Φαρμακευτική Bιοτεχνολογία

Transcript

1 Φαρμακευτική Bιοτεχνολογία ΔIAΛEΞΕΙΣ 5-6 ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΣΕ ΦΟΡΕΙΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΚΑΙ EIΣAΓΩΓH ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA ΣΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ-ΣΤΟΧΟΥΣ Χρήστος Παναγιωτίδης, Ph.D. Καθηγητής Κυτταρικής/Μοριακής Βιολογίας Εργαστήριο Φαρμακολογίας, Τομέας Φαρμακογνωσίας/Φαρμακολογίας Τμήμα Φαρμακευτικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Θεσσαλονίκη

2 Οι στόχοι της παρούσας διάλεξης είναι: 1) Επανάληψη αυτών που ήδη έχουμε παρουσιάσει σχετικά με την κλωνοποίηση 2) Φορείς κλωνοποίησης και φορείς έκφρασης: ομοιότητες και διαφορές 3) Κλωνοποίηση σε φορείς έκφρασης 3α) Κλωνοποίηση ενός γονιδίου με PCR χρησιμοποιώντας μήτρα DNA 3β) Κλωνοποίηση ενός γονιδίου με RT-PCR χρησιμοποιώντας μήτρα mrna 4) Κυτταρικά εργοστάσια: Κυτταρικά συστήματα που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή πρωτεϊνών. Παρουσίαση πλεονεκτημάτων και μειονεκτημάτων 5) Μέθοδοι εισαγωγής DNA στα κύτταρα στα οποία θα πρέπει να εκφρασθεί (ή να πολλαπλασιασθεί) το γονίδιο του ενδιαφέροντος.

3 Πλασμίδια: Οι πιο κοινοί φορείς κλωνοποίησης (αλλά όχι και οι μοναδικοί)

4 Τα πλασμίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν και ως φορείς κλωνοποίησης, αλλά και ως φορείς έκφρασης Τι είναι οι φορείς έκφρασης και πως διαφοροποιούνται από τους φορείς κλωνοποίησης;

5 Ας θυμηθούμε τις ιδιότητες που πρέπει να έχει ένας πλασμιδιακός φορέας κλωνοποίησης 1. Aλληλουχίεςέναρξης αντιγραφής (ORI) 2. Γονίδιο που επιτρέπει εύκολη επιλογή (π.χ. αντίσταση σε αντιβιοτικό) 3. Aλληλουχίες που επιτρέπουν κοπή από αρκετές ενδονουκλεάσες περιορισμού (polylinker) 4. ( Υποκινητής που επιτρέπει ρυθμιζόμενη έκφραση)

6 Τι ιδιότητες θα πρέπει να έχει ένας πλασμιδιακός φορέας έκφρασης; 1) Θα πρέπει να έχει όλες τις ιδιότητες ενός φορέα κλωνοποίησης 2) Θα πρέπει να μπορεί να επιτρέπει υψηλά ποσά έκφρασης της πρωτεΐνης που θέλουμε να εκφράσουμε 3) Η έκφραση θα πρέπει να είναι ρυθμιζόμενη 4) Η παραγόμενη ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη θα πρέπει να είναι λειτουργική 5) Η πρωτεΐνη θα πρέπει να κατευθύνεται στο κατάλληλο ενδοκυτταρικό διαμέρισμα 6) Η παραγόμενη πρωτεΐνη θα πρέπει να μπορεί να καθαρισθεί εύκολα και φθηνά

7 Παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων πρωτεϊνών με κλωνοποίηση γονιδίων σε φορείς έκφρασης Παράδειγμα: Οι βακτηριακοί φορείς έκφρασης pgex ("Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase (1988) Smith, D. B. and Johnson, K. S., Gene 67, ) Ιδιότητες των φορέων pgex 1. Ισχυρός και ρυθμιζόμενος υποκινητής (Tac pmoter) 2. Παρουσία γονιδίου lac Iq 3. Ετικέτα (tag) GST (θειοτρανσφεράση της γλουταθειόνης)

8 Ποιά κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως κυτταρικά εργοστάσια για την παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών; 1) Βακτήρια τα οποία φέρουν ένα πλασμίδιο που εκφράζει την πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει (π.χ. E. coli που εκφράζουν την αλυσίδα Α ή την αλυσίδα Β της ινσουλίνης) 2) Μονοκύτταροι ευκαρυώτες (π.χ. ζυμομύκητας [Sacchamyces cerevisiae], Pichia Pastoris κλπ. 3) Κυτταρικές σειρές από πολυκύτταρους ευκαρυώτες (π.χ. Sf9 & SF21 λεπιδόπτερο Spodoptera frugiperda, High-five (BTI-TN-5B1-4 ) από τονν σκόρο Trichoplusia ni (Noctuidae) κλπ. 4) Κύτταρα θηλαστικών (κυτταρικές σειρές αλλά και ολόκληροι οργανισμοί) 5) Φυτικά κύτταρα (κυτταρικές σειρές αλλά και ολόκληροι οργανισμοί) Α) Πλεονεκτήματα-Μειονεκτήματα των διαφόρων συστημάτων Β) Τρόποι έκφρασης των πρωτεϊνών (σταθερή έκφραση, ιικά λυτικά συστήματα κλπ.

