ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΑΙΣΘΗΤΗΡΙΩΝ ΟΡΓΑΝΩΝ Α ΟΦΘΑΛΜΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟ ΑΧΕΠΑ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Ν. ΓΕΩΡΓΙΑΔΗΣ ΠΑΝΕΠ.ΕΤΟΣ Αριθμ Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ EXCIMER LASER ΣΤΟ ΕΝΔΟΘΗΛΙΟ ΤΟΥ ΚΕΡΑΤΟΕΙΔΟΥΣ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗ ΔΙΟΡΘΩΣΗ ΔΙΑΘΛΑΣΤΙΚΩΝ ΑΝΩΜΑΛΙΩΝ ΑΝΑΣΤΑΣΙΑ ΜΠΑΣΤΕΑ ΙΑΤΡΟΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΟΣ ΟΦΘΑΛΜΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

2 2

3 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΓΕΩΡΓΙΑΔΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ, ΔΕΡΕΚΛΗΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ, ΖΙΑΚΑΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΟΦΘΑΛΜΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΟΦΘΑΛΜΟΛΟΓΙΑΣ ΕΠ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΟΦΘΑΛΜΟΛΟΓΙΑΣ ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΓΕΩΡΓΙΑΔΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΟΦΘΑΛΜΟΛΟΓΙΑΣ ΔΕΡΕΚΛΗΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΟΦΘΑΛΜΟΛΟΓΙΑΣ ΖΙΑΚΑΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ, ΕΠ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΟΦΘΑΛΜΟΛΟΓΙΑΣ ΛΑΚΕ ΣΥΜΕΩΝ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΟΦΘΑΛΜΟΛΟΓΙΑΣ ΔΟΥΔΟΥ ΚΑΚΑΒΟΥΤΗ ΑΓΓΕΛΙΚΗ, ΑΝ.ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ OΦΘΑΛΜΟΛΟΓΙΑΣ ΚΩΝΣΤΑΣ ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΟΦΘΑΛΜΟΛΟΓΙΑΣ ΠΑΠΑΔΟΠΟΥΛΟΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΟΦΘΑΛΜΟΛΟΓΙΑΣ «Ή έγκρισης της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλοί αποδοχήν των γνωμών του συγγραφέως». (Νόμος 5343/32, αρθρ και ν. 1268/82, αρθρ. 50 8) 3

4 4

5 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΝΤΟΜΠΡΟΣ 5

6 6

7 Στην Οικογένειά μου Στους δασκάλους μου 7

8 8

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 11 Ι. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΙΣΤΟΡΙΑ 17 ΑΝΑΤΟΜΙΑ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΚΕΡΑΤΟΕΙΔΟΥΣ 19 ΔΙΑΤΗΡΗΣΗ ΚΕΡΑΤΟΕΙΔΙΚΗΣ ΔΙΑΦΑΝΕΙΑΣ 33 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΟΥ ΦΡΑΓΜΟΥ 34 ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ 41 ΤΗΣ ΑΝΤΛΙΑΣ 41 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΗΣ ΑΝΤΛΙΑΣ ΕΝΔΟΘΗΛΙΟΥ 39 ΕΝΔΟΘΗΛΙΟΣΚΟΠΗΣΗ 44 ΟΠΤΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΟΥ ΕΝΔΟΘΗΛΙΟΣΚΟΠΙΟΥ 46 ΒΕΛΤΙΩΣΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 52 ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΚΕΡΑΤΙΚΟΥ ΕΝΔΟΘΗΛΙΟΥ 56 ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ 57 ΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΟΡΙΑ ΚΑΙ ΣΥΝΔΕΣΕΙΣ 61 ΟΠΙΣΘΙΑ ΚΕΡΑΤΟΕΙΔΙΚΗ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ 63 ΔΙΑΦΟΡΕΣ ΔΟΜΕΣ 64 ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ 69 ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΤΑΘΕΡΟΥ ΠΛΑΙΣΙΟΥ 71 9

10 ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΜΕ ΜΕΤΑΒΛΗΤΟ ΠΛΑΙΣΙΟ 73 ΑΤΟΜΙΚΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΉ ΑΝΑΛΥΣΗ 74 ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΟ ΕΝΔΟΘΗΛΙΟ 78 LASER 79 II. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 87 Ασθενείς και μέθοδος 89 Αποτελέσματα 93 Συζήτηση 95 Περίληψη 103 Περίληψη στην Αγγλική 105 Βιβλιογραφία

11 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Ένα από τα μεγαλύτερα όνειρα του ανθρώπου ήταν μέχρι την προπερασμένη δεκαετία η διόρθωση των διαθλαστικών ανωμαλιών και ιδιαίτερα της μυωπίας με χειρουργική επέμβαση ώστε να μην απαιτείται η χρήση διορθωτικών γυαλιών ή άλλων βοηθητικών μέσων. Οι πρώτες προσπάθειες αναφέρονται στα τέλη του 18 ου αιώνα με την χειρουργική του φακού. Το όνειρο όμως αυτό έγινε πραγματικότητα με την εισαγωγή της σύγχρονης τεχνολογίας της ακτινοβολίας Laser από τους Trokel 1-2 Srinivasan 1 και τους συνεργάτες τους στη σμίλευση του κερατοειδούς. Η εφαρμογή του Excimer Laser αποτέλεσε το έναυσμα για την έκρηξη στον τομέα της διαθλαστικής χειρουργικής. Το excimer Laser παρουσιάσθηκε για πρώτη φορά το από τον Stuart Seals 4, ο οποίος βομβάρδισε με ηλεκτρόνια, μείγμα ξένου και βρωμίου. Η ονομασία Excimer προήλθε από τη σύντμηση των λέξεων excited και dimmer που σημαίνουν διηγερμένο διμερές, επειδή το υλικό που παράγει την ακτινοβολία είναι συνδυασμός αερίου και αλογόνου, σε ασταθή μοριακή κατάσταση. Τα αέρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν της ομάδας των ευγενών αερίων όπως Ar, Kr, Xe, και He. Τα αλογόνα ήταν το Cl και το F. Πρώτος ο Trokel 1 απέδειξε τη δυνατότητα εφαρμογής του Excimer laser στη διαθλαστική και θεραπευτική φωτοεξαίρεση και ο Τ. Seiler 5 6 ήταν ο πρώτος που το εφήρμοσε σε ανθρώπινο οφθαλμό. Εκτοτε η φωτοδιαθλαστική κερατεκτομή βρήκε αλματώδη εφαρμογή σε όλο σχεδόν τον κόσμο. Υπάρχουν όμως ανησυχίες σχετικά με την επίδραση του Laser και της διαθλαστικής χειρουργικής, γενικότερα, στα νεύρα του κερατοειδούς, στο 11

12 κολλαγόνο του στρώματος και στο ενδοθήλιο και το ερώτημα που γεννήθηκε ήταν, ποιες πιθανόν αλλαγές επισυμβαίνουν μετά την εφαρμογή που μπορεί ενδεχόμενα να αλλοιώσoυν την αρχιτεκτονική του κερατοειδούς. Η διατήρηση φυσιολογικού ενδοθηλίου αποτελεί τον σπουδαιότερο παράγοντα για τη διαφάνεια του κερατοειδούς και τη διατήρηση της όρασης. Σκοπός της μελέτης αυτής είναι η αναζήτηση τυχόν βλαπτικής επίδρασης στο ενδοθήλιο του κερατοειδούς, μετά την εφαρμογή του Excimer laser για τη διόρθωση μυωπίας υπερμετρωπίας και αστιγματισμού. Η παρούσα διατριβή αποτελείται από δύο μέρη. Στο πρώτο, το γενικό μέρος, γίνεται λεπτομερής περιγραφή της ανατομικής του κερατοειδούς με αναλυτικότερη αναφορά στο ενδοθήλιο του κερατοειδούς. Ακολουθεί η σημασία του ενδοθηλίου στη διατήρηση της διαφάνειας του κερατοειδούς και ο μηχανισμός λειτουργίας του φραγμού του ενδοθηλίου. Γίνεται λεπτομερής περιγραφή του ενδοθηλιοσκοπίου, του τρόπου λειτουργίας του και των αποτελεσμάτων από την ενδοθηλιοσκόπηση. Τέλος γίνεται αναφορά για τα Laser και ιδιαίτερα για το Excimer Laser και τη δράση τους στους οφθαλμικούς ιστούς. Στο δεύτερο μέρος το ειδικό, περιγράφεται το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε, τα στοιχεία που προέκυψαν από την ενδοθηλιοσκόπηση των υποψηφίων για διαθλαστική χειρουργική με Excimer Laser και οι μετρήσεις μετεγχειρητικά στους χρόνους που είχαν ορισθεί. Γίνεται στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων και ακολουθούν, η συζήτηση και τα αποτελέσματα της μελέτης. Στο τέλος υπάρχει περίληψη και η βιβλιογραφία. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον καθηγητή κ. Νικόλαο Γεωργιάδη, διευθυντή της Οφθαλμολογικής κλινικής του ΑΠΘ για την 12

13 ευκαιρία που μου έδωσε να εκπονήσω την παρούσα διατριβή καθώς και για την πολύτιμη καθοδήγησή του κατά τη διάρκεια των διαφόρων σταδίων της έρευνας. Ευχαριστώ θερμά τον καθηγητή κ. Δημήτριο Δερεκλή για την υποστήριξή του και τις υποδείξεις του που με βοήθησαν να κατανοήσω τη δράση των Laser στους οφθαλμικούς ιστούς και τα πιθανά αναμενόμενα αποτελέσματα. Τον κ. Νικόλαο Ζιάκα, Επίκουρο καθηγητή του ΑΠΘ ευχαριστώ θερμά για την υποστήριξή του και τη συμμετοχή του στο σχεδιασμό της μελέτης. Ευχαριστώ επίσης τη κ. Μπεττίνα Χάιδιτς λέκτορα του ΑΠΘ, βιοστατιστικό για την εκτέλεση της στατιστικής ανάλυσης της μελέτης και για τις πολύτιμες συμβουλές της. Ευχαριστώ την γραμματέα του τομέα αισθητηρίων οργάνων κ. Άγλα Χατζηκωνσταντίνου για τη βοήθειά της καθ όλη τη διαδικασία της μελέτης. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά μου για την κατανόηση, την υποστήριξη, σε κάθε δύσκολη στιγμή και την ενθάρυνση που μου έδωσε σε όλο το διάστημα της ενασχόλησής μου με τη παρούσα διατριβή, στοιχεία απαραίτητα για την ολοκλήρωσή της. 13

14 14

15 Ι. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 15

16 16

17 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΙΣΤΟΡΙΑ Το ανθρώπινο γένος, ανέκαθεν έψαχνε να βρει πιο είναι το πιο ζωτικό όργανο της ύπαρξης μας. Ο φιλόσοφος του 16 ου αιώνα Rene Descartes, για παράδειγμα, αποφάσισε ότι στην επίφυση ήταν η θέση της ψυχής, η ένωση μεταξύ σκέψης και σώματος. Έτσι και οι οφθαλμίατροι που ασχολούνται με τον κερατοειδή, θεωρούν ότι στο ενδοθήλιο βρίσκεται η ψυχή του κερατοειδούς, αφού είναι ο πιο ζωτικός ιστός για τη διατήρηση της διαφάνειας του κερατοειδούς. Δεν είχε ανιχνευθεί καν, μέχρι τα μέσα του 19 ου αιώνα. Τότε ήταν που ο William Bowman 7, εξέτασε προσεκτικά τη μικροσκοπική δομή του κερατοειδούς, και παρατήρησε ότι μια «ευαίσθητη και φθαρτή» στιβάδα καταλάμβανε την οπίσθια επιφάνεια. Αργότερα, στον ίδιο αιώνα, ο Theodor Leber προσάρμοσε κερατοειδείς στο τέλος ενός απλού υδραργυρικού μανόμετρου και έδειξε ότι οι κερατοειδείς που δεν είχαν ενδοθήλιο, υφίσταντο εξοίδηση καθώς η πίεση του μανόμετρου έσπρωχνε νερό μέσα σ αυτούς. Αλλά εκείνοι που διέθεταν ενδοθήλιο, παρέμεναν διαυγείς. Ο Alfred Vogt 8, ένας κορυφαίος παρατηρητής της βιομικροσκόπησης, όχι μόνο είδε το ζωντανό ενδοθηλιακό μωσαϊκό, αλλά και το ζωγράφισε με τόση ακρίβεια, προς όφελος όλης της οφθαλμολογίας. Ο John Harris ανακάλυψε ότι η ενδοθηλιακή λειτουργία εξαρτάται από ενεργείς μεταβολικές διαδικασίες, αφού το οίδημα του κερατοειδούς που είχε προκληθεί από ψύχος εξαφανιζόταν με την επαναθέρμανση. Ο David Maurice 9 χρησιμοποίησε κατοπτρικό μικροσκόπιο για να περιγράψει με λεπτομέρεια τις διαδικασίες που σχετίζονται με την μεταβολική αντλία. Ο Herbert Kaufman 10 έδειξε ότι τα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα δεν 17

18 μπορούν να αντισταθμίσουν τον κυτταρικό τους θάνατο με μίτωση, αλλά μόνο με μεγέθυνση, για να διατηρήσουν μια συνεχή, αδιάσπαστη μονοστιβάδα. Η φακοθρυψία και οι ενδοφθάλμιοι φακοί, έφεραν την ανάγκη για μελέτες στο ενδοθήλιο έξω από το εργαστήριο, στο ιατρείο, στο χειρουργείο, στην καθημερινή πρακτική, όπου οι οφθαλμίατροι κάνουν σημαντικές προσπάθειες να προστατέψουν το ενδοθήλιο από εργαλεία, μοσχεύματαπροθέσεις και φάρμακα που χρησιμοποιούν ενδοφθαλμίως. O Ronald Laing 11 προσάρμοσε το κατοπτρικό μικροσκόπιο στην κλινική πράξη, επιτρέποντας τη μελέτη και τις επιδράσεις των χειρουργικών τεχνικών στο ενδοθήλιο και τη μελέτη της μορφολογίας των διαφόρων ενδοθηλιακών διαταραχών. 18

19 ΑΝΑΤΟΜΙΑ - ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΚΕΡΑΤΟΕΙΔΟΥΣ Ο κερατοειδής αποτελεί το πρόσθιο 1/6 τμήμα του εξωτερικού χιτώνα του οφθαλμού. Ενώνεται με το σκληρό με μία μεταβατική ζώνη, το σκληροκερατοειδές όριο (ΣΚΟ). Η πρόσθια επιφάνειά του δεν είναι συμμετρικά καμπύλη, αλλά είναι περισσότερο επίπεδη στη ρινική πλευρά και ιδίως στο ανώτερο τμήμα παρά στο κατώτερο. Σύμφωνα με το σχηματικό μάτι του Gullstrand 12, ο κερατοειδής είναι υπεύθυνος για το 70% της διαθλαστικής ισχύος του οφθαλμού σε κατάσταση ηρεμίας. Μεταβάλλοντας κατά 10% την διαθλαστική ισχύ του, προκαλείται μεταβολή κατά 4,87 D στη διάθλαση του ασθενούς. Αυτός είναι και ο κυριότερος λόγος για τον οποίο οι τεχνικές διαθλαστικής χειρουργικής εφαρμόζονται στον κερατοειδή. Οι διαστάσεις του κερατοειδούς είναι: 12,6 mm οριζοντίως, και 11,7 mm καθέτως. Το πάχος του ποικίλει από 1mm στην περιφέρεια έως 0,5-0,7 mm στο κέντρο Μέση ακτίνα καμπυλότητας: 7,8 mm. Η οπίσθια επιφάνεια έχει ακτίνα καμπυλότητας: 6,8mm Σημαντικό ρόλο στη γενική υγεία και στιλπνότητα του κερατοειδούς, παίζει η προκεράτειος δακρυϊκή στιβάδα, η οποία απλώνεται με το μηχανισμό του βλεφαρισμού. Έτσι ανωμαλίες των βλεφάρων ή των μυών μπορούν να επηρεάσουν την κατάσταση της επιφάνειας του ματιού. Ο κερατοειδής αποτελείται από δύο τμήματα: Το στέλεχος του κερατοειδούς και το ΣΚΟ. Το στέλεχος αποτελείται από πέντε στιβάδες. 1. Επιθήλιο 2. Μεμβράνη του Bowman 19

