ΑΛΚΥΛΟ-ΕΣΤΕΡΕΣ ΤΟΥ ΠΡΟΠΙΟΛΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ ΩΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΘΕΙΟΛΩΝ :

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΑΛΚΥΛΟ-ΕΣΤΕΡΕΣ ΤΟΥ ΠΡΟΠΙΟΛΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ ΩΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΘΕΙΟΛΩΝ : ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ ΣΕ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΣΥΝΕΧΟΥΣ ΡΟΗΣ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΑΝΑΛΥΤΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΑ ΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΘΕΙΟΛΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ Ν. ΤΣΙΟΜΛΕΚΤΣΗΣ ΧΗΜΙΚΟΣ Επιβλέπων: Λέκτορας Π.Δ. Τζαναβάρας ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ, 2010

2 Περιεχόμενα Περιεχόμενα Πρόλογος i ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εισαγωγή 1 1. Αυτοματισμός στο αναλυτικό εργαστήριο Ορισμοί Ανάγκη για αυτοματοποίηση - Πλεονεκτήματα 5 Βιβλιογραφία 6 2. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή SIA Εισαγωγή Ιστορική εξέλιξη Βασικές αρχές λειτουργίας Οργανολογία ενός αναλυτή SIA Τυπικά στάδια κύκλου ανάλυσης με τη SIA Αναχαίτιση ροής σε συτήματα SIA Πλεονεκτήματα Μειονεκτήματα SIA 14 Βιβλιογραφία Παραγωγοποίηση : Ορισμός Στόχοι Πλεονεκτήματα 16 Βιβλιογραφία Εφαρμογές των τεχνικών FIA και SIA στη φαρμακευτική ανάλυση 20 Βιβλιογραφία Γενικά χαρακτηριστικά - ιδιότητες προσδιοριζόμενων ενώσεων και 23 αντιδραστηρίων 5.1. Καπτοπρίλη Κυστεΐνη 24

3 Περιεχόμενα 5.3 Ν-ακέτυλοκυστεΐνη Προπιολικός μεθυλεστέρας Προπιολικός αιθυλεστέρας Προπιολικός βουτυλεστέρας 27 Βιβλιογραφία Βιβλιογραφική επισκόπηση 30 Βιβλιογραφία 36 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 7. Αντιδραστήρια Οργανολογία Αντιδραστήρια Οργανολογία Μελέτη της αντίδρασης θειολών με άλκυλο εστέρες του 41 προπιολικού οξέος σε συνθήκες συνεχούς ροής σε σύστημα SIA 8.1. Εισαγωγή Προκαταρκτικά πειράματα Μελέτη αντιδράσεων σε συνθήκες συνεχούς ροής Μελέτη επίδρασης του ph Μελέτη επίδρασης της θερμοκρασίας Μελέτη επίδρασης της συγκέντρωσης ποσότητας των 56 αντιδραστηρίων Βιβλιογραφία Ανάπτυξη αυτόματων μεθόδων SIA για τον έλεγχο διαλυτοποίησης 70 δισκίων καπτοπρίλης μετά από παραγωγοποίηση με άλκυλοεστέρες του προπιολικού οξέος 9.1. Αρχή της μεθόδου Προσδιορισμός της CAP σε υδατικά διαλύματα 71

4 Περιεχόμενα 9.3. Προσδιορισμός CAP σε δείγματα διαλυτοποίησης δισκίων Δοκιμή διαλυτοποίησης (Dissolution test) Μέθοδος αναφοράς Αποτελέσματα και Συζήτηση Ανάπτυξη - μελέτη μεθόδων 73 Επίδραση παροχής όγκου μεταφορέα προς τον ανιχνευτή 74 Επίδραση του όγκου του εγχυόμενου δείγματος 75 Επίδραση του όγκου των αντιδραστηρίων 75 Επίδραση του όγκου του ρυθμιστικού διαλύματος 76 Επίδραση του μήκους του σπειράματος αντίδρασης Επικύρωση των αναλυτικών μεθόδων Εφαρμογή των προτεινόμενων μεθόδων SIA 81 Βιβλιογραφία Ανάπτυξη αυτόματων μεθόδων SIA για τον φασματοφωτομετρικό 85 προσδιορισμό της κυστεΐνης σε συμπληρώματα διατροφής μετά από παραγωγοποίηση με άλκυλο-εστέρες του προπιολικού οξέος Αρχή της μεθόδου Προσδιορισμός της CYS σε υδατικά διαλύματα Προσδιορισμός CYS σε συμπληρώματα διατροφής Αποτελέσματα και Συζήτηση Ανάπτυξη μελέτη μεθόδων 87 Επίδραση παροχής όγκου μεταφορέα προς τον ανιχνευτή 88 Επίδραση του όγκου του εγχυόμενου δείγματος 89 Επίδραση του όγκου των αντιδραστηρίων 90 Επίδραση του όγκου του ρυθμιστικού διαλύματος 91 Επίδραση του μήκους του σπειράματος αντίδρασης Επικύρωση των αναλυτικών μεθόδων Εφαρμογή των προτεινόμενων μεθόδων SIA 96

5 Περιεχόμενα 11. Ανάπτυξη αυτόματων μεθόδων SIA για τον φασματοφωτομετρικό 98 προσδιορισμό της Ν-ακέτυλοκυστεΐνης σε φαρμακευτικά σκευάσματα μετά από παραγωγοποίηση με άλκυλο-εστέρες του προπιολικού οξέος Αρχή της μεθόδου Προσδιορισμός της NAC σε υδατικά διαλύματα Προσδιορισμός ΝΑC σε φαρμακευτικά σκευάσματα Αποτελέσματα και Συζήτηση Ανάπτυξη μελέτη μεθόδων 101 Επίδραση παροχής όγκου μεταφορέα προς τον ανιχνευτή 101 Επίδραση του όγκου του εγχυόμενου δείγματος 102 Επίδραση του όγκου των αντιδραστηρίων 103 Επίδραση του όγκου του ρυθμιστικού διαλύματος 104 Επίδραση του μήκους του σπειράματος αντίδρασης Επικύρωση των αναλυτικών μεθόδων Εφαρμογή των προτεινόμενων μεθόδων SIA 109 Βιβλιογραφία Συμπεράσματα Περίληψη 113

6 Πρόλογος i ΠΡΟΛΟΓΟΣ Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία αναπτύχθηκαν νέες αυτόματες μέθοδοι για τον φασματοφωτομετρικό προσδιορισμό μιας σειράς θειολών, και πιο συγκεκριμένα της καπτοπρίλης, της κυστεΐνης και της Ν-ακέτυλοκυστεΐνης. Οι προτεινόμενες μέθοδοι βασίζονται στην αυτόματη τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή (Sequential Injection Analysis, SIA). Η εργασία απαρτίζεται από δυο μέρη, το θεωρητικό και το πειραματικό. Στο θεωρητικό μέρος, αναφέρονται αρχικά κάποιοι ορισμοί, ενώ στη συνέχεια καταγράφονται όλες οι αρχές που διέπουν τις αντιδράσεις παραγωγοποίησης και τις τεχνικές FIA και SIA. Στο τέλος παρουσιάζεται βιβλιογραφική ανασκόπηση των εργασιών που είχαν ήδη, κατά το παρελθόν, προτείνει διάφορες μεθόδους προσδιορισμού των συγκεκριμένων θειολών. Στο πειραματικό μέρος επιχειρείται μια προσπάθεια, όσο το δυνατόν λεπτομερέστερης περιγραφής όλων των πειραματικών προσδιορισμών, που πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστήριο, για την ανάπτυξη των νέων μεθόδων. Το πειραματικό μέρος της εργασίας έλαβε χώρα στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, του τμήματος Χημείας, της Σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτέλειου Πανεπιστήμιου Θεσσαλονίκης από τον Ιούνιο του 2009 μέχρι τον Οκτώβριο του ίδιου έτους. Το θέμα της συγκεκριμένης μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας υποδείχθηκε από τον Λέκτορα κ. Παρασκευά Δ. Τζαναβάρα, η συμβολή του οποίου ήταν καθοριστική σε όλη τη διάρκεια της εργασίας. Τον ευχαριστώ θερμά όχι μόνο για αυτό, αλλά και για την αμέριστη συμπαράστασή του, τη συνεχή επιστημονική του καθοδήγηση και την καθημερινή του παρουσία. Ιδιαίτερες ευχαριστίες χρωστώ στον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Δημήτριο Γ. Θεμελή, ο οποίος ήταν εκείνος που μου έδωσε, πριν από χρόνια, το ερέθισμα να ασχοληθώ με το αντικείμενο της Αναλυτικής Χημείας. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω την κα. Ασπασία Βερδούκα, υπεύθυνη του εργοστασίου Cosmopharm ΕΠΕ, για την προμήθεια των δειγμάτων διαλυτοποίησης δισκίων καπτοπρίλης και των αποτελεσμάτων ανάλυσης με την μέθοδο αναφοράς. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά μου για την ηθική και υλική συμπαράστασή της, χωρίς την οποία η ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας θα ήταν αδύνατη. Αλέξανδρος Ν. Τσιομλεκτσής Θεσσαλονίκη, 2010

