρακάτω, καθώς αποτελούν δύο από τις υπό μελέτη εγκεφαλικές περιοχές. Επίσης μία από τις εγκεφαλικές περιοχές του πρόσθιου εγκεφάλου που θα παρουσιαστούν αναλυτικά παρακάτω είναι το ραβδωτό που βρίσκεται στα βασικά γάγγλια, καθώς αποτελεί και αυτή μία από τις υπό μελέτη εγκεφαλικές περιοχές. Η Παρεγκεφαλίδα Πήρε το όνομά της καθώς έμοιαζε με μικρό εγκέφαλο κατά τους πρώτους ανατόμους (cerebellum = little brain). Η παρεγκεφαλίδα, το μεγαλύτερο τμήμα του οπισθίου εγκεφάλου, ελέγχει υποσυνείδητα την ομαλή συστολή των γραμμωτών (εκούσιων) μυών και συντονίζει τη δράση τους. Μπορεί επίσης να συμμετέχει σε ορισμένες γνωστικές λειτουργίες όπως η προσοχή και τη γλώσσα, καθώς και στη ρύθμιση του φόβου (Wolf et al. 2009). Κάθε παρεγκεφαλιδικό ημισφαίριο ελέγχει τους μυς του ιδίου ημιμορίου του σώματος (Snell, 1995) [15]

26 Εξωτερική μορφολογία Η παρεγκεφαλίδα έχει σχήμα ωοειδές αποπλατυσμένο στη μέση με οβελιαία περίσφιγξη. Αποτελείται από δύο παρεγκεφαλιδικά ημισφαίρια που συνδέονται μεταξύ τους με το σκώληκα της παρεγκεφαλίδας. Υποδιαιρείται σε 3 κύριους λοβούς: τον πρόσθιο λοβό, το μέσο λοβό (ή οπίσθιο λοβό) και τον κροκυδοοζώδη λοβό (Berne & Levy 2003). Ο πρόσθιος λοβός, η σταφυλή και η πυραμίδα αποτελούν την παλαιοπαρεγκεφαλίδα, η οποία λειτουργικά σχετίζεται με τις αδρές κινήσεις της κεφαλής και του σώματος. Ο μέσος λοβός, με εξαίρεση την σταφυλή και την πυραμίδα, αποτελεί την νεοπαρεγκεφαλίδα που σχετίζεται με τις εκούσιες κινήσεις. Ο κροκυδοοζώδης λοβός αποτελεί την αρχαιοπαρεγκεφαλίδα που συνδέεται με το αιθουσαίο σύστημα. Ο φλοιός της παρεγκεφαλίδας εμφανίζεται με πολλές πτυχές που αποτελούν τις έλικες ή φύλλα της παρεγκεφαλίδας, που χωρίζονται μεταξύ τους με πολυάριθμες λεπτές σχισμές. Βαθύτερες σχισμές χωρίζουν την παρεγκεφαλίδα σε λοβούς. Κάθε φύλλο (έλικα) της παρεγκεφαλίδας εμφανίζει μια κεντρική μάζα λευκής ουσίας που περιβάλλεται εξωτερικά από φαιά ουσία (Snell 1995). Η παρεγκεφαλίδα δηλαδή αποτελείται από φαιά και λευκή ουσία. Η φαιά ουσία βρίσκεται περιφερικά ως φλοιός και εσωτερικά ως συσσωματώματα φαιάς ουσίας μέσα στη λευκή ουσία που αποτελούν τους πυρήνες της παρεγκεφαλίδας (Vander et al. 2001). Εσωτερική μορφολογία Ο παρεγκεφαλιδικός φλοιός εμφανίζει τρεις ζώνες, 1) την εξωτερική μοριώδη ζώνη, 2) τη μέση ζώνη (η στιβάδα των κυττάρων του Purkinje) και 3) την εσωτερική κοκκώδη ζώνη (Snell 1995). Η εξωτερική μοριώδη ζώνη περιέχει δύο τύπους νευρώνων, εξωτερικά τα αστεροειδή κύτταρα, εσωτερικά τα καλαθιοφόρα κύτταρα. Επίσης περιέχει τους νευράξονες των κοκκοειδών κυττάρων που σχηματίζουν τις παράλληλες ίνες και τους δενδρίτες των υποκείμενων κυττάρων Purkinje. Η στιβάδα των κυττάρων του Purkinje αποτελείται από τα σώματα των κυττάρων Purkinje που είναι μεγάλοι νευρώνες τύπου Golgi1, ασκοειδούς σχήματος και διατάσσονται το ένα δίπλα στο άλλο σε μία μοναδική στιβάδα. Οι δενδρίτες [16]

27 αυτών των κυττάρων φέρονται στη μοριώδη στιβάδα με πλούσια διακλάδωση. Από τη βάση των κυττάρων του Purkinje εκφύεται ο άξονας τους που διασχίζει την κοκκώδη στιβάδα και εισέρχεται στη λευκή ουσία, αποκτά μυελώδες έλυτρο και καταλήγει σε έναν από τους ενδοπαρεγκεφαλιδικούς πυρήνες. Λίγοι άξονες των κυττάρων Purkinje συνδέονται απευθείας με τους αιθουσαίους πυρήνες του εγκεφαλικού στελέχους. Η κοκκώδη ζώνη εμφανίζει πυκνή διάταξη μικρών κοκκοειδών κυττάρων με βαθυχρωματικούς πυρήνες και αραιό κυτταρόπλασμα. O άξονας τους φέρεται στη μοριώδη ζώνη, αποσχίζεται σαν δύο σε δύο κλάδους παράλληλους προς τον παρεγκεφαλιδικό φλοιό σχηματίζοντας τις παράλληλες ίνες που πορεύονται προς τις δενδριτικές διακλαδώσεις των κυττάρων Purkinje. Στη στιβάδα αυτή υπάρχουν διάσπαρτα παντού νευρογλοιακά κύτταρα και κύτταρα του Golgi. Τα κύτταρα της κοκκώδους στιβάδας με τις σφαιρικές απολήξεις των προσαγωγών ινών σχηματίζουν σύνθετες συνάψεις, τα παρεγκεφαλιδικά σπειράματα (Panagopoulos et al. 1991). Εικόνα 1: Παρουσιάζεται ο παρεγκεφαλιδικός φλοιός. Οι τρεις στιβάδες που των απαρτίζουν (1. την εξωτερική μοριώδη ζώνη, 2. τη μέση ζώνη (η στιβάδα των κυττάρων του Purkinje) και 3. την εσωτερική κοκκώδη ζώνη (Snell 1995)) καθώς και τα κύτταρα που περιέχουν. Πηγή: Neuroscience [17]

28 Από κυτταρολογικές και φυσιολογικές έρευνες αποδίδονται στην παρεγκεφαλίδα ορισμένοι βασικοί μηχανισμοί. Οι αναρριχώμενες και οι βρυώδεις ίνες αποτελούν τους δύο τύπους προσαγωγών στο φλοιό ινών που διεγείρουν τα κύτταρα του Pυrkinje. Κάθε αναρριχώμενη ίνα κάνει ένα μεγάλο αριθμό συνάψεων με τους δενδρίτες ενός και μόνο κυττάρου του Pυrkinje. Μερικοί μόνο παράπλευροι κλάδοι της ίνας συνάπτονται με τα αστεροειδή και τα καλαθιοφόρα κύτταρα. Αντίθετα οι βρυώδεις ίνες έχουν πιο έντονη διεγερτική δράση καθώς μία και μόνο ίνα μπορεί να διεγείρει χιλιάδες κύτταρα του Pυrkinje. Στη συνέχεια τα κύτταρα του Pυrkinje με τους άξονες δρουν ανασταλτικά στους παρεγκεφαλιδικούς και στους αιθουσαίους πυρήνες. Η λειτουργία των αστεροειδών, των καλαθιοφόρων και των κυττάρων Golgi πιστεύεται ότι όχι μόνο περιορίζουν την έκταση του φλοιού που διεγείρετε αλλά και επηρεάζουν το βαθμό διέγερσης των κυττάρων του Pυrkinje από τις αναρριχώμενες και βρυώδεις ίνες (Berne και Levy, 2003; Vander, et al., 2001). Σε κάθε παρεγκεφαλιδικό ημισφαίριο υπάρχει άφθονη λευκή ουσία που σχηματίζεται από τρία είδη ινών. Οι ενδογενείς ίνες που συνδέουν διάφορες περιοχές του οργάνου και δεν εξέρχονται από την παρεγκεφαλίδα. Οι προσαγωγοί ίνες που εισέρχονται στην παρεγκεφαλίδα κυρίως από τα κάτω και τα μέσα παρεγκεφαλιδικά σκέλη. Τέλος οι απαγωγοί ίνες εκπορεύονται αρχικά ως οι άξονες των κυττάρων του Pyrkinje. Οι περισσότερες από αυτές συνάπτονται με τους νευρώνες παρεγκεφαλιδικών πυρήνων και εγκαταλείπουν την παρεγκεφαλίδα μέσω των άνω και κάτω παρεγκεφαλιδικών σκελών ενώ λίγες παρακάμπτουν τους πυρήνες. Εκατέρωθεν του μέσου οβελιαίου επιπέδου υπάρχουν 4 μάζες φαιάς ουσίας, μέσα στη λευκή ουσία, που αποτελούν τους πυρήνες της παρεγκεφαλίδας (Panagopoulos et al. 1991) Οι πυρήνες είναι ο οδοντωτός, ο εμβολοειδής, ο σφαιροειδής και ο οροφιαίος (Guyton & Hall 1996; Snell 1995; Panagopoulos et al. 1991): Ο οδοντωτός, ο μεγαλύτερος όλων, στο εσωτερικό του περιέχει λευκή ουσία και αποτελείται από απαγωγές ίνες που εξέρχονται από το στόμιο προς το άνω παρεγκεφαλιδικό σκέλος. Ο εμβολοειδής ωοειδούς σχήματος που καλύπτει εν μέρει το στόμιο του οδοντωτού. Ο σφαιροειδής που αποτελείται από μικρότερες υποστρόγγυλες ομάδες μέσα στον εμβολοειδή πυρήνα. Τέλος ο οροφιαίος πυρήνας που βρίσκεται μέσα στο σκώληκα κοντά στη μέση γραμμή. Οι πυρήνες αποτελούνται [18]

29 από πολύπολους νευρώνες με απλά διακλαδιζόμενους δενδρίτες και οι άξονες τους αποτελούν τις απαγωγούς ίνες από την παρεγκεφαλίδα στα άνω και κάτω παρεγκεφαλιδικά σκέλη. Λειτουργική ανατομία της παρεγκεφαλίδας Η αρχαιοπαρεγκεφαλίδα δέχεται προσαγωγούς ίνες από το αιθουσαίο νεύρο και από τους αιθουσαίους πυρήνες. Η απαγωγός οδός προς τους κατώτερους κινητικούς νευρώνες φέρεται με το αιθουσονωτιαίο δεμάτιο, την έσω επιμήκη δεσμίδα και το δικτυωτονωτιαίο δεμάτιο. Η αρχαιοπαρεγκεφαλίδα ανταποκρίνεται σε ερεθίσματα από την αίθουσα του μέσου αυτιού και διατηρεί την ισορροπία του σώματος με την τροποποίηση του μυϊκού τόνου. Η παλαιοπαρεγκεφαλίδα δέχεται προσαγωγούς ίνες από τις ιδιοδεκτικές απολήξεις εντός των μυών και των τενόντων και από τους υποδοχείς αφής και πίεσης. Η απαγωγός οδός προς τους κατώτερους κινητικούς νευρώνες φέρεται δια του αιθουσονωτιαίου, του ερυθρονωτιαίου και του δικτυοτονωτιαίου δεματίου. Είναι ευαίσθητη στις τάσεις των μυών και των τενόντων και σε ερεθίσματα αφής και εν τω βάθει πίεσης και απαντά με τροποποίηση του μυϊκού τόνου και την συνεργιτική δράση των μυϊκών οργάνων για την διατήρηση της τάσης και την εκτέλεση των εκούσιων κινήσεων. Η νεοπαρεγκεφαλίδα δέχεται τη μεγάλη προσαγωγό φλοιογεφυροπαρεγκεφαλιδική οδό από την εγκεφαλικό φλοιό του αντίθετου ημισφαιρίου. Η απαγωγός οδός προς τους κατώτερους κινητικούς νευρώνες πραγματοποιείται μέσω του θαλάμου στην κινητική χώρα του κινητικού φλοιού και ακολούθως με την φλοιονωτιαία και την φλοιοπυρηνική προς τους κατώτερους κινητικούς νευρώνες. Η νεοπαρεγκεφαλίδα εξασφαλίζει συντονισμένες εκούσιες κινήσεις με ακριβή δύναμη, διεύθυνση και έκταση κινήσεων (Guyton & Hall 1996; Snell 1995). [19]

30 Μεγάλη σημασία έχουν δύο νευροανατομικά στοιχεία της παρεγκεφαλίδας (Berne & Levy 2003; Vander et al. 2001). Πρώτο, ο φλοιός της παρεγκεφαλίδας σε αντίθεση με αυτόν του εγκεφάλου, έχει ενιαία μικροσκοπική δομή και έρευνες δείχνουν ότι και οι λειτουργικές δραστηριότητες είναι οι ίδιες σε όλες της περιοχές του. Δεύτερο, κάθε παρεγκεφαλιδικό ημισφαίριο συνδέεται με το ίδιο ημιμόριο του σώματος. Έχει θεωρηθεί ότι η παρεγκεφαλίδα αποτελείται το σύστημα εκτίμησης του χρόνου για μικρής τάξης χρονικές διάρκειες τόσο σε ότι αφορά την κίνηση όσο και σε ότι αφορά την αντίληψη (Ivry 1996). Τη δράση της παρεγκεφαλίδας την έχουν επίσης συσχετίσει με ποικίλες λειτουργίες όπως λειτουργίες του αυτόνομου νευρικού συστήματος (Reis & Golanov 1997), την ανάπτυξη στρατηγικών πλοήγησης στο χώρο (Gandhi et al. 2000) και το μεταιχμιακό σύστημα (Berman 1997) κ.α. Επίσης η δράση της έχει συσχετιστεί και με γνωστικές (Timmann & Daum 2007) και αμιγώς νοητικές λειτουργίες (Kim et al. 1994) αλλά και με νοητικές εκπτώσεις (Schmahmann 1998). Όμως η δράση της παρεγκεφαλίδας δε σταματά μόνο στις παραπάνω λειτουργίες αλλά εμπλέκεται και στη συναισθηματική ρύθμιση και τη γνωστική λειτουργία (Bugalho et al. 2006; Baldaçara et al. 2008). Τέλος, έχει δειχθεί ότι η παρεγκεφαλίδα εμπλέκεται σε διαδικασίες μάθησης όπως η γνώση του χρόνου (Campos-Rodriguez et al. 2005), σε καταστάσεις όπως η κατάθλιψη αλλά και σε εκδηλώσεις άγχους που χαρακτηρίζουν πολλές ασθένειες (Baldaçara et al. 2008). O Εγκεφαλικός φλοιός Δομή του φλοιού των εγκεφαλικών ημισφαιρίων Ο εγκεφαλικός φλοιός αποτελείται από φαιά ουσία και εκτιμάται ότι συνολικά περιέχει 10 δισεκατομμύρια νευρώνων. Η συνολική επιφάνεια του φλοιού αυξάνεται με τη δημιουργία ελίκων που χωρίζονται μεταξύ τους με αύλακες (ή σχισμές). Το πάχος του φλοιού ποικίλει από 1,5 έως 4,5 χιλιοστά. Ο φλοιός, όπως εν γένει η φαιά ουσία οπουδήποτε στο ΚΝΣ, αποτελείται από νευρικά κύτταρα, νευρικές ίνες, [20]

31 νευρογλοία και αιμοφόρα αγγεία. Στο φλοιό απαντώνται 5 είδη κυττάρων, τα πυραμοειδή, τα αστεροειδή, τα ατρακτοειδή, τα οριζόντια κύτταρα του Cajal και τα κύτταρα του Martinotti (Snell 1995). Τα πυραμοειδή κύτταρα που συμπεριλαμβάνουν και τα γιγαντιαίοπυραμοειδή κύτταρα του Betz. Οι κορυφές των κυττάρων στρέφονται προς την εξωτερική επιφάνεια του φλοιού, από τις γωνίες της βάσης εκπορεύουν οι βασικοί δενδρίτες με πολλές δενδριτικές άκανθες. Ο άξονας του πυραμοειδούς κυττάρου καταλήγει σε υποκείμενες βαθύτερες στιβάδες του φλοιού ή στη λευκή ουσία του ημισφαιρίου. Τα αστεροειδή κύτταρα (ή κοκκοειδή κύτταρα) έχουν πολλαπλώς διακλαδιζόμενους δενδρίτες και βραχύ άξονα που καταλήγει σε παρακείμενο νευρώνα. Τα ατρακτοειδή έχουν μακρύ άξονα που εισέρχεται στη λευκή ουσία. Είναι συγκεντρωμένα κυρίως στις βαθύτερες στιβάδες του φλοιού. Τα οριζόντια κύτταρα του Cajal είναι οριζοντίως προσανατολισμένα στην επιπολής στιβάδα του φλοιού και συνάπτονται με δενδρίτες πυραμοειδών κυττάρων. Τα κύτταρα του Martinotti απαντώνται σε όλες τις στιβάδες του φλοιού και ο άξονας του καταλήγει σε πιο επιφανειακή στιβάδα (Berne & Levy 2003; Vander et al. 2001). Για περιγραφικούς κυρίως λόγους ο φλοιός των ημισφαιρίων υποδιαιρείται σε στιβάδες ανάλογα με τον τύπο, την πυκνότητα και την διάταξη των κυττάρων σε μοριώδη στιβάδα ή πλεγματώδη στιβάδα, σε έξω κοκκώδη στιβάδα, σε έξω στιβάδα πυραμοειδών κυττάρων, σε έσω κοκκώδη στιβάδα, σε στιβάδα των γαγγλιακών κυττάρων ή έσω στιβάδα πυραμοειδών κυττάρων και σε στιβάδα των πολυμόρφων κυττάρων. Οι νευρικές ίνες του φλοιού των ημισφαιρίων διακρίνονται λόγω της κατεύθυνσης του σε ακτινοειδείς και σε οριζόντιες εφαπτόμενες. Ο φλοιός λειτουργικά είναι οργανωμένος σε κάθετες λειτουργικές μονάδες. Μια τέτοια μονάδα αποτελείται από προσαγωγές ίνες, συνδετικούς νευρώνες και απαγωγές ίνες (Guyton & Hall 1996). [21]

32 Φλοιώδη κέντρα Κατά τον Snell (Snell 1995) η υποδιαίρεση των φλοιωδών περιοχών σε κινητικές και σε αισθητικές είναι εσφαλμένη γιατί πολλές από τις αισθητικές χώρες είναι πολύ πιο εκτεταμένες και επίσης είναι γνωστό ότι μπορούν να προκληθούν κινητικές αντιδράσεις από διέγερση αισθητικών περιοχών. Έτσι για την περιγραφή των διαφόρων περιοχών του φλοιού θα πρέπει να χρησιμοποιείται η τοπογραφική τους ορολογία, μετωπιαίος λοβός, βρεγματικός λοβός, ινιακός λοβός και κροταφικός λοβός. Εικόνα 2: Οι τέσσερεις λοβοί του εγκεφάλου (μετωπιαίος λοβός, βρεγματικός λοβός, ινιακός λοβός και κροταφικός λοβό). Πηγή: Διαδικτυακό Επιστημονικό Πανεπιστήμιο Ο μετωπιαίος λοβός βρίσκεται στην πρόσθια κεντρική έλικα και ονομάζεται πρόσθια κεντρική χώρα και μπορεί να υποδιαιρεθεί σε οπίσθια περιοχή ή κινητική χώρα ή πρωτογενής κινητική χώρα και σε πρόσθια περιοχή ή προκινητική χώρα ή δευτερογενής κινητική χώρα. Ο ηλεκτρικός ερεθισμός της κύριας κινητικής χώρας προκαλεί μεμονωμένες κινήσεις στο αντίθετο ημιμόριο του σώματος αλλά και [22]

33 συνεργατικές συστολές ομάδων μυών για την επιτέλεση μιας απλής συγκεκριμένης κίνησης (Snell 1995; Berne & Levy 2003). Όσον αφορά τις κινήσεις, οι διάφορες περιοχές του σώματος αντιπροσωπεύονται επί της πρόσθιας κεντρικής έλικας, σε ανεστραμμένη διάταξη. Η λειτουργία της κύριας κινητικής περιοχής είναι να διεκπεραιώνει τις εκάστοτε κινήσεις των διάφορων μερών του σώματος γι αυτό το λόγο δέχεται πλήθος προσαγωγών ινών από την παρακινητική περιοχή, τον αισθητικό φλοιό, το θάλαμο, την παρεγκεφαλίδα και τα βασικά γάγγλια. Η κύρια κινητική περιοχή δεν σχεδιάζει τον τρόπο της κίνησης αλλά είναι ο τελικός σταθμός για τη μετατροπή του σχεδίου σε εκτέλεση κίνησης. Η προκινητική περιοχή δέχεται πλήθος προσαγωγών ινών από το φλοιό, το θάλαμο και τα βασικά γάγγλια. Η λειτουργία της προκινητικής περιοχής είναι να εναποθηκεύει προγράμματα κινητικών αλληλουχιών σχεδιασμένα βάσει προηγούμενης εμπειρίας (κέντρο του εξωπυραμιδικού συστήματος). Με αυτόν τον τρόπο προγραμματίζει τη δραστηριότητα της κύριας κινητικής περιοχής. Η παραπληρωματική κινητική περιοχή βρίσκεται στην μετωπιαία έλικα και ο ερεθισμός της προκαλεί κινήσεις των αντίπλευρων άκρων. Το μετωπιαίο οφθαλμικό πεδίο βρίσκεται στην πρόσθια κεντρική έλικα. Ο ηλεκτρικός ερεθισμός της προκαλεί συζυγείς κινήσεις των οφθαλμών ιδίως προς την αντίθετη πλευρά και θεωρείται ότι ελέγχει τις εκούσιες κινήσεις των βολβών. Το κινητικό κέντρο του λόγου εντοπίζεται στην κάτω μετωπιαία έλικα και προκαλεί τον σχηματισμό των λέξεων με τις συνδέσεις που έχει με την παρακείμενη κινητική ώρα έτσι ώστε να ρυθμίζονται οι συνδυασμένες κινήσεις των μυών, των χειλιών, της γλώσσας, του στόματος κλπ. Ο προμετωπιαίος φλοιός βρίσκεται μπροστά από την πρόσθια κεντρική περιοχή και έχει σχέση με τη διάπλαση της προσωπικότητας του ατόμου και του βάθους των ψυχικών συναισθημάτων του. Ο βρεγματικός λοβός, η κύρια σωματοαισθητική περιοχή καταλαμβάνει την οπίσθια κεντρική έλικα στη έξω επιφάνεια του ημισφαιρίου και το οπίσθιο τμήμα του παράκεντρου λοβίου και αποτελεί το κέντρο της κοινής αισθητικότητας δηλαδή της αφής, πίεσης, πόνου, θερμοκρασίας και μυϊκής αίσθησης. Βλάβες του συνεπάγονται ημιαναισθησία του αντίθετου ημιμορίου του σώματος. Τα επιμέρους κέντρα για τις [23]

34 διάφορες περιοχές του αντίθετου ημιμορίου του σώματος είναι αντιστρόφως διατεταγμένα. Η δευτερογενής σωματοαισθητική χώρα βρίσκεται στο άνω χείλος του οπίσθιου κλάδου της πλάγιας σχισμής και πιστεύεται ότι έχει σχέση με τα νωτιαιθαλαμικά δεμάτια. Η συνειρμική σωματοαισθητική χώρα καταλαμβάνει το άνω βρεγματικό λοβίο. Η κύρια λειτουργία της συνιστάται στο συνειρμό των διαφόρων σωματοαισθητικών μηνυμάτων (Berne & Levy 2003; Snell 1995). Ο ινιακός λοβός, η κύρια οπτική περιοχή, το κύριο κέντρο της όρασης καταλαμβάνει τα τοιχώματα του οπίσθιου τμήματος της πληκτραίας σχισμής. Το φλοιώδες κέντρο της όρασης δέχεται τις νευρικές ίνες προερχόμενες από το κροταφικό ημιμόριο του ομόπλευρου αμφιβληστροειδούς και από το ρινικό ημιμόριο του αντίπλευρου αμφιβληστροειδούς. Επομένως το δεξί ήμισυ του οπτικού πεδίου αντιπροσωπεύεται στον οπτικό φλοιό του αριστερού ημισφαιρίου και το αντίστροφο. Το συνειρμικό κέντρο της όρασης ( ή μνημονικό οπτικό κέντρο) περιβάλλει την κύρια οπτική περιοχή και τη λειτουργία του είναι να συσχετίζει και να συγκρίνει τα παραχθέντα οπτικά συναισθήματα κατά των παρελθόντων εντυπώσεων, έτσι ώστε το άτομο να μπορεί να αναγνωρίσει τα αντικείμενα που βλέπει. (Snell 1995; Berne & Levy 2003). Ο κροταφικός λοβός, η κύρια ακουστική περιοχή (το φλοιώδες κέντρο της ακοής), καταλαμβάνει την έλικα του Heschl, στο κάτω τοίχωμα της πλάγιας σχισμής. Το πρόσθιο τμήμα της δέχεται ήχους χαμηλής συχνότητας και το οπίσθιο τους ήχους υψηλής συχνότητας. Το συνειρμικό κέντρο της ακοής (το μνημονικό ακουστικό κέντρο) βρίσκεται πίσω από την κύρια ακουστική περιοχή, στην πλάγια σχισμή και στην άνω κροταφική έλικα. Χρησιμεύει για την κατανόηση των ήχων. Το αισθητικό κέντρο του λόγου του Wernicke (οπτικό και ακουστικό κέντρο λόγου) εντοπίζεται κυρίως στο οπίσθιο τμήμα της άνω κροταφικής έλικας επεκτεινόμενο και γύρω από το οπίσθιο άκρο της πλάγιας σχισμής στον βρεγματικό λοβό. Η χώρα του Wernicke συνδέεται με την χώρα του Broca (κινητικό κέντρο λόγου). Χρησιμεύει για την κατανόηση του γραπτού και του προφορικού λόγου (Berne & Levy 2003; Snell 1995). [24]

35 Άλλα φλοιώδη κέντρα είναι το κέντρο της γεύσης στο κάτω άκρο της οπίσθιας κεντρικής έλικας, η αιθουσαία χώρα κοντά στην οπίσθια κεντρική έλικα και η νήσος. O Ιππόκαμπος Δομή του Ιππόκαμπου Ο ιππόκαμπος εντοπίζεται στο βάθος του κροταφικού λοβού, και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην αποθήκευση και ανάκληση νέων πληροφοριών που εμπίπτουν στον τύπο της δηλωτικής ή έκδηλης μνήμης. Είναι επίμηκες κυρτό έπαρμα φαιάς ουσίας που προβάλλει σε όλο το μήκος του εδάφους του κροταφικού (κάτω) κέρατος της πλαγίας κοιλίας. Το πρόσθιο άκρο του είναι αποπλατυσμένο και αποτελεί τον πόδα του ιπποκάμπου, που φέρει 3-4 υποστρόγγυλα επάρματα, τα δακτυλιοειδή επάρματα του ιπποκάμπου. Το όνομα του προέρχεται από τον θαλάσσιο ιππόκαμπο με τον οποίο μοιάζει στην κατά μέτωπο διατομή. Εικόνα 3: Ο Ιππόκαμπος. Πηγή: oldtownhypnotherapy.co.uk [25]

36 Οι κύριοι και πρωτεύοντες νευρώνες του ιππόκαμπου ονομάζονται πυραμιδικοί, λόγω του σχήματος του σώματός τους. Παρά το μεγάλο μέγεθός τους (~30μm), η ταχύτητα εκπυρσοκρότησης τους περιορίζεται (Wu & Wei 2002). Το μέγεθος των σωμάτων τους και οι προσαγωγές ίνες που δέχονται ήταν η βάση του διαχωρισμού του ιππόκαμπου κατά μήκος του εγκάρσιου άξονά του σε τρεις περιοχές. Η πυραμιδική στοιβάδα όπου είναι συγκεντρωμένα τα σώματα όλων των πυραμιδικών νευρώνων. Η ακτινωτή στοιβάδα που βρίσκεται πάνω από τη πυραμιδική στοιβάδα, προς την επιφάνεια του φλοιού, όπου εκτείνονται οι κορυφαίοι δενδρίτες των πυραμιδικών νευρώνων. Η πολυμορφική στιβάδα, που βρίσκεται κάτω από την πυραμιδική στοιβάδα, όπου εκτείνονται οι πυραμιδικοί νευρώνες. Πάνω από την στιβάδα του ιππόκαμπου, πάνω από την ακτινωτή στιβάδα, βρίσκεται η λεπτή βοκτριώδης-μοριώδης στιβάδα και κάτω από τη στιβάδα του ιπποκάμπου, κάτω από την πολυμορφική στιβάδα, βρίσκεται μια λεπτή στοιβάδα εμμύελων ινών. Μέσα από την βοκτριώδης-μοριώδης στιβάδα διέρχεται η διατιτραίνουσα οδός από τον ενδορινικό φλοιό προς την οδοντωτή έλικα. Ο ιπποκάμπειος σχηματισμός συγκροτείται από τρεις διακριτές περιοχές που περιλαμβάνουν την οδοντωτή έλικα (DG), τον ιππόκαμπο ο οποίος υποδιαιρείται σε 3 κύρια πεδία το υπόθεμα (CA1), το προϋπόθεμα (CA2), το παραϋπόθεμα (CA3) και την ιπποκάμπεια έλικα. Το υπόθεμα, το προϋπόθεμα και το παραϋπόθεμα αναφέρονται συνήθως μαζί και ως υποθεματικό σύμπλοκο (Amaral & Witter 1989). Στη συνέχεια από τα κοκκοειδή κύτταρα της οδοντωτής έλικας ξεκινούν οι βρυώδεις ίνες και καταλήγουν στους κορυφαίους δενδρίτες των πυραμιδικών κυττάρων του παραϋποθέματος. Παρόλο που κάποιοι παράπλευροι κλάδοι των αξόνων των πυραμιδικών κυττάρων του παραϋποθέματος επιστρέφουν στην οδοντωτή έλικα, δεν νευρώνουν τα κοκκοειδή κύτταρα οπότε το κύκλωμα παραμένει μονόδρομο. Στη συνέχεια οι παράπλευρες ίνες του Schaffer των πυραμιδικών κυττάρων του παραϋποθέματος συνάπτονται στους κορυφαίους δενδρίτες των πυραμιδικών κυττάρων του υποθέματος επίσης μονόδρομα. Τα πυραμιδικά κύτταρα τέλος του υποθέματος προβάλουν μέσω του υποθέματος στον ενδορινικό φλοιό. Όλες οι παραπάνω προβολές είναι διεγερτικές και γλουταμινεργικές (Amaral & Witter 1989). Η παραπάνω συνδεσμολογία αποτελεί το βασικό τρισυναπτικό κύκλωμα του [26]

37 ιππόκαμπου, το οποίο επαναλαμβάνεται σε όλο τον επιμήκη άξονά του (Shepherd 2004; Amaral & Witter 1989). Εικόνα 4: Εγκάρσια τομή του διαφραγματικού ιππόκαμπου όπου φαίνεται το ενδογενές τρισυναπτικό ιπποκαμπικό κύκλωμα. Πηγή: Centre for Synaptic Plasticity, University of Bristol. Ο κύριος κυτταρικός τύπος που απαντάται στην οδοντωτή έλικα είναι το κοκκοειδές κύτταρο. Η οδοντωτή έλικα είναι στενή λωρίδα φαιάς ουσίας με οδοντώματα μεταξύ της παρυφής του ιπποκάμπου και της ιπποκαμπείας έλικας. Αποτελείται από τρεις στιβάδες. Πλησιέστερα προς την ιπποκαμπική σχισμή υπάρχει μια σχετικώς ακυτταρική στιβάδα, η μοριώδης στιβάδα. Βαθύτερα αυτής υπάρχει η κύρια κυτταρική στιβάδα που λέγεται κοκκοειδής στιβάδα και αποτελείται από τα κοκκοειδή κύτταρα διαταγμένα πυκνά σε στήλες. Οι δύο αυτές στιβάδες σχηματίζουν μία δομή σε σχήμα U ή V, ανάλογα με το διαφραγματο/κροταφικό επίπεδο, περικλείοντας μια κυτταρική στιβάδα (την τρίτη στιβάδα της οδοντωτής έλικας) που ονομάζεται πολυμορφική (Snell 1995). [27]

38 Εκτός από τους πυραμιδικούς νευρώνες του ιπποκάμπου, ένας μεγάλος αριθμός δευτερευόντων νευρώνων εξαπλώνεται σε όλες τις στιβάδες του ιπποκάμπου. Η συντριπτική πλειοψηφία τους είναι GABAεργικοί που αν και καλούνται και ενδονευρώνες, κάποιοι από αυτούς προβάλλουν σε μεγάλες (Buckmaster et al. 1996). Οι ενδονευρώνες συνάπτονται τόσο με πυραμιδικούς, όσο και με άλλους ενδονευρώνες (Gulyás et al. 1999), σχηματίζοντας δίκτυα αμοιβαίας αναστολής, σημαντικά στη δημιουργία ορισμένων ρυθμών (Wang & Buzsáki 1996). Λειτουργία του ιπποκάμπου Είναι γενικά γνωστό ότι ο ιππόκαμπος και άλλες περιοχές του κροταφικού λοβού είναι σημαντικές για τη μνημονική λειτουργία. Ιστορικά, η πιο επικρατούσα άποψη, για τη λειτουργία του ιπποκάμπου, υποστήριζε ότι ο ιππόκαμπος σχετιζόταν με την αίσθηση της όσφρησης. Σήμερα θεωρείται ότι αυτό αποτελεί την πρωταρχική του λειτουργία εξελικτικά. Με το πέρασμα των χρόνων έγινε φανερό ότι ο ιππόκαμπος ανήκε στο μεταιχμιακό. Πιο πρόσφατες μελέτες σε ασθενείς με βλάβες περιορισμένες αποκλειστικά στον ιππόκαμπο (Zola-Morgan et al. 1986; Rempel- Clower et al. 1996), υπέδειξαν τον ιππόκαμπο ως την υπεύθυνη δομή για πολλές από τις διαδικασίες μνήμης του κεντρικού κροταφικού λοβού. Ο ιππόκαμπος φαίνεται ότι είναι μόνο παροδικός χώρος αποθήκευσης της μακρόχρονης μνήμης και ότι τελικά μεταβιβάζει σε άλλες περιοχές τις πληροφορίες που αποκτήθηκαν, πιθανώς στο φλοιό των εγκεφαλικών ημισφαιρίων για μόνιμη αποθήκευση. Ο ιππόκαμπος μπορεί να μην αποθηκεύει καθόλου μακρόχρονες πληροφορίες αλλά να χρησιμεύει ως συνεργάτης που βοηθά στην αποθήκευση των πληροφοριών οι οποίες υπέστησαν αρχικά επεξεργασία από τον κάτω κροταφικό φλοιό. Επομένως, ο ιππόκαμπος μπορεί να είναι είτε σταθμός για τη μακρόχρονη μνήμη είτε σύστημα διευκόλυνσης το οποίο είναι σημαντικό για την αποθήκευση της μνήμης κάπου αλλού στον εγκέφαλο Νευροφυσιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι ο ιππόκαμπος παίζει σημαντικό ρόλο στη μνήμη και τη μάθηση και ειδικότερα στη λειτουργία της βραχυπρόθεσμης λειτουργικής μνήμης και της μάθησης (Fell et al. 2001; Eichenbaum 2004; Jeffery & [28]