20 3. Στρώμα 4. Μεμβράνη Descemet 5. Ενδοθήλιο Το επιθήλιο του κερατοειδούς είναι στρωματοποιημένο κυλινδρικό μη κερατινοποιημένο πάχους 50 μm (περίπου το 10% του συνολικού πάχους του κερατοειδούς. Ανανεώνεται κάθε 7 ημέρες και αποτελείται από 4-6 στιβάδες κυττάρων: τα βασικά, τα πτερυγοειδή πολυγωνικά και από επιφανειακά κύτταρα. Τα βασικά κύτταρα πρόσκεινται στη βασική μεμβράνη και διακρίνονται σε 3 στρώματα: επιπολής μέσο βασικό. Τα βασικά κύτταρα υφίστανται μίτωση και διαφοροποιούνται σε μέσα και επιπολής Αν και δεν έχουμε αποδείξεις για την ύπαρξη ειδικών στελεχιαίων κυττάρων του κερατοειδούς, μελέτες του επιθηλίου δείχνουν ότι το επιθήλιο του ΣΚΟ είναι σημαντικό για τη διατήρηση της κυτταρικής μάζας του επιθηλίου του κερατοειδούς υπό φυσιολογικές συνθήκες και παίζει σημαντικό ρόλο στην επούλωση των τραυμάτων του κερατικού επιθηλίου. Το επιθήλιο παίρνει οξυγόνο κυρίως από τα τριχοειδή του κερατοειδούς ή από το διαλυμένο στην προκεράτια δακρυική στιβάδα οξυγόνο. Η βασική μεμβράνη είναι ένα εξωκυττάριο σύμπλεγμα μακρομορίων. Τα πτερυγοειδή κύτταρα είναι διατεταγμένα σε 3 στρώματα με τα ανώτερα στρώματα να είναι αποπλατυσμένα. Τα επιφανειακά (επιπολής) κύτταρα δομούνται σε τρία στρώματα. 20

21 Είναι αποπεπλατυσμένα με πλατύ - στενό πυρήνα, που προβάλει εσωτερικά. Είναι συνδεδεμένα μεταξύ τους με γέφυρες. Τα κύτταρα της επιφάνειας είναι πλατύτερα από τα άλλα. Δεν υπάρχει κερατινοποίηση και η επιφάνειά τους είναι λεία και στιλπνή. Η στιβάδα του Bowman Είναι η επιπολής στιβάδα του στρώματος και αποτελεί υαλίνη μεμβράνη. Στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, εμφανίζεται σαν ένα λεπτό στρώμα ινιδίων κολλαγόνου χωρίς δομή. Έχει πάχος περίπου 13 μm. Παρέχει λεία στήριξη στα επιθηλιακά κύτταρα και δρα ως φραγμός για το υποκείμενο στρώμα. Μετά από βλάβη δεν αντικαθίσταται και επουλώνεται με ινώδη ιστό, σχηματίζοντας ουλή. Υπάρχουν λεπτά ανοίγματα για το πέρασμα των νεύρων του κερατοειδούς στο επιθήλιο. Η στιβάδα του Bowman ενώ πίστευαν ότι σταθεροποιούσε την καμπυλότητα του κερατοειδούς, πρόσφατες μελέτες των βιο-μηχανικών ιδιοτήτων του κερατοειδούς, με ή χωρίς την μεμβράνη, απέδειξαν ότι ίσως δεν παίζει σημαντικό ρόλο στην ακαμψία του κερατοειδούς 19. Στρώμα Το στρώμα αποτελεί το 90% του συνόλου του κερατοειδούς και δομείται από δύο στοιχεία: διάμεση ουσία και κύτταρα. Η διάμεση ουσία αποτελείται από πετάλια ινιδίων κολλαγόνου. Τα ινίδια είναι ομοιόμορφα σε μέγεθος και το καθένα εδράζεται σε έδαφος βλεννώδους υφής, η δε διάταξή τους είναι τέτοια, ώστε να παρεμποδίζεται η διάχυση του φωτός 20. Υπάρχουν κάποιες ελαστικές ίνες, ιδίως στα βαθύτερα στρώματα, ενώ μεταξύ των πεταλίων βρίσκονται δύο τύποι κυττάρων: τα κερατοκύτταρα και τα μεταναστευτικά. 21

22 Τα κερατοκύτταρα είναι κύτταρα συνεκτικού ιστού, διαφοροποιημένοι μεσεγχυματικοί ινοβλάστες και είναι υπεύθυνα για την παραγωγή των μακρομορίων της εξωκυττάριας ουσίας και ενζύμων. Έχουν συνεχή συνθετική δραστηριότητα και έτσι στηρίζουν την ακεραιότητα των εξωκυτταρικών ινιδίων και της εξωκυττάριας ουσίας. Η πυκνότητά τους είναι μεγαλύτερη στο πρόσθιο τμήμα και μειωμένη στο οπίσθιο. Τα μεταναστευτικά κύτταρα είναι άμορφα λεμφοκύτταρα. Η εξωκυττάρια ουσία αποτελείται από ένα οργανικό πλέγμα μακρομορίων (κολλαγόνο και πρωτεογλυκάνες). Η διάμεση στηρικτική ουσία του στρώματος του κερατοειδούς περιέχει πρωτεογλυκάνες (γλυκοπρωτεΐνες) και γλυκοζαμινογλυκάνες (Keratin sulfate proteoglycan [(KSPG0], χονδροϊτίνη και dermatan sulfate proteoglycan (decorin). H KSPG είναι πρωτεύουσα γλυκοζαμινογλυκάνη και παίζει σημαντικό ρόλο στην διατήρηση της διαφάνειας του κερατοειδούς. Το ενδοθήλιο Το ενδοθήλιο συνίσταται από μία μόνο στιβάδα ως πλακόστρωτο από πολυγωνικά κύτταρα με πέντε (5) ως 7 (επτά) πλευρές που βρίσκονται στην έσω επιφάνεια της δεσκεμετείου. Έχουν διάμετρο περίπου 20 μm και 250 μm 2 έκταση. Ο πληθυσμός τους είναι ομοιόμορφα κατανεμημένος και υπάρχει συμμετρία στα δύο μάτια ενός ατόμου. Στη γέννηση το ενδοθήλιο αποτελείται από περίπου έως κύτταρα (4.000 έως κύτταρα/mm 2 ) τοποθετημένα σε μια συνεχή μονο-στιβάδα 4 έως 6 μm πάχους. (εικ. 1)

23 Αν το δούμε από τον πρόσθιο θάλαμο με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης, το νεαρό ενδοθήλιο φαίνεται ως ένα αδιάσπαστο, ομοιόμορφο, σαν πλακόστρωτο μωσαϊκό από στενά παραταγμένα πολυγωνικά κύτταρα 22. Το κάθε ένα από αυτά τα κύτταρα έχει πέντε με επτά πλευρές, περίπου 20 μm διάμετρο και 250 μm 2 εμβαδόν, όπως έχει ήδη αναφερθεί. Τα κυτταρικά τους όρια σύνορα συμπλέκονται και υπερκαλύπτονται δημιουργώντας μια πτυχωτή εμφάνιση, ενώ οι πυρήνες προκαλούν χαμηλά, επίπεδα εξογκώματα και πινοκυτταρικά κυστίδια σαν μικρά εντυπώματα. Σε φυσιολογικά μάτια, τα ενδοθηλιακά κύτταρα είναι ομοιόμορφα κατανεμημένα στον κερατοειδή αν και σε μερικά μάτια μπορεί να φανεί μια μεγαλύτερη πυκνότητα στη περιφέρεια. Στην περιφέρεια του κερατοειδούς, τα ενδοθηλιακά κύτταρα γίνονται βαθμιαία πιο ανώμαλα, και έχουν περισσότερες πτυχές, καθώς τελικά συγχωνεύονται με το ενδοθήλιο από το διηθητικό ηθμό της γωνίας (trabeculum). Το φυσιολογικό ενδοθηλιακό κύτταρο είναι κυβοειδές σε εγκάρσια τομή, περιέχει ένα μεγάλο επιμήκη πυρήνα και διαθέτει τα χαρακτηριστικά οργανίδια των κυττάρων που σχετίζονται με ενεργή μεταφορά και πρωτεϊνική σύνθεση και έκκριση. (Εικόνα 3) Η πλασματική μεμβράνη του κυττάρου είναι μια τυπική μεμβράνη με πολλά πινοκυτοτικά κυστίδια στην πρόσθια και στην οπίσθια επιφάνεια σαν ένδειξη της μεταφορικής και εκκριτικής λειτουργίας που επιτελεί. Πρόσφατη είναι η κατανόηση της δομής της μεμβράνης όπου υποστηρίζεται το μοντέλο του υγρού-μωσαϊκού στο οποίο η λιπιδική διπλοστιβάδα περιέχει πρωτεϊνικά μακρομόρια σφηνωμένα σαν παγόβουνα και ελεύθερα να κινούνται πλαγίως μέσα στη μεμβράνη. 23

24 Τέτοιες πρωτεΐνες ίσως να φέρουν υποδοχείς για φάρμακα ή ορμόνες, αντιγονικές θέσεις (όπως η HLA) και ένζυμα για ενεργή μεταφορά. Η οπίσθια κυτταροπλασματική επιφάνεια σχηματίζει 20 έως 30 μικρολάχνες ανά κύτταρο. Το ενδοθηλιακό κύτταρο κατέχει οργανίλια σχεδιασμένα προορισμένα για πρωτεϊνική σύνθεση: το πυρηνικό DNA, το σκληρό και λείο ενδοπλασματικό δίκτυο με τα ριβοσώματα τους και RNA και μια συσκευή Golgi με τις δεξαμενές και τα κυστίδια της. Τρεις κύριοι τύποι πρωτεϊνών ανευρίσκονται και παράγονται : ένζυμα, δομικές πρωτεΐνες και εκείνες που συντελούν στην παραγωγή εξωκυττάριας ουσίας μεμβράνη του Descemet. Η μεμβράνη του Descemet είναι η φυσιολογική βασική μεμβράνη του ενδοθηλίου του κερατοειδούς τοποθετημένη ανάμεσα στο στρώμα και το ενδοθήλιο. Αποτελείται από κολλαγόνο, κυρίαρχου τύπου IV και γλυκοπρωτεϊνες. Ο μηχανισμός με τον οποίο τα ενδοθήλια κύτταρα προσκολλώνται στην μεμβράνη του Descemet δεν είναι ξεκάθαρα γνωστός, αλλά η φιμπρονεκτίνη, μια επιφανειακή πρωτεΐνη ίσως παίζει ρόλο στη διατήρηση του ενδοθηλίου ως ομοιόμορφη μονοστιβάδα. Το αν η γλυκοπρωτεϊνη λαμινίνη είναι παρούσα στην μεμβράνη του Descemet, είναι άγνωστο. Μετά τη γέννηση, τα ενδοθηλιακά κύτταρα εκκρίνουν ένα δεύτερο σχηματισμό της μεμβράνης του Descemet στην οπίσθια επιφάνεια του εμβρυικού δεσμιδωτού τμήματος. Η οπίσθια αυτή μη δεσμιδωτή στιβάδα εμφανίζεται μικροσκοπικά ομοιογενής, με λεπτή κοκκώδη υφή, που παχύνεται με την πρόοδο της ηλικίας και το πάχος αυξάνεται από τα 2 μm που είναι στην ηλικία των 10, στα 10 μm που φτάνει στην ηλικία των 80. Το γιατί το σχέδιο της έκκρισης της Δεσκεμετείου μεμβράνης αλλάζει, δεν έχει εξηγηθεί. Παρ όλα αυτά, το πρόσθιο δεσμιδωτό τμήμα παραμένει σταθερό 24

25 σε πάχος και άσχετο με την πρόοδο της ηλικίας, ενώ η πρόσθετη βασική μεμβράνη και το κολλαγωνώδες υλικό που εκκρίνεται, αποτελούν ένα «αρχαιολογικό αρχείο» της ζωής του ενδοθηλιακού κυττάρου, το οποίο μπορεί να μελετηθεί μικροσκοπικά. Εικόνα 1. Ενδοθηλιακή στοιβάδα 25

26 Εικόνα 2. Η εικόνα 2 δείχνει πώς η πυκνότητα των κυττάρων μεταβάλλεται με την ηλικία 23 Εικόνα 3. 26

27 Καθώς τα κύτταρα γερνάνε, μερικά πεθαίνουν. Το ενθοθήλιο των ενηλίκων έχει περιορισμένη ικανότητα να διαιρείται και να αντικαθιστά τα γερασμένα ή τα τραυματισμένα ενδοθηλιακά κύτταρα. Αντί γι αυτό, το ενδοθήλιο έχει μία εξαιρετική ικανότητα να μεγενθύνει, να ξαναοργανώνει, να μεταναστεύει τα κύτταρά του ώστε να διατηρείται σφιχτή παράθεση γειτονικών κυττάρων και έτσι συνεχή μονοστιβάδα που ρυθμίζει την είσοδο του υδατοειδούς υγρού μέσα στο στρώμα. (εικ.4 ) Εικόνα 4. Τα κύτταρα που περιβάλλουν ένα έλλειμμα μεγεθύνονται και απλώνουν για να το «γεμίσουν» και να αποκαταστήσουν την ενδοθηλιακή μονοστιβάδα. Ως αποτέλεσμα, το μέσο κυτταρικό μέγεθος γίνεται μεγαλύτερο σε περιοχές τραύματος. Έτσι όμως, άλλα κύτταρα μεγαλώνουν σε απάντηση στην ηλικία ή σε ασθένεια, ενώ άλλα παραμένουν στο ίδιο 27

28 μέγεθος και έτσι η αρχική ομοιογένεια του πληθυσμού σταδιακά γίνεται ετερογένεια. Ανάμεσα στις ηλικίες από τα 5 έως τα 80 έτη η πυκνότητα των κυττάρων μεταβάλλεται από τα στα 900 κύτταρα/mm 2. (εικ 5 και 6 ) 29 Εικόνα 5. και 6. Για να περιγραφεί με ακρίβεια η φυσιολογική γήρανση ή η απάντηση του ενδοθηλίου σε ασθένεια ή τραύμα, πρέπει να λάβουμε υπ όψιν μας 3 μεταβλητές. 1) Το μέγεθος του κυττάρου, με τον όρο της κυτταρικής πυκνότητας 2) Την έκταση του κυτταρικού μεγέθους, με τον όρο της σταθερής απόκλισης ή του συντελεστή μεταβλητότητας. 3) Την ετερογένεια ή ασυμμετρία του πληθυσμού, με τους όρους του συντελεστή «λοξότητας» ή εξαγωνικότητας. 28

29 Καθώς όμως ο πληθυσμός των κυττάρων διαφέρει σε αριθμό από άτομο σε άτομο κατά τη γέννηση, γερνάει με διαφορετικούς ρυθμούς και επηρεάζεται από ασθένειες ή τραύμα, δεν μπορεί κάποιος να δει μια φωτογραφία ενδοθηλίου και με ακρίβεια να προσδιορίσει την ηλικία του ατόμου. Παρομοίως, αν και οι περισσότεροι χειρουργοί μεταμόσχευσης κερατοειδούς προτιμούν μόσχευμα από νεαρό δότη, καμία μελέτη δεν έχει αποδείξει τη συσχέτιση ανάμεσα στην ηλικία του δότη και την διαύγεια του μοσχεύματος. Όμως, νεαρά ενδοθηλιακά κύτταρα έχουν μεγαλύτερη λειτουργική ικανότητα να αναρρώνουν. Εικόνα 7. και 8. 29

