Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR

Transcript

1 Δεκέμβριος 2014 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR Έκδοση 1 24 Ποσοτική in vitro διαγνωστική εξέταση Προορίζεται για χρήση σε συνδυασμό με το όργανο Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, Hilden, ΓΕΡΜΑΝΙΑ R EL Sample & Assay Technologies

2 Τεχνολογίες προετοιμασίας δειγμάτων και ανάλυσης της QIAGEN Η QIAGEN είναι ο κορυφαίος προμηθευτής καινοτόμων τεχνολογιών προετοιμασίας δειγμάτων και ανάλυσης για την απομόνωση και την ανίχνευση του περιεχομένου βιολογικών δειγμάτων οποιουδήποτε τύπου. Τα προηγμένα και υψηλής ποιότητας προϊόντα και υπηρεσίες μας εξασφαλίζουν την επιτυχία, από την προετοιμασία του δείγματος μέχρι την εξαγωγή των αποτελεσμάτων. Η QIAGEN θέτει πρότυπα: στον καθαρισμό DNA, RNA και πρωτεϊνών στις αναλύσεις νουκλεϊκών οξέων και πρωτεϊνών στην έρευνα microrna και RNAi στην αυτοματοποίηση τεχνολογιών προετοιμασίας δειγμάτων και ανάλυσης Αποστολή μας είναι η διασφάλιση της επιτυχίας σας και της επίτευξης καινοτόμων ανακαλύψεων. Για περισσότερες πληροφορίες επισκεφθείτε την ιστοσελίδα

3 Περιεχόμενα Προβλεπόμενη χρήση 5 Σύνοψη και επεξήγηση 5 Γενικές πληροφορίες για τη χρόνια μυελογενή λευχαιμία 5 Παρακολούθηση της νόσου 6 Αρχή της διαδικασίας 8 Υλικά που παρέχονται 10 Περιεχόμενα του κιτ 10 Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται 11 Αντιδραστήρια για τη λύση των ερυθροκυττάρων 11 Αντιδραστήρια για απομόνωση ολικού RNA 11 Αναλώσιμα 12 Εξοπλισμός 12 Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις 13 Πληροφορίες ασφαλείας 13 Γενικές προφυλάξεις 13 Χειρισμός και αποθήκευση αντιδραστηρίων 15 Συνθήκες μεταφοράς 15 Συνθήκες αποθήκευσης 15 Σταθερότητα 15 Χειρισμός και αποθήκευση δειγμάτων 16 Δείγματα ολικού αίματος 16 Δείγματα RNA 16 Διαδικασία 17 Πρωτόκολλο λύσης ερυθροκυττάρων για την απομόνωση ολικών λευκοκυττάρων από ολικό αίμα 17 Απομόνωση ολικού RNA 19 Ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός του RNA 21 Συμπύκνωση του RNA (προαιρετικό βήμα) 22 Αντίστροφη μεταγραφή 24 qpcr στο όργανο Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM με ρότορα 72 σωληναρίων 26 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014 3

4 Επεξεργασία δειγμάτων σε όργανο Rotor-Gene Q MDx με ρότορα 72 σωληναρίων 27 Αποτελέσματα 33 Αρχή ανάλυσης δεδομένων 33 Πρότυπες καμπύλες και κριτήρια ποιότητας για τα πρωτογενή δεδομένα 34 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων 41 Ποιοτικός έλεγχος 45 Περιορισμοί 45 Χαρακτηριστικά απόδοσης 46 Όριο τυφλού 46 Όριο ανίχνευσης 46 Γραμμικότητα 46 Επαναληψιμότητα και αναπαραγωγιμότητα 46 Παρεμβαλλόμενες ουσίες 47 Κλινική επικύρωση και σύγκριση μεθόδων 48 Βιβλιογραφία 49 Σύμβολα 51 Πληροφορίες επικοινωνίας 51 Πληροφορίες παραγγελίας 52 4 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

5 Προβλεπόμενη χρήση Το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR είναι μια ποσοτική in vitro διαγνωστική εξέταση για τη μέτρηση της ποσότητας των μεταγράφων b3a2 (e14a2) και b2a2 (e13a2) του γονιδίου σύντηξης BCR-ABL1 σε ολικό RNA απομονωμένο από ολικό αίμα. Το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR προορίζεται για την παρακολούθηση της βαθιάς μοριακής ανταπόκρισης στους ασθενείς που έχουν διαγνωστεί με χρόνια μυελογενή λευχαιμία (ΧΜΛ) χρόνιας φάσης, θετική για χρωμόσωμα Philadelphia (Ph+) p210. Η εξέταση βαθμονομείται έναντι του διεθνούς γενετικού πίνακα αναφοράς (International Genetic Reference Panel) του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (ΠΟΥ). Σύνοψη και επεξήγηση Γενικές πληροφορίες για τη χρόνια μυελογενή λευχαιμία Η ΧΜΛ ανήκει στις μυελοϋπερπλαστικές νεοπλασίες και παρατηρείται σε > 90% των περιπτώσεων που χαρακτηρίζονται από την παρουσία του χρωμοσώματος Philadelphia (Ph CHRS). Το χρωμόσωμα αυτό σχηματίζεται μετά από αμοιβαία μετατόπιση του μακρού βραχίονα των χρωμοσωμάτων 9 και 22, t(9,22), με την περιοχή συστάδας σημείων ρήξης (breakpoint cluster region, BCR) να εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 22 και το ογκογονίδιο c-abl να βρίσκεται στο χρωμόσωμα 9. Το γονίδιο σύντηξης που προκύπτει, BCR-ABL1, μεταγράφεται σε ένα μόριο mrna μήκους 8,5 kb, με 2 παραλλαγές συνένωσης: το b2a2 (που απαντά στο 40% των περιπτώσεων) και το b3a2 (55% των περιπτώσεων). Αυτό το γονίδιο σύντηξης κωδικοποιεί μια χιμαιρική πρωτεΐνη που ονομάζεται p210 και έχει αυξημένη δραστηριότητα κινάσης τυροσίνης. Τα μετάγραφα b2a3 και b3a3 απαντούν σε λιγότερες από το 5% των περιπτώσεων. Χρωμόσωμα Philadelphia εντοπίζεται επίσης στο 35% των ενήλικων ασθενών με οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (ΟΛΛ). Η ετήσια επίπτωση της ΧΜΛ είναι περίπου 1 2 ανά άτομα και η ΧΜΛ αντιπροσωπεύει το 20% των περιστατικών λευχαιμίας στους ενήλικες. Κλινικά, χαρακτηρίζεται από περίσσεια μυελοειδών κυττάρων που διαφοροποιούνται και λειτουργούν φυσιολογικά. Στο 90 95% των περιπτώσεων ΧΜΛ, η διάγνωση γίνεται στη χρόνια ή σταθερή φάση της νόσου. Στο παρελθόν, η νόσος εξελισσόταν σε βλαστική εκτροπή και οξεία λευχαιμία, με μοιραία έκβαση μέσα σε διάστημα 4 έως 6 ετών κατά μέσο όρο. Η έλευση της ιματινίμπης και, πιο πρόσφατα, των αναστολέων κινάσης τυροσίνης (tyrosine kinase inhibitors, TKI) δεύτερης γενιάς έχει αλλάξει ριζικά τη φυσική πορεία της νόσου. Οι περισσότεροι ασθενείς παραμένουν πλέον σε ύφεση και συνεπώς απαιτείται μακροχρόνια παρακολούθηση της νόσου και επανέλεγχοι του ασθενούς. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014 5

6 Παρακολούθηση της νόσου Ο στόχος της θεραπείας της ΧΜΛ σήμερα είναι να επιτευχθεί επιβίωση 100% και αρνητική κατάσταση ως προς το χρωμόσωμα Philadelphia. Κατά συνέπεια, η παρακολούθηση της νόσου αποτελεί απαραίτητο εργαλείο για την αξιολόγηση της ανταπόκρισης στη θεραπεία και για τον εντοπισμό τυχόν υποτροπής όσο το δυνατόν συντομότερα. Κατά τη θεραπεία με TKI, οι ασθενείς κατά κανόνα προχωρούν από την αιματολογική στην κυτταρογενετική και κατόπιν στη μοριακή ύφεση, με αντίστοιχη μείωση στον αριθμό των λευχαιμικών κυττάρων και των μεταγράφων BCR-ABL1 όπως φαίνεται στην Εικόνα 1. Διεθνής κλίμακα (IS) MR 4.5 (μείωση κατά 4,5 log, 0,0032% IS ) MR 4.0 (μείωση κατά 4 log, 0,01% IS ) MR 5.0 (μείωση κατά 5 log, 0,001% IS ) 100% Τιμή αναφοράς 10% 1% 0,1% MMR 0,01% 0,001% Μη ανιχνεύσιμο BCR-ABL1 Αριθμός λευχαιμικών κυττάρων Εικόνα 1. Ορισμός της μοριακής ανταπόκρισης. Προσαρμογή από τις παραπομπές 1,2. MR: μοριακή ανταπόκριση. MMR: μείζων μοριακή ανταπόκριση. Η μέθοδος αναφοράς για την εκτίμηση του φορτίου όγκου στους ασθενείς με ΧΜΛ είναι η συμβατική κυτταρογενετική ανάλυση (ζώνωση G) σε μεταφάσεις μυελού των οστών. Η κυτταρογενετική ανταπόκριση προσδιορίζεται σε τουλάχιστον 20 μεταφάσεις μυελού των οστών. Το επίπεδο κυτταρογενετικής ανταπόκρισης υπολογίζεται με βάση το ποσοστό των μεταφάσεων που είναι θετικές για χρωμόσωμα Ph (βλ. Πίνακα 1) (3). Η αξιολόγηση αυτή όμως επηρεάζεται από τις επιδόσεις και την τεχνογνωσία του εργαστηρίου και παρουσιάζει χαμηλή ευαισθησία, της τάξης του 5% όταν εξετάζονται 20 μεταφάσεις. Ο ποσοτικός προσδιορισμός του BCR-ABL1 Mbcr mrna σε δείγματα περιφερικού αίματος με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (quantitative polymerase chain reaction, qpcr) σε πραγματικό χρόνο προσδιορίζει τη μοριακή ανταπόκριση και περιλαμβάνεται πλέον στις 6 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

7 τεχνικές παρακολούθησης της νόσου που χρησιμοποιούνται στη ΧΜΛ. Είναι λιγότερο επεμβατικός από τη συμβατική κυτταρογενετική εξέταση μεταφάσεων στον μυελό των οστών και παρουσιάζει μεγαλύτερη ευαισθησία. Οι συστάσεις για την παρακολούθηση της ΧΜΛ επικαιροποιήθηκαν πρόσφατα ώστε να συμπεριληφθούν νέα κλινικά στοιχεία από φαρμακευτικές μελέτες, πληροφορίες για την υψηλότερη κλινική δραστικότητα των TKI δεύτερης γενιάς και πληροφορίες για τις τεχνικές βελτιώσεις στον ποσοτικό προσδιορισμό του BCR-ABL1, επιτεύγματα που επιτρέπουν να τεθούν βελτιωμένοι στόχοι κατά την παρακολούθηση της νόσου. Συγκεκριμένα, οι TKI δεύτερης γενιάς επιτυγχάνουν μεγαλύτερη μοριακή ανταπόκριση σε μεγάλο αριθμό ασθενών με ΧΜΛ, δηλαδή τη λεγόμενη «βαθιά μοριακή ανταπόκριση» η οποία αντιστοιχεί σε φορτίο BCR-ABL1 μικρότερο του 0,01% (MR4.0) ή του 0,0032% (MR4.5). Η δυνατότητα ορθού προσδιορισμού τόσο χαμηλών επιπέδων φορτίου BCR-ABL1 μπορεί να έχει κλινική σημασία, καθώς μελέτες παρατήρησης έχουν δείξει ότι η λήψη TKI μπορεί να διακοπεί με ασφάλεια στους ασθενείς με παρατεταμένη μοριακή ανταπόκριση βαθμού MR4.5 (4). Αυτή τη στιγμή όμως βρίσκονται υπό εξέλιξη άλλες κλινικές μελέτες προκειμένου να επιβεβαιωθούν τα ευρήματα αυτά. Οι πιο πρόσφατες συστάσεις σχετικά με τον ορισμό και την παρακολούθηση της ανταπόκρισης των ασθενών με ΧΜΛ υπό θεραπεία με TKI προήλθαν από τους ειδικούς του δικτύου ELN (3). Από τεχνικής άποψης, έχουν καταβληθεί προσπάθειες από ειδικούς διάφορων χωρών προκειμένου να εναρμονιστούν οι μέθοδοι μέτρησης και αναφοράς του BCR-ABL1 Mbcr (5 7). Επιπλέον, πρόσφατα επικυρώθηκε ένας πίνακας αναφοράς υπό την αιγίδα του ΠΟΥ, με στόχο την απλούστευση του ποσοτικού προσδιορισμού του BCR-ABL1 (8). Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014 7

8 Αρχή της διαδικασίας Η ποσοτική PCR (quantitative PCR, qpcr) επιτρέπει τον ορθό ποσοτικό προσδιορισμό των προϊόντων της PCR κατά την εκθετική φάση ενίσχυσης της PCR. Η ποσοτική PCR μπορεί να προσφέρει δεδομένα γρήγορα, χωρίς περαιτέρω επεξεργασία, μέσω ανίχνευσης σημάτων φθορισμού σε πραγματικό χρόνο κατά τη διάρκεια ή/και μετά τους κύκλους ενίσχυσης, χαρακτηριστικό που μειώνει σημαντικά τον κίνδυνο μόλυνσης των προϊόντων της PCR. Σήμερα υπάρχουν τρεις βασικοί τύποι τεχνικών qpcr: ανάλυση qpcr με χρήση χρωστικής SYBR Green I, ανάλυση qpcr με χρήση ανιχνευτών υδρόλυσης και ανάλυση qpcr με χρήση ανιχνευτών υβριδοποίησης. Στην παρούσα μέθοδο χρησιμοποιείται η αρχή της υδρόλυσης ολιγονουκλεοτιδίων διπλής χρωστικής qpcr. Κατά την αντίδραση PCR, ευθείς και αντίστροφοι εκκινητές υβριδοποιούνται σε μια ειδική αλληλουχία. Στο ίδιο μείγμα περιλαμβάνεται ένα ολιγονουκλεοτίδιο με διπλή χρωστική. Αυτός ο ανιχνευτής, που αποτελείται από ένα ολιγονουκλεοτίδιο σημασμένο με μια χρωστική αναφοράς 5 και μια κατάντη χρωστική απόσβεσης 3, υβριδοποιείται σε μια αλληλουχία-στόχο εντός του προϊόντος της PCR. Η ανάλυση qpcr με ανιχνευτές υδρόλυσης αξιοποιεί τη δραστηριότητα 5 3 εξωνουκλεάσης της DNA πολυμεράσης του Thermus aquaticus (Taq). Όταν ο ανιχνευτής είναι ακέραιος, η εγγύτητα της χρωστικής αναφοράς στη χρωστική απόσβεσης συνεπάγεται καταστολή του φθορισμού της χρωστικής αναφοράς, κυρίως μέσω μεταφοράς ενέργειας τύπου Förster. Εάν ο εξεταζόμενος στόχος είναι παρών κατά την αντίδραση PCR, ο ανιχνευτής υβριδοποιείται ειδικά σε ένα σημείο ανάμεσα στις θέσεις του ευθέος και του αντίστροφου εκκινητή. Η δραστηριότητα 5 3 εξωνουκλεάσης της DNA πολυμεράσης διασπά τον ανιχνευτή σε ένα σημείο ανάμεσα στις χρωστικές αναφοράς και απόσβεσης μόνον εάν ο ανιχνευτής υβριδοποιηθεί στον στόχο. Τα τμήματα του ανιχνευτή εκτοπίζονται κατόπιν από τον στόχο και ο πολυμερισμός του κλώνου συνεχίζεται. Το 3 άκρο του ανιχνευτή είναι φραγμένο για να αποφευχθεί η επιμήκυνση του ανιχνευτή κατά την PCR (Εικόνα 2). Η διαδικασία αυτή συμβαίνει σε κάθε κύκλο και δεν επηρεάζει την εκθετική συσσώρευση του προϊόντος. Αύξηση του σήματος φθορισμού ανιχνεύεται μόνον όταν η αλληλουχία-στόχος είναι συμπληρωματική προς τον ανιχνευτή και συνεπώς ενισχύεται με την PCR. Λόγω των απαιτήσεων αυτών, δεν ανιχνεύεται μη ειδική ενίσχυση. Έτσι η αύξηση του φθορισμού είναι ευθέως ανάλογη της ενίσχυσης του στόχου με την PCR. 8 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