39 Hayman 2004), στη χωρική μνήμη (spatial memo) (Morris et al. 1982; O Keefe & Dostrovsky 1971) και στην μνήμης εργασίας working memory(miyamoto et al. 1987; Olton et al. 1978; Zola-Morgan et al. 1989). Πρόσφατες επίσης μελέτες έχουν δείξει ότι οι δυο πόλοι του ιππόκαμπου συμμετέχουν με διαφορετικό τρόπο στις διαδικασίες της μνήμης και της μάθησης (Bannerman et al. 2004; Sullivan Giovanello et al. 2004; Rudy & Matus-Amat 2005; Hobin et al. 2006). Ακόμα η δυσλειτουργία της μάθησης σε ηλικιωμένους επίμυες έχει συσχετιστεί με το μέγεθος των αλλαγών που σχετίζονται με την ηλικία στις νευροχημικές και στις νευροφυσιολογικές παράμετρους στον ιππόκαμπο (Barnes & McNaughton 1985; Gage et al. 1984; Ingram et al. 1981). Το ραβδωτό Βασικά γάγγλια Βασικά γάγγλια (βασικοί πυρήνες) είναι ένα σύνολο πυρήνων (μορφολογικώς ευκρινείς μάζες φαιάς ουσίας) που βρίσκονται στο εσωτερικό κάθε εγκεφαλικού ημισφαιρίου και συμμετέχουν στον έλεγχο της στάσης και των εκούσιων κινήσεων. Απαντώνται στον βασικό τελικό εγκέφαλο (κάποιοι πυρήνες ανήκουν στον διεγκέφαλο και τον μεσεγκέφαλο) και απαρτίζονται από πέντε αλληλοσυνδεόμενους πυρήνες: τον κερκοφόρο πυρήνα (caudate nucleus), το κέλυφος (putamen), την ωχρά σφαίρα (globus palidus), τη μέλαινα ουσία (substantia nigra), και τον υποθαλάμιο πυρήνα (subthalamic nucleus) (Nieuwenhuys et al. 1988). Ο κερκοφόρος πυρήνας και το κέλυφος συναποτελούν το ραχιαίο ραβδωτό (ή νευροραβδωτό). Αυτό έχει καθιερωθεί γιατί ενώ οι δύο δομές χωρίζονται μερικώς από την έσω κάψα, είναι παρόμοιες δομικά και λειτουργικά και παράλληλα γεφυρώνονται από πολλές ομάδες κυττάρων. [29]

40 Εικόνα 5: Εγκάρσια τομή εγκεφαλικών ημισφαιρίων στην οποία φαίνονται τα βασικά γάγγλια και οι πυρήνες τους: ο κερκοφόρος πυρήνας (caudate nucleus), το κέλυφος (putamen), η ωχρά σφαίρα (globus palidus), η μέλαινα ουσία (substantia nigra), και ο υποθαλάμιος πυρήνας (subthalamic nucleus). Πηγή: (Nieuwenhuys et al. 1988). Το ραβδωτό σώμα (corpus striatum) υποδιαιρείται σε δύο πυρήνες, από τη δέσμη των νευρικών ινών (που απαρτίζουν την έσω κάψα) που το διαπερνά. Οι δύο πυρήνες είναι ο κερκοφόρος πυρήνας (caudate nucleus) και ο φακοειδής πυρήνας (lenticular nucleus). Ο φακοειδής πυρήνας χωρίζεται με λευκή ουσία σε δύο ανισομερή τμήματα, σε ένα έξω και μεγαλύτερο τμήμα, το κέλυφος (putamen), και σε ένα έσω και μικρότερο τμήμα, την ωχρά σφαίρα (globus pallidus). Η ωχρά σφαίρα χωρίζεται σε δύο μοίρες, την έξω (globus pallidus external, GPe) και την έσω (globus pallidus internal, GPi). Η μέλαινα ουσία είναι ένας μεγάλος κινητικός πυρήνας μεταξύ της καλύπτρας και της βάσης του εγκεφαλικού σκέλους και εκτείνεται σε όλο το μήκος του μέσου και χωρίζεται στην συμπαγή και την δικτυωτή μοίρα (substantia nigra pars compacta, SNc και substantia nigra pars reticulata, SNr). Τέλος, ο υποθαλάμιος πυρήνας εντοπίζεται στο όριο μεταξύ διεγκεφάλου και μεσεγκεφάλου και αποτελεί την ταχύτερη έξοδο των βασικών γαγγλίων προς τον φλοιό. [30]

41 Σημαντική είναι η συμμετοχή των βασικών γαγγλίων σε πολλά νευρωνικά μονοπάτια επηρεάζοντας συναισθηματικές, κινητικές και νοητικές λειτουργίες. Ακόμα τα βασικά γάγγλια εμπλέκονται σε έναν σημαντικό αριθμό κινητικών λειτουργιών και ιδιαίτερα στην έναρξη των κινητικών αποκρίσεων (Hauber 1998). Τα βασικά γάγγλια είναι η περιοχή του εγκεφάλου με τη μεγαλύτερη ποικιλομορφία σε νευροδιαβιβαστές. Ραβδωτό Το ραβδωτό ή νεοραβδωτό αποτελείται από τον κερκοφόρο πυρήνα και το κέλυφος. Ο όρος ραβδωτό χρησιμοποιήθηκε εξαιτίας της ραβδοειδούς εμφάνισής που έχει. Αυτή η ραβδωειδής εμφάνιση προκύπτει από τις ταινίες φαιάς ουσίας που διασχίζουν την έσω κάψα και συνδέουν τον κερκοφόρο πυρήνα με το κέλυφος του φακοειδούς πυρήνα. Οι δύο αυτές δομές αναπτύσσονται από την ίδια περιοχή του πρόσθιου εγκεφάλου, αποτελούνται από τα ίδια είδη κυττάρων σε όλη τους την έκταση και συνενώνονται στο πρόσθιο τμήμα τους (Panagopoulos et al. 1991). Ο κερκοφόρος πυρήνας έχει το σχήμα του λατινικού γράμματος C και βρίσκεται στην έξω επιφάνεια της πλάγιας κοιλίας. Κατ ουσία, είναι μία μάζα φαιάς ουσίας που βρίσκεται σε στενή σχέση με την πλάγια κοιλία, εξωτερικά του θαλάμου. Υποδιαιρείται σε κεφαλή, σώμα και ουρά (το όνομά του κατά λέξη σημαίνει πυρήνας που φέρει ουρά). Η ουρά του κερκοφόρου πυρήνα καταλήγει στην αμυγδαλή με την οποία συνενώνεται. Το κέλυφος πρόκειται για το έξω και μεγαλύτερο τμήμα του φακοειδούς πυρήνα, που αναφέρθηκε και παραπάνω. Στο κατώτερο σημείο του το κέλυφος συνδέεται με την κεφαλή του κερκοφόρου πυρήνα. Βρίσκεται δίπλα στο πρόσθιο σκέλος της έσω κάψας. Στο ραβδωτό στους επίμυς δεν είναι αναπτυγμένη η εσωτερική κάψα και θεωρείται μία ενιαία δομή. Ο διαχωρισμός, η σύγκλιση και η απόκλιση είναι τρία βασικά χαρακτηριστικά της οργάνωσης του ραβδωτού (Parent & Hazrati 1995). Πιο συγκεκριμένα το ραβδωτό μπορεί να υποδιαιρεθεί με βάση τη λειτουργική εξειδίκευση των [31]

42 υποπεριοχών του σε κινητικό (motor), συνειρμικό (associative) και μεταιχμιακό (limbic). Στον επίμυ το κινητικό ραβδωτό σώμα καταλαμβάνει την πλευρική περιοχή του πυρήνα, το συνειρμικό ραβδωτό σώμα τη μέση περιοχή του πυρήνα ενώ το μεταιχμιακό ραβδωτό είναι το κοιλιακό ραβδωτό και ο επικλινής πυρήνας. Τα φαινόμενα της σύγκλισης και της απόκλισης δίνουν τη δυνατότητα ολοκλήρωσης και μετασχηματισμού της πληροφορίας από πολλαπλές περιοχές του φλοιού. Διαχωρισμός: Η τοπογραφικά οργανωμένη προβολή του εγκεφαλικού φλοιού στο ραβδωτό σώμα, αποτελεί ένα βασικό γνώρισμα των βασικών γαγγλίων γενικότερα και αποτελεί τη βάση για την ύπαρξη διακριτών, λειτουργικά διαφορετικών κυκλωμάτων στα βασικά γάγγλια. Η ύπαρξη διακριτών, λειτουργικά διαφορετικών κυκλωμάτων εξασφαλίζει στη φλοιοραβδωτή προβολή το χαρακτήρα της παράλληλης οργάνωσης και επεξεργασίας της πληροφορίας. Σύγκλιση: Το εκτεταμένο δενδριτικό πεδίο των ακανθωτών νευρώνων τύπου Ι επιτρέπει στους νευρώνες εξόδου του ραβδωτού να δέχονται συνάψεις από περιοχές του φλοιού σχετικώς απομακρυσμένες μεταξύ τους, και κατ αυτόν τον τρόπο να επέρχεται σύγκλιση πληροφορίας από διαφορετικές φλοιϊκές περιοχές και συνεπώς ολοκλήρωση φυσιολογικώς σχετιζόμενων παραμέτρων. Απόκλισης: Επιπλέον κάθε φλοιϊκή περιοχή είναι δυνατό να προβάλλει σε περισσότερες από μία υποπεριοχές του ραβδωτού. Έτσι με αυτό τον τρόπο αυτό η φλοιραβδωτή προβολή εμφανίζει το γνώρισμα της απόκλισης. Λειτουργία του Ραβδωτού Ο κερκοφόρος πυρήνας και το κέλυφος που συναποτελούν το ραβδωτό αποτελούν την κύρια πηγή εισόδου πληροφοριών των βασικών γαγγλίων. Δέχονται πληροφορίες από το φλοιό και τους ενδοπετάλιους πυρήνες του θαλάμου. Ο πυρήνας του κελύφους σχετίζεται κυρίως με τον κινητικό έλεγχο. Ο κερκοφόρος πυρήνας μετέχει στον έλεγχο των οφθαλμών και σε ορισμένες γνωστικές λειτουργίες. Λειτουργίες όπως τα συναισθήματα, ο κινητικός έλεγχος, η γνωστική λειτουργία, και η μνήμη-μάθηση έχουν σχετιστεί με τις προβολές που ξεκινούν από τον φλοιό προς το [32]

43 ραβδωτό, την ωχρά σφαίρα, το θάλαμο (Pennartz et al. 2009). Μελέτες, επίσης, έχουν δείξει ότι ραχιαίο το ραβδωτό παίζει σημαντικό ρόλο σε διαδικασίες μάθησης, ανταμοιβής (Yin et al. 2005) και λήψης αποφάσεων (Schultz 2016). Το νεοραβδωτό περιλαμβάνει χολινεργικούς νευρώνες και δέχεται γλουταμινεργική νεύρωση από το φλοιό και ντοπαμινεργική νεύρωση από τη συμπαγή μοίρα της μέλαινας ουσίας Το νεοραβδωτό θεωρείται ότι αποτελεί περιοχή στην οποία βρίσκονται αποθηκευμένα κινητικά προγράμματα. Συνεργάζεται με το μετωπιαίο φλοιό και αναστέλλει την εκδήλωση κινήσεων ή συνειρμών που δεν ταιριάζουν με μια συγκεκριμένη δράση. Το νεοραβδωτό έχει επίσης ενοχοποιηθεί και για την εμπλοκή του σε ψυχικές διαταραχές (Παναγής 2002). Το συναίσθημα του φόβου φαίνεται να εμπλέκεται με αλληλεπιδράσεις ραβδωτού και αμυγδαλής με το ραβδωτό να ενισχύει την οργανωμένη δράση για την διαφυγή από το φόβο (Hartley & Phelps 2010). Η αποφυγή πράξεων που ελαχιστοποιούν την έκθεση σε συναισθήματα φόβου αποτελεί και αυτή ένα ρόλο του ραβδωτού, όσον αφορά τη μάθηση (LeDoux 2003). Ακόμα, έχει παρατηρηθεί ότι το ραβδωτού σε συνεργασία με την αμυγδαλή συμμετέχει και στην ενίσχυση των διαδικασιών της μάθησης (Delgado et al. 2009). Αξίζει να σημειωθεί ότι υποστηρίζεται ότι η ακετυλοχολίνη, που δρα σε συγκεκριμένες περιοχές του ραβδωτού, είναι αυτή που ρυθμίζει την ελαστικότητα των συμπεριφορικών αποκρίσεων (Ragozzino et al. 2009). Επίσης κρίσιμες για την ευέλικτη συμπεριφορά αλλά και τις συμπεριφορές που είναι κατευθυνόμενες από στόχους είναι προβολές στο ραχιαίο ραβδωτό από τον ενδιάμεσο προμετωπιαίο φλοιό (Bissonette & Roesch 2016). [33]

44 3. ΣΥΝΑΨΕΙΣ Το νευρικό σύστημα αποτελείται από ένα τεράστιο αριθμό νευρώνων οι οποίοι συνδέονται λειτουργικά και όχι ανατομικά σχηματίζοντας οδούς μεταφοράς των ώσεων. Η θέση όπου δύο νευρώνες έρχονται σε χωρική συνύρπαξη και πραγματοποιείται λειτουργική διανευρωτική επικοινωνία ονομάζεται σύναψη. (Berne & Levy 2003). Κατά την πρόσφατη βιβλιογραφία υπάρχουν δύο ειδών συνάψεις οι ηλεκτρικές και οι χημικές (Berne & Levy 2003; Vander et al. 2001). Στην ηλεκτρική σύναψη δύο διεγέρσιμα κύτταρα επικοινωνούν με άμεση διέλευση ηλεκτρικού ρεύματος. Η κυτταροπλασματικές μεμβράνες των προσυναπτικών και μετασυναπτικών κυττάρων ενώνονται με χασματικές συνδέσεις. Αυτού του είδους οι συνάψεις είναι σχετικά σπάνιες στο νευρικό σύστημα των θηλαστικών. Στις χημικές συνάψεις ένας εξωκυττάριος χώρος 10 έως 20nm, η συναπτική σχισμή, χωρίζει τον προσυναπτικό με τον μετασυναπτικό νευρώνα και εμποδίζει την απευθείας διάδοση του ρεύματος από τον προσυναπτικό στον μετασυναπτικό κύτταρο. Τα σήματα μπορούν να μεταδοθούν μέσω της συναπτικής σχισμής με τη βοήθεια μιας χημικής ουσίας, του νευροδιαβιβαστή, που απελευθερώνεται από τα τελικά κομβία του τελικού άξονα. Το προσυναπτικό κομβίο περιέχει πολλά μικρά προσυναπτικά κυστίδια που περιέχουν τον νευροδιαβιβαστή. Τα κυστίδια συντήκονται με την προσυναπτική μεμβράνη και αποβάλλουν το νευροδιαβιβαστή στο συναπτικό διάστημα με την διαδικασία της εξωκύττωσης (Kandel et al. 2006). Τα μιτοχόνδρια χορηγούν την απαραίτητη ενέργεια (ATP) για τη σύνθεση νέας νευροδιαβιβαστικής ουσίας. Οι χημικές συνάψεις είναι είτε ανασταλτικές είτε διεγερτικές. Διεγερτικές είναι όταν ο νευροδιαβιβαστής προκαλεί εκπόλωση στη μεμβράνη του μετασυναπτικού κυττάρου και ανασταλτικές όταν ο νευροδιαβιβαστής προκαλεί υπερπόλωση στη μεμβράνη του μετασυναπτικού κυττάρου. Το διεγερτικό ή ανασταλτικό αποτέλεσμα στην μετασυναπτική μεμβράνη εξαρτάται από το άθροισμα των μετασυναπτικών αντιδράσεων στις διάφορες συνάψεις. Αν το συνολικό [34]

45 αποτέλεσμα είναι η εκπόλωση, τότε θα διεγερθεί ο νευρώνας και θα προκληθεί δυναμικό ενέργειας στο αρχικό τμήμα του άξονα και η νευρική ώση θα πορευτεί κατά μήκος του άξονα. Αν, αντίθετα, το συνολικό αποτέλεσμα είναι η υπερπόλωση ο νευρώνας θα ανασταλεί και δεν θα προκληθεί νευρική ώση (Berne & Levy 2003; Vander et al. 2001; Kandel et al. 2006) Οι νευροδιαβιβαστές Νευροδιαβιβαστές είναι οι χημικές ουσίες του νευρικού συστήματος που απελευθερώνονται από τις αξονικές απολήξεις των νευρικών κυττάρων στην περιοχή των συνάψεων και επιδρούν στα μετασυναπτικά κύτταρα μεταβάλλοντας την ηλεκτρική τους δραστηριότητα, προκαλώντας είτε εκπόλωση είτε υπερπόλωση, και κατά συνέπεια αυξάνοντας ή μειώνοντας την πιθανότητα πυροδότησης στα κύτταρα αυτά. Οι ενώσεις που μπορεί να λειτουργούν ως νευροδιαβιβαστές ονομάζονται υποψήφιοι ή υποτιθέμενοι νευροδιαβιβαστές. Οι υποψήφιοι νευροδιαβιβαστές είναι συνήθως συγκεντρωμένοι σε συγκεκριμένες νευρικές οδούς. Είναι συχνά δύσκολο να αποδειχθεί ο νευροδιαβιβαστής σε μια συγκεκριμένη σύναψη. Έτσι ένας υποτιθέμενος νευροδιαβιβαστής πρέπει να ακολουθεί τα ακόλουθα κριτήρια (Kandel et al. 2006): Συντίθεται στο νευρώνα Βρίσκεται στην προσυναπτική απόληξη μέσα σε συναπτικά κυστίδια και απελευθερώνεται σε επαρκείς ποσότητες ώστε να ασκήσει μια ορισμένη δράση στο μετασυναπτικό νευρώνα Όταν χορηγηθεί ενδογενώς ως φάρμακο σε λογικές συγκεντρώσεις μιμείται τη δράση του ενδογενώς απελευθερωμένου νευροδιαβιβαστή Οι δράσεις της μπορούν να ανασταλούν με τη χορήγηση συναγωνιστικών ανταγωνιστών του νευροδιαβιβαστή κατά δοσο-εξαρτώμενο τρόπο Υπάρχει συγκεκριμένος μηχανισμός για την απομάκρυνση της από τη θέση δράσης της [35]

46 Το νευρικό σύστημα χρησιμοποιεί δύο κύριες κατηγορίες χημικών ουσιών για τη μετάδοση σημάτων: μικρομοριακούς διαβιβαστές και νευροδραστικά πεπτίδια που είναι βραχείες αλυσίδες αμινοξέων. Οι μικρομοριακές ουσίες που λειτουργούν ως διαβιβαστές είναι η ακετυλοχολίνη (Ach), βιογενείς αμίνες (ντοπαμίνη, νεραδρεναλίνη, αδρεναλίνη, σεροτονίνη και ισταμίνη), τα αμινοξέα (γ-αμινοβουτυρικό οξύ, γλυκίνη και γλουταμινικό οξύ) και η τριφωσφορική αδενοσίνη (ATP) (Kandel et al. 2006). Η ακετυλοχολίνη είναι μια μικρή τεταρτοταγής αμίνη με απλή χημική δομή και αποτελεί το νευροδιαβιβαστή του χολινεργικού συστήματος. Οι βιογενείς αμίνες συντίθενται από αμινοξέα (R-NH2) και είναι η ντοπαμίνη, η νοραδρεναλίνη, η αδρεναλίνη, η σεροτονίνη, και η ισταμίνη. Η ισταμίνη είναι ένα ιμιδαζόλιο και αναφέρεται ως βιογενής αμίνη παρά το γεγονός ότι η βιοχημεία της διαφέρει από των υπόλοιπων και εντοπίζεται κυρίως στα ασπόνδυλα (Kandel et al. 2006). Η ντοπαμίνη, η νοραδρεναλίνη και η αδρεναλίνη ανήκουν στις κατεχολαμίνες. Οι κατεχολαμίνες σχηματίζονται από το αμινοξύ τυροσίνη και έτσι προσλαμβάνονται από τις συναπτικές απολήξεις των αξόνων. Το ποια από τις κατεχολαμίνες θα απελευθερωθεί εξαρτάται από τα ενζυμα που βρίσκονται στις απολήξεις των αξόνων. Στο κεντρικό νευρικό σύστημα οι άξονες που απελευθερώνουν κατεχολαμίνες βρίσκονται στο στέλεχος και στον υποθάλαμο αλλά επειδή διακλαδίζονται ευρέως βρίσκονται παντού. Οι κατεχολαμίνες έχουν ουσιαστικό ρόλο στις καταστάσεις της συνείδησης, στη διάθεση, στη ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης, στην προσοχή και στην απελευθέρωση ορμονών (Berne & Levy 2003; Vander et al. 2001; Kandel et al. 2006). Η ακετυλοχολίνη και οι βιογενείς αμίνες δεν είναι ενδιάμεσα μόρια γενικών βιοχημικών οδών και παράγονται κατά κανόνα μόνο σε ορισμένους νευρώνες. Αντιθέτως, μία ομάδα αμινοξέων που λειτουργούν ως νευροδιαβιβαστές είναι πολύ κοινά κυτταρικά συστατικά. Το γλουταμινικό οξύ είναι διεγερτικό αμινοξύ και παίζει ρόλο στη μάθησης και ενέχεται στην επιληψίας, στη νόσο Alzheimer και Parkinson και στις νευρικές βλάβες μετά από εγκεφαλικό επεισόδιο. Το γ- αμινοβουτυρικό οξύ και το αμινοξύ γλυκίνη είναι οι πιο σημαντικοί ανασταλτικοί [36]

47 νευροδιαβιβαστές στο κεντρικό νευρικό σύστημα (Berne & Levy 2003; Vander et al. 2001). Χολινεργικό σύστημα Ακετυλοχολίνη (ACh) Η ακετυλοχολίνη αποτελεί τον πιο καλά μελετημένο νευροδιαβιβαστή καθώς είναι ο πρώτος που απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε. Συντέθηκε για πρώτη φορά το 1867, ενώ το 1914 ο Dale παρατήρησε ότι η δράση της μιμούταν τον ερεθισμό παρασυμπαθητικών νευρώνων. Το 1920 ο Loewi απέδειξε, για πρώτη φορά, ότι όταν ερεθιστεί το πνευμονογαστρικό νεύρο, απελευθερώνεται ακετυλοχολίνη η οποία μειώνει τον καρδιακό ρυθμό στον βάτραχο. Σημαντικές είναι και οι μελέτες του Dale και των συνεργατών από τις οποίες τους προσδιορίστηκε η ακετυλοχολίνη ως χημικός διαβιβαστής στη νευρομυϊκή σύναψη των σκελετικών μυών. Η ακετυλοχολίνη αποτελεί τον πρώτο νευροδιαβιβαστή που ανακαλύφθηκε. Η ανακάλυψη αυτή έγινε από τον Otto Loewi και τον Henry Hallett Dale το 1921 και λίγα χρόνια αργότερα, το 1936, τους απονεμήθηκε το νόμπελ ιατρικής. Σήμερα, παρόλο που υπάρχουν πολλές πληροφορίες για τη λειτουργία της χολινεργικής μετάδοσης, οι δράσεις της ακετυλοχολίνης δεν είναι όλες πλήρως κατανοητές. Η ακετυλοχολίνη είναι μια μικρή τεταρτοταγή αμίνη με απλή χημική δομή. Παράγεται στο κυτταρόπλασμα των τελικών κομβίων των νευρικών κυττάρων από χολίνη (choline), η οποία εισάγεται στο κύτταρο μέσω ενός ειδικού μεταφορέα και αποθηκεύεται στο κυτταρόπλασμα των χολινεργικών απολήξεων. Η ακετυλοχολίνη συντίθεται από χολίνη και ακετυλοσυνένζυμο Α (ακέτυλοcoa) με τη βοήθεια του ενζύμου, την ακετυλοτρανσφεράση της χολίνης (ChAT) (Barrett & Ganong 2010). Το ακέτυλοcoa μπορεί να προέρχεται από γλυκόζη μέσω γλυκόλυσης, από διάσπαση του κιτρικού οξέος αλλά και από το οξικό οξύ. Η χολίνη προέρχεται από τη διατροφή (λαχανικά, κρόκος αυγών, όσπρια, ήπαρ, νεφροί) και φτάνει στους νευρώνες μέσω της κυκλοφορίας του αίματος. Συντίθεται επίσης στο ήπαρ. Κατά τη διάρκεια ενός γεύματος πλούσιου σε χολίνη, αμέσως τα επίπεδα της χολίνης στο [37]

48 πλάσμα αυξάνονται και μέσω της κυκλοφορίας του αίματος η χολίνη εισέρχεται στον εγκέφαλο, προσλαμβάνεται από τους νευρώνες και χρησιμοποιείται για τη σύνθεση ακετυλοχολίνης Επίσης ένα μεγάλο μέρος της χολίνης προέρχεται από την ακετυλοχολίνη που έχει απενεργοποιηθεί στη συναπτική σχισμή καθώς έχει καταλυθεί από το ένζυμο ακετυλοχολινεστεράση στα συστατικά της. Μετά την υδρόλυση της ακετυλοχολίνης, το 35-50% της χολίνης μεταφέρεται πίσω στην προσυναπτική απόληξη ενώ η υπόλοιπη μπορεί να καταβολιστεί ή να ενσωματωθεί σε φωσφολιπίδια που θα αποτελέσουν ξανά πηγή χολίνης. Η ρύθμιση των επιπέδων της ακετυλοχολίνης στα κύτταρα γίνεται με τρείς μηχανισμούς. Από αυτούς τους μηχανισμούς φαίνεται ότι ο κύριος ρυθμιστικός παράγοντας είναι η χολίνη καθώς η ίδια είναι ρυθμοπεριοριστική για τη σύνθεση της ακετυλοχολίνης. Συνεπώς, η ποσότητα της χολίνης που είναι διαθέσιμη στους νευρώνες αποτελεί το καθοριστικό παράγοντα για το ρυθμό σύνθεσης της ακετυλοχολίνης (Kandel et al. 2006; Barrett & Ganong 2010; Berne & Levy 2003). Η σύνθεση της ακετυλοχολίνης καταλύεται από το ένζυμο, ακετυλοτρανσφεράση της χολίνης του οποίου η μεγαλύτερη δραστηριότητα παρατηρείται στο μεσοσκελικό πυρήνα, στον κερκοφόρο πυρήνα, στον αμφιβληστροειδή, στο επιθήλιο του κερατοειδούς και στις κοιλιακές νωτιαίες ρίζες. Το μοριακό της βάρος μετά από απομόνωσή της από τον εγκέφαλο αρουραίων, υπολογίζεται σε 66-70KDa. Ενεργοποιείται από τα χλωριούχα και αναστέλλεται από τα σουλφυδρυλικά αντιδραστήρια. Στο εσωτερικό του κυττάρου, μετά από φυγοκέντρηση σε μέσο σουκρόζης, εντοπίζεται κυρίως στο αδρό μιτοχονδριακό κλάσμα το οποίο περιλαμβάνει μιτοχόνδρια, σωματίδια νευρικών απολήξεων και τμήματα μεμβρανών. Το ενζυμο in vivo βρίσκεται σε διαλυτή μορφή στο κυτταρόπλασμα ενώ στις νευρικές απολήξεις έχει βρεθεί και μια σωματιδιακή μορφή της ακετυλοτρανσφεράσης η οποία όταν γίνει διαλυτή έχει τα ίδια κινητικά χαρακτηριστικά με το διαλυτό ένζυμο αλλά μεγαλύτερη ειδική ενεργότητα. Όπως έχει αναφερθεί η ακετυλοχολίνη είναι αποθηκευμένη στα συναπτικά κυστίδια των τελικών κομβίων των χολινεργικών νευρώνων σε υψηλές συγκεντρώσεις. Με την άφιξη της ώσης αυξάνει τη διαπερατότητα της μεμβράνης των συναπτικών κομβίων και κατά συνέπεια εισέρχεται ασβέστιο (Ca 2+ ) το οποίο [38]

49 απελευθερώνει την ακετυλοχολίνη στη συναπτική σχισμή διαμέσου εξωκύττωσης. Η ακετυλοχολίνη διασχίζει τη σχισμή και δρα στους υποδοχείς της μετασυναπτικής κυτταρικής μεμβράνης κάνοντας την να αυξήσει την διαπερατότητα της στο νάτριο (Na + ). Αφού απελευθερωθεί και ενεργοποιήσει τους υποδοχείς της μετασυναπτικής μεμβράνης, η ακετυλοχολίνη ελαττώνεται από την δράση του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση που μεταβολίζοντας γρήγορα την ακετυλοχολίνη απελευθερώνει χολίνη. Η χολίνη μεταφέρεται πίσω στα τελικά κομβία του άξονα και ξαναχρησιμοποιείται για τη σύνθεση νέων μορίων ακετυλοχολίνης. Χολινεργικοί υποδοχείς Οι χολινεργικοί υποδοχείς μπορεί να είναι είτε ιοντοτρόποι (νικοτινικοί) είτε μεταβολοτρόποι (μουσκαρινικοί) (Kandel et al. 2006). Το όνομά τους πήραν από τις ουσίες νικοτίνη και μουσκαρίνη (δηλητηριώδες αλκαλοειδές που βρίσκεται σε κάποια μανιτάρια), εξαιτίας της μιμητικής επίδρασης που παρατηρήθηκε σε συγκεκριμένους περιφερικούς υποδοχείς ακετυλοχολίνης. Όσον αφορά τους νικοτινικούς υποδοχείς (nachr), ανήκουν στην κατηγορία των ιοντοτρόπων υποδοχέων. Οι αντιδράσεις τους είναι διεγερτικές και ταχείες και έχει δειχθεί ότι εμπλέκονται κυρίως σε μνημονικές λειτουργίες (Lane et al. 2006). Κυριαρχούν στις νευρομυϊκές συνάψεις, αλλά απαντούν και στον εγκέφαλο όπου λειτουργούν ως δίαυλοι Na + και Ca 2+ (μη εκλεκτικοί κατιοντικοί δίαυλοι). Οι νικοτινικοί υποδοχείς στο νευρικό σύστημα είναι ένα μεγάλο μοριακό σύμπλοκο και αποτελείται από πέντε υπομονάδες διατεταγμένες γύρω από έναν πόρο ενσωματωμένο κεντρικά στη μεμβράνη. Ο υποδοχέας αποτελείται από πέντε υπομονάδες πρωτεΐνης συμμετρικά διατεταγμένα σχηματίζοντας ένα βαρέλι όπου στο κέντρο βρίσκεται το ιοντικό κανάλι (Karlin 2002). Αυτός ο τύπος πενταμερούς δομής αποτελείται από δυο οικογένειες γλυκοπρωτεϊνικών υπομονάδων: α2-α9 και β2-β4 (Barrett & Ganong 2010; Nitsch et al. 1998; Vander et al. 2001). Κάθε υπομονάδα των νικοτινικών υποδοχέων περιλαμβάνει τέσσερις διαμεμβρανικές περιοχές που σχηματίζουν το τμήμα του ιοντικού διαύλου του υποδοχέα, και μία μεγάλη εξωκυττάρια περιοχή που σχηματίζει την περιοχή σύνδεσης της ακετυλοχολίνη (Purves et al. 2004). [39]

50 Εικόνα 6: a) Το σπειροειδές μοτίβο των υπομονάδων του νικοτινικού υποδοχέα διαμέσου της μεμβράνης. b) Σχηματική αναπαράσταση της τεταρτοταγής δομής του υποδοχέα, που δείχνει την διάταξη των υπομονάδων του υποδοχέα μυϊκού τύπου, τις δύο θέσεις σύνδεση της ακετυλοχολίνης (ACh) (1. μεταξύ α και γ υπομονάδας, 2. μεταξύ α και δ υπομονάδας), και τον ιοντικό δίαυλο που σχηματίζεται στο εσωτερικό των υπομονάδων. c) Η εγκάρσια τομή του υποδοχέα όπου με διακεκομμένη γραμμή παρουσιάζεται η προτεινόμενη διαδρομή της ακετυλοχολίνης στη θέση πρόσδεσης. Πηγή: (Karlin 2002). [40]

51 Οι μουσκαρινικοί υποδοχείς (Μ1-Μ5) εμφανίζουν βραδύ ρυθμό απάντησης σε σύγκριση με τους νικοτινικούς, είναι συζευγμένοι με G πρωτεΐνες και δρουν άμεσα σε διαύλους ιόντων ή συνδέονται με ποικίλα συστήματα δευτερογενών αγγελιοφόρων. Είναι μεταβολοτρόποι υποδοχείς και ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο η ενεργοποίησή τους προκαλεί εκπόλωση ή υπερπόλωση. Στον εγκέφαλο εκφράζονται ιδιαίτερα στο ραβδωτό, αλλά και σε διάφορες περιοχές της παρεγκεφαλίδας όπου ασκούν ανασταλτική επιρροή στις κινητικές δράσεις που διευκολύνονται από τη ντοπαμίνη (Purves et al. 2004). Εικόνα 7: Ο μουσκαρινικός χολινεργικός υποδοχέας είναι ένας μεταβολοτρόπος υποδοχέας που λειτουργεί μέσω G πρωτεϊνών. Η πρωτεΐνη G μπορεί είτε να ανοίξετε ή να κλείσετε ένα κανάλι ιόντων ή ενεργοποιήσει ένα ένζυμο, ανάλογα με το μετασυναπτικό νευρώνα στο οποίο βρίσκεται. Πηγή: Στο περιφερειακό νευρικό σύστημα η ακετυλοχολίνη είναι ο νευροδιαβιβαστής όλων των συνάψεων στα γάγγλια του αυτόνομου νευρικού συστήματος, στις νευρομυϊκές συνάψεις και στις μεταγαγγλιακές συνάψεις του παρασυμπαθητικού. Τα τελευταία χρόνια επιτεύχθηκε η ανίχνευση των χολινεργικών οδών στο κεντρικό νευρικό σύστημα και εμφανίζονται δύο βασικά οργανωτικά σχήματα. Στο πρώτο ανήκουν τα κύτταρα τοπικών κυκλωμάτων, οι διάμεσοι νευρώνες του κερκοφόρου πυρήνα και του κελύφους του φακοειδούς πυρήνα και στο δεύτερο τα κύτταρα προβολής τα οποία συνδέουν δυο ή περισσότερες διαφορετικές [41]

