ΜΕΛΕΤΗ ΑΝΑΓΩΓΗΣ ΔΙΣΟΥΛΦΙΔΙΚΩΝ ΔΕΣΜΩΝ ΣΕ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΣΥΝΕΧΟΥΣ ΡΟΗΣ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΔΙΑΛΥΜΕΝΗΣ ΚΑΙ ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΜΕΝΗΣ ΤΡΙΣ-(2-ΚΑΡΒΟΞΥΑΙΘΥΛΟ)ΦΩΣΦΙΝΗΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΛΕΤΗ ΑΝΑΓΩΓΗΣ ΔΙΣΟΥΛΦΙΔΙΚΩΝ ΔΕΣΜΩΝ ΣΕ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΣΥΝΕΧΟΥΣ ΡΟΗΣ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΔΙΑΛΥΜΕΝΗΣ ΚΑΙ ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΜΕΝΗΣ ΤΡΙΣ-(2-ΚΑΡΒΟΞΥΑΙΘΥΛΟ)ΦΩΣΦΙΝΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑ Β. ΜΗΤΑΝΗ ΧΗΜΙΚΟΣ Επιβλέπων: Λέκτορας Π.Δ. Τζαναβάρας ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ, 2010

2 Περιεχόμενα Περιεχόμενα Πρόλογος i ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εισαγωγή 1 1. Αυτοματισμός στο αναλυτικό εργαστήριο Ορισμοί Ανάγκη για αυτοματοποίηση - Πλεονεκτήματα 4 Βιβλιογραφία 5 2. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή SIA Εισαγωγή Ιστορική εξέλιξη Βασικές αρχές λειτουργίας Οργανολογία ενός αναλυτή SIA Τυπικά στάδια κύκλου ανάλυσης με τη SIA Αναχαίτιση ροής σε συτήματα SIA Πλεονεκτήματα Μειονεκτήματα SIA 13 Βιβλιογραφία Εφαρμογές των τεχνικών FIA και SIA στη φαρμακευτική ανάλυση 15 Βιβλιογραφία Θειόλες 18 Βιβλιογραφία Χημική αναγωγή των δισουλφιδίων 23 Βιβλιογραφία Τρις(2-καρβοξυαίθυλ)φωσφίνη (tris(2-carboxyethyl)phosphine, 29

3 Περιεχόμενα TCEP) Βιβλιογραφία ,5-διθειο-δις-(2-νιτροβενζοϊκό οξύ) (DTNB ή αντιδραστήριο Ellman) 34 Βιβλιογραφία 36 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 8. Αντιδραστήρια Οργανολογία Αντιδραστήρια Υλικά Οργανολογία Μελέτη της μη αυτοματοποιημένης (off-line) αναγωγής δισουλφιδίων 40 με τη χρήση της τρις-(καρβοξυαίθυλο) φωσφίνης (TCEP) 9.1. Εισαγωγή Προκαταρκτικά πειράματα Μελέτη της κινητικής της αντίδραση αναγωγής Επίδραση του ph στην αντίδραση αναγωγής Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας του ρυθμιστικού 45 διαλύματος στην αντίδραση αναγωγής 9.6. Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας της TCEP στην 46 αντίδραση αναγωγής 9.7. Έλεγχος γραμμικότητας Ανάλυση μιγμάτων CSN-CYS Αντίδραση αναγωγής της CSN από την TCEP σε συνθήκες 50 συνεχούς ροής Βιβλιογραφία 52

4 Περιεχόμενα 10. Μελέτη της εν-ροή (on-line) αναγωγής δι-σουλφιδίων σε σύστημα 53 SIA με τη χρήση διαλυμένης τρις-(καρβοξυαίθυλο) φωσφίνης (TCEP) Εισαγωγή Προκαταρκτικά πειράματα Λήψη φασμάτων DTNB και ΤΝΒ Αναγωγή του DTNB off-line και οn-line Επίδραση του ph στην αντίδραση αναγωγής Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας της TCEP στην αντίδραση αναγωγής 10.5 Επίδραση της παροχής όγκου του μεταφορέα στην αντίδραση αναγωγής 10.6 Επίδραση της θερμοκρασίας στην αντίδραση αναγωγής Έλεγχος γραμμικότητας Μελέτη της εν-ροή (on-line) αναγωγής δι-σουλφιδίων σε σύστημα 66 SIA με τη χρήση ακινητοποιημένης τρις-(καρβοξυαίθυλο) φωσφίνης (TCEP) Εισαγωγή Επίδραση του ph στην αντίδραση αναγωγής Επίδραση της παροχής όγκου του μεταφορέα στην αντίδραση 69 αναγωγής 11.4 Έλεγχος γραμμικότητας Σταθερότητα της αναγωγικής στήλης Συμπεράσματα Περίληψη Summary 79

5 Πρόλογος i Πρόλογος Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία αναπτύχθηκε μια νέα, αυτόματη μέθοδος για την αναγωγή των δεσμών S-S, με τη χρήση του αναγωγικού αντιδραστηρίου TCEP. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην αυτόματη τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή (Sequential Injection Analysis, SIA). Η εργασία απαρτίζεται από δυο μέρη, το θεωρητικό και το πειραματικό. Στο θεωρητικό μέρος, αναφέρονται αρχικά κάποιοι ορισμοί, ενώ στη συνέχεια καταγράφονται όλες οι αρχές που διέπουν τις τεχνικές FIA και SIA. Στο τέλος γίνεται μία θεωρητική προσέγγιση των θειολών, της αναγωγής των δεσμών S-S, όπως επίσης και των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιήθηκαν. Στο πειραματικό μέρος, επιχειρείται μια προσπάθεια, όσο το δυνατόν λεπτομερέστερης περιγραφής όλων των πειραματικών προσδιορισμών, που πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστήριο, για την ανάπτυξη των νέων μεθόδων. Το πειραματικό μέρος της εργασίας έλαβε χώρα στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, του τμήματος Χημείας, της Σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτέλειου Πανεπιστήμιου Θεσσαλονίκης από τον Οκτώβριο του 2009 μέχρι τον Φεβρουάριο του Το θέμα της συγκεκριμένης μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας υποδείχθηκε από τον Λέκτορα του Τμήματος Παρασκευά Δ. Τζαναβάρα, η συμβολή του οποίου ήταν καθοριστική σε όλη τη διάρκεια της εργασίας. Τον ευχαριστώ θερμά όχι μόνο για αυτό αλλά και για την αμέριστη συμπαράστασή του, τη συνεχή επιστημονική του καθοδήγηση και την καθημερινή του παρουσία. Ιδιαίτερες ευχαριστίες χρωστώ στον Καθηγητή του Τμήματος Δημήτριο Γ. Θεμελή, ο οποίος ήταν πάντα πρόθυμος να ακούσει τις ανησυχίες και τους προβληματισμούς μου. Οι συμβουλές του ήταν εύστοχες και καθοριστικές για τα πρώτα βήματά μου στον τομέα της Αναλυτικής Χημείας. Επίσης Ευχαριστώ τον λέκτορα Π.Δ. 407/80 κ. Κώστα Ζαχαρή για την φιλική ατμόσφαιρα στο καθημερινό περιβάλλον εργασίας καθώς επίσης και για την βοήθεια που μου προσέφερε σε τεχνικά και επιστημονικά θέματα της εργασίας αυτής. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά μου για την ηθική και υλική συμπαράστασή της, χωρίς την οποία η ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας θα ήταν αδύνατη. Κωνσταντίνα Β. Μητάνη Θεσσαλονίκη, 2010

6 Εισαγωγή 1 Εισαγωγή Η προσπάθεια για βελτιστοποίηση των ήδη υπαρχουσών αναλυτικών μεθόδων από άποψη ευαισθησίας, ακρίβειας, επαναληψιμότητας, μείωσης του χρόνου και του κόστους ανάλυσης και ταυτόχρονα μερικής ή ολικής αντικατάστασης του ανθρώπινου παράγοντα σε αναλύσεις ρουτίνας οδήγησε στην έρευνα για την αυτοματοποίηση των αναλυτικών τεχνικών. Η έρευνα αυτή είχε σαν αποτέλεσμα την εξέλιξη ενός σημαντικού κλάδου της αναλυτικής χημείας. Η τεχνική που κυριάρχησε αρχικά και μονοπώλησε την πρωτοκαθεδρία στην αυτοματοποιημένη ανάλυση ήταν αυτή της αεροδιαχωριζόμενης ροής. Όταν μερικά χρόνια αργότερα εμφανίστηκαν η τεχνική αναλύσεων με εισαγωγή του δείγματος σε συνεχή ροή (FIA) και η διαδοχική έγχυση του δείγματος σε ροή (SIA) οριοθετήθηκε μια νέα εποχή στις αυτοματοποιημένες μεθόδους αναλύσεων. Οι παραπάνω τεχνικές στηρίζονται στη χρησιμοποίηση μη διαχωριζόμενων ρευμάτων αντιδραστηρίων και δείγματος και εισήγαγαν σημαντικές βελτιώσεις, όπως η αυξημένη συχνότητα δειγματοληψίας και αναλύσεων, η άμεση λήψη αποτελεσμάτων, η ευελιξία της ανάλυσης και το μειωμένο κόστος ανάλυσης. Μα πάνω από όλα η ελεγχόμενη διασπορά της ζώνης του δείγματος σε συνδυασμό με τον επαναλήψιμο χρόνο από την εισαγωγή του δείγματος μέχρι την είσοδό του στον ανιχνευτή κατέστησαν δυνατή τη λήψη αξιόπιστων αποτελεσμάτων ακόμα και όταν στο σύστημα της αντίδρασης δεν έχει προλάβει να επιτευχθεί κατάσταση φυσικής και χημικής ισορροπίας. Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία μελετήθηκε για πρώτη φορά η δυνατότητα χρήσης της TCEP ως αντιδραστηρίου αναγωγής δεσμών S-S σε συνθήκες συνεχούς ροής σε σύστημα SIA. Οι θειόλες και τα δισουλφίδια είναι ευρέως διαδεδομένα στα ανθρώπινα κύτταρα καθώς είτε βρίσκονται ελεύθερα μέσα σε αυτά, είτε συναντώνται στα μόρια των πρωτεϊνών. Η σουλφυδρυλική ομάδα συναντάται επιπλέον, πολύ συχνά και σε πολλά φαρμακευτικά σκευάσματα. Η μελέτη συνεπώς των ενώσεων αυτών απασχολεί το ενδιαφέρον πολλών ερευνητικών πεδίων, όπως αυτό της βιοχημείας, του κλινικού ελέγχου και της φαρμακευτικής ανάλυσης. Το πειραματικό μέρος της εργασίας αποτελείται από τρία τμήματα:

7 Εισαγωγή 2 1. Μελέτη της μη αυτοματοποιημένης (off-line) αναγωγής δι-σουλφιδίων με τη χρήση της τρις-(2-καρβοξυαίθυλο) φωσφίνης (TCEP). Μελετήθηκε η δυνατότητα και αποτελεσματικότητα της μη αυτοματοποιημένης (off-line) αναγωγής δισουλφιδίων από την TCEP. Ως αντιπροσωπευτικό χημικό σύστημα επιλέχθηκε το ζεύγος κυστεΐνης (CYS) κυστίνης (CSN). Το προϊόν της αναγωγής της CSN μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά σε σύστημα SIA μετά από αντίδραση της CYS με τον αίθυλο εστέρα του προπιολικού οξέος (ΕΡ) σε αλκαλικό περιβάλλον. Μελετήθηκε η επίδραση διαφόρων παραμέτρων που επηρεάζουν την αντίδραση αναγωγής, όπως το ph, η συγκέντρωση του ρυθμιστικού διαλύματος και του αναγωγικού αντιδραστηρίου και ο χρόνος αντίδρασης. 2. Μελέτη της εν-ροή (on-line) αναγωγής δι-σουλφιδίων σε σύστημα SIA με τη χρήση διαλυμένης τρις-(2-καρβοξυαίθυλο) φωσφίνης (TCEP). Μελετήθηκε η δυνατότητα και αποτελεσματικότητα της εν-ροή (on-line) αναγωγής δισουλφιδίων από την TCEP σε σύστημα SIA. Στη μελέτη αυτή ως αντιπροσωπευτικό χημικό σύστημα επιλέχθηκε αντιδραστήριο Ellman s (5,5- διθειο-δις-(2-νιτροβενζοϊκό οξύ), DTNB). Το προϊόν της αναγωγής (TNB) μετρήθηκε απευθείας φασματοφωτομετρικά σε μέγιστο μήκος κύματος 412 nm. Μελετήθηκε η επίδραση διαφόρων παραμέτρων που επηρεάζουν την αντίδραση αναγωγής, όπως το ph, η συγκέντρωση του αναγωγικού αντιδραστηρίου, η θερμοκρασία, η παροχή όγκου του μεταφορέα. Η κινητική της αντίδρασης μελετήθηκε με πειράματα αναχαίτισης της ροής αντίδρασης. 3. Μελέτη της εν-ροή (on-line) αναγωγής δι-σουλφιδίων σε σύστημα SIA με τη χρήση ακινητοποιημένης τρις-(2-καρβοξυαίθυλο) φωσφίνης (TCEP). Μελετήθηκε η δυνατότητα και αποτελεσματικότητα της εν-ροή (on-line) αναγωγής δισουλφιδίων από ακινητοποιημένη TCEP σε πηκτή αγαρόζης. Για το σκοπό αυτό κατασκευάστηκε αναγωγική μικρο-στήλη, η οποία ενσωματώθηκε στο σύστημα της SIA. Και στη μελέτη αυτή ως αντιπροσωπευτικό χημικό σύστημα επιλέχθηκε αντιδραστήριο Ellman s (5,5-διθειο-δις-(2-νιτροβενζοϊκό οξύ), DTNB). Μελετήθηκε η επίδραση διαφόρων παραμέτρων που επηρεάζουν την αντίδραση αναγωγής, όπως το ph, η παροχή όγκου του μεταφορέα, το μήκος της αναγωγικής στήλης και ελέγχθηκε η σταθερότητά της στο χρόνο.

8 Κεφάλαιο 1 3 Κεφάλαιο 1 Αυτοματισμός στο αναλυτικό εργαστήριο 1.1. Ορισμοί Η έννοια της «αυτοματοποίησης», όπως αυτή έχει οριστεί από την Επιτροπή Αναλυτικής ορολογίας της Διεθνούς Ένωσης Καθαρής και Εφαρμοσμένης Χημείας (IUPAC) [1], παρερμηνεύεται συχνά από πολλούς αναλυτικούς χημικούς, πιθανότατα γιατί ο ορισμός καθαυτός συμπεριλαμβάνει στη διατύπωσή του ορισμούς άλλων εννοιών, οι διαφορές των οποίων δεν είναι ούτε αυτές πλήρως κατανοητές. Για να δοθεί, επομένως ο ορισμός της «αυτοματοποίησης» κρίνεται σκόπιμο να δοθούν αρχικά οι ορισμοί όλων εκείνων των εννοιών που μπορεί να συγχέονται μεταξύ τους [1,2]. Σύμφωνα, λοιπόν, με την Επιτροπή Αναλυτικής ορολογίας της Διεθνούς Ένωσης Καθαρής και Εφαρμοσμένης Χημείας (IUPAC), «μηχανισμός» ονομάζεται ο κατάλληλος συνδυασμός των εξαρτημάτων, ένα τουλάχιστον από τα οποία έχει την δυνατότητα να παράγει έργο ή μπορεί να κινείται. Μια «μηχανή» είναι μια διάταξη που αποτελείται από έναν οι περισσότερους μηχανισμούς. Οι μηχανισμοί αυτοί είναι σε θέση να εκτελούν μια ή περισσότερες λειτουργίες. Σύμφωνα πάντα με την IUPAC με τον όρο «μηχανοποίηση» ορίζεται η χρησιμοποίηση μηχανών για την αντικατάσταση, βελτίωση, επέκταση και συμπλήρωση της ανθρώπινης προσπάθειας. Τα όργανα χωρίζονται σε δύο κατηγορίες. Τα «επιστημονικά όργανα», που είναι συσκευές που χρησιμοποιούνται για την παρατήρηση, μέτρηση ή έλεγχο μιας ιδιότητας που αντικαθιστά, επεκτείνει ή συμπληρώνει την ανθρώπινη ικανότητα, και τα «αναλυτικά όργανα», συσκευές που χρησιμοποιούνται για την εκτέλεση μιας αναλυτικής μεθόδου. Τα όργανα είναι δυνατό να αποτελούνται από έναν ή περισσότερους μηχανισμούς. «Αυτοματοποίηση», συνεπώς, καλείται η συνδυασμένη χρήση μηχανών και οργάνων με σκοπό την αντικατάσταση, τη βελτίωση, την επέκταση και τέλος την συμπλήρωση της ανθρώπινης προσπάθειας στην πραγματοποίηση μιας δεδομένης διεργασίας, κατά την οποία ένα τουλάχιστον βασικό στάδιο εκτελείται όχι από ανθρώπινη παρέμβαση αλλά από ένα σύστημα «ανάδρασης» (ανατροφοδότησης, feedback). Το σύστημα ανάδρασης είναι μια μηχανική ή ηλεκτρονική διάταξη που