9 Υβριδοποίηση Υβριδοποίηση εκκινητών και ανιχνευτή Πολυμερισμός Εκτόπιση κλώνου Διάσπαση Οδηγεί στην αποδέσμευση της χρωστικής απόσβεσης και εκπομπή σήματος φθορισμού από τη χρωστική αναφοράς Ολοκλήρωση πολυμερισμού Ολοκλήρωση προϊόντος PCR και συσσώρευση σήματος φθορισμού σε κάθε κύκλο Χρωστική αναφοράς Χρωστική απόσβεσης Ειδικός ανιχνευτής Προϊόν PCR Ευθείς και αντίστροφοι εκκινητές Taq πολυμεράση Εικόνα 2. Αρχή της αντίδρασης. Πραγματοποιείται αντίστροφη μεταγραφή του ολικού RNA και ενίσχυση του παραγόμενου cdna μέσω PCR, με χρήση ενός ζεύγους ειδικών εκκινητών και ενός ειδικού εσωτερικού ανιχνευτή διπλής χρωστικής (FAM BHQ -1). Ο ανιχνευτής δεσμεύεται στο αμπλικόνιο σε κάθε βήμα υβριδοποίησης της PCR. Καθώς η Taq DNA πολυμεράση επιμηκύνει τον εκκινητή που έχει δεσμευτεί στο αμπλικόνιο, εκτοπίζει το 5 άκρο του ανιχνευτή, το οποίο κατόπιν αποδομείται από τη δραστηριότητα 5 3 εξωνουκλεάσης της Taq DNA πολυμεράσης. Η διάσπαση συνεχίζεται μέχρις ότου ο ανιχνευτής που απομένει αποκολληθεί από το αμπλικόνιο στο επόμενο βήμα τήξης. Με τον τρόπο αυτόν το φθορισμοφόρο μόριο και το μόριο απόσβεσης ελευθερώνονται στο διάλυμα και απομακρύνονται μεταξύ τους, με αποτέλεσμα να αυξηθεί ο φθορισμός της FAM και να μειωθεί ο φθορισμός από το BHQ-1. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014 9

10 Υλικά που παρέχονται Περιεχόμενα του κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR Kit (24) Αρ. καταλόγου Αριθμός αντιδράσεων 24 Αντιδραστήρια για αντίστροφη μεταγραφή (RT) Reverse transcriptase (Αντίστροφη μεταγραφάση) Πορφυρό 100 µl RT Mix (Μείγμα αντίστροφης μεταγραφής) Πορφυρό 300 µl Αντιδραστήρια για βαθμονόμηση High Positive RNA Control (Θετικός ορός ελέγχου RNA υψηλής συγκέντρωσης) Low Positive RNA Control (Θετικός ορός ελέγχου RNA χαμηλής συγκέντρωσης) IS-MMR Calibrator (Βαθμονομητής MMR σε διεθνή κλίμακα) SP1-BCR-ABL Mbcr and ABL: Τυπική αραίωση κοινού πλασμιδίου Mbcr και ABL1 (10 1 αντίγραφα/5 µl) SP2-BCR-ABL Mbcr and ABL: Τυπική αραίωση κοινού πλασμιδίου Mbcr και ABL1 (10 2 αντίγραφα/5 µl) SP3-BCR-ABL Mbcr and ABL: Τυπική αραίωση κοινού πλασμιδίου Mbcr και ABL1 (10 3 αντίγραφα/5 µl) SP4-BCR-ABL Mbcr and ABL: Τυπική αραίωση κοινού πλασμιδίου Mbcr και ABL1 (10 4 αντίγραφα/5 µl) SP5-BCR-ABL Mbcr and ABL: Τυπική αραίωση κοινού πλασμιδίου Mbcr και ABL1 (10 5 αντίγραφα/5 µl) Λευκό 15 µl 3 Λευκό 15 µl 3 Λευκό 15 µl 3 Κίτρινο 35 µl Κίτρινο 35 µl Κίτρινο 70 µl Κίτρινο 35 µl Κίτρινο 70 µl Ο πίνακας συνεχίζεται στην επόμενη σελίδα 10 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

11 Ο πίνακας συνεχίζεται από την προηγούμενη σελίδα SP6-BCR-ABL Mbcr and ABL: Τυπική αραίωση κοινού πλασμιδίου Mbcr και ABL1 (10 6 αντίγραφα/5 µl) Κίτρινο 70 µl Αντιδραστήρια για qpcr Taq DNA polymerase (Taq DNA πολυμεράση) Πράσινο της μέντας 85 µl qpcr Mix ABL1 (Μείγμα για qpcr του ABL1)* Πράσινο 720 µl 3 qpcr Mix Mbcr (Μείγμα για qpcr του Mbcr) Κόκκινο 720 µl 3 ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR Kit Handbook (Εγχειρίδιο στα αγγλικά) * Περιέχει μείγμα ειδικών ευθέων και αντίστροφων εκκινητών για το γονίδιο ελέγχου ABL1 και έναν ειδικό ανιχνευτή FAM BHQ-1. Περιέχει μείγμα ειδικών ευθέων και αντίστροφων εκκινητών για το γονίδιο σύντηξης BCR-ABL1 Mbcr και έναν ειδικό ανιχνευτή FAM BHQ-1. Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Κατά την εργασία με χημικά, φοράτε πάντα κατάλληλη προστατευτική ποδιά εργαστηρίου, γάντια μίας χρήσης και προστατευτικά γυαλιά. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στα σχετικά δελτία δεδομένων ασφαλείας (SDS), τα οποία διατίθενται από τον προμηθευτή του προϊόντος. Αντιδραστήρια για τη λύση των ερυθροκυττάρων Erythrocyte Lysis (EL) Buffer (Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης ερυθροκυττάρων) (αρ. κατ ) β-μερκαπτοαιθανόλη 14,3 M* RNeasy Midi Kit (αρ. κατ ) Αντιδραστήρια για απομόνωση ολικού RNA RNeasy Midi Kit (αρ. κατ ) Αιθανόλη (70%, 80% και %) 1 * Οι χημικές ουσίες και ο εξοπλισμός που συνιστώνται για τη λύση των ερυθροκυττάρων και την απομόνωση του RNA είναι δυνητικά επικίνδυνα. Πριν από τη χρήση, βεβαιωθείτε ότι έχουν τεθεί σε εφαρμογή κατάλληλα μέσα ατομικής προστασίας και κατάλληλες προφυλάξεις. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/

12 Προαιρετικό βήμα καθαρισμού και συμπύκνωσης RNA: Κιτ καθαρισμού RNeasy MinElute Cleanup Kit (αρ. κατ ) Νερό ελεύθερο νουκλεασών, κατάλληλο για PCR Αναλώσιμα Αποστειρωμένα ρύγχη πιπέτας για PCR, ελεύθερα νουκλεασών, με προστασία από τα αερολύματα και με υδρόφοβο φίλτρο Βελόνα gauge* τοποθετημένη σε σύριγγα ελεύθερη RNασών Σωληνάρια των 0,5 ml ή 0,2 ml ελεύθερα νουκλεασών Σωληνάρια των 1,5 ml ή 2 ml ελεύθερα νουκλεασών Σωληνάρια φυγοκέντρου των 50 ml Σειρές σωληναρίων και πώματα, 0,1 ml, για το Rotor-Gene Q (αρ. κατ ή ) Πάγος Εξοπλισμός Πιπέτες αποκλειστικά για την PCR (1 10 µl, µl, µl) Επιτραπέζια φυγόκεντρος με ρότορα για σωληνάρια αντίδρασης 0,2 ml και 2 ml (με δυνατότητα περιστροφής στα 8000 g ή σ.α.λ.) Φασματοφωτόμετρο Εργαστηριακή φυγόκεντρος με ρότορα για σωληνάρια φυγοκέντρου 15 και 50 ml (με δυνατότητα περιστροφής στα g), ψυχόμενη (4 C) Συσκευή θέρμανσης και ανακίνησης (thermomixer), θερμαινόμενος επωαστήρας τροχιακής κίνησης, θερμαντικό μπλοκ ή υδατόλουτρο (για το βήμα αντίστροφης μεταγραφής) Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM (αρ. κατ ) και σχετικό ειδικό υλικό Λογισμικό Rotor-Gene Q, έκδοση ή νεότερη Σημείωση: Το Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί στο βήμα της αντίστροφης μεταγραφής * Οι χημικές ουσίες και ο εξοπλισμός που συνιστώνται για τη λύση των ερυθροκυττάρων και την απομόνωση του RNA είναι δυνητικά επικίνδυνα. Πριν από τη χρήση, βεβαιωθείτε ότι έχουν τεθεί σε εφαρμογή κατάλληλα μέσα ατομικής προστασίας και κατάλληλες προφυλάξεις. Βεβαιωθείτε ότι τα όργανα έχουν ελεγχθεί και βαθμονομηθεί σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. 12 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

13 Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις Για in vitro διαγνωστική χρήση. Πληροφορίες ασφαλείας Κατά την εργασία με χημικά, φοράτε πάντα κατάλληλη προστατευτική ποδιά εργαστηρίου, γάντια μίας χρήσης και προστατευτικά γυαλιά. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στα σχετικά δελτία δεδομένων ασφάλειας (SDS). Διατίθενται στο Διαδίκτυο σε εύχρηστη και συμπιεσμένη μορφή PDF, στην ιστοσελίδα όπου μπορείτε να βρείτε, να εμφανίσετε και να εκτυπώσετε τα SDS για κάθε κιτ της QIAGEN καθώς και για τα περιεχόμενά του. Όλες οι χημικές ουσίες και τα βιολογικά υλικά είναι εν δυνάμει επικίνδυνα. Τα δείγματα είναι εν δυνάμει μολυσματικά και πρέπει να αντιμετωπίζονται ως βιολογικά επικίνδυνα υλικά. Το αίμα θεωρείται δυνητικά μολυσματικό. Κατά τις εργασίες με ολικό αίμα θα πρέπει να λαμβάνονται όλες οι απαραίτητες προφυλάξεις που συνιστώνται από τη Διεύθυνση Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) στις ΗΠΑ, τον νόμο περί λοιμωδών νοσημάτων (Bundesseuchengesetz) στη Γερμανία, ή τις αρμόδιες κανονιστικές αρχές στη χώρα χρήσης. Οι χημικές ουσίες και ο εξοπλισμός που συνιστώνται για τη λύση των ερυθροκυττάρων και την απομόνωση του RNA είναι δυνητικά επικίνδυνα. Πριν από τη χρήση, βεβαιωθείτε ότι έχουν τεθεί σε εφαρμογή κατάλληλα μέσα ατομικής προστασίας και κατάλληλες προφυλάξεις. Γενικές προφυλάξεις Η διεξαγωγή αναλύσεων qpcr απαιτεί ορθές εργαστηριακές πρακτικές, συμπεριλαμβανομένης της συντήρησης του εξοπλισμού που χρησιμοποιείται αποκλειστικά για πειράματα μοριακής βιολογίας και συμμορφώνεται με τους ισχύοντες κανονισμούς και τα σχετικά πρότυπα. Τα απόβλητα των δειγμάτων και των αναλύσεων πρέπει να απορρίπτονται σύμφωνα με τις τοπικές διαδικασίες ασφαλείας. Τα αντιδραστήρια που παρέχονται με το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR βρίσκονται στην ιδανική αραίωση. Μην εκτελείτε περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων, καθώς ενδέχεται να προκληθεί υποβάθμιση των επιδόσεων. Όλα τα αντιδραστήρια που παρέχονται στο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR προορίζονται για χρήση αποκλειστικά με τα άλλα αντιδραστήρια που παρέχονται στο ίδιο κιτ. Μην ανταλλάσσετε αντιδραστήρια μεταξύ διαφορετικών κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR, καθώς αυτό μπορεί να επηρεάσει τις επιδόσεις τους. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/

14 Για επιπλέον προειδοποιήσεις, προφυλάξεις και διαδικασίες, ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήστη του οργάνου Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM. Η τροποποίηση των χρόνων ή/και των θερμοκρασιών επώασης μπορεί να οδηγήσει σε εσφαλμένα ή ασυνεπή δεδομένα. Μη χρησιμοποιείτε το περιεχόμενο της συσκευασίας αν έχει παρέλθει η ημερομηνία λήξης ή δεν έχουν ληφθεί τα σωστά μέτρα αποθήκευσης. Προσέξτε ιδιαίτερα ώστε να αποφύγετε τη διασταυρούμενη μόλυνση κατά τη χρήση θετικών ορών ελέγχου. Προσέξτε ιδιαίτερα ώστε να αποφύγετε τη μόλυνση λόγω μεταφοράς cdna ή προϊόντος PCR, που μπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς θετικό σήμα. Προσέξτε ιδιαίτερα ώστε να αποφύγετε τη μόλυνση από RNάση ή DNάση, που μπορεί να προκαλέσει αποδόμηση των μητρών RNA ή cdna. Μην ανοίγετε το όργανο Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM πριν ολοκληρωθεί η εκτέλεση ανάλυσης. Απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή, ώστε να διασφαλιστεί η σωστή εξέταση των δειγμάτων με έμφαση στην αποφυγή εσφαλμένης εισαγωγής δείγματος και τυχόν σφαλμάτων φόρτωσης και διοχέτευσης με πιπέτα. Βεβαιωθείτε ότι ο χειρισμός των δειγμάτων γίνεται με συστηματικό τρόπο ώστε να εξασφαλίζεται διαρκώς η σωστή ταυτοποίησή τους. Κατά συνέπεια, συνιστούμε τα εξής: Να χρησιμοποιείτε εργαστηριακό εξοπλισμό ελεύθερο νουκλεασών (πιπέτες, ρύγχη πιπέτας, φιαλίδια αντίδρασης κ.λπ.) Να χρησιμοποιείτε νέα ρύγχη πιπέτας, με προστασία από τα αερολύματα, για όλα τα βήματα αναρρόφησης ώστε να αποφευχθεί η διασταυρούμενη μόλυνση των δειγμάτων και των αντιδραστηρίων. Να προετοιμάζετε κύρια μείγματα προ της PCR χρησιμοποιώντας εξοπλισμό αποκλειστικής χρήσης (πιπέτες, ρύγχη κ.λπ.) σε αποκλειστικό χώρο όπου δεν εισέρχεται καθόλου μήτρα DNA (cdna, πλασμίδια ή προϊόντα PCR). Να προσθέτετε τη μήτρα σε χωριστή ζώνη (κατά προτίμηση σε χωριστό δωμάτιο) χρησιμοποιώντας ειδικό εξοπλισμό (πιπέτες, ρύγχη κ.λπ.). Ανατρέξτε στα αντίστοιχα εγχειρίδια για πληροφορίες ασφάλειας ειδικές για τα αντιδραστήρια και τα κιτ που χρησιμοποιούνται για την προετοιμασία των δειγμάτων. Πληροφορίες ασφάλειας για το RNeasy Midi Kit (αρ. κατ ) σε συνδυασμό με το ρυθμιστικό διάλυμα EL Buffer (αρ. κατ ) παρέχονται στο εγχειρίδιο του RNeasy Midi Kit και πληροφορίες ασφάλειας για το κιτ καθαρισμού RNeasy MinElute Cleanup Kit (αρ. κατ ) παρέχονται στο εγχειρίδιο του κιτ αυτού. 14 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