52 περιοχές. Το χολινεργικό σύμπλεγμα του βασικού πρόσθιου εγκεφάλου και το γεφυρομεσεγκεφαλοκαλυπτρικό χολινεργικό σύμπλεγμα αποτελούν τους δυο κύριους υποπληθυσμούς χολινεργικών νευρώνων προβολής. Ακόμα στο ραβδωτό σώμα και στον προδιαφραγματικό πυρήνα ανευρίσκονται μόνο χολινεργικοί διάμεσοι νευρώνες, ενώ πρόσφατα εντοπίστηκαν και στο φλοιό του εγκεφάλου (Barrett & Ganong 2010; Vander et al. 2001). Χολινεργικοί πυρήνες Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, οι χολινεργικοί νευρώνες βρίσκονται σε διάφορα σημεία του κεντρικού νευρικού συστήματος, συμπεριλαμβανομένης της οπτικής και της ακουστικής οδού. Τα κεντρικά χολινεργικά μονοπάτια ρυθμίζουν τις λειτουργίες που βασίζονται στον εγκεφαλικό φλοιό. Στις λειτουργίες αυτές περιλαμβάνονται η προσοχή, η διέγερση, τα κίνητρα, η μνήμη και η συνείδηση (Woolf 1991; Woolf 1996). Πιο συγκεκριμένα, τρεις είναι οι σημαντικοί χολινεργικοί πυρήνες και έχουν ιδιαίτερη σημασία για τις νευροεκφυλιστικές νόσους (Woolf 1991): 1. Στον βασικό διεγκέφαλο εντοπίζονται τρεις πυρήνες: ο πυρήνας του Meynert, ο πυρήνας της διαγώνιας δεσμίδας του Broca και ο έσω διαφραγματικός πυρήνας (M. Marsel Mesulam et al. 1983; M.Marsel Mesulam et al. 1983) 2. Στο δικτυωτό σχηματισμό και τη μεσοσκελιαία περιοχή, οι χολινεργικοί νευρώνες προβάλλουν προς τον υποθάλαμο, το μεταιχμιακό σύστημα, το ραβδωτό, τον θάλαμο και τον φλοιό (M. Marsel Mesulam et al. 1983; M.Marsel Mesulam et al. 1983) 3. Από την έλικα του προσαγωγίου οι χολινεργικές ίνες καταλήγουν προς τον ιπποκάμπειο σχηματισμό (Kapaki et al. 2003). [42]

53 Εικόνα 8: Τα μονοπάτια του κεντρικού χολινεργικού συστήματος (Woolf 1991) Ακετυλοχολινεστεράση (AChE) Ένα από τα αντικείμενα μελέτης της παρούσας εργασίας είναι η επίδραση του εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτού Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca στην ενεργότητα του ενζύμου της ακετυλοχολινεστεράσης. Για το λόγο αυτό θα ακολουθήσει ιδιαίτερη αναφορά στο ενζυμο. Σε ομογενοποιήματα εγκεφάλου θηλαστικών που υποβάλλονται σε κλασματική φυγοκέντρηση με σουκρόζη, το ένζυμο ανευρίσκεται στα κλάσματα των μιτοχονδρίων και των μικροσωματίων (κυτταρική μεμβράνη και μεμβράνες του ενδοπλασματικού δικτύου). Όσον αφορά τη δραστηριότητα του ενζύμου, με τη βοήθεια ηλεκτρονικού μικροσκοπίου αλλά και με ιστοχημικές μελέτες είναι γνωστό ότι εντοπίζεται σε μεμβράνες κάθε είδους στο κεντρικό νευρικό σύστημα και στο περιφερικό νευρικό σύστημα. Όπως έχει ήδη αναφερθεί η ακετυλοχολινεστεράση υδρολύει ταχέως το νευροδιαβιβαστή ακετυλοχολίνη τόσο στις χολινεργικές συνάψεις του εγκεφάλου όσο και στις νευρομυϊκές συνάψεις (Taylor et al. 1994). Εντοπίζεται στις προ και μετασυναπτικές μεμβράνες των χολινεργικών συνάψεων στο κεντρικό νευρικό [43]

54 σύστημα και στο περιφερειακό νευρικό σύστημα (Berne & Levy 2003; Vander et al. 2001). Υπάρχουν πολλών ειδών χολινεστεράσες, οι αληθείς ή ειδικές χολινεστεράσες (ακετυλοχολινεστεράσες, AChE) και οι ψευδείς ή μη ειδικές χολινεστεράσες (βουτυρυλοχολινεστεράσες, BuChE) (Massoulié 2002). Οι δύο αυτές κατηγορίες μοιάζουν ως προς τη μοριακή δομή τους, είναι διαφορετικές οντότητες, κωδικοποιούνται από διαφορετικά γονίδια και είναι διαφοροποιημένες ως προς την τοποθέτηση τους στο νευρώνα. Και οι δύο χολινεστεράσες υδρολύουν την ακετυλοχολίνη, αλλά διαφέρουν ως προς την ειδικότητα τους προς άλλα υποστρώματα, και την ευαισθησία τους σε αναστολείς (Massoulié 2002). Ο νευρικός ιστός περιέχει, κυρίως ακετυλοχολινεστεράση, οι εξωνευρικοί ιστοί βουτυρυλοχολινεστεράση, ενώ τα αυτόνομα γάγγλια, το ήπαρ και οι πνεύμονες περιέχουν και τις δύο σε σημαντικές ποσότητες. Η ακετυλοχολινεστεράση είναι μια πρωτεΐνη 57 kda που μπορεί να υπάρχει ενδοκυτταρικά ή εξωκυτταρικά, στο πλάσμα και στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό. Στα θηλαστικά, η ακετυλοχολινεστεράση κωδικοποιείται από ένα μόνο γονίδιο ενώ ορισμένα ασπόνδυλα έχουν πολλαπλά γονίδια ακετυλοχολινεστεράσης. Στα θηλαστικά παρά το γεγονός ότι υπάρχει μόνο ένα γονίδιο για την ακετυλοχολινεστεράση παρατηρούνται διαφορετικά προϊόντα. Το γονίδιο της ακετυλοχολινεστεράσης του ανθρώπου περιέχει έξι μεγάλα εξώνια. Ο καταλυτικός πυρήνας της ακετυλοχολινεστεράσης του ανθρώπου κωδικοποιείται από τα τρία εξώνια (1,2 και 3) και τα επιπλέον τρία εξώνια (4,5 και 6) κωδικοποιούν την καρβοξυτελική αλληλουχία (García-Ayllón et al. 2011). Η διαφορετικότητα των προϊόντων του γονιδίου της ακετυλοχολινεστεράσης προκύπτει από την εναλλακτική χρήση του υποκινητή, το εναλλακτικό μάτισμα των εξωνίων (4,5 και 6) και τις μετα-μεταφραστικές ενώσεις των καταλυτικών και δομικών υπομονάδων. Το 3 και το 5 άκρο του mrna του γονιδίου της ακετυλοχολινεστεράσης τροποποιείται και επιτρέπει την παραγωγή έξι πρωτεϊνικών υπομονάδων με διαφορετικά Ν- και C- άκρα (Massoulié et al. 2008). [44]

55 Ως αποτέλεσμα προκύπτουν τρεις διαφορετικές μορφές: α) υδρόφοβη (hydrophobic) ή H μορφή (AChE-H), η οποία αναφέρεται και ως η μορφή των ερυθροκυττάρων (erythrocytic) ή Ε (AChE-Ε) (Kaufer et al. 1998) β) η read through ή R μορφή (AChE-R) (Li et al. 1991) και γ) η μορφή «ουράς» (tailed) ή T μορφή (AChE-T), η οποία αναφέρεται και ως «συναπτική» (synaptic) ή S μορφή (AChE-S) (Massoulié 2002), Οι αλλαγές στο αμινοτελικό και το καρβοξυτελικό άκρο μεταβάλλουν διάφορα βασικά χαρακτηριστικά της πρωτεΐνης, ενώ ταυτόχρονα η καταλυτική περιοχή όλων των ισομορφών AChE παραμένει αμετάβλητη. Εικόνα 9: Διάγραμμα της δομής ανθρώπινου γονιδίου της AChE. Παραλλαγές της μορφής της AChE αποτέλεσμα του εναλλακτικού ματίσματος: AChE-H, AChE-R και AChE-T. Η δομή του γονιδίου δείχνει το σχέδιο συνένωσης των έξι μεγάλων εξώνιων για τη δημιουργία των παραλλαγών (Grisaru et al. 1999). Το μετάγραφο της AChE-R [45]

56 κωδικοποιεί μια μονομερική μορφή και της AChE-T μορφή κωδικοποιεί μονομερείς (G1) διμερείς (G2) και τετραμερείς (G4) μοριακές μορφές (Massoulié et al. 1993) πηγή: (García-Ayllón et al. 2011) Με επιπλέον 3 εναλλακτικά ματίσματα μπορεί να δημιουργηθούν πρόσθετες πολυπλοκότητες οι οποίες έχουν ως αποτέλεσμα τη δημιουργία της AChE-Η, η οποία είναι μια διμερική γλυκοφωσφατιδυλινοσινη (GPI) και αποτελεί μία αγκυροβολημένη ισομορφή που εκφράζεται κυρίως στα ερυθροκύτταρα. Μέχρι σήμερα, δεν έχει παρατηρηθεί στον εγκέφαλο έκφραση της AChE-H μορφής (Grisaru et al. 1999). Η δεύτερη παραλλαγή της ακετυλοχολινεστεράσης, η AChE R, παράγεται με την προσθήκη του εσωνίου 4 στο κανονικό μάτισμα. Στον ανθρώπινο εγκέφαλο παράγεται πολύ περισσότερο mrna της AChE-T από της AChE-R. Ωστόσο, υπό την επίδραση του στρες η έκφραση της AChE-R είναι αυξημένη. Το καρβοξυτελικό άκρο της AChE-R διαφέρει από αυτό της AChE-T στο ότι είναι υδροφιλικό και δεν φέρει κατάλοιπο κυστεΐνης με αποτέλεσμα να μην μπορεί να τετραμεριστεί με δισουλφιδικό δεσμό με άλλες υπομονάδες. Έτσι, παραμένει ένα διαλυτό μονομερές μόριο. Το μετάγραφο της AChE-T, που είναι το κύριο νευρωνικό μετάγραφο, φέρει ένα χαρακτηριστικό κατάλοιπο κυστεΐνης στο καρβοξυτελικό της άκρο εξαιτίας του οποίου κωδικοποιεί μία ευρεία ποικιλία μονομερών και ολιγομερών (διμερή και τετραμερή) μοριακών μορφών (Massoulié et al. 1993). Οι μοριακές μορφές της ακετυλοχολινεστεράσης μπορεί να ποικίλουν ως προς τα χαρακτηριστικά διαλυτότητάς τους (μη αμφίφιλο (non-amphiphilic) και αμφίφιλο (amphiphilic) (García-Ayllón et al. 2011). Έχει δειχθεί ότι οι ισομορφές της ακετυλοχολινεστεράσης είναι διαφοροποιημένα τοποθετημένες στους νευρώνες (Guyton & Hall 1996; Vander et al. 2001). Τα τετραμερή της AChE-T αλληλεπιδρούν με δύο ειδών μόρια προκειμένου να αγκυροβοληθούν στην κυτταρική μεμβράνη. Η κύρια αμφίφιλη μορφή του εγκεφάλου αγκιστρώνεται στη μεμβράνη με μία πλούσια σε προλίνη μεμβρανική πρωτεΐνη, την υπομονάδα PRIMA (Perrier et al. 2002). Το δεύτερο μόριο είναι το κολλαγόνο Q (ColQ), που επιτρέπει την αγκυροβόληση του τετραμερούς στις νευρομυϊκές συνάψεις (Noureddine et al. 2008). Επειδή η AChE-H [46]

57 και AChE-R είναι ανίκανες για αγκίστρωση στις νευρομυϊκές συνάψεις ή σε συναπτικές μεμβράνες μέσω του ColQ ή της PRiMA υπομονάδας, μόνο η μορφή AChE-Τ του ενζύμου θεωρείται ως αληθινά «συναπτική» (Zhao & Tang 2002), γι αυτό όπως και προαναφέρθηκε καλείται και AChE-S (synaptic). Τα τετραμερή της ακετυλοχολινεστεράσης που συνδέονται με το σύμπλοκο PRiMA ονομάζονται παραδοσιακά ως G4 (G: globular, σφαιρική), ενώ τα μονομερή και διμερή που δεν δένουν με καμία αγκυροβολημένη πρωτεΐνη ορίζονται ως G1 και G2, αντίστοιχα. Στον εγκέφαλο των θηλαστικών οι επικρατούσες μορφές της AChE είναι οι G1 και G4, με τη G1 μορφή να βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα ενώ η G4 είναι δεσμευμένη όπως προαναφέρθηκε στη μεμβράνη των κυττάρων (Heller & Hanahan 1972; Taylor & Radić 1994). Παράλληλα έχει αποδειχθεί ότι το διαλυτό σε απορρυπαντικό (Detergent-soluble fraction, DS) και το διαλυτό σε άλας (Salt-soluble fraction, SS) κλάσμα της ακετυλοχολινεστεράσης περιέχουν κυρίως τις G4 και G1 ισομορφές του ενζύμου αντιστοίχως (Rieger & Vigny 1976; Das et al. 2005). Η G4 ισομορφή είναι λειτουργικά απαραίτητη για την υδρόλυση της ακετυλοχολίνης. Εντοπίζεται σε όλες τις περιοχές του εγκεφάλου (μετωπιαίος φλοιός, φλοιός παρεγκεφαλίδας, ραβδωτό, υποθάλαμος, θάλαμος, προμήκης μυελός, παρεγκεφαλίδα). Λίγα είναι γνωστά για το πώς οι αναστολείς της ακετυλοχολινεστεράσης επηρεάζουν τις διαφορετικές μοριακές μορφές του ενζύμου. [47]

58 Εικόνα 10: a) Χαρακτηριστικά της μοριακής δομής του ενζύμου. Η κρυσταλλογραφία ακτινών Χ έχει εντοπίσει μια ενεργή θέση στο κάτω μέρος του στενού ανοίγματος, με επένδυση από υδρόφοβες πλευρικές αλυσίδες αμινοξέων. Την ίδια στιγμή, η καταλυτική τριάδα ήταν μοναδική ανάμεσα σε υδρολάσες της σερίνης έχοντας μία γλουταμική πλευρική αλυσίδα στη θέση κοινής ασπαρτικής πλευρικής αλυσίδας. Η περιοχή σύνδεσης της χολίνης χαρακτηρίζεται από υδρόφοβα υπολείμματα τρυπτοφάνης αντί των αναμενόμενων ανιονικές ομάδων. Μία περιφερειακή θέση σύνδεσης έχει επίσης ταυτοποιηθεί με τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση. b) Η αντίδραση της ακετυλοχολινεστεράσης (AChE). AChE προάγει την υδρόλυση ακετυλοχολίνης με σχηματισμό ενός ακετυλο-ache ενδιαμέσου με την απελευθέρωση της χολίνης, και ακολουθεί υδρόλυση του ενδιάμεσου ώστε να απελευθερωθεί το οξικό άλας. Πηγή: (Soreq & Seidman 2001) H ακετυλοχολινεστεράση έχει την ικανότητα να υδρολύει 5000 μόρια ακετυλοχολίνης ανά ένζυμο το δευτερόλεπτο δηλαδή ο χρόνος ανακύκλωσής του ενζύμου είναι 150μsec. Γεγονός που την καθιστά ένα από τα πιο αποτελεσματικά γνωστά μας ενζυμα. Το ενεργό κέντρο έχει δύο κύριες θέσεις μία ανιονική θέση με τουλάχιστον ένα καρβοξύλιο που έλκει το θετικό φορτίο της ακετυλοχολίνης και μια εστερασική ομάδα που συνδέεται με το άτομο του άνθρακα του καρβονυλίου της ακετυλοχολίνης. Το ενεργό αυτό κέντρο είναι κοινό για όλες τις μορφές, αποτελείται από 500 περίπου υπολείμματα και προσδίδει χαρακτηριστικές υδροδυναμικές [48]

59 ιδιότητες, ικανότητα πολυμερισμού και προσκόλλησης σε μεμβράνες (Soreq & Seidman 2001). Εικόνα 11: Η υδρόλυση της ακετυλοχολίνης από την ακετυλοχολινεστεράση (AChE) σε χολίνη και οξικό άλας. Πηγή: Λόγος των ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης Φυσιολογικά στον εγκέφαλο των θηλαστικών η ακετυλοχολινεστεράση αντιπροσωπεύεται από δύο κύριες ισομορφές τη G1 και τη G4 με ποικιλία στην αναλογία τους στις διαφορετικές εγκεφαλικές περιοχές (Atack et al. 1986). Η γνώση αυτή τα τελευταία χρόνια έχει γίνει αφορμή για μια σειρά από καινούργιες μελέτες με το ενδιαφέρον των ερευνητών να επικεντρώνεται στην αναλογία αυτών των δύο μορφών στις επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές. Από παρατηρήσεις μελετών μέχρι σήμερα έχει διαπιστωθεί ότι η αναλογία αυτή μεταβάλλεται στους διάφορους ιστούς καθώς και στις διάφορες καταστάσεις φυσιολογίας. Το γεγονός αυτό αποτελεί ένα πολύ σημαντικό στοιχείο για τις ερευνητικές μελέτες και έχει προταθεί να γίνει χρήση αυτής της αναλογίας ως δείκτης νευροεκφυλιστικών διαδικασιών (Lane et al. 2006; Ferlemi et al. 2014). Η χρήση της αναλογίας των δύο ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης ως δείκτης νευροεκφυλιστικών διαδικασιών έχει ως στόχο αυτή η αναλογία μελλοντικά να αποτελέσει ένα βιοδείκτη των επιμέρους καταστάσεων. [49]

60 Σημαντική θα είναι η συμβολή του λόγου των ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης ως βιοδείκτη στη φαρμακολογική μελέτη. Η μεταβολή του λόγου σε συγκεκριμένες εγκεφαλικές περιοχές θα μπορούσε να γίνει κριτήριο για την πιθανή ύπαρξη κάποιας παθολογικής κατάστασης. Για παράδειγμα σε ασθενείς με τη νόσο του Alzheimer έχει παρατηρηθεί στη φλοιώδη και στην υποφλοιωδη περιοχή μείωση του λόγου των δύο ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης (Atack et al. 1983; Fishman et al. 1986; Arendt et al. 1992). Σε άλλες μελέτες έχουν παρατηρηθεί διακριτά πρότυπα αλλοιώσεων στην αναλογία των ισομορφών τόσο στον ιππόκαμπο όσο και στην αμυγδαλή που συσχετίζεται με την γνωστή κατανομή των ιστοπαθολογικών μεταβολών στον εγκέφαλο ασθενών με τη νόσο του Alzheimer (Siek et al. 1990). Τέλος η μεταβολή του λόγου των ισομορφών λόγω κάποιας παθολογικής κατάστασης και η επαναφορά του με τη χρήση κάποιας υπό μελέτης φαρμακευτικής ουσίας θα μπορούσε να αναδείξει την θεραπευτική δράση της ουσίας αλλά και να δώσει πληροφορίες για την πρόοδο κάποιας γνωστής θεραπείας. Επίσης σε άλλες μελέτες έχει διαπιστωθεί ότι ο λόγος των ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης συσχετίζεται θετικά με τη δραστηριότητα της ακετυλοτρανσφεράση της χολίνης και μπορεί να θεωρηθεί ως ένας προσυναπτικός χολινεργικός δείκτης (Siek et al. 1990; Darreh-Shori et al. 2004). Χολινεργικό σύστημα και γήρας Με την αύξηση της ηλικίας παρατηρούνται μεταβολές στον εγκέφαλο σε δομικό, μοριακό και κυτταρικό επίπεδο. Στο μοριακό και στο κυτταρικό επίπεδο καταγράφονται οι μεταβολές που παρατηρούνται στη νευροδιαβίβαση. Το νευροδιαβιβαστικό σύστημα που πιθανό υφίσταται τις πιο δραματικές αλλαγές φαίνεται να είναι το χολινεργικό σύστημα. Μελέτες σε τρωκτικά και ανθρώπους συσχετίζουν τις αλλαγές που παρατηρούνται στους διάφορους νευροχημικούς δείκτες του χολινεργικού συστήματος με τις αλλαγές στην ηλικία. Με την αύξηση της ηλικίας παρατηρείται μείωση στους προ και μετασυναπτικούς νευροχημικούς δείκτες του χολινεργικού συστήματος του εγκεφάλου (McGeer et al. 1984). Κατά τη γήρανση [50]

61 έχει παρατηρηθεί μείωση των εγκεφαλικών μουσκαρινικών υποδοχέων στον άνθρωπο (H U Rehman & Masson 2001). Μερικές από τις μεταβολές που έχουν παρατηρηθεί κατά τη μελέτη σε γηραιούς μυς και επίμυς είναι: α) η μείωση των επιπέδων της ακετυλοχολίνης (λόγω μειωμένης in vivo σύνθεσης της και απελευθέρωσης της) (Gibson et al. 1981a), β) η μείωση της δραστηριότητας της ακετυλοτρανσφεράση της χολίνης (Strong et al. 1980), γ) η μείωση της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης (James & Kanungo 1976; Das et al. 2001) και δ) η διαφοροποίηση του ενδιάμεσου μεταβολισμού (Gibson et al. 1981a). Όπως προαναφέρθηκε η συσχέτιση μεταξύ της ηλικίας και των αλλαγών που παρατηρούνται στους διάφορους νευροχημικούς δείκτες του χολινεργικού συστήματος σε τρωκτικά και ανθρώπους, συνοψίζεται στην θεωρία της «χολινεργικής υπόθεσης» του γήρατος και της γηριατρικής δυσλειτουργίας της μνήμης. Επίσης παρατηρείται μείωση του αριθμού μουσκαρινικών υποδοχέων στον κερκοφόρο πυρήνα, στο κέλυφος, στον ιππόκαμπο και στο μετωπιαίο φλοιό η οποία έχει βρεθεί ότι είναι της τάξης του 50-60% (Rinne 1987; Amenta et al. 1994). Τα γνωστικά ελλείμματα κατά τη γήρανση και τη νόσο του Alzheimer οφείλονται σε ελλείμματα στο χολινεργικό σύστημα. Η ακετυλοτρανσφεράση της χολίνης είναι μειωμένη σε ασθενείς με τη νόσο του Alzheimer, ιδιαίτερα στο κροταφικό φλοιό και στον ιππόκαμπου (Davies & Maloney 1976) καθώς και οι συγκεντρώσεις της ακετυλοχολίνης στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (Tohgi et al. 1994). Η πυκνότητα των χολινεργικών νευρώνων είναι αισθητά μειωμένη στις περιοχές του ιππόκαμπου και του φλοιού κατά την τη νόσο του Alzheimer. Σε πολλές μελέτες, χρησιμοποιώντας ποικιλία από τεχνικές καταμέτρησης, έχει αναφερθεί μείωση του αριθμού των χολινεργικών νευρώνων κατά τη γήρανση (Stroessner-Johnson et al. 1992; Lee et al. 1994; Altavista et al. 1990; Armstrong et al. 1993; Fischer et al. 1992). Σε άλλες πάλι μελέτες έχει παρατηρηθεί μικρού βαθμού μείωση (Bigl et al. 1987; Ypsilanti et al. 2008) αλλά υπάρχουν και κάποιες μελέτες στις οποίες δεν παρατηρήθηκε αλλαγή (McQuail et al. 2011). [51]

62 Επιπρόσθετα αξίζει να σημειωθεί ότι η ακετυλοχολινεστεράση αποτελεί ένα σημαντικό θεραπευτικό στόχο. Σε μελέτες έχει παρατηρηθεί ότι τα αντιχολινεργικά φάρμακα τα οποία κατά κύριο λόγο είναι αναστολείς της ακετυλοχολινεστεράσης παρεμβαίνουν στις λειτουργίες της μνήμης και χρησιμοποιούνται ως γνωστικοί ενισχυτές στη θεραπεία της νόσου του Alzheimer αλλά και σε άλλες διαταραχές άνοιας (Enz et al. 1993; Siddiqui & Levey 1999). Τα ευρήματα αυτά, σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα άλλων μελετών οδήγησαν τους ερευνητές να υποθέσουν ότι τα χολινεργικά ελλείμματα είναι υπεύθυνα για τα γνωστικά ελλείμματα που συνδέονται με τη γήρανση και τη νόσο του Alzheimer. Επίσης η διατήρηση των επιπέδων των νικοτινικών υποδοχέων φαίνεται να είναι εξίσου σημαντική για τη νευρωνική επιβίωση και πιστεύεται ότι χρόνιοι καπνιστές είναι λιγότερο πιθανό να αναπτύξουν τη νόσο του Alzheimer ή την ιδιοπαθή νόσο του Parkison (Quik et al. 2007). Ωστόσο, τα χολινεργικά ελλείμματα δεν εξηγούν πλήρως τα γνωστικά ελλείμματα της νόσου του Alzheimer. Παρά τους παρόμοιους βαθμούς άνοιας που υπάρχουν, δεν έχουν παρατηρηθεί ελλείμματα των χολινεργικών δεικτών μεταξύ των ατόμων με πολυ-αποφρακτική άνοια (multi-infarct dementia) (Rinne et al. 1988). Αφ 'ετέρου, ασθενείς με έλαιογεφυροπαρεγκεφαλιδική ατροφία (olivopontocerebellar atrophy) έχουν μείωση της δραστηριότητας της ακετυλοτρανσφεράση της χολίνης στο φλοιό εξίσου σοβαρή με εκείνη των ασθενών με τη νόσο του Alzheimer, αλλά σε αυτή την περίπτωση παρουσιάζουν μόνο ήπια γνωστική εξασθένηση (Kish et al. 1988). Είναι πιθανό, κατά τη γήρανση και τη νόσο του Alzheimer, να εμπλέκονται στην έλλειψη της γνωστική λειτουργίας περισσότεροι του ενός νευροδιαβιβαστή όπως νευροδιαβιβαστές του νοραδρενεργικού, ντοπαμινεργικού, και σεροτονινεργικού συστήματος (Engelborghs & De Deyn, 1997; Nazarali & Reynolds, 1992 [52]

63 4. Η ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ Εγκέφαλος και συμπεριφορά Οι ενέργειες του εγκεφάλου, αποτελούν τη βάση του συνόλου της συμπεριφοράς. Όχι μόνο απλών σχετικά συμπεριφορών, όπως η βάδιση ή η λήψη τροφής, αλλά και όλων των σύνθετων γνωστικών δράσεων, τις οποίες συνδέουμε με την ανθρώπινη συμπεριφορά όπως η σκέψη, η ομιλία και η μάθηση. Έτσι, αποστολή των νευροεπιστημόνων είναι να ερμηνεύσουν τη συμπεριφορά, με βάση τη δραστηριότητα του εγκεφάλου. Οι πρώτες συσχετίσεις μεταξύ της συμπεριφοράς και του νευρικού συστήματος έγιναν από την παρατήρηση ασυνήθιστων συμπεριφορών σε άτομα που έπασχαν από ασθένειες σχετιζόμενες με κάποια νευρολογική διαταραχή. Καθώς είναι δύσκολο να προσδιοριστεί με ακρίβεια ο όρος συμπεριφορά σε ένα βιολογικό πλαίσιο, μια κοινώς χρησιμοποιούμενη ερμηνεία αναφέρει ότι «η συμπεριφορά είναι οι εσωτερικά συντονισμένες απαντήσεις (παραλείψεις ή πράξεις) ολόκληρων των οργανισμών σε εσωτερικούς ή/ και εξωτερικούς διεγέρτες». Οποιαδήποτε ενέργεια ενός οργανισμού που αλλάζει τη σχέση του με το περιβάλλον του μπορεί να θεωρηθεί συμπεριφορά. Οι συμπεριφορές μπορεί να είναι επίκτητες, ως αποτέλεσμα της εμπειρίας ή έμφυτες (Kandel et al. 2006). Η ανθρώπινη συμπεριφορά θεωρείται ότι επηρεάζεται από το ενδοκρινικό και το νευρικό σύστημα. Υποστηρίζεται η συσχέτιση της πολυπλοκότητας στη συμπεριφορά με την πολυπλοκότητα του νευρικού συστήματος, καθώς έχει παρατηρηθεί ότι οι οργανισμοί με πιο σύνθετα νευρικά συστήματα έχουν μεγαλύτερη ικανότητα να μάθουν νέες απαντήσεις και με αυτό τον τρόπο να προσαρμόσουν τη συμπεριφορά τους (Kandel et al. 2006). Στόχος των ερευνητών που μελετούν τη συμπεριφορά σε ανθρώπους ή ζώα είναι η παρατήρηση και η ανάλυση σε ποσοτικά μεγέθη της συμπεριφοράς και η συσχέτιση αυτής με ειδικούς μηχανισμούς και λειτουργίες του κεντρικού νευρικού συστήματος. Η μελέτη δηλαδή της λειτουργίας των εκατομμυρίων νευρικών [53]

64 κύτταρων και του καθενός ξεχωριστά για την παραγωγή της συμπεριφοράς αλλά και πως τα κύτταρα αυτά επηρεάζονται από το περιβάλλον ώστε να εκδηλώσουν ποικίλες συμπεριφορές. Τα τελευταία 50 χρόνια έχουν αναπτυχθεί διάφορες τεχνικές με σκοπό τη μελέτη της συμπεριφοράς. Οι νευροεπιστήμονες στην προσπάθεια τους να μελετήσουν τη συμπεριφορά χρησιμοποιούν μεθόδους με τις οποίες επιτυγχάνουν τον έλεγχο, την απλούστευση και την αντικειμενική μέτρηση στοιχείων της συμπεριφοράς. Για το σκοπό αυτό έχουν αναπτυχθεί ειδικά πρότυπα μελέτης συμπεριφοράς και αντικειμενικούς τρόπους μελέτης και αξιολόγησης. Χρησιμοποιούνται ηλεκτρικοί ή χημικοί μηχανισμοί, φάρμακα ή προκαλούνται βλάβες σε περιοχές του κεντρικού νευρικού συστήματος. Επίσης παρατηρούνται αποκλίσεις από τη φυσιολογική συμπεριφορά σε περιπτώσεις ασθενειών ή τραυματισμών. Μεταξύ των πεδίων που εξετάζονται με τη χρήση των ανωτέρων μεθόδων είναι η κινητική συμπεριφορά, καθώς και οι γνωστικές λειτουργίες όπως η μνήμη και η μάθηση. Η εκφύλιση των αντίστοιχων νευρικών κυκλωμάτων οδηγεί σε γνωστικές διαταραχές με αποτέλεσμα την εμφάνιση σοβαρών για τον άνθρωπο συνδρόμων όπως η νόσος του Alzheimer. Μία ακόμα καλά μελετημένη συμπεριφορά είναι η εκδήλωση του άγχους και συχνά γίνεται σε συνδυασμό με τη δράση αγχολυτικών φαρμάκων. Ακόμα πειραματικά μοντέλα χρησιμοποιούνται κατά την έρευνα που αφορά την κατάθλιψη και αποσκοπούν στον έλεγχο της δράσης των αντικαταθλιπτικών φαρμάκων και ουσιών. Σήμερα έχουν αναπτυχθεί εκατοντάδες τεχνικές για τη μελέτη των διαφόρων συμπεριφορών και μερικές από αυτές αναφέρονται παρακάτω. Για τη μελέτη της συμπεριφοράς του άγχους υπάρχουν αρκετά μοντέλα συμπεριφοράς όπως οι δοκιμασίες του υπερυψωμένου λαβύρινθου (Elevated plus-maze) (Walf & Frye 2007), ανοιχτού πεδίου (Open field) (Telonis & Margarity 2015), του υπερυψωμένου κυκλικού λαβυρίνθου (Elevated zero maze) (Kulkarni et al. 2007) και η δοκιμασία προτίμησης φως/σκοτάδι (Light/Dark preference). Επίσης μοντέλα συμπεριφοράς για τη μελέτη των γνωστικών λειτουργιών (μνήμη/μάθηση) είναι η δοκιμασία ακτινωτού λαβυρίνθου (Radial arm maze) (Brown et al. 2007), υδατικού λαβυρίνθου (Morris water maze) (Vorhees & Williams 2006), η δοκιμασία παθητικής αποφυγής (Passive avoidance) και η δοκιμασία ενεργητικής αποφυγής (Active avoidance) (Cimadevilla [54]

