ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR

Transcript

1 Σεπτέμβριος 2016 ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR Έκδοση 1 24 Ποσοτική in vitro διαγνωστική εξέταση Προορίζεται για χρήση σε συνδυασμό με το όργανο Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, Hilden, ΓΕΡΜΑΝΙΑ R EL Sample to Insight

2 ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/2016 2

3 Περιεχόμενα Προβλεπόμενη χρήση... 6 Περίληψη και επεξήγηση... 6 Γενικές πληροφορίες για τη χρόνια μυελογενή λευχαιμία... 6 Παρακολούθηση της νόσου... 7 Αρχή της διαδικασίας Υλικά που παρέχονται Περιεχόμενα του κιτ Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις Πληροφορίες ασφαλείας Γενικές προφυλάξεις Φύλαξη και χειρισμός αντιδραστηρίων Συνθήκες μεταφοράς Συνθήκες φύλαξης Σταθερότητα Χειρισμός και αποθήκευση δειγμάτων Δείγματα ολικού αίματος Δείγματα RNA Διαδικασία Πρωτόκολλο λύσης ερυθροκυττάρων για την απομόνωση ολικών λευκοκυττάρων από ολικό αίμα Απομόνωση ολικού RNA Ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός του RNA Συγκέντρωση RNA ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/2016

4 Αντίστροφη μεταγραφή qpcr στο όργανο Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM με ρότορα 72 σωληναρίων Επεξεργασία δειγμάτων σε όργανο Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM με ρότορα 72 σωληναρίων Αποτελέσματα Αρχή ανάλυσης δεδομένων Πρότυπες καμπύλες και κριτήρια ποιότητας για τα πρωτογενή δεδομένα Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων Έλεγχος ποιότητας Περιορισμοί Χαρακτηριστικά επιδόσεων Όριο τυφλού Όριο ανίχνευσης Γραμμικότητα Επαναληψιμότητα και αναπαραγωγιμότητα Παρεμβαλλόμενες ουσίες Κλινική επικύρωση και σύγκριση μεθόδων Μελέτη συμφωνίας: Πρότυπο κοινού πλασμιδίου ERM-AD623 BCR-ABL1 (IRMM) έναντι προτύπου κοινού πλασμιδίου ipsogen (QIAGEN) Βιβλιογραφία Σύμβολα Πληροφορίες επικοινωνίας Πληροφορίες παραγγελιών ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/2016 4

5 5 ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/2016

6 Προβλεπόμενη χρήση Το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR είναι μια ποσοτική in vitro διαγνωστική εξέταση για τη μέτρηση της ποσότητας των μεταγράφων b3a2 (e14a2) και b2a2 (e13a2) του γονιδίου σύντηξης BCR-ABL1 σε ολικό RNA απομονωμένο από ολικό αίμα. Το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR προορίζεται για την παρακολούθηση της βαθιάς μοριακής ανταπόκρισης στους ασθενείς που έχουν διαγνωστεί με χρόνια μυελογενή λευχαιμία (ΧΜΛ) χρόνιας φάσης, θετική για το χρωμόσωμα Philadelphia (Ph+) p210. Η εξέταση βαθμονομείται έναντι του διεθνούς γενετικού πίνακα αναφοράς (International Genetic Reference Panel) του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (ΠΟΥ). Περίληψη και επεξήγηση Γενικές πληροφορίες για τη χρόνια μυελογενή λευχαιμία Η ΧΜΛ ανήκει στις μυελοϋπερπλαστικές νεοπλασίες και παρατηρείται σε > 90% των περιπτώσεων που χαρακτηρίζονται από την παρουσία του χρωμοσώματος Philadelphia (Ph CHRS). Το χρωμόσωμα αυτό σχηματίζεται έπειτα από αμοιβαία μετατόπιση του μακρού βραχίονα των χρωμοσωμάτων 9 και 22, t(9,22), με την περιοχή συστάδας σημείων ρήξης (breakpoint cluster region, BCR) να εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 22 και το ογκογονίδιο c-abl να βρίσκεται στο χρωμόσωμα 9. Το γονίδιο σύντηξης που προκύπτει, το BCR-ABL1, μεταγράφεται σε ένα μόριο mrna μήκους 8,5 kb, με 2 παραλλαγές συνένωσης: το b2a2 (που απαντά στο 40% των περιπτώσεων) και το b3a2 (παρατηρείται στο 55% των περιπτώσεων). Αυτό το γονίδιο σύντηξης κωδικοποιεί μια χιμαιρική πρωτεΐνη που ονομάζεται p210 και έχει αυξημένη δραστηριότητα κινάσης τυροσίνης. Τα μετάγραφα b2a3 και b3a3 απαντούν σε κάτω από το 5% των περιπτώσεων. Χρωμόσωμα Philadelphia εντοπίζεται επίσης στο 35% των ενήλικων ασθενών με οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (ΟΛΛ). ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/2016 6

7 Η ετήσια επίπτωση της ΧΜΛ είναι περίπου 1 2 ανά άτομα και η ΧΜΛ αντιπροσωπεύει το 20% των περιστατικών λευχαιμίας στους ενήλικες. Κλινικά, χαρακτηρίζεται από περίσσεια μυελοειδών κυττάρων που διαφοροποιούνται και λειτουργούν φυσιολογικά. Στο 90 95% των περιπτώσεων ΧΜΛ, η διάγνωση γίνεται στη χρόνια ή σταθερή φάση της νόσου. Στο παρελθόν, η νόσος εξελισσόταν σε βλαστική εκτροπή και οξεία λευχαιμία, με μοιραία έκβαση μέσα σε διάστημα 4 έως 6 ετών κατά μέσο όρο. Η έλευση της ιματινίμπης και, πιο πρόσφατα, των αναστολέων κινάσης τυροσίνης (tyrosine kinase inhibitors, TKI) δεύτερης γενιάς έχει αλλάξει ριζικά τη φυσική πορεία της νόσου. Οι περισσότεροι ασθενείς παραμένουν πλέον σε ύφεση και συνεπώς απαιτείται μακροχρόνια παρακολούθηση της νόσου και επανέλεγχοι του ασθενούς. Παρακολούθηση της νόσου Ο στόχος της θεραπείας της ΧΜΛ σήμερα είναι να επιτευχθεί επιβίωση 100% και αρνητική κατάσταση ως προς το χρωμόσωμα Philadelphia. Κατά συνέπεια, η παρακολούθηση της νόσου αποτελεί απαραίτητο εργαλείο για την αξιολόγηση της ανταπόκρισης στη θεραπεία και για τον εντοπισμό τυχόν υποτροπής όσο το δυνατόν συντομότερα. Κατά τη θεραπεία με TKI, οι ασθενείς κατά κανόνα προχωρούν από την αιματολογική στην κυτταρογενετική και κατόπιν στη μοριακή ύφεση, με αντίστοιχη μείωση στον αριθμό των λευχαιμικών κυττάρων και των μεταγράφων BCR-ABL1, όπως φαίνεται στην Εικόνα 1 7 ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/2016

8 Διεθνής κλίμακα MR 4 (μείωση κατά 4 log, 0,01% IS ) Ανιχνεύσιμη νόσος 0,01% BCR-ABL1 IS ή Μη ανιχνεύσιμη νόσος σε cdna με ABL MR 4.5 (μείωση κατά 4,5 log, 0,0032% IS ) Ανιχνεύσιμη νόσος 0,0032% BCR-ABL1 IS ή Μη ανιχνεύσιμη νόσος σε cdna με ABL MR 5 (μείωση κατά 5 log, 0,001% IS ) Ανιχνεύσιμη νόσος 0,001% BCR-ABL1 IS ή Μη ανιχνεύσιμη νόσος σε cdna με ABL Η μείωση log είναι μια μείωση από την αρχική τιμή IRIS MR: μοριακή ανταπόκριση, MMR: μείζων μοριακή ανταπόκριση 100% αρχικής τιμής 10% 1% 0,1% MMR 0,01% 0,001% BCR-ABL1 μη ανιχνεύσιμο Αριθμός λευχαιμικών κυττάρων Εικόνα 1. Ορισμός της μοριακής ανταπόκρισης. Προσαρμογή από τις παραπομπές 1, 2 και 9. MR: μοριακή ανταπόκριση. MMR: μείζων μοριακή ανταπόκριση. Η μέθοδος αναφοράς για την εκτίμηση του φορτίου όγκου στους ασθενείς με ΧΜΛ είναι η συμβατική κυτταρογενετική ανάλυση (ζώνωση G) σε μεταφάσεις μυελού των οστών. Η κυτταρογενετική ανταπόκριση αξιολογείται σε τουλάχιστον 20 μεταφάσεις του μυελού. Το επίπεδο κυτταρογενετικής ανταπόκρισης υπολογίζεται με βάση το ποσοστό των μεταφάσεων που είναι θετικές για χρωμόσωμα Ph (3). Η αξιολόγηση αυτή όμως επηρεάζεται από τις επιδόσεις και την τεχνογνωσία του εργαστηρίου και παρουσιάζει χαμηλή ευαισθησία, της τάξης του 5% όταν εξετάζονται 20 μεταφάσεις. Ο ποσοτικός προσδιορισμός του BCR-ABL1 Mbcr mrna σε δείγματα περιφερικού αίματος με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (quantitative polymerase chain reaction, qpcr) σε πραγματικό χρόνο προσδιορίζει τη μοριακή ανταπόκριση και περιλαμβάνεται πλέον στις τεχνικές παρακολούθησης της νόσου που χρησιμοποιούνται στη ΧΜΛ. Είναι λιγότερο επεμβατικός από τη συμβατική κυτταρογενετική εξέταση μεταφάσεων στον μυελό των οστών και παρουσιάζει μεγαλύτερη ευαισθησία. ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/2016 8