15 Χειρισμός και αποθήκευση αντιδραστηρίων Συνθήκες μεταφοράς Το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR αποστέλλεται σε ξηρό πάγο. Εάν οποιοδήποτε συστατικό του κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR δεν είναι κατεψυγμένο κατά την παραλαβή, εάν η εξωτερική συσκευασία έχει ανοίξει κατά τη μεταφορά ή εάν στο κιβώτιο αποστολής δεν περιλαμβάνεται το δελτίο συσκευασίας ή τα αντιδραστήρια, επικοινωνήστε με κάποιο από τα τμήματα τεχνικής υποστήριξης ή τους τοπικούς αντιπροσώπους της QIAGEN (ανατρέξτε στο οπισθόφυλλο ή επισκεφτείτε την ιστοσελίδα Συνθήκες αποθήκευσης Το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR θα πρέπει να αποθηκεύεται αμέσως μετά την παραλαβή σε θερμοκρασία -15 έως -30 C σε καταψύκτη σταθερής θερμοκρασίας. Χρειάζεται προσοχή ώστε να προστατεύονται τα μείγματα qpcr από το φως. Για πληροφορίες αποθήκευσης των αντιδραστηρίων και των κιτ που χρησιμοποιούνται για την προετοιμασία των δειγμάτων: RNeasy Midi Kit (αρ. κατ ), Buffer EL (αρ. κατ ), RNeasy MinElute Cleanup Kit (αρ. κατ ), ανατρέξτε στα αντίστοιχα εγχειρίδια. Σταθερότητα Το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR παραμένει σταθερό μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης, εφόσον αποθηκεύεται υπό τις καθορισμένες συνθήκες αποθήκευσης. Μετά το άνοιγμα, τα αντιδραστήρια μπορούν να αποθηκευτούν στην αρχική τους συσκευασία σε θερμοκρασία -15 έως -30 C μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στη συσκευασία. Μην υπερβαίνετε το μέγιστο όριο 5 κύκλων κατάψυξης-απόψυξης. Για πληροφορίες σταθερότητας των αντιδραστηρίων και των κιτ που χρησιμοποιούνται για την προετοιμασία των δειγμάτων: RNeasy Midi Kit (αρ. κατ ), Buffer EL (αρ. κατ ), RNeasy MinElute Cleanup Kit (αρ. κατ ), ανατρέξτε στα αντίστοιχα εγχειρίδια. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/

16 Χειρισμός και αποθήκευση δειγμάτων Το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR προορίζεται για χρήση με δείγματα RNA απομονωμένα από ολικό αίμα. Όλα τα δείγματα πρέπει να αντιμετωπίζονται ως δυνητικά επικίνδυνα. Δείγματα ολικού αίματος Τα δείγματα ολικού αίματος θα πρέπει να περιέχουν ως αντιπηκτικό καλιούχο EDTA (K2-EDTA) και να φυλάσσονται στους 2 8 C για διάστημα 4 ημερών το πολύ προτού απομονωθεί το RNA. Μη χρησιμοποιείτε κατεψυγμένο αίμα. Να επισημαίνετε, να χειρίζεστε και να φυλάσσετε τα δείγματα αίματος με ελεγχόμενο τρόπο, σύμφωνα με τις κατά τόπους διαδικασίες. Σημείωση: Τα δείγματα ολικού αίματος πρέπει να αποστέλλονται σε συνθήκες ίδιες με τις συνθήκες στις οποίες φυλάσσονταν προκειμένου να αποφευχθούν οι μεταβολές στη θερμοκρασία. Δείγματα RNA Μετά την απομόνωσή του, το RNA μπορεί να αποθηκευτεί σε θερμοκρασία -15 έως -30 C ή χαμηλότερη (-65 έως -90 C) εάν απαιτείται μακροχρόνια αποθήκευση. Να επισημαίνετε, να χειρίζεστε και να φυλάσσετε τα δείγματα RNA με ελεγχόμενο τρόπο, σύμφωνα με τις κατά τόπους διαδικασίες. Σημείωση: Τα δείγματα RNA πρέπει να αποστέλλονται σε συνθήκες ίδιες με τις συνθήκες στις οποίες φυλάσσονταν προκειμένου να αποφευχθούν οι μεταβολές στη θερμοκρασία κατά τη φύλαξη και την αποστολή. 16 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

17 Διαδικασία Απομονώνεται ολικό RNA από 10 ml περιφερικού ολικού αίματος συλλεγμένου σε σωληνάρια EDTA. Βεβαιωθείτε ότι τα αντιδραστήρια που θα χρησιμοποιηθούν για τη λύση των ερυθροκυττάρων, την απομόνωση του RNA και τη συμπύκνωση του RNA δεν έχουν λήξει και ότι έχουν μεταφερθεί και αποθηκευτεί υπό κατάλληλες συνθήκες. Χρησιμοποιήστε το RNeasy Midi Kit (QIAGEN, αρ. κατ ) και το ρυθμιστικό διάλυμα EL Buffer (QIAGEN, αρ. κατ ) για τον καθαρισμό του RNA από περιφερικό ολικό αίμα. Πρωτόκολλο λύσης ερυθροκυττάρων για την απομόνωση ολικών λευκοκυττάρων από ολικό αίμα Αυτό το πρωτόκολλο αποσκοπεί στην απομόνωση ολικών λευκοκυττάρων από 10 ml ολικού ανθρώπινου αίματος με χρήση του ρυθμιστικού διαλύματος EL Buffer (αρ. κατ ). Σημείωση: Αυτό το πρωτόκολλο δεν προορίζεται για χρήση με κατεψυγμένα δείγματα ολικού αίματος. Σημαντικές παρατηρήσεις πριν από την έναρξη Το αίμα και τα σωματικά υγρά όλων των ανθρώπων θεωρούνται δυνητικά μολυσματικά. Κατά τις εργασίες με ολικό αίμα θα πρέπει να λαμβάνονται όλες οι απαραίτητες προφυλάξεις που συνιστώνται από τη Διεύθυνση Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) στις ΗΠΑ, τον νόμο περί λοιμωδών νοσημάτων (Bundesseuchengesetz) στη Γερμανία, ή τις αρμόδιες κανονιστικές αρχές στη χώρα χρήσης. Το ρυθμιστικό διάλυμα RLT μπορεί να σχηματίσει κατακρήμνισμα κατά τη διάρκεια της φύλαξής του. Διαλύστε το με θέρμανση, εάν χρειάζεται, και φυλάξτε κατόπιν σε θερμοκρασία δωματίου. Το βήμα λύσης των ερυθροκυττάρων θα πρέπει να εκτελεστεί μέσα σε πάγο. Τα βήματα φυγοκέντρησης 3 και 5 του πρωτοκόλλου αυτού πρέπει να πραγματοποιηθούν σε θερμοκρασία 4 C μέσα σε κοινή εργαστηριακή φυγόκεντρο. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/

18 Απαραίτητα βήματα πριν από την έναρξη Παρασκευάστε ρυθμιστικό διάλυμα RLT (που παρέχεται με το RNeasy Midi Kit της QIAGEN, αρ. κατ ) / β-μερκαπτοαιθανόλης (β-me): Προσθέστε 10 µl β-me ανά 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος RLT. Το ρυθμιστικό διάλυμα RLT παραμένει σταθερό για 1 μήνα μετά την προσθήκη της β-me. Σημείωση: Η β-me είναι τοξική μεταγγίστε την κάτω από απαγωγό φορώντας κατάλληλο προστατευτικό ρουχισμό. Διαδικασία 1. Προσθέστε 40 ml EL Buffer σε 10 ml ολικού αίματος μέσα σε ένα σωληνάριο φυγοκέντρου 50 ml. Αναμείξτε αναστρέφοντας στιγμιαία. 2. Επωάστε επί 15 λεπτά μέσα σε πάγο. Αναμείξτε αναστρέφοντας στιγμιαία δύο φορές κατά τη διάρκεια της επώασης. Σημείωση: Το θολό εναιώρημα γίνεται διαυγές κατά τη διάρκεια της επώασης, γεγονός που υποδεικνύει τη λύση των ερυθροκυττάρων. 3. Φυγοκεντρήστε στα 400 g επί 10 λεπτά, σε θερμοκρασία 4 C. Απορρίψτε ολόκληρο το υπερκείμενο. Φυλάξτε το ίζημα των λευκοκυττάρων. Σημείωση: Τα λευκοκύτταρα σχηματίζουν ίζημα κατά τη φυγοκέντρηση. Φροντίστε να απομακρύνετε όλο το υπερκείμενο. Τυχόν ίχνη ερυθροκυττάρων που απομένουν θα απομακρυνθούν με τα επόμενα βήματα. Η ατελής απομάκρυνση του υπερκειμένου θα οδηγήσει σε αναστολή της λύσης και αραίωση του κυτταρολύματος, γεγονός που θα επηρεάσει τις συνθήκες δέσμευσης του RNA στη μεμβράνη RNeasy. Και οι δύο αυτές συνέπειες μπορούν να ελαττώσουν την απόδοση ανάκτησης RNA. 4. Προσθέστε 20 ml ρυθμιστικού διαλύματος EL στο ίζημα λευκοκυττάρων και επανεναιωρήστε το ίζημα με επανειλημμένη αναρρόφηση και έγχυση με πιπέτα. 5. Φυγοκεντρήστε στα 400 g επί 10 λεπτά, σε θερμοκρασία 4 C. Απορρίψτε ολόκληρο το υπερκείμενο. Φυλάξτε το ίζημα των λευκοκυττάρων. Σημείωση: Τα επόμενα βήματα φυγοκέντρησης (π.χ. κατά την απομόνωση του RNA) πρέπει να πραγματοποιηθούν σε θερμοκρασία C. 6. Αποκολλήστε το ίζημα λευκοκυττάρων, αναστρέφοντας το σωληνάριο αφού προσθέσετε 4 ml ρυθμιστικού διαλύματος RLT στο οποίο έχει συμπληρωθεί β-me. Αναμείξτε με στροβιλισμό ή με επανειλημμένη αναρρόφηση και έγχυση με πιπέτα. Σημείωση: Βεβαιωθείτε ότι έχει προστεθεί β-me στο ρυθμιστικό διάλυμα RLT πριν από τη χρήση. 18 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

19 7. Διασπάστε το ίζημα χρησιμοποιώντας συμβατικό ομογενοποιητή ρότορα/στάτορα επί 45 δευτερόλεπτα τουλάχιστον, στη μέγιστη ταχύτητα, μέχρι να ομογενοποιηθεί πλήρως το μείγμα. Εναλλακτικά, στροβιλίστε το δείγμα επί 10 δευτερόλεπτα και περάστε το κυτταρόλυμα τουλάχιστον 10 φορές από μια βελόνα των gauge τοποθετημένη σε σύριγγα ελεύθερη RNασών. Σημείωση: Τυχόν ατελής διάσπαση θα μειώσει σημαντικά την απόδοση ανάκτησης επειδή θα αποφράξει τη στήλη RNeasy. Η διάσπαση με χρήση ομογενοποιητή ρότορα/στάτορα κατά κανόνα οδηγεί σε υψηλότερη ολική απόδοση ανάκτησης RNA σε σύγκριση με τις άλλες μεθόδους ομογενοποίησης. Σημείωση: Τα δείγματα μπορούν να φυλαχθούν σε θερμοκρασία -65 έως -90 C μέσα σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης μετά τη διάσπαση. Τα κατεψυγμένα δείγματα παραμένουν σταθερά επί αρκετούς μήνες. Απομόνωση ολικού RNA Αυτό το πρωτόκολλο προορίζεται για την απομόνωση ολικού κυτταρικού RNA από ομογενοποιημένο κυτταρόλυμα λευκοκυττάρων που έχει επανεναιωρηθεί σε 4 ml διαλύματος RLT/β-ME. Σημαντικές παρατηρήσεις πριν από την έναρξη Δεν απαιτείται πέψη με DNάση επειδή η τεχνολογία μεμβράνης πυριτίας RNeasy απομακρύνει αποτελεσματικά το μεγαλύτερο μέρος του DNA. Το ρυθμιστικό διάλυμα RLT και το ρυθμιστικό διάλυμα RW1 περιέχουν άλας γουανιδίνης και συνεπώς δεν είναι συμβατά με αντιδραστήρια απολύμανσης που περιέχουν λευκαντικό. Η γουανιδίνη είναι ερεθιστική. Λάβετε τα κατάλληλα μέτρα ασφάλειας και φορέστε γάντια πριν τη χειριστείτε. Το πρωτόκολλο RNeasy πρέπει να εκτελείται σε θερμοκρασία δωματίου. Να εργάζεστε γρήγορα κατά τη διάρκεια της διαδικασίας. Όλα τα βήματα φυγοκέντρησης εκτελούνται σε θερμοκρασία 20 έως 25 C. Βεβαιωθείτε ότι η φυγόκεντρος δεν θα ψυχρανθεί κάτω από τους 20 C. Σε κάθε βήμα φυγοκέντρησης, πρέπει να διέρχεται από τη στήλη ολόκληρος ο όγκος. Ίσως χρειαστεί να επαναληφθεί η φυγοκέντρηση. Απαραίτητα βήματα πριν από την έναρξη Εάν χρειάζεται, αποψύξτε το κυτταρόλυμα των λευκοκυττάρων σε θερμοκρασία δωματίου προτού ξεκινήσετε το πρωτόκολλο απομόνωσης RNA. Παρασκευάστε 4 ml διαλύματος αιθανόλης 70% ανά δείγμα. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/