9 Κεφάλαιο 1 4 συνδυάζει την λήψη πληροφοριών, από διάφορους αισθητήρες, και την αποστολή εντολών τροποποιώντας τις επιμέρους λειτουργίες των οργάνων με σκοπό την παραγωγή συγκεκριμένου έργου Ανάγκη για αυτοματοποίηση - Πλεονεκτήματα Οι ολοένα αυξανόμενες απαιτήσεις για γρήγορες, αξιόπιστες και οικονομικές αναλύσεις πολλών και ταυτόχρονα διαφορετικής φύσεως δειγμάτων (βιολογικών, βιομηχανικών, γεωργικών, κλινικών, φαρμακευτικών και άλλα) κατέστησαν τις τελευταίες δεκαετίες επιτακτική την ανάγκη ανάπτυξης αυτοματοποιημένων αναλυτικών τεχνικών. Για τον λόγο αυτό δεν είναι λίγες οι ερευνητικές ομάδες, που έχουν στρέψει το ερευνητικό τους ενδιαφέρον προς την κατεύθυνση αυτή [3]. Οι στόχοι, που έπρεπε να επιτευχθούν, ήταν πολλοί, με αρχικό πάντα γνώμονα την αντικατάσταση της χειροκίνητης διαδικασίας. Ο σημαντικότερος ίσως λόγος που οδήγησε στην ανάπτυξη αυτοματοποιημένων τεχνικών ήταν η απελευθέρωση του ανθρώπινου δυναμικού από αναλύσεις ρουτίνας. Αυτό θα επέφερε σημαντικά οφέλη. Θα οδηγούσε όχι μόνο στον μεγαλύτερο δυνατό αριθμό αναλύσεων, αλλά και στην μεγαλύτερη ασφάλεια του προσωπικού, μιας και η έκθεσή του σε επικινδύνους και τοξικούς διαλύτες θα περιοριζόταν, με τον τρόπο αυτό, σημαντικά. Πολύπλοκες μεθοδολογίες μπορούν πλέον να πραγματοποιούνται σε σύντομο χρονικό διάστημα και με λιγότερο κοπιαστικές και επίπονες προκατεργασίες του δείγματος αλλά και πολύ πιο οικονομικά. Ο μεγάλος αριθμός αναλύσεων οδηγεί στην μείωση του κόστους τις κάθε επιμέρους ανάλυσης και το πλεονέκτημα αυτό γίνεται ακόμα σημαντικότερο όταν τα προς ανάλυση δείγματα είναι πολύτιμα ή περιορισμένης ποσότητας. Η ανάγκη για άμεση λήψη αναλυτικών αποτελεσμάτων και η βελτίωση της αναλυτικής διαδικασίας οδήγησαν και αυτές με τη σειρά τους στην αυτοματοποίηση των αναλυτικών διεργασιών. Ο περιορισμός της ανθρώπινης δράσης στις αναλύσεις οδηγεί στην εξάλειψη τυχαίων ή συστηματικών σφαλμάτων, που προέρχονται από τον ανθρώπινο παράγοντα, βελτιώνοντας, έτσι, την ακρίβεια και την επαναληψιμότητα των μετρήσεων.

10 Κεφάλαιο 1 5 Βιβλιογραφία [1] IUPAC, Compendium of Analytical Nomenclature, The Orange Book, 1 st Edition, Pergamon Press, New York, [2] Σημειώσεις μαθήματος του Μ.Π.Σ. του τμήματος Χημείας του Α.Π.Θ., «Προχωρημένη Ενόργανη Χημική Ανάλυση» (Διδάσκων: Επικ. Καθ. Α. Ανθεμίδης). [3] Δ.Γ. Θεμελή, Αυτόματες μέθοδοι χημικής ανάλυσης, Θεσσαλονίκη, 1998.

11 Κεφάλαιο 2 6 Κεφάλαιο 2 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή SIA 2.1 Εισαγωγή Ιστορική εξέλιξη Η τεχνική των Aυτόματων Aναλύσεων με Έγχυση του Δείγματος σε Συνεχή Ροή (Flow injection analysis FIA) ανακαλύφθηκε κάπου στα μέσα του 1974 όταν οι Ruzicka και Hansen δούλευαν πάνω στην ανάπτυξη ενός αισθητήρα αερίων για τον προσδιορισμό ατμών αμμωνίας. Οι ερευνητές είχαν κατασκευάσει ένα κατάλληλο ηλεκτρόδιο, η αρχή λειτουργίας του οποίου βασιζόταν στη μέτρηση της μερικής πιέσεως του αερίου ύστερα από ανάμειξη του δείγματος με κινούμενο ρεύμα NaOH με την βοήθεια μιας περισταλτικής αντλίας. Η ανάμειξη των ρευμάτων γινόταν αμέσως πριν τον ανιχνευτή και οι παραγόμενοι ατμοί NH 3 ανιχνεύονταν στη συνέχεια από το ηλεκτρόδιο. Το πρόβλημα, όμως, ήταν η πολύ αργή απόκριση του αισθητήρα για δείγματα διαφορετικών συγκεντρώσεων. Σε μία στιγμή εκνευρισμού οι ερευνητές, με τη χρήση μιας απλής σύριγγας, εισήγαγαν απευθείας στο ρεύμα NaOH μια ποσότητα δείγματος ορισμένης συγκέντρωσης και προς μεγάλη τους έκπληξη παρατήρησαν την καταγραφή μιας κορυφής, η οποία ήταν επαναλήψιμη και ανάλογη της συγκεντρώσεως του προς ανάλυση συστατικού [1]. Χωρίς ακόμα να έχουν συνειδητοποιήσει την σημαντικότητα της ανακάλυψής τους, δημοσιεύουν στα 1975 την πρώτη τους εργασία [2] και μερικά χρόνια αργότερα δίνουν τον ορισμό της FIA στο πρώτο τους βιβλίο [3]. Σύμφωνα με τους ερευνητές, «Η FIA είναι μια τεχνική που βασίζεται στην έγχυση ενός υγρού δείγματος σε συνεχές, μη διακοπτόμενο, κινούμενο ρεύμα κατάλληλου υγρού. Το εγχυόμενο δείγμα σχηματίζει μια ζώνη, που οδηγείται στον ανιχνευτή, ο οποίος μετρά τη συνεχή μεταβολή μιας φυσικοχημικής παραμέτρου του δείγματος, καθώς αυτό διέρχεται από την κυψελίδα συνεχούς ροής». Με τον ορισμό αυτόν ορίστηκε από την πρώτη στιγμή η πρώτη βασική αρχή της FIA, που δεν είναι άλλη από την έγχυση του δείγματος σε μη διακοπτόμενο ρεύμα ροής. Παρόλα αυτά, στην δεύτερη έκδοση, ο ορισμός της νέας τεχνικής διατυπώνεται ξανά από τους ερευνητές όπως παρακάτω: «FIA ονομάζεται η συλλογή πληροφοριών μέσω της βαθμίδωσης της συγκέντρωσης που δημιουργείται όταν μια αυστηρά καθορισμένη ζώνη δείγματος εγχυθεί και διασπαρθεί σε ένα μη διακοπτόμενο ρεύμα μεταφορέα» [1].

12 Κεφάλαιο 2 7 Η δεύτερη αυτή διατύπωση δεν αναιρεί την προηγούμενη αλλά δρα συμπληρωματικά της πρώτης, εισάγοντας και τη δεύτερη αρχή της FIA, που είναι η αυστηρά καθορισμένη και ελεγχόμενη διασπορά της ζώνης του δείγματος. Αυτή η αρχή, συνεπώς δίνει τη δυνατότητα στον χρήστη για λήψη αποτελεσμάτων πριν ακόμα ολοκληρωθεί η αντίδραση και φτάσει σε κατάσταση, τόσο φυσικής όσο και χημικής, ισορροπίας. Οι βασικές αρχές της FIA είναι συνεπώς [4]: 1. Ο αυστηρά καθορισμένος όγκος δείγματος, ο οποίος εγχύεται σε ρεύμα κατάλληλου μεταφορέα ή αντιδραστηρίου 2. Η συνεχής και μη διακοπτόμενη ροή των διαλυμάτων 3. Η ελεγχόμενη και επαναλήψιμη διασπορά της ζώνης του δείγματος. 4. Ο επαναλήψιμος χρόνος παραμονής του δείγματος στο σύστημα. Μια δεκαετία περίπου μετά την εισαγωγή της FIA στην πραγματικότητα της χημικής ανάλυσης, η αυξανόμενη απαίτηση κυρίως από τους χώρους της βιομηχανίας και της κλινικής χημείας για μια αυτοματοποιημένη τεχνική, με πιο απλά και ανθεκτικά μηχανικά μέρη, τα οποία να μην έχουν αυξημένες απαιτήσεις για συντήρηση αλλά ταυτόχρονα να δίνουν αξιόπιστες και γρήγορες μετρήσεις, οδήγησε στην γέννηση της «Τεχνικής της Διαδοχικής Έγχυσης του δείγματος σε Ροή» (Sequential Injection analysis, SIA) [5]. Η τεχνική αυτή αποτελεί ουσιαστικά τη δεύτερη γενιά της FIA, και ήρθε να επιλύσει τις δυσχέρειες και τα προβλήματα αυτής. Τα προβλήματα αυτά ήταν : 1. Η κατανάλωση μεγάλων όγκων αντιδραστηρίου, λόγω της συνεχούς λειτουργίας του οργάνου 2. Η συχνά απαιτούμενη βαθμονόμηση του συστήματος 3. Το υψηλό πολλές φορές κόστος συντήρησης των μηχανικών τμημάτων του συστήματος, όπως οι περισταλτικές αντλίες, αλλά και των αναλώσιμων τμημάτων, όπως τα κανάλια ροής που με το πέρασμα του χρόνου φθείρονται. 4. Η ανάγκη χρησιμοποίησης πολλών καναλιών και πολλές φορές περίπλοκων διατάξεων για την ανάμιξη των διαλυμάτων και την αντίδρασή τους. 2.2 Βασικές αρχές λειτουργίας Από την αρχή έγινε κατανοητό ότι η νέα τεχνική ανήκει στην οικογένεια της FIA καθώς διέπεται από τις ίδιες αρχές (έγχυση δείγματος και αντιδραστηρίου, ελεγχόμενη διασπορά και επαναλήψιμος χρόνος από τη στιγμή της έγχυσης του δείγματος μέχρι την έξοδό του.)

13 Κεφάλαιο 2 8 Η επιτυχία της νέας αυτής τεχνικής βασίζεται στον ακριβή έλεγχο τον δύο κινητικών διεργασιών που συμβαίνουν ταυτόχρονα, καθώς μετακινείται το δείγμα μέσα στο κανάλι. Οι διεργασίες αυτές είναι από τη μία η φυσική διασπορά των ζωνών του δείγματος και τον αντιδραστηρίων και από την άλλη η χημική διεργασία σχηματισμού των προϊόντων, τα οποία οδηγούνται προς τον ανιχνευτή. Το επιπλέον χαρακτηριστικό της SIA που την διακρίνει από την FIA είναι η δυνατότητα αντιστροφής της ροής του δείγματος και του αντιδραστηρίου με τη βοήθεια της αντλίας και της βαλβίδας επιλογής πολλαπλών θέσεων, έτσι ώστε να μπορούν να πραγματοποιηθούν διάφορες χημικές αντιδράσεις, χωρίς να απαιτείται ο επανασχεδιασμός του πολλαπλού τμήματος ανάμειξης και αντιδράσεων, που απαιτείται στη FIA. Η καρδιά επομένως του αναλυτή είναι η βαλβίδα πολλαπλής επιλογής. Οι περιφερειακές θύρες της βαλβίδας είναι συνδεδεμένες με τους περιέκτες των δειγμάτων, των αντιδραστηρίων και το σύστημα ανίχνευσης, ενώ η κεντρική θύρα συνδέεται μέσω ενός σπειράματος παραμονής (holding coil - HC) με κατάλληλη αντλία, με τη βοήθεια της οποίας μπορούμε να επιλέξουμε τη φορά της ροής των διαλυμάτων. Όταν η αντλία λειτουργεί προς τη μια κατεύθυνση αναρροφώνται, μέσω της βαλβίδας, συγκεκριμένοι όγκοι δείγματος και αντιδραστηρίων από τον εκάστοτε περιέκτη και οδηγούνται στοιβάζονται στο σπείραμα παραμονής. Στη συνέχεια θέτουμε την αντλία σε λειτουργία, προς την αντίθετη κατεύθυνση αυτή τη φορά, και οι στοιβαγμένες ζώνες προωθούνται μέσω της ανάλογης θύρας της βαλβίδας προς το σύστημα ανίχνευσης. Η χημική αντίδραση πραγματοποιείται με διέλευση των ζωνών δια μέσω κατάλληλου σπειράματος (reaction coil-rc), στο οποίο λαμβάνει χώρα επικάλυψη των ζωνών και σχηματισμός του επιθυμητού προϊόντος. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η μείωση κατανάλωσης όγκου δείγματος και αντιδραστηρίων και συνεπώς η μείωση του όγκου των παραγόμενων αποβλήτων. Ένα τυπικό διάγραμμα ροής SIA καθώς και η αρχή λειτουργίας της τεχνικής δίνονται σχηματικά στα σχήματα 2.1 και 2.2 αντίστοιχα. Σχήμα 2.1. Τυπικό διάγραμμα ροής αναλυτή SIA.

14 Κεφάλαιο 2 9 Σχήμα 2.2. Αρχή λειτουργίας της SIA [6]. (A) Έγχυση καθορισμένου όγκου δείγματος. (B)Έγχυση καθορισμένου όγκου αντιδραστηρίου - σχηματίζονται ευδιάκριτες ζώνες. (Γ) Έγχυση του διαλύματος του μεταφορέα ή δεύτερου διαλύματος αντιδραστηρίου (Δ) Αναστροφή της ροής - προώθηση προς τον ανιχνευτή. (E) Ανίχνευση καταγραφή κορυφής. Συνοψίζοντας μπορούμε να πούμε ότι η SIA είναι μια τεχνική συνεχούς ροής που πραγματοποιείται με απόλυτα επαναλήψιμο χειρισμό των ζωνών του δείγματος και των αντιδραστηρίων σε συνθήκες μη θερμοδυναμικής ισορροπίας Οργανολογία ενός αναλυτή SIA Τα βασικά τμήματα από τα οποία αποτελείται ένας αναλυτής SIA είναι: 1. Αντλία. Με τη βοήθεια της αντλίας πραγματοποιείται η αναρρόφηση των ζωνών των δειγμάτων και των αντιδραστηρίων και στη συνέχεια, με αλλαγή της φοράς λειτουργίας της, πραγματοποιείται η προώθησή τους προς τον ανιχνευτή. Η λειτουργία της καθορίζεται από το κατάλληλο λογισμικό. Η λειτουργία της πρέπει να είναι πλήρως επαναλήψιμη και ακριβής. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων οι αντλίες που χρησιμοποιούνται σε συστήματα SIA είναι είτε περισταλτικές είτε τύπου σύριγγας. Μειονέκτημα των περισταλτικών αντλιών είναι ότι δεν είναι εφικτό να δώσουν ροές τελείως απαλλαγμένες από παλμούς, ενώ οι σωλήνες που χρησιμοποιούνται φθείρονται σχετικά εύκολα και δεν επιτρέπουν τη χρήση όλου του φάσματος των διαλυτών. Αντίθετα, οι αντλίες τύπου σύριγγας έχουν το

15 Κεφάλαιο 2 10 μειονέκτημα της καθορισμένης χωρητικότητας, με αποτέλεσμα να απαιτείται περιοδικό ξαναγέμισμά τους με το διάλυμα του μεταφορέα. 2. Βαλβίδα πολλαπλής επιλογής. Έχουν συνήθως 6-10 θέσεις. Βασικό χαρακτηριστικό που πρέπει να διακρίνει μια βαλβίδα είναι οι μικροί νεκροί όγκοι ώστε να αποφεύγεται επιπλέον διασπορά των ζωνών όταν δεν είναι επιθυμητή. Η λειτουργία της βαλβίδας καθορίζεται και αυτή ηλεκτρονικά από το εγκατεστημένο λογισμικό στον ηλεκτρονικό υπολογιστή. 3. Σπείραμα παραμονής (holding coil). Το σπείραμα αυτό τοποθετείται μεταξύ της αντλίας και της βαλβίδας επιλογής. Σε αυτό οδηγούνται και στοιβάζονται διαδοχικά και με τη σειρά που επιθυμεί ο χρήστης οι ζώνες των δειγμάτων και των αντιδραστηρίων πριν την προώθηση τους στον ανιχνευτή. Η χωρητικότητα του σπειράματος αυτού θα πρέπει να είναι ικανή, ώστε να αποτρέπεται η είσοδος των ζωνών δείγματος και αντιδραστηρίου στο διάλυμα του μεταφορέα και να αποφεύγεται η επιμόλυνσή του. 4. Σπείραμα αντίδρασης (reaction coil). Το σπείραμα αυτό τοποθετείται μεταξύ της βαλβίδας επιλογής και του ανιχνευτή. Εκεί λαμβάνει χώρα η αντίδραση μεταξύ του δείγματος και του αντιδραστηρίου οπότε και σχηματίζεται το επιθυμητό προϊόν το οποίο οδηγείται στη συνέχεια στον ανιχνευτή. 5. Σύστημα ανίχνευσης. Πρακτικά χρησιμοποιούνται όλα τα διαθέσιμα συστήματα ανίχνευσης τα οποία μπορούν να λειτουργήσουν σε συνθήκες συνεχούς ροής. 6. Λογισμικό ελέγχου. Η απαραίτητη χρήση κατάλληλου λογισμικού ελέγχου αποτελεί βασική διαφορά μεταξύ των τεχνικών FIA και SIA. Με το λογισμικό αυτό ελέγχονται πλήρως όλες οι απαραίτητες λειτουργίες του αναλυτή (εισαγωγή δειγμάτων και αντιδραστηρίων, σειρά ανάμιξης, παροχές όγκου κ.α.) Τυπικά στάδια κύκλου ανάλυσης με τη SIA Ένας κύκλος ανάλυσης με την τεχνική της SIA περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια: 1. Προώθηση του διαλύματος του μεταφορέα προς τον ανιχνευτή (πλήρωση του σπειράματος συγκράτησης, του σπειράματος αντίδρασης και της κυψελίδας του ανιχνευτή) μέχρι λήψη σταθερής γραμμής βάσης. 2. Αναρρόφηση καθορισμένου όγκου δείγματος στο σπείραμα παραμονής.