65 et al. 2000). Τέλος μοντέλα για τη μελέτη της καταθλιπτικής τάσης είναι η δοκιμασία εξαναγκασμένης κολύμβησης (Forced swimming test) (Can, Dao, Arad, et al. 2012) και αιώρησης από την ουρά (Tail suspension) (Can, Dao, Terrillion, et al. 2012; Cryan et al. 2005) Άγχος Το άγχος αποτελεί καθημερινή εμπειρία που αφορά, λίγο πολύ, όλους ανεξαρτήτως τους ανθρώπους. Παρόλα αυτά ο ακριβής ορισμός του όρου είναι δύσκολος γιατί η έννοια αυτή χρησιμοποιείται για ένα ευρύ φάσμα απαντήσεων του ατόμου. Ετυμολογικά η λέξη άγχος προέρχεται από το ρήμα άγχω, που σημαίνει σφίγγω πιεστικά, ιδίως στο λαιμό, εξ ου και αγχόνη. Ο Selye το 1930 υπογράμμισε πως το άγχος είναι μία αυτόματη βιολογική αντίδραση του οργανισμού σε διάφορα εξωγενή ερεθίσματα. Επιπλέον, θεωρούσε πως η αγχωτική αντίδραση θα προκύψει μόνο εάν το άτομο νιώσει ανίκανο να αντεπεξέλθει στις απαιτήσεις μίας κατάστασης (Szabo et al. 2012). Οι Lazarus και Folkman το 1984 πρότειναν πως το άτομο κάνει δυο γνωστικές αξιολογήσεις μόλις ενοχληθεί: πρώτον, εάν ο αγχωτικός παράγοντας ή το γεγονός θέτει σε κίνδυνο το άτομο (the primary appraisal), και δεύτερον, εάν είναι ικανό να τα βγάλει πέρα με αυτόν (the secondary appraisal) (Lazarus & Folkman 1984). Ως άγχος ο Sarafino το 1994 όρισε την κατάσταση που υπάρχει όταν η συναλλαγή μεταξύ του ατόμου και του περιβάλλοντος οδηγεί το μεμονωμένο άτομο να αντιληφθεί μια διαφορά -αληθινή ή όχι- μεταξύ των απαιτήσεων μίας κατάστασης και των πόρων των βιολογικών, των ψυχολογικών και των κοινωνικών συστημάτων (Sarafino 1994). Αυτός ο ορισμός αναζητά το κενό μεταξύ του πώς αξιολογούμε μία κατάσταση και πως τις ικανότητες του εαυτού μας. Το άγχος αποτελεί ένα αίσθημα ανησυχίας που προκαλείται από την αναμονή του κινδύνου που μπορεί να είναι εξωτερικός ή εσωτερικός (Sadock & Sadock 2004). Όλοι οι άνθρωποι σε κάποια στιγμή της ζωής τους έχουν βιώσει μια διάχυτη, δυσάρεστη και ακαθόριστη αίσθηση ανησυχίας, δηλαδή άγχος. Συνήθως αυτό το αίσθημα ανησυχίας συνοδεύεται από σωματικά συμπτώματα όπως είναι η εφίδρωση, η ταχυκαρδία, το αίσθημα πνιγμού, η ζάλη, η αστάθεια, το βάρος στο στήθος, και οι μύες που τρέμουν. Λειτουργεί ως σήμα που προειδοποιεί τον οργανισμό για έναν επερχόμενο κίνδυνο και τον προετοιμάζει να ανασυνταχθεί, να κινητοποιήσει τις [55]

66 άμυνες του για να αντιμετωπίσει την απειλή, να διαφύγει ή να μειώσει τις επιπτώσεις της. Αυτό το αίσθημα απειλής, του επερχόμενου κινδύνου αντικειμενικού ή υποκειμενικού, πραγματικού ή συμβολικού (Ραγιά 2009) κλιμακώνεται από την απλή δυσφορία μέχρι το μεγάλο πανικό. Το άτομο καταλαμβάνεται από δυσφορία, αγωνία, ανησυχία, μελαγχολία και πολλές φορές πλήρη πανικό εξαιτίας της αδυναμίας εύρεσης τρόπων αντιμετώπισής του (Ρώμας 1989). Οι αντιδράσεις αυτές εξαρτώνται από την προσωπικότητα του ατόμου, το φιλοσοφικό του προσανατολισμό και τις κληρονομικές προδιαθέσεις του. Ακόμα, επηρεάζονται από την κοινωνική και πολιτιστική υποδομή του, την εμπειρία του, το βαθμό ευφυΐας, τις συνήθειες και τη μόρφωσή του (Ραγιά 2009) Ένας ακόμα ορισμός που δίνεται για το άγχος αναφέρεται στην «αναγνώριση ότι τα γεγονότα που αντιμετωπίζει κανείς βρίσκονται έξω από το πεδίο καταλληλότητας του συστήματος νοητικών κατασκευών» (Pervin & John 1999). Δηλαδή τα γεγονότα βρίσκονται έξω από το πεδίο του τρόπου αντίληψης και ερμηνείας των γεγονότων και έτσι είναι δύσκολο να τα ερμηνεύσει το άτομο. Όπως αναφέρει ο Οικονόμου, «το άγχος είναι ένα ιδιότυπο βίωμα μεγάλης εσωτερικής δυσφορίας, που προκαλείται από μια αόριστη εσωτερική απειλή, η οποία με έχουσα συγκεκριμένο αντικείμενο δεν μπορεί να αποφευχθεί από το άτομο το οποίο και εξουθενώνεται» (Οικονόμου 1994). Εν τέλει το άγχος, είναι μια συναισθηματική αντίδραση, που κινητοποιεί το άτομο για να αντιμετωπίσει τους κινδύνους, να αποτρέψει μία πραγματική ή συμβολική βλάβη και ζημία, εξασφαλίζοντας του έτσι την εξισορρόπηση του με το περιβάλλον (Samuel 1997). Κατά την αναμονή του κινδύνου υπάρχουν δύο τρόποι αντίδρασης ο υγιής και ο παθολογικός (Lesch et al. 2003; Viveros et al. 2005). Υγιής είναι η αντίδραση που τείνει στη λύση του προβλήματος καθώς το φυσιολογικό άγχος, που καλείται και «δημιουργικό», αποτελεί έναν προσαρμοστικό μηχανισμό. Παθολογικό θεωρείται το άγχος εάν δημιουργεί προβλήματα στην καθημερινή λειτουργικότητα, στην επίτευξη επιθυμητών στόχων ή στη συναισθηματική ηρεμία του ατόμου, οπότε και έχουμε κάποια αγχώδη διαταραχή. Η θετική αντίδραση «eustress» βοηθάει τους ανθρώπους να αντιδρούν γρήγορα, να αναπτύσσουν πιο αποτελεσματικές στρατηγικές [56]

67 αντιμετώπισης των προβλημάτων τους και να επιτυγχάνουν σε διάφορους τομείς της ζωής, αξιοποιώντας όλες τις δυνατότητές τους στο μέγιστο βαθμό. Μια άλλη κατηγοριοποίηση του άγχους είναι σε ασθενές, μέτριο, έντονο άγχος και ο πανικός. Το ελαφρό άγχος είναι το φυσιολογικό άγχος της καθημερινής ζωής, το οποίο δημιουργεί τα κίνητρα για προσπάθεια και επιτυχία των στόχων του ατόμου. Το μέτριο αφαιρεί από το άτομο την προσοχή, τη συγκέντρωση, την ικανότητα για διαυγή σκέψη, καθώς και την άμεση εκπλήρωση κάποιου έργου. Το έντονο άγχος είναι οξύ, απομονώνει το άτομο και δυσχεραίνει την μάθηση και εκπλήρωση δράσεων. Τέλος, ο πανικός επιφέρει ανικανότητα αντιμετώπισης οποιασδήποτε κατάστασης, λήψης οποιασδήποτε απόφασης και ψυχωσικά συμπτώματα, όπως ψευδαισθήσεις και παραληρητικές ιδέες (Ραγιά 2009). Όταν το άγχος αποτελεί καθημερινό στοιχείο και μπλοκάρει τις καθημερινές συνηθισμένες πράξεις και όταν κινητοποιείται από ερεθίσματα που δεν είναι σημαντικά για την επιβίωση και οδηγεί σε λανθασμένες προβλέψεις και εκτιμήσεις, τότε παύει να αποτελεί προσαρμοστικό μηχανισμό και πρόκειται για το παθολογικό άγχος (Γαλανός 2007). Σε περιπτώσεις όπου το άτομο εμφανίζει μια ψυχωσική διαταραχή, το άγχος είναι υπερβολικό και καταλύει τον έλεγχο της πραγματικότητας, οπότε μιλάμε για «ψυχωσικό» άγχος. Σε αυτές τις περιπτώσεις το άγχος εκδηλώνεται σαν αίσθημα απελπισίας σε σχέση με το αίτιο που την προκαλεί με αποτέλεσμα το άτομο να γίνεται άτολμο, ανασφαλές και να βρίσκεται σε συναισθηματικό τέλμα. Το παθολογικό άγχος εκφράζεται με συμπτώματα από την ψυχική και τη σωματική σφαίρα (Samuel 1997). Τα ψυχολογικά συμπτώματα του άγχους είναι: ανησυχία, ανυπομονησία εκνευρισμός, ευερεθιστότητα, αγωνία, αίσθημα ακαθόριστου φόβου, δυσχέρεια στη συγκέντρωση, διαταραχές της μνήμης, διάσπαση της προσοχής και επιλεκτική προσοχή. Τα σωματικά συμπτώματα του άγχους αναφέρονται σε ταχυκαρδία, αίσθημα παλμών, έκτακτες συστολές, εφιδρώσεις, τρόμος (τρέμουλο), συσπάσεις των μυών, αίσθημα πνιγμού και κόμπου στο λαιμό, βάρος στο στήθος, ζάλη, αστάθεια, ναυτία, μούδιασμα των άκρων, συχνουρία, πόνοι στο στομάχι και υπέρταση. [57]

68 Με τη βοήθεια νευροχημικών και νέων απεικονιστικών τεχνικών έχει βρεθεί ότι η αμυγδαλή και ο ιππόκαμπος εμπλέκονται στις περισσότερες διαταραχές που σχετίζονται με το άγχος. Η αμυγδαλή είναι σημαντική για την αποκωδικοποίηση των συγκινήσεων αλλά και των ιδιαίτερων ερεθισμάτων που απειλούν τον ίδιο τον οργανισμό. Η ενημέρωση της αμυγδαλής για τους πιθανούς κινδύνους από το περιβάλλον γίνεται από πολλές αισθητήριες οδούς και πιθανόν να φτάνουν σε αυτή μέσω του θαλάμου ή μέσω του φλοιού. Η πύλη της αμυγδαλής που επιτρέπει να παραληφθούν οι πληροφορίες από το εξωτερικό περιβάλλον είναι ο πλευρικός πυρήνας της αμυγδαλής. Στην αμυγδαλή ακόμα προβάλλουν τους νευρώνες τους και άλλες εγκεφαλικές περιοχές όπως ο θάλαμος, ο υποθάλαμος, το διάφραγμα και ο δικτυωτός σχηματισμός του στελέχους του εγκεφάλου. Στο κεντρικό τμήμα της αμυγδαλής αποθηκεύονται και συναισθηματικές μνήμες που μπορεί να ευθύνονται για αγχώδεις διαταραχές. Ο ιππόκαμπος είναι ειδικευμένος επίσης στο να επεξεργάζεται το γενικότερο πλαίσιο μιας κατάστασης και κωδικοποιεί τα απειλητικά γεγονότα σε μνήμες. Ο ιππόκαμπος και η αμυγδαλή είναι στενά συνδεδεμένα μεταξύ τους και έτσι ένα τραυματικό γεγονός ενός ατόμου μπορεί να προκαλέσει κάποια νευρική διαταραχή. Σύμφωνα με τη βιολογική προσέγγιση το άγχος γίνεται αντιληπτό ως φυσιολογική αντίδραση του οργανισμού, η ένταση της οποίας εξαρτάται εξ ολοκλήρου από την ένταση των ερεθισμάτων (Βασιλάκη et al. 2001). Πολλές αγχώδεις διαταραχές έχουν προγεννετική διάθεση (Μάνος 1997). Κατά το συμπεριφορισμό, το άγχος αναπτύσσεται ως εξαρτημένη ή επίκτητη αντίδραση σε ένα συγκεκριμένο ερέθισμα (Grant et al. 2001). Οι αιτίες που προκαλούν άγχος κατατάσσονται σε τρεις κατηγορίες Στην πρώτη συναντάται ως αιτία μια σοβαρή και σαφής κληρονομική προδιάθεση, ενώ η επιρροή του περιβάλλοντος είναι μικρότερης σημασίας. Στη δεύτερη κατηγορία, η προσωπικότητα που δεν έχει δομηθεί πλήρως, δημιουργεί το «έδαφος» στις φυσιολογικές ή έντονες επιδράσεις του περιβάλλοντος να δράσουν παθολογικά πάνω της. Ενώ στην τελευταία κατηγορία, περιβαλλοντικοί παράγοντες διαμορφώνουν την προσωπικότητα και μπορούν να επιδράσουν καταλυτικά, δημιουργώντας το άγχος (Γαλανός 2007). [58]

69 Φόβος Η αντίληψη του άγχους αποδίδεται με διάφορους όρους όπως αγωνία, απειλή, στρες και φόβος. Αυτό οδήγησε διάφορους μελετητές να ασχοληθούν με την ταύτιση, τις ομοιότητες ή τις διαφορές τους. Η αγωνία είναι μια από τις πολλές λέξεις με τις οποίες αποδίδεται στα ελληνικά η υποκειμενική αντίληψη του συναισθήματος του άγχους. Το άτομο λέγοντας ότι έχει αγωνία, εννοεί ότι έχει άγχος, χωρίς να γνωρίζει πολλές φορές ότι οι δυο λέξεις είναι συνώνυμες (Παπαδόπουλος 2005). Η αγωνία είναι πιο δύσκολο να διαχωριστεί από το άγχος. Στην αγωνία το αντικείμενό της είναι πιο φανερό, πιο εξωτερικό, πιο πραγματικό και προσιτό, γι αυτό υπάρχει δυνατότητα διαφυγής και διεξόδου, η οποία οδηγεί στην ανάπτυξη δραστηριότητας. Η αγωνία εκφράζεται με περισσότερη ανησυχία από το άγχος και έτσι προκαλεί εντονότερες κινητικές αντιδράσεις για αποφυγή, αποτροπή και κατανίκηση του κινδύνου, από ότι το άγχος που διαποτίζει, ακινητοποιεί, παραλύει και καταβάλλει το άτομο (Γαλανός 2007). Απειλή ορίζεται ως η επίγνωση μιας επικείμενης ευρύτατης αλλαγής στην πυρηνική δομή κάποιου. Κάθε φορά που οι άνθρωποι αναλαμβάνουν κάποια νέα δραστηριότητα, εκτίθενται στη σύγχυση. Η σύγχυση μπορεί να οδηγήσει σε κάτι καινούργιο ή να εξελιχθεί σε απειλή για το άτομο (Pervin & John 1999). Στρες ή αλλιώς ψυχολογική ένταση ορίζεται ως μια ιδιαίτερη σχέση του ατόμου με το περιβάλλον η οποία εκφράζεται με την εκτίμηση ότι η κατάσταση που αντιμετωπίζει επιβαρύνει σημαντικά ή και υπερβαίνει τα ψυχικά αποθέματα του κι έτσι θέτει σε κίνδυνο την ψυχική του ισορροπία (Βασιλάκη et al. 2001). Οι έννοιες του «άγχους» και του «στρες» χρησιμοποιούνται σαν συνώνυμοι τόσο από επιστήμονες όσο και από μη ειδικούς. Ο Φόβος είναι το δυσάρεστο συναίσθημα που προκαλείται από τη συνειδητοποίηση ενός πραγματικού ή πλασματικού κινδύνου και συνοδεύεται από ψυχοφυσιολογικές μεταβολές και συναισθηματική ταραχή καθώς και την επιθυμία του ατόμου να αμυνθεί ή να τραπεί σε φυγή (Πιάνος 1998; Sadock & Sadock 2004). [59]

70 Είναι ένας μηχανισμός προστατευτικού χαρακτήρα, μια φυσιολογική αμυντική αντίδραση του οργανισμού χωρίς να απαιτείται συνειδητή σκέψη. Στην παρουσία ενός πραγματικού κινδύνου, ο φόβος προκαλεί την τάση φυγής ή την τάση αντιμετώπισης του κινδύνου και κατά συνέπεια την προετοιμασία για αυτήν. Στο άγχος, που είναι ένα υποκειμενικό συναίσθημα, ο κίνδυνος και η απειλή είναι ασαφή και άγνωστα, όχι απτά και η αναμονή για την αντιμετώπιση τους καθηλώνει και αδρανοποιεί. Όταν όμως ο φόβος συνεχίζει να υφίσταται, ενώ δεν υπάρχει πραγματικός κίνδυνος, τότε μετατρέπεται σε φοβία και γίνεται εμπόδιο στην φυσιολογική αντιμετώπιση της καθημερινότητας του ατόμου (Samuel 1997). Ο φόβος έχει συνήθως βραχεία διάρκεια (Οικονόμου 1994), και επειδή η αιτία που τον προκαλεί είναι γνωστή, δύνεται η δυνατότητα της οργάνωσης της άμυνας και της αντιμετώπισης του. Είναι δηλαδή είναι ένας προστατευτικός μηχανισμός, μια λειτουργία και προστασία του ατόμου απαραίτητη για τη σωματική αλλά και τη ψυχική του υγεία. Ο φόβος είναι ένα αίσθημα υγιές, όταν όμως μετατρέπεται σε φοβία, πρέπει να αντιμετωπιστεί. Πολλές φορές τα άτομα που διακατέχονται από φοβίες, αντιμετωπίζουν δυσκολία ακόμη και στην απλή καθημερινότητα τους, μια βόλτα, ένα μικρό ταξίδι, ακόμη και μια φιλική επίσκεψη μπορεί να μετατραπεί σε μια επώδυνη διαδικασία που τους καταρρακώνει. Τα συμπτώματα της φοβίας είναι πολλά, φόβος, πανικός, τρόμος και φρίκη. Η ψυχοφυσιολογική αντίδραση του φόβου είναι αποτέλεσμα διέγερσης ενός αμυντικού συστήματος με το οποίο είναι προικισμένος ο άνθρωπος (Kandel et al. 2006). Σήμερα γνωρίζουμε ότι η περιοχή του εγκεφάλου που είναι υπεύθυνη για την αντίδραση αυτή είναι μια περιοχή του εγκεφάλου που ονομάζεται αμυγδαλή, η οποία είναι μέρος του μεταιχμιακού συστήματος, το οποίο σχετίζεται με τα συναισθήματα και τη συμπεριφορά. Η αμυγδαλή δέχεται πληροφορίες από το θάλαμο (τον ενδιάμεσο σταθμό οπτικών κι ακουστικών οδών) και οι πληροφορίες φτάνουν στην αμυγδαλή νωρίτερα από ότι φτάνουν στο φλοιό. Έτσι η άμεση αυτή προβολή του θαλάμου μπορεί να διεκπεραιώνει σύντομα αρχέγονες συναισθηματικές αποκρίσεις, κάτι που είναι σημαντικό σε περίπτωση κινδύνου (LeDoux 2003). [60]

71 Επίσης η αμυγδαλή προετοιμάζεται από το θάλαμο να δεχθεί προβολές από ανώτερα φλοιϊκά κέντρα, όπως είναι ο κοιλιακός έσω προμετωπιαίος φλοιός, που μεταφέρουν πιο πολύπλοκες πληροφορίες για τη γνωστική αντιπροσώπευση του συναισθήματος, ώστε να δημιουργηθεί συνειδητή συναισθηματική εμπειρία (Kandel et al. 2006). Ειδικά για το συναίσθημα του φόβου, η προβολή του θαλάμου στην αμυγδαλή είναι πολύ σημαντική και μάλιστα οι πληροφορίες που μεταβιβάζει φθάνουν σε αυτήν ταχύτερα από τις αισθητικές πληροφορίες του φλοιού. Επομένως, η άμεση αυτή προβολή του θαλάμου επιτρέπει την ταχεία δραστηριοποίηση της αμυγδαλής σε αρχέγονα συναισθηματικά ερεθίσματα, ειδικά υπό το καθεστώς απειλής. Διαφορές άγχους και φόβου Λόγω των επικαλυπτόμενων χαρακτηριστικών τους, η διάκριση μεταξύ φόβου και άγχους είναι δύσκολη και αμφιλεγόμενη (Grillon 2008). Η ένταξη του άγχους στο φόβο απαιτεί καλύτερη κατανόηση του φυσιολογικού και παθολογικού άγχους. Στοιχεία από διαφορετικά επίπεδα αναλύσεων υποστηρίζουν ότι οι καταστάσεις του άγχους και του φόβου αποτελούν διαφορετικά φαινόμενα. Οι κλινικοί γενικά δέχονται τη διάκριση μεταξύ του φόβου, μιας απόκρισης στον κίνδυνο, και του άγχους, ένα στάδιο χρόνιας κατανόησης μιας μελλοντικής βλάβης. Η διάκριση μεταξύ φόβου και άγχους υποστηρίζεται από φυσιομετρικές αναλύσεις της αγχώδους συμπτωματολογίας που διακρίνουν τα συμπτώματα του γενικού στρες και της αγχώδους κατανόησης από αυτά της μάχης ή της φυγής (Brown et al. 1998) Όπως έχει ήδη αναφερθεί ο φόβος συνιστά αντίδραση σε μια άμεση, γνωστή και συγκεκριμένη εξωτερική απειλή. Αντίθετα το άγχος αποτελεί τη συναισθηματική απάντηση στην αναμονή ενός κινδύνου, άγνωστου, αόριστου, συγκεχυμένου και ασαφούς. Ο φόβος εισβάλλει αιφνίδια και υποχωρεί όταν η απειλή αποχωρήσει, ενώ το άγχος, επειδή η απειλή είναι ασαφής και άγνωστη, διαρκεί πολύ περισσότερο και έχει την τάση να χρονίζει. Ο φόβος αποτελεί μια αντίδραση της στιγμής που καταλήγει σε αντανακλαστική αντίδραση, μάχης ή φυγής, ή έχει ως στόχο να μειώσει το αντίκτυπο της απειλής, για παράδειγμα μέσω μείωσης της ευαισθησίας στον πόνο όταν η πράξη διακόπτεται (Blanchard et al. 1993; Carlsson et al. 2006). Αντίθετα, το [61]

72 άγχος χαρακτηρίζεται από μη προβλεψιμότητα και από ανύπαρκτες συμβολικές απειλές. Σε κατάσταση φόβου, το άτομο είναι σε θέση να οργανώσει την άμυνα του διότι η αιτία που τον προκαλεί είναι γνωστή και συγκεκριμένη, αντιθέτως στο άγχος αυτό δεν είναι εφικτό, επειδή ο κίνδυνος είναι εσωτερικός. Μοντέλο μελέτης των καταστάσεων άγχος-φόβος Δοκιμασία Ανοιχτού Πεδίου Καταμέτρηση Θιγμοτακτισμού Από τη φύση τους τα τρωκτικά έχουν μια ιδιαίτερη προτίμηση στους σκοτεινούς και κλειστούς χώρους. Έτσι οι φωτεινοί και ανοιχτοί χώροι αποτελούν έναν παράγοντα ανησυχίας που εξελίσσεται σε φόβο. Η δοκιμασία καταμέτρησης του θιγμοτακτισμού μελετά μέσω της εξερευνητικής ικανότητας των πειραματόζωων το φόβο που αποκτούν όταν βρίσκονται σε ένα ανοιχτό πεδίο. Με τον όρο θιγμοτακτισμός περιγράφεται η τάση του πειραματόζωου να παραμένει κοντά στις κάθετες επιφάνειες (Telonis & Margarity 2015). Η συμπεριφορά αυτή εξετάζεται σε μια συσκευή που ονομάζεται συσκευή ανοιχτού πεδίου (open field) και αποτελεί το μέσο για να διερευνηθεί αυτή η εξερευνητική συμπεριφορά του ζώου. Τυπικά, τα πειραματόζωα παραμένουν στην περιφέρεια περισσότερο χρόνο σε σχέση με την κεντρική περιοχή, μια προτίμηση η οποία εξηγείται από την έννοια του θιγμοτακτισμού (Valle 1970). Το ανοιχτό πεδίο είναι μία ακόμη δοκιμασία που εκμεταλλεύεται την τάση των πειραματόζωων να εξερευνούν νέα περιβάλλοντα (Walsh & Cummins 1976). Αποτελέσματα ερευνών επιβεβαίωσαν προηγούμενες μελέτες που υποστήριζαν ότι η δοκιμασία του θιγμοτακτισμού σε ανοιχτό πεδίο αποτελεί ένα χρήσιμο τεστ για τη μελέτη της αγχολυτικής δραστηριότητας στα τρωκτικά (Treit & Fundytus 1988). Η πειραματική συσκευή αποτελείται από ένα τετράγωνο ανοιχτό πεδίο κατασκευασμένο από plexyglass διαστάσεων 40x40cm με τοιχώματα ύψους 30cm. Οι τρεις από τις τέσσερεις πλευρές είναι βαμμένες μαύρες και από την τέταρτη πλευρά διέρχεται ασθενής φωτισμός. Το δάπεδο της συσκευής έχει διαστάσεις 40x40cm και χωρίζεται σε 25 τετράγωνα διαστάσεων 8x8cm. Στο κέντρο διαγράφεται ένα τετράγωνο, αποτελούμενο από τα 9 κεντρικά τετράγωνα, και αντιπροσωπεύει την [62]

73 κεντρική περιοχή. Η δοκιμασία πραγματοποιείται σε δωμάτιο με χαμηλό φωτισμό και απόλυτη ησυχία όπου τα πειραματόζωα αφήνονται να ηρεμήσουν για 1 ώρα, με σκοπό την ηρεμία και την εξοικείωση με το χώρο. Κάθε πειραματόζωο τοποθετείται στο κέντρο της συσκευής. Ο συνολικός χρόνος παραμονής κάθε πειραματόζωου στη συσκευή είναι 10min και σε όλη τη διάρκεια καταγράφεται ο χρόνος παραμονής του πειραματόζωου στην περιφέρεια της συσκευής δηλαδή ο χρόνος παραμονής έξω από το κεντρικό τετράγωνο και ο αριθμός των εισόδων στην κεντρική περιοχή της συσκευής. Από έρευνες υποστηρίχθηκε ότι τα τρωκτικά προτιμούν να κινούνται και να τρώνε δίπλα στα τοιχώματα είτε του κλουβιού τους είτε ενός ανοιχτού πεδίου καθώς και ότι λειτουργικά η θιγμοτακτική συμπεριφορά είναι πιθανώς μια άποψη κάλυψης από έναν εχθρό (Brain 1976). Τέλος η χορήγηση αγχογενών φαρμάκων μπορεί να αυξήσει το θιγμοτακτικό δείκτη και το χρόνο παραμονής στην περιφέρεια ενώ αντίθετα η χορήγηση αγχολυτικών φαρμάκων μείωσε το θιγμοτακτικό δείκτη αλλά και το χρόνο παραμονής στην περιφέρεια (Simon et al. 1994). Άγχος, εγκέφαλος και νευροδιαβιβαστικά συστήματα Αναφερόμενοι στις αγχώδεις συμπεριφορές δεν πρέπει να παραλείψουμε τη συσχέτιση που έχουν οι εγκεφαλικές περιοχές και τα διάφορα νευροδιαβιβαστικά συστήματα με αυτές τις συμπεριφορές (Zarrindast & Khakpai 2015; Viveros et al. 2005). Πολλές είναι οι περιοχές του εγκεφάλου αλλά και τα νευροδιαβιβαστικά συστήματα που εμπλέκονται με το άγχος (Canteras et al. 2010). Σε έρευνες έχει προταθεί ότι διαφορετικές περιοχές του εγκεφάλου εμπλέκονται στην διαμόρφωση και την έκφραση του άγχους, κάποιες από αυτές είναι η αμυγδαλή (Zarrindast et al. 2011; Palomares-Castillo et al. 2012), ο ιππόκαμπος (Rostami et al. 2006; Ashabi et al. 2011; Zarrindast, Babapoor-Farrokhran, et al. 2008), ο μετωπιαίος φλοιός (Fogaça et al. 2012; Peleg-Raibstein et al. 2005), το διάφραγμα (Septum pellucidum) (Molina Hernández et al. 2006; Zarrindast, Valizadegan, et al. 2008) καθώς και ο επικλινής πυρήνας (Zarrindast, Babapoor-Farrokhran, et al. 2008; Kochenborger et al. 2012). [63]

74 Οι κύριοι παράγοντες που εμπλέκονται στην επαγόμενη από στρες συμπεριφορά είναι κεντρικοί νευροδιαβιβαστές που συνδέονται ιδίως με τον άξονα υπόφυσης-επινεφριδίων και με την παραγωγή ελευθέρων ριζών (Herman & Cullinan 1997; Sullivan 1995). Σημαντικό ρόλο στις αγχώδεις συμπεριφορές υποστηρίζεται ότι έχουν οι νευροδιαβιβαστές γ-αμινοβουτυρικό οξύ (Lydiard 2003; Enna 1984), ντοπαμίνη (Ferreira et al. 2011; Falco et al. 2014), νοραδρεναλίνη (Charney & Redmond 1983), σεροτονίνη (Amital et al. 2005; Wesołowska 2008) και η ακετυλοχολίνη (Farchi et al. 2007; Zimmerman & Soreq 2006). Ο νευροδιαβιβαστής που είναι καλυτέρα μελετημένος για τη σχέση του με το άγχος και φαίνεται να είναι αυτός που επηρεάζει περισσότερο τις αγχώδεις συμπεριφορές είναι το γ-αμινοβουτυρικό οξύ καθώς αποτελεί τον ο κυριότερο ανασταλτικό νευροδιαβιβαστής του εγκεφάλου (Lydiard 2003; Enna 1984). Τα περισσότερα και τα πιο δραστικά φάρμακα που χορηγούνται σήμερα ως αγχολυτικά περιέχουν ουσίες όπως είναι η γκαμπαπεντίνη, η πρεγκαμπαλίνη αλλά και πολλές άλλες, που είναι αναστολείς της επαναπρόσληψης του γ-αμινοβουτυρικού οξέως (Nemeroff 2003).. Ένας ακόμα σημαντικός νευροδιαβιβαστής που εμπλέκεται στην συμπεριφορική απόκριση σε αγχογόνα περιβαλλοντικά ερεθίσματα είναι η ντοπαμίνη, η οποία παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στο άγχος και στο φόβο (de la Mora et al. 2010; Kienast et al. 2008; Diaz et al. 2011). Σημαντική είναι και η σύνδεση που έχει το ντοπαμινεργικό σύστημα με το γ-αμινοβουτυρικό οξύ και η επίδραση της σύνδεσης αυτής στην αγχώδη συμπεριφορά (Diaz et al. 2011). Από έρευνες έχει αποδειχτεί ότι η σχέση της ντοπαμίνης με το γ-αμινοβουτυρικό οξύ είναι αντιστρόφως ανάλογη. Η ντοπαμίνη αυξάνει την απελευθέρωση του αμινοβουτυρικού οξέως, με την ενεργοποίησης του D1 υποδοχέα της ενώ το αμινοβουτυρικό οξύ μειώνει την απελευθέρωση της ντοπαμίνης. Η ντοπαμίνη φαίνεται ακόμα να εμπλέκεται και στο επαγόμενο από την ισταμίνη άγχος στη βασοπλευρική αμυγδαλή (Zarrindast & Khakpai 2015). Η ισταμίνη έχει δειχθεί ότι έχει αγχογόνο δράση και σε άλλες εγκεφαλικές περιοχές όπως η κεντρική αμυγδαλή και ο ραχιαίος και ο κοιλιακός ιππόκαμπος σε ποντίκια και αρουραίους αντίστοιχα. Ωστόσο, στον επικλινή πυρήνα λειτουργεί ως αγχολυτικό [64]

75 Σε περιόδους άγχους η νοραδρεναλίνη έχει βρεθεί να είναι σε υψηλά επίπεδα στο αίμα. Τα φάρμακα αλλά και οι ουσίες που έχουν ως δράση την αύξηση της δραστηριότητάς της έχει παρατηρηθεί ότι προκαλούν αγχογένεση. Σε σύνδεση με τα παραπάνω έχει παρατηρηθεί ακόμα ότι με τη χορήγηση της νοραδρεναλίνης ο οργανισμός παρουσιάζει μεταβολές που μιμούνται τις φυσιολογικές μεταβολές που επικρατούν σε καταστάσεις άγχους, τέτοιες είναι η αύξηση πίεσης και καρδιακών παλμών, η εφίδρωση και το αίσθημα τις ανησυχίας (Charney & Redmond 1983). Ένας άλλος παράγοντας που ενέχεται στην αγχώδη συμπεριφορά είναι η σεροτονίνη, η οποία έχει υποδοχείς με εξαιρετικά ποικιλόμορφη δομή και λειτουργία. Η ίδια ασκεί τόσο αγχολυτική όσο και αγχογόνο δράση. Πιο συγκεκριμένα, ενώ έχει προταθεί ότι η ενεργοποίηση των υποδοχέων της 5-HT- 1 D (Amital et al. 2005), 1 C (Baldwin & Rudge 1995), 2 C (Millan et al. 2005), 4 (Kennett et al. 1997), 6 (Wesołowska 2008) και 7 (Hedlund et al. 2005) επάγει αγχογένεση. Από την άλλη μεριά η ενεργοποίηση των υποδοχέων 5-HT- 1 A (Parks et al. 1998), 2 A (Schreiber et al. 1998) και 2 B (Kennett et al. 1996)προκαλεί αγχόλυση Άγχος και χολινεργικό σύστημα Μεταξύ των κεντρικών νευροδιαβιβαστών το γ-αμινοβουτυρικό οξύ και οι κατεχολαμίνες είναι οι νευροδιαβιβαστές που έχουν μελετηθεί εκτεταμένα σε σχέση με το στρες (Nowakowska et al. 2001). Όσον αφορά στο χολινεργικό σύστημα και την ακετυλοχολίνη, η σύνδεση του χολινεργικού συστήματος στις διαδικασίες της μάθησης και της μνήμης είναι καλά εδραιωμένη (Blokland et al. 1992; Power et al. 2003; Power 2004; Elvander et al. 2004). Η χολινεργική σηματοδότηση στον ιππόκαμπο και το νεοφλοιό εμπλέκετε σε μεγάλο βαθμό στη γνωστική λειτουργία, συμπεριλαμβανομένης της εκμάθησης, της μνήμης και προσοχής (McKinney & Jacksonville 2005; Schliebs & Arendt 2011; Fragkouli et al. 2005; Ormerod & Beninger 2002). Πλέον υπάρχουν μελέτες που υπογραμμίζουν τη σημασία του χολινεργικού μηχανισμού στο άγχος (Das et al. 2005). Από το 1985 ευρήματα υποστηρίζουν ότι η ακετυλοχολίνης επηρεάζεται από το στρες ακινητοποίησης (Finkelstein et al. 1985). Το 1987 ο Fatranska και οι συνεργάτες του παρατήρησαν ότι η επίδραση του στρες προκαλεί ανομοιογενείς και ποικίλες αλλαγές στο χολινεργικό σύστημα. Οι αλλαγές που παρατήρησαν αφορούσαν τα επίπεδα της ακετυλοχολίνης, [65]