20 Το ρυθμιστικό διάλυμα RPE παρέχεται υπό μορφή πυκνού διαλύματος. Προτού το χρησιμοποιήσετε για πρώτη φορά, προσθέστε 4 όγκους αιθανόλης (96 100%), όπως αναγράφεται στη φιάλη, για να παρασκευάσετε το διάλυμα εργασίας. Διαδικασία 1. Προσθέστε 4 ml διαλύματος αιθανόλης 70% στο κυτταρόλυμα και αναμείξτε σχολαστικά ανακινώντας ζωηρά. Μη φυγοκεντρήσετε. Σημείωση: Ενδέχεται να σχηματιστεί ορατό κατακρήμνισμα μετά την προσθήκη αιθανόλης. Διαλύστε πλήρως το κατακρήμνισμα με ζωηρή ανακίνηση και προχωρήστε αμέσως στο βήμα 2. Τυχόν ατελής διάλυση των κατακρημνισμάτων μπορεί να προκαλέσει μόλυνση με DNA με αποτέλεσμα να ληφθεί ακάθαρτο δείγμα ολικού RNA. 2. Μεταφέρετε το δείγμα, μαζί με τυχόν κατακρήμνισμα, σε μια στήλη RNeasy Midi τοποθετημένη σε σωληνάριο φυγοκέντρου των 15 ml (παρέχεται). Κλείστε μαλακά το σωληνάριο και φυγοκεντρήστε επί 5 λεπτά στα 4000 g. Απορρίψτε το υγρό που θα διέλθει από τη στήλη. Σημείωση: Ο μέγιστος όγκος φόρτωσης είναι 4 ml. Εάν ο όγκος υπερβαίνει τα 4,0 ml, φορτώστε διαδοχικά μερίδες στη στήλη RNeasy και φυγοκεντρήστε όπως περιγράφεται παραπάνω. Απορρίψτε το υγρό που θα διέλθει από τη στήλη μετά από κάθε βήμα φυγοκέντρησης. Χρησιμοποιήστε ξανά το σωληνάριο φυγοκέντρου στο βήμα Προσθέστε 4 ml ρυθμιστικού διαλύματος RW1 στη στήλη RNeasy. Κλείστε μαλακά το σωληνάριο φυγοκέντρου και φυγοκεντρήστε επί 5 λεπτά στα 4000 g για να εκπλυθεί η στήλη. Απορρίψτε το υγρό που θα διέλθει από τη στήλη. Σημείωση: Το διελθόν υγρό περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα RLT ή ρυθμιστικό διάλυμα RW1 και συνεπώς δεν είναι συμβατό με λευκαντικό. Χρησιμοποιήστε ξανά το σωληνάριο φυγοκέντρου στο βήμα Προσθέστε 2,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος RPE στη στήλη RNeasy. Κλείστε μαλακά το σωληνάριο φυγοκέντρου και φυγοκεντρήστε επί 2 λεπτά στα 4000 g για να εκπλυθεί η στήλη. Σημείωση: Το ρυθμιστικό διάλυμα RPE παρέχεται υπό μορφή πυκνού διαλύματος. Βεβαιωθείτε ότι έχει προστεθεί αιθανόλη στο ρυθμιστικό διάλυμα RPE πριν από τη χρήση. Χρησιμοποιήστε ξανά το σωληνάριο φυγοκέντρου στο βήμα 5. Δεν χρειάζεται να απορρίψετε το υγρό που θα διέλθει από τη στήλη. 20 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

21 5. Προσθέστε άλλα 2,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος RPE στη στήλη RNeasy. Κλείστε μαλακά το σωληνάριο φυγοκέντρου και φυγοκεντρήστε επί 5 λεπτά στα 4000 g για να στεγνώσει η μεμβράνη γέλης πυριτίας. Σημείωση: Είναι σημαντικό να στεγνώσει η μεμβράνη RNeasy επειδή τα υπολείμματα αιθανόλης μπορούν να επηρεάσουν τις περαιτέρω αντιδράσεις. Με τη φυγοκέντρηση αυτή εξασφαλίζεται ότι δεν θα μεταφερθεί αιθανόλη κατά τη διάρκεια της έκλουσης. Σημείωση: Μετά τη φυγοκέντρηση, αφαιρέστε τη στήλη RNeasy από το σωληνάριο φυγοκέντρου με προσοχή, έτσι ώστε η στήλη να μην έρθει σε επαφή με το διελθόν υγρό καθώς αυτό θα οδηγήσει σε μεταφορά αιθανόλης. 6. Για την έκλουση, μεταφέρετε τη στήλη RNeasy σε νέο σωληνάριο συλλογής των 15 ml (παρέχεται). Με μια πιπέτα, μεταφέρετε 200 µl νερού ελεύθερου RNασών απευθείας πάνω στη μεμβράνη γέλης πυριτίας RNeasy. Κλείστε μαλακά το σωληνάριο. Αφήστε το να ηρεμήσει επί 1 λεπτό και κατόπιν φυγοκεντρήστε επί 3 λεπτά στα 4000 g. 7. Επαναλάβετε το βήμα της έκλουσης (βήμα 6) χρησιμοποιώντας το έκλουσμα από το βήμα 6 και κατόπιν φυγοκεντρήστε επί 5 λεπτά στα 4000 g. Σημείωση: Για μακροχρόνια φύλαξη, το RNA μπορεί να αποθηκευτεί σε θερμοκρασία -65 έως -90 C. Ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός του RNA Η ποιότητα ανάλυσης εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την ποιότητα του αρχικού RNA. Συνιστούμε την ανάλυση του κεκαθαρμένου RNA μέσω ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης ή μέσω φασματοφωτομετρίας πριν από την ανάλυση. Για τη βαθμονόμηση του φασματοφωτομέτρου θα πρέπει να χρησιμοποιείται ένα τυφλό νερού, ελεύθερου νουκλεασών, κατάλληλου για PCR. Μια τιμή OD ίση με 1,0 στα 260 nm ισοδυναμεί με περίπου 40 µg/ml μονόκλωνου RNA. Μια τιμή λόγου OD 260 /OD 280 μεταξύ 1,8 και 2,1 υποδηλώνει ότι το RNA είναι υψηλής καθαρότητας. Για το βήμα της RT, απαιτείται συγκέντρωση RNA ίση με 200 ng/µl. Εάν η συγκέντρωση του RNA στο έκλουσμα είναι μικρότερη από 200 ng/µl, η συγκέντρωση RNA στο έκλουσμα θα πρέπει να αυξηθεί με χρήση του Rneasy MinElute Cleanup Kit (QIAGEN, αρ. κατ ). Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/

22 Εάν η συγκέντρωση RNA στο έκλουσμα είναι μεγαλύτερη από το ανώτατο όριο, θα πρέπει να ρυθμιστεί στα 200 ng/µl με νερό ελεύθερο RNασών. Σημείωση: Ελέγξτε τη συγκέντρωση RNA μετά την κανονικοποίηση. Συμπύκνωση του RNA (προαιρετικό βήμα) Αυτό το πρωτόκολλο έχει τελειοποιηθεί με σκοπό τη συμπύκνωση του RNA. Σημαντικές παρατηρήσεις πριν από την έναρξη Δεν απαιτείται πέψη με DNάση επειδή η τεχνολογία μεμβράνης πυριτίας RNeasy MinElute απομακρύνει αποτελεσματικά το μεγαλύτερο μέρος του DNA. Το ρυθμιστικό διάλυμα RLT περιέχει άλας γουανιδίνης και συνεπώς δεν είναι συμβατό με αντιδραστήρια απολύμανσης που περιέχουν λευκαντικό. Πραγματοποιήστε όλα τα βήματα της διαδικασίας σε θερμοκρασία δωματίου (15 25 C). Να εργάζεστε γρήγορα κατά τη διάρκεια της διαδικασίας. Εκτελέστε όλα τα βήματα φυγοκέντρησης στους C μέσα σε μια κοινή μικροφυγόκεντρο. Βεβαιωθείτε ότι η φυγόκεντρος δεν θα ψυχρανθεί κάτω από τους 20 C. Το ρυθμιστικό διάλυμα RLT μπορεί να σχηματίσει κατακρήμνισμα κατά τη φύλαξή του. Διαλύστε το με θέρμανση, εάν χρειάζεται, και φυλάξτε κατόπιν σε θερμοκρασία δωματίου (15 25 C). Απαραίτητα βήματα πριν από την έναρξη Παρασκευάστε 500 µl διαλύματος αιθανόλης 80% για κάθε δείγμα RNA προς συμπύκνωση. Το ρυθμιστικό διάλυμα RPE παρέχεται υπό μορφή πυκνού διαλύματος. Προτού το χρησιμοποιήσετε για πρώτη φορά, προσθέστε 4 όγκους αιθανόλης (96 100%), όπως αναγράφεται στη φιάλη, για να δημιουργηθεί ένα διάλυμα εργασίας. Προετοιμάστε τις στήλες σε θερμοκρασία δωματίου προτού ξεκινήσετε. Μετρήστε τον όγκο των δειγμάτων προς επεξεργασία και ρυθμίστε τον έτσι ώστε ο τελικός όγκος του δείγματος να είναι 200 µl. Διαδικασία 1. Αφού ρυθμίσετε το δείγμα σε όγκο 200 µl με νερό ελεύθερο RNασών, προσθέστε 700 µl ρυθμιστικού διαλύματος RLT και αναμείξτε καλά. 2. Προσθέστε 500 µl διαλύματος αιθανόλης % στο αραιωμένο RNA και αναμείξτε καλά με επανειλημμένη αναρρόφηση και έγχυση με πιπέτα. Μη φυγοκεντρήσετε. Προχωρήστε αμέσως στο βήμα Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

23 3. Μεταφέρετε μια ποσότητα δείγματος όχι μεγαλύτερη από 700 µl σε μια στήλη φυγοκέντρησης RNeasy MinElute τοποθετημένη μέσα σε σωληνάριο συλλογής των 2 ml (παρέχεται). Κλείστε μαλακά το καπάκι και φυγοκεντρήστε επί 15 δευτερόλεπτα σε ταχύτητα 8000 g ( σ.α.λ.). Απορρίψτε το υγρό που θα διέλθει από τη στήλη. Μεταφέρετε τυχόν εναπομείναν δείγμα (μέχρι 700 µl) και επαναλάβετε τη φυγοκέντρηση. Απορρίψτε το υγρό που θα διέλθει από τη στήλη. Σημείωση: Το διελθόν υγρό περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα RLT και συνεπώς δεν είναι συμβατό με λευκαντικό. Βλ. «Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις», σελ. 13, για πληροφορίες ασφάλειας. 4. Τοποθετήστε τη στήλη φυγοκέντρησης RNeasy MinElute σε νέο σωληνάριο συλλογής των 2 ml (παρέχεται). 5. Προσθέστε 500 µl ρυθμιστικού διαλύματος RPE στη στήλη φυγοκέντρησης. Κλείστε μαλακά το καπάκι και φυγοκεντρήστε επί 15 δευτερόλεπτα σε ταχύτητα 8000 g ( σ.α.λ.) για να εκπλυθεί η μεμβράνη της στήλης φυγοκέντρησης. Απορρίψτε το υγρό που θα διέλθει από τη στήλη. Σημείωση: Το ρυθμιστικό διάλυμα RPE παρέχεται υπό μορφή πυκνού διαλύματος. Βεβαιωθείτε ότι έχει προστεθεί αιθανόλη στο ρυθμιστικό διάλυμα RPE πριν από τη χρήση. Χρησιμοποιήστε ξανά το σωληνάριο συλλογής στο βήμα Προσθέστε 500 µl διαλύματος αιθανόλης 80% στη στήλη φυγοκέντρησης RNeasy MinElute. Κλείστε μαλακά το καπάκι και φυγοκεντρήστε επί 2 λεπτά στα 8000 g ( σ.α.λ.) για να εκπλυθεί η μεμβράνη της στήλης φυγοκέντρησης. Απορρίψτε το υγρό που θα διέλθει από τη στήλη, καθώς και το σωληνάριο συλλογής. Σημείωση: Το διελθόν υγρό περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα RLT και συνεπώς δεν είναι συμβατό με λευκαντικό. Σημείωση: Μετά τη φυγοκέντρηση, αφαιρέστε προσεκτικά τη στήλη φυγοκέντρησης RNeasy MinElute από το σωληνάριο συλλογής έτσι ώστε η στήλη να μην έρθει σε επαφή με το διελθόν υγρό. Διαφορετικά θα μεταφερθεί αιθανόλη στη στήλη. 7. Τοποθετήστε τη στήλη φυγοκέντρησης RNeasy MinElute σε νέο σωληνάριο συλλογής των 2 ml (παρέχεται). 8. Ανοίξτε το καπάκι της στήλης φυγοκέντρησης και φυγοκεντρήστε στη μέγιστη ταχύτητα για 5 λεπτά. Απορρίψτε το υγρό που θα διέλθει από τη στήλη, καθώς και το σωληνάριο συλλογής. 9. Για να αποφευχθεί η πρόκληση βλάβης στα καπάκια των στηλών φυγοκέντρησης, τοποθετήστε τις στήλες μέσα στη φυγόκεντρο έτσι ώστε να υπάρχει τουλάχιστον μία κενή θέση ανάμεσά τους. Στρέψτε τα καπάκια προς κατεύθυνση αντίθετη από την κατεύθυνση Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/

24 περιστροφής του ρότορα (π.χ. εάν ο ρότορας περιστρέφεται προς τα δεξιά, στρέψτε τα καπάκια προς τα αριστερά). 10. Είναι σημαντικό να στεγνώσει η μεμβράνη της στήλης περιστροφής επειδή τα υπολείμματα αιθανόλης μπορούν να επηρεάσουν τις περαιτέρω αντιδράσεις. Με τη φυγοκέντρηση των στηλών με ανοικτό καπάκι εξασφαλίζεται ότι δεν θα μεταφερθεί αιθανόλη κατά την έκλουση του RNA. 11. Τοποθετήστε τη στήλη φυγοκέντρησης RNeasy MinElute σε νέο σωληνάριο συλλογής των 1,5 ml (παρέχεται). 12. Προσθέστε 20 µl νερού ελεύθερου RNασών ακριβώς στο κέντρο της μεμβράνης της στήλης φυγοκέντρησης. Κλείστε μαλακά το καπάκι και φυγοκεντρήστε επί 1 λεπτό στη μέγιστη ταχύτητα για να εκλουστεί το RNA. 13. Αφού ολοκληρωθεί το βήμα της έκλουσης, τοποθετήστε τα δείγματα σε πάγο. 14. Μετρήστε τον όγκο των δειγμάτων προς επεξεργασία και ρυθμίστε τον έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση να είναι 200 ng/µl. Βλ. «Ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός του RNA» στη σελίδα 21 εάν χρειάζεστε περισσότερες λεπτομέρειες. Αντίστροφη μεταγραφή Απαραίτητα βήματα πριν από την έναρξη Αποψύξτε όλα τα απαιτούμενα συστατικά εκτός από την αντίστροφη μεταγραφάση, η οποία πρέπει να φυλάσσεται στον καταψύκτη όταν δεν χρησιμοποιείται. Τοποθετήστε σε πάγο τα σωληνάρια που περιέχουν τα συστατικά που θα αποψυχθούν για χρήση. Σημείωση: Η διάρκεια του σταδίου απόψυξης δεν θα πρέπει να υπερβεί τα 30 λεπτά, ώστε να αποφευχθεί ο κίνδυνος αποδόμησης του υλικού. Καθαρίστε την επιφάνεια του πάγκου που χρησιμοποιείται αποκλειστικά για την παρασκευή του μείγματος αντίστροφης μεταγραφής (RT) ώστε να αποφευχθεί η μόλυνση από μήτρα ή από νουκλεάσες. Αναμείξτε καλά, αναρροφώντας και εγχέοντας 10 φορές με πιπέτα το περιεχόμενο των σωληναρίων με τα αντιδραστήρια αντίστροφης μεταγραφής, τα δείγματα RNA, τους θετικούς ορούς ελέγχου και τον βαθμονομητή IS-MMR και φυγοκεντρήστε στιγμιαία πριν από τη χρήση. Κατόπιν φυλάξτε τα υλικά πάνω σε πάγο. Ο αρνητικός ορός ελέγχου RT παράγεται κατά το στάδιο αντίστροφης μεταγραφής με χρήση νερού ελεύθερου νουκλεασών, κατάλληλου για PCR. Η απαιτούμενη αρχική ποσότητα είναι 3 µg RNA ανά δείγμα. 24 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

