Η νέα προσέγγιση στην ταχεία προγεννητική διάγνωση των χρωµοσωµατικών ανωµαλιών του εµβρύου

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "Η νέα προσέγγιση στην ταχεία προγεννητική διάγνωση των χρωµοσωµατικών ανωµαλιών του εµβρύου"

Σωκράτης Αγγελίδης
8 χρόνια πριν
Προβολές:

1 Αµνιο-PCR Η νέα προσέγγιση στην ταχεία προγεννητική διάγνωση των χρωµοσωµατικών ανωµαλιών του εµβρύου Αγγελική Χατζάκη, PhD Γεωργία Χριστοπούλου, MSc Τµήµα Γενετικής και Μοριακής Βιολογίας Μαιευτήριο «ΜΗΤΕΡΑ»

Αγγελική Χατζάκη, PhD Γεωργία Χριστοπούλου, MSc

2 Μελέτη δοµικών και αριθµητικών χρωµοσωµικών ανωµαλιών Κυτταρογενετική ΓΕΝΕΤΙΚΗ µελέτη της κληρονοµικότητας και της ποικιλοµορφίας σε όλους τους ζωντανούς οργανισµούς ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΝΘΡΩΠΟΥ =...στον άνθρωπο ΙΑΤΡΙΚΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ =...µε ιατρικό ενδιαφέρον Εφαρµογή στην κλινική διάγνωση και θεραπεία Κλινική Γενετική Μελέτη δοµής και λειτουργίας µεµονωµένων γονιδίων Μοριακή και Βιοχηµική Γενετική Πληθυσµιακή γενετική, γενετική επιδηµιολογία, αναπτυξιακή γενετική, ανοσογενετική κ.α

..µε ιατρικό ενδιαφέρον Εφαρµογή στην κλινική διάγνωση και θεραπεία Κλινική Γενετική Μελέτη δοµής και λειτουργίας

3 Ανθρώπινο γονιδίωµα: 3x10 9 bp Αριθµός γονιδίων: Μέσο µέγεθος γονιδίου: bp Αρα x10.000=3x10 8 bp Μόνο τo 1/10 χρήσιµο?? Tο πυρηνικό DNA των θηλαστικών είναι ετερογενές και αποτελείται από µοναδικές (µη επαναλαµβανόµενες) και µετρίως ή πολύ επαναλαµβανόµενες αλληλουχίες.

4 Επαναλαµβανόµενο DNA Στον άνθρωπο µοναδικό DNA 60-70% του συνολικού γονιδιώµατος 30-40% µετρίως ή πολύ επαναλαµβανόµενο Mε εξαίρεση τα (ελάχιστα) γνωστά γονίδια που βρίσκονται σε περισσότερα από ένα αντίγραφα µέσα στο ανθρώπινο DNA, το υπόλοιπο µεγάλο µέρος του µετρίως και πολύ επαναλαµβανόµενου DNA απαρτίζεται από µη κωδικές αλληλουχίες.

βρίσκονται σε περισσότερα από ένα αντίγραφα µέσα στο ανθρώπινο DNA, το υπόλοιπο

5 Επαναλαµβανόµενο DNA Οι µετρίως επαναλαµβανόµενες περιοχές βρίσκονται διεσπαρµένες µέσα στις µοναδικές αλληλουχίες του ανθρώπινου DNA Πολύ επαναλαµβανόµενο κλάσµα τείνει να συγκεντρώνεται σε ευδιάκριτες και συνεχείς περιοχές.

αλληλουχίες του ανθρώπινου DNA Πολύ επαναλαµβανόµενο

6 Πολυµορφισµοί µήκους Επαναλαµβανόµενες αλληλουχίες Ανήκουν στο µετρίως επαναλαµβανόµενο κλάσµα του ανθρώπινου πυρηνικού DNA SINEs και LINEs (short and long interspersed nuclear elements)

7 Πολυµορφισµοί µήκους STRs (short tandem repeats) Μικρές (1-6 6 bp) επαναλαµβανόµενες αλληλουχίες διασκορπισµένες στο ανθρώπινο γονιδίωµα (short tandem repeats- STRs) microsatellite DNA έως 10 5 ανά γονιδίωµα βαθµός επανάληψης ανά γενετική θέση

ανθρώπινο γονιδίωµα (short tandem repeats- STRs)

8 Εντοπισµός υψηλά πολυµορφικών περιοχών STR που συστήνονται από την GDB για την ανάλυση του χρωµοσώµατος 21

9 Πολυµορφισµοί µήκους-εφαρµογές Πληθυσµιακές µελέτες Χαρτογράφηση γονιδίων σε χρωµοσωµικές θέσεις µε ανάλυση σύνδεσης Προσυµπτωµατική και προγεννητική διάγνωση µονογονιδιακών νοσηµάτων Ταχεία προγεννητική διάγνωση χρωµοσωµιακών ανωµαλιών (ανευπλοειδίες) Εντοπισµός φορέων Βιολογικοί δείκτες για µελέτες συσχέτισης Προσωπική ταυτοποίηση Ελεγχος πατρότητας Ελεγχος συµβατότητας δότη-λήπτη για µεταµοσχεύσεις, έλεγχος ελάχιστης υπολειµµατικής νόσου (minimal residual disease - MMR)

(ανευπλοειδίες) Εντοπισµός φορέων Βιολογικοί δείκτες για µελέτες συσχέτισης Προσωπική ταυτοποίηση Ελεγχος πατρότητας

10 Αµνιο-PCR Αποµόνωση γενετικού υλικού από AF ή CVS Εκλεκτική ενίσχυση προεπιλεγµένης DNA περιοχής µε ποσοτικό φθορίζων PCR (QF-PCR) Ανίχνευση µε αυτόµατο αναλυτή αλληλουχίας DNA (ABI PRISM TM 310 Genetic Analyzer) Αριθµός αντιγράφων (ανευπλοειδίες) Μέγεθος (µοριακό βάρος)

(QF-PCR) Ανίχνευση µε αυτόµατο αναλυτή αλληλουχίας DNA (ABI PRISM

11 PCR polymerase chain reaction Αρχή της µεθόδου

12 PCR-amplification fragment length polymorphism

13 Σχηµατική αναπαράσταση QF-PCR µε χρήση υψηλά πολυµορφικών STR περιοχών Adinolfi et al., 1997

14 Amnio-PCR Amplification of D21S11 STR for trisomy 21 detection NI tris NI tris tris NI NI NI: non informative / tris: trisomy 21 detected

15 Αµνιο-PCR, πλεονεκτήµατα Ταχύτητα ( h) / ευκολία / αξιοπιστία / ευαισθησία / ευελιξία / χαµηλό κόστος λειτουργίας Μικρότερη απαιτούµενη αρχική ποσότητα εµβρυϊκού υλικού (CVS ή AF) υνατότητα ανίχνευσης πρόσµιξης από µητρικά κύτταρα υνατότητα ταυτοποίησης µονοζυγωτικών/διζυγωτικών εµβρύων υνατότητα επέκτασης της µεθόδου µε ενσωµάτωση πολλών πληροφοριακών δεικτών STR ανά χρωµόσωµα υνατότητα παραλλήλου ελέγχου φορείας σε συχνά µονογονιδιακά νοσήµατα (π.χ. µετάλλαξη F508 στο γονίδιο CFTR γιά έλεγχο κυστικής ίνωσης)

µονοζυγωτικών/διζυγωτικών εµβρύων υνατότητα επέκτασης της µεθόδου µε ενσωµάτωση πολλών πληροφοριακών δεικτών STR ανά χρωµόσωµα

16 Αµνιο-PCR, µειονεκτήµατα Απώλεια πληροφοριακότητας σε 0.3% του συνόλου των παθολογικών δειγµάτων Μωσαϊκά Άλλες αριθµητικές χρωµοσωµατικές ανωµαλίες (και πολυπλοειδίες) οµικές χρωµοσωµατικές ανωµαλίες (αναστροφές, µεταθέσεις, µικροδιπλασιασµοί, µικροελλείµµατα, µικροενθέσεις) υνατότητα µείωσης του παραπάνω ποσοστού σε 0.19% άν συµπεριληφθούν πληροφοριακοί δείκτες STR στο χρωµόσωµα Χ (XHPRT για διάγνωση σ. Turner) Υψηλό κόστος εξοπλισµού Εξειδικευµένο προσωπικό

οµικές χρωµοσωµατικές ανωµαλίες (αναστροφές, µεταθέσεις, µικροδιπλασιασµοί, µικροελλείµµατα, µικροενθέσεις)

19 PCR-amplification fragment length polymorphism

20 Σχηµατική αναπαράσταση QF-PCR µε χρήση υψηλά πολυµορφικών STR περιοχών Adinolfi et al., 1997

21 Εντοπισµός υψηλά πολυµορφικών περιοχών STR που συστήνονται από την GDB για την ανάλυση του χρωµοσώµατος 21

22 STR περιοχές που αναλύονται στα χρωµοσώµατα 21,18,13 και Χ/Υ Mult-A F R Dye PCR product size F primer sequence R primer sequence D21S NED bp 5' TAT GTG AGT CAA TTC CCC AAG TGA 3' 5' GTT GTA TTA GTC AAT GTT CTC CAG 3' D18S PET bp 5' TCA TGT GAC AAA AGC CAC AC 3' 5' AGA CAG AAA TAT AGA TGA GAA TGC A 3' D13S FAM bp 5' GGC AGA TTC AAT AGG ATA AAT AGA 3' 5' GTA ACC CCT CAG GTT CTC AAG TCT 3' AMXY FAM X:106bp / Y:112bp 5' CCC TGG GCT CTG TAA AGA ATA GTG 3' 5' ATC AGA GCT TAA ACT GGG AAG CTG 3' Mult-B D21S NED bp 5' GTA GAT ACA TAA ATA TGA TGA ATG C 3' 5' TAT TAA TGT GTG TCC TTC CAG GC 3' D18S FAM bp 5' CTC TTC CAT GAA GTA GCT AAG CAG 3' 5' TGA GTC AGG AGA ATC ACT TGG AAC 3' D13S PET bp 5' GGC AAC AAG AGC AAA ACT CT 3' 5' TAG CCC TCA CCA TGA TTG G 3' CF ( F508) FAM 94-97bp 5' GTT TTC CTG GAT TAT GCC TGG CAC 3' 5' GTT GGC ATG CTT TGA TGA CGC TTC 3' Mult-C D21S FAM bp 5' CGG AGG TTG CAG TGA GTT G 3' 5' GGG AAG GCT ATG GAG GAG A 3' X NED bp 5' TAA TGA GAG TTG GAA AGA AA 3' 5' CCC ATT GTT GCT ACT TGA GA 3' MBP-A/B PET locusa: bp 5' ATT TAC CTA CCT GTT CAT CC 3' 5'GGA CCT CGT GAA TTA CAA TC 3' locusb: bp

23 Ταχεία προγεννητική διάγνωση αριθµητικών ανωµαλιών των χρωµοσωµάτων 13,18,21 µε ανάλυση 2 πολυµορφικών STR περιοχών ανά χρωµόσωµα είγµα 1, φυσιολογικό

24 Ταχεία προγεννητική διάγνωση αριθµητικών ανωµαλιών των χρωµοσωµάτων 13,18,21 µε ανάλυση 2 πολυµορφικών STR περιοχών ανά χρωµόσωµα είγµα 2, τρισωµία

25 Ταχεία προγεννητική διάγνωση αριθµητικών ανωµαλιών των χρωµοσωµάτων 13,18,21 µε ανάλυση 2 πολυµορφικών STR περιοχών ανά χρωµόσωµα είγµα 3, τρισωµία

26 Τµήµα Κυτταρογενετικής και Μοριακής Βιολογίας «ΜΗΤΕΡΑ» Σύνολο δειγµάτων 23/5/2005 έως 30/9/2005 Σύνολο δειγµάτων προγεννητικής διάγνωσης 23/5/2005 έως 30/9/ Αµνιακό υγρό 611 Χοριακές λάχνες 216 Ιστός προϊόντος αποβολής 11 Αίµα 4

27 Τµήµα Κυτταρογενετικής και Μοριακής Βιολογίας «ΜΗΤΕΡΑ» Αποτελέσµατα QF-PCR AF CVS Φυσιολογικά Τρισωµία Τρισωµία σ. Klinefelter 1 0 Μη πληροφοριακά λόγω µητρικής πρόσµιξης 3 0 ΣΥΝΟΛΟ

28 Τµήµα Κυτταρογενετικής και Μοριακής Βιολογίας «ΜΗΤΕΡΑ» Αποτελέσµατα QF-PCR Φυσιολογικό Καρυότυπος mos46,x isoq/45,x/46xxp - Υλικό AF Φυσιολογικό 45,X CVS Φυσιολογικό mos47,xx+21 [10]/46, XX [6] 3/ =0. =0.36 CVS 36% 2 CVS και 1 AF

29 Τµήµα Κυτταρογενετικής και Μοριακής Βιολογίας «ΜΗΤΕΡΑ» Αποτελέσµατα F508 (CF) (κυστική ίνωση) AF CVS ιστός προϊόντος αποβολής Ν/Ν F508/Ν Σύνολο ετερόζυγων F508/N 13/838=1.55% Συχνότητα F508 στον Ελληνικό πληθυσµό 2.27% x 2 = / P=0.157, στατιστικά µησηµαντική απόκλιση

Σχετικά έγγραφα

Supplemental file 3. All 306 mapped IDs collected by IPA program. Supplemental file 6. The functions and main focused genes in each network.

LIST OF SUPPLEMENTAL FILES Supplemental file 1. Primer sets used for qrt-pcr. Supplemental file 2. All 1305 differentially expressed genes. Supplemental file 3. All 306 mapped IDs collected by IPA program.