Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας Τμήμα Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας Χειμερινό Ακαδημαϊκό Εξάμηνο 2016_17

Transcript

1 Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας Τμήμα Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας Χειμερινό Ακαδημαϊκό Εξάμηνο 2016_17 ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Τροποποίηση της γονιδιακής έκφρασης σε μοντέλα κυτταροκαλλιεργειών- Κυτταρικός μετασχηματισμός Αμανατιάδου Π. Έλσα, PhD

2 Τροποποίηση της γονιδιακής έκφρασης σε μοντέλα κυτταροκαλλιεργειών A. Έκτοπη έκφραση γονιδίων σε κυτταρικές σειρές (πολισχιδία εφαρμογών: μελέτη του φυσιολογικού ρόλου της κωδικοποιούμενης πρωτεΐνης, υποκυτταρική ανίχνευση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών συζευγμένων με επίτοπο, έκφραση μεταλλαγμένων μορφών πρωτεϊνών, διαπίστωση μοριακών αλληλεπιδράσεων σηματοδότησης κ.ά.) - Ευκαρυωτικοί φορείς έκφρασης (χάρτης πλασμιδίου, κλωνοποίηση γονιδίου, προαγωγέας, δείκτες αντίστασης) - Μέθοδοι επιμόλυνσης ευκαρυωτικών κυττάρων (μέθοδος κατακρήμνισης φωσφορικού ασβεστίου, επιμόλυνση με τη χρήση λιποσωμάτων, ηλεκτροδιήθηση, ιϊκή μεταγωγή) - Μέθοδοι επιβεβαίωσης του κυτταρικού μετασχηματισμού Β. Αποσιώπηση γονιδιακής έκφρασης σε κυτταρικές σειρές (πολισχιδία εφαρμογών: μελέτη φυσιολογικού ρόλου της κωδικοποιούμενης πρωτεΐνης, δημιουργία μοντέλων μελέτης παθολογικών καταστάσεων, διαπίστωση μοριακών αλληλεπιδράσεων σηματοδότησης, θεραπευτική προσέγγιση κ.ά.) - Τεχνολογία RNAi (sirna, shrna, mirna), αντινοηματικά νουκλεοτίδια - Τεχνολογία CRISPR/Cas9 2/18

3 Επιμόλυνση/Διαμόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων Χρήση των κυτταροκαλλιεργειών στη διερεύνηση του φυσιολογικού και παθολογικού ρόλου γονιδίων και των αντίστοιχων κωδικοποιούμενων πρωτεϊνών o Θετική ή αρνητική τροποποίηση των επιπέδων γονιδιακής έκφρασης και συσχετισμός με τον αντίκτυπο στα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των κυττάρων ή/και μεταβολές στην ενδοκυττάρια σηματοδότηση o Παραγωγή-Απομόνωση-Καθαρισμός ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών Επιμόλυνση/Διαμόλυνση (Transfection) Μεταμόρφωση (Transformation) Μεταγωγή (Transduction) 3/18

4 Παροδική και σταθερή επιμόλυνση Παροδική: το εξωγενές γενετικό υλικό δεν ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του κυττάρου, δε μεταφέρεται στα θυγατρικά κύτταρα και ανιχνεύεται για περιορισμένο χρονικό διάστημα (ημέρες) Σταθερή: το εξωγενές γενετικό υλικό ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του κυττάρου ή συντηρείται ως επίσωμα, μακροπρόθεσμη συντήρηση στα θυγατρικά κύτταρα Ενσωμάτωση εξωγενούς DNA: σπάνιο γεγονός, επιλογή κυττάρων με τη χρήση κατάλληλου δείκτη αντίστασης Schematic diagrams of two different transfections. (a) Stable transfection. Foreign DNA (red wave) is delivered to nucleus by passage through the cell and nuclear membranes. Foreign DNA is integrated into the host genome (black wave) and expressed sustainably. (b). Transient transfection. Foreign DNA is delivered into the nucleus but is not integrated into the genome. Foreign mrna (blue wave) is also delivered into the cytosol, where it is translated. Hexagons are expressed proteins from transfected nucleic acids. Black arrows indicate delivery of foreign nucleic acids 4/18