30 Ο όρος πολυμεγενθυσμός περιγράφει την ετερογένεια στο μέγεθος των κυττάρων ενώ ο πλεομορφισμός την ετερογένεια στο σχήμα. Και τα δύο αυξάνουν με την ηλικία ασθένεια και τραύμα. (εικόνα 7 και 8) Η ενδοθηλιακή κυτταρική πυκνότητα, μέχρι ενός ορίου, δεν σχετίζεται με την ενδοθηλιακή λειτουργία. Καθώς τα κύτταρα μεγεθύνονται διατηρούν τη λειτουργική τους ικανότητα, που κρατά τον κερατοειδή διαυγή. Όταν όμως η πυκνότητα, πέσει κάτω από cells/mm 2 οι λειτουργικές εφεδρείες είναι ελάχιστες και το οίδημα του κερατοειδούς πιθανώς θα εμφανιστεί 34. Το ενδοθήλιο διαβητικών ασθενών 35 και χρηστών φακών επαφής 36 μπορεί να εμφανίσει πολυμεγενθυσμό, και η απάντηση ενός τέτοιου ενδοθηλίου σε τραύμα ή ενδοφθάλμια εγχείρηση πρέπει να μας προβληματίσει. Μεμβράνη του Descemet Η δεσκεμέτειος μεμβράνη είναι ομοιογενής μεμβράνη πάχους περίπου 10 μm που βρίσκεται μεταξύ στρώματος και ενδοθηλίου. Είναι το προϊόν έκκρισης των ενδοθηλιακών κυττάρων. Είναι ελαφρώς παχύτερη στην περιφέρεια παρά στο κέντρο, και βαθμιαία αυξάνεται σε πάχος κατά τη διάρκεια της ζωής. Η δομή της αποτελείται από κανονικά διατεταγμένες δικτυωτές ίνες. Η σύνθεσή της είναι από κολλαγόνο τύπου IV με υψηλό περιεχόμενο γλυκίνης, υδροξυγλυκίνης και υδροξυπρολίνης και γλυκοπρωτεΐνες συμπεριλαμβανομένης και της φιμπρονεκτίνης (Fibronectin). Η φιμπρονεκτίνη πιθανώς παίζει ρόλο στην διατήρηση του ενδοθηλίου σε μια 30

31 ομοιόμορφη μονο-στιβάδα και στην προσκόλλησή του στην Δεσκεμέτειο. Το κολλαγόνο της Δεσκεμετίου είναι μη διαλυτό και πιο ανθεκτικό απ αυτό του στρώματος. Η Δεσκεμέτειος μεμβράνη αποτελείται από ασύνηθες κολλαγόνο, με υψηλό περιεχόμενο υδατανθράκων, υψηλό βαθμό ελαστικότητας και άμορφη εμφάνιση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Λειτουργεί σαν φραγμός στη διάτρηση σε περίπτωση βαθέων ελκών του κερατοειδούς. Το περιφερικό όριό της ορατό στην γωνιοσκοπία, είναι γνωστό σαν γραμμή του Schwalbe. Η φυσιολογική Δεσκεμέτειος έχει δύο μορφολογικά τμήματα που φαίνονται με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο: 1) ένα πρόσθιο τμήμα που εκκρίνεται στη μήτρα, πάχους 3 μm και 2) ένα οπίσθιο ομοιογενές τμήμα που παχύνεται με την ηλικία και γίνεται 10-12μm στις επόμενες δεκαετίες της ζωής. Εκτός από την ομοιόμορφη πάχυνση, σχετιζόμενα με την ηλικία είναι τα εστιακά οζίδια που ονομάζονται Ηassal Henle σωμάτια και αναπτύσσονται κοντά στο περιφερικό όριο της Δεσκεμετείου μεμβράνης. Όταν εμφανιστούν ανάλογα οζίδια στον κεντρικό κερατοειδή, ονομάζονται guttata και σχετίζονται πιο συχνά με τη δυστροφία του Fuchs. Η Δεσκεμέτειος λοιπόν, αποτελεί μία «σκαλωσιά» πάνω στην οποία απλώνονται τα ενδοθηλιακά κύτταρα και ένα φραγμό στην είσοδο λευκοκυττάρων και αιμοφόρων αγγείων στο στρώμα, αλλά δεν λειτουργεί ως φραγμός στην είσοδο νερού και μικρών μορίων. Όταν η μεμβράνη σπάσει, είτε στο χειρουργείο είτε στα πλαίσια κάποιας νόσου (οξύς ύδρωπας στον κερατόκωνο), συστέλλεται και 31

32 ελλίσσεται προς το στρώμα σαν ελατήριο. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα τότε μεταναστεύουν γύρω από τη διάνοιξη και εκκρίνουν νέα βασική μεμβράνη, σαν μια μη ειδική απάντηση όπου το σκληρό ενδοπλασματικό δίκτυο και η συσκευή του Golgi, παίζουν ρόλο. Συνήθως, η ουσία που παράγεται είναι ανώμαλος κολλαγονώδης ιστός που συσσωρεύεται πίσω από τη φυσιολογική προϋπάρχουσα μεμβράνη του Descemet. Ονομάζεται «οπισθοκερατοειδική ινώδης μεμβράνη» και «παχυμένη» Δεσκεμέτειος, και αποτελεί σαφή παθολογική ή εκφυλιστική οντότητα. Κλινικά, αυτός ο ανώμαλος ιστός, εμφανίζεται ως ένα γκρι λεπτό στρώμα πίσω από τον κερατοειδή αλλά μπορεί να πάρει και ξεχωριστή μορφή, όπως κερατοειδική «guttata και οπίσθιες κερατοειδικές πτυχές. Η συσσώρευση της οπίσθιας κολαγονώδους στιβάδας αποτελεί ενδοθηλιακή απάντηση σε τραυματικά περιστατικά και μπορεί να θεωρηθεί σαν ιστορική καταγραφή της ζωής των ενδοθηλιακών κυττάρων και να μελετηθεί με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. 32

33 ΔΙΑΤΗΡΗΣΗ ΤΗΣ ΚΕΡΑΤΟΕΙΔΙΚΗΣ ΔΙΑΥΓΕΙΑΣ Το στρώμα του κερατοειδούς φυσιολογικά απορροφά νερό με την επίδραση δύο δυνάμεων: 1) Οι γλυκοζαμινογλυκάνες (GAGs) αναπτύσσουν οσμωτική πίεση περίπου 60 mmhg που τραβά νερό μέσα στο στρώμα. 37 2) Η ΕΟΠ σπρώχνει το υδατοειδές υγρό μέσα στο στρώμα. Το ενδοθήλιο αντιδρά σ αυτή την υδροφιλική τάση και διατηρεί την διαφάνεια του κερατοειδούς με δύο τρόπους: A. Η λειτουργία του φραγμού μειώνει τη ροή του νερού προς το στρώμα. B. Η μεταβολική αντλία μεταφέρει ιόντα από το στρώμα προς το υδατοειδές υγρό και το νερό ακολουθεί αυτή την πορεία με διάχυση. (εικόνα 9) ΣΤΡΩΜΑ ΥΔΑΤΟΕΙΔΕΣ ΥΔΡΟΣΤΑΤΙΚΗ ΔΥΝΑΜΗ 33

34 Εικόνα 9: Η μετακίνηση ιόντων Να + είναι η κύρια δύναμη που οσμωτικά διατηρεί το κερατοειδικό στρώμα σε κατάσταση αφυδάτωσης με 78% νερό. Από Stiemke MM, Roman RJ, Palmer ML, et al: Sodium activity in the aqeous humor and corneal stroma of the rabbit. Exp. Eye Res SS:425, 1972 Δηλαδή, η λειτουργία της αντλίας, οσμωτικά τραβά το νερό έξω από το στρώμα. Ο ενδοθηλιακός φραγμός είναι «διαρρέων» αλλά ο ρυθμός διαρροής φυσιολογικά ισούται με το ρυθμό της μεταβολικά ενεργούς αντλίας- μεταβολικής άντλησης, έτσι ώστε το ενδοθήλιο να διατηρεί την αναλογία του στρωματικού νερού στο 78% και ένα μέσο πάχος κερατοειδούς στο 0,52 mm ± 0,002mm. Όταν η ενδοθηλιακή λειτουργία καταργείται, το νερό διαχέεται μέσα στο στρώμα, διακόπτει την κανονική δομή των κολλαγόνων ινιδίων με αποτέλεσμα το προσπίπτων φως να διαχέεται και ο κερατοειδής να θολώνει. Το νερό επίσης μπορεί να περάσει στο στρώμα και εκεί να συσσωρευθεί σε μικροκύστεις και φυσαλίδες, κάτω και μέσα στο επίθήλιο, το οποίο σχηματίζει έναν ουσιαστικά αδιαπέραστο φραγμό με τις ζωνοειδείς ενώσεις του. Η ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΟΥ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΟΥ ΦΡΑΓΜΟΥ Τα ενδοθηλιακά κύτταρα εφάπτονται μεταξύ τους με πολύπλοκες συνδέσεις. Είναι προσκολλημένα το ένα με το άλλο με ασυνεχείς σφιχτές συνδέσεις, οι οποίες είναι τοποθετημένες στο κορυφαίο τμήμα των 34

35 πλευρικών κυτταροπλασματικών μεμβρανών 38, και με θυριδωτές συνδέσεις οι οποίες επιτρέπουν στα κύτταρα να είναι πλευρικά συνδεδεμένα. Οι σφιχτές συνδέσεις δεν αποτελούν απόλυτο φραγμό στην είσοδο μικρών μορίων και νερού αλλά αποκλείουν την μαζική ροή υγρού ανάμεσα στο υδατοειδές και στο στρώμα. Ο συνηθισμένος διακυτταρικός χώρος των 25 με 40 nm, που υπάρχει ανάμεσα στα ενδοθηλιακά κύτταρα, στενεύει και φτάνει περίπου τα 3 nm στις περιοχές των ενωτικών συμπλεγμάτων, στα όρια των κυττάρων. Καθώς οι ενδοθηλιακές συνδέσεις δημιουργούνται κατά την ανάπτυξη του ενδοθηλίου, η διαπερατότητα μειώνεται και ο αριθμός των θέσεων της αντλίας Na + /K + -ATPάση αυξάνεται. Χωρίς τη δημιουργία των ενδοθηλιακών συνδέσεων δεν υπάρχει λειτουργία της αντλίας και αυτό γιατί ένας από τους ρόλους των σφιχτών συνδέσεων είναι να κρατάνε την Na + /K + - ATPάση τοποθετημένη στις πλευρικές κυτταρικές μεμβράνες ΡΥΘΜΟΣ ΔΙΑΡΡΟΗΣ= ΡΥΘΜΟ ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΗΣ ΑΝΤΛΙΑΣ (1)78% Η 2 Ο (2) ΔΙΑΤΗΡΗΣΗ ΚΕΡΑΤΟΕΙΔΙΚΟΥ ΠΑΧΟΥΣ (ΔΙΑΡΡΕΩΝ) ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΗ ΦΡΑΓΜΟΣ ΑΝΤΛΙΑ Εικόνα 10.Δύο ενδοθηλιακές λειτουργίες κρατούν τον κερατοειδή αφυδατωμένο 1. ο φραγμός και 2. η μεταβολική αντλία 35

36 Πολλοί παράγοντες επηρεάζουν την λειτουργία του φραγμού. Η ακεραιότητα των διακυτταρικών συνδέσεων εξαρτάται από το ασβέστιο ενώ διαλύματα χωρίς ασβέστιο μειώνουν τη λειτουργία του φραγμού, με αποτέλεσμα την αύξηση του στρωματικού οιδήματος 41. Η ενδοκυτταρική γλουταθειόνη επίσης, βοηθά στη διατήρηση ακέραιων συνδέσεων και οξείδωση αυτής της ουσίας οδηγεί στην αύξηση του στρωματικού πάχους 42. Φάρμακα και διαλύματα πλύσης μπορούν να βλάψουν την λειτουργία του φραγμού, ενώ παράγοντες με ph έξω από τα ανεκτά όρια 6,8 έως 7,8 μπορούν να βλάψουν τις ενδοθηλιακές πλασματικές μεμβράνες μέσα σε λίγα λεπτά. Έτσι λοιπόν, όσα διαλύματα και φάρμακα που χρησιμοποιούνται ενδοφθαλμίως και έχουν ph πέρα από τα παραπάνω όρια, αλλάζουν τη λειτουργία του ενδοθηλιακού φραγμού γιατί καταστρέφουν την εξωτερική πλασματική μεμβράνη. 36

37 Εικόνα 11. Η διαβάθμιση των ιόντων Να+ εκατέρωθεν του ενδοθηλίου όταν έχουν χαθεί ενδοθηλιακά κύτταρα. Η λειτουργία του φραγμού έχει χαθεί. Συντηρητικά που χρησιμοποιούνται ως αντιμικροβιακά (π.χ. θειομερσάλη και χλωριούχο βενζαλκόνιο) και το θειώδες νάτριο που λειτουργεί ως αντιοξειδωτικό σε διαλύματα επινεφρίνης, σε μεγάλες συγκεντρώσεις, καταστρέφουν τον ενδοθηλιακό φραγμό 43. Οι αρχικές μελέτες αυτών των διακυτταρικών ενώσεων τις χαρακτηρίζουν ως τελικούς φραγμούς ή ζωνοειδείς αποφράξεις, μετέπειτα όμως μελέτες με μοριακά ίχνη όπως το κόκκινο του ρουθενίου και ιστολογικές τεχνικές, έχουν αναμφίβολα δείξει ότι σε διάφορα είδη αυτές οι ενώσεις δεν επεκτείνονται γύρω από τα κύτταρα, όπως συμβαίνει στις ζωνοειδείς αποφράξεις που εκεί σχηματίζουν χαρακτηριστική συνεχή ζώνη. Αντίθετα, αυτές συμπεριλαμβάνουν και εστιακές ενώσεις και ενώσεις διαστήματα - κενού με μεσοδιαστήματα 3nm, όπου καμία από τις δυο δεν αποτελεί φραγμό στη διείσδυση μικρών μορίων από τον πρόσθιο θάλαμο στα μεσοκυττάρια διαστήματα του κερατοειδούς. Η ακεραιότητα αυτών των ενώσεων, εξαρτάται από το ασβέστιο, δεν αποτελούν υδατοσταγή φραγμό, και ο ενδοθηλιακός φραγμός επιτρέπει τη διαρροή, όπως φαίνεται από την ικανότητα των ουσιών να κυκλοφορούν κατά μήκος των ενωτικών συμπλεγμάτων ανάμεσα στα κύτταρα και μέσα στο στρώμα. Τέτοια μόρια μπορούν επίσης να περάσουν γύρω από τις ενώσεις με ενδοθηλιακή πινοκίττωση. Αρκετοί μεταβολίτες επηρεάζουν τη λειτουργία του φραγμού. Διαλύματα χωρίς ασβέστιο βλάπτουν τις ενώσεις ανάμεσα στα ενδοθηλιακά κύτταρα και μειώνουν τη λειτουργία του φραγμού. Ανθρώπινοι κερατοειδείς 37

38 που το ενδοθήλιο τους έχει διαχυθεί με plasmalyte 148, το οποίο στερείται ασβεστίου, επίσης προκαλεί καταστροφή των ενώσεων. Οξείδωση της διακυτταρικής γλουταθειόνης με διαμίδη διακόπτει τον ενδοθηλιακό φραγμό, οδηγώντας σε εκτεταμένη πάχυνση του κερατοειδούς. Τα συντηρητικά, επίσης αλλοιώνουν τη λειτουργία του φραγμού του ενδοθηλίου του κερατοειδούς. Για παράδειγμα, το sodium bisulfite (το αντιοξειδωτικό για την επινεφρίνη), η Thimerosal και το χλωριούχο βενζαλκόνιο θα οδηγήσουν σε κατάρρευση της λειτουργίας του φραγμού και οίδημα του κερατοειδούς, αν έρθουν σε άμεση επαφή με το ενδοθήλιο του κερατοειδούς. Οποιαδήποτε από αυτές τις ουσίες που βλάπτουν τη λειτουργία του φραγμού, επιτρέπει το ρυθμό διαρροής να υπερβεί το ρυθμό της μεταβολικής αντλίας και έτσι οδηγεί σε στρωματικό οίδημα

39 Η ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΗΣ ΑΝΤΛΙΑΣ ΤΟΥ ΕΝΔΟΘΗΛΙΟΥ Μια πρώτη μαρτυρία, που αποδεικνύει ότι μια μεταβολικά ενεργή αντλία είναι υπεύθυνη για τη διατήρηση της διαφάνειας του κερατοειδή, ήταν η παρατήρηση των Harris και Nordquist 44. Σύμφωνα με αυτή, η μεταβολικά ενεργή αντλία του κερατοειδούς, είναι εξαρτημένη από την θερμοκρασία. Η μείωση της θερμοκρασίας αναστέλλει τον μεταβολισμό του ενδοθηλίου και οδηγεί σε οίδημα του στρώματος, ενώ επαναφορά της θερμοκρασίας σε φυσιολογικά επίπεδα, μειώνει το οίδημα 45. Η ενδοθηλιακή αντλία αποτελείται από ένζυμα στην πλευρική πλασματική μεμβράνη που καταλύουν την κίνηση των ιόντων από το στρώμα προς το υδατοειδές υγρό, δημιουργώντας μια οσμωτική διαφορά που «τραβά» το νερό έξω από το στρώμα. Πολλά μιτοχόνδρια υπάρχουν στο κυτταρόπλασμα για να μεταβολίζουν τη γλυκόζη και να παρέχουν το απαραίτητο ATP για τη διατήρηση της λειτουργίας της αντλίας. Η ενεργής μεταφορά των δικαρβονικών ιόντων προς το υδατοειδές υγρό είναι συνεχής καθώς αποτελεί την κύρια λειτουργία της ενδοθηλιακής αντλίας, αν και η ενεργή μεταφορά του Νατρίου και του Καλίου παίζουν επίσης ένα ρόλο. Έτσι λοιπόν, καθώς υπάρχει ηλεκτρικό δυναμικό κατά μήκος του ενδοθηλίου στο οποίο, η πλευρά προς τα ανιόντα των - δικαρβονικών HCO 3 περισσότερο, παρά τα κατιόντα Na + και Κ +, είναι υπεύθυνα για την μεταφορά του υγρού διαμέσου του ενδοθηλίου. Η μεταφορά των ιόντων πιθανόν εξαρτάται από την ΑΡΤάση. Τα δικαρβονικά προέρχονται από το υδατοειδές υγρό και από την αναγωγή των CO 2 και H 2 O από την ενδοθηλιακή καρβονική ανυδράση. 39