7 Εισαγωγή 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η προσπάθεια για βελτιστοποίηση των ήδη υπαρχουσών αναλυτικών μεθόδων από άποψη ευαισθησίας, ακρίβειας, επαναληψιμότητας, μείωσης του χρόνου και του κόστους μιας ανάλυσης, και ταυτόχρονα η μερική ή ολική αντικατάσταση του ανθρώπινου παράγοντα σε αναλύσεις ρουτίνας, οδήγησε στην έρευνα για την αυτοματοποίηση των αναλυτικών τεχνικών. Η έρευνα είχε σαν αποτέλεσμα την εξέλιξη ενός σημαντικού κλάδου της Αναλυτικής Χημείας. Η τεχνική που κυριάρχησε αρχικά και μονοπώλησε την πρωτοκαθεδρία στην αυτοματοποιημένη ανάλυση ήταν αυτή της αεροδιαχωριζόμενης ροής. Όταν μερικά χρόνια αργότερα εμφανίστηκαν η τεχνική αναλύσεων με εισαγωγή του δείγματος σε συνεχή ροή (FIA) και η διαδοχική έγχυση του δείγματος σε ροή (SIA) οριοθετήθηκε μια νέα εποχή στις αυτοματοποιημένες μεθόδους ανάλυσης. Οι παραπάνω τεχνικές στηρίζονται στη χρησιμοποίηση μη διαχωριζόμενων ρευμάτων αντιδραστηρίων και δείγματος και εισήγαγαν σημαντικές βελτιώσεις, όπως η αυξημένη συχνότητα δειγματοληψίας, η άμεση λήψη αποτελεσμάτων, η ευελιξία της ανάλυσης και το μειωμένο κόστος της ανάλυσης. Μα πάνω από όλα η ελεγχόμενη διασπορά της ζώνης του δείγματος, σε συνδυασμό με τον επαναλήψιμο χρόνο από την εισαγωγή του δείγματος μέχρι την είσοδό του στον ανιχνευτή, κατέστησαν δυνατή τη λήψη αξιόπιστων αποτελεσμάτων, ακόμα και όταν στο σύστημα της αντίδρασης δεν έχει επιτευχθεί κατάσταση φυσικής και χημικής ισορροπίας. Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία περιγράφεται η ανάπτυξη νέων αυτοματοποιημένων αναλυτικών μεθόδων για τον φασματοφωτομετρικό προσδιορισμό θειολικών ενώσεων, χρησιμοποιώντας την τεχνική SIA. Οι θειόλες είναι ευρέως διαδεδομένες στα ανθρώπινα κύτταρα καθώς είτε βρίσκονται ελεύθερες μέσα σε αυτά είτε συναντώνται στα μόρια των πρωτεϊνών. Η σουλφυδρυλική ομάδα συναντάται επιπλέον, πολύ συχνά και σε πολλά φαρμακευτικά σκευάσματα. Συνεπώς, η ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων προσδιορισμού των ενώσεων αυτών απασχολεί το ενδιαφέρον πολλών ερευνητικών πεδίων, όπως αυτό της βιοχημείας, του κλινικού ελέγχου και της φαρμακευτικής ανάλυσης. Η παραγωγοποίηση των θειολικών ενώσεων είναι συχνά αναγκαία, προκειμένου να σχηματιστούν σταθερότερες ενώσεις με μεγαλύτερη ικανότητα διαχωρισμού και με καλύτερη ανιχνευσιμότητα. Ειδικότερα, αναπτύχθηκαν, μελετήθηκαν και εφαρμόστηκαν με επιτυχία στη φαρμακευτική ανάλυση οι παρακάτω μέθοδοι:

8 Εισαγωγή 2 1. Μελέτη της αντίδρασης των θειολών με άλκυλο εστέρες του προπιολικού οξέος σε συνθήκες συνεχούς ροής σε σύστημα SIA. Μελετήθηκαν οι αντιδράσεις των θειολών με τους άλκυλο εστέρες του προπιολικού οξέος, και, πιο συγκεκριμένα, με τον προπιολικό μεθυλεστέρα (MP), τον προπιολικό αιθυλεστέρα (EP) και τον προπιολικό βουτυλεστέρα (BP). Αξιολογήθηκαν και μελετήθηκαν όλες οι χημικές παράμετροι που επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα των αντιδράσεων. Ειδικότερα αξιολογήθηκαν η θερμοκρασία (Θ = C), το ph (ph = 8-12) και η συγκέντρωση ποσότητας των αντιδραστηρίων (c = mol L -1 ). 2. Αυτόματος φασματοφωτομετρικός προσδιορισμός της καπτοπρίλης με χρήση των άλκυλο εστέρων του προπιολικού οξέος ως αντιδραστηρίων παραγωγοποίησης σε σύστημα SIA. Η προτεινόμενη μέθοδος βασίζεται στην αντίδραση της καπτοπρίλης (CAP) με τους άλκυλο εστέρες του προπιολικού οξέος προς σχηματισμό σταθερών παραγώγων. Η διεργασία της αντίδρασης πραγματοποιείται εν-ροή σε σύστημα SIA. Mελετήθηκαν και επιλέχτηκαν όλες οι βασικές γεωμετρικές παράμετροι που επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα της μεθόδου (παροχή όγκου q v, μήκος σπειράματος αντίδρασης l RC, όγκος δείγματος V S, όγκος αντιδραστηρίου V R και όγκος ρυθμιστικού διαλύματος V Β ). Η προτεινόμενη μέθοδος επικυρώθηκε ως προς τη γραμμικότητα και το εύρος προσδιορισμού, την επαναληψιμότητα, την ακρίβεια και την εκλεκτικότητα. Εφαρμόστηκε με επιτυχία στον έλεγχο διαλυτοποίησης εμπορικά διαθέσιμου φαρμακευτικού σκευάσματος. 3. Αυτόματος φασματοφωτομετρικός προσδιορισμός της κυστεΐνης με χρήση των άλκυλο εστέρων του προπιολικού οξέος ως αντιδραστηρίων παραγωγοποίησης σε σύστημα SIA. Η προτεινόμενη μέθοδος βασίζεται στην αντίδραση της κυστεΐνης (CYS) με τους άλκυλο εστέρες του προπιολικού οξέος προς σχηματισμό σταθερών παραγώγων. Η διεργασία της αντίδρασης πραγματοποιείται εν-ροή σε σύστημα SIA. Mελετήθηκαν και επιλέχτηκαν όλες οι βασικές γεωμετρικές παράμετροι που επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα της μεθόδου (παροχή όγκου q v, μήκος σπειράματος l RC, όγκος δείγματος V S, όγκος αντιδραστηρίου V R και όγκος ρυθμιστικού διαλύματος V Β ). Η προτεινόμενη μέθοδος επικυρώθηκε ως προς τη γραμμικότητα και το εύρος προσδιορισμού, την επαναληψιμότητα, την ακρίβεια και την εκλεκτικότητα.

9 Εισαγωγή 3 Εφαρμόστηκε με επιτυχία στον προσδιορισμό της κυστεΐνης σε συμπληρώματα διατροφής. 4. Αυτόματος φασματοφωτομετρικός προσδιορισμός της Ν-ακετυλοκυστεΐνης με χρήση των άλκυλο εστέρων του προπιολικού οξέος ως αντιδραστηρίων παραγωγοποίησης σε σύστημα SIA. Η προτεινόμενη μέθοδος βασίζεται στην αντίδραση της Ν-ακετυλοκυστεΐνης (NAC) με τους άλκυλο εστέρες του προπιολικού οξέος προς σχηματισμό σταθερών παραγώγων. Η διεργασία της αντίδρασης πραγματοποιείται εν-ροή σε σύστημα SIA. Mελετήθηκαν και επιλέχτηκαν όλες οι βασικές γεωμετρικές παράμετροι που επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα της μεθόδου (παροχή όγκου q v, μήκος σπειράματος l RC, όγκος δείγματος V S, όγκος αντιδραστηρίου V R και όγκος ρυθμιστικού διαλύματος V Β ). Η προτεινόμενη μέθοδος επικυρώθηκε ως προς τη γραμμικότητα και το εύρος προσδιορισμού, την επαναληψιμότητα, την ακρίβεια και την εκλεκτικότητα. Εφαρμόστηκε με επιτυχία στον έλεγχο ομοιομορφίας της περιεκτικότητας εμπορικά διαθέσιμων φαρμακευτικών σκευασμάτων. Όλες οι μέθοδοι που αναπτύχθηκαν είναι απλές, γρήγορες και με μικρή κατανάλωση δειγμάτων και αντιδραστηρίων. Δεν απαιτούν πολύπλοκη προκατεργασία των δειγμάτων, πριν την εισαγωγή τους στον αναλυτή, ενώ έχουν επαρκή αναλυτικά χαρακτηριστικά για τον αποτελεσματικό έλεγχο ποιότητας των φαρμακευτικών σκευασμάτων και συμπληρωμάτων διατροφής.

10 Αυτοματισμός στο αναλυτικό εργαστήριο 4 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΑΥΤΟΜΑΤΙΣΜΟΣ ΣΤΟ ΑΝΑΛΥΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ 1.1. Ορισμοί Η έννοια της «αυτοματοποίησης», όπως αυτή έχει οριστεί από την Επιτροπή Αναλυτικής Ορολογίας της Διεθνούς Ένωσης Καθαρής και Εφαρμοσμένης Χημείας (IUPAC) [1], παρερμηνεύεται συχνά από πολλούς αναλυτικούς χημικούς, πιθανότατα γιατί ο ορισμός καθαυτός συμπεριλαμβάνει στη διατύπωσή του ορισμούς άλλων εννοιών, οι διαφορές των οποίων δεν είναι ούτε αυτές πλήρως κατανοητές. Για να δοθεί, επομένως ο ορισμός της «αυτοματοποίησης» κρίνεται σκόπιμο να δοθούν αρχικά οι ορισμοί όλων εκείνων των εννοιών που μπορεί να συγχέονται μεταξύ τους [1,2]. Σύμφωνα, λοιπόν, με την Επιτροπή Αναλυτικής Ορολογίας της Διεθνούς Ένωσης Καθαρής και Εφαρμοσμένης Χημείας (IUPAC), «μηχανισμός» ονομάζεται ο κατάλληλος συνδυασμός των εξαρτημάτων, ένα τουλάχιστον από τα οποία έχει την δυνατότητα να παράγει έργο ή μπορεί να κινείται. Μια «μηχανή» είναι μια διάταξη που αποτελείται από έναν ή περισσότερους μηχανισμούς. Οι μηχανισμοί αυτοί είναι σε θέση να εκτελούν μια ή περισσότερες λειτουργίες. Σύμφωνα πάντα με την IUPAC, με τον όρο «μηχανοποίηση» ορίζεται η χρησιμοποίηση μηχανών για την αντικατάσταση, βελτίωση, επέκταση και συμπλήρωση της ανθρώπινης προσπάθειας. Τα όργανα χωρίζονται σε δύο κατηγορίες. Τα «επιστημονικά όργανα», που είναι συσκευές που χρησιμοποιούνται για την παρατήρηση, μέτρηση ή έλεγχο μιας ιδιότητας που αντικαθιστά, επεκτείνει ή συμπληρώνει την ανθρώπινη ικανότητα, και τα «αναλυτικά όργανα», συσκευές που χρησιμοποιούνται για την εκτέλεση μιας αναλυτικής μεθόδου. Τα όργανα είναι δυνατό να αποτελούνται από έναν ή περισσότερους μηχανισμούς. «Αυτοματοποίηση», συνεπώς, καλείται η συνδυασμένη χρήση μηχανών και οργάνων με σκοπό την αντικατάσταση, τη βελτίωση, την επέκταση και τέλος την συμπλήρωση της ανθρώπινης προσπάθειας στην πραγματοποίηση μιας δεδομένης διεργασίας, κατά την οποία ένα τουλάχιστον βασικό στάδιο εκτελείται όχι από ανθρώπινη παρέμβαση αλλά από ένα σύστημα «ανάδρασης» (ανατροφοδότησης, feedback). Το σύστημα ανάδρασης είναι μια μηχανική ή ηλεκτρονική διάταξη που συνδυάζει την λήψη πληροφοριών από διάφορους αισθητήρες και την αποστολή

11 Αυτοματισμός στο αναλυτικό εργαστήριο 5 εντολών τροποποιώντας τις επιμέρους λειτουργίες των οργάνων με σκοπό την παραγωγή συγκεκριμένου έργου Ανάγκη για αυτοματοποίηση - Πλεονεκτήματα Οι ολοένα αυξανόμενες απαιτήσεις για γρήγορες, αξιόπιστες και οικονομικές αναλύσεις πολλών και ταυτόχρονα διαφορετικής φύσεως δειγμάτων (βιολογικών, βιομηχανικών, γεωργικών, κλινικών, φαρμακευτικών και άλλα) κατέστησαν τις τελευταίες δεκαετίες επιτακτική την ανάγκη ανάπτυξης αυτοματοποιημένων αναλυτικών τεχνικών. Για τον λόγο αυτό δεν είναι λίγες οι ερευνητικές ομάδες, που έχουν στρέψει το ερευνητικό τους ενδιαφέρον προς την κατεύθυνση αυτή [3]. Οι στόχοι που έπρεπε να επιτευχθούν ήταν πολλοί, με αρχικό πάντα γνώμονα την αντικατάσταση της χειροκίνητης διαδικασίας. Ο σημαντικότερος ίσως λόγος που οδήγησε στην ανάπτυξη των αυτοματοποιημένων τεχνικών ήταν η απελευθέρωση του ανθρώπινου δυναμικού από αναλύσεις ρουτίνας. Αυτό θα επέφερε σημαντικά οφέλη. Θα οδηγούσε όχι μόνο στον μεγαλύτερο δυνατό αριθμό αναλύσεων, αλλά και στην μεγαλύτερη ασφάλεια του προσωπικού, μιας και η έκθεσή του σε επικινδύνους και τοξικούς διαλύτες θα περιοριζόταν, με τον τρόπο αυτό, σημαντικά. Πολύπλοκες μεθοδολογίες μπορούν πλέον να πραγματοποιούνται σε σύντομο χρονικό διάστημα και με λιγότερο κοπιαστικές και επίπονες προκατεργασίες του δείγματος αλλά και πολύ πιο οικονομικά. Ο μεγάλος αριθμός αναλύσεων οδηγεί στην μείωση του κόστους της κάθε επιμέρους ανάλυσης και το πλεονέκτημα αυτό γίνεται ακόμα σημαντικότερο όταν τα προς ανάλυση δείγματα είναι πολύτιμα ή περιορισμένης ποσότητας. Η ανάγκη για άμεση λήψη αναλυτικών αποτελεσμάτων και η βελτίωση της αναλυτικής διαδικασίας οδήγησαν και αυτές, με τη σειρά τους στην αυτοματοποίηση των αναλυτικών διεργασιών. Ο περιορισμός της ανθρώπινης δράσης στις αναλύσεις οδηγεί στην εξάλειψη τυχαίων ή συστηματικών σφαλμάτων, που προέρχονται από τον ανθρώπινο παράγοντα, βελτιώνοντας, έτσι, την ακρίβεια και την επαναληψιμότητα των μετρήσεων.

12 Αυτοματισμός στο αναλυτικό εργαστήριο 6 Βιβλιογραφία [1] IUPAC, Compendium of Analytical Nomenclature, The Orange Book, 1 st Edition, Pergamon Press, New York, [2] Σημειώσεις μαθήματος του Μ.Π.Σ. του τμήματος Χημείας του Α.Π.Θ., «Προχωρημένη Ενόργανη Χημική Ανάλυση» (Διδάσκων: Επικ. Καθ. Α. Ανθεμίδης). [3] Δ.Γ. Θεμελή, Αυτόματες μέθοδοι χημικής ανάλυσης, Θεσσαλονίκη, 1998.

13 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή - SIA 7 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΤΕΧΝΙΚΗ ΤΗΣ ΔΙΑΔΟΧΙΚΗΣ ΕΓΧΥΣΗΣ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΣΕ ΡΟΗ SIA 2.1. Εισαγωγή Ιστορική εξέλιξη Η τεχνική των Aυτόματων Aναλύσεων με Έγχυση του Δείγματος σε Συνεχή Ροή (Flow injection analysis FIA) ανακαλύφθηκε στα μέσα του 1974, όταν οι Ruzicka και Hansen δούλευαν πάνω στην ανάπτυξη ενός αισθητήρα αερίων για τον προσδιορισμό ατμών αμμωνίας. Οι ερευνητές είχαν κατασκευάσει ένα κατάλληλο ηλεκτρόδιο, η αρχή λειτουργίας του οποίου βασιζόταν στη μέτρηση της μερικής πιέσεως του αερίου ύστερα από ανάμειξη του δείγματος με κινούμενο ρεύμα NaOH με την βοήθεια μιας περισταλτικής αντλίας. Η ανάμειξη των ρευμάτων γινόταν αμέσως πριν τον ανιχνευτή και οι παραγόμενοι ατμοί NH 3 ανιχνεύονταν στη συνέχεια από το ηλεκτρόδιο. Το πρόβλημα, όμως, ήταν η πολύ αργή απόκριση του αισθητήρα για δείγματα διαφορετικών συγκεντρώσεων. Σε μία στιγμή εκνευρισμού οι ερευνητές, με τη χρήση μιας απλής σύριγγας, εισήγαγαν απευθείας στο ρεύμα NaOH μια ποσότητα δείγματος ορισμένης συγκέντρωσης και προς μεγάλη τους έκπληξη παρατήρησαν την καταγραφή μιας κορυφής, η οποία ήταν επαναλήψιμη και ανάλογη της συγκεντρώσεως του προς ανάλυση συστατικού [1]. Χωρίς ακόμα να έχουν συνειδητοποιήσει την σημαντικότητα της ανακάλυψής τους, δημοσιεύουν το 1975 την πρώτη τους εργασία [2] και μερικά χρόνια αργότερα δίνουν τον ορισμό της FIA στο πρώτο τους βιβλίο [3]. Σύμφωνα με τους ερευνητές, «Η FIA είναι μια τεχνική που βασίζεται στην έγχυση ενός υγρού δείγματος σε συνεχές, μη διακοπτόμενο, κινούμενο ρεύμα κατάλληλου υγρού. Το εγχυόμενο δείγμα σχηματίζει μια ζώνη, που οδηγείται στον ανιχνευτή, ο οποίος μετρά τη συνεχή μεταβολή μιας φυσικοχημικής παραμέτρου του δείγματος, καθώς αυτό διέρχεται από την κυψελίδα συνεχούς ροής». Με τον ορισμό αυτόν ορίστηκε από την πρώτη στιγμή η πρώτη βασική αρχή της FIA, που δεν είναι άλλη από την έγχυση του δείγματος σε μη διακοπτόμενο ρεύμα ροής. Παρόλα αυτά, στην δεύτερη έκδοση, ο ορισμός της νέας τεχνικής διατυπώνεται ξανά από τους ερευνητές όπως παρακάτω: «FIA ονομάζεται η συλλογή πληροφοριών μέσω της βαθμίδωσης της συγκέντρωσης που δημιουργείται, όταν μια αυστηρά καθορισμένη ζώνη δείγματος εγχυθεί και διασπαρθεί σε ένα μη διακοπτόμενο ρεύμα μεταφορέα» [1].

14 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή - SIA 8 Η δεύτερη αυτή διατύπωση δεν αναιρεί την προηγούμενη, αλλά δρα συμπληρωματικά της πρώτης, εισάγοντας και τη δεύτερη αρχή της FIA, που είναι η αυστηρά καθορισμένη και ελεγχόμενη διασπορά της ζώνης του δείγματος. Η αρχή αυτή δίνει τη δυνατότητα στον χρήστη για τη λήψη αποτελεσμάτων πριν ακόμα ολοκληρωθεί η αντίδραση και φτάσει σε κατάσταση τόσο φυσικής όσο και χημικής ισορροπίας. Οι βασικές αρχές της FIA είναι συνεπώς [4]: 1. Ο αυστηρά καθορισμένος όγκος δείγματος, ο οποίος εγχύεται σε ρεύμα κατάλληλου μεταφορέα ή αντιδραστηρίου 2. Η συνεχής και μη διακοπτόμενη ροή των διαλυμάτων 3. Η ελεγχόμενη και επαναλήψιμη διασπορά της ζώνης του δείγματος. 4. Ο επαναλήψιμος χρόνος παραμονής του δείγματος στο σύστημα. Μια δεκαετία περίπου μετά την εισαγωγή της FIA η αυξανόμενη απαίτηση, κυρίως από τους χώρους της βιομηχανίας και της κλινικής χημείας, για μια αυτοματοποιημένη τεχνική, με πιο απλά και ανθεκτικά μηχανικά μέρη, τα οποία να μην έχουν αυξημένες απαιτήσεις για συντήρηση, αλλά ταυτόχρονα να δίνουν αξιόπιστες και γρήγορες μετρήσεις, οδήγησε στην γέννηση της «Τεχνικής της Διαδοχικής Έγχυσης του δείγματος σε Ροή» (Sequential Injection analysis, SIA) [5]. Η τεχνική αυτή αποτελεί τη δεύτερη γενιά της FIA και ήρθε να επιλύσει τις δυσχέρειες και τα προβλήματα αυτής. Τα προβλήματα αυτά ήταν : 1. Η κατανάλωση μεγάλων όγκων αντιδραστηρίων, λόγω της συνεχούς λειτουργίας του οργάνου. 2. Η συχνά απαιτούμενη βαθμονόμηση του συστήματος. 3. Το υψηλό, πολλές φορές, κόστος συντήρησης των μηχανικών τμημάτων του συστήματος, όπως οι περισταλτικές αντλίες, αλλά και των αναλώσιμων τμημάτων, όπως τα κανάλια ροής που με το πέρασμα του χρόνου φθείρονται. 4. Η ανάγκη χρησιμοποίησης πολλών καναλιών και πολλές φορές περίπλοκων διατάξεων για την ανάμιξη των διαλυμάτων και την αντίδρασή τους Βασικές αρχές λειτουργίας Από την αρχή έγινε κατανοητό ότι η νέα τεχνική ανήκει στην οικογένεια της FIA, καθώς διέπεται από τις ίδιες αρχές (έγχυση δείγματος και αντιδραστηρίου, ελεγχόμενη διασπορά και επαναλήψιμος χρόνος από τη στιγμή της έγχυσης του δείγματος μέχρι την έξοδό του).

15 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή - SIA 9 Η επιτυχία της νέας τεχνικής βασίζεται στον ακριβή έλεγχο τον δύο κινητικών διεργασιών που συμβαίνουν ταυτόχρονα, καθώς μετακινείται το δείγμα μέσα στο κανάλι. Οι διεργασίες αυτές είναι από τη μία η φυσική διασπορά των ζωνών του δείγματος και τον αντιδραστηρίων και από την άλλη η χημική διεργασία σχηματισμού των προϊόντων, τα οποία οδηγούνται προς τον ανιχνευτή. Το επιπλέον χαρακτηριστικό της SIA, που την διακρίνει από την FIA είναι η δυνατότητα αντιστροφής της ροής του δείγματος και του αντιδραστηρίου με τη βοήθεια της αντλίας και της βαλβίδας επιλογής πολλαπλών θέσεων, έτσι ώστε να μπορούν να πραγματοποιηθούν διάφορες χημικές αντιδράσεις, χωρίς να απαιτείται ο επανασχεδιασμός του πολλαπλού τμήματος ανάμειξης και αντιδράσεων, που απαιτείται στη FIA. Η καρδιά επομένως του αναλυτή είναι η βαλβίδα πολλαπλής επιλογής. Οι περιφερειακές θύρες της βαλβίδας είναι συνδεδεμένες με τους περιέκτες των δειγμάτων, των αντιδραστηρίων και το σύστημα ανίχνευσης, ενώ η κεντρική θύρα συνδέεται μέσω ενός σπειράματος παραμονής (holding coil - HC) με κατάλληλη αντλία, με τη βοήθεια της οποίας μπορεί να επιλεχθεί η φορά της ροής των διαλυμάτων. Όταν η αντλία λειτουργεί προς τη μια κατεύθυνση αναρροφώνται, μέσω της βαλβίδας, συγκεκριμένοι όγκοι δείγματος και αντιδραστηρίων από τον εκάστοτε περιέκτη και οδηγούνται στοιβάζονται στο σπείραμα παραμονής. Στη συνέχεια θέτεται η αντλία σε λειτουργία, προς την αντίθετη κατεύθυνση αυτή τη φορά, και οι στοιβαγμένες ζώνες προωθούνται μέσω της ανάλογης θύρας της βαλβίδας προς το σύστημα ανίχνευσης. Η χημική αντίδραση πραγματοποιείται με διέλευση των ζωνών δια μέσω κατάλληλου σπειράματος (reaction coil-rc), στο οποίο λαμβάνει χώρα επικάλυψη των ζωνών και σχηματισμός του επιθυμητού προϊόντος. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η μείωση κατανάλωσης όγκου δείγματος και αντιδραστηρίων και συνεπώς η μείωση του όγκου των παραγόμενων αποβλήτων. Ένα τυπικό διάγραμμα ροής SIA, καθώς και η αρχή λειτουργίας της τεχνικής δίνονται σχηματικά στα σχήματα 2.1 και 2.2 αντίστοιχα. Σχήμα 2.1. Τυπικό διάγραμμα ροής αναλυτή SIA.

16 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή - SIA 10 Σχήμα 2.2. Αρχή λειτουργίας της SIA [6]. (A) Έγχυση καθορισμένου όγκου δείγματος. (B) Έγχυση καθορισμένου όγκου αντιδραστηρίου - σχηματίζονται ευδιάκριτες ζώνες. (Γ) Έγχυση του διαλύματος του μεταφορέα ή δεύτερου διαλύματος αντιδραστηρίου (Δ) Αναστροφή της ροής - προώθηση προς τον ανιχνευτή. (E) Ανίχνευση καταγραφή κορυφής. Συνοψίζοντας μπορεί να ειπωθεί ότι η SIA είναι μια τεχνική συνεχούς ροής που πραγματοποιείται με απόλυτα επαναλήψιμο χειρισμό των ζωνών του δείγματος και των αντιδραστηρίων σε συνθήκες μη θερμοδυναμικής ισορροπίας Οργανολογία ενός αναλυτή SIA Τα βασικά τμήματα ενός αναλυτή SIA είναι: 1. Αντλία. Με τη βοήθεια της αντλίας πραγματοποιείται η αναρρόφηση των ζωνών των δειγμάτων και των αντιδραστηρίων και στη συνέχεια, με αλλαγή της φοράς λειτουργίας της, πραγματοποιείται η προώθησή τους προς τον ανιχνευτή. Η λειτουργία της καθορίζεται από το κατάλληλο λογισμικό. Η λειτουργία της πρέπει να είναι πλήρως επαναλήψιμη και ακριβής. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων οι αντλίες που χρησιμοποιούνται σε συστήματα SIA είναι είτε περισταλτικές είτε τύπου σύριγγας. Μειονέκτημα των περισταλτικών αντλιών είναι ότι δεν είναι εφικτό να δώσουν ροές τελείως απαλλαγμένες από παλμούς, ενώ οι σωλήνες που χρησιμοποιούνται φθείρονται σχετικά εύκολα και δεν επιτρέπουν τη χρήση όλου του φάσματος των διαλυτών. Αντίθετα, οι αντλίες τύπου σύριγγας έχουν το

17 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή - SIA 11 μειονέκτημα της καθορισμένης χωρητικότητας, με αποτέλεσμα να απαιτείται περιοδικό ξαναγέμισμά τους με το διάλυμα του μεταφορέα. 2. Βαλβίδα πολλαπλής επιλογής. Έχει συνήθως 6-10 θέσεις. Βασικό χαρακτηριστικό που πρέπει να διακρίνει μια βαλβίδα είναι οι μικροί νεκροί όγκοι, ώστε να αποφεύγεται επιπλέον διασπορά των ζωνών, όταν δεν είναι επιθυμητή. Η λειτουργία της βαλβίδας καθορίζεται και αυτή ηλεκτρονικά από το εγκατεστημένο λογισμικό στον ηλεκτρονικό υπολογιστή. 3. Σπείραμα παραμονής (holding coil). Το σπείραμα αυτό τοποθετείται μεταξύ της αντλίας και της βαλβίδας επιλογής. Σε αυτό οδηγούνται και στοιβάζονται διαδοχικά και με τη σειρά που επιθυμεί ο χρήστης οι ζώνες των δειγμάτων και των αντιδραστηρίων, πριν την προώθηση τους στον ανιχνευτή. Η χωρητικότητα του σπειράματος θα πρέπει να είναι ικανή, ώστε να αποτρέπεται η είσοδος των ζωνών δείγματος και αντιδραστηρίου στο διάλυμα του μεταφορέα και να αποφεύγεται η επιμόλυνσή του. 4. Σπείραμα αντίδρασης (reaction coil). Το σπείραμα αυτό τοποθετείται μεταξύ της βαλβίδας επιλογής και του ανιχνευτή. Εκεί λαμβάνει χώρα η αντίδραση μεταξύ του δείγματος και του αντιδραστηρίου, οπότε σχηματίζεται το επιθυμητό προϊόν, το οποίο οδηγείται στη συνέχεια στον ανιχνευτή. 5. Σύστημα ανίχνευσης. Πρακτικά χρησιμοποιούνται όλα τα διαθέσιμα συστήματα ανίχνευσης, τα οποία μπορούν να λειτουργήσουν σε συνθήκες συνεχούς ροής. 6. Λογισμικό ελέγχου. Η απαραίτητη χρήση κατάλληλου λογισμικού ελέγχου αποτελεί βασική διαφορά μεταξύ των τεχνικών FIA και SIA. Με το λογισμικό αυτό ελέγχονται πλήρως όλες οι απαραίτητες λειτουργίες του αναλυτή (εισαγωγή δειγμάτων και αντιδραστηρίων, σειρά ανάμιξης, παροχές όγκου κ.α.) Τυπικά στάδια κύκλου ανάλυσης με τη SIA Ένας κύκλος ανάλυσης με την τεχνική της SIA περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια: 1. Προώθηση του διαλύματος του μεταφορέα προς τον ανιχνευτή (πλήρωση του σπειράματος συγκράτησης, του σπειράματος αντίδρασης και της κυψελίδας του ανιχνευτή) μέχρι λήψη σταθερής γραμμής βάσης. 2. Αναρρόφηση καθορισμένου όγκου δείγματος στο σπείραμα παραμονής.

18 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή - SIA Αναρρόφηση καθορισμένων όγκων διαλυμάτων αντιδραστηρίων στο σπείραμα παραμονής. 4. Προώθηση του μίγματος της αντίδρασης προς τον ανιχνευτή (ενδέχεται να εφαρμοστεί αναχαίτιση της ροής, πριν ή εντός του ανιχνευτή κατά περίπτωση). 5. Καταγραφή των σημάτων. 6. Προώθηση του προϊόντος της αντίδρασης στα απόβλητα Αναχαίτιση ροής σε συστήματα SIA (stopped flow -SIA) Με την τεχνική της αναχαίτισης της ροής παρέχεται στο χημικό σύστημα περισσότερος χρόνος προκειμένου να εξελιχθεί η αντίδραση, χωρίς την επίδραση της αξονικής διασποράς στις ζώνες του δείγματος και των αντιδραστηρίων. Στόχοι της εφαρμογής της τεχνικής της αναχαίτισης της ροής είναι: 1. Η αύξηση της ευαισθησίας ενός προσδιορισμού σε περιπτώσεις αργών αντιδράσεων. 2. Η αύξηση της εκλεκτικότητας άρση παρεμποδίσεων υποστρώματος. 3. Η κινητική θεωρητική μελέτη των αντιδράσεων. 4. Η ανάπτυξη μεθόδων ταυτόχρονων προσδιορισμών με κινητική διαφοροποίηση. Στα σχήματα 2.3 και 2.4 δίνονται αντίστοιχα η αρχή της τεχνικής και τα τυπικά λαμβανόμενα καταγραφήματα. Σχήμα 2.3 : Προφίλ ζώνης του δείγματος με εφαρμογή αναχαίτισης της ροής [7].

19 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή - SIA 13 Σχήμα 2.4: Τυπικό γράφημα εφαρμογής αναχαίτισης της ροής σε ένα σύστημα SIA / FIA [8]. Στην περίπτωση α) ευνοείται ο σχηματισμός του προϊόντος της αντίδρασης με το χρόνο αναχαίτισης. Στην περίπτωση β) η αντίδραση είναι ανεξάρτητη του χρόνου αναχαίτισης και τέλος στην περίπτωση γ) το προϊόν της αντίδρασης αρχίζει να αποικοδομείται κατά το χρονικό διάστημα αναχαίτισης της ροής. Η αναχαίτιση της ροής μπορεί να πραγματοποιηθεί είτε πριν είτε μέσα στην κυψελίδα του ανιχνευτή. Αναχαίτιση της ροής μέσα στον ανιχνευτή δίνει τη δυνατότητα στον αναλυτή να παρακολουθήσει την πορεία εξέλιξης της αντίδρασης σε πραγματικό χρόνο παρέχοντας τη δυνατότητα εξαγωγής συμπερασμάτων που αφορούν στο μηχανισμό της αντίδρασης. Με αναχαίτιση της ροής πριν τον ανιχνευτή απλά παρατείνεται ο χρόνος αντίδρασης. Η προσέγγιση αυτή επιλέγεται σε περιπτώσεις επίδρασης της ακτινοβολίας των οπτικών ανιχνευτών στην αντίδραση.

20 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή - SIA Πλεονεκτήματα Μειονεκτήματα SIA Τα βασικά πλεονεκτήματα της SIA σε σχέση με την FIA είναι: 1. Είναι οργανολογικά απλούστερη από τη FIA, αφού ανεξαρτήτως από τον αριθμό των διαλυμάτων, χρησιμοποιείται μια και μόνο βαλβίδα πολλαπλής επιλογής, μια μονοκαναλική αντλία και μόνο ένα κανάλι ροής. Όλες δηλαδή οι απαραίτητες διεργασίες για τον προσδιορισμό γίνονται σε μονοκαναλικό σύστημα. 2. Η κατανάλωση των αντιδραστηρίων και των δειγμάτων, καθώς και οι όγκοι των παραγόμενων αποβλήτων είναι σημαντικά μικρότεροι, αφού τα αντιδραστήρια εισάγονται μέσω της βαλβίδας σε αυστηρά καθορισμένους όγκους και δεν ρέουν συνεχώς. 3. Οι βασικές γεωμετρικές παράμετροι ενός συστήματος SIA, δηλαδή οι όγκοι και οι ταχύτητες ροής, μπορούν εύκολα να μεταβάλλονται με τη βοήθεια κατάλληλου λογισμικού. Τα κυριότερα μειονεκτήματα της τεχνικής SIA, ως προς την πρόδρομή της FIA, αφορούν το κόστος της οργανολογίας και της απόκτησης του απαραίτητου λογισμικού. Επίσης, είναι σχετικά δύσκολη η εφαρμογή πολύπλοκων χημικών συστημάτων που απαιτούν πολλαπλά στάδια αντιδράσεων, καθώς και τεχνικές προκατεργασίας, όπως η εκχύλιση υγρού.

21 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή - SIA 15 Βιβλιογραφία [1] Ε.Η. Hansen, Comprehensive Anal. Chem. 54 (2008) 3. [2] J.Ruzicka, E.H. Hansen, Anal. Chim. Acta 78 (1975) 145. [3] J.Ruzicka, E.H. Hansen, Flow injection analysis, 1 st edition, Wiley, New York, [4] Δ.Γ. Θεμελή, Αυτόματες μέθοδοι χημικής ανάλυσης, Θεσσαλονίκη [5] J.Ruzicka, G.D. Marschall, Anal. Chim. Acta 237 (1990) 329. [6] J.Ruzicka, Comprehensive Anal. Chem. 54 (2008) 23. [7] Φ.Σ. Κίκα, «Αναλυτικές εφαρμογές του χρωμοτροπικού οξέως σε αυτοματοποιημένα συστήματα συνεχούς ροής με τις τεχνικές FIA και SIA». Διδακτορική Διατριβή, Θεσσαλονίκη, [8] Π.Δ Τζαναβάρα, «Ανάπτυξη μεθόδων προσδιορισμού ορισμένων ανιόντων με την τεχνική της έγχυσης του δείγματος σε συνεχή ροή», Διδακτορική Διατριβή, Θεσσαλονίκη, 2003.

22 Παραγωγοποίηση: Ορισμός Στόχοι Πλεονεκτήματα 16 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΣΗ: ΟΡΙΣΜΟΣ ΣΤΟΧΟΙ - ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Με την παρούσα εργασία επιδιώκεται αφενός μεν η μελέτη των αντιδράσεων παραγωγοποίησης των θειολών με τους άλκυλο εστέρες του προπιολκού οξέος, αφετέρου ο προσδιορισμός των θειολών αυτών σε φαρμακευτικά σκευάσματα. Ως παραγωγοποίηση (derivatization) καλείται κάθε πορεία τροποποίησης μιας ένωσης με χημικές ή φυσικές μεθόδους υπό κατάλληλες συνθήκες [1], ώστε να δημιουργηθεί μια νέα ένωση, συνήθως με δομή παρόμοια με αυτήν της αρχικής (παράγωγο), κατάλληλη για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό της με συνήθεις και καθιερωμένες μεθόδους χημικής ανάλυσης. Το γενικό σχήμα μιας αντίδρασης παραγωγοποίησης είναι: Α (αρχική ένωση) + R (αντιδραστήριο) P (παράγωγο) Πιο συγκεκριμένα, κατά την παραγωγοποίηση, που δεν είναι τίποτα άλλο παρά ένα επιπλέον στάδιο προκατεργασίας του δείγματος, μια συγκεκριμένη δραστική ομάδα της ένωσης συμμετέχει στην αντίδραση παραγωγοποίησης με αποτέλεσμα την μετατροπή της ένωσης σε ένα παράγωγο, το οποίο διαφέρει από την αρχική ένωση ως προς διάφορες φυσικές ή χημικές ιδιότητες, (π.χ. τη δραστικότητα, τη διαλυτότητα, την πολικότητα, το σημείο ζέσεως, το σημείο τήξεως, την ικανότητα φθορισμού, φωσφορισμού κ.α.). Οι νέες χαρακτηριστικές ιδιότητες που αποκτά το παράγωγο, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό του. Στην παραγωγοποίηση καταφεύγει συχνά ο αναλυτικός χημικός όταν η υπό μελέτη ένωση είναι μη επαρκώς σταθερή, όταν δεν είναι πτητική ή επαρκώς πτητική και τέλος όταν δεν είναι επαρκώς ανιχνεύσιμη με το σύστημα ανίχνευσης που είναι διαθέσιμο. Με την παραγωγοποίηση αίρονται οι παραπάνω δυσκολίες στην ανάλυση, καθώς, αυξάνεται η πτητικότητα των μη πτητικών ενώσεων, ελαττώνεται η πτητικότητα των πολύ πτητικών ενώσεων, εξουδετερώνονται ή παρακάμπτονται οι πολικές ομάδες των μορίων, αυξάνεται η ανιχνευσιμότητα, και η σταθερότητα των ενώσεων, καθώς και η ευαισθησία της ανάλυσης. Στη βιβλιογραφία υπάρχει αναφορά σε μεγάλο αριθμό εργασιών που έχουν χρησιμοποιήσει την παραγωγοποίηση ως στάδιο προκατεργασίας των δειγμάτων, πριν την ανάλυσή τους. Στις περισσότερες εργασίες τα αντιδραστήρια παραγωγοποίησης είναι εμπορικά διαθέσιμα, ενώ σε λίγες περιπτώσεις γίνεται

23 Παραγωγοποίηση: Ορισμός Στόχοι Πλεονεκτήματα 17 αναφορά στην οργανική σύνθεση των αντιδραστηρίων αυτών πριν τη χρήση τους [2]. Η παραγωγοποίηση, παρά τα πολύ σημαντικά πλεονεκτήματα που προσφέρει στη χημική ανάλυση, δεν παύει να αποτελεί ένα επιπλέον στάδιο προκατεργασίας του δείγματος. Δεν είναι λίγοι οι ερευνητές που έχουν δηλώσει ότι η παραγωγοποίηση είναι στις περισσότερες των περιπτώσεων αναγκαίο κακό [2], καθώς βασικός στόχος μιας σύγχρονης αναλυτικής μεθόδου είναι να πραγματοποιείται ο προσδιορισμός με όσο το δυνατό λιγότερα στάδια προκατεργασίας του δείγματος. Είναι φανερό ότι η εισαγωγή ενός επιπλέον σταδίου προκατεργασίας, αυξάνει την αβεβαιότητα των αποτελεσμάτων μιας ανάλυσης. Ακόμα μεγαλύτερη είναι η αβεβαιότητα αυτή, όταν τα στάδια της παραγωγοποίησης και ο χειρισμός όλων των διαλυμάτων της γίνονται από κάποιον άνθρωπο. Στην περίπτωση αυτή θα πρέπει να συνυπολογίσει κανείς όλα εκείνα τυχαία και στατιστικά σφάλματα, που εισάγονται στην ανάλυση λόγω του ανθρώπινου παράγοντα. Επιπλέον, κατά την ανάπτυξη και μελέτη μιας αντίδρασης παραγωγοποίησης, υπάρχουν πάρα πολλές παράμεροι, που πρέπει να μελετηθούν και να βελτιστοποιηθούν ώστε να πετύχουμε τελικά τη μεγαλύτερη δυνατή ευαισθησία και εκλεκτικότητα προσδιορισμού. Οι παράμετροι που μελετώνται συνήθως είναι η θερμοκρασία, ο χρόνος αντίδρασης, το ph, ο χρησιμοποιούμενος διαλύτης, η συγκέντρωση του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης και της ένωσης που επιθυμείτε η παραγωγοποίησή της και τέλος η συγκέντρωση όλων εκείνων των ενώσεων, η παρουσία των οποίων μπορεί πολλές φορές να είναι απαραίτητη για την πραγματοποίηση της αντίδρασης ή την πορεία εξέλιξής της. Στο τελικό στάδιο της ανάλυσης επιλέγονται και χρησιμοποιούνται εκείνες οι τιμές των παραμέτρων, οι οποίες προσδίδουν στη μέθοδο τη μεγαλύτερη εκλεκτικότητα, ακρίβεια και ευαισθησία [2]. Συνήθως οι αντιδράσεις παραγωγοποίησης είναι οι αντιδράσεις ακυλίωσης, συλιλίωσης, αλκυκίωσης και εστεροποίησης [3]. Σε τι είδους αντίδραση παραγωγοποίησης θα προχωρήσει ένας αναλυτικός χημικός, εξαρτάται από την ελεύθερη ομάδα της ένωσης που θέλει να παραγωγοποιήσει, από την αναλυτική τεχνική που χρησιμοποιεί για τους προσδιορισμούς και τέλος από το είδος των δειγμάτων που πρόκειται να αναλυθούν. Οι αντιδράσεις παραγωγοποίησης που πραγματοποιούνται ευκολότερα είναι εκείνες στις οποίες υπάρχει ένα τουλάχιστον ευκίνητο άτομο υδρογόνου στο μόριο της ένωσης. Σε αυτές τις κατηγορίες ενώσεων ανήκουν οι ενώσεις που περιέχουν ελεύθερες αμινομάδες, ιμινομάδες, καβοξυλομάδες, σουλφυδρυλομάδες και υδροξυλομάδες. Τα περισσότερο υποσχόμενα αντιδραστήρια παραγωγοποίησης που χρησιμοποιούνται συνήθως για την παραγωγοποίηση θειολικών ενώσεων, πρέπει

24 Παραγωγοποίηση: Ορισμός Στόχοι Πλεονεκτήματα 18 να πληρούν τις εξής δυο προϋποθέσεις, ως προς τα δομικά χαρακτηριστικά τους. Πρέπει αφενός να περιέχουν στο μόριό τους μια λειτουργική ομάδα, η οποία να μπορεί να αντιδρά με τις θειολικές ομάδες (συνήθως αμινομάδα ή αλογόνο) και αφετέρου να έχει μια επιπλέον ομάδα, η οποία θα προσδίδει στο μόριο ικανοποιητική δυνατότητα ανίχνευσης (κάποιο χρωμοφόρο ή φθοροφόρο) [4]. Καθώς η αντίδραση παραγωγοποίησης, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, είναι συνήθως μια σχετικά επίπονη διαδικασία (αφενός εξαιτίας του γεγονότος ότι μπορεί να αποτελείται από περισσότερα του ενός στάδια και αφετέρου γιατί ο ανθρώπινος παράγοντας επιβαρύνει την ανάλυση με σφάλματα), ήταν αναγκαία η αυτοματοποίησή της. Οι περισσότερες αυτοματοποιημένες αντιδράσεις παραγωγοποίησης χρησιμοποιούνται στη χρωματογραφία. Εκεί το προς ανάλυση δείγμα παραγωγοποιείται είτε πριν τη χρωματογραφική στήλη (pre-column derivatization), για αύξηση της διαχωριστικής ικανότητας και ελάττωση του χρόνου διαχωρισμού, είτε μετά τη στήλη (post column derivatization) για αύξηση της ευαισθησίας και εκλεκτικότητας της ανάλυσης. Ιδιαίτερα σημαντική, όμως, ήταν η είσοδος της παραγωγοποίησης στις αυτοματοποιημένες αναλυτικές τεχνικές FIA και SIA [5]. Αφενός η ικανότητα ανίχνευσης σχεδόν κάθε είδους μορίου μετά από παραγωγοποίηση του με κατάλληλο αντιδραστήριο παραγωγοποίησης και αφετέρου ο αυτοματισμός των τεχνικών αυτών, που εξαλείφει τις παρεμποδίσεις που προκύπτουν από τους ανθρώπινους χειρισμούς και αυξάνει στο μέγιστο δυνατό τον ρυθμό δειγματοληψίας και αναλύσεων, καθιστά τη σύζευξη αυτών ένα ιδιαίτερα χρήσιμο εργαλείο σε κάθε αναλυτικό εργαστήριο τόσο για μεμονωμένες αναλύσεις όσο και για αναλύσεις ρουτίνας.