5 Φορείς έκφρασης για ευκαρυωτικά κύτταρα Περιοχή πολλαπλών θέσεων περιορισμού για την κλωνοποίηση του γονιδίου (multiple cloning site) Προαγωγέα που εξασφαλίζει την υψηλή έκφραση του κλωνοποιημένου γονιδίου σε ευκαρυωτικά κύτταρα (όπως CMV, SV40) Σημείο τερματισμού της μεταγραφής - Σήμα πολυαδενυλίωσης Μη μεταφραζόμενη περιοχή (UTR) - Αλληλουχία Kozak Επίτοπο για την ανίχνευση-απομόνωση-καθαρισμό της πρωτεΐνης (Myc, His, GST, GFP) Δείκτες αντίστασης για την επιλογή των μετασχηματισμένων κυττάρων (ευκαρυωτικά και βακτηριακά κύτταρα) Σημείο έναρξης της αντιγραφής (αντιγραφή και συντήρηση του πλασμιδίου σε ευκαρυωτικά και βακτηριακά κύτταρα) 5/18

6 Διαπερατότητα κυτταρικής μεμβράνης Μέθοδοι επιμόλυνσης ευκαρυωτικών κυττάρων Φωσφολιπιδική διπλοστοιβάδα της κυτταρικής μεμβράνης Ημιπερατή Για την επιμόλυνση/διαμόλυνση των κυττάρων με νουκλεϊκά οξέα (DNA/RNA) χρησιμοποιούνται χημικές, βιολογικές, φυσικές μέθοδοι: Κατιονικά λιπίδια (Cationic lipid mediated delivery) Μέθοδος κατακρήμνισης φωσφορικού ασβεστίου (Calcium phosphate coprecipitation) Ιϊκή μεταγωγή (Viral delivery - transduction) Ηλεκτροδιήθηση (Electroporation) Άλλες μέθοδοι: DEAE- Dextran, μικροέγχυση κ.ά. 6/18

7 Επιμόλυνση/Διαμόλυνση με κατιονικά λιπίδια Συνήθως μείγμα κατιονικών και ουδέτερα φορτισμένων λιπιδίων Ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των θετικά φορτισμένων ομάδων των κατιονικών λιπιδίων και των αρνητικά φορτισμένων φωσφορικών ομάδων του DNA αυθόρμητη σύνδεση Σχηματισμός λιποσωμάτων Σύζευξη με την κυτταροπλασματική μεμβράνη Μεταφορά του DNA στο εσωτερικό του κυττάρου 7/18

8 Μέθοδος κατακρήμνισης φωσφορικού ασβεστίου Ανάμειξη του DNA με διάλυμα χλωριούχου ασβεστίου CaCl2 σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου Κατακρήμνιση του DNA στην επιφάνεια των κυττάρων (DMSO, γλυκερόλη) Είσοδος στο κύτταρο με φαγοκύττωση ή ενδοκύττωση 8/18

9 Μέθοδος της ηλεκτροδιήθησης Η ηλεκτροδιήθηση χρησιμοποιεί ηλεκτρικό παλμό για να δημιουργήσει παροδικούς πόρους (electropores) στην κυτταρική μεμβράνη επιτρέποντας την είσοδο του DNA στα κύτταρα Τα κύτταρα τοποθετούνται σε διάλυμα που περιέχει DNA και υπόκεινται σε ηλεκτρικό παλμό που προκαλεί παροδικούς πόρους στην κυτταρική μεμβράνη Μέσω των παροδικών πόρων το DNA εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα και στη συνέχεια στον πυρήνα 9/18