40 Η λειτουργία της αντλίας μπορεί να επηρεαστεί από πολλούς μεταβολίτες. Αναστολή της ΑΤΡάσης με ουαβαΐνη θα προκαλέσει οίδημα στον κερατοειδή με ένα ρυθμό 33μm/hr. Η αντλία επίσης μπορεί να ανασταλεί με διαλύματα χωρίς δικαρβονικά ιόντα, οδηγώντας σε οίδημα με ρυθμό 38μm/hr. Ακόμα, αν η καρβονική ανυδράση, μέσα στα ενδοθηλιακά κύτταρα ανασταλεί με bromacetazolamide, έχουμε ένα ρυθμό οιδήματος 15μm/hr. Όταν η λειτουργία της αντλίας μειωθεί προκαλείται στρωματικό οίδημα, αλλά καθώς η λειτουργία του φραγμού είναι ανέπαφη, ο ρυθμός οιδήματος που προκύπτει από την διακοπή της λειτουργίας του φραγμού( πχ από ασβέστιο-free) θα είναι υψηλός ως 127μm/hr 46. Κύρια απόδειξη του ότι ενεργής μεταβολική αντλία παίζει ρόλο στην διατήρηση της διαφάνειας του κερατοειδούς, είναι η εξάρτηση της από τη θερμοκρασία. Η πτώση της θερμοκρασίας αναστέλλει την ενδοθηλιακή μεταβολική αντλία και δημιουργεί οίδημα στο στρώμα. Η επαναφορά της σε φυσιολογικές τιμές οδηγεί σε διαύγεια του κερατοειδούς. Όπως έχει αναφερθεί, η ενδοθηλιακή αντλία αποτελείται από ένζυμα που είναι τοποθετημένα στις πλευρικές κυτταροπλασματικές μεμβράνες και καταλύουν την κίνηση των ιόντων από το στρώμα προς το υδατοειδές υγρό δημιουργώντας διαφορά οσμωτικής πίεσης που οδηγεί το νερό έξω από το στρώμα. Αυτά τα ένζυμα εξαρτώνται από την τριφοσφωρική αδενοσίνη (ΑΤΡ). Αυτό το ΑΤΡ προέρχεται από τα πολλά μιτοχόνδρια του κυτταροπλάσματος που μεταβολίζουν τη γλυκόζη και αερόβια και αναερόβια. 40

41 ΑΝΤΛΙΑΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΗΣ ΣΤΡΩΜΑ ΕΝΔΟ ΕΠΙ ΦΡΑΓΜΟΣ ΑΝΤΛΙΑ αριθμός κυττάρων (1) Αναστολή της Να Κ ΑΤΡάσης με ουαβαϊνη (2) μειωμένη θερμοκρασία (3) Έλλειψη ιόντων ΗCO3 ή αναστολή της καρβονικής ανύδρασης (4) Ικανότητα της αντλίας: Ασθένειες Κερατοπλαστική Μειωμένος - Εικόνα 12. Παράγοντες που επηρεάζουν τη λειτουργία της αντλίας ενδοθηλίου. Η ΑΤΡ επίσης καταλύει την μεταφορά διττανθρακικών ιόντων προς το υδατοειδές υγρό. Επιπλέον η ΑΤΡάση θεωρείται ότι είναι ένας παράγοντας της ενδοθηλιακής αντλίας Νa αν και η ενεργής μεταφορά των ιόντων Na + και Κ + παίζουν το μεγαλύτερο ρόλο. Διττανθρακικά μπορούν επίσης να διαχυθούν λόγω διαφοράς συγκέντρωσής τους, από το ενδοθηλιακό κύτταρο προς το υδατοειδές, όταν δημιουργηθούν από διοξείδιο του άνθρακα και νερό με την καταλυτική δράση της καρβονικής ανυδράσης μέσα στο ενδοθηλιακό κύτταρο. Νάτριο και διττανθρακικά διαχέονται μαζί έξω από το κύτταρο. 41

42 Πολλοί παράγοντες μπορούν να επηρεάσουν την λειτουργία της αντλίας. (εικ. 12 ). Αναστολή της ΑΤΡάσης με ουαβαΐνη παράγει οίδημα στον κερατοειδή. Διαλύματα χωρίς διττανθρακικά ή αναστολή της ενδοθηλιακής ΑΤΡάσης από το εικοσανοειδές 12(R)HETE που παράγεται από τη διάσπαση του αραχιδονικού οξέος στο επιθήλιο του κερατοειδούς (από χρήση φακών επαφής), επίσης, δημουργεί κερατοειδικό οίδημα. Η πτώση της θερμοκρασίας και η ενδοφθάλμια φλεγμονή μειώνει τη λειτουργία του φραγμού και της αντλίας, αν και η διάσπαση του φραγμού οδηγεί σε ταχύτερο και μεγαλύτερου βαθμού οίδημα, απ ό,τι η διάσπαση της λειτουργίας της αντλίας 47. Ενδοφθάλμια πίεση και ενδοθήλιο Αν το ενδοθήλιο, λειτουργεί φυσιολογικά, η αυξημένη ΕΟΠ αρχικά μπορεί να συμπιέσει το στρώμα. Για παράδειγμα, αν η διαμπερής κερατοπλαστική είναι εξαιρετικά τεταμένη την πρώτη μετεγχειρητική μέρα, ο χειρουργός πρέπει να υποψιαστεί αυξημένη ΕΟΠ. Αν η ενδοθηλιακή λειτουργία είναι οριακή, αυτή η ΕΟΠ είναι πολύ πιθανό να οδηγήσει υγρό μέσα από το ενδοθήλιο και να δημιουργήσει επιθηλιακό οίδημα, όπως στο οξύ γλαύκωμα στενής γωνίας. Αν η λειτουργία του ενδοθηλίου είναι φτωχή η αυξημένη ΕΟΠ θα δημιουργήσει και στρωματικό και επιθηλιακό οίδημα. Μία χαμηλή ΕΟΠ συχνά συνοδεύεται από παχύ οιδηματώδη κερατοειδή, χωρίς επιθηλιακό οίδημα εξαιτίας της απώλειας του συμπιεστικού αποτελέσματος. 42

43 ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΙΜΕΣ Τα κερατοειδικά ενδοθηλιακά κύτταρα έχουν εύρος ανεκτικότητας σε ph μεταξύ 6,8 και 7,8 48 ενώ η οσμωτική πίεση που ανέχονται βρίσκεται μεταξύ 260 και 350 Οsm 49, δεδομένου ότι τα βασικά ιόντα, νατρίου, καλίου ασβεστίου, μαγνησίου, χλωρίου και διττανθακικών, είναι παρόντα. 43

44 ΕΝΔΟΘΗΛΙΟΣΚΟΠΗΣΗ Το ενδοθηλιοσκόπιο (corneal specular microscope) είναι ένα μικροσκόπιο ανακλώμενου φωτός. Προβάλλει φως μέσα στον κερατοειδή και χρησιμοποιεί το ανακλώμενο φως από μια οπτική ενδοεπιφάνεια του ιστού ή από οπτικά ξεχωριστές δομές μέσα στον ιστό και έτσι σχηματίζει εικόνα διαφορετικά από ότι το συμβατικό βιολογικό μικροσκόπιο (standard bright field) που χρησιμοποιεί τη μετάδοση του φωτός διαμέσου του ιστού. Ανάλογα με τον τύπο του οργάνου,το προβαλλόμενο φως μπορεί να είναι μια σταθερή δέσμη φωτός ή κινούμενη δέσμη ή μια κινούμενη φωτεινή κηλίδα (spot). Τα διαθέσιμα μηχανήματα χρησιμοποιούνται κυρίως για τη μελέτη του ενδοθηλίου του κερατοειδούς, αν και άλλες δομές όπως το επιθήλιο του κερατοειδούς το στρώμα και πρόσθια και οπίσθια επιφάνεια του κρυσταλλοειδούς φακού, μπορούν επίσης να μελετηθούν. Το 1968 ο Maurice 50 χρησιμοποιώντας ένα επί φωτιζόμενο μικροσκόπιο, εστίασε μια δέσμη φωτός πάνω στην οπίσθια επιφάνεια του κερατοειδούς (μάτι εξορυγμένο κουνελιού) και έτσι δημοσίευσε ενδοθηλιακές φωτογραφίες. Εξαιτίας της κατοπτρικής εικόνας του ενδοθηλίου που φωτογράφισε, ονόμασε το εργαλείο specular microscope. 44

45 Εικόνα 13. Το πρώτο εργαστηριακό κατοπτρικό μικροσκόπιο Οι Hoefle και συνεργάτες 51 έδειξαν την μεγάλη χρησιμότητα του εργαλείου του Maurice στην εκτίμηση του ενδοθηλίου του κερατοειδούς άθικτων ανθρώπινων ματιών όταν αυτά προορίζονται ως δότες ολικού πάχους για κερατοπλαστική. Οι ίδιοι ερευνητές επίσης έδειξαν ότι το μηχάνημα μπορεί να προσδιορίσει το πάχος του κερατοειδούς μετρώντας την απόσταση που διασχίζεται από το φως και προσλαμβάνεται από τον αντικειμενικό φακό του μικροσκοπίου μετά από διαδοχικές εστιάσεις στην πρόσθια και οπίσθια επιφάνεια του κερατοειδούς. Οι Laing 52 και συνεργάτες τροποποίησαν το μηχάνημα του Maurice και παρήγαγαν φωτομικρογραφίες ικανής ανάλυσης, ώστε να φαίνονται συγκεκριμένα κυτταρικά όρια και αρκετές ξεχωριστές ενδοκυτταρικές δομές. Μετά πρόσθεσαν έναν κατάλληλα σχεδιασμένο αντικειμενικό φακό, ένα 45

46 απορροφητικό φακό σταθεροποίησης και κατάλληλο flash, φωτισμό τροποποιήσεις που οδήγησαν στο πρώτο ενδοθηλιοσκόπιο, κατάλληλο για in vivo κλινική χρήση 53. Από τότε ξεκίνησε η τεχνική της κλινικής ενδοθηλιοσκόπησης όπως είναι σήμερα γνωστή. ΟΠΤΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΕΝΔΟΘΗΛΙΟΣΚΟΠΙΟΥ Για να κατανοήσουμε τις βασικές οπτικές αρχές που σχετίζονται με την δημιουργία εικόνας από ενδοθηλιοσκόπιο, είναι απαραίτητη η ερμηνεία των ενδοθηλιακών φωτομικρογραφιών που παίρνουμε κλινικά. Το φως που προσπίπτει σε μια επιφάνεια μπορεί να ανακλαστεί, να μεταδοθεί διαμέσου αυτής ή να απορροφηθεί. Γενικά, ένας συνδυασμός και των τριών αυτών φαινόμενων συμβαίνει. Η σχετική αναλογία εξαρτάται από συνθήκες όπως: το μήκος κύμματος του φωτός, τη σχετική διαφάνεια του μέσου κάτω από την επιφάνεια, και τους σχετικούς ανακλαστικούς δείκτες της κάθε πλευράς της επιφάνειας. Μεγάλη σημασία έχει, στην κλινική ενδοθηλιοσκόπηση, το φως που αντανακλάται. Το φως μπορεί να ανακλαστεί από μια επιφάνεια με δυο τρόπους: 1. κατοπτρικά εστιακά και 2. διάχυτα Η κατοπτρική ανάκλαση γίνεται με κάτοπτρα και άλλες λείες επιφάνειες, όπου η γωνία ανάκλασης είναι ίση με τη γωνία πρόσπτωσης. Η διάχυτη ανάκλαση γίνεται από ανώμαλες επιφάνειες, όπως θολωμένο γυαλί, ύφασμα. Σ αυτή το ανακλώμενο φως σκορπίζεται σε πολλές γωνίες. Για τις περισσότερες επιφάνειες, η ανάκλαση είναι συνδυασμός της κατοπτρικής και 46

47 της διάχυτης μορφής. Το περισσότερο φως ανακλάται κατοπτρικά ενώ το υπόλοιπο ανακλάται με μη κατοπτρικές γωνίες. Στον φυσιολογικό, διαφανή κερατοειδή, το μεγαλύτερο μέρος του ορατού φωτός που πέφτει επάνω στην επιθηλιακή επιφάνεια, μεταδίδεται διαμέσου και ουσιαστικά, δεν απορροφάται καθόλου φως. Παρ όλα αυτά και επειδή υπάρχει μια διαφορά στο δείκτη διάθλασης στην επιθηλιακή επιφάνεια κάποιο φως ανακλάται, αν και το ποσοστό αυτό είναι μικρό. Καθώς το φως περνάει μέσα από τον ιστό του κερατοειδούς μπορεί: 1. να μεταδοθεί διαμέσου (διάθλαση) 2. να απορροφηθεί ή 3. να διαχυθεί. Η διάχυση είναι ένα φαινόμενο που είναι παρόμοιο αλλά πιο γενικό από την ανάκλαση. Ο όρος διάχυση περιγράφει φωτεινές ακτίνες που εκτρέπονται προς κάθε κατεύθυνση με διάφορες γωνίες. Η ανάκλαση αναφέρεται μόνο στις ακτίνες που εκτρέπονται πίσω προς την πηγή του προσπίπτοντος φωτός (με ίση γωνία). Στο στρώμα του φυσιολογικού κερατοειδούς, το προσπίπτων φως μεταδίδεται δια μέσω του ιστού. Παρ όλα αυτά ένα μικρό, συνήθως αμελητέο μέρος, απορροφάται από τα κυτταρικά οργανίδια και ένα άλλο μικρό μέρος διασκορπίζεται, διαχέεται. Στον οιδηματώδη κερατοειδή το κλάσμα του διαχεόμενου φωτός αυξάνει και μπορεί να γίνει το κυρίαρχο στοιχείο. Από το φως που προσκρούει στην οπίσθια επιφάνεια του κερατοειδούς, το μεγαλύτερο μέρος μεταδίδεται προς το υδατοειδές υγρό. Ουσιαστικά, καθόλου φως δεν απορροφάται από το υδατοειδές υγρό. Όμως, 47

48 επειδή υπάρχει μια αλλαγή του δείκτη διάθλασης στο ενδοθήλιο υδατοειδές κάποιο από το φως ανακλάται πίσω στον κερατοειδή. Για μια λεία οπίσθια επιφάνεια του κερατοειδούς αυτό το ανακλώμενο κλάσμα έχει υπολογιστεί ότι είναι ίσο με το 0,022% του συνολικού προσπίπτοντος φωτός. Σ ένα παθολογικό κερατοειδή με ανώμαλη οπίσθια επιφάνεια, θα υπάρχει ένα σημαντικό μέρος του φωτός που θα διαχέεται αντί να ανακλάται και αυτό οδηγεί σε μια μείωση της έντασης του κατοπτρικά ανακλώμενου φωτός. Καθώς η φωτεινή δέσμη του κατοπτρικού μικροσκοπίου περνάει μέσα από τον κερατοειδή συναντάει μια σειρά από ενδοεπιφάνειες μεταξύ οπτικά διαφορετικών περιοχών. Σε κάθε μια από αυτές τις επιφάνειες κάποιο φως ανακλάται πίσω προς το μικροσκόπιο και κάποιο μεταδίδεται βαθύτερα μέσα στον κερατοειδή. Όσο μεγαλύτερη είναι η διαφορά του δείκτη διάθλασης ανάμεσα σε δύο περιοχές τόσο μεγαλύτερο είναι και το ποσό και η ένταση του ανακλώμενου φωτός. Όσο πιο οιδηματώδης είναι ο ιστός, τόσο μεγαλύτερη είναι η ένταση του διαχεόμενου φωτός. Ένα μέρος του ανακλώμενου και διαχεόμενου προς τα πίσω φωτός συλλέγεται από τον αντικειμενικό φακό του μικροσκοπίου και έτσι σχηματίζεται στο φιλμ μια εικόνα του επιπέδου εκείνου που είναι εστιασμένο στο μηχάνημα. Το προσπίπτον φως συναντάει με τη σειρά την προκεράτιο δακρυϊκή στιβάδα ή κάποιο άλλο τεχνητό μέσο (π.χ. τεχνητά δάκρυα, Coniogel) ανάμεσα στον αντικειμενικό φακό και στον κερατοειδή, το επιθήλιο, την στιβάδα του Bowman, το στρώμα, τη μεμβράνη του Descemet, το ενδοθήλιο και το υδατοειδές υγρό. 48