76 την πρόσληψη της χολίνης, τη δραστηριότητα των υποδοχέων της ακετυλοχολίνης, τη δραστικότητα της ακετυλοτρανσφεράσης της χολίνης και της ακετυλοχολινεστεράσης (Fatranská et al. 1987). Η απάντηση του οργανισμού στο στρες εκλύει μια σειρά αλλαγών στη σύνθεση και δέσμευση της ακετυλοχολίνη, γεγονός που δείχνει την εμπλοκή του χολινεργικού συστήματος του ιππόκαμπου σε αυτή την απάντηση (Gilad et al., 1983). Ακόμα κατά τον Gilad, η επίδραση του στρες στο χολινεργικό σύστημα του ιππόκαμπου ποικίλει ανάλογα με το στέλεχος των αρουραίων. Ιδιαίτερα, πρόσφατες μελέτες συσχετίζουν το χολινεργικό σύστημα με την παθοφυσιολογία των διαταραχών λόγω άγχους (Dori et al. 2011). Άλλα αποτελέσματα ερευνών επίσης καταδεικνύουν ότι η AChE-R εμπλέκεται τόσο στη γνωστική κατάσταση των τρωκτικών, από την άποψη της μάθησης του φόβου κάτω από συνθήκες στρες (Farchi et al. 2007) όσο και στην αγχώδη συμπεριφορά (Zimmerman & Soreq 2006) Το οξύ στρες με τη μέθοδο της ακινητοποίησης έδειξε στην έρευνα του Das και των συνεργατών ότι επηρεάζει την εγκεφαλική δραστηριότητα της ακετυλοχολινεστεράσης και την γνωστική λειτουργία (παθητική μάθηση αποφυγής) σε ενήλικα ποντίκια (Das et al. 2000). Παρά τις γνώσεις που έχουμε μέχρι σήμερα για τις δράσεις των νευροδιαβιβαστών σχετικά με τις αγχώδεις συμπεριφορές, τις περισσότερες φορές είναι δύσκολη η ενοχοποίηση ενός συγκεκριμένου νευροδιαβιβαστή για κάποια αγχολυτική ή αγχογενή λειτουργία. Μία αιτία θα μπορούσε να είναι η αλληλοεπικάλυψη των νευροδιαβιβαστικών οδών σε πολλές εγκεφαλικές περιοχές. Μία άλλη αιτία θα μπορούσε να είναι η κοινή βιοσυνθετική οδός πολλών νευροδιαβιβαστών. Σημαντική αιτία είναι η αλληλοεξάρτηση των νευροδιαβιβαστικών οδών και η αλληλοεπίδραση των νευροδιαβιβαστών καθώς όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η αύξηση ενός νευροδιαβιβαστή μπορεί να οδηγήσει σε μείωση ή και αύξηση των επιπέδων ενός άλλου νευροδιαβιβαστή. Θα μπορούσε κατ επέκταση να είναι η αιτία της εκδήλωσης κάποιας αγχολυτικής δράσης ή κάποιας αγχογόνου δράσης τόσο του πρώτου [66]

77 νευροδιαβιβαστή όσο και του δεύτερου. Ακόμα υπάρχει η πιθανότητα 2 νευροδιαβιβαστές σε μία περιοχή να μην μπορούν να έχουν αγχολυτική ή αγχογόνο δράση αν δρουν ξεχωριστά, καθώς μπορεί να είναι απαραίτητη η ταυτόχρονη μεταβολή τους, δηλαδή να δρουν συνεργατικά. Για την καλύτερη δυνατή μελέτη των νευροδιαβιβαστών και των λειτουργιών τους θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ανταγωνιστές, αγωνιστές και αναστολείς της επαναπρόσληψης του υπό μελέτη νευροδιαβιβαστή. Δηλαδή πρέπει να χρησιμοποιούνται ουσίες που θα έχουν επιλεκτική δράση για κάθε νευροδιαβιβαστή, ώστε να αποφεύγονται λανθασμένα συμπεράσματα, για παράδειγμα λόγω δράσης της ουσίας στους υποδοχείς ενός άλλου νευροδιαβιβαστή. Άγχος και η σχέση του με την ηλικία και το φύλο Όπως έχει αναφερθεί και παραπάνω ότι η γήρανση έχει οριστεί ως μία «προοδευτική επιδείνωση» όλων των βιολογικών διεργασιών του οργανισμού. Συχνά σε πολλά συστήματα του οργανισμού εμφανίζεται με το γήρας κάποια μορφής λειτουργική απώλεια, για παράδειγμα τέτοια συστήματα μπορεί να είναι το ενδοκρινικό, το γνωστικό (Snowdon & Nun Study 2003), αλλά το κινητικό. Ο βαθμός εμφάνισης των λειτουργικών απωλειών στον οργανισμό έχει μεγάλες διαφορές μεταξύ των οργανισμών (Miller & O Callaghan 2005). Καθώς οι δημογραφικές αναλύσεις δείχνουν ότι ο μέσος όρος ζωής έχει συνεχή αύξηση οι μελέτες που αφορούν το γήρας και τις επιπτώσεις του στον οργανισμό ολοένα και αυξάνονται. Το γήρας σχετίζεται με την αλλοίωση του εγκεφάλου, τόσο των ανατομικών όσο και των νευροχημικών του συνθηκών, η μείωση της γνωστικής λειτουργίας είναι ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα (Heuser & Lammers 2003). Αυτό οφείλεται εν μέρει στο γεγονός ότι η άνοια και οι άλλες απώλειες της λειτουργίας του εγκεφάλου ενίοτε συνοδεύουν το γήρας εμφανίζοντας και μια προφανή μείωση της ποιότητας της ζωής του ατόμου. Το άγχος επίσης από την άλλη πλευρά, σε μια κοινωνία με γρήγορους ρυθμούς και άκρως ανταγωνιστική, κυριαρχεί στην ζωή μας γι αυτό και υπάρχει μεγάλο ενδιαφέρον για την κατανόηση του ρόλου του αλλά και τη σύνδεση της αγχώδους συμπεριφοράς με το γήρας και τον εγκέφαλο κατά το γήρας. Η μελέτη της [67]

78 επίδρασης του γήρατος στον εγκέφαλο καθώς και το πώς συνδέεται η επίδραση αυτή με τη συμπεριφορά όπως το άγχος, αποτελεί ένα σημαντικό πεδίο έρευνας για τους νευροεπιστήμονες. Οι έρευνες που μελετούν το άγχος, έχουν ως απώτερο σκοπό την βελτίωση της ποιότητας ζωής του ανθρώπου, όπως για παράδειγμα δια μέσου της παρασκευής φαρμάκων ή συμπληρωμάτων διατροφής με αγχολυτικές δράσεις. Με βάσει το γεγονός ότι τα κατώτερα θηλαστικά δεν παρουσιάζουν τις ίδιες γνωστικές ικανότητες με τον άνθρωπο, η μελέτη του άγχους σε κατώτερα θηλαστικά περιορίζεται σε πιο γενικά συμπεράσματα. Επομένως οι περισσότερες μελέτες που γίνονται στον άνθρωπο είναι κυρίως ψυχιατρικές και συγκεκριμένες, μελετώντας με επίκεντρο την ψυχοπαθολογία του ατόμου και εστιάζοντας σε διαταραχές που προκαλούνται από το άγχος όπως ο πανικός, το γενικευμένο άγχος, το κοινωνικό άγχος και φοβίες που συνδέονται άμεσα με το άγχος όπως η αγοραφοβία, η κλειστοφοβία και άλλες. Οι περισσότερες συμπεριφορικές μελέτες που αφορούν συναισθηματικές αποκρίσεις άγχους, εστιάζουν κυρίως σε συγκεκριμένες ηλικιακές ομάδες η φύλα και όχι τόσο στην μεταβολή του ανάλογα με το πέρας της ηλικία, η τη σύγκριση μεταξύ των δύο φύλων. Όσον αφορά τον άνθρωπο, το άγχος εμφανίζει μεγάλη ετερογένεια σε σχέση με το φύλο και την ηλικία του ατόμου. Μελέτες σε πειραματόζωα έχουν δείξει ότι με το γήρας εμφανίζονται αλλαγές στη συμπεριφορά και συγκεκριμένα για το άγχος, εμφανίζεται αύξηση της αγχώδους συμπεριφοράς (Pietropaolo et al. 2014; Miller & O Callaghan 2005). Αντίστοιχα έρευνες σε μυς και επίμυς έχουν υποδείξει αύξηση του άγχους με το γήρας (Pietropaolo et al. 2014; Guimarães et al. 2015) Μια πολύ εμφανιζόμενη ομάδα ψυχιατρικών διαταραχών που σχετίζονται με το άγχος είναι οι αγχώδεις διαταραχές (Avenevoli et al. 2012). Από έρευνες είναι τεκμηριωμένο ότι οι γυναίκες έχουν περισσότερες πιθανότητες από τους άνδρες να αναπτύξουν κάποια αγχώδη διαταραχή κατά τη διάρκεια της ζωής τους και σε μελέτη του 2011 και 2013 αναφέρεται ότι το ποσοστό εμφάνισης αγχωδών διαταραχών στις γυναίκες είναι 1,5 με 2 φορές υψηλότερο από τους άνδρες (McLean et al. 2011; Donner & Lowry 2013). Επίσης το ποσοστό εμφάνισης των κρίσεων πανικού που μπορεί να προκληθούν από συγκεκριμένα ερεθίσματα (αλλά όχι απαραίτητα) είναι δύο έως τρεις φορές υψηλότερο στις γυναίκες από ότι στους άνδρες (Gater et al. 1998; Yonkers et al. 2003). Σε μελέτη διάρκειας οχτώ χρόνων ο Yonkers και οι [68]

79 συνεργάτες του ανέφεραν ότι οι γυναίκες εμφανίζουν υποτροπές σε τριπλά υψηλότερη συχνότητα σε σύγκριση με τους άνδρες (Yonkers et al. 2003). Επίσης μελέτες σε μυς και επίμυς σε διάφορες ηλικιακές ομάδες και σε διάφορα στελέχη έχουν παρατηρήσει ότι οι θηλυκοί μυς/επίμυς παρουσιάζουν αυξημένη αγχώδη διαταραχή σε σύγκριση με τους αρσενικούς (Xu et al. 2011; Lynn & Brown 2009; Estanislau & Morato 2006). [69]

80 5. ΑΡΩΜΑΤΙΚΑ ΦΥΤΙΚΑ ΕΙΔΗ Το φυτικό βασίλειο περιλαμβάνει τουλάχιστον διαφορετικά είδη. Ανάμεσά τους, εκτιμάται ότι υπάρχουν περίπου είδη αρωματικών φυτών και είδη φαρμακευτικών φυτών. Τα αρωματικά και φαρμακευτικά φυτά (Α/Φ) φυτά ανήκουν σε τουλάχιστον πενήντα οικογένειες (π.χ. Apiaceae, Asteraceae, Geraniaceae, Labiatae, Rutaceae, κ.λπ.) (Μαλούπα et al. 2013). Πολλά από τα αρωματικά φυτά χαρακτηρίζονται και ως φαρμακευτικά, διότι περιέχουν ουσίες με αποδεδειγμένες θεραπευτικές ιδιότητες Πολλά από τα είδη των φυτών που δεν αναφέρονται ως αρωματικά και φαρμακευτικά δεν έχουν ερευνηθεί ως προς τις φαρμακευτικές ιδιότητες των συστατικών τους. Η πλούσια χλωρίδα της Ελλάδας σε αρωματικά και φαρμακευτικά φυτά την κάνει ένα ιδανικό μέρος για την καλλιέργεια πολλών από τα παραπάνω φυτά. Κοινό χαρακτηριστικό των αρωματικών φυτών είναι ότι τα διάφορα φυτικά μέρη τους (φύλλα, άνθη, κλπ.) περιέχουν αιθέρια έλαια, τα οποία τους προσδίδουν χαρακτηριστική οσμή. Τα αιθέρια έλαια μπορεί να εμφανίζονται σε όλα τα όργανα των φυτών (βλαστό, ρίζα, φύλλα, άνθη, καρπούς). Τα βότανα ήταν η κύρια θεραπευτική μέθοδος μέχρι τα μέσα του 19ου αιώνα και ακόμη και σήμερα, σε πολλές χώρες της Ευρώπης η χρήση τους ως αφεψήματα είναι πολύ δημοφιλής, αποτελώντας εναλλακτική λύση σε φάρμακα που προέρχονται από συνθετικές χημικές ουσίες (Gurib-Fakim 2006). Η πλειονότητα των ελληνικών αρωματικών φυτών ανήκει στις οικογένειες Apiaceae, Asteraceae, Lamiaceae, Lauraceae, Myrtaceae, Pinaceae, από τις οποίες πιο ενδιαφέρουσα μπορεί να θεωρηθεί αυτή των Lamiaceae (ή αλλιώς Labiatae). Η οικογένεια των Lamiaceae συγκροτείται από περίπου 250 γένη με τα 41 να βρίσκονται στην Ευρώπη, 45 στη Μεσογειακή περιοχή. Ο αριθμός των ειδών τους φτάνει 6700 με τα 452 να βρίσκονται στην Ευρώπη. Στην Οικογένεια αυτή ανήκουν φυτά μονοετή ή πολυετή, με τετράγωνο βλαστό, ποώδη, θαμνώδη ή ημιθαμνώδη, με αρωματικά φύλλα, σπάνια δέντρα ή αναρριχώμενα. Μία από τις περιοχές με την μεγαλύτερη συγκέντρωση ειδών της οικογένειας είναι στη Μεσόγειο. Οι δενδρώδεις μορφές που είναι εξαιρετικά σπάνιες και εμφανίζονται μόνον στο Ν. Αμερικανικό γένος Hyptis, όπου οι αντιπρόσωποι του μπορούν να φθάσουν μέχρι τα 12 μέτρα [70]

81 ύψος. Χαραχτηριστικά είναι τα αρωματικά και τα φαρμακευτικά είδη της οικογένειας, τα οποία ανήκουν σε γένη όπως έιναι η μέντα (Mentha), η ρίγανη (Origanum), το φασκόμηλο/σάλβια (Salvia), η λεβάντα (Lavandula), το θυμάρι (Thymus), ο βασιλικός (Ocimum), το δεντρολίβανο (Rosmarinus), η θρούμπη (Satureja) και το τσάι του βουνού (Sideritis) (Στεφανάκη Νικηφοράκη 1999). Γενικά χαρακτηριστικά του γένους Sideritis Το Ελληνικό τσάι του βουνού είναι πολυετές φυτό, ανήκει στην οικογένεια των χειλανθών (Lamiaceae ή Labiate) και στο γένος Sideritis και περιλαμβάνει περίπου 150 είδη σε όλο τον κόσμο (Linardaki et al. 2011). Tο επιστημονικό όνομα του Sideritis (σιδηρόχορτο) προέρχεται από την ελληνική λέξη «σίδηρος» και κατά µια εκδοχή δόθηκε στο φυτό επειδή εθεωρείτο εξαιρετικό φάρμακο κατά των τραυμάτων από σιδερένια όπλα, δηλαδή κατάλληλο για τις πληγές κατά τη διάρκεια των πολέμων στην αρχαιότητα (González-Burgos et al. 2011). Ακόμα πολλοί είναι αυτοί που υποστηρίζουν ότι η ονομασία του δόθηκε λόγω του ότι αποτελεί φυσική πηγή σιδήρου. Μια τρίτη άποψη υποστηρίζει ότι το σχήμα των δοντιών του κάλυκα του φυτού, που μοιάζουν με αιχμή λόγχης, είναι ο λόγος που πήρε αυτή την ονομασία. Το φυτό Sideritis είναι γνωστό στην Ελλάδα από αρχαιοτάτων χρόνων, από τις αναφορές και περιγραφές του Ιπποκράτη, του Θεόφραστου και του Διοσκουρίδη (Hanlidou et al. 2004). Από τον Ιπποκράτη που το συνιστούσε ως τονωτικό λόγω της υψηλής περιεκτικότητας του σε σίδηρο. Τον Διοσκουρίδης που συμβούλευε τους στρατιώτες να καταναλώνουν έγχυμα από τσάι του βουνού ως ένα αναζωογονητικό, αναγεννητικό βοήθημα για να επιτύχουν ταχύτερη και καλύτερη θεραπεία και το θεωρούσε ακόμα μια ισχυρή ασπίδα κατά του κρυολογήματος. Μέχρι και σήμερα που είναι γνωστό από μελέτες για την αντιφλεγμονώδη (Tadić et al. 2012; Hernández- Pérez & Rabanal 2002), την αντιπυρετική (Hanlidou et al. 2004; González-Burgos et al. 2011), την αναλγητική (Hernández-Pérez & Rabanal 2002) την αντιοξειδωτική (Danesi et al. 2013; Linardaki et al. 2011), την αντι-υπερτασική, και την αντιθρομβωτική δράση του. Γνωστές είναι επίσης οι προστατευτικές του δράσεις στο γαστρεντερικό σύστημα (Tadić et al. 2012), κατά της δυσπεψίας (Hanlidou et al. [71]

82 2004) και του έλκους, στα μιτοχόνδρια (González-Burgos et al. 2013) και ευεργετική δράση του στις ρευματικές παθήσεις (Tadić et al. 2012). Ακόμα έχει ανοσοτροποποιητική (Navarro et al. 2001) και αντιβακτηριδιακή δράση (Basile et al. 2006; Hanlidou et al. 2004) και περιέχει ουσίες που αναστέλλουν την επαναπρόσληψη της σεροτονίνης, της ντοπαμίνης και της νορανδρεναλίνης (τρικυκλικά αντικαταθλιπτικά) (Knörle 2012). Τέλος έχει πλούσια περιεκτικότητα σε φλαβονοειδή που θωρακίζουν το κυκλοφορικό και το καρδιαγγειακό σύστημα. Η φαρμακευτική δράση των ειδών του γένους Sideritis οφείλεται κυρίως σε χημικά συστατικά, όπως τερπένια, φλαβονοειδή, κουμαρίνες, στερόλες, ιριδοειδή, λιγνάνες και αιθέρια έλαια. Τα διτερπένια, τα φλαβανοειδή καθώς και τα αιθέρια έλαια απαντώνται σχεδόν σε κάθε είδος του γένους (González-Burgos et al. 2011). Έτσι το Τσάι του Βουνού με όλες αυτές τις ιδιότητες παραμένει το δημοφιλέστερο ελληνικό βότανο. Χρησιμοποιείται παραδοσιακά σε Ισπανία, Τουρκία και Ελλάδα ως αφέψημα (González-Burgos et al. 2011; Strid & Tan 1991) για τις ευεργετικές του ιδιότητες. Τα τελευταία χρόνια παρατηρείται αύξηση της ζήτησης του, καθώς αυξάνεται ο αριθμός των δημοσιευμάτων για τις θεραπευτικές του δράσεις (González-Burgos et al. 2011). Το γένος Sideritis απαντάτε σε εύκρατα και τροπικά κλίματα του Βορείου Ημισφαιρίου από τις Μπαχάμες ως τη Δυτική Κίνα και από τη Γερμανία στο Μαρόκο. Τα περισσότερα είδη απαντώνται στη Μεσόγειο, από τα Κανάρια νησιά έως τη Μαδέρα και τον Καύκασο, την Ισπανία και την Τουρκία (González-Burgos et al. 2011; Barber et al. 2002). [72]

83 Εικόνα 12: Γεωγραφική εξάπλωση του γένος Sideritis. Πηγή:(Barber et al. 2002) Το γένος Sideritis περιλαμβάνει περίπου 150 γνωστά είδη που αυτοφύονται, σχεδόν αποκλειστικά στις ορεινές περιοχές της Ελλάδας και περιλαμβάνει τα παρακάτω είδη (Γκόλιαρης 1984): 1. Τσάι Βλάχικο (Sideritis athoa Papan. & Kokkini.) που αυτοφύεται στον Άθω, την Πίνδο και στα ορεινά της νήσου Σαμοθράκης. Είναι πολυετής πόα ύψους μέχρι 40 εκ., όπου καλύπτεται ολόκληρο με μικρές αδενώδεις τρίχες. 2. Τσάι του Μαλεβού ή τσάι Ταΰγετου (Sideritis clandestina Chaub & Bory) που αυτοφύεται πάνω στους βράχους στα όρη του Πάρνωνα, του Μαλεβού, του Ταΰγετου και της Κυλλήνης. Είναι πολυετής πόα ύψους μέχρι 40 εκ. Ο βλαστός του είναι, όπως και στο προηγούμενο είδος, απλός ή διακλαδισμένος. 3. Τσάι του Ολύμπου (Sideritis scardica Griseb.) που αυτοφύεται σε βραχώδη εδάφη στον Όλυμπο, τον Κίσαβο, το Πηλίου και το Σκάρδυ. Είναι πολυετής πόα, έχει βλαστό απλό ή διακλαδισμένο, τετραγωνισμένο, λίγο ξυλώδη στην βάση. 4. Τσάι του Παρνασσού ή τσάι του βελουχιού (Sideritis rαeseri Boiss & He1dr.) που αυτοφύεται στον Παρνασσό, στο Τυμφρηστό (Βελούχι) και σε άλλα βουνά της Αιτωλίας, Δωρίδας και Φθιώτιδας. Είναι πολυετής πόα, [73]

84 ύψους μέχρι 40 εκ. Ο βλαστός είναι λεπτός, χνοώδης, απλός και σπάνια διακλαδισμένος, λίγο ξυλώδης στη βάση. Τα κατώτερα φύλλα είναι έμμισχα και τα ανώτερα άμισχα λογχοειδή, λίγο πριονωτά με άσπρο χνούδι, και άνθη έντονα κίτρινα στις ακραίες ταξιανθίες. 5. Τσάι της Κρήτης (Sideritis syriαcα L.) γνωστό ως Μαλοτήρα ή Καλοκοιμηθιά που αυτοφύεται στα ψηλά βουνά της Κρήτης και κυρίως στα Λευκά Όρη και τον Ψηλορείτη. Είναι πολυετής πόα, ύψους 50 εκ. Έχει βλαστό συνήθως απλό, ισχυρό, όρθιο, που καλύπτεται με πυκνό άσπρο χνούδι. 6. Τσάι της Εύβοιας (Sideritis euboea Heldr.) ή τσάι απ' το Δέλφι που αυτοφύεται άφθονα στο βουνό Δίρφυ σε υψόμετρο μέτρα. Είναι πολυετής πόα, ύψους 50 εκ. Έχει βλαστό συνήθως απλό, ισχυρό, όρθιο, που καλύπτεται με πυκνό άσπρο χνούδι. Τα φυτά του γένους Sideritis είναι δικοτυλήδονα, μονοετή ή πολυετή. Η βάση τους είναι αποξυλωμένη και τριχωτή. Έχουν κωνοειδή κάλυκα που έχει 10 νευρώσεις και 5 οδόντες διαταγμένους σε δύο χείλη. Το χρώμα της δίχειλης στεφάνης του μπορεί να είναι κίτρινο, κιτρινόλευκο, λευκό ή και ροδόχροο. Οι στήμονες είναι τέσσερεις με του δύο μπροστινούς να έχουν μεγαλύτερο μήκος. Δύο συμφυή πέταλα αποτελούν το επάνω χείλος που είναι συνήθως δισχιδές. Το κάτω χείλος καταλήγει σε τρεις λοβούς, όπου ο μεσαίος είναι ο μεγαλύτερος. Ο στύλος καταλήγει σε δυο άνισα στίγματα. Ενώ η ωοθήκη είναι δίχωρη, γίνεται τετράχωρη με ψευδή διαφράγματα. Τέσσερα κάρυα, που αποτελούν τους καρπούς, περικλείουν ένα σπέρμα. Ο πολλαπλασιασμός του μπορεί να γίνει εγγενώς με σπόρο ή και αγενώς με παραφυάδες. Η ανθοφόρος περίοδος είναι τους μήνες Ιούλιο και Αύγουστο όπου γίνεται η συλλογή του υπέργειο τμήματος όταν είναι σε πλήρη άνθηση. Τα αιθέρια έλαια ορισμένων ειδών της οικογένειας όπως η μινθόλη και η θυμόλη, εκχυλίζονται για εμπορικούς. Η μινθόλη (menthol) αποτελεί ένα από τα σπουδαιότερα αιθέρια έλαια και χρησιμοποιείται στην Ιατρική, αλλά και ως καρύκευμα. Η θυμόλη (thymol) από την άλλη μεριά, που εκχυλίζεται από το θυμάρι, βρίσκει εφαρμογές στην Ιατρική, ως πολύ ισχυρό αντισηπτικό. Αποτελεί ένα ιδιαίτερο παραδοσιακό τσάι με ευχάριστη γεύση, ξεχωριστό άρωμα και ένα [74]

85 χαρακτηριστικό κίτρινο ή καφέ-κίτρινο χρώμα. Σήμερα, το εκχύλισμα των φυτών του γένους Sideritis εξαιτίας των ευεργετικών ιδιοτήτων καταναλώνεται ευρέως στην Ελλάδα. Η εκτεταμένη κατανάλωση του Sideritis ως παραδοσιακό ελληνικό τσάι, έχει ως αποτέλεσμα η αυτοφυή παραγωγή του να μην επαρκεί για να καλύψει τις αυξημένες ανάγκες και έτσι έχει δημιουργηθεί τη ανάγκη για την καλλιέργεια του φυτού Η χημική ανάλυση του γένους Sideritis Όπως προαναφέρθηκε η φαρμακευτική δράση των ειδών του γένους Sideritis οφείλεται κυρίως σε χημικά συστατικά, όπως τερπένια, φλαβονοειδή, κουμαρίνες, στερόλες, ιριδοειδή, λιγνάνες και αιθέρια έλαια (González-Burgos et al. 2011). Η χημική ανάλυση έχει δείξει ότι το εκχύλισμα των φυτών του γένους αυτού, περιέχει κυρίως τρεις κύριες κατηγορίες ενεργών συστατικών τα αιθέρια έλαια, τα διτερπένια και οι πολυφαινόλες. 1. Αιθέρια έλαια. Τα αιθέρια έλαια είναι πτητικές ουσίες σε υγρή μορφή και με ελαιώδη εμφάνιση που απομονώνονται μέσω μιας διεργασίας, όπως η απόσταξη, από ένα αρωματικό φυτό ενός συγκεκριμένου φυτικού είδους. Τα μόρια τους, καθώς είναι πτητικές ουσίες, εξατμίζονται εύκολα στον ατμοσφαιρικό αέρα, έρχονται σε επαφή με τα όργανα όσφρησης και δημιουργούν μια ευχάριστη αίσθηση, χαρακτηριστική για κάθε είδος φυτού. Τα συστατικά των αιθέριων ελαίων διακρίνονται σε δυο μεγάλες κατηγορίες: τα οξυγονούχα και τα μη οξυγονούχα. Στα οξυγονούχα ανήκουν οι αλκοόλες, αλδεΰδες, φαινόλες, κετόνες, οξέα και αστέρες ενώ στα μη οξυγονούχα ανήκουν οι υδρογονάνθρακες. Η βιοσύνθεση των αιθέριων ελαίων γίνεται μέσα στους φυτικούς ιστούς και είναι μια σειρά διαφόρων χημικών αντιδράσεων όπου ο ακριβής τρόπος με τον οποίο πραγματοποιούνται δεν είναι ακόμα γνωστός. Τα αιθέρια έλαια βρίσκονται μέσα σε ειδικούς αδένες εκκρίσεως του φυτού, που μπορεί να είναι εσωτερικοί ή εξωτερικοί. [75]

86 Κατά καιρούς έχουν περιγραφεί διάφορες εμπορικές χρήσεις των αιθέριων ελαίων, ως καρυκεύματα, ως καλλυντικά και αρωματικά αλλά και ως αρωματοθεραπευτικά. Βέβαια πολλά κοινά αιθέρια έλαια έχουν φαρμακευτικές ιδιότητες ως αντισηπτικά ενώ επίσης επιδεικνύουν αντιβακτηριακή (Aligiannis et al. 2001; Uğur et al. 2005), αντιμικροβιακή (Gergis et al. 1990), αντιμυκητιακή (Aligiannis et al. 2001)και αντιπαρασιτική δράση 2. Διτερπένια Πολύ σημαντική είναι η υψηλή περιεκτικότητα των ειδών του γένους Sideritis σε διτερπένια. Τα διτερπένια είναι ενώσεις με 4 μονάδες ισοπρενίου. Το ισοπεντάνιο είναι η βασική μονάδα από όπου προέρχονται όλες οι ενώσεις του τύπου αυτού. Περιλαμβάνει πολυάριθμα μέλη με εξαιρετική ποικιλότητα στη μορφή. Τα διτερπένια του γένους Sideritis έχουν πολλές βιολογικές δράσεις και συγκεκριμένα παρουσιάζουν αντιβακτηριακή, αντιμυκητιακή, αντιφλεγμονώδη (Gómez-Serranillos et al. 2004), κυτταροτοξική και γαστροπροστατευτική (Gómez- Serranillos et al. 2004) αντικαρκινική δράση (Loğoğlu et al. 2006). 3. Πολυφαινόλες Οι πολυφαινόλες αποτελούν ένα αναπόσπαστο κομμάτι της διατροφής, του ανθρώπου αλλά και των ζώων, καθώς αποτελούν μία από τις πολυπληθέστερες και ευρύτατα διαδεδομένες ομάδες φυτικών μεταβολιτών. οι κυριότερες πηγές πολυφαινολών είναι τα τρόφημα, τα φρούτα, το τσάι και το κόκκινο κρασί, βέβαια σημαντικές πηγές είναι και τα λαχανικά, τα οσπριοειδή φυτά και τα δημητριακά. Οι φυτικές πολυφαινόλες συμβάλουν στη φυσιολογία του φυτού και για αυτό ήταν για πολλές δεκαετίες στο επίκεντρο των μελετών επιστημόνων που ασχολούνται με τη φυσιολογία των φυτών. Πιο συγκεκριμένα μπορούμε να πούμε ότι συμβάλουν στη μορφολογία του φυτού, όπως το χρωματισμό, προσφέρουν στα φυτά αντίσταση έναντι των παθογόνων και των αρπακτικών ζώων, εμπλέκονται στην ανάπτυξη και την αναπαραγωγή του, καθώς επίσης προστατεύουν τις καλλιέργειες από μολύνσεις (Duthie et al. 2003). Έχουν ταυτοποιηθεί, στο φυτικό βασίλειο, πολλές χιλιάδες μόρια με πολυφαινολική [76]

87 δομή και μέχρι σήμερα είναι γνωστές πάνω από 8000 φαινολικές δομές (Bravo 1998). Οι πολυφαινόλες, προκύπτουν από δύο κύρια βιοσυνθετικά μονοπάτια καθώς που αποτελούν προϊόντα του δευτερογενούς μεταβολισμού των φυτών. Τα δύο αυτά μονοπάτια είναι: α) το μονοπάτι του σικιμικού οξέος και β) το μονοπάτι του οξικού οξέος. Σήμερα υπάρχει ολοένα και αυξανόμενο ενδιαφέρον για τις φυτικές πολυφαινόλες από τους ερευνητές αλλά και από τις βιομηχανίες τροφίμων Ο βασικός λόγος αυτού του αυξανόμενου ενδιαφέροντος, είναι η αναγνώριση μιας πληθώρας βιολογικών ιδιοτήτων και δράσεων των πολυφαινολών και του πιθανού ρόλου τους στη παρεμπόδιση πολλών ασθενειών. Έχει αναφέρθεί ότι οι πολυφαινόλες πιθανόν παρουσιάζουν αντιοξειδωτική και αντικαρκινική δράση καθώς και ευεργετική δράση κατά των καρδιαγγειακών παθήσεων και άλλων ασθενειών. Πέραν των αιθέριων ελαίων και των διτερπενίων, πολλές βιβλιογραφικές μελέτες πιστοποιούν την παρουσία πολυφαινολικών ενώσεων και μάλιστα σε αρκετά μεγάλη αναλογία, στα φυτά του γένους Sideritis, όπως στο γένους Sideritis από την περιοχή της Μακεδονίας (Janeska et al. 2007), στο είδος Sideritis syriaca (Venturella et al. 1995) από την Κρήτη και στα περισσότερα από τα 27 ειδή που μελετήθηκαν του γένους Sideritis από την Τουρκία (Tunalier et al. 2004). [77]

88 6. ΣΚΟΠΟΣ Τα αυξανόμενα ποσοστά εμφάνισης νευροεκφυλιστικών ασθενειών που παρατηρούνται τα τελευταία χρόνια και οφείλονται σε ανεπαρκή τόσο πρόγνωση όσο και θεραπεία έχουν στρέψει το ενδιαφέρον των ερευνητών στην αναζήτηση φυσικών προϊόντων με νευροπροστατευτική δράση. Στη λογική αυτή, το εργαστήριο μας (εργαστήριο Φυσιολογίας Ανθρώπου και Ζώων του τμήματος Βιολογίας) σε συνεργασία με τον τομέα Βιολογίας Φυτών του τμήματος Βιολογίας και το εργαστήριο Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών προϊόντων του τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών έχει πραγματοποιήσει μελέτες με στόχο την εύρεση της πιθανής νευροπροστατευτικής δράσης τόσο αφεψημάτων όσο και άλλων φυτικών εκχυλισμάτων, φυτών κυρίως της ελληνικής χλωρίδας, σε παθοφυσιολογικές καταστάσεις. Οι μελέτες αυτές εστιάζουν κυρίως στη διερεύνηση της συμπεριφοράς αλλά και ποικίλων βιοχημικών παραμέτρων των νευροδιαβιβαστικών συστημάτων όπως το χολινεργικό σύστημα, οξειδωτικών δεικτών κ.α.. Σε πρόσφατη μελέτη της ερευνητικής ομάδας (Vasilopoulou et al. 2013) είχε διερευνηθεί η επίδραση της πόσης αφεψήματος του φυτού Sideritis clandestina subsp. cladestina σε συμπεριφορικές και σε οξειδωτικές/αντιοξειδωτικές παραμέτρους, ενήλικων αρσενικών μυών. Στην ίδια μελέτη είχε πραγματοποιηθεί επίσης και ανάλυση της φυτοχημικής σύστασης του φυτού.. Σε αυτή την έρευνα πραγματοποιήθηκε καθημερινή χορήγηση του αφεψήματος του φυτού Sideritis clandestina subsp. clandestina (σε συγκέντρωση 4% w/v) για περίοδο 40 ημερών σε ενήλικους αρσενικούς Balb-c μύες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ομάδα στην οποία χορηγήθηκε το αφέψημα παρουσίασε στατιστικά σημαντική μείωση του χρόνου θιγμοτακτισμού (δείκτης άγχους) και σημαντική αύξηση του αριθμού των εισόδων στην κεντρική περιοχή της συσκευής (δείκτης κινητικότητας) σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Vasilopoulou et al. 2013). Επομένως το αφέψημα του ανωτέρω φυτού έχει αγχολυτική δράση καθώς κατά τον Simon ο μειωμένος χρόνος θιγμοτακτισμού και αυξημένος αριθμός εισόδων στην κεντρική περιοχή αποτελούν δείκτες αγχόλυσης (Simon et al. 1994). Όσον αφορά οξειδωτικές/αντιοξειδωτικές παραμέτρους η χορήγηση του αφεψήματος προκάλεσε αύξηση της GSH (αντιοξειδωτικός δείκτης) και μείωση των επιπέδων της MDA (δείκτης υπεροξείδωσης λιπιδίων) τόσο στην [78]