9 Η σημασία της γνώσης της Κυτταρικής και της Μοριακής Βιολογίας στην έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών 1) Μηχανισμοόι που εμπλέκονται στη ρύθμιση των διαφόρων σταδίων της μεταγραφής (π.χ. έναρξη, επιμήκυνση, λήξη) 2) Μηχανισμοί που ρυθμίζουν την ωρίμανση και σταθερότητα των mrnas 3) Μηχανισμοί ρύθμισης της πρωτεϊνοσύνθεσης και παράγοντες που την επηρεάζουν 4) Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις πρωτεϊνών, ορθή αναδίπλωση, σταθερότητα κλπ. 5) Καθαρισμός και αποθήκευση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών

10 Η γνώση των αλληλουχιών των πρωτεϊνών που θα εκφρασθούν (και των γονιδίων τους) είναι απαραίτητη

11 Η γνώση των αλληλουχιών των πρωτεϊνών που θα εκφρασθούν (και των γονιδίων τους) είναι απαραίτητη

12 Α αλυσίδα Ινσουλίνης Β αλυσίδα Ινσουλίνης Παραγωγή ανασυνδυασμένης Μετασχηματισμός E. coli με τα πλασμίδια ινσουλίνης σε Ανάπτυξη βακτηρίων βακτήρια Καθαρισμός υβριδικών πρωτεϊνών β- γαλακτοσιδάσης (β-gal)- ινσουλίνης Πως έφτιαξαν ινσουλίνη από ανασυνδυασμένο DNA; Όσοι ενδιαφέρονται μπορούν να ακολουθήσουν το link : Και κατόπιν να επιλέξουν : How did they make insulin fm recombinant DNA? Α αλυσίδα Καθαρισμός Α & Β αλυσίδων Δισουλφιδικός δεσμός Ενεργή Ινσουλίνη Β αλυσίδα Figure after 2000 by Griffiths et al. ; All text material 2011 by Steven M. Carr

13 H PCR στην κλωνοποιηση DNA και RNA κύτταρα απομόνωση DNA απομόνωση RNA mrna που θα κλωνοποιηθεί DNA που θα κλωνοποιηθεί Αποδιάταξη DNA/ προσθήκη εκκινητών Προσθήκη 1 ου εκκινητή, αντίστροφης μεταγραφάσης και νουκλεοτιδίων Αποδιάταξη αλυσίδων & προσθήκη 2 ου εκκινητή Ενίσχυση Ενίσχυση με με PCR PCR Ενίσχυση με με PCR γενωμικοί κλώνοι cdna κλώνοι

14 Σχεδιασμός εκκινητών PCR Πρόσθιος εκκινητής Ανάστροφος εκκινητής

15 PCR Η ενίσχυση του DNA in vit

16 Ο κύκλος της τεχνικής PCR

17 Κλωνοποίηση προϊόντων PCR σε φορέα που εκφράζει ένα «θανατηφόρο» γονίδιο Comments for pzero nucleotides Lac Pmoter/Operator Region: bases M13 Reverse Priming Site: bases LacZα ORF: bases Sp6 Priming Site: bases Multiple Cloning Site: bases M13 (-20) Forward Priming Site: bases M13 (-40) Forward Priming Site: bases Fusion Joint: bases ccdb Lethal Gene ORF: bases f1 origin: bases Kanamycin Resistance ORF: bases ColE1 origin: bases Sp6 Nsi I* Hind III Asp718 I Kpn I Ecl136 II Sac I BamH I Spe I EcoR I Pst I EcoR V Not I Xho I Nsi I* Xba I Dra II Apa I BstB I Afl III P lac laczα SnaB I ccdb Stu I ColE1 pzero kb f1 ori Apo I * The two Nsi I sites in the MCS are the only sites in the vector. There are two tandem Apo I sites at this location. Apo I also recognizes the EcoR I site. BspH I Kanamycin A The sequence of pzero -2.1 has been compiled fm information in sequence databases, published sequences, and other sources. This vector has not been completely sequenced. If you suspect an err in the sequence, please contact Invitgen's Technical Services Department.