9 Οι συστάσεις για την παρακολούθηση της ΧΜΛ επικαιροποιήθηκαν πρόσφατα ώστε να συμπεριληφθούν νέα κλινικά στοιχεία από φαρμακευτικές μελέτες, πληροφορίες για την υψηλότερη κλινική δραστικότητα των TKI δεύτερης γενιάς και πληροφορίες για τις τεχνικές βελτιώσεις στον ποσοτικό προσδιορισμό του BCR-ABL1, επιτεύγματα που επιτρέπουν να τεθούν βελτιωμένοι στόχοι κατά την παρακολούθηση της νόσου. Συγκεκριμένα, οι TKI δεύτερης γενιάς επιτυγχάνουν μεγαλύτερη μοριακή ανταπόκριση σε μεγάλο αριθμό ασθενών με ΧΜΛ, δηλαδή τη λεγόμενη «βαθιά μοριακή ανταπόκριση» η οποία αντιστοιχεί σε φορτίο BCR-ABL1 μικρότερο του 0,01% (MR4.0) ή του 0,0032% (MR4.5). Η δυνατότητα ορθού προσδιορισμού τόσο χαμηλών επιπέδων φορτίου BCR-ABL1 μπορεί να έχει κλινική σημασία, καθώς μελέτες παρατήρησης έχουν δείξει ότι η λήψη TKI μπορεί να διακοπεί με ασφάλεια στους ασθενείς με παρατεταμένη μοριακή ανταπόκριση βαθμού MR4.5 (4). Αυτήν τη στιγμή όμως βρίσκονται υπό εξέλιξη άλλες κλινικές μελέτες προκειμένου να επιβεβαιωθούν τα ευρήματα αυτά. Οι πιο πρόσφατες συστάσεις σχετικά με τον ορισμό και την παρακολούθηση της ανταπόκρισης των ασθενών με ΧΜΛ υπό θεραπεία με TKI προήλθαν από τους ειδικούς του δικτύου ELN (3). Από τεχνικής άποψης, έχουν καταβληθεί προσπάθειες από ειδικούς διάφορων χωρών προκειμένου να εναρμονιστούν οι μέθοδοι μέτρησης και αναφοράς του BCR-ABL1 Mbcr (5 7). Επιπλέον, πρόσφατα επικυρώθηκε ένας πίνακας αναφοράς υπό την αιγίδα του ΠΟΥ, με στόχο την απλούστευση του ποσοτικού προσδιορισμού του BCR-ABL1 (8). 9 ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/2016

10 Αρχή της διαδικασίας Η ποσοτική PCR (quantitative PCR, qpcr) επιτρέπει τον ορθό ποσοτικό προσδιορισμό των προϊόντων της PCR κατά την εκθετική φάση ενίσχυσης της PCR. Η ποσοτική PCR μπορεί να προσφέρει δεδομένα γρήγορα, χωρίς περαιτέρω επεξεργασία, μέσω ανίχνευσης σημάτων φθορισμού σε πραγματικό χρόνο κατά τη διάρκεια ή/και μετά τους κύκλους ενίσχυσης, χαρακτηριστικό που μειώνει σημαντικά τον κίνδυνο μόλυνσης των προϊόντων της PCR. Σήμερα υπάρχουν τρεις βασικοί τύποι τεχνικών qpcr: ανάλυση qpcr με χρήση χρωστικής SYBR Green I, ανάλυση qpcr με χρήση ιχνηθετών υδρόλυσης και ανάλυση qpcr με χρήση ιχνηθετών υβριδοποίησης. Στην παρούσα μέθοδο χρησιμοποιείται η αρχή της υδρόλυσης ολιγονουκλεοτιδίων διπλής χρωστικής qpcr. Κατά την αντίδραση PCR, ευθείς και αντίστροφοι εκκινητές υβριδοποιούνται σε μια ειδική αλληλουχία. Στο ίδιο μείγμα περιλαμβάνεται ένα ολιγονουκλεοτίδιο με διπλή χρωστική. Αυτός ο ιχνηθέτης, που αποτελείται από ένα ολιγονουκλεοτίδιο σημασμένο με μια χρωστική αναφοράς 5 και μια κατάντη χρωστική απόσβεσης 3, υβριδοποιείται σε μια αλληλουχία-στόχο εντός του προϊόντος της PCR. Η ανάλυση qpcr με ιχνηθέτες υδρόλυσης αξιοποιεί τη δραστηριότητα 5 3 εξωνουκλεάσης της DNA πολυμεράσης του Thermus aquaticus (Taq). Όταν ο ιχνηθέτης είναι ακέραιος, η εγγύτητα της χρωστικής αναφοράς στη χρωστική απόσβεσης συνεπάγεται καταστολή του φθορισμού της χρωστικής αναφοράς, κυρίως μέσω μεταφοράς ενέργειας τύπου Förster. Εάν ο εξεταζόμενος στόχος είναι παρών κατά την αντίδραση PCR, ο ιχνηθέτης υβριδοποιείται ειδικά σε ένα σημείο ανάμεσα στις θέσεις του ευθέος και του αντίστροφου εκκινητή. Η δραστηριότητα 5 3 εξωνουκλεάσης της DNA πολυμεράσης διασπά τον ιχνηθέτη σε ένα σημείο ανάμεσα στις χρωστικές αναφοράς και απόσβεσης μόνον εάν ο ιχνηθέτης υβριδοποιηθεί στον στόχο. Τα τμήματα του ιχνηθέτη εκτοπίζονται κατόπιν από τον στόχο και ο πολυμερισμός του κλώνου συνεχίζεται. Το 3 άκρο του ιχνηθέτη είναι φραγμένο για να αποφευχθεί η επιμήκυνση του ιχνηθέτη κατά την PCR (Εικόνα 2). Η διαδικασία αυτή συμβαίνει σε κάθε κύκλο και δεν επηρεάζει την εκθετική συσσώρευση του προϊόντος. ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/

11 Αύξηση του σήματος φθορισμού ανιχνεύεται μόνον όταν η αλληλουχία-στόχος είναι συμπληρωματική προς τον ιχνηθέτη και συνεπώς ενισχύεται με την PCR. Λόγω των απαιτήσεων αυτών, δεν ανιχνεύεται μη ειδική ενίσχυση. Έτσι η αύξηση του φθορισμού είναι ευθέως ανάλογη της ενίσχυσης του στόχου με την PCR. Υβριδοποίηση Υβριδοποίηση εκκινητών και ιχνηθέτη Πολυμερισμός, Εκτόπιση κλώνου Διάσπαση Οδηγεί στην αποδέσμευση της χρωστικής απόσβεσης και εκπομπή σήματος φθορισμού από τη χρωστική αναφοράς Ολοκλήρωση πολυμερισμού Ολοκλήρωση προϊόντος PCR και συσσώρευση σήματος φθορισμού σε κάθε κύκλο Χρωστική αναφοράς Χρωστική απόσβεσης Ειδικός ιχνηθέτης Προϊόν PCR Ευθείς και αντίστροφοι εκκινητές Taq πολυμεράση Εικόνα 2. Αρχή της αντίδρασης. Το ολικό RNA μεταγράφεται αντίστροφα και το παραγόμενο cdna ενισχύεται μέσω της PCR χρησιμοποιώντας ένα ζεύγος ειδικών εκκινητών και έναν ειδικό εσωτερικό ιχνηθέτη διπλής χρώσης (FAM BHQ -1). Ο ιχνηθέτης δεσμεύεται στο αμπλικόνιο σε κάθε βήμα υβριδοποίησης της PCR. Καθώς η Taq DNA πολυμεράση επιμηκύνει τον εκκινητή που έχει δεσμευτεί στο αμπλικόνιο, εκτοπίζει το 5 άκρο του ιχνηθέτη, το οποίο κατόπιν αποδομείται από τη δραστηριότητα 5 3 εξωνουκλεάσης της Taq DNA πολυμεράσης. Η διάσπαση συνεχίζεται μέχρις ότου η ιχνηθέτης που απομένει αποκολληθεί από το αμπλικόνιο στο επόμενο βήμα τήξης. Αυτή η διεργασία απελευθερώνει το φθορισμοφόρο και τη χρωστική απόσβεσης φθορισμού, διαχωρίζοντάς τα στο χώρο και οδηγώντας σε μια αύξηση του φθορισμού από το FAM και μια μείωση του φθορισμού από το BHQ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/2016