89 παρεγκεφαλίδας όσο και στο μεσεγκέφαλο, ενώ ο εγκεφαλικός φλοιός παρέμεινε ανεπηρέαστος. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η χορήγηση αυτού του αφεψήματος εκτός από αγχολυτική δράση έχει και αντιοξειδωτική δράση (Vasilopoulou et al. 2013). Με βάση τα ανωτέρω στην παρούσα εργασία επιλέχθηκε να διερευνηθεί περεταίρω τη δράση του φυτού Sideritis clandestina με τη χρήση ένα εκχύλισμα οξικού αιθυλεστέρα του φυτικού είδους Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca προκειμένου για να διερευνήσουμε την πιθανή θετική του επίδρασή στην αγχώδη συμπεριφορά και στην ενεργότητα των δύο ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης (οι ανωτέρω ισομορφές των εγκεφαλικών περιοχών αποτελούν ένα από τους κύριους στόχους της ερευνητικής μας ομάδας). Προκειμένου να επιλεχτεί η ηλικία των πειραματόζωων που θα χρησιμοποιούνταν ανατρέξαμε σε μια άλλη εργασία της ερευνητικής μας ομάδας (Papandreou et al. 2011). Στη συγκεκριμένη εργασία είχε μελετηθεί η επίδραση του φυτικού εκχυλίσματος του Crocus sativus στη μάθηση - μνήμη και στην ενεργότητα των ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης, σε αρσενικούς μυς δύο ηλικιακών ομάδων 4 μηνών (ενήλικοι) και 20 μηνών (γηραιοί). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι μύες που έλαβαν το φυτικό εκχύλισμα εμφάνισαν βελτίωση στη μάθηση, - μνήμη και στις δύο ηλικιακές ομάδες ενώ σε σχέση την ενεργότητα των ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης παρατηρήθηκε μείωση της G4 ισομορφής μόνο στους ενήλικες μυς. Με βάση την παραπάνω παρατήρηση προτάθηκε να μελετηθούν οι δράσεις του φυτικού εκχύλισμα του Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca σε διαφορετικές ηλικιακές ομάδες για να προσδιορισθούν τυχόν διαφοροποιήσεις της επίδραση του με βάση την ηλικία Ακλουθώντας αυτή τη λογική πρωταρχικός στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η επιλογή των επιθυμητών ηλικιακών ομάδων για τη χορήγηση του φυτικού εκχυλίσματος τόσο σε αρσενικούς όσο και θηλυκούς μυς. Επιλέχθηκαν συνολικά 8 ηλικιακές ομάδες (13-14 ημερών έως την ηλικία των μηνών) και των δύο φύλων για να μελετηθεί αρχικά η τυχόν επίδραση της ηλικίας σε συμπεριφορικούς παραμέτρους (άγχος/φόβος, κινητικότητα). Αναλυτικότερα ο στόχος της παρούσας εργασίας ήταν: [79]

90 A. Η επίδραση της ηλικίας και του φύλου: στην συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος στην κινητικότητα στην ενεργότητα των δύο ισομορφών του ενζύμου της ακετυλοχολινεστεράσης (G1 και G4) σε επιλεγμένες εγκεφαλικές περιοχές και στο λόγο των δύο ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης ο οποίος πρόσφατα παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον καθώς έχει προταθεί ως δείκτης της φυσιολογικής ή μη κατάστασης του οργανισμού και ιδιαίτερα ως δείκτης νευροεκυλιστικών διαδικασιών (Lane et al. 2006; Ferlemi et al. 2014) B. Η διερεύνηση της πιθανής επίδρασης του εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτικού είδους Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca: στην συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος στην κινητικότητα στην ενεργότητα των δύο ισομορφών του ενζύμου της ακετυλοχολινεστεράσης (G1 και G4) σε επιλεγμένες εγκεφαλικές περιοχές και στο λόγο των δύο ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης. Για την πραγματοποίηση του πρώτου στόχου της παρούσας μελέτης οι 8 ηλικιακές ομάδες θηλυκών και αρσενικών μυών που επιλέχθηκαν ήταν: 1) ημερών, 2) ημερών, 3) νεαρά (30 ημερών), 4) ενήλικα (3-4μηνών), 5) ενήλικα (5-6 μηνών), 6) μεσήλικα (9-10μηνών), 7) γηραιά (12-13μηνών) και 8) γηραιά (15-16μηνών). Αρχικά μελετήθηκε η επίδραση της ηλικία και του φύλου στη συμπεριφορική κατάσταση αγχος/φόβος και στην κινητικότητα με τη δοκιμασία του ανοιχτού πεδίου. Η δοκιμασία αυτή εκμεταλλεύεται την τάση που έχουν τα πειραματόζωα να εξερευνούν νέα περιβάλλοντα (Walsh & Cummins 1976) και [80]

91 μελετά το φόβο των πειραματόζωων όταν βρίσκονται σε ένα ανοιχτό πεδίο, μέσω της ικανότητάς τους για εξερεύνηση. Με βάση τα συμπεριφορικά αποτελέσματα επιλέχτηκαν οι ηλικιακές ομάδες, ενήλικες (3-4μηνών) και γηραιοί μύες (15-16μηνών) για να ακολούθησε ο προσδιορισμός της ενεργότητας των ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης σε επιλεγμένες εγκεφαλικές περιοχές (παρεγκεφαλίδα, εγκεφαλικός φλοιός, ιππόκαμπος και ραβδωτό) με τη χρωματογραφική μέθοδο του Ellman και ο υπολογισμός των λόγων των ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης. Πιο συγκεκριμένα με τη χρωματογραφική μέθοδο του Ellman προσδιορίστηκαν η ενεργότητα ισοενζύμων της ακετυλοχολινεστεράσης διαλυτών σε άλας (SS) και διαλυτών σε απορρυπαντικό (DS), όπου κυριαρχούν η G1 και G4 ισομορφή αντίστοιχα (Rieger & Vigny 1976). Η μελέτη των εγκεφαλικών περιοχών κρίθηκε σκόπιμη για να γίνει συσχέτιση των βιοχημικών αποτελεσμάτων με τα συμπεριφορικά αποτελέσματα. Σε δεύτερο επίπεδο πραγματοποιήθηκε η χορήγηση του εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα (που μας χορηγήθηκε από την ερευνητή ομάδα της κας Λάμαρη) του φυτού Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca σε μυς 3-4μηνών (ενήλικές) και μηνών (γηραιοί) και των δυο φύλων. Με τη δοκιμασία του ανοιχτού πεδίου μελετήθηκε η επίδραση του φυτικού εκχυλίσματος στην συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος και στην κινητικότητα και ακολούθησε ο προσδιορισμός της ενεργότητας των ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης στις επιλεγμένες εγκεφαλικές περιοχές που προαναφέρθηκαν και με τη χρωματογραφική μέθοδο του Ellman. Επίσης ακολούθησε ο υπολογισμός των λόγων των ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης. [81]

92 7. ΤΑ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Πειραματόζωα Τα πειραματόζωα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν balb-c και αναπτύχθηκαν σε πολυακρυλικά κλουβιά (8 μύες/κλουβί) κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες θερμοκρασίας C, σχετικής υγρασίας 50-60% και δωδεκάωρο κύκλο εναλλαγής ημέρας-νύκτας. Η τροφή, που ήταν υπό τη μορφή ξηρών κόκκων και το νερό ήταν διαθέσιμα ad libitum. Ο χειρισμός των πειραματόζωων έγινε σύμφωνα με το νόμο του ελληνικού κράτους για τη φροντίδα και τη μεταχείριση των πειραματόζωων (Animal Act, PD 56/13). Αρχικά ερευνήθηκε ο συμπεριφορικός δείκτης άγχος/φόβος με τη δοκιμασία ανοιχτού πεδίου σε 8 ηλικιακές ομάδες αρσενικών και θηλυκών μυών για την επιλογή των κατάλληλων ηλικιακών ομάδων ώστε να χορηγηθεί σε αυτές το εκχύλισμα οξικού αιθυλεστέρα του φυτού Sideritis clandestina subsp. Peloponnesiaca. Οι ηλικιακές ομάδες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: 1) ημερών, 2) ημερών, 3) νεαρά (30 ημερών), 4) ενήλικα (3-4μηνών), 5) ενήλικα (5-6 μηνών), 6) μεσήλικα (9-10μηνών), 7) γηραιά (12-13μηνών) και 8) γηραιά (15-16μηνών). Με βάση τα συμπεριφορικά αποτελέσματα επιλέχτηκαν οι ηλικιακές ομάδες, οι ενήλικες (3-4μηνών) και γηραιοί μύες (15-16μηνών) για τη χορήγηση του φυτικού εκχυλίσματος. Πιο συγκεκριμένα οι ομάδες των πειραματοζώων που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη της επίδρασης του εκχυλίσματος ήταν οι εξής: 1) ενήλικοι θηλυκοί μύες 2) ενήλικοι αρσενικοί μύες 3) ενήλικοι θηλυκοί μύες που τους χορηγήθηκε το εκχύλισμα του Sideritis 4) ενήλικοι αρσενικοί μύες που τους χορηγήθηκε το εκχύλισμα του Sideritis 5) γηραιοί θηλυκοί μύες 6) γηραιοί αρσενικοί μύες [82]

93 7) γηραιοί θηλυκοί μύες που τους χορηγήθηκε το εκχύλισμα του Sideriti 8) γηραιοί αρσενικοί μύες που τους χορηγήθηκε το εκχύλισμα του Sideriti Αφού επιλέχθηκαν οι ηλικιακές ομάδες ακολούθησε η χορήγηση του φυτικού εκχυλίσματος του οξικού αιθυλεστέρα ενδοπεριτοναϊκώς για 3 συνεχείς μέρες. Για την επιλογή της κατάλληλης δόσης του εκχυλίσματος, χορηγήθηκαν αρχικά δύο δόσεις μόνο στους ενήλικους μυς, θηλυκούς και αρσενικούς, η δόση των 30 mg/kg βάρους σώματος και η δόση των 100 mg/kg βάρους σώματος. Μετά την πάροδο 24 ωρών από την τελευταία δόση πραγματοποιήθηκε η δοκιμασία ανοιχτού πεδίου για να βρεθεί η τυχών επίδραση του εκχυλίσματος στη συμπεριφορική κατάσταση αγχος/φόβος. Από τη δοκιμασία ανοιχτού πεδίου παρατηρήθηκε αλλαγή στη συμπεριφορά μόνο με την δόση των 100 mg/kg βάρους σώματος. Έτσι πραγματοποιήθηκε εκ νέου η δοκιμασία ανοιχτού πεδίου μόνο με τη μία δόση και στους γηραιούς μυς και στα δύο φύλα. Από τα συμπεριφορικά αποτελέσματα παρατηρήθηκε αγχολυτική δράση του φυτικού εκχυλίσματος μόνο με τη χορήγηση της δόσης των 100mg/kg και στις δύο ηλικίες και φύλα. Αμέσως μετά την πραγματοποίηση της δοκιμασίας ανοιχτού πεδίου οι μύες θυσιάστηκαν με αυχενική μετατόπιση. Στη συνέχεια απομονώθηκαν οι εγκεφαλικές περιοχές παρεγκεφαλίδα, ιππόκαμπος, φλοιός των εγκεφαλικών ημισφαιρίων και ραβδωτό. Τα εγκεφαλικά δείγματα αποθηκεύθηκαν σε βαθιά κατάψυξη (-80οC) μέχρι την ημέρα επεξεργασίας τους, δηλαδή τον προσδιορισμό της ενεργότητας της AChE. Μελέτη συμπεριφορικής κατάστασης άγχους/φόβου - δοκιμασία ανοιχτού πεδίου Η δοκιμασία ανοιχτού πεδίου ή καταμετηρση θιγμοτακτισμού (Open Field test) όπως προαναφέρθηκε μελετά τη συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος. Ο όρος θιγμοτακτισμός αναφέρεται στην τάση που έχουν τα πειραματόζωα να παραμένουν κοντά στις κάθετες επιφάνειες. Η συμπεριφορά αυτή μελετάτε με τη συσκευή ανοιχτού πεδίου (open field) που αποτελεί το μέσο για να διερευνηθεί η εξερευνητική συμπεριφορά του ζώου (Telonis & Margarity 2015). [83]

94 Η συσκευή ανοιχτού πεδίου αποτελείται από ένα τετράγωνο ανοιχτό πεδίο κατασκευασμένο από plexyglass διαστάσεων 40x40cm με τοιχώματα ύψους 30cm. Οι τρεις από τις τέσσερεις πλευρές είναι βαμμένες μαύρες ενώ από την τέταρτη πλευρά διέρχεται ασθενής φωτισμός. Το δάπεδο της συσκευής έχει διαστάσεις 40x40cm και χωρίζεται σε 25 τετράγωνα διαστάσεων 8x8cm. Στο κέντρο διαγράφεται ένα κεντρικό τετράγωνο, αποτελούμενο από 9 κεντρικά τετράγωνα, το οποίο αντιπροσωπεύει την κεντρική περιοχή. Τα πειραματόζωα αφήνονται να ηρεμήσουν για 1 ώρα, στο δωμάτιο που θα διεξαχθεί η δοκιμασία, με σκοπό την ηρεμία και την εξοικείωση τους με το χώρο. Η δοκιμασία πραγματοποιείται σε δωμάτιο με χαμηλό φωτισμό και απόλυτη ησυχία. Για την έναρξη της δοκιμασίας κάθε πειραματόζωο τοποθετείται στο κέντρο της συσκευής. Η τοποθέτηση του πειραματόζωου στο κέντρο της συσκευής πρέπει να πραγματοποιείται με ιδιαίτερη προσοχή στις κινήσεις και να αποτρέπεται οποιοσδήποτε θόρυβος ώστε να μην αγχωθούν και φοβηθούν τα πειραματόζωα. Ο συνολικός χρόνος παραμονής κάθε πειραματόζωου στη συσκευή είναι 10 min. Στη διάρκεια των 10 min καταγράφεται ο χρόνος παραμονής του πειραματόζωου στην περιφέρεια της συσκευής, δηλαδή ο χρόνος παραμονής του έξω από το κεντρικό τετράγωνο και ο αριθμός των εισόδων στην κεντρική περιοχή της συσκευής. Μετά το πέρας της δοκιμασίας για κάθε πειραματόζωο απαραίτητος είναι ο καθαρισμός της συσκευής με αραιό διάλυμα αιθανόλης ώστε το επόμενο πειραματόζωο, που θα τοποθετηθεί για τη δοκιμασία στη συσκευή, να βρεθεί σε χώρο στείρο από εξωγενείς παράγοντες και να θεωρεί το περιβάλλον ξένο και προς εξερεύνηση. [84]

95 Εικόνα 13: Συσκευή δοκιμασίας ανοιχτού πεδίου Προσδιορισμός της ενεργότατης του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση Η διαδικασία που ακολουθήθηκε για τον προσδιορισμό της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης μπορεί να χωριστεί σε δύο μέρη. Το πρώτο μέρος αποτελεί την προετοιμασία των εγκεφαλικών ιστών ώστε να μπορέσει να πραγματοποιηθεί το δεύτερο μέρος που είναι ή μέθοδος για τον προσδιορισμό της ενεργότητας του ενζύμου. 1. Προετοιμασία εγκεφαλικών ιστών Μετά την επιλογή των εγκεφαλικών περιοχών όπου θα γίνει ο προσδιορισμός της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης ακολουθεί η έναρξη της προετοιμασίας των δειγμάτων των εγκεφαλικών ιστών. Τα δείγματα των εγκεφαλικών περιοχών, παρεγκεφαλίδα, φλοιός, ιππόκαμπος και ραβδωτό αρχικά αποψύχονται, καθώς είχαν αποθηκευτεί σε βαθιά κατάψυξη (-80οC) και ζυγίζεται το βάρος τους ώστε να υπολογιστούν σωστά οι αραιώσεις τους. Οι αραιώσεις που χρειάζονται για την ομογενοποίηση κάθε ιστού είναι 1,25% w/v για την παρεγκεφαλίδα, 10% w/v για το φλοιό, 1,25% w/v για τον ιππόκαμπο και 1,25% w/v για το ραβδωτό. Στη συνέχεια ακολουθεί η διαδικασία της ομογενοποίησης που πραγματοποιείται σε ομογενοποιητή τύπου glass-teflon με παγωμένο ρυθμιστικό [85]

96 διάλυμα Na 2 HPO 4 συγκέντρωσης 30mM και 7.6pH. Η φυγοκέντρηση των ομογενοποιημάτων γίνεται σε ψυχόμενη φυγόκεντρο με ταχύτητα rpm (ή g) για 20 λεπτά σε θερμοκρασία 4 C. Μετά τη φυγοκέντρηση ακολουθεί η συλλογή του υπερκειμένου, το οποίο αποτελεί το διαλυτό σε άλας κλάσμα ή κλάσμα SS (Salt - Soluble Fraction) (Das et al. 2005; Das et al. 2001). Στο κλάσμα SS μεταξύ άλλων περιέχεται η G1 ισομορφή της ακετυλοχολινεστεράσης, που φυσιολογικά βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα. Το ίζημα επαναδιαλύεται σε διάλυμα που περιείχε Na 2 HPO 4 και 1% Triton X-100 συγκέντρωσης 30mM και 7.6pH. Ακολουθεί εκ νέου φυγοκέντρηση των δειγμάτων στις ίδιες συνθήκες ταχύτητας, θερμοκρασίας και χρόνου (12.500rpm, 4 C, 20min) με τη πρώτη φυγοκέντρηση. Τέλος μετά το πέρας της δεύτερης φυγοκέντρησης συλλέγεται πάλι το υπερκείμενο το οποίο αποτελεί το διαλυτό σε απορρυπαντικό κλάσμα ή κλάσμα DS (Detergent- Soluble Fraction) (Das et al. 2005; Das et al. 2001). Το κλάσμα DS μεταξύ άλλων περιέχει τη G4 ισομορφή της ακετυλοχολινεστεράσης, που ήταν συνδεδεμένη στη μεμβράνη. 2. Προσδιορισμός της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης Η ακετυλοχολινεστεράση, όπως έχει ήδη αναφερθεί, είναι το ένζυμο υδρολύει την ακετυλοχολίνη σε χολίνη και ακέτυλο- συνένζυμο Α. Η ακετυλοχολινεστεράση απαντάται στον εγκέφαλο κυρίως σε δύο ισομορφές τη μονομερή G1 και την τετραμερή G4. Η ενεργότητα των δύο ισομορφών προσδιορίστηκε στο κλάσμα SS όπου και κυριαρχεί η G1 ισομορφή και στο κλάσμα DS όπου και κυριαρχεί. η G4 ισομορφή. Πιο συγκεκριμένα η ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας χρωματομετρική μέθοδο του Ellman (Ellman et al. 1961) στην οποία, όπως έχει δειχθεί από άλλους ερευνητές (Lassiter et al. 1998) [33] αλλά και από την ομάδα μας [34], ο όρος ακετυλοχολινεστεράση στην πραγματικότητα αναφέρεται στην συνολική δραστηριότητα χολινεστεράσης (ChE), δεδομένου ότι δεν xρησιμοποιήθηκαν ειδικοί αναστολείς για βουτυρυλοχολινεστεράσης (BuChE). Ωστόσο, ωστόσο η βουτυρυλοχολινεστεράση κατέχει μόνο ένα μικρό κλάσμα της συνολικής δραστηριότητας της χολίνης [34]. Επίσης όλοι προσδιορισμοί διεξήχθησαν τρεις φορές και εις τριπλούν και η ενεργότητα της ακετυλοχολινεστρεράσης εκφράστηκε ως μmol / min / g ιστού. [86]

97 Η αρχή της μεθόδου του Ellman βασίζεται στην υδρόλυση της ακετυλοθειοχολίνης (acetylthiocholine iodide, ATCI) από την ακετυλοχολινεστεράση που έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή θειοχολίνης και οξικού οξέος. Η θειοχολίνη που παράγεται αντιδρά με τη χρωστική 5,5 - διθειο-2-νιτροβενζοϊκό ιόν (dithiobisnitrobenzoic acid, DTNB) και να παράγει το 5-θειο-2-νιτρο-βενζοϊκό οξύ (TNB), προϊόν κίτρινου χρώματος. Η ένταση του χρώματος του προϊόντος μετράται σε φασματοφωτόμετρο σε μήκος κύματος 405 nm, και είναι ανάλογη προς τη δραστικότητα του ενζύμου (Saleem Ali-Shtayeh et al. 2014). Εικόνα 14: Ο χημικός μηχανισμός της χρωματομετρικής μεθόδου του Ellman (Saleem Ali-Shtayeh et al. 2014) Πιο συγκεκριμένα, σε μικροπλάκες ELISA 96 κελιών προστίθεται σε κάθε κελί συνολική ποσότητα διαλυμάτων 200μL. Η ποσότητα αυτή των 175μL αποτελείται από: 1) 75μL Tris-HCl συγκέντρωσης 50mM με 8.0pH που περιέχει 0,1% BSA, [87]

98 2) 25μL 25μL ΑTCI συγκέντρωσης 15mM 3) 75μL DTNB συγκέντρωσης 3Mm και 4) 25μL δείγματος από τα SS ή DS κλάσματα των υπό μελέτη εγκεφαλικών περιοχών. Οι συγκέντρωσης των δειγμάτων για την πραγματοποίηση της μεθόδου πρέπει να είναι 12,5mg/mL για όλους τις εγκεφαλικές περιοχές εκτός από το ραβδωτό που πρεπει να είναι 6,25mg/mL, καθώς στο ραβδωτό το χολινεργικό σύστημα είναι πιο ανεπτυγμένο. Μετά από 5 λεπτά επώαση σε θερμοκρασία δωματίου ακλουθεί η μέτρηση της απορρόφησης στα 405nm, σε φωτόμετρο ELISA (της εταιρίας Molecular Devices). Πριν την προσθήκη των δειγμάτων, δηλαδή του ενζύμου πραγματοποιείται μια πρώτη μέτρηση απορρόφησης η οποία αφαιρείται από την τελική απορρόφηση. Η αφαίρεση αυτή πραγματοποιείται για την διόρθωση τυχόν αύξησης της απορρόφησης λόγω τυχαίας υδρόλυσης του υποστρώματος πριν την προσθήκη των δειγμάτων. Για κάθε δείγμα χρησιμοποιήούνται 3 κελιά (τριπλέτα κελιών) για τον καλύτερο προσδιοριμό της απορρόφησης. Η απορρόφηση, όπως αναφέρθηκε, είναι ανάλογη προς τη ενεργότητα του ενζύμου (Saleem Ali-Shtayeh et al. 2014) η οποία εκφράζεται ως μmol/min/g ιστού. Εικόνα 15: Η μικροπλάκα ELISA με το χρώμα που σχηματίζεται κατά την χρωματομετρική μέθοδο Ellman. Πηγή: Weinersmith [88]

99 Στατιστική ανάλυση Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το στατιστικό πακέτο SPSS (Statistical Package for Social Science, 20.0). Χρησιμοποιήθηκαν μέθοδοι περιγραφικής στατιστικής (μέσοι όροι και τυπικές αποκλίσεις) για την περιγραφή των εξεταζόμενων μεταβλητών ανάλογα με το φύλο, την ηλικία, την πειραματική ομάδα κτλ. Για τη διερεύνηση των διαφορών μεταξύ των ομάδων που προέκυψαν και τον έλεγχο των υποθέσεων της έρευνας, χρησιμοποιήθηκαν μέθοδοι επαγωγικής στατιστικής πολλαπλής ανάλυσης διακύμανσης (MANOVA) για τον έλεγχο των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των μεταβλητών και στη συνέχεια απλές αναλύσεις διακύμανσης (ANOVA) για τον έλεγχο των κυρίων επιδράσεων. Όταν υπήρχαν περισσότερες των δύο συγκριμένων ομάδων και είχαν παρατηρηθεί στατιστικά σημαντικές διαφορές στους στατιστικούς ελέγχους, ακολούθησαν post-hoc αναλύσεις κατά Tukey. Ο έλεγχος πιθανών συσχετίσεων πραγματοποιήθηκε με τον δείκτη r Pearson. Το επίπεδο σημαντικότητας τέθηκε εξ αρχής στο p<0.05 [89]

100 8. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Α ΜΕΡΟΣ Μελέτη της επίδρασης της ηλικίας και του φύλου στη συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος, στην κινητικότητα και της ενεργότατης της ακετυλοχολινεστεράσης σε επιλεγμένες εγκεφαλικές περιοχές α) Επίδραση της ηλικίας και του φύλου στη συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος Για τη μελέτη της συμπεριφορικής κατάστασης άγχος/φόβος με την πάροδο της ηλικίας σε θηλυκούς και αρσενικούς μυς χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία ανοιχτού πεδίου. Οι ηλικιακές ομάδες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: 1) ημερών, 2) ημερών, 3) νεαρά (30 ημερών), 4) ενήλικα (3-4μηνών), 5) ενήλικα (5-6 μηνών), 6) μεσήλικα (9-10μηνών), 7) γηραιά (12-13μηνών) και 8) γηραιά (15-16μηνών). Η δοκιμασία ανοιχτού πεδίου (Δοκιμασία Θιγμοτακτισμού) μελετά μέσω της εξερευνητικής ικανότητας των πειραματόζωων τη συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος, η οποία έχει ως αποτέλεσμα τα πειραματόζωα να παραμένουν κοντά στις κάθετες επιφάνειες της συσκευής του ανοιχτού πεδίου (στην περιφέρεια της συσκευής). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσοι όροι του χρόνου παραμονής κοντά στα τοιχώματα της συσκευής (χρόνος θιγμοτακτισμού) στο συνολικό χρόνο των 10 λεπτών. Χρόνος Θιγμοτακτισμού Ηλικία ημερών ημερών Νεαρά 30 ημερών Ενήλικα 3-4 μηνών Ενήλικα 5-6 μηνών Μεσήλικα 9-10 μηνών Γηραιά μηνών Γηραιά μηνών Θηλυκά Αρσενικά 565,77 ± 5,02 533,56 ± 6,12 ( 5,7%) 564,36 ± 3,64 512,33 ± 6,91 ( 9,2%) 562,00 ± 7,05 499,78 ± 11,45 ( 11,1%) ** 493,5 ± 6,58 446,33 ± 10,78 ( 9,6%) [90] 488,00 ± 6,82 444,75 ± 12,25 ( 8,9%) 467,71 ± 5,20 402,75 ± 9,57 ( 13,9%) 563,60 ± 9,90 519,80 ± 10,01 ( 7,7%) * 529,67 ± 9,01 492,33 ± 2,66 ( 7,0%) * ** * * Πίνακας 1: Επίδραση της ηλικίας στη συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος Οι τιμές για το χρόνο θιγμοτακτισμού αντιστοιχούν στη Μέση Τιμή ± Τυπικό Σφάλμα (SE) από 7 πειραματόζωα. Το ποσοστό στην παρένθεση () εκφράζει την % αλλαγή του χρόνου μεταξύ των θηλυκών και των αρσενικών μυών. Η μείωση του χρόνου θιγμοτακτισμού είναι στατιστικώς σημαντική (*) με p<0,05, (**) με p<0,01και () με p<0,001.

101 600 Θηλυκά Χρόνος Θιγμοτακτισμού (sec) ** ** * * * Αρσενικά * ,5 2 1,5 1 0, ημερών ημερών ημερών ημερών Νεαρά 30 ημερών Νεαρά 30 ημερών Ενήλικα Ενήλικα 3-4 μηνών 5-6 μηνών Ενήλικα Ενήλικα 3-4 μηνών 5-6 μηνών Μεσήλικα 9-10 μηνών Γηραιά μηνών Γηραιά μηνών Διάγραμμα 1: Μελέτη αγχώδους συμπεριφοράς με την εξέλιξη της ηλικίας. Οι τιμές αντιστοιχούν στους μέσους όρους ± SE από 8 μύες/ομάδα. Η στατιστικώς σημαντική αλλαγή του χρόνου θιγμοτακτισμού μεταξύ των θηλυκών και των αρσενικών μυών συμβολίζεται με (*) για p<0,05, (**) για p<0,01και με () για p<0,001. Μ.Τ. χρόνου θηλυκών/ Μ.Τ. χρόνου αρενικών Μεσήλικα 9-10 μηνών Γηραιά μηνών Γηραιά μηνών Διάγραμμα 2: Ο λόγος της μέσης τιμής (Μ.Τ.) του χρόνου θιγμοτακτισμού των θηλυκών και των αρσενικών μυών Οι αναλύσεις ANOVA έδειξαν ότι πειραματόζωά διαφορετικού φύλου διέφεραν στον χρόνο θιγμοτακτισμού στατιστικώς σημαντικά σε όλες τις ηλικιακές ομάδες, με τα θηλυκά να έχουν μεγαλύτερο μέσο όρο. Δηλαδή στους θηλυκούς μυς καταγράφηκε αυξημένος ο δείκτης άγχος/φόβος σε σύγκριση με τους αρσενικούς σε όλες τις ηλικιακές ομάδες. Αναλύοντας το λόγο των μέσων τιμών του χρόνου θιγμοτακτισμού των θηλυκών και των αρσενικών μυών με το πέρας της ηλικίας, παρατηρείται ότι η διαφορά της μεταβολή των λόγων δεν είναι στατιστικά σημαντική. Δηλαδή ο συμπεριφορικός δείκτης έχει ίδιες [91]

102 ποσοστιαίες αλλαγές στα δύο φύλα σε κάθε ηλικιακή ομάδα κάτι που υποδεικνύει ότι οι μεταβολές που παρατηρούνται στο χρόνο θιγμοτακτισμού μεταξύ των ηλικιακών ομάδων είναι ανεξάρτητες του φυλετικού παράγοντα. Επίσης από τα παραπάνω αποτελέσματα παρατηρείται μια κλιμακούμενη μείωση του συμπεριφορικού δείκτη άγχος/φόβος στις 6 πρώτες ηλικιακές ομάδες τόσο στους θηλυκούς όσο και στους αρσενικούς μυς, ενώ στους γηραιούς μυς παρατηρήθηκε αύξηση του δείκτη. Ηλικία ημερών ημερών Νεαρά 30 ημερών Ενήλικα 3-4 μηνών Ενήλικα 5-6 μηνών Μεσήλικα 9-10 μηνών Γηραιά μηνών Γηραιά μηνών ημερών ημερών Νεαρά 30 ημερών Ενήλικα 3-4 μηνών Ενήλικα 5-6 μηνών Μεσήλικα 9-10 μηνών Γηραιά μηνών - 1,58% 3,75% 14,12% - 2,20% 12,73% - 10,77% 14,82% 13,45% 11,50% 21,21% 19,94% 18,14% - 0,82% 8,26% - 7,51% 1,45% 0,14% 2,34% 7,63% 13,56% - 20,05% 7,04% 5,54% 3,41% 7,62% 8,37% 15,25% - 5,67% Πίνακας 2: Το ποσοστό % αλλαγής χρόνου θιγμοτακτισμού μεταξύ των ηλιακών ομάδων ανεξάρτητα του φυλετικού παράγοντα. Η στατιστικώς σημαντική αλλαγή του χρόνου θιγμοτακτισμού συμβολίζεται με () για p<0,001. Πιο συγκεκριμένα τα πειραματόζωα διαφορετικής ηλικίας διέφεραν στον χρόνο θιγμοτακτισμού. Οι post-hoc αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν στον χρόνο θιγμοτακτισμού εντόπισαν τις ακόλουθες στατιστικά σημαντικές διαφορές ανεξάρτητα του φύλου: 1. Η ηλικιακή ομάδα ημερών είχε στατιστικά σημαντικές διαφορές με τις ηλικιακές ομάδες: ενήλικα 3-4 μηνών (p<0.001), ενήλικα 5-6 μηνών (p<0.001), μεσήλικα 9-10 μηνών (p<0.001). [92]

103 2. Η ηλικιακή ομάδα νεαρά ημερών είχε στατιστικά σημαντικές διαφορές με τις ηλικιακές ομάδες: ενήλικα 3-4 μηνών (p<0.001), ενήλικα 5-6 μηνών (p<0.001), μεσήλικα 9-10 μηνών (p<0.001). 3. Η ηλικιακή ομάδα νεαρά 30 ημερών είχε στατιστικά σημαντικές διαφορές με τις ηλικιακές ομάδες: ενήλικα 3-4 μηνών (p<0.001), ενήλικα 5-6 μηνών (p<0.001), μεσήλικα 9-10 μηνών (p<0.001). 4. Η ηλικιακή ομάδα ενήλικα 3-4 μηνών είχε στατιστικά σημαντικές διαφορές με: τις προηγούμενες ηλικιακές ομάδες και επιπλέον με τα μεσήλικα 9-10 μηνών, τα γηραιά μηνών (p<0.001) και τα γηραιά μηνών (p<0.001). 5. Η ηλικιακή ομάδα ενήλικα 5-6 μηνών είχε στατιστικά σημαντικές διαφορές με: τις προηγούμενες ηλικιακές ομάδες, εκτός από τα ενήλικα 3-4 μηνών και επιπλέον με τα μεσήλικα 9-10 μηνών, τα γηραιά μηνών (p<0.001) και τα γηραιά μηνών (p<0.001). 6. Η ηλικιακή ομάδα μεσήλικα 9-10 μηνών είχε στατιστικά σημαντικές διαφορές με: τις προηγούμενες ηλικιακές ομάδες και επιπλέον γηραιά μηνών (p<0.001) και γηραιά μηνών (p<0.001). 7. Η ηλικιακή ομάδα γηραιά μηνών είχε στατιστικά σημαντικές διαφορές με τις ηλικιακές ομάδες: ενήλικα 3-4 μηνών(p<0.001), ενήλικα 5-6 μηνών (p<0.001) και μεσήλικα 9-10 μηνών (p<0.001). 8. Η ηλικιακή ομάδα γηραιά μηνών είχε στατιστικά σημαντικές διαφορές με τις ηλικιακές ομάδες: ενήλικα 3-4 μηνών(p<0.001), ενήλικα 5-6 μηνών (p<0.001) και μεσήλικα 9-10 μηνών (p<0.001). [93]