16 Κεφάλαιο Αναρρόφηση καθορισμένων όγκων διαλυμάτων αντιδραστηρίων στο σπείραμα παραμονής. 4. Προώθηση του μίγματος της αντίδρασης προς τον ανιχνευτή (ενδέχεται να εφαρμοστεί αναχαίτιση της ροής, πριν ή εντός του ανιχνευτή κατά περίπτωση). 5. Καταγραφή των σημάτων 6. Προώθηση του προϊόντος της αντίδρασης στα απόβλητα Αναχαίτιση ροής σε συστήματα SIA (stopped flow -SIA) Με την τεχνική της αναχαίτισης της ροής παρέχεται στο χημικό σύστημα περισσότερος χρόνος προκειμένου να εξελιχθεί η αντίδραση, χωρίς την επίδραση της αξονικής διασποράς στις ζώνες του δείγματος και των αντιδραστηρίων. Στόχοι της εφαρμογής της τεχνικής της αναχαίτισης της ροής είναι: 1. Η αύξηση της ευαισθησίας ενός προσδιορισμού σε περιπτώσεις αργών αντιδράσεων. 2. Η αύξηση της εκλεκτικότητας άρση παρεμποδίσεων υποστρώματος. 3. Η κινητική θεωρητική μελέτη των αντιδράσεων. 4. Η ανάπτυξη μεθόδων ταυτόχρονων προσδιορισμών με κινητική διαφοροποίηση. Στα σχήματα 2.3 και 2.4 δίνονται αντίστοιχα η αρχή της τεχνικής και τα τυπικά λαμβανόμενα καταγραφήματα. Σχήμα 2.3 : Προφίλ ζώνης του δείγματος με εφαρμογή αναχαίτισης της ροής [7].

17 Κεφάλαιο 2 12 Σχήμα 2.4: Τυπικό γράφημα εφαρμογής αναχαίτισης της ροής σε ένα σύστημα SIA / FIA [8]. Στην περίπτωση α) ευνοείται ο σχηματισμός του προϊόντος της αντίδρασης με το χρόνο αναχαίτισης. Στην περίπτωση β) η αντίδραση είναι ανεξάρτητη του χρόνου αναχαίτισης και τέλος στην περίπτωση γ) το προϊόν της αντίδρασης αρχίζει να αποικοδομείται κατά τον χρονικό διάστημα αναχαίτισης της ροής. Η αναχαίτιση της ροής μπορεί να πραγματοποιηθεί είτε πριν είτε μέσα στην κυψελίδα του ανιχνευτή. Αναχαίτιση της ροής μέσα στον ανιχνευτή δίνει τη δυνατότητα στον αναλυτή να παρακολουθήσει την πορεία εξέλιξης της αντίδρασης σε πραγματικό χρόνο παρέχοντας τη δυνατότητα εξαγωγής συμπερασμάτων που αφορούν στο μηχανισμό της αντίδρασης. Με αναχαίτιση της ροής πριν τον ανιχνευτή απλά παρατείνεται ο χρόνος αντίδρασης. Η προσέγγιση αυτή επιλέγεται σε περιπτώσεις επίδρασης της ακτινοβολίας των οπτικών ανιχνευτών στην αντίδραση.

18 Κεφάλαιο Πλεονεκτήματα Μειονεκτήματα SIA Τα βασικά πλεονεκτήματα της SIA σε σχέση με την FIA είναι: 1. Είναι οργανολογικά απλούστερη από τη FIA, αφού ανεξαρτήτως από τον αριθμό των διαλυμάτων, χρησιμοποιείται μια και μόνο βαλβίδα πολλαπλής επιλογής, μια μονοκαναλική αντλία και μόνο ένα κανάλι ροής. Όλες δηλαδή οι απαραίτητες διεργασίες για τον προσδιορισμό γίνονται σε μονοκαναλικό σύστημα. 2. Η κατανάλωση των αντιδραστηρίων και των δειγμάτων καθώς και οι όγκοι των παραγόμενων αποβλήτων είναι σημαντικά μικρότεροι αφού τα αντιδραστήρια εισάγονται μέσω της βαλβίδας σε αυστηρά καθορισμένους όγκους και δεν ρέουν συνεχώς. 3. Οι βασικές γεωμετρικές παράμετροι ενός συστήματος SIA, δηλαδή οι όγκοι και οι ταχύτητες ροής, μπορούν εύκολα να μεταβάλλονται με τη βοήθεια κατάλληλου λογισμικού. Τα κυριότερα μειονεκτήματα της τεχνικής SIA, ως προς την πρόδρομή της, FIA, αφορούν το κόστος της οργανολογίας και της απόκτησης του απαραίτητου λογισμικού. Επίσης, είναι σχετικά δύσκολη η εφαρμογή πολύπλοκων χημικών συστημάτων που απαιτούν πολλαπλά στάδια αντιδράσεων, καθώς και τεχνικές προκατεργασίας όπως η εκχύλιση υγρού.

19 Κεφάλαιο 2 14 Βιβλιογραφία [1] Ε.Η. Hansen, Comprehensive Anal. Chem. 54 (2008) 3. [2] J.Ruzicka, E.H. Hansen, Anal. Chim. Acta 78 (1975) 145. [3] J.Ruzicka, E.H. Hansen, Flow injection analysis, 1 st edition, Wiley, New York, [4] Δ.Γ. Θεμελή, Αυτόματες μέθοδοι χημικής ανάλυσης, Θεσσαλονίκη [5] J.Ruzicka, G.D. Marschall, Anal. Chim. Acta 237 (1990) 329. [6] J.Ruzicka, Comprehensive Anal. Chem. 54 (2008) 23. [7] Φ.Σ. Κίκα, «Αναλυτικές εφαρμογές του χρωμοτροπικού οξέως σε αυτοματοποιημένα συστήματα συνεχούς ροής με τις τεχνικές FIA και SIA». Διδακτορική Διατριβή, Θεσσαλονίκη, [8] Π.Δ Τζαναβάρα, «Ανάπτυξη μεθόδων προσδιορισμού ορισμένων ανιόντων με την τεχνική της έγχυσης του δείγματος σε συνεχή ροή», Διδακτορική Διατριβή, Θεσσαλονίκη, 2003.

20 Κεφάλαιο 3 15 Κεφάλαιο 3 Εφαρμογές των τεχνικών FIA και SIA στη φαρμακευτική ανάλυση Οι ασθενείς οφείλουν να έχουν τον υψηλότερο δυνατό βαθμό εμπιστοσύνης όσον αφορά στην ποιότητα και την αποτελεσματικότητα των φαρμάκων, τα οποία τους συνταγογραφούνται. Η λήψη, παρόλα αυτά, φαρμάκων κρύβει τόσο οφέλη όσο και κινδύνους για την ανθρώπινη υγεία. Προκειμένου να διασφαλιστεί, ότι η ισορροπία μεταξύ των οφελών και των κινδύνων κλείνει προς όφελος του ασθενή, ο έλεγχος της αποτελεσματικότητας των φαρμάκων και της ασφάλειάς τους πρέπει να είναι εξονυχιστικός και συνεχής. Για το λόγο αυτό, οι κανονισμοί, που αφορούν σήμερα στα φαρμακευτικά σκευάσματα και καθορίζονται από αρμόδιους και εξουσιοδοτημένους εθνικούς φορείς (Εθνικός Οργανισμός Φαρμάκων - ΕΟΦ), γίνονται ολοένα και πιο αυστηροί. Οι κανονισμοί αυτοί ελέγχουν και καθορίζουν όλα τα στάδια από τα οποία περνά ένα φαρμακευτικό προϊόν τόσο κατά την παραγωγή του, όσο κατά τη διακίνηση και την αποθήκευσή του. Ο έλεγχος ποιότητας ενός φαρμακευτικού σκευάσματος περιλαμβάνει μια πληθώρα δοκιμών, στις οποίες περιλαμβάνονται μεταξύ άλλων: 1. Ποσοτικός προσδιορισμός και έλεγχος καθαρότητας του δραστικού συστατικού. 2. Έλεγχος διαλυτοποίησης. 3. Ομοιομορφία της περιεκτικότητας. 4. Έλεγχος των πρώτων υλών. 5. Έλεγχος διαδικασίας παραγωγής (in process control). Στα παραπάνω πλαίσια, η αναλυτική χημεία παίζει καθοριστικό ρόλο τόσο στη διασφάλιση της ποιότητας των εμπορικά διαθέσιμων φαρμακευτικών σκευασμάτων, όσο και στην έρευνα για ανάπτυξη νέων φαρμακοτεχνικών μορφών και δραστικών ουσιών. Οι απαιτήσεις των αναλυτικών μεθόδων για την αποτελεσματική εφαρμογή τους στον έλεγχο ποιότητας των φαρμάκων μεταξύ άλλων περιλαμβάνουν: 1. Υψηλό βαθμό αυτοματοποίησης. 2. Υψηλό ρυθμό ανάλυσης δειγμάτων σε βιομηχανική κλίμακα.

21 Κεφάλαιο Απλή προκατεργασία των δειγμάτων. 4. Χαμηλό κόστος αντιδραστηρίων. 5. Απλές διαδικασίες ελέγχου και χειρισμού. Είναι φανερό ότι οι τεχνικές συνεχούς ροής όπως η FIA και η SIA πληρούν τα περισσότερα, αν όχι όλα, από τα παραπάνω κριτήρια. Αποτέλεσμα αυτού είναι η ύπαρξη στη διεθνή βιβλιογραφία εκατοντάδων αναφορών που περιγράφουν την ανάπτυξη αυτόματων μεθόδων FIA και SIA για τον έλεγχο ποιότητας φαρμακευτικών σκευασμάτων, τόσο σε ακαδημαϊκό όσο και σε βιομηχανικό επίπεδο [1-5].

22 Κεφάλαιο 3 17 Βιβλιογραφία [1] M. Polasek, Comprehensive Anal. Chem. 54 (2008) 591. [2] P. D. Tzanavaras, D. G. Themelis, Anal. Chim. Acta 588 (2007) 1. [3] P. D. Tzanavaras, A. Verdoukas, T. Balloma, J. Pharm. Biomed. Anal. 41 (2006) 437. [4] P. D. Tzanavaras, D. G. Themelis, Anal. Lett. 38 (2005) [5] P. D. Tzanavaras, A. Verdoukas, D.G. Themelis, Anal. Sci. 21 (2005) 1515.

23 Κεφάλαιο 4 18 Κεφάλαιο 4 Θειόλες Στην οργανική χημεία, η θειόλη είναι μια ένωση στην οποία υπάρχει η λειτουργική ομάδα SH. Η ομάδα αυτή λέγεται θειολική ή σουλφυδρυλική ομάδα. Στην βιβλιογραφία οι θειόλες αναφέρονται και ως μερκαπτάνες. Στο Σχήμα 1.1 φαίνεται η χημική δομή των θειολών. Οι θειόλες (R-SH) και τα δισουλφίδιά τους (R-S-S-R) είναι ευρέως κατανεμημένες στο περιβάλλον, τόσο ως φυσικά προϊόντα όσο και ως συνθετικές ενώσεις. Στους οργανισμούς ο κύριος ρόλος των θειολών είναι η συμμετοχή τους στη συνολική σταθερότητα της δομής των πρωτεϊνών. Οι θειόλες συνήθως δεν σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου τόσο μεταξύ τους όσο και με τα μόρια του νερού. Συνεπώς έχουν χαμηλό σημείο ζέσης και είναι ελάχιστα διαλυτές στο νερό και σε άλλους πολικούς διαλύτες. Οι πτητικές θειόλες ανιχνεύονται εύκολα από τη δυσάρεστη οσμή τους. Σχήμα 1.1. Χημική δομή των θειολών. Αναμφισβήτητα η ποιο συχνά εμφανιζόμενη στη φύση θειόλη είναι το αμινοξύ κυστεΐνη, η οποία μαζί με το δισουλφίδιό της, την κυστίνη, βρίσκονται στους ζωντανούς οργανισμούς. Η κυστεΐνη είναι βασικό συστατικό των πρωτεϊνών ενώ ενώσεις χαμηλού μοριακού βάρους που έχουν σαν δομικό συστατικό την κυστεΐνη (συνένζυμο Α, γλουταθειόνη, λιποϊκό οξύ) παίζουν σημαντικό ρόλο στην κυτταρική βιοχημεία. Ενώ τα ζώα δεν είναι ικανά να

24 Κεφάλαιο 4 19 συνθέσουν την κυστεΐνη, τα φυτά και οι μικροοργανισμοί χρησιμοποιούν ανόργανο θείο για τη βιοσύνθεση αυτών των αμινοξέων, και άλλων ενώσεων που περιέχουν θείο, οι οποίες δεν βρίσκονται στους ζωικούς ιστούς. Η S- Αλκυλοκυστεΐνη και το θειοξείδιο της S-αλκυλοκυστεΐνης βρίσκονται στα φυτά και κυρίως στις οικογένειες Allium και Brassica, στα οποία αποτελούν το 5% της υγρής ύλης. Αυτά τα συστατικά μπορούν να προστατεύσουν τα φυτά από τους μύκητες οι οποίοι καταστρέφουν τους ιστούς. Η δίαιτα του ανθρώπου περιλαμβάνει ένα μεγάλο ποσοστό φυτικών και ζωικών ιστών. Οι ιστοί αυτοί υφίστανται ένα είδος επεξεργασίας ή μαγειρέματος πριν καταναλωθούν, κατά την διάρκεια της οποίας, συμβαίνουν κάποιες αλλαγές στις θειούχες ενώσεις που περιέχονται. Κατά το μαγείρεμα του κρέατος παράγεται ένας μεγάλος αριθμός ενώσεων περιλαμβάνοντας κορεσμένες αλειφατικές θειόλες, διθειόλες, βενζοθειόλες, και παράγωγα των φουρανο-3-θειολών, τα οποία δεν υπάρχουν σε ανεπεξέργαστους ιστούς. Υπεύθυνες για την παραγωγή αυτών των ενώσεων είναι οι πυρολυτικές αντιδράσεις της κυστεΐνης. Ομοίως κατά την επεξεργασία ή κατά το μαγείρεμα των λαχανικών, παράγονται αλειφατικές θειόλες και δισουλφίδια από την S-Αλκυλοκυστεΐνη και το θειοξείδιο της S- αλκυλοκυστεΐνης. Πολλές τέτοιες ενώσεις έχουν απομονωθεί από τα εδώδιμα φυτά. Στα φυτό του γένους Brassica το επικρατέστερο παράγωγο της κυστεΐνης είναι το σουλφοξείδιο της S-μεθυλοκυστεΐνης, το οποίο είναι προϊόν αποικοδόμησης της μεθανοθειόλης και του διμέθυλο δισουλφιδίου. Στα κρεμμύδια και σε άλλα μέλη του γένους Allium, οι περισσότερες ενώσεις που σχηματίζονται είναι δισουλφίδια που παράγονται από την προπανοθειόλη, την προπ-2-ενο-θειόλη και την προπ-1-ενο-θειόλη. Αυτές οι θειόλες και τα δισουλφίδια, ανιχνεύτηκαν στο μαγειρεμένο κρέας και συνεισφέρουν σημαντικά στη γεύση και στην οσμή αυτών των τροφίμων. Επίσης τα φυτά αποτελούν την αποκλειστική τροφή αρκετών κατοικίδιων ζώων. Η χρήση των φυτών του γένους Brassica, όπως το λάχανο, το ραπανάκι και η ζωοτροφή ελαιοκράμβης, είναι μια ευρέως διαδεδομένη γεωργική πρακτική η οποία έχει ως αποτέλεσμα την υψηλή παραγωγή μεθανοθειόλης και διμέθυλο δισουλφιδίου [1]. Η ύπαρξη ελεύθερων θειολών είναι σχετικά σπάνια στη φύση λόγω της γρήγορης οξείδωσής τους στα αντίστοιχα δισουλφίδια. Οι θειόλες σχηματίζουν κυρίως προϊόντα μεταβολισμού μιας ποικιλίας φυσικών ενώσεων. Για παράδειγμα έχει σημειωθεί ότι η φυσική διάσπαση της μεθειονίνης παρέχει μεθανοθειόλη. Η μεθανοθειόλη έχει επίσης απομονωθεί από διάφορες ποικιλίες λάχανου. Από το αιθέριο έλαιο του ferula assafoetida απομονώθηκε η 2-βουτυλο-2-προπενο-1-

25 Κεφάλαιο 4 20 θειόλη ως το αντίστοιχο δισουλφίδιο, και από τον χυμό του σπαραγγιού απομονώθηκε το ασπαραγουσικό οξύ [2]. Οι Starkenmann et. al. μελέτησαν το ρόλο των θειολών σε συγκεκριμένα δείγματα ή καταστάσεις [3]: α) Δυσοσμία του στόματος Η στοματική σήψη η οποία συνεπάγεται τη δυσοσμία του στόματος, προκαλείται από τη χημική αποικοδόμηση των κύριων αμινοξέων, καθώς και από τη βακτηριδιακή υδρόλυση των πεπτιδίων και των πρωτεϊνών από το σάλιο, τα υγρά των ούλων και από απλούς ιστούς του στόματος. Τα βακτήρια μπορούν να παράγουν σημαντικές ποσότητες υδρόθειου (H 2 S) από τις πρωτεΐνες του ορού και από την κυστεΐνη. β) Άρωμα του τυριού Οι πτητικές θειούχες ενώσεις είναι οι ενώσεις που ευθύνονται σε μεγάλο ποσοστό για το άρωμα των τυριών και άλλων γαλακτοκομικών προϊόντων, όπως για παράδειγμα, η μεθανοθειόλη, το διμέθυλο-δισουλφίδιο, το διμέθυλο-τρισουλφίδιο και το υδρόθειο. Αυτές οι ενώσεις είναι προϊόντα του καταβολισμού της μεθειονίνης και της κυστεΐνης από βακτήρια στη μήτρα του τυριού. Η σχηματισμός των πτητικών θειούχων ενώσεων από τα βακτήρια που βοηθούν στην ωρίμανση του τυριού και τα βακτήρια γαλακτικού οξέως έχουν επαληθευθεί. γ) Σπαράγγι Το αυθεντικό άρωμα του σπαραγγιού είναι δύσκολο να αναπαραχθεί, ειδικά για τις εφαρμογές στην παραγωγή αρωματικών σαπουνιών. Ένας από τους λόγους είναι η πολυπλοκότητα των θειολικών ενώσεων που το αποτελούν. Μια άλλη ενδιαφέρουσα άποψη της χημείας του σπαραγγιού είναι η έντονη οσμή των ούρων μετά την κατανάλωση σπαραγγιού, λόγω της ύπαρξης διάφορων θειολικών ενώσεων. Το ασπαραγουσικό οξύ είναι επίσης μια σημαντική ένωση στο σπαράγγι, η δομή της οποίας συγγενεύει με το λιποϊκό οξύ. δ) Κρασί και φρούτα Οι οργανοθειικές ενώσεις είναι υπεύθυνες για το χαρακτηριστικό άρωμα των κρασιών και αρκετών φρούτων.