12 Υλικά που παρέχονται Περιεχόμενα του κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR Kit Αρ. καταλόγου Αριθμός αντιδράσεων (24) Αντιδραστήρια για αντίστροφη μεταγραφή (RT) 24 µl Reverse transcriptase (Αντίστροφη μεταγραφάση) Πορφυρό 100 µl RT Mix (Μείγμα αντίστροφης μεταγραφής) Πορφυρό 300 µl Αντιδραστήρια για βαθμονόμηση High Positive RNA Control (Θετικός ορός ελέγχου RNA υψηλής συγκέντρωσης) Low Positive RNA Control (Θετικός ορός ελέγχου RNA χαμηλής συγκέντρωσης) Λευκό 15 µl 3 Λευκό 15 µl 3 IS-MMR Calibrator (Βαθμονομητής IS-MMR) Λευκό 15 µl 3 SP1-BCR-ABL Mbcr and ABL: Τυπική αραίωση κοινού πλασμιδίου Mbcr και ABL1 (10 1 αντίγραφα/5 µl) SP2-BCR-ABL Mbcr and ABL: Τυπική αραίωση κοινού πλασμιδίου Mbcr και ABL1 (10 2 αντίγραφα/5 µl) SP3-BCR-ABL Mbcr and ABL: Τυπική αραίωση κοινού πλασμιδίου Mbcr και ABL1 (10 3 αντίγραφα/5 µl) SP4-BCR-ABL Mbcr and ABL: Τυπική αραίωση κοινού πλασμιδίου Mbcr και ABL1 (10 4 αντίγραφα/5 µl) SP5-BCR-ABL Mbcr and ABL: Τυπική αραίωση κοινού πλασμιδίου Mbcr και ABL1 (10 5 αντίγραφα/5 µl) SP6-BCR-ABL Mbcr and ABL: Τυπική αραίωση κοινού πλασμιδίου Mbcr και ABL1 (10 6 αντίγραφα/5 µl) Κίτρινο 35 µl Κίτρινο 35 µl Κίτρινο 70 µl Κίτρινο 35 µl Κίτρινο 70 µl Κίτρινο 70 µl Ο πίνακας συνεχίζεται στην επόμενη σελίδα ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/

13 Ο πίνακας συνεχίζεται από την προηγούμενη σελίδα Αντιδραστήρια για qpcr Taq DNA πολυμεράση Πράσινο της μέντας qpcr Mix ABL1 (Μείγμα για qpcr του ABL1)* Πράσινο 720 µl 3 qpcr Mix Mbcr (Μείγμα για qpcr του Mbcr) Κόκκινο 720 µl 3 Εγχειρίδιο του ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 1 85 µl * Περιέχει μείγμα ειδικών ευθέων και αντίστροφων εκκινητών για το γονίδιο ελέγχου ABL1 και έναν ειδικό ιχνηθέτη FAM BHQ-1. Περιέχει μείγμα ειδικών ευθέων και αντίστροφων εκκινητών για το γονίδιο σύντηξης BCR-ABL1 Mbcr και έναν ειδικό ιχνηθέτη FAM BHQ-1. Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Κατά την εργασία με χημικά, φοράτε πάντα κατάλληλη προστατευτική ποδιά εργαστηρίου, γάντια μίας χρήσης και προστατευτικά γυαλιά. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στα σχετικά δελτία δεδομένων ασφαλείας (safety data sheets, SDS), τα οποία διατίθενται από τον προμηθευτή του προϊόντος. Αντιδραστήρια για τη λύση των ερυθροκυττάρων Erythrocyte Lysis (EL) Buffer (Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης ερυθροκυττάρων) (αρ. κατ ) 14.3 M β-mercaptoethanol* (β-μερκαπτοαιθανόλη 14,3 Μ) RNeasy Midi Kit (κιτ RNeasy Midi) (αρ. κατ ) * Οι χημικές ουσίες και ο εξοπλισμός που συνιστώνται για τη λύση των ερυθροκυττάρων και την απομόνωση του RNA είναι δυνητικά επικίνδυνα. Πριν από τη χρήση, βεβαιωθείτε ότι έχουν τεθεί σε εφαρμογή κατάλληλα μέσα ατομικής προστασίας και κατάλληλες προφυλάξεις. 13 ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/2016

14 Αντιδραστήρια για απομόνωση ολικού RNA RNeasy Midi Kit (κιτ RNeasy Midi) (αρ. κατ ) Αιθανόλη (70%, 80% και %) Προαιρετικό βήμα καθαρισμού και συμπύκνωσης RNA: RNeasy MinElute Cleanup Kit (κιτ καθαρισμού RNeasy MinElute ) (αρ. κατ ) Νερό ελεύθερο νουκλεασών, κατάλληλο για PCR Αναλώσιμα Αποστειρωμένα ρύγχη πιπέτας για PCR, ελεύθερα νουκλεασών, με προστασία από τα αερολύματα και με υδρόφοβο φίλτρο Βελόνα gauge* τοποθετημένη σε σύριγγα ελεύθερη RNασών Σωληνάρια των 0,5 ml ή 0,2 ml ελεύθερα νουκλεασών Σωληνάρια των 1,5 ml ή 2 ml ελεύθερα νουκλεασών Σωληνάρια φυγοκέντρου των 50 ml Σειρές σωληναρίων και πώματα, 0,1 ml, για το Rotor-Gene Q (αρ. κατ ή ) Πάγος Εξοπλισμός Πιπέτες* αποκλειστικά για την PCR (1 10 µl, µl, µl) Επιτραπέζια φυγόκεντρος* με ρότορα για σωληνάρια αντίδρασης 0,2 ml και 2 ml (με δυνατότητα περιστροφής στα g ή σ.α.λ.) Φασματοφωτόμετρο* Εργαστηριακή φυγόκεντρος* με ρότορα για σωληνάρια φυγοκέντρου 15 και 50 ml (με δυνατότητα περιστροφής στα g), ψυχόμενη (4 C) * Βεβαιωθείτε ότι τα όργανα έχουν ελεγχθεί και βαθμονομηθεί σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/

15 Συσκευή θέρμανσης και ανακίνησης (thermomixer), θερμαινόμενος επωαστήρας τροχιακής κίνησης, θερμαντικό μπλοκ ή υδατόλουτρο (για το βήμα αντίστροφης μεταγραφής)* Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM* (αρ. κατ ) και σχετικό ειδικό υλικό Λογισμικό Rotor-Gene Q, έκδοση ή νεότερη Σημείωση: Το Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί στο βήμα της αντίστροφης μεταγραφής Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις Για in vitro διαγνωστική χρήση Πληροφορίες ασφαλείας Κατά την εργασία με χημικά, φοράτε πάντα κατάλληλη προστατευτική ποδιά εργαστηρίου, γάντια μίας χρήσης και προστατευτικά γυαλιά. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στα σχετικά δελτία δεδομένων ασφάλειας (SDS). Διατίθενται στο Διαδίκτυο σε εύχρηστη και συμπιεσμένη μορφή PDF, στη διεύθυνση όπου μπορείτε να βρείτε, να εμφανίσετε και να εκτυπώσετε τα SDS για κάθε κιτ και για κάθε συστατικό των κιτ της QIAGEN. Όλες οι χημικές ουσίες και τα βιολογικά υλικά είναι εν δυνάμει επικίνδυνα. Τα δείγματα είναι εν δυνάμει μολυσματικά και πρέπει να αντιμετωπίζονται ως βιολογικά επικίνδυνα υλικά. Το αίμα θεωρείται δυνητικά μολυσματικό. Κατά τη διεξαγωγή εργασιών με ολικό αίμα, θα πρέπει να λαμβάνονται όλες οι απαραίτητες προφυλάξεις που συνιστώνται από τις αρμόδιες ρυθμιστικές αρχές. 15 ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/2016

16 Οι χημικές ουσίες και ο εξοπλισμός που συνιστώνται για τη λύση των ερυθροκυττάρων και την απομόνωση του RNA είναι δυνητικά επικίνδυνα. Πριν από τη χρήση, βεβαιωθείτε ότι έχουν τεθεί σε εφαρμογή κατάλληλα μέσα ατομικής προστασίας και κατάλληλες προφυλάξεις. Γενικές προφυλάξεις Η διεξαγωγή αναλύσεων qpcr απαιτεί ορθές εργαστηριακές πρακτικές, συμπεριλαμβανομένης της συντήρησης του εξοπλισμού που χρησιμοποιείται αποκλειστικά για πειράματα μοριακής βιολογίας και συμμορφώνεται με τους ισχύοντες κανονισμούς και τα σχετικά πρότυπα. Τα συστατικά του προϊόντος αυτού επαρκούν για τη διεξαγωγή 24 αντιδράσεων για κάθε ανάλυση. Τα απόβλητα των δειγμάτων και των αναλύσεων πρέπει να απορρίπτονται σύμφωνα με τις τοπικές διαδικασίες ασφαλείας. Τα αντιδραστήρια που παρέχονται με το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR βρίσκονται στην ιδανική αραίωση. Μην εκτελείτε περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων, καθώς ενδέχεται να προκληθεί υποβάθμιση των επιδόσεων. Όλα τα αντιδραστήρια που παρέχονται στο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR προορίζονται για χρήση αποκλειστικά με τα άλλα αντιδραστήρια που παρέχονται στο ίδιο κιτ. Μην ανταλλάσσετε αντιδραστήρια μεταξύ διαφορετικών κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR, καθώς αυτό μπορεί να επηρεάσει τις επιδόσεις τους. Για επιπλέον προειδοποιήσεις, προφυλάξεις και διαδικασίες, ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήστη του οργάνου Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM. Η τροποποίηση των χρόνων ή/και των θερμοκρασιών επώασης μπορεί να οδηγήσει σε εσφαλμένα ή ασυνεπή δεδομένα. Μη χρησιμοποιείτε το περιεχόμενο της συσκευασίας εάν έχει παρέλθει η ημερομηνία λήξης ή δεν έχουν ληφθεί τα σωστά μέτρα αποθήκευσης. Προσέξτε ιδιαίτερα ώστε να αποφύγετε τη διασταυρούμενη μόλυνση κατά τη χρήση θετικών ορών ελέγχου. ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/

