Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR

Transcript

1 Αύγουστος 2014 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR Έκδοση 1 24 Ποιοτική in vitro διαγνωστική εξέταση Προορίζεται για χρήση σε συνδυασμό με τα όργανα Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM ή Rotor-Gene Q 5plex HRM QIAGEN Manchester Ltd, Skelton House, Lloyd Street North, Manchester, M15 6SH, UK R EL Sample & Assay Technologies

2 Τεχνολογίες προετοιμασίας δειγμάτων και ανάλυσης της QIAGEN Η QIAGEN είναι ο κορυφαίος προμηθευτής καινοτόμων τεχνολογιών προετοιμασίας δειγμάτων και ανάλυσης για την απομόνωση και την ανίχνευση του περιεχομένου βιολογικών δειγμάτων οποιουδήποτε τύπου. Τα προηγμένα και υψηλής ποιότητας προϊόντα και υπηρεσίες μας εξασφαλίζουν την επιτυχία, από την προετοιμασία του δείγματος μέχρι την εξαγωγή των αποτελεσμάτων. Η QIAGEN θέτει πρότυπα: στον καθαρισμό DNA, RNA και πρωτεϊνών στις αναλύσεις νουκλεϊκών οξέων και πρωτεϊνών στην έρευνα microrna και RNAi στην αυτοματοποίηση τεχνολογιών προετοιμασίας δειγμάτων και ανάλυσης Αποστολή μας είναι η διασφάλιση της επιτυχίας σας και της επίτευξης καινοτόμων ανακαλύψεων. Για περισσότερες πληροφορίες επισκεφθείτε την ιστοσελίδα

3 Περιεχόμενα Προβλεπόμενη χρήση 5 Σύνοψη και επεξήγηση 5 Αρχή της διαδικασίας 7 Αντιδραστήρια 9 Υλικά που παρέχονται 13 Περιεχόμενα του κιτ 13 Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται 14 Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις 15 Πληροφορίες ασφαλείας 15 Γενικές προφυλάξεις 15 Αποθήκευση και χειρισμός αντιδραστηρίων 16 Συλλογή δειγμάτων, προετοιμασία για ανάλυση και αποθήκευση 17 Διαδικασία 20 Εκχύλιση DNA (δείγματα CRC) 20 Εκχύλιση DNA (δείγματα NSCLC) 21 Πρωτόκολλο: Αξιολόγηση δειγμάτων DNA 22 Πρωτόκολλο: Ανίχνευση μεταλλάξεων KRAS 35 Ερμηνεία αποτελεσμάτων 48 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων 49 Ενδείξεις που δημιουργούνται από το λογισμικό therascreen KRAS Assay Package 50 Ποιοτικός έλεγχος 58 Περιορισμοί 58 Αναμενόμενα αποτελέσματα 59 Χαρακτηριστικά επιδόσεων (CRC) 59 Αναλυτικές επιδόσεις 59 Όριο ανίχνευσης (LOD) 64 Εισαγόμενο DNA και γραμμικότητα 69 Παρεμβαλλόμενες ουσίες 74 Διασταυρούμενη μόλυνση 75 Αποκλειστικότητα/διασταυρούμενη αντιδραστικότητα 75 Επαναληψιμότητα και αναπαραγωγιμότητα 78 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014 3

4 Διαφοροποίηση χειρισμού δειγμάτων 79 Εναλλαξιμότητα παρτίδων 81 Χαρακτηριστικά επιδόσεων (NSCLC) 81 Αναλυτικές επιδόσεις 81 Όριο ανίχνευσης (LOD) 84 Εισαγόμενο DNA και γραμμικότητα 86 Παρεμβαλλόμενες ουσίες 90 Αποκλειστικότητα/διασταυρούμενη αντιδραστικότητα 92 Επαναληψιμότητα και αναπαραγωγιμότητα 94 Διαφοροποίηση χειρισμού δειγμάτων 96 Ισοδυναμία μεθόδων δειγματοληψίας 99 Εναλλαξιμότητα παρτίδων 101 Βιβλιογραφία 102 Σύμβολα 105 Πληροφορίες επικοινωνίας 106 Παράρτημα: Εγκατάσταση του λογισμικού therascreen KRAS Assay Package 107 Πληροφορίες παραγγελίας Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

5 Προβλεπόμενη χρήση Το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR είναι μια μέθοδος ποιοτικής ανάλυσης PCR πραγματικού χρόνου για την ανίχνευση επτά σωματικών μεταλλάξεων στο ανθρώπινο ογκογονίδιο KRAS με χρήση του οργάνου Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM*. Το κιτ KRAS προορίζεται για χρήση με DNA που έχει εκχυλιστεί από δείγματα μονιμοποιημένα σε φορμόλη και εγκλεισμένα σε παραφίνη (formalin fixed paraffin embedded, FFPE) από ιστό πρωτοπαθούς όγκου ορθοκολικού καρκίνου (Colorectal Cancer, CRC) ή μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC). Οι σωματικές μεταλλάξεις του γονιδίου KRAS είναι πιθανοί προβλεπτικοί βιολογικοί δείκτες της αντοχής σε θεραπείες που στρέφονται κατά του ανθρώπινου υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (epidermal growth factor receptor, EGFR), όπως η πανιτουμουμάμπη και η κετουξιμάμπη, για τη θεραπεία του CRC. Οι σωματικές μεταλλάξεις του γονιδίου KRAS ενδεχομένως ενδείκνυνται και για χρήση ως πιθανοί προβλεπτικοί βιολογικοί δείκτες κατά τη λήψη θεραπευτικών αποφάσεων για ορισμένες θεραπευτικές αγωγές κατά του NSCLC. Η κατάσταση μετάλλαξης του ασθενή θα πρέπει να αξιολογείται από έναν κλινικό ιατρό, σε συνδυασμό με άλλους παράγοντες νόσου, για τη λήψη αποφάσεων σχετικά με τη θεραπεία. Οι αποφάσεις για καρκινοπαθείς ασθενείς δεν θα πρέπει να βασίζονται αποκλειστικά στην κατάσταση μετάλλαξης του KRAS. Το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR δεν προορίζεται για τη διάγνωση του CRC, του NSCLC ή οποιασδήποτε άλλης νόσου. Σύνοψη και επεξήγηση Οι μεταλλάξεις στο ογκογονίδιο KRAS απαντώνται συχνά σε καρκίνους στον άνθρωπο (14). Η παρουσία αυτών των μεταλλάξεων συσχετίζεται με την έλλειψη ανταπόκρισης σε ορισμένες αντικαρκινικές θεραπείες με αναστολείς του EGFR, σε ασθενείς με μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο και μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (519, 2326). Ο συνδυασμός των τεχνολογιών Scorpions και ARMS (Allele Refractory Mutation System - Σύστημα Ανίχνευσης Μεταλλάξεων Ανθεκτικών στην Ενίσχυση) (20, 21), επιτρέπει στο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR να ανιχνεύει επτά μεταλλάξεις στα κωδικόνια 12 και 13 του ογκογονιδίου KRAS, έναντι ενός υποβάθρου γενωμικού DNA άγριου τύπου (wild-type) (βλ. Πίνακα 1). Βάσει των δεδομένων που περιλαμβάνονται στη βάση δεδομένων COSMIC (2012 v59), οι επτά μεταλλάξεις που ανιχνεύονται με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR αποτελούν >97% του συνόλου των μεταλλάξεων KRAS που έχουν περιγραφεί * Το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί στο όργανο Rotor-Gene Q 5plex HRM, εφόσον υπάρχει το όργανο. Αυτό το όργανο είναι γνωστό και ως Rotor-Gene Q MDx σε ορισμένες χώρες. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014 5

6 σε ασθενείς με CRC και >92% του συνόλου των μεταλλάξεων που έχουν περιγραφεί σε ασθενείς με NSCLC (22). Πίνακας 1. Κατάλογος μεταλλάξεων και κωδικοί ταυτοποίησης COSMIC Μετάλλαξη Αλλαγή βάσης COSMIC ID* GLY12ALA (G12A) GGT>GCT 522 GLY12ASP (G12D) GGT>GAT 521 GLY12ARG (G12R) GGT>CGT 518 GLY12CYS (G12C) GGT>TGT 516 GLY12SER (G12S) GGT>AGT 517 GLY12VAL (G12V) GGT>GTT 520 GLY13ASP (G13D) GGC>GAC 532 * Τα αναγνωριστικά COSMIC ID προέρχονται από τον κατάλογο σωματικών μεταλλάξεων στον καρκίνο Catalog of Somatic Mutations in Cancer (22) ( Η εξέταση υψηλής ειδικότητας και ευαισθησίας επιτρέπει την ανίχνευση χαμηλού ποσοστού μεταλλαγμένου DNA έναντι υποβάθρου DNA άγριου τύπου. Υπό την προϋπόθεση ότι υπάρχουν επαρκή αντίγραφα DNA, είναι δυνατή η ανίχνευση μετάλλαξης 0,8% σε υπόβαθρο γενωμικού DNA άγριου τύπου (για το όριο πληροφοριών ανίχνευσης για κάθε μετάλλαξη, βλ. "Χαρακτηριστικά επιδόσεων (CRC)", σελίδα 59). Το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR χρησιμοποιείται σε μια διαδικασία αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Το πλεονέκτημα αυτού του κιτ είναι η υψηλή ειδικότητά του ως προς το στόχο καθώς και η ταχύτητα και η αποτελεσματικότητά του χωρίς περιθώρια υποκειμενικότητας κατά τον προσδιορισμό των αποτελεσμάτων. 6 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

7 Αρχή της διαδικασίας Το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR παρέχει 8 χωριστές αντιδράσεις ενίσχυσης PCR: 7 ειδικές για μετάλλαξη αντιδράσεις στα κωδικόνια 12 και 13 του εξονίου 2 του ογκογονιδίου KRAS και έναν ορό ελέγχου άγριου τύπου στο εξόνιο 4. Τα κυριότερα συστατικά του κιτ περιγράφονται παρακάτω. Μίγματα αντίδρασης μετάλλαξης Σε κάθε μίγμα αντίδρασης χρησιμοποιείται ειδικός για τη μετάλλαξη εκκινητής ARMS για την επιλεκτική ενίσχυση του μεταλλαγμένου DNA και στη συνέχεια ένας εκκινητής Scorpions για την ανίχνευση του προϊόντος ενίσχυσης. ARMS Η ειδική για αλληλόμορφα ενίσχυση επιτυγχάνεται με την τεχνολογία ARMS, κατά την οποία αξιοποιείται η ικανότητα της Taq DNA πολυμεράσης να διαχωρίζει τη σωστή και την εσφαλμένη αντιστοίχιση βάσης στο 3' άκρο του εκκινητή PCR. Όταν υπάρχει πλήρης αντιστοίχιση του εκκινητή, η απόδοση της ενίσχυσης είναι πλήρης. Σε περίπτωση εσφαλμένης αντιστοίχισης της 3' βάσης, είναι δυνατή μόνο η ενίσχυση υποβάθρου χαμηλού επιπέδου. Επομένως, μια μεταλλαγμένη αλληλουχία υποβάλλεται σε επιλεκτική ενίσχυση ακόμη και σε δείγματα στα οποία το μεγαλύτερο μέρος του DNA δεν παρουσιάζει μετάλλαξη. Scorpions Η ανίχνευση ενίσχυσης πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας την τεχνολογία Scorpions. Η τεχνολογία Scorpions συνίσταται σε διλειτουργικά μόρια που περιέχουν έναν εκκινητή PCR ομοιοπολικά συνδεδεμένο με έναν ιχνηθέτη. Ο ιχνηθέτης περιλαμβάνει τη φθορισμοφόρο καρβοξυφλουορεσκεΐνη (FAM ) και έναν παρεμποδιστή. Ο τελευταίος παρεμποδίζει το φθορισμό του φθορισμοφόρου. Όταν ο ιχνηθέτης δεσμεύεται στον κλώνο (amplicon) ARMS κατά τη διάρκεια της αντίδρασης PCR, το φθορισμοφόρο και ο παρεμποδιστής διαχωρίζονται, προκαλώντας ανιχνεύσιμη αύξηση του φθορισμού. Αντίδραση ορού ελέγχου Στο μίγμα αντίδρασης ορού ελέγχου (CTRL) χρησιμοποιείται ένας εκκινητής Scorpions και ένας μη επισημασμένος εκκινητής για την ενίσχυση μιας μικρής αλληλουχίας του εξονίου 4 του γονιδίου KRAS. Η αντίδραση ορού ελέγχου χρησιμοποιείται για να προσδιοριστεί εάν υπάρχει κατάλληλο επίπεδο ενισχύσιμου DNA στο δείγμα και αποτελεί παράγοντα που χρησιμοποιείται στους αναλυτικούς υπολογισμούς που συμβάλλουν στον προσδιορισμό της κατάστασης της μετάλλαξης. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014 7

8 Εσωτερική μήτρα ελέγχου Καθένα από τα οκτώ μίγματα αντίδρασης περιλαμβάνει μια εσωτερική μήτρα ελέγχου που έχει σχεδιαστεί για την ανίχνευση μη επιτυχούς αντίδρασης (π.χ. λόγω παρουσίας αναστολέων). Στην εσωτερική μήτρα ελέγχου χρησιμοποιείται μια ολιγονουκλεοτιδική αλληλουχία-στόχος που δεν σχετίζεται με το ογκογονίδιο KRAS, ένας μη επισημασμένος εκκινητής και ένας εκκινητής Scorpions επισημασμένος με εξαχλωροφλουορεσκεΐνη (HEX ) για τη διάκρισή του από τους επισημασμένους με FAM εκκινητές Scorpions στις αντιδράσεις ορού ελέγχου και μετάλλαξης. Θετικός ορός ελέγχου Το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR περιλαμβάνει επίσης τον θετικό ορό ελέγχου (PC) KRAS. Ο θετικός ορός ελέγχου είναι ένα μίγμα συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων που αντιπροσωπεύουν καθεμία από τις μεταλλάξεις που ανιχνεύονται με το κιτ. Με την ανίχνευση του θετικού ορού ελέγχου επιβεβαιώνεται η σωστή λειτουργία των μιγμάτων αντίδρασης στο κιτ. Αρνητικός ορός ελέγχου Το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR περιέχει νερό χωρίς νουκλεάση για ορό ελέγχου χωρίς μήτρα (NTC) που χρησιμοποιείται στην αντίδραση "ορού ελέγχου χωρίς μήτρα" (NTC). Το NTC χρησιμοποιείται ως αρνητικός ορός ελέγχου και αξιολογεί την πιθανή μόλυνση κατά τη διάρκεια της ρύθμισης της ανάλυσης. Taq DNA πολυμεράση Η Taq DNA πολυμεράση είναι το ένζυμο που χρησιμοποιείται με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Πλατφόρμα και λογισμικό Το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR έχει σχεδιαστεί ειδικά για χρήση με το όργανο Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM. Το όργανο Rotor-Gene Q είναι προγραμματισμένο για διαφορετικές παραμέτρους κύκλου, ή "εκτελέσεις ανάλυσης", με το λογισμικό therascreen KRAS Assay Package. Το therascreen KRAS Assay Package περιλαμβάνει δύο πρότυπα: το "therascreen KRAS QC Locked Template" (Κλειδωμένο πρότυπο ποιοτικού ελέγχου therascreen KRAS) (για την αξιολόγηση του δείγματος DNA) και το "therascreen KRAS Locked Template" (Κλειδωμένο πρότυπο therascreen KRAS) (για την ανίχνευση μεταλλάξεων KRAS). Τα πρότυπα αυτά περιλαμβάνουν τις παραμέτρους ανάλυσης PCR και υπολογίζουν τα αποτελέσματα. 8 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

9 Οι ίδιες παράμετροι ανάλυσης χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση δείγματος DNA με το μίγμα αντίδρασης ορού ελέγχου και για την ανίχνευση μεταλλάξεων KRAS με χρήση των μιγμάτων αντίδρασης μετάλλαξης: 1. Διατηρήστε στους 95 C για 15 λεπτά για να ενεργοποιηθεί η Taq DNA πολυμεράση. 2. Εκτελέστε τη διαδικασία PCR για 40 κύκλους στους 95 C για 30 δευτερόλεπτα για μετουσίωση και στους 60 C για 1 λεπτό για υβριδισμό και επέκταση. Ο κύκλος PCR, στον οποίο ο φθορισμός από μια συγκεκριμένη αντίδραση συμπίπτει με την προκαθορισμένη τιμή κατωφλίου που παρέχεται από το therascreen KRAS Assay Package, ορίζεται ως η τιμή C T. Με τη χρήση της αντίδρασης ορού ελέγχου για την αξιολόγηση του δείγματος DNA, βάσει των τιμών C T που λαμβάνονται, είναι δυνατό να προσδιοριστεί εάν τα δείγματα περιέχουν επίπεδα DNA κατάλληλα για ανάλυση και σε ποια δείγματα απαιτείται αραίωση πριν από την ανάλυση. Με την αξιολόγηση του δείγματος χρησιμοποιώντας διαφορετικά μίγματα αντίδρασης μετάλλαξης για τον προσδιορισμό των αντίστοιχων τιμών C T, το λογισμικό therascreen KRAS Assay Package μπορεί να εκτελέσει έναν υπολογισμό για τον προσδιορισμό της τιμής C T του δείγματος με χρήση της εξίσωσης: C T = [τιμή C T ανάλυσης μετάλλαξης] [τιμή C T ανάλυσης ορού ελέγχου] Βάσει προκαθορισμένων αναλυτικών τιμών C T και C T, το λογισμικό Rotor- Gene Q προσδιορίζει ποιοτικά την κατάσταση μετάλλαξης των δειγμάτων DNA και αναφέρει τον τύπο μετάλλαξης που εμφανίζεται στο εκάστοτε δείγμα.* Αντιδραστήρια Τα μίγματα αντίδρασης παρέχονται εις διπλούν και διαθέτουν αντιδραστήρια επισημασμένα με FAM για την ανίχνευση στόχων και μια εσωτερική μήτρα ελέγχου επισημασμένη με HEX. Τα μίγματα αντίδρασης και τα αντιδραστήρια θετικού ορού ελέγχου περιέχουν ρυθμιστικό διάλυμα Tris EDTA και ο θετικός ορός ελέγχου περιέχει το φορέα Poly A RNA. * Σπάνια μια νεοπλασία μπορεί να εμφανίζει περισσότερες από μία μεταλλάξεις. Σε αυτές τις περιπτώσεις, ταυτοποιείται η μετάλλαξη που δίνει τη χαμηλότερη τιμή C T. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014 9

10 Πίνακας 2. Αντιδραστήρια που παρέχονται στο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR Αντιδραστήρια Συστατικά Control Reaction Mix (Μίγμα αντίδρασης ορού ελέγχου) 12ALA Reaction Mix (Μίγμα αντίδρασης 12ALA) 12ASP Reaction Mix (Μίγμα αντίδρασης 12ASP) 12ARG Reaction Mix (Μίγμα αντίδρασης 12ARG) Μη επισημασμένος εκκινητής ορού ελέγχου, Εκκινητής Scorpions ορού ελέγχου, Μη επισημασμένος εκκινητής εσωτερικής μήτρας ελέγχου, Εκκινητής Scorpions εσωτερικής μήτρας ελέγχου, Εσωτερική μήτρα ελέγχου, Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια, Χλωριούχο μαγνήσιο, Ρυθμιστικό διάλυμα Tris EDTA, Ρυθμιστικό διάλυμα PCR Εκκινητής 12ALA ARMS, Εκκινητής Scorpions, Μη επισημασμένος εκκινητής εσωτερικής μήτρας ελέγχου, Εκκινητής Scorpions εσωτερικής μήτρας ελέγχου, Εσωτερική μήτρα ελέγχου, Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια, Χλωριούχο μαγνήσιο, Ρυθμιστικό διάλυμα Tris EDTA, Ρυθμιστικό διάλυμα PCR Εκκινητής 12ASP ARMS, Εκκινητής Scorpions, Μη επισημασμένος εκκινητής εσωτερικής μήτρας ελέγχου, Εκκινητής Scorpions εσωτερικής μήτρας ελέγχου, Εσωτερική μήτρα ελέγχου, Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια, Χλωριούχο μαγνήσιο, Ρυθμιστικό διάλυμα Tris EDTA, Ρυθμιστικό διάλυμα PCR Εκκινητής 12ARG ARMS, Εκκινητής Scorpions, Μη επισημασμένος εκκινητής εσωτερικής μήτρας ελέγχου, Εκκινητής Scorpions εσωτερικής μήτρας ελέγχου, Εσωτερική μήτρα ελέγχου, Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια, Χλωριούχο μαγνήσιο, Ρυθμιστικό διάλυμα Tris EDTA, Ρυθμιστικό διάλυμα PCR 2 σωληνάρια x 600 µl 1 σωληνάριο x 600 µl 1 σωληνάριο x 600 µl 1 σωληνάριο x 600 µl Ο πίνακας συνεχίζεται στην επόμενη σελίδα 10 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

11 Πίνακας 2. Συνέχεια Αντιδραστήρια Συστατικά 12CYS Reaction Mix (Μίγμα αντίδρασης 12CYS) 12SER Reaction Mix (Μίγμα αντίδρασης 12SER) 12VAL Reaction Mix (Μίγμα αντίδρασης 12VAL) 13ASP Reaction Mix (Μίγμα αντίδρασης 13ASP) KRAS Positive Control (Θετικός ορός ελέγχου KRAS) Εκκινητής 12CYS ARMS, Εκκινητής Scorpions, Μη επισημασμένος εκκινητής εσωτερικής μήτρας ελέγχου, Εκκινητής Scorpions εσωτερικής μήτρας ελέγχου, Εσωτερική μήτρα ελέγχου, Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια, Χλωριούχο μαγνήσιο, Ρυθμιστικό διάλυμα Tris EDTA, Ρυθμιστικό διάλυμα PCR Εκκινητής 12SER ARMS, Εκκινητής Scorpions, Μη επισημασμένος εκκινητής εσωτερικής μήτρας ελέγχου, Εκκινητής Scorpions εσωτερικής μήτρας ελέγχου, Εσωτερική μήτρα ελέγχου, Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια, Χλωριούχο μαγνήσιο, Ρυθμιστικό διάλυμα Tris EDTA, Ρυθμιστικό διάλυμα PCR Εκκινητής 12VAL ARMS, Εκκινητής Scorpions, Μη επισημασμένος εκκινητής εσωτερικής μήτρας ελέγχου, Εκκινητής Scorpions εσωτερικής μήτρας ελέγχου, Εσωτερική μήτρα ελέγχου, Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια, Χλωριούχο μαγνήσιο, Ρυθμιστικό διάλυμα Tris EDTA, Ρυθμιστικό διάλυμα PCR Εκκινητής 13ASP ARMS, Εκκινητής Scorpions, Μη επισημασμένος εκκινητής εσωτερικής μήτρας ελέγχου, Εκκινητής Scorpions εσωτερικής μήτρας ελέγχου, Εσωτερική μήτρα ελέγχου, Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια, Χλωριούχο μαγνήσιο, Ρυθμιστικό διάλυμα Tris EDTA, Ρυθμιστικό διάλυμα PCR Μήτρα ορού ελέγχου, Μήτρα 12ALA, Μήτρα 12ASP, Μήτρα 12ARG, Μήτρα 12CYS, Μήτρα 12SER, Μήτρα 12VAL, Μήτρα 13ASP, Poly A RNA, Ρυθμιστικό διάλυμα Tris EDTA 1 σωληνάριο x 600 µl 1 σωληνάριο x 600 µl 1 σωληνάριο x 600 µl 1 σωληνάριο x 600 µl 1 σωληνάριο x 250 µl Ο πίνακας συνεχίζεται στην επόμενη σελίδα Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

12 Πίνακας 2. Συνέχεια Αντιδραστήρια Συστατικά Taq DNA Polymerase (Taq DNA πολυμεράση) Water for NTC (Νερό για ορό ελέγχου χωρίς μήτρα (NTC)) Water for Sample Dilution (Νερό για Αραίωση δειγμάτων) Taq πολυμεράση: 50% γλυκερόλη/νερό Νερό χωρίς νουκλεάση Νερό χωρίς νουκλεάση 1 σωληνάριο x 70 µl 1 σωληνάριο x 1,9 ml 1 σωληνάριο x 1,9 ml Πλατφόρμες Το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR έχει σχεδιαστεί ειδικά για χρήση με το όργανο Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM, στο οποίο έχει εγκατασταθεί η έκδοση του λογισμικού Rotor-Gene Q (υποέκδοση 9), και με την έκδοση του πακέτου λογισμικού therascreen KRAS Assay Package, το οποίο διατίθεται χωριστά σε δίσκο CD (αρ. κατ ). Για πληροφορίες σχετικά με το όργανο, ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήστη του οργάνου. Ανατρέξτε στο "Παράρτημα: Εγκατάσταση του λογισμικού therascreen KRAS Assay Package", σελίδα 107, για οδηγίες σχετικά με την εγκατάσταση του λογισμικού therascreen KRAS Assay Package. Τα όργανα Rotor-Gene Q πρέπει να συντηρούνται σύμφωνα με τις απαιτήσεις που περιγράφονται στο εγχειρίδιο χρήστη του οργάνου. 12 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

13 Υλικά που παρέχονται Περιεχόμενα του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR Kit (24) Αρ. καταλόγου Αριθμός παρασκευών 24 Χρώμα Κόκκινο Πορφυρό Πορτοκαλί Ροζ Πράσινο Κίτρινο Γκρι Μπλε Μπεζ Πράσινο της μέντας Λευκό Λευκό Αναγνωριστικό Control Reaction Mix (Μίγμα αντίδρασης ορού ελέγχου) 12ALA Reaction Mix (Μίγμα αντίδρασης 12ALA) 12ASP Reaction Mix (Μίγμα αντίδρασης 12ASP) 12ARG Reaction Mix (Μίγμα αντίδρασης 12ARG) 12CYS Reaction Mix (Μίγμα αντίδρασης 12CYS) 12SER Reaction Mix (Μίγμα αντίδρασης 12SER) 12VAL Reaction Mix (Μίγμα αντίδρασης 12VAL) 13ASP Reaction Mix (Μίγμα αντίδρασης 13ASP) KRAS Positive Control (Θετικός ορός ελέγχου KRAS) Taq DNA Polymerase (Taq DNA πολυμεράση) Water for NTC (Νερό για ορό ελέγχου χωρίς μήτρα (NTC)) Water for Sample Dilution (Νερό για αραίωση δειγμάτων) therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbook (Εγχειρίδιο στα αγγλικά) Ταυτοποίηση σωληναρίου Όγκος 1 CTRL 2 x 600 µl 2 12ALA 600 µl 3 12ASP 600 µl 4 12ARG 600 µl 5 12CYS 600 µl 6 12SER 600 µl 7 12VAL 600 µl 8 13ASP 600 µl 9 PC 250 µl Taq 70 µl NTC Dil. 1,9 ml 1,9 ml 1 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

14 Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Κατά την εργασία με χημικά, φοράτε πάντα κατάλληλη προστατευτική ποδιά εργαστηρίου, γάντια μίας χρήσης και προστατευτικά γυαλιά. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στα σχετικά δελτία δεδομένων ασφαλείας (SDS), τα οποία διατίθενται από τον προμηθευτή του προϊόντος. 0.1 ml Strip Tubes and Caps (Σειρές σωληναρίων και πώματα, 0,1 ml), για χρήση σε ρότορα 72 βυθισμάτων (αρ. κατ ή ) Αποστειρωμένα σωληνάρια μικροφυγόκεντρου για την προετοιμασία κύριων μιγμάτων Αποστειρωμένα ρύγχη πιπέτας με φραγή αερολυμάτων Ανεξίτηλος μαρκαδόρος Όργανο Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM με κανάλια φθορισμού για πράσινο και κίτρινο (ανίχνευση FAM και HEX αντίστοιχα) Λογισμικό Rotor-Gene Q, έκδοση Σημείωση: Το λογισμικό therascreen KRAS Assay Package λειτουργεί μόνο με λογισμικό έκδοσης (build 9). CD του λογισμικού therascreen KRAS Assay Package, έκδοση (αρ. κατ ) Loading Block 72 x 0.1 ml Tubes (Μπλοκ φόρτωσης για 72 x 0,1 ml σωληνάρια), μονάδα αλουμινίου για χειροκίνητη προετοιμασία αντίδρασης (αρ. κατ ) Ειδικές πιπέτες* (ρυθμιζόμενες) για προετοιμασία δειγμάτων Ειδικές πιπέτες* (ρυθμιζόμενες) για την προετοιμασία του κύριου μίγματος PCR Ειδικές πιπέτες* (ρυθμιζόμενες) για τη διοχέτευση της μήτρας DNA Συσκευή θέρμανσης και ανακίνησης (thermomixer), θερμαινόμενος επωαστήρας τροχιακής κίνησης, θερμαντικό μπλοκ ή λουτρό νερού με δυνατότητα επώασης στους 56 C και στους 90 C* Επιτραπέζια φυγόκεντρος* με ρότορα για σωληνάρια 1,5 ml Επιτραπέζιος αναδευτήρας* QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (αρ. κατ , βλ. ενότητα "Εκχύλιση DNA", στη σελίδα 20) Ξυλόλιο Αιθανόλη (96100%) * Πριν από τη χρήση, βεβαιωθείτε ότι τα όργανα έχουν ελεγχθεί και βαθμονομηθεί σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Μη χρησιμοποιείτε μετουσιωμένη αλκοόλη που περιέχει άλλες ουσίες, όπως μεθανόλη ή μεθυλαιθυλοκετόνη. 14 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

