ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ-ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ-ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ Μεταπτυχιακή διατριβή της πτυχιούχου φαρμακοποιού Ελένης Αστ. Καραστέργιου Χημική ανάλυση αιθερίων ελαίων στον κύκλο βλάστησης του φυτού Dittrichia viscosa ssp. viscosa Επιβλέπων καθηγητής: κ. Κοκκάλου Ευγένιος Καθηγητής Φαρμακογνωσίας Α.Π.Θ. Θεσσαλονίκη 2015

2

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ-ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ Μεταπτυχιακή διατριβή της πτυχιούχου φαρμακοποιού Ελένης Αστ. Καραστέργιου Χημική ανάλυση αιθερίων ελαίων στον κύκλο βλάστησης του φυτού Dittrichia viscosa ssp. viscosa Επιβλέπων καθηγητής: κ. Κοκκάλου Ευγένιος Καθηγητής Φαρμακογνωσίας Α.Π.Θ. Θεσσαλονίκη 2015

4 ΜΕΛΗ ΤΡΙΜΕΛΟΥΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Επιβλέπων καθηγητής: κος Κοκκάλου Ευγένιος Επίκουρη καθηγήτρια: κα Λάζαρη Διαμάντω Λέκτορας: κα Καριώτη Αναστασία Η ερευνητική μελέτη αυτή εκπονήθηκε με την υποστήριξη του εργαστηρίου Φαρμακογνωσίας του τομέα Φαρμακογνωσίας- Φαρμακολογίας του τμήματος Φαρμακευτικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης.

5 Στην Ειρήνη μου

6

7 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η εκπόνηση μιας μεταπτυχιακής διατριβής ήταν πάντα για μένα ένας μεγάλος στόχος και κόπιασα πολύ όλα αυτά τα χρόνια για να φτάσω ως εδώ. Στον πηγαιμό για την Ιθάκη όμως δεν ήμουν μόνη. Με βοήθησαν ακαδημαϊκοί δάσκαλοι, συνάδελφοι, συγγενείς και φίλοι. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον Διευθυντή του Τομέα Φαρμακογνωσίας-Φαρμακολογίας του Τμήματος Φαρμακευτικής του Α.Π.Θ. και επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Ευγένιο Κοκκάλου για την ευκαιρία που μου έδωσε, για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε αναθέτοντάς μου αυτή την μεταπτυχιακή μελέτη καθώς επίσης για την καθοδήγησή του και την βοήθειά του που αγόγγυστα μου προσέφερε αυτά τα χρόνια. Ευχαριστώ θερμά την Επίκουρο καθηγήτρια κα Λάζαρη Διαμάντω για την πολύτιμη βοήθειά της τόσο κατά τη διάρκεια εκπόνησης αυτής της μελέτης όσο και στη διόρθωση του τελικού κειμένου. Παρόλο τον ελάχιστο χρόνο της πάντα ήταν διαθέσιμη όποτε την χρειαζόμουν. Ευχαριστώ πολύ την τριμελή επιτροπή, τον Καθηγητή κ. Κοκκάλου Ευγένιο, την Επίκουρο καθηγήτρια κα. Λάζαρη Διαμάντω και την Λέκτορα κα. Καριώτη Αναστασία για την συμμετοχή τους στην εξεταστική επιτροπή. Ευχαριστώ πολύ την κα Τουπλικιώτη Δήμητρα από το Γεωπονικό Κέντρο Ερευνών Βορείου Ελλάδας «ΔΗΜΗΤΡΑ» για την ταυτοποίηση του φυτού. Θα ήταν παράλειψη να μην ευχαριστήσω την κα. Χρυσή Γαβριέλη που με το πλατύ χαμόγελο με καλημέριζε κάθε φορά που με συναντούσε στο εργαστήριο και με ενδιαφέρον πάντα με ρωτούσε " πώς πας Ελένη"; Ευχαριστώ επίσης τους συναδέλφους, με τους οποίους βέβαια γίναμε φίλοι, Ανδρέου Βασιλική και Γούναρη Χρήστο που ξεκινήσαμε μαζί αυτή την πορεία. Μοιραστήκαμε προβληματισμούς προσφέροντας ο ένας στον άλλο ότι μπορούσε από τις γνώσεις του και την ηθική του συμπαράσταση. Η μελέτη αυτή δεν θα μπορούσε να ολοκληρωθεί χωρίς την αδιάκοπη βοήθεια από την συνάδελφο μου στο φαρμακείο μου κα

8 Συμεωνίδου Αναστασία η οποία με αντικατέστησε πλήρως στα καθήκοντα της εργασίας μου προκειμένου να έχω χρόνο για την διατριβή μου. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς του συζύγου μου για την βοήθεια που μου προσέφεραν στην καθημερινότητά μου κάνοντας ότι μπορούσαν. Ένα μεγάλο ευχαριστώ όμως οφείλω στους γονείς μου που όλα αυτά τα χρόνια ήταν δίπλα μου στηρίζοντάς με, με κάθε τρόπο, με το να με εμψυχώνουν, να μου δίνουν κουράγιο και να με απαλλάσσουν από καθημερινές μου υποχρεώσεις ώστε να έχω χρόνο για να ασχοληθώ με την μεταπτυχιακή μου μελέτη. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά μου, τον σύζυγό μου και την μικρή μου κόρη, την Ειρήνη, για την υπομονή, την συμπαράσταση και την κατανόησή τους όλο αυτό το διάστημα. Ιδιαίτερα την Ειρήνη μου που αν και μικρή στην ηλικία έκανε πολύ υπομονή και με ενθάρρυνε συνεχώς μέχρι να ολοκληρώσω την εργασία μου. Δεν σας κρύβω την ανυπομονησία της να στολίσουμε το Χριστουγεννιάτικο δέντρο!!!!! Αν ξέχασα κάποιον θα ήθελα να ζητήσω ταπεινά συγνώμη, δεν το έκανα ηθελημένα και παρόλα αυτά να τον ευχαριστήσω κλείνοντας τις ευχαριστίες και δείχνοντας μεγάλη ευγνωμοσύνη σε όλους όσους στάθηκαν δίπλα μου άλλος λιγότερο και άλλος περισσότερο

9 ΠΕΡΙΛΗΨΗ H Dittrichia viscosa ssp. viscosa (L.W.Greuther) της οικογένειας Asteraceae (Compositae) είναι ένας αειθαλής πολυετής θάμνος που ευδοκιμεί κυρίως στην Αφρική, την Ασία και την Ευρώπη, κυρίως γύρω από τη λεκάνη της Μεσογείου. Αναπτύσσεται σε υποβαθμισμένα περιβάλλοντα λόγω ανθρωπογενών δραστηριοτήτων. Η D. viscosa είναι ευρέως γνωστή από τους αρχαίους χρόνους λόγω των φαρμακευτικών ιδιοτήτων της και της χρήσης αυτής στην παραδοσιακή ιατρική σε πολλές χώρες του κόσμου. Έχει αντιφλεγμονώδη, αντιπυρετική, αντισηπτική, αντιφλογιστική και επουλωτική δράση. Χρησιμοποιήθηκε επίσης κατά της ψώρας, του έλκους στομάχου και του διαβήτη. Ο Διοσκουρίδης αναφέρει ότι τα φύλλα της γίνονται αποτελεσματικό κατάπλασμα στα δαγκώματα από φίδια, στις νεοπλασίες και τα τραύματα. Σκοπός της εργασίας αυτής είναι η χημική ανάλυση του αιθερίου ελαίου στον κύκλο βλάστησης του φυτού και η σύγκριση με βιβλιογραφικά δεδομένα αιθερίων ελαίων φυτών άλλων χωρών. Το φυτικό υλικό συλλέχτηκε από την περιοχή Άγιος Γεώργιος στο νησί της Αμμουλιανής στη Χαλκιδική, έξι διαφορετικές περιόδους σε ένα χρόνο. Συλλέχτηκαν τα υπέργεια τμήματα του φυτού από τον Οκτώβριο 2013 έως τον Οκτώβριο Φαρμακευτικό υλικό υπάρχει αποθηκευμένο στο εργαστήριο Φαρμακογνωσίας της Φαρμακευτικής Σχολής του ΑΠΘ. Για την απομόνωση και παραλαβή του αιθερίου ελαίου του φυτού, κάθε συλλογής, χρησιμοποιήθηκε η κλασσική μέθοδος της υδροαπόσταξης. Τα υπέργεια τμήματα του φυτού αποστάχθηκαν με συσκευή τύπου Clevenger για 4 ώρες. Η ίδια μέθοδος ακολουθήθηκε για όλα τα φυτικά υλικά. Η απόδοση ποικίλλει ανάλογα με την εποχή συλλογής του φυτικού υλικού, με μέγιστη απόδοση την εποχή της ανθοφορίας. Η ανάλυση των αιθερίων ελαίων έγινε με αέριο χρωματογραφίαφασματοσκοπία μάζας (GC-MS). Για την GC-MS ανάλυση χρησιμοποιήθηκε σύστημα SHIMADZU GC-2010-GCMS-QP2010 και η μέθοδος παραγωγής ιόντων ήταν ιονισμός με ηλεκτρόνια (70eV). Χρησιμοποιήθηκε μία άπολη στήλη ΗΡ-5MS (30m x 0.25 mm, film - 9 -

10 thickness: 0.25μm) και μία πολική στήλη ΑΤ-Wax (60m x 0.32 mm i.d., film thickness: 0.25μm) με θερμικό πρόγραμμα. Στο τέλος της εργασίας καταλήξαμε ότι κύρια συστατικά του αιθερίου ελαίου, σχεδόν καθ' όλη τη διάρκεια του έτους, είναι η βορνεόλη και ο οξικός βορνυλεστέρας. Τόσο η ποιοτική όσο και η ποσοτική σύσταση διαφέρει ανάλογα με την εποχή. Διαφορές υπάρχουν ακόμα και τον ίδιο μήνα διαφορετικών ετών. Ανάλογα με την φάση του κύκλου βλάστησης του φυτού η απόδοση σε αιθέριο έλαιο διαφέρει παρουσιάζοντας τη μέγιστη απόδοση την περίοδο της ανθοφορίας. Στη σύγκριση με τα βιβλιογραφικά δεδομένα που αφορούν τη σύσταση του αιθερίου ελαίου του φυτού D. viscosa ssp. viscosa, διαφορετικών χωρών, στη φάση της ανθοφορίας του φυτού, υπάρχουν πολύ μεγάλες διαφορές τόσο στην ποιοτική όσο και την ποσοτική σύσταση

11 ABSTRACT Dittrichia viscosa ssp. viscosa (L.W.Greuther) is a perennial herbaceous plant of family Asteraceae (Compositae) growing wild in waste places of Africa, Asia and the Mediterranean zone. D. viscosa is a well known medicinal plant because it is used in folk medicine in many countries. It has anti-inflammatory, antipyretic, antiseptic and antiflogistic properties. Also it is used for the treatment of wounds, against psora, diabetes mellitus and gastric ulcer. Dioscourides mentioned that Dittrichia's leaves are made an effective cataplasm for snakes' bites, neoplasm and woulds. The aim of this study is to determine the chemical composition of the essential oil during the growing circle of the plant D. viscosa ssp. viscosa and to make the comparison with the literature's data for essential oils of plants from different countries. The plant material was collected from the area Saint George on the Ammouliani island in Chalkidiki, six different periods during a year. Aerial parts of the plant were collected from October 2013 until October Plant material has been deposited at the Laboratory of Pharmacognosy, Department of Pharmacognosy-Pharmacology, School of Pharmacy, Aristotle University of Thessaloniki. The classical method of hydrodistillation using the Clevenger-type apparatus for 4 hours was used for the isolation of the essential oil from the aerial parts (for every collection) of D. viscosa. The same method was followed for every plant material. The yield of essential oil was varied in depend of the Dittrichia's growing stage. The maximum yield was at the flowering stage. The chemical analysis of the oil was carried out using GC-MS system SHIMADZU GC-2010-GCMS-QP2010. The ionization voltage was 70eV. It was utilized a low polarity capillary column HP-5MS (30m x 0.25 mm, film thickness: 0.25μm) and a polar column ΑΤ-Wax (60m x 0.32 mm i.d., film thickness: 0.25μm) under non-linear temperature programme. In the conclusion we could say that the main constituents of the D. viscosa essential oil, during the year of study, were borneol and bornyl ester. So, the qualitative as the quantitative analysis vary

12 depending on the growing stage of the plant. There are also differences between constituents of the oils that collected the same month of different years. The essential oil yield varies depending also on the growing stage of the plant and it is exhibited the maximum rate at the flowering stage. In comparison with the literature data for the essential oil of the D. viscosa which comes from different countries, at the flowering stage of the plant we can find noticeable qualitative and quantitative differences

13 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ 7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 9 ABSTRACT 11 Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΑΙΘΕΡΙΑ ΕΛΑΙΑ ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ ΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΚΑΙ ΠΟΥ ΑΠΑΝΤΩΝΤΑΙ ΣΤΟ ΦΥΤΟ ΦΥΣΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΤΕΡΠΕΝΙΑ ΜΗ ΤΕΡΠΕΝΙΚΟΙ ΥΔΡΟΓΟΝΑΝΘΡΑΚΕΣ ΤΕΡΠΕΝΙΚΟΙ ΥΔΡΟΓΟΝΑΝΘΡΑΚΕΣ α. ΜΟΝΟΤΕΡΠΕΝΙΑ 24 α. Άκυκλα μονοτερπένια 25 β. Κυκλικά μονοτερπένια 26 β1. Μονοκυκλικά μονοτερπένια 26 β2. Δικυκλικά μονοτερπένια 27 β3. Τρικυκλικά μονοτερπένια β. ΣΕΣΚΙΤΕΡΠΕΝΙΑ 28 α. Άκυκλα σεσκιτερπένια 28 β. Κυκλικά σεσκιτερπένια 29 β1. Μονοκυκλικά σεσκιτερπένια 29 β2. Δικυκλικά σεσκιτερπένια 30 β3. Διάφορα σεσκιτερπένια γ. ΔΙΤΕΡΠΕΝΙΑ ΦΑΙΝΥΛΟΠΡΟΠΑΝΟΕΙΔΗ Βιοσύνθεση φαινυλοπροπανοειδών ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΚΑΙ ΤΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ Γενικά

14 Μεταβολές στη φυσιολογία του φυτού Το στάδιο ανάπτυξης των Το μέρος του φυτού που αναλύεται Το εκκριτικό όργανο που παράγει τα αιθέρια 34 έλαια Εποχική διακύμανση Μηχανικές και χημικές βλάβες Περιβαλλοντικοί παράγοντες Το κλίμα Γεωγραφική θέση Γενετικοί παράγοντες Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΣΤΑ ΦΥΤΑ ΚΥΡΙΕΣ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΑΡΑΛΑΒΗΣ ΤΩΝ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΑΠΟΣΤΑΞΗ 39 α. Απόσταξη με νερό 41 β. Απόσταξη με νερό και υδρατμούς 42 γ. Απόσταξη με υδρατμούς ΕΚΧΥΛΙΣΗ 43 α. Εκχύλιση με διαλύτες 43 β. Εκχύλιση με κρύο λίπος (enfleurage) 44 γ. Εκχύλιση με ζεστό λίπος (maceratio) 45 δ. Εκχύλιση με υπερκρίσιμα υγρά (CO2 ) ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΕΚΠΙΕΣΗ ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΜΕ ΥΠΕΡΗΧΟΥΣ ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΜΕ ΜΙΚΡΟΚΥΜΑΤΑ (ΜΑΕ: microwave assisted extraction) Solvent Free Microwave Extraction (SFME) ΑΕΡΙΟΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ-ΦΑΣΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΜΑΖΑΣ (GAS CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROSCOPY, GC-MS Kovats Retention Index System DITTRICHIA VISCOSA (L.W. Greuther) ή INULA

15 (L.Aiton) 4.1. Γενικά Ονομασία, βοτανική ταξινόμηση του φυτού και εξάπλωσή του Κύκλος βλάστησης του φυτού Αναπαραγωγή και καλλιέργεια ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΡΑΣΗ-ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΧΡΗΣΕΙΣ Ιστορική αναδρομή 58 α. Αντιοξειδωτική δράση 59 β. Αντιμικροβιακή και αντιμυκητιασική δράση 60 γ. Αντιδιαβητική δράση 60 δ. Δράση κατά του έλκους του στομάχου και της ελκώδους κολίτιδας 61 ε. Δράση κατά της ψωρίασης και των φλεγμονωδών δερματοπαθειών 62 στ. Εκτρωτική και δράση κατά της γονιμοποίησης 63 ζ. Αλληλοπαθητική δράση του φυτού D. Viscosa 63 η. Άλλες 64 Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Β.1. ΓΕΝΙΚΑ 65 Β.1.1. ΦΥΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ 66 Β.1.2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 66 Β Διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν 66 Β.1.3 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 67 Β Παραλαβή των πτητικών συστατικών 67 Β Ποιοτική και ποσοτική ανάλυση των πτητικών συστατικών 67 Εκτίμηση των δεδομένω από την ανάλυση στο GC-MS των ίδιων δειγμάτων αλλά με τη χρήση στήλης πολικού υποστρώματος AT-WAX. 81 Γ. ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΑ ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΤΩΝ ΚΥΡΙΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΤΟΥ ΑΙΘΕΡΙΟΥ ΕΛΑΙΟΥ ΤΟΥ ΦΥΤΟΥ ΜΑΣ ΜΕ ΤΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΑΛΛΩΝ ΧΩΡΩΝ

16 Δ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

17 Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΑΙΘΕΡΙΑ ΕΛΑΙΑ 1.1 ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ Υπάρχουν στοιχεία ότι οι μέθοδοι παραλαβής των αιθερίων ελαίων αναπτύχθηκαν πολύ νωρίς και τα πρώτα κείμενα είναι εκείνα των αλχημιστών των πρώτων Μεσανατολικών πολιτισμών. Αποδίδεται στην Μαρία την Εβραία η ανακάλυψη του άμβυκα. Μέχρι το 1982 επικρατούσε η εντύπωση ότι η ηλικία των πρώτων αποστάξεων για την παραλαβή αρωματικών ενώσεων ήταν περίπου 4000 ετών με πρώτους γνώστες και ειδικούς αργότερα τους Άραβες. Αποστακτικές τεχνικές αναπτύχθηκαν και στην Κίνα με πατέρα της κινέζικης αλχημείας τον Ko Hung. Ενώ οι Kινέζοι ανέπτυσσαν την βελονοθεραπεία οι Αιγύπτιοι βελτίωσαν και αύξησαν τις γνώσεις τους επί των αιθέριων ελαίων. Οι Αιγύπτιοι φημισμένοι για την ταρίχευση των νεκρών ανακάλυψαν ότι εκχυλίσματα κέδρου και μύρων καθυστερούσαν την αποσύνθεση ώστε μουμιοποιημένα σώματα εκείνης της εποχής διατηρούνται μέχρι και σήμερα. Επίσης, πρώτοι οι Αιγύπτιοι ξεκίνησαν τις εκχυλίσεις των essences από φυτά θερμαίνοντας τα σε πήλινα σκεύη. Η ανακάλυψη της απόσταξης ανάγεται στους Έλληνες αλχημιστές. Πολλές συνταγές είναι καταγεγραμμένες σε μαρμάρινες επιγραφές που βρέθηκαν στα ιερά του Ασκληπιού και της Αφροδίτης. Οι Ρωμαίοι, υπερβολικοί με τη χρήση αρωμάτων, ψέκαζαν στα ανάκτορα του Νέρωνα αρώματα τους επισκέπτες. Η Ρώμη ήταν γεμάτη λουτρά που ευωδίαζαν την τότε πρωτεύουσα του κόσμου. Στην διάρκεια των αιώνων οι γνώσεις και οι μέθοδοι των βοτανολόγων και των αρωματοποιών σχετικά με τα αιθέρια έλαια γινόταν περισσότερο σφαιρικές. Η απόσταξη ως μέθοδος παραλαβής και παραγωγής αιθέριων ελαίων χρησιμοποιήθηκε αρχικά στην Ανατολή, την Αίγυπτο, την Ινδία και την Περσία πριν από 2000 χρόνια και βελτιώθηκε τον 9ο αιώνα από τους Άραβες. Μέχρι το 13ο αιώνα τα αιθέρια έλαια παράγονταν στα φαρμακεία και οι φαρμακευτικές τους ιδιότητες περιγράφονταν στις εθνικές φαρμακοποιίες αλλά η χρήση τους δεν φαίνεται να ήταν διαδεδομένη στην Ευρώπη μέχρι το 16ο αιώνα

18 Κατά τον 17ο αιώνα η παραγωγή αιθέριων ελαίων ήταν πολύ γνωστή και τα φαρμακεία ήταν εφοδιασμένα με διαφορετικά αιθέρια έλαια. Η χρήση του ελαίου του τεϊόδεντρου για ιατρικούς λόγους ήταν τεκμηριωμένη ήδη από την αποίκιση της Αυστραλίας στο τέλος του 18ου αιώνα. Κατά το Μεσαίωνα οι βοτανολόγοι και οι αλχημιστές προσπαθούσαν να καταπολεμήσουν τους λοιμούς. Οι αρωματικές ουσίες ήταν τα καλύτερα αντισηπτικά που υπήρχαν εκείνη την περίοδο. Κατά τη διάρκεια του 19ου αιώνα ένας μεγάλος αριθμός αιθέριων ελαίων αντικαταστάθηκε από συνθετικές φαρμακοχημικές ενώσεις λόγω της ισχυρής δράσης τους. Τα αιθέρια έλαια ακόμα και σήμερα χρησιμοποιούνται στη θεραπευτική σαν αρωματικά πρόσθετα, σε αρώματα και σε άλλες περιπτώσεις (Κατσιώτης- Χατζοπούλου 2010). 1.2 ΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΚΑΙ ΠΟΥ ΑΠΑΝΤΩΝΤΑΙ ΣΤΟ ΦΥΤΟ. Αιθέρια έλαια: (aetherolea, essential oils, volatile oils). Τα αιθέρια έλαια είναι πολυσύνθετα, αρωματικής οσμής, πτητικά μίγματα τα οποία περιέχουν πολλές διαφορετικές ενώσεις (Samuelson, 1992). Η σύνθεσή τους είναι αποτέλεσμα αποκλειστικά φυσικών αντιδράσεων. Το χαρακτηριστικό άρωμα κάθε αιθερίου ελαίου είναι συνισταμένη όλων των συστατικών του. Πολλές φορές όμως η παρουσία ενός μόνο συστατικού σε αναλογία 1% ή και μικρότερη έχει ως αποτέλεσμα την αλλαγή του αρώματος (Κωφίδης, 2006). Τα αιθέρια έλαια μπορεί να απαντώνται στα φύλλα, τα άνθη, το φλοιό των καρπών, τις ρητίνες ή ακόμη και στις ρίζες των φυτών (Κατσιώτης, 1997). Η παραγωγή τους γίνεται σε ειδικευμένους εκκριτικούς σχηματισμούς του φυτού, όπως είναι τα ελαιοφόρα δοχεία, οι αδενώδης τρίχες, οι ελαιοφόροι πόροι και τα ιδιόβλαστα ελαιοκύτταρα. Η κάθε βοτανική οικογένεια φαίνεται πως έχει τη δική της ταυτότητα, συγκεκριμένες Εικόνα 1: Αδενώδεις τρίχες

19 ιδιότητες και συγκεκριμένο χώρο ανάπτυξης ελαιοφόρων αδένων απ' όπου παράγονται τα αιθέρια έλαια, επομένως και διαφορετική σύσταση σε αιθέρια έλαια. Υψηλά ποσοστά πτητικών ελαίων είναι ιδιαίτερα συνήθη σε μέλη των οικογενειών Apiaceae, Lamiaceae, Lauraceae, Myrtaceae και Rutaceae (Samuelsson, 2004). 1.3 ΦΥΣΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ Τα περισσότερα από τα αιθέρια έλαια είναι σχεδόν άχρωμα, κάποια από αυτά υποκίτρινα και εξαίρεση αποτελούν το γαρυφαλλέλαιο που είναι καστανοκίτρινο και όσα περιέχουν αζουλένιο που είναι μπλε. Κατά την παραμονή τους επί πολύ χρόνο σκουραίνουν, ρητινοποιούνται και αλλοιώνεται η οσμή τους. Αυτό οφείλεται σε αυτοοξειδώσεις, πολυμερισμό και υδρολύσεις των εστέρων. Η υγρασία, η θερμοκρασία και το φως επηρεάζουν τα αιθέρια έλαια γι' αυτό πρέπει να φυλάσσονται σε μικρούς σκουρόχρωμους και καλά κλειστούς περιέκτες προστατευμένα από το φως και τη θερμοκρασία. Τα αιθέρια έλαια έχουν υψηλό δείκτη διάθλασης, με εξαίρεση το Εικόνα 2: Σκουρόχρωμα φιαλίδια αιθερίων ελαίων αιθέριο έλαιο της αρτεμισίας, και είναι οπτικώς ενεργές ενώσεις. Βρίσκονται σε υγρή μορφή σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, γίνονται όμως πτητικά σε θερμοκρασία ζέσης ( ο C). Λόγω της πτητικότητάς τους έχουν χαρακτηριστικό άρωμα. Είναι διαλυτά στους περισσότερους οργανικούς διαλύτες και έχουν πολύ μικρή διαλυτότητα στο νερό. Επίσης έχουν χαμηλότερη πυκνότητα από το νερό γεγονός που επιτρέπει το διαχωρισμό τους κατά την απόσταξη με υδρατμούς, με ορισμένες εξαιρέσεις, όπως τα αιθέρια έλαια της κανέλλας και του γαρύφαλλου. (Κυμπάρης, ΔΠΘ) 1.4 ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ Από χημικής άποψης τα αιθέρια έλαια δεν αποτελούν ομοιογενή ομάδα. Παρουσιάζουν θα λέγαμε μια χημική ποικιλότητα

20 Συγκεκριμένα περιέχουν πτητικά συστατικά κατά 85-99% τα οποία είναι μίγμα από τερπενικές, τερπενοειδείς και άλλες αρωματικές και αλειφατικές ενώσεις, φαυνυλοπροπανοειδή κλπ, με κύριο εκπρόσωπό τους όμως τα τερπένια. (Κυμπάρης et al., ΔΠΘ) 1.4.1ΤΕΡΠΕΝΙΑ Τα τερπένια συνιστούν την μεγαλύτερη κατηγορία δευτερογενών μεταβολιτών με περίπου μέλη. Συναντώνται σε μεγάλο αριθμό ανώτερων φυτών αλλά και σε βρυόφυτα, μύκητες και βακτήρια. Τα τερπένια είναι μια κατηγορία ακόρεστων υδρογονανθράκων που δομικά αποτελούνται από τη σύνδεση μονάδων ισοπρενίου, μίας αλυσίδας πενταμελούς άνθρακα (C5), με σύνδεση «κεφαλής-ουράς». Διακρίνονται ανάλογα με τις μονάδες ισοπρενίου που περιέχουν σε μονοτερπένια (10 άτομα C), σεσκιτερπένια (15 άτομα C), διτερπένια (20 άτομα C), σεστετερπένια (25 άτομα C), τριτερπένια (30 άτομα C) και τετρατερπένια (40 άτομα C). Πίνακας 1: Ταξινόμηση των τερπενίων με βάση των αριθμό μονάδων ισοπρενίου που περιέχουν. Αριθμός ατόμων C Μονάδες Ισοπρενίου Ταξινόμηση 10 2 Μονοτερπένια 15 3 Σεσκιτερπένια 20 4 Διτερπένια 25 5 Σεστετερπένια 30 6 Τριτερπένια 40 8 Τετρατερπένια Οι δομικές μονάδες των τερπενίων, δηλαδή οι μονάδες ισοπρενίου προέρχονται από το πυροφωσφορικό ισοπεντενύλιο (IPP) το οποίο μετασχηματίζεται προς το πυροφωσφορικό διμεθυλαλλύλιο (DMAPP). Παρόλο που το ισοπρένιο αποτελεί τη βάση σχηματισμού των τερπενίων δεν είναι η πρόδρομη ουσία in vivo. Αντί αυτού οι δύο προαναφερόμενες, C5-πυροσφωσφορικές ενώσεις, το πυροφωσφορικό ισοπεντύλιο (ΙΡΡ) και το πυροφωσφορικό διμεθυλαλλύλιο (DΜΑΡΡ) αποτελούν τα βιολογικά ισοδύναμα της δομικής μονάδας του ισοπρενίου (Βώκου, 1983). Η αλλυλική πυροφωσφορική ομάδα (ΟΡΡ) αποτελεί μια εύκολα αποχωρούσα

21 ομάδα. Έτσι η υποκατάστασή της από τον πυρηνόφιλο δεσμό C=C του πυροφωσφορικού ισοπεντενύλιου, ακολουθούμενη από απώλεια ενός πρωτονίου, στο ενδιάμεσο καρβοκατιόν που σχηματίζεται, οδηγεί, με σύζευξη κεφαλής-ουράς, στο σχηματισμό του πυροφωσφορικού γερανυλίου (GPP) από το οποίο συντίθενται τα μονοτερπένια. Σχήμα 1. Βιοσύνθεση πυροφωσφορικού ισοπεντενυλίου. ( Αναλυτικά, το πρώτο βήμα είναι ο σχηματισμός του ακετοακετυλοσυνζύμου-α με συμπύκνωση Claisen δύο μορίων ακετυλοσυνενζύμου-α. Στη συνέχεια σχηματίζεται το (S)-3-υδροξυ- 3-μεθυλογλουταρυλοσυνενζυμο A (HMG-Co A) με συμπύκνωση του ακετυλοσυνενζύμου Α με το ακετοακετυλοσυνένζυμο Α. Το επόμενο μη αντιστρεπτό βήμα περιλαμβάνει την ενζυμική αναγωγή του μορίου (S)-3-υδροξυ-3-μεθυλογλουταρυλοσυνένζυμο Α (HMG-Co A) από το υδρογόνο δύο μορίων NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) για να δώσει το (R)-μεβαλονικό οξύ. Το μεβαλονικό οξύ με τη σειρά του υφίσταται δύο διαδοχικές φωσφορυλιώσεις από δύο μόρια τριφωσφορικής αδενοσίνης (ATP) για να δώσει το 5-πυροφωσφορικό. Το τελευταίο υφίσταται

22 απομάκρυνση της trans τεταρτοταγούς υδροξυλικής ομάδας καθώς επίσης και της καρβοξυλικής για να σχηματιστεί το 3-μεθυλοβουτ-3- ενυλοπυροφωσφορικό (ή πυροφωσφορικό ισοπεντενύλιο -IPP). To IPP βρίσκεται σε ισορροπία με το πυροφωσφορικό διμεθυλαλλύλιο (DMAPP). Από το ΙPP και το ισομερές του DMAPP σχηματίζεται όπως φαίνεται σχηματικά παρακάτω το πυροφωσφορικό γερανύλιο (GPP) πρόδρομη ένωση για τον σχηματισμό των μονοτερπενίων (Σχήμα 2). Στο σχήμα 3 φαίνεται ο σχηματισμός και των υπόλοιπων κατηγοριών των τερπενίων. Σχήμα 2: Σχηματισμός πυροφωσφορικόυ γερανυλίου (GPP)

23 Σχήμα 3: Σχηματική απεικόνιση της βιοσύνθεσης των τερπενίων (

24 Τα συστατικά των αιθερίων ελαίων διακρίνονται σε τερπενικούς και μη τερπενικούς υδρογονάνθρακες. Θα αναλύσουμε στη συνέχεια καθεμία από αυτές τις κατηγορίες ΜΗ ΤΕΡΠΕΝΙΚΟΙ ΥΔΡΟΓΟΝΑΝΘΡΑΚΕΣ Στην κατηγορία αυτή ανήκουν αλκάνια ή αλκένια με μικρό αριθμό ατόμων άνθρακα ή αλκοόλες και αλδεΰδες που έχουν προκύψει ως προϊόντα μεταβολισμού ή αποικοδόμησης των φωσφολιπιδίων και των λιπαρών οξέων. Τέτοιες ενώσεις είναι το trans-βουτ-2-ένιο και το cis-βουτ-2-ένιο. Μόρια με τρία άτομα C συνδέονται μόνο σε ευθεία αλυσίδα. Τέσσερα άτομα C και περισσότερα μπορούν να συνδέονται σε ευθεία αλυσίδα ή και σε διακλάδωση. Το ισοπρένιο (2-μεθυλο-1,3- βουταδιένιο) είναι ένα τέτοιο μόριο. trans-βουτ-2-ένιο cis- βουτ-2-ένιο 2-μεθυλο-1,3-βουταδιένιο Σχήμα 4: Μη τερπενικοί υδρογονάνθρακες ΤΕΡΠΕΝΙΚΟΙ ΥΔΡΟΓΟΝΑΝΘΡΑΚΕΣ α. ΜΟΝΟΤΕΡΠΕΝΙΑ Τα μονοτερπένια, όπως αναφέρθηκε και παραπάνω αποτελούνται από δύο μόρια ισοπρενίου. Μπορεί να είναι άκυκλα όπως το β- μυρκένιο, το (Ε)-β-οκυμένιο, το (Ζ)-β-οκυμένιο και το αλλο-οκυμένιο, ή κυκλικά όπως τα π-μενθάνιο και p-κυμένιο. Τα κυκλικά μονοτερπένια μπορούν με τη σειρά τους να είναι μονοκυκλικά όπως τα π-μενθάνιο και p-κυμένιο, δικυκλικά όπως το δ-3-καρένιο και τρικυκλικά όπως το τρικυκλένιο. Μονοτερπένια που η δομή τους περιέχει βενζολικό δακτύλιο όπως το p-κυμένιο, η καρβακρόλη, η θυμόλη και η φαινυλαιθυλική αλκοόλη (Σχήμα 5), συναντώνται συχνά ως συστατικά αιθερίων ελαίων αρωματικών φυτών όπως η ρίγανη (Origanum spp.), το θυμάρι (Thymus spp.), το θρούμπι (Satureja spp.) κ.ά.. Στην

25 κατηγορία των μονοτερπενίων ανήκουν και τα φαινυλοπροπανοειδή, τα οποία προκύπτουν από διαφορετικό βιοσυνθετικό μονοπάτι, αυτό του σικιμικού οξέος. καρβακρόλη θυμόλη φαινυλαιθυλική αλκοόλη Σχήμα 5: Μονοτερπένια Άκυκλα μονοτερπένια Η ομάδα αυτή των μονοτερπενίων έχει πολύ λίγα μέλη και περιέχει τα τριένια, το μυρκένιο και τα οκυμένια καθώς και τις αλκοόλες γερανιόλη, νερόλη, κιτρονελόλη, λιναλοόλη, κλπ. Η κιτράλη είναι το μίγμα της γερανιάλης και της νεράλης. Η κιτρονελάλη είναι επίσης μία άκυκλη αλδεΰδη που ανήκει στην ομάδα αυτή των μονοτερπενίων. Πίνακας 2: Άκυκλα μονοτερπένια ΑΚΥΚΛΑ ΜΟΝΟΤΕΡΠΕΝΙΑ γερανιόλη γερανιάλη ή α-κιτράλη νεράλη ή β-κιτράλη νερόλη κιτρονελόλη κιτρονελάλη λιναλοόλη μυρκένιο

26 β. Κυκλικά μονοτερπένια Ανάλογα με τον αριθμό των δακτυλίων, τα κυκλικά μονοτερπένια διακρίνονται σε : 1. Μονοκυκλικά μονοτερπένια 2. Δικυκλικά μονοτερπένια 3. Τρικυκλικά μονοτερπένια β1. Μονοκυκλικά μονοτερπένια Τα μονοτερπένια της δομής του π-μενθανίου που διαθέτουν δηλαδή σκελετό 1-μεθυλοϊσοπροπυλοκυκλοεξανίου, αποτελούν τη μεγαλύτερη ομάδα μονοτερπενίων. Στα μονοκυκλικά μονοτερπένια ανήκουν και αυτά με δομή π-μενθαδιενίου όπως το λιμονένιο, το α- τερπινένιο, το β-τερπινένιο, το τερπινολένιο, το α- και β- φελλανδρένιο. Μονοτερπένια όπως τα p-κυμένιο και τα υδροξυλιωμένα παράγωγά του, τη θυμόλη και το ισομερές αυτής την καρβακρόλη, τα συναντούμε πάντα μαζί με το α- και γ- τερπινένιο και την τερπιν-4-όλη. Επίσης συστατικά όπως η p-κυμεν-8-όλη και η κουμινιλική αλκοόλη προκύπτουν από το p-κυμένιο. Στην κατηγορία των μονοκυκλικών μονοτερπενίων ανήκουν και οι μονοτερπενικές αλκοόλες: α-τερπινεόλη, μενθόλη, ισοπουλεγόλη και cisεξαϋδροκουμινιλική αλκοόλη. Πίνακας 3: Μονοκυκλικά μονοτερπένια ΜΟΝΟΚΥΚΛΙΚΑ ΜΟΝΟΤΕΡΠΕΝΙΑ λιμονένιο καρβόνη μενθόλη τερπινεόλη Οι μονοτερπενικές κετόνες που ανήκουν σ' αυτή την ομάδα είναι η καρβόνη, η διυδροκαρβόνη, η ισομενθόνη, η πιπεριτόνη, η πουλεγόνη, ή πιπεριτενόνη και η ισοπουλεγόνη

27 Πίνακας 4: Moνοτερπενικές κετόνες ΜΟΝΟΤΕΡΠΕΝΙΚΕΣ ΚΕΤΟΝΕΣ καρβόνη διυδροκαρβόνη ισομενθόνη πιπεριτόνη πουλεγόνη ισοπουλεγόνη β2. Δικυκλικά μονοτερπένια Οι κυκλικοί αιθέρες 1,8-κινεόλη και 1,4-κινεόλη μαζί με την ασκαριδόλη είναι δικυκλικά οξυγονωμένα μονοτερπένια. Στην ομάδα αυτή ανήκουν επίσης τα μονοτερπένια της δομής του πινανίου (ακαι β- πινένιο) καθώς και η βορνεόλη, ο οξικός εστέρας του ισοβορνυλίου, το καμφένιο, η κάμφορα και η φενχόνη. Επίσης, μονοτερπένια της δομής του θουγιανίου (που έχουν στη δομή τους ένα δακτύλιο κυκλοπροπανίου [3,1,0]) α-θουγένιο, σαβινένιο, το cis ισομερές του ένυδρου σαβινενίου, η σαβινόλη, ο οξικός εστέρας του σαβινυλίου, η β-θουγιόνη και η ισοθουγιανόλη, ανήκουν στην ομάδα αυτή. Τέλος, στα δικυκλικά μονοτερπένια κατατάσσονται τα μονοτερπένια της δομής του καρενίου (που έχουν στη δομή τους ένα δακτύλιο κυκλοπροπανίου [4,1,0]) με κύριο εκπρόσωπο το δ-3- καρένιο

28 Πίνακας 5: Δικυκλικά μονοτερπένια ΔΙΚΥΚΛΙΚΑ ΜΟΝΟΤΕΡΠΕΝΙΑ α-πινένιο β-πινένιο 3-θουγένιο καμφορά β3. Τρικυκλικά μονοτερπένια Κύριος εκπρόσωπος των τρικυκλικών μονοτερπενίων είναι το τρικυκλένιο β. ΣΕΣΚΙΤΕΡΠΕΝΙΑ Τα σεσκιτερπένια είναι ακόρεστα συστατικά που σχηματίζονται με την προσθήκη ενός ισοπρενίου στο μόριο των μονοτερπενίων. Έχουν μοριακό τύπο C15H24. Η δομή τους μπορεί να είναι ευθεία, διακλαδισμένη ή κυκλική. Τα κυκλικά σεσκιτερπένια διακρίνονται σε μονοκυκλικά, δικυκλικά και τρικυκλικά. α. Άκυκλα σεσκιτερπένια Εκπρόσωποι αυτής της ομάδας είναι το β-φαρνεσένιο που είναι συστατικό του λυκίσκου, το α-φαρνεσένιο που είναι το δομικό ισομερές του (structural isomer) και η φαρνεσόλη η οποία συνήθως απαντάται στα αιθέρια έλαια των ανθέων όπως του τριαντάφυλλου και του κυκλάμινου. α-φαρνεσένιο β-φαρνεσένιο

29 Σχήμα 6: Ισομερείς μορφές της φαρνεσόλης Ακόμα συχνά απαντώμενο άκυκλο σεσκιτερπένιο είναι η νερολιδόλη, ισομερές της φαρνεσόλης που στη φύση βρίσκεται συνήθως με την Ε- ισομερή μορφή παρά με τη Ζ-. Σχήμα 7: Άκυκλα σεσκιτερπένια β. Κυκλικά σεσκιτερπένια β1. Μονοκυκλικά σεσκιτερπένια Στην κατηγορία αυτή ανήκουν τα σεσκιτερπένια τύπου μπισαμπολενίου καθώς και τα οξυγονωμένα παράγωγά του α- μπισαμπολόλη και β-μπισαμπολόλη τα οποία αποτελούν κύρια συστατικά του αιθερίου ελαίου του χαμομηλιού. Ένας άλλος εκπρόσωπος της ομάδας των μονοκυκλικών σεσκιτερπενίων είναι το ζινγκιμπερένιο που αποτελεί κύριο συστατικό του αιθερίου ελαίου της αρμπαρόριζας. Στον πίνακα 6 φαίνονται οι δομές κάποιων μονοκυκλικών σεσκιτερπενίων

30 Πίνακας 6: Μονοκυκλικά σεσκιτερπένια ΜΟΝΟΚΥΚΛΙΚΑ ΣΕΣΚΙΤΕΡΠΕΝΙΑ α-μπιζαμπολόλη αμπσκισικό οξύ γ-μπιζαμπολένιο β2. Δικυκλικά σεσκιτερπένια Κύριος εκπρόσωπος της ομάδας των δικυκλικών σεσκιτερπενίων είναι το καδινένιο το οποίο απαντάται με τρεις ισομερείς μορφές α- καδινένιο, γ-καδινένιο και δ-καδινένιο. Τα α-, β-, γ- και δ-σελινένια ανήκουν στην ομάδα των δικυκλικών σεσκιτερπενίων και είναι συστατικά του αιθερίου ελαίου του σέλινου. Τέλος, γνωστή ομάδα ενώσεων που ανήκει στην κατηγορία αυτή είναι τα αζουλένια, τα οποία ευθύνονται για το μπλε χρώμα των αιθερίων ελαίων των οποίων αποτελούν συστατικά. Κύριος εκπρόσωπος της ομάδας αυτής είναι το χαμαζουλένιο. Πίνακας 7: Δικυκλικά σεσκιτερπένια ΔΙΚΥΚΛΙΚΑ ΣΕΣΚΙΤΕΡΠΕΝΙΑ α-καδινένιο α-καδινόλη α-σελινένιο epi-α καδινόλη

31 β3. Διάφορα σεσκιτερπένια Στην κατηγορία αυτή ανήκουν τα παράγωγα του καρυοφυλλενίου, το β-καρυοφυλλένιο (ή trans-καρυοφυλλένιο) και το χουμουλένιο. Πίνακας 8: Διάφορα σεσκιτερπένια ΔΙΑΦΟΡΑ ΣΕΣΚΙΤΕΡΠΕΝΙΑ β-καρυοφυλλένιο γ. ΔΙΤΕΡΠΕΝΙΑ Οξείδιο του καρυοφυλλενίου κεδρένιο Συνένωση κεφαλής ουράς τεσσάρων μονάδων ισοπρενίου οδηγεί στην δημιουργία των διτερπενίων (C20H32). Για την παραλαβή τους με τη μέθοδο της απόσταξης απαιτείται μεγαλύτερος χρόνος (όπως και για τα σεσκιτερπένια), καθώς είναι βαρύτερα από τα μονοτερπένια. Τυπικοί εκπρόσωποι της ομάδας αυτής είναι η φυτόλη, μία άκυκλη διτερπενική αλκοόλη, η οποία απαντάται σε δύο ισομερής μορφές την trans- φυτόλη και τη cis φυτόλη και η μανουλοόλη μια δικυκλική διτερπενική αλκοόλη ΦΑΙΝΥΛΟΠΡΟΠΑΝΟΕΙΔΗ Βιοσύνθεση φαινυλοπροπανοειδών Ο κύκλος του σικιμικού οξέος από την άλλη οδηγεί στη σύνθεση των φαινυλοπροπανοειδών. Οδηγεί αρχικά στην παραγωγή της φανυλαλανίνης (αρωματικό αμινοξύ) το οποίο μέσω του ενζύμου λυάση της φαινυλαλανίνης (PAL) δρα επί του αζώτου του αμινοξέος και μετατρέπεται σε trans-κινναμωμικό οξύ. Αυτό το βιοχημικό μονοπάτι οδηγεί στη βιοσύνθεση αλκαλοειδών, λιγνανών,

32 φλαβονοειδών και κουμαρινών. Τα φαινυλοπροπανοειδή αποτελούν τα απλούστερα παράγωγα του κινναμωμικού οξέος. Μετατροπές επί αυτού του μορίου αφορούν την απώλεια οξυγόνου από την πλευρική αλυσίδα είτε στη θέση του διπλού δεσμού της ίδιας αλυσίδας. Η θέση του διπλού δεσμού καθορίζει το σχηματισμό των δύο ισομερών της ανηθόλης και της εστραγόλης (Hay & Waterman, 1993). Σχήμα 8 : Βιοσύνθεση των φαινυλοπροπανοειδών (Γαρδέλη, 2009)

33 1.5 ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΚΑΙ ΤΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ Γενικά Τα αιθέρια έλαια μαζί με τα αλκαλοειδή και τα φαινολικά συστατικά είναι σημαντικά προϊόντα του δευτερογενούς μεταβολισμού του φυτού. Η αξία τους κρίνεται τόσο από τη μέχρι σήμερα γνωστή χρήση τους από τη βιομηχανία φαρμάκων, τροφίμων και αρωμάτων αλλά και από τις αντιμικροβιακές και αντιοξειδωτικές ιδιότητές τους που ενισχύουν τη χρήση των αιθερίων ελαίων στα τρόφιμα. Καθίσταται έτσι τις περισσότερες φορές απαραίτητο να είναι γνωστή η κατάλληλη εποχή συλλογής ώστε να επιτυγχάνεται η επιθυμητή σύσταση και απόδοση σε αιθέριο έλαιο. Για να είναι αυτό εφικτό θα πρέπει να γνωρίζουμε τους παράγοντες που επηρεάζουν τη χημική σύσταση καθώς και την απόδοση του αιθερίου ελαίου στα φυτά (Figueiredo et al. 2008). Στη συνέχεια θα γίνει ανάλυση των παραγόντων αυτών μια και παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον Μεταβολές στη φυσιολογία του φυτού Οι μεταβολές στη φυσιολογία του φυτού αφορούν: Το στάδιο ανάπτυξης των οργάνων (φύλλα, άνθη, καρποί) Το μέρος του φυτού (φύλλα, άνθη, κλπ) που αναλύεται Το εκκριτικό όργανο που παράγει τα αιθέρια έλαια Την εποχική διακύμανση Τις μηχανικές και χημικές βλάβες Το στάδιο ανάπτυξης των οργάνων Το στάδιο ανάπτυξης των οργάνων του φυτού (φύλλα, άνθη, καρποί) είναι καθοριστικό για τη σύσταση του αιθερίου ελαίου του φυτού. Στις περισσότερες περιπτώσεις η απόδοση σε αιθέριο έλαιο είναι αυξημένη τη περίοδο της ανθοφορίας. Ταυτόχρονα, η αναλογία κάποιων συστατικών αυξάνεται από 10% που μπορεί να βρισκόταν στα αρχικά στάδια, σε 50-70% στο στάδιο πλήρους άνθησης. Σύμφωνα με τους Manez et al. (1991) οι αλλαγές που παρατηρούνται στη σύσταση των πτητικών συστατικών κατά την ωρίμανση των οργάνων οφείλονται σε αντιδράσεις κυκλοποίησης και αφυδάτωσης των συστατικών

34 Το μέρος του φυτού που αναλύεται Στις περισσότερες περιπτώσεις η σύσταση του αιθερίου ελαίου εξαρτάται από το μέρος του φυτού που αναλύεται: άνθη, πράσινα μέρη (φύλλα, βλαστοί), φλοιοί, ολόκληροι καρποί, περικάρπιο ή μόνο σπόροι, ρίζες κ.ά. Στο είδος για παράδειγμα Achillea ptarmica, έχει βρεθεί ότι τα μονοτερπένια υπάρχουν μόνο στα άνθη και σχεδόν καθόλου στα πράσινα μέρη και τις ρίζες. Υψηλές συγκεντρώσεις μονοτερπενίων, κυρίως α-φελλανδρενίου, λιμονενίου και φενχόνης στο αιθέριο έλαιο των ανθέων, σχετίζονται με τη διαδικασία της επικονίασης. Η συγκέντρωση των τερπενίων είναι γενικά μεγαλύτερη στα αναπαραγωγικά όργανα, συνήθως, στην περίοδο πριν και κατά τη διάρκεια της άνθησης. Επίσης, εξαιτίας του προστατευτικού ρόλου που παρέχουν στο φυτό έναντι φυσικών εχθρών, η συγκέντρωσή τους είναι αυξημένη στα νεαρά όργανα παρά στα ώριμα To εκκριτικό όργανο που παράγει τα αιθέρια έλαια Οι διαφορές στη σύσταση του αιθερίου ελαίου στα διάφορα μέρη του φυτού μπορεί να εξηγηθεί εν μέρει και από την ετερογενή κατανομή των εκκριτικών οργάνων (τριχίδια, πόροι) στο φυτό. Συχνά από τα όργανα αυτά δεν εκκρίνονται τα ίδια συστατικά, ενώ μπορεί και ο μηχανισμός έκκρισης να είναι διαφορετικός ή ακόμα και να μην αναπτύσσονται ταυτόχρονα σε όλα τα μέρη του φυτού. Το είδος και η θέση των οργάνων αυτών είναι χαρακτηριστικά για κάθε οικογένεια Εποχική διακύμανση Σε πολλά είδη η σύσταση του αιθερίου ελαίου τους μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια του έτους, γεγονός που καθορίζει και την εποχή συλλογής του φυτού. Έτσι, ανάλογα με την εποχή παρατηρούνται αλλαγές στη ταυτότητα του κύριου συστατικού ή ακόμα και της κύριας ομάδας. Συχνά οι μεταβολές στη σύσταση όσο και στην απόδοση σε αιθέριο έλαιο συνδέονται με τις καιρικές συνθήκες που επικρατούν τους διάφορους μήνες του έτους (διάρκεια ηλιοφάνειας, θερμοκρασία, υγρασία) ή ακόμα και με επιμολύνσεις από παθογόνους μικροοργανισμούς (ιδιαίτερα κατά τους μήνες με υψηλή βροχόπτωση)

35 Σε κάθε περίπτωση η εποχή συλλογής επιλέγεται βάσει του επιθυμητού συνδυασμού σύστασης και απόδοσης σε αιθέριο έλαιο Μηχανικές και χημικές βλάβες Η συγκέντρωση των δευτερογενών μεταβολιτών στο φυτό επηρεάζεται από πληγές ή προσβολές που μπορεί να προκληθούν από αρπακτικά πτηνά ή ακόμα και από την εφαρμογή ζιζανιοκτόνων. Στις περιπτώσεις αυτές νέα συστατικά μπορεί να παραχθούν ή ακόμα μπορεί να παρατηρηθεί αύξηση της συγκέντρωσης ή/ και αλλαγή στις αναλογίες των ήδη υπαρχόντων συστατικών. Η αντίδραση ενός υγιούς φυτού σε οποιοδήποτε είδος μηχανικής ή χημικής βλάβης εξαρτάται επιπλέον και από το στάδιο ανάπτυξης του φυτού, τη διαθεσιμότητα του νερού, την ηλιοφάνεια κλπ Περιβαλλοντικοί παράγοντες Το κλίμα Η παραγωγή των αιθερίων ελαίων εξαρτάται άμεσα από τις κλιματικές συνθήκες που επικρατούν στο περιβάλλον ανάπτυξης του φυτού. Το κλίμα είναι ίσως ο μοναδικός παράγοντας που δεν μπορεί να ελέγξει ο άνθρωπος γι' αυτό και θεωρείται καθοριστικός στην ποιότητα των αιθερίων ελαίων. Οι Turtola et al. (2003) έδειξαν ότι υπό συνθήκες ξηρασίας η συγκέντρωση των τερπενίων αυξάνεται, ενώ μειώνεται η ανάπτυξη στα φυτά Pinus sylvestris και Picea abies. Στα είδη Coriandrum sativum και Thymus vulgaris η απόδοση σε αιθέριο έλαιο αυξάνει με την αύξηση της άρδευσης. Σε συνθήκες ξηρασίας μειώνεται η φωτοσυνθετική δραστηριότητα των φυτών και μεταβάλλεται η ικανότητα πρόσληψης θρεπτικών συστατικών. Κάτω από τέτοιες συνθήκες stress τα φυτά είναι πιο επιρρεπή σε παθογόνους οργανισμούς και φυτοφάγα ζώα Γεωγραφική θέση Από πολλές βιβλιογραφικές αναφορές επιβεβαιώνεται ότι συχνά τόσο η απόδοση όσο και η σύσταση του αιθερίου ελαίου για το ίδιο είδος φυτού εξαρτάται από τη γεωγραφική θέση της καλλιέργειας. Έτσι, στη βιβλιογραφία παρατηρείται μία αξιοσημείωτη ποικιλότητα στην περιεκτικότητα των συστατικών αιθερίου ελαίου σε κάποια είδη φυτών (π.χ. Τhymus vulgaris) που υποδηλώνει την ύπαρξη

36 χημειοτύπων. Η ύπαρξη χημειοτύπων είναι το αποτέλεσμα διαφορών στις περιβαλλοντικές συνθήκες, στις συνθήκες καλλιέργειας (γεωγραφικό ύψος, ηλιοφάνεια, τύπος εδάφους), οι οποίες καταλήγουν και σε γενετικές διαφοροποιήσεις των ειδών (Nemeth, 2005) Γενετικοί παράγοντες Η παραγωγή και η χημική σύσταση των αιθερίων ελαίων από τα φυτά είναι γενετικά καθορισμένη. Ωστόσο, μικρές διαφορές στο γονότυπο ατόμων του ίδιου είδους επηρεάζουν σημαντικά τη χημική σύσταση των δευτερογενών μεταβολιτών (δημιουργία χημειοτύπων), χωρίς να μεταβάλλουν την μορφολογία του (Nemeth, 2005) O ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΣΤΑ ΦΥΤΑ Η βιολογική δραστικότητα των αιθερίων ελαίων στα φυτά είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με τα συστατικά από τα οποία αποτελούνται τα τελευταία. Έτσι όπως προειπώθηκε τα τερπένια είναι τα κυριότερα συστατικά των αιθερίων ελαίων και σ' αυτά στηρίζεται κυρίως η βιολογική δράση αυτών. Έτσι ορισμένα τερπένια θεωρούνται, λόγω του ζωτικού ρόλου που επιτελούν, ως πρωτογενείς μεταβολίτες, όπως ορισμένες φυτορμόνες (αμπσισικό οξύ (C15) και γιββερελλίνες (C20)) (Taiz & Zaiger, 1998), συστατικά των μεμβρανών (στερόλες (C30) (Seigler, 1998) και φωτοσυνθετικές και φωτοπροστατευτικές χρωστικές (φυτόλη στο μόριο της χλωροφύλλης και καροτενοειδή (C40)) (Taiz & Zaiger, 1998). Ωστόσο στην πλειονότητά τους τα τερπένια αποτελούν δευτερογενείς μεταβολίτες. Σημαντική είναι η βιολογική δράση των αιθερίων ελαίων ως αλληλοπαθητικών δραστικών ουσιών, απωθητικών ή ως προσελκυστικών, στην φυτοπαθογόνο/φυτοφάγο αλληλεπίδραση (Κατσιώτης & Χατζοπούλου, 2010). Παρατηρήθηκε ότι γύρω από αρωματικά φυτά, όπως ή Σάλβια η λευκόφυλλος (Salvia leucophylla), η αρτεμίσια η καλιφορνική (Artemisia californica), όπως και το φυτό που μελετούμε, η D. viscosa (Parolin et al., 2014), δε φύτρωναν ετήσια φυτά, σε διάμετρο 90cm, ενώ σε απόσταση 2-6m η παρουσία τους ήταν περιορισμένη. Εξαιτίας αυτού του φαινομένου βρέθηκε ότι πτητικά συστατικά (κινεόλη, καμφορά, πινένιο, θουγιόνη), που

37 απελευθερώνονται από τα φυτικά είδη, δρουν ως αναστολείς της φύτρωσης στο εγγύς περιβάλλον των φυτών. Τα τερπένια εκπέμπονται κατά τη διάρκεια θερμών περιόδων και συμπυκνώνονται στην επιφάνεια του εδάφους γύρω από τα φυτικά είδη. Μια ακόμα δράση που έχει παρατηρηθεί αφορά στην άμυνα και στην επούλωση πληγών σε είδη κωνοφόρων δέντρων. Σε συνδυασμό με τις ρητίνες που εκκρίνουν τα κωνοφόρα δέντρα σε περίπτωση τραυματισμού, συντελούν στην επούλωση της πληγής και επομένως στην αποφυγή της εισόδου παθογόνων παραγόντων. Τα αιθέρια έλαια προσελκύουν τα έντομα που μαζεύουν τη γύρη και βοηθούν έτσι στην αναπαραγωγή και επικονίαση. Αυτό οφείλεται σε ορισμένα μονοτερπένια, συστατικά των αιθερίων ελαίων, που δρουν ως φερομόνες. Τέτοια είναι η γερανιόλη, το μυρκένιο, το α- και β-πινένιο (Pichersky & Gershenzon, 2000). Επιπλέον πτητικά μονοτερπένια που εκκρίνονται κατά τη διάρκεια φυτοφάγου δραστηριότητας ή δραστηριότητας εντόμων λειτουργούν ως αποτρεπτικά ή αντιβιοτικά για τα φυτά. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα αιθέρια έλαια λόγω των διαφόρων συστατικών που περιέχουν έχουν αντισηπτικές ιδιότητες και ενεργούν κατά των βακτηρίων, μυκήτων και ζυμών (Seca et al., 2014). Αποδεδειγμένη με πολλές μελέτες είναι και η αντιοξειδωτική δράση των αιθερίων ελαίων (Ghalen et al., 2015). Τέλος, σημαντική είναι και η βιολογική δράση τους που σχετίζεται με την θερμοανθεκτικότητα των φυτών. Τα αιθέρια έλαια είναι πρόδρομες ουσίες δραστικών μεταβολιτών και μειώνουν την απώλεια του νερού με την διαπνοή. Φυτά σε ακραία περιβάλλοντα συχνά πρέπει να ανταπεξέλθουν σε ακραίες θερμοκρασίες. Η σύνδεση μεταξύ της συγκέντρωσης των τερπενίων και της θερμοαντοχής οδήγησε στην εικασία ότι αυτά τα συστατικά αυξάνουν την αντοχή στη θερμότητα αλληλεπιδρώντας με τις μεμβράνες των φυτών (Grassmann et al., 2003 & Pare et al., 1999)

38 1.7. ΚΥΡΙΕΣ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ Τα αιθέρια έλαια, λόγω της ετερογενούς και πολυποίκιλης σύστασής τους, εμφανίζουν ενδιαφέρουσες και σημαντικές θεραπευτικές ιδιότητες, βρίσκοντας ολοένα και ευρύτερη χρήση στην Φαρμακευτική επιστήμη. Συγκεκριμένα τα αιθέρια έλαια, ανάλογα με τη σύστασή τους, εμφανίζουν τις εξής ιδιότητες: Αναλγητικές, αντιφλεγμονώδεις, αντιτοξικές, υπεραιμικές. Ανοσοδιεγερτικές, ορμονικές. Αντισηπτικές, αντιβακτηριακές, αντιιικές, αντιμυκητιασικές. Αποσμητικές. Αποχρεμπτικές. Εντομοκτόνες, απωθητικές. Επουλωτικές. Σπασμολυτικές, χωνευτικές, διουρητικές. Χαλαρωτικές, κατασταλτικές, αντικαταθλιπτικές (Steflitsch & Steflitsch, 2008). Μπορούν να χρησιμοποιηθούν εσωτερικά και εξωτερικά με τρεις κυρίως τρόπους: 1. Δια της εισπνοής και της αίσθησης της όσφρησης. 2. Εξωτερικά δια του δέρματος, με τη μορφή χρισμάτων, αλοιφών, γελών, φυραμάτων. 3. Εσωτερικά, σε θεραπευτικές δόσεις, με τη μορφή σιροπιών, καψακίων, βαμμάτων. Έτσι τα αιθέρια έλαια βρίσκουν εφαρμογή αφενός στην Φαρμακευτική, ως συστατικά σκευασμάτων με φαρμακολογική δράση ή ως βελτιωτικά οσμής και γεύσης σε διάφορα σκευάσματα,

39 και αφετέρου στην Κοσμητολογία, ως συστατικά καλλυντικών. Επίσης, τα τελευταία χρόνια είναι ιδιαίτερα διαδεδομένη η Αρωματοθεραπεία, μια μέθοδος εναλλακτικής ιατρικής, που βασίζεται στην χαλάρωση και ανακούφιση των συμπτωμάτων κάποιων παθήσεων, με την εφαρμογή των αιθερίων ελαίων στο δέρμα (μασάζ), με κατάποση ή απλά με εισπνοές μετά από διάχυση του ελαίου στο χώρο. Και στις τρεις περιπτώσεις συμμετέχει η αίσθηση της όσφρησης, που είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με τον ορισμό της Αρωματοθεραπείας. Τα αιθέρια έλαια κατά τη χρήση τους αραιώνονται σε κάποια οργανική (λάδι) ή υδατική βάση. Σε περίπτωση που χρησιμοποιηθούν ως έχουν, είναι πιθανή η πρόκληση ερεθισμού ή εγκαυμάτων στο δέρμα. Αυτό οφείλεται στην υψηλή συγκέντρωση συστατικών που τα χαρακτηρίζει. Επίσης, η χρόνια χρήση σε υψηλές δόσεις ορισμένων από αυτά μπορεί να οδηγήσει σε χρόνιες δηλητηριάσεις. Είναι προτιμότερο η χρήση τους να αποφεύγεται από εγκύους, μωρά κι επιληπτικούς. Αξίζει να σημειωθεί, πως τα σκευάσματα των αιθερίων ελαίων πρέπει να διατηρούνται κατά τη χρήση τους σε δροσερό μέρος και μακριά από το φως, καθώς υπάρχει κίνδυνος αλλοίωσης της σύστασής τους με αποτέλεσμα μειωμένη ποιότητα και κατά συνέπεια μειωμένο θεραπευτικό-φαρμακευτικό αποτέλεσμα (Κατσιώτης & Χατζοπούλου 2010). 2. ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΑΡΑΛΑΒΗΣ ΤΩΝ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ Τα αιθέρια έλαια παραλαμβάνονται από τα φυτικά υλικά με διάφορους τρόπους. Μεταξύ αυτών οι πιο γνωστοί και κλασσικοί παραμένουν η απόσταξη, η εκχύλιση και η μηχανική εκπίεση. Υπάρχουν βέβαια και νέες τεχνικές όπως η εκχύλιση με υπέρηχους και με μικροκύματα. 2.1 ΑΠΟΣΤΑΞΗ Η απόσταξη είναι η πιο απλή, οικονομική και ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος παραλαβής αιθερίων ελαίων από όλα σχεδόν τα αρωματικά φυτά. Η μέθοδος εφαρμόζεται από την αρχαιότητα, και μάλιστα το πρώτο αιθέριο έλαιο που παραλήφθηκε με αυτό τον τρόπο ήταν το τερεβινθέλαιο. Η απόσταξη των αιθέριων ελαίων φυσικοχημικά είναι απόσταξη μη μιγνυομένων υγρών,

40 δηλαδή ετερογενών μιγμάτων, κατά την οποία τα διάφορα συστατικά παραλαμβάνονται σε χαμηλότερες θερμοκρασίες από του σημείου βρασμού του εκάστου. Κατά την παραλαβή αιθέριου ελαίου με απόσταξη, το φυτικό υλικό φέρεται στον άμβυκα και αποστάζει είτε με παραγόμενους από το νερό του άμβυκα υδρατμούς είτε με διοχέτευση υδρατμών από ατμολέβητα. Οι ατμοί του αιθέριου ελαίου και νερού που παράγονται εισέρχονται μέσω του απαγωγού σωλήνα στον ψυκτήρα όπου και υγροποιούνται. Το λαμβανόμενο με αυτό τον τρόπο απόσταγμα ρέει στο διαχωριστικό δοχείο όπου διαχωρίζεται το νερό από το αιθέριο έλαιο. Κατά την συμπύκνωση, το αιθέριο έλαιο επειδή έχει διαφορετικό ειδικό βάρος από το νερό, διαχωρίζεται από αυτό και έτσι σχηματίζονται δυο φάσεις, μια του αιθερίου ελαίου και μια του νερού. Εκτός του πρωτεύοντος προϊόντος (αιθερίου ελαίου), παραλαμβάνεται και η υδατική φάση που είναι εμπλουτισμένη με το φυτικό άρωμα και είναι ένα χρήσιμο επιπλέον προϊόν της απόσταξης. Έτσι, σε γενικές γραμμές παράγεται το αρωματικό ύδωρ λουλουδιών ή εσπεριδοειδών. Το αρωματικό τους αποτέλεσμα βέβαια απέχει πολύ από εκείνο του αρωματικού αιθερίου ελαίου. Η απόσταξη ανάλογα με τον τρόπο που γίνεται διακρίνεται σε τρία είδη: α) Απόσταξη με νερό β) Απόσταξη με νερό και υδρατμούς γ) Απόσταξη με υδρατμούς (Γαρδέλη, 2009)

41 Εικόνα 3: Μέθοδοι απόσταξης. (Αmit Tandom, RK-Essential Oils Company) Εικόνα 4: Υδροαπόσταξη στο εργαστήριο α) Απόσταξη με νερό. Κατά την απόσταξη με νερό, το φυτικό υλικό φέρεται στον άμβυκα όπου υπάρχει νερό και θερμαίνεται. Το χαρακτηριστικό της απόσταξης αυτής είναι ότι το υπό απόσταξη φυτικό υλικό βρίσκεται σε άμεση επαφή με το νερό που βράζει. Το υλικό ανάλογα με το ειδικό του βάρος και την εκάστοτε φόρτωση του άμβυκα, επιπλέει ή βρίσκεται βυθισμένο στο νερό. Αυτή η μέθοδος εφαρμόζεται σε υλικά όπως τρίμματα αμυγδάλων, ροδοπέταλα, άνθη πορτοκαλιάς κτλ. Επειδή παρόμοια υλικά πρέπει να αιωρούνται στο νερό και να κινούνται ελεύθερα κατά την απόσταξη, δεν μπορούν να αποσταχθούν με υδρατμούς διότι σχηματίζουν συμπαγείς μάζες (βώλους) μέσα από τις οποίες δε

42 μπορεί να διεισδύσει ο ατμός. Σημασία σε αυτού του είδους την απόσταξη έχουν: H σωστή πλήρωση του άμβυκα Η ταχύτητα της απόσταξης Η αποφυγή υπερθέρμανσης του φυτικού υλικού Η μεγάλη επιφάνεια εξατμίσεως (ο άμβυκας που χρησιμοποιείται προτιμάται να είναι μικρού ύψους και μεγάλης διαμέτρου) Πλεονεκτήματα της μεθόδου αυτής είναι ότι είναι απλή, οικονομική και χρησιμοποιείται εύκολα, αλλά έχει και μεταξύ των άλλων και το μειονέκτημα ότι απαιτείται μεγαλύτερος χρόνος απόσταξης (Κατσιώτης & Χατζοπούλου, 2010). β) Απόσταξη με νερό και υδρατμούς. Στη μέθοδο αυτή το νερό δεν έρχεται σε επαφή με το φυτικό υλικό αλλά τοποθετείται σε πλέγμα που βρίσκεται λίγο πιο ψηλά από την επιφάνειά του. Έτσι, η απόσταξη πραγματοποιείται με τους ατμούς, πράγμα που αποτελεί πλεονέκτημα της μεθόδου. Το νερό θερμαίνεται με έναν από τους γνωστούς τρόπους. Έτσι, ο ατμός που διέρχεται από το υλικό και συμπαρασύρει το αιθέριο έλαιο είναι κορεσμένος, υγρός και χαμηλής πίεσης. Με αυτόν τον τρόπο, επιτυγχάνεται ο ατμός να μην είναι ποτέ υπερθερμασμένος και το φυτικό υλικό να μην έρχεται ποτέ σε επαφή με το νερό που βράζει. Συνήθως χρησιμοποιείται σε μικρής κλίμακας αποστάξεις. Σαν μειονέκτημα μπορεί να αναφερθεί αφ' ενός μεν η μεγάλη διάρκεια της απόσταξης και αφετέρου η μικρότερη απόδοση σε αιθέριο έλαιο σε σχέση με τη μέθοδο με τους υδρατμούς (Κατσιώτης & Χατζοπούλου, 2010). γ) Απόσταξη με υδρατμούς. Πρόκειται για τον κατεξοχήν εφαρμοζόμενο τρόπο παραγωγής αιθέριων ελαίων στη βιομηχανία. Χρησιμοποιούνται άμβυκες 2-3 τόνων (φυτικού υλικού), όπου δεν εισάγεται καθόλου νερό, αλλά ατμός που παράγεται από ατμογεννήτρια και διοχετεύεται υπό πίεση μεγαλύτερης της ατμοσφαιρικής. Η εισαγωγή του γίνεται με σωλήνωση, από τον πυθμένα του άμβυκα, που φέρει πολλές οπές, δια των οποίων ο ατμός κατανέμεται ομοιόμορφα σε όλη τη μάζα του φυτικού υλικού το οποίο συγκρατείται από μεταλλικό πλέγμα λίγο πιο πάνω από τον πυθμένα του άμβυκα. Η πίεση του ατμού πρέπει να ρυθμίζεται κατάλληλα σε κάθε απόσταξη ανάλογα με το είδος του φυτικού

43 υλικού. Έχει το πλεονέκτημα, σε σχέση με τους δυο άλλους τρόπους, ότι το λαμβανόμενο αιθέριο έλαιο είναι καλύτερης ποιότητας και με μεγάλη σχετικά απόδοση, ενώ ως μειονέκτημα μπορεί να θεωρηθεί η μεγαλύτερη δυσκολία εγκατάστασης και μετακίνησης του συγκεκριμένου αποστακτικού συγκροτήματος (Κατσιώτης & Χατζοπούλου, 2010). 2.2 ΕΚΧΥΛΙΣΗ Μια άλλη κοινή και αρκετά συχνά εναλλακτική μέθοδος παραλαβής των αιθέριων ελαίων είναι η εκχύλιση. Η μέθοδος έγκειται στη διαβροχή του φυτικού υλικού με τα κατάλληλα εκχυλιστικά μέσα (διαλύτες ή άλλα) στα οποία είναι πλήρως διαλυτά τα αιθέρια έλαια. Από το εκχυλισμένο υλικό το αιθέριο έλαιο επανακτάται με διάφορους τρόπους, συμβατούς με τη φύση και τη σταθερότητα των εμπεριεχομένων συστατικών και αποτελεί το συμπύκνωμα (κονκρέτα). Έτσι, είναι δυνατό να χρησιμοποιηθεί: α) οργανικός διαλύτης αρκετά πτητικός (πετρελαϊκός αιθέρας) ο οποίος ακολούθως απομακρύνεται β) έλαιο ή λίπος στα οποία το αιθέριο έλαιο διαχέεται. Η επανάκτηση γίνεται με εκπλύσεις του εκχυλίσματος με αιθανόλη στην οποία δεν είναι διαλυτό το λίπος, ή με άλλες διαδικασίες καθαρισμού. Η μέθοδος παραλαβής με εκχύλιση προτιμάται όταν η απόσταξη προκαλεί αλλοιώσεις σε ορισμένα συστατικά ή τη διάσπαση ορισμένων χημικών ομάδων των συστατικών, με αποτέλεσμα να παραλαμβάνεται αιθέριο έλαιο με οργανοληπτικά χαρακτηριστικά υποδεέστερα εκείνων του αρχικού φυτικού υλικού (Κατσιώτης & Χατζοπούλου, 2010). α) Εκχύλιση με διαλύτες. Η διαδικασία εκχύλισης με πτητικούς διαλύτες είναι απλή. Στην περίπτωση π.χ. των φρέσκων ανθέων αυτά εισάγονται σε ειδικά κατασκευασμένους εκχυλιστήρες και εκχυλίζονται συνεχώς σε θερμοκρασία δωματίου με πολύ καθαρό διαλύτη, συνήθως πετρελαϊκό αιθέρα. Ο διαλύτης εισέρχεται στους ιστούς του φυτικού υλικού και παραλαμβάνει τα πτητικά συστατικά του φυσικού αρώματός του. Μαζί όμως παραλαμβάνει και κηρούς, αλβουμίνες και χρωστικές ουσίες (στα ίχνη των τελευταίων, που παραμένουν ως και το τελικό στάδιο επεξεργασίας, οφείλεται και το σκοτεινό χρώμα των τελικών προϊόντων που λαμβάνονται με αυτή την μέθοδο). Ακολούθως, το διάλυμα μέσω αντλίας διοχετεύεται σε εξατμιστήρα και συμπυκνώνεται σε χαμηλή θερμοκρασία. Το προϊόν που τελικά παραλαμβάνεται μετά την πλήρη απομάκρυνση του διαλύτη υπό κενό, και περιέχει κατά κύριο λόγο το αιθέριο έλαιο,

44 ονομάζεται κονκρέτα ή σύγκριμα. Η θερμοκρασία καθ' όλη τη διαδικασία διατηρείται όσο το δυνατόν χαμηλότερη. Σε σύγκριση με τα αποσταγμένα αιθέρια έλαια, τα εκχυλισμένα αντιπροσωπεύουν το πραγματικό άρωμα του φυτικού υλικού από το οποίο προέρχονται. Όμως, λόγω του υψηλού κόστους τους η μέθοδος αυτή εφαρμόζεται σε υψηλής προστιθέμενης αξίας φυτικά υλικά (Κατσιώτης & Χατζοπούλου, 2010). β) Εκχύλιση με κρύο λίπος (enfleurage). Πρόκειται για μια πολύ παλιά μέθοδο απομόνωσης πτητικών συστατικών από αρωματικάευωδιάζοντα και ευαίσθητα φυτικά υλικά, όπως π.χ. το γιασεμί, και η οποία κατά γενική αποδοχή δίνει τελικό προϊόν που πλησιάζει, περισσότερο από κάθε άλλη μέθοδο, το πραγματικό άρωμα του φυτικού υλικού απ' όπου προέρχεται. Αναπτύχθηκε και παραμένει χαρακτηριστικό Εικόνα 5: enfleurage της περιοχής Grasse της Ν. Γαλλίας. Ορισμένα άνθη (γιασεμί, πολυανθές) συνεχίζουν τις φυσιολογικές τους δραστηριότητες, παράγοντας και εκπέμποντας άρωμα, ακόμη και μετά τη συλλογή τους. Το λίπος, παράλληλα, διαθέτει μεγάλη ικανότητα να απορροφά και να συγκρατεί τα πτητικά συστατικά που αποτελούν το άρωμα ενός φυτικού υλικού, εάν έρθει σε επαφή με αυτό. Με βάση αυτά τα στοιχεία αναπτύχθηκε και εφαρμόστηκε η τεχνική enfleurage. Κατ' αυτήν, τα φρέσκα συλλεχθέντα άνθη (καθ' όλη τη διάρκεια της συγκομιδής που διαρκεί 8-10 εβδομάδες) καθημερινά στρώνονται σε επιφάνειες ενός λεπτού στρώματος λίπους που βρίσκεται πάνω σε πλάκες γυαλιού. Αφήνονται για 24 ώρες και κατόπιν αυτά αφαιρούνται και προστίθενται νέα άνθη, που μόλις έχουν συλλεχθεί. Το λίπος που χρησιμοποιείται πρέπει να είναι απόλυτα καθαρό και άοσμο ενώ η συνοχή και η υφή του πρέπει να είναι ημίσκληρη. Συνήθως χρησιμοποιείται μίγμα χοιρινού και βοδινού λίπους σε αναλογία 2:1. Στο τέλος της συγκομιδής το λίπος, που δεν έχει ανανεωθεί κατά τη διάρκεια της διαδικασίας, είναι πλέον κορεσμένο από τα πτητικά συστατικά. Το κορεσμένο λίπος (pomade) διατίθεται στο εμπόριο ή υφίσταται εκχύλιση με αιθανόλη για την παραλαβή του αιθέριου ελαίου. Η αρχή αυτής της ανάκτησης έγκειται στην πολλαπλή εκχύλιση της πομάδας με αλκοόλη, με σκοπό την

45 παραλαβή εξ' ολοκλήρου των πτητικών συστατικών από την πομάδα και τον συνεχή εμπλουτισμό της αλκοόλης. Παραλαμβάνεται έτσι, το extrait d' enfleurage. Αυτό στη συνέχεια ψύχεται στους -15 ο C και ακολούθως διηθείται για την απομάκρυνση των υπολειμμάτων λίπους από το αλκοολικό μέσον (Κατσιώτης & Χατζοπούλου, 2010). γ) Εκχύλιση με ζεστό λίπος (maceratio). Σε αντίθεση με την προηγούμενη μέθοδο, αυτή χρησιμοποιείται για φυτικά υλικά που σταματούν τις φυσιολογικές τους δραστηριότητες (παραγωγή αρώματος) αμέσως μετά τη συλλογή τους -τριαντάφυλλα, άνθη πορτοκαλιάς, μιμόζας κτλ. Κατ' αυτήν τη μέθοδο, τα άνθη βυθίζονται σε ζεστό λίπος. Σε κυλινδρικούς ανοξείδωτους εκχυλιστήρες εισάγονται περίπου 80 kg λίπους, και κάθε φορά 20 kg άνθη που θερμαίνονται για μισή ώρα στους 80 ο C. Η εμβροχή υπό συνεχή ανάδευση, συνεχίζεται και κατά την ψύξη. Με προσθήκες νέου φυτικού υλικού επαναλαμβάνεται η διαδικασία 8-10 φορές μέχρις ότου το λίπος να κορεστεί. Στη συνέχεια το περιεχόμενο διηθείται σε μεταλλικά φίλτρα απομακρύνοντας τα διάφορα τμήματα φυτικών υλικών. Η εναπομένουσα pomade επεξεργάζεται κατά τα γνωστά με αλκοόλη για την παραλαβή πλέον του extrait (Κατσιώτης & Χατζοπούλου, 2010). δ) Εκχύλιση με υπερκρίσιμα υγρά (CO2). Το υπερκρίσιμο CO2 έχει χαρακτηριστεί σαν μη πολικός διαλύτης, παρόμοιας πολικότητας με αυτήν του εξανίου και πεντανίου. Τα πλεονεκτήματα που κάνουν να υπερτερεί το υπερκρίσιμο CO2 έναντι όλων των μη πολικών διαλυτών είναι: μπορεί