17 Προσέξτε ιδιαίτερα ώστε να αποφύγετε τη μόλυνση λόγω μεταφοράς cdna ή προϊόντος PCR, που μπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς θετικό σήμα. Προσέξτε ιδιαίτερα ώστε να αποφύγετε τη μόλυνση από RNάση ή DNάση, που μπορεί να προκαλέσει αποδόμηση των μητρών RNA ή cdna. Μην ανοίγετε το όργανο Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM πριν ολοκληρωθεί η εκτέλεση ανάλυσης. Απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή, ώστε να διασφαλιστεί η σωστή εξέταση των δειγμάτων με έμφαση στην αποφυγή εσφαλμένης εισαγωγής δείγματος και τυχόν σφαλμάτων φόρτωσης και διοχέτευσης με πιπέτα. Βεβαιωθείτε ότι ο χειρισμός των δειγμάτων γίνεται με συστηματικό τρόπο ώστε να εξασφαλίζεται διαρκώς η σωστή ταυτοποίησή τους. Κατά συνέπεια, συνιστούμε τα εξής: Να χρησιμοποιείτε εργαστηριακό εξοπλισμό ελεύθερο νουκλεασών (πιπέτες, ρύγχη πιπέτας, φιαλίδια αντίδρασης κ.λπ.). Να χρησιμοποιείτε νέα ρύγχη πιπέτας, με προστασία από τα αερολύματα, για όλα τα βήματα αναρρόφησης ώστε να αποφευχθεί η διασταυρούμενη μόλυνση των δειγμάτων και των αντιδραστηρίων. Να προετοιμάζετε κύρια μείγματα προ της PCR χρησιμοποιώντας εξοπλισμό αποκλειστικής χρήσης (πιπέτες, ρύγχη κ.λπ.) σε αποκλειστικό χώρο όπου δεν εισέρχεται καθόλου μήτρα DNA (cdna, πλασμίδια ή προϊόντα PCR). Να προσθέτετε τη μήτρα σε χωριστή ζώνη (κατά προτίμηση σε χωριστό δωμάτιο) χρησιμοποιώντας ειδικό εξοπλισμό (πιπέτες, ρύγχη κ.λπ.). Ανατρέξτε στα αντίστοιχα εγχειρίδια για πληροφορίες ασφάλειας ειδικές για τα αντιδραστήρια και τα κιτ που χρησιμοποιούνται για την προετοιμασία των δειγμάτων. Πληροφορίες ασφάλειας για το κιτ RNeasy Midi (αρ. κατ ) σε συνδυασμό με το ρυθμιστικό διάλυμα EL (αρ. κατ ) παρέχονται στο εγχειρίδιο του RNeasy Midi/Maxi (RNeasy Midi/Maxi Handbook) και πληροφορίες ασφάλειας για το κιτ καθαρισμού RNeasy MinElute 17 ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/2016

18 (αρ. κατ ) παρέχονται στο εγχειρίδιο του κιτ καθαρισμού RNeasy MinElute (RNeasy MinElute Cleanup Handbook). Φύλαξη και χειρισμός αντιδραστηρίων Συνθήκες μεταφοράς Το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR αποστέλλεται σε ξηρό πάγο. Εάν οποιοδήποτε συστατικό του κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR δεν είναι κατεψυγμένο κατά την παραλαβή, εάν η εξωτερική συσκευασία έχει ανοίξει κατά τη μεταφορά ή εάν στο κιβώτιο αποστολής δεν περιλαμβάνεται το δελτίο συσκευασίας ή τα αντιδραστήρια, επικοινωνήστε με κάποιο από τα τμήματα τεχνικής υποστήριξης ή τους τοπικούς αντιπροσώπους της QIAGEN (ανατρέξτε στο οπισθόφυλλο ή επισκεφτείτε την ιστοσελίδα Συνθήκες φύλαξης Το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR θα πρέπει να αποθηκεύεται αμέσως μετά την παραλαβή σε θερμοκρασία 30 έως 15 C σε καταψύκτη σταθερής θερμοκρασίας. Χρειάζεται προσοχή ώστε να προστατεύονται τα μείγματα qpcr από το φως. Για πληροφορίες αποθήκευσης των αντιδραστηρίων και των κιτ που χρησιμοποιούνται για την προετοιμασία των δειγμάτων: κιτ RNeasy Midi (αρ. κατ ), ρυθμιστικό διάλυμα EL (αρ. κατ ), κιτ καθαρισμού RNeasy MinElute (αρ. κατ ), ανατρέξτε στα αντίστοιχα εγχειρίδια. Σταθερότητα Το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR παραμένει σταθερό μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης, εφόσον αποθηκεύεται υπό τις καθορισμένες συνθήκες αποθήκευσης. ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/

19 Μετά το άνοιγμα, τα αντιδραστήρια μπορούν να αποθηκευτούν στην αρχική τους συσκευασία σε θερμοκρασία 30 έως 15 C μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στη συσκευασία. Μην υπερβαίνετε το μέγιστο όριο πέντε κύκλων κατάψυξης-απόψυξης. Για πληροφορίες σταθερότητας των αντιδραστηρίων και των κιτ που χρησιμοποιούνται για την προετοιμασία των δειγμάτων: κιτ RNeasy Midi (αρ. κατ ), ρυθμιστικό διάλυμα EL (αρ. κατ ), κιτ καθαρισμού RNeasy MinElute (αρ. κατ ), ανατρέξτε στα αντίστοιχα εγχειρίδια. Χειρισμός και αποθήκευση δειγμάτων Το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR προορίζεται για χρήση με δείγματα RNA απομονωμένα από ολικό αίμα. Όλα τα δείγματα πρέπει να αντιμετωπίζονται ως δυνητικά επικίνδυνα. Δείγματα ολικού αίματος Τα δείγματα ολικού αίματος θα πρέπει να περιέχουν ως αντιπηκτικό καλιούχο EDTA (K2EDTA) και να φυλάσσονται στους 2 8 C για διάστημα 4 ημερών το πολύ προτού απομονωθεί το RNA. Μη χρησιμοποιείτε κατεψυγμένο αίμα. Να επισημαίνετε, να χειρίζεστε και να φυλάσσετε τα δείγματα αίματος με ελεγχόμενο τρόπο, σύμφωνα με τις κατά τόπους διαδικασίες. Σημείωση: Τα δείγματα ολικού αίματος πρέπει να αποστέλλονται σε συνθήκες ίδιες με τις συνθήκες στις οποίες φυλάσσονταν προκειμένου να αποφευχθούν οι μεταβολές στη θερμοκρασία. 19 ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/2016

20 Δείγματα RNA Μετά την απομόνωσή του, το RNA μπορεί να αποθηκευτεί σε θερμοκρασία 30 έως 15 C ή χαμηλότερη ( 90 έως 65 C) εάν απαιτείται μακροχρόνια αποθήκευση. Να επισημαίνετε, να χειρίζεστε και να φυλάσσετε τα δείγματα RNA με ελεγχόμενο τρόπο, σύμφωνα με τις κατά τόπους διαδικασίες. Σημείωση: Τα δείγματα RNA πρέπει να αποστέλλονται σε συνθήκες ίδιες με τις συνθήκες στις οποίες φυλάσσονταν προκειμένου να αποφευχθούν οι μεταβολές στη θερμοκρασία κατά τη φύλαξη και την αποστολή. Διαδικασία Απομονώνεται ολικό RNA από 10 ml περιφερικού ολικού αίματος συλλεγμένου σε σωληνάρια EDTA. Βεβαιωθείτε ότι τα αντιδραστήρια που θα χρησιμοποιηθούν για τη λύση των ερυθροκυττάρων, την απομόνωση του RNA και τη συμπύκνωση του RNA δεν έχουν λήξει και ότι έχουν μεταφερθεί και αποθηκευτεί υπό κατάλληλες συνθήκες. Χρησιμοποιήστε το κιτ RNeasy Midi (αρ. κατ ) και το ρυθμιστικό διάλυμα EL (αρ. κατ ) για τον καθαρισμό του RNA από περιφερικό ολικό αίμα. Πρωτόκολλο λύσης ερυθροκυττάρων για την απομόνωση ολικών λευκοκυττάρων από ολικό αίμα Αυτό το πρωτόκολλο αποσκοπεί στην απομόνωση ολικών λευκοκυττάρων από 10 ml ολικού ανθρώπινου αίματος με χρήση του ρυθμιστικού διαλύματος EL (αρ. κατ ). ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/

21 Σημείωση: Αυτό το πρωτόκολλο δεν προορίζεται για χρήση με κατεψυγμένα δείγματα ολικού αίματος. Σημαντικές παρατηρήσεις πριν από την έναρξη Το αίμα και τα σωματικά υγρά όλων των ανθρώπων θεωρούνται δυνητικά μολυσματικά. Κατά τη διεξαγωγή εργασιών με ολικό αίμα, θα πρέπει να λαμβάνονται όλες οι απαραίτητες προφυλάξεις που συνιστώνται από τις αρμόδιες ρυθμιστικές αρχές. Το ρυθμιστικό διάλυμα RLT μπορεί να σχηματίσει κατακρήμνισμα κατά τη διάρκεια της φύλαξής του. Διαλύστε το με θέρμανση, εάν χρειάζεται, και φυλάξτε κατόπιν σε θερμοκρασία δωματίου. Το βήμα λύσης των ερυθροκυττάρων θα πρέπει να εκτελεστεί μέσα σε πάγο. Τα βήματα φυγοκέντρησης 3 και 5 του πρωτοκόλλου αυτού πρέπει να πραγματοποιηθούν σε θερμοκρασία 4 C μέσα σε κοινή εργαστηριακή φυγόκεντρο. Απαραίτητα βήματα πριν από την έναρξη Παρασκευάστε το ρυθμιστικό διάλυμα RLT (περιλαμβάνεται στο κιτ RNeasy Midi), προσθέτοντας β-μερκαπτοαιθανόλη (β-me). Προσθέστε 10 µl β-me ανά 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος RLT. Το ρυθμιστικό διάλυμα RLT παραμένει σταθερό για 1 μήνα μετά την προσθήκη της β-me. Σημείωση: Ηβ-ME είναι τοξική μεταγγίστε την κάτω από απαγωγό φορώντας κατάλληλο προστατευτικό ρουχισμό. Σημείωση: Το ρυθμιστικό διάλυμα RLT περιέχει ισοθειοκυανική γουανιδίνη, η οποία μπορεί να σχηματίσει εξαιρετικά αντιδραστικές ενώσεις όταν συνδυαστεί με λευκαντικό. Μην προσθέτετε λευκαντικό ή όξινα διαλύματα απευθείας στα απόβλητα της παρασκευής δειγμάτων. 21 ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/2016