25 Παραγωγοποίηση: Ορισμός Στόχοι Πλεονεκτήματα 19 Βιβλιογραφία [1] R.M. Smith, J. Chromatogr. A 1000 (2003) 3 [2] H. Lingeman, W. J. M. Underberg, Detection-Oriented Derivatization Techniques in Liquid Cromatography, New York, 1990 [3] Σημειώσεις μαθήματος του Μ.Π.Σ. του τμήματος Χημείας του Α.Π.Θ., «Ειδικά θέματα Οργανικής Χημείας» (Διδάσκων: Επικ. Καθ. Κ. Χατζηαντωνίου-Μαρούλη). [4] K. Shimad, K. Mitamura, Journal of Chromatography B 659 (1994) 227 [5] Κ. Ζαχαρής, Αυτοματισμός στην προκατεργασία και ανάλυση δειγμάτων με χρήση της τεχνικής της διαδοχικής έγχυσης δείγματος σε συνδυασμό με διαχωριστικές τεχνικές στην υγρή φάση, Διδακτορική Διατριβή, Α.Π.Θ. 2006

26 Εφαρμογές των τεχνικών FIA και SIA στη φαρμακευτική ανάλυση 20 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ FIA ΚΑΙ SIA ΣΤΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Οι ασθενείς οφείλουν να έχουν τον υψηλότερο δυνατό βαθμό εμπιστοσύνης όσον αφορά στην ποιότητα και την αποτελεσματικότητα των φαρμάκων, τα οποία τους συνταγογραφούνται. Η λήψη, παρόλα αυτά, φαρμάκων κρύβει τόσο οφέλη όσο και κινδύνους για την ανθρώπινη υγεία. Προκειμένου να διασφαλιστεί ότι η ισορροπία μεταξύ των οφελειών και των κινδύνων πρέπει να είναι προς όφελος του ασθενή, ο έλεγχος της αποτελεσματικότητας των φαρμάκων και της ασφάλειάς τους πρέπει να είναι εξονυχιστικός και συνεχής. Για το λόγο αυτό, οι κανονισμοί, που αφορούν σήμερα στα φαρμακευτικά σκευάσματα και καθορίζονται από αρμόδιους και εξουσιοδοτημένους εθνικούς φορείς (Εθνικός Οργανισμός Φαρμάκων - ΕΟΦ), γίνονται ολοένα και πιο αυστηροί. Οι κανονισμοί αυτοί ελέγχουν και καθορίζουν όλα τα στάδια από τα οποία περνά ένα φαρμακευτικό προϊόν τόσο κατά την παραγωγή του όσο κατά τη διακίνηση και την αποθήκευσή του. Ο έλεγχος ποιότητας ενός φαρμακευτικού σκευάσματος περιλαμβάνει μια πληθώρα δοκιμών, στις οποίες περιλαμβάνονται μεταξύ άλλων: 1. Ο ποσοτικός προσδιορισμός και έλεγχος καθαρότητας του δραστικού συστατικού. 2. Ο έλεγχος διαλυτοποίησης. 3. Η ομοιομορφία της περιεκτικότητας. 4. Ο έλεγχος των πρώτων υλών. 5. Ο έλεγχος διαδικασίας παραγωγής (in process control). Στα παραπάνω πλαίσια, η Αναλυτική Χημεία παίζει καθοριστικό ρόλο τόσο στη διασφάλιση της ποιότητας των εμπορικά διαθέσιμων φαρμακευτικών σκευασμάτων όσο και στην έρευνα για ανάπτυξη νέων φαρμακοτεχνικών μορφών και δραστικών ουσιών. Οι απαιτήσεις των αναλυτικών μεθόδων για την αποτελεσματική εφαρμογή τους στον έλεγχο ποιότητας των φαρμάκων μεταξύ άλλων περιλαμβάνουν: 1. Υψηλό βαθμό αυτοματοποίησης. 2. Υψηλό ρυθμό ανάλυσης δειγμάτων σε βιομηχανική κλίμακα. 3. Απλή προκατεργασία των δειγμάτων.

27 Εφαρμογές των τεχνικών FIA και SIA στη φαρμακευτική ανάλυση Χαμηλό κόστος αντιδραστηρίων. 5. Απλές διαδικασίες ελέγχου και χειρισμού. Είναι φανερό ότι οι τεχνικές συνεχούς ροής όπως η FIA και η SIA πληρούν τα περισσότερα, αν όχι όλα, από τα παραπάνω κριτήρια. Αποτέλεσμα αυτού είναι η ύπαρξη στη διεθνή βιβλιογραφία εκατοντάδων αναφορών που περιγράφουν την ανάπτυξη αυτόματων μεθόδων FIA και SIA για τον έλεγχο ποιότητας φαρμακευτικών σκευασμάτων τόσο σε ακαδημαϊκό όσο και σε βιομηχανικό επίπεδο [1-5].

28 Εφαρμογές των τεχνικών FIA και SIA στη φαρμακευτική ανάλυση 22 Βιβλιογραφία [1] M. Polasek, Comprehensive Anal. Chem. 54 (2008) 591. [2] P. D. Tzanavaras, D. G. Themelis, Anal. Chim. Acta 588 (2007) 1. [3] P. D. Tzanavaras, A. Verdoukas, T. Balloma, J. Pharm. Biomed. Anal. 41 (2006) 437. [4] P. D. Tzanavaras, D. G. Themelis, Anal. Lett. 38 (2005) [5] P. D. Tzanavaras, A. Verdoukas, D.G. Themelis, Anal. Sci. 21 (2005) 1515.

29 Γενικά χαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόμενων ενώσεων και αντιδραστηρίων 23 Κεφάλαιο 5 ΓΕΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΖΟΜΕΝΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ 5.1. Καπτοπρίλη Μέχρι σήμερα μια από τις αποτελεσματικότερες δραστικές φαρμακευτικές ουσίες που χρησιμοποιούνται για την πρόληψη ενός δεύτερου καρδιακού επεισοδίου, μετά από έμφραγμα του μυοκαρδίου, είναι η CAP (σχήμα 5.1). Η CAP ανήκει στην κατηγορία των αναστολέων του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτασίνης I. Αναστέλλει δηλαδή την μετατροπή της αγγειοτασίνης I σε αγγειοτασίνη II, μειώνοντας έτσι την αύξηση της πίεσης που προκαλεί η τελευταία. Η CAP μειώνει επίσης τους θανάτους που προκαλούνται από καρδιακά νοσήματα, όπως η καρδιακή υπερτροφία. Είναι ο πρώτος ενεργός αναστολέας του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτασίνης I που μπορεί να λαμβάνεται από τη στοματική οδό και έχει εγκριθεί, ώστε να μπορεί να χρησιμοποιείται ως αντιυπερτασικό και ως φάρμακο για την καρδιακή ανεπάρκεια. Η χημική της δομή την κάνει να ξεχωρίζει από τους υπόλοιπους αναστολείς του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτασίνης I ως προς στο ότι περιέχει μια σουλφυδρυλική (-SH) ομάδα. Η CAP απορροφάται ταχέως μετά τη χορήγηση από το στόμα. Στον ορό αρχίζει να ανιχνεύεται 15 λεπτά μετά τη λήψη. Μέγιστα επίπεδα επιτυγχάνονται μετά από 30 έως 90 λεπτά [1]. Σημαντική παρενέργεια της CAP ήταν ότι το 30% των ασθενών στους οποίους χρειάστηκε να χορηγηθεί το φάρμακο παρουσίασαν επίμονο βήχα, εξανθήματα και αλλαγές στη γεύση. Σχήμα 5.1. Συντακτικός τύπος CAP. (M (CAP) = 217,29 g mol -1 )

30 Γενικά χαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόμενων ενώσεων και αντιδραστηρίων 24 Λιγότερο συχνές καταγεγραμμένες παρενέργειες περιλαμβάνουν υπόταση, ίλιγγο, κεφαλαλγία, αδυναμία, αίσθημα κοπώσεως, ναυτία, εμετούς και διάρροια. Οι αντιδράσεις αυτές είναι κοινές όλων των αναστολέων του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτασίνης I, μερικές όμως ίσως είναι ειδικές της καπτοπρίλης και οφείλονται πιθανώς στην σουλφυδρυλική ομάδα του μορίου Κυστεΐνη Η CYS (σχήμα 5.2) είναι ένα θειούχο αμινοξύ που παίζει ενεργό ρόλο στη δομή πολλών πρωτεϊνών. Σε συνδυασμό με άλλα στοιχεία της διατροφής μας, η L- CYS, δρα ως αντιοξειδωτικός παράγοντας εναντίον των ανεπιθύμητων επιδράσεων της ακτινοβολίας, του καπνίσματος και τοξικών ουσιών όπως το αλκοόλ και τα βαρέα μέταλλα. Η CYS είναι βασικό μέρος του πεπτιδίου της γλουταθειόνης, το οποίο με τη σειρά του συμμετέχει στη δημιουργία του αντιοξειδωτικού ενζύμου της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης. Η L- CYS είναι επίσης απαραίτητη για την παραγωγή του συνενζύμου Α, ενός σημαντικού ενζύμου για την απελευθέρωση της ενέργειας των τροφών στον οργανισμό. Είναι χρήσιμη για την αντιμετώπιση αναπνευστικών προβλημάτων (βοηθάει στη ρευστοποίηση και την απομάκρυνση των βλεννωδών εκκρίσεων από τους βρόγχους και τους πνεύμονες : βλεννολυτικό - αποχρεμπτικό), βοηθάει στην ενδυνάμωση και την εξυγίανση των μαλλιών, για προστασία από τις παρενέργειες της χημειοθεραπείας και περιπτώσεις περιστατικών δηλητηρίασης από βαρέα μέταλλα [2]. Σχήμα 5.2. Συντακτικός τύπος CYS. (M(CYS) = g mol 1 ).