15 Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις Για in vitro διαγνωστική χρήση Για επαγγελματική χρήση Πληροφορίες ασφαλείας Κατά την εργασία με χημικά, φοράτε πάντα κατάλληλη προστατευτική ποδιά εργαστηρίου, γάντια μίας χρήσης και προστατευτικά γυαλιά. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στα σχετικά δελτία δεδομένων ασφάλειας (SDS). Διατίθενται στο Διαδίκτυο σε εύχρηστη και συμπιεσμένη μορφή PDF, στην ιστοσελίδα όπου μπορείτε να βρείτε, να εμφανίσετε και να εκτυπώσετε τα SDS για κάθε κιτ της QIAGEN καθώς και για τα περιεχόμενά του. Γενικές προφυλάξεις Η εξέταση προορίζεται για χρήση με μονιμοποιημένα σε φορμόλη και εγκλεισμένα σε παραφίνη δείγματα ιστού. Όλες οι χημικές ουσίες και τα βιολογικά υλικά είναι εν δυνάμει επικίνδυνα. Τα δείγματα είναι εν δυνάμει μολυσματικά και πρέπει να αντιμετωπίζονται ως βιολογικά επικίνδυνα υλικά. Τα απόβλητα των δειγμάτων και των αναλύσεων πρέπει να απορρίπτονται σύμφωνα με τις τοπικές διαδικασίες ασφαλείας. Τα αντιδραστήρια για το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR έχουν αραιωθεί σε βέλτιστο βαθμό. Μην εκτελείτε περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων, καθώς ενδέχεται να προκληθεί υποβάθμιση των επιδόσεων. Μη χρησιμοποιείτε όγκους αντίδρασης (μίγμα αντίδρασης συν δείγμα) μικρότερους από 25 µl. Όλα τα αντιδραστήρια του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR έχουν παρασκευαστεί ειδικά για χρήση με τις εξετάσεις που παρέχονται στο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Όλα τα αντιδραστήρια που παρέχονται στο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR προορίζονται για χρήση αποκλειστικά με τα άλλα αντιδραστήρια που παρέχονται στο ίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Μην αντικαθιστάτε τα αντιδραστήρια στο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR με αντιδραστήρια άλλων κιτ therascreen KRAS RGQ PCR, καθώς ενδέχεται να επηρεαστούν οι επιδόσεις. Χρησιμοποιείτε μόνο την Taq DNA πολυμεράση (Taq) που παρέχεται με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Μην την αντικαθιστάτε με Taq DNA πολυμεράση άλλων κιτ ίδιου ή διαφορετικού τύπου ή με Taq DNA πολυμεράση άλλου προμηθευτή. Για επιπλέον προειδοποιήσεις, προφυλάξεις και διαδικασίες, ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήστη του οργάνου Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

16 Μη χρησιμοποιείτε το περιεχόμενο της συσκευασίας αν έχει παρέλθει η ημερομηνία λήξης ή δεν έχουν ληφθεί τα σωστά μέτρα αποθήκευσης. Σημείωση: Απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή ώστε να αποφευχθεί η μόλυνση των αντιδραστηρίων του μίγματος αντίδρασης και του ορού ελέγχου με συνθετικά υλικά που περιέχονται στο αντιδραστήριο θετικού ορού ελέγχου. Σημείωση: Χρησιμοποιείτε μεμονωμένες, ειδικές πιπέτες για την προετοιμασία μιγμάτων αντίδρασης και την προσθήκη αντιδραστηρίων θετικού ορού ελέγχου. Σημείωση: Η προετοιμασία και διοχέτευση των μιγμάτων αντίδρασης πρέπει να πραγματοποιείται σε ξεχωριστό χώρο από εκείνον που χρησιμοποιείται για την προσθήκη του θετικού ορού ελέγχου. Σημείωση: Μην ανοίγετε το όργανο Rotor-Gene Q πριν ολοκληρωθεί η εκτέλεση ανάλυσης. Σημείωση: Μην ανοίγετε τα σωληνάρια Rotor-Gene Q αφού ολοκληρωθεί η εκτέλεση ανάλυσης. Σημείωση: Απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή, ώστε να διασφαλιστεί η σωστή εξέταση των δειγμάτων με έμφαση στην αποφυγή εσφαλμένης εισαγωγής δείγματος και τυχόν σφαλμάτων φόρτωσης και διοχέτευσης με πιπέτα. Αποθήκευση και χειρισμός αντιδραστηρίων Το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR αποστέλλεται σε ξηρό πάγο. Εάν οποιοδήποτε συστατικό του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR δεν είναι κατεψυγμένο κατά την παραλαβή, η εξωτερική συσκευασία έχει ανοίξει κατά τη μεταφορά ή στο κιβώτιο αποστολής δεν περιλαμβάνονται το δελτίο συσκευασίας, το εγχειρίδιο ή τα αντιδραστήρια, επικοινωνήστε με κάποιο από τα τμήματα τεχνικής υποστήριξης της QIAGEN ή με τους τοπικούς αντιπροσώπους (ανατρέξτε στο οπισθόφυλλο ή επισκεφτείτε την ιστοσελίδα Το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR θα πρέπει να αποθηκεύεται αμέσως μετά την παραλαβή στους 15 έως 25 C σε καταψύκτη σταθερής θερμοκρασίας, σε σκοτεινό χώρο. Το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR παραμένει σταθερό μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης, εφόσον αποθηκεύεται υπό τις καθορισμένες συνθήκες αποθήκευσης. Μετά το άνοιγμα, τα αντιδραστήρια μπορούν να αποθηκευτούν στην αρχική τους συσκευασία σε θερμοκρασία 15 έως 25 C μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στη συσκευασία. Η επανειλημμένη απόψυξη και κατάψυξη θα πρέπει να αποφεύγεται. Μην υπερβαίνετε το μέγιστο όριο 6 κύκλων κατάψυξης-απόψυξης. Η απόψυξη των αντιδραστηρίων πρέπει να πραγματοποιείται σε θερμοκρασία δωματίου για τουλάχιστον 1 ώρα και για έως και 4,5 ώρες. Όταν τα αντιδραστήρια είναι έτοιμα για χρήση, μπορείτε να προετοιμάσετε τις αντιδράσεις PCR. Μπορείτε να φορτώσετε αμέσως στο όργανο Rotor-Gene Q 16 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

17 τα σωληνάρια Rotor-Gene Q που περιέχουν τα κύρια μίγματα και το δείγμα DNA. Δεν πρέπει να σημειωθεί υπέρβαση του συνολικού χρόνου αποθήκευσης μετά την προετοιμασία των αντιδράσεων PCR και πριν από την εκτέλεση ανάλυσης: 7 ώρες εάν έχουν αποθηκευτεί σε θερμοκρασία δωματίου Σημείωση: Ο χρόνος αυτός περιλαμβάνει την προετοιμασία PCR και την αποθήκευση. 18 ώρες εάν έχουν αποθηκευτεί σε ψυγείο (28 C) Σημείωση: Ο χρόνος αυτός περιλαμβάνει την προετοιμασία PCR και την αποθήκευση. Σημείωση: Τα Scorpions (όπως όλα τα επισημασμένα με φθορισμό μόρια) στα αντιδραστήρια μίγματος αντίδρασης είναι φωτοευαίσθητα. Απαιτείται η προστασία των αντιδραστηρίων του μίγματος αντίδρασης και του ορού ελέγχου από το φως, ώστε να αποφευχθεί τυχόν φωτολεύκανση. Τα αντιδραστήρια στο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR έχουν αραιωθεί σε βέλτιστο βαθμό και δεν απαιτείται περαιτέρω καθαρισμός ή επεξεργασία πριν από τη χρήση τους στην ανάλυση, σύμφωνα με τις οδηγίες που παρέχονται στο εγχειρίδιο του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Εφιστάται η προσοχή στις ημερομηνίες λήξης και τις συνθήκες αποθήκευσης που αναγράφονται στα κουτιά και τις ετικέτες όλων των συστατικών. Μη χρησιμοποιείτε το περιεχόμενο της συσκευασίας αν έχει παρέλθει η ημερομηνία λήξης ή δεν έχουν ληφθεί τα σωστά μέτρα αποθήκευσης. Συλλογή δειγμάτων, προετοιμασία για ανάλυση και αποθήκευση Το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR προορίζεται για χρήση σε δείγματα DNA που εκχυλίστηκαν από ιστό όγκου ο οποίος συλλέχθηκε από ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο (CRC) ή μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) και ο οποίος έχει μονιμοποιηθεί σε φορμόλη και εγκλειστεί σε παραφίνη (FFPE). Οι νεοπλασίες είναι ετερογενείς όσον αφορά στο γονότυπο και στο φαινότυπο. Οι θετικές στη μετάλλαξη νεοπλασίες μπορεί να περιέχουν DNA άγριου τύπου και, παρομοίως, η ιστολογική εξέταση μπορεί να υποδεικνύει περιοχές μη νεοπλασματικού ιστού. Όλα τα δείγματα ιστού πρέπει να αντιμετωπίζονται ως εν δυνάμει επικίνδυνα. Προετοιμασία δειγμάτων ιστού για εκχύλιση DNA (CRC) Χρησιμοποιώντας πρότυπα υλικά και μεθόδους, μονιμοποιήστε το δείγμα ιστού σε ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμόλης (NBF) 10% και συνεχίστε με τον εγκλεισμό του δείγματος ιστού σε παραφίνη. Με τη χρήση μικροτόμου, δημιουργήστε διαδοχικές τομές 5 µm από ένα μπλοκ παραφίνης και τοποθετήστε τις σε γυάλινες αντικειμενοφόρους πλάκες. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

18 Απευθυνθείτε σε εκπαιδευμένο άτομο (π.χ. σε παθολογοανατόμο) για την αξιολόγηση μιας τομής με χρώση αιµατοξυλίνης και ηωσίνης (H&E) για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε νεοπλασματικό ιστό και του εμβαδού. Επισημάνετε τη χρωματισμένη αντικειμενοφόρο πλάκα για να διαχωρίσετε το νεοπλασματικό από το φυσιολογικό ιστό. Χρησιμοποιήστε διαδοχικές τομές για την εκχύλιση DNA. Χρησιμοποιήστε τομές με περιεκτικότητα σε νεοπλασματικό ιστό >20% κατά εμβαδόν για επεξεργασία χωρίς μακροεκτομή (βλ. παρακάτω). Για τομές με περιεκτικότητα σε νεοπλασματικό ιστό <20% κατά εμβαδόν, απαιτείται μακροεκτομή μίας ή περισσότερων τομών. Απορρίψτε το μη νεοπλασματικό ιστό. Για τομές εμβαδού <4 mm 2, υποβάλλετε δύο ή περισσότερες τομές σε επεξεργασία για να αυξήσετε το συνολικό εμβαδόν της νεοπλασματικής περιοχής τουλάχιστον στα 4 mm 2 (ισχύει για δείγματα με ή χωρίς μακροεκτομή). Απορρίψτε το μη νεοπλασματικό ιστό. Απομακρύνετε με απόξεση την περίσσεια παραφίνης από τον ιστό χρησιμοποιώντας ένα καινούριο, αποστειρωμένο νυστέρι. Σημείωση: Χρησιμοποιείτε στεγνά νυστέρια. Μην εκτελείτε αυτό το βήμα σε θάλαμο νηματικής ροής ή απαγωγό εστία. Απομακρύνετε με απόξεση το νεοπλασματικό ιστό από τις τομές και μεταφέρετέ τον σε επισημασμένα σωληνάρια μικροφυγόκεντρου, χρησιμοποιώντας καινούριο νυστέρι για κάθε δείγμα. Προετοιμασία δειγμάτων ιστού για εκχύλιση DNA (NSCLC) Χρησιμοποιώντας πρότυπα υλικά και μεθόδους, μονιμοποιήστε το δείγμα ιστού σε ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμόλης (NBF) 10% και συνεχίστε με τον εγκλεισμό του δείγματος ιστού σε παραφίνη. Με τη χρήση μικροτόμου, δημιουργήστε διαδοχικές τομές 5 µm από ένα μπλοκ παραφίνης και τοποθετήστε τις σε γυάλινες αντικειμενοφόρους πλάκες. Απευθυνθείτε σε εκπαιδευμένο άτομο (π.χ. παθολογοανατόμο) για την αξιολόγηση μιας τομής με χρώση αιµατοξυλίνης και ηωσίνης (H&E) ως προς την παρουσία όγκου. Χρησιμοποιήστε διαδοχικές τομές για την εκχύλιση DNA. Απομακρύνετε με απόξεση την περίσσεια παραφίνης από τον ιστό χρησιμοποιώντας ένα καινούριο, αποστειρωμένο νυστέρι. Σημείωση: Χρησιμοποιείτε στεγνά νυστέρια. Μην εκτελείτε αυτό το βήμα σε θάλαμο νηματικής ροής ή απαγωγό εστία. Απομακρύνετε με απόξεση το νεοπλασματικό ιστό από τις τομές και μεταφέρετέ τον σε επισημασμένα σωληνάρια μικροφυγόκεντρου, χρησιμοποιώντας καινούριο νυστέρι για κάθε δείγμα. 18 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

19 Αποθήκευση Επισημάνετε με ετικέτες, χειριστείτε και αποθηκεύστε νεοπλασματικά δείγματα, μπλοκ, αντικειμενοφόρους πλάκες, δείγματα και σωληνάρια μικροφυγόκεντρου που είναι έτοιμα για εκχύλιση με ελεγχόμενο τρόπο, σύμφωνα με τις τοπικές διαδικασίες. Αποθηκεύστε τα μπλοκ FFPE και τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε θερμοκρασία δωματίου. Μπορείτε να αποθηκεύσετε τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για έως και 4 εβδομάδες πριν από την εκχύλιση DNA. Μπορείτε να αποθηκεύσετε το γενωμικό DNA σε θερμοκρασία 28 C για 1 εβδομάδα μετά την εκχύλιση και στη συνέχεια σε θερμοκρασία 15 έως 25 C για έως και 8 εβδομάδες πριν από τη χρήση. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

20 Διαδικασία Εκχύλιση DNA (δείγματα CRC) Τα χαρακτηριστικά επιδόσεων του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR προέκυψαν με χρήση DNA που εκχυλίστηκε με το κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue (αρ. κατ ). Εάν χρησιμοποιείτε το κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue, εκτελέστε την εκχύλιση του DNA σύμφωνα με τις οδηγίες του εγχειριδίου, προσέχοντας τα εξής: Ανατρέξτε στο QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook (εγχειρίδιο του κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue) για την προετοιμασία των δειγμάτων πριν από την εκχύλιση DNA. Το κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο χειροκίνητα. Μη χρησιμοποιείτε το βήμα με τη δεοξυριβονουκλεάση που περιγράφεται στο εγχειρίδιο του κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue. Μη χρησιμοποιείτε το διάλυμα αποπαραφίνωσης της QIAGEN. Για την αποπαραφίνωση χρησιμοποιείτε μόνο τη μέθοδο ξυλολίου/αιθανόλης που περιγράφεται στο εγχειρίδιο του κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue. Η διάσπαση της πρωτεϊνάσης K (βήμα 11 στο εγχειρίδιο του κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue) πρέπει να συνεχίζεται για 1 ώρα. Η έκλουση των δειγμάτων πρέπει να πραγματοποιείται σε 200 µl ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης (ρυθμιστικό διάλυμα ATE) από το κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue. Αποθηκεύστε το γενωμικό DNA σε θερμοκρασία 28 C για 1 εβδομάδα μετά την εκχύλιση και στη συνέχεια σε θερμοκρασία 15 έως 25 C για έως και 8 εβδομάδες πριν από τη χρήση. 20 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

21 Εκχύλιση DNA (δείγματα NSCLC) Τα χαρακτηριστικά επιδόσεων του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR προέκυψαν με χρήση DNA που εκχυλίστηκε με το κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue (αρ. κατ ). Εάν χρησιμοποιείτε το κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue, εκτελέστε την εκχύλιση του DNA σύμφωνα με τις οδηγίες του εγχειριδίου, προσέχοντας τα εξής: Ανατρέξτε στο QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook (εγχειρίδιο του κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue) για την προετοιμασία των δειγμάτων πριν από την εκχύλιση DNA. Χρησιμοποιήστε τομές 2 x 5 µm ανά εκχύλιση. Το κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο χειροκίνητα. Μη χρησιμοποιείτε το βήμα με τη δεοξυριβονουκλεάση που περιγράφεται στο εγχειρίδιο του κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue. Μη χρησιμοποιείτε το διάλυμα αποπαραφίνωσης QIAGEN που παρέχεται με το κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue. Για την αποπαραφίνωση χρησιμοποιείτε μόνο τη μέθοδο ξυλολίου/αιθανόλης που περιγράφεται στο εγχειρίδιο του κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue. Η διάσπαση της πρωτεϊνάσης K (βήμα 11 στο εγχειρίδιο του κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue) πρέπει να συνεχίζεται για 1 ώρα. Τα δείγματα πρέπει να εκλουστούν σε 60 µl ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης (ATE) από το κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue και να επωαστούν επί 2,5 λεπτά. Φυγοκεντρίστε σε πλήρη ταχύτητα επί 1 λεπτό. Εκτελέστε ένα δεύτερο βήμα έκλουσης με άλλα 60 µl ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης (ATE) από το κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue και επωάστε ξανά επί 2,5 λεπτά. Αποθηκεύστε το γενωμικό DNA σε θερμοκρασία 28 C για 1 εβδομάδα μετά την εκχύλιση και στη συνέχεια σε θερμοκρασία 15 έως 25 C για έως και 8 εβδομάδες πριν από τη χρήση. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

22 Πρωτόκολλο: Αξιολόγηση δειγμάτων DNA Το πρωτόκολλο αυτό χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση του ολικού ενισχύσιμου DNA στα δείγματα. Σημαντικές πληροφορίες πριν από την έναρξη Είναι δυνατή η αξιολόγηση έως και 24 δειγμάτων με τη χρήση του μίγματος αντίδρασης ορού ελέγχου (CTRL) που διατίθεται. Χρησιμοποιήστε το μίγμα αντίδρασης ορού ελέγχου (CTRL) για την αξιολόγηση του DNA πριν από την εξέταση. Σημείωση: Για την αξιολόγηση αυτή, πρέπει να χρησιμοποιείται το μίγμα αντίδρασης ορού ελέγχου (CTRL) όπως περιγράφεται παρακάτω και όχι φασματοφωτομετρία ή άλλες εναλλακτικές μέθοδοι. Δεν είναι δυνατή η ενίσχυση DNA που είναι αποδομημένο σε μεγάλο βαθμό, παρόλο που οι εκκινητές δημιουργούν μικρά θραύσματα DNA. Για την αποτελεσματική χρήση των αντιδραστηρίων στο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR, ομαδοποιήστε τα δείγματα DNA σε παρτίδες όσο γίνεται περισσότερο για τη δημιουργία ολοκληρωμένων εκτελέσεων αναλύσεων. Εάν τα δείγματα υποβληθούν σε εξέταση μεμονωμένα ή σε μικρότερους αριθμούς, χρησιμοποιούνται περισσότερα αντιδραστήρια και μειώνεται ο συνολικός αριθμός των δειγμάτων που μπορούν να εξεταστούν με ένα κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Μη στροβιλίζετε την Taq DNA πολυμεράση (Taq) ή οποιοδήποτε μίγμα που περιέχει Taq DNA πολυμεράση, καθώς υπάρχει κίνδυνος αδρανοποίησης του ενζύμου. Διοχετεύστε με πιπέτα την Taq DNA πολυμεράση τοποθετώντας προσεκτικά το ρύγχος της πιπέτας ακριβώς κάτω από την επιφάνεια του υγρού, ώστε να αποφευχθεί η επικάλυψη του ρύγχους με περίσσεια ενζύμου. Απαραίτητα βήματα πριν από την έναρξη Βεβαιωθείτε ότι είναι εγκατεστημένο το λογισμικό therascreen KRAS Assay Package πριν χρησιμοποιήσετε το όργανο Rotor-Gene Q για πρώτη φορά (βλ. "Παράρτημα: Εγκατάσταση του λογισμικού therascreen KRAS Assay Package", σελίδα 107). Πριν από κάθε χρήση, όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να αποψύχονται εντελώς για 1 ώρα τουλάχιστον σε θερμοκρασία δωματίου (1525 C), να αναμιγνύονται με αναστροφή 10 φορές και να υποβάλλονται σε φυγοκέντριση για σύντομο χρονικό διάστημα, ώστε το περιεχόμενο να συγκεντρωθεί στον πυθμένα των σωληναρίων. Βεβαιωθείτε ότι η Taq DNA πολυμεράση (Taq) βρίσκεται σε θερμοκρασία δωματίου (1525 C) πριν από κάθε χρήση. Φυγοκεντρίστε για σύντομο χρονικό διάστημα το σωληνάριο, ώστε το ένζυμο να συγκεντρωθεί στον πυθμένα του σωληναρίου. 22 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

23 Διαδικασία 1. Αποψύξτε πλήρως το μίγμα αντίδρασης ορού ελέγχου (CTRL), το νερό χωρίς νουκλεάση για ορό ελέγχου χωρίς μήτρα (NTC) και το θετικό ορό ελέγχου (PC) KRAS σε θερμοκρασία δωματίου (1525 C) για τουλάχιστον 1 ώρα. Οι χρόνοι απόψυξης των αντιδραστηρίων, προετοιμασίας PCR και αποθήκευσης πριν από την έναρξη της εκτέλεσης ανάλυσης υποδεικνύονται στον Πίνακα 3. Σημείωση: Η προετοιμασία PCR πρέπει να πραγματοποιείται σε θερμοκρασία δωματίου. Πίνακας 3. Χρόνος απόψυξης, χρόνοι προετοιμασίας PCR και θερμοκρασίες αποθήκευσης Χρόνος απόψυξης Ελάχιστος χρόνος Μέγιστος χρόνος 1 ώρα 4,5 ώρες Θερμοκρασία αποθήκευσης* μετά την προετοιμασία PCR Θερμοκρασία δωματίου (15 25 C) Μέγιστος χρόνος προετοιμασίας PCR και αποθήκευσης 7 ώρες 1 ώρα 4,5 ώρες 28 C 18 ώρες * Ο όρος "Αποθήκευση" αναφέρεται στο χρόνο μεταξύ της ολοκλήρωσης της προετοιμασίας PCR και της έναρξης της εκτέλεσης ανάλυσης PCR στο όργανο Rotor-Gene Q. Σημείωση: Αφήστε την Taq DNA πολυμεράση (Taq) να αποκτήσει θερμοκρασία δωματίου (1525 C) συγχρόνως με τα άλλα αντιδραστήρια (βλ. "Αποθήκευση και χειρισμός αντιδραστηρίων", σελίδα 16). Φυγοκεντρίστε για σύντομο χρονικό διάστημα το σωληνάριο, ώστε το ένζυμο να συγκεντρωθεί στον πυθμένα του σωληναρίου. 2. Αναμείξτε τα αποψυγμένα αντιδραστήρια, αναστρέφοντας κάθε σωληνάριο 10 φορές προκειμένου να αποφευχθεί η δημιουργία τοπικών συγκεντρώσεων αλάτων και, στη συνέχεια, φυγοκεντρίστε για σύντομο χρονικό διάστημα, ώστε το περιεχόμενο να συγκεντρωθεί στον πυθμένα των σωληναρίων. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

24 3. Παρασκευάστε επαρκή ποσότητα κύριων μιγμάτων (μίγμα αντίδρασης ορού ελέγχου [CTRL] συν Taq DNA πολυμεράση [Taq]) σύμφωνα με τους όγκους που αναφέρονται στον Πίνακα 4 για: όλα τα δείγματα DNA 1 αντίδραση θετικού ορού ελέγχου (PC) KRAS 1 αντίδραση με νερό χωρίς νουκλεάση ως ορό ελέγχου χωρίς μήτρα (NTC) 1 επιπλέον δείγμα ώστε να υπάρχει επαρκής ποσότητα επιπλέον υλικού για την προετοιμασία της PCR Το κύριο μίγμα περιέχει όλα τα συστατικά που απαιτούνται για την αντίδραση PCR, εκτός από το δείγμα. Πίνακας 4. Προετοιμασία κύριου μίγματος ανάλυσης ορού ελέγχου Συστατικό Μίγμα αντίδρασης ορού ελέγχου (CTRL) Taq DNA πολυμεράση (Taq) Συνολικός όγκος Όγκος 19,76 µl x (n+1)* 0,24 µl x (n+1)* 20 µl/αντίδραση * n = αριθμός αντιδράσεων (δείγματα και οροί ελέγχου). Παρασκευάστε αρκετή ποσότητα κύριου μίγματος για ένα επιπλέον δείγμα (n+1), ώστε να υπάρχει επαρκής ποσότητα επιπλέον υλικού για την προετοιμασία της PCR. Η τιμή n δεν πρέπει να υπερβαίνει την τιμή 24 (συν οροί ελέγχου), καθώς ο μέγιστος αριθμός δειγμάτων που μπορούν να υποβληθούν σε επεξεργασία σε μια εκτέλεση ανάλυσης είναι 24. Σημείωση: Κατά την προετοιμασία του κύριου μίγματος, προστίθεται αρχικά ο απαιτούμενος όγκος του μίγματος αντίδρασης ορού ελέγχου (CTRL) στο σχετικό σωληνάριο και στη συνέχεια προστίθεται η Taq DNA πολυμεράση (Taq). 4. Τοποθετήστε τον κατάλληλο αριθμό σωληναρίων για PCR σε σειρές των 4 (κάθε σειρά έχει τέσσερα σωληνάρια) στο μπλοκ φόρτωσης, σύμφωνα με τη διάταξη στον Πίνακα 5. Μην τοποθετείτε πώματα στα σωληνάρια. Σημείωση: Αφήστε τα πώματα στον πλαστικό περιέκτη, για όσο είναι απαραίτητο. 24 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

25 Πίνακας 5. Διάταξη ανάλυσης στο μπλοκ φόρτωσης για αξιολόγηση δειγμάτων DNA Ανάλυση Θέση (PC) (NTC) Ορός ελέγχου Οι αριθμοί υποδηλώνουν τις θέσεις στο μπλοκ φόρτωσης και υποδεικνύουν την τελική θέση του ρότορα. 5. Ρυθμίστε μια πιπέτα σε όγκο μικρότερο από τον συνολικό όγκο του κύριου μίγματος αντίδρασης και αναμείξτε σχολαστικά εκτελώντας αναρρόφηση και έγχυση ολόκληρου του όγκου της πιπέτας επί 10 φορές. 6. Προσθέστε αμέσως 20 µl κύριου μίγματος σε κάθε σωληνάριο της σειράς PCR. Σημείωση: Ανατρέξτε στη διάταξη σωληναρίων στον Πίνακα 5. Για την αξιολόγηση των δειγμάτων DNA, πρέπει να προστίθεται κύριο μίγμα ανάλυσης ορού ελέγχου σε ένα σωληνάριο PC, σε ένα σωληνάριο NTC και σε ένα σωληνάριο για κάθε δείγμα DNA. 7. Προσθέστε αμέσως 5 µl νερού χωρίς νουκλεάση για ορό ελέγχου χωρίς μήτρα (NTC) στο σωληνάριο NTC (θέση σωληναρίου 2) και τοποθετήστε το πώμα στο σωληνάριο. 8. Προσθέστε 5 µl κάθε δείγματος DNA στα σωληνάρια δείγματος (θέσεις σωληναρίων 326) και τοποθετήστε τα πώματα στα σωληνάρια. 9. Προσθέστε 5 µl θετικού ορού ελέγχου (PC) KRAS στο σωληνάριο PC (θέση σωληναρίου 1) και τοποθετήστε το πώμα στο σωληνάριο. Κάθε σωληνάριο πρέπει να περιέχει συνολικό όγκο αντίδρασης 25 µl (20 µl προετοιμασμένου κύριου μίγματος, όπως φαίνεται στον Πίνακα 4, και 5 µl NTC/δείγματος/PC). Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

26 10. Με έναν ανεξίτηλο μαρκαδόρο, επισημάνετε τα καπάκια των πρώτων σωληναρίων στη χαμηλότερη αριθμητική θέση σε κάθε σωληνάριο για PCR στη σειρά των 4 (π.χ., θέσεις 1, 5 και 9, κ.λπ.) για να υποδεικνύεται ο προσανατολισμός για τη φόρτωση των σωληναρίων μέσα στο ρότορα 72 βυθισμάτων του οργάνου Rotor-Gene Q. 11. Αναστρέψτε τα πωματισμένα σωληνάρια 4 φορές για να αναμιχθεί το δείγμα και το μίγμα αντίδρασης. 12. Τοποθετήστε όλα τα σωληνάρια για PCR σε σειρές των 4 στις κατάλληλες θέσεις του ρότορα 72 βυθισμάτων σύμφωνα με τη διάταξη της ανάλυσης (Πίνακας 5), χρησιμοποιώντας τις επισημάνσεις για προσανατολισμό. Σημείωση: Εάν υπάρχουν κενές θέσεις στο ρότορα, πρέπει να τοποθετήσετε ένα κενό σωληνάριο με πώμα σε όλες τις θέσεις που δεν χρησιμοποιούνται. Με τον τρόπο αυτό διασφαλίζεται η διατήρηση της θερμικής απόδοσης του οργάνου Rotor-Gene Q. 13. Τοποθετήστε το ρότορα 72 βυθισμάτων μέσα στο όργανο Rotor- Gene Q. Βεβαιωθείτε ότι ο δακτύλιος ασφάλισης (παρέχεται με το όργανο Rotor-Gene Q) είναι τοποθετημένος στο επάνω μέρος του ρότορα για την ασφάλιση των σωληναρίων κατά τη διάρκεια της εκτέλεσης ανάλυσης. 14. Ενεργοποιήστε το λογισμικό Rotor-Gene Q και ανοίξτε ταυτόχρονα το πρότυπο κάνοντας διπλό κλικ στο εικονίδιο "therascreen KRAS QC Locked Template" (Κλειδωμένο πρότυπο ποιοτικού ελέγχου therascreen KRAS) στην επιφάνεια εργασίας του φορητού υπολογιστή που είναι συνδεδεμένος με το όργανο Rotor-Gene Q (Εικόνα 1). Εικόνα 1. Εικονίδιο "therascreen KRAS QC Locked Template" (Κλειδωμένο πρότυπο ποιοτικού ελέγχου therascreen KRAS). 26 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