22 Διαδικασία 1. Προσθέστε 40 ml ρυθμιστικού διαλύματος EL σε 10 ml ολικού αίματος μέσα σε ένα σωληνάριο φυγοκέντρου 50 ml. Αναμείξτε αναστρέφοντας στιγμιαία. 2. Επωάστε επί 15 λεπτά μέσα σε πάγο. Αναμείξτε αναστρέφοντας στιγμιαία δύο φορές κατά τη διάρκεια της επώασης. Σημείωση: Το θολό εναιώρημα γίνεται διαυγές κατά τη διάρκεια της επώασης, γεγονός που υποδεικνύει τη λύση των ερυθροκυττάρων. 3. Φυγοκεντρήστε στα 400 g επί 10 λεπτά, σε θερμοκρασία 4 C. Απορρίψτε ολόκληρο το υπερκείμενο. Φυλάξτε το ίζημα των λευκοκυττάρων. Σημείωση: Τα λευκοκύτταρα σχηματίζουν ίζημα κατά τη φυγοκέντρηση. Φροντίστε να απομακρύνετε όλο το υπερκείμενο. Τυχόν ίχνη ερυθροκυττάρων που απομένουν θα απομακρυνθούν με τα επόμενα βήματα. Η ατελής απομάκρυνση του υπερκειμένου θα οδηγήσει σε αναστολή της λύσης και αραίωση του κυτταρολύματος, γεγονός που θα επηρεάσει τις συνθήκες δέσμευσης του RNA στη μεμβράνη RNeasy. Και οι δύο αυτές συνέπειες μπορούν να ελαττώσουν την απόδοση ανάκτησης RNA. 4. Προσθέστε 20 ml ρυθμιστικού διαλύματος EL στο ίζημα λευκοκυττάρων και επανεναιωρήστε το ίζημα με επανειλημμένη αναρρόφηση και έγχυση με πιπέτα. 5. Φυγοκεντρήστε στα 400 g επί 10 λεπτά, σε θερμοκρασία 4 C. Απορρίψτε ολόκληρο το υπερκείμενο. Φυλάξτε το ίζημα των λευκοκυττάρων. Σημείωση: Τα επόμενα βήματα φυγοκέντρησης (π.χ. κατά την απομόνωση του RNA) πρέπει να πραγματοποιηθούν σε θερμοκρασία C. 6. Αποκολλήστε το ίζημα λευκοκυττάρων, αναστρέφοντας το σωληνάριο αφού προσθέσετε 4 ml ρυθμιστικού διαλύματος RLT στο οποίο έχει συμπληρωθεί β-me. Αναμείξτε με στροβιλισμό ή με επανειλημμένη αναρρόφηση και έγχυση με πιπέτα. Σημείωση: Βεβαιωθείτε ότι έχει προστεθεί β-me στο ρυθμιστικό διάλυμα RLT πριν από τη χρήση. ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/

23 7. Διασπάστε το ίζημα χρησιμοποιώντας συμβατικό ομογενοποιητή ρότορα/στάτορα επί 45 δευτερόλεπτα τουλάχιστον, στη μέγιστη ταχύτητα, μέχρι να ομογενοποιηθεί πλήρως το μείγμα. Εναλλακτικά, στροβιλίστε το δείγμα επί 10 δευτερόλεπτα και περάστε το κυτταρόλυμα τουλάχιστον 10 φορές από μια βελόνα των gauge τοποθετημένη σε σύριγγα ελεύθερη RNασών. Σημείωση: Τυχόν ατελής διάσπαση θα μειώσει σημαντικά την απόδοση ανάκτησης επειδή θα αποφράξει τη στήλη RNeasy. Η διάσπαση με χρήση ομογενοποιητή ρότορα/στάτορα κατά κανόνα οδηγεί σε υψηλότερη ολική απόδοση ανάκτησης RNA σε σύγκριση με τις άλλες μεθόδους ομογενοποίησης. Σημείωση: Τα δείγματα μπορούν να φυλαχθούν σε θερμοκρασία 90 έως 65 C μέσα σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης μετά τη διάσπαση. Τα κατεψυγμένα δείγματα παραμένουν σταθερά επί αρκετούς μήνες. Απομόνωση ολικού RNA Αυτό το πρωτόκολλο προορίζεται για την απομόνωση ολικού κυτταρικού RNA από ομογενοποιημένο κυτταρόλυμα λευκοκυττάρων που έχει επανεναιωρηθεί σε 4 ml διαλύματος RLT/β-ME. Σημαντικές παρατηρήσεις πριν από την έναρξη Δεν απαιτείται πέψη με DNάση επειδή η τεχνολογία μεμβράνης πυριτίας RNeasy απομακρύνει αποτελεσματικά το μεγαλύτερο μέρος του DNA. Το ρυθμιστικό διάλυμα RLT και το ρυθμιστικό διάλυμα RW1 περιέχουν άλας γουανιδίνης και συνεπώς δεν είναι συμβατά με αντιδραστήρια απολύμανσης που περιέχουν λευκαντικό. Η γουανιδίνη είναι ερεθιστική. Λάβετε τα κατάλληλα μέτρα ασφάλειας και φορέστε γάντια πριν τη χειριστείτε. Το πρωτόκολλο RNeasy πρέπει να εκτελείται σε θερμοκρασία δωματίου. Να εργάζεστε γρήγορα κατά τη διάρκεια της διαδικασίας. 23 ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/2016

24 Όλα τα βήματα φυγοκέντρησης εκτελούνται σε θερμοκρασία 20 έως 25 C. Βεβαιωθείτε ότι η φυγόκεντρος δεν θα ψυχρανθεί κάτω από τους 20 C. Σε κάθε βήμα φυγοκέντρησης, πρέπει να διέρχεται από τη στήλη ολόκληρος ο όγκος. Ίσως χρειαστεί να επαναληφθεί η φυγοκέντρηση. Απαραίτητα βήματα πριν από την έναρξη Εάν χρειάζεται, αποψύξτε το κυτταρόλυμα των λευκοκυττάρων σε θερμοκρασία δωματίου προτού ξεκινήσετε το πρωτόκολλο απομόνωσης RNA. Παρασκευάστε 4 ml διαλύματος αιθανόλης 70% ανά δείγμα. Το ρυθμιστικό διάλυμα RPE παρέχεται υπό μορφή πυκνού διαλύματος. Προτού το χρησιμοποιήσετε για πρώτη φορά, προσθέστε 4 όγκους αιθανόλης (96 100%), όπως αναγράφεται στη φιάλη, για να παρασκευάσετε το διάλυμα εργασίας. Διαδικασία 1. Προσθέστε 4 ml διαλύματος αιθανόλης 70% στο κυτταρόλυμα και αναμείξτε σχολαστικά ανακινώντας ζωηρά. Μη φυγοκεντρήσετε. Σημείωση: Ενδέχεται να σχηματιστεί ορατό κατακρήμνισμα μετά την προσθήκη αιθανόλης. Διαλύστε πλήρως το κατακρήμνισμα με ζωηρή ανακίνηση και προχωρήστε αμέσως στο βήμα 2. Τυχόν ατελής διάλυση των κατακρημνισμάτων μπορεί να προκαλέσει μόλυνση με DNA με αποτέλεσμα να ληφθεί ακάθαρτο δείγμα ολικού RNA. 2. Μεταφέρετε το δείγμα, μαζί με τυχόν κατακρήμνισμα, σε μια στήλη RNeasy Midi τοποθετημένη σε σωληνάριο φυγοκέντρου των 15 ml (παρέχεται). Κλείστε απαλά το σωληνάριο και φυγοκεντρήστε επί 5 λεπτά στα g. Απορρίψτε το υγρό που θα διέλθει από τη στήλη. Σημείωση: Ο μέγιστος όγκος φόρτωσης είναι 4 ml. Εάν ο όγκος υπερβαίνει τα 4,0 ml, φορτώστε διαδοχικά μερίδες στη στήλη RNeasy και φυγοκεντρήστε όπως περιγράφεται παραπάνω. Απορρίψτε το υγρό που θα διέλθει από τη στήλη μετά από κάθε βήμα φυγοκέντρησης. Χρησιμοποιήστε ξανά το σωληνάριο φυγοκέντρου στο βήμα 3. ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/