49 Σε κάθε μια από αυτές τις επιφάνειες κάποιο φως διαχέεται πίσω στο φιλμ. Στις ισχυρότερες οπτικά ενδοεπιφάνειες ένα σημαντικό μέρος του φωτός ανακλάται κατοπτρικά πίσω στο φιλμ. Τα κλάσματα του φωτός που ανακλώνται από κάθε μία από αυτές τις ενδοεπιφάνειες έχουν υπολογιστεί και είναι: 0.36% από την επιφάνεια αντικειμενικού φακού δακρύων, 0,025% από την επιφάνεια δάκρυα επιθήλιο και 0,022% από την επιφάνεια ενδοθηλίου υδατοειδούς υγρού. Χρησιμοποιήθηκαν για τους υπολογισμούς οι δείκτες διάθλασης για τον αντικειμενικό φακό = 1,517, για τα δάκρυα = 1,333, για τον κερατοειδή = 1,376 και για το υδατοειδές υγρό = 1,336. Ενδοκερατοειδικές οπτικές επιφάνειες όπως π.χ. μεταξύ επιθηλίου και στιβάδας του Bowman ή μεταξύ στρώματος και μεμβράνης του Descemet, επίσης ανακλούν φως αλλά το ποσοστό του ανακλώμενου φωτός δεν μπορεί να μετρηθεί γιατί ο δείκτης διάθλασης των χωριστών αυτών στιβάδων του κερατοειδούς δεν έχει ποτέ υπολογιστεί. Αναμφίβολα όμως αυτές οι μετρήσεις είναι πολύ μικρές και οι ενδοκερατοειδικές ανακλάσεις, αγνοούνται. Ανατομικά διαφορετικές περιοχές στον κερατοειδή επίσης διαχέουν φως πίσω στο μικροσκόπιο και τα διάφορα μέρη του κερατοειδούς μπορούν να συμπεριφερθούν αλλιώς κατά τη διάρκεια παθήσεων του κερατοειδούς. Για παράδειγμα, σε παθήσεις που έχουμε μικροκυστικό οίδημα του επιθηλίου ή γενικότερα ανώμαλη επιθηλιακή επιφάνεια, το επιθήλιο διαχέει περισσότερο φως πίσω στο μικροσκόπιο από ότι ο φυσιολογικός κερατοειδής. 49

50 Ακόμα, όταν έχουμε στρωματικό οίδημα, συμβαίνει το εξής: περισσότερο φως διαχέεται πίσω από το θολό οιδηματώδες στρώμα απ ότι από το συμπαγές διαυγές στρώμα ενός φυσιολογικού κερατοειδούς. Στο φιλμ του μικροσκοπίου το φως που προέρχεται από διάφορες περιοχές του κερατοειδούς και ενδοεπιφάνειες επικαλύπτεται. Όταν μια φωτεινή περιοχή και μια σκοτεινή περιοχή επικαλύπτονται, η σκοτεινή περιοχή, δεν φαίνεται. Αν μια ικανοποιητικά στενή δέσμη προσπίπτοντος φωτός χρησιμοποιηθεί, μπορεί γενικά κάποιος να δει μέρος από το υδατοειδές υγρό, την περιοχή του ενδοθηλίου, μέρος του στρώματος, και μια φωτεινή περιοχή. Η φωτεινή περιοχή σχηματίζεται από το φως που ανακλάται από τις ενδοεπιφάνειες φακού τεχνητού υγρού gel, τεχνητού υγρού επιθηλίου ή και των δύο, εξαρτώμενη από το δείκτη διάθλασης του τεχνητού υγρού που χρησιμοποιούμε. Επειδή σημαντικά ποσά φωτός διαχέονται από το στρώμα, καμιά πλευρά του ορίου δεν είναι σκοτεινή. Το φως που διαχέεται από τη μεμβράνη του Descemet και από το στρώμα δημιουργεί το φωτεινό όριο το οποίο είναι λιγότερο σαφές από ότι το σκοτεινό όριο και προκαλεί την προοδευτική μείωση της αντίθεσης καθώς το φωτεινό όριο πλησιάζει. Μεγάλη κλινική σημασία έχει το εύρος της φωτεινής δέσμης που προβάλλεται στον κερατοειδή από το μικροσκόπιο. Αν η γωνία πρόπτωσης του φωτός αυξηθεί μπορεί να χρησιμοποιηθεί πιο φαρδιά δέσμη και έτσι θα φανεί ένα ευρύτερο πεδίο ενδοθηλιακών κυττάρων. Επίσης η φαρδιά δέσμη, φωτίζει περισσότερο ιστό του κερατοειδούς μπροστά από το ενδοθήλιο κι έτσι ο όγκος του ενδιάμεσου στρώματος αυξάνεται και περισσότερο φως διαχέεται πίσω στο φιλμ του μικροσκοπίου. 50

51 Το αποτέλεσμα είναι να προκύπτει μια μείωση στην αντίθετη της εικόνας του ενδοθηλίου και μια απώλεια της ευκρίνειας των κυττάρων. Συμπερασματικά λοιπόν, όταν χρησιμοποιείται φαρδιά ζώνη φωτός, μεγαλύτερος αριθμός κυττάρων θα φανεί αλλά σε βάρος της αντίθεσης και της ευκρίνειας που χρειάζεται για να μελετηθούν τα κυτταρικά όρια και ενδοκυτταρικές δομές. Αυτή η ανταλλαγή μεταξύ της ευκρίνειας της φωτογραφίας και του αριθμού των κυττάρων μέσα σε ένα συγκεκριμένο πλαίσιο, δεν είναι αποτέλεσμα οπτικού περιορισμού του μηχανήματος, αλλά οφείλεται στη διάχυση του φωτός στον ιστό πάνω από το ενδοθήλιο. Έτσι, αυξάνοντας τη γωνία πρόσπτωσης της δέσμης φωτός αυξάνεται στο μέγιστο το εύρος της δέσμης που μπορεί να χρησιμοποιηθεί. Όμως, σε μεγάλη γωνία πρόσπτωσης (και αναλόγως σε μεγάλη γωνία ανάκλασης και παρατήρησης), τα φυσιολογικά ενδοθηλιακά κύτταρα φαίνονται πιο κοντά, πιο στενά, σε μια κατεύθυνση. Έτσι η φαρδιά φωτεινή δέσμη δίνει την εικόνα ενός διαταραγμένου ενδοθηλιακού μοτίβου, και κάνει πολύ πιο δύσκολους τους υπολογισμούς των μορφολογικών λεπτομερειών των κυττάρων. Η φαρδιά δέσμη με μεγάλη γωνία πρόπτωσης χρησιμοποιείται στους περισσότερους τύπους ενδοθηλιοσκοπίων μη επαφής. Όταν χρησιμοποιείται μια στενή δέσμη φωτός, η φωτογραφική εικόνα περιέχει μια περιοχή που παράγεται από το φως που διαχέεται αποκλειστικά από το στρώμα. Όπως ειπώθηκε πριν, η περιοχή αυτή προοδευτικά εξαφανίζεται καθώς η δέσμη γίνεται όλο και πιο φαρδιά. Η ένταση του φωτός που διαχέεται μόνο από το στρώμα, όταν χρησιμοποιείται στενή δέσμη φωτός μπορεί ποσοτικά να προσδιοριστεί μετρώντας την πυκνότητα του φιλμ σ 51

52 αυτή την περιοχή του φωτομικρογραφήματος. Το αποτέλεσμα είναι ένας αντικειμενικός τρόπος μέτρησης του στρωματικού οιδήματος. ΒΕΛΤΙΩΣΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Η οπτική επεξεργασία του αντικειμενικού φακού οδήγησε στην σημαντική βελτίωση της ποιότητας της εικόνας και στην εύκολη χρήση κλινικά του μηχανήματος. Ακόμα και σε οιδηματώδεις κερατοειδείς, το βελτιωμένο σχέδιο έδωσε εικόνες ικανοποιητικής ποιότητας ώστε να επιτραπεί η μορφομετρική ανάλυση, με τη βοήθεια βέβαια συστημάτων computer, που ανέπτυξε ο Laing 54. Διάφοροι μέθοδοι χρησιμοποιήθηκαν για να έχουμε ένα ευρύτερο πεδίο κυττάρων, από αυτό που παίρνουμε με τη σταθερή δέσμη φωτός. Οι Sherrard και Buckley 55 ανέπτυξαν ένα αντικειμενικό φακό με φθοριούχο πρόσθια επιφάνεια. Αυτό μείωσε την αντανάκλαση της ενδιάμεσης επιφάνειας φακού επιθηλίου, επιτρέποντας έτσι τη χρήση πιο φαρδιάς δέσμης και συνεπώς ευρύτερου πεδίου κυττάρων για παρατήρηση. Γενικά, η χρήση του περιορίστηκε σε διαυγείς κερατοειδείς με μηδαμινή διάχυση φωτός από το στρώμα του κερατοειδούς. Ο Koester 56 σχεδίασε ένα οπτικό σύστημα, στο οποίο, συνεχώς κινείται μια στενή δέσμη φωτός, πάνω κάτω στο ενδοθήλιο. Αυτό παρήγαγε μια εικόνα με μεγάλο εύρος, χωρίς τις διαταραχές που οφείλονται στη στρωματική διάχυση. Οι Lemp και Gold 57 έδειξαν ότι ένα συνεστιακό μικροσκόπιο ήταν ικανό να πάρει και ενδοθηλιακές και επιθηλιακές και στρωματικές εικόνες, κάτι που δεν ήταν δυνατό παλαιότερα. Το ενδιαφέρον για το συνεστιακό μικροσκόπιο οδήγησε στην ανάπτυξη μιας ποικιλίας κατοπτρικών μικροσκοπίων με περιστρεφόμενο δίσκο και περιστρεφόμενη δέσμη φωτός. Με αυτά τα 52

53 περίπλοκα μηχανήματα πήραμε εικόνες βελτιωμένες των δομών μέσα στο στρώμα, αλλά δεν πήραμε ενδοθηλιακές εικόνες σημαντικά καλύτερες από εκείνες που είχαμε με τα πιο απλά σταθερής δέσμης κατοπτρικά μικροσκόπια. Η κλινική χρήση του κατοπτρικού μικροσκοπίου μπορεί να γίνει με υψηλή μεγέθυνση και ανάλυση χρησιμοποιώντας αντικειμενικό φακό επαφής που εφάπτεται με τον κερατοειδή και ακινητοποιεί το μάτι ή αντικειμενικό φακό μη επαφής, που δεν ακουμπά τον κερατοειδή και έχουμε χαμηλότερη μεγέθυνση και ανάλυση. Έχουμε δυο κατοπτρικά μικροσκόπια που διατίθεται στο εμπόριο, το Bio Optics LSM 2000C και το Keeler Konan S80 μπορούν να γίνουν και τα δύο επαφής ή μη επαφής αλλάζοντας αντικειμενικό φακό. Τα αποκλειστικά μη επαφής μηχανήματα που αναπτύχθηκαν τη δεκαετία του 80 απέτυχαν εμπορικά εξαιτίας της δυσκολίας στη χρήση και της κατώτερης ποιότητας εικόνας. Ωστόσο, βελτιωμένα, μη επαφής μηχανήματα (Topcon, Konan) έχουν αναπτυχθεί τα τελευταία χρόνια. Το Konan NonCon Robo μικροσκόπιο (εικόνα 13β) είναι το πιο αυτοματοποιημένο κατοπτρικό μικροσκόπιο που δημιουργήθηκε για κλινική χρήση. 53

54 Εικόνα 13β Η απεικόνιση του ενδοθηλίου είναι πλήρως αυτοματοποιημένη και μόνο ελάχιστη παρέμβαση χρειάζεται από το χειριστή. Ο ασθενής τοποθετεί το πηγούνι στην αριστερή ή δεξιά θέση της υποδοχής, ανάλογα με το πιο μάτι εξετάζεται και πρέπει να κοιτάει στο φως εστίασης. Ο χειριστής πρέπει να τοποθετήσει το κεφάλι του ασθενούς σωστά ώστε η κόρη του ματιού να φαίνεται στο κέντρο της βίντεο οθόνης του μηχανήματος. Μετά ο χειριστής πατάει ένα κουμπί και αυτομάτως αρχίζει η διαδικασία φωτογράφησης. Τα οπτικά συστήματα του μηχανήματος ευθυγραμμίζονται με τον κερατοειδή μέχρι να επιτευχθεί σωστή κατοπτρική αντανάκλαση, εστιάζουν στο ενδοθήλιο, το φωτάκι εστίασης αναβο-σβήνει 54

55 για να προειδοποιήσει τον ασθενή να μην κλείσει τα βλέφαρα, το flash ενεργοποιείται και η ενδοθηλιακή φωτογραφία φαίνεται στη βίντεο-οθόνη. Σε αντίθεση με άλλα μικροσκόπια, αυτό το μηχάνημα απαιτεί λίγο χρόνο εκπαίδευσης χειριστή. Διαθέτει ενσωματωμένο πρόγραμμα κυτταρικού υπολογισμού. Ένα βελτιωμένο μοντέλο μπορεί να φωτογραφήσει πιο περιφερικό ενδοθήλιο, 3mm από το κέντρο του κερατοειδούς στις θέσεις και 10 ώρες και να κάνει ατομική κυτταρική ανάλυση. Αυτό δίνει ακριβείς τιμές για την επί τοις εκατό αναλογία των εξαγωνικών κυττάρων, τη μέση έκταση και το συντελεστή μεταβλητότητας της έκτασης, μιας γειτονικής ομάδας κυττάρων, των οποίων τα κέντρα έχουν μαρκαριστεί με το ποντίκι του μηχανήματος. Επίσης υπάρχει έξοδος στη βίντεο-οθόνη για να συνδέεται με συσκευή αποθήκευσης εικόνων ή προηγμένο σύστημα ενδοθηλιακής ανάλυσης. 55

56 ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΕΝΔΟΘΗΛΙΟΥ ΤΟΥ ΚΕΡΑΤΟΕΙΔΟΥΣ Το κατοπτρικό μικροσκόπιο χρησιμοποιήθηκε κυρίως για να εκτιμήσει το ενδοθήλιο του κερατοειδούς. Μπορεί να γίνει και ποιοτική και ποσοτική εκτίμηση αυτής της στιβάδας. Η ποιοτική ανάλυση ταυτοποιεί ανώμαλες ενδοθηλιακές δομές και βαθμολογεί το ενδοθήλιο είτε ως προς τον αριθμό ή το μέγεθος των ανώμαλων σχηματισμών που υπάρχουν είτε ως προς μια βάση συνολικής ορατής εκτίμησης της ενδοθηλιακής εμφάνισης. Ο στόχος είναι να μας παρέχει μια υποκειμενική εκτίμηση του ενδοθηλίου και όχι να υπολογίσει ακριβώς αριθμητικές αξίες στο μικρογράφημα. Η ποιοτική ανάλυση δίνει μια γρήγορη κλινική εκτίμηση του ενδοθηλίου προκειμένου να υπολογίσουμε τον κίνδυνο μιας ενδοφθάλμιας επέμβασης, να κάνουμε μια διάγνωση ή για αποφασίσουμε μια θεραπευτική αγωγή. Ο κλινικός οφθαλμίατρος πρέπει να είναι προσεκτικός στο να ξεχωρίζει τεχνικά λάθη τόσο στην ποιοτική, όσο και στην ποσοτική ανάλυση του ενδοθήλιου. Για την πλήρη ποιοτική ανάλυση, εκτιμώνται αρκετοί παράμετροι, όπως 58 : 1) Κυτταρική μορφολογία 2) Κυτταρικά όρια και οι διασυνδέσεις τους 3) Η διαμόρφωση του σκοτεινού ορίου 4) Η παρουσία ακυτταρικών δομών 56