27 15. Εμφανίζεται η καρτέλα "Setup" (Ρυθμίσεις) βάσει προεπιλογής (Εικόνα 2). Βεβαιωθείτε ότι ο δακτύλιος ασφάλισης είναι τοποθετημένος σωστά και επιλέξτε το πλαίσιο "Locking Ring Attached" (Δακτύλιος ασφάλισης τοποθετημένος). Κλείστε το καπάκι του οργάνου Rotor-Gene Q. Εικόνα 2. Καρτέλα "Setup" (Ρυθμίσεις) και πλαίσιο "Locking Ring Attached" (Δακτύλιος ασφάλισης τοποθετημένος). 16. Εισαγάγετε το αναγνωριστικό εκτέλεσης ανάλυσης στο πεδίο διαλόγου "Run ID" (Αναγνωριστικό εκτέλεσης ανάλυσης) σύμφωνα με την τοπική σύμβαση ονομασίας. Εισαγάγετε το όνομα δείγματος στο πεδίο διαλόγου "Sample Name" (Όνομα δείγματος) σύμφωνα με την τοπική σύμβαση ονομασίας και πατήστε το πλήκτρο return. Με τον τρόπο αυτό προστίθεται το όνομα δείγματος στην παρακάτω λίστα δειγμάτων και αντιστοιχίζεται στο δείγμα ένα "Sample ID" (Αναγνωριστικό δείγματος) (1, 2, 3 κ.λπ.). Επιπλέον, ενημερώνεται ο πίνακας "Layout of the pipetting adapter" (Διάταξη προσαρμογέα διοχέτευσης με πιπέτα) που βρίσκεται στη δεξιά πλευρά, ώστε να συμπεριληφθεί το όνομα δείγματος (Εικόνα 3). Σημείωση: Στον πίνακα "Layout of the pipetting adapter" (Διάταξη προσαρμογέα διοχέτευσης με πιπέτα), ελέγξτε εάν η προσθήκη του ονόματος δείγματος έχει επισημανθεί με αλλαγή χρώματος και εάν το όνομα δείγματος υπάρχει στη θέση δείγματος (Εικόνα 3). Σημείωση: Τα ονόματα δείγματος που περιέχουν περισσότερους από 8 χαρακτήρες ενδέχεται να μην εμφανίζονται ολοκληρωμένα στον πίνακα Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

28 "Layout of the pipetting adapter" (Διάταξη προσαρμογέα διοχέτευσης με πιπέτα). Εικόνα 3. Συμπλήρωση των πεδίων "Run ID" (Αναγνωριστικό εκτέλεσης ανάλυσης) και "Sample Name" (Όνομα δείγματος). 17. Επαναλάβετε το βήμα 15 για να εισάγετε τα ονόματα όλων των πρόσθετων δειγμάτων (Εικόνα 4). Σημείωση: Για να επεξεργαστείτε ένα όνομα δείγματος, κάντε κλικ στο όνομα δείγματος της λίστας δειγμάτων "Sample Name" (Όνομα δείγματος). Το επιλεγμένο όνομα εμφανίζεται στο παραπάνω πεδίο διαλόγου "Sample Name" (Όνομα δείγματος). Επεξεργαστείτε το όνομα δείγματος σύμφωνα με την τοπική σύμβαση ονομασίας και πατήστε το πλήκτρο return για να ενημερωθεί το όνομα. 28 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

29 Εικόνα 4. Εισαγωγή πρόσθετων ονομάτων δειγμάτων στο πεδίο διαλόγου "Sample Name" (Όνομα δείγματος). Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

30 18. Όταν έχετε εισάγει όλα τα ονόματα των δειγμάτων, επαληθεύστε την ορθότητά τους. Προσθέστε τυχόν επιπλέον πληροφορίες στο πεδίο διαλόγου "Notes" (Σημειώσεις) εάν είναι απαραίτητο και στη συνέχεια κάντε κλικ στο κουμπί "Start Run" (Έναρξη εκτέλεσης ανάλυσης) (Εικόνα 5). Εικόνα 5. Πεδίο διαλόγου "Notes" (Σημειώσεις), κουμπί "Start Run" (Έναρξη εκτέλεσης ανάλυσης) και μήνυμα "Warning" (Προειδοποίηση) σχετικά με τις θέσεις του ρότορα που δεν χρησιμοποιούνται. Σημείωση: Εάν υπάρχουν κενές θέσεις στο ρότορα, εμφανίζεται ένα μήνυμα "Warning" (Προειδοποίηση) (Εικόνα 5 και Εικόνα 6) για να υπενθυμίσει στο χρήστη ότι πρέπει να τοποθετήσει από ένα κενό σωληνάριο με πώμα σε όλες τις θέσεις του ρότορα που δεν χρησιμοποιούνται. Βεβαιωθείτε ότι υπάρχει ένα κενό σωληνάριο με πώμα σε όλες τις θέσεις του ρότορα που δεν χρησιμοποιούνται και κάντε κλικ στο "ΟΚ" για να συνεχίσετε. 30 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

31 Εικόνα 6. Μήνυμα "Warning" (Προειδοποίηση) σχετικά με τις θέσεις του ρότορα που δεν χρησιμοποιούνται. 19. Εμφανίζεται ένα παράθυρο "Save As" (Αποθήκευση ως). Επιλέξτε ένα κατάλληλο όνομα αρχείου, αποθηκεύστε την εκτέλεση ανάλυσης PCR ως αρχείο ανάλυσης *.rex στην επιλεγμένη θέση. Κάντε κλικ στο "Save" (Αποθήκευση) (Εικόνα 7). Εικόνα 7. Αποθήκευση του αρχείου εκτέλεσης ανάλυσης. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

32 20. Η εκτέλεση ανάλυσης PCR ξεκινάει. Σημείωση: Κατά την έναρξη της εκτέλεσης ανάλυσης, ανοίγει αυτόματα η καρτέλα "Run Progress" (Πρόοδος εκτέλεσης ανάλυσης), υποδεικνύοντας την παρακολούθηση της θερμοκρασίας και τον υπολειπόμενο χρόνο της ανάλυσης (Εικόνα 8). Εικόνα 8. Καρτέλα "Run Progress" (Πρόοδος εκτέλεσης ανάλυσης). 32 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

33 21. Μετά την ολοκλήρωση της εκτέλεσης ανάλυσης, ανοίγει αυτόματα η καρτέλα "Analysis" (Ανάλυση). Σημείωση: Εάν η καρτέλα "Analysis" δεν ανοίξει αυτόματα, κάντε κλικ στην καρτέλα "Analysis" (Ανάλυση) (Εικόνα 9). Σημείωση: Μια επεξήγηση της μεθόδου υπολογισμού παρουσιάζεται στην ενότητα "Ερμηνεία αποτελεσμάτων", σελίδα 48. Εικόνα 9. Καρτέλα "Analysis" (Ανάλυση) και αναφορά αποτελεσμάτων. 1 = Καρτέλα "Analysis" (Ανάλυση), 2 = "Sample QC Result Table" (Πίνακας αποτελεσμάτων ποιοτικού ελέγχου δειγμάτων). 22. Τα αποτελέσματα ορού ελέγχου αναφέρονται στον πίνακα "Sample QC Result Table" (Πίνακας αποτελεσμάτων ποιοτικού ελέγχου δειγμάτων) όπως φαίνεται παρακάτω (σημείο 2 στην Εικόνα 9). Οροί ελέγχου ανάλυσης (PC και NTC, θέσεις σωληναρίου 1 και 2 αντίστοιχα): Εάν τα αποτελέσματα βρίσκονται εντός του αποδεκτού εύρους, εμφανίζεται η ένδειξη "Valid" (Έγκυρο). Διαφορετικά εμφανίζεται αποτέλεσμα "Invalid" (Άκυρο). C T αντίδρασης ορού ελέγχου δείγματος > 32,00: Εμφανίζεται η ένδειξη "Invalid" (Άκυρο). Η ποσότητα του DNA δεν επαρκεί για την ανάλυση της μετάλλαξης. Επαναλάβετε την εξέταση του δείγματος. Εάν η ποσότητα του DNA εξακολουθεί να μην επαρκεί, εκχυλίστε περισσότερο νεοπλασματικό ιστό, εάν υπάρχει (βλ. "Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων", σελίδα 45. C T αντίδρασης ορού ελέγχου δείγματος < 21,92: Εμφανίζεται η ένδειξη "Invalid" (Άκυρο). Η συγκέντρωση του DNA είναι εξαιρετικά υψηλή για την ανάλυση της μετάλλαξης. Αραιώστε με νερό χωρίς νουκλεάση για αραίωση (Dil.) και επαναλάβετε την εξέταση. Αραιώστε μέχρι η τιμή C T να κυμαίνεται μεταξύ 21,92 και 32,00. Με αραίωση σε αναλογία 1:1 η τιμή C T αυξάνεται κατά περίπου 1,0. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

34 C T αντίδρασης ορού ελέγχου δείγματος 21,9232,00 (21,92 C T ορού ελέγχου 32,00): Εμφανίζεται η ένδειξη "Valid" (Έγκυρο). Η συγκέντρωση του DNA είναι κατάλληλη για την ανάλυση της μετάλλαξης. Σημείωση: Εάν απαιτείται επανάληψη εκχύλισης ή αραίωση, επαναλάβετε την αντίδραση ορού ελέγχου για να βεβαιωθείτε ότι η συγκέντρωση του DNA είναι κατάλληλη για χρήση. 23. Μπορείτε να δημιουργήσετε αρχεία αναφοράς κάνοντας κλικ στο κουμπί "Report" (Αναφορά). Εμφανίζεται το παράθυρο "Report Browser" (Φυλλομετρητής αναφορών). Επιλέξτε "KRAS Analysis Report" (Αναφορά ανάλυσης KRAS) στο "Templates" (Πρότυπα) και στη συνέχεια κάντε κλικ στο κουμπί "Show" (Εμφάνιση) (Εικόνα 10). Σημείωση: Μπορείτε να αποθηκεύσετε τις αναφορές σε μια εναλλακτική θέση σε μορφή αρχείων ιστού, κάνοντας κλικ στο κουμπί "Save As" (Αποθήκευση ως) που βρίσκεται στην επάνω αριστερή γωνία κάθε αναφοράς. Εικόνα 10. Επιλογή του "KRAS Analysis Report" (Αναφορά ανάλυσης KRAS). 34 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

35 Πρωτόκολλο: Ανίχνευση μεταλλάξεων KRAS Το παρόν πρωτόκολλο προορίζεται για την ανίχνευση των μεταλλάξεων KRAS. Σημαντικές πληροφορίες πριν από την έναρξη Μετά την επιτυχή αξιολόγησή του, το δείγμα μπορεί να υποβληθεί σε εξέταση με χρήση των μεθόδων προσδιορισμού μεταλλάξεων KRAS. Για αποτελεσματική χρήση του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR, τα δείγματα πρέπει να ομαδοποιούνται σε παρτίδες των 7 (για την πλήρωση του ρότορα 72 βυθισμάτων). Εάν το μέγεθος της παρτίδας είναι μικρότερο, θα υποβληθούν σε εξέταση λιγότερα δείγματα με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Μη στροβιλίζετε την Taq DNA πολυμεράση (Taq) ή οποιοδήποτε μίγμα που περιέχει Taq DNA πολυμεράση, καθώς υπάρχει κίνδυνος αδρανοποίησης του ενζύμου. Διοχετεύστε με πιπέτα την Taq DNA πολυμεράση τοποθετώντας προσεκτικά το ρύγχος της πιπέτας ακριβώς κάτω από την επιφάνεια του υγρού, ώστε να αποφευχθεί η επικάλυψη του ρύγχους με περίσσεια ενζύμου. Απαραίτητα βήματα πριν από την έναρξη Πριν από κάθε χρήση, αποψύξτε πλήρως όλα τα αντιδραστήρια για 1 ώρα τουλάχιστον σε θερμοκρασία δωματίου (1525 C), αναμείξτε αναστρέφοντας 10 φορές και φυγοκεντρίστε για σύντομο χρονικό διάστημα, ώστε το περιεχόμενο να συγκεντρωθεί στον πυθμένα των σωληναρίων. Βεβαιωθείτε ότι η Taq DNA πολυμεράση (Taq) βρίσκεται σε θερμοκρασία δωματίου (1525 C) πριν από κάθε χρήση. Φυγοκεντρίστε για σύντομο χρονικό διάστημα το σωληνάριο, ώστε το ένζυμο να συγκεντρωθεί στον πυθμένα του σωληναρίου. Πρωτόκολλο 1. Αποψύξτε πλήρως όλα τα σωληνάρια μίγματος αντίδρασης, το νερό χωρίς νουκλεάση για ορό ελέγχου χωρίς μήτρα (NTC) και το θετικό ορό ελέγχου (PC) KRAS σε θερμοκρασία δωματίου (1525 C) για τουλάχιστον 1 ώρα. Οι χρόνοι απόψυξης των αντιδραστηρίων, προετοιμασίας PCR και αποθήκευσης πριν από την έναρξη της εκτέλεσης ανάλυσης υποδεικνύονται στον Πίνακα 6. Σημείωση: Η προετοιμασία PCR πρέπει να πραγματοποιείται σε θερμοκρασία δωματίου. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

36 Πίνακας 6. Χρόνος απόψυξης, χρόνοι προετοιμασίας PCR και θερμοκρασίες αποθήκευσης Χρόνος απόψυξης Ελάχιστος χρόνος Μέγιστος χρόνος 1 ώρα 4,5 ώρες Θερμοκρασία αποθήκευσης* μετά την προετοιμασία PCR Θερμοκρασία δωματίου (1525 C) Μέγιστος χρόνος προετοιμασίας PCR και αποθήκευσης 7 ώρες 1 ώρα 4,5 ώρες 28 C 18 ώρες * Ο όρος "Αποθήκευση" αναφέρεται στο χρόνο μεταξύ της ολοκλήρωσης της προετοιμασίας PCR και της έναρξης της εκτέλεσης ανάλυσης PCR στο όργανο Rotor-Gene Q. Σημείωση: Αφήστε την Taq DNA πολυμεράση (Taq) να αποκτήσει θερμοκρασία δωματίου (1525 C) συγχρόνως με τα άλλα αντιδραστήρια (βλ. "Αποθήκευση και χειρισμός αντιδραστηρίων", σελίδα 16). Φυγοκεντρίστε για σύντομο χρονικό διάστημα το σωληνάριο, ώστε το ένζυμο να συγκεντρωθεί στον πυθμένα του σωληναρίου. 2. Αναμείξτε τα αποψυγμένα αντιδραστήρια, αναστρέφοντας κάθε σωληνάριο 10 φορές ώστε να αποφευχθεί η δημιουργία τοπικών συγκεντρώσεων αλάτων. Φυγοκεντρίστε για σύντομο χρονικό διάστημα, ώστε το περιεχόμενο να συγκεντρωθεί στον πυθμένα του σωληναρίου. 3. Επισημάνετε 8 σωληνάρια μικροφυγόκεντρου (δεν παρέχονται) για τα αντίστοιχα μίγματα αντίδρασης, όπως φαίνεται στον Πίνακα 7. Παρασκευάστε επαρκή ποσότητα κύριων μιγμάτων (μίγμα ορού ελέγχου ή αντίδρασης μετάλλαξης [CTRL, 12ALA, 12ASP, 12ARG, 12CYS, 12SER, 12VAL ή 13ASP] συν Taq DNA πολυμεράση) για: όλα τα δείγματα DNA 1 αντίδραση θετικού ορού ελέγχου (PC) KRAS 1 αντίδραση με νερό χωρίς νουκλεάση ως ορό ελέγχου χωρίς μήτρα (NTC) 1 επιπλέον δείγμα ώστε να υπάρχει επαρκής ποσότητα επιπλέον υλικού για την προετοιμασία της PCR Το κύριο μίγμα περιέχει όλα τα συστατικά που απαιτούνται για την αντίδραση PCR, εκτός από το δείγμα. 36 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

37 Πίνακας 7. Προετοιμασία κύριων μιγμάτων ανάλυσης Ανάλυση Ορός ελέγχου Σωληνάριο μίγματος αντίδρασης Όγκος μίγματος αντίδρασης Όγκος Taq DNA πολυμεράσης (Taq) CTRL 19,76 µl x (n+1)* 0,24 µl x (n+1)* 12ALA 12ALA 19,76 µl x (n+1) 0,24 µl x (n+1) 12ASP 12ALA 19,76 µl x (n+1) 0,24 µl x (n+1) 12ARG 12ALA 19,76 µl x (n+1) 0,24 µl x (n+1) 12CYS 12ALA 19,76 µl x (n+1) 0,24 µl x (n+1) 12SER 12ALA 19,76 µl x (n+1) 0,24 µl x (n+1) 12VAL 12ALA 19,76 µl x (n+1) 0,24 µl x (n+1) 13ASP 12ALA 19,76 µl x (n+1) 0,24 µl x (n+1) * n = αριθμός αντιδράσεων (δείγματα και οροί ελέγχου). Παρασκευάστε αρκετή ποσότητα κύριου μίγματος για ένα επιπλέον δείγμα (n+1), ώστε να υπάρχει επαρκής ποσότητα επιπλέον υλικού για την προετοιμασία της PCR. Η τιμή n δεν πρέπει να υπερβαίνει την τιμή 24 (συν οροί ελέγχου), καθώς ο μέγιστος αριθμός δειγμάτων που μπορούν να υποβληθούν σε επεξεργασία σε μια εκτέλεση ανάλυσης είναι 24. Σημείωση: Κατά την προετοιμασία του κύριου μίγματος, προστίθεται αρχικά ο απαιτούμενος όγκος του μίγματος αντίδρασης ορού ελέγχου (CTRL) ή μίγματος αντίδρασης μετάλλαξης στο σχετικό σωληνάριο και τελευταία προστίθεται η Taq DNA πολυμεράση (Taq). 4. Τοποθετήστε τον κατάλληλο αριθμό σωληναρίων για PCR σε σειρές των 4 (κάθε σειρά έχει 4 σωληνάρια) στο μπλοκ φόρτωσης, σύμφωνα με τη διάταξη στον Πίνακα 8. Μην τοποθετείτε πώματα στα σωληνάρια. Σημείωση: Αφήστε τα πώματα στον πλαστικό περιέκτη, για όσο είναι απαραίτητο. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

38 Πίνακας 8. Διάταξη ανάλυσης στο μπλοκ φόρτωσης για την ανίχνευση μεταλλάξεων KRAS Δείγματα ελέγχου Αριθμός δείγματος Ανάλυση PC NTC CTRL 1* ALA ASP ARG CYS SER VAL ASP * Οι αριθμοί υποδηλώνουν τις θέσεις στο μπλοκ φόρτωσης και υποδεικνύουν την τελική θέση του ρότορα. 5. Προσθέστε αμέσως 5 µl νερού χωρίς νουκλεάση για ορό ελέγχου χωρίς μήτρα (NTC) στα σωληνάρια NTC (θέσεις σωληναρίων 916) και τοποθετήστε τα πώματα στα σωληνάρια. 6. Προσθέστε 5 µl κάθε δείγματος DNA στα σωληνάρια δείγματος (θέσεις σωληναρίων 1772) και τοποθετήστε τα πώματα στα σωληνάρια. 7. Προσθέστε 5 µl θετικού ορού ελέγχου (PC) KRAS στα σωληνάρια PC (θέσεις σωληναρίων 18) και τοποθετήστε τα πώματα στα σωληνάρια. 8. Με έναν ανεξίτηλο μαρκαδόρο, επισημάνετε τα καπάκια των πρώτων σωληναρίων στη χαμηλότερη αριθμητική θέση σε κάθε σωληνάριο για PCR στη σειρά των 4 (π.χ., θέσεις 1, 5 και 9, κ.λπ.) για να υποδεικνύεται ο προσανατολισμός για τη φόρτωση των σωληναρίων μέσα στο ρότορα 72 βυθισμάτων του οργάνου Rotor-Gene Q. 9. Αναστρέψτε τα πωματισμένα σωληνάρια 4 φορές για να αναμιχθεί το δείγμα και το μίγμα αντίδρασης. 38 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

39 10. Τοποθετήστε όλα τα σωληνάρια για PCR σε σειρές των 4 στις κατάλληλες θέσεις του ρότορα 72 βυθισμάτων σύμφωνα με τη διάταξη της ανάλυσης (Πίνακας 8), χρησιμοποιώντας τις επισημάνσεις για προσανατολισμό. Σημείωση: Σε κάθε εκτέλεση ανάλυσης PCR μπορεί να συμπεριληφθούν το ανώτερο 7 δείγματα. Εάν υπάρχουν κενές θέσεις στο ρότορα, πρέπει να τοποθετήσετε ένα κενό σωληνάριο με πώμα σε όλες τις θέσεις που δεν χρησιμοποιούνται. Με τον τρόπο αυτό διασφαλίζεται η διατήρηση της θερμικής απόδοσης του οργάνου Rotor-Gene Q. 11. Τοποθετήστε το ρότορα 72 βυθισμάτων μέσα στο όργανο Rotor- Gene Q. Βεβαιωθείτε ότι ο δακτύλιος ασφάλισης (παρέχεται με το όργανο Rotor-Gene Q) είναι τοποθετημένος στο πάνω μέρος του ρότορα για την ασφάλιση των σωληναρίων κατά την εκτέλεση της ανάλυσης. 12. Ενεργοποιήστε το λογισμικό Rotor-Gene Q και ανοίξτε ταυτόχρονα το πρότυπο κάνοντας διπλό κλικ στο εικονίδιο "therascreen KRAS Locked Template" (Κλειδωμένο πρότυπο therascreen KRAS)στην επιφάνεια εργασίας του φορητού υπολογιστή που είναι συνδεδεμένος με το όργανο Rotor-Gene Q (Εικόνα 11). Εικόνα 11. Εικονίδιο "therascreen KRAS Locked Template" (Κλειδωμένο πρότυπο therascreen KRAS). Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

40 13. Εμφανίζεται η καρτέλα "Setup" (Ρυθμίσεις) βάσει προεπιλογής (Εικόνα 12). Βεβαιωθείτε ότι ο δακτύλιος ασφάλισης είναι τοποθετημένος σωστά και επιλέξτε το πλαίσιο "Locking Ring Attached" (Δακτύλιος ασφάλισης τοποθετημένος). Κλείστε το καπάκι του οργάνου Rotor-Gene Q. Εικόνα 12. Καρτέλα "Setup" (Ρυθμίσεις) και πλαίσιο "Locking Ring Attached" (Δακτύλιος ασφάλισης τοποθετημένος). 14. Εισαγάγετε το αναγνωριστικό εκτέλεσης ανάλυσης στο πεδίο διαλόγου "Run ID" (Αναγνωριστικό εκτέλεσης ανάλυσης) σύμφωνα με την τοπική σύμβαση ονομασίας. 15. Εισαγάγετε το όνομα δείγματος στο πεδίο διαλόγου "Sample Name" (Όνομα δείγματος) σύμφωνα με την τοπική σύμβαση ονομασίας και πατήστε το πλήκτρο return. Με τον τρόπο αυτό προστίθεται το όνομα δείγματος στην παρακάτω λίστα δειγμάτων και αντιστοιχίζεται στο δείγμα ένα "Sample ID" (Αναγνωριστικό δείγματος) (1, 2, 3 κ.λπ.). Επιπλέον, ενημερώνεται ο πίνακας "Layout of the pipetting adapter" (Διάταξη προσαρμογέα διοχέτευσης με πιπέτα) που βρίσκεται στη δεξιά πλευρά, ώστε να συμπεριληφθεί το όνομα δείγματος (Εικόνα 13). Σημείωση: Στον πίνακα "Layout of the pipetting adapter" (Διάταξη προσαρμογέα διοχέτευσης με πιπέτα), ελέγξτε εάν η προσθήκη του ονόματος δείγματος έχει επισημανθεί με αλλαγή χρώματος και εάν είναι επισημασμένες και οι οκτώ αναλύσεις στη στήλη κάτω από τον κύκλο δείγματος (Εικόνα 13). 40 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

41 Σημείωση: Μπορείτε να προσθέσετε έως και 7 δείγματα. Τα αναγνωριστικά δειγμάτων (στους κύκλους δειγμάτων) αντιστοιχίζονται αυτόματα με τιμές από 1 έως 7. Σημείωση: Τα ονόματα δείγματος που περιέχουν περισσότερους από 8 χαρακτήρες ενδέχεται να μην εμφανίζονται ολοκληρωμένα στον πίνακα "Layout of the pipetting adapter" (Διάταξη προσαρμογέα διοχέτευσης με πιπέτα). Εικόνα 13. Συμπλήρωση των πεδίων "Run ID" (Αναγνωριστικό εκτέλεσης ανάλυσης) και "Sample Name" (Όνομα δείγματος). Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

42 16. Επαναλάβετε το βήμα 14 για να εισάγετε τα ονόματα όλων των πρόσθετων δειγμάτων (Εικόνα 14). Σημείωση: Για να επεξεργαστείτε ένα όνομα δείγματος, κάντε κλικ στο όνομα δείγματος της λίστας δειγμάτων "Sample Name" (Όνομα δείγματος). Το επιλεγμένο όνομα εμφανίζεται στο παραπάνω πεδίο διαλόγου "Sample Name" (Όνομα δείγματος). Επεξεργαστείτε το όνομα δείγματος σύμφωνα με την τοπική σύμβαση ονομασίας και πατήστε το πλήκτρο return για να ενημερωθεί το όνομα. Εικόνα 14. Εισαγωγή πρόσθετων ονομάτων δειγμάτων στο πεδίο διαλόγου "Sample Name" (Όνομα δείγματος). 42 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

43 17. Όταν έχετε εισάγει όλα τα ονόματα των δειγμάτων, επαληθεύστε την ορθότητά τους. Προσθέστε τυχόν επιπλέον πληροφορίες στο πεδίο διαλόγου "Notes" (Σημειώσεις) εάν είναι απαραίτητο και στη συνέχεια κάντε κλικ στο κουμπί "Start Run" (Έναρξη εκτέλεσης ανάλυσης) (Εικόνα 15). Σημείωση: Εάν υπάρχουν κενές θέσεις στο ρότορα, εμφανίζεται ένα μήνυμα "Warning" (Προειδοποίηση) (Εικόνα 15 και Εικόνα 16) για να υπενθυμίσει στο χρήστη ότι πρέπει να τοποθετήσει από ένα κενό σωληνάριο με πώμα σε όλες τις θέσεις του ρότορα που δεν χρησιμοποιούνται. Βεβαιωθείτε ότι υπάρχει ένα κενό σωληνάριο με πώμα σε όλες τις θέσεις του ρότορα που δεν χρησιμοποιούνται και κάντε κλικ στο "ΟΚ" για να συνεχίσετε. Εικόνα 15. Πεδίο διαλόγου "Notes" (Σημειώσεις), κουμπί "Start Run" (Έναρξη εκτέλεσης ανάλυσης) και μήνυμα "Warning" (Προειδοποίηση) σχετικά με τις θέσεις του ρότορα που δεν χρησιμοποιούνται. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

44 Εικόνα 16. Μήνυμα "Warning" (Προειδοποίηση) σχετικά με τις θέσεις του ρότορα που δεν χρησιμοποιούνται. 18. Εμφανίζεται ένα παράθυρο "Save As" (Αποθήκευση ως). Επιλέξτε ένα κατάλληλο όνομα αρχείου, αποθηκεύστε την εκτέλεση ανάλυσης PCR ως αρχείο εκτέλεσης ανάλυσης *.rex στην επιλεγμένη θέση (Εικόνα 17). Εικόνα 17. Αποθήκευση του αρχείου εκτέλεσης ανάλυσης. 44 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

45 19. Η εκτέλεση ανάλυσης PCR ξεκινάει. Σημείωση: Κατά την έναρξη της εκτέλεσης ανάλυσης, ανοίγει αυτόματα η καρτέλα "Run Progress" (Πρόοδος εκτέλεσης ανάλυσης), υποδεικνύοντας την παρακολούθηση της θερμοκρασίας και τον υπολειπόμενο χρόνο της ανάλυσης (Εικόνα 18). Εικόνα = Καρτέλα "Run Progress" (Πρόοδος εκτέλεσης ανάλυσης). Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

46 20. Μετά την ολοκλήρωση της εκτέλεσης ανάλυσης, ανοίγει αυτόματα η καρτέλα "Analysis" (Ανάλυση). Σημείωση: Εάν η καρτέλα "Analysis" δεν ανοίξει αυτόματα, κάντε κλικ στην καρτέλα "Analysis" (Ανάλυση) (Εικόνα 19). Σημείωση: Μια επεξήγηση της μεθόδου υπολογισμού παρουσιάζεται στην ενότητα "Ερμηνεία αποτελεσμάτων", σελίδα 48. Εικόνα 19. Καρτέλα "Analysis" (Ανάλυση) και αναφορά αποτελεσμάτων. 21. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης αναφέρονται ως εξής (Εικόνα 19): Πίνακας "Run Controls, Positive Control" (Οροί ελέγχου ανάλυσης, θετικός ορός ελέγχου): Εάν τα αποτελέσματα είναι εντός του αποδεκτού εύρους τιμών, στο πεδίο "Positive Control Status" (Κατάσταση θετικού ορού ελέγχου) εμφανίζεται η ένδειξη "Valid" (Έγκυρο), διαφορετικά εμφανίζεται η ένδειξη "Invalid" (Άκυρο). Πίνακας "Run Controls, Negative Control" (Οροί ελέγχου ανάλυσης, αρνητικός ορός ελέγχου): Εάν τα αποτελέσματα "NTC" και "Internal Control" (Εσωτερική μήτρα ελέγχου) είναι εντός του αποδεκτού εύρους τιμών, στο πεδίο "Negative Control Status" (Κατάσταση αρνητικού ορού ελέγχου) εμφανίζεται η ένδειξη "Valid" (Έγκυρο), διαφορετικά εμφανίζεται η ένδειξη "Invalid" (Άκυρο). Πίνακας "Sample Result Table" (Πίνακας αποτελεσμάτων δειγμάτων): Για τα θετικά για μετάλλαξη δείγματα, οι συγκεκριμένες μεταλλάξεις αναφέρονται στη στήλη "KRAS Mutation Status" (Κατάσταση μετάλλαξης KRAS). 46 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

47 22. Μπορείτε να δημιουργήσετε αρχεία αναφοράς κάνοντας κλικ στο κουμπί "Report" (Αναφορά). Εμφανίζεται το παράθυρο "Report Browser" (Φυλλομετρητής αναφορών). Επιλέξτε "KRAS Analysis Report" (Αναφορά ανάλυσης KRAS) στο "Templates" (Πρότυπα) και στη συνέχεια κάντε κλικ στο κουμπί "Show" (Εμφάνιση) (Εικόνα 20). Σημείωση: Μπορείτε να αποθηκεύσετε τις αναφορές σε μια εναλλακτική θέση σε μορφή αρχείων web, κάνοντας κλικ στο κουμπί "Save As" (Αποθήκευση ως) που βρίσκεται στην επάνω αριστερή γωνία κάθε αναφοράς. Εικόνα 20. Επιλογή του "KRAS Analysis Report" (Αναφορά ανάλυσης KRAS). Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