18 Η κατασκευή των φορέων έκφρασης pxck-κ και pxck-e ως παράδειγμα κλωνοποίησης με PCR ξεκινώντας από DNA ως υπόστρωμαμήτρα

19 Κατασκευή του φορέα pxck-e/j που εκφράζει ταυτόχρονα δύο πρωτεΐνες (GrpE & DnaJ)

20 Ταυτοποίηση της έκφρασης των πρωτεϊνών από κύτταρα που περιέχουν τους φορείς έκφρασης

21 Οι φορείς pxck-κ και pxck-e που χρησιμοποιούνται για την έκφραση πρωτεϊνών ως υβρίδια προσδεδεμένα στο C-τελικό άκρο της DnaK ή της GEL A HSP-fusion expression vectors f1 ori 6XHis-tag Multiple cloning site Thmbin cleavage f1 ori 6XHis-tag Multiple cloning site Thmbin cleavage AmpR DnaK AmpR pxck-k pxck-el 7320 bp 7017 bp T7 pmoter ColE1 ori laci ColE1 ori laci GEL T7 pmoter B BamH I EcoR I SacI SalI HindIII... TTA GTC CCA CGC GGC TCG GAT CCG AAT TCG AGC TCC GTC GAC AAG CTT... Leu Val P Arg Gly Ser Asp P Asn Ser Ser Ser Val Asp Lys Ile Thmbin cleavage site NotI XhoI GCG GCC GCA CTC GAG CAC CAC CAC CAC CAC CAC TGA... Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His Stop 6X His tag

22 Οι φορείς pxck-e/j και pxck-es που εκφράζουν πρωτεΐνες που βοηθούν τη δράσης τη DnaK ή της GEL A CmR CmR p15a ori p15a ori pxck-e/j 6917 bp pxck-es 5419 bp dnaj grpe ges T7 pmoter T7 pmoter B pet-21a pxck-es pxck-e/j DnaJ GrpE GES

23 Έκφραση της πρωτεΐνης Prion (PrP) ως υβρίδιο με μοριακές συνοδούς (HSP) Thmbin cleavage site 6X His tag HSP PrP (kda) MW Total ptein staining pxck-el pet-21a px-prp pxck-k px- px-gel-prp (kda) MW Western blot analysis pxck-el pet-21a px-prp pxck-k px- px-gel-prp GEL-PrP DnaK GEL GEL-PrP DnaK GEL PrP 30 PrP

24 tal eins uble Pteins 50 Έκφραση της πρωτεΐνης prion στα βακτήρια με μορφή υβριδίων HSP-PrP βελτιώνει τη διαλυτότητα της pe T Pr P D na K D -PrP na K D -Pr na P K- + G PrP E/J +G E r G L-P rp oes EL G -P r EL P + -P E/ rp J +G ES 64 DnaJ Total GEL-PrP64 Soluble 64 Pteins Pteins DnaJ PrP 22 GrpE Pteins Inclusion Bodies DnaJ DnaJ PrP PrP GrpE GrpE Pteins Inclusion GEL-PrP GEL-PrP DnaJ DnaJ PrP PrP GrpE GrpE Soluble GEL-PrP Pr P W pe T (KDa) GEL-PrP Total GEL-PrP GrpE 16 M Pr P pe T W M (KDa) DnaJ PrP Αδιάλυτα έγκλειστα 50 GrpE 16 M W Soluble Pteins PrP 22 GrpE D na K D -PrP na K D -Pr na P K- + G PrP E/J +G E r G L-P rp oes EL G -P r EL P + -P E/ rp J +G ES Διαλυτό κλάσμα 50 PrP GEL-PrP GEL-PrP 64 DnaJ (KDa) D na K D -PrP na K D -Pr na P K- + G PrP E/J +G E G L-P ES r EL P G PrP EL + -P E/ rp J +G ES Συνολικό εκχύλισμα Total Pteins pe T Pr P D na K D -PrP na K D -Pr na P K- + G PrP E/J +G E r G L-P rp oes EL G -P r EL P + - P E/ rp J +G ES (KDa) M W GEL-PrP Soluble GEL-PrP Pteins Δρ. Χρήστος Παναγιωτίδης Τμήμα Φαρμακευτικής, Α.Π.Θ GEL-PrP

25 Το υβρίδιο διασπάται από την θρομβίνη σε DnaK και PrP /Thmbin (KDa) MW DnaK Time (h) DnaK * * PrP 22

26 Η DnaK είναι ενζυμικά ενεργός όταν βρίσκεται σε μορφή υβριδίου με PrP DnaK A (KDa) B MW Time (min) DnaK DnaK

27 Γιατί τα HSP-υβρίδια εμφανίζουν καλύτερη διαλυτότητα; Μπορούμε να είμαστε πραγματικά σίγουροι ότι η αυξημένη διαλυτότητα εγγυάται ότι η πρωτεΐνη είναι ορθά αναδιπλωμένη;

28 Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας