Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR

Transcript

1 Δεκέμβριος 2014 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR Έκδοση 1 24 Για in vitro διαγνωστική χρήση Προορίζεται για χρήση σε συνδυασμό με τα όργανα Rotor-Gene Q MDx QIAGEN Manchester Ltd, Skelton House, Lloyd Street North, Manchester, M15 6SH, Ηνωμένο Βασίλειο R EL Sample & Assay Technologies

2 Τεχνολογίες προετοιμασίας δειγμάτων και ανάλυσης της QIAGEN Η QIAGEN είναι ο κορυφαίος προμηθευτής καινοτόμων τεχνολογιών προετοιμασίας δειγμάτων και ανάλυσης για την απομόνωση και την ανίχνευση του περιεχομένου βιολογικών δειγμάτων οποιουδήποτε τύπου. Τα προηγμένα και υψηλής ποιότητας προϊόντα και υπηρεσίες μας εξασφαλίζουν την επιτυχία, από την προετοιμασία του δείγματος μέχρι την εξαγωγή των αποτελεσμάτων. Η QIAGEN θέτει πρότυπα: στον καθαρισμό DNA, RNA και πρωτεϊνών στις αναλύσεις νουκλεϊκών οξέων και πρωτεϊνών στην έρευνα microrna και RNAi στην αυτοματοποίηση τεχνολογιών προετοιμασίας δειγμάτων και ανάλυσης Αποστολή μας είναι η διασφάλιση της επιτυχίας σας και της επίτευξης καινοτόμων ανακαλύψεων. Για περισσότερες πληροφορίες επισκεφθείτε την ιστοσελίδα

3 Περιεχόμενα Προβλεπόμενη χρήση 4 Σύνοψη και επεξήγηση 4 Αρχή της διαδικασίας 5 Υλικά που παρέχονται 8 Περιεχόμενα του κιτ 8 Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται 9 Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις 10 Πληροφορίες ασφαλείας 10 Γενικές προφυλάξεις 10 Αποθήκευση και χειρισμός αντιδραστηρίων 11 Χειρισμός και αποθήκευση δειγμάτων 12 Διαδικασία 13 Πρωτόκολλα 1: Ανίχνευση μεταλλάξεων του EGFR 14 2: Ρύθμιση Rotor-Gene Q EGFR 18 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων 33 Ποιοτικός έλεγχος 34 Περιορισμοί 34 Χαρακτηριστικά απόδοσης 35 Παραπομπές 41 Σύμβολα 42 Πληροφορίες επικοινωνίας 42 Παράρτημα A: Λεπτομέρειες μετάλλαξης 43 Πληροφορίες παραγγελίας 44 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 3

4 Προβλεπόμενη χρήση Το κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR είναι μια in vitro διαγνωστική εξέταση για την ανίχνευση των ελλείψεων στο εξόνιο 19 και των αντικαταστάσεων στα εξόνια 20 και 21 (T790M και L858R αντίστοιχα) στο γονίδιο του υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και επιτρέπει την ποιοτική αξιολόγηση της κατάστασης μετάλλαξης. Τα αποτελέσματα προορίζονται για την υποστήριξη του κλινικού ιατρού στην αναγνώριση των ασθενών με NSCLC που ενδέχεται να ωφεληθούν από τη θεραπεία με IRESSA (γεφιτινίµπη), σε περιπτώσεις όπου δεν είναι δυνατή η αξιολόγηση δείγματος ιστού. Το κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR θα πρέπει να χρησιμοποιείται από εκπαιδευμένο προσωπικό σε επαγγελματικό εργαστηριακό περιβάλλον, με δείγματα DNA που έχουν εξαχθεί από πλάσμα προερχόμενο από αίμα ασθενών με μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Το κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR προορίζεται για in vitro διαγνωστική χρήση. Σύνοψη και επεξήγηση Το κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR είναι ένα έτοιμο για χρήση προϊόν για την ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο EGFR, που σχετίζεται με τον καρκίνο, με τη χρήση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) σε όργανα Rotor-Gene Q MDx. Ο συνδυασμός των τεχνολογιών Scorpions και ARMS επιτρέπει στο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR να ανιχνεύει τις παρακάτω μεταλλάξεις του γονιδίου EGFR έναντι ενός υποβάθρου γονιδιωματικού DNA άγριου τύπου (wild type). Ελλείψεις στο εξόνιο 19 T790M L858R Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται είναι εξαιρετικά επιλεκτικές και, ανάλογα με τη συνολική ποσότητα του DNA που υπάρχει, μπορούν να ανιχνεύσουν ένα χαμηλό ποσοστό μετάλλαξης σε υπόβαθρο γονιδιωματικού DNA άγριου τύπου (wild type). Η επιλεκτικότητα καθώς και τα όρια ανίχνευσης είναι ανώτερα από άλλες τεχνολογίες, όπως η αλληλούχηση τερματισμού επιμήκυνσης με χρωστικές (dye terminator sequencing). 4 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

5 Αρχή της διαδικασίας Το κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR χρησιμοποιεί 2 τεχνολογίες ARMS και Scorpions για την ανίχνευση μεταλλάξεων κατά τη διάρκεια αντιδράσεων PCR πραγματικού χρόνου. ARMS Η ειδική για αλληλόμορφα ή μεταλλάξεις ενίσχυση επιτυγχάνεται με χρήση της τεχνολογίας ARMS (Amplification Refractory Mutation System: σύστημα ανίχνευσης μεταλλάξεων ανθεκτικών στην ενίσχυση). Η Taq DNA πολυμεράση (Taq) είναι αποτελεσματική στη διάκριση μεταξύ σωστής και εσφαλμένης αντιστοίχισης στο 3' άκρο ενός εκκινητή PCR. Ειδικές μεταλλαγμένες αλληλουχίες υφίστανται επιλεκτική ενίσχυση, ακόμη και σε δείγματα στα οποία η πλειοψηφία των αλληλουχιών δεν παρουσιάζει μετάλλαξη. Όταν υπάρχει πλήρης αντιστοίχιση του εκκινητή, η απόδοση της ενίσχυσης είναι πλήρης. Σε περίπτωση εσφαλμένης αντιστοίχισης της 3' βάσης, πραγματοποιείται μόνο ενίσχυση υποβάθρου χαμηλού επιπέδου. Scorpions Η ανίχνευση ενίσχυσης πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας την τεχνολογία Scorpions. Η τεχνολογία Scorpions συνίσταται σε διλειτουργικά μόρια που περιέχουν έναν εκκινητή PCR ομοιοπολικά συνδεδεμένο με έναν ιχνηθέτη. Το φθορισμοφόρο στον ιχνηθέτη αυτόν αλληλεπιδρά με έναν παρεμποδιστή, που περιλαμβάνεται επίσης στον ιχνηθέτη, ο οποίος μειώνει τον φθορισμό. Κατά τη διάρκεια μιας αντίδρασης PCR, όταν ο ιχνηθέτης δεσμεύεται στο αμπλικόνιο, το φθορισμοφόρο και ο παρεμποδιστής διαχωρίζονται. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του φθορισμού στο σωληνάριο αντίδρασης. Μορφή κιτ Το κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR περιλαμβάνει 4 αναλύσεις: 1 ανάλυση ελέγχου (Ctrl) 3 αναλύσεις μετάλλαξης Όλα τα μείγματα αντίδρασης περιλαμβάνουν αντιδραστήρια για την ανίχνευση στόχων επισημασμένων με FAM, καθώς και μια ανάλυση εσωτερικού ελέγχου επισημασμένη με HEX. Η ανάλυση εσωτερικού ελέγχου ανιχνεύει την παρουσία αναστολέων που ενδέχεται να οδηγήσουν σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. Η ενίσχυση FAM μπορεί να υπερισχύσει της ενίσχυσης εσωτερικού ελέγχου. Συνεπώς, η ανάλυση εσωτερικού ελέγχου χρησιμοποιείται για να υποδείξει απλά ότι τυχόν απουσία ενίσχυσης FAM αποτελεί αληθώς αρνητικό αποτέλεσμα κι όχι αποτυχία της αντίδρασης PCR. Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 5

6 Αναλύσεις: Ανάλυση ελέγχου Η ανάλυση ελέγχου, που είναι επισημασμένη με FAM, χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση του ολικού DNA σε ένα δείγμα. Η ανάλυση αυτή ενισχύει μια περιοχή του εξονίου 2 του γονιδίου EGFR. Ο εκκινητής και ο ιχνηθέτης έχουν σχεδιαστεί με τέτοιο τρόπο, ώστε να αποφεύγονται οι γνωστοί πολυμορφισμοί του EGFR. Αναλύσεις μετάλλαξης Κάθε ανάλυση μετάλλαξης περιέχει έναν ιχνηθέτη Scorpion επισημασμένο με FAM και έναν εκκινητή ARMS για τη διάκριση μεταξύ του DNA άγριου τύπου (wild type) και ενός συγκεκριμένου μεταλλαγμένου DNA. Οροί ελέγχου Σημείωση: Όλες οι εκτελέσεις πειραμάτων πρέπει να περιλαμβάνουν τους παρακάτω ορούς ελέγχου: Θετικός ορός ελέγχου Κάθε εκτέλεση πρέπει να περιέχει θετικό ορό ελέγχου στα σωληνάρια 1 4. Το κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR περιέχει έναν θετικό ορό ελέγχου EGFR (PC) για χρήση ως μήτρα στην αντίδραση θετικού ορού ελέγχου. Τα αποτελέσματα θετικού ορού ελέγχου θα αξιολογηθούν, για να διασφαλιστεί ότι η απόδοση του κιτ βρίσκεται εντός των καθορισμένων κριτηρίων αποδοχής. Αρνητικός ορός ελέγχου Κάθε εκτέλεση πρέπει να περιέχει αρνητικό ορό ελέγχου (χωρίς μήτρα, NTC) στα σωληνάρια Ο NTC αποτελείται από νερό χωρίς νουκλεάσες (H 2 O) για χρήση ως «μήτρα» στην αντίδραση ορού ελέγχου χωρίς μήτρα. Ο ορός ελέγχου χωρίς μήτρα χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση πιθανής μόλυνσης κατά την προετοιμασία της εκτέλεσης και για την αξιολόγηση της απόδοσης της αντίδρασης εσωτερικού ορού ελέγχου. 6 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

7 Αξιολόγηση αντίδρασης εσωτερικού ορού ελέγχου Κάθε μείγμα αντίδρασης περιέχει έναν εσωτερικό ορό ελέγχου επιπλέον στην αντίδραση-στόχο. Η μη επιτυχής έκβαση υποδεικνύει είτε την ύπαρξη αναστολέων, που ενδέχεται να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα, είτε την ύπαρξη σφάλματος στην προετοιμασία της ανάλυσης από τον χειριστή για το συγκεκριμένο σωληνάριο. Σε περίπτωση που η μη επιτυχής ανάλυση του εσωτερικού ορού ελέγχου οφείλεται σε αναστολή της PCR, η αραίωση του δείγματος μπορεί να μειώσει τη δράση των αναστολέων. Ωστόσο, πρέπει να σημειωθεί ότι στην περίπτωση αυτή αραιώνεται και το DNA-στόχος. Η ενίσχυση FAM μπορεί να υπερισχύσει της ενίσχυσης του εσωτερικού ορού ελέγχου, με αποτέλεσμα η τιμή εσωτερικού ορού ελέγχου (IC) CT (HEX) που προκύπτει να βρίσκεται ενδεχομένως εκτός του καθορισμένου εύρους. Τα αποτελέσματα FAM παραμένουν έγκυρα για αυτά τα δείγματα. Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 7

8 Υλικά που παρέχονται Περιεχόμενα του κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR Kit (24) Αρ. καταλόγου Αριθμός αντιδράσεων 24 Κόκκινο Πορφυρό Control Reaction Mix (Μείγμα αντίδρασης ορού ελέγχου) T790M Reaction Mix (Μείγμα αντίδρασης T790M) Πορτοκαλί Deletions Reaction Mix (Μείγμα αντίδρασης ελλείψεων) Ροζ Μπεζ Πράσινο της μέντας Λευκό Λευκό L858R Reaction Mix (Μείγμα αντίδρασης L858R) EGFR Positive Control (Θετικός ορός ελέγχου EGFR) Taq DNA Polymerase (Taq DNA πολυμεράση) Νερό χωρίς νουκλεάσες για ορό ελέγχου χωρίς μήτρα Νερό χωρίς νουκλεάσες για αραίωση Ctrl µl T790M 600 µl Del 600 µl L858R 600 µl PC 300 µl Taq 2 80 µl NTC 1 1,9 ml Dil 1 1,9 ml 8 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

9 Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Κατά την εργασία με χημικά, φοράτε πάντα κατάλληλη προστατευτική ποδιά εργαστηρίου, γάντια μίας χρήσης και προστατευτικά γυαλιά. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στα σχετικά δελτία δεδομένων ασφαλείας (SDS), τα οποία διατίθενται από τον προμηθευτή του προϊόντος. Κιτ εκχύλισης DNA (βλ. «Διαδικασία», σελίδα 13) Ειδικές πιπέτες* (ρυθμιζόμενες) για προετοιμασία δειγμάτων Ειδικές πιπέτες* (ρυθμιζόμενες) για την προετοιμασία του κύριου μείγματος PCR Ειδικές πιπέτες* (ρυθμιζόμενες) για τη διοχέτευση της μήτρας DNA Ρύγχη πιπέτας χωρίς δεοξυριβονουκλεάση, ριβονουκλεάση και DNA, με φίλτρα (για την αποφυγή διασταυρούμενης μόλυνσης, συνιστάται η χρήση ρυγχών πιπέτας με φραγμό αερολυμάτων) Υδατόλουτρο ή παρόμοια συσκευή με δυνατότητα διατήρησης σωληναρίων φυγοκέντρησης των 50 ml στους 60 C. Θερμαντικό μπλοκ ή παρόμοια συσκευή με δυνατότητα επώασης στους 56 C* Θρυμματισμένος πάγος Επιτραπέζια φυγόκεντρος* με ρότορα για σωληνάρια αντίδρασης 2 ml Αναδευτήρας τύπου vortex Όργανο Rotor-Gene Q MDx* με κανάλια φθορισμού για Cycling Green και Cycling Yellow (ανίχνευση FAM και HEX, αντίστοιχα) Λογισμικό Rotor-Gene Q, έκδοση 2.3 Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (Σειρές σωληναρίων και πώματα, 0,1 ml), για χρήση σε ρότορα 72 βυθισμάτων (αρ. κατ ή ) Σωληνάρια μικροφυγόκεντρου χωρίς δεοξυριβονουκλεάση, ριβονουκλεάση και DNA, για την προετοιμασία κύριων μειγμάτων Loading Block ml Tubes (Μπλοκ φόρτωσης για 72 0,1 ml σωληνάρια), μονάδα αλουμινίου για χειροκίνητη προετοιμασία αντίδρασης με μονοκάναλη πιπέτα (QIAGEN, αρ. κατ ) * Βεβαιωθείτε ότι τα όργανα έχουν ελεγχθεί και βαθμονομηθεί σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Στο παρόν, δεν αναφέρονται όλοι οι προμηθευτές. Μη χρησιμοποιείτε μετουσιωμένη αλκοόλη που περιέχει άλλες ουσίες, όπως μεθανόλη ή μεθυλαιθυλοκετόνη. Σε ορισμένες χώρες, μπορεί να χρησιμοποιηθεί το όργανο Rotor-Gene Q 5plex HRM με ημερομηνία παραγωγής Μαΐου 2011 ή μεταγενέστερη, κατά περίπτωση. Η ημερομηνία παραγωγής μπορεί να προσδιοριστεί από τον αριθμό σειράς στο πίσω μέρος του οργάνου. Ο αριθμός σειράς αναγράφεται σε μορφή «μμεεααα», όπου το «μμ» υποδεικνύει τον μήνα παραγωγής σε ψηφία, το «εε» υποδεικνύει τα δύο τελευταία ψηφία του έτους παραγωγής και το «ααα» υποδεικνύει το μοναδικό αναγνωριστικό του οργάνου. Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 9

10 Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις Για in vitro διαγνωστική χρήση Για επαγγελματική χρήση Πληροφορίες ασφαλείας Κατά την εργασία με χημικά, φοράτε πάντα κατάλληλη προστατευτική ποδιά εργαστηρίου, γάντια μίας χρήσης και προστατευτικά γυαλιά. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στα σχετικά δελτία δεδομένων ασφάλειας (SDS). Διατίθενται στο Διαδίκτυο σε εύχρηστη και συμπιεσμένη μορφή PDF, στην ιστοσελίδα όπου μπορείτε να βρείτε, να εμφανίσετε και να εκτυπώσετε τα SDS για όλα τα κιτ της QIAGEN καθώς και για τα συστατικά τους. Γενικές προφυλάξεις Ο χρήστης πρέπει να λαμβάνει πάντοτε υπόψη του τα εξής: Χρησιμοποιείτε ρύγχη πιπέτας χωρίς δεοξυριβονουκλεάση, ριβονουκλεάση και DNA, με φίλτρα, και βεβαιωθείτε ότι οι πιπέτες έχουν βαθμονομηθεί σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αποθηκεύετε και εξάγετε τα θετικά υλικά (δείγματα και θετικούς ορούς ελέγχου) ξεχωριστά από όλα τα υπόλοιπα αντιδραστήρια και προσθέτετέ τα στο μείγμα αντίδρασης σε ξεχωριστό χώρο. Αποψύχετε πλήρως όλα τα συστατικά σε θερμοκρασία δωματίου (15 25 C) πριν από την έναρξη μιας ανάλυσης. Αφού αποψυχθούν τα συστατικά, αναμείξτε τα αναστρέφοντας κάθε σωληνάριο 10 φορές και φυγοκεντρήστε στιγμιαία. Σημείωση: Απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή για την αποφυγή της μόλυνσης των αντιδράσεων PCR με συνθετικό υλικό ελέγχου. Συνιστάται η χρήση ξεχωριστών, ειδικών πιπετών για την προετοιμασία των μειγμάτων αντίδρασης και την προσθήκη της μήτρας DNA. Η προετοιμασία και η διοχέτευση των μειγμάτων αντίδρασης θα πρέπει να πραγματοποιείται σε ξεχωριστό χώρο από εκείνον που χρησιμοποιήθηκε για την προσθήκη της μήτρας. Τα σωληνάρια Rotor-Gene Q δεν πρέπει να ανοίγονται μετά την ολοκλήρωση της εκτέλεσης PCR. Αυτό αποσκοπεί στην αποτροπή τυχόν εργαστηριακής λοίμωξης από προϊόντα που προκύπτουν μετά την ανάλυση PCR. Σημείωση: Τα αντιδραστήρια έχουν εγκριθεί για χειροκίνητη προετοιμασία. Εάν χρησιμοποιήσετε αυτοματοποιημένη μέθοδο, ενδέχεται να μειωθεί ο αριθμός των εφικτών αντιδράσεων, καθώς σε αυτά τα όργανα απαιτείται πλήρωση «νεκρών όγκων» με τα αντιδραστήρια. Σημείωση: Όλα τα αντιδραστήρια του κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR έχουν παρασκευαστεί ειδικά για χρήση με τις εξετάσεις που αναφέρονται. 10 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

11 Όλα τα αντιδραστήρια που παρέχονται στο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR προορίζονται για χρήση αποκλειστικά με τα άλλα αντιδραστήρια που παρέχονται στο ίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR. Τα αντιδραστήρια του κιτ δεν πρέπει να αντικαθίστανται, ώστε να διατηρηθεί η βέλτιστη απόδοση. Σημείωση: Χρησιμοποιείτε μόνο την Taq DNA πολυμεράση (Taq) που παρέχεται με το κιτ. Μην την αντικαθιστάτε με Taq DNA πολυμεράση άλλων κιτ ίδιου ή διαφορετικού τύπου ή με Taq DNA πολυμεράση άλλου προμηθευτή. Σημείωση: Τα αντιδραστήρια για το κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR έχουν αραιωθεί σε βέλτιστο βαθμό. Δεν συνιστάται περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων, καθώς κάτι τέτοιο μπορεί να οδηγήσει σε μείωση της απόδοσης. Δεν συνιστάται η χρήση όγκων αντίδρασης κάτω από 25 µl, καθώς στην περίπτωση αυτή αυξάνεται ο κίνδυνος ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων. Αποθήκευση και χειρισμός αντιδραστηρίων Το κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR αποστέλλεται σε ξηρό πάγο. Εάν οποιοδήποτε συστατικό του κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR δεν είναι κατεψυγμένο κατά την παραλαβή, η εξωτερική συσκευασία έχει ανοίξει κατά τη μεταφορά ή στο κιβώτιο αποστολής δεν περιλαμβάνονται το δελτίο συσκευασίας, οι οδηγίες χρήσης ή τα αντιδραστήρια, επικοινωνήστε με κάποιο από τα τμήματα τεχνικής υποστήριξης της QIAGEN ή με τους τοπικούς αντιπροσώπους (επισκεφτείτε την ιστοσελίδα Το κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR θα πρέπει να αποθηκεύεται αμέσως μετά την παραλαβή στους -15 έως -30 C σε καταψύκτη σταθερής θερμοκρασίας, σε σκοτεινό χώρο. Το κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR παραμένει σταθερό μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης, εφόσον αποθηκεύεται υπό τις καθορισμένες συνθήκες αποθήκευσης. Μετά το άνοιγμα, τα αντιδραστήρια μπορούν να αποθηκευτούν στην αρχική τους συσκευασία σε θερμοκρασία -15 έως -30 C για 90 ημέρες ή μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης, όποιο επέλθει πρώτο. Η επανειλημμένη απόψυξη και κατάψυξη θα πρέπει να αποφεύγεται. Μην υπερβαίνετε το μέγιστο όριο 8 κύκλων κατάψυξης-απόψυξης. Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/

12 Η απόψυξη των αντιδραστηρίων πρέπει να πραγματοποιείται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για τουλάχιστον 1 ώρα και μέχρι 4,5 ώρες το πολύ. Όταν τα αντιδραστήρια είναι έτοιμα για χρήση, μπορείτε να προετοιμάσετε τις αντιδράσεις PCR. Μπορείτε να φορτώσετε αμέσως στο όργανο Rotor-Gene Q τα σωληνάρια Rotor-Gene Q MDx που περιέχουν τα κύρια μείγματα και το δείγμα DNA. Ο συνολικός χρόνος αναμονής μετά την προετοιμασία των αντιδράσεων PCR και πριν από την εκτέλεση δεν πρέπει να υπερβαίνει τις: 7 ώρες εάν έχουν αποθηκευτεί σε θερμοκρασία περιβάλλοντος Σημείωση: Ο χρόνος αυτός περιλαμβάνει την προετοιμασία PCR και την αποθήκευση. 18 ώρες εάν έχουν αποθηκευτεί σε ψυγείο (2 8 C) Σημείωση: Ο χρόνος αυτός περιλαμβάνει την προετοιμασία PCR και την αποθήκευση. Σημείωση: Τα Scorpions (όπως όλα τα επισημασμένα με φθορισμό μόρια) στα αντιδραστήρια μείγματος αντίδρασης είναι φωτοευαίσθητα. Απαιτείται η προστασία των αντιδραστηρίων του μείγματος αντίδρασης και του ορού ελέγχου από το φως, ώστε να αποφευχθεί τυχόν φωτολεύκανση. Τα αντιδραστήρια στο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR έχουν αραιωθεί σε βέλτιστο βαθμό και δεν απαιτείται περαιτέρω καθαρισμός ή επεξεργασία πριν από τη χρήση τους στην ανάλυση, σύμφωνα με τις οδηγίες χρήσης του κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR (Εγχειρίδιο). Εφιστάται η προσοχή στις ημερομηνίες λήξης και τις συνθήκες αποθήκευσης που αναγράφονται στα κουτιά και τις ετικέτες όλων των συστατικών. Μη χρησιμοποιείτε το περιεχόμενο της συσκευασίας αν έχει παρέλθει η ημερομηνία λήξης ή δεν έχουν ληφθεί τα σωστά μέτρα αποθήκευσης. Χειρισμός και αποθήκευση δειγμάτων Σημείωση: Όλα τα δείγματα πρέπει να αντιμετωπίζονται ως εν δυνάμει μολυσματικά υλικά. Το υλικό δείγματος πρέπει να είναι γονιδιωματικό DNA ανθρώπινης προέλευσης εκχυλισμένο από πλάσμα. Η μεταφορά των δειγμάτων πρέπει να πραγματοποιείται σύμφωνα με την τυπική μεθοδολογία της παθολογοανατομίας, για τη διασφάλιση της ποιότητάς τους. 12 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

13 Διαδικασία Εκχύλιση DNA Τα χαρακτηριστικά απόδοσης αυτού του κιτ προσδιορίστηκαν με χρήση DNA που εκχυλίστηκε με το κιτ QIAamp Circulating Nucleic Acid (αρ. κατ ). Όταν χρησιμοποιείτε το κιτ QIAamp Circulating Nucleic Acid, εκτελέστε την εκχύλιση του DNA σύμφωνα με τις οδηγίες του εγχειριδίου, προσέχοντας τα εξής: Ο αρχικός όγκος πλάσματος είναι 2 ml. Πριν από την εκχύλιση του DNA πρέπει να γίνει φυγοκέντρηση 2 ml πλάσματος σε ταχύτητα σ.α.λ. επί 2 λεπτά και να μεταφερθεί το υπερκείμενο σε καθαρό σωληνάριο. Ο όγκος της πρωτεϊνάσης K πρέπει να είναι 250 µl. Η διάσπαση με πρωτεϊνάση K πρέπει να πραγματοποιηθεί επί 1 ώρα στους 60 C. Η έκλουση του καθαρού γονιδιωματικού DNA πρέπει να πραγματοποιείται σε 55 µl ρυθμιστικού διαλύματος AVE (παρέχεται στο κιτ QIAamp Circulating Nucleic Acid). Αποθηκεύστε το καθαρό γονιδιωματικό DNA στους -15 έως -30 C. Σημείωση: Από όλες τις αναλύσεις στο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR δημιουργούνται προϊόντα PCR μικρού μήκους. Ωστόσο, το κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR δεν είναι αποτελεσματικό, όταν το DNA είναι ιδιαίτερα κατακερματισμένο. Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/

14 Πρωτόκολλο 1: Ανίχνευση μεταλλάξεων του EGFR Σημαντικές πληροφορίες πριν από την έναρξη Πριν ξεκινήσετε τη διαδικασία, διαβάστε τις «Γενικές προφυλάξεις», στη σελίδα 10. Αφιερώστε χρόνο για να εξοικειωθείτε με το Rotor-Gene Q MDx πριν προχωρήσετε στην εφαρμογή του πρωτοκόλλου. Ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήστη του οργάνου. Μη στροβιλίζετε την Taq DNA πολυμεράση (Taq) ή οποιοδήποτε μείγμα που περιέχει Taq DNA πολυμεράση, καθώς υπάρχει κίνδυνος αδρανοποίησης του ενζύμου. Είναι δυνατή η εκτέλεση έως και 16 δειγμάτων σε μία πλάκα. Αναρροφήστε την Taq, τοποθετώντας το ρύγχος της πιπέτας ακριβώς κάτω από την επιφάνεια του υγρού, ώστε να αποφευχθεί η επικάλυψη του ρύγχους με περίσσεια ενζύμου. Για κάθε δείγμα DNA οι αναλύσεις ελέγχου και μετάλλαξης πρέπει να πραγματοποιούνται στην ίδια εκτέλεση PCR, ώστε να αποφευχθούν διακυμάνσεις μεταξύ εκτελέσεων. Απαραίτητα βήματα πριν από την έναρξη Πριν από κάθε χρήση, όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να αποψύχονται εντελώς για τουλάχιστον 1 ώρα και μέχρι 4,5 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου (15 25 C), να αναμειγνύονται με αναστροφή 10 φορές και να υποβάλλονται σε φυγοκέντρηση για σύντομο χρονικό διάστημα, ώστε το περιεχόμενο να συγκεντρωθεί στον πυθμένα των σωληναρίων. Βεβαιωθείτε ότι η Taq βρίσκεται σε θερμοκρασία δωματίου (15 25 C) πριν από κάθε χρήση. Φυγοκεντρήστε για σύντομο χρονικό διάστημα το σωληνάριο, ώστε το ένζυμο να συγκεντρωθεί στον πυθμένα του σωληναρίου. Διαδικασία 1. Αποψύξτε πλήρως όλα τα μείγματα αντίδρασης, το νερό χωρίς νουκλεάσες για ορό ελέγχου χωρίς μήτρα (NTC) και τον θετικό ορό ελέγχου (PC) EGFR σε θερμοκρασία δωματίου (15 25 C) για τουλάχιστον 1 ώρα. Όταν τα αντιδραστήρια έχουν αποψυχθεί, αναμείξτε τα αναστρέφοντας κάθε σωληνάριο 10 φορές, για την αποφυγή τοπικών συγκεντρώσεων αλάτων και, στη συνέχεια, εκτελέστε φυγοκέντρηση για σύντομο χρονικό διάστημα, ώστε το περιεχόμενο να συγκεντρωθεί στον πυθμένα των σωληναρίων. 14 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

15 Πίνακας 1. Χρόνοι απόψυξης, χρόνοι προετοιμασίας PCR και θερμοκρασίες αποθήκευσης Χρόνος απόψυξης Ελάχιστος χρόνος Μέγιστος χρόνος Θερμοκρασία αποθήκευσης μετά την προετοιμασία PCR 1 ώρα 4,5 ώρες Θερμοκρασία δωματίου (15 25 C) Μέγιστος χρόνος προετοιμασίας PCR και αποθήκευσης 7 ώρες 1 ώρα 4,5 ώρες 2 8 C 18 ώρες Σημείωση: Η προετοιμασία PCR πρέπει να πραγματοποιείται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ο όρος «Αποθήκευση» αναφέρεται στο χρόνο μεταξύ της ολοκλήρωσης της προετοιμασίας PCR και της έναρξης της εκτέλεσης PCR στο όργανο Rotor-Gene Q MDx. Σημείωση: Αφήστε την Taq DNA πολυμεράση (σωληνάριο Taq) να φθάσει σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (15 25 C) συγχρόνως με τα άλλα αντιδραστήρια (βλ. «Αποθήκευση και χειρισμός αντιδραστηρίων», σελίδα 11). Φυγοκεντρήστε για σύντομο χρονικό διάστημα το σωληνάριο, ώστε το ένζυμο να συγκεντρωθεί στον πυθμένα του σωληναρίου. 2. Επισημάνετε 4 σωληνάρια μικροφυγόκεντρου (δεν παρέχονται) ανάλογα με κάθε αντίστοιχο μείγμα αντίδρασης, όπως φαίνεται στον Πίνακα 2. Παρασκευάστε επαρκείς ποσότητες κύριων μειγμάτων (μείγμα αντίδρασης ελέγχου ή μετάλλαξης [CTRL, T790M, Deletions, L858R] και Taq DNA πολυμεράση [Taq]) για τα δείγματα DNA, μία αντίδραση θετικού ελέγχου (σωληνάριο PC) EGFR και μία αντίδραση με νερό χωρίς νουκλεάσες για ορό ελέγχου χωρίς μήτρα (σωληνάριο NTC) σύμφωνα με τους όγκους που αναφέρονται στον Πίνακα 2. Συμπεριλάβετε αντιδραστήρια για 1 επιπλέον δείγμα, ώστε να υπάρχει επαρκής περίσσεια υλικού για την προετοιμασία της PCR. Τα κύρια μείγματα περιέχουν όλα τα συστατικά που απαιτούνται για την αντίδραση PCR εκτός από το δείγμα. Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/

16 Πίνακας 2. Παρασκευή κύριων μειγμάτων* Ανάλυση Σωληνάριο μείγματος αντίδρασης Όγκος μείγματος αντίδρασης Όγκος Taq DNA πολυμεράσης (σωληνάριο Taq) Ορός ελέγχου CTRL 19,50 µl (n + 1) 0,50 µl (n + 1) T790M T790M 19,50 µl (n + 1) 0,50 µl (n + 1) Ελλείψεις Del 19,50 µl (n + 1) 0,50 µl (n + 1) L858R L858R 19,50 µl (n + 1) 0,50 µl (n + 1) * Κατά την παρασκευή του κύριου μείγματος, παρασκευάστε αρκετό υλικό για ένα επιπλέον δείγμα, ώστε να υπάρχει επαρκής περίσσεια υλικού για την προετοιμασία της PCR. Σημείωση: Κατά την παρασκευή του κύριου μείγματος, προστίθεται αρχικά ο απαιτούμενος όγκος του μείγματος αντίδρασης ελέγχου ή μετάλλαξης στο σχετικό σωληνάριο και στη συνέχεια προστίθεται η Taq DNA πολυμεράση. 3. Τοποθετήστε τον κατάλληλο αριθμό σωληναρίων για PCR σε σειρές των 4 (κάθε σειρά έχει 4 σωληνάρια) στο μπλοκ φόρτωσης, σύμφωνα με τη διάταξη στον Πίνακα 3. Μην τοποθετείτε πώματα στα σωληνάρια. Σημείωση: Αφήστε τα πώματα στον πλαστικό περιέκτη μέχρι να τα χρειαστείτε. 4. Πωματίστε το σωληνάριο για το κύριο μείγμα, αναστρέψτε 10 φορές για να αναμείξετε το κύριο μείγμα και στη συνέχεια φυγοκεντρήστε για σύντομο χρονικό διάστημα ώστε το μείγμα να συγκεντρωθεί στον πυθμένα του σωληναρίου. Προσθέστε αμέσως 20 µl κύριου μείγματος στο κάθε κατάλληλο σωληνάριο της σειράς για PCR. 5. Προσθέστε αμέσως 5 µl νερού χωρίς νουκλεάσες (H 2 O) στις σειρές σωληναρίων για PCR του ορού ελέγχου χωρίς μήτρα (σωληνάρια PCR αρ. 9 12) και πωματίστε τα. 6. Προσθέστε 5 µl κάθε δείγματος στα σωληνάρια δείγματος (σωληνάρια PCR 5 8, και 17 72) και πωματίστε τα. 7. Προσθέστε 5 µl θετικού ορού ελέγχου (PC) EGFR στα σωληνάρια θετικού ορού ελέγχου (σωληνάρια PCR αρ. 1 4). Κάθε δείγμα DNA πρέπει να υποβληθεί σε εξέταση με την ανάλυση ελέγχου και με όλες τις αναλύσεις μετάλλαξης. Η διάταξη παρατίθεται στον Πίνακα Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

17 Πίνακας 3. Διάταξη αναλύσεων ελέγχου και μετάλλαξης Οροί ελέγχου Αριθμός δείγματος Ανάλυση PC NTC Ctrl T790M Ελλείψεις L858R Αριθμός δείγματος Ανάλυση Ctrl T790M Ελλείψεις L858R Με έναν ανεξίτηλο μαρκαδόρο, επισημάνετε τα καπάκια των πρώτων σωληναρίων στη χαμηλότερη αριθμητική θέση σε κάθε σωληνάριο για PCR στη σειρά των 4 (π.χ. θέσεις 1, 5 και 9, κ.λπ.) για να υποδεικνύεται ο προσανατολισμός για τη φόρτωση των σωληναρίων μέσα στον ρότορα 72 βυθισμάτων του οργάνου Rotor-Gene Q MDx. 9. Τοποθετήστε όλα τα σωληνάρια για PCR σε σειρές των 4 στις αντίστοιχες θέσεις στον ρότορα 72 βυθισμάτων και βεβαιωθείτε ελέγχοντας οπτικά ότι όλα τα σωληνάρια περιέχουν τον ίδιο όγκο υλικού. Σημείωση: Βεβαιωθείτε ότι οι σειρές σωληναρίων δεν έχουν αναστραφεί κατά τη μεταφορά τους στον ρότορα. 10. Εάν ο ρότορας δεν είναι πλήρης, τοποθετήστε άδεια σωληνάρια με πώμα στις κενές θέσεις. 11. Τοποθετήστε αμέσως τον ρότορα μέσα στο Rotor-Gene Q MDx. Βεβαιωθείτε ότι ο δακτύλιος ασφάλισης (εξάρτημα του οργάνου Rotor-Gene Q MDx) είναι τοποθετημένος στο πάνω μέρος του ρότορα για την ασφάλιση των σωληναρίων κατά τη διάρκεια της εκτέλεσης. 12. Ανατρέξτε στις ρυθμίσεις του οργάνου Rotor-Gene Q MDx (βλ. «Πρωτόκολλο 2: Ρύθμιση Rotor-Gene Q EGFR», σελίδα 18), για να δημιουργήσετε το προφίλ θερμοκρασίας και να ξεκινήσετε την εκτέλεση. Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/

18 Πρωτόκολλο 2: Ρύθμιση Rotor-Gene Q EGFR Συνοψίζοντας, οι παράμετροι κυκλοποίησης είναι οι εξής. Πίνακας 4. Παράμετροι κυκλοποίησης Κύκλοι Θερμοκρασία Χρόνος Λήψη δεδομένων 1 95 C 15 λεπτά Κανένα C 30 δευτερόλεπτα Κανένα 60 C 60 δευτερόλεπτα Πράσινο και κίτρινο 1. Κάντε διπλό κλικ στο εικονίδιο του λογισμικού σειράς Rotor-Gene Q, έκδοση 2.3, στην επιφάνεια εργασίας του φορητού υπολογιστή που είναι συνδεδεμένος με το όργανο Rotor-Gene Q MDx. Επιλέξτε την καρτέλα «Advanced» (Για προχωρημένους) στο πλαίσιο διαλόγου «New Run» (Νέα εκτέλεση) που εμφανίζεται. 2. Για να δημιουργήσετε ένα νέο πρότυπο, επιλέξτε «Empty Run» (Κενή εκτέλεση) και στη συνέχεια κάντε κλικ στο «New» (Νέα) για να μεταβείτε στο «New Run Wizard» (Οδηγός νέας εκτέλεσης). 3. Στον τύπο ρότορα επιλέξτε «72-Well Rotor» (Ρότορας 72 βυθισμάτων). Βεβαιωθείτε ότι ο δακτύλιος ασφάλισης είναι τοποθετημένος και επισημάνετε το πλαίσιο «Locking Ring Attached» (Δακτύλιος ασφάλισης τοποθετημένος). Κάντε κλικ στο «Next» (Επόμενο) (βλ. Εικόνα 1) Εικόνα 1. Πλαίσιο διαλόγου «New Run Wizard» (Οδηγός νέας εκτέλεσης). 18 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

19 4. Πληκτρολογήστε το όνομα του χειριστή. Προσθέστε τυχόν σημειώσεις και δώστε την τιμή 25 για τον όγκο αντίδρασης. Βεβαιωθείτε ότι στο πλαίσιο «Sample Layout» (Διάταξη δειγμάτων) εμφανίζεται η ένδειξη «1, 2, 3». Κάντε κλικ στο «Next» (Επόμενο) (βλ. Εικόνα 2) Εικόνα 2. Εισαγωγή ονόματος χειριστή και όγκων αντίδρασης Κάντε κλικ στο κουμπί «Edit Profile» (Επεξεργασία προφίλ) στο πλαίσιο διαλόγου «New Run Wizard» (Οδηγός νέας εκτέλεσης) (βλ. Εικόνα 3) και προγραμματίστε τις παραμέτρους της εκτέλεσης σύμφωνα με τις οδηγίες των παρακάτω βημάτων. 1 Εικόνα 3. Επεξεργασία του προφίλ. Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/

20 6. Κάντε κλικ στο κουμπί «Insert after» (Εισαγωγή μετά από) και επιλέξτε «New Hold at Temperature» (Διατήρηση νέας θερμοκρασίας) (βλ. Εικόνα 4). 1 2 Εικόνα 4. Εισαγωγή ενός αρχικού βήματος επώασης. 7. Αλλάξτε την τιμή στο πλαίσιο «Hold Temperature» (Διατήρηση θερμοκρασίας) σε 95 C και την τιμή στο πλαίσιο «Hold Time» (Χρόνος διατήρησης) σε «15 mins 0 secs» (15 λεπτά 0 δευτερόλεπτα). Κάντε κλικ στο κουμπί «Insert after» (Εισαγωγή μετά από) και στη συνέχεια επιλέξτε «New Cycling» (Νέα κυκλοποίηση) (βλ. Εικόνα 5) Εικόνα 5. Αρχικό βήμα επώασης στους 95 C. 20 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

21 8. Αλλάξτε τον αριθμό επαναλήψεων κύκλου σε 40. Επιλέξτε το πρώτο βήμα και ρυθμίστε σε «95 C for 30 secs» (95 C για 30 δευτερόλεπτα) (βλ. Εικόνα 6) Εικόνα 6. Βήμα κυκλοποίησης στους 95 C. Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/

22 9. Επισημάνετε το δεύτερο βήμα και ρυθμίστε σε «60 C for 60 secs» (60 C για 60 δευτερόλεπτα). Ενεργοποιήστε τη λήψη δεδομένων κατά τη διάρκεια αυτού του βήματος, πατώντας το κουμπί «Not Acquiring» (Δεν γίνεται λήψη) (βλ. Εικόνα 7). 2 1 Εικόνα 7. Βήμα κυκλοποίησης στους 60 C. 22 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

23 10. Ορίστε τα «Green» (Πράσινο) και «Yellow» (Κίτρινο) ως κανάλια λήψης, χρησιμοποιώντας το κουμπί «>» για να τα μεταφέρετε από τη λίστα «Available Channels» (Διαθέσιμα κανάλια). Κάντε κλικ στο «OK» (βλ. Εικόνα 8). 1 2 Εικόνα 8. Λήψη στο βήμα κυκλοποίησης των 60 C. Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/

24 11. Επισημάνετε το τρίτο βήμα και διαγράψτε το κάνοντας κλικ στο κουμπί «-». Κάντε κλικ στο «OK» (βλ. Εικόνα 9). 2 1 Εικόνα 9. Διαγραφή του βήματος επέκτασης Στο επόμενο πλαίσιο διαλόγου, κάντε κλικ στο κουμπί «Gain Optimisation» (Βελτιστοποίηση απολαβής) (βλ. Εικόνα 10). 1 Εικόνα 10. Βελτιστοποίηση απολαβής. 24 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

25 13. Κάντε κλικ στο κουμπί «Optimise Acquiring» (Βελτιστοποίηση λήψης). Εμφανίζονται οι ρυθμίσεις καναλιού για κάθε κανάλι. Αποδεχτείτε αυτές τις προεπιλεγμένες τιμές κάνοντας κλικ στο «OK» και για τα δύο κανάλια (βλ. Εικόνα 11). 1 2 Εικόνα 11. Αυτόματη βελτιστοποίηση απολαβής για το πράσινο κανάλι. Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/

26 14. Επισημάνετε το πλαίσιο «Perform Optimisation before 1st Acquisition» (Εκτέλεση βελτιστοποίησης πριν από την 1η λήψη) και, στη συνέχεια, κάντε κλικ στο κουμπί «Close» (Κλείσιμο) για να επιστρέψετε στον οδηγό (βλ. Εικόνα 12). 1 2 Εικόνα 12. Επιλογή πράσινου και κίτρινου καναλιού. 15. Κάντε κλικ στο «Next» (Επόμενο) για να αποθηκεύσετε το πρότυπο σε κατάλληλη θέση επιλέγοντας «Save Template» (Αποθήκευση προτύπου). Ανάλυση δεδομένων αξιολόγησης μεταλλάξεων Μετά την ολοκλήρωση της εκτέλεσης, αναλύστε τα δεδομένα σύμφωνα με την παρακάτω διαδικασία. Ρυθμίσεις λογισμικού ανάλυσης 1. Ανοίξτε το κατάλληλο αρχείο με τη βοήθεια του λογισμικού (2.3) της σειράς Rotor-Gene Q. 2. Εάν τα δείγματα δεν έχουν ήδη ονομαστεί πριν από την εκτέλεση, κάντε κλικ στο «Edit Samples» (Επεξεργασία δειγμάτων). 3. Εισαγάγετε τα ονόματα δειγμάτων στη στήλη «Name» (Όνομα). Σημείωση: Αφήστε κενά τα ονόματα τυχόν άδειων βυθισμάτων. 26 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

27 4. Κάντε κλικ στο «Analysis» (Ανάλυση). Στη σελίδα της ανάλυσης κάντε κλικ στο «Cycling A. Yellow» (Κυκλοποίηση Α. Κίτρινο) για να ελέγξετε το κανάλι HEX. 5. Βεβαιωθείτε ότι είναι επισημασμένο το «Dynamic Tube» (Δυναμικό σωληνάριο). Πατήστε «Slope Correct» (Σωστή κλίση) και «Linear Scale» (Γραμμική κλίμακα). 6. Κάντε κλικ στο «Take Off Adj.» (Προσαρμογή σημείου μέτρησης) και πληκτρολογήστε και όπως φαίνεται στην Εικόνα Εικόνα 13. Ρυθμίσεις κανονικοποίησης ανάλυσης EGFR. 1 = κουμπί «Dynamic Tube» (Δυναμικό σωληνάριο), 2 = κουμπί «Slope Correct» (Διόρθωση κλίσης), 3 = κουμπί «Take Off Adj.» (Προσαρμογή σημείου μέτρησης), 4 = παράθυρο διαλόγου «Take Off Point Adjustment» (Προσαρμογή σημείου μέτρησης) με τιμές παραμέτρων. 7. Ρυθμίστε την τιμή κατωφλίου στο 0,02 και ελέγξτε τις τιμές HEX C T. 8. Στη σελίδα της ανάλυσης, κάντε κλικ στο «Cycling A. Green» (Κυκλοποίηση Α. Πράσινο) για να προβάλετε το κανάλι FAM. Ρυθμίστε τις παραμέτρους όπως φαίνεται στην Εικόνα 13 παραπάνω. 9. Το δυναμικό σωληνάριο θα πρέπει να είναι επισημασμένο. Πατήστε «Slope Correct» (Σωστή κλίση) και «Linear Scale» (Γραμμική κλίμακα). 10. Ρυθμίστε την τιμή κατωφλίου στο 0,075 και ελέγξτε τις τιμές FAM C T. Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/

28 Ανάλυση ορών ελέγχου εκτέλεσης Μετά την ολοκλήρωση της εκτέλεσης, αναλύστε τα δεδομένα ως εξής: Αρνητικός ορός ελέγχου: Για να διασφαλιστεί ότι δεν έχει σημειωθεί μόλυνση μήτρας, ο ορός ελέγχου NTC δεν πρέπει να δώσει τιμή C T στο πράσινο κανάλι (FAM) μικρότερη του 40. Για να διασφαλίσετε ότι η εκτέλεση προετοιμάστηκε σωστά, ο ορός ελέγχου NTC πρέπει να εμφανίζει τιμή ενίσχυσης από 29,85 έως 35,84 στο κίτρινο κανάλι (HEX) (εσωτερικός ορός ελέγχου). Εάν υφίσταται θετική ενίσχυση στο πράσινο κανάλι και/ή ενίσχυση εκτός του εύρους 29,85 έως 35,84 στο κίτρινο κανάλι, η εκτέλεση είναι άκυρη. Θετικός ορός ελέγχου: Για κάθε μείγμα αντίδρασης, ο θετικός ορός ελέγχου (PC) EGFR πρέπει να δίνει τιμή C T εντός του εύρους που παρατίθεται στον Πίνακα 5, συμπεριλαμβανομένων των ακραίων τιμών. Μια εκτέλεση με τιμή θετικού ορού ελέγχου εκτός αυτού του εύρους υποδεικνύει πρόβλημα προετοιμασίας της ανάλυσης και η εκτέλεση θα πρέπει να χαρακτηριστεί ανεπιτυχής. Εάν ο θετικός ορός ελέγχου εμφανίζει τιμή C T εντός εύρους (FAM) αλλά η τιμή C T ενός εσωτερικού ορού ελέγχου (HEX) είναι εκτός του εύρους 29,85 έως 35,84, συνεχίστε την ανάλυση. Σημείωση: Τα δεδομένα των δειγμάτων δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται εάν ο αρνητικός ή ο θετικός ορός ελέγχου δεν είναι επιτυχής. Πίνακας 5. Αποδεκτό εύρος C T για ορούς ελέγχου εκτέλεσης Ορός ελέγχου αντίδρασης Θετικός ορός ελέγχου Ορός ελέγχου χωρίς μήτρα Ανάλυση Κανάλι Εύρος C T Ορός ελέγχου Πράσινο (FAM) 28,13 έως 34,59 T790M Πράσινο (FAM) 30,22 έως 34,98 Ελλείψεις Πράσινο (FAM) 28,90 έως 34,90 L858R Πράσινο (FAM) 29,97 έως 34,81 Και τα 8 μείγματα αντίδρασης Πράσινο (FAM) 40,00 Κίτρινο (HEX) 29,85 έως 35,84 28 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

29 Τιμή FAM C T αρνητικού ορού ελέγχου Είναι η τιμή FAM C T < 40; ΟΧΙ Είναι η τιμή HEX C T εντός του εύρους 29,85 35,84; ΝΑΙ Επιτυχ. αποτέλ. αρν. ορού ελέγχ. ΝΑΙ ΑΠΟΤΥΧΙΑ ΕΚΤΕΛΕΣΗΣ ΟΧΙ Τιμή FAM C T θετικού ορού ελέγχου Είναι η τιμή FAM C T του σωλην. ορού ελέγχ. εντός εύρ. 28,13 34,59; ΝΑΙ Είναι η τιμή T790M FAM C T του σωλην. εντός εύρ. 30,22 34,98; ΝΑΙ Είναι η τιμή ελλείψεων FAM C T του σωλην. εντός εύρ. 28,90 34,90; ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ ΑΠΟΤΥΧΙΑ ΕΚΤΕΛΕΣΗΣ ΑΠΟΤΥΧΙΑ ΕΚΤΕΛΕΣΗΣ ΑΠΟΤΥΧΙΑ ΕΚΤΕΛΕΣΗΣ ΝΑΙ ΟΧΙ Προχωρήστε στην ανάλυση δειγμάτων Επιτυχ. αποτέλ. θετ. ορού ελέγχ. ΝΑΙ Είναι η τιμή L858R FAM C T του σωλην. εντός εύρ. 29,97 34,81; Εικόνα 14. Ροή εργασιών ανάλυσης ορών ελέγχου εκτέλεσης. Υπό την προϋπόθεση ότι και οι δύο οροί ελέγχου εκτέλεσης είναι έγκυροι, η τιμή C T κάθε ανάλυσης ορού ελέγχου δείγματος πρέπει να κυμαίνεται εντός του εύρους 23,70 έως 31,10 στο πράσινο (FAM) κανάλι. Βλ. Πίνακα 6. Πίνακας 6. Εύρος αποδεκτών τιμών C T στο FAM για αντίδραση ορού ελέγχου δείγματος Εύρος αποδεκτών τιμών C T στο FAM για αντίδραση ορού ελέγχου δείγματος Μείγμα αντίδρασης Κανάλι Εύρος αποδεκτών τιμών C T Ορός ελέγχου Πράσινο (FAM) 23,70 31,10 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/

30 Σε περίπτωση που η τιμή του δείγματος βρίσκεται εκτός αυτού του εύρους τιμών, ακολουθήστε τις παρακάτω οδηγίες. Τιμή ανάλυσης ορού ελέγχου δείγματος C T < 23,70: Τα δείγματα με τιμή ορού ελέγχου C T < 23,70 θα προκαλέσουν υπερκορεσμό των αναλύσεων μετάλλαξης και πρέπει να αραιωθούν. Για την ανίχνευση όλων των μεταλλάξεων σε χαμηλό επίπεδο, είναι απαραίτητη η αραίωση των υπερβολικά συμπυκνωμένων δειγμάτων, ώστε οι τιμές τους να κυμαίνονται εντός του παραπάνω εύρους τιμών, λαμβάνοντας υπόψη ότι αραιώνοντας κατά το ήμισυ, η τιμή C T αυξάνεται κατά 1 μονάδα. Τιμή ανάλυσης ορού ελέγχου δείγματος C T > 31,10: Το δείγμα δεν περιέχει επαρκή ποσότητα DNA, ώστε να είναι δυνατή η εκτέλεση της ανάλυσης. Υπό την προϋπόθεση ότι και οι δύο οροί ελέγχου εκτέλεσης είναι έγκυροι και η ανάλυση ορού ελέγχου είναι εντός του εύρους που αναφέρεται στον Πίνακα 6, η τιμή C T κάθε μετάλλαξης δείγματος πρέπει να είναι εντός του εύρους που αναφέρεται στον Πίνακα 7 στο πράσινο (FAM) κανάλι. Σε περίπτωση που η τιμή του δείγματος βρίσκεται εκτός αυτού του εύρους τιμών, ακολουθήστε τις παρακάτω οδηγίες. Πίνακας 7. Αποδεκτές τιμές δειγμάτων αντίδρασης μετάλλαξης Αποδεκτές τιμές δειγμάτων αντίδρασης μετάλλαξης Αντίδραση Μείγμα αντίδρασης Κανάλι Εύρος C T T790M Πράσινο (FAM) 0,00 40,00 Αντίδραση μετάλλαξης Ελλείψεις Πράσινο (FAM) 0,00 40,00 L858R Πράσινο (FAM) 0,00 40,00 Και οι 3 μεταλλάξεις Κίτρινο (HEX) 29,85 35,84 Σημείωση: Εάν κάποιο δείγμα δεν δώσει τιμή C T (δηλαδή C T > 40), αυτό ενδέχεται να οφείλεται στην παρουσία αναστολέα, σε σφάλμα στην προετοιμασία της ανάλυσης ή στην απουσία ενισχύσιμου EGFR DNA. Τιμή C T εσωτερικού ορού ελέγχου 29,85 35,84: Δεν υπάρχει ενισχύσιμο EGFR DNA. Τιμή C T εσωτερικού ορού ελέγχου εκτός του εύρους τιμών 29,85 35,84: Αυτό μπορεί να υποδεικνύει την ύπαρξη σφάλματος στην προετοιμασία της ανάλυσης ή την παρουσία αναστολέα. Μπορείτε να μειώσετε τη δράση του αναστολέα αραιώνοντας το δείγμα. Ωστόσο, στην περίπτωση αυτή θα αραιωθεί και το DNA. 30 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

31 Αραίωση δείγματος Απαιτείται αραίωση δείγμ. ΝΑΙ Τιμή FAM CT ορού ελέγχου δείγματος Είναι η τιμή FAM CT ανάλ. ορού ελέγχ. εντός εύρ. 23,70 31,10; ΟΧΙ Είναι η τιμή FAM CT < 23,70; ΝΑΙ Τιμές HEX CT αναλύσεων μεταλλάξεων εσωτερικού ελέγχου δείγματος ΟΧΙ Τιμές FAM CT αναλύσεων μεταλλάξ. δείγμ. Είναι κάθε τιμή FAM CT μετάλλαξ. εντός εύρ. 00,00 40,00; ΟΧΙ Είναι η τιμή HEX CT μεταλλ. εσωτ. ελέγχ. εντός εύρ. 29,85 35,84; ΝΑΙ Είναι η τιμή FAM CT > 31,10; ΟΧΙ ΝΑΙ ΟΧΙ Ενδέχ. το δείγμα να μην περιέχ. ανιχνεύσ. DNA ή να περιέχ. αναστολ. Σωληνάριο θετικό για ενίσχυση FAM Άκυρο δείγμα Δεν ανιχνεύθηκε μετάλλαξη Υπολογισμός τιμών CT για κάθε μετάλλαξη CT = CT μετάλλαξης CT ορού ελέγχου Σύγκριση τιμών CT με τις οριακές τιμές ανά μετάλλαξη Είναι κάποια τιμή CT εντός του καθορ. εύρους τιμών CT για την ανάλυση; ΟΧΙ Δεν ανιχνεύθηκε μετάλλαξη ΝΑΙ Ανιχνεύθηκε μετάλλαξη E FR για την ανάλυση μετάλλαξης Εικόνα 15. Διάγραμμα ροής εργασιών ανάλυσης μετάλλαξης. Τιμή FAM C T αναλύσεων μεταλλάξεων δείγματος Οι τιμές FAM και για τα τρία μείγματα αντίδρασης μετάλλαξης πρέπει να ελέγχονται σε σχέση με τις τιμές που παρατίθενται στον Πίνακα 7. Υπολογίστε την τιμή C T για κάθε δείγμα μετάλλαξης που εμφανίζει θετική ενίσχυση όπως υποδεικνύεται παρακάτω, διασφαλίζοντας ότι οι τιμές μετάλλαξης και ορού ελέγχου C T προέρχονται από το ίδιο δείγμα. C T = C T μετάλλαξης C T ορού ελέγχου Συγκρίνετε την τιμή C T για το δείγμα με την οριακή τιμή για τη συγκεκριμένη ανάλυση (βλ. Πίνακας 8), διασφαλίζοντας ότι χρησιμοποιείται η σωστή οριακή τιμή σε κάθε ανάλυση. Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/

32 Πίνακας 8. Οριακές τιμές ανάλυσης μετάλλαξης Ανάλυση μετάλλαξης Όρια C T T790M 7,40 Ελλείψεις 8,00 L858R 8,90 Η οριακή τιμή είναι το σημείο πάνω από το οποίο ένα θετικό σήμα θα μπορούσε δυνητικά να οφείλεται στο σήμα υποβάθρου από έναν εκκινητή ARMS στο DNA άγριου τύπου. Αν η τιμή C T του δείγματος είναι υψηλότερη από την οριακή τιμή, τότε αυτό θα χαρακτηριστεί δείγμα στο οποίο δεν ανιχνεύθηκε μετάλλαξη ή δείγμα εκτός των ορίων ανίχνευσης του κιτ. Αν η τιμή του δείγματος είναι μικρότερη από την οριακή τιμή, το δείγμα θεωρείται θετικό για μετάλλαξη που ανιχνεύεται με τη συγκεκριμένη ανάλυση. Σημείωση: Για δείγματα που δεν εμφανίζουν τιμή μετάλλαξης FAM C T, απαιτείται αξιολόγηση της τιμής εσωτερικού ελέγχου (HEX) C T προκειμένου να προσδιοριστεί εάν δεν ανιχνεύεται μετάλλαξη ή αν η ανάλυση δεν είναι έγκυρη. Εάν η τιμή HEX C T βρίσκεται μεταξύ 29,85 και 35,84, τότε δεν ανιχνεύεται μετάλλαξη. Εάν η τιμή HEX C T είναι εκτός του εύρους αυτού, το δείγμα είναι άκυρο. Συνοψίζοντας, σε κάθε αντίδραση μετάλλαξης για κάθε δείγμα θα αποδίδεται ο χαρακτηρισμός «ανιχνεύθηκε μετάλλαξη», «δεν ανιχνεύθηκε μετάλλαξη» ή «μη έγκυρη» χρησιμοποιώντας τα παρακάτω κριτήρια. Ανιχνεύθηκε μετάλλαξη: Θετικό για ενίσχυση FAM και η τιμή C T είναι ίση ή μικρότερη από την οριακή τιμή. Εάν ανιχνευθούν πολλαπλές μεταλλάξεις, μπορούν να αναφερθούν όλες. Δεν ανιχνεύθηκε μετάλλαξη: Θετικό για ενίσχυση FAM και η τιμή C T είναι μεγαλύτερη από την οριακή τιμή και η τιμή HEX (εσωτερικός έλεγχος) είναι εντός του εύρους 29,85 35,84. Αρνητικό για ενίσχυση FAM και η τιμή HEX (εσωτερικός έλεγχος) είναι εντός του εύρους 29,85 35,84. Μη έγκυρη: Αρνητικό για ενίσχυση FAM και η ενίσχυση HEX είναι εκτός προδιαγραφής. 32 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

33 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων Αυτός ο οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων μπορεί να σας βοηθήσει στην επίλυση ενδεχόμενων προβλημάτων. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε και στη σελίδα Frequently Asked Questions (Συχνές ερωτήσεις) του κέντρου τεχνικής υποστήριξης της εταιρείας μας: Οι επιστήμονες των τμημάτων Τεχνικής Υποστήριξης της QIAGEN είναι πάντοτε πρόθυμοι να απαντήσουν σε τυχόν ερωτήσεις σχετικά με τις πληροφορίες και τα πρωτόκολλα που περιέχονται στο παρόν εγχειρίδιο ή τις τεχνολογίες προετοιμασίας δειγμάτων και ανάλυσης (για πληροφορίες επικοινωνίας, βλ. οπισθόφυλλο ή επισκεφθείτε την ιστοσελίδα Σχόλια και συστάσεις Δεν ανιχνεύεται σήμα με τον θετικό ορό ελέγχου (PC) EGFR στο κανάλι φθορισμού Cycling Green α) Το επιλεγμένο κανάλι φθορισμού για την ανάλυση δεδομένων της αντίδρασης PCR δεν είναι συμβατό με το πρωτόκολλο β) Εσφαλμένος προγραμματισμός του προφίλ θερμοκρασίας στο όργανο Rotor- Gene Q γ) Εσφαλμένη διευθέτηση της PCR δ) Οι συνθήκες αποθήκευσης για ένα ή περισσότερα από τα συστατικά του κιτ δεν συμμορφώνονται με τις οδηγίες που περιλαμβάνονται στην ενότητα «Αποθήκευση και χειρισμός αντιδραστηρίων» (σελίδα 11) Για την ανάλυση δεδομένων επιλέξτε το κανάλι φθορισμού Cycling Green για την ανάλυση αντίδρασης PCR του EGFR και το κανάλι φθορισμού Cycling Yellow για την ανάλυση αντίδρασης PCR εσωτερικού ορού ελέγχου. Συγκρίνετε το προφίλ θερμοκρασίας με το πρωτόκολλο και αν είναι εσφαλμένο επαναλάβετε την εκτέλεση. Ελέγξτε τα βήματά εργασίας σας με χρήση του πλάνου διοχέτευσης με πιπέτα και, αν χρειάζεται, επαναλάβετε την PCR. Ελέγξτε τις συνθήκες αποθήκευσης και την ημερομηνία λήξης (ανατρέξτε στην ετικέτα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα καινούριο κιτ, αν χρειαστεί. Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/

34 ε) Η ημερομηνία λήξης του κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR έχει παρέλθει Σχόλια και συστάσεις Ελέγξτε τις συνθήκες αποθήκευσης και την ημερομηνία λήξης (ανατρέξτε στην ετικέτα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα καινούριο κιτ, αν χρειαστεί. Σήματα των αρνητικών ορών ελέγχου στο κανάλι φθορισμού Cycling Green της ανάλυσης PCR α) Παρατηρήθηκε μόλυνση κατά την προετοιμασία της PCR Επαναλάβετε την PCR με νέα αντιδραστήρια σε πολλές επαναλήψεις. Αν είναι δυνατόν, σφραγίστε τα σωληνάρια PCR αμέσως μετά την προσθήκη του δείγματος που πρόκειται να υποβληθεί σε εξέταση. Βεβαιωθείτε ότι ο χώρος εργασίας σας και τα όργανα απολυμαίνονται σε τακτά χρονικά διαστήματα. Ποιοτικός έλεγχος Σύμφωνα με το πιστοποιημένο με ISO Σύστημα Διαχείρισης Ποιότητας της QIAGEN, κάθε παρτίδα του κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR ελέγχεται ως προς τις προκαθορισμένες προδιαγραφές για τη διασφάλιση της ομοιογενούς ποιότητας των προϊόντων. Περιορισμοί Τα αποτελέσματα που εξάγονται από το προϊόν αυτό πρέπει να ερμηνεύονται στο πλαίσιο όλων των σχετικών κλινικών και εργαστηριακών ευρημάτων και δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται αυτόνομα για διαγνωστικούς σκοπούς. Το προϊόν προορίζεται για χρήση αποκλειστικά από ειδικά καταρτισμένο και εκπαιδευμένο προσωπικό σε in vitro διαγνωστικές διαδικασίες και σε συνδυασμό με το όργανο Rotor-Gene Q MDx. Στις αναλυτικές μελέτες επικύρωσης συμπεριλήφθηκε ανθρώπινο DNA που έχει εκχυλιστεί από δείγματα πλάσματος. Το προϊόν προορίζεται για χρήση αποκλειστικά στον θερμοκυκλοποιητή PCR πραγματικού χρόνου Rotor-Gene Q MDx. Η αυστηρή συμμόρφωση με το εγχειρίδιο του κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR είναι απαραίτητη για την επίτευξη βέλτιστων αποτελεσμάτων. Δεν συνιστάται η αραίωση των αντιδραστηρίων με τρόπο που δεν προβλέπεται από το παρόν εγχειρίδιο, καθώς κάτι τέτοιο θα οδηγήσει σε μείωση της απόδοσης. 34 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

35 Εφιστάται η προσοχή στις ημερομηνίες λήξης και τις συνθήκες αποθήκευσης που αναγράφονται στα κουτιά και τις ετικέτες όλων των συστατικών. Μη χρησιμοποιείτε το περιεχόμενο της συσκευασίας αν έχει παρέλθει η ημερομηνία λήξης ή δεν έχουν ληφθεί τα σωστά μέτρα αποθήκευσης. Χαρακτηριστικά απόδοσης Αναλυτική ευαισθησία όριο τυφλού (LOB) Για την αξιολόγηση της απόδοσης του κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR απουσία μήτρας και για να διασφαλιστεί ότι ένα τυφλό δείγμα ή ένα δείγμα με DNA άγριου τύπου δεν παράγει αναλυτικό σήμα που ενδέχεται να υποδεικνύει χαμηλή συγκέντρωση μετάλλαξης, αξιολογήθηκε το EGFR DNA άγριου τύπου από 59 διαφορετικά δείγματα πλάσματος ασθενών με NSCLC. Τα κριτήρια αποδοχής της μελέτης (τουλάχιστον 95% των δειγμάτων άγριου τύπου πρέπει να έχουν τιμή C T άνω του αντίστοιχου ορίου) εκπληρώθηκαν. Όριο ανίχνευσης (LOD) Το LOD είναι το ελάχιστο ποσοστό μεταλλαγμένου DNA που μπορεί να ανιχνευθεί σε υπόβαθρο DNA άγριου τύπου όταν το συνολικό ενισχύσιμο DNA (εντός του εύρους εισαγωγής) έδινε σωστούς προσδιορισμούς μεταλλάξεων σε ποσοστό 95% για κάθε δείγμα θετικό για μετάλλαξη (C95). Το εύρος εργασίας εισαγωγής DNA για την ανάλυση ορίζεται με βάση την τιμή C T της ανάλυσης ελέγχου, με προκαθορισμένο εύρος από 23,70 έως 31,10. Το LOD προσδιορίστηκε στα χαμηλά επίπεδα εισαγόμενου DNA (C T ορού ελέγχου περίπου 30,10) με τη χρήση DNA προερχόμενου από ιστό FFPE για το κιτ therascreen EGFR RGQ PCR. Το LOD προσδιορίστηκε με τη χρήση κλινικών δειγμάτων FFPE και κυτταρικής σειράς FFPE στα χαμηλά επίπεδα εισαγόμενου DNA για τις συγκεκριμένες μεταλλάξεις EGFR. Οι τιμές LOD που καθορίστηκαν με τη χρήση ιστού FFPE επαληθεύτηκαν για το κιτ therascreen EGFR Plasma RQG PCR με DNA προερχόμενο από τεχνητά δείγματα πλάσματος θετικά για μετάλλαξη. Οι τελικές τιμές LOD που παρατίθενται στον Πίνακα 9 παρακάτω υποδεικνύουν το ποσοστό μετάλλαξης που έδωσε μια πιθανότητα σωστών προσδιορισμών 95% για καθεμία από τις μεταλλάξεις. Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/

36 Πίνακας 9. Όρια LOD για καθεμία από τις αναλύσεις μετάλλαξης του EGFR Εξόνιο Μετάλλαξη COSMIC ID* Τιμή LOD (%) 20 T790M ,5* 19 Ελλείψεις ,4* ,24* , , , , , ,2* ,1* , , , ,5* ,7* ,81* ,45* ,58* , ,94* 21 L858R ,94* * Τιμές LOD επαληθευμένες σε πλάσμα στο πλαίσιο της μελέτης επιβεβαίωσης LOD του κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR. Οι μεταλλάξεις αυτές δεν επιβεβαιώθηκαν σε πλάσμα. 36 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

37 Αναλυτική ευαισθησία Όρια C T Κατά τον καθορισμό των οριακών τιμών των αναλύσεων υιοθετήθηκε για τα ποσοστά ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων μια προσέγγιση με βάση τον κίνδυνο και οι εκτιμώμενες τιμές LOB χρησιμοποιήθηκαν ως ένα από τα στοιχεία ανάπτυξης οριακών τιμών. Τα αντίστοιχα όρια C T για κάθε ανάλυση μετάλλαξης στο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR παρατίθενται στον Πίνακα 10. Πίνακας 10. Όρια C T κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR Ανάλυση μετάλλαξης Όρια C T T790M 7,40 Έλλειψη 8,00 L858R 8,90 Επαναληψιμότητα και αναπαραγωγιμότητα Η επαναληψιμότητα και η αναπαραγωγιμότητα αξιολογήθηκαν μέσω της εξέτασης ενός επιπέδου μετάλλαξης που αντιστοιχούσε στο τριπλάσιο του LOD, σε υπόβαθρο γονιδιωματικού DNA άγριου τύπου, σε τρία κέντρα εξέτασης, με τη χρήση πολλαπλών παρτίδων κιτ, χειριστών και εκτελέσεων και σε διαφορετικές ημέρες, με δύο αντίγραφα για κάθε δείγμα. Και στις τρεις αναλύσεις μετάλλαξης τα δείγματα μεταλλαγμένου DNA βρέθηκαν θετικά για μετάλλαξη σε ποσοστό 100%. Τα δείγματα άγριου τύπου ήταν αρνητικά για μετάλλαξη σε όλες τις αναλύσεις σε όλα τα κέντρα. Επίδραση της συγκέντρωσης εισαγόμενου DNA Η μελέτη αυτή διενεργήθηκε με τη χρήση DNA εκχυλισμένου από ιστό FFPE. Για τον προσδιορισμό της επίδρασης της αλλαγής συγκέντρωσης εισαγόμενου DNA πάνω στα αποτελέσματα που λαμβάνονται με το κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR κοντά στο όριο LOD, δημιουργήθηκε ένα σετ δειγμάτων για τις μεταλλάξεις αναμειγνύοντας συνθετικό μεταλλαγμένο DNA με γονιδιωματικό DNA άγριου τύπου ώστε να παραχθούν δείγματα με χαμηλό, μεσαίο και υψηλό επίπεδο ολικού εισαγόμενου DNA. Το υψηλό και χαμηλό επίπεδο εισαγόμενου DNA επελέγησαν με μια τιμήστόχο τέτοια που να αντιστοιχεί στο εύρος τιμών C T ανάλυσης ελέγχου (23,70 έως 31,10). Η αξιολόγηση του σετ δεδομένων εισαγόμενου DNA (σε τιμές συγκέντρωσης κοντά στο όριο LOD και σε τρία διαφορετικά επίπεδα εισαγόμενου DNA) κατέδειξε ποσοστό 95,44% θετικό για μετάλλαξη. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η διακύμανση επιπέδου του εισαγόμενου DNA, εντός του εύρους εργασίας της ανάλυσης, δεν επηρεάζει την τιμή C T ή την ένδειξη για μετάλλαξη ενός δείγματος. Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/

38 Παρεμβαλλόμενες ουσίες Ενδογενείς παρεμβαλλόμενες ουσίες Οι δυνητικά παρεμβαλλόμενες ουσίες προστέθηκαν εξωγενώς σε τεχνητά δείγματα πλάσματος θετικά για μετάλλαξη, 3 φορές το LOD. Τα δείγματα υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε εξέταση με το κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR. Τα δείγματα που περιείχαν τις δυνητικά παρεμβαλλόμενες ουσίες συγκρίθηκαν με τεχνητά δείγματα πλάσματος θετικά για μετάλλαξη, 3 φορές το LOD, τα οποία δεν περιείχαν καμία εξωγενώς προστεθείσα παρεμβαλλόμενη ουσία. Κάθε παρεμβαλλόμενη ουσία υποβλήθηκε σε εξέταση με 4 αντίγραφα. Μια διαφορά στην τιμή C T > 2 φορές την τυπική απόκλιση (SD) (που λήφθηκε από τη μελέτη ακρίβειας) μεταξύ της «εξέτασης» και του «ορού ελέγχου» (δηλαδή του δείγματος χωρίς παρεμβαλλόμενη ουσία) θεωρήθηκε ένδειξη πιθανής παρεμβολής. Στις περιπτώσεις αυτές, παρέχεται η παρατηρηθείσα διαφορά στην τιμή C T. Οι συγκεντρώσεις εξέτασης που παρατίθενται στον Πίνακα 11 έχουν επιλεχθεί βάσει των οδηγιών που περιλαμβάνονται στο CLSI EP07-A2 και είναι αντιπροσωπευτικές των μέγιστων συγκεντρώσεων που αναμένεται να παρατηρηθούν σε ένα κλινικό δείγμα. Σημείωση: Αυτές οι ενδογενείς ουσίες προστέθηκαν εξωγενώς σε τεχνητά δείγματα πλάσματος θετικά για μετάλλαξη τα οποία περιλάμβαναν πλάσμα από υγιείς δότες. Επομένως, αυτές οι ενδογενείς ουσίες θα υπήρχαν ήδη σε άγνωστες συγκεντρώσεις στα δείγματα πριν από την προσθήκη. Η τελική συγκέντρωση κάθε δυνητικά παρεμβαλλόμενης ενδογενούς ουσίας που δοκιμάστηκε θα ήταν κατά πάσα πιθανότητα μεγαλύτερη από την εξεταζόμενη συγκέντρωση. Πίνακας 11. Δυνητικά παρεμβαλλόμενες ενδογενείς ουσίες Δυνητικά παρεμβαλλόμενη ουσία (IS) Μη συζευγμένη χολερυθρίνη Αιμοσφαιρίνη (ανθρώπινη) Τριγλυκερίδια Συγκέντρωση εξέτασης 150 mg/dl 2 g/dl 3 g/dl Ανάλυση T790M Οι ακόλουθες ενδογενείς ουσίες στις συγκεντρώσεις που παρατίθενται στον Πίνακα 11 αποδείχθηκε ότι έχουν επίδραση > 2 φορές την SD (0,40 C T ) στην απόδοση της ανάλυσης T790M: Τριγλυκερίδια, διαφορά 1,37 C T 38 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

39 Ανάλυση ελλείψεων Οι ακόλουθες ενδογενείς ουσίες στις συγκεντρώσεις που παρατίθενται στον Πίνακα 11 αποδείχθηκε ότι έχουν επίδραση > 2 φορές την SD (0,71 C T ) στην απόδοση της ανάλυσης ελλείψεων: Αιμοσφαιρίνη, διαφορά 0,80 C T Ανάλυση L858R Οι ακόλουθες ενδογενείς ουσίες στις συγκεντρώσεις που παρατίθενται στον Πίνακα 11 αποδείχθηκε ότι έχουν επίδραση > 2 φορές την SD (0,56 C T ) στην απόδοση της ανάλυσης L858R: Χολερυθρίνη, διαφορά 1,13 C T Τριγλυκερίδια, διαφορά 1,53 C T Εξωγενείς παρεμβαλλόμενες ουσίες Οι δυνητικά παρεμβαλλόμενες ουσίες προστέθηκαν εξωγενώς σε τεχνητά δείγματα πλάσματος θετικά για μετάλλαξη, 3 φορές το LOD. Τα δείγματα υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε εξέταση με το κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR. Τα δείγματα που περιείχαν τις δυνητικά παρεμβαλλόμενες ουσίες συγκρίθηκαν με τεχνητά δείγματα πλάσματος θετικά για μετάλλαξη, 3 φορές το LOD, τα οποία δεν περιείχαν καμία εξωγενώς προστεθείσα παρεμβαλλόμενη ουσία. Κάθε παρεμβαλλόμενη ουσία υποβλήθηκε σε εξέταση με 4 αντίγραφα. Μια διαφορά > 2 φορές η τυπική απόκλιση (που λήφθηκε από τη μελέτη ακρίβειας) μεταξύ της τιμής C T της «εξέτασης» και της τιμής C T του «ορού ελέγχου» (δηλαδή του δείγματος χωρίς παρεμβαλλόμενη ουσία) θεωρήθηκε ένδειξη πιθανής παρεμβολής. Στις περιπτώσεις αυτές, παρέχεται η παρατηρηθείσα διαφορά στην τιμή C T. Οι συγκεντρώσεις εξέτασης που παρατίθενται στον Πίνακα 12 έχουν επιλεχθεί βάσει των οδηγιών που περιλαμβάνονται στο CLSI EP07-A2 και υπερβαίνουν τη θεραπευτική συγκέντρωση σε όλες τις περιπτώσεις. Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/

40 Πίνακας 12. Δυνητικά παρεμβαλλόμενες εξωγενείς ουσίες Δυνητικά παρεμβαλλόμενη ουσία (IS) Υδροβρωμική σιταλοπράμη 0,75 Ημιυδρική υδροχλωρική παροξετίνη 1,14 Υδροχλωρική σερτραλίνη 0,67 Υδροχλωρική φλουοξετίνη 3,87 Ακεταμινοφαίνη 200,7 K2 EDTA 3600 Ανάλυση T790M Συγκέντρωση εξέτασης (µg/ml) Οι ακόλουθες εξωγενείς ουσίες στις συγκεντρώσεις που παρατίθενται στον Πίνακα 12 αποδείχθηκε ότι έχουν επίδραση > 2 φορές την SD (0,40 C T ) στην απόδοση της ανάλυσης T790M: Υδροβρωμική σιταλοπράμη, διαφορά 0,52 C T Υδροχλωρική σερτραλίνη, διαφορά 0,47 C T Υδροχλωρική φλουοξετίνη, διαφορά 0,48 C T Ανάλυση ελλείψεων Οι ακόλουθες εξωγενείς ουσίες στις συγκεντρώσεις που παρατίθενται στον Πίνακα 12 αποδείχθηκε ότι έχουν επίδραση > 2 φορές την SD (0,71 C T ) στην απόδοση της ανάλυσης ελλείψεων: Φλουοξετίνη, διαφορά 0,73 C T Ανάλυση L858R Οι ακόλουθες εξωγενείς ουσίες στις συγκεντρώσεις που παρατίθενται στον Πίνακα 12 αποδείχθηκε ότι έχουν επίδραση > 2 φορές την SD (0,56 C T ) στην απόδοση της ανάλυσης L858R: Υδροβρωμική σιταλοπράμη, διαφορά 0,72 C T Ημιυδρική υδροχλωρική παροξετίνη, διαφορά 0,92 C T Υδροχλωρική σερτραλίνη, διαφορά 0,82 C T Υδροχλωρική φλουοξετίνη, διαφορά 0,98 C T Ακεταμινοφαίνη, διαφορά 0,81 C T K2 EDTA, διαφορά 0,57 C T 40 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

41 Κλινική απόδοση Η κλινική δοκιμή NCT ήταν μια ανοικτή μελέτη φάσης IV, ενός σκέλους, για την αξιολόγηση της ασφάλειας και της αποτελεσματικότητας/ ανεκτικότητας της γεφιτινίµπης ως θεραπείας πρώτης γραμμής σε ασθενείς καυκάσιας φυλής με NSCLC σταδίου IIIA/B/IV, θετικό σε μετάλλαξη του EGFR. Η επιλεξιμότητα των ασθενών για εγγραφή στην κλινική δοκιμή NCT καθορίστηκε από την παρουσία μεταλλάξεων ευαισθητοποίησης του EGFR. Η κατάσταση μετάλλαξης του EGFR στους ασθενείς με NSCLC αξιολογήθηκε με τη χρήση της ανάλυσης κλινικής δοκιμής (CTA), με DNA από αντίστοιχα δείγματα ιστού και πλάσματος. Η μελέτη περιλάμβανε έναν προκαθορισμένο στόχο διερεύνησης βιοδεικτών με σκοπό να εξακριβωθεί εάν μπορούν να χρησιμοποιηθούν δείγματα πλάσματος για ανάλυση μεταλλάξεων σε περίπτωση που δεν υπάρχουν διαθέσιμα δείγματα ιστού. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν υψηλά ποσοστά συμφωνίας μεταξύ των αντίστοιχων δειγμάτων ιστού και πλάσματος, της τάξης του 94,3%, με ειδικότητα ανάλυσης 99,8% και ευαισθησία 65,7%. 1 Πραγματοποιήθηκε αναδρομική εξέταση δειγμάτων πλάσματος από ασθενείς υποψήφιους για συμμετοχή στην κλινική δοκιμή NCT , με τη χρήση του κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR. Διεξήχθη μια συγκριτική μελέτη για την αξιολόγηση της συμφωνίας του κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR με τη CTA που χρησιμοποιήθηκε για την επιλογή ασθενών για την κλινική δοκιμή NCT Διαπιστώθηκε ισοδυναμία μεταξύ της CTA και του κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR. Παραπομπές 1. Douillard, J.Y., et al. (2014). First-line gefitinib in Caucasian EGFR mutation-positive NSCLC patients: a phase-iv, open-label, single-arm study. Br J Cancer 110(1), 55. Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/

42 Σύμβολα Τα παρακάτω σύμβολα ενδέχεται να εμφανίζονται στη συσκευασία και την επισήμανση: <N> Περιέχει αντιδραστήρια που επαρκούν για <N> εξετάσεις Ημερομηνία λήξης In vitro διαγνωστικό ιατροτεχνολογικό προϊόν Αριθμός καταλόγου Αριθμός παρτίδας Αριθμός υλικού Συστατικά Περιεχόμενα Αριθμός Διεθνής κωδικός μονάδας εμπορίας Περιορισμός θερμοκρασίας Κατασκευαστής Ανατρέξτε στις οδηγίες χρήσης Προσοχή Πληροφορίες επικοινωνίας Για θέματα τεχνικής υποστήριξης και περισσότερες πληροφορίες, επισκεφθείτε το Κέντρο Τεχνικής Υποστήριξης στη διεύθυνση ή επικοινωνήστε με κάποιο από τα τμήματα τεχνικής εξυπηρέτησης της QIAGEN ή με τους κατά τόπους αντιπροσώπους (ανατρέξτε στο οπισθόφυλλο ή επισκεφθείτε τη διεύθυνση 42 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

43 Παράρτημα A: Λεπτομέρειες μετάλλαξης Οι αριθμοί COSMIC ID προέρχονται από τον κατάλογο Catalogue of Somatic Mutations in Cancer ( Πίνακας 13. Κατάλογος μεταλλάξεων και COSMIC ID. Μετάλλαξη Εξόνιο Αλλαγή βάσης T790M C>T 6240 L858R T>G 6224 Ελλείψεις _2249del COSMIC ID 2235_2252>AAT (σύμπλοκο) _2253del _2251del _2254del _2255>T (σύμπλοκο) _2250del _2255del _2248>GC (σύμπλοκο) _2252>GCA (σύμπλοκο) _2247del _2253del _2256del _2248TTAAGAGAAG>C (σύμπλοκο) _2258>CA (σύμπλοκο) _2251del _2257del _2254del _2251>C (σύμπλοκο) Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/

44 Πληροφορίες παραγγελίας Προϊόν Περιεχόμενα Αρ. κατ. therascreen EGFR Plasma RGQ PCR Kit (24) Rotor-Gene Q και εξαρτήματα Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM System Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Platform Rotor-Gene Q 5plex HRM System Για 24 αντιδράσεις: 1 ανάλυση ελέγχου, 7 αναλύσεις μετάλλαξης, θετικός ορός ελέγχου, Taq DNA πολυμεράση Θερμοκυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και αναλυτής καμπυλών τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας (HRM) με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βυσσινί) και κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για τα ανταλλακτικά και την εργασία. Η εγκατάσταση και η εκπαίδευση δεν συμπεριλαμβάνονται. Θερμοκυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και αναλυτής καμπυλών τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας (HRM) με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βυσσινί) και κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για ανταλλακτικά και εργασία, εγκατάσταση και εκπαίδευση Θερμοκυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και αναλυτής καμπυλών τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας (HRM) με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βυσσινί) και κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για τα ανταλλακτικά και την εργασία. Η εγκατάσταση και η εκπαίδευση δεν συμπεριλαμβάνονται Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

45 Προϊόν Περιεχόμενα Αρ. κατ. Rotor-Gene Q 5plex HRM Platform Loading Block ml Tubes Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (2500) Σχετικά προϊόντα QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit Θερμοκυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και αναλυτής καμπυλών τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας (HRM) με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βυσσινί) και κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για ανταλλακτικά και εργασία, εγκατάσταση και εκπαίδευση Μονάδα αλουμινίου για χειροκίνητη προετοιμασία αντίδρασης με μονοκάναλη πιπέτα σε σωληνάρια 72 0,1 ml 250 σειρές των 4 σωληναρίων και πώματα για 1000 αντιδράσεις σειρές των 4 σωληναρίων και πώματα για αντιδράσεις Για 50 προπαρασκευές: Στήλες QIAamp Mini, επεκτάσεις σωληναρίων (20 ml), πρωτεϊνάση K QIAGEN, RNA φορέας, ρυθμιστικά διαλύματα, VacConnectors και σωληνάρια συλλογής (1,5 ml και 2 ml) Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/

46 Η σελίδα αυτή είναι σκόπιμα κενή. 46 Εγχειρίδιο κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

47 Εμπορικά σήματα: QIAGEN, therascreen, Rotor-Gene, Pyro, ARMS, Scorpions, Taq (Όμιλος QIAGEN), IRESSA (Όμιλος AstraZeneca). Άδεια περιορισμένης χρήσης για το κιτ therascreen EGFR Plasma RGQ PCR Η χρήση του προϊόντος αυτού συνεπάγεται την αποδοχή των παρακάτω όρων εκ μέρους του αγοραστή ή του χρήστη του προϊόντος: 1. Το προϊόν μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποκλειστικά και μόνο όπως ορίζεται στα πρωτόκολλα που παρέχονται μαζί με το προϊόν και όπως ορίζεται στο εγχειρίδιο αυτό και μόνο με τα συστατικά που περιλαμβάνονται στο κιτ. Η QIAGEN δεν παρέχει άδεια χρήσης υπό οποιαδήποτε πνευματική ιδιοκτησία της για τη χρήση ή ενσωμάτωση των παρεχόμενων συστατικών αυτού του κιτ σε οποιαδήποτε συστατικά που δεν περιλαμβάνονται σε αυτό το κιτ, παρά μόνον όπως περιγράφεται στα πρωτόκολλα που παρέχονται μαζί με το προϊόν, στο εγχειρίδιο αυτό και στα συμπληρωματικά πρωτόκολλα που διατίθενται στον ιστότοπο Ορισμένα από αυτά τα συμπληρωματικά πρωτόκολλα παρέχονται από χρήστες της QIAGEN για χρήση από χρήστες της QIAGEN. Αυτά τα πρωτόκολλα δεν έχουν δοκιμαστεί σχολαστικά ούτε έχουν βελτιστοποιηθεί από την QIAGEN. Η QIAGEN δεν παρέχει καμία εγγύηση επ' αυτών, ούτε εγγυάται πως αυτά δεν παραβιάζουν δικαιώματα τρίτων. 2. Εκτός από τις άδειες που αναφέρονται ρητά, η QIAGEN δεν εγγυάται ότι αυτό το κιτ ή/και η χρήση(εις) του δεν παραβιάζουν τα δικαιώματα τρίτων. 3. Αυτό το κιτ και τα συστατικά του παραχωρούνται με άδεια για μία μόνο χρήση και δεν επιτρέπεται η επαναχρησιμοποίηση, η επανεπεξεργασία, η ανακατασκευή ή η μεταπώλησή τους. 4. Η QIAGEN αποποιείται ειδικά κάθε άλλη άδεια, ρητή ή σιωπηρή, εκτός από αυτές που αναφέρονται ρητά. 5. Ο αγοραστής και ο χρήστης του κιτ συμφωνούν να μην προβούν και να μην επιτρέψουν σε κανέναν να προβεί σε ενέργειες οι οποίες θα μπορούσαν να προκαλέσουν ή να διευκολύνουν τις ενέργειες που απαγορεύονται σύμφωνα με τα προαναφερθέντα. Η QIAGEN διατηρεί το δικαίωμα να επιβάλει τις απαγορεύσεις της παρούσας Άδειας περιορισμένης χρήσης σε οποιοδήποτε δικαστήριο και πρέπει να αποζημιωθεί για όλες τις δαπάνες ανάκρισης και δικαστηρίου, συμπεριλαμβανομένων των δικηγορικών αμοιβών, στο πλαίσιο οποιασδήποτε ενέργειας για την επιβολή της παρούσας Άδειας περιορισμένης χρήσης ή οποιουδήποτε εκ των δικαιωμάτων πνευματικής της ιδιοκτησίας σχετικά με το κιτ και/ή τα συστατικά του. Για τους ενημερωμένους όρους της άδειας, ανατρέξτε στην ιστοσελίδα Δεκ HB QIAGEN, με την επιφύλαξη παντός δικαιώματος.

48 Australia Austria Belgium Brazil China Denmark Finland France Germany Hong Kong India Ireland Italy Japan Korea (South) Luxembourg Mexico The Netherlands Norway Singapore Sweden Switzerland UK EL /2014 Sample & Assay Technologies