48 Ερμηνεία αποτελεσμάτων Η ανάλυση και οι προσδιορισμοί μετάλλαξης διεξάγονται αυτόματα από το λογισμικό therascreen KRAS Assay Package μόλις ολοκληρωθεί μια εκτέλεση ανάλυσης. Ακολουθούν πληροφορίες που εξηγούν τον τρόπο με τον οποίο το λογισμικό therascreen KRAS Assay Package διεξάγει την ανάλυση και τους προσδιορισμούς μετάλλαξης. Ο κύκλος PCR στον οποίο ο φθορισμός από μια συγκεκριμένη αντίδραση συμπίπτει με μια προκαθορισμένη τιμή κατωφλίου, ορίζεται ως η τιμή C T. Οι τιμές C T υποδεικνύουν την ποσότητα συγκεκριμένου εισαγόμενου DNA. Οι χαμηλές τιμές C T υποδεικνύουν υψηλότερα επίπεδα εισαγόμενου DNA και οι υψηλές τιμές C T υποδεικνύουν χαμηλότερα επίπεδα εισαγόμενου DNA. Οι αντιδράσεις με τιμή C T ταξινομούνται ως θετικές για ενίσχυση. Με το λογισμικό Rotor-Gene Q παρεμβάλλονται σήματα φθορισμού μεταξύ δύο οποιωνδήποτε καταχωρημένων τιμών. Επομένως, οι τιμές C T μπορεί να είναι οποιοσδήποτε πραγματικός αριθμός (χωρίς περιορισμό σε ακέραιους αριθμούς) εντός του εύρους 0 έως 40. Για το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR, η τιμή κατωφλίου έχει οριστεί σε 0,05 σχετικές μονάδες φθορισμού. Η τιμή αυτή έχει διαμορφωθεί στο λογισμικό therascreen KRAS Assay Package για τα κανάλια φθορισμού για το πράσινο και το κίτρινο. Η τιμή κατωφλίου καθορίστηκε κατά την ανάπτυξη του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Εκτελείται υπολογισμός για τον προσδιορισμό της τιμής C T με τη χρήση της εξίσωσης: C T = [τιμή C T ανάλυσης μετάλλαξης] [τιμή C T ανάλυσης ορού ελέγχου] Οι οροί ελέγχου της ανάλυσης (θετικός ορός ελέγχου, NTC και εσωτερικές μήτρες ελέγχου) αξιολογούνται, ώστε να διασφαλιστεί ότι επιτυγχάνονται αποδεκτές τιμές C T και ότι οι αντιδράσεις εκτελούνται σωστά. Οι τιμές δείγματος C T υπολογίζονται ως η διαφορά μεταξύ της τιμής C T της ανάλυσης μετάλλαξης και της τιμής C T της ανάλυσης ορού ελέγχου από το ίδιο δείγμα. Τα δείγματα ταξινομούνται ως θετικά για μετάλλαξη, εάν η τιμή C T που δίνουν είναι μικρότερη ή ίση με την οριακή τιμή αποκοπής C T για τη συγκεκριμένη μέθοδο. Πάνω από την τιμή αυτή, το δείγμα ενδέχεται να περιέχει μετάλλαξη σε ποσοστό μικρότερο από αυτό που μπορεί να ανιχνευθεί από το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR (εκτός των ορίων των μεθόδων) ή να είναι αρνητικό για μετάλλαξη, γεγονός που θα υποδεικνύεται από την ένδειξη "No Mutation Detected" (Δεν ανιχνεύτηκε μετάλλαξη). Οι αντιδράσεις μετάλλαξης χωρίς ενίσχυση ταξινομούνται ως "No Mutation Detected" (Δεν ανιχνεύτηκε μετάλλαξη). Οι τιμές C T που υπολογίζονται από την ενίσχυση υποβάθρου αναμένεται να είναι μεγαλύτερες από τις οριακές τιμές αποκοπής C T και το δείγμα ταξινομείται ως "No Mutation Detected" (Δεν ανιχνεύτηκε μετάλλαξη). 48 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

49 Τα αποτελέσματα της ανάλυσης εμφανίζονται ως "Mutation Positive" (Θετικό για μετάλλαξη), "No Mutation Detected" (Δεν ανιχνεύτηκε μετάλλαξη), "Invalid" (Άκυρο) ή, σε περίπτωση αποτυχίας της ανάλυσης του ορού ελέγχου, ως "Run Control Failed" (Αποτυχία ανάλυσης ορού ελέγχου). Για τα θετικά για μετάλλαξη δείγματα, αναφέρονται συγκεκριμένες μεταλλάξεις. Τα υπόλοιπα πιθανά αποτελέσματα που ενδέχεται να εμφανιστούν περιγράφονται στις ενότητες "Πρωτόκολλο: Αξιολόγηση δειγμάτων DNA", "Πρωτόκολλο: Ανίχνευση μεταλλάξεων KRAS" και "Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων" του εγχειριδίου αυτού. Σπάνια μια νεοπλασία μπορεί να εμφανίζει περισσότερες από μία μεταλλάξεις. Σε αυτές τις περιπτώσεις, ταυτοποιείται η μετάλλαξη που δίνει τη χαμηλότερη τιμή C T. Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων Αυτός ο οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων μπορεί να σας βοηθήσει στην επίλυση ενδεχόμενων προβλημάτων. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε και στη σελίδα Frequently Asked Questions (Συχνές ερωτήσεις) του Κέντρου τεχνικής υποστήριξης της εταιρείας μας: Οι επιστήμονες των τμημάτων Τεχνικής Υποστήριξης της QIAGEN είναι πάντοτε πρόθυμοι να απαντήσουν σε τυχόν ερωτήσεις σχετικά με τις πληροφορίες και τα πρωτόκολλα που περιέχονται στο παρόν εγχειρίδιο ή τις τεχνολογίες προετοιμασίας δειγμάτων και ανάλυσης (για πληροφορίες επικοινωνίας, βλ. οπισθόφυλλο ή επισκεφθείτε την ιστοσελίδα Άκυρα αποτελέσματα α) Οι συνθήκες αποθήκευσης για ένα ή περισσότερα από τα συστατικά του κιτ δεν συμμορφώνονται με τις οδηγίες που περιλαμβάνονται στην ενότητα "Αποθήκευση και χειρισμός αντιδραστηρίων" (σελίδα 16) β) Η ημερομηνία λήξης του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR έχει παρέλθει Σχόλια και συστάσεις Ελέγξτε τις συνθήκες αποθήκευσης και την ημερομηνία λήξης (ανατρέξτε στην ετικέτα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα καινούριο κιτ, αν χρειαστεί. Ελέγξτε τις συνθήκες αποθήκευσης και την ημερομηνία λήξης (ανατρέξτε στην ετικέτα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα καινούριο κιτ, αν χρειαστεί. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

50 Σχόλια και συστάσεις Τα δείγματα NTC δίνουν θετικά αποτελέσματα στο κανάλι FAM Παρατηρήθηκε μόλυνση κατά την προετοιμασία της PCR Επαναλάβετε την PCR με νέα αντιδραστήρια. Αν είναι δυνατόν, σφραγίστε τα σωληνάρια PCR αμέσως μετά την προσθήκη του δείγματος που πρόκειται να υποβληθεί σε εξέταση. Βεβαιωθείτε ότι ο χώρος εργασίας σας και τα όργανα απολυμαίνονται σε τακτά χρονικά διαστήματα. Ενδείξεις που δημιουργούνται από το λογισμικό therascreen KRAS Assay Package Στον Πίνακα 9 αναφέρονται οι πιθανές ενδείξεις που ενδέχεται να δημιουργηθούν από το λογισμικό therascreen KRAS Assay Package, η σημασία τους και οι ενέργειες που πρέπει να εκτελεστούν. Πίνακας 9. Ενδείξεις του therascreen KRAS Assay Package Ένδειξη Επεξήγηση Ενέργεια που πρέπει να εκτελεστεί PC_CTRL _ASSAY_FAIL PC_MUTATION _ASSAY_FAIL PC_CTRL_ INVALID_DATA Άκυρη ανάλυση PCR Η τιμή FAM C T για το θετικό ορό ελέγχου στην αντίδραση ορού ελέγχου είναι εκτός εύρους. Άκυρη ανάλυση PCR Η τιμή FAM C T για μία ή περισσότερες αντιδράσεις ορού ελέγχου μετάλλαξης είναι εκτός εύρους. Άκυρη ανάλυση PCR Δεν είναι δυνατή η ερμηνεία των δεδομένων φθορισμού στο θετικό ορό ελέγχου (μίγμα αντίδρασης ορού ελέγχου). Επαναλάβετε ολόκληρη την ανάλυση PCR. Επαναλάβετε ολόκληρη την ανάλυση PCR. Επαναλάβετε ολόκληρη την ανάλυση PCR. 50 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

51 Ένδειξη Επεξήγηση Ενέργεια που πρέπει να εκτελεστεί PC_MUTATION _INVALID _DATA NTC_INT _CTRL_FAIL NTC_INT _CTRL_EARLY _CT NTC_INVALID _CT NTC_INVALID _DATA SAMPLE_CTRL _INVALID _DATA Άκυρη ανάλυση PCR Δεν είναι δυνατή η ερμηνεία των δεδομένων φθορισμού στο θετικό ορό ελέγχου (μίγμα αντίδρασης μετάλλαξης). Άκυρη ανάλυση PCR Εσωτερική μήτρα ελέγχου πάνω από το εύρος τιμών για αρνητικό ορό ελέγχου. Άκυρη ανάλυση PCR Εσωτερική μήτρα ελέγχου κάτω από το εύρος τιμών για αρνητικό ορό ελέγχου. Άκυρη ανάλυση PCR Μη έγκυρη τιμή FAM (μικρότερη του ορίου) για αρνητικό ορό ελέγχου. Άκυρη ανάλυση PCR Δεν είναι δυνατή η ερμηνεία των δεδομένων φθορισμού στον αρνητικό ορό ελέγχου. Άκυρο δείγμα Δεν είναι δυνατή η ερμηνεία των δεδομένων φθορισμού στον ορό ελέγχου δείγματος. Επαναλάβετε ολόκληρη την ανάλυση PCR. Επαναλάβετε ολόκληρη την ανάλυση PCR. Επαναλάβετε ολόκληρη την ανάλυση PCR. Επαναλάβετε ολόκληρη την ανάλυση PCR. Επαναλάβετε ολόκληρη την ανάλυση PCR. Προετοιμάστε μια νέα ανάλυση PCR για να επαναλάβετε την εξέταση των σχετικών δειγμάτων. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

52 Ένδειξη Επεξήγηση Ενέργεια που πρέπει να εκτελεστεί SAMPLE_CTRL _HIGH_CONC SAMPLE_CTRL _LOW_CONC SAMPLE_CTRL _FAIL Άκυρο δείγμα Η τιμή FAM C T είναι εξαιρετικά χαμηλή στον ορό ελέγχου δείγματος. Χαμηλή συγκέντρωση στον ορό ελέγχου δείγματος (προειδοποίηση, όχι σφάλμα). Άκυρο δείγμα Η τιμή FAM C T είναι εξαιρετικά υψηλή στην αντίδραση ορού ελέγχου δείγματος. Αραιώστε το δείγμα για να αυξηθεί η τιμή C T του ορού ελέγχου. Η αραίωση αυτή πρέπει να υπολογιστεί βάσει της υπόθεσης ότι η αραίωση σε αναλογία 1:1 με νερό που παρέχεται στο κιτ οδηγεί σε αύξηση της τιμής C T κατά 1,0. Μετά την αραίωση του δείγματος, προετοιμάστε μια νέα ανάλυση PCR για να επαναλάβετε την εξέταση του δείγματος. Καμία. Προετοιμάστε μια νέα ανάλυση PCR για να επαναλάβετε την εξέταση του δείγματος. Εάν μετά την επανάληψη της ανάλυσης PCR προκύψει άκυρο αποτέλεσμα, εκχυλίστε το δείγμα από νέες τομές FFPE. Προετοιμάστε μια νέα ανάλυση PCR για την εξέταση της νέας εκχύλισης. Εάν το αποτέλεσμα είναι άκυρο, επαναλάβετε αυτήν τη δεύτερη εκχύλιση. Εάν το δείγμα δεν δώσει έγκυρο αποτέλεσμα μετά από αυτήν την ανάλυση, του αντιστοιχίζεται απροσδιόριστη κατάσταση μετάλλαξης και δεν πρέπει να διεξαχθεί περαιτέρω εξέταση. 52 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

53 Ένδειξη Επεξήγηση Ενέργεια που πρέπει να εκτελεστεί SAMPLE_INT _CTRL_FAIL Η τιμή C T είναι εξαιρετικά υψηλή (ή δεν υπάρχει τιμή C T ) για την εσωτερική μήτρα ελέγχου (HEX), κανάλι FAM αρνητικό για μετάλλαξη. Εάν το δείγμα έδωσε έγκυρο αποτέλεσμα Δεν απαιτείται καμία ενέργεια. Δείγματα CRC: Εάν το δείγμα έδωσε άκυρο αποτέλεσμα, προετοιμάστε μια νέα ανάλυση PCR για να επαναλάβετε την εξέταση του δείγματος. Εάν μετά την επανάληψη της ανάλυσης PCR προκύψει άκυρο αποτέλεσμα, εκχυλίστε το δείγμα από νέες τομές FFPE. Προετοιμάστε μια νέα ανάλυση PCR για την εξέταση της νέας εκχύλισης. Εάν το αποτέλεσμα είναι άκυρο, επαναλάβετε αυτήν τη δεύτερη εκχύλιση. Εάν το δείγμα δεν δώσει έγκυρο αποτέλεσμα μετά από αυτήν την ανάλυση, του αντιστοιχίζεται απροσδιόριστη κατάσταση μετάλλαξης και δεν πρέπει να διεξαχθεί περαιτέρω εξέταση. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

54 Ένδειξη Επεξήγηση Ενέργεια που πρέπει να εκτελεστεί SAMPLE_INT _CTRL_FAIL (συνέχεια) Δείγματα NSCLC: Εάν ένα δείγμα υποδειχθεί σε άκυρη κατάσταση, αραιώστε το υπόλοιπο του δείγματος σε αναλογία 1 προς 8 με νερό από το σωληνάριο με την ένδειξη DIL, φροντίζοντας ώστε ο τελικός όγκος να είναι μεγαλύτερος από 40 µl (π.χ. 10 µl DNA και 70 µl νερού από το σωληνάριο με την ένδειξη DIL), και προετοιμάστε μια νέα ανάλυση PCR για να επαναλάβετε την ανάλυση του δείγματος. Εάν μετά την επανάληψη της ανάλυσης PCR προκύψει άκυρο αποτέλεσμα, εκχυλίστε το δείγμα από νέες τομές FFPE. Προετοιμάστε μια νέα ανάλυση PCR για την εξέταση της νέας εκχύλισης. Εάν το δείγμα είναι άκυρο, αραιώστε το υπόλοιπο του δείγματος σε αναλογία 1 προς 8 με νερό από το σωληνάριο με την ένδειξη DIL, φροντίζοντας ώστε ο τελικός όγκος να είναι μεγαλύτερος από 40 µl, και εξετάστε αυτή την αραίωση. Εάν το δείγμα δεν δώσει έγκυρο αποτέλεσμα μετά από αυτήν την ανάλυση, του αντιστοιχίζεται απροσδιόριστη κατάσταση μετάλλαξης και δεν πρέπει να διεξαχθεί περαιτέρω εξέταση. 54 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

55 Ένδειξη Επεξήγηση Ενέργεια που πρέπει να εκτελεστεί SAMPLE_INT _CTRL_EARLY _CT Άκυρο σωληνάριο μετάλλαξης Η τιμή HEX C T είναι εξαιρετικά χαμηλή για το δείγμα (εσωτερική μήτρα ελέγχου) Εάν το δείγμα έδωσε έγκυρο αποτέλεσμα Δεν απαιτείται καμία ενέργεια. Εάν το δείγμα έδωσε άκυρο αποτέλεσμα, προετοιμάστε μια νέα ανάλυση PCR για να επαναλάβετε την εξέταση του δείγματος. Εάν μετά την επανάληψη της ανάλυσης PCR προκύψει άκυρο αποτέλεσμα, εκχυλίστε το δείγμα από νέες τομές FFPE. Προετοιμάστε μια νέα ανάλυση PCR για την εξέταση της νέας εκχύλισης. Εάν το αποτέλεσμα είναι άκυρο, επαναλάβετε αυτήν τη δεύτερη εκχύλιση. Εάν το δείγμα δεν δώσει έγκυρο αποτέλεσμα μετά από αυτήν την ανάλυση, του αντιστοιχίζεται απροσδιόριστη κατάσταση μετάλλαξης και δεν πρέπει να διεξαχθεί περαιτέρω εξέταση. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

56 Ένδειξη Επεξήγηση Ενέργεια που πρέπει να εκτελεστεί SAMPLE _INVALID _DATA Άκυρο σωληνάριο μετάλλαξης Δεν είναι δυνατή η ερμηνεία των δεδομένων φθορισμού στην εσωτερική μήτρα ελέγχου. Εάν το δείγμα έδωσε έγκυρο αποτέλεσμα Δεν απαιτείται καμία ενέργεια. Εάν το δείγμα έδωσε άκυρο αποτέλεσμα, προετοιμάστε μια νέα ανάλυση PCR για να επαναλάβετε την εξέταση του δείγματος. Εάν μετά την επανάληψη της ανάλυσης PCR προκύψει άκυρο αποτέλεσμα, εκχυλίστε το δείγμα από νέες τομές FFPE. Προετοιμάστε μια νέα ανάλυση PCR για την εξέταση της νέας εκχύλισης. Εάν το αποτέλεσμα είναι άκυρο, επαναλάβετε αυτήν τη δεύτερη εκχύλιση. Εάν το δείγμα δεν δώσει έγκυρο αποτέλεσμα μετά από αυτήν την ανάλυση, του αντιστοιχίζεται απροσδιόριστη κατάσταση μετάλλαξης και δεν πρέπει να διεξαχθεί περαιτέρω εξέταση. 56 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

57 Ένδειξη Επεξήγηση Ενέργεια που πρέπει να εκτελεστεί MUTATION _EARLY_CT SAMPLE _POSITIVE _AND_INVALID Άκυρο σωληνάριο μετάλλαξης Η τιμή FAM C T είναι εξαιρετικά χαμηλή για το δείγμα. Το αποτέλεσμα ενός δείγματος για μία ή περισσότερες μεταλλάξεις είναι έγκυρο και θετικό, ενώ συγχρόνως τα αποτελέσματα του ίδιου δείγματος για μία ή περισσότερες μεταλλάξεις είναι άκυρα (προειδοποίηση, όχι σφάλμα). Εάν το δείγμα έδωσε έγκυρο αποτέλεσμα Δεν απαιτείται καμία ενέργεια. Εάν το δείγμα έδωσε άκυρο αποτέλεσμα, προετοιμάστε μια νέα ανάλυση PCR για να επαναλάβετε την εξέταση του δείγματος. Εάν μετά την επανάληψη της ανάλυσης PCR προκύψει άκυρο αποτέλεσμα, εκχυλίστε το δείγμα από νέες τομές FFPE. Προετοιμάστε μια νέα ανάλυση PCR για την εξέταση της νέας εκχύλισης. Εάν το αποτέλεσμα είναι άκυρο, επαναλάβετε αυτήν τη δεύτερη εκχύλιση. Εάν το δείγμα δεν δώσει έγκυρο αποτέλεσμα μετά από αυτήν την ανάλυση, του αντιστοιχίζεται απροσδιόριστη κατάσταση μετάλλαξης και δεν πρέπει να διεξαχθεί περαιτέρω εξέταση. Καμία. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

58 Ποιοτικός έλεγχος Σύμφωνα με το πιστοποιημένο με ISO Σύστημα Διαχείρισης Ποιότητας της QIAGEN, κάθε παρτίδα του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR ελέγχεται ως προς τις προκαθορισμένες προδιαγραφές για τη διασφάλιση της ομοιογενούς ποιότητας των προϊόντων. Περιορισμοί Η εξέταση έχει σχεδιαστεί για την ανίχνευση 7 μεταλλάξεων στα κωδικόνια 12 και 13 του γονιδίου KRAS. Τα δείγματα με αποτελέσματα που αναφέρονται ως "No Mutation Detected" (Δεν ανιχνεύτηκε μετάλλαξη) ενδέχεται να φέρουν μεταλλάξεις KRAS που δεν ανιχνεύονται με τη μέθοδο (π.χ., 13CYS). Η ανίχνευση των μεταλλάξεων εξαρτάται από την ακεραιότητα του δείγματος και την ποσότητα του ενισχύσιμου DNA που υπάρχει στο δείγμα. Η διαδικασία πρέπει να επαναληφθεί σε περίπτωση που η αρχική αξιολόγηση του DNA στο δείγμα υποδεικνύει ότι η ποσότητα δεν είναι επαρκής ή ότι είναι εξαιρετικά μεγάλη για την ανάλυση της μετάλλαξης. Το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR χρησιμοποιείται σε μια διαδικασία αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Όπως συμβαίνει σε όλες τις διαδικασίες PCR, τα δείγματα ενδέχεται να μολυνθούν από εξωτερικές πηγές DNA στο περιβάλλον εξέτασης και το DNA στο θετικό ορό ελέγχου. Απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή για να αποφευχθεί τυχόν μόλυνση των δειγμάτων και των αντιδραστηρίων μίγματος αντίδρασης. Το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR δεν προορίζεται για χρήση στη διάγνωση νόσου. Το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR προορίζεται μόνο για τη διάκριση μεταξύ μεταλλαγμένου και άγριου τύπου. Η εξέταση είναι σχεδιασμένη έτσι, ώστε κάθε αντίδραση μετάλλαξης να είναι πιο ευαίσθητη για τη συγκεκριμένη μετάλλαξη που αξιολογείται. Ωστόσο, σε δείγματα στα οποία ανιχνεύεται μια μετάλλαξη, ενδέχεται να προκύψει διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με άλλες αντιδράσεις μετάλλαξης. Εάν τα αποτελέσματα είναι θετικά για περισσότερες από μία αντιδράσεις μετάλλαξης, λαμβάνεται υπόψη το αποτέλεσμα με τη χαμηλότερη τιμή C T. Το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR έχει επικυρωθεί μόνο για μονιμοποιημένο σε φορμόλη και εγκλεισμένο σε παραφίνη ιστό ορθοκολικού καρκίνου και μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα. Το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR έχει επικυρωθεί για χρήση μόνο με το κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue. Μόνο το όργανο Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM ή το όργανο Rotor-Gene Q 5plex HRM έχει επικυρωθεί για χρήση με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. 58 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

59 Αναμενόμενα αποτελέσματα Το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR παρέχει μια ποιοτική ένδειξη της παρουσίας επτά μεταλλάξεων στα κωδικόνια 12 και 13 του ογκογονιδίου KRAS. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης για κάθε μετάλλαξη εμφανίζονται ως "Mutation Positive" (Θετικό για μετάλλαξη), "No Mutation Detected" (Δεν ανιχνεύτηκε μετάλλαξη), "Invalid" (Άκυρο) ή, σε περίπτωση αποτυχίας της ανάλυσης του ορού ελέγχου, ως "Run Control Failed" (Αποτυχία ανάλυσης ορού ελέγχου). Σε περίπτωση αποτελέσματος "Mutation Positive" (Θετικό για μετάλλαξη), εμφανίζεται επίσης η συγκεκριμένη μετάλλαξη KRAS. Χαρακτηριστικά επιδόσεων (CRC) Αναλυτικές επιδόσεις Τα ειδικά χαρακτηριστικά επιδόσεων του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR προσδιορίστηκαν βάσει μελετών σε μονιμοποιημένα σε φορμόλη και εγκλεισμένα σε παραφίνη (FFPE) δείγματα ιστού που συλλέχθηκαν από ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο (CRC) και σε 8 μονιμοποιημένες σε φορμόλη και εγκλεισμένες σε παραφίνη ανθρώπινες κυτταρικές σειρές (κυτταρικές σειρές FFPE), εκ των οποίων οι 7 φέρουν γνωστές μεταλλάξεις KRAS που ανιχνεύονται με αυτή τη μέθοδο και η μία φέρει γονίδιο KRAS άγριου τύπου (δηλ. δεν φέρει μεταλλάξεις στα κωδικόνια 12 και 13). Η κατάσταση μετάλλαξης των δειγμάτων επιβεβαιώθηκε βάσει της αμφίδρομης αλληλούχησης κατά Sanger. Οριακή τιμή αποκοπής Εξετάστηκαν διακόσια είκοσι δείγματα FFPE χρησιμοποιώντας μια μέθοδο σύμφωνα με τις οδηγίες που περιλαμβάνονται στο CLSI EP17-A (2004) (27) για τον καθορισμό των οριακών τιμών αποκοπής για τη μέθοδο. Το εύρος τιμών αντίδρασης ορού ελέγχου C T ορίστηκε μεταξύ 21,92 και 32,00. Οι οριακές τιμές αποκοπής, οι οποίες βασίζονται στην τιμή C T της αντίδρασης ορού ελέγχου που αφαιρείται από την τιμή C T των αντιδράσεων μετάλλαξης ( C T ), φαίνονται στον Πίνακα 10. Πίνακας 10. Καθορισμένες οριακές τιμές αποκοπής για κάθε μέθοδο προσδιορισμού μετάλλαξης Οριακή τιμή αποκοπής ( C T ) Μέθοδος προσδιορισμού μετάλλαξης 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 8,0 6,6 8,0 8,0 8,0 7,5 7,5 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

60 Όριο τυφλού Για την αξιολόγηση των επιδόσεων του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR απουσία μήτρας θετικής για μετάλλαξη και για να διασφαλιστεί ότι ένα τυφλό δείγμα δεν δημιουργεί αναλυτικό σήμα που ενδέχεται να υποδεικνύει χαμηλή συγκέντρωση μετάλλαξης, αξιολογήθηκαν δείγματα χωρίς μήτρα. Τα αποτελέσματα δεν κατέδειξαν ανιχνεύσιμες τιμές C T ορού ελέγχου ή μετάλλαξης σε κανένα σωληνάριο αντίδρασης μετάλλαξης ή ορού ελέγχου (οι τιμές C T της εσωτερικής μήτρας ελέγχου ήταν όλες έγκυρες). Σύγκριση προς την αναλυτική μέθοδο αναφοράς Εκπονήθηκαν δύο μελέτες, οι οποίες κατέδειξαν συνέπεια στην κατάσταση μετάλλαξης των δειγμάτων CRC που εξετάστηκαν με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR, η οποία σχετίζεται με την αμφίδρομη αλληλούχηση. Στην πρώτη μελέτη, συλλέχθηκαν 350 νεοπλασματικά δείγματα από ασθενείς με CRC βάσει μιας ομάδας κλινικών και δημογραφικών χαρακτηριστικών αναφοράς, καθώς και χαρακτηριστικών νεοπλασματικών δειγμάτων αναφοράς. Με τη χρήση μιας στατιστικής τεχνικής τυχαίας δειγματοληψίας, επιλέχθηκαν για αξιολόγηση 150 δείγματα άγνωστης κατάστασης μετάλλαξης. Αυτά τα (150) δείγματα FFPE εξετάστηκαν και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση σε αυτήν τη μελέτη με χρήση των στατιστικών μέτρων συμφωνίας/ασυμφωνίας που περιλαμβάνονται στις οδηγίες CLSI EP12-A2 (2008) (28). Συνολικά 137 από τα δείγματα FFPE έδωσαν έγκυρα αποτελέσματα τόσο με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR όσο και με την αμφίδρομη αλληλούχηση. Το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR χαρακτήρισε 2 δείγματα ως αρνητικά. Η αμφίδρομη αλληλούχηση έδειξε ότι το ένα δείγμα ήταν θετικό για 12ASP και το άλλο ήταν θετικό για 13ASP. Αντιθέτως, 3 δείγματα χαρακτηρίστηκαν θετικά για μετάλλαξη KRAS από το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR αλλά δεν χαρακτηρίστηκαν θετικά στην αμφίδρομη αλληλούχηση. Επιπλέον, ένα δείγμα ταυτοποιήθηκε ως 12ARG με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR και προσδιορίστηκε ως 12ASP με την αμφίδρομη αλληλούχηση. 5 δείγματα βρέθηκαν αρνητικά για μετάλλαξη με την αμφίδρομη αλληλούχηση ενώ με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR χαρακτηρίστηκαν είτε απροσδιόριστα (3 δείγματα) είτε άκυρα (2 δείγματα) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ένα δείγμα που ήταν απροσδιόριστο με την αμφίδρομη αλληλούχηση κατά Sanger, προσδιορίστηκε ως 12SER με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στον πίνακα 11 παρατίθεται η ανάλυση συμφωνίας μεταξύ του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR και της αμφίδρομης αλληλούχησης. 60 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

61 Πίνακας 11. Κιτ therascreen KRAS RGQ PCR έναντι αμφίδρομης αλληλούχησης κατά Sanger Προσδιορισμός μετάλλαξης βάσει αμφίδρομης αλληλούχησης Αρν. 12ALA 12ARG 12ASP 12CYS 12SER 12VAL 13ASP Αρνητικό Θετικό 12ALA 1 Θετικό 12ARG 20 Θετικό 12ASP 3 Θετικό 12CYS Θετικό 12SER Σύνολο Προσδιορισμός κιτ KRAS Θετικό 12VAL 1 Θετικό 13ASP Σύνολο Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