25 Το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR περιέχει ποσότητα αντιδραστηρίων επαρκή για την πραγματοποίηση 3 εκτελέσεων ανάλυσης των 8 δειγμάτων. Διαδικασία 1. Επωάστε 15 µl του κάθε δείγματος, των θετικών ορών ελέγχου (υψηλής και χαμηλής συγκέντρωσης), νερού (για την παραγωγή του αρνητικού ορού ελέγχου RT) και του βαθμονομητή IS-MMR επί 5 λεπτά στους 65 C. Κατόπιν ψύξτε τα αμέσως σε πάγο επί 5 λεπτά τουλάχιστον. 2. Φυγοκεντρήστε στιγμιαία (περίπου 5 δευτερόλεπτα), ώστε να συγκεντρωθεί το υγρό στον πυθμένα του σωληναρίου. Κατόπιν φυλάξτε τα υλικά πάνω σε πάγο. 3. Παρασκευάστε το παρακάτω μείγμα RT ανάλογα με τον αριθμό των δειγμάτων, ορών ελέγχου και βαθμονομητών υπό επεξεργασία (Πίνακας 1). Πίνακας 1. Παρασκευή μείγματος RT Συστατικό Όγκος ανά δείγμα (µl) Μείγμα RT: αντιδράσεις (µl) Τελική συγκέντρωση Μείγμα RT, 3,33 7,5 97,5 1 Αντίστροφη μεταγραφάση, 10 Τελικός όγκος μείγματος RT (που θα προστεθεί στο βήμα 4) Δείγμα, θετικοί οροί ελέγχου, βαθμονομητής IS-MMR ή νερό (από το βήμα 1) 2,5 32, έκαστο Συνολικός όγκος έκαστο Σημείωση: Ο τελικός όγκος ανά αντίδραση πρέπει να είναι 25 µl. 4. Με μια πιπέτα, μεταφέρετε 10 µl μείγματος RT σε καθένα από τα σημασμένα σωληνάρια που περιέχουν δείγμα RNA, θετικό ορό ελέγχου, νερό ή βαθμονομητή (από το βήμα 3). Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/

26 5. Αναμείξτε καλά, αναρροφώντας και εγχέοντας με πιπέτα το περιεχόμενο των σωληναρίων 10 φορές, και κατόπιν φυγοκεντρήστε στιγμιαία (περίπου 5 δευτερόλεπτα) ώστε να συγκεντρωθεί το υγρό στον πυθμένα του σωληναρίου. Σημείωση: Επανατοποθετήστε όλα τα αντιδραστήρια αντίστροφης μεταγραφής του κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR στον καταψύκτη αφού προετοιμάσετε τις αντιδράσεις, για να αποφύγετε τυχόν αποδόμηση των υλικών. 6. Τοποθετήστε τα σωληνάρια στον θερμοκυκλοποιητή και ρυθμίστε το πρόγραμμα αντίστροφης μεταγραφής (Πίνακας 2). Πίνακας 2. Προφίλ θερμοκρασίας Αντίστροφη μεταγραφή 1 Θερμοκρασία: 25 C Χρόνος: 10 min Αντίστροφη μεταγραφή 2 Θερμοκρασία: 46 C Χρόνος: 45 min Αδρανοποίηση Θερμοκρασία: 85 C Χρόνος: 5 min Ψύξη Θερμοκρασία: 4 C Χρόνος: 5 min 7. Αφού ολοκληρωθεί το πρόγραμμα, φυγοκεντρήστε τα σωληνάρια στιγμιαία (περίπου 5 δευτερόλεπτα) ώστε να συγκεντρωθεί το υγρό στον πυθμένα του σωληναρίου. Αφήστε τα σωληνάρια μέσα σε πάγο ή σε θερμοκρασία -20 C μέχρι να εκτελέσετε το πείραμα qpcr. qpcr στο όργανο Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM με ρότορα 72 σωληναρίων Συνιστούμε την εκτέλεση όλων των μετρήσεων εις διπλούν, όπως αναφέρεται στον Πίνακα 3. Το κιτ επαρκεί για την ανάλυση 8 δειγμάτων cdna στο ίδιο πείραμα, εις διπλούν. Μπορούν να πραγματοποιηθούν τρία πειράματα με το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR. 26 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

27 Πίνακας 3. Αριθμός αντιδράσεων για το όργανο Rotor-Gene Q με ρότορα 72 σωληναρίων Δείγμα Με το μείγμα qpcr Mix ABL1 (34 αντιδράσεις) Αντιδράσεις 8 δείγματα cdna 8 2 αντιδράσεις 1 θετικός ορός ελέγχου cdna υψηλής συγκέντρωσης 1 θετικός ορός ελέγχου cdna χαμηλής συγκέντρωσης 2 αντιδράσεις 2 αντιδράσεις 1 βαθμονομητής cdna IS-MMR 2 αντιδράσεις Πρότυπα κοινού πλασμιδίου Αρνητικός ορός ελέγχου RT Δείγμα ελέγχου καθαρού νερού Με το μείγμα qpcr Mix Mbcr (34 αντιδράσεις) 4 2 αντιδράσεις (SP3, SP4, SP5 και SP6) 2 αντιδράσεις 2 αντιδράσεις 8 δείγματα cdna 8 2 αντιδράσεις 1 θετικός ορός ελέγχου cdna υψηλής συγκέντρωσης 1 θετικός ορός ελέγχου cdna χαμηλής συγκέντρωσης 2 αντιδράσεις 2 αντιδράσεις 1 βαθμονομητής cdna IS-MMR 2 αντιδράσεις Πρότυπα κοινού πλασμιδίου Δείγμα ελέγχου καθαρού νερού 5 2 αντιδράσεις (SP1, SP2, SP3, SP5 και SP6) 2 αντιδράσεις Επεξεργασία δειγμάτων σε όργανο Rotor-Gene Q MDx με ρότορα 72 σωληναρίων Συνιστούμε την εξέταση τουλάχιστον 8 δειγμάτων cdna στο ίδιο πείραμα προκειμένου να αξιοποιηθούν καλύτερα τα πρότυπα και τα μείγματα εκκινητών και ανιχνευτών. Η διάταξη ρότορα στην Εικόνα 3 αποτελεί ένα παράδειγμα πειράματος. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/

28 qpcr μείγμα Mbcr Taq DNA πολυμεράση qpcr μείγμα ABL1 Taq DNA πολυμεράση Ανίχνευση Bcr-ABL1 Mbcr Ανίχνευση ABL1 Θέση #1 Εικόνα 3. Προετοιμασία ρότορα για κάθε πείραμα. SP1 SP6: Πρότυπα BCR-ABL1 Mbcr και ABL1, HC: Θετικός ορός ελέγχου υψηλής συγκέντρωσης, LC: Θετικός ορός ελέγχου χαμηλής συγκέντρωσης, IS-Cal: Βαθμονομητής IS-MMR, RTneg: Αρνητικός ορός ελέγχου RT, S1 S8: Δείγματα cdna, H 2 O: Δείγμα ελέγχου με καθαρό νερό. Σημείωση: Τοποθετήστε κενά σωληνάρια σε όλες τις κενές θέσεις. 28 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

29 Απαραίτητα βήματα πριν από την έναρξη Αποψύξτε όλα τα απαιτούμενα συστατικά εκτός από την Taq DNA πολυμεράση, η οποία πρέπει να φυλάσσεται στον καταψύκτη όταν δεν χρησιμοποιείται. Τοποθετήστε σε πάγο τα σωληνάρια που περιέχουν τα συστατικά που θα αποψυχθούν για χρήση. Σημείωση: Η διάρκεια του σταδίου απόψυξης δεν θα πρέπει να υπερβεί τα 30 λεπτά, ώστε να αποφευχθεί ο κίνδυνος αποδόμησης του υλικού. Καθαρίστε την επιφάνεια του πάγκου που χρησιμοποιείται αποκλειστικά για την παρασκευή των μειγμάτων PCR ώστε να αποφευχθεί η μόλυνση από μήτρα ή από νουκλεάσες. Αναμείξτε καλά, αναρροφώντας και εγχέοντας 10 φορές με πιπέτα το περιεχόμενο των σωληναρίων που περιέχουν το μείγμα qpcr Mix ABL1 και το μείγμα qpcr Mix Mbcr και φυγοκεντρήστε στιγμιαία πριν από τη χρήση. Κατόπιν φυλάξτε τα υλικά πάνω σε πάγο. Διαδικασία 1. Παρασκευάστε το παρακάτω κύριο μείγμα PCR ανάλογα με τον αριθμό των δειγμάτων υπό επεξεργασία. Ο Πίνακας 4 περιγράφει τη μέθοδο μεταφοράς με πιπέτα για την παρασκευή ενός μείγματος αντιδραστηρίων, με ποσότητες υπολογισμένες για τελικό όγκο διαλύματος αντίδρασης 25 μl. Παρασκευάζεται ένα προμείγμα, ανάλογα με τον αριθμό των αντιδράσεων, με χρήση του ίδιου μείγματος εκκινητών και ανιχνευτών (είτε μείγμα qpcr Mix ABL1 είτε μείγμα qpcr Mix Mbcr). Έχουν συμπεριληφθεί περίσσειες όγκου για να αντισταθμιστεί τυχόν σφάλμα μεταφοράς. Σημείωση: Μη χρησιμοποιείτε όγκους αντίδρασης (μείγμα αντίδρασης συν δείγμα) μικρότερους από 25 µl. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/

30 Πίνακας 4. Προετοιμασία κύριου μείγματος PCR Συστατικό Μείγμα qpcr (είτε μείγμα qpcr Mix ABL1 είτε μείγμα qpcr Mix Mbcr) 1 αντίδραση Προμείγμα ABL1 ή Mbcr: αντιδράσεις (µl) Τελική συγκέντρωση 19, Taq DNA πολυμεράση 0, Δείγμα, πρότυπο, ορός ελέγχου ή βαθμονομητής IS-MMR (για προσθήκη στο βήμα 3) 5 5 έκαστο Συνολικός όγκος έκαστο 2. Μεταφέρετε 20 µl προμείγματος qpcr σε κάθε σωληνάριο Rotor- Gene Q του 0,1 ml. 3. Προσθέστε 5 µl προϊόντος RT (cdna) που ελήφθη από τις αντίστροφες μεταγραφές (βλ. «Αντίστροφη μεταγραφή», σελ. 24), προτύπου, ορού ελέγχου ή βαθμονομητή IS-MMR, σύμφωνα με τη διάταξη δείγματος που φαίνεται στην Εικόνα 3 (συνολικός όγκος 25 µl). 4. Αναμείξτε μαλακά με επανειλημμένη αναρρόφηση και έγχυση με την πιπέτα. 5. Τοποθετήστε τα σωληνάρια στον προσαρμογέα που παρέχεται με το όργανο. 6. Οι κενές θέσεις πρέπει να γεμίσουν με κενά σωληνάρια. 7. Τοποθετήστε τον δακτύλιο ασφάλισης πάνω από τα σωληνάρια και πιέστε τον για να κλειδώσει. 8. Τοποθετήστε τον γεμάτο προσαρμογέα μέσα στο όργανο Rotor- Gene Q MDx. 9. Προγραμματίστε το όργανο Rotor-Gene Q MDx με το πρόγραμμα θερμοκυκλοποίησης που δίνεται στον Πίνακα 5. Σημείωση: Επανατοποθετήστε όλα τα συστατικά του κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR στον καταψύκτη για να αποφύγετε τυχόν αποδόμηση των υλικών. 30 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

31 Πίνακας 5. Προφίλ θερμοκρασίας Μέθοδος ανάλυσης Ποσοτικός προσδιορισμός Hold 1 (Διατήρηση 1) Θερμοκρασία: 95 C Cycling (Κύκλοι) Χρόνος: 15 min 50 κύκλοι 94 C, 15 s 60 C, 60 s με μέτρηση φθορισμού FAM στο πράσινο κανάλι 10. Πατήστε το «Gain Optimisation» (Βελτιστοποίηση απολαβής) στο πλαίσιο διαλόγου «New Run Wizard» (Οδηγός νέας ανάλυσης) για να ανοίξετε το πλαίσιο διαλόγου «Auto-Gain Optimisation Setup» (Ρυθμίσεις βελτιστοποίησης αυτόματης απολαβής). Βεβαιωθείτε ότι το εύρος για το πράσινο κανάλι είναι από «5 Fl» για το «Min Reading» (Ελάχιστη τιμή ανάγνωσης) μέχρι «10 Fl» για το «Max Reading» (Μέγιστη τιμή ανάγνωσης) και ότι το αποδεκτό εύρος του «Gain» (Απολαβή) είναι από -10 έως Βεβαιωθείτε ότι έχει σημειωθεί το πλαίσιο «Perform Optimisation Before 1st Acquisition» (Να γίνει βελτιστοποίηση πριν από την 1η λήψη) και κλείστε το πλαίσιο διαλόγου «Auto-Gain Optimisation Setup». 12. Ξεκινήστε το πρόγραμμα θερμικών κύκλων. 13. Δημιουργήστε υποομάδες ABL1 και Mbcr, συμπληρώνοντας το παράθυρο «Edit samples» (Επεξεργασία δειγμάτων). 14. Αφού ολοκληρωθούν οι θερμικοί κύκλοι, ρυθμίστε τα «Options» (Επιλογές) και «Crop Start Cycles» (Διαγραφή κύκλων έναρξης). Διαγράψτε τα στοιχεία πριν από τον κύκλο 10. Κατόπιν επιλέξτε «Analysis» και «Cycling A. Green from 10» (Κύκλοι Α. Πράσινο από το 10), που θα υποδειχθεί στην αναφορά ως «left threshold = 10.00» (αριστερό όριο = 10,00). 15. Για το ABL1 και για το Mbcr, προχωρήστε ως εξής: Εάν ανοίξει το παράθυρο «Calculate Automatic Threshold» (Υπολογισμός αυτόματου ορίου), πατήστε «Cancel» (Ακύρωση). Ρυθμίστε το όριο στην τιμή 0,03 (στην κάτω δεξιά πλευρά του παραθύρου). Επιλέξτε τη μέθοδο κανονικοποίησης «Dynamic Tube» (Δυναμικό σωληνάριο) στην αναφορά και επιλέξτε «Slope Correct» (Διόρθωση κλίσης) για να διορθώσετε την κλίση θορύβου. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/

32 Βεβαιωθείτε ότι η ρύθμιση «Outlier Removal» (Αφαίρεση έκτοπων τιμών) έχει την τιμή 0% (που αντιστοιχεί στο όριο NTC) και ότι η ρύθμιση «Reaction Efficiency Threshold» (Όριο απόδοσης αντίδρασης) είναι απενεργοποιημένη. Ρυθμίστε το διάγραμμα σε γραμμική κλίμακα και επιλέξτε «Auto-Scale» (Αυτόματη κλίμακα). Κάντε δεξί κλικ στο παράθυρο όπου προβάλλονται οι καμπύλες ενίσχυσης και βεβαιωθείτε ότι η ρύθμιση «Digital filter» (Ψηφιακό φίλτρο) έχει την τιμή «Light» (Ελαφρό). Επιλέξτε «named on» (ονομασμένα ενεργά) στη δεξιά πλευρά του παραθύρου για να βεβαιωθείτε ότι προβάλλονται όλα τα δείγματα. Αφού ολοκληρωθούν όλα τα βήματα, βεβαιωθείτε ότι γίνεται καταγραφή πρωτογενών δεδομένων και προχωρήστε στην ανάλυση των αποτελεσμάτων όπως περιγράφεται παρακάτω. 32 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

33 Αποτελέσματα Αρχή ανάλυσης δεδομένων Με την τεχνολογία TaqMan, ο αριθμός των κύκλων PCR που απαιτείται για να ανιχνευτεί ένταση σήματος ισχυρότερη από το όριο ονομάζεται κύκλος ορίου (C T ) και είναι ευθέως ανάλογος με την ποσότητα στόχου που υπάρχει στην αρχή της αντίδρασης. Με τη χρήση προτύπων με γνωστό αριθμό μορίων μπορεί να σχεδιαστεί μια πρότυπη καμπύλη και να προσδιοριστεί η ακριβής ποσότητα στόχου που υπάρχει στο εξεταζόμενο δείγμα. Οι πρότυπες καμπύλες βασίζονται σε πλασμίδια. Για να διασφαλιστεί η ορθότητα των πρότυπων καμπυλών, χρησιμοποιούνται 4 τυπικές αραιώσεις για το ABL1 και 5 τυπικές αραιώσεις για το Mbcr. Το κιτ περιλαμβάνει επίσης έναν βαθμονομητή IS, που επιτρέπει τη μετατροπή των αποτελεσμάτων στη διεθνή κλίμακα. Στις εικόνες 4 και 5 φαίνονται παραδείγματα καμπυλών ενίσχυσης TaqMan όμοιων με αυτές που λαμβάνονται με τα πρότυπα, τον βαθμονομητή IS-MMR, τον θετικό ορό ελέγχου RNA υψηλής συγκέντρωσης και τον θετικό ορό ελέγχου RNA χαμηλής συγκέντρωσης με το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR. Κανονικοποιημένος φθορισμός 0,60 0,55 0,50 Θετικός ορός ελέγχου 0,45 χαμηλής συγκέντρωσης 0,40 Βαθμονομητής IS-MMR 0,35 Θετικός ορός ελέγχου 0,30 υψηλής συγκέντρωσης 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 Όριο Κύκλος Εικόνα 4. Ανίχνευση του ABL1 με ορούς ελέγχου και πρότυπα SP3, SP4, SP5 και SP , 10 4, 10 5 και 10 6 αντίγραφα/αντίδραση. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/

34 Κανονικοποιημένος φθορισμός 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 Θετικός ορός ελέγχου υψηλής συγκέντρωσης Βαθμονομητής IS-MMR 0,2 0,1 0,0 Όριο Θετικός ορός ελέγχου χαμηλής συγκέντρωσης Κύκλος Εικόνα 5. Ανίχνευση του BCR-ABL1 Mbcr με ορούς ελέγχου και πρότυπα SP1, SP2, SP3, SP5 και SP , 10 2, 10 3, 10 5 και 10 6 αντίγραφα/αντίδραση. Πρότυπες καμπύλες και κριτήρια ποιότητας για τα πρωτογενή δεδομένα Αναπαραγωγιμότητα μεταξύ επαναλήψεων Η μεταβλητότητα των τιμών C T μεταξύ επαναλήψεων πρέπει να είναι 2 διαφορετικά η επανάληψη θα πρέπει να ακυρωθεί, εκτός από τις παρακάτω περιπτώσεις: Εάν ο μέσος C T 36 ή εάν C Ta 36 και ο C Tb είναι «not detected» (δεν ανιχνεύτηκε), τότε τα κριτήρια C T δεν ισχύουν και η επανάληψη θεωρείται αποδεκτή. Σε αυτή την περίπτωση, ο αριθμός αντιγράφων (CN) που υπολογίζεται για τον C Ta θα πρέπει να διαιρεθεί διά 2. Σημείωση: Οι χρήστες θα πρέπει να μετρήσουν την αναπαραγωγιμότητα στο εργαστήριό τους. Πρότυπες καμπύλες Μπορείτε να επικολλήσετε τα πρωτογενή δεδομένα σε ένα αρχείο Excel για ανάλυση. Για κάθε γονίδιο (ABL1 και BCR-ABL1 Mbcr), οι τιμές C T που λαμβάνονται από τυπικές αραιώσεις του πλασμιδίου σχεδιάζονται σε καμπύλη ανάλογα με τον λογάριθμο του αριθμού αντιγράφων (3, 4, 5, και 6 για τα SP3, SP4, SP5 και SP6, και 1, 2, 3, 5 και 6 για τα SP1, SP2, SP3, SP5 και SP6). Στην Εικόνα 6 φαίνεται ένα παράδειγμα καμπύλης ABL1 που σχεδιάστηκε με βάση 4 τυπικές αραιώσεις. Στην Εικόνα 7 φαίνεται ένα παράδειγμα καμπύλης BCR-ABL1 Mbcr που σχεδιάστηκε με βάση 5 τυπικές αραιώσεις. 34 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

35 y = -3,359x + 37,829 R 2 = 0,9999 Εικόνα 6. Πρότυπη καμπύλη για το ABL1, υπολογισμένη με βάση 4 τυπικές αραιώσεις. Υπολογίζεται μια γραμμική καμπύλη παλινδρόμησης (y = ax + b), όπου a είναι η κλίση της ευθείας και b είναι η τεταγμένη, δηλαδή το σημείο όπου η ευθεία τέμνει τον άξονα y. Η εξίσωση και ο συντελεστής προσδιορισμού (R²) φαίνονται στο διάγραμμα. y = -3,503x + 37,283 R 2 = 0,99945 Εικόνα 7. Πρότυπη καμπύλη για το BCR-ABL1 Mbcr, υπολογισμένη με βάση 5 τυπικές αραιώσεις. Υπολογίζεται μια γραμμική καμπύλη παλινδρόμησης (y = ax + b), όπου a είναι η κλίση της ευθείας και b είναι η τεταγμένη, δηλαδή το σημείο όπου η ευθεία τέμνει τον άξονα y. Η εξίσωση και ο συντελεστής προσδιορισμού (R²) φαίνονται στο διάγραμμα. Καθώς τα πρότυπα παράγονται με αραιώσεις 1:10, η θεωρητική κλίση της καμπύλης είναι -3,3. Μια κλίση μεταξύ -3,1 και -3,6 είναι αποδεκτή εφόσον ο R² είναι > 0,95. Ωστόσο, η επιθυμητή τιμή R² για αποτελέσματα υψηλής ακρίβειας είναι > 0,98. Σημείωση: Η τυπική αραίωση SP1 (πλασμίδιο BCR-ABL1, 10 αντίγραφα) πρέπει να είναι ανιχνεύσιμη προκειμένου να προσδιοριστεί η πρότυπη καμπύλη BCR-ABL Mbcr. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/

36 Αριθμός αντιγράφων (copy number, CN) Η εξίσωση πρότυπης καμπύλης ABL1 ή BCR-ABL1 Mbcr θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί για να μετασχηματιστούν οι πρωτογενείς τιμές C T (που έχουν ληφθεί με το μείγμα qpcr Mix ABL1 ή το μείγμα qpcr Mix Mbcr για τα άγνωστα δείγματα) σε αριθμούς αντιγράφων ABL1 ή BCR-ABL1 (ABL1 CN και BCR-ABL1 Mbcr CN ). Log 10 δείγματος ABL1 CN = Μέση τιμή ABL C T Τεταγμένη πρότυπης καμπύλης ABL1 Κλίση πρότυπης καμπύλης ABL Log 10 δείγματος BCR-ABL1 Mbcr CN = Μέση τιμή BCR-ABL1 Mbcr C T Τεταγμένη πρότυπης καμπύλης BCR-ABL1 Mbcr Κλίση πρότυπης καμπύλης BCR-ABL1 Mbcr Έλεγχος ποιότητας όλων των τιμών ABL1 CN Η κακή ποιότητα του RNA ή τυχόν προβλήματα κατά την RT-qPCR θα οδηγήσουν ενδεχομένως σε χαμηλό αριθμό αντιγράφων ABL1. Για να έχει βέλτιστη ευαισθησία η ανάλυση, ο ABL1CN θα πρέπει να είναι ίσος ή μεγαλύτερος από για τον θετικό ορό ελέγχου RNA υψηλής συγκέντρωσης, τον θετικό ορό ελέγχου RNA χαμηλής συγκέντρωσης και τον βαθμονομητή IS-MMR. Αρνητικός ορός ελέγχου RT και δείγμα ελέγχου καθαρού νερού Ο ορός ελέγχου χωρίς μήτρα (no template control, NTC) για το βήμα της PCR (δείγμα ελέγχου καθαρού νερού) και το βήμα αντίστροφης μεταγραφής (αρνητικός ορός ελέγχου RT) θα πρέπει να δώσουν μηδενικό CN τόσο για το ABL1 όσο και για το BCR-ABL1 Mbcr. Κατά συνέπεια, δεν θα πρέπει να ληφθεί τιμή C T ή η τιμή C T θα πρέπει να είναι υψηλότερη από την τεταγμένη των αντίστοιχων πρότυπων καμπυλών. Τυχόν θετικό αποτέλεσμα από αυτούς τους NTC δείχνει διασταυρούμενη μόλυνση κατά την αντίστροφη μεταγραφή ή/και την qpcr. Κανονικοποιημένος αριθμός αντιγράφων (normalized copy number, NCN) Ο λόγος αυτών των τιμών CN αποτελεί τον κανονικοποιημένο αριθμό αντιγράφων (NCN): NCN = BCR-ABL1 Mbcr CN ABL1 CN Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

37 Υπολογίστε το αποτέλεσμα NCN για τον θετικό ορό ελέγχου RNA υψηλής συγκέντρωσης (NCN HC ), τον θετικό ορό ελέγχου RNA χαμηλής συγκέντρωσης (NCN LC ), τον βαθμονομητή IS MMR (NCN βαθμ. ) και κάθε δείγμα (NCN δείγμα ). Έλεγχος ποιότητας των τιμών κανονικοποιημένων αριθμών αντιγράφων Ο θετικός ορός ελέγχου RNA υψηλής συγκέντρωσης, ο θετικός ορός ελέγχου RNA χαμηλής συγκέντρωσης και ο βαθμονομητής IS-MMR επιτρέπουν την παρακολούθηση των βημάτων αντίστροφης μεταγραφής και ενίσχυσης του ABL1 και του BCR-ABL1 Mbcr κατά τον ποσοτικό προσδιορισμό των μεταγράφων. Το αποτέλεσμα NCN που θα ληφθεί για τον βαθμονομητή IS-MMR μετά την εξέταση με το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR πρέπει να είναι μεταξύ 0,05 και 0,3, καθώς διαφορετικά οι τιμές NCN δεν μπορούν να μετατραπούν στη διεθνή κλίμακα. Η ευαισθησία του πειράματος μπορεί να αξιολογηθεί μόνον εάν ανιχνευτεί ο θετικός ορός ελέγχου RNA χαμηλής συγκέντρωσης. Μετατροπή στη διεθνή κλίμακα Σημείωση: Πριν από την ερμηνεία, δείτε την τιμή που αναγράφεται στην ετικέτα του σωληναρίου του βαθμονομητή IS-MMR ή στο πιστοποιητικό ανάλυσης που συνοδεύει το κιτ. (Βεβαιωθείτε ότι η ίδια τιμή αναγράφεται στην ετικέτα και στο πιστοποιητικό). Χρησιμοποιήστε το πειραματικό αποτέλεσμα NCN για τον βαθμονομητή IS-MMR (NCN βαθμ. ) και την αντιστοιχισμένη τιμή (τιμή IS-Cal) που αναγράφεται στο πιστοποιητικό ανάλυσης για να υπολογίσετε τον κανονικοποιημένο αριθμό αντιγράφων στη διεθνή κλίμακα (IS-NCN δείγμα ). IS-NCN δείγμα = NCN δείγμα τιμή IS-Cal NCN βαθμ. Έλεγχος ποιότητας των τιμών IS-NCN Το αποτέλεσμα IS-NCN HC (NCN στη διεθνή κλίμακα για τον θετικό ορό ελέγχου RNA υψηλής συγκέντρωσης) δεν θα πρέπει να δείχνει μείζονα μοριακή ανταπόκριση («No MMR», βλ. «Αναφορά μοριακής ανταπόκρισης» παρακάτω). Το αποτέλεσμα IS-NCN LC (NCN στη διεθνή κλίμακα για τον θετικό ορό ελέγχου RNA χαμηλής συγκέντρωσης) θα πρέπει να είναι < 0,01 (MR4) ώστε να διασφαλιστεί ότι είναι δυνατόν να εξακριβωθεί με αξιοπιστία η κατάσταση MR4.5. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/

38 Αναφορά μοριακής ανταπόκρισης Προσδιορίστε τον βαθμό (κατάσταση) μοριακής ανταπόκρισης σε κάθε δείγμα ανάλογα με την ερμηνεία στον Πίνακα 6. Περίληψη των κριτηρίων ποιότητας Στον Πίνακα 7 συνοψίζονται τα διάφορα κριτήρια ποιότητας και οι αντίστοιχες τιμές ή αποτελέσματα. 38 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

39 Πίνακας 6. Αναφορά μοριακής ανταπόκρισης Περίπτωση ABL CN BCR-ABL1 Mbcr CN IS-NCN% Κατάσταση 1 < < 10 2 < CN ABL < CN ABL < CN ABL Δείγμα κακής ποιότητας 10 > 0,1 Χωρίς MMR 10 0,1 Απροσδιόριστο LOD LOB < CN < LOD Αντικατάσταση CN από LOD > 0,1 Χωρίς MMR 0,1 MMR > 0,1 Χωρίς MMR 0,1 MMR LOB Δεν ανιχνεύτηκε/mr4 LOD LOB < CN < LOD Αντικατάσταση CN από LOD > 0,1 Χωρίς MMR 0,01 < IS 0,1 MMR 0,01 MR4 > 0,1 Χωρίς MMR 0,01 < IS 0,1 MMR 0,01 LOB LOD LOB < CN < LOD Αντικατάσταση CN από LOD MR4 Δεν ανιχνεύτηκε/mr4.5 > 0,1 Χωρίς MMR 0,01 < IS 0,1 MMR 0,0032 < IS 0,01 MR4 0,0032 MR4.5 > 0,1 Χωρίς MMR 0,01 < IS 0,1 MMR 0,0032 < IS 0,01 MR4 0,0032 MR4.5 LOB Δεν ανιχνεύτηκε/mr5 LOB: όριο τυφλού, LOD: όριο ανίχνευσης, MR: μοριακή ανταπόκριση, MMR: μείζων μοριακή ανταπόκριση. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/

40 Πίνακας 7. Περίληψη κριτηρίων ποιότητας Κριτήρια Αποδεκτές τιμές/αποτελέσματα Διακυμάνσεις των τιμών C T μεταξύ επαναλήψεων Κλίση των πρότυπων καμπυλών Μεταξύ -3,1 και -3,6 2 C T Εκτός εάν ο μέσος C T 36 ή εάν C Ta 36 και ο C Tb είναι «not detected» (δεν ανιχνεύτηκε): η επανάληψη θεωρείται αποδεκτή. Ο CN που θα υπολογιστεί για τον C Ta θα πρέπει να διαιρεθεί διά 2. R 2 των πρότυπων καμπυλών Τουλάχιστον > 0,95 (και ιδανικά > 0,98) Τυπική αραίωση SP1 (BCR-ABL1, 10 αντίγραφα πλασμιδίου) Πρέπει να είναι ανιχνεύσιμη για να σχηματιστεί η πρότυπη καμπύλη Έλεγχος ποιότητας για την τιμή ABL CN για βιολογικά δείγματα Θετικός ορός ελέγχου RNA υψηλής συγκέντρωσης, θετικός ορός ελέγχου RNA χαμηλής συγκέντρωσης και βαθμονομητής IS-MMR Οροί ελέγχου NTC (νερό) και RTneg Λαμβάνεται NCN για τον βαθμονομητή IS-MMR (NCN βαθμ. ) High Positive RNA Control (Θετικός ορός ελέγχου RNA υψηλής συγκέντρωσης) Low Positive RNA Control (Θετικός ορός ελέγχου RNA χαμηλής συγκέντρωσης) IS-NCN HC IS-NCN LC Βλ. Πίνακα 6 ABL1 CN Για καθένα: ABL1 CN = 0 και Mbcr CN = 0 (καμία τιμή C T ή C T > τεταγμένη πρότυπης καμπύλης) Πρέπει να είναι μεταξύ 0,05 και 0,3 Πρέπει να ανιχνευτεί Πρέπει να ανιχνευτεί Κατάσταση: Χωρίς μείζονα μοριακή ανταπόκριση IS-NCN LC 0,01 (MR4) Πρέπει να ανιχνευτεί για να διασφαλιστεί ότι είναι δυνατόν να εξακριβωθεί με αξιοπιστία η κατάσταση MR4.5. C T : κύκλος ορίου, HC: θετικός ορός ελέγχου υψηλής συγκέντρωσης, IS: διεθνές πρότυπο, LC: χαμηλός ορός ελέγχου, MR: μοριακή ανταπόκριση, MMR: μείζων μοριακή ανταπόκριση, NCN: κανονικοποιημένος αριθμός αντιγράφων, NTC: ορός ελέγχου χωρίς μήτρα, RTneg: αρνητικό για αντίστροφη μεταγραφή. 40 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

41 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων Αυτός ο οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων μπορεί να σας βοηθήσει στην επίλυση ενδεχόμενων προβλημάτων. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε και στη σελίδα Frequently Asked Questions (Συχνές ερωτήσεις) του Κέντρου τεχνικής υποστήριξης της εταιρείας μας: Οι επιστήμονες των τμημάτων Τεχνικής Υποστήριξης της QIAGEN είναι πάντοτε πρόθυμοι να απαντήσουν σε τυχόν ερωτήσεις σχετικά με τις πληροφορίες και τα πρωτόκολλα που περιέχονται στο παρόν εγχειρίδιο ή τις τεχνολογίες προετοιμασίας δειγμάτων και ανάλυσης (για πληροφορίες επικοινωνίας, βλ. οπισθόφυλλο ή επισκεφθείτε την ιστοσελίδα Απομόνωση RNA Σχόλια και συστάσεις Για την αντιμετώπιση προβλημάτων κατά την απομόνωση RNA από ολικό αίμα με χρήση του RNeasy Midi Kit και του ρυθμιστικού διαλύματος Buffer EL, ανατρέξτε στα εγχειρίδια των αντίστοιχων κιτ. Ανεπαρκές RNA στο έκλουσμα Χρησιμοποιήθηκε ανεπαρκές αίματος Ανεπαρκές RNA στο έκλουσμα Η συγκέντρωση RNA πρέπει να είναι 200 ng/µl για να επιτευχθεί άριστη ευαισθησία Επαναλάβετε την απομόνωση του RNA χρησιμοποιώντας περισσότερα δείγματα. Εξετάστε το ενδεχόμενο να αναμείξετε τα εκλούσματα και να συμπυκνώσετε το RNA χρησιμοποιώντας το RNeasy MinElute Cleanup Kit (αρ. κατ ). Χρησιμοποιήστε το RNeasy MinElute Cleanup Kit (αρ. κατ ) για να συμπυκνώσετε το δείγμα και κατόπιν ρυθμίστε τη συγκέντρωση στα 200 ng/µl. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/

42 Σχόλια και συστάσεις Δεν ανιχνεύτηκε πρότυπο, ορός ελέγχου ή IS-Cal α) Σφάλματα μεταφοράς με πιπέτα ή παράλειψη αντιδραστηρίων, αναστροφή σωληναρίου ή βυθίσματος β) Λανθασμένη φύλαξη των συστατικών του κιτ γ) Το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR έχει λήξει Ελέγξτε τη μέθοδο μεταφοράς με την πιπέτα και την προετοιμασία της αντίδρασης. Επαναλάβετε την εκτέλεση της ανάλυσης PCR. Φυλάξτε το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR σε θερμοκρασία -15 C έως -30 C και φυλάξτε τα μείγματα qpcr Mix ABL1 και qpcr Mix Mbcr σε σημείο προστατευμένο από το φως. Μην υπερβαίνετε το μέγιστο όριο 3 κύκλων κατάψυξης-απόψυξης. Ελέγξτε τις συνθήκες αποθήκευσης και την ημερομηνία λήξης (ανατρέξτε στην ετικέτα του κιτ) των αντιδραστηρίων και, εάν χρειαστεί, χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ. Δεν εντοπίζεται σήμα, ούτε καν στους ορούς ελέγχου α) Δεν υπάρχει σωληνάριο αντίδρασης στη θέση 1 του οργάνου Rotor- Gene Q β) Σφάλματα μεταφοράς με πιπέτα ή παράλειψη αντιδραστηρίων, αναστροφή σωληναρίου ή βυθίσματος γ) Λανθασμένη φύλαξη των συστατικών του κιτ Φροντίστε να τοποθετείτε πάντοτε ένα δείγμα στη θέση 1 του ρότορα. Διαφορετικά το όργανο δεν θα εκτελέσει βαθμονόμηση με αποτέλεσμα να ληφθούν λανθασμένα δεδομένα φθορισμού. Ελέγξτε τη διάταξη μεταφοράς με πιπέτα και την προετοιμασία της αντίδρασης. Επαναλάβετε την εκτέλεση της ανάλυσης PCR. Φυλάξτε το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR σε θερμοκρασία -15 C έως -30 C και φυλάξτε τα μείγματα εκκινητών και ανιχνευτών σε σημείο προστατευμένο από το φως. Μην υπερβαίνετε το μέγιστο όριο 3 κύκλων κατάψυξης-απόψυξης. 42 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

43 δ) Το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR έχει λήξει ε) Επελέγη λανθασμένο κανάλι ανίχνευσης στ) Δεν υπάρχει πρόγραμμα λήψης δεδομένων Η ένταση του φθορισμού ποικίλλει Σφάλματα μεταφοράς με πιπέτα ή παράλειψη αντιδραστηρίων, αναστροφή σωληναρίου ή βυθίσματος Πολύ χαμηλή ένταση φθορισμού α) Λανθασμένη φύλαξη των συστατικών του κιτ β) Το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR έχει λήξει γ) Πολύ μικρή ποσότητα στόχου RNA Σχόλια και συστάσεις Ελέγξτε τις συνθήκες αποθήκευσης και την ημερομηνία λήξης (ανατρέξτε στην ετικέτα του κιτ) των αντιδραστηρίων και, εάν χρειαστεί, χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ. Ρυθμίστε το κανάλι ανίχνευσης στην τιμή «Cycling Green» (Κύκλοι, πράσινο) ή 470 nm/510 nm. Ελέγξτε το πρόγραμμα κύκλων. Βλ. Πίνακα 5, σελ. 31. Επιλέξτε τη λειτουργία λήψης «Single» (Μία φορά) στο τέλος κάθε τμήματος υβριδοποίησης του προγράμματος PCR. Ελέγξτε τη διάταξη μεταφοράς με πιπέτα και την προετοιμασία της αντίδρασης. Επαναλάβετε την εκτέλεση της ανάλυσης PCR. Φυλάξτε το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR σε θερμοκρασία -15 C έως -30 C και φυλάξτε τα μείγματα qpcr Mix ABL1 και qpcr Mix Mbcr σε σημείο προστατευμένο από το φως. Μην υπερβαίνετε το μέγιστο όριο 3 κύκλων κατάψυξης-απόψυξης. Ελέγξτε τις συνθήκες αποθήκευσης και την ημερομηνία λήξης (ανατρέξτε στην ετικέτα του κιτ) των αντιδραστηρίων και, εάν χρειαστεί, χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ. Να ελέγχετε πάντοτε τη συγκέντρωση του RNA προτού ξεκινήσετε. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/

44 Σχόλια και συστάσεις Ο αρνητικός ορός ελέγχου (H 2 O) δίνει θετικό αποτέλεσμα Διασταυρούμενη μόλυνση, μόλυνση αντιδραστηρίων, σφάλμα οργάνου, αναστροφή βυθισμάτων ή τριχοειδών, αποδόμηση ανιχνευτή. Αντικαταστήστε όλα τα κρίσιμα αντιδραστήρια ή χρησιμοποιήστε νέο κιτ. Όλοι οι χειρισμοί δειγμάτων, συστατικών του κιτ και αναλώσιμων θα πρέπει να γίνονται σύμφωνα με τις γενικώς αποδεκτές πρακτικές ώστε να αποφεύγεται η διασταυρούμενη μόλυνση. Φυλάσσετε τα μείγματα qpcr Mix ABL1 και qpcr Mix Mbcr σε σημείο προστατευμένο από το φως. Ελέγξτε τις καμπύλες φθορισμού για τυχόν ψευδώς θετικές μετρήσεις. Ελέγξτε την προετοιμασία της αντίδρασης. 44 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

45 Ποιοτικός έλεγχος Ο ποιοτικός έλεγχος ολόκληρου του κιτ πραγματοποιήθηκε σε όργανο Rotor- Gene Q MDx 5plex HRM. Το κιτ αυτό παράγεται σύμφωνα με το πρότυπο ISO Πιστοποιητικά ανάλυσης διατίθενται κατόπιν αιτήματος, από τη διεύθυνση Περιορισμοί Το κιτ αυτό προορίζεται για επαγγελματική χρήση. Το προϊόν θα πρέπει να χρησιμοποιείται μόνον από προσωπικό με ειδική κατάρτιση, εκπαιδευμένο σε τεχνικές μοριακής βιολογίας και εξοικειωμένο με την τεχνολογία αυτή. Το κιτ θα πρέπει να χρησιμοποιείται σύμφωνα με τις οδηγίες στο εγχειρίδιο αυτό, μαζί με ένα από τα επικυρωμένα όργανα που αναφέρονται στην παράγραφο «Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται», σελίδα 11. Πρέπει να δίνεται προσοχή στις ημερομηνίες λήξης που αναγράφονται στην ετικέτα του κουτιού. Μη χρησιμοποιείτε ληγμένα συστατικά. Όλα τα αντιδραστήρια που παρέχονται στο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR προορίζονται για χρήση αποκλειστικά με τα άλλα αντιδραστήρια που παρέχονται στο ίδιο κιτ. Η χρήση άλλων αντιδραστηρίων ή αντιδραστηρίων από άλλες παρτίδες μπορεί να επηρεάσει τις επιδόσεις. Το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR έχει επικυρωθεί μόνο για χρήση με ολικό αίμα με καλιούχο EDTA (K2EDTA) ως αντιπηκτικό, που έχει συλλεχθεί από ασθενείς που έχουν διαγνωστεί με ΧΜΛ χρόνιας φάσης θετική για χρωμόσωμα Philadelphia (Ph+) p210. Οι επιδόσεις του κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR εξακριβώθηκαν με χρήση του RNeasy Midi Kit (αρ. κατ ), του Buffer EL (αρ. κατ ) και, για το προαιρετικό βήμα καθαρισμού και συμπύκνωσης RNA, του RNeasy MinElute Cleanup Kit (αρ. κατ ). Μόνο το όργανο Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM έχει επικυρωθεί για την εκτέλεση PCR με αυτό το κιτ. Οποιαδήποτε μη ενδεδειγμένη χρήση του προϊόντος ή/και τροποποίηση των συστατικών του απαλλάσσει την QIAGEN από κάθε ευθύνη. Τα διαγνωστικά αποτελέσματα που προκύπτουν πρέπει να ερμηνεύονται σε συνδυασμό με άλλα κλινικά ή εργαστηριακά ευρήματα. Αποτελεί ευθύνη του χρήστη να επικυρώνει την απόδοση του συστήματος για οποιεσδήποτε διαδικασίες χρησιμοποιούνται στο εργαστήριο και δεν καλύπτονται από τις μελέτες απόδοσης της QIAGEN. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/

46 Χαρακτηριστικά απόδοσης Όριο τυφλού Το όριο τυφλού (LOB) προσδιορίστηκε με βάση το πρότυπο LSI/NCCLS EP17-2A σε δείγματα υγιούς ολικού αίματος (7 δείγματα, 12 μετρήσεις/2 παρτίδες). Βρέθηκε ότι το LOB είναι 1,02 αντίγραφα του μεταγράφου BCR-ABL1 Mbcr. Όριο ανίχνευσης Το όριο ανίχνευσης (LOD ή αναλυτική ευαισθησία) προσδιορίστηκε μέσω της «κλασσικής προσέγγισης» που περιγράφεται στο πρότυπο CLSI/NCCLS EP17-2A. Σε αυτή τη μελέτη αναλύθηκαν γνωστά χαμηλά θετικά δείγματα (7 δείγματα, 12 μετρήσεις/2 παρτίδες). Βρέθηκε ότι το LOD είναι 3,21 αντίγραφα του μεταγράφου BCR-ABL1 Mbcr, ή 0,0030% IS-NCN. Γραμμικότητα Η γραμμικότητα προσδιορίστηκε με βάση το πρότυπο CLSI/NCCLS EP6-A με μία παρτίδα του κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR σε 9 διαφορετικά δείγματα που παρασκευάστηκαν με διαδοχικές αραιώσεις θετικού RNA που απομονώθηκε από μια κυτταρική σειρά και αναμίχθηκε με αρνητικό RNA από υγιείς δότες. Ο προσδιορισμός πραγματοποιήθηκε με 3 διαφορετικά αρχικά RNA. Ο ποσοτικός προσδιορισμός του μεταγράφου BCR-ABL1 Mbcr είναι γραμμικός από την τιμή LOD μέχρι την τιμή 56% IS-NCN εφόσον η συγκέντρωση RNA του προσδιοριζόμενου δείγματος είναι κοντά στα 200 ng/µl, τη συνιστώμενη αρχική ποσότητα για τη μέθοδο (συνολική αρχική ποσότητα 3 µg). Εάν η αρχική ποσότητα RNA είναι μικρότερη, η περιοχή γραμμικότητας μπορεί να μειωθεί. Επαναληψιμότητα και αναπαραγωγιμότητα Η μελέτη ακρίβειας πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρότυπο CLSI/NCCLS EP5-A2. Αναλύθηκαν 9 διαφορετικά δείγματα, 45 φορές εις διπλούν, σε 45 εξετάσεις εντός 23 ημερών, ώστε να προκύψουν 90 μετρήσεις ανά δείγμα. Τα αποτελέσματα ακρίβειας συνοψίζονται στον Πίνακα Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

47 Πίνακας 8. Αποτελέσματα ακρίβειας Δείγμα Μέση τιμή BCR-ABL1 Mbcr IS-NCN SD R+ SD RUN++ SD TOTAL+++ CV TOTAL S1 64,5243 4, , , ,29% S2 36,1684 1,7104 5,9078 6, ,96% S3 6,4876 0,4231 0,7857 1, ,86% S4 0,7305 0,0512 0,0779 0, ,12% S5 0,0754 0,0068 0,0073 0, ,62% S6 0,0075 0,0016 0,0009 0, ,81% S7 0,0036 0,0014 0,0002 0, ,64% S8 0,0020 0,0010 0,0000 0, ,71% S9 0,0011 0,0007 0,0000 0, ,32% CV TOTAL : Συντελεστής μεταβλητότητας για τη συνολική ακρίβεια (BCR-ABL1 Mbcr IS-NCN), SD: τυπική απόκλιση, R+: επαναληψιμότητα, RUN++: αναπαραγωγιμότητα μεταξύ εκτελέσεων, S: πρότυπο, TOTAL+++: συνολική ακρίβεια (συμπεριλαμβανομένης της ακρίβειας μεταξύ οργάνων, μεταξύ χειριστών και μεταξύ παρτίδων). Παρεμβαλλόμενες ουσίες Η σχεδίαση της μελέτης βασίστηκε σε συστάσεις που περιγράφονται στο πρότυπο EP7-A2 «Interference Testing in clinical Chemistry» (Δοκιμασίες παρεμβολών στην κλινική χημεία) του NCCLS. Οι παρακάτω ουσίες, που ενδέχεται να περιέχονται σε δείγματα αίματος ή να προστεθούν κατά τον καθαρισμό του RNA, επελέγησαν με βάση την πιθανή επίδρασή τους στην PCR: μη συζευγμένη χολερυθρίνη, συζευγμένη χολερυθρίνη, αιμοσφαιρίνη (ανθρώπου), λευκωματίνη ορού (ανθρώπου), περίσσεια καλιούχου EDTA (K2-EDTA), αιθανόλη. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν δεν έδειξαν επιδράσεις παρεμβολής από τις ουσίες αυτές. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/

48 Κλινική επικύρωση και σύγκριση μεθόδων Πραγματοποιήθηκαν δύο μελέτες για τη σύγκριση του κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR με εναλλακτικές μεθόδους. Μελέτη 1: 76 δείγματα RNA απομονώθηκαν από περιφερικό αίμα και αναλύθηκαν με το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR και το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr IS-MMR DX. Οι τιμές IS-NCN που μετρήθηκαν με τις δύο μεθόδους συγκρίθηκαν με παλινδρόμηση Deming. Βρέθηκε ισχυρή συσχέτιση ανάμεσα στο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR και το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr IS-MMR DX (R 2 = 0,97), όπως φαίνεται στην Εικόνα 8. ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR Kit (Log IS-NCN) ipsogen BCR-ABL1 Mbcr IS-MMR DX Kit (Log IS-NCN) Εικόνα 8. Διάγραμμα τιμών IS-NCN που ελήφθησαν με το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR και το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr IS-MMR DX. Μελέτη 2: 39 δείγματα RNA που απομονώθηκαν από περιφερικό αίμα ασθενών με προηγούμενη διάγνωση ΧΜΛ Ph+ οι οποίοι βρίσκονταν υπό θεραπεία με TKI αναλύθηκαν σε ένα γαλλικό κλινικό κέντρο με χρήση του κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR και μιας μεθόδου που αναπτύχθηκε στο εργαστήριο (μέθοδος αναφοράς). Η μέθοδος αναφοράς μπορούσε να δώσει αποτελέσματα τυποποιημένα στη διεθνή κλίμακα με χρήση ενός συντελεστή μετατροπής. Ο παρακάτω πίνακας συνάφειας δημιουργήθηκε με σκοπό τη σύγκριση της κλινικής κατάστασης που εξακριβώθηκε με τις δύο μεθόδους. Βρέθηκε υψηλός βαθμός συμφωνίας ανάμεσα στο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 48 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

49 και τη μέθοδο αναφοράς (συνολική συμφωνία = 97,4%), όπως φαίνεται στην Εικόνα 9. Μέθοδος αναφοράς ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR Kit Χωρίς MR4 MR4 ή χαμηλότερη n Χωρίς MR MR4 ή χαμηλότερη n Εικόνα 9. Πίνακας συνάφειας για τη σύγκριση του κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR με μια εργαστηριακά αναπτυχθείσα εξέταση τυποποιημένη έναντι της διεθνούς κλίμακας. Βιβλιογραφία 1. Cross NCP et al. (2012) Standardized definitions of molecular response in chronic myeloid leukemia. Leukemia 26(10): Mahon et al. (2013) Deep Molecular Response in Chronic Myeloid Leukemia: The New Goal of Therapy. Clin Cancer Res 20(2): Baccarani, M. et al. (2013) European LeukemiaNet recommendations for the management of chronic myeloid leukemia: Blood, 122(6): Rousselot et al. (2014) Loss of major molecular response as a trigger for restarting tyrosine kinase inhibitor therapy in patients with chronic-phase chronic myelogenous leukemia who have stopped imatinib after durable undetectable disease. Journal of Clinical Oncology 32(5): Branford, S. et al. (2006) Rationale for the recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts in patients with chronic myeloid leukaemia. Leukemia 20, Branford, S. et al. (2008) Desirable performance characteristics for BCR-ABL measurement on an international reporting scale to allow consistent interpretation of individual patient response and comparison of response rates between clinical trials. Blood 112, Hughes, T. et al. (2006) Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood 108, 28. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/

50 8. White, H.E. et al. (2010) Establishment of the first World Health Organization International Genetic Reference Panel for quantitation of BCR-ABL mrna. Blood 116, e111. Άλλη βιβλιογραφία που δεν μνημονεύεται στο κείμενο αλλά μπορεί να φανεί χρήσιμη είναι: Baccarani, M. et al. (2006) Evolving concepts in the management of chronic myeloid leukemia: recommendations from an expert panel on behalf of the European LeukemiaNet. Blood 108, Beillard E. et al. (2003) Evaluation of candidate control genes for diagnosis and residual disease detection in leukemic patients using real-time quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RQ-PCR) a Europe against cancer program. Leukemia 17, Gabert J. et al. (2003) Standardization and quality control studies of real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia a Europe Against Cancer program. Leukemia 17, van der Velden, V.H., Hochhaus, A., Cazzaniga, G., Szczepanski, T., Gabert J., and van Dongen, J.J. (2003) Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by real-time quantitative PCR: principles, approaches, and laboratory aspects. Leukemia 17, Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

51 Σύμβολα Τα παρακάτω σύμβολα ενδέχεται να εμφανίζονται στην συσκευασία και την επισήμανση. <N> Περιέχει αντιδραστήρια που επαρκούν για <N> αντιδράσεις Ημερομηνία λήξης In vitro διαγνωστικό ιατροτεχνολογικό προϊόν Αριθμός καταλόγου Αριθμός παρτίδας Αριθμός υλικού Διεθνής κωδικός μονάδας εμπορίας Περιορισμοί θερμοκρασίας Κατασκευαστής Φυλάσσεται προστατευμένο από το φως Ανατρέξτε στις οδηγίες χρήσης Προειδοποίηση Πληροφορίες επικοινωνίας Για τεχνική υποστήριξη και περισσότερες πληροφορίες, επισκεφθείτε το Κέντρο Τεχνικής Υποστήριξης στην ιστοσελίδα καλέστε το ή απευθυνθείτε σε κάποιο από τα τμήματα Τεχνικής Υποστήριξης της QIAGEN ή τους κατά τόπους αντιπροσώπους (δείτε το οπισθόφυλλο ή επισκεφθείτε την ιστοσελίδα Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/

52 Πληροφορίες παραγγελίας Προϊόν Περιεχόμενα Αρ. κατ. ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR Kit (24) Για 24 αντιδράσεις: ποσοτικά πρότυπα κοινού πλασμιδίου ABL1 και BCR-ABL1 Mbcr, θετικός ορός ελέγχου χαμηλής και υψηλής συγκέντρωσης, βαθμονομητής IS-MMR, μείγμα qpcr Mix ABL1, μείγμα qpcr Mix Mbcr, αντιδραστήρια αντίστροφης μεταγραφής και qpcr. Rotor-Gene Q MDx για αναλύσεις PCR πραγματικού χρόνου επικυρωμένες για σκοπούς IVD σε κλινικές εφαρμογές Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Platform Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM System Loading Block ml Tubes Strip Tubes and Caps, 0.1ml (250) Strip Tubes and Caps, 0.1ml (2500) Θερμοκυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και αναλυτής καμπυλών τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας (HRM) με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βυσσινί) και κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα. Περιλαμβάνεται εγγύηση 1 έτους για ανταλλακτικά και εργασία, δεν περιλαμβάνεται η εγκατάσταση και η εκπαίδευση. Θερμοκυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και αναλυτής καμπυλών τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας (HRM) με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βυσσινί) και κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα. Περιλαμβάνεται εγγύηση 1 έτους για ανταλλακτικά και εργασία, εγκατάσταση και εκπαίδευση. Μονάδα αλουμινίου για χειροκίνητη προετοιμασία αντίδρασης με μονοκάναλη πιπέτα σε σωληνάρια 72 0,1 ml. 250 σειρές των 4 σωληναρίων και πώματα για 1000 αντιδράσεις σειρές των 4 σωληναρίων και πώματα για αντιδράσεις Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

53 Προϊόν Περιεχόμενα Αρ. κατ. Απομόνωση RNA RNeasy Midi Kit Buffer EL RNeasy MinElute Cleanup Kit 50 στήλες RNeasy Midi Spin, σωληνάρια συλλογής (15 ml), αντιδραστήρια και ρυθμιστικά διαλύματα ελεύθερα RNασών. Για τον καθαρισμό ολικού RNA ml ρυθμιστικού διαλύματος λύσης ερυθροκυττάρων. 50 στήλες RNeasy MinElute Spin, σωληνάρια συλλογής (1,5 ml και 2 ml), αντιδραστήρια και ρυθμιστικά διαλύματα ελεύθερα RNασών. Για καθαρισμό και συμπύκνωση RNA με μικρό όγκο έκλουσης Για ενημερωμένες πληροφορίες άδειας και δηλώσεις αποποίησης ευθύνης σχετικά με συγκεκριμένα προϊόντα, ανατρέξτε στο εγχειρίδιο του αντίστοιχου κιτ QIAGEN ή στο εγχειρίδιο χρήστη. Τα εγχειρίδια των κιτ QIAGEN και τα εγχειρίδια χρήστη είναι διαθέσιμα στην ιστοσελίδα Μπορείτε επίσης να τα ζητήσετε από το τμήμα Τεχνικής Εξυπηρέτησης της QIAGEN ή τον τοπικό σας αντιπρόσωπο. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/

54 Η σελίδα αυτή είναι σκόπιμα κενή. 54 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RTPCR 12/2014

55 Το προϊόν αυτό προορίζεται για in vitro διαγνωστική χρήση. Τα προϊόντα QIAGEN δεν επιτρέπεται να επαναπωληθούν, να τροποποιηθούν για επαναπώληση ή να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή εμπορικών προϊόντων χωρίς τη γραπτή έγκριση της QIAGEN. Οι πληροφορίες του παρόντος εγγράφου υπόκεινται σε αλλαγή χωρίς ειδοποίηση. Η QIAGEN δεν αναλαμβάνει καμία ευθύνη για τυχόν σφάλματα που ενδέχεται να υπάρχουν στο παρόν έγγραφο. Το παρόν έγγραφο θεωρείτο πλήρες και ακριβές κατά τη στιγμή της δημοσίευσής του. Σε καμία περίπτωση η QIAGEN δεν φέρει ευθύνη για τυχόν θετικές, ειδικές, πολλαπλές ή αποθετικές ζημίες που σχετίζονται ή προκύπτουν από τη χρήση του εγγράφου αυτού. Τα προϊόντα QIAGEN ικανοποιούν εγγυημένα τις δηλωμένες προδιαγραφές. Η μόνη υποχρέωση της QIAGEN και η μόνη αποζημίωση του αγοραστή περιορίζονται στη δωρεάν αντικατάσταση των προϊόντων στην περίπτωση που αυτά δεν αποδίδουν σύμφωνα με την εγγύηση. Η αγορά αυτού του προϊόντος επιτρέπει στον αγοραστή να το χρησιμοποιήσει για την παροχή διαγνωστικών υπηρεσιών στο πλαίσιο της in vitro διαγνωστικής χρήσης σε δείγματα ανθρώπινης προέλευσης. Κανένα γενικό δίπλωμα ευρεσιτεχνίας ή άλλη άδεια οποιουδήποτε είδους πέρα από αυτό το συγκεκριμένο δικαίωμα χρήσης που απορρέει από την αγορά δεν παρέχεται διά του παρόντος. Εμπορικά σήματα: QIAGEN, ipsogen, MinElute, RNeasy, Rotor-Gene (Όμιλος QIAGEN), FAM, SYBR (Life Technologies), BHQ-1 (Biosearch Technologies, Inc), Excel (Microsoft Corporation), TaqMan (Όμιλος Roche). Άδεια περιορισμένης χρήσης για το κιτ ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR Η χρήση του προϊόντος αυτού συνεπάγεται την αποδοχή των παρακάτω όρων εκ μέρους του αγοραστή ή του χρήστη του προϊόντος: 1. Το προϊόν μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποκλειστικά και μόνο όπως ορίζεται στα πρωτόκολλα που παρέχονται μαζί με το προϊόν και όπως ορίζεται στο εγχειρίδιο αυτό, και μόνο με τα συστατικά που περιλαμβάνονται στο κιτ. Η QIAGEN δεν παρέχει άδεια χρήσης υπό οποιαδήποτε πνευματική ιδιοκτησία της για τη χρήση ή ενσωμάτωση των παρεχόμενων συστατικών αυτού του κιτ σε οποιαδήποτε συστατικά που δεν περιλαμβάνονται σε αυτό το κιτ, παρά μόνον όπως περιγράφεται στα πρωτόκολλα που παρέχονται μαζί με το προϊόν, στο εγχειρίδιο αυτό, και στα συμπληρωματικά πρωτόκολλα που διατίθενται στον ιστότοπο Ορισμένα από αυτά τα συμπληρωματικά πρωτόκολλα παρέχονται από χρήστες της QIAGEN για χρήση από χρήστες της QIAGEN. Αυτά τα πρωτόκολλα δεν έχουν δοκιμαστεί σχολαστικά ούτε έχουν βελτιστοποιηθεί από την QIAGEN. Η QIAGEN δεν παρέχει καμία εγγύηση επ' αυτών, ούτε εγγυάται πως αυτά δεν παραβιάζουν δικαιώματα τρίτων. 2. Εκτός από τις άδειες που αναφέρονται ρητά, η QIAGEN δεν εγγυάται ότι αυτό το κιτ ή/και η χρήση(εις) του δεν παραβιάζουν τα δικαιώματα τρίτων. 3. Αυτό το κιτ και τα συστατικά του παραχωρούνται με άδεια για μία μόνο χρήση και δεν επιτρέπεται η επαναχρησιμοποίηση, η επανεπεξεργασία, η ανακατασκευή ή η μεταπώλησή τους. 4. Η QIAGEN αποποιείται ειδικά κάθε άλλη άδεια, ρητή ή σιωπηρή, εκτός από αυτές που αναφέρονται ρητά. 5. Ο αγοραστής και ο χρήστης του κιτ συμφωνούν να μην προβούν και να μην επιτρέψουν σε κανέναν να προβεί σε ενέργειες οι οποίες θα μπορούσαν να προκαλέσουν ή να διευκολύνουν τις ενέργειες που απαγορεύονται σύμφωνα με τα προαναφερθέντα. Η QIAGEN διατηρεί το δικαίωμα να επιβάλει τις απαγορεύσεις της παρούσας Άδειας περιορισμένης χρήσης σε οποιοδήποτε δικαστήριο και πρέπει να αποζημιωθεί για όλες τις δαπάνες ανάκρισης και δικαστηρίου, συμπεριλαμβανομένων των δικηγορικών αμοιβών, στο πλαίσιο οποιασδήποτε ενέργειας για την επιβολή της παρούσας Άδειας περιορισμένης χρήσης ή οποιουδήποτε εκ των δικαιωμάτων πνευματικής της ιδιοκτησίας σχετικά με το κιτ και/ή τα συστατικά του. Για τους ενημερωμένους όρους της άδειας, ανατρέξτε στην ιστοσελίδα Δεκ HB QIAGEN, με την επιφύλαξη παντός δικαιώματος.

56 Australia Austria Belgium Brazil Canada China Denmark Finland France Germany Hong Kong India Ireland Italy Japan Korea (South) Luxembourg Mexico The Netherlands Norway Singapore Sweden Switzerland UK USA EL 12/2014 Sample & Assay Technologies