26 Κεφάλαιο 4 21 Οι συνθετικές θειόλες είναι ευρέως διαδεδομένες στην βιομηχανία, όπου χρησιμοποιούνται αλειφατικές ενώσεις ως πρόσθετα λιπαντικά, ως αντιδραστήρια που συμμετέχουν σε αντιδράσεις πολυμερισμού και ως αρωματικά σε εύφλεκτα αέρια. Η βουτανοθειόλη χρησιμοποιείται για την παρασκευή φυτοφαρμάκων. Μεγάλες ποσότητες αλειφατικών και αρωματικών θειολών και δισουλφιδίων παράγονται ως παραπροϊόντα κατά τη βιομηχανική επεξεργασία όπως κατά την παραγωγή χαρτιού, και κατά τη βελτίωση του λαδιού και του φυσικού αερίου. Στη βιομηχανία πετρελαίου χρησιμοποιείται οξειδωτικός καταλύτης με βάση το χαλκό για την καταστροφή της οσμής, μετατρέποντας τις ασταθείς θειόλες σε αδρανή προϊόντα [4]. Λόγω των ισχυρών οργανοληπτικών ιδιοτήτων των θειολών και των δισουλφιδίων καθώς και της φυσικής ύπαρξής τους στα τρόφιμα, δεν είναι καθόλου παράξενο η χρήση αυτών των συνθετικών ενώσεων να βρίσκει εφαρμογή και στη βιομηχανία τροφίμων. Περισσότερες από 50 αλειφατικές, αρωματικές και ετεροκυκλικές θειόλες και δισουλφίδια είναι εγκεκριμένα για χρήση σε τρόφιμα. Λόγω της ευρείας έκθεσης του ανθρώπου και των κατοικίδιων ζώων στις θειόλες και τα δισουλφίδια, είναι επιθυμητό να υπάρχει μια ξεκάθαρη εικόνα της τοξικότητάς τους. Για το λόγο αυτό στην βιβλιογραφία έχουν αναφερθεί αρκετές μελέτες σχετικά με τη συμπεριφορά των θειολών [1].

27 Κεφάλαιο 4 22 Βιβλιογραφία [1] R. Munday, Free Radical Biology & Medicine 659 (1989) 7 [2] I.V. Koval, Russian Journal of Organic Chemistry 631 (2005) 41 [3] C. Starkenmann et al., Flavour Fragr. J. 369 (2008) 23 [4] S. Patai, The Chemistry of Thiol Group, John Wiley, New York, 1974

28 Κεφάλαιο 5 23 Κεφάλαιο 5 Χημική Αναγωγή των δισουλφιδίων Με τον όρο δισουλφίδια αναφερόμαστε στις χημικές ενώσεις στις οποίες υπάρχει δεσμός μεταξύ δυο ατόμων S και έχουν γενικό χημικό τύπο RSSR (Σχήμα 5.1). Σχήμα 5.1. Συντακτικός τύπος ενός δισουλφιδίου. Στη βιβλιογραφία έχουν αναφερθεί πολλές μέθοδοι και πρωτόκολλα αναγωγής δισουλφιδικών δεσμών [1]. Χαρακτηριστικές προσεγγίσεις είναι η χρήση άλλων θειολών, το νάτριο-βόριο υδρίδιο και οι φωσφίνες. Λιγότερο καλά ελεγχόμενη είναι η αλκαλική υδρόλυση. Τα παραπάνω αντιδραστήρια θα σχολιαστούν πιο αναλυτικά στη συνέχεια. Αναγωγή δισουλφιδίων με χρήση θειολών Η αντίδραση θειόλης-δισουλφιδίου συμβαίνει σε δυο στάδια: RS - + XSSX RSSX + XS - RSSX + RS - RSSR + XS Για την ολοκλήρωση του κάθε σταδίου της αντίδρασης, είναι απαραίτητο να χρησιμοποιηθεί περίσσεια της θειόλης (RSH) (όπως στην μέθοδο Β), ή

29 Κεφάλαιο 5 24 εναλλακτικά να χρησιμοποιηθεί μια θειόλη με ένα δυναμικό οξειδοαναγωγής πολύ περισσότερο αρνητικό από αυτό της θειόλης που θα παραχθεί από την αναγωγή (όπως στην μέθοδο Α). Μέθοδος Α: Διθειοθρεϊτόλη και Διθειοερυθριτόλη Η διθειοθρεϊτόλη (dithiothreitol, DTT) και η διθειοερυθριτόλη (dithioerythritol, DTE) (Σχήμα 5.2) εισήχθησαν για πρώτη φορά από τον Cleland και είναι από τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα αντιδραστήρια για τον σκοπό αυτό [2]. Είναι χαρακτηριστικό ότι μέχρι το 1987 είχαν δημοσιευτεί περισσότερες από 500 σχετικές εργασίες. Είναι υδατοδιαλυτά στερεά με ασήμαντη οσμή. Οι τιμές των pk είναι 8,3 και 9,5 για την DTT και 9,0 και 9,9 για την DTE. Η περιοχή του ph στην οποία εμφανίζεται η καλύτερη αναγωγική τους ικανότητα είναι 7,0-9,5. Σε χαμηλότερα ph, η DTT είναι περισσότερο δραστική από την DTE και αυτός είναι ένας από τους λόγους για τους οποίους η DTT χρησιμοποιείται περισσότερο. Η αντίδραση της αναγωγής μπορεί να σταματήσει με την προσθήκη ενός οξέος π.χ. οξικού οξέος (ph = 3,0). (α) DTT (β) DTE Σχήμα 5.2. Συντακτικοί τύποι α) της Διθειοθρεϊτόλης (DTT) και β) της Διθειοερυθριτόλης (DTE). Η αναγωγή των δισουλφιδίων στις πρωτεΐνες από την DTT ή την DTE, συνήθως γίνεται μερικώς. Αυτό συμβαίνει επειδή τα δισουλφίδια των πρωτεϊνών προσεγγίζονται δύσκολα λόγω της τριτοταγούς δομής τους. Επίσης η υδροφιλικότητα των αντιδραστηρίων πιθανόν να παρεμποδίζει τη διαπερατότητά τους. Η ολοκλήρωση της αναγωγής πιθανόν να απαιτεί ένα

30 Κεφάλαιο 5 25 κατάλληλο αντιδραστήριο όπως ουρία, γουανιδίνη ή δωδέκυλο σουλφονικό νάτριο (SDS) το οποίο διαφοροποιεί τη δομή των πρωτεϊνών στο χώρο (denaturant reagent). Μέθοδος Β: Μερκαπτοαιθανόλη Η μερκαπτοαιθανόλη (Σχήμα 5.3) είναι η πιο απλή υδατοδιαλυτή οργανική θειόλη και συγκριτικά με την DTT είναι φορές φθηνότερη. Ωστόσο συνήθως χρησιμοποιείται σε συγκεντρώσεις περίπου 10 φορές μεγαλύτερες από αυτές που απαιτούνται όταν χρησιμοποιείται η DTT. Αυτό συμβαίνει λόγω της υψηλής τιμής pk της μερκαπτοαιθανόλης η οποία είναι 9.5 και το λιγότερο αρνητικό δυναμικό οξειδοαναγωγής της. Σχήμα 5.3. Συντακτικός τύπος της 2-μερκαπτοαιθανόλης. Η μερκαπτοαιθανόλη ήταν το αναγωγικό που χρησιμοποιήθηκε περισσότερο πριν το 1963 και ακόμα και σήμερα χρησιμοποιείται πάρα πολύ, ειδικά σε συνδυασμό με την ηλεκτροφόρηση πηκτής. Βασικό μειονέκτημα της χρήσης της μερκαπτοαιθανόλης είναι ότι στις υψηλές συγκεντρώσεις οι οποίες απαιτούνται απορροφά στο υπεριώδες, με αποτέλεσμα να υπάρχουν παρεμποδίσεις σε φωτομετρικές μεθόδους. Μέθοδος Γ: Άλλες θειόλες Εναλλακτικές θειόλες που χρησιμοποιούνται λιγότερο συχνά είναι το θειογλυκολικό οξύ και η γλουταθειόνη, με αντίστοιχα πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα. Αναγωγή δισουλφιδίων χωρίς χρήση θειολών Ένα μεγάλο πλεονέκτημα της άμεσης αναγωγής χωρίς χρήση θειολών είναι ότι στο τέλος, δεν χρειάζεται να απομακρυνθεί η θειόλη.

31 Κεφάλαιο 5 26 Βόριο-υδρίδιο Για την αναγωγή με βόριο-υδρίδιο παρασκευάζεται φρέσκο διάλυμα NaBH 4 ή KBH 4 (0,75 mol L -1 ) και προστίθεται στην πρωτεΐνη σε ph 9,0 για να δώσει τελική συγκέντρωση 0,3 mol L -1. Στη συνέχεια το μίγμα αντίδρασης αφήνεται να επωαστεί. Η περίσσεια του αντιδραστηρίου αποσυντίθεται με οξίνιση, ενώ τα τελευταία υπολείμματα μπορούν να απομακρυνθούν προσθέτοντας ακετόνη. Κάτω από αυτές τις συνθήκες, έχει αναφερθεί ότι και οι 17 δισουλφιδικοί δεσμοί της αλβουμίνης του αγελαδινού ορού ανάγονται σε μία ώρα στους 50 C. Το βόριο-υδρίδιο χρησιμοποιείται επίσης και για την αναγωγή μιγμάτων πρωτεϊνικών-μη πρωτεϊνικών δισουλφιδίων σε ιστούς. Μετά την αναγωγή, η πρωτεΐνη μπορεί να καταβυθιστεί με υπερχλωρικό ή τριχλωροξικό οξύ και η μη πρωτεϊνική θειόλη παραμένει στο διάλυμα. Τα απλά δισουλφίδια ανάγονται εύκολα από το βοροϋδρίδιο και είναι έτοιμα να προσδιοριστούν. Οξικός υδράργυρος Το αντιδραστήριο αυτό ανάγει τα δισουλφίδια και συνδέει τις θειόλες με υδράργυρο σε ph 4,5 δίνοντας το παράγωγο της υδραργυρικής διθειόλης. Ωστόσο η αντίδρασή της με την κυστίνη δεν είναι ποσοτική ακόμα και μετά από 2 μέρες. RSSR + 2 Hg + RSHgSR + Hg 2+ Τριβουτυλοφωσφίνη Bu 3 P + RSSR + H 2 O Bu 3 PO + 2 RSH Η τριβουτυλοφωσφίνη (Bu 3 P) (εμπορικά διαθέσιμη) είναι ένα υγρό με μεγάλη πτητικότητα η οποία το καθιστά πολύ τοξικό. Τα απλά δισουλφίδια όπως το διπρόπυλο ή το διβούτυλο δισουλφίδιο ανάγονται σε 10 % μεθανόλη ανακινώντας τα με Bu 3 P για 1 hr στους 20 C. Η περίσσεια του αντιδραστηρίου απομακρύνεται εύκολα με εκχύλιση υγρού. Το πλεονέκτημα είναι ότι δεν αυτοξειδώνεται εύκολα και λόγω της δραστικότητάς του απαιτείται μόνο μια μικρή περίσσεια.

32 Κεφάλαιο 5 27 Αναγωγή με υποκατάσταση Ένας αριθμός αντιδραστηρίων προστίθεται στο δισουλφιδικό δεσμό για να δώσει μόνο ένα μόριο της ομάδας SH, ενώ τα υπόλοιπα απομακρύνονται με την μορφή S- υποκατεστημένων παραγώγων. RSSR + X - RS - + RSX Αναγωγή με χρήση θειωδών ιόντων RSSR + SO 3 2- RS - + RS SO 3 - Το θειώδες ιόν διασπά τα δισουλφίδια σε θειόλες και οργανικά θειοθειικά, RSSO 3 -. H μελέτη της κινητικής δείχνει ότι το πραγματικό αντιδρόν είναι το SO 3 2- και όχι το ΗSO 3 -, και συνεπώς η αντίδραση δεν γίνεται εύκολα όταν το δισουλφίδιο βρίσκεται σε ένα αρνητικά φορτισμένο περιβάλλον. Λόγω του ότι το ph επηρεάζει την αντίδραση, αναμένονται αλλαγές στην συμπεριφορά των δισουλφιδίων. Έτσι, η κυστεαμίνη (δικατιόν) αντιδρά 6-8 φορές πιο γρήγορα από την κυστίνη (ουδέτερη) και 50 φορές γρηγορότερα από την οξειδωμένη γλουταθειόνη (GSSG, διανιόν). Αναγωγή με χρήση κυανιούχων ιόντων RSSR + CN - RS - + RSCN Τα απλά αλειφατικά δισουλφίδια δεν αντιδρούν εύκολα με τα κυανιούχα ιόντα εκτός από τις περιπτώσεις που η διαδικασία συνοδεύεται από ταυτόχρονη απομάκρυνση ενός από τα προϊόντα. Ωστόσο αν στο υπόστρωμα (δισουλφίδιο) υπάρχει μια γειτονική αμινομάδα (όπως για παράδειγμα στην περίπτωση της κυστίνης), η αντίδραση υδρόλυσης ευνοείται μέσω ενός μηχανισμού σχηματισμού ετεροκυκλικών δακτυλίων.

33 Κεφάλαιο 5 28 Βιβλιογραφία [1] P.C. Jocelyn, in Methods in Enzymology 143 (1987) 46. [2] W.W. Cleland, Biochemistry 3 (1964) 480.

34 Κεφάλαιο 6 29 Κεφάλαιο 6 Τρις (2-καρβοξυαίθυλο) φωσφίνη (tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP) Όπως έχει αναφερθεί και σε προηγούμενα κεφάλαια, στόχος της εργασίας αυτής ήταν η μελέτη της αναγωγής δισουλφιδικών δεσμών (-S-S-) σε συνθήκες συνεχούς ροής με χρήση της TCEP ως αναγωγικού αντιδραστηρίου. Η ικανότητα και η αποτελεσματικότητα των τριαλκυλοφωσφινών στην αναγωγή των πρωτεϊνικών και μη δισουλφιδικών δεσμών είναι γνωστή εδώ και πολλά χρόνια. Οι φωσφίνες είναι πολύ σταθερές σε υδατικό περιβάλλον, ανάγουν εκλεκτικά τους δισουλφιδικούς δεσμούς και δεν αντιδρούν με άλλες χαρακτηριστικές ομάδες που υπάρχουν στις πρωτεΐνες. Ωστόσο, η δυσάρεστη οσμή τους και η μικρή διαλυτότητα στο νερό είναι δύο παράγοντες που παρεμποδίζουν την ευρεία εφαρμογή τους. Τα μειονεκτήματα αυτά εξαλείφθηκαν με τη χρήση της TCEP, η οποία αναφέρθηκε για πρώτη φορά ως αντιδραστήριο αναγωγής δεσμών S-S το 1969 από τον Levison [1]. Τα κύρια πλεονεκτήματα της TCEP μπορούν να συνοψιστούν στα παρακάτω: α) διαλύεται εύκολα και είναι πολύ σταθερή σε υδατικό περιβάλλον β) είναι άοσμη γ) είναι μη-πτητική και σε αντίθεση με άλλα αναγωγικά αντιδραστήρια είναι ανθεκτική στην οξείδωση από τον αέρα δ) είναι δραστική σε ευρεία περιοχή ph ( ph = 5 10) ε) ο τυπικός χρόνος που απαιτείται για την αναγωγή είναι μικρότερος από 5 min στ) είναι δραστική σε θερμοκρασία δωματίου ζ) ανάγει εκλεκτικά ακόμα και τα πιο σταθερά δισουλφίδια Η τυπική αντίδραση αναγωγής θειολών από την TCEP φαίνεται στο Σχήμα 6.1.