62 Τα αποτελέσματα στον Πίνακα 11 καταδεικνύουν θετική ποσοστιαία συμφωνία (PPA) 96,3%, αρνητική ποσοστιαία συμφωνία (NPA) 96,3% και συνολική ποσοστιαία συμφωνία (OPA) 96,4%. Τα συνολικά αποτελέσματα, εκτός από 6 μη επιτυχή δείγματα κατά Sanger, εμφανίζονται στον Πίνακα 12 παρακάτω. Πίνακας 12. Ανάλυση συμφωνίας Βαθμός συμφωνίας Συχνότητα (%) Συνολική ποσοστιαία συμφωνία 132/137 (96,35) 92,6998,21 Θετική ποσοστιαία συμφωνία 52/54 (96,30) 89,4198,77 Αρνητική ποσοστιαία συμφωνία 80/83 (96,39) 91,3098,55 Διάστημα εμπιστοσύνης 95% (ΔΕ) Μια δεύτερη μοναδική ομάδα δειγμάτων αξιολογήθηκε ως συμπληρωματική στα δεδομένα της πρώτης μελέτης. Συλλέχθηκε μια ομάδα 271 δειγμάτων CRC FFPE. 250 δείγματα άγνωστης κατάστασης μετάλλαξης και 21 δείγματα γνωστής κατάστασης μετάλλαξης για εμπλουτισμό των σπάνιων μεταλλάξεων, συγκρίθηκαν με την αμφίδρομη αλληλούχηση κατά Sanger, όπως περιγράφηκε παραπάνω. Σε 13 (περίπου 5%) συνολικά δείγματα απαιτήθηκε μακροεκτομή για αξιολόγηση με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Από τα 271 δείγματα με αποτελέσματα αμφίδρομης αλληλούχησης, τα 24 δείγματα ήταν απροσδιόριστα βάσει του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR (μη επιτυχές εύρος τιμών C T του ορού ελέγχου, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η ανάλυση συμφωνίας διεξήχθη σε 247 δείγματα με έγκυρα αποτελέσματα τόσο με την αμφίδρομη αλληλούχηση όσο και με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Προέκυψαν 9 ασύμφωνα δείγματα. Ένα από τα 247 δείγματα έδωσε αποτέλεσμα θετικό για μετάλλαξη στην αμφίδρομη αλληλούχηση αλλά αποτέλεσμα "No Mutation Detected" (Δεν ανιχνεύτηκε μετάλλαξη) με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR, ενώ 8 δείγματα έδωσαν θετικό αποτέλεσμα με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR αλλά αρνητικό αποτέλεσμα στην αμφίδρομη αλληλούχηση. Η συνολική συμφωνία ήταν 96,4%. Τα δεδομένα υποστηρίζουν τις ακριβείς επιδόσεις του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR (βλ. Πίνακα 13 και Πίνακα 14). Πίνακας 13. Ανάλυση συμφωνίας (δεύτερη μελέτη) Βαθμός συμφωνίας Συχνότητα (%) Συνολική ποσοστιαία συμφωνία 238/247 (96,36) 93,7398,09 Θετική ποσοστιαία συμφωνία 106/107 (99,07) 95,6499,95 Αρνητική ποσοστιαία συμφωνία 132/140 (94,29) 89,9397,13 Διάστημα εμπιστοσύνης 95% (ΔΕ) 62 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

63 Πίνακας 14. Κιτ therascreen KRAS RGQ PCR έναντι αμφίδρομης αλληλούχησης κατά Sanger (δεύτερη μελέτη) Προσδιορισμός μετάλλαξης βάσει αμφίδρομης αλληλούχησης Αρν. 12ALA 12ARG 12ASP 12CYS 12SER 12VAL 13ASP Σύνολο Αρνητικό Θετικό 12ALA Θετικό 12ARG Θετικό 12ASP Θετικό 12CYS Θετικό 12SER Προσδιορισμός κιτ KRAS Θετικό 12VAL Θετικό 13ASP Σύνολο Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

64 Όριο ανίχνευσης (LOD) Το εύρος εργασίας για το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR βασίζεται στην ποσότητα του ενισχύσιμου DNA στο δείγμα, όπως καθορίστηκε από την τιμή C T της αντίδρασης ορού ελέγχου. Το καθορισμένο εύρος εισαγωγής για την ανάλυση ορίζεται από το προκαθορισμένο εύρος τιμών C T του ορού ελέγχου που κυμαίνεται μεταξύ 21,92 και 32,00. Το όριο ανίχνευσης (LOD) είναι το ελάχιστο ποσοστό του μεταλλαγμένου DNA που μπορεί να ανιχνευτεί σε υπόβαθρο άγριου τύπου, όταν το συνολικό ενισχύσιμο DNA είναι εντός του καθορισμένου εύρους εισαγωγής και μικρότερο από την οριακή τιμή κατωφλίου C T. Διεξήχθη μια μελέτη για τον προσδιορισμό της τιμής LOD καθεμίας από τις 7 ειδικές για μετάλλαξη αντιδράσεις, που περιλαμβάνονται στο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Για το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR, το όριο του ανιχνεύσιμου μεταλλαγμένου DNA σε υπόβαθρο DNA άγριου τύπου ορίζεται ως ο κατώτερος συντελεστής αραίωσης στον οποίο το 95% των αντιγράφων της εξέτασης για κάθε θετικό για μετάλλαξη δείγμα προσδιορίστηκε ως θετικό. Οκτώ κυτταρικές σειρές FFPE, 7 με γνωστό περιεχόμενο μεταλλαγμένου DNA και μία άγριου τύπου χρησιμοποιήθηκαν για αυτήν την αξιολόγηση. Η αναλογία του μεταλλαγμένου προς το συνολικό ενισχύσιμο DNA (ποσοστιαίο μεταλλαγμένο DNA) καθορίστηκε προηγουμένως με τη μέθοδο αμφίδρομης αλληλούχησης κατά Sanger από μη μονιμοποιημένα κύτταρα και στη συνέχεια με τη σχετική ανάλυση κορυφής. Στην περίπτωση των 3 κυτταρικών σειρών, το μεταλλαγμένο περιεχόμενο ήταν 100% (δηλ. το DNA κυτταρικής σειράς ήταν ομόζυγου μεταλλαγμένου γονότυπου). Οι άλλες κυτταρικές γραμμές ήταν μικτής ζυγωτίας. Συλλέχθηκαν πολλαπλές εκχυλίσεις DNA από κάθε δείγμα για τη δημιουργία αποθεματικών διαλυμάτων DNA. Τα αποθεματικά διαλύματα DNA στη συνέχεια κανονικοποιήθηκαν για την επίτευξη των τιμών C T στόχου της αντίδρασης ορού ελέγχου. Τα κανονικοποιημένα προϊόντα εκχύλισης μεταλλαγμένου DNA αραιώθηκαν με κανονικοποιημένο προϊόν εκχύλισης DNA άγριου τύπου για τη δημιουργία μιας σειράς αραιώσεων προϊόντων εκχύλισης που περιείχαν το ίδιο επίπεδο συνολικού ενισχύσιμου DNA, αλλά διαφορετικά επίπεδα μεταλλαγμένου DNA. Ακολούθησαν διαδοχικές αραιώσεις από αυτά τα δείγματα και ανάλυση σε πολλαπλά αντίγραφα. 64 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

65 Η πρώτη σειρά αραιώσεων δημιουργήθηκε για την τιμή C T της αντίδρασης ορού ελέγχου μεσαίου εύρους (περίπου 26). Εξετάστηκαν συνολικά 9 αντίγραφα ανά αραίωση. Το ποσοστό των σωστών προσδιορισμών ως συνάρτηση της αραίωσης για κάθε αντίδραση μετάλλαξης φαίνεται στον Πίνακα 15. Οι τονισμένες τιμές υποδεικνύουν το ποσοστό στο οποίο περισσότερα από το 95% των αντιγράφων έδωσαν σωστό προσδιορισμό. Πίνακας 15. Ποσοστό σωστών προσδιορισμών Ποσοστό (%) αραίωσης μετάλλαξης Ποσοστό (%) σωστών προσδιορισμών μεθόδου 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 0,78 100* 0 33,3 55,6 22,2 66,7 0 1, ,3 100* 100* 88,9 100* 0 3, , * ,7 6, * * 12, , , * Πάνω από το 95% των αντιγράφων έδωσαν σωστό προσδιορισμό. Η αραίωση μετάλλαξης για αυτό το δείγμα ήταν 40,0%. Τα αποτελέσματα της πρώτης σειράς αραίωσης χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία αραιώσεων για την επιβεβαίωση των τιμών LOD με τη χρήση μικρότερου, ειδικού για την αντίδραση, εύρους τιμών των ποσοστιαίων αραιώσεων μετάλλαξης τόσο σε χαμηλά όσο και σε υψηλά επίπεδα εντός του εύρους εισαγωγής της μεθόδου. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

66 Αξιολογήθηκαν συνολικά 12 αντίγραφα για τις σειρές υψηλής αραίωσης. Το ποσοστό των σωστών προσδιορισμών ως συνάρτηση της αραίωσης για τις σειρές υψηλής αραίωσης (τιμές C T -στόχοι περίπου 2324) φαίνεται στον Πίνακα 16. Οι επισημασμένες τιμές υποδεικνύουν το ποσοστό στο οποίο περισσότερα από το 95% των αντιγράφων έδωσαν σωστό προσδιορισμό. Πίνακας 16. Ποσοστό σωστών προσδιορισμών (υψηλή αραίωση) Ανάλυση 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP Ποσοστό (%) σωστών προσδιορισμών Ποσοστό (%) σωστών προσδιορισμών Ποσοστό (%) σωστών προσδιορισμών Ποσοστό (%) σωστών προσδιορισμών Ποσοστό (%) σωστών προσδιορισμών Ποσοστό (%) σωστών προσδιορισμών Ποσοστό (%) σωστών προσδιορισμών 0,13 0 0,56 0 0,16 0 0,12 0 0,31 0 0,17 0 0,63 0 Ποσοστό (%) αραίωσης μετάλλαξης (υψηλή αραίωση) 0,27 0 1,13 8,3 0,33 0 0,24 0 0,63 0 0,34 0 1,25 0 0,54 91,7 2,25 33,3 0,65 8,3 0,49 8,3 1,25 33,3 0,69 16,7 2,50 0 1,08 100* 4,50 83,3 1,30 100* 0,98 83,3 2,50 66,7 1,38 100* 5,0 100* 2, ,00 100* 2, ,95 100* 5,00 100* 2, , , , , , , , ,0 100 * Πάνω από το 95% των αντιγράφων έδωσαν σωστό προσδιορισμό. 11 έγκυρα αντίγραφα. 66 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

67 Για τη σειρά χαμηλής αραίωσης χρησιμοποιήθηκαν 24 αντίγραφα ανά αραίωση, εκτός εάν καθορίζεται διαφορετικά. Το ποσοστό των σωστών προσδιορισμών ως συνάρτηση της αραίωσης για τις σειρές χαμηλής αραίωσης (τιμή C T -στόχος περίπου 31) φαίνεται στον Πίνακα 17. Οι επισημασμένες τιμές υποδεικνύουν το ποσοστό στο οποίο περισσότερα από το 95% των αντιγράφων έδωσαν σωστό προσδιορισμό. Πίνακας 17. Ποσοστό σωστών προσδιορισμών (χαμηλή αραίωση) Ανάλυση 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP Ποσοστό (%) σωστών προσδιορισμών Ποσοστό (%) σωστών προσδιορισμών Ποσοστό (%) σωστών προσδιορισμών Ποσοστό (%) σωστών προσδιορισμών Ποσοστό (%) σωστών προσδιορισμών Ποσοστό (%) σωστών προσδιορισμών Ποσοστό (%) σωστών προσδιορισμών 0,27 12,5 0,56 0 0,33 8,3 0,24 8,3 0,63 0 0,34 4,3 0,63 0 Ποσοστό (%) αραίωσης μετάλλαξης (χαμηλή αραίωση) 0,54 20,8 1,13 16,7 0,65 4,2 0,49 4,2 1,25 0 0,69 16,7 1,25 4,2 1,08 33,3 2,25 29,2 1,30 29,2 0,98 20,9 2,50 8,3 1,38 46,7 2,5 8,3 2,15 83,3 4,50 58,3 2,60 52,2 1,95 54,2 5,0 33,3 2,75 75,0 5,0 33,3 4,30 100* 9,0 100* 5,20 95,8* 3,90 83,3 10,0 70,9 5,50 100* 10,0 70,8 8, , , ,80 100* 20,0 83,3 11, ,0 100* 12, , , , ,0 100* 16, ,0 100 * Πάνω από το 95% των αντιγράφων έδωσαν σωστό προσδιορισμό. Σε αραίωση 2,60 για την ανάλυση 12ARG, ο αριθμός των έγκυρων αντιγράφων ήταν 23. Ο αριθμός των έγκυρων αντιγράφων στη σειρά 12VAL ήταν 23, 24, 15, 16, 13, 12 και 19. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

68 Εφαρμόστηκαν μοντέλα λογιστικής παλινδρόμησης σε κάθε ανάλυση ξεχωριστά για τις ομάδες δεδομένων εισαγόμενου DNA χαμηλού και υψηλού επιπέδου. Σε αυτά τα μοντέλα, η μεταβλητή απόκρισης ήταν η δυαδική έξοδος της μετάλλαξης που ανιχνεύτηκε (ανίχνευση = 1) και της μετάλλαξης που δεν ανιχνεύτηκε (ανίχνευση = 0) ενώ η συνεχής επεξηγηματική μεταβλητή ήταν η αραίωση μετάλλαξης log2 %. Οι τιμές LOD υπολογίστηκαν ως ποσοστιαία αραίωση μετάλλαξης που έδωσε μια προβλεπόμενη πιθανότητα ανίχνευσης 0,95. Οι τιμές LOD που καθορίστηκαν από τις σειρές αραίωσης ξεκινώντας είτε με τις χαμηλές, είτε με τις υψηλές τιμές C T, φαίνονται στον Πίνακα 18. Πίνακας 18. Δεδομένα λογιστικής παλινδρόμησης για σειρές αραίωσης χαμηλών και υψηλών τιμών C T Ανάλυση Χαμηλή τιμή Υψηλή τιμή 12ALA 4,25 0,56 12ASP 10,23 6,43 12ARG 7,27 0,87 12CYS 6,90 1,21 12SER 25,75 4,20 12VAL 5,17 0,90 13ASP 18,83 4,16 Οι τελικές τιμές LOD με τη χρήση κυτταρικών σειρών FFPE όταν η τιμή C T εισαγωγής κυμαίνεται μεταξύ περίπου 22 και 27 C T φαίνονται στον Πίνακα 19 παρακάτω. Στο κατώτερο όριο του εύρους τιμών εισαγωγής C T η ευαισθησία της ανάλυσης αυξάνεται, καθώς η ποσότητα του εισαγόμενου DNA ενδέχεται να μην περιέχει αρκετά αντίγραφα για την υποστήριξη των ίδιων ποσοστιαίων αναλογιών DNA άγριου τύπου προς μεταλλαγμένο DNA που παρατηρούνται στα υψηλά και μεσαία σημεία του εύρους εργασίας. 68 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

69 Πίνακας 19. Τιμές LOD για κάθε μέθοδο προσδιορισμού μετάλλαξης με χρήση κυτταρικών σειρών FFPE Ανάλυση LOD C 95 (ποσοστό του μεταλλαγμένου DNA σε DNA άγριου τύπου (wild-type)) 12ALA 0,8 12ARG 2,6 12ASP 6,4 12CYS 1,5 12SER 5,6 12VAL 1,6 13ASP 6,4 Εισαγόμενο DNA και γραμμικότητα Επίδραση του επιπέδου εισαγόμενου DNA πάνω στις τιμές C T Όταν τα δείγματα σε διαφορετικά επίπεδα ολικού DNA περιέχουν την ίδια αναλογία μεταλλαγμένου DNA, αναμένεται οι τιμές μέτρησης C T να παραμένουν σταθερές. Σκοπός της μελέτης ήταν να καταδειχθεί ότι οι επιδόσεις του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR είναι σταθερές κατά το εύρος εισαγωγής ολικού DNA (C T του ορού ελέγχου) της μεθόδου. Χρησιμοποιήθηκε DNA που εκχυλίστηκε από 8 κυτταρικές σειρές FFPE για την προετοιμασία δεξαμενών DNA με τη χαμηλότερη δυνατή τιμή C T στην αντίδραση ορού ελέγχου. Στη συνέχεια, τα πυκνά αποθεματικά διαλύματα DNA αραιώθηκαν ώστε να παραχθούν διαλύματα DNA που να καλύπτουν ολόκληρο το εύρος εργασίας (συνολικά 5 αραιώσεις συμπεριλαμβανομένου του αρχικού πυκνού αποθεματικού διαλύματος). Για κάθε σημείο εντός του εύρους εργασίας, προετοιμάστηκε επαρκές υλικό για τη διεξαγωγή εξετάσεων 6 αντιγράφων. Το εύρος αραίωσης για κάθε αντίδραση μετάλλαξης και η μέση τιμή C T που λήφθηκε από τα αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα 20. Για καθεμία από τις μεταλλάξεις που ανιχνεύτηκαν με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR, η τιμή C T μετρήθηκε σε διαφορετικά επίπεδα εισαγωγής ολικού DNA διευρύνοντας το εύρος εργασίας της μεθόδου πέρα από τα προκαθορισμένα κριτήρια αποδοχής για τη μελέτη. Παρόλο που υπάρχει ελαφριά αύξηση στην τιμή C T κατά την αύξηση της εισαγωγής DNA, συνολικά, οι τιμές C T ήταν σταθερές στο εύρος εργασίας του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR εντός των καθορισμένων κριτηρίων αποδοχής. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

70 Πίνακας 20. Επίδραση εισαγωγής DNA στις τιμές C T στο εύρος τιμών C T της αντίδρασης ορού ελέγχου εισαγωγής κυτταρικές σειρές FFPE Ανάλυση Αραίωση 1 ~2021 C T Αραίωση 2 ~2324 C T C T Αραίωση 3 ~2627 C T Αραίωση 4 ~2930 C T Αραίωση 5 ~3233 C T 12ALA 1,56 1,25 1,16 1,14 1,27 12ASP* 2,46 2,18 2,11 2,11 1,75 12ARG 1,18 0,63 1,08 0,94 1,06 12VAL 0,29 0,25 0,15 0,26 0,1 12SER 2,91 2,21 2,15 2,15 2,08 12CYS 0,98 0,71 0,58 0,81 0,67 13ASP 3,57 2,84 2,54 2,46 2,62 * Ο συνολικός αριθμός των αντιγράφων για το 12ASP ήταν 27. Γραμμικότητα/απόδοση της ενίσχυσης ως συνάρτηση της εισαγωγής DNA Καταδείχθηκε η γραμμικότητα και η απόδοση της ενίσχυσης της αντίδρασης PCR για κάθε αντίδραση μετάλλαξης, σε σχέση με την αντίδραση ορού ελέγχου, στο εύρος εργασίας του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Η απόδοση της ενίσχυσης υπολογίστηκε για καθεμία από τις αντιδράσεις προσδιορισμού μετάλλαξης και για την αντίδραση ορού ελέγχου, με τον τύπο [2(1/κλίση)] 1. Η απόδοση ενίσχυσης του ορού ελέγχου σε σύγκριση με την αντίδραση προσδιορισμού μετάλλαξης δείχνει ότι το C T, και άρα και ο προσδιορισμός της μετάλλαξης, είναι σταθερά σε ολόκληρο το εύρος εργασίας της μεθόδου. Η μεγαλύτερη διαφορά στην απόδοση της ενίσχυσης μεταξύ της αντίδρασης ορού ελέγχου και της αντίδρασης μετάλλαξης παρατηρήθηκε στην ανάλυση του 13ASP με μέση διαφορά στις αποδόσεις περίπου 14,5%. Η σύνοψη των δεδομένων φαίνεται στον Πίνακα 21. Γραμμικότητα/απόδοση της ενίσχυσης ως συνάρτηση της ποσοστιαίας μετάλλαξης Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η αξιολόγηση της επίδρασης διαδοχικά αραιωμένου, θετικού για μετάλλαξη δείγματος στην απόδοση της ενίσχυσης στο εύρος εργασίας του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR, ξεκινώντας με επίπεδα εισαγωγής της τιμής C T σε περίπου 2223 C T. Τα προϊόντα εκχύλισης DNA από κυτταρικές σειρές FFPE αξιολογήθηκαν αρχικά βάσει ενδείξεων OD πριν από τη διεξαγωγή της αντίδρασης PCR με 70 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

71 το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Στη συνέχεια, παρασκευάστηκαν αποθεματικά διαλύματα DNA σε τιμή C T της αντίδρασης ορού ελέγχου που αντιστοιχεί σε περίπου 23 C T. Στα αποθεματικά διαλύματα πραγματοποιήθηκαν διαδοχικές αραιώσεις 1:1 κάθε φορά με τη χρήση DNA άγριου τύπου, ώστε να διατηρηθεί σταθερό το ολικό DNA άγριου τύπου, διαφοροποιώντας το ποσοστό μεταλλαγμένου DNA στη μήτρα. Επομένως, όλες οι μήτρες που δημιουργήθηκαν είχαν την ίδια απόλυτη ποσότητα και συγκέντρωση DNA, αλλά διαφορετικές αναλογίες DNA άγριου τύπου προς μεταλλαγμένο DNA. Προετοιμάστηκαν δεξαμενές επαρκούς ποσότητας DNA για 6 αντίγραφα ανά μετάλλαξη. Υπολογίστηκαν τα δεδομένα C T και C T για κάθε μετάλλαξη σε κάθε σημείο αραίωσης. Οι τιμές C T της αντίδρασης μετάλλαξης αποτυπώθηκαν γραφικά και υπολογίστηκε η απόδοση. Οι τιμές C T της αντίδρασης ορού ελέγχου ήταν σταθερές στις σειρές αραιώσεων της εκάστοτε μετάλλαξης. Για κάθε δείγμα με τιμή C T της αντίδρασης ορού ελέγχου εντός του καθορισμένου εύρους (21,9232,00), υπολογίστηκαν οι τιμές C T. Εφαρμόστηκε ένα μοντέλο γραμμικής παλινδρόμησης με C T αντίδρασης αραίωσης έναντι αραίωσης εισαγωγής DNA log2. Αναφέρθηκε η κλίση και τα διαστήματα εμπιστοσύνης 95%. Η μελέτη κατέδειξε ότι η αραίωση των μεταλλάξεων σε υπόβαθρο σταθερής συγκέντρωσης DNA άγριου τύπου οδήγησε σε απόδοση ενίσχυσης που δεν διέφερε σημαντικά εκτός των τιμών που καθορίστηκαν στην παραπάνω μελέτη γραμμικότητας, με την απόδοση της ενίσχυσης να παρουσιάζει απόκλιση μικρότερη από ±10% (Πίνακας 22). Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

72 Τυπικό σφάλμα σημείου τομής 0,060 0,103 0,083 0,083 0,13 0,065 0,063 0,039 0,050 0,087 0,047 0,043 0,056 0,106 Υπολογισμένη κλίση 1,008 0,987 1,035 0,993 1,013 1,015 0,981 0,961 1,003 0,934 0,995 0,972 1,001 0,909 Τυπικό σφάλμα (κλίση) 0,007 0,013 0,01 0,011 0,16 0,008 0,01 0,006 0,008 0,014 0,006 0,005 0,009 0,017 Πίνακας 21. Απόδοση ενίσχυσης Σημείο τομής 21,060 22,476 CT ορού ελέγχου 12ALA 12ALA CT 20,825 23,237 CT ορού ελέγχου 12ASP 12ASP CT 20,385 21,347 CT ορού ελέγχου 12ARG 12ARG CT 23,437 24,289 CT ορού ελέγχου 12CYS 12CYS CT 22,568 25,212 CT ορού ελέγχου 12SER 12SER CT 21,208 21,532 CT ορού ελέγχου 12VAL 12VAL CT 23,207 26,466 Κατώτατο αμφίπλευρο όριο εμπιστοσύνης 95% (κλίση) 1,023 1,013 1,056 1,016 1,046 1,032 1,003 0,974 1,02 0,963 1,007 0,983 1,02 0,945 Ανώτατο αμφίπλευρο όριο εμπιστοσύνης 95% (κλίση) 0,993 0,961 1,014 0,97 0,98 0,999 0,96 0,947 0,986 0,904 0,983 0,961 0,982 0,873 Απόδοση ενίσχυσης 0,989 1,019 0,954 1,01 0,982 0,979 1,026 1,058 0,996 1,101 1,007 1,04 0,999 1,144 Διαφορά στην απόδοση ενίσχυσης 0,03 0,056-0,003 0,032 0,105 0,033 0,145 Δείγμα CT ορού ελέγχου 13ASP 13ASP CT 72 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

73 Πίνακας 22. Απόδοση ενίσχυσης Σημείο τομής Τυπικό σφάλμα σημείου τομής 12ALA 23,540 0,025 12ASP 24,804 0,054 12ARG 24,226 0,028 12CYS 24,354 0,027 12SER 25,376 0,054 12VAL 22,703 0,035 13ASP 27,555 0,057 Υπολογισμένη κλίση 0,968 1,030 1,008 0,981 0,892 1,021 0,810 Κλίση τυπικού σφάλματος 0,010 0,022 0,011 0,011 0,022 0,014 0,023 Κατώτατο αμφίπλευρο όριο εμπιστοσύνης 95% (κλίση) 0,989 1,075 1,031 1,003 0,937 1,050 0,857 Ανώτατο αμφίπλευρο όριο εμπιστοσύνης (κλίση) 0,947 0,985 0,984 0,959 0,847 0,992 0,763 Απόδοση ενίσχυσης 1,047 0,960 0,990 1,027 1,174 0,972 1,353 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

74 Παρεμβαλλόμενες ουσίες Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η αξιολόγηση της επίδρασης δυνητικά παρεμβαλλόμενων ουσιών στις επιδόσεις του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Η αξιολόγηση αυτή πραγματοποιήθηκε αναλύοντας της επίδραση κάθε ουσίας, μέσω πειραμάτων εξωγενούς προσθήκης σε δύο συγκεντρώσεις, στις τιμές C T και στην κατάσταση μετάλλαξης των δειγμάτων εξέτασης. Οι συγκεντρώσεις παρατίθενται στον Πίνακα 23. Πίνακας 23. Ποσότητα παρεμβαλλόμενων ουσιών που εξετάστηκαν σε κάθε ανάλυση (δηλ. 1x) Παρεμβαλλόμενη ουσία Πραγματική υψηλή ποσότητα (έκλουσμα µl/200 µl) Ρυθμιστικό διάλυμα AL 1,33 x ,33 x 10-5 Ρυθμιστικό διάλυμα ATL 5,40 x ,35 x 10-4 Αιθανόλη 1,35 x ,38 x 10-4 Κηρός παραφίνης (σε ξυλόλιο) 2,00 x ,00 x 10-5 Πρωτεϊνάση K 1,32 x ,30 x 10-6 Πραγματική χαμηλή ποσότητα (έκλουσμα µl/200 µl) Ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης AW1 Ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης AW2 0,50 1,25 x ,00 1,25 Ξυλόλιο 2,00 x ,00 x 10-5 Στις συγκεντρώσεις που αναμένεται να προκύψουν κατά την κανονική χρήση, καμία από τις πιθανώς παρεμβαλλόμενες ουσίες που αξιολογήθηκαν δεν επηρεάζει την ικανότητα του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR να διακρίνει τα θετικά από τα αρνητικά για μετάλλαξη δείγματα. Εκτός από τη μελέτη των παρεμβαλλόμενων ουσιών, αξιολογήθηκε η πιθανή επίδραση της νέκρωσης σε κλινικά δείγματα, για να προσδιοριστεί εάν τυχόν υψηλά επίπεδα νεκρωτικού ιστού σε νεοπλασματικά δείγματα επηρεάζουν την ικανότητα δημιουργίας έγκυρων δεδομένων. Από τα συνολικά 421 δείγματα που αξιολογήθηκαν στο πλαίσιο των μελετών σύγκρισης προς την αναλυτική μέθοδο αναφοράς, τα 29 δείγματα παρουσίασαν νέκρωση σε επίπεδο >50%, όπως προσδιορίστηκε από την ιστοπαθολογική εξέταση. Από αυτά τα 29 δείγματα, τα 28 έδωσαν έγκυρα αποτελέσματα που ήταν σύμφωνα με την αμφίδρομη αλληλούχηση κατά Sanger. Ένα μόνο αποτέλεσμα ήταν άκυρο, λόγω ανεπαρκούς ποσότητας DNA. 74 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

75 Διασταυρούμενη μόλυνση Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν ο προσδιορισμός της έκτασης της διασταυρούμενης μόλυνσης, η οποία θα μπορούσε δυνητικά να οδηγήσει σε ψευδώς θετικά αποτελέσματα στα δείγματα DNA, χρησιμοποιώντας το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Στις πιθανές αιτίες διασταυρούμενης μόλυνσης περιλαμβάνονται οι εξής: Εκχύλιση δείγματος (π.χ. απόξεση αντικειμενοφόρων πλακών) Διοχέτευση δειγμάτων με πιπέτα Σφράγιση ("πωματισμός") σωληναρίων δείγματος Μόλυνση των αντιδραστηρίων του κιτ κατά τη διάρκεια της χρήσης Φόρτωση των σωληναρίων ανάλυσης στο όργανο Rotor-Gene Q Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν πρότυπα FFPE: το πρότυπο άγριου τύπου και το πρότυπο 12ALA (καθώς η αντίδραση 12ALA είναι η αντίδραση του κιτ με τη χαμηλότερη τιμή LOD). Η μελέτη αποτελούταν από 10 σειρές αναλύσεων PCR, σχεδιασμένες για τη διερεύνηση της πιθανότητας μόλυνσης τόσο κατά τη διάρκεια όσο και μεταξύ των αναλύσεων με το όργανο Rotor-Gene Q. Σε αυτές τις αναλύσεις δειγμάτων εξέτασης, χρησιμοποιήθηκαν σωληνάρια με DNA άγριου τύπου για την ανίχνευση μόλυνσης από μεταλλαγμένο DNA. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης δεν κατέδειξαν ανιχνεύσιμη μόλυνση σε κανένα από τα προϊόντα εκχύλισης DNA άγριου τύπου που προορίζονταν για την ανίχνευση διασταυρούμενης μόλυνσης. Αποκλειστικότητα/διασταυρούμενη αντιδραστικότητα Το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR περιλαμβάνει 8 χωριστές αντιδράσεις. Πρόκειται για μία μοναδική αντίδραση ελέγχου που εντοπίζει μια μη πολυμορφική περιοχή του γονιδίου KRAS και 7 ειδικές αντιδράσεις ανίχνευσης μεταλλάξεων. Δεν υπάρχει καμία αντίδραση που να υπολογίζει συγκεκριμένα την ακολουθία KRAS άγριου τύπου στο κωδικόνιο 12 ή 13. Το αποτέλεσμα KRAS "No Mutation Detected" (Δεν ανιχνεύτηκε μετάλλαξη) (δηλ. άγριου τύπου) προσδιορίζεται από την απουσία οποιασδήποτε από τις 7 μεταλλάξεις που οδηγούν σε θετικό για μετάλλαξη αποτέλεσμα. Επομένως, είναι απαραίτητο να καταδειχθεί ο βαθμός μη ειδικής ενίσχυσης ή η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα που παρατηρείται σε κάθε αντίδραση με περίσσειες ποσότητες DNA άγριου τύπου KRAS, για να διασφαλιστεί ότι δεν προκύπτουν ψευδώς θετικά αποτελέσματα. Αντίστοιχα αξιολογείται η μη ειδική ενίσχυση των μεταλλάξεων KRAS που δεν προορίζονται για ανίχνευση από την αντίδραση. Αυτό αποδεικνύει ότι ο βαθμός της διασταυρούμενης αντιδραστικότητας μεταξύ των αντιδράσεων ανίχνευσης μεταλλάξεων δεν οδηγεί σε λανθασμένους προσδιορισμούς μετάλλαξης σε περίπτωση που υπάρχει περίσσεια ποσότητα μεταλλαγμένου DNA. Καθώς η εισαγωγή DNA Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