25 3. Προσθέστε 4 ml ρυθμιστικού διαλύματος RW1 στη στήλη RNeasy. Κλείστε μαλακά το σωληνάριο φυγοκέντρου και φυγοκεντρήστε επί 5 λεπτά στα g για να εκπλυθεί η στήλη. Απορρίψτε το υγρό που θα διέλθει από τη στήλη. Σημείωση: Το διελθόν υγρό περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα RLT ή ρυθμιστικό διάλυμα RW1 και συνεπώς δεν είναι συμβατό με λευκαντικό. Χρησιμοποιήστε ξανά το σωληνάριο φυγοκέντρου στο βήμα Προσθέστε 2,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος RPE στη στήλη RNeasy. Κλείστε μαλακά το σωληνάριο φυγοκέντρου και φυγοκεντρήστε επί 2 λεπτά στα g για να εκπλυθεί η στήλη. Σημείωση: Το ρυθμιστικό διάλυμα RPE παρέχεται υπό μορφή πυκνού διαλύματος. Βεβαιωθείτε ότι έχει προστεθεί αιθανόλη στο ρυθμιστικό διάλυμα RPE πριν από τη χρήση. Χρησιμοποιήστε ξανά το σωληνάριο φυγοκέντρου στο βήμα 5. Δεν χρειάζεται να απορρίψετε το υγρό που θα διέλθει από τη στήλη. 5. Προσθέστε άλλα 2,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος RPE στη στήλη RNeasy. Κλείστε μαλακά το σωληνάριο φυγοκέντρου και φυγοκεντρήστε επί 5 λεπτά στα g για να στεγνώσει η μεμβράνη γέλης πυριτίας RNeasy. Σημείωση: Είναι σημαντικό να στεγνώσει η μεμβράνη RNeasy επειδή τα υπολείμματα αιθανόλης μπορούν να επηρεάσουν τις περαιτέρω αντιδράσεις. Με τη φυγοκέντρηση αυτή εξασφαλίζεται ότι δεν θα μεταφερθεί αιθανόλη κατά τη διάρκεια της έκλουσης. Σημείωση: Μετά τη φυγοκέντρηση, αφαιρέστε τη στήλη RNeasy από το σωληνάριο φυγοκέντρου με προσοχή, έτσι ώστε η στήλη να μην έρθει σε επαφή με το διελθόν υγρό καθώς αυτό θα οδηγήσει σε μεταφορά αιθανόλης. 6. Για την έκλουση, μεταφέρετε τη στήλη RNeasy σε νέο σωληνάριο συλλογής των 15 ml (παρέχεται). Με μια πιπέτα, μεταφέρετε 200 µl νερού ελεύθερου RNασών απευθείας πάνω στη μεμβράνη γέλης πυριτίας RNeasy. Κλείστε μαλακά το σωληνάριο. Αφήστε το να ηρεμήσει επί 1 λεπτό και κατόπιν φυγοκεντρήστε επί 3 λεπτά στα g. 25 ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/2016

26 7. Επαναλάβετε το βήμα της έκλουσης (βήμα 6) χρησιμοποιώντας το έκλουσμα από το βήμα 6 και κατόπιν φυγοκεντρήστε επί 5 λεπτά στα g. Σημείωση: Για μακροχρόνια φύλαξη, το RNA μπορεί να αποθηκευτεί σε θερμοκρασία 90 έως 65 C. Ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός του RNA Η ποιότητα ανάλυσης εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την ποιότητα του αρχικού RNA. Συνιστούμε την ανάλυση του κεκαθαρμένου RNA μέσω ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης ή μέσω φασματοφωτομετρίας πριν από την ανάλυση. Για τη βαθμονόμηση του φασματοφωτομέτρου θα πρέπει να χρησιμοποιείται ένα τυφλό νερού, ελεύθερου νουκλεασών, κατάλληλου για PCR. Μια τιμή OD ίση με 1,0 στα 260 nm ισοδυναμεί με περίπου 40 µg/ml μονόκλωνου RNA. Μια τιμή λόγου OD260/OD280 μεταξύ 1,8 και 2,1 υποδηλώνει ότι το RNA είναι υψηλής καθαρότητας. Για το βήμα της RT, απαιτείται συγκέντρωση RNA ίση με 200 ng/µl. Εάν η συγκέντρωση του RNA στο έκλουσμα είναι μικρότερη από 200 ng/µl, η συγκέντρωση RNA στο έκλουσμα θα πρέπει να αυξηθεί με χρήση του κιτ καθαρισμού RNeasy MinElute (QIAGEN, αρ. κατ ). Εάν η συγκέντρωση RNA στο έκλουσμα είναι μεγαλύτερη από το ανώτατο όριο, θα πρέπει να ρυθμιστεί στα 200 ng/µl με νερό ελεύθερο RNασών. Σημείωση: Ελέγξτε τη συγκέντρωση RNA μετά την κανονικοποίηση. ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/

27 Συγκέντρωση RNA Αυτό το πρωτόκολλο έχει τελειοποιηθεί με σκοπό τη συμπύκνωση του RNA. Σημαντικές παρατηρήσεις πριν από την έναρξη Δεν απαιτείται πέψη με DNάση επειδή η τεχνολογία μεμβράνης πυριτίας RNeasy MinElute απομακρύνει αποτελεσματικά το μεγαλύτερο μέρος του DNA. Το ρυθμιστικό διάλυμα RLT περιέχει άλας γουανιδίνης και συνεπώς δεν είναι συμβατό με αντιδραστήρια απολύμανσης που περιέχουν λευκαντικό. Πραγματοποιήστε όλα τα βήματα της διαδικασίας σε θερμοκρασία δωματίου (15 25 C). Να εργάζεστε γρήγορα κατά τη διάρκεια της διαδικασίας. Εκτελέστε όλα τα βήματα φυγοκέντρησης στους C μέσα σε μια κοινή μικροφυγόκεντρο. Βεβαιωθείτε ότι η φυγόκεντρος δεν θα ψυχρανθεί κάτω από τους 20 C. Το ρυθμιστικό διάλυμα RLT μπορεί να σχηματίσει κατακρήμνισμα κατά τη φύλαξή του. Διαλύστε το με θέρμανση, εάν χρειάζεται, και φυλάξτε κατόπιν σε θερμοκρασία δωματίου (15 25 C). Απαραίτητα βήματα πριν από την έναρξη Παρασκευάστε 500 µl διαλύματος αιθανόλης 80% για κάθε δείγμα RNA προς συμπύκνωση. Το ρυθμιστικό διάλυμα RPE παρέχεται υπό μορφή πυκνού διαλύματος. Προτού το χρησιμοποιήσετε για πρώτη φορά, προσθέστε 4 όγκους αιθανόλης (96 100%), όπως αναγράφεται στη φιάλη, για να δημιουργηθεί ένα διάλυμα εργασίας. Προετοιμάστε τις στήλες σε θερμοκρασία δωματίου προτού ξεκινήσετε. Μετρήστε τον όγκο των δειγμάτων προς επεξεργασία και ρυθμίστε τον έτσι ώστε ο τελικός όγκος του δείγματος να είναι 200 µl. 27 ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/2016

28 Διαδικασία 1. Αφού ρυθμίσετε το δείγμα σε όγκο 200 µl με νερό ελεύθερο RNασών, προσθέστε 700 µl ρυθμιστικού διαλύματος RLT και αναμείξτε καλά. 2. Προσθέστε 500 µl διαλύματος αιθανόλης % στο αραιωμένο RNA και αναμείξτε καλά με επανειλημμένη αναρρόφηση και έγχυση με πιπέτα. Μη φυγοκεντρήσετε. Προχωρήστε αμέσως στο βήμα Μεταφέρετε μια ποσότητα δείγματος όχι μεγαλύτερη από 700 µl σε μια στήλη φυγοκέντρησης RNeasy MinElute τοποθετημένη μέσα σε σωληνάριο συλλογής των 2 ml (παρέχεται). Κλείστε μαλακά το καπάκι και φυγοκεντρήστε επί 15 δευτερόλεπτα σε ταχύτητα g ( σ.α.λ.). Απορρίψτε το υγρό που θα διέλθει από τη στήλη. Μεταφέρετε τυχόν εναπομείναν δείγμα (μέχρι 700 µl) και επαναλάβετε τη φυγοκέντρηση. Απορρίψτε το υγρό που θα διέλθει από τη στήλη. Σημείωση: Το διελθόν υγρό περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα RLT και συνεπώς δεν είναι συμβατό με λευκαντικό. Βλ. «Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις», σελ. 15, για πληροφορίες ασφάλειας. 4. Τοποθετήστε τη στήλη φυγοκέντρησης RNeasy MinElute σε νέο σωληνάριο συλλογής των 2 ml (παρέχεται). 5. Προσθέστε 500 µl ρυθμιστικού διαλύματος RPE στη στήλη φυγοκέντρησης. Κλείστε μαλακά το καπάκι και φυγοκεντρήστε επί 15 δευτερόλεπτα σε ταχύτητα g ( σ.α.λ.) για να εκπλυθεί η μεμβράνη της στήλης φυγοκέντρησης. Απορρίψτε το υγρό που θα διέλθει από τη στήλη. Σημείωση: Το ρυθμιστικό διάλυμα RPE παρέχεται υπό μορφή πυκνού διαλύματος. Βεβαιωθείτε ότι έχει προστεθεί αιθανόλη στο ρυθμιστικό διάλυμα RPE πριν από τη χρήση. Χρησιμοποιήστε ξανά το σωληνάριο συλλογής στο βήμα Προσθέστε 500 µl διαλύματος αιθανόλης 80% στη στήλη φυγοκέντρησης RNeasy MinElute. Κλείστε μαλακά το καπάκι και φυγοκεντρήστε επί 2 λεπτά στα g ( σ.α.λ.) για να εκπλυθεί η μεμβράνη της στήλης φυγοκέντρησης. Απορρίψτε το υγρό που θα διέλθει από τη στήλη, καθώς και το σωληνάριο συλλογής. ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/