57 ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ Το κατοπτρικό μικροσκόπιο αναλύει το ενδοθηλιακό μοντέλο του φυσιολογικού κερατοειδή σαν ένα ομαλό εξαγωνικό μοτίβο γειτονικών κυττάρων με καλά καθορισμένα κυτταρικά όρια. Γεωμετρικά και θερμοδυναμικά, το ομαλό εξαγωνικό σχήμα, αποτελεί την πιο σταθερή διαμόρφωση προκειμένου να καλυφθεί μια επιφάνεια, επειδή αυτό το σχήμα ελαχιστοποιεί την συνολική κυτταρική περίμετρο και επιπλέον προκαλεί την μικρότερη επιφανειακή τάση. Συνεπώς, θεωρείται ότι η οποιαδήποτε εξεσημασμένη διαταραχή του ομαλού εξαγωνικού μοτίβου αντανακλά ένα ασταθές ενδοθήλιο, ευάλωτο σε ένα πιθανό τραύμα. Σε νέους ανθρώπους με φυσιολογικό κερατοειδή, τα κεντρικά ενδοθηλιακά κύτταρα έχουν περίπου το ίδιο μέγεθος και η κατανομή της κυτταρικής επιφάνειας είναι περίπου φυσιολογική. Με το πέρασμα της ηλικίας η μέση κυτταρική επιφάνεια αυξάνεται, το κυτταρικό μοτίβο γίνεται ξεκάθαρα πλεομορφικό και η κατανομή του κυτταρικού μεγέθους αλλάζει προς μεγαλύτερες κυτταρικές επιφάνειες. (εικόνα 14, 15) Σε νέα άτομα επίσης, με φυσιολογικούς κερατοειδείς, τα μήκη των κυτταρικών πλευρών είναι σχεδόν ίσα. Σε μεγαλύτερα άτομα, τα πλευρικά μήκη, χάνουν την ομαλότητα τους και παρουσιάζουν μια τάση αύξησης. Οι γωνίες σύνδεσης των κυτταρικών πλευρών είναι περίπου 120 ο σε όλες τις ηλικίες αν και σε ηλικιωμένα άτομα ή σε ασθενείς με απώλεια κυττάρων υπάρχει σημαντική παρέκκλιση. Το κυτταρικό μέγεθος μπορεί να ποικίλει ευρέως ως αποτέλεσμα διάφορων διαταραχών. 57

58 Εικόνα 14. και 15. Μέχρι σήμερα, ούτε ο κυτταρικός πλεομορφισμός, ούτε η ομοιόμορφη κυτταρική μεγέθυνση μέχρι ενός ορίου, έχουν δείξει να σχετίζονται με την απώλεια της ικανότητας του ενδοθηλίου να διατηρεί τον κερατοειδή διαυγή. Παρ όλα αυτά, θεωρείται ότι ο πλεομορφισμός και η κυτταρική μεγέθυνση αντανακλούν μια απώλεια στην ικανότητα ανάνηψης του ενδοθηλίου σε μια ενδεχομένη προσβολή. Επιπρόσθετα με τις αλλαγές στο μέγεθος, τα ενδοθηλιακά κύτταρα μπορεί να πάρουν ένα σχήμα που πραγματικά διαφέρει από το σύνηθες εξαγωνικό. Η εικόνα 16 και 17 δείχνει ενδοθηλιακά κύτταρα μεγενθυσμένα και επιμηκυσμένα. Στη μελέτη, αυτά τα κύτταρα μετρήθηκαν κοντά στον κώνο του κερατοειδούς σε ασθενή με κερατόκωνο. 58

59 Εικόνα 16. και 17. Φαίνονται να είναι ευθυγραμμισμένα στην ίδια κατεύθυνση και να ακολουθούν τις γραμμές του stress, όπως θα ήταν, αν είχαν τεντωθεί μετά από μεγάλη παραμόρφωση του κερατοειδούς. Κύτταρα με σχήμα πλευρών σαν χτένι (όστρακο) αντί για τις τοπικές ίσιες πλευρές φαίνονται στην εικόνα 17, όπως επίσης στρογγυλά κύτταρα τετράγωνα και τρίγωνα (εικόνα 18). 59

60 Εικόνα 18. Όπως συμβαίνει με τις αλλαγές στο μέγεθος των ενδοθηλιακών κυττάρων, έτσι και με τις αλλαγές στο σχήμα, φαίνεται ότι δεν επηρεάζουν άμεσα τη φυσιολογική λειτουργία των επηρεασμένων κυττάρων. 60

61 ΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΟΡΙΑ ΚΑΙ ΣΥΝΔΕΣΕΙΣ Τα φυσιολογικά κυτταρικά όρια τις περισσότερες φορές φαίνονται ως σκούρες, ίσιες, στενές γραμμές ( εικόνα 19, 20). Έχουν παρατηρηθεί και άλλοι τύποι κυτταρικών ορίων, όπως τα διπλά όρια. Εικόνα 19. και 20. Ο πιο κοινός τύπος διπλού ορίου, παρουσιάζει μια δεύτερη σκούρα γραμμή, λιγότερο ευδιάκριτη μέσα στο κύτταρο που είναι προσκείμενη και παράλληλη στο κυρίως όριο (εικόνα 20). Το διπλό όριο, συνήθως αφορά μια ή δυο κυτταρικές πλευρές, συμβαίνει σε πολλά κύτταρα στο δεδομένο πεδίο μελέτης και φαίνεται πάντα προς την ίδια πλευρά των κυττάρων. Συμπερασματικά, μπορούμε να πούμε, ότι ο σχηματισμός αυτών των ορίων, οφείλεται σε φαινόμενο σκίασης. 61

62 Εικόνα 21. Ένας άλλος τύπος διπλού ορίου επηρεάζει μόνο ορισμένα κύτταρα (εικόνα 21). Σ αυτή την περίπτωση το διπλό όριο βρίσκεται μέσα στο κύτταρο. Είναι συνήθως το ίδιο σκούρο όσο το κυρίως όριο και είναι παρακείμενο και παράλληλο προς δυο ή περισσότερες κυτταρικές πλευρές. Αυτοί οι δυο τύποι διπλών ορίων παρουσιάζονται σε κερατοειδείς που φαίνονται φυσιολογικοί κατά την εξέταση στη σχισμοειδή λυχνία. Η σημασία τους δεν είναι ξεκάθαρη, και δεν υπάρχουν πληροφορίες που να δείχνουν ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα που περιέχουν διπλά όρια, είναι ανώμαλα ως προς τη φυσιολογική τους λειτουργία. Στο φυσιολογικό ενδοθήλιο, τα κυτταρικά όρια διασταυρώνονται μ ένα τρόπο που οδηγεί στο σχηματισμό τριών γωνιών διασύνδεσης που η κάθε μια είναι 120 ο58. Διαφοροποίηση από το συγκεκριμένο μοτίβο (εικόνα 22) όπου οι γωνίες δεν 62

63 είναι 120 ο η κάθε μία, μπορούμε να δούμε στις ενώσεις ανώμαλων κυττάρων ή σε καταστάσεις όπου γίνεται μετάβαση σε διαφορετικό σχήμα προκαλούμενη από ενδοθηλιακή απώλεια ή κινήσεις γειτονικών κυττάρων. Τέτοιες ενώσεις είναι θερμοδυναμικά ασθενείς. Εικόνα 22. ΟΠΙΣΘΙΑ ΚΕΡΑΤΟΕΙΔΙΚΗ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ Πληροφορίες για την οπίσθια επιφάνεια του ενδοθηλίου, μπορούμε να πάρουμε εξετάζοντας την εμφάνιση του σκοτεινού ορίου, που βρίσκεται ανάμεσα στην απεικόνιση του ενδοθηλιακού μοτίβου και της σκοτεινής ζώνης που παράγεται από το υδατοειδές υγρό. Αν η ενδοθηλιακή επιφάνεια είναι λεία, το προκαλούμενο σκοτεινό όριο θα είναι ευθύ. Αν η ενδοθηλιακή επιφάνεια είναι ανώμαλη, το αποτέλεσμα θα είναι ένα ανώμαλο, σκοτεινό 63

64 όριο. Τέσσερις βασικές διαμορφώσεις του σκοτεινού ορίου είναι πιθανές. Κλινικά, εκτός από τις τέσσερις αυτές διαμορφώσεις, υπάρχουν και οι συνδυασμοί τους. Ειδική σχέση ανάμεσα σε ανωμαλίες διαμόρφωσης της οπίσθιας επιφάνειας και της φυσιολογικής λειτουργίας του ενδοθηλίου, δεν έχει αποδειχθεί. ΔΙΑΦΟΡΕΣ ΔΟΜΕΣ Διάφορες διακυτταρικές και ενδοκυτταρικές δομές, μπορούν να φανούν στις φωτογραφίες του ενδοθηλίου, είτε ως σκοτεινές είτε ως φωτεινές. Ένας τύπος σκοτεινής δομής διακόπτει το ενδοθηλιακό μοτίβο και μπορεί να ποικίλει σε μέγεθος από μικρότερο ως μεγαλύτερο απλού ενδοθηλιακού κυττάρου. Κάθε τέτοια δομή γενικά έχει σκούρες πλευρές και ένα κεντρικό φωτεινό σημείο. Τέτοιες δομές αντιπροσωπεύουν ομαλές εκφύσεις της μεμβράνης του Descemet (π.χ. guttata του κερατοειδούς) και συχνά περιστοιχίζεται από ένα δακτύλιο κυττάρων με ανώμαλο σχήμα. Η κερατοειδική guttata μπορεί να φανεί σε πολύ πρωϊμότερο στάδιο απ ότι στην συμβατική βιομικροσκόπηση στη σχισμοειδή λυχνία. Όταν αυτές οι εκφύσεις είναι άφθονες, αγγίζουν η μία την άλλη και συγκολούνται. Αυτό φαίνεται στην εικόνα Εικόνα 23. Αν και το ενδοθηλιακό μοτίβο δεν διακρίνεται, οι φωτεινές ανακλάσεις από την κορυφή του κάθε εκφύματος, φαίνονται καθαρά. 64

65 Εικόνα 23. και 24. Ενδοκυτταρικές φωτεινές δομές, που κάποιες μπορεί να είναι πυρήνες, φαίνονται στο ενδοθηλιακό φωτομικρογράφημα. Ποικίλουν σε μέγεθος και τοπικά, περιέχονται εξ ολοκλήρου στο ενδοθηλιακό κύτταρο (εικόνα 24). Περιορισμένες εξαιρέσεις συμβαίνουν, όπου η φωτεινή δομή φαίνεται να διαπερνά το κυτταρικό όριο. Πιστεύουμε, ότι αυτές οι ενδοκυτταρικές φωτεινές δομές βρίσκονται σε στρεσαρισμένα (stressed) κύτταρα, γιατί τα συναντάμε συχνά σε μεγενθυσμένα κύτταρα μετά από επιτυχή μεταμόσχευση κερατοειδούς. Το μέγεθος ή ο αριθμός τους, (πολλαπλές φωτεινές δομές μπορεί να υπάρχουν μέσα σε ένα μόνο αρκετά μεγενθυσμένο κύτταρο) εξαρτάται από το μέγεθος του κυττάρου. Αυτό σημαίνει ότι όσο πιο μεγάλο είναι το ενδοθηλιακό κύτταρο, τόσο πιο μεγάλη και η φωτεινή δομή. Ένας δεύτερος τύπος φωτεινής δομής γεφυρώνει μερικά 65

66 ενδοθηλιακά κύτταρα και είναι τοποθετημένη τυχαία μέσα στο ενδοθηλιακό μοτίβο του μικρογραφήματος. Στην άμεση επισκόπηση αυτές οι δομές, φαίνονται να γυαλίζουν. Μερικές είναι πορτοκαλί και άλλες είναι λευκές. Η εξέταση στη σχισμοειδή λυχνία φανερώνει πολυάριθμες χρωστικές εναποθέσεις στο ενδοθήλιο. Οι φωτεινές δομές που φαίνονται στο κατοπτρικό μικροσκόπιο αντιστοιχούν στις χρωστικές ενδοθηλιακές εναποθέσεις που φαίνονται στη σχισμοειδή λυχνία, άρα, πρόκειται για την ίδια ανωμαλία. Έχουν παρατηρηθεί δύο επιπλέον τύποι σκοτεινών σωμάτων και οι δυο, ενδοκυτταρικοί. Ο πρώτος τύπος είναι μικρός και είναι γενικά τοποθετημένος κεντρικά ή παρακεντρικά στο κύτταρο. Έχει οξείες και σαφώς περιγεγραμμένες πλευρές και αυτό σημαίνει ότι είναι τοποθετημένο στην οπίσθια επιφάνεια του κυττάρου. (εικόνα 24). Αυτή η δομή εμφανίζεται σε κλινικά φυσιολογικούς κερατοειδείς. Όταν εμφανίζεται αφορά πολλά αλλά όχι όλα τα κύτταρα. Πιθανώς αντιπροσωπεύει τη βάση μιας ενδοθηλιακής βλεφαρίδας (cilium), αν και δεν έχει αποδειχθεί αυτό το εύρημα ιστολογικά. Ο δεύτερος τύπος σκοτεινού σωματίου είναι σημαντικά πιο μεγάλος και έχει συγκεχυμένα άκρα. Αυτό σημαίνει ότι είναι τοποθετημένο μέσα στο κύτταρο (εικόνα 25). Αντιπροσωπεύει ένα ενδοκυτταρικό κενοτόπιο ή φυσαλλίδα. 66

67 Εικόνα 25. και 26. Διακυτταρικές σκοτεινές δομές που βρίσκονται κατά το πλείστον στις διασυνδέσεις των ενδοθηλιακών κυττάρων (εικόνα 26) τείνουν να είναι ομοιόμορφες στο μέγεθος και τυχαία κατανεμημένες στο ενδοθήλιο. Αυτές οι δομές συναντώνται σε ασθενείς με πρόσθια ραγοειδίτιδα και πιστεύεται ότι οφείλονται σε εισερχόμενα φλεγμονώδη κύτταρα. Με τη χρήση του κατοπτρικού φωτομικροσκοπίου διάφορα αλλά ενδιαφέροντα και ασυνήθη ευρήματα μπορούν να παρατηρηθούν και να επιβεβαιωθούν μέσα στο ενδοθήλιο ή προσκείμενα σε αυτό. Ένα παράδειγμα αποτελεί μια πεπαχυμένη και ανώμαλη μεμβράνη του Descemet). Το ενδοθήλιο δεν φαίνεται σ αυτή τη φωτογραφία, αλλά μπορεί να φανεί αν η εστίαση γίνει σε βαθύτερο επίπεδο. Ασυνήθεις ενδοθηλιακές δομές και μεγενθυσμένα κύτταρα με φωτεινά σωμάτια έχουν 67

68 βρεθεί μετά από επιτυχημένη θεραπεία για αντίδραση απόρριψης σε μεταμόσχευση κερατοειδούς. Με την κλινική ενδοθηλιοσκόπηση μπορούν να ανιχνευθούν μορφολογικές διαταραχές στα ενδοθηλιακά κύτταρα, χαρακτηριστικά της κυτταρικής επιφάνειάς τους, τα κυτταρικά όρια όπως επίσης και διάφορες ενδοκυτταρικές δομές. Αν και η φύση και η σημασία πολλών από αυτών των ανωμαλιών, προς το παρόν, δεν είναι γνωστή, παρ όλα αυτά, η αναγνώριση τους αποτελεί ένα αρχικό βήμα στην διευκρίνιση της παθοφυσιολογικής τους σημασίας. 68