35 Κεφάλαιο 6 30 Σχήμα 6.1. Αναγωγή του δισουλφιδικού δεσμού με TCEP. Παρά όμως τις σημαντικές αυτές ιδιότητες που παρουσιάζει η TCEP, δεν είχε ευρεία εφαρμογή μέχρι πρόσφατα [2]. Το 1991 οι Burns et al. ανέφεραν ότι η TCEP μπορεί να συντεθεί εύκολα και σε μεγάλες ποσότητες με την όξινη υδρόλυση του εμπορικά διαθέσιμου αντιδραστηρίου τρις(2-κυανοαιθυλο)φωσφίνη. Οι ερευνητές αυτοί ανάφεραν επίσης ότι με την TCEP επιτυγχάνεται εύκολα η πλήρης αναγωγή πολύ σταθερών δισουλφιδίων (π.χ. οξειδωμένη διθειοθρεϊτόλη (DTT)) σε ph = 5,0 [2]. Το Δεκέμβριο του 1992 η εταιρία Pierce Chemical Co. ξεκίνησε τη διαφήμιση του αντιδραστηρίου αυτού ως ένα καινούργιο, άοσμο, δραστικό αναγωγικό αντιδραστήριο περισσότερο δραστικό από την DTT ή τη μερκαπτοαιθανόλη [3]. Εκτός από την αποτελεσματικότητα του αντιδραστηρίου στην αναγωγή δισουλφιδικών δεσμών, η TCEP πλεονεκτεί στο γεγονός ότι δεν περιέχει στο μόριό της θειολική ομάδα. Η DTT και άλλα αναγωγικά αντιδραστήρια που περιέχουν θειολική ομάδα, πρέπει να απομακρύνονται μετά την αναγωγή, καθώς η περίσσεια τους συνήθως παρεμποδίζει τον προσδιορισμό. Ακινητοποιημένη TCEP Τα πλεονεκτήματα της TCEP που αναφέρθηκαν παραπάνω την καθιστούν ως ένα από τα αποτελεσματικότερα αναγωγικά αντιδραστήρια σε υδατικά διαλύματα. Ωστόσο μερικά πρωτόκολλα απαιτούν τον διαχωρισμό του αναγωγικού αντιδραστηρίου από το δείγμα, μετά την αναγωγή. Για να αποφευχθούν οι δύσκολες και επίπονες διαδικασίες διήθησης πηκτής (gel filtration) ως εναλλακτική λύση προτείνεται η ακινητοποιημένη TCEP [4]. Το πλεονέκτημα αυτό είναι εξαιρετικά σημαντικό σε περιπτώσεις αναγωγής πεπτιδίων τα οποία είναι ευαίσθητα στην διαδικασία της διήθησης πηκτής [5].

36 Κεφάλαιο 6 31 Γενικά η ακινητοποίηση αναγωγικών αντιδραστηρίων δισουλφιδικών δεσμών γίνεται πάνω σε αδιάλυτα σφαιρίδια αγαρόζης ή σεφαρόζης [6], τα οποία έχουν τροποποιηθεί κατάλληλα με ενώσεις που περιέχουν σουλφυδριλική ομάδα. Η παρουσία των ομάδων αυτών καθιστά το υπόστρωμα ως ένα ισχυρό αναγωγικό μέσο. Με μια απλή ανάμιξη ενός δείγματος, το οποίο αποτελείται από πεπτίδια ή πρωτεΐνες, με το ακινητοποιημένο αναγωγικό, προκύπτει η αποτελεσματική θραύση των δισουλφιδικών δεσμών και δημιουργούνται ελεύθερες θειόλες. Η αναγωγή αυτή γίνεται χωρίς εξωτερικές επιμολύνσεις που πιθανόν να έχει το αναγωγικό, όπως συμβαίνει στην περίπτωση του διαλυμένου αναγωγικού μέσου [7]. Τα ακινητοποιημένα αναγωγικά αντιδραστήρια μπορεί κανείς να τα παρασκευάσει στο εργαστήριο, όπως έχει περιγράψει ο Hermanson [7] ή να τα προμηθευτεί από το εμπόριο. Τα ακινητοποιημένα αναγωγικά αντιδραστήρια υπάρχει δυνατότητα να τοποθετούνται σε στήλες (Immobilized Reductant Columns) μέσα από τις οποίες διέρχεται το δείγμα. Οι στήλες αυτές βοηθούν στη γρήγορη και εύκολη αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών σε πρωτεϊνικά και πεπτιδικά δείγματα. Ο χρόνος που απαιτείται για την αναγωγή των πεπτιδικών δεσμών είναι μόλις λίγα λεπτά, όσος δηλαδή απαιτείται ώστε το δείγμα να περάσει μέσα από τη στήλη. Ο τρόπος αυτός της αναγωγής πλεονεκτεί, γιατί αποφεύγονται τα χρονοβόρα στάδια διαχωρισμού του αναγωγικού από το δείγμα. Τα κύρια πλεονεκτήματα των ακινητοποιημένων αναγωγικών μέσων μπορούν να συνοψιστούν στα εξής: α) τα ακινητοποιημένα αναγωγικά μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αναγωγή όλων των ειδών των βιολογικών δισουλφιδίων χωρίς την παραγωγή παραπροϊόντων β) όταν χρησιμοποιούνται τα ακινητοποιημένα αναγωγικά δεν υπάρχουν διαλυμένες ουσίες που αλληλεπιδρούν με τις ελεύθερες θειόλες που παράγονται γ) τα μικρά μόρια τα οποία περιέχουν δισουλφιδικούς δεσμούς (π.χ. πεπτίδια που περιέχουν κυστίνη) μπορούν να αναχθούν και να απομονωθούν πολύ εύκολα με την απομάκρυνση του ακινητοποιημένου αναγωγικού μέσου. Στην περίπτωση των διαλυμένων αναγωγικών η απομάκρυνση του αναγωγικού είναι πολύ δύσκολη δ) τα ακινητοποιημένα αναγωγικά αντιδραστήρια μπορούν εύκολα να αναγεννηθούν και να ξαναχρησιμοποιηθούν πολλές φορές. [7].

37 Κεφάλαιο 6 32 Τα κύρια πλεονεκτήματα της ακινητοποιημένης TCEP είναι [4, 5]: α) αναγωγή σε ποσοστό πάνω από 85% β) είναι άοσμη, οπότε η αναγωγή μπορεί να γίνεται εύκολα στον πάγκο του εργαστηρίου γ) είναι σταθερή στον αέρα και συνεπώς δεν χρειάζονται ειδικές προφυλάξεις κατά τον χειρισμό και την φύλαξή της δ) είναι εύκολη στο χειρισμό (με την ακινητοποιημένη TCEP γίνεται χρήση όσης ποσότητας απαιτείται για κάθε περίπτωση) ε) η αναγωγή μπορεί να διεξαχθεί σε ένα μεγάλο εύρος ph ( ) και θερμοκρασιών (5 C - 95 C) στ) παρέχεται η δυνατότητα κατασκευής αναγωγικών στηλών (Immobilized Reductant Columns) ζ) είναι εμπορικά διαθέσιμη

38 Κεφάλαιο 6 33 Βιβλιογραφία [1] M.E. Levison, A.S. Joseph, D.M. Kirschenbaum, Experientia 25 (1969) 126. [2] J.A. Burns, J.C. Butler, J. Moran, G.M. Whitesides, J. Org. Chem. 56 (1991) 2648 [3] J.C. Han, G.Y. Han, Anal. Biochem. 220 (1994) 5. [4] Pierce Biotechnology Inc, Immobilized TCEP disulfide reducing gel, (2003) URL: [5] Thermo Scientific, Immobilized reductant columns, (2007) URL: [6] J. Han, C. Clark, G. Han, T.C. Chu, P. Han, Anal. Biochem. 268 (1999) 404. [7] G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2 nd Ed., 2008, Elsevier.

39 Κεφάλαιο 7 34 Κεφάλαιο 7 5,5-διθειο-δις-(2-νιτροβενζοϊκό οξύ) (DTNB ή αντιδραστήριο Ellman) Ως αντιπροσωπευτικό υπόστρωμα για τη μελέτη της εν-ροή αναγωγής δισουλφιδικών δεσμών από την TCEP χρησιμοποιήθηκε το αντιδραστήριο Ellman (DTNB). Η χημική του δομή φαίνεται στο Σχήμα 7.1. Το DTNB προτάθηκε για πρώτη φορά το 1959 από τον Ellman ως αντιδραστήριο για τον ποσοτικό προσδιορισμό ελεύθερων θειολικών ομάδων [1]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7.1, το DTNB είναι το ίδιο ένα δισουλφίδιο. Η πιο χαρακτηριστική του ιδιότητα είναι ότι η υδρόλυση του δεσμού S-S οδηγεί στο σχηματισμό του έγχρωμου προϊόντος 5-θειο-(2-νιτροβενζοϊκού) οξέος (ΤΝΒ) (λ max = 412 nm). Η ιδιότητα αυτή είναι πολύ σημαντική στην παρούσα εργασία, καθώς επιτρέπει τη μελέτη υδρόλυσης των δεσμών S-S χωρίς την πραγματοποίηση επιπλέον χημικών αντιδράσεων. Η χρήση του DTNB για τον προσδιορισμό θειολών βασίζεται στην αντίδραση του Σχήματος 7.2. Όπως φαίνεται στην αντιπροσωπευτική αντίδραση του σχήματος, το DTNB αντιδρά με μια ελεύθερη σουλφυδρυλική ομάδα και παράγεται ένα μικτό δισουλφίδιο και το TNB. Το τελευταίο μπορεί να ανιχνευτεί φασματοφωτομετρικά στα 412 nm. Βιβλιογραφικά έχει αποδειχθεί ότι το DTNB είναι ένα πολύ χρήσιμο αντιδραστήριο για την ανάλυση των θειολών. Κύρια πλεονεκτήματά του είναι: α) έχει υψηλή εκλεκτικότητα ως προς τις θειόλες, β) αντιδρά γρήγορα, γ) οι συνθήκες αντίδρασης είναι ήπιες και δ) η ευαισθησία είναι ικανοποιητική για τις περισσότερες εφαρμογές. Σχήμα 7.1. Χημική δομή του αντιδραστηρίου Ellman.

40 Κεφάλαιο 7 35 Σχήμα 7.2. Αντίδραση του DTNB με ελεύθερες θειολικές ομάδες. Στην βιβλιογραφία έχει αναφερθεί ότι η TCEP έχει τη δυνατότητα να διασπά το δεσμό S-S που υπάρχει στο DTNB ταχύτατα και ποσοτικά [2]. Αντιπροσωπευτικά, η αντίδραση αναγωγής του DTNB από ακινητοποιημένη TCEP δίνεται στο Σχήμα 7.3. Σχήμα 7.3. Αναγωγή του αντιδραστηρίου Ellman από ακινητοποιημένο TCEP.

41 Κεφάλαιο 7 36 Βιβλιογραφία [1] G.L. Ellman, Arch. Biochem. Biophys. 82 (1959) 70. [2] J.C. Han, G.Y. Han, Anal. Biochem. 220 (1994) 5.

42 Κεφάλαιο 8 37 Κεφάλαιο 8 Αντιδραστήρια Οργανολογία Αντιδραστήρια-Υλικά Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν στο πειραματικό μέρος της παρούσας μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας ήταν αναλυτικού βαθμού καθαρότητας και προμηθεύτηκαν από τον οίκο Merck, εκτός αν αναφέρεται κάτι διαφορετικό. Ως διαλύτης αραίωσης χρησιμοποιήθηκε δις-απιονισμένο νερό. Το αντιδραστήριο του αιθυλεστέρα του προπιολικού οξέος (EP) προμηθεύτηκε από τον οίκο Fluka. Τα διαλύματα εργασίας του αντιδραστηρίου αυτού όγκου 10 ml είχαν συγκέντρωση ποσότητας c = mol L -1, και παρασκευάζονταν καθημερινά με κατάλληλη αραίωση σε δις-απιονισμένο νερό. Τα πυκνά πρότυπα διαλύματα της κυστεΐνης και της κυστίνης (Merck) είχαν συγκέντρωση ποσότητας c = 1, mol L -1 και παρασκευάζονταν με διάλυση ακριβώς ζυγισμένης στερεής ουσίας σε 50 ml δις-απιονισμένου νερού. Τα διαλύματα αυτά ήταν σταθερά για μία εβδομάδα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Τα πρότυπα διαλύματα εργασίας παρασκευάζονταν καθημερινά με κατάλληλες αραιώσεις σε δις-απιονισμένο νερό. Το αντιδραστήριο Ellman s (5,5-διθειο-δις-(2-νιτρο βενζοϊκό οξύ), DTNB) προμηθεύτηκε από τον οίκο Sigma. Τα πυκνά διαλύματά του είχαν συγκέντρωση ποσότητας c = 5, mol L -1 και παρασκευάζονταν με διάλυση ακριβώς ζυγισμένης ποσότητας του αντιδραστηρίου σε 50 ml ρυθμιστικού διαλύματος TRIS (0,01 mol L -1, ph = 7,0). Τα διαλύματα εργασίας του DTNB συγκέντρωσης ποσότητας c = 0, mol L -1, παρασκευάζονταν από το πυκνό με κατάλληλη αραίωση σε δις-απιονισμένο νερό. Το πυκνό διάλυμα του αντιδραστηρίου ήταν σταθερό για τουλάχιστον τρεις εβδομάδες εφόσον φυλασσόταν στους 4 ο C προστατευμένο από το φως. Τα διαλύματα εργασίας παρασκευάζονταν σε καθημερινή βάση.

43 Κεφάλαιο 8 38 Η TCEP (τρις(2-καρβοξυαίθυλ)φωσφίνη) προμηθεύτηκε από τον οίκο Sigma. Τo πυκνό διάλυμα είχε συγκέντρωση ποσότητας mol L -1 και παρασκευαζόταν με διάλυση κατάλληλης ποσότητας του αντιδραστηρίου σε δις-απιονισμένο νερό. Τα διαλύματα εργασίας της TCEP συγκέντρωσης ποσότητας c = 5, mol L -1, παρασκευάζονταν από το πυκνό με κατάλληλη αραίωση σε δις-απιονισμένο νερό. Το πυκνό διάλυμα του αντιδραστηρίου φυλασσόταν στους 4 ο C προστατευμένο από το φως. Τα διαλύματα εργασίας παρασκευάζονταν σε καθημερινή βάση. Η ακινητοποιημένη TCEP προμηθεύτηκε από την εταιρία Pierce και αποτελούνταν από το αντιδραστήριο ακινητοποιημένο σε υπόστρωμα σφαιριδίων αγαρόζης (8 μmoles ανά ml πηκτής). Σύμφωνα με τον κατασκευαστή το μέγεθος των σφαιριδίων ήταν μm. Οι αναγωγικές μικρο-στήλες (FIALab) είχαν μήκος 1 και 2 cm και εσωτερικό όγκο 85 και 170 μl αντίστοιχα. Οι στήλες πληρώνονταν με αναρρόφηση αιωρήματος του ακινητοποιημένου αντιδραστηρίου. Για την αποφυγή διαρροής του ακινητοποιημένου αντιδραστηρίου από τις μικρο-στήλες χρησιμοποιούνταν μη μεταλλικές φρίττες πορώδους μm. Το ρυθμιστικό διάλυμα Britton-Robinson παρασκευαζόταν με διάλυση κατάλληλων ποσοτήτων βορικού, οξικού και φωσφορικού οξέος σε 500 ml δις-απιονισμένου νερού και είχε τελική συγκέντρωση ποσότητας ουσίας κάθε συστατικού ίση με mol L -1. Η ρύθμιση του ph γινόταν με διάλυμα ΝaOH συγκέντρωσης ποσότητας c = 2,0 mol L -1 ενώ ο έλεγχος του ph γινόταν σε καθημερινή βάση πριν την έναρξη των πειραμάτων. Το ρυθμιστικό διάλυμα τρις-(υδροξυμέθυλο)-αμινομεθάνιο (TRIS) συγκέντρωσης ποσότητας c = 0,1 mol L -1 παρασκευαζόταν με διάλυση κατάλληλης ποσότητας του αντιδραστηρίου σε 250 ml δις-απιονισμένου νερού και ρύθμιση του ph με διάλυμα HCl συγκέντρωσης ποσότητας c = 1,0 mol L -1.