10 Ιϊκή μεταγωγή Η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδος στην κλινική έρευνα (in vivo) Χρησιμοποιείται για την επιμόλυνση/διαμόλυνση «δύσκολων» κυτταρικών σειρών.. (πρωτογενή κύτταρα, στελεχιαία κύτταρα, μη διαιρούμενα κύτταρα) ~90-100% μεταγωγή σε κύτταρα που φέρουν τους αντίστοιχους υποδοχείς για τον ιό Αδενοιοί, ρετροϊοί (MLV, Lentivirus), AAV Πρόβλημα της ανοσογονικότητας και τυχαίας ενσωμάτωσης διαγονιδίου /18

11 Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα των μεθόδων επιμόλυνσης 11/18

12 Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα των μεθόδων επιμόλυνσης 12/18

13 Επιβεβαίωση του μετασχηματισμού των κυττάρων Η πρώτη ένδειξη για τον επιτυχή μετασχηματισμό των κυττάρων είναι η ανάπτυξή τους παρουσία του δείκτη αντίστασης (σε σταθερή επιμόλυνση/διαμόλυνση) Επιβεβαίωση με ποικιλία μεθοδολογιών σε επίπεδο γονιδιακής ή/και πρωτεϊνικής έκφρασης: WESTERN BLOT RT-PCR, qpcr ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ (GFP) ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ & ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ (υποκυτταρικός εντοπισμός - ανίχνευση) ΦΡΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑ (GFP) SOUTHERN BLOT (ένθεση DNA) 13/18

14 RNA interference (RNAi) Βιολογικό φαινόμενο : μετα-μεταγραφική αποσιώπηση γονιδιακής έκφρασης sirna, mirna, Drosha, Dicer, RISC sirna: 21-25bp δίκλωνα RNA με 3 - προεξοχές που προκύπτουν από την επεξεργασία dsrna (Dicer) απόλυτη συμπληρωματικότητα mirna: nt μονόκλωνα RNA που προκύπτουν από την επεξεργασία μονόκλωνων πρόδρομων μορίων ατελής συμπληρωματικότητα 14/18

15 RNA interference (RNAi) Επιμόλυνση/ Διαμόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων με: Συνθετικά sirna sirna που προκύπτουν από πρόδρομα μόρια shrnas (δομή φουρκέτας) μετά από επεξεργασία από το ένζυμο DICER φορείς έκφρασης mirna που προκύπτουν από πρόδρομα μονόκλωνα μετάγραφα -φορείς έκφρασης 15/18

16 CRISPR/Cas9 Το σύστημα CRISPR/Cas9 στηρίζεται σε ένα φυσικό αμυντικό μηχανισμό των βακτηρίων ενάντια στους ιούς Η μεθοδολογία στηρίζεται σε ένα συνθετικό οδηγό μόριο RNA και την πρωτεΐνη Cas9 Το οδηγό μόριο RNA είναι συμπληρωματικό με την αλληλουχία στόχο και οδηγεί εκεί την ενδονουκλεάση Cas9 η οποία «κόβει» την αλληλουχία DNA Αφαίρεση, προσθήκη ή και αλλαγή αλληλουχιών του DNA με μεγάλη ακρίβεια (!) Π.χ. Λάθη κατά την επιδιόρθωση της αλληλουχίας (NHEJ) απενεργοποιούν το γονίδιο Π.χ. Αν προστεθεί ομόλογη αλληλουχία (δότης) με την αλληλουχία στόχο αντικατάσταση μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού (HR) 16/18

17 CRISPR/Cas /18

18 ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Η τροποποίηση της γονιδιακής έκφρασης σε μοντέλα κυτταροκαλλιεργειών αποτελεί ένα σημαντικό σύστημα μελέτης της φυσιολογικής λειτουργίας γονιδίων και των αντίστοιχων κωδικοποιούμενων πρωτεϊνών (Διαφάνειες 3-5, 7-10, 13!) Επόμενη διάλεξη: Χρήσεις των κυτταροκαλλιεργειών με σημαντικές προεκτάσεις στην αντιμετώπιση της ανθρώπινης παθοφυσιολογίας