69 ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Η ποιοτική ανάλυση της εικόνας που παίρνουμε με το κατοπτρικό μικροσκόπιο, αρκεί για αρκετές περιπτώσεις, ωστόσο χρειάζονται και οι ποσοτικές πληροφορίες. Ο σκοπός της ποσοτικής ανάλυσης είναι να δώσει έναν αριθμό ή ένα σύνολο αριθμών πάνω στο φωτομικρογράφημα ώστε να παρέχει μια μέτρηση της ενδοθηλιακής κατάστασης. Οι μορφολογικοί παράμετροι που μπορούν να ποσοτικοποιηθούν είναι: 1) Cell size= ( Μέγεθος κυττάρου) ή (έκταση κυττάρου ή πυκνότητα κυττάρων) 2) Πολυμεγενθυσμός= (η παρέκκλιση στο μέγεθος του κυττάρου που εκφράζεται με τον συντελεστή παρέκλισης της μέσης κυτταρικής έκτασης) 3) Πλεομορφισμός= (παρέκκλιση στο σχήμα του κυττάρου, που εκφράζεται με την επί τις εκατό αναλογία των εξαγωνικών κυττάρων ή συντελεστής παρέκκλισης του κυτταρικού σχήματος) 4) Περίμετρος κυττάρου 5) Μέσο μήκος κυτταρικής πλευράς 6) Σχήμα κυττάρου Ιστογράμματα ή κατανομές συχνότητας για κάθε μια από αυτές τις ποσότητες, μπορούν να κατασκευαστούν. Όμως μόνο το μέγεθος κυττάρου, ο πλεομορφισμός, ο πολυμεγενθυσμός και μερικές μεταβλητές που σχετίζονται με αυτές τις ειδικές παραμέτρους, έχουν αποδειχθεί χρήσιμοι στον προσδιορισμό της κατάστασης του ενδοθηλίου. 69

70 Δύο ισοδύναμες παράμετροι έχουν χρησιμοποιηθεί για να ποσοτικοποιήσουν το μέγεθος του ενδοθηλιακού κυττάρου: η μέση κυτταρική έκταση (mean cell area) και κυτταρική πυκνότητα (cell density). Η κυτταρική έκταση εκφράζεται με μονάδες σε τετραγωνικά μικρόμετρα ανά κύτταρο. Η κυτταρική πυκνότητα εκφράζεται με μονάδες σε κύτταρα ανά τετραγωνικό χιλιοστόμετρο. Οι δύο ποσότητες σχετίζονται με την ακόλουθη εξίσωση: Mean cell area (μm 2 / cell) = 10 6 /cell density (cells/ mm 2 ) ή Cell density (cells / mm 2 ) = 10 6 / mean cell area (μm 2 / cell) Δύο διαφορετικές μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να μετρήσουν κάθε μια από αυτές τις δυο παραμέτρους του κυτταρικού μεγέθους: η σταθερού πλαισίου ανάλυση (fixed frame analysis) και η μεταβλητού πλαισίου ανάλυση (variable frame analysis). 70

71 ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΤΑΘΕΡΟΥ ΠΛΑΙΣΙΟΥ Στην ανάλυση σταθερού πλαισίου, μετράμε τον αριθμό των κυττάρων που υπάρχουν μέσα σε ένα πλαίσιο ή παράθυρο συνεχόμενης περιοχής. Όλα τα κύτταρα που βρίσκονται εξ ολοκλήρου μέσα στο πλαίσιο μετρώνται ως ξεχωριστά κύτταρα. Παρ όλα αυτά, στο όριο του πλαισίου, πολλά κύτταρα βρίσκονται μόνο κατά ένα μέρος τους μέσα στο πλαίσιο. Σ αυτά τα κύτταρα είναι αδύνατο να προσδιοριστεί η ακριβής έκταση που είναι μέσα στο όριο. Έτσι, κάθε ένα από αυτά προσμετράται ως το μισό ενός κυττάρου, ανεξάρτητα από το μέγεθος του κομματιού τους. Ο συνολικός αριθμός των κυττάρων (π.χ. cell count) θεωρείται το άθροισμα των ολόκληρων και των μισών κυττάρων που βρίσκονται μέσα στο πλαίσιο. Για να επιταχυνθεί η διαδικασία μέτρησης, χρησιμοποιείται η αρχή της συμμετρίας και έτσι μετράνε μόνο τα κύτταρα που κόβονται από τα δυο όρια του πλαισίου, ως ολόκληρα, ενώ τα κύτταρα που κόβονται από τα άλλα δυο όρια δεν μετρώνται καθόλου. Οταν ο αριθμός των κομμένων κυττάρων από τα όρια του πλαισίου (boundary cells) συγκρίνεται με τον αριθμό των ολόκληρων κυττάρων μέσα στο πλαίσιο και είναι μικρός, τότε ο κυτταρικός πολυμεγενθυσμός δεν είναι μεγάλος και το κυτταρικό δείγμα είναι αντιπροσωπευτικό της περιοχής που μελετάται, και η μέθοδος μπορεί να δώσει ακριβείς τιμές για το μέσο κυτταρικό μέγεθος. Η τιμή του μεγέθους αυτού βγαίνει διαιρώντας τον αριθμό των κυττάρων (cell count) με την έκταση του πλαισίου και εκφράζεται ως κυτταρική πυκνότητα (cell density) σε κύτταρα ανά τετραγωνικό χιλιοστόμετρο. Η έκταση του πλαισίου πρέπει να ρυθμιστεί με το ενδοθήλιο. 71

72 Εικόνα 27. Αυτό κατορθώνεται διαιρώντας την πραγματική έκταση του πλαισίου με το τετράγωνο της γραμμικής μεγέθυνσης του κατοπτρικού μικροσκοπίου και αν τα κύτταρα μετρήθηκαν μετά από μεγέθυνση του αρνητικού (φιλμ), η διαίρεση γίνεται με το τετράγωνο της γραμμικής μεγέθυνσης της νέας μεγέθυνσης. (εικ. 27 ) Επίσης μπορεί να υπολογιστεί η μέση κυτταρική έκταση, αν διαιρεθεί η έκταση του πλαισίου με τον αριθμό των κυττάρων όπου, μέση κυτταρική έκταση = μέση επιφάνεια κυττάρου. 72

73 ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΜΕ ΜΕΤΑΒΛΗΤΟ ΠΛΑΙΣΙΟ Στην ανάλυση μεταβλητού πλαισίου, η περιοχή έκταση που καταλαμβάνει ένας ακέραιος αριθμός κυττάρων, μετριέται, χρησιμοποιώντας ένα επιπεδόμετρο (planimeter) ή ένα digitizer. Χρησιμοποιούμε το στυλό του μηχανήματος για να σημάνουμε, γύρω, το όριο της ομάδας των κυττάρων που μελετάμε. Όταν το στυλό ξαναγυρνάει στο σημείο εκκίνησης, η περιοχή, άμεσα διαβάζεται από το μηχάνημα. Η κυτταρική πυκνότητα τότε, υπολογίζεται διαιρώντας τον αριθμό των κυττάρων που έχουν σημανθεί με την έκταση του πλαισίου. Εικόνα 28. Μια ισοδύναμη τιμή, η μέση κυτταρική έκταση, μπορεί να υπολογιστεί διαιρώντας την έκταση του πλαισίου με τον αριθμό των κυττάρων που είναι μέσα στο πλαίσιο. Επειδή αυτή η μέθοδος εξαλείφει το πρόβλημα της μέτρησης κομμένων κυττάρων δίνει πιο ακριβή προσδιορισμό 73

74 του μέσου κυτταρικού μεγέθους αν υποθέσουμε ότι το δείγμα των κυττάρων είναι αντιπροσωπευτικό της περιοχής που μελετάται. Αν υπάρχει έντονος κυτταρικός πολυμεγενθυσμός και πλεομορφισμός, ο αριθμός των κυττάρων μέσα στο πλαίσιο, είτε είναι σταθερό, είτε μεταβλητό, μπορεί να μην είναι αντιπροσωπευτικός του συνόλου του πληθυσμού των ενδοθηλιακών κυττάρων και έτσι η κυτταρική πυκνότητα ή η μέση κυτταρική έκταση που υπολογίζεται δεν είναι αντιπροσωπευτικά του ενδοθηλίου. Στις σύγχρονες ενδοθηλιακές κάμερες, οι οποίες φωτογραφίζουν περισσότερα από 100 φυσιολογικά κύτταρα ανά πεδίο, το παραπάνω πρόβλημα είναι σπάνιο εκτός από τις περιπτώσεις που έχουμε δραματική μείωση της κυτταρικής πυκνότητας. ΑΤΟΜΙΚΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Στην ανάλυση σταθερού πλαισίου μόνο ο μέσος όρος του κυτταρικού μεγέθους μπορεί να υπολογιστεί. Το ίδιο ισχύει και για την ανάλυση μεταβλητού πεδίου όταν μόνο μια ομάδα κυττάρων κυκλώνονται. Παρ όλα αυτά, στη μέθοδο μεταβλητού πεδίου, ένα ένα τα κύτταρα μπορούν να μαρκαριστούν με το στυλό του μηχανήματος. Αυτό οδηγεί στην ατομική κυτταρική ανάλυση, και παρέχει περισσότερες πληροφορίες για το ενδοθηλιακό μοτίβο από ότι οι άλλες μέθοδοι που προσδιορίζουν μόνο κυτταρική πυκνότητα και μέση κυτταρική έκταση. Η ατομική κυτταρική ανάλυση μπορεί να γίνει χειροκίνητα, ημιαυτόματα ή πλήρως αυτοματοποιημένα. 74

75 Η πρώτη χειροκίνητη ανάλυση σε συνεργασία με υπολογιστή έγινε από τους Laing και συν. Στο εμπόριο έγινε γνωστό ως Bio optics Manding system. Σ αυτή την ανάλυση τα κυτταρικά όρια σημαίνονται μ ένα ειδικό στυλό ή κέρσορα του μηχανήματος. Καθώς γίνεται η σήμανση οι συντεταγμένες χ και ψ των σημείων του ορίου αυτόματα εισάγονται στον υπολογιστή. Ο υπολογιστής προσδιορίζει αυτό το κύτταρο που έχει πλήρως περιγραφεί και υπολογίζει την έκτασή του (επιφάνεια) και άλλες μορφολογικές παραμέτρους αυτού του κυττάρου. Στην συνέχεια ο υπολογιστής καθοδηγεί τον χρήστη να σημάνει άλλο κύτταρο. Η κυτταρική πυκνότητα ή η μέση κυτταρική έκταση καθορίζεται από το μέσο όρο των δεδομένων μιας ομάδας κυττάρων. Επιπλέον μπορούμε να πάρουμε τη συχνότητα κατανομής (ιστόγραμμα) του κυτταρικού μεγέθους. 75

76 Εικόνα 29. Αν και η συχνότητα κατανομής δίνει σημαντικές πληροφορίες για το ενδοθήλιο, η διαδικασία είναι εξαιρετικά κοπιαστική και έτσι λίγες μελέτες έχουν γίνει πάνω σ αυτή. Ημιαυτόματες μέθοδοι που χρησιμοποιούν εικόνες βίντεο, αναπτύχθηκαν από τους Laing 54 και συνεργάτες. Καταργούν τις δυσκολίες που σχετίζονται με την ενδοθηλιακή ανάλυση και έχουν προσθέσει νέες μορφολογικές παραμέτρους που προσδιορίζονται εύκολα. Η διαδικασία, με τη χρήση του Bio optics, απαιτεί μια αρχική ψηφιακή σήμανση των κυττάρων με το ποντίκι του υπολογιστή και μετά υπολογίζονται όλες οι σημαντικές μορφομετρικές παράμετροι. Το σύστημα επιτρέπει την εισαγωγή επιπλέον προγραμμάτων για να υπολογίζουν και νέες παραμέτρους. Φτωχές ενδοθηλιακές εικόνες 76

77 ενισχύονται ως προς την αντίθεση για να βελτιωθεί η ποιότητά τους. Εικόνες και δεδομένα αποθηκεύονται, τυπώνονται, ανασύρονται και μεταφέρονται σε άλλους υπολογιστές. Υπάρχει πολύ ισχυρή συσχέτιση ανάμεσα στον προσδιορισμό της κυτταρικής πυκνότητας που υπολογίζεται με το κατοπτρικό μικροσκόπιο με αυτό το σύστημα και στον ιστοπαθολογικό προσδιορισμό του αριθμού των κυττάρων. Η πλήρως αυτοματοποιημένη μέθοδος της ατομικής κυτταρικής ανάλυσης έχει αναπτυχθεί εδώ και αρκετά χρόνια. Σ αυτή ο υπολογιστής προσδιορίζει τα κυτταρικά όρια και τις κυτταρικές κορυφές από τον υποκείμενο θόρυβο στην εικόνα και πραγματοποιεί μορφομετρικούς και στατιστικούς υπολογισμούς. Τώρα πλήρως αυτοματοποιημένες μέθοδοι χρησιμοποιούνται από καταρτισμένους χειριστές που όταν χρειαστεί παίρνουν τις σωστές αποφάσεις για την εισαγωγή των δεδομένων που θα οδηγήσουν στην επιτυχή ανάλυση της πολύπλοκης ενδοθηλιακής εικόνας. 77

78 ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΟ ΕΝΔΟΘΗΛΙΟ 1) Τραύμα 60 2) Ηλικία ) Δυστροφία Fuchs 63 4) Δικτυωτή κερατοειδική δυστροφία 64 5) Ιριδοκερατικό ενδοθηλιακό σύνδρομο 65 6) Οπίσθια πολύμορφη δυστροφία 66 7) Κερατόκωνος 67 8) Γλαύκωμα ) Ενδοθφάλμια φλεγμονή ) Αφαίρεση καταρράκτη ) Εμφύτευση ενδοφακού 74 12) Διαμπερής κερατοπλαστική ) Ενδοφθάλμια διαλύματα 77 14) Επαφή υαλοειδούς ενδοθηλίου 78 15) Επιθηλιοποίηση του προσθίου θαλάμου 79 16) Αμβλύ τραύμα 80 17) Φακοί επαφής ) Διαβήτης 89 19) Διαθλαστική χειρουργική

79 LASER Ο όρος LASER προέρχεται από τα αρχικά των αγγλικών λέξεων Light Amplication by Stimulated Emission of Radiation και σημαίνει ενίσχυση φωτός με εξαναγκασμένη εκπομπή ακτινοβολίας. Η ακτινοβολία Laser διαφέρει από την ακτινοβολία του συνηθισμένου φωτός σε ορισμένα σημαντικά σημεία, που οφείλονται στον διαφορετικό τρόπο παραγωγής κάθε μιας απ αυτές. Η φωτεινή ακτινοβολία (δέσμη φωτονίων) διαδίδεται στο χώρο με τη μορφή κύματος που χαρακτηρίζεται από το μήκος και το πλάτος της ταλάντωσής του. Το λευκό φως αποτελείται από πλήθος ακτινοβολιών που περιλαμβάνονται στο ορατό φάσμα της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας ( nm) που κάθε μία έχει διαφορετικό μήκος κύματος και βρίσκεται σε διαφορετική φάση ταλάντωσης (απουσία συντονισμού). Η διάδοσή τους γίνεται προς όλες τις κατευθύνσεις. Η ακτινοβολία Laser είναι μονοχρωματική, δηλαδή χαρακτηρίζεται από ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος και διαφέρει από το σύνηθες μονοχρωματικό φως στο ότι τα φωτόνια που την αποτελούν βρίσκονται στην ίδια φάση ταλάντωσης (συντονισμό) και διαδίδονται προς μία συγκεκριμένη κατεύθυνση. H Laser ακτινοβολία επιδρά με διάφορους τρόπους επάνω στους ιστούς, ανάλογα με το μήκος κύμματός της. Οι κυριότερες από τις επιδράσεις αυτές είναι η θερμική, η ιονίζουσα και η φωτοχημική, που προκαλούν αλλοιώσεις ανάλογα με το είδος του ιστού, την ένταση και το χρόνο εφαρμογής της ακτινοβολίας. 1) Θερμική επίδραση 79

80 Η θερμική επίδραση της Laser ακτινοβολίας είναι δυνατόν να προκαλέσει είτε πήξη του ιστού (φωτοπηξία) είτε εξάτμισή του (φωτοεξάτμιση). α) Φωτοπηξία Όταν η Laser ακτινοβολία προκαλέσει αύξηση της θερμοκρασίας του ιστού στον οποίο εστιάζεται και από τον οποίο απορροφάται κατά ºC προκαλεί πήξη. Έτσι δημιουργείται σε πρώτη φάση έγκαυμα που στη συνέχεια ουλοποιείται και η ουλοποίηση είναι και η επιδιωκόμενη θεραπευτική δράση. Η απορρόφηση της προσπίπτουσας ακτινοβολίας γίνεται συνήθως από χρωστικές που υπάρχουν στους ιστούς, όπως η μελανίνη, η αιμοσφαιρίνη και η ξανθοφύλλη. Η φωτοπηξία χρησιμοποιείται κυρίως σε παθήσεις του αμφιβληστροειδούς. β) Φωτοεξάτμιση Όταν η ακτινοβολία Laser έχει τέτοιες ιδιότητες, ώστε απορροφούμενη από ορισμένους ιστούς να αυξάνει την θερμοκρασία του ιστού στους 100 ºC, έχει ως αποτέλεσμα την τοπική εξάχνωση του ιστού. Έτσι δημιουργούνται κανονικές τομές στους ιστούς, ανάλογα με το σχήμα της δέσμης της ακτινοβολίας. Οι τομές αυτές έχουν το πλεονέκτημα να είναι αναίμακτες, διότι συγχρόνως αποφράζονται τα αιμοφόρα αγγεία. 2) Ιονίζουσα επίδραση Εξαιρετικά υψηλής ενέργειας και συγκεντρωμένη ακτινοβολία Laser προσπίπτουσα στους ιστούς προκαλεί διέγερση των ηλεκτρονίων των μορίων του ιστού, με αποτέλεσμα τη δημιουργία ελεύθερων ηλεκτρονίων και ιόντων. 80