31 Γενικά χαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόμενων ενώσεων και αντιδραστηρίων Ν-ακέτυλοκυστεΐνη Η ΝAC αποτελεί το Ν-ακετυλικό παράγωγο του αμινοξέως L-CYS (σχήματα 5.2 και 5.3) και είναι πρόδρομη ένωση για το σχηματισμό του αντιοξειδωτικού γλουταθείου στο ανθρώπινο σώμα. Η σουλφίδρυλομάδα του μορίου δίνει σε αυτό αντιοξειδωτικές ιδιότητες, μπορεί δηλαδή να καταπολεμά τις ελεύθερες ρίζες. Η ΝAC χρησιμοποιείται στην παρασκευή φαρμάκων [3,4], λόγω των βλεννολυτικών ιδιοτήτων που παρουσιάζει. Μερικά από τα εμπορικά διαθέσιμα φάρμακα που περιέχουν ακέτυλοκυστεΐνη είναι τα: ASİST (Bilim Pharmaceuticals), ACC (Hexal AG), Mucomyst (Bristol-Myers Squibb), Acetadote (Cumberland Pharmaceuticals), Fluimucil (Zambon), Parvolex (GSK), Lysox (Menarini), Mucomelt-A tab (Venus Remedies, India) and Mucolysin (Sandoz). Τα φάρμακα αυτά χορηγούνται κυρίως από το στόμα (διαλύματα, αναβράζοντα δισκία, χάπια), αλλά σε ορισμένες περιπτώσεις η χορήγησή τους μπορεί να γίνει μέσω της αναπνευστικής οδού ή ακόμα και ενδοφλεβίως. Η χορήγηση ΝAC ενδείκνυται στις βλεννολυτικές θεραπείες σε περιπτώσεις εμφυσήματος, βρογχίτιδας, φυματίωσης, βρογχοεστίασης και πνευμονίας. Η δράση της στηρίζεται στη μείωση του ιξώδους της βλέννας, καθώς το μόριο αυτό μπορεί να διασπά τους δισουλφιδικούς δεσμούς που αναπτύσσονται ανάμεσα στις πρωτεΐνες της βλέννας. Σχήμα 5.3. Συντακτικός τύπος ΝAC. (M(NAC)= 163,19 g mol 1 ) Προπιολικός μεθυλεστέρας Ο MP (σχήμα 5.4) ανήκει στην οικογένεια των άλκυλο-εστέρων του προπιολικού οξέος. Είναι ένα από τα αντιδραστήρια που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην

32 Γενικά χαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόμενων ενώσεων και αντιδραστηρίων 26 παραγωγοποίηση των θειολών. Πρόκειται για ένα υποκίτρινο υγρό το οποίο έχει σημείο ζέσεως Θ =102 0 C και πυκνότητα ρ = 1,006 g ml -1. Ανήκει στα εύφλεκτα αντιδραστήρια, ενώ παράλληλα είναι ιδιαίτερα διαλυτό στο νερό. [5]. Σχήμα 5.4. Συντακτικός τύπος του MP. (M(ΜP) = 84,07 g mol -1 ). Ο MP αντιδρά με φαρμακευτικά δραστικές θειόλες όπως είναι η CAP, η CYS και η ΝAC, δίνοντας σταθερά παράγωγα. Η αντίδραση γίνεται γρήγορα σε θερμοκρασία δωματίου και σε αλκαλικό ph ( 8 12), ενώ τα σχηματισθέντα παράγωγα απορροφούν στην περιοχή του υπεριώδους και συγκεκριμένα στα 285 nm. Μια γενική αντίδραση παραγωγοποίησης θειολών με τον εν λόγω εστέρα περιγράφεται από την εξίσωση : R-SH + HC C-COOCH 3 R-S-CH=CH-COOCH Προπιολικός αιθυλεστέρας Ο EP (σχήμα 5.5) ανήκει στην οικογένεια των άλκυλο-εστέρων του προπιολικού οξέος. Είναι και αυτό ένα από τα αντιδραστήρια που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην παραγωγοποίηση των θειολών. Το σημείο ζέσεώς του είναι στους 180 Ο C ενώ η πυκνότητά του είναι ίση με ρ = 0,968 g ml -1. Πρόκειται για αντιδραστήριο το οποίο είναι διαλυτό στο νερό όχι όμως τόσο όσο ο MP [5]. Σχήμα 5.5. Συντακτικός τύπος του ΕP. (Μ(EP) = 98,1 g mol -1 ).

33 Γενικά χαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόμενων ενώσεων και αντιδραστηρίων 27 Ο EP αντιδρά με φαρμακευτικά δραστικές θειόλες, όπως είναι η CAP, η CYS και η ΝAC, δίνοντας σταθερά παράγωγα. Η αντίδραση γίνεται γρήγορα σε θερμοκρασία δωματίου και σε αλκαλικό ph ( 8 12) ενώ τα σχηματισθέντα παράγωγα απορροφούν στην περιοχή του υπεριώδους και συγκεκριμένα στα 285 nm [6]. Μια γενική αντίδραση παραγωγοποίησης θειολών με τον εν λόγω εστέρα περιγράφεται από την εξίσωση : R-SH + HC C-COOCH 2 CH 3 R-S-CH=CH-COOCH 2 CH Προπιολικός βουτυλεστέρας Ένας ακόμη εστέρας που ανήκει στην οικογένεια των άλκυλο-εστέρων του προπιολικού οξέος είναι BP (σχήμα 5.6). Όπως οι δυο προηγούμενοι (MP, ΕP) έτσι και αυτός μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως αντιδραστήριο παραγωγοποίησης των θειολών. Το σημείο ζέσεώς του είναι σχετικά χαμηλό (Θ = 53 0 C) και αυτός είναι ένας παράγοντας που πρέπει να λαμβάνεται υπόψη προκειμένου να αποφευχθεί η εξάτμισή του σε πειράματα και αντιδράσεις που χρησιμοποιούνται υψηλές θερμοκρασίες. Η πυκνότητά του είναι ίση με ρ = 0,919 g ml -1. Σχήμα Συντακτικός τύπος του BP. (Μ(BP) = 126,15 g mol -1 ). Ο BP αντιδρά με φαρμακευτικά δραστικές θειόλες, όπως είναι η CAP, η CYS και η ΝAC, δίνοντας σταθερά παράγωγα. Η αντίδραση γίνεται γρήγορα σε θερμοκρασία δωματίου και σε αλκαλικό ph ( 8 12), ενώ τα σχηματισθέντα παράγωγα απορροφούν στην περιοχή του υπεριώδους και συγκεκριμένα στα 285

34 Γενικά χαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόμενων ενώσεων και αντιδραστηρίων 28 nm. Μια γενική αντίδραση παραγωγοποίησης θειολών με τον εν λόγω εστέρα περιγράφεται από την εξίσωση : R-SH + HC C-COOC(CH 3 ) 3 R-S-CH=CH-COOC(CH 3 ) 3

35 Γενικά χαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόμενων ενώσεων και αντιδραστηρίων 29 Βιβλιογραφία [1] [2] [3] [4] [4] [5] T.C. Owen, Biorganic Chemistry 36 (2008) 156 [6] C.K.Zacharis, P.D.Tzanavaras, D.G.Themelis, J. Pharm. Biomed. Anal. 50 (2009) 384

36 Βιβλιογραφική επισκόπηση 30 Κεφάλαιο 6 Βιβλιογραφική επισκόπηση Οι αυτόματες μέθοδοι FIA και SIA που έχουν αναφερθεί στη διεθνή βιβλιογραφία για τον προσδιορισμό των CAP, CYS, NAC παρατίθενται στους Πίνακες Στους πίνακες δίνεται η τεχνική που χρησιμοποιήθηκε, το σύστημα ανίχνευσης / η αρχή της μεθόδου, το γραμμικό εύρος προσδιορισμού, το όριο ανίχνευσης, ο ρυθμός ανάλυσης των δειγμάτων και τα δείγματα που εφαρμόστηκαν. Αξίζει να παρατηρηθεί ότι οι μέθοδοι που χρησιμοποιούν την τεχνική SIA είναι σχετικά περιορισμένες για την CAP [4, 7, 12, 13] ενώ δεν έχει αναφερθεί μέχρι στιγμής στη διεθνή βιβλιογραφία μέθοδος SIA για τον προσδιορισμό της NAC. Χρησιμοποιείται αρκετά μεγάλη γκάμα ενόργανων τεχνικών ανίχνευσης, τόσο οπτικών (UV-Vis, φθορισμομετρία, χημειοφωταύγεια) όσο και ηλεκτροχημικών (βολταμμετρία και αμπερομετρία). Η συντριπτική πλειοψηφία των μεθόδων FIA και SIA για τον προσδιορισμό των τριών θειολών βρίσκει εφαρμογές σε φαρμακευτικά σκευάσματα.

37 Βιβλιογραφική επισκόπηση 31

38 Βιβλιογραφική επισκόπηση 32

39 Βιβλιογραφική επισκόπηση 33

40 Βιβλιογραφική επισκόπηση 34