29 Σημείωση: Το διελθόν υγρό περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα RLT και συνεπώς δεν είναι συμβατό με λευκαντικό. Σημείωση: Μετά τη φυγοκέντρηση, αφαιρέστε προσεκτικά τη στήλη φυγοκέντρησης RNeasy MinElute από το σωληνάριο συλλογής έτσι ώστε η στήλη να μην έρθει σε επαφή με το διελθόν υγρό. Διαφορετικά θα μεταφερθεί αιθανόλη στη στήλη. 7. Τοποθετήστε τη στήλη φυγοκέντρησης RNeasy MinElute σε νέο σωληνάριο συλλογής των 2 ml (παρέχεται). 8. Ανοίξτε το καπάκι της στήλης φυγοκέντρησης και φυγοκεντρήστε στη μέγιστη ταχύτητα για 5 λεπτά. Απορρίψτε το υγρό που θα διέλθει από τη στήλη, καθώς και το σωληνάριο συλλογής. Για να αποφευχθεί η πρόκληση βλάβης στα καπάκια των στηλών φυγοκέντρησης, τοποθετήστε τις στήλες μέσα στη φυγόκεντρο έτσι ώστε να υπάρχει τουλάχιστον μία κενή θέση ανάμεσά τους. Στρέψτε τα καπάκια προς κατεύθυνση αντίθετη από την κατεύθυνση περιστροφής του ρότορα (π.χ. εάν ο ρότορας περιστρέφεται προς τα δεξιά, στρέψτε τα καπάκια προς τα αριστερά). Είναι σημαντικό να στεγνώσει η μεμβράνη της στήλης περιστροφής επειδή τα υπολείμματα αιθανόλης μπορούν να επηρεάσουν τις περαιτέρω αντιδράσεις. Με τη φυγοκέντρηση των στηλών με ανοικτό καπάκι εξασφαλίζεται ότι δεν θα μεταφερθεί αιθανόλη κατά την έκλουση του RNA. 9. Τοποθετήστε τη στήλη φυγοκέντρησης RNeasy MinElute σε νέο σωληνάριο συλλογής των 1,5 ml (παρέχεται). 10. Προσθέστε 20 µl νερού ελεύθερου RNασών ακριβώς στο κέντρο της μεμβράνης της στήλης φυγοκέντρησης. Κλείστε μαλακά το καπάκι και φυγοκεντρήστε επί 1 λεπτό στη μέγιστη ταχύτητα για να εκλουστεί το RNA. 11. Αφού ολοκληρωθεί το βήμα της έκλουσης, τοποθετήστε τα δείγματα σε πάγο. 12. Μετρήστε τον όγκο των δειγμάτων προς επεξεργασία και ρυθμίστε τον έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση να είναι 200 ng/µl. Βλ. «Ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός του RNA» στη σελίδα 26, εάν χρειάζεστε περισσότερες λεπτομέρειες. 29 ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/2016

30 Αντίστροφη μεταγραφή Απαραίτητα βήματα πριν από την έναρξη Αποψύξτε όλα τα απαιτούμενα συστατικά εκτός από την αντίστροφη μεταγραφάση, η οποία πρέπει να φυλάσσεται στον καταψύκτη όταν δεν χρησιμοποιείται. Τοποθετήστε σε πάγο τα σωληνάρια που περιέχουν τα συστατικά που θα αποψυχθούν για χρήση. Σημείωση: Η διάρκεια του σταδίου απόψυξης δεν θα πρέπει να υπερβεί τα 30 λεπτά, ώστε να αποφευχθεί ο κίνδυνος αποδόμησης του υλικού. Καθαρίστε την επιφάνεια του πάγκου που χρησιμοποιείται αποκλειστικά για την παρασκευή του μείγματος αντίστροφης μεταγραφής (RT) ώστε να αποφευχθεί η μόλυνση από μήτρα ή από νουκλεάσες. Αναμείξτε καλά, αναρροφώντας και εγχέοντας 10 φορές με πιπέτα το περιεχόμενο των σωληναρίων με τα αντιδραστήρια αντίστροφης μεταγραφής, τα δείγματα RNA, τους θετικούς ορούς ελέγχου και τον βαθμονομητή IS-MMR και φυγοκεντρήστε στιγμιαία πριν από τη χρήση. Κατόπιν φυλάξτε τα υλικά πάνω σε πάγο. Ο αρνητικός ορός ελέγχου RT παράγεται κατά το στάδιο αντίστροφης μεταγραφής με χρήση νερού ελεύθερου νουκλεασών, κατάλληλου για PCR. Η απαιτούμενη αρχική ποσότητα είναι 3 µg RNA ανά δείγμα. Το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR περιέχει ποσότητα αντιδραστηρίων επαρκή για την πραγματοποίηση τριών εκτελέσεων ανάλυσης των οκτώ δειγμάτων. Διαδικασία 1. Επωάστε 15 µl του κάθε δείγματος, των θετικών ορών ελέγχου (υψηλής και χαμηλής συγκέντρωσης), νερού (για την παραγωγή του αρνητικού ορού ελέγχου RT) και του βαθμονομητή IS-MMR επί 5 λεπτά στους 65 C. Κατόπιν ψύξτε τα αμέσως σε πάγο επί 5 λεπτά τουλάχιστον. 2. Φυγοκεντρήστε στιγμιαία (περίπου 5 δευτερόλεπτα), ώστε να συγκεντρωθεί το υγρό στον πυθμένα του σωληναρίου. Κατόπιν φυλάξτε τα υλικά πάνω σε πάγο. ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/

31 3. Παρασκευάστε το παρακάτω μείγμα RT ανάλογα με τον αριθμό των δειγμάτων, ορών ελέγχου και βαθμονομητών υπό επεξεργασία. Πίνακας 1. Παρασκευή μείγματος RT Συστατικό Όγκος ανά δείγμα (µl) Μείγμα RT: αντιδράσεις (µl) Τελική συγκέντρωση Μείγμα RT, 3,33 7,5 97,5 1 Αντίστροφη μεταγραφάση, 10 2,5 32,5 1 Τελικός όγκος μείγματος RT (που θα προστεθεί στο βήμα 4) Δείγμα, θετικοί οροί ελέγχου, βαθμονομητής IS-MMR ή νερό (από το βήμα 1) έκαστο Συνολικός όγκος έκαστο Σημείωση: Ο τελικός όγκος ανά αντίδραση πρέπει να είναι 25 µl. 4. Με μια πιπέτα, μεταφέρετε 10 µl μείγματος RT σε καθένα από τα σημασμένα σωληνάρια που περιέχουν δείγμα RNA, θετικό ορό ελέγχου, νερό ή βαθμονομητή (από το βήμα 3). 5. Αναμείξτε καλά, αναρροφώντας και εγχέοντας με πιπέτα το περιεχόμενο των σωληναρίων 10 φορές, και κατόπιν φυγοκεντρήστε στιγμιαία (περίπου 5 δευτερόλεπτα) ώστε να συγκεντρωθεί το υγρό στον πυθμένα του σωληναρίου. Σημείωση: Επανατοποθετήστε όλα τα αντιδραστήρια αντίστροφης μεταγραφής του κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR στον καταψύκτη αφού προετοιμάσετε τις αντιδράσεις, για να αποφύγετε τυχόν αποδόμηση των υλικών. 6. Τοποθετήστε τα σωληνάρια στον θερμοκυκλοποιητή και ρυθμίστε το πρόγραμμα αντίστροφης μεταγραφής (Πίνακας 2). 31 ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/2016

32 Πίνακας 2. Προφίλ θερμοκρασίας Βήμα Αντίστροφη μεταγραφή 1 Αντίστροφη μεταγραφή 2 Αδρανοποίηση Ψύξη Παράμετροι Θερμοκρασία: 25 C Χρόνος: 10 λεπτά Θερμοκρασία: 46 C Χρόνος: 45 λεπτά Θερμοκρασία: 85 C Χρόνος: 5 λεπτά Θερμοκρασία: 4 C Χρόνος: 5 λεπτά 7. Αφού ολοκληρωθεί το πρόγραμμα, φυγοκεντρήστε τα σωληνάρια στιγμιαία (περίπου 5 δευτερόλεπτα) ώστε να συγκεντρωθεί το υγρό στον πυθμένα του σωληναρίου. Αφήστε τα σωληνάρια μέσα σε πάγο ή σε θερμοκρασία 20 C μέχρι να εκτελέσετε το πείραμα qpcr. qpcr στο όργανο Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM με ρότορα 72 σωληναρίων Συνιστούμε την εκτέλεση όλων των μετρήσεων εις διπλούν, όπως αναφέρεται στον Πίνακας 3. Το κιτ επαρκεί για την ανάλυση οκτώ δειγμάτων cdna στο ίδιο πείραμα, εις διπλούν. Μπορούν να πραγματοποιηθούν τρία πειράματα με το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR. ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/