76 για αυτήν την ανάλυση βασίζεται στο εύρος τιμών C T του ορού ελέγχου (21,92 έως 32,00), η υψηλότερη συγκέντρωση της εισαγωγής DNA βασίζεται στην ύπαρξη τιμής C T ορού ελέγχου περίπου 22. Για την αξιολόγηση αυτή χρησιμοποιήθηκαν κλινικά δείγματα FFPE καθώς και DNA κυτταρικής σειράς FFPE. Μη ειδική ενίσχυση/διασταυρούμενη αντιδραστικότητα: KRAS DNA άγριου τύπου Μελετήθηκε ο βαθμός μη ειδικής ενίσχυσης DNA άγριου τύπου ανά μίγμα αντίδρασης σχεδιασμένο για την ενίσχυση συγκεκριμένων μεταλλάξεων. Συνολικά 60 αντίγραφα DNA άγριου τύπου από κυτταρική σειρά FFPE ή DNA εκχυλισμένου από ιστό όγκων CRC αξιολογήθηκαν στην υψηλότερη συγκέντρωση εισαγόμενου ενισχύσιμου DNA με χρήση του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Για DNA εκχυλισμένο από την κυτταρική σειρά FFPE, οι τιμές C T ορού ελέγχου ήταν περίπου Οι τιμές C T ορού ελέγχου για 3 δείγματα CRC άγριου τύπου ήταν μεταξύ 24 και 25. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι τιμές C T υπερέβαιναν τις καθορισμένες οριακές τιμές αποκοπής. Οι μέσες ή/και χαμηλότερες τιμές C T που παρατηρήθηκαν για κάθε αντίδραση φαίνονται στον Πίνακα 24. Πίνακας 24. Μέσες τιμές C T και κατώτατες τιμές C T που παρατηρήθηκαν για δείγματα άγριου τύπου (wild-type) σε αντιδράσεις προσδιορισμού μεταλλάξεων Ανάλυση Οριακή τιμή αποκοπής Χαμηλότερη τιμή C T που παρατηρήθηκε Μέση τιμή C T δείγματος 1 (χαμηλότερη) Μέση τιμή C T δείγματος 2 (χαμηλότερη) Μέση τιμή C T δείγματος 3 (χαμηλότερη) 12ALA 8 12,76 18,00 (11,40) 18,62 (11,50) 20,03 (19,36) 12ASP 6,6 10,35 10,90 (9,62) 10,34 (8,84) 10,68 (9,01) 12ARG 8 14,26 20,33 (12,94) 20,02 (13,20) 20,03 (19,36) 12CYS 8 13,66 20,62 (17,38) 20,29 (19,62) 20,03 (19,36) 12SER 8 11,97 17,26 (11,14) 17,90 (11,42) 18,05 (10,44) 12VAL 7,5 11,81 14,87 (11,46) 16,27 (11,50) 18,68 (11,36) 13ASP 7,5 10,94 12,35 (9,08) 13,68 (10,69) 14,82 (9,97) 76 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

77 Μη ειδική ενίσχυση/διασταυρούμενη αντιδραστικότητα/ αποκλειστικότητα: KRAS DNA θετικό για μετάλλαξη Μεταλλαγμένα δείγματα με υψηλή συγκέντρωση εισαγόμενου DNA εξετάστηκαν με όλα τα μίγματα αντίδρασης. Παρασκευάστηκαν δείγματα DNA από καθεμία από τις κυτταρικές σειρές FFPE, έτσι ώστε η τιμή C T της αντίδρασης ορού ελέγχου να αντιστοιχεί σε 23 περίπου. Αξιολογήθηκαν 6 αντίγραφα κάθε δείγματος μετάλλαξης. Το ποσοστό της μετάλλαξης στο δείγμα διέπεται από το ποσοστό της μετάλλαξης στην κυτταρική σειρά DNA. Οι μέσες τιμές C T που παρουσιάζονται στον Πίνακα 25 δείχνουν ότι υπάρχει διασταυρούμενη αντιδραστικότητα μεταξύ των αντιδράσεων μετάλλαξης. Η μετάλλαξη 12ALA ενισχύθηκε και δημιουργήθηκαν τιμές C T μικρότερες από τις τιμές κατωφλίου C T για τις αντιδράσεις 12CYS, 12SER και 12VAL. Η μετάλλαξη 12VAL ενισχύθηκε και έδωσε τιμή C T μικρότερη από την τιμή κατωφλίου C T για την αντίδραση 12ALA. Σε όλες τις περιπτώσεις, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι προσδιορίστηκε η σωστή μετάλλαξη με την αντίστοιχη αντίδραση μετάλλαξης (δηλαδή η χαμηλότερη τιμή C T ήταν η σωστά προσδιορισμένη μετάλλαξη). Όλες οι υπόλοιπες περιπτώσεις της εξέτασης είτε δεν ανιχνεύτηκαν, είτε ήταν εκτός της τιμής κατωφλίου C T. Πίνακας 25. Διασταυρούμενη αντιδραστικότητα ( C T ) μεταξύ αντιδράσεων μετάλλαξης με χρήση DNA κυτταρικών σειρών FFPE στο υψηλό εύρος εισαγωγής Μεταλλαγμένο DNA Οριακή τιμή αποκοπής C T μεθόδου 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 12ALA 8 1,42* 12,66 Δ/Ε 5,81 2,78 6,31 13,21 12ASP 6,6 12,56 2,42* Δ/Ε Δ/Ε 13,44 11,21 13,55 12ARG 8 13,12 11,56 1,12* 11,42 Δ/Ε 13,43 12,66 12CYS 8 14,2 12,48 9,23 0,98* Δ/Ε 7,96 12,88 12SER 8 Δ/Ε 13,39 13,31 Δ/Ε 3,02* 12,99 13,97 12VAL 7,5 6,83 Δ/Ε Δ/Ε Δ/Ε 13,38 0,28* 13,74 13ASP 7,5 Δ/Ε 13,29 13,89 Δ/Ε Δ/Ε 14,36 4,5* * Τιμές C T από αντίστοιχες αντιδράσεις. Δ/Ε: Καμία διασταυρούμενη αντίδραση. C T από αντιδράσεις με διασταυρούμενη αντίδραση κάτω από την οριακή τιμή. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

78 Επαναληψιμότητα και αναπαραγωγιμότητα Η ακρίβεια του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο που ενσωμάτωνε τμήματα των CLSI EP12-A (28) και CLSI EP05-A2 (29). Για την αξιολόγηση αυτή χρησιμοποιήθηκαν κλινικά δείγματα CRC. Με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR εξετάστηκε ένα δείγμα άγριου τύπου και ένα δείγμα για κάθε μετάλλαξη, με 2 χειριστές σε 3 κέντρα να αναλύουν όλα τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου με κιτ therascreen KRAS RGQ PCR από 3 παρτίδες, καθημερινά επί 5 ημέρες, με 2 σειρές αναλύσεων ανά ημέρα και με 2 αντίγραφα κάθε δείγματος σε κάθε σειρά αναλύσεων. Αναλύθηκαν και οι τιμές C T και C T που λήφθηκαν για κάθε αντίδραση σε κάθε δείγμα με χρήση της ανάλυσης διασποράς δειγμάτων. Η αναπαραγωγιμότητα του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR καταδείχτηκε για τα δείγματα μετάλλαξης χαμηλού επιπέδου (3x LOD) και για τα δείγματα άγριου τύπου, με τουλάχιστον 39/40 σωστές περιπτώσεις προσδιορισμού μετάλλαξης για όλες τις αναλύσεις σε πολλαπλές παρτίδες, πλατφόρμες και χειριστές, τόσο κατά τη διάρκεια του ίδιου πειράματος όσο και μεταξύ διαφορετικών πειραμάτων. Οι εκτιμήσεις αποδεδειγμένης διασποράς (μία φορά την τυπική απόκλιση), χρησιμοποιώντας δείγματα C50 και 3x LOD παρατίθενται στον Πίνακα 26 και στον Πίνακα 27. Πίνακας 26. Εκτιμήσεις διασποράς ανάλυσης και ακρίβειας αναπαραγωγιμότητας Ανάλυση %CV για C T %CV για C T μετάλλαξης %CV για C T ορού ελέγχου 3x LOD C50 3x LOD C50 3x LOD C50 WT 12ALA 13,14 8,32 1,87 2,02 0,97 1,12 1,12 12ARG 10,79 8,04 1,59 1,96 1,24 1,51 1,15 12ASP 12,86 5,87 1,11 1,00 0,90 0,90 1,04 12CYS 17,61 10,83 1,86 2,02 1,54 1,22 1,15 12SER 13,97 10,43 1,71 2,11 0,94 1,19 1,15 12VAL 9,66 15,47 1,52 1,65 1,11 3,74 1,26 13ASP 13,73 9,35 1,91 2,08 1,11 1,41 1,19 78 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

79 Πίνακας 27. Εκτιμήσεις ακριβείας για την επαναληψιμότητα Ανάλυση %CV για C T %CV για C T μετάλλαξης %CV για C T ορού ελέγχου 3x LOD C50 3x LOD C50 3x LOD C50 WT 12ALA 10,71 7,51 1,69 1,76 0,77 0,90 0,79 12ARG 9,83 8,04 1,21 1,76 0,84 1,33 0,90 12ASP 10,16 4,08 0,93 0,89 0,80 0,76 0,76 12CYS 13,15 8,80 1,31 1,76 1,40 1,01 0,76 12SER 6,76 6,18 1,10 1,48 0,80 0,90 0,90 12VAL 9,21 15,32 1,40 1,42 0,91 3,49 0,94 13ASP 8,67 7,01 1,30 1,65 0,91 1,19 0,97 Αναφέρθηκε συνολικά και εντός κάθε κέντρου η υπολογιζόμενη αναλογία δειγμάτων 3x LOD που έδωσαν αποτέλεσμα μετάλλαξης και άγριου τύπου. Σε όλες τις αναλύσεις και τους συνδυασμούς δειγμάτων, τουλάχιστον τα 79 στα 80 αντίγραφα έδωσαν σωστό προσδιορισμό μετάλλαξης. Η συνολική αναλογία σωστών προσδιορισμών ήταν 99,6% (1115/1120): Σημειώθηκε αναλογία 99,6% (558/560) για θετικά για μετάλλαξη δείγματα (3x LOD) και 99,5% (557/560) για δείγματα στα οποία δεν ανιχνεύτηκε μετάλλαξη (βλ. Πίνακα 28). Πίνακας 28. Συνολικοί σωστοί προσδιορισμοί Δείγμα 3x LOD μετάλλαξης Σωστοί προσδιορισμοί ανά μέθοδο προσδιορισμού μετάλλαξης 12ALA 12ARG 12ASP 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 79/80 80/80 80/80 79/80 80/80 80/80 80/80 Άγριου τύπου (χαμηλού επιπέδου) 80/80 79/80 80/80 80/80 79/80 79/80 80/80 Διαφοροποίηση χειρισμού δειγμάτων Για την αξιολόγηση της διαφοροποίησης χειρισμού δειγμάτων στο πλαίσιο της διαδικασίας εξέτασης του συστήματος με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR, λήφθηκαν 30 διαδοχικές τομές 5 µm από καθένα από τα 10 δείγματα FFPE CRC (3 άγριου τύπου και 1 ανά μετάλλαξη). Οι τομές τυχαιοποιήθηκαν σε ένα από τα 3 κέντρα εξέτασης και κάθε κέντρο έλαβε 10 τομές ανά δείγμα FFPE (συνολικά 100 τομές). Από τις 300 εκχυλίσεις DNA που εξετάστηκαν, τα Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

80 298 δείγματα ήταν έγκυρα. Υπήρχε συμφωνία 99,33% όσον αφορά τους προσδιορισμούς μετάλλαξης KRAS μεταξύ των 3 κέντρων. Εκτιμήθηκε η διασπορά των τιμών C T για κάθε ανάλυση καθώς και η συνεισφορά μεταξύ και εντός των εργαστηριακών πηγών με τη χρήση του μοντέλου διασποράς δειγμάτων ANOVA. Η διασπορά εντός των κέντρων εξέτασης ήταν υψηλότερη για το 12ASP (0,30). Η διασπορά μεταξύ των κέντρων εξέτασης ήταν υψηλότερη για το 12SER (0,05). Μια σύγκριση των μέσων τιμών C T κατά κέντρο με την αντίστοιχη τυπική απόκλιση για δείγματα μετάλλαξης και άγριου τύπου κατέδειξε πολύ στενή συμφωνία για τα αποτελέσματα (βλ. Πίνακα 29 και Πίνακα 30). Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν τη συμφωνία της διαδικασίας εκχύλισης DNA και της επεξεργασίας δειγμάτων σε συνδυασμό με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Πίνακας 29. Σύγκριση των μέσων τιμών C T (τυπική απόκλιση) κατά κέντρο για δείγματα τύπου μετάλλαξης Κέντρο 1 Μέση C T (τυπική απόκλιση) ανά μέθοδο 12ALA 12ARG 12ASP 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 2,44 (0,1) 2,62 (0,3) 3,03 (0,6) 2,24 (0,1) 2,34 (0,3) 2,51 (0,1) 3,93 (0,4) 2 2,44 (0,2) 2,52 (0,4) 3,01 (0,7) 2,29 (0,2) 2,10 (0,4) 2,44 (0,5) 4,15 (0,7) 3 2,67 (0,6) 2,52 (0,2) 3,07 (0,5) 2,29 (0,2) 2,74 (0,5) 2,56 (0,2) 3,95 (0,3) Πίνακας 30. Σύγκριση των μέσων τιμών C T (τυπική απόκλιση) κατά κέντρο για δείγματα άγριου τύπου (wild-type) Κέντρο 1 Μέση C T (τυπική απόκλιση) ανά μέθοδο 12ALA 12ARG 12ASP 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 12,46 (0,3) * 10,37 (0,4) 11,84 (0,4) 12,36 (0,5) 11,11 (0,6) 2 12,09 (0,6) 13,07 (0,2) 10,17 (0,5) 11,71 (0,7) 12,20 (0,6) 11,00 (0,9) 3 12,07 (0,2) 10,61 (0,4) 11,94 (0,3) 12,28 (0,6) 11,82 (0,5) * "": Απούσα τιμή διότι δεν παρατηρήθηκε διαφυγή. 80 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

81 Εναλλαξιμότητα παρτίδων Αξιολογήθηκε η πιθανότητα επίδρασης της ανίχνευσης μετάλλαξης λόγω διαφοροποίησης από παρτίδα σε παρτίδα. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήθηκαν 3 παρτίδες κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue και therascreen KRAS RGQ PCR με κάθε παρτίδα εκχύλισης FFPE. DNA εκχυλίστηκε από κυτταρικές σειρές μονιμοποιημένες σε φορμόλη και εγκλεισμένες σε παραφίνη, με κιτ εκχύλισης FFPE από 3 παρτίδες, προκειμένου να ληφθούν δείγματα DNA με τιμές-στόχους C T ορού ελέγχου ίσες με 23, 26 και 31 περίπου. Αυτές οι τιμές C T επελέγησαν έτσι ώστε να καλύπτουν το καθορισμένο εύρος εργασίας του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR για το επίπεδο ολικού εισαγόμενου DNA (C T ορού ελέγχου εντός του διαστήματος 21,9232,00). Εξετάστηκαν συνολικά 6 αντίγραφα εκχυλισμάτων σε καθεμία από τις τιμέςστόχους C T με καθεμία από τις 3 ανεξάρτητες παρτίδες κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Οι τιμές C T και οι προσδιορισμοί μετάλλαξης συλλέχθηκαν για όλα τα δείγματα εξέτασης. Οι προκαθορισμένοι στόχοι της μελέτης ικανοποιήθηκαν εφόσον παρατηρήθηκαν σωστοί προσδιορισμοί μετάλλαξης στο 100% έγκυρων εξετάσεων, επιβεβαιώνοντας ότι ο προσδιορισμός μετάλλαξης δειγμάτων δεν επηρεάζεται με τη χρήση διαφορετικών παρτίδων κιτ εκχύλισης FFPE ή/και κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Χαρακτηριστικά επιδόσεων (NSCLC) Αναλυτικές επιδόσεις Τα ειδικά χαρακτηριστικά επιδόσεων του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR προσδιορίστηκαν βάσει μελετών σε μονιμοποιημένα σε φορμόλη και εγκλεισμένα σε παραφίνη (FFPE) δείγματα ιστού που συλλέχθηκαν από ασθενείς με μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Οι μέθοδοι δειγματοληψίας ήταν η βιοψία με κόπτουσα βελόνη (CNB), η αναρρόφηση με λεπτή βελόνη (FNA) και η εκτομή. Στην εργασία αυτή χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 8 κυτταρικές σειρές μονιμοποιημένες σε φορμόλη και εγκλεισμένες σε παραφίνη (κυτταρικές σειρές FFPE), από τις οποίες οι 7 είχαν ήδη βρεθεί θετικές για μεταλλάξεις KRAS που ανιχνεύονται με αυτή τη μέθοδο. Η τελευταία κυτταρική σειρά ήταν άγριου τύπου ως προς το KRAS (δηλαδή χωρίς μεταλλάξεις στα κωδικόνια 12 και 13). Η κατάσταση μετάλλαξης όλων των δειγμάτων επιβεβαιώθηκε μέσω αμφίδρομης αλληλούχησης κατά Sanger. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

82 Σύγκριση με την αναλυτική μέθοδο αναφοράς Σκοπός της μελέτης αυτής ήταν να καταδειχθεί η συμφωνία (ορθότητα) ως προς την αναφερόμενη κατάσταση μετάλλαξης (θετικά ή αρνητικά για μετάλλαξη) των δειγμάτων NSCLC που εξετάστηκαν με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR σε σύγκριση με την αμφίδρομη αλληλούχηση κατά Sanger. Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν κλινικά δείγματα FFPE NSCLC που ελήφθησαν μέσω εκτομής, CNB ή FNA. DNA εκχυλίστηκε από κάθε δείγμα πριν από την εξέταση με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Τα αποτελέσματα από την εξέταση αυτή συγκρίθηκαν με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από αμφίδρομη αλληλούχηση κατά Sanger. Συνολικά 360 δείγματα έδωσαν έγκυρο αποτέλεσμα τόσο με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR όσο και με αμφίδρομη αλληλούχηση κατά Sanger, με 340 δείγματα να παρουσιάζουν συμφωνία αποτελεσμάτων. 20 δείγματα παρουσίασαν ασυμφωνία μεταξύ των αποτελεσμάτων με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR και με αμφίδρομη αλληλούχηση κατά Sanger. Από αυτά, το 1 δείγμα έδωσε θετικό αποτέλεσμα με την αλληλούχηση κατά Sanger και αρνητικό αποτέλεσμα με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Τα υπόλοιπα 19 δείγματα ήταν θετικά με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR και αρνητικά στην αλληλούχηση κατά Sanger. Ο βαθμός συμφωνίας μεταξύ του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR και της αμφίδρομης αλληλούχησης φαίνεται στον Πίνακα Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

83 Πίνακας 31. Κιτ therascreen KRAS RGQ PCR έναντι αμφίδρομης αλληλούχησης κατά Sanger Προσδιορισμός μεταλλάξεων με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR Αρνητικό 12ALA 12ARG 12ASP 12CYS 12SER 12VAL 13ASP Σύνολο Αρνητικό Θετικό ALA Θετικό ALA_12CYS Θετικό ARG Θετικό ASP Προσδιορισμός μεταλλάξεων μέσω αμφίδρομης αλληλούχησης κατά Sanger Θετικό CYS Θετικό CYS_12VAL Θετικό VAL Θετικό ASP Σύνολο Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

84 Δύο δείγματα έδωσαν διπλό προσδιορισμό μεταλλάξεων μέσω αλληλούχησης κατά Sanger. Η μία μετάλλαξη συνέπιπτε με το αποτέλεσμα του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Ως εκ τούτου, θεωρήθηκε ότι τα δείγματα αυτά παρουσίαζαν συμφωνία για τους σκοπούς των αναλύσεων συνολικής συμφωνίας, θετικής συμφωνίας και αρνητικής συμφωνίας, οι οποίες παρουσιάζονται στον Πίνακα 32. Πίνακας 32. Συνοπτικά αποτελέσματα συμφωνίας και εμπιστοσύνης Βαθμός συμφωνίας Συχνότητα (%) Συνολική ποσοστιαία συμφωνία 340/360 (94,44) 92,0396,29 Θετική ποσοστιαία συμφωνία 79/80 (98,75) 94,2199,94 Αρνητική ποσοστιαία συμφωνία 261/280 (93,21) 90,2095,51 Διάστημα εμπιστοσύνης 95% (ΔΕ) Αυτή η μελέτη έδειξε ότι επιτυγχάνεται συμφωνία αποτελεσμάτων όταν εξετάζονται ιστοί NSCLC με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR και με αμφίδρομη αλληλούχηση κατά Sanger. Ο βαθμός συμφωνίας υπολογίστηκε με βάση 340 σύμφωνα δείγματα και 20 ασύμφωνα δείγματα. Ως εκ τούτου, η συνολική ποσοστιαία συμφωνία είναι 94,44%. Το κατώτατο όριο του μονόπλευρου ακριβούς διαστήματος εμπιστοσύνης 95% (που ισοδυναμεί με το κατώτατο όριο του αμφίπλευρου ακριβούς διαστήματος εμπιστοσύνης 90%) για τη συνολική ποσοστιαία συμφωνία στη συνολική κατάσταση μετάλλαξης ήταν 92,03%. Συνεπώς ικανοποιείται το κριτήριο αποδοχής για τη μελέτη αυτή (συνολική ποσοστιαία συμφωνία ίση ή μεγαλύτερη από 90%). Όριο ανίχνευσης (LOD) Το LOD για τις αναλύσεις με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR προσδιορίστηκε και επαληθεύτηκε με χρήση ιστών CRC (βλ. ενότητα "Χαρακτηριστικά επιδόσεων (CRC)"). Η μελέτη που πραγματοποιήθηκε με σκοπό να επαληθευτούν οι ισχυρισμοί περί LOD για τους ιστούς CRC (Πίνακας 19) είχε επίσης εφαρμογή στους ιστούς NSCLC. Η μελέτη περιλάμβανε δύο μέρη. Στο μέρος 1, 60 αντίγραφα από 7 μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές FFPE NSCLC που αντιπροσώπευαν την κάθε μετάλλαξη αραιώθηκαν μέχρι το LOD της αντίστοιχης μεθόδου και εξετάστηκαν. Στο μέρος 2, 96 αντίγραφα κλινικών δειγμάτων FFPE NSCLC που αντιπροσώπευαν την κάθε μετάλλαξη με τις 3 μεθόδους δειγματοληψίας (εκτομή, CNB και FNA) εξετάστηκαν μετά από αραίωση μέχρι το LOD της αντίστοιχης μεθόδου. Λόγω του περιορισμένου αριθμού τομών από κλινικά δείγματα, αυτά υποκαταστάθηκαν από κυτταρικές σειρές FFPE ή από δείγματα αντίστοιχων ασθενών όπως απαιτείτο προκειμένου να εξασφαλιστεί ότι θα αντιπροσωπεύονταν όλες οι μεταλλάξεις. Συλλέχθηκαν πολλαπλές εκχυλίσεις DNA από κάθε δείγμα για τη δημιουργία αποθεματικών διαλυμάτων DNA. Τα αποθεματικά διαλύματα DNA στη συνέχεια κανονικοποιήθηκαν για να επιτευχθούν τιμές-στόχοι C T ίσες με Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

85 για την αντίδραση ορού ελέγχου. Τα κανονικοποιημένα προϊόντα εκχύλισης μεταλλαγμένου DNA αραιώθηκαν με κανονικοποιημένα προϊόντα εκχύλισης DNA άγριου τύπου, με αντίστοιχο τρόπο λήψης, προκειμένου να σχηματιστούν εκχυλίσματα που να περιέχουν το ίδιο επίπεδο ολικού ενισχύσιμου DNA αλλά με ποσοστό μετάλλαξης ίσο με το LOD της αντίστοιχης μεθόδου. Για το μέρος 1 (κυτταρικές σειρές FFPE), και τα 60 έγκυρα αντίγραφα κυτταρικών σειρών FFPE για κάθε δείγμα που αξιολογήθηκε έδειξαν ανίχνευση 100% για την αντίστοιχη αντίδραση μετάλλαξης στο εξεταζόμενο LOD. Τα ακριβή ανώτατα μονόπλευρα όρια εμπιστοσύνης 95% για όλα τα δείγματα ήταν 100%, γεγονός που σημαίνει ότι οι τιμές LOD που είχαν προσδιοριστεί προηγουμένως ισχύουν και για τους ιστούς NSCLC (βλ. Πίνακα 33). Πίνακας 33. Παρατηρηθέντα ποσοστά και ακριβή όρια εμπιστοσύνης για δείγματα που προσδιορίστηκαν ως θετικά για μετάλλαξη για το 1ο μέρος της μελέτης (κυτταρικές σειρές FFPE) Μετάλλαξη δείγματος Αριθμός έγκυρων σημείων δεδομένων Ποσοστό ανίχνευσης Ακριβές ανώτατο μονόπλευρο όριο εμπιστοσύνης 95% (%) 12ALA 60/ ASP 60/ ARG 60/ CYS 60/ SER 60/ VAL 60/ ASP 60/ Για το μέρος 2 (κλινικά δείγματα FFPE NSCLC / κυτταρικές σειρές FFPE / δείγματα αντίστοιχων ασθενών), τα 96 έγκυρα αντίγραφα για τις μεταλλάξεις 12ALA, 12ASP, 12ARG, 12VAL και 13ASP έδωσαν σωστό προσδιορισμό σε ποσοστό 100%, με ακριβές ανώτατο μονόπλευρο όριο εμπιστοσύνης 95% ίσο με 100%. Οι μέθοδοι προσδιορισμού για τις 12CYS και 12SER έδωσαν ανίχνευση 95,8% στο LOD, με ακριβές ανώτατο μονόπλευρο όριο εμπιστοσύνης 95% ίσο με 98,6%. Αυτό δείχνει ότι η τιμή LOD που είχε προσδιοριστεί προηγουμένως επαληθεύεται για όλες τις μεθόδους προσδιορισμού μεταλλάξεων κατά την αξιολόγηση κλινικών δειγμάτων FFPE NSCLC / κυτταρικών σειρών FFPE / δειγμάτων αντίστοιχων ασθενών (βλ. Πίνακα 34). Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

86 Πίνακας 34. Παρατηρηθέντα ποσοστά και ακριβή όρια εμπιστοσύνης για δείγματα που προσδιορίστηκαν ως θετικά για μετάλλαξη για το 2ο μέρος της μελέτης (κλινικά δείγματα FFPE NSCLC / κυτταρικές σειρές FFPE) Μετάλλαξη δείγματος Αριθμός έγκυρων σημείων δεδομένων Ποσοστό ανίχνευσης Ακριβές ανώτατο μονόπλευρο όριο εμπιστοσύνης 95% (%) 12ALA 96/ ASP 96/ ARG 96/ CYS 96/96 95,8 98,6 12SER 96/96 95,8 98,6 12VAL 96/ ASP 96/ Εισαγόμενο DNA και γραμμικότητα Επίδραση του επιπέδου εισαγόμενου DNA πάνω στις τιμές C T Όταν τα δείγματα σε διαφορετικά επίπεδα ολικού DNA περιέχουν την ίδια αναλογία μεταλλαγμένου DNA, αναμένεται οι τιμές μέτρησης C T να παραμένουν σταθερές. Σκοπός της μελέτης ήταν να καταδειχθεί ότι οι επιδόσεις του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR είναι σταθερές κατά το εύρος εισαγωγής ολικού DNA (C T του ορού ελέγχου) της μεθόδου. DNA που εκχυλίστηκε από 9 δείγματα FFPE (3 κλινικά δείγματα FFPE NSCLC, 4 κυτταρικές σειρές FFPE και 2 κλινικά δείγματα FFPE NSCLC άγριου τύπου) χρησιμοποιήθηκε για την προετοιμασία δεξαμενών DNA με το χαμηλότερο δυνατό C T αντίδρασης ορού ελέγχου (υψηλή ποσότητα εισαγόμενου DNA). Στη συνέχεια, τα πυκνά αποθεματικά διαλύματα DNA αραιώθηκαν ώστε να παραχθούν αποθεματικά διαλύματα DNA με C T αντίδρασης ορού ελέγχου που να περιλαμβάνει το εύρος εργασίας. Παρασκευάστηκαν συνολικά 5 αραιώσεις, συμπεριλαμβανομένου του αρχικού πυκνού αποθεματικού διαλύματος. Για κάθε αραίωση, παρασκευάστηκε υλικό επαρκές για τη εξέταση 6 αντιγράφων. Το εύρος αραίωσης και η μέση τιμή C T που ελήφθησαν από τα αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα 35. Για καθεμία από τις μεταλλάξεις που ανιχνεύτηκαν με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR, η τιμή C T μετρήθηκε σε διαφορετικά επίπεδα εισαγωγής ολικού DNA διευρύνοντας το εύρος εργασίας της μεθόδου πέρα από τα προκαθορισμένα κριτήρια αποδοχής για τη μελέτη. 86 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

87 Πίνακας 35. Επίδραση της εισαγωγής DNA πάνω στις τιμές C T καθ' όλο το εύρος τιμών C T της αντίδρασης ορού ελέγχου εισαγωγής δείγματα NSCLC FFPE Ανάλυση Αραίωση 1 ~2021 C T Αραίωση 2 ~2324 C T C T Αραίωση 3 ~2627 C T Αραίωση 4 ~2930 C T Αραίωση 5 ~3233 C T 12ALA 3,40 3,25 3,11 2,90 3,31 12ASP 3,63 2,92 2,55 2,46 * 12ARG 2,49 2,22 2,25 2,23 1,40 12VAL 1,34 1,23 1,18 1,13 0,97 12SER 5,34 4,50 4,30 3,92 * 12CYS 1,70 1,71 1,70 1,77 1,01 13ASP 6,24 5,36 5,14 4,87 * * Δεν ελήφθη C T για την αντίδραση μετάλλαξης λόγω της χαμηλής συγκέντρωσης του DNA, και συνεπώς δεν υπολογίστηκε C T. Οι συνολικές τιμές C T παρουσιάζουν συμφωνία σε ολόκληρο το εύρος εργασίας του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR για όλες τις μεθόδους προσδιορισμού, γεγονός που δείχνει ότι το επίπεδο εισαγωγής DNA δεν επηρεάζει την ορθότητα του προσδιορισμού των μεταλλάξεων των δειγμάτων. Γραμμικότητα/απόδοση της ενίσχυσης ως συνάρτηση της εισαγωγής DNA Καταδείχθηκε η γραμμικότητα και η απόδοση της ενίσχυσης της αντίδρασης PCR για κάθε αντίδραση μετάλλαξης, σε σχέση με την αντίδραση ορού ελέγχου, στο εύρος εργασίας του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Η απόδοση της ενίσχυσης υπολογίστηκε για καθεμία από τις αντιδράσεις προσδιορισμού μετάλλαξης και για την αντίδραση ορού ελέγχου, με τον τύπο [2(1/κλίση)] 1. Η απόδοση ενίσχυσης του ορού ελέγχου σε σύγκριση με την αντίδραση προσδιορισμού μετάλλαξης δείχνει ότι το CT, και άρα και ο προσδιορισμός της μετάλλαξης, είναι σταθερά σε ολόκληρο το εύρος εργασίας της μεθόδου (βλ. Πίνακα 36). Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

88 Πίνακας 36. Απόδοση ενίσχυσης στις αντιδράσεις ορού ελέγχου και προσδιορισμού μετάλλαξης Απόδοση ενίσχυσης Κλίση, ανώτατο αμφίπλευρο ΟΕ 95% Κλίση, κατώτατο αμφίπλευρο ΟΕ 95% Κλίση, τυπικό σφάλμα Υπολογισμένη κλίση Τυπικό σφάλμα σημείου τομής Σημείο τομής 0,94 0,11 0,19 0,02 0,15 0,04 22,74 1,01 0,93 1,20 0,07 1,06 0,16 24,11 CT ορού ελέγχου 12ALA CT 12ALA 0,94 0,05 0,09 0,01 0,07 0,03 21,92 1,04 0,96 0,96 0,01 0,98 0,02 24,44 CT ορού ελέγχου 12ASP CT 12ASP 0,96 0,08 0,17 0,02 0,13 0,05 21,73 0,96 0,95 1,00 0,01 0,97 0,03 22,69 CT ορού ελέγχου 12ARG CT 12ARG 0,98 0,08 0,14 0,01 0,11 0,04 21,73 1,00 0,99 1,03 0,01 1,01 0,03 22,77 CT ορού ελέγχου 12CYS CT 12CYS 0,97 0,02 0,10 0,02 0,06 0,05 23,03 1,09 0,94 0,99 0,01 0,97 0,03 25,34 CT ορού ελέγχου 12SER CT 0,92 0,01 Διαφορά στην απόδοση ενίσχυσης 0,069 0,093 0,001 0,019 0,07 0,02 0,03 0,04 22,13 0,91 0,88 1,01 0,03 0,95 0,08 23,34 CT ορού ελέγχου 12VAL CT 0,94 0,04 0,001 0,01 0,02 0,02 22,63 1,01 0,88 1,00 0,03 0,94 0,07 25,14 0,127 0,011 0,066 Δείγματα 12SER 12VAL CT ορού ελέγχου 13ASP CT 13ASP 88 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

89 Γραμμικότητα/απόδοση της ενίσχυσης ως συνάρτηση της ποσοστιαίας μετάλλαξης Σκοπός της μελέτης αυτής ήταν η αξιολόγηση της επίδρασης των διαδοχικών αραιώσεων δειγμάτων θετικών για μετάλλαξη σε υπόβαθρο DNA άγριου τύπου πάνω στην απόδοση ενίσχυσης. Εκχυλίστηκε DNA από 12 δείγματα FFPE: 3 κλινικά δείγματα FFPE NSCLC, 4 κυτταρικές σειρές FFPE και 4 κλινικά δείγματα FFPE NSCLC άγριου τύπου. Τα δείγματα αξιολογήθηκαν αρχικά βάσει ενδείξεων OD πριν από τη διεξαγωγή της αντίδρασης PCR με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Παρασκευάστηκαν αποθεματικά διαλύματα DNA σε τιμή C T αντίδρασης ορού ελέγχου ίση με 23 περίπου. Τα αποθεματικά διαλύματα αραιώθηκαν διαδοχικά σε αναλογία 1:1 με DNA άγριου τύπου, έτσι ώστε να διατηρηθεί σταθερό το ολικό DNA άγριου τύπου ενώ μεταβάλλεται το ποσοστό μεταλλαγμένου DNA στη μήτρα. Επομένως, όλες οι μήτρες που δημιουργήθηκαν είχαν την ίδια απόλυτη ποσότητα και συγκέντρωση DNA, αλλά διαφορετικές αναλογίες DNA άγριου τύπου προς μεταλλαγμένο DNA. Προετοιμάστηκαν δεξαμενές επαρκούς ποσότητας DNA για 6 αντίγραφα ανά μετάλλαξη. Υπολογίστηκαν δεδομένα C T και C T για κάθε μετάλλαξη σε καθεμία από τις 5 αραιώσεις. Οι τιμές C T για τις αντιδράσεις μετάλλαξης αποτυπώθηκαν γραφικά και υπολογίστηκαν οι τιμές απόδοσης. Οι τιμές C T για τις αντιδράσεις ορού ελέγχου ήταν σταθερές σε ολόκληρη τη σειρά αραιώσεων για κάθε μετάλλαξη. Εφαρμόστηκε ένα μοντέλο γραμμικής παλινδρόμησης με C T αντίδρασης αραίωσης έναντι αραίωσης εισαγωγής DNA log2. Αναφέρθηκε η κλίση και τα διαστήματα εμπιστοσύνης 95% (βλ. Πίνακα 37). Η μελέτη έδειξε ότι η αραίωση των μεταλλάξεων σε υπόβαθρο σταθερής συγκέντρωσης DNA άγριου τύπου οδήγησε σε απόδοση ενίσχυσης που δεν βρισκόταν σημαντικά εκτός των τιμών οι οποίες προσδιορίστηκαν στην παραπάνω μελέτη γραμμικότητας. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

90 Πίνακας 37. Απόδοση ενίσχυσης της μεθόδου προσδιορισμού μετάλλαξης Σημείο Μετάλλαξη τομής Τυπικό σφάλμα σημείου τομής Υπολογισμένη κλίση Κλίση, τυπικό σφάλμα Κλίση, κατώτατο αμφίπλευρο ΟΕ 95% Κλίση, ανώτατο αμφίπλευρο ΟΕ 95% 12ALA 24,11 0,16 1,06 0,07 1,20 0,93 12ASP 24,44 0,02 0,98 0,01 0,96 0,96 12ARG 22,69 0,03 0,97 0,01 1,00 0,95 12CYS 22,77 0,03 1,01 0,01 1,03 0,99 12SER 25,34 0,03 0,97 0,01 0,99 0,94 12VAL 23,34 0,08 0,95 0,03 1,01 0,88 13ASP 25,14 0,07 0,94 0,03 1,00 0,88 Απόδοση ενίσχυσης 1,01 1,04 0,96 1,00 1,09 0,91 1,01 Παρεμβαλλόμενες ουσίες Σκοπός της μελέτης αυτής ήταν η αξιολόγηση της επίδρασης ορισμένων δυνητικά παρεμβαλλόμενων ουσιών από το κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue πάνω στις επιδόσεις του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Η επίδραση της κάθε ουσίας πάνω στις τιμές C T και στην κατάσταση μετάλλαξης των εξεταζόμενων δειγμάτων αναλύθηκε μέσω πειραμάτων προσθήκης (spiking) με τρεις συγκεντρώσεις της δυνητικά παρεμβαλλόμενης ουσίας. 90 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

91 Οι δυνητικά παρεμβαλλόμενες ουσίες που χρησιμοποιούνται στη διαδικασία εκχύλισης του DNA και δοκιμάστηκαν ήταν: ρυθμιστικό διάλυμα AL, ρυθμιστικό διάλυμα ATL, αιθανόλη, κηρός παραφίνης, πρωτεϊνάση K, ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης AW1, ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης AW2 και ξυλόλιο. Το τελικό ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης από το κιτ, το ρυθμιστικό διάλυμα ATE, εξετάστηκε επίσης ως ορός ελέγχου τυφλού. Στη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν 8 κυτταρικές σειρές FFPE που αντιπροσώπευαν καθεμία από τις 7 μεταλλάξεις (3x LOD) και ένα δείγμα άγριου τύπου. Όλα τα δείγματα εξετάστηκαν με επίπεδο εισαγόμενου DNA τέτοιο ώστε να ληφθεί τιμή CT αντίδρασης ορού ελέγχου ίση με 27 περίπου (που αντιστοιχεί σε ένα μέσο επίπεδο του εύρους εργασίας). Όλες οι κυτταρικές σειρές FFPE εξετάστηκαν με καθεμία από τις δυνητικά παρεμβαλλόμενες ουσίες στην υπολογιζόμενη μέγιστη αναμενόμενη συγκέντρωση επιμόλυνσης (1x). Εξετάστηκαν επίσης δύο ακόμη επίπεδα της δυνητικά παρεμβαλλόμενης ουσίας, που αντιστοιχούσαν στο 10x και στο 100x της μέγιστης αναμενόμενης επιμόλυνσης. Η συγκέντρωση των δυνητικά παρεμβαλλόμενων ουσιών σε κάθε επίπεδο που εξετάστηκε φαίνεται στον Πίνακα 38. Πίνακας 38. Συγκέντρωση δυνητικά παρεμβαλλόμενων ουσιών στον τελικό όγκο έκλουσης, στο 1x, 10x και 100x της ανώτατης αναμενόμενης συγκέντρωσης Παρεμβαλλόμενη ουσία Υπολογιζόμενη μέγιστη ποσότητα σε 120 µl εκλούσματος (µl) [1x] [10x] [100x] Ρυθμιστικό διάλυμα AL 2,00 x ,02 0,2 Ρυθμιστικό διάλυμα ATL 1,80 x ,80 x ,18 Αιθανόλη 1,00 x ,01 0,1 Κηρός παραφίνης 1,00 x ,00 x ,01 Πρωτεϊνάση K 2,00 x ,00 x ,02 Ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης AW1 Ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης AW2 0,05 0,5 5 0, Ξυλόλιο 1,00 x ,00 x ,01 Τα μεταλλαγμένα δείγματα 3x LOD εξετάστηκαν σε 8 αντίγραφα και τα δείγματα άγριου τύπου εξετάστηκαν σε 4 αντίγραφα. Κάθε μετάλλαξη εξετάστηκε μόνο με το αντίστοιχο μίγμα αντίδρασης για παράδειγμα, τα δείγματα 12ALA εξετάστηκαν με το μίγμα αντίδρασης 12ALA. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

92 Η μελέτη έδειξε ότι οι ουσίες του κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue που αναγνωρίστηκαν ως δυνητικά παρεμβαλλόμενες δεν επηρεάζουν δυσμενώς τις επιδόσεις μιας μεθόδου προσδιορισμού σε επίπεδο παρεμβαλλόμενης ουσίας 1x. Ο σωστός προσδιορισμός δόθηκε πάντοτε, για κάθε συνδυασμό δείγματος/ουσίας. Αυτό σημαίνει ότι τα μεταλλαγμένα δείγματα 3x LOD έδωσαν "Mutation Detected" (Ανιχνεύτηκε μετάλλαξη), όπως αναμενόταν, και τα δείγματα άγριου τύπου έδωσαν "No Mutation Detected" (Δεν ανιχνεύτηκε μετάλλαξη), όπως αναμενόταν. Η παρουσία παρεμβαλλόμενης ουσίας σε συγκέντρωση 1x δεν προκάλεσε στατιστικώς σημαντική επίδραση σε 58/64 συνθήκες δείγματος που εξετάστηκαν. Στις 6 περιπτώσεις που σημειώθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά, η παρατηρηθείσα διαφορά ήταν μικρότερη από 2x SD για τη μέθοδο, όπως αυτή υπολογίστηκε κατά τη μελέτη επαναληψιμότητας και αναπαραγωγιμότητας. Η μελέτη αυτή έδειξε επίσης ότι το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR μπορεί να ανεχθεί υψηλότερα επίπεδα των εξεταζόμενων ουσιών. Η σωστή μετάλλαξη προσδιορίστηκε όταν η παρεμβαλλόμενη ουσία απαντούσε σε συγκέντρωση 10x μεγαλύτερη από τη μέγιστη αναμενόμενη. Επιπλέον, όταν η παρεμβαλλόμενη ουσία απαντούσε σε συγκέντρωση 100x μεγαλύτερη από τη μέγιστη αναμενόμενη συγκέντρωση επιμόλυνσης, προσδιορίστηκε και πάλι η σωστή μετάλλαξη. Το ρυθμιστικό διάλυμα AW2 σε συγκέντρωση 100x οδήγησε σε αδυναμία παραγωγής τιμών C T στα κανάλια HEX ή FAM από τη μέθοδο και, σε αυτές τις περιπτώσεις, οι αναλύσεις ορθά χαρακτηρίστηκαν "Invalid" (άκυρες). Αποκλειστικότητα/διασταυρούμενη αντιδραστικότητα Το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR αποτελείται από 8 ξεχωριστές αντιδράσεις. Μία μεμονωμένη αντίδραση ορού ελέγχου που ανιχνεύει τη μη πολυμορφική περιοχή του γονιδίου KRAS και επτά ειδικές για μετάλλαξη αντιδράσεις. Καμία αντίδραση δεν μετρά συγκεκριμένα την ακολουθία KRAS άγριου τύπου στο κωδικόνιο 12 ή 13. Το αποτέλεσμα KRAS "No Mutation Detected" (Δεν ανιχνεύτηκε μετάλλαξη) (δηλ. άγριου τύπου) προσδιορίζεται από την απουσία και των 7 μεταλλάξεων που οδηγούν σε θετικό για μετάλλαξη αποτέλεσμα. Επομένως, προκειμένου να διασφαλιστεί ότι δεν θα ληφθούν ψευδώς θετικά αποτελέσματα, είναι απαραίτητο να καταδειχθεί ο βαθμός μη ειδικής ενίσχυσης ή η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα που παρατηρείται σε κάθε αντίδραση με περίσσειες ποσότητες DNA άγριου τύπου KRAS. Ομοίως, αξιολογήθηκε η μη ειδική ενίσχυση των μεταλλάξεων KRAS που δεν προορίζονται για ανίχνευση από τη μέθοδο. Αυτό αποδεικνύει ότι η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα μεταξύ των αντιδράσεων ανίχνευσης μεταλλάξεων δεν οδηγεί σε λανθασμένους προσδιορισμούς μετάλλαξης σε περίπτωση που υπάρχει περίσσεια ποσότητα μεταλλαγμένου DNA. Δείγματα παρήχθησαν από κυτταρικές σειρές με σκοπό την αξιολόγηση της διασταυρούμενης αντιδραστικότητας των μεταλλάξεων και κλινικά δείγματα 92 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

93 εκτομής χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της διασταυρούμενης αντιδραστικότητας με DNA άγριου τύπου. Μη ειδική ενίσχυση/διασταυρούμενη αντιδραστικότητα (KRAS DNA άγριου τύπου) Σκοπός της μελέτης αυτής ήταν να αξιολογηθεί το επίπεδο ενίσχυσης υποβάθρου σε δείγματα άγριου τύπου που περιέχουν υψηλές συγκεντρώσεις εισαγόμενου DNA (C T αντίδρασης ορού ελέγχου ίσο με 22,0023,00 περίπου) εντός του εύρους εργασίας του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR (C T αντίδρασης ορού ελέγχου ίσο με 21,9232,00). Συνολικά 60 έγκυρα αντίγραφα αναμεμειγμένων κλινικών δειγμάτων FFPE NSCLC άγριου τύπου από χειρουργική εκτομή χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της ενίσχυσης υποβάθρου σε περιπτώσεις υψηλών επιπέδων εισαγόμενου DNA (C T αντίδρασης ορού ελέγχου ίσο με 22,0023,00 περίπου). Και τα 60 αντίγραφα δειγμάτων άγριου τύπου εξετάστηκαν με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR και παρουσίασαν τιμές C T που υπερέβαιναν τις οριακές τιμές αποκοπής της μεθόδου. Και τα 60 αντίγραφα δειγμάτων NSCLC άγριου τύπου προσδιορίστηκαν ως άγριου τύπου από το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Συνεπώς ικανοποιείται το κριτήριο αποδοχής για τη μελέτη αυτή καθώς τουλάχιστον 95% ( 57 από 60) αντίγραφα άγριου τύπου προσδιορίστηκαν σωστά. Μη ειδική ενίσχυση/διασταυρούμενη αντιδραστικότητα/αποκλειστικότητα: KRAS DNA θετικό για μετάλλαξη Επτά δείγματα κυτταρικών σειρών FFPE NSCLC, ένα για καθεμία από τις 7 μεταλλάξεις που ανιχνεύονται από το κιτ KRAS, χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή. DNA από τα δείγματα κυτταρικών σειρών FFPE αραιώθηκε μέχρι μια τιμή C T αντίδρασης ορού ελέγχου ίση με 23,00 περίπου. Από τις αραιώσεις αυτές παρασκευάστηκαν 6 αντίγραφα ανά μετάλλαξη. Εξετάστηκε ένα αντίγραφο ανά μεταλλαγμένο δείγμα σε κάθε ανάλυση PCR. Κάθε δείγμα εξετάστηκε και με τα 8 μίγματα αντίδρασης στο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Δεδομένα από τη μελέτη αυτή παρουσιάζονται στον Πίνακα 39 και δείχνουν ότι υπάρχει διασταυρούμενη αντιδραστικότητα μεταξύ των αντιδράσεων μετάλλαξης σε αρκετούς συνδυασμούς. Η χαμηλότερη μέση C T για διασταυρούμενη αντίδραση παρατηρήθηκε με την αντίδραση μετάλλαξης 12SER σε DNA θετικό για 12ALA, με διαφορά τιμής ίση με 2,26 C T. Σε όλες τις εξεταζόμενες περιπτώσεις προσδιορίστηκε η σωστή μετάλλαξη με την αντίστοιχη αντίδραση μετάλλαξης (δηλαδή η χαμηλότερη τιμή C T ήταν η σωστά προσδιορισμένη μετάλλαξη). Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

94 Πίνακας 39. Διασταυρούμενη αντιδραστικότητα ( C T ) μεταξύ αντιδράσεων μετάλλαξης με χρήση DNA κυτταρικών σειρών FFPE Μεταλλαγμένο DNA Οριακή τιμή αποκοπής C T μεθόδου 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 12ALA 8 1,31* 12,8 Δ/Ε 5,01 2,26 5,57 12,65 12ASP 6,6 12,61 1,66* Δ/Ε Δ/Ε Δ/Ε 10,3 12,6 12ARG 8 12,98 11,08 0,81* 11,24 Δ/Ε 12,66 12,62 12CYS 8 Δ/Ε 12,22 7,84 0,56* Δ/Ε 13,06 11,84 12SER 8 Δ/Ε 12,87 13,21 Δ/Ε 1,93* 13,25 12,93 12VAL 7,5 5,93 14,29 Δ/Ε Δ/Ε 13,14 0,45* 12,39 13ASP 7,5 Δ/Ε Δ/Ε Δ/Ε Δ/Ε Δ/Ε Δ/Ε 2,02* * Τιμές C T από αντίστοιχες αντιδράσεις. Δ/Ε: Καμία διασταυρούμενη αντίδραση. C T από αντιδράσεις με διασταυρούμενη αντίδραση κάτω από την οριακή τιμή. Επαναληψιμότητα και αναπαραγωγιμότητα Σκοποί της μελέτης αυτής ήταν να καταδειχθεί η ακρίβεια του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR, εντός του ίδιου εργαστηρίου (επαναληψιμότητα) και μεταξύ εργαστηρίων (αναπαραγωγιμότητα). Η σχεδίαση της μελέτης βασίστηκε σε δύο έγγραφα του CLSI, τα EP12-A2 (28) και EP05-A2 (29). Περιγράφεται τόσο η ορθότητα των αποτελεσμάτων προσδιορισμού μεταλλάξεων όσο και η ακρίβεια των τιμών C T (διαφορά τιμών C T μεταξύ αντίδρασης μετάλλαξης και αντίδρασης ορού ελέγχου). Για καθεμία από τις 7 μεταλλάξεις KRAS NSCLC χρησιμοποιήθηκαν 3 δείγματα που αντιπροσώπευαν καθεμία από τις 3 μεθόδους δειγματοληψίας (εκτομή, CNB και FNA). Άλλα 6 κλινικά δείγματα άγριου τύπου, 2 για καθεμία από τις 3 μεθόδους δειγματοληψίας, χρησιμοποιήθηκαν για να παραχθούν δεξαμενές DNA άγριου τύπου για αραίωση. Πραγματοποιήθηκαν πολλαπλές εκχυλίσεις για δείγματα άγριου τύπου και για καθένα από τα 21 δείγματα μετάλλαξης προκειμένου να παραχθούν επαρκείς ποσότητες DNA. Τα διάφορα εκχυλίσματα για καθένα από τα δείγματα μετάλλαξης αναμείχθηκαν προκειμένου να δημιουργηθεί μία δεξαμενή δείγματος ανά μετάλλαξη. Κάθε δεξαμενή δείγματος μετάλλαξης αραιώθηκε προκειμένου να παραχθούν δείγματα εξέτασης με επίπεδα μετάλλαξης 1x LOD και 3x LOD. Προκειμένου να διασφαλιστούν σταθερά επίπεδα εισαγόμενου DNA δείγματος, το μεταλλαγμένο DNA αραιώθηκε με DNA άγριου τύπου από την αντίστοιχη μέθοδο δειγματοληψίας και κατόπιν κανονικοποιήθηκε στην ίδια τιμή C T αντίδρασης ορού ελέγχου. 94 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

95 Τα εργαστήρια που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή βρίσκονταν σε 3 διαφορετικά κέντρα. Οι εργαστηριακές συνθήκες σε κάθε κέντρο μεταβάλλονταν μέσω της χρήσης 2 οργάνων Rotor-Gene Q, 2 χειριστών, 2 παρτίδων του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR και 2 σειρών ανάλυσης ανά ημέρα (ανά χειριστή) επί 16 μη διαδοχικές ημέρες. Οι εκτιμήσεις ακρίβειας αναπαραγωγιμότητας και επαναληψιμότητας για όλες τις μεταλλάξεις δίνονται στους Πίνακες 40 και 41. Υπολογίστηκε επίσης το ποσοστό ορθών προσδιορισμών ανά μετάλλαξη. Αυτά τα αποτελέσματα, μαζί με τα αμφίπλευρα διαστήματα εμπιστοσύνης (ΔΕ) 90%, δίνονται στον Πίνακα 42. Πίνακας 40. Εκτιμήσεις ακριβείας για την αναπαραγωγιμότητα (%CV) Ανάλυση %CV για C T %CV για C T μετάλλαξης %CV για C T ορού ελέγχου 3x LOD 1x LOD 3x LOD 1x LOD 3x LOD 1x LOD 12ALA 5,36 6,55 0,81 1,23 0,77 0,77 12ARG 9,51 7,31 0,94 1,07 0,68 0,86 12ASP 11,6 9,69 2,08 2,01 1,52 1,49 12CYS 7,21 5,6 0,9 0,97 0,74 0,8 12SER 9,87 7,77 1,2 1,19 0,74 0,76 12VAL 8,99 6,22 0,95 0,97 0,95 0,78 13ASP 10,21 8,22 1,31 1,18 0,83 0,8 Πίνακας 41. Εκτιμήσεις ακριβείας για την επαναληψιμότητα (%CV) Ανάλυση %CV για C T %CV για C T μετάλλαξης %CV για C T ορού ελέγχου 3x LOD 1x LOD 3x LOD 1x LOD 3x LOD 1x LOD 12ALA 4,88 5,43 0,71 1,04 0,73 0,64 12ARG 10,2 7,71 0,9 0,99 0,67 1,04 12ASP 12,9 9,88 2,13 2,08 1,47 1,51 12CYS 7,68 5,97 0,89 0,96 0,82 0,72 12SER 9,92 8,49 1,08 1,23 0,69 0,81 12VAL 7,73 6,08 0,88 0,99 0,76 0,77 13ASP 10,87 7,43 1,47 1,02 0,93 0,71 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

96 Πίνακας 42. Σωστοί προσδιορισμοί για 1x LOD, 3x LOD και άγριου τύπου (wild-type) Επίπεδο μετάλλαξης Ανάλυση Σωστοί προσδιορισμοί Ποσοστό (%) σωστών προσδιορισμών Κατώτατο αμφίπλευρο ΔΕ 90% 12ALA 288/ ,97 12ARG 288/ ,97 12ASP 288/ ,97 1x LOD 12CYS 284/ ,85 12SER 284/ ,85 12VAL 288/ ,97 13ASP 288/ ,97 12ALA 288/ ,97 12ARG 288/ ,97 12ASP 288/ ,97 3x LOD 12CYS 284/288 98,61 96,85 12SER 284/288 98,61 96,85 12VAL 288/ ,97 13ASP 287/ ,96 Άγριου τύπου 285/ ,95 Σε όλες τις αναλύσεις και τους συνδυασμούς δειγμάτων, τουλάχιστον τα 284 στα 288 αντίγραφα έδωσαν σωστό προσδιορισμό μετάλλαξης. Το συνολικό ποσοστό ορθών προσδιορισμών, για όλες τις μεθόδους συγκεντρωτικά, στην ομάδα 1x LOD ήταν 100% (2008/2008). Το συνολικό ποσοστό ορθών προσδιορισμών, για όλες τις μεθόδους συγκεντρωτικά, στην ομάδα 3x LOD ήταν 99,6% (2007/2015). Το συνολικό ποσοστό ορθών προσδιορισμών για τα δείγματα χωρίς ανιχνευόμενη μετάλλαξη (άγριου τύπου) ήταν 100% (285/285) (βλ. Πίνακα 42). Διαφοροποίηση χειρισμού δειγμάτων Σκοπός της μελέτης αυτής ήταν η αξιολόγηση της επίδρασης της μεταβλητότητας στον χειρισμό των δειγμάτων, και συγκεκριμένα στην εκχύλιση του DNA, πάνω στο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Αυτή η μελέτη συμπληρώνει τη μελέτη επαναληψιμότητας και αναπαραγωγιμότητας, αναλύοντας τη μεταβλητότητα στον χειρισμό δειγμάτων κατά τη μελέτη των 96 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

97 ίδιων τομών κλινικών δειγμάτων FFPE NSCLC και κυτταρικών σειρών FFPE σε 3 κέντρα πριν από εξέταση με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Στη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν 13 κλινικά δείγματα NSCLC (3 x 12ASP, 3 x 12CYS, 4 x 12VAL και 3 άγριου τύπου) και 4 δείγματα κυτταρικών σειρών FFPE (12ALA, 12ARG, 12SER και 13ASP). Τα 13 κλινικά δείγματα NSCLC περιλάμβαναν 3 διαφορετικούς τύπους κλινικών δειγμάτων KRAS NSCLC που διέφεραν ως προς τη μέθοδο λήψης: χειρουργική εκτομή, FNA ή CNB. Κάθε δείγμα μετάλλαξης και άγριου τύπου αντιπροσωπευόταν από ένα δείγμα εκτομής, FNA και CNB. Ο αριθμός των διαθέσιμων κλινικών δειγμάτων ήταν ανεπαρκής και συνεπώς χρησιμοποιήθηκε κλινικός ιστός FFPE NSCLC από αντίστοιχους ασθενείς για όλα τα δείγματα CNB και FNA. Κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν για να αντιπροσωπευτούν οι σπάνιες μεταλλάξεις, για τις οποίες δεν υπήρχε διαθέσιμος κλινικός ιστός NSCLC. Παρασκευάστηκαν συνολικά 60 τομές FFPE ανά τύπο μετάλλαξης, ώστε να προκύψουν 8 σύνολα με 60 τομές FFPE. Κάθε σύνολο κλινικών δειγμάτων περιλάμβανε 20 FNA, 20 εκτομές και 20 CNB. Για τις σπανιότερες μεταλλάξεις παρασκευάστηκαν 60 τομές κυτταρικών σειρών FFPE. Διαδοχικές τομές FFPE για κάθε δείγμα τοποθετήθηκαν σε 10 σύνολα των 6. Κάθε σύνολο αποτελούνταν από μία ομάδα 6 διαδοχικών τομών FFPE. Δύο τομές FFPE από κάθε σύνολο των 6 τοποθετήθηκαν τυχαία σε μια ομάδα ώστε να προκύψουν 3 ομάδες. Οι 3 ομάδες των 20 τομών FFPE κατανεμήθηκαν κατόπιν τυχαία στα 3 κέντρα. Σε καθένα από τα 3 κέντρα πραγματοποιήθηκε εκχύλιση του DNA από μια ομάδα των 20 τομών FFPE (δηλαδή 10 ζεύγη) ανά δείγμα μετάλλαξης και άγριου τύπου. Η κατάσταση μετάλλαξης των κλινικών δειγμάτων ήταν γνωστή, καθώς τα δείγματα είχαν εξεταστεί προηγουμένως με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR και με αμφίδρομη αλληλούχηση κατά Sanger. Όλα τα δείγματα ήταν τυφλά, καθώς η κατάσταση μετάλλαξης δεν ήταν γνωστή στους χειριστές του κάθε κέντρου. Για να θεωρηθούν αποδεκτά τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής, η προσδιοριζόμενη μετάλλαξη σε κάθε κέντρο έπρεπε να είναι ίδια για κάθε εξεταζόμενο δείγμα. Αφού εξετάστηκαν όλα τα παρασκευάσματα δειγμάτων σε 3 χωριστά κέντρα εξέτασης με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR, καθεμία από τις 7 μεταλλάξεις και το δείγμα άγριου τύπου ταυτοποιήθηκαν ως προς τη σωστή προσδιοριζόμενη μετάλλαξη. Η συνολική ορθότητα προσδιορισμού για καθεμία από τις 7 μεταλλάξεις και το δείγμα άγριου τύπου ήταν 100%, γεγονός που δηλώνει συνέπεια μεταξύ κέντρων ως προς την εκχύλιση του DNA και την ανίχνευση μεταλλάξεων με χρήση του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR (Πίνακας 43 και Πίνακας 44). Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

98 Πίνακας 43. Μέσες τιμές C T και προσδιοριζόμενες μεταλλάξεις που αναφέρθηκαν από 3 κέντρα εξέτασης με χρήση των ίδιων δειγμάτων και κιτ Μετάλλαξη Πηγή δείγματος Ακρίβεια Διάστημα εμπιστοσύνης 95% C T Κατώτατο αμφίπλευρο Ανώτατο αμφίπλευρο Μέση τιμή %CV 12ALA Κυτταρική σειρά 0,22 0,17 0,29 1,36 15,76 FNA 0,39 0,27 0,72 3,09 12,679 12ASP CNB 0,39 0,27 0,75 2,24 17,49 Εκτομή 0,17 0,11 0,30 4,26 3,86 12ARG Κυτταρική σειρά 0,20 0,16 0,27 0,81 24,32 CNB 0,30 0,20 0,54 3,87 7,63 12CYS FNA 0,11 0,08 0,21 1,71 6,57 Εκτομή 0,17 0,12 0,31 2,71 6,35 12SER Κυτταρική σειρά 0,55 0,44 0,75 2,10 26,24 CNB 0,24 0,17 0,44 2,98 8,04 12VAL FNA 0,37 0,26 0,68 3,53 10,58 Εκτομή 0,2 0,18 0,47 1,93 13,21 13ASP Κυτταρική σειρά 0,23 0,18 0,31 2,24 10,32 Πίνακας 44. Προσδιοριζόμενες μεταλλάξεις ανά μετάλλαξη σε 3 κέντρα, συνδυασμένες Ανάλυση Σωστοί προσδιορισμοί Ποσοστό (%) σωστών προσδιορισμών Κατώτατο αμφίπλευρο ΔΕ 90% 12ALA 29/ ,19 12ARG 29/ ,19 12ASP 30/ ,5 12CYS 30/ ,5 12SER 29/ ,19 12VAL 30/ ,5 13ASP 29/ ,19 Άγριου τύπου 29/ ,19 98 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

99 Ισοδυναμία μεθόδων δειγματοληψίας Σκοπός της μελέτης αυτής ήταν να διαπιστωθεί κατά πόσον ο προσδιορισμός μετάλλαξης για τα δείγματα NSCLC με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR επηρεάζεται από τη μέθοδο δειγματοληψίας. Οι 3 μέθοδοι δειγματοληψίας που εξετάστηκαν στη μελέτη αυτή ήταν η εκτομή, η βιοψία με κόπτουσα βελόνη (CNB) και η αναρρόφηση με λεπτή βελόνη (FNA). Σε αυτή τη μελέτη, δείγματα CNB και FNA από αντίστοιχους ασθενείς παρήχθησαν από δείγματα όγκων που είχαν ληφθεί με χειρουργική εκτομή προκειμένου να επιτευχθεί δειγματοληψία από τον ίδιο όγκο με τις 3 διαφορετικές μεθόδους. Για τη μελέτη αυτή διατίθεντο συνολικά 169 δείγματα όγκων από εκτομή, με καθένα από αυτά να δίνει ένα δείγμα εκτομής, ένα δείγμα CNB και ένα δείγμα FNA, δηλαδή συνολικά 169 δείγματα εκτομής, 169 CNB και 169 FNA. Κάθε δείγμα εκχυλίστηκε και εξετάστηκε με τη μέθοδο ορού ελέγχου KRAS. Κάθε δείγμα που έδωσε έγκυρο αποτέλεσμα (169 δείγματα εκτομής, 169 CNB και 164 FNA) εξετάστηκε και με τις 8 μεθόδους προσδιορισμού KRAS. Επιπλέον, για καθένα από τα κλινικά δείγματα FFPE NSCLC, το εκχυλισμένο DNA που χρησιμοποιήθηκε στην ανάλυση με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR αξιολογήθηκε επίσης μέσω αμφίδρομης αλληλούχησης κατά Sanger προκειμένου να προσδιοριστεί ο βαθμός συμφωνίας μεταξύ του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR και της αμφίδρομης αλληλούχησης κατά Sanger. Η συνολική συμφωνία κατά ζεύγη μεταξύ των τύπων δειγματοληψίας παρουσιάζεται στον Πίνακα 45. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής δείχνουν ότι το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR παρέχει ισοδύναμα αποτέλεσμα με τις 3 μεθόδους δειγματοληψίας που μελετήθηκαν, όπως φαίνεται από τα επίπεδα της κατά ζεύγη συνολικής ποσοστιαίας συμφωνίας: CNB έναντι FNA 97,52 (όρια εμπιστοσύνης 94,4199,15) CNB έναντι εκτομής 96,39 (όρια εμπιστοσύνης 92,9998,41) FNA έναντι εκτομής 98,76 (όρια εμπιστοσύνης 96,14-99,78) Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

100 Πίνακας 45. Σύγκριση μεθόδων δειγματοληψίας και προσδιορισμών μετάλλαξης Ανάλυση Μέθοδος λήψης Συχνότητες Ποσοστό συμφωνίας CNB έναντι FNA 161/ ,16 Ακριβές διωνυμικό κατώτατο αμφίπλευρο ΔΕ 90% 12ALA CNB έναντι RES* 166/ ,21 FNA έναντι RES 161/ ,16 CNB έναντι FNA 160/161 99,38 97,09 12ARG CNB έναντι RES 165/166 99,4 97,17 FNA έναντι RES 161/ ,16 CNB έναντι FNA 160/161 99,38 97,09 12ASP CNB έναντι RES 165/166 99,4 97,17 FNA έναντι RES 161/ ,16 CNB έναντι FNA 157/161 97,52 94,41 12CYS CNB έναντι RES 160/166 96,39 92,99 FNA έναντι RES 159/161 98,76 96,14 CNB έναντι FNA 161/ ,16 12SER CNB έναντι RES 166/ ,21 FNA έναντι RES 161/ ,16 CNB έναντι FNA 161/ ,16 12VAL 13ASP CNB έναντι RES 166/ ,21 FNA έναντι RES 161/ ,16 CNB έναντι FNA 161/ ,16 CNB έναντι RES 166/ ,21 FNA έναντι RES 161/ ,16 * RES: εκτομή. 100 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

101 Σε όλους τους τύπους δειγμάτων, το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR προσδιορίζει σωστά την κατάσταση μετάλλαξης σε σύγκριση με την αμφίδρομη αλληλούχηση κατά Sanger, με επίπεδο συνολικής ποσοστιαίας συμφωνίας ίσο με 96,96% (Πίνακας 46). Πίνακας 46. Συμφωνία ως προς την κατάσταση μετάλλαξης μεταξύ του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR και της αμφίδρομης αλληλούχησης κατά Sanger για τον NSCLC Βαθμός συμφωνίας Συνολική ποσοστιαία συμφωνία Θετική ποσοστιαία συμφωνία Αρνητική ποσοστιαία συμφωνία Συχνότητα Ποσοστό συμφωνίας Όριο εμπιστοσύνης 90% Ακριβές διωνυμικό κατώτατο αμφίπλευρο 478/493 96,96 95,35 98,12 87/ , /406 96,31 94,37 97,71 Ακριβές διωνυμικό ανώτατο αμφίπλευρο Εναλλαξιμότητα παρτίδων Σκοπός της μελέτης αυτής ήταν να επιβεβαιωθεί πως η χρήση διαφορετικών παρτίδων του κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue και του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR δεν επηρεάζει την κατάσταση μετάλλαξης ενός εξεταζόμενου δείγματος (δηλαδή να αποδειχθεί η εναλλαξιμότητα των παρτίδων με βάση τη συνέπεια στον προσδιορισμό μεταλλάξεων με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR). Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 24 δείγματα NSCLC, 3 για καθεμία από τις 7 μεταλλάξεις που ανιχνεύονται με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR συν 3 δείγματα άγριου τύπου. Τα 24 δείγματα NSCLC περιλάμβαναν 6 κλινικά δείγματα FFPE NSCLC, 7 δείγματα FFPE από αντίστοιχους ασθενείς και 11 κυτταρικές σειρές FFPE. Για καθένα από τα δείγματα (μεταλλαγμένα και άγριου τύπου), 12 τομές FFPE κατανεμήθηκαν τυχαία σε 3 ομάδες. Τα δείγματα κάθε ομάδας τομών FFPE υποβλήθηκαν σε εκχύλιση με χρήση κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue διαφορετικής παρτίδας. Συνολικά παρασκευάστηκαν 6 χωριστά εκχυλίσματα DNA για καθένα από τα 24 δείγματα (2 εκχυλίσματα ανά παρτίδα x 3 παρτίδες του κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue). Δείγματα FFPE NSCLC θετικά για μετάλλαξη εξετάστηκαν κατόπιν με το μίγμα αντίδρασης ορού ελέγχου και με το αντίστοιχο μίγμα αντίδρασης μετάλλαξης Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

102 από 3 διαφορετικές παρτίδες του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Όλα τα εκχυλίσματα DNA εξετάστηκαν με καθεμία από τις 3 παρτίδες του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR εντός της ίδιας σειράς αναλύσεων PCR στο όργανο Rotor-Gene Q. Τα δείγματα NSCLC άγριου τύπου εξετάστηκαν και με τα 8 μίγματα αντίδρασης, με χρήση 3 διαφορετικών παρτίδων του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR στο όργανο Rotor-Gene Q. Όταν συλλέχθηκαν οι τιμές C T και οι προσδιορισμένες μεταλλάξεις, ελήφθη ο σωστός προσδιορισμός μετάλλαξης για όλα τα δείγματα. Η χρήση διαφορετικών παρτίδων του κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue και του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR δεν επηρεάζει τον σωστό προσδιορισμό της κατάστασης μετάλλαξης KRAS. Βιβλιογραφία 1. Hilger, R.A., Scheulen, M.E., Strumberg, D. (2002) The Ras-Raf-MEK- ERK pathway in the treatment of cancer. Onkologie 25, Bachireddy, P., Bendapudi, P.K., Felsher, D.W. (2005) Getting at MYC through RAS. Clin Cancer Res. 11, Han, S.-W. et al. (2006) Optimization of patient selection for gefitinib in non-small cell lung cancer by combined analysis of epidermal growth factor receptor mutation, K-ras mutation, and AKT phosphorylation. Clin Cancer Res. 12, Pao, W. et al. (2005) KRAS mutations and primary resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib. PloS Medicine 2, Lievre, A. et al. (2006) KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66, Benvenuti, S. et al. (2007) Oncogenic activation of the RAS/RAF signaling pathway impairs the response of metastatic colorectal cancers to anti-epidermal growth factor receptor antibody therapies. Cancer Res. 67, De Roock, W. et al. (2007) KRAS mutations preclude tumor shrinkage of colorectal cancers treated with cetuximab. J Clin Oncol. 25, Finocchiaro, G. et al. (2007) EGFR, HER2, and Kras as predictive factors for cetuximab sensitivity in colorectal cancer. J Clin Oncol. 25, Di Fiore, F. et al. (2007) Clinical relevance of KRAS mutation detection in metastatic colorectal cancer treated by cetuximab plus chemotherapy. British Journal of Cancer 96, Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

103 10. Khambata-Ford, S. et al. (2007) Expression of Epiregulin and Amphiregulin and K-ras mutation status predict disease control in metastatic colorectal cancer patients treated with cetuximab. J Clin Oncol. 25, Lièvre A. et al. (2006) KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66, Lièvre A. et al. (2008) KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab. J Clin Oncol. 26, Bokemeyer, C. et al., (2008) K-RAS status and efficacy of first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mcrc) with FOLFOX with or without cetuximab: The OPUS experience. J Clin Oncol. 26, (May 20 suppl; abstr 4000). 14. Van Cutsem, E. et al. (2008) K-RAS status and efficacy in the first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mcrc) treated with FOLFIRI with or without cetuximab: The CRYSTAL experience. J Clin Oncol. 26, (May 20 suppl; abstr 2). 15. Tejpar, S. et al. (2008) Relationship of efficacy with K-RAS status (wild type versus mutant) in patients with irinotecan-refractory metastatic colorectal cancer (mcrc), treated with irinotecan (q2w) and escalating doses of cetuximab (q1w): The EVEREST experience (preliminary data). J Clin Oncol. 26, (May 20 suppl; abstr 4001). 16. Karapetis C. et al. (2008) KRAS mutation status is a predictive biomarker for cetuximab benefit in the treatment of advanced colorectal cancer. Results from NCIC CTG CO.17: A phase III trial of cetuximab versus best supportive care. 10th World Congress on Gastrointestinal Cancer: Abstract o-037. Presented June 27, Amado, R.G. (2008) Wild-type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol. 26, De Roock, W. et al. (2007) KRAS wild-type state predicts survival and is associated to early radiological response in metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. Ann. Oncol. Nov Thelwell, N. et al. (2000) Mode of action and application of Scorpion primers to mutation detection. Nucleic Acids Res. 28, Newton, C.R. et al. (1989) Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res. 17, Whitcombe, D. et al. (1999) Detection of PCR products using selfprobing amplicons and fluorescence. Nature Biotech 17, Catalog of Somatic Mutations in Cancer ( Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

104 23. Reckamp, K.L. et al. (2014) A phase 2 trial of dacomitinib (PF ), an oral, irreversible pan-her (human epidermal growth factor receptor) inhibitor, in patients with advanced non-small cell lung cancer after failure of prior chemotherapy and erlotinib. Cancer Feb Chaft, J.E. et al. (2013) Phase II trial of neoadjuvant bevacizumab plus chemotherapy and adjuvant bevacizumab in patients with resectable nonsquamous non-small-cell lung cancers. J. Thorac. Oncol. 8, Dingemans, A.M. et al. (2013) A phase II study of sorafenib in patients with platinum-pretreated, advanced (Stage IIIb or IV) non-small cell lung cancer with a KRAS mutation. Clin. Cancer Res. 3, Jänne, P.A. et al. (2013) Selumetinib plus docetaxel for KRAS-mutant advanced non-small-cell lung cancer: a randomised, multicentre, placebo-controlled, phase 2 study. Lancet Oncol. 1, Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2004). Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation: Approved Guideline. CLSI Document EP17-A. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). 28. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2008). User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance: Approved Guideline, 2nd ed. CLSI Document EP12-A2. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). 29. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2004). Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods: Approved Guideline, 2nd ed. CLSI Document EP05-A2. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). 104 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

105 Σύμβολα Τα παρακάτω σύμβολα ενδέχεται να εμφανίζονται στην συσκευασία και την επισήμανση. <N> Περιέχει αντιδραστήρια που επαρκούν για <N> αντιδράσεις Ημερομηνία λήξης In vitro διαγνωστικό ιατροτεχνολογικό προϊόν Αριθμός καταλόγου Αριθμός παρτίδας Αριθμός υλικού Συστατικά Περιεχόμενα Αριθμός Rn Το R δηλώνει αναθεώρηση του εγχειριδίου και το n είναι ο αριθμός αναθεώρησης Περιορισμοί θερμοκρασίας Κατασκευαστής Ανατρέξτε στις οδηγίες χρήσης Προσοχή Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

106 Πληροφορίες επικοινωνίας Για τεχνική υποστήριξη και περισσότερες πληροφορίες, επισκεφθείτε το Κέντρο Τεχνικής Υποστήριξης στην ιστοσελίδα καλέστε το ή απευθυνθείτε σε κάποιο από τα τμήματα Τεχνικής Υποστήριξης της QIAGEN ή τους κατά τόπους αντιπροσώπους (δείτε το οπισθόφυλλο ή επισκεφθείτε την ιστοσελίδα Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

107 Παράρτημα: Εγκατάσταση του λογισμικού therascreen KRAS Assay Package Το therascreen KRAS RGQ PCR είναι σχεδιασμένο για χρήση με το όργανο Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM με ρότορα 72 βυθισμάτων. Το λογισμικό therascreen KRAS Assay Package διατίθεται ξεχωριστά σε CD (αρ. κατ ). Το πακέτο περιλαμβάνει τα πρότυπα "therascreen KRAS QC Locked Template" (Κλειδωμένο πρότυπο ποιοτικού ελέγχου therascreen KRAS) και "therascreen KRAS Locked Template" (Κλειδωμένο πρότυπο therascreen KRAS). Το CD περιλαμβάνει επίσης εκτυπώσιμους χάρτες πλακών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την καταγραφή των πειραμάτων και μήτρες ανάλυσης που ορίζουν τα πρωτόκολλα PCR για την προετοιμασία δειγμάτων FFPE με χρήση του κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue, την αξιολόγηση δειγμάτων DNA με χρήση του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR και την ανίχνευση μεταλλάξεων KRAS με χρήση του κιτ therascreen KRAS RGQ PCR. Σημείωση: Το λογισμικό therascreen KRAS Assay Package λειτουργεί μόνο με λογισμικό Rotor-Gene Q έκδοσης (build 9). Βεβαιωθείτε ότι έχει εγκατασταθεί η σωστή έκδοση του λογισμικού Rotor-Gene Q πριν προχωρήσετε την εγκατάσταση του λογισμικού therascreen KRAS Assay Package. Διαδικασία 1. Παραγγείλετε το CD του λογισμικού therascreen KRAS RGQ Assay Package CE (αρ. κατ ) που διατίθεται ξεχωριστά από την QIAGEN. 2. Εισαγάγετε το CD στη μονάδα δίσκου CD του φορητού υπολογιστή που είναι συνδεδεμένος με το όργανο Rotor-Gene Q. 3. Ξεκινήστε την εγκατάσταση κάνοντας διπλό κλικ στο αρχείο therascreen_kras_assay_package_ exe. 4. Εμφανίζεται ο οδηγός εγκατάστασης. Κάντε κλικ στο "Next" (Επόμενο) για να συνεχίσετε (Εικόνα 21). Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

108 Εικόνα 21. Πλαίσιο διαλόγου "Setup" (Εγκατάσταση). 1 = Κουμπί "Next" (Επόμενο). 5. Διαβάστε την Άδεια χρήσης στο πλαίσιο διαλόγου "License Agreement" (Άδεια χρήσης) και αποδεχτείτε την άδεια χρήσης επιλέγοντας τη δήλωση "I accept the agreement" (Αποδέχομαι τους όρους της άδειας). Κάντε κλικ στο "Next" (Επόμενο) για να συνεχίσετε (Εικόνα 22). Εικόνα 22. Πλαίσιο διαλόγου "License Agreement" (Άδεια χρήσης). 108 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

109 6. Η εγκατάσταση των προτύπων ξεκινάει αυτόματα και εμφανίζεται ένα τελικό πλαίσιο διαλόγου "Setup" (Εγκατάσταση). Κάντε κλικ στο "Finish" (Τέλος) για να κλείσετε τον οδηγό εγκατάστασης (Εικόνα 23). Εικόνα 23. Ολοκλήρωση του οδηγού εγκατάστασης. 7. Εκτελέστε επανεκκίνηση του υπολογιστή. Οι συντομεύσεις για τα πρότυπα "therascreen KRAS QC Locked Template" (Κλειδωμένο πρότυπο ποιοτικού ελέγχου therascreen KRAS) και "therascreen KRAS Locked Template" (Κλειδωμένο πρότυπο therascreen KRAS) δημιουργούνται αυτόματα και εμφανίζονται στην επιφάνεια εργασίας. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

110 Πληροφορίες παραγγελίας Προϊόν Περιεχόμενα Αρ. κατ. Κιτ therascreen KRAS RGQ PCR (24) therascreen KRAS Assay Package CD Rotor-Gene Q και εξαρτήματα Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Platform Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM System Rotor-Gene Q 5plex HRM Platform Για 24 αντιδράσεις: 1 ανάλυση ορού ελέγχου, 7 αναλύσεις μετάλλαξης, θετικός ορός ελέγχου, νερό, Taq DNA πολυμεράση Πακέτο πρωτοκόλλου λογισμικού για χρήση με το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR και το όργανο Rotor-Gene Q 5plex HRM ή MDx της QIAGEN με ρότορα 72 βυθισμάτων Θερμοκυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και αναλυτής καμπυλών τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας (HRM) με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βυσσινί) και κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για τα ανταλλακτικά και την εργασία. Η εγκατάσταση και η εκπαίδευση δεν συμπεριλαμβάνονται. Θερμοκυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και αναλυτής καμπυλών τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας (HRM) με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βυσσινί) και κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για ανταλλακτικά και εργασία, εγκατάσταση και εκπαίδευση Θερμοκυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και αναλυτής καμπυλών τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας (HRM) με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βυσσινί) και κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για τα ανταλλακτικά και την εργασία. Η εγκατάσταση και η εκπαίδευση δεν συμπεριλαμβάνονται Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

111 Προϊόν Περιεχόμενα Αρ. κατ. Rotor-Gene Q 5plex HRM System Loading Block 72 x 0,1 ml Tubes Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (2500) Θερμοκυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και αναλυτής καμπυλών τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας (HRM) με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βυσσινί) και κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για ανταλλακτικά και εργασία, εγκατάσταση και εκπαίδευση Μονάδα αλουμινίου για χειροκίνητη προετοιμασία αντίδρασης με μονοκάναλη πιπέτα σε σωληνάρια 72 x 0,1 ml 250 σειρές των 4 σωληναρίων και πώματα για 1000 αντιδράσεις 10 x 250 σειρές των 4 σωληναρίων και πώματα για αντιδράσεις Κιτ QIAamp DNA FFPE Tissue για καθαρισμό γενωμικού DNA από εγκλεισμένους σε παραφίνη ιστούς QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (50) Για 50 προπαρασκευές DNA: Στήλες QIAamp MinElute, πρωτεϊνάση K, ρυθμιστικά διαλύματα και σωληνάρια συλλογής (2 ml) Για ενημερωμένες πληροφορίες άδειας και δηλώσεις αποποίησης ευθύνης σχετικά με συγκεκριμένα προϊόντα, ανατρέξτε στο εγχειρίδιο του αντίστοιχου κιτ QIAGEN ή στο εγχειρίδιο χρήστη. Τα εγχειρίδια του κιτ QIAGEN και τα εγχειρίδια χρήστη είναι διαθέσιμα στην ιστοσελίδα Μπορείτε επίσης να τα ζητήσετε από το τμήμα Τεχνικής Εξυπηρέτησης της QIAGEN ή τον τοπικό σας αντιπρόσωπο. Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

112 Η σελίδα αυτή είναι σκόπιμα κενή 112 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

113 Η σελίδα αυτή είναι σκόπιμα κενή Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/

114 Η σελίδα αυτή είναι σκόπιμα κενή 114 Εγχειρίδιο κιτ therascreen KRAS RGQ PCR 08/2014

115 Εμπορικά σήματα: QIAGEN, QIAamp, MinElute, Rotor-Gene, Scorpions, therascreen (Όμιλος QIAGEN); ARMS (AstraZeneca Ltd.); FAM, HEX (Life Technologies, Inc.). Οι κατατεθείσες ονομασίες, τα εμπορικά σήματα κ.ά. που χρησιμοποιούνται σε αυτό το έγγραφο δεν θα πρέπει να θεωρηθούν μη προστατευόμενα από το νόμο, ακόμα κι αν δεν υποδεικνύονται ρητώς. Να μη χρησιμοποιείται με δείγματα κοπράνων. Να μη χρησιμοποιείται με δείγματα ούρων. Να μη χρησιμοποιείται με εξωκυττάριο νουκλεϊκό οξύ από δείγμα αίματος. Να μη χρησιμοποιείται με δείγματα μυελού των οστών χωρίς κύτταρα. Να μη χρησιμοποιείται με δείγματα σιέλου. ΜΕ ΤΗΝ ΑΓΟΡΑ ΑΥΤΟΥ ΤΟΥ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ ΔΙΑΣΦΑΛΙΖΟΝΤΑΙ ΤΑ ΔΙΚΑΙΩΜΑΤΑ ΤΟΥ ΑΓΟΡΑΣΤΗ ΟΣΟΝ ΑΦΟΡΑ ΣΥΓΚΕΚΡΙΜΕΝΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΑ ΕΥΡΕΣΙΤΕΧΝΙΑΣ ΤΗΣ ROCHE ΓΙΑ ΑΠΟΚΛΕΙΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ ΓΙΑ ΠΑΡΟΧΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΩΝ IN VITRO ΥΠΗΡΕΣΙΩΝ. ΚΑΝΕΝΑ ΓΕΝΙΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΥΡΕΣΙΤΕΧΝΙΑΣ Ή ΑΛΛΗ ΑΔΕΙΑ ΟΠΟΙΟΥΔΗΠΟΤΕ ΕΙΔΟΥΣ ΠΕΡΑ ΑΠΟ ΑΥΤΟ ΤΟ ΣΥΓΚΕΚΡΙΜΕΝΟ ΔΙΚΑΙΩΜΑ ΧΡΗΣΗΣ ΠΟΥ ΑΠΟΡΡΕΕΙ ΑΠΟ ΤΗΝ ΑΓΟΡΑ ΔΕΝ ΠΑΡΕΧΕΤΑΙ ΔΙΑ ΤΟΥ ΠΑΡΟΝΤΟΣ. Άδεια περιορισμένης χρήσης για το κιτ therascreen KRAS RGQ PCR Η χρήση του προϊόντος αυτού συνεπάγεται την αποδοχή των παρακάτω όρων εκ μέρους του αγοραστή ή του χρήστη του προϊόντος: 1. Το προϊόν μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποκλειστικά και μόνο όπως ορίζεται στα πρωτόκολλα που παρέχονται μαζί με το προϊόν και όπως ορίζεται στο εγχειρίδιο αυτό, και μόνο με τα συστατικά που περιλαμβάνονται στο κιτ. Η QIAGEN δεν παρέχει άδεια χρήσης υπό οποιαδήποτε πνευματική ιδιοκτησία της για τη χρήση ή ενσωμάτωση των παρεχόμενων συστατικών αυτού του κιτ σε οποιαδήποτε συστατικά που δεν περιλαμβάνονται σε αυτό το κιτ, παρά μόνον όπως περιγράφεται στα πρωτόκολλα που παρέχονται μαζί με το προϊόν, στο εγχειρίδιο αυτό, και στα συμπληρωματικά πρωτόκολλα που διατίθενται στον ιστότοπο Ορισμένα από αυτά τα συμπληρωματικά πρωτόκολλα παρέχονται από χρήστες της QIAGEN για χρήση από χρήστες της QIAGEN. Αυτά τα πρωτόκολλα δεν έχουν δοκιμαστεί σχολαστικά ούτε έχουν βελτιστοποιηθεί από την QIAGEN. Η QIAGEN δεν παρέχει καμία εγγύηση επ' αυτών, ούτε εγγυάται πως αυτά δεν παραβιάζουν δικαιώματα τρίτων. 2. Εκτός από τις άδειες που αναφέρονται ρητά, η QIAGEN δεν εγγυάται ότι αυτό το κιτ ή/και η χρήση(εις) του δεν παραβιάζουν τα δικαιώματα τρίτων. 3. Αυτό το κιτ και τα συστατικά του παραχωρούνται με άδεια για μία μόνο χρήση και δεν επιτρέπεται η επαναχρησιμοποίηση, η επανεπεξεργασία, η ανακατασκευή ή η μεταπώλησή τους. 4. Η QIAGEN αποποιείται ειδικά κάθε άλλη άδεια, ρητή ή σιωπηρή, εκτός από αυτές που αναφέρονται ρητά. 5. Ο αγοραστής και ο χρήστης του κιτ συμφωνούν να μην προβούν και να μην επιτρέψουν σε κανέναν να προβεί σε ενέργειες οι οποίες θα μπορούσαν να προκαλέσουν ή να διευκολύνουν τις ενέργειες που απαγορεύονται σύμφωνα με τα προαναφερθέντα. Η QIAGEN διατηρεί το δικαίωμα να επιβάλει τις απαγορεύσεις της παρούσας Άδειας περιορισμένης χρήσης σε οποιοδήποτε δικαστήριο και πρέπει να αποζημιωθεί για όλες τις δαπάνες ανάκρισης και δικαστηρίου, συμπεριλαμβανομένων των δικηγορικών αμοιβών, στο πλαίσιο οποιασδήποτε ενέργειας για την επιβολή της παρούσας Άδειας περιορισμένης χρήσης ή οποιουδήποτε εκ των δικαιωμάτων πνευματικής της ιδιοκτησίας σχετικά με το κιτ και/ή τα συστατικά του. Για τους ενημερωμένους όρους της άδειας, ανατρέξτε στην ιστοσελίδα Αύγ.-14 HB-XXXX QIAGEN, με την επιφύλαξη παντός δικαιώματος.

116 Australia Austria Belgium Brazil Canada China Denmark Finland France Germany Hong Kong India Ireland Italy Japan Korea (South) Luxembourg Mexico The Netherlands Norway Singapore Sweden Switzerland UK USA EL Sample & Assay