104 β) Επίδραση της ηλικίας και του φύλου στην κινητικότητα Με τη δοκιμασία του ανοιχτού πεδίου μελετήθηκε και η κινητικότητα των πειραματόζωων με την καταμέτρηση του αριθμού των εισόδων στην κεντρική περιοχή της συσκευής Είσοδοι στο κεντρική περιοχή της συσκευής Ηλικία ημερών ημερών Νεαρά 30 ημερών Ενήλικα 3-4 μηνών Ενήλικα 5-6 μηνών Μεσήλικα 9-10 μηνών Γηραιά μηνών Γηραιά μηνών Θηλυκά 6,25 ± 0,44 15,11 ± 0,58 18,43 ± 1,14 26,43 ± 0,55 26,67 ± 1,35 32,50 ± 1,24 16,60 ± 0,78 24,00 ± 0,46 Αρσενικά 4,29 ± 0,59 ( 34,8%) * 11,57 ± 0,50 ( 23,4%) ** 13,67 ± 0,65 ( 25,8%) * 23,86 ± 0,61 ( 9,7%) * 21,13 ± 1,50 ( 20,8%) * 27,57 ± 1,13 ( 15,2%) * 12,00 ± 0,20 ( 27,7%) * 20,40 ± 0,72 ( 15,0%) * Πίνακας 3 : Επίδραση της ηλικίας στην κινητικότητα των πειραματόζωων. Οι τιμές για τον αριθμό των εισόδων στην κεντρική περιοχή αντιστοιχούν στη Μέση Τιμή ± Τυπικό Σφάλμα (SE) από 8 πειραματόζωα. Το ποσοστό στην παρένθεση () εκφράζει την % αλλαγή του αριθμού των εισόδων μεταξύ των θηλυκών και των αρσενικών μυών. Η μείωση του αριθμού είναι στατιστικώς σημαντική (*) με p<0,05 και (**) με p<0,01. Αριθμός εισόδων στην κεντρική περιοχή * ** * * * * * Θηλυκά Αρσενικά * ημερών ημερών Νεαρά 30 ημερών Ενήλικα Ενήλικα 3-4 μηνών 5-6 μηνών Μεσήλικα 9-10 μηνών Γηραιά μηνών Γηραιά μηνών Διάγραμμα 3: Μελέτη της κινητικότητας των πειραματόζωων με την εξέλιξη της ηλικίας. Οι τιμές για τον αριθμό των εισόδων στην κεντρική περιοχή αντιστοιχούν στη Μέση Τιμή ± Τυπικό Σφάλμα (SE) από 8 πειραματόζωα. Το ποσοστό στην παρένθεση () εκφράζει την % αλλαγή του αριθμού των εισόδων μεταξύ των θηλυκών και των αρσενικών μυών. Η μείωση του αριθμού είναι στατιστικώς σημαντική (*) με p<0,05 και (**) με p<0,01. [94]

105 3 2,5 M.T. εισόδων θηλυκών/μ.τ. εισόδων αρσενικών 2 1,5 1 0, ημερών ημερών Νεαρά 30 ημερών Ενήλικα Ενήλικα 3-4 μηνών 5-6 μηνών Μεσήλικα 9-10 μηνών Γηραιά μηνών Γηραιά μηνών Διάγραμμα 4: Ο λόγος της μέσης τιμής (Μ.Τ.) του αριθμού των εισόδων στην κεντρική περιοχή της συσκευής των θηλυκών και των αρσενικών μυών. Οι αναλύσεις ANOVA έδειξαν ότι πειραματόζωά διαφορετικού φύλου διέφεραν στον αριθμό των εισόδων στατιστικώς σημαντικά σε όλες τις ηλικιακές ομάδες, με τα θηλυκά να έχουν μεγαλύτερο μέσο όρο. Δηλαδή στους θηλυκούς μυς καταγράφηκε αυξημένη κινητικότητα σε σύγκριση με τους αρσενικούς σε όλες τις ηλικιακές ομάδες. Αναλύοντας το λόγο των μέσων τιμών του αριθμού των εισόδων στην κεντρική περιοχή των θηλυκών και των αρσενικών μυών με το πέρας της ηλικίας, παρατηρείται ότι η διαφορά της μεταβολή των λόγων δεν είναι στατιστικά σημαντική. Δηλαδή η κινητικότητα έχει ίδιες ποσοστιαίες αλλαγές στα δύο φύλα σε κάθε ηλικιακή ομάδα κάτι που υποδεικνύει ότι οι μεταβολές που παρατηρούνται στην κινητικότητα μεταξύ των ηλικιακών ομάδων είναι ανεξάρτητες του φυλετικού παράγοντα. Ακόμα από τα παραπάνω αποτελέσματα παρατηρείται μια κλιμακούμενη αύξηση της κινητικότητας στις 6 πρώτες ηλικιακές ομάδες, δηλαδή μέχρι και την ηλικιακή ομάδα μεσήλικα 9-10 μηνών, τόσο στους θηλυκούς όσο και στους αρσενικούς μυς, ενώ στους γηραιούς μυς παρατηρήθηκε μείωση αυτής. [95]

106 Ηλικία ημερών ημερών Νεαρά 30 ημερών Ενήλικα 3-4 μηνών Ενήλικα 5-6 μηνών Μεσήλικα 9-10 μηνών Γηραιά μηνών Γηραιά μηνών ημερών - 60,69% 66,16% 78,68 77,32% 82,15% 62,73% 75,99% ημερών - 13,90% 45,76% 42,30% 54,59% 5,17% 38,92% Νεαρά 30 ημερών - 37,00% 32,98% 47,25% 9,21% 29,05% Ενήλικα 3-4 μηνών - 6,00% 16,28% 42,80% 11,20% * Ενήλικα 5-6 μηνών - 21,30% 39,15% 5,53% Μεσήλικα 9-10 μηνών - 52,11% 25,65% Γηραιά μηνών - 35,59% Πίνακας 4: Το ποσοστό % αλλαγής του αριθμού των εισόδων στην κεντρική περιοχή της συσκευής μεταξύ των ηλιακών ομάδων ανεξάρτητα του φυλετικού παράγοντα. Η στατιστικώς σημαντική αλλαγή του αριθμού των εισόδων συμβολίζεται με (*) για p<0,05 και () για p<0,001. Πιο συγκεκριμένα τα πειραματόζωα διαφορετικής ηλικίας διέφεραν μεταξύ τους στον αριθμό των εισόδων στην κεντρική περιοχή της συσκευής (p=<0,001). Οι post-hoc αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν στον αριθμό των εισόδων εντόπισαν τις ακόλουθες στατιστικά σημαντικές διαφορές ανεξάρτητα του φύλου: 1. Η ηλικιακή ομάδα ημερών είχε στατιστικά σημαντικές διαφορές με όλες τις ηλικιακές ομάδες (p<0.001). 2. Η ηλικιακή ομάδα νεαρά ημερών είχε στατιστικά σημαντικές διαφορές με τις ηλικιακές ομάδες: ενήλικα 3-4 μηνών (p<0.001), ενήλικα 5-6 μηνών (p<0.001), μεσήλικα 9-10 μηνών (p<0.001) και γηραιά μηνών (0,001). 3. Η ηλικιακή ομάδα νεαρά 30 ημερών είχε στατιστικά σημαντικές διαφορές με όλες τις ηλικιακές ομάδες (p<0.001) εκτός από την ηλικιακή ομάδα ημερών και τα γηραιά μηνών [96]

107 4. Η ηλικιακή ομάδα ενήλικα 3-4 μηνών είχε στατιστικά σημαντικές διαφορές με: τις προηγούμενες ηλικιακές ομάδες και επιπλέον με τα μεσήλικα 9-10 μηνών, τα γηραιά μηνών (p<0.001) και τα γηραιά μηνών (p<0.05). 5. Η ηλικιακή ομάδα ενήλικα 5-6 μηνών είχε στατιστικά σημαντικές διαφορές με: τις προηγούμενες ηλικιακές ομάδες, εκτός από τα ενήλικα 3-4 μηνών και επιπλέον με τα μεσήλικα 9-10 μηνών, και τα γηραιά μηνών (p<0.001). 6. Η ηλικιακή ομάδα μεσήλικα 9-10 μηνών είχε στατιστικά σημαντικές διαφορές όλες τις ηλικιακές ομάδες (p<0.001). 7. Η ηλικιακή ομάδα γηραιά μηνών είχε στατιστικά σημαντικές διαφορές με τις ηλικιακές ομάδες (p<0.001), εκτός από τις ηλικιακές ομάδες νεαρά ημερών και νεαρά 30 ημερών. 8. Η ηλικιακή ομάδα γηραιά μηνών είχε στατιστικά σημαντικές διαφορές με όλες τις ηλικιακές ομάδες (p<0.001) εκτός από την ηλικιακή ομάδα, ενήλικα 5-6 μηνών. Συμπερασματικά αναλύοντας συγκεντρωτικά τα αποτελέσματα της δοκιμασίας ανοιχτού πεδίου, τόσο για το χρόνο θιγμοτακτισμού όσο και για τον αριθμό εισόδων στην κεντρική περιοχή, να ακολουθείται ένα συγκεκριμένο μοτίβο τόσο στους θηλυκούς μυς όσο και στους αρσενικούς, στις πρώτες 6 ηλικιακές ομάδες μέχρι και την ηλικία των 9-10 μηνών. Το μοτίβο αυτό δείχνει να ακολουθείται σε αυτές τις ηλικίες μια κλιμακούμενη αλλαγή τόσο στον χρόνο θιγμοτακτισμού όσο και στον αριθμό των εισόδων, δηλαδή στη συμπεριφορά, με μείωση του χρόνου θιγμοτακτισμού (μείωση του άγχους) και αύξηση της κινητικότητας. Στις 2 τελευταίες ηλικίες (γηραιά μηνών και γηραιά μηνών) η κλιμακούμενη αυτή αλλαγή στη συμπεριφορά παρουσιάζεται να μεταβάλλεται και να μην ακολουθεί αυτό το μοτίβο που παρουσιάζεται στις προηγούμενες ηλικιακές ομάδες. Πιο συγκεκριμένα ενώ στις 6 πρώτες ηλικιακές ομάδες και στα δύο φύλα παρατηρήθηκε μείωση της αγχώδους συμπεριφοράς, στις γηραιές ηλικιακές ομάδες παρουσιάστηκε αύξηση της αγχώδους συμπεριφοράς και στα δύο φύλα. Το ίδιο παρατηρήθηκε και με την κινητικότητα, με κλιμακούμενη αύξηση αυτής στις 6 πρώτες ηλικιακές ομάδες και μείωση της κινητικότητας στις γηραιές ομάδες. [97]

108 γ) Επίδραση της ηλικίας στη ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης Ακολουθεί η μελέτη της επίδρασης της ηλικίας στην ενεργότητα του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση σε επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές σε θηλυκούς και αρσενικούς μυς. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα, παρατηρώντας δηλαδή αυτή την αλλαγή στη συμπεριφορά στους γηραιούς μυς, επιλέχτηκαν για την μελέτη αυτή, οι ηλικιακές ομάδες ενήλικα 3-4 μηνών και γηραιά μηνών και των δύο φύλων. Η ακετυλοχολινεστεράση είναι το ένζυμο τα οποίο διασπά το νευροδιαβιβαστή ακετυλοχολίνη σε χολίνη και οξικό οξύ. Πιο συγκεκριμένα πραγματοποιήθηκε η μελέτη της ενεργότητας των δύο ισομορφών (G1 και G4) της AChE με τη χρήση της χρωματομετρικής μεθόδου του Ellman στις εγκεφαλικές περιοχές παρεγκεφαλίδα, εγκεφαλικός φλοιός, ιππόκαμπος και ραβδωτό. Η G1 ισομορφή (κυτταροπλασματική) συναντάται στο κλάσμα του ομογενοποιήματος της AChE που είναι διαλυτό σε άλας (SS) και η G4 ισομορφή (μεμβρανική) συναντάται στο κλάσμα που είναι διαλυτό σε απορρυπαντικό (DS). Τα αποτελέσματα της ηλικίας στην ενεργότητα των ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης παρουσιάζονται στους παρακάτω πίνακες και διαγράμματα ξεχωριστά για κάθε κλάσμα και φύλλο. 1. Επίδραση της ηλικίας στη ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης στους θηλυκούς μυς Ενεργότητα ακετυλοχολινεστεράσης (μmol/gr ιστού) / Θηλυκοί μύες Εγκεφαλικός Παρεγκεφαλίδα Ιππόκαμπος φλοιός Ραβδωτό Κλάσμα SS DS SS DS SS DS SS DS Ενήλικα 3-4 μηνών Γηραιά μηνών 12,22 ±0,60 9,47 ±0,27 ( 22,45%) * 19,12 ±0,47 12,13 ±0,10 ( 36,57%) 23,64 ±1,13 5,76 ±0,69 ( 75,62%) * 131,59 ±2,99 117,04 ±2,49 12,62 ±0,82 8,51 ±0,43 ( 32,56%) * 53,11 ±6,43 21,31 ±2,93 ( 59,88%) 30,31 ±3,28 15,48 ±2,01 ( 48,93%) 136,59 ±1,56 56,01 ±1,81 ( 58,99%) Πίνακας 5: Επίδραση της ηλικίας στην ενεργότητα του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση του SS και DS κλάσματος στις επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές ενήλικων και γηραιών θηλυκών μυών. Οι τιμές της ενεργότητας αντιστοιχούν στη Μέση Τιμή ± Τυπικό Σφάλμα (SE) από 6 πειραματόζωα. Το ποσοστό στην παρένθεση () εκφράζει την % αλλαγή ως προς τους ενήλικες μυς. Η μείωση της ενεργότητας είναι στατιστικώς σημαντική (*) με p<0,05 και () με p<0,001. [98]

109 Ενεργότητα ακετυλοχολινεστεράσης στο SS κλάσμα (μmol/gr ιστού) * Παρεγκεφαλίδα Ενήλικα 3-4 μηνών Εγκεφαλικός φλοιός * Ιππόκαμπος Γηραιά μηνών Ραβδωτό Διάγραμμα 5: Μελέτη της επίδρασης της ηλικίας στην ενεργότητα του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση του SS κλάσματος στις επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές ενήλικων και γηραιών θηλυκών μυών. Οι τιμές αντιστοιχούν στους μέσους όρους ± SE από 6 μύες/ομάδα. Η στατιστικώς σημαντική αλλαγή ενεργότητας μεταξύ των ενήλικων και των γηραιών μυών, συμβολίζεται με (*) για p<0,05 και με () για p<0,001. Ενεργότητα ακετυλοχολινεστεράσης στο DS κλάσμα (μmol/gr ιστού) Παρεγκεφαλίδα Ενήλικα 3-4 μηνών Εγκεφαλικός φλοιός Ιππόκαμπος Γηραιά μηνών Ραβδωτό Διάγραμμα 6: Μελέτη της επίδρασης της ηλικίας στην ενεργότητα του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση του DS κλάσματος στις επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές ενήλικων και γηραιών θηλυκών μυών. Οι τιμές αντιστοιχούν στους μέσους όρους ± SE από 6 μύες/ομάδα. Η στατιστικώς σημαντική αλλαγή ενεργότητας μεταξύ των ενήλικων και των γηραιών μυών, συμβολίζεται με () για p<0,001. Αναλύοντας τα παραπάνω αποτελέσματα της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης προκύπτει ότι το γήρας είχε επίδραση στην ενεργότητα των ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης στους θηλυκούς μυς. Όσον αφορά το SS κλάσμα, [99]

110 όπου κυριαρχεί η G1 ισομορφή της ακετυλοχολινεστεράσης, παρουσιάζεται στατιστικώς σημαντική μείωση της ενεργότητας σε όλες της υπό μελέτη εγκεφαλικές περιοχές στους γηραιούς θηλυκούς μυς μηνών σε σύγκριση με τους θηλυκούς ενήλικους μυς 3-4 μηνών. Πιο συγκεκριμένα στην παρεγκεφαλίδα παρουσιάστηκε μείωση 22,45%, στον εγκεφαλικό φλοιό μείωση 75,62%, στον ιππόκαμπο 32,56% και στο ραβδωτό 48,93%. Παρατηρείται ότι μεγαλύτερη μεταβολή παρουσιάστηκε στον εγκεφαλικό φλοιό και ακολουθεί το ραβδωτό και ο ιππόκαμπος. Εξετάζοντας τα αποτελέσματα στο DS κλάσμα όπου κυριαρχεί η G4 ισομορφή της ακετυλοχολινεστεράσης παρατηρείται και εδώ στατιστικώς σημαντική μείωση σε όλες τις υπό μελέτη εγκεφαλικές περιοχές εκτός από τον εγκεφαλικό φλοιό. Το ποσοστό της μείωσης της ενεργότητας που παρατηρείται στην παρεγκεφαλίδα είναι 36,57%, στον ιππόκαμπο 59,88% και στο ραβδωτό 58,99%. Στην περίπτωση του DS κλάσματος τη μεγαλύτερη μεταβολή είχε ο ιππόκαμπος και ακολουθεί το ραβδωτό με περίπου ίδιο ποσοστό και τελευταία η παρεγκεφαλίδα. Συνοψίζοντας παρατηρείται ότι το γήρας έχει επίδραση στην ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης στους θηλυκούς μυς, τόσο στο SS κλάσμα και τη G1 ισομορφή που κυριαρχεί όσο και στο DS κλάσμα και τη G4 ισομορφή σε όλες τις υπό μελέτη εγκεφαλικές περιοχές εκτός από το εγκεφαλικό φλοιό στο DS κλάσμα. 2. Επίδραση της ηλικίας στη ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης στους αρσενικούς μυς Ενεργότητα ακετυλοχολινεστεράσης (μmol/gr ιστού) / Αρσενικοί μύες Εγκεφαλικός Παρεγκεφαλίδα Ιππόκαμπος φλοιός Ραβδωτό Κλάσμα SS DS SS DS SS DS SS DS Ενήλικα 3-4 μηνών 11,84 ±0,56 18,22 ±0,77 20,32 ±0,38 90,17 ±7,08 15,17 ±1,45 54,92 ±5,59 20,99 ±1,48 157,20 ±14,67 Γηραιά μηνών 10,18 ±0,51 ( 14,01%) 4,15 ±0,15 ( 77,24%) 17,37 ±0,91 58,76 ±1,18 ( 34,83%) * 11,07 ±1,32 ( 26,99%) 9,20 ±0,42 ( 83,24%) 11,44 ±0,51 ( 45,48%) ** 49,52 ±1,00 ( 68,50%) Πίνακας 6: Επίδραση της ηλικίας στην ενεργότητα του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση στο SS και DS κλάσμα στις επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές ενήλικων και γηραιών αρσενικών μυών. Οι τιμές της ενεργότητας αντιστοιχούν στη Μέση Τιμή ± Τυπικό Σφάλμα (SE) από 6 πειραματόζωα. Το ποσοστό στην παρένθεση () εκφράζει την % αλλαγή ως προς τους ενήλικες μυς. Η μείωση της ενεργότητας είναι στατιστικώς σημαντική (*) με p<0,05, (**) με p<0,01 και () με p<0,001. [100]

111 Ενεργότητα ακετυλοχολινεστεράσης στο SS κλάσμα (μmol/gr ιστού) Παρεγκεφαλίδα Εγκεφαλικός φλοιός Ενήλικα 3-4 μηνών Ιππόκαμπος Γηραιά μηνών ** Ραβδωτό Διάγραμμα 7: Μελέτη της επίδρασης της ηλικίας στην ενεργότητα του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση του SS κλάσματος στις επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές ενήλικων και γηραιών αρσενικών μυών. Οι τιμές αντιστοιχούν στους μέσους όρους ± SE από 6 μύες/ομάδα. Η στατιστικώς σημαντική αλλαγή ενεργότητας μεταξύ των ενήλικων και των γηραιών μυών, συμβολίζεται με (**) για p<0,01 και με () για p<0,001. Ενεργότητα ακετυλοχολινεστεράσης στο DS κλάσμα (μmol/gr ιστού) Παρεγκεφαλίδα * Εγκεφαλικός φλοιός Ενήλικα 3-4 μηνών Ιππόκαμπος Γηραιά μηνών Ραβδωτό Διάγραμμα 8: Μελέτη της επίδρασης της ηλικίας στην ενεργότητα του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση του DS κλάσματος στις επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές ενήλικων και γηραιών αρσενικών μυών. Οι τιμές αντιστοιχούν στους μέσους όρους ± SE από 6 μύες/ομάδα. Η στατιστικώς σημαντική αλλαγή ενεργότητας μεταξύ των ενήλικων και των γηραιών μυών, συμβολίζεται με (*) για p<0,05 και με () για p<0,001. Από τα αποτελέσματα της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης που παρουσιάστηκαν παραπάνω προκύπτει ότι το γήρας είχε επίδραση στην ενεργότητα των [101]

112 ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης και στους αρσενικούς μυς. Όσον αφορά το SS κλάσμα, που περιέχει κυρίως την G1 ισομορφή της ακετυλοχολινεστεράσης, παρουσιάζεται στατιστικώς σημαντική μείωση της ενεργότητας σε όλες της υπό μελέτη εγκεφαλικές περιοχές στους γηραιούς αρσενικούς μυς μηνών σε σύγκριση με τους θηλυκούς ενήλικους μυς 3-4 μηνών εκτός από τον εγκεφαλικό φλοιό. Πιο συγκεκριμένα στην παρεγκεφαλίδα παρουσιάστηκε μείωση 14,01%, στον ιππόκαμπο μείωση 26,99% και στο ραβδωτό 45,48%. Παρατηρείται ότι μεγαλύτερη μεταβολή παρουσιάστηκε στο ραβδωτό και ακολουθεί ο ιππόκαμπος και η παρεγκεφαλίδα. Εξετάζοντας τα αποτελέσματα στο DS κλάσμα, που περιέχει κυρίως την G4 ισομορφή της ακετυλοχολινεστεράσης, παρατηρείται και εδώ στατιστικώς σημαντική μείωση σε όλες τις υπό μελέτη εγκεφαλικές περιοχές. Το ποσοστό της μείωσης της ενεργότητας που παρατηρείται στην παρεγκεφαλίδα είναι 77,24%, στον εγκεφαλικό φλοιό 34,83%, στον ιππόκαμπο 83,24% και στο ραβδωτό 68,50%. Στην περίπτωση του DS κλάσματος τη μεγαλύτερη μεταβολή είχε ο ιππόκαμπος και ακολουθεί η παρεγκεφαλίδα, το ραβδωτό και τελευταίος ο εγκεφαλικός φλοιός. Συνοψίζοντας παρατηρείται ότι το γήρας έχει επίδραση στην ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης και στους αρσενικούς μυς, τόσο στο SS κλάσμα και τη G1 ισομορφή που κυριαρχεί όσο και στο DS κλάσμα και τη G4 ισομορφή σε όλες τις υπό μελέτη εγκεφαλικές περιοχές εκτός από το εγκεφαλικό φλοιό στο DS κλάσμα. Συμπερασματικά παρατηρείται ότι το γήρας επιφέρει μείωση στην ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης και στα δύο φύλα τόσο στο SS κλάσμα όσο και στο DS κλάσμα με διαφοροποίηση μεταξύ των δύο φίλων μόνο στον εγκεφαλικό φλοιό. Παρατηρήθηκε μείωση στους θηλυκούς μυς μόνο στο SS κλάσμα του εγκεφαλικού φλοιού και στους αρσενικούς μυς μόνο στο DS κλάσμα του εγκεφαλικού φλοιού 3. Επίδραση της ηλικίας στο λόγο SS/DS της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης σε θηλυκούς και αρσενικούς μυς Στον παρακάτω πίνακα παρουσιάζεται η επίδραση της ηλικίας στο λόγο SS/DS της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης. Ο λόγος SS/DS κυρίως αναφέρεται στο λόγο των ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης καθώς, όπως έχει ήδη αναφερθεί παραπάνω, στο SS κλάσμα κυριαρχεί η G1 ισομορφή ενώ στο DS η G4. [102]

113 Λόγος SS/DS της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης Φύλο Ηλικία Παρεγκεφαλίδα Εγκεφαλικός φλοιός Ιππόκαμπος Ενήλικα 0,64 0,18 0, μηνών ±0,09 ±0,03 ±0,07 Θηλυκά 0,05 0,40 Γηραιά 0,78 ±0,01 ±0, μηνών ±0,06 ( 72,59%) ( 68,10%) * Αρσενικά Ενήλικα 3-4 μηνών Γηραιά μηνών 0,65 ±0,10 2,45 ±0,25 ( 277,76%) 0,23 ±0,04 0,30 ±0,05 0,28 ±0,10 1,20 ±0,42 ( 335,66%) Ραβδωτό 0,22 ±0,05 0,28 ±0,09 0,13 ±0,03 0,23 ±0,04 ( 73,05%) * Πίνακας 7: Επίδραση της ηλικίας στο λόγο SS/DS της ενεργότητας του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση στις επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές ενήλικων και γηραιών μυών και των δύο φύλων. Οι τιμές της ενεργότητας αντιστοιχούν στη Μέση Τιμή ± Τυπικό Σφάλμα (SE) από 6 πειραματόζωα. Το ποσοστό στην παρένθεση () εκφράζει την % αλλαγή ως προς τους ενήλικες μυς. Η μείωση της ενεργότητας είναι στατιστικώς σημαντική (*) με p<0,05 και () με p<0,001. 0,9 Λόγος SS/DS της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Παρεγκεφαλίδα Εγκεφαλικός φλοιός Ενήλικα 3-4 μηνών Γηραιά μηνών * Ιππόκαμπος Ραβδωτό Διάγραμμα 9: Μελέτη της επίδρασης της ηλικίας στο λόγο SS/DS της ενεργότητας του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση στις επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές ενήλικων και γηραιών θηλυκών μυών Οι τιμές αντιστοιχούν στους μέσους όρους ± SE από 6 μύες/ομάδα. Η στατιστικώς σημαντική αλλαγή ενεργότητας μεταξύ των ενήλικων και των γηραιών μυών, συμβολίζεται με (*) για p<0,05 και με () για p<0,001. [103]

114 Λόγος SS/DS της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Παρεγκεφαλίδα Εγκεφαλικός φλοιός Ενήλικα 3-4 μηνών Γηραιά μηνών * Ιππόκαμπος Ραβδωτό Διάγραμμα 10: Μελέτη της επίδρασης της ηλικίας στο λόγο SS/DS της ενεργότητας του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση στις επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές ενήλικων και γηραιών αρσενικών μυών. Οι τιμές αντιστοιχούν στους μέσους όρους ± SE από 6 μύες/ομάδα. Η στατιστικώς σημαντική αλλαγή ενεργότητας μεταξύ των ενήλικων και των γηραιών μυών, συμβολίζεται με (*) για p<0,05 και με () για p<0,001. Από την σύγκριση των λόγων SS/DS μεταξύ των ενήλικων μυών 3-4 μηνών και των γηραιών μυών μηνών και των δύο φύλων στις υπό μελέτη εγκεφαλικές περιοχές προκύπτουν διαφορές ανά περιοχή του εγκεφάλου. Πιο συγκεκριμένα στους θηλυκούς μυς παρατηρήθηκαν μεταβολές στο λόγο σε όλες τις εγκεφαλικές περιοχές που μελετήθηκαν με τις διαφορές να είναι στατιστικώς σημαντικές μόνο στον εγκεφαλικό φλοιό και στον ιππόκαμπο αλλά προς άλλη κατεύθυνση. Στον ιππόκαμπο παρουσιάζεται αύξηση του λόγου SS/DS στους γηραιούς θηλυκούς μυς με ποσοστό 68,10%, η οποία είναι και στατιστικώς σημαντική. Όσον αφορά τον εγκεφαλικό φλοιό παρουσιάζεται στατιστικώς σημαντική μείωση του λόγου SS/DS με ποσοστό 72,59%. Στους αρσενικούς μυς παρατηρήθηκαν μεταβολές μεταξύ των δύο ηλικιακών ομάδων στο λόγο SS/DS στην παρεγκεφαλίδα, στον ιππόκαμπο και στο ραβδωτό. Παρατηρήθηκε και στις τρεις εγκεφαλικές περιοχές στατιστικώς σημαντική αύξηση στους γηραιούς αρσενικούς μυς, με το ιππόκαμπο να έχει τη μεγαλύτερη μεταβολή. Η αύξηση στο ιππόκαμπο είναι 335,66% ακολουθεί η παρεγκεφαλίδα με αύξηση 277,76% και τέλος το ραβδωτό με 73,05% αύξηση του λόγου SS/DS. Στον εγκεφαλικό φλοιό δεν [104]

115 παρατηρείται κάποια στατιστικώς σημαντική αλλαγή μόνο μια μικρή τάση για αύξηση. Αξίζει να σημειωθεί ότι παρατηρείται αύξηση του λόγου στον ιππόκαμπο τόσο στους αρσενικούς (335,66%) όσο και στους θηλυκούς (68,10%) μυς με την αύξηση αυτή να είναι κατά τέσσερεις φορές μεγαλύτερη στους αρσενικούς μυς. Φυσιολογικά στον εγκέφαλο των θηλαστικών η ακετυλοχολινεστεράση αντιπροσωπεύεται από δύο κύριες ισομορφές τη G1 και τη G4 με ποικιλία στην αναλογία τους στις διαφορετικές εγκεφαλικές περιοχές (Atack et al. 1986). Η γνώση αυτή τα τελευταία χρόνια έχει γίνει αφορμή για μια σειρά από καινούργιες μελέτες με το ενδιαφέρον των ερευνητών να επικεντρώνεται στην αναλογία αυτών των δύο μορφών στις επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές. Από παρατηρήσεις μελετών μέχρι σήμερα έχει διαπιστωθεί ότι η αναλογία αυτή μεταβάλλεται στους διάφορους ιστούς καθώς και στις διάφορες καταστάσεις φυσιολογίας (Lane et al. 2006; Ferlemi et al. 2014). Η χρήση της αναλογίας των δύο ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης ως δείκτης νευροεκφυλιστικών διαδικασιών έχει ως στόχο αυτή η αναλογία μελλοντικά να αποτελέσει ένα βιοδείκτη των επιμέρους καταστάσεων. Συμπερασματικά από την ανάλυση των παραπάνω αποτελεσμάτων προκύπτει ότι το γήρας προκαλεί αλλαγές στο λόγος SS/DS της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης τόσο στους θηλυκούς όσο και στους αρσενικούς μυς. Συγκεκριμένα ο λόγος SS/DS αυξάνεται με το γήρας στον ιππόκαμπο τόσο στους θηλυκούς όσο και στους αρσενικούς μυς ( 68,10% και 335,66% αντίστοιχα) ενώ ο λόγος στους αρσενικούς μυς αυξάνεται και στην παρεγκεφαλίδα ( 277,76%) και στο ραβδωτό ( 73,05%). Αντίθεση παρουσιάζει η μεταβολή του λόγου στον εγκεφαλικό φλοιό των θηλυκών μυών όπου παρατηρείται μείωση του λόγου ( 72.59%). Σημαντικό είναι να σημειωθεί ότι οι μεταβολές που προκύπτουν είναι διαφορετικές ανά εγκεφαλική περιοχή με μία τάση στις περισσότερες υπό μελέτη εγκεφαλικές περιοχές αύξησης του λόγου στους γηραιούς μυς θηλυκούς και αρσενικούς. [105]

116 δ) Επίδραση του φύλου στην ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης Ακολουθεί ανάλυση των αποτελεσμάτων της ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης με σκοπό τη διερεύνηση της επίδρασης του φύλου και στις δύο ηλικίες, ενήλικα 3-4 μηνών και γηραιά μηνών. Τα αποτελέσματα αυτά παρουσιάζονται στους παρακάτω πίνακες και διαγράμματα ξεχωριστά για κάθε κλάσμα και ηλικία. 1. Επίδραση του φύλου στη ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης στους θηλυκούς και αρσενικούς ενήλικες μυς Ενεργότητα ακετυλοχολινεστεράσης (μmol/gr ιστού) / Ενήλικοι μύες 3-4 μηνών Παρεγκεφαλίδα Εγκεφαλικός φλοιός Ιππόκαμπος Ραβδωτό Κλάσμα SS DS SS DS SS DS SS DS Θηλυκά Αρσενικά 12,22 ±0,60 11,84 ±0,56 19,12 ±0,47 18,22 ±0,77 23,64 ±1,13 20,32 ±0,38 131,59 ±2,99 90,17 ±7,08 ( 45,94%) ** 12,62 ±0,82 15,17 ±1,45 53,11 ±6,43 54,92 ±5,59 30,31 ±3,28 20,99 ±1,48 ( 30,75%) 136,5 ±91,56 157,20 ±14,67 ( 15,09%) * Πίνακας 8: Επίδραση φύλου στην ενεργότητα του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση στο SS και DS κλάσμα στις επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές θηλυκών και αρσενικών ενήλικων μυών. Οι τιμές της ενεργότητας αντιστοιχούν στη Μέση Τιμή ± Τυπικό Σφάλμα (SE) από 6 πειραματόζωα. Το ποσοστό στην παρένθεση () εκφράζει την % αλλαγή των αρσενικών ως προς τους θηλυκούς μυς. Η μείωση της ενεργότητας είναι στατιστικώς σημαντική (*) με p<0,05, (**) με p<0,01 και () με p<0,001. [106]

117 Ενεργότητα ακετυλοχολινεστεράσης στο SS κλάσμα (μmol/gr ιστού) Παρεγκεφαλίδα Εγκεφαλικός φλοιός Ιππόκαμπος Θηλυκά Αρσενικά Ραβδωτό Διάγραμμα 11: Μελέτη της επίδρασης του φύλου στην ενεργότητα του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση του SS κλάσματος στις επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές θηλυκών και αρσενικών ενήλικων μυών. Οι τιμές αντιστοιχούν στους μέσους όρους ± SE από 6 μύες/ομάδα. Η στατιστικώς σημαντική αλλαγή ενεργότητας μεταξύ των θηλυκών και των αρσενικών μυών, συμβολίζεται με () για p<0,001. Ενεργότητα ακετυλοχολινεστεράσης στο DS κλάσμα (μmol/gr ιστού) Παρεγκεφαλίδα ** Εγκεφαλικός φλοιός Θηλυκά Ιππόκαμπος Αρσενικά * Ραβδωτό Διάγραμμα 12: Μελέτη της επίδρασης του φύλου στην ενεργότητα του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση του DS κλάσματος στις επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές θηλυκών και αρσενικών ενήλικων μυών. Οι τιμές αντιστοιχούν στους μέσους όρους ± SE από 6 μύες/ομάδα. Η στατιστικώς σημαντική αλλαγή ενεργότητας μεταξύ των θηλυκών και των αρσενικών μυών, συμβολίζεται με (**) για p<0,01. [107]