81 Η κατάσταση αυτή του ιονισμένου μέσου ονομάζεται και κατάσταση «πλάσματος». Η ταχεία, σε όγκο, ανάπτυξη του πλάσματος δημιουργεί υπερηχητικά κρουστικά κύματα, τα οποία, σε συνδυασμό με τοπικές παραμορφώσεις στην δομή του ιστού, προκαλούν τελικά διάσπαση του ιστού - στόχου με τη μορφή της τομής (φωτοδιάσπαση). 3) Φωτοχημική επίδραση Σε περίπτωση που η ακτινοβολία Laser έχει υψηλή ενέργεια και ορισμένο μήκος κύματος (π.χ. 630 nm) είναι δυνατόν να προκαλέσει χημικές αντιδράσεις στους ιστούς με αποτέλεσμα την παραγωγή ελεύθερων ριζών που είναι κυτταροτοξικές. Η φωτοχημική αυτή δράση έχει χρησιμοποιηθεί πειραματικά για την καταστροφή όγκων, αφού προηγουμένως ο ιστός του όγκου έχει ευαισθητοποιηθεί τεχνητά, με την πρόσληψη αιματοπορφυρίνης. Ένα άλλο αποτέλεσμα της φωτοχημικής επίδρασης της Laser ακτινοβολίας είναι η αφαιρετική φωτοαποσύνθεση. Στην περίπτωση αυτή η Laser ακτινοβολία έχει υψηλή ενέργεια και μήκος κύματος στην υπεριώδη περιοχή. Κατά την αφαιρετική φωτοαποσύνθεση, η υψηλή ενέργεια της ακτινοβολίας απορροφόμενη από τα μόρια το ιστού στόχου, διασπά τους ενδομοριακούς δεσμούς των μακρομορίων και δημιουργεί μοριακά θραύσματα που εκτοπίζονται με μεγάλη ταχύτητα υπό μορφή έκρηξης. Αποτέλεσμα της διαδικασίας αυτής είναι η αφαίρεση τμήματος ιστού χωρίς θερμική επίδραση στους παρακείμενους ιστούς (φωτοεκτομή). 81

82 Τα κυριότερα είδη Laser που χρησιμοποιούνται στην οφθαλμολογία είναι: 1) Argon-Laser: μήκος κύματος 488 nm (κυανό) και 511 nm (πράσινο). Η δράση του είναι θερμική και προκαλεί έγκαυμα στους ιστούς. (Απορροφάται από την μελανίνη, ξανθοφύλλη, αιμοσφαιρίνη). 2) Krypton-Laser: μήκος κύματος συνήθως 641 nm. Έχει θερμική δράση στους ιστούς και δεν απορροφάται από την ξανθοφύλλη, γι αυτό και χρησιμοποιείται για φωτοπηξία αλλοιώσεων στην περιοχή της ωχράς. 3) Nd: YAG-Laser: Δραστικό υλικό: Νεοδύμιο, τα ιόντα του οποίου είναι εμφυτευμένα μέσα σε συνθετικό κρύσταλλο Αργιλικού Υττρίου, που έχει τη μορφή κυλινδρικής ράβδου. Το YAG προέρχεται από τις λέξεις Yttrium Aluminium Garnen. Μήκος κύματος: 1064 nm. 4) Dye-Laser: Δραστικό υλικό: Αργό, με την ακτινοβολία του να περνά πρώτα από οργανική χρωστική ροδαμίνη, με αποτέλεσμα τη δημιουργία νέου μήκους κύματος δέσμη Laser. 5) Diode-Laser: Δραστικό υλικό: Ένα ηλεκτρο-οπτικό σύστημα που ονομάζεται δίοδος (diodes), είναι στερεό και αποτελείται από στρώσεις μίγματος κραμάτων Αλουμινίου Γαλλίου, Αρσενίτη και Γαλλίου Αρσενίτη. Μήκος κύματος: nm. Θερμική δράση. 6) Excimer Laser: Παρουσιάστηκε για πρώτη φορά το Μάιο του 1975 από τον Stuart Seals που βομβάρδισε με ηλεκτρόνια μίγμα ξένου και 82

83 βρωμίου. Η ονομασία Excimer προήλθε από σύντμηση των λέξεων excited και dimmer που σημαίνουν «διεγερμένο διμερές» επειδή το ενεργό υλικό που παράγει την ακτινοβολία είναι συνδυασμός αερίου και αλογόνου σε ασταθή μοριακή κατάσταση. Τα αέρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν της ομάδας των ευγενών αερίων όπως Ar, Kr, Xe και He. Τα αλογόνα ήταν το Cl και το F. Ο κάθε συνδυασμός δίνει διαφορετικού μήκους κύματος υπεριώδες Laser. Ο πιο συνηθισμένος συνδυασμός είναι Ar και F με μήκος κύματος 193 nm και είναι αυτός που έχει κλινική εφαρμογή. Το Excimer Laser επιτρέπει αφαίρεση κερατοειδικού ιστού με μεγάλη ακρίβεια διαμέσου φωτοχημικής αλληλαντίδρασης Laser-ιστού. Αυτή η αλληλαντίδραση οδηγεί στην αφαίρεση της πιο επιφανειακής 0,2 έως 0,5 mm στιβάδας με κάθε παλμό. Η ενέργεια των υπεριωδών φωτονίων αρχικά σπα τους πεπτιδικούς και άνθρακα με άνθρακα μοριακούς δεσμούς. O S. Trokel και ο βιοφυσικός G. Munnerlyn συνεργάστηκαν για την κλινική εφαρμογή της νέας τεχνολογίας 100. Το 1983 προτάθηκε από τον Trokel και Srinivasan εφαρμογή του Excimer Laser στη διαθλαστική και θεραπευτική φωτοεξαίρεση. Αυτό επιτυγχάνεται με την ακριβή και ελεγχόμενη χάραξη του κερατοειδούς από Argon Fluorine (ArF) excimer Laser. Παρατηρήθηκε η διατήρηση της φυσιολογικής μικροδομής του στρώματος του κερατοειδούς κατά την ζώνη της φωτοαφαίρεσης με την ακτινοβολία των 193 nm, να προκαλεί άριστα βιολογικά αποτελέσματα και ελάχιστη θερμική βλάβη στους παρακείμενους ιστούς. Ο Trokel 100 πρώτος παρατήρησε σε ιστικές τομές στο μικροσκόπιο ότι οι κομμένες επιφάνειες των επιθηλιακών κυττάρων ήταν 83

84 τελείως καλυμμένες από πυκνές στιβάδες ηλεκτρονίων τα οποία σχηματίζουν ένα είδος μεμβράνης. Η μεμβράνη αυτή ονομάστηκε «ψευδομεμβράνη» και θεωρήθηκε ότι προστατεύει το κύτταρο από κατάρρευση, ενώ στις τομές από ατσάλινο ή διαμάντινο μαχαιρίδιο, όπου δεν παρατηρείται αυτή, η επιφάνεια των τομών είναι ανώμαλη. Η μεμβράνη καλύπτει όλη την περιοχή της ιστοαφαίρεσης και αποτελείται από δύο επιφάνειες, την πρώτη από υψηλή ηλεκτρονιακή πυκνότητα πάχους nm και μία μικρότερης ηλεκτρονιακής πυκνότητας πάχους nm. Η φύση της μεμβράνης αυτής δεν έγινε γνωστή. Υποστηρίχθηκε ότι σχηματίζεται από αδιάσπαστους οργανικούς δεσμούς που παράγονται στην επιφάνεια τη στιγμή της φωτοαφαίρεσης ή ότι είναι θερμικό προϊόν. Όμως φαίνεται να έχει τις ιδιότητες των πραγματικών μεμβρανών. Ο T Seiler 101 ήταν ο πρώτος που εφάρμοσε το excimer Laser σε ανθρώπινο μάτι για να κάνει αστιγματική κερατεκτομή το 1985 ενώ η Mc Donald 102 ήταν η πρώτη που έκανε φωτοδιαθλαστική κερατεκτομή (PRK). Ανάλογα με τον τρόπο και τη θέση εφαρμογής του Laser έχουμε τις εξής χειρουργικές μεθόδους: 1) PRK: (Photo - Refractive Keratectomy) Φωτοδιαθλαστική κερατεκτομή, που γίνεται αφαίρεση του επιθηλίου με μηχανικό τρόπο ή με το Laser και στη συνέχεια εφαρμογή του Laser ώστε να σμιλευτεί κατάλληλα η πρόσθια επιφάνεια του κερατοειδούς (αποπλάτυνση ή κύρτωση). 2) LASIK: (Laser in situ keratomileusis), όπου δημιουργείται ένας επιφανειακός κρημνός πάχους μικρών και διαμέτρου 8,5 mm 84

85 περίπου, ανασηκώνεται προσωρινά ενώ συγκρατείται από ρινικό μίσχο και η εκτομή του ιστού με το excimer γίνεται απ ευθείας στο στρώμα του κερατοειδούς. Ο κρημνός επαναφέρεται και επικάθεται πάλι στη θέση του. 3) LASEK: Laser Assisted Subepithelium Keratomileusis όπου δημιουργείται κρημνός επιθηλίου, εφαρμόζεται το laser και κάνουμε επαναφορά του επιθηλιακού κρημνού. 4) LTK: Laser Thermokeratoplasty (έως 4 D) keratomileusis: αναφέρεται στην λάξευση ή σμίλευση του κερατοειδούς. Αν και η ιδέα εισήχθε το 1949, τα πρώτα κλινικά ευρήματα δεν ανακοινώθηκαν μέχρι το 1964 από τον Jose Barraquer Κερατοσμίλευση για πρώτη φορά έγινε στις Ηνωμένες Πολιτείες το 1980 από τον Swinger 105. Ο μικροκερατόμος που χρησιμοποιείται στη μέθοδο LASIK αναπτύχθηκε από τον Luis Ruiz. Υπάρχουν στη βιβλιογραφία κάποιες μελέτες που συσχετίζουν την επίδραση του Excimer laser στο ενδοθήλιο του κερατοειδούς όπως η εργασία των Nawa Y 106, και συν, (2003) όπου καταλήγουν στο συμπέρασμα πως το υπερμετρωπικό Lasik με Nidek EC-5000 excimer laser δεν μείωσε σημαντικά τα ενδοθηλιακά κύτταρα 1 χρόνο μετά το χειρουργείο. Στο ίδιο συμπέρασμα για το υπερμετρωπικό Lasik με το VISX STAR S2 Excimer Laser καταλήγει και η μελέτη του Jabbur 107. Μία μελέτη από το Πανεπιστήμιο της Κίνας από τους Wu Z, Xu Y, Xie C 108. συμπεραίνει πως μετά από Excimer Laser εκτομή σε κουνέλια ένα 85

86 ηλεκτρονιακό υλικό εμφανίζεται στην μεμβράνη του Descemet και αλλοιώνει την ενδοθηλιακή ακεραιότητα. Η εργασία του Edelhauser 109 HF που δημοσιεύθηκε στο Cornea May 2000 αναφέρεται στην αντίδραση ενδοθηλίου κάτω από διάφορους στρεσογόνους παράγοντες όπως: η ενστάλαξη φαινυλεφρίνης, (2,5-10%) που ενώ με ανέπαφο επιθήλιο δεν επηρεάζει το ενδοθήλιο, σε περίπτωση βλάβης του επιθηλίου εισάγεται στρωματικό οίδημα και δημιουργία κενών στο ενδοθήλιο. Οι φακοί επαφής είναι ικανοί να διεγείρουν το επιθηλιακό αραχιδονικό οξύ που θα οδηγήσει στην απελευθέρωση 12(R) hydroχyeicosatetraenoic acid (12(R)HETE) και 8(R) hydroxyhexadecatrienoic acid 8(R) HHDTrE τα οποία αναστέλλουν την ενδοθηλιακή Κ + Na + -Αδενόσινοτριφωσφατάση και έτσι να οδηγούν σε πολυμεγενθυσμό. Η ίδια εργασία καταλήγει ότι με RRK και LASIK αλλά και ενδοστρωματικούς δακτυλίους, το αποτέλεσμα στο ενδοθήλιο είναι ελάχιστο. Παρ όλα αυτά, laser εκτομή στο στρώμα μέσα στα 200 micron από το ενδοθήλιο θα οδηγήσει σε δομικές αλλαγές των κυττάρων και στη δημιουργία μιας άμορφης ουσίας που εναποτίθεται πάνω στη Δεσκεμέτειο μεμβράνη. Επίσης αναφέρει τις επιδράσεις της φακοθρυψίας στο ενδοθήλιο και την πορεία ανάρρωσης του ενδοθηλίου μετά από κερατοπλαστική. 86

87 ΙΙ. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 87

88 88

89 ΣΚΟΠΟΣ Υπάρχουν ανησυχίες σχετικά με την επίδραση του Laser και της διαθλαστικής χειρουργικής, γενικότερα, στα κερατοειδικά νεύρα, στο κολλαγόνο του στρώματος και στο ενδοθήλιο. Η διατήρηση φυσιολογικού ενδοθηλίου αποτελεί τον σπουδαιότερο παράγοντα για τη διαφάνεια του κερατοειδούς και τη διατήρηση της όρασης. Σκοπός της μελέτης αυτής είναι η αναζήτηση τυχόν βλαπτικής επίδρασης στο ενδοθήλιο του κερατοειδούς, μετά την εφαρμογή του Excimer laser για τη διόρθωση μυωπίας υπερμετρωπίας και αστιγματισμού. Από όσα γνωρίζουμε και από τη μελέτη της βιβλιογραφίας δεν υπάρχει άλλη αντίστοιχη ερευνητική εργασία στον ελληνικό χώρο ενώ ακόμα και στη διεθνή βιβλιογραφία αντίστοιχες μελέτες δεν καλύπτουν όλο το φάσμα των ερωτημάτων όπως προκύπτουν από τον σκοπό της παρούσας μελέτης ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ Στόχος της μελέτης είναι να ελεγχθούν προεγχειρητικά 300 υποψήφιοι οφθαλμοί εφαρμογής laser για τη διόρθωση αμμετρωπίας τους, όσον αφορά την κατάσταση του ενδοθηλίου του κερατοειδούς των. Για το σκοπό αυτό έγινε: 1. Καταγραφή της διαθλαστικής ισχύος του ή των οφθαλμών στους οποίους θα εφαρμοσθεί το Excimer Laser 2. Φωτογράφηση της ενδοθηλιακής στοιβάδας με το ως άνω ενδοθηλιοσκόπιο 3. Καταγραφή του πάχους του κερατοειδούς και καταμέτρηση των ενδοθηλιακών κυττάρων 4. Καταγραφή του μέγιστου και του ελάσσονος ενδοθηλιακού κυττάρου καθώς και της μορφολογίας του 89

90 5. Καταγραφή δεδομένων εφαρμογής Excimer Laser (μέθοδος εφαρμογής, μέγεθος διάρκεια και βάθος εφαρμογής) Οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε εξέταση του ενδοθηλίου του κερατοειδούς με το αυτόματο χωρίς επαφή ενδοθηλιοσκόπιο τύπου Κonan NONCON ROBO Model SP-9000 στην Α Οφθαλμολογική κλινική του ΑΠΘ. Το μικροσκόπιο ήταν προγραμματισμένο να εξετάζει την ίδια πάντα περιοχή την κεντρική του κερατοειδούς. Η ανάλυση της εικόνας γίνεται με τυχαία επιλογή των δεδομένων που λαμβάνονται από τις απεικονίσεις του ενδοθηλίου της ίδιας περιοχής έτσι όπως αυτές λαμβάνονται από το βίντεο. Εικόνα 30 Η ανάλυση είναι ταχεία, μορφομετρική και έχει υψηλή επαναληψιμότητα και ακρίβεια. 90