33 Πίνακας 3. Αριθμός αντιδράσεων για το όργανο Rotor-Gene Q με ρότορα 72 σωληναρίων Δείγμα Αντιδράσεις Με το μείγμα qpcr Mix ABL1 (34 αντιδράσεις) 8 δείγματα cdna 8 2 αντιδράσεις 1 θετικός ορός ελέγχου cdna υψηλής συγκέντρωσης 1 θετικός ορός ελέγχου cdna χαμηλής συγκέντρωσης 2 αντιδράσεις 2 αντιδράσεις 1 βαθμονομητής cdna IS-MMR 2 αντιδράσεις Πρότυπα κοινού πλασμιδίου Αρνητικός ορός ελέγχου RT Δείγμα ελέγχου καθαρού νερού Με το μείγμα qpcr Mix Mbcr (34 αντιδράσεις) 4 x 2 αντιδράσεις (SP3, SP4, SP5 και SP6) 2 αντιδράσεις 2 αντιδράσεις 8 δείγματα cdna 8 2 αντιδράσεις 1 θετικός ορός ελέγχου cdna υψηλής συγκέντρωσης 1 θετικός ορός ελέγχου cdna χαμηλής συγκέντρωσης 2 αντιδράσεις 2 αντιδράσεις 1 βαθμονομητής cdna IS-MMR 2 αντιδράσεις Πρότυπα κοινού πλασμιδίου Δείγμα ελέγχου καθαρού νερού 5 x 2 αντιδράσεις (SP1, SP2, SP3, SP5 και SP6) 2 αντιδράσεις Επεξεργασία δειγμάτων σε όργανο Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM με ρότορα 72 σωληναρίων Συνιστούμε την εξέταση τουλάχιστον οκτώ δειγμάτων cdna στο ίδιο πείραμα προκειμένου να αξιοποιηθούν καλύτερα τα πρότυπα και τα μείγματα εκκινητών και ιχνηθετών. Η διάταξη ρότορα στην Εικόνα 3 αποτελεί ένα παράδειγμα πειράματος. 33 ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/2016

34 qpcr μείγμα Mbcr Taq DNA πολυμεράση qpcr μείγμα ABL1 Taq DNA πολυμεράση Ανίχνευση Bcr-ABL1 Mbcr Ανίχνευση ABL1 Θέση #1 Εικόνα 3. Προετοιμασία ρότορα για κάθε πείραμα. SP1 SP6: Πρότυπα BCR-ABL1 Mbcr και ABL1, RTneg: Αρνητικός ορός ελέγχου RT, IS-MMR: βαθμονομητής διεθνούς κλίμακας, HC: Θετικός ορός ελέγχου υψηλής συγκέντρωσης, LC: Θετικός ορός ελέγχου χαμηλής συγκέντρωσης; H2O: Δείγμα ελέγχου καθαρού νερού, S1 S8: Δείγματα cdna. Σημείωση: Τοποθετήστε κενά σωληνάρια σε όλες τις κενές θέσεις. Οι αριθμοί υποδηλώνουν τις θέσεις στο μπλοκ φόρτωσης και υποδεικνύουν την τελική θέση του ρότορα. ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/

35 Απαραίτητα βήματα πριν από την έναρξη Αποψύξτε όλα τα απαιτούμενα συστατικά εκτός από την Taq DNA πολυμεράση, η οποία πρέπει να φυλάσσεται στον καταψύκτη όταν δεν χρησιμοποιείται. Τοποθετήστε σε πάγο τα σωληνάρια που περιέχουν τα συστατικά που θα αποψυχθούν για χρήση. Σημείωση: Η διάρκεια του σταδίου απόψυξης δεν θα πρέπει να υπερβεί τα 30 λεπτά, ώστε να αποφευχθεί ο κίνδυνος αποδόμησης του υλικού. Καθαρίστε την επιφάνεια του πάγκου που χρησιμοποιείται αποκλειστικά για την παρασκευή των μειγμάτων PCR ώστε να αποφευχθεί η μόλυνση από μήτρα ή από νουκλεάσες. Αναμείξτε καλά, αναρροφώντας και εγχέοντας 10 φορές με πιπέτα το περιεχόμενο των σωληναρίων που περιέχουν το μείγμα qpcr Mix ABL1 και το μείγμα qpcr Mix Mbcr και φυγοκεντρήστε στιγμιαία πριν από τη χρήση. Κατόπιν φυλάξτε τα υλικά πάνω σε πάγο. Διαδικασία 1. Παρασκευάστε το κύριο μείγμα PCR ανάλογα με τον αριθμό των δειγμάτων υπό επεξεργασία. Ο Πίνακας 4 περιγράφει τη μέθοδο μεταφοράς με πιπέτα για την παρασκευή ενός μείγματος αντιδραστηρίων, με ποσότητες υπολογισμένες για τελικό όγκο διαλύματος αντίδρασης 25 μl. Παρασκευάζεται ένα προμείγμα, ανάλογα με τον αριθμό των αντιδράσεων, με χρήση του ίδιου μείγματος εκκινητών και ιχνηθετών (είτε μείγμα qpcr Mix ABL1 είτε μείγμα qpcr Mix Mbcr). Συμπεριλαμβάνονται επιπλέον όγκοι για αντιστάθμιση σφάλματος διανομής με πιπέτα. Σημείωση: Μη χρησιμοποιείτε όγκους αντίδρασης (μείγμα αντίδρασης συν δείγμα) μικρότερους από 25 µl. 35 ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/2016

36 Πίνακας 4. Προετοιμασία κύριου μείγματος PCR Συστατικό 1 αντίδραση (µl) Προμείγμα ABL1 ή Mbcr: αντιδράσεις (µl) Τελική συγκέντρωση Μείγμα qpcr (είτε μείγμα qpcr Mix ABL1 είτε μείγμα qpcr Mix Mbcr) 19, Taq DNA πολυμεράση 0, Δείγμα, πρότυπο, ορός ελέγχου ή βαθμονομητής ISMMR (για προσθήκη στο βήμα 3) 5 5 έκαστο Συνολικός όγκος έκαστο 2. Μεταφέρετε 20 µl προμείγματος qpcr σε κάθε σωληνάριο Rotor-Gene Q του 0,1 ml. 3. Προσθέστε 5 µl προϊόντος RT (cdna) που ελήφθη από τις αντίστροφες μεταγραφές (βλ. «Αντίστροφη μεταγραφή», σελ. 30), προτύπου, ορού ελέγχου ή βαθμονομητή IS-MMR, σύμφωνα με τη διάταξη δείγματος που φαίνεται στην Εικόνα 3 (συνολικός όγκος 25 µl). 4. Αναμείξτε μαλακά με επανειλημμένη αναρρόφηση και έγχυση με την πιπέτα. 5. Τοποθετήστε τα σωληνάρια στον προσαρμογέα που παρέχεται με το όργανο. Σημείωση: Οι κενές θέσεις πρέπει να γεμίσουν με κενά σωληνάρια. 6. Τοποθετήστε τον δακτύλιο ασφάλισης πάνω από τα σωληνάρια και πιέστε τον για να κλειδώσει. 7. Τοποθετήστε τον γεμάτο προσαρμογέα μέσα στο όργανο Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM. 8. Προγραμματίστε το όργανο Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM με το πρόγραμμα θερμοκυκλοποίησης που δίνεται στον Πίνακας 5. Σημείωση: Επανατοποθετήστε όλα τα συστατικά του κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR στον καταψύκτη για να αποφύγετε τυχόν αποδόμηση των υλικών. ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/

37 Πίνακας 5. Προφίλ θερμοκρασίας Βήμα Παράμετροι Μέθοδος ανάλυσης Ποσοτικός προσδιορισμός Διατήρηση 1 Θερμοκρασία: 95 C Cycling (Κύκλοι) Χρόνος: 15 λεπτά 50 κύκλοι 94 C, 15 s 60 C, 60 s με μέτρηση φθορισμού FAM στο πράσινο κανάλι. 9. Πατήστε το «Gain Optimisation» (Βελτιστοποίηση απολαβής) στο πλαίσιο διαλόγου «New Run Wizard» (Οδηγός νέας ανάλυσης) για να ανοίξετε το πλαίσιο διαλόγου «Auto-Gain Optimisation Setup» (Ρυθμίσεις βελτιστοποίησης αυτόματης απολαβής). Βεβαιωθείτε ότι το εύρος για το πράσινο κανάλι είναι από «5 Fl» για το «Min Reading» (Ελάχιστη τιμή ανάγνωσης) μέχρι «10 Fl» για το «Max Reading» (Μέγιστη τιμή ανάγνωσης) και ότι το αποδεκτό εύρος του «Gain» (Απολαβή) είναι από -10 έως Βεβαιωθείτε ότι έχει σημειωθεί το πλαίσιο «Perform Optimisation Before 1st Acquisition» (Να γίνει βελτιστοποίηση πριν από την 1η λήψη) και κλείστε το πλαίσιο διαλόγου «Auto-Gain Optimisation Setup». 11. Ξεκινήστε το πρόγραμμα θερμικών κύκλων. 12. Δημιουργήστε υποομάδες ABL1 και Mbcr, συμπληρώνοντας το παράθυρο «Edit samples» (Επεξεργασία δειγμάτων). 13. Αφού ολοκληρωθούν οι θερμικοί κύκλοι, ρυθμίστε τα «Options» (Επιλογές) και «Crop Start Cycles» (Διαγραφή κύκλων έναρξης). Διαγράψτε τα στοιχεία πριν από τον κύκλο 10. Κατόπιν επιλέξτε «Analysis» (Ανάλυση) και «Cycling A. Green from 10» (Κύκλοι Α. Πράσινο από το 10), που θα υποδειχθεί στην αναφορά ως «left threshold = 10.00» (αριστερό όριο = 10,00). 14. Για το ABL1 και για το Mbcr, προχωρήστε ως εξής: Εάν ανοίξει το παράθυρο «Calculate Automatic Threshold» (Υπολογισμός αυτόματου ορίου), πατήστε «Cancel» (Ακύρωση). Ρυθμίστε το όριο στην τιμή 0,03 (στην κάτω δεξιά πλευρά του παραθύρου). 37 ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ Εγχειρίδιο του κιτ RT-PCR 09/2016