118 Από τα αποτελέσματα προκύπτει ότι το φύλο έχει επίδραση στην ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης των ενήλικων μυών στο SS κλάσμα στο ραβδωτό και στο DS κλάσμα στον εγκεφαλικό φλοιό και στο ραβδωτό. Στο SS κλάσμα στο ραβδωτό παρατηρείται μειωμένη ενεργότητα στους αρσενικούς μυς σε σχέση με τους θηλυκούς μυς κατά 30,75% με τη διαφορά τους να είναι στατιστικώς σημαντική. Στο DS κλάσμα παρατηρείται στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο φύλων στην ενεργότητα του ενζύμου στον εγκεφαλικό φλοιό με την ενεργότητα να παρουσιάζεται μειωμένη στους αρσενικούς ενήλικους μυς κατά 45,94%. Ωστόσο σε αντίθεση με τη μειωμένη ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης στο ραβδωτό του SS κλάσματος των αρσενικών μυών στο DS κλάσμα παρατηρείται αυξημένη ενεργότητα στους αρσενικούς μυς κατά 15,09% όπου και αυτή η διαφορά της ενεργότητας είναι στατιστικώς σημαντική. Στις υπόλοιπες εγκεφαλικές περιοχές δεν παρατηρήθηκε καμία στατιστικώς σημαντική μεταβολή μεταξύ των δύο φύλων τόσο στο SS κλάσμα όσο και στο DS κλάσμα. 2. Επίδραση του φύλου στη ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης στους θηλυκούς και αρσενικούς γηραιούς μυς Ενεργότητα ακετυλοχολινεστεράσης (μmol/gr ιστού) / Γηραιοί μύες μηνών Παρεγκεφαλίδα Εγκεφαλικός φλοιός Ιππόκαμπος Ραβδωτό Κλάσμα SS DS SS DS SS DS SS DS Θηλυκά Αρσενικά 9,47 ±0,27 10,18 ±0,91 12,13 ±0,10 4,15 ±0,15 ( 65,81%) 5,76 ±0,69 17,37 ±0,91 ( 201,44%) 117,04 ±2,49 58,76 ±1,18 ( 49,79%) ** 8,51 ±0,43 11,07 ±2,32 21,31 ±2,93 9,20 ±0,42 ( 56,80%) * 15,48 ±2,01 11,44 ±0,51 56,01 ±1,81 49,52 ±1,00 ( 11,58%) * Πίνακας 9: Επίδραση φύλου στην ενεργότητα του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση στο SS και DS κλάσμα στις επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές θηλυκών και αρσενικών γηραιών μυών. Οι τιμές της ενεργότητας αντιστοιχούν στη Μέση Τιμή ± Τυπικό Σφάλμα (SE) από 6 πειραματόζωα. Το ποσοστό στην παρένθεση () εκφράζει την % αλλαγή των αρσενικών ως προς τους θηλυκούς μυς. Η μείωση της ενεργότητας είναι στατιστικώς σημαντική (*) με p<0,05, (**) με p<0,01 και () με p<0,001. [108]

119 Ενεργότητα ακετυλοχολινεστεράσης στο SS κλάσμα (μmol/gr ιστού) Παρεγκεφαλίδα Εγκεφαλικός φλοιός Θηλυκά Ιππόκαμπος Αρσενικά Ραβδωτό Διάγραμμα 13: Μελέτη της επίδρασης του φύλου στην ενεργότητα του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση του SS κλάσματος στις επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές θηλυκών και αρσενικών γηραιών μυών. Οι τιμές αντιστοιχούν στους μέσους όρους ± SE από 6 μύες/ομάδα. Η στατιστικώς σημαντική αλλαγή ενεργότητας μεταξύ των θηλυκών και των αρσενικών μυών, συμβολίζεται με (*) για p<0,05. Ενεργότητα ακετυλοχολινεστεράσης στο DS κλάσμα (μmol/gr ιστού) Παρεγκεφαλίδα ** Εγκεφαλικός φλοιός * Ιππόκαμπος Θηλυκά Αρσενικά * Ραβδωτό Διάγραμμα 14: Μελέτη της επίδρασης του φύλου στην ενεργότητα του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση του DS κλάσματος στις επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές θηλυκών και αρσενικών γηραιών μυών. Οι τιμές αντιστοιχούν στους μέσους όρους ± SE από 6 μύες/ομάδα. Η στατιστικώς σημαντική αλλαγή ενεργότητας μεταξύ των θηλυκών και των αρσενικών μυών, συμβολίζεται με (*) για p<0,05, με (**) για p<0,01 και με () για p<0,001. [109]

120 Με βάση τα αποτελέσματα που παρουσιαστήκαν παραπάνω προκύπτει ότι και στους γηραιούς μυς υπάρχουν διαφορές στην ενεργότητα των δύο φύλων στις υπό μελέτη εγκεφαλικές περιοχές μεταξύ των δύο φύλων. Στο SS κλάσμα παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική διαφοροποίηση της ενεργότητας μεταξύ των δύο φύλων μόνο στον εγκεφαλικό φλοιό. Η ενεργότητα του ενζύμου στον εγκεφαλικό φλοιό του SS κλάσματος στους αρσενικούς γηραιούς μυς βρέθηκε αυξημένη κατά 201,44% σε σύγκριση με τους θηλυκούς. Στις υπόλοιπες εγκεφαλικές περιοχές του SSκλάσματος δεν παρατηρήθηκε καμία στατιστικώς σημαντική μεταβολή μεταξύ των δύο φύλων Όσον αφορά το DS κλάσμα στατιστικώς σημαντικές διαφορές στην ενεργότητα του ενζύμου παρατηρήθηκε σε όλες τις υπό μελέτη εγκεφαλικές περιοχές, με την ενεργότητα του ενζύμου να παρουσιάζεται μειωμένη στους αρσενικούς μυς. Πιο συγκεκριμένα παρατηρήθηκε ότι η ενεργότητα του ενζύμου στο DS κλάσμα των αρσενικών γηραιών μυών ήταν μειωμένη κατά 65,81% στην παρεγκεφαλίδα, 49,79% στον εγκεφαλικό φλοιό, 56,80% στον ιππόκαμπο και κατά 11,58% στο ραβδωτό. Αξίζει να σημειωθεί ότι η ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης στο DS κλάσμα του εγκεφαλικού φλοιού ήταν η μοναδική που είχε τις ίδιες αλλαγές (μείωση) μεταξύ των δύο φύλων τόσο στους ενήλικες (3-4 μηνών) όσο και στους γηραιούς μυς (15-16 μηνών) Παρακάτω ακολουθεί ένας συγκεντρωτικός πίνακας των μεταβολών που παρατηρούνται, στην ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης στο SS αλλά και DS κλάσμα, μεταξύ των δύο φύλων τόσο στους ενήλικους όσο και στους γηραιούς μυς. Η παρουσίαση αυτή πραγματοποιείται με σκοπό να υπάρχει μία ολοκληρωμένη εικόνα για τη δράση του φυλετικού παράγοντα στην ενεργότητα των ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης στην παρεγκεφαλίδα, στον εγκεφαλικό φλοιό, στον ιππόκαμπο και στο ραβδωτό. [110]

121 % Μεταβολή της ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης αρσενικών μυών σε σύγκριση με τους θηλυκούς μυς Ηλικία Ενήλικα Γηραιά Παρεγκεφαλίδα Εγκεφαλικός φλοιός Ιππόκαμπος SS κλάσμα 3,10% 14,01% 20,19% DS κλάσμα SS κλάσμα DS κλάσμα 4,73% 7,44% 65,81% 31,48% ** 201,44% 49,79% ** 3,41% 30,12% 56,80% * Ραβδωτό 30,75% 15,09% * 26,06% 11,58% * Πίνακας 10: Συγκεντρωτικός πίνακας παρουσίασης της % μεταβολής της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης στο SS και στο DS κλάσμα στους αρσενικούς ενήλικους γηραιούς μυς σε σύγκριση με τους αντίστοιχους θηλυκούς ενήλικους και γηραιούς μυς, στις υπό μελέτη εγκεφαλικές περιοχές. Η μεταβολή της ενεργότητας είναι στατιστικώς σημαντική με (*) για p<0,05, με (**) για p<0,01 και με () για p<0, % Ενηλικα SS κλάσμα % μεταβολή της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης 200% 150% 100% 50% 0% -50% -100% Παρεγκεφαλίδα ** ** Εγκεφαλικός φλοιός Ενηλικα DS κλάσμα Γηραια SS κλάσμα Γηραια DS κλάσμα * * * Ιππόκαμπος Ραβδωτό Διάγραμμα 15: Διαγραμματική απεικόνιση της % μεταβολής της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης στο SS και στο DS κλάσμα στους αρσενικούς ενήλικους γηραιούς μυς σε σύγκριση με τους αντίστοιχους θηλυκούς ενήλικους και γηραιούς μυς, στις υπό μελέτη εγκεφαλικές περιοχές. Η στατιστικώς σημαντική μεταβολή της ενεργότητας, συμβολίζεται με (*) για p<0,05, με (**) για p<0,01 και με () για p<0,001. [111]

122 Συνοψίζοντας παρατηρώντας την ανάλυση των αποτελεσμάτων της ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης προκύπτει ιστοειδικότητα σε σχέση με τη επίδραση του φυλετικού παράγοντα καθώς δεν παρατηρείται κάποιο συγκεκριμένο μοτίβο στη σύγκριση μεταξύ των δύο φύλων τόσο στην ενήλικη ηλικία όσο και στη γηραιή. 3. Επίδραση του φύλου στο λόγο ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης στους ενήλικες και γηραιούς Συνεχίζοντας στην ανάλυση της επίδρασης του φυλετικού παράγοντα στην ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης στους ενήλικου και στους γηραιούς μυς, πραγματοποιήθηκε ο προσδιορισμός του λόγου SS/DS της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης. Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω λόγος SS/DS αναφέρεται κυρίως στο λόγο των ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης, καθώς στο SS και στο DS κλάσμα κυριαρχούν η G1 και η G4 ισομορφή αντίστοιχα. Λόγος SS/DS της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης Εγκεφαλικός Ηλικία Φύλο Παρεγκεφαλίδα Ιππόκαμπος φλοιός 0,64 0,18 0,24 Θηλυκά ±0,95 ±0,15 ±0,07 Ενήλικα 3-4 μηνών Γηραιά μηνών Αρσενικά Θηλυκά Αρσενικά 0,65 ±0,10 0,78 ±0,06 2,45 ±0,25 ( 68,18%) 0,23 ±0,02 ( 25,50%) 0,05 ±0,01 0,30 ±0,05 ( 83,35%) 0,28 ±0,10 0,40 ±0,05 1,20 ±0,42 ( 66,80%) * Ραβδωτό 0,22 ±0,05 0,13 ±0,03 0,28 ±0,09 0,23 ±0,04 Πίνακας 11: Επίδραση φύλου στο λόγο SS/DS της ενεργότητας του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση στις επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές θηλυκών και αρσενικών μυών και των δύο ηλικιών. Οι τιμές της ενεργότητας αντιστοιχούν στη Μέση Τιμή ± Τυπικό Σφάλμα (SE) από 6 πειραματόζωα. Το ποσοστό στην παρένθεση () εκφράζει την % αλλαγή των αρσενικών ως προς τους θηλυκούς μυς. Η μείωση της ενεργότητας είναι στατιστικώς σημαντική (*) με p<0,05 και () με p<0,001. [112]

123 0,8 Λόγος SS/DS της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Παρεγκεφαλίδα * Εγκεφαλικός φλοιός Ιππόκαμπος Θηλυκά Αρσενικά Ραβδωτό Διάγραμμα 16: Μελέτη της επίδρασης του φύλου στο λόγο SS/DS της ενεργότητας του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση στις επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές ενήλικων θηλυκών και αρσενικών μυών. Οι τιμές αντιστοιχούν στους μέσους όρους ± SE από 6 μύες/ομάδα. Η στατιστικώς σημαντική αλλαγή ενεργότητας μεταξύ των ενήλικων και των γηραιών μυών, συμβολίζεται με (*) για p<0,05. Λόγος SS/DS της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης 3 2,5 2 1,5 1 0,5 * Θηλυκά Αρσενικά 0 Παρεγκεφαλίδα Εγκεφαλικός φλοιός Ιππόκαμπος Ραβδωτό Διάγραμμα 17: Μελέτη της επίδρασης του φύλου στο λόγο SS/DS της ενεργότητας του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση στις επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές γηραιών θηλυκών και αρσενικών μυών. Οι τιμές αντιστοιχούν στους μέσους όρους ± SE από 6 μύες/ομάδα. Η στατιστικώς σημαντική αλλαγή ενεργότητας μεταξύ των ενήλικων και των γηραιών μυών, συμβολίζεται με (*) για p<0,05 και με () για p<0,001. [113]

124 Από τα αποτελέσματα της μελέτης της επίδρασης του φύλου στο λόγο SS/DS παρουσιάζονται μεταβολές μεταξύ των δύο φύλων τόσο στους ενήλικους μυς 3-4 μηνών όσο και στους γηραιούς μυς μηνών. Οι μεταβολές του λόγου SS/DS που παρατηρούνται μεταξύ των δύο φύλων παρουσιάζουν αλλαγές ανά εγκεφαλική περιοχή. Αρχικά αναλύοντας τους λόγους SS/DS μεταξύ των δύο φύλων στην ενήλικη ηλικία των 3-4 μηνών παρατηρείται στατιστικά σημαντική να είναι η μεταβολή μόνο στον εγκεφαλικό φλοιό με τους αρσενικούς μυς να παρουσιάζουν αύξηση σε σύγκριση με τα θηλυκά (25,50%). Όσον αφορά τους γηραιούς μυς μηνών παρατηρείται αλλαγή στο λόγο SS/DS σε όλες τις υπό μελέτη εγκεφαλικές περιοχές εκτός από το ραβδωτό. Πιο συγκεκριμένα ο λόγος SS/DS στους αρσενικούς μυς παρατηρήθηκε αυξημένος και στις τρεις εγκεφαλικές περιοχές με τον εγκεφαλικό φλοιό να έχει τη μεγαλύτερη μεταβολή με ποσοστό 83,35%, ακολουθεί η παρεγκεφαλίδα με 68,18% και ο ιππόκαμπος με 66,80% αύξηση. Συμπερασματικά από την ανάλυση των παραπάνω αποτελεσμάτων προκύπτει ότι υπάρχουν διαφορές στο λόγο SS/DS της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης μεταξύ των δύο φύλων τόσο στους ενήλικους όσο και στους γηραιούς μυς, που δεν ακολουθούν το ίδιο πρότυπο ανά εγκεφαλική περιοχή με μία τάση στις περισσότερες υπό μελέτη περιοχές αύξησης του λόγου στους αρσενικούς μυς και στις δύο ηλικιακές ομάδες. [114]

125 Συμπεράσματα του Α μέρους Συνοψίζοντας, από τα συμπεριφορικά πειράματα προέκυψε ότι: Παρατηρήθηκε κλιμακούμενη μείωση στον χρόνο θιγμοτακτισμού (μείωση άγχους) στις πρώτες 6 ηλικιακές ομάδες μέχρι και την ηλικία των 9-10 μηνών και στα δύο φύλα. Στις 2 τελευταίες ηλικίες (γηραιά μηνών και γηραιά μηνών) η κλιμακούμενη αυτή αλλαγή στη συμπεριφορά παρουσιάζεται να μεταβάλλεται και να μην ακολουθεί αυτό το μοτίβο που παρουσιάζεται στις προηγούμενες ηλικιακές ομάδες. Πιο συγκεκριμένα, στις γηραιές ηλικιακές ομάδες παρουσιάστηκε αύξηση της αγχώδους συμπεριφοράς και στα δύο φύλα. Επιπρόσθετα οι θηλυκοί μύες παρουσίασαν σε όλες τις ηλικιακές ομάδες αυξημένη αγχώδη συμπεριφορά σε σύγκριση με τους αρσενικούς μυς. Παρατηρήθηκε κλιμακούμενη αύξηση στην κινητικότητα στις πρώτες 6 ηλικιακές ομάδες μέχρι και την ηλικία των 9-10 μηνών και στα δύο φύλα. Στις 2 τελευταίες ηλικίες (γηραιά μηνών και γηραιά μηνών) η κλιμακούμενη αυτή αλλαγή στη κινητικότητα παρουσιάζεται να μεταβάλλεται και να μην ακολουθεί αυτό το μοτίβο που παρουσιάζεται στις προηγούμενες ηλικιακές ομάδες. Πιο συγκεκριμένα, στις γηραιές ηλικιακές ομάδες παρουσιάστηκε μείωση της κινητικότητας και στα δύο φύλα. Επιπρόσθετα οι θηλυκοί μύες παρουσίασαν σε όλες τις ηλικιακές ομάδες αυξημένη κινητικότητα σε σύγκριση με τους αρσενικούς μυς. Από τα πειράματα προσδιορισμού της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης προέκυψε ότι: Το γήρας επιφέρει μείωση στην ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης των υπό μελέτη εγκεφαλικών περιοχών και στα δύο φύλα τόσο στο SS κλάσμα όσο και στο DS κλάσμα με διαφοροποίηση μεταξύ των δύο φίλων μόνο στον εγκεφαλικό φλοιό. Παρατηρήθηκε μείωση στους θηλυκούς μυς μόνο στο SS κλάσμα του εγκεφαλικού φλοιού και στους αρσενικούς μυς μόνο στο DS κλάσμα του εγκεφαλικού φλοιού. Εμφανίζεται ιστοειδικότητα σε σχέση με τη επίδραση του φύλου στην ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης, καθώς δεν παρατηρείται κάποιο συγκεκριμένο μοτίβο στη σύγκριση μεταξύ των δύο φύλων τόσο στην ενήλικη ηλικία όσο και στη γηραιή. Το γήρας προκαλεί αλλαγές στο λόγος SS/DS της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης τόσο στους θηλυκούς όσο και στους αρσενικούς μυς. [115]

126 Συγκεκριμένα ο λόγος SS/DS αυξάνεται με το γήρας στον ιππόκαμπο τόσο στους θηλυκούς όσο και στους αρσενικούς μυς (4 φορές μεγαλύτερη από τους θηλυκούς) ενώ ο λόγος στους αρσενικούς μυς αυξάνεται και στην παρεγκεφαλίδα και στο ραβδωτό. Αντίθεση παρουσιάζει η μεταβολή του λόγου στον εγκεφαλικό φλοιό των θηλυκών μυών όπου παρατηρείται μείωση του λόγου. Σημαντικό είναι να σημειωθεί ότι οι μεταβολές που προκύπτουν είναι διαφορετικές ανά εγκεφαλική περιοχή με μία τάση στις περισσότερες υπό μελέτη εγκεφαλικές περιοχές αύξησης του λόγου στους γηραιούς μυς θηλυκούς και αρσενικούς. Από παρατηρήσεις μελετών μέχρι σήμερα έχει διαπιστωθεί ότι η αναλογία αυτή μεταβάλλεται στους διάφορους ιστούς καθώς και στις διάφορες καταστάσεις φυσιολογίας (Lane et al. 2006; Ferlemi et al. 2014). Η χρήση της αναλογίας των δύο ισομορφών της ακετυλοχολινεστεράσης ως δείκτης νευροεκφυλιστικών διαδικασιών έχει ως στόχο αυτή η αναλογία μελλοντικά να αποτελέσει ένα βιοδείκτη των επιμέρους καταστάσεων [116]

127 Β ΜΕΡΟΣ Επίδραση εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτού sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca στη συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος, στην κινητικότητα και στην ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης α) Επίδραση εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτού Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca στη συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος και στην κινητικότητα. 1. Ενήλικοι μύες (3-4 μηνών) Αρχικά, για τη μελέτη της επίδρασης του εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτού Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca στη συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος, επιλέχτηκε η ηλικιακή ομάδα ενήλικα 3-4 μηνών (θηλυκά και αρσενικά) όπου χορηγήθηκαν δύο διαφορετικές δόσεις του φυτικού εκχυλίσματος και ακολούθησε καταγραφή της συμπεριφοράς με τη δοκιμασία ανοιχτού πεδίου. Αυτή η διαδικασία πραγματοποιήθηκε ώστε μέσα από την επίδραση του φυτικού εκχυλίσματος στη συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος στους ενήλικους μυς να γίνει η επιλογή της κατάλληλης δόσης του εκχυλίσματος για περεταίρω έρευνα. Οι δύο δόσεις του εκχυλίσματος που επιλέχτηκαν ήταν, η δόση των 30 mg/kg βάρους σώματος και η δόση των 100 mg/kg βάρους σώματος. Το φυτικό εκχύλισμα χορηγήθηκε στους ενήλικούς θηλυκούς και αρσενικούς μυς ενδοπεριτοναϊκώς για 3 συνεχείς μέρες και μετά την πάροδο 24 ωρών από την τελευταία δόση πραγματοποιήθηκε η δοκιμασία ανοιχτού πεδίου για να βρεθεί η τυχών επίδραση του εκχυλίσματος στη συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος. Εξετάζοντας την πρώτη παράμετρο της δοκιμασίας θιγμοτακτισμού, το χρόνο θιγμοτακτισμού, τα αποτελέσματα της επίδρασης των δύο δόσεων του φυτικού εκχυλίσματος στους θηλυκούς και αρσενικούς ενηλίκους μυς 3-4 μηνών παρατίθενται παρακάτω. [117]

128 Χρόνος Θιγμοτακτισμού / Ενήλικοι μύες 3-4 μηνών Μάρτυρες Εκχύλισμα 30 Εκχύλισμα 100 Θηλυκά 495,67±6,09 484,00±13,49 Αρσενικά 460,00±9,02 435,43±10,60 448,40±8,24 ( 9,54% *) 417,38±11,76 ( 9,27% *) Πίνακας 12: Επίδραση των δύο δόσεων (30 mg/kg βάρους σώματος και 100 mg/kg βάρους σώματος) του εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτού Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca στη συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος σε ενήλικους θηλυκούς και αρσενικούς μυς. Οι τιμές για το χρόνο θιγμοτακτισμού αντιστοιχούν στη Μέση Τιμή ± Τυπικό Σφάλμα (SE) από 8 πειραματόζωα. Το ποσοστό στην παρένθεση () εκφράζει την % αλλαγή του χρόνου μεταξύ των μαρτύρων και των μυών που τους χορηγήθηκε η δόση των 100 mg/kg βάρους σώματος. Η μείωση του χρόνου θιγμοτακτισμού είναι στατιστικώς σημαντική (*) με p<0, Μάρτυρες Εκχύλισμα 30 Χρόνος Θιγμοτακτισμού (sec) * Εκχύλισμα 100 Μάρτυρες * 300 Ενήλικα Θηλυκά Ενήλικα Αρσενικά Διάγραμμα 18: Μελέτη της επίδρασης των δύο δόσεων (30 mg/kg βάρους σώματος και 100 mg/kg βάρους σώματος) του εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτού Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca στη συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος σε ενήλικους θηλυκούς και αρσενικούς μυς. Οι τιμές αντιστοιχούν στους μέσους όρους ± SE από 8 μύες/ομάδα. Η στατιστικώς σημαντική αλλαγή του χρόνου θιγμοτακτισμού μεταξύ των μαρτύρων και των μυών που τους χορηγήθηκε η δόση των 100 mg/kg βάρους σώματος, συμβολίζεται με (*) για p<0,05. [118]

129 Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται παραπάνω, προκύπτει ότι η χορήγηση εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτού Sideritis cladestina subsp. peloponnesiaca, μείωσε στατιστικώς σημαντικά το χρόνο θιγμοτακτισμού μόνο στη δόση των 100mg/kg σωματικού βάρους. Ωστόσο τάση μείωσης παρατηρήθηκε και στη δόση των 30mg/kg σωματικού βάρους, η οποία όμως δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Η χορήγηση της δόσης των 100mg/kg σωματικού βάρους μείωσε το χρόνο θιγμοτακτισμού τόσο στους θηλυκούς ενηλίκους μυς (κατά 9,54%) όσο και στους αρσενικούς ενήλικες μυς (κατά 9,27%). Αυτή η στατιστικώς σημαντική μεταβολή, υποδηλώνει ότι τα πειραματόζωα που τους χορηγήθηκε η μεγάλη δόση παρουσίασαν λιγότερο άγχος/φόβο σε σχέση με τους μάρτυρες, γεγονός που υποδεικνύει ότι το συγκεκριμένο εκχύλισμα του φυτού στην δόση των 100mg/kg σωματικού βάρους ασκεί μια αγχολυτική επίδραση στα πειραματόζωα. Επίσης προσδιοριστικέ και ο αριθμός των εισόδων στην κεντρική περιοχή της συσκευής που υποδεικνύει την κινητικότητα. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται παρακάτω εκφράζουν την επίδραση των δύο δόσεων του φυτικού εκχυλίσματος στον αριθμό των εισόδων στην κεντρική περιοχή των θηλυκών και αρσενικών ενηλίκων μυών. Αριθμός των εισόδων στην κεντρική περιοχή / Ενήλικοι μύες 3-4 μηνών Μάρτυρες Εκχύλισμα 30 Εκχύλισμα 100 Θηλυκά 25,40±0,67 26,00±1,19 Αρσενικά 22,60±1,76 25,40±2,60 36,34±2,27 ( 30,07%)* 33,17±2,64 ( 31,86%)* Πίνακας 13: Επίδραση των δύο δόσεων (30 mg/kg βάρους σώματος και 100 mg/kg βάρους σώματος) του εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτού Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca στην κινητικότητα ενήλικων θηλυκών και αρσενικών μυών. Οι τιμές αντιστοιχούν στους μέσους όρους ± SE από 8 μύες/ομάδα. Το ποσοστό στην παρένθεση () εκφράζει την % αλλαγή του αριθμού των εισόδων στην κεντρική περιοχή μεταξύ των μαρτύρων και των μυών που τους χορηγήθηκε η δόση των 100 mg/kg βάρους σώματος. Η αύξηση του αριθμού των εισόδων είναι στατιστικώς σημαντική (*) με p<0,05. [119]

130 45 Μάρτυρες Εκχύλισμα 30 Αριθμός εισόδων στην κεντρική περιοχή * Εκχύλισμα 100 Μάρτυρες * 0 Ενήλικα Θηλυκά Ενήλικα Αρσενικά Διάγραμμα 19: Μελέτη της επίδρασης των δύο δόσεων (30 mg/kg βάρους σώματος και 100 mg/kg βάρους σώματος) του εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτού Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca στην κινητικότητα ενήλικων θηλυκών και αρσενικών μυών. Οι τιμές αντιστοιχούν στους μέσους όρους ± SE από 8 μύες/ομάδα. Η στατιστικώς σημαντική αλλαγή αριθμού των εισόδων στην κεντρική περιοχή της συσκευής μεταξύ των μαρτύρων και των μυών που τους χορηγήθηκε η δόση των 100 mg/kg βάρους σώματος, συμβολίζεται με (*) για p<0,05 Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, προκύπτει ότι η χορήγηση εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα από το φυτό Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca, αύξησε τον αριθμό των εισόδων στην κεντρική περιοχή της συσκευής μόνο στη δόση των 100mg/kg σωματικού βάρους. Ωστόσο τάση μια μικρή τάση αύξησης παρατηρήθηκε και στη δόση των 30mg/kg σωματικού βάρους, η οποία όμως δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Η χορήγηση της δόσης των 100mg/kg σωματικού βάρους αύξησε των αριθμό των εισόδων τόσο στους θηλυκούς ενηλίκους μυς (κατά 30,07%) όσο και στους αρσενικούς ενήλικες μυς (κατά 31,86%). Αυτή η στατιστικώς σημαντική μεταβολή της κινητικότητας, δείχνει αυξημένη τάση των πειραματόζωων για εξερεύνηση και πιθανό να οφείλεται στη μείωση του δείκτη του άγχους που παρατηρήθηκε στις αντίστοιχες ομάδες. Συμπερασματικά, με τη δοκιμασία του ανοιχτού πεδίου παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές αλλαγές στη συμπεριφορά και στις δύο παραμέτρους που μελετήθηκαν (χρόνος θιγμοτακτισμού και αριθμός των εισόδων) αλλά μόνο στην δόση των 100mg/kg σωματικού βάρους. Δηλαδή παρατηρήθηκε αγχολυτική επίδραση του [120]

131 φυτικού εκχυλίσματος στη δόση των 100mg/kg σωματικού βάρους στους ενήλικους θηλυκούς και αρσενικούς μυς. 2. Γηραιοί μύες (15-16 μηνών) Με βάση τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν στη δοκιμασία του ανοιχτού πεδίου επιλέχτηκε για περεταίρω μελέτη η δόση των 100mg/kg σωματικού βάρους που προκάλεσε μεταβολή στη συμπεριφορά των πειραματόζωων στα οποία είχε χορηγηθεί. Έχοντας πλέον γίνει η επιλογή της κατάλληλης δοσολογίας του εκχυλίσματος πραγματοποιήθηκε εκ νέου η δοκιμασία του ανοιχτού πεδίου ώστε να μελετηθεί και η επίδραση της δόσης 100mg/kg σωματικού βάρους του φυτικού εκχυλίσματος στην ηλικιακή ομάδα των γηραιών μυών θηλυκών και αρσενικών. Τα αποτελέσματα και για τις δύο παραμέτρους της δοκιμασίας του ανοιχτού πεδίου παρατίθενται παρακάτω. Χρόνος Θιγμοτακτισμού / Γηραιοί μύες μηνών Μάρτυρες Εκχύλισμα 100 Θηλυκά 527,33±13,92 Αρσενικά 487,25±6,81 439,71±12,83 ( 16,62%) 385,50±13,73 ( 20,88%) Πίνακας 14: Επίδραση του εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτού Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca (100 mg/kg βάρους σώματος) στη συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος σε γηραιούς θηλυκούς και αρσενικούς μυς αγχώδους συμπεριφοράς με την εξέλιξη της ηλικίας. Οι τιμές αντιστοιχούν στους μέσους όρους ± SE από 8 μύες/ομάδα. Το ποσοστό στην παρένθεση () εκφράζει την % αλλαγή του χρόνου μεταξύ των μαρτύρων και των μυών που τους χορηγήθηκε η δόση των 100 mg/kg βάρους σώματος. Η μείωση του χρόνου θιγμοτακτισμού είναι στατιστικώς σημαντική () με p<0,001. [121]

132 Χρόνος Θιγμοτακτισμού (sec) Μάρτυρες Εκχύλισμα 100 Μάρτυρες Γηραιά Θηλυκά Γηραιά Αρσενικά Διάγραμμα 20: Μελέτη της επίδρασης του εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτού Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca (100 mg/kg βάρους σώματος) στη συμπεριφορική κατάσταση άγχος/φόβος σε γηραιούς θηλυκούς και αρσενικούς μυς. Οι τιμές αντιστοιχούν στους μέσους όρους ± SE από 8 μύες/ομάδα. Η στατιστικώς σημαντική αλλαγή του χρόνου θιγμοτακτισμού μεταξύ των μαρτύρων και των μυών που τους χορηγήθηκε η δόση των 100 mg/kg βάρους σώματος, συμβολίζεται με () για p<0,001. Από τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται παραπάνω, προκύπτει ότι η χορήγηση εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτού Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca, μείωσε στατιστικώς σημαντικά το χρόνο θιγμοτακτισμού στους γηραιούς μυς. Πιο συγκεκριμένα η χορήγηση της δόσης των 100mg/kg σωματικού βάρους μείωσε το χρόνο θιγμοτακτισμού τόσο στους θηλυκούς γηραιούς μυς (κατά 16,62%) όσο και στους αρσενικούς γηραιούς μυς (κατά 20,88%). Αυτή η στατιστικώς σημαντική μεταβολή, υποδηλώνει ότι οι γηραιοί μύες που τους χορηγήθηκε το φυτικό εκχύλισμα είχαν λιγότερο άγχος/φόβο σε σχέση με τους μάρτυρες. Γεγονός που υποδεικνύει ότι το συγκεκριμένο εκχύλισμα του φυτού ασκεί μια αγχολυτική επίδραση στους γηραιούς μυς όπως παρατηρήθηκε και παραπάνω και στους ενήλικους μυς. [122]

133 Αριθμός των εισόδων στην κεντρική περιοχή της συσκευής / Γηραιοί μύες μηνών Μάρτυρες Εκχύλισμα 100 Θηλυκά 24,75±1,12 Αρσενικά 20,33±1,43 31,67±2,51 ( 21,84%)* 28,00±0,76 ( 27,38%)* Πίνακας 15: Επίδραση του εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτού Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca (100 mg/kg βάρους σώματος) στην κινητικότητα γηραιών θηλυκών και αρσενικών μυών. Οι τιμές αντιστοιχούν στους μέσους όρους ± SE από 8 μύες/ομάδα. Το ποσοστό στην παρένθεση () εκφράζει την % αλλαγή του αριθμού των εισόδων στην κεντρική περιοχή μεταξύ των μαρτύρων και των μυών που τους χορηγήθηκε το φυτικό εκχύλισμα. Η αύξηση του αριθμού των εισόδων είναι στατιστικώς σημαντική (*) με p<0,05. Αριθμός εισόδων στην κεντρική περιοχή Μάρτυρες Εκχύλισμα 30 Μάρτυρες * * Γηραιά Θηλυκά Γηραιά Αρσενικά Διάγραμμα 21: Μελέτη της επίδρασης του εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του φυτού Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca (100 mg/kg βάρους σώματος) στην κινητικότητα γηραιών θηλυκών και αρσενικών μυών Οι τιμές αντιστοιχούν στους μέσους όρους ± SE από 8 μύες/ομάδα. Η στατιστικώς σημαντική αλλαγή αριθμού των εισόδων στην κεντρική περιοχή της συσκευής μεταξύ των μαρτύρων και των μυών που τους χορηγήθηκε το φυτικό εκχύλισμα, συμβολίζεται με (*) για p<0,05. Όσον αφορά τη δεύτερη παράμετρο της δοκιμασίας ανοιχτού πεδίου, από τα αποτελέσματα παρατηρείται πως η χορήγηση του φυτικού εκχυλίσματος στους γηραιούς θηλυκούς και αρσενικούς μεταβάλει την κινητικότητά τους. [123] Πιο συγκεκριμένα η χορήγηση της δόσης των 100mg/kg σωματικού βάρους αύξησε των αριθμό των εισόδων τόσο στους θηλυκούς ενηλίκους μυς (κατά 21,84%) όσο και στους αρσενικούς ενήλικες μυς (κατά 27,38%). Αυτή η στατιστικώς σημαντική μεταβολή της κινητικότητας, δείχνει