44 Κεφάλαιο 8 39 Οργανολογία Ο αυτόματος αναλυτής SIA που χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη της εν-ροή αναγωγής δισουλφιδικών δεσμών αποτελούνταν από τα επιμέρους οργανολογικά τμήματα: 1. Αυτόματη βαλβίδα επιλογής 10 θέσεων (Valco, Ελβετία). 2. Περισταλτική αντλία (Gilson Miniplus3, Γαλλία). 3. Φασματοφωτομετρικό ανιχνευτή του οίκου Shimadzu, μοντέλο SPD-10A VP. Το σύστημα ροής αποτελούνταν από σωλήνες Teflon, εσωτερικής διαμέτρου 0.5 mm, εκτός αν αναφέρεται κάτι διαφορετικό. Το σπείραμα συγκράτησης (HC) είχε μήκος 300 cm και εσωτερική διάμετρο 0,7 mm. Όπου απαιτούνταν εν-ροή θερμοστάτηση των διαλυμάτων, αυτή επιτυγχάνονταν με τη χρήση του θερμοστάτη FIAStar 5101 (Tecator, Σουηδία). Η λειτουργία του αναλυτή ελέγχονταν μέσω ηλεκτρονικού υπολογιστή με κάρτα εισόδου / εξόδου (6025 Ε, National Instrument, Austin, TX). Ο έλεγχος του συστήματος γινόταν με τη χρήση ενός λογισμικού LabVIEW (National Instrument, Austin, TX). Το πρόγραμμα αναπτύχθηκε στο εργαστήριο αναλυτικής Χημείας, του τμήματος Χημείας του Α.Π.Θ. Τα λαμβανόμενα σήματα από το σύστημα ανίχνευσης καταγράφονταν και αποτιμούνταν με τη βοήθεια του λογισμικού Clarity Station for Windows (DatApex, Τσεχία). Ο επιπλέον συνήθης εργαστηριακός εξοπλισμός περιλάμβανε κατά τη διάρκεια της εργασίας: - αναλυτικό ζυγό του οίκου Sartorius, μοντέλο πεχάμετρο του οίκου Orion, μοντέλο EA940 - λουτρό υπερήχων του οίκου Elma Transonic, μοντέλο 460/H

45 Κεφάλαιο 9 40 Κεφάλαιο 9 Μελέτη της μη αυτοματοποιημένης (off-line) αναγωγής δι-σουλφιδίων με τη χρήση της τρις-(καρβοξυαίθυλο) φωσφίνης (TCEP) 9.1. Εισαγωγή Στο κεφάλαιο αυτό μελετήθηκε η δυνατότητα και αποτελεσματικότητα της μη αυτοματοποιημένης (off-line) αναγωγής δισουλφιδίων από την TCEP. Ως αντιπροσωπευτικό χημικό σύστημα επιλέχθηκε το ζεύγος κυστεΐνης (CYS) κυστίνης (CSN). Το πειραματικό πρωτόκολλο της αντίδρασης αναγωγής του μελετούμενου δισουλφιδίου περιλάμβανε off-line ανάμιξη κατάλληλων όγκων των αντιδραστηρίων (δισουλφίδιο ή/και θειόλη, ρυθμιστικό διάλυμα, διάλυμα TCEP) και τελική αραίωση σε όγκο 2,0 ml με απιονισμένο νερό. Η αποτελεσματικότητα της αναγωγής της CSN μελετούνταν με μέτρηση της παραγόμενης CYS λαμβάνοντας υπόψη την μοριακή αναλογία της αντίδρασης (1:2), όπως φαίνεται στο παρακάτω γενικό σχήμα. Ο προσδιορισμός της παραγόμενης CYS γίνονταν με τη χρήση αυτοματοποιημένης μεθόδου SIA που βασίζεται στην εν-ροή αντίδραση της CYS με τον αίθυλο εστέρα του προπιολικού οξέος (ΕΡ) σε αλκαλικό περιβάλλον [1]. Η διάταξη της SIA που χρησιμοποιήθηκε φαίνεται στο σχήμα 9.1. Ο τυπικός κύκλος ανάλυσης με τη SIA περιλάμβανε τέσσερα στάδια, όπως φαίνεται στο σχήμα 9.2. Συγκεκριμένα, αναρροφώνταν διαδοχικά καθορισμένοι όγκοι από το αντιδραστήριο (ΕΡ), το ρυθμιστικό διάλυμα και το δείγμα (μίγμα αντίδρασης αναγωγής) και με αντιστροφή της φοράς λειτουργίας της αντλίας οδηγούνταν, μέσω κατάλληλου σπειράματος αντίδρασης (RC), στον ανιχνευτή. Το προϊόν της αντίδρασης της CYS με το ΕΡ ανιχνεύονταν φασματοφωτομετρικά στα 285 nm. Οι γεωμετρικές και χημικές παράμετροι του συστήματος της SIA για τον προσδιορισμό της CYS δίνονται συγκεντρωτικά στον Πίνακα 9.1.

46 Κεφάλαιο 9 41 Σχήμα 9.1. Διάταξη SIA για τον προσδιορισμό της CYS: C = μεταφορέας (νερό), PP = περισταλτική αντλία, HC = σπείραμα συγκράτησης (300 cm / 0,7 mm i.d.), MVP = βαλβίδα πολλαπλών θέσεων, RC = σπείραμα αντίδρασης (60 cm / 0,5 mm i.d.), D = ανιχνευτής (λ max = 285 nm), S = δείγμα, R 1 = ΕΡ (c = 0,01 mol L -1 ), R 2 = ρυθμιστικό διάλυμα Britton-Robinson (ph = 10,0), W = απόβλητα. Σχήμα 9.2. Στάδια (S1-S4) κύκλου ανάλυσης με τη SIA για τον προσδιορισμό της CYS: P = περισταλτική αντλία, HC = σπείραμα συγκράτησης (300 cm / 0,7 mm i.d.), V.P. = θέση βαλβίδας, RC = σπείραμα αντίδρασης (60 cm / 0,5 mm i.d.), D = ανιχνευτής (λ max = 285 nm), S = δείγμα.

47 Κεφάλαιο 9 42 Πίνακας 9.1. Συγκεντρωτικός πίνακας παραμέτρων SIΑ. Παράμετρος Τιμή Γεωμετρικές q V (C) / ml min -1 0,6 V(S) / μl 50 V(R 1 ) / μl 50 V(R 2 ) / μl 50 l(rc) / cm 60 Χημικές T / ο C 25 ph 10,0 c(r 1 ) / mol L Προκαταρκτικά πειράματα Τα προκαταρκτικά πειράματα περιλάμβαναν μια σειρά μετρήσεων με σκοπό τη διερεύνηση της καταλληλότητας της μεθόδου SIA για τη μελέτη της αντίδρασης αναγωγής της CSN από την TCEP. Για το σκοπό αυτό αναλύθηκε μια σειρά δειγμάτων και τα αποτελέσματα δίνονται στο σχήμα 9.3. Από το σχήμα 9.3, προκύπτουν τα κάτωθι συμπεράσματα: 1. Απουσία TCEP από το μίγμα αναγωγής, η CSN (c = 0, mol L -1 ) δεν αντιδρά με το αντιδραστήριο παραγωγοποίησης (ΕΡ) και κατά συνέπεια δεν παρεμποδίζει θετικά ή αρνητικά τον προσδιορισμό της CYS (c = 1, mol L -1 ) (σχήμα 9.3, στήλες 1 και 2). 2. Η περίσσεια του αναγωγικού αντιδραστηρίου επίσης δεν παρεμποδίζει τον προσδιορισμό της CYS (σχήμα 9.3, στήλες 1 και 3). 3. Απουσία CYS, οι τιμές των τυφλών προσδιορισμών είναι σταθερές και σε χαμηλά επίπεδα (σχήμα 9.3, στήλες 4-6)

48 Κεφάλαιο Μελέτη της κινητικής της αντίδραση αναγωγής Για τη μελέτη της κινητικής της αντίδρασης αναγωγής της CSN, το πειραματικό πρωτόκολλο περιλάμβανε την ανάμιξη των εξής: μl CYS (c = mol L -1 ) ή CSN (c = mol L -1 ) μl ρυθμιστικού διαλύματος TRIS (c = 0,1 mol L -1, ph = 7,5) μl TCEP (c = 0.01 mol L -1 ) 4. Αραίωση μέχρι τα 2,0 ml με απιονισμένο νερό. Το μείγμα της αντίδρασης αναδευόταν και εισαγόταν στον αναλυτή SIA. Η πρώτη μέτρηση γινόταν 5 min μετά την προσθήκη του αναγωγικού αντιδραστηρίου και ακολουθούσαν επαναλαμβανόμενες εγχύσεις δείγματος κάθε 2 min. Τα πειραματικά αποτελέσματα δίνονται στο σχήμα 9.4. Από τα λαμβανόμενα σήματα είναι σαφές ότι η αντίδραση αναγωγής είναι ταχύτατη, καθώς έχει ήδη ολοκληρωθεί σε διάστημα μικρότερο των 5 min. Σχήμα 9.3. Προκαταρκτικά πειράματα.

49 Κεφάλαιο Επίδραση του ph στην αντίδραση αναγωγής Σύμφωνα με τη διεθνή βιβλιογραφία η TCEP έχει τη δυνατότητα να ανάγει δεσμούς S-S σε ένα αρκετά μεγάλο εύρος τιμών ph που μπορεί να κυμανθεί από [2]. Το πειραματικό πρωτόκολλο περιλάμβανε την ανάμιξη των εξής: Σχήμα 9.4. Μελέτη κινητικής της αντίδρασης αναγωγής της CSN από την TCEP σε εύρος χρόνου 5 15 min. Σχήμα 9.5. Επίδραση του ph στην αντίδραση αναγωγής της CSN από την TCEP.

50 Κεφάλαιο μl CYS (c = mol L -1 ) ή CSN (c = mol L -1 ) μl ρυθμιστικού διαλύματος TRIS (c = 0,1 mol L -1, ph = 6,0 10,0) μl TCEP (c = 0.01 mol L -1 ) 4. Αραίωση μέχρι τα 2,0 ml με απιονισμένο νερό. Το μίγμα της αντίδρασης αφήνονταν να αντιδράσει για 5 min και στη συνέχεια ακολουθούσαν επαναλαμβανόμενες εγχύσεις μέχρι τη λήψη σταθερών σημάτων (χημική ισορροπία). Το ποσοστό αναγωγής υπολογιζόταν με βάση τον παρακάτω τύπο: Όπου Η(CSN) είναι το ύψος των λαμβανόμενων σημάτων για την CSN μετά το πέρας της αντίδρασης αναγωγής και Η(CYS) το ύψος των λαμβανόμενων σημάτων στοιχειομετρικών συγκεντρώσεων CYS για τις ίδιες συνθήκες αντίδρασης. Τα πειραματικά αποτελέσματα δίνονται στο σχήμα 9.5. Όπως φαίνεται από το σχήμα 9.5, η αναγωγική δράση της TCEP αυξάνεται δραματικά σε τιμές ph μεγαλύτερες του 7,5. Η συμπεριφορά αυτή είναι σε συμφωνία με τη διεθνή βιβλιογραφία όπου αναφέρεται ότι η pk a της TCEP είναι ίση με 7,66 [3]. Με βάση τα πειραματικά δεδομένα που προέκυψαν, η TCEP ανάγει ποσοτικά την CSN (97,2 98,7 %) σε εύρος τιμών ph από 7,5 9, Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας του ρυθμιστικού διαλύματος στην αντίδραση αναγωγής Για τη μελέτη της πιθανής επίδρασης της συγκέντρωσης ποσότητας του ρυθμιστικού διαλύματος στην αντίδραση αναγωγής της CSN από την TCEP ακολουθήθηκε το πειραματικό πρωτόκολλο που αναφέρεται στην προηγούμενη παράγραφο. Η ιοντική ισχύς μεταβλήθηκε σε εύρος 0,01 0,025 mol L -1, μεταβάλλοντας τον όγκο του ρυθμιστικού διαλύματος στο μίγμα της αντίδρασης αναγωγής. Το ph της αντίδρασης διατηρήθηκε σταθερό και ίσο με 8,0. Τα πειραματικά αποτελέσματα (σχήμα 9.6), δεν έδειξαν σημαντική επίδραση της ιοντικής ισχύος, καθώς η ποσοστιαία αναγωγή κυμάνθηκε σε τιμές > 96,0 % σε όλες τις περιπτώσεις.

51 Κεφάλαιο Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας της TCEP στην αντίδραση αναγωγής Η μελέτη της επίδρασης της συγκέντρωσης ποσότητας της TCEP στην αντίδραση αναγωγής της CSN πραγματοποιήθηκε σε εύρος συγκεντρώσεων ποσότητας 1, έως 10, mol L -1, μεταβάλλοντας τον όγκο του αναγωγικού αντιδραστηρίου στο μίγμα της αντίδρασης. Σχήμα 9.6. Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας του ρυθμιστικού διαλύματος στην αντίδραση αναγωγής της CSN από την TCEP. Σχήμα 9.7. Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας της TCEP στην αντίδραση αναγωγής της CSN.

52 Κεφάλαιο 9 47 Οι συγκεντρώσεις ποσότητας της CSN και της CYS ήταν ίσες με 0, και 1, mol L -1 αντίστοιχα και το ph = 8,0. Τα πειραματικά αποτελέσματα δίνονται στο σχήμα 9.7. Το ποσοστό αναγωγής της CSN ήταν σταθερό και > 96,0 % σε εύρος συγκεντρώσεων ποσότητας TCEP από 2, έως 10, mol L Έλεγχος γραμμικότητας Η αποτελεσματικότητα της αντίδρασης αναγωγής της CSN από την TCEP ελέγχθηκε σε εύρος συγκεντρώσεων CSN από 0-1, mol L -1. Κατά τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας η τιμή του ph ήταν ίση με 8,0, η συγκέντρωση ποσότητας του ρυθμιστικού διαλύματος ήταν ίση με 0,015 mol L -1 και η συγκέντρωση ποσότητας της TCEP ίση με 5, mol L -1. Όπως φαίνεται από το σχήμα 9.8, η γραμμικότητα ήταν εξαιρετική σε όλο το μελετούμενο εύρος συγκεντρώσεων. Συγκριτικά, λήφθηκαν και καμπύλες αναφοράς για την CYS σε εύρος συγκεντρώσεων ποσότητας 0-2, mol L -1 με τις παρακάτω πειραματικές συνθήκες: Α: απουσία CSN και TCEP B: παρουσία CSN (1, mol L -1 ) και απουσία TCEP Γ: απουσία CSN και παρουσία TCEP (5, mol L -1 ) Σχήμα 9.8. Έλεγχος γραμμικότητας της αντίδρασης αναγωγής της CSN από την TCEP.

53 Κεφάλαιο 9 48 Σχήμα 9.9. Έλεγχος γραμμικότητας προσδιορισμού CYS με τη μέθοδο SIA σε διάφορες συνθήκες: Α) απουσία CSN και TCEP, Β) παρουσία CSN (1, mol L -1 ) και απουσία TCEP, C) απουσία CSN και παρουσία TCEP (5, mol L -1 ).

54 Κεφάλαιο 9 49 Όπως φαίνεται από τις κλίσεις των ευθειών του σχήματος 9.9, αυτές παρέμειναν πρακτικά ανεπηρέαστες, επιβεβαιώνοντας για μια ακόμα φορά την εκλεκτικότητα και καταλληλότητα της μεθόδου SIA. Επίσης ο λόγος των κλίσεων των ευθειών ελαχίστων τετραγώνων για τις CSN και CYS (R = 1,98) επιβεβαιώνουν τη στοιχειομετρία και την αποτελεσματικότητα της αντίδρασης αναγωγής Ανάλυση μιγμάτων CSN-CYS Η πιθανή αποτελεσματικότητα του συνδυασμού της αντίδρασης αναγωγής της CSN από την TCEP με τη μέθοδο SIA για τον προσδιορισμό της CYS, ελέγχθηκε αναλύοντας μίγματα των δύο συστατικών σε διάφορες αναλογίες. Από τα αποτελέσματα του Πίνακα 9.2 φαίνεται πως οι ανακτήσεις κυμάνθηκαν σε ικανοποιητικά επίπεδα σε όλες τις περιπτώσεις (95,7 104,9 %). Πίνακας 9.2. Ανάλυση μιγμάτων CSN και CYS. c(cys) ( 10 4 mol L -1 ) c(csn) Ανάκτηση (%) ( 10 4 mol L -1 ) CYS CSN 0,25 97,5 0,50 101,5 0,75 99,0 1,0 98,1 0,25 97,1 0,50 96,9 0,75 102,3 1,0 97,0 0,25 0,25 97,2 96,5 0,50 0,25 98,1 98,7 0,75 0,25 97,6 100,9 1,0 0,25 103,5 98,4 0,25 0,50 96,5 102,4 0,50 0,50 98,6 95,7 0,75 0,50 104,9 98,7 1,0 0,50 104,7 96,3

55 Κεφάλαιο Αντίδραση αναγωγής της CSN από την TCEP σε συνθήκες συνεχούς ροής Στο τελευταίο μέρος του κεφαλαίου αυτού έγινε μια πρώτη προσέγγιση μελέτης της δυνατότητας της εν-ροή αναγωγής της CSN από την TCEP. Το διάγραμμα ροής της SIA ήταν παρόμοιο με αυτό που φαίνεται στο σχήμα 9.1. Τα στάδια του κύκλου ανάλυσης δίνονται σχηματικά στο σχήμα Όπως φαίνεται στο σχήμα 9.10, το αναγωγικό αντιδραστήριο προαναμιγνυόταν με το ρυθμιστικό διάλυμα (ph = 10,0). H μελέτη της εν-ροή αναγωγής της CSN έγινε με πειράματα αναχαίτισης της ροής, μέσα στην κυψελίδα συνεχούς ροής του φασματοφωτομετρικού ανιχνευτή. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα δίνονται στο σχήμα Όπως φαίνεται από τα πειραματικά αποτελέσματα, η εν-ροή αναγωγή της CSN από την TCEP εξαρτάται σε σημαντικό βαθμό από τη συγκέντρωση ποσότητας του αναγωγικού αντιδραστηρίου. Με χρήση συγκέντρωσης ποσότητας TCEP ίσης με 3, mol L -1 (σχήμα 9.11 D), επιτεύχθηκε αναγωγή σε ποσοστό περίπου 60 % σε διάστημα 5 min. Με βάση τα αποτελέσματα αυτά, στα επόμενα κεφάλαια μελετήθηκε αναλυτικά η εν-ροή αναγωγή δισουλφιδικών δεσμών σε σύστημα SIA με χρήση της TCEP τόσο σε διαλυμένη μορφή, όσο και ακινητοποιημένης σε κατάλληλο υπόστρωμα. Σχήμα Στάδια (S1-S4) κύκλου ανάλυσης με τη SIA για την εν-ροή αναγωγή της CSN από την TCEP: P = περισταλτική αντλία, HC = σπείραμα συγκράτησης (300 cm / 0,7 mm i.d.), V.P. = θέση βαλβίδας, RC = σπείραμα αντίδρασης (60 cm / 0,5 mm i.d.), D = ανιχνευτής (λ max = 285 nm), S = δείγμα.

56 Κεφάλαιο 9 51 Σχήμα Πειράματα αναχαίτισης της ροής για την εν-ροή αναγωγή της CSN από την TCEP: Α = c(csn) = 0, mol L -1 c(tcep) = 0 mol L -1, B = c(csn) = 0, mol L -1 c(tcep) = 1, mol L -1, C = c(csn) = 0, mol L -1 c(tcep) = 2, mol L -1, D = c(csn) = 0, mol L -1 c(tcep) = 3, mol L -1, E = c(cys) = 1, mol L -1.

57 Κεφάλαιο 9 52 Βιβλιογραφία [1] C.K. Zacharis, P.D. Tzanavaras, D.G. Themelis, J. Pharm. Biomed. Anal. 50 (2009) 384. [2] Pierce Biotechnology Inc, TCEP HCl, (2005) URL: [3] S.D. Heck, P.R. Kelbaugh, J. Am. Chem. Soc. 116 (1994)

58 Κεφάλαιο Κεφάλαιο 10 Μελέτη της εν-ροή (on-line) αναγωγής δι-σουλφιδίων σε σύστημα SIA με τη χρήση διαλυμένης τρις-(καρβοξυαίθυλο) φωσφίνης (TCEP) Εισαγωγή Στο κεφάλαιο αυτό μελετήθηκε η δυνατότητα και αποτελεσματικότητα της εν-ροή (on-line) αναγωγής δισουλφιδίων από την TCEP. Στη μελέτη αυτή ως αντιπροσωπευτικό χημικό σύστημα επιλέχθηκε το αντιδραστήριο Ellman (5,5- διθειο-δις-(2-νιτροβενζοϊκό οξύ), DTNB). Όπως φαίνεται από τη δομή του DTNB στο σχήμα 10.1, το αντιδραστήριο αυτό είναι ένα δισουλφίδιο, το οποίο μπορεί να αναχθεί από την TCEP. Το σημαντικό πλεονέκτημα του DTNB είναι ότι το προϊόν της αναγωγής (TNB) εμφανίζει σημαντική απορρόφηση σε μέγιστο μήκος κύματος 412 nm. Κατά συνέπεια η αντίδραση της αναγωγής μπορεί να παρακολουθείται απευθείας φασματοφωτομετρικά χωρίς τη μεσολάβηση άλλης αντίδρασης ανίχνευσης του προϊόντος αναγωγής. Το χαρακτηριστικό αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό γιατί σε αντίθετη περίπτωση θα έπρεπε να ληφθούν υπόψη και τα όποια κινητικά χαρακτηριστικά της αντίδρασης ανίχνευσης. Σχήμα Αντίδραση αναγωγής του DTNB από την TCEP

59 Κεφάλαιο Σχήμα Διάταξη SIA για τη μελέτη της εν-ροή αναγωγής του DTNB από την TCEP: C = μεταφορέας (νερό), PP = περισταλτική αντλία, HC = σπείραμα συγκράτησης (300 cm / 0,7 mm i.d.), MVP = βαλβίδα πολλαπλών θέσεων, RC = σπείραμα αντίδρασης (60 cm / 0,5 mm i.d.), D = ανιχνευτής (λ max = 412 nm), S = DTNB, R 1 = TCEP, R 2 = ρυθμιστικό διάλυμα TRIS (c = 0,1 mol L -1 ), W = απόβλητα. Σχήμα Στάδια (S1-S4) κύκλου ανάλυσης με τη SIA για τη μελέτη της εν-ροή αναγωγής του DTNB από την TCEP: P = περισταλτική αντλία, HC = σπείραμα συγκράτησης (300 cm / 0,7 mm i.d.), V.P. = θέση βαλβίδας, RC = σπείραμα αντίδρασης (60 cm / 0,5 mm i.d.), D = ανιχνευτής (λ max = 412 nm).

60 Κεφάλαιο Η διάταξη της SIA που χρησιμοποιήθηκε σε όλη τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας φαίνεται στο σχήμα Ο τυπικός κύκλος ανάλυσης με τη SIA περιλάμβανε τέσσερα στάδια, όπως φαίνεται στο σχήμα Συγκεκριμένα, αναρροφώνταν διαδοχικά καθορισμένοι όγκοι από το αναγωγικό αντιδραστήριο (TCEP), το ρυθμιστικό διάλυμα (TRIS) και το δείγμα (DTNB) και με αντιστροφή της φοράς λειτουργίας της αντλίας οδηγούνταν, μέσω κατάλληλου σπειράματος αντίδρασης (RC), στον ανιχνευτή. Το προϊόν της αντίδρασης αναγωγής (ΤNB) ανιχνευόταν φασματοφωτομετρικά στα 412 nm. Οι βασικές παράμετροι του συστήματος της SIA για τη μελέτη της εν-ροή αναγωγής του DTNB δίνονται συγκεντρωτικά στον Πίνακα Πίνακας Συγκεντρωτικός πίνακας παραμέτρων SIΑ. Παράμετρος Τιμή q V (C) / ml min -1 0,6 V(DTNB) / μl 50 V(TCEP) / μl 50 V(Ρ.Δ.) / μl 50 l(rc) / cm 60 T / ο C 25 Σχήμα Φάσματα υπεριώδους-ορατού του DTNB (Ι) και του προϊόντος αναγωγής (ΤΝΒ) από την TCEP (ΙΙ).

61 Κεφάλαιο Προκαταρκτικά πειράματα Λήψη φασμάτων DTNB και ΤΝΒ Για τη λήψη φασμάτων του DTNB και του προϊόντος αναγωγής (TNB), χρησιμοποιήθηκε διάλυμα του δισουλφιδίου τελικής συγκέντρωσης ποσότητας 0, mol L -1 σε ph = 8,0, με χρήση ρυθμιστικού διαλύματος TRIS (c = 0,1 mol L - 1 ). Η λήψη των φασμάτων έγινε σε off-line με χρήση φασματοφωτομέτρου υπεριώδους ορατού Jasco V-530 και χαλαζιακών κυψελίδων οπτικής διαδρομής 1 cm. Το φάσμα του DTNB σε εύρος μηκών κύματος nm φαίνεται στο σχήμα 10.4 (Ι). Για τη λήψη του φάσματος του προϊόντος αναγωγής (ΤΝΒ) χρησιμοποιήθηκε επιπλέον διάλυμα TCEP τελικής συγκέντρωσης ποσότητας 5, mol L -1. Η αντίδραση αφέθηκε να ολοκληρωθεί για 15 min σε θερμοκρασία δωματίου. Το φάσμα του TNB σε εύρος μηκών κύματος nm δίνεται στο σχήμα 10.4 (ΙΙ), όπου φαίνεται η μέγιστη απορρόφηση στα 412 nm Αναγωγή του DTNB off-line και οn-line Η σειρά αυτή των προκαταρκτικών πειραμάτων είχε σαν στόχο μια πρώτη συγκριτική προσέγγιση της αντίδρασης αναγωγής του DTNB από την TCEP σε μηαυτοματοποιημένες συνθήκες και εν-ροή με τη χρήση της διάταξης SIA του σχήματος Για την αντίδραση αναγωγής σε μη αυτοματοποιημένες συνθήκες (off-line), οι τελικές συγκεντρώσεις ποσότητας του DTNB και της TCEP ήταν 0, mol L -1 και 5, mol L -1 αντίστοιχα και το ph = 8,0. Το μίγμα της αντίδρασης αφηνόταν να αντιδράσει για 15 min και στη συνέχεια 50 μl εγχυόταν στο σύστημα της SIA. Παράλληλα αναλυόταν και τυφλό διάλυμα απουσία του αναγωγικού αντιδραστηρίου. Τα πειραματικά αποτελέσματα δίνονται στο σχήμα Η προκαταρκτική μελέτη της εν-ροή αναγωγής του δεσμού S-S του DTNB από την TCEP πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τα στάδια της SIA που δίνονται στο σχήμα Οι συγκεντρώσεις ποσότητας του DTNB και της TCEP ήταν 0, mol L -1 και 5, mol L -1 αντίστοιχα και το ph = 8,0. Οι τιμές των υπόλοιπων γεωμετρικών παραμέτρων ήταν αυτές που αναφέρονται στον Πίνακα Όπως φαίνεται από τα πειραματικά αποτελέσματα του σχήματος 10.6(Α), το DTNB ανάγεται αποτελεσματικά σε συνθήκες συνεχούς ροής παρουσία

62 Κεφάλαιο Σχήμα Προκαταρκτικά πειράματα: A) Off-line αναγωγή του DTNB από την TCEP και Β) τυφλός προσδιορισμός (απουσία TCEP). Σχήμα Προκαταρκτικά πειράματα: A) On-line αναγωγή του DTNB από την TCEP και Β) τυφλός προσδιορισμός (απουσία TCEP).

63 Κεφάλαιο της TCEP, ενώ δεν παρατηρείται αντίδραση απουσία του αναγωγικού αντιδραστηρίου (σχήμα 10.6(Β)) Επίδραση του ph στην αντίδραση αναγωγής Η επίδραση του ph στην εν-ροή αντίδραση αναγωγής του δεσμού S-S του DTNB από την TCEP μελετήθηκε σε εύρος τιμών ph = 6,0 10,0 με χρήση κατάλληλων ρυθμιστικών διαλυμάτων TRIS (c = 0,1 mol L -1 ). Οι τιμές των χημικών και γεωμετρικών παραμέτρων του συστήματος SIA ήταν αυτές που δίνονται στην προηγούμενη παράγραφο και στον Πίνακα Τα πειραματικά αποτελέσματα της μελέτης της επίδρασης του ph δίνονται στο σχήμα Όπως φαίνεται από τις τιμές του σχήματος και όπως ήταν αναμενόμενο, η αντίδραση αναγωγής είναι πιο αποτελεσματική σε αλκαλικό περιβάλλον και συγκεκριμένα σε τιμές ph = 8,0 9,0. Σχήμα Επίδραση του ph στην εν-ροή αναγωγή του DTNB από την TCEP: c(dtnb) = 0, mol L -1, c(tcep) = 5, mol L -1.

64 Κεφάλαιο Η κινητική συμπεριφορά της αντίδρασης αναγωγής σε συνάρτηση με το ph μελετήθηκε με πειράματα αναχαίτισης της ροής. Συγκεκριμένα, μετά την πραγματοποίηση των σταδίων S1-S4 του σχήματος 10.3, το πιο πυκνό κομμάτι της ζώνης του μίγματος της αντίδρασης παγιδευόταν στην κυψελίδα του φασματοφωτομετρικού ανιχνευτή και η πορεία της αντίδρασης παρακολουθούνταν σε πραγματικό χρόνο για 300 s. Τα πειραματικά αποτελέσματα δίνονται στο σχήμα Όπως φαίνεται από τις κινητικές καμπύλες του σχήματος 10.8, για τιμές ph μεγαλύτερες του 7,0 η αντίδραση αναγωγής ολοκληρώνεται σε χρόνο μικρότερο των 60 s. Αντίθετα, σε τιμή ph = 6,0 η αντίδραση ολοκληρώνεται πρακτικά σε χρόνο 300 s. Στο σχήμα 10.9 δίνονται τα ποσοστά αναγωγής του DTNB στις μελετούμενες τιμές ph για χρόνους αντίδρασης 0 (ορίζεται κατά σύμβαση η εν-ροή αντίδραση χωρίς αναχαίτιση της ροής) και 300 s. Στο σημείο αυτό πρέπει να σημειωθεί ότι ως 100 % αναγωγή θεωρήθηκε το λαμβανόμενο ύψος των κορυφών SIA που προέκυψαν από off-line πειράματα αναγωγής με χρόνο αντίδρασης 15 min. Όπως φαίνεται από τις τιμές του σχήματος 10.9, ο χρόνος αναχαίτισης της ροής (300 s) έχει σημαντική επίδραση στην εν-ροή αναγωγή μόνο σε τιμή ph = 6,0 της τάξης του 36 %. Για τιμή ph = 7,0 η αντίστοιχη αύξηση είναι 9 %, ενώ η αναχαίτιση της ροής δεν έχει πρακτική επίδραση σε μεγαλύτερες τιμές ph. Σχήμα Επίδραση του ph στην κινητική της εν-ροή αναγωγής του DTNB από την TCEP: c(dtnb) = 0, mol L -1, c(tcep) = 5, mol L -1.

65 Κεφάλαιο Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας της TCEP στην αντίδραση αναγωγής Η μελέτη της επίδρασης της συγκέντρωσης ποσότητας της TCEP στην εν-ροή αντίδραση αναγωγής του DTNB πραγματοποιήθηκε σε εύρος συγκεντρώσεων ποσότητας 1, έως 10, mol L -1. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε εύρος τιμών ph από 6,0 ως 10,0. Τα πειραματικά αποτελέσματα δίνονται στο σχήμα Όπως αναμενόταν, η επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας του αναγωγικού αντιδραστηρίου ήταν πιο σημαντική σε χαμηλές τιμές ph, όπου η κινητική συμπεριφορά της αντίδρασης είναι πιο αργή. Χαρακτηριστικά, στο εύρος των μελετούμενων συγκεντρώσεων, παρατηρήθηκε αύξηση στα λαμβανόμενα σήματα της τάξης του 162 % σε ph = 6,0 και 120 % σε ph = 7,0. Η κινητική συμπεριφορά της αντίδρασης αναγωγής σε συνάρτηση με τη συγκέντρωση ποσότητάς του μελετήθηκε με πειράματα αναχαίτισης της ροής. Συγκεκριμένα, όπως και στην προηγούμενη παράγραφο, μετά την πραγματοποίηση των σταδίων S1-S4 του σχήματος 10.3, το πιο πυκνό κομμάτι της ζώνης του μίγματος της αντίδρασης παγιδευόταν στην κυψελίδα του φασματοφωτομετρικού ανιχνευτή και η πορεία της αντίδρασης παρακολουθούνταν σε πραγματικό χρόνο για 300 s. Αντιπροσωπευτικά πειραματικά αποτελέσματα για τιμές ph = 6,0 και 8,0 δίνονται στα σχήματα και αντίστοιχα. Σχήμα Επίδραση του ph στην ποσοστιαία εν-ροή αναγωγή του DTNB από την TCEP σε χρόνο 0 και 300 s: c(dtnb) = 0, mol L -1, c(tcep) = 10, mol L -1.

66 Κεφάλαιο Σχήμα Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας της TCEP στην εν-ροή αναγωγή του DTNB σε διάφορες τιμές ph. Α) c(tcep) = 1, mol L -1, B) c(tcep) = 2, mol L -1, C) c(tcep) = 5, mol L -1 και D) c(tcep) = 10, mol L -1 : c(dtnb) = 0, mol L -1. Σχήμα Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας της TCEP στην κινητική της εν-ροή αναγωγή του DTNB σε ph=6,0. Α) c(tcep) = 1, mol L -1, B) c(tcep) = 2, mol L -1, C) c(tcep) = 5, mol L -1 και D) c(tcep) = 10, mol L -1 : c(dtnb) = 0, mol L -1.

67 Κεφάλαιο Όπως φαίνεται από τις κινητικές καμπύλες των σχημάτων, για τιμή του ph = 8,0, η συγκέντρωση ποσότητας του αναγωγικού αντιδραστηρίου δεν είχε σημαντική επίδραση στην κινητική της αντίδρασης, αφού σε όλες τις περιπτώσεις οι αντιδράσεις ολοκληρώνονται σε χρόνο μικρότερο των 60 s. Αντίθετα, σε χαμηλότερες τιμές ph, αύξηση της συγκέντρωσης ποσότητας της TCEP οδηγεί σε αύξηση της ταχύτητας της αντίδρασης (σχήμα 10.11) Επίδραση της παροχής όγκου του μεταφορέα στην αντίδραση αναγωγής Η επίδραση της παροχής όγκου του ρεύματος του μεταφορέα στην εν-ροή αντίδραση αναγωγής του DTNB από την TCEP μελετήθηκε σε εύρος τιμών 0,4 1,0 ml min -1. Η συγκέντρωση ποσότητας της TCEP ήταν σταθερή και ίση με 5, mol L -1. Η παράμετρος αυτή είναι εν δυνάμει ιδιαίτερα σημαντική σε αντιδράσεις συνεχούς ροής σε συστήματα SIA καθότι καθορίζει το χρόνο Σχήμα Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας της TCEP στην κινητική της εν-ροή αναγωγή του DTNB σε ph=8,0. Α) c(tcep) = 1, mol L -1, B) c(tcep) = 2, mol L -1, C) c(tcep) = 5, mol L -1 και D) c(tcep) = 10, mol L -1 : c(dtnb) = 0, mol L -1.

68 Κεφάλαιο Σχήμα Επίδραση της παροχής όγκου του ρεύματος του μεταφορέα στην εν-ροή αναγωγή του DTNB από την TCEP σε διάφορες τιμές ph: c(dtnb) = 0, mol L -1, c(tcep) = 5, mol L -1.

69 Κεφάλαιο παραμονής του μίγματος της αντίδρασης στο σπείραμα αντίδρασης και κατ επέκταση το χρόνο αντίδρασης. Όπως φαίνεται στο σχήμα 10.13, η μελέτη της επίδρασης της παροχής όγκου του μεταφορέα πραγματοποιήθηκε σε εύρος τιμών ph από 6,0 ως 10,0. Τα πειραματικά αποτελέσματα έδειξαν σημαντικότερη επίδραση της παροχής όγκου του μεταφορέα σε τιμή ph = 6,0, όπου αύξηση της τιμής της παροχής όγκου από 0,4 σε 0,6 ml min -1 είχε σαν αποτέλεσμα μείωση του ποσοστού αναγωγής κατά περίπου 9 %. Για τιμές ph από 8,0 9,0 η αναγωγή ήταν ποσοτική σε εύρος παροχών όγκου 0,4 0,6 ml min -1. Περεταίρω αύξηση των τιμών των παροχών όγκου οδήγησε σε μείωση του ποσοστού αναγωγής του DTNB σε όλες τις τιμές ph Επίδραση της θερμοκρασίας στην αντίδραση αναγωγής Η επίδραση της θερμοκρασίας στην αντίδραση της εν-ροή αναγωγής του DTNB από την TCEP μελετήθηκε σε εύρος ο C. Η μελέτη έγινε θερμοστατώντας το σπείραμα αντίδρασης στην επιθυμητή, κάθε φορά, θερμοκρασία. Τα πειραματικά αποτελέσματα δίνονται στο σχήμα Σχήμα Επίδραση της θερμοκρασίας του σπειράματος αντίδρασης στην εν-ροή αναγωγή του DTNB από την TCEP σε διάφορες τιμές ph. Α) 25 ο C, B) 40 ο C, C) 50 ο C και D) 60 ο C: c(dtnb) = 0, mol L -1, c(tcep) = 5, mol L -1.

70 Κεφάλαιο Όπως ήταν αναμενόμενο, η επίδραση της θερμοκρασίας ήταν πιο έντονη σε ph = 6,0, όπου παρατηρήθηκε αύξηση των σημάτων της τάξης του 75 % περίπου. Αντίθετα, σε πιο αλκαλικές τιμές ph η επίδραση της θερμοκρασίας σε όλο το μελετούμενο εύρος ήταν μικρότερη από 10 % Έλεγχος γραμμικότητας Η γραμμικότητα της εν-ροή αντίδρασης αναγωγής του DTNB από την TCEP ελέγχθηκε σε εύρος συγκεντρώσεων ποσότητας DTNB 0 0, mol L -1. Η συγκέντρωση ποσότητας της TCEP ήταν ίση με 5, mol L -1 και του ph ίση με 8,0. Οι υπόλοιπες παράμετροι ήταν αυτές που αναφέρονται στον Πίνακα 10.1 και η ακολουθία της SIA αυτή του σχήματος Όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα του σχήματος 10.15, η γραμμικότητα της διαδικασίας ήταν ικανοποιητική (r 2 > 0,999) σε όλο το εύρος των μελετούμενων συγκεντρώσεων DTNB, γεγονός που αποδεικνύει την αποτελεσματικότητα της αντίδρασης. Σχήμα Έλεγχος γραμμικότητας της εν-ροή αναγωγής του DTNB από την TCEP: c(tcep) = 5, mol L -1, ph = 8,0, T = 25 o C.

71 Κεφάλαιο Κεφάλαιο 11 Μελέτη της εν-ροή (on-line) αναγωγής δι-σουλφιδίων σε σύστημα SIA με τη χρήση ακινητοποιημένης τρις-(καρβοξυαίθυλο) φωσφίνης (TCEP) Εισαγωγή Στο προηγούμενο κεφάλαιο μελετήθηκε η δυνατότητα και αποτελεσματικότητα της εν-ροή (on-line) αναγωγής δισουλφιδίων από διαλυμένη TCEP. Σε πολλές περιπτώσεις χημικών συστημάτων είναι ανεπιθύμητη η παρουσία της περίσσειας του αναγωγικού αντιδραστηρίου, με αποτέλεσμα να απαιτείται η απομάκρυνσή του πριν την συνέχιση της αναλυτικής διαδικασίας. Κατά συνέπεια πραγματοποιούνται επιπλέον πειραματικά στάδια (εκχυλίσεις υγρής ή στερεάς φάσης) με σκοπό, όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, τη δέσμευση και απομάκρυνση της περίσσειας του αναγωγικού αντιδραστηρίου. Τα στάδια αυτά είναι συνήθως χρονοβόρα και εισάγουν επιπλέον σφάλματα και αβεβαιότητα στην ανάλυση. Μια ενδιαφέρουσα εναλλακτική λύση στην περίπτωση αυτή αποτελεί η χρήση του αναγωγικού αντιδραστηρίου ακινητοποιημένου σε κατάλληλο υπόστρωμα. Στο κεφάλαιο αυτό μελετήθηκε, κατά συνέπεια, η δυνατότητα και αποτελεσματικότητα της εν-ροή (online) αναγωγής δισουλφιδίων από ακινητοποιημένη TCEP. Και στη μελέτη αυτή ως αντιπροσωπευτικό χημικό σύστημα επιλέχθηκε αντιδραστήριο Ellman s (5,5- διθειο-δις-(2-νιτροβενζοϊκό οξύ), DTNB), καθώς όπως αναφέρθηκε και στο προηγούμενο κεφάλαιο, το σημαντικό πλεονέκτημα του DTNB είναι ότι το προϊόν της αναγωγής (TNB) εμφανίζει σημαντική απορρόφηση σε μέγιστο μήκος κύματος 412 nm και κατά συνέπεια η αντίδραση της αναγωγής μπορεί να παρακολουθείται απευθείας φασματοφωτομετρικά χωρίς τη μεσολάβηση άλλης αντίδρασης ανίχνευσης του προϊόντος αναγωγής. Η διάταξη της SIA που χρησιμοποιήθηκε σε όλη τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας φαίνεται στο σχήμα 11.1, ενώ η στήλη η οποία πληρώθηκε με την ακινητοποιημένη TCEP φαίνεται στο σχήμα Ο τυπικός κύκλος ανάλυσης με τη SIA περιλάμβανε τέσσερα στάδια, όπως φαίνεται στο σχήμα Συγκεκριμένα, καθορισμένος όγκος του υποστρώματος (DTNB) αναρροφόνταν μεταξύ δύο ζωνών ρυθμιστικού διαλύματος (TRIS). Το δείγμα (DTNB), με αντιστροφή της φοράς λειτουργίας της αντλίας, οδηγούνταν, μέσω κατάλληλου σπειράματος ανάμιξης (ΜC), στην αναγωγική στήλη. Το προϊόν της αντίδρασης

72 Κεφάλαιο Σχήμα Διάταξη SIA για τη μελέτη της εν-ροή αναγωγής του DTNB από την ακινητοποιημένη TCEP: C = μεταφορέας (νερό), PP = περισταλτική αντλία, HC = σπείραμα συγκράτησης (300 cm / 0,7 mm i.d.), MVP = βαλβίδα πολλαπλών θέσεων, ΜC = σπείραμα ανάμιξης (30 cm / 0,5 mm i.d.), D = ανιχνευτής (λ max = 412 nm), S = DTNB, R 1 = ρυθμιστικό διάλυμα TRIS (c = 0,1 mol L -1 ), TCEP = μικροστήλη, W = απόβλητα. Σχήμα Μικροστήλη για χρήση σε συστήματα συνεχούς ροής.

73 Κεφάλαιο Σχήμα Στάδια (S1-S4) κύκλου ανάλυσης με τη SIA για τη μελέτη της εν-ροή αναγωγής του DTNB από την ακινητοποιημένη TCEP: P = περισταλτική αντλία, HC = σπείραμα συγκράτησης (300 cm / 0,7 mm i.d.), V.P. = θέση βαλβίδας, TCEP-MC = μικροστήλη ακινητοποιημένης TCEP, D = ανιχνευτής (λ max = 412 nm). Πίνακας Συγκεντρωτικός πίνακας παραμέτρων SIΑ. Παράμετρος Τιμή q V (C) / ml min -1 0,2 V(DTNB) / μl 25 V(Ρ.Δ.) / μl 2 50 l(mc) / cm 30 T / ο C 25 αναγωγής (ΤNB) ανιχνεύονταν φασματοφωτομετρικά στα 412 nm. Οι βασικές παράμετροι του συστήματος της SIA για τη μελέτη της εν-ροή αναγωγής του DTNB δίνονται συγκεντρωτικά στον Πίνακα 11.1.

74 Κεφάλαιο Επίδραση του ph στην αντίδραση αναγωγής Η επίδραση του ph στην εν-ροή αντίδραση αναγωγής του δεσμού S-S του DTNB από την ακινητοποιημένη TCEP μελετήθηκε σε εύρος τιμών ph = 6,0 10,0 με χρήση κατάλληλων ρυθμιστικών διαλυμάτων TRIS (c = 0,1 mol L -1 ). Οι τιμές των χημικών και γεωμετρικών παραμέτρων του συστήματος SIA ήταν αυτές που δίνονται στην προηγούμενη παράγραφο και στον Πίνακα Τα πειραματικά αποτελέσματα της μελέτης της επίδρασης του ph δίνονται στο σχήμα Η αποτελεσματικότητα της αναγωγής σε ποσοστιαία κλίμακα μελετήθηκε με σύγκριση των αποτελεσμάτων με πειράματα σε μη αυτοματοποιημένες συνθήκες (off-line) στις αντίστοιχες τιμές ph. Τα μίγματα της αντίδρασης αφήνονταν να αντιδράσει για 15 min και στη συνέχεια 25 μl εγχύονταν στο σύστημα της SIA. Για πληρέστερη μελέτη της αποτελεσματικότητας της εν-ροή αναγωγής, η πειραματική διαδικασία πραγματοποιήθηκε με χρήση δύο στηλών διαφορετικών διαστάσεων (V = 90 και 180 μl αντίστοιχα). Τα πειραματικά αποτελέσματα δίνονται στο σχήμα Όπως φαίνεται από τις τιμές του σχήματος η αντίδραση αναγωγής είναι πιο αποτελεσματική σε τιμές ph = 7,0 8,0. Συγκρίνοντας τα αντίστοιχα αποτελέσματα σε σχέση με τη διαλυμένη TCEP, προκύπτει το συμπέρασμα ότι με την ακινητοποιημένη TCEP επιτυγχάνεται αποτελεσματικότερη αναγωγή του δεσμού S-S σε χαμηλότερες τιμές ph. Χαρακτηριστικά μπορεί να αναφερθεί ότι σε τιμή ph = 6,0, με την διαλυμένη TCEP το ποσοστό αναγωγής ήταν της τάξης του 40 % χωρίς αναχαίτιση της ροής και έφτανε μέχρι το 80 % μόνο μετά από αναχαίτιση της ροής για χρόνο 300 s. Αντίστοιχα, με τη χρήση της ακινητοποιημένης TCEP στο ίδιο ph, το ποσοστό αναγωγής ήταν περίπου 80 % χωρίς αναχαίτιση της ροής. Παράλληλα, όπως φαίνεται και από το σχήμα 11.5, το μήκος της αναγωγικής στήλης δεν επηρεάζει σημαντικά το ποσοστό αναγωγής, γεγονός που αποδεικνύει τη γρήγορη κινητική της αντίδρασης Επίδραση της παροχής όγκου του μεταφορέα στην αντίδραση αναγωγής Η παροχή όγκου του ρεύματος του μεταφορέα αποτελεί μια εν-δυνάμει σημαντική παράμετρο για την αποτελεσματικότητα της εν-ροή αναγωγής δεσμών S-S από την

75 Κεφάλαιο Σχήμα Επίδραση του ph στην εν-ροή αναγωγή του DTNB από την ακινητοποιημένη TCEP. Α) στήλη 1,0 cm (V = 90 μl) και B) στήλη 2,0 cm (V = 180 μl): c(dtnb) = 0, mol L -1 ακινητοποιημένη TCEP, καθώς καθορίζει το χρόνο επαφής μεταξύ του υποστρώματος και του αναγωγικού αντιδραστηρίου μέσα στην αναγωγική στήλη. Η επίδραση της παροχής όγκου του ρεύματος του μεταφορέα μελετήθηκε σε εύρος τιμών 0,15 0,30 ml min -1. Και στην παράμετρο αυτή, η μελέτη

76 Κεφάλαιο πραγματοποιήθηκε για στήλες διαφορετικών διαστάσεων (V = 90 και 180 μl αντίστοιχα). Τα πειραματικά αποτελέσματα δίνονται στο σχήμα Όπως ήταν αναμενόμενο, αύξηση των τιμών της παροχής όγκου του μεταφορέα οδήγησε σε μείωση των σημάτων και στις δύο αναγωγικές στήλες. Στη στήλη με το μεγαλύτερο μήκος (L = 2 cm) τα σήματα παρέμειναν αμετάβλητα για τιμές παροχών 0,25 0,30 ml min -1, προφανώς λόγω αντιστάθμισης του μειωμένου χρόνου αντίδρασης από το αυξημένο μήκος της αναγωγικής στήλης. Σχήμα Επίδραση του ph στην ποσοστιαία αναγωγή του DTNB από την ακινητοποιημένη TCEP, Στήλη Ι = 1,0 cm (V = 90 μl) και Στήλη ΙΙ = 2,0 cm (V = 180 μl): c(dtnb) = 0, mol L Έλεγχος γραμμικότητας Η γραμμικότητα της εν-ροή αντίδρασης αναγωγής του DTNB από την ακινητοποιημένη TCEP ελέγχθηκε εισάγοντας στις στήλες αυξανόμενες ποσότητες

77 Κεφάλαιο Σχήμα Επίδραση της παροχής όγκου του ρεύματος του μεταφορέα στην εν-ροή αναγωγή του DTNB από την ακινητοποιημένη TCEP. Α) στήλη 1,0 cm (V = 90 μl) και B) στήλη 2,0 cm (V = 180 μl): c(dtnb) = 0, mol L -1. DTNB σε εύρος 0,375 0,875 nmol. Οι υπόλοιπες παράμετροι ήταν αυτές που αναφέρονται στον Πίνακα 11.1 και η ακολουθία της SIA αυτή του σχήματος Όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα του σχήματος 11.7, η γραμμικότητα της διαδικασίας ήταν ικανοποιητική (r 2 > 0,997) και για τις δύο στήλες σε όλο το εύρος των μελετούμενων ποσοτήτων DTNB, γεγονός που αποδεικνύει την αποτελεσματικότητα της αντίδρασης.

78 Κεφάλαιο Σχήμα Έλεγχος γραμμικότητας της εν-ροή αναγωγής του DTNB από την ακινητοποιημένη TCEP. Α) στήλη 1,0 cm (V = 90 μl) και B) στήλη 2,0 cm (V = 180 μl): ph = 8,0, T = 25 o C Σταθερότητα της αναγωγικής στήλης Μια σημαντική παράμετρος που πρέπει να μελετάται στις περιπτώσεις των ακινητοποιημένων αντιδραστηρίων είναι η σταθερότητά τους στο χρόνο. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε μια σειρά πειραμάτων που είχε να κάνει με τη συμπεριφορά των αναγωγικών στηλών τόσο κατά τη διάρκεια της ίδιας μέρας, όσο και από μέρα σε μέρα. Η σταθερότητα των αναγωγικών στηλών κατά τη διάρκεια

79 Κεφάλαιο της ίδιας μέρας μελετήθηκε με επαναλαμβανόμενες εγχύσεις του DTNB κάθε 5 min για χρονικό διάστημα οκτώ (8) ωρών. Μέρος των πειραματικών αποτελεσμάτων δίνεται στα σχήματα 11.8 και Και οι δύο στήλες που χρησιμοποιήθηκαν αποδείχθηκαν ικανοποιητικά σταθερές για περισσότερες από 60 διαδοχικές εγχύσεις που αντιστοιχούν σε χρονικό διάστημα συνεχούς λειτουργίας έξι ωρών. Μετά το πέρας των αναλύσεων οι στήλες πλένονταν με δις-απιονισμένο νερό και στη συνέχεια αναγεννιούνταν με διάλυμα της TCEP (1, mol L -1, ph = 8,0, V = 5 ml). Αποθηκεύονταν στους 4 ο C στο διάλυμα της TCEP μέχρι την επόμενη χρήση. Πρακτικά οι αναγωγικές στήλες μπορούσαν να αναγεννηθούν μέχρι τρεις φορές χωρίς σημαντική απώλεια της αναγωγικής τους ικανότητας (< 10 %).

80 Κεφάλαιο Σχήμα Έλεγχος σταθερότητας της στήλης (L = 1,0 cm, V = 90 μl).

81 Κεφάλαιο Σχήμα Έλεγχος σταθερότητας της στήλης (L = 2,0 cm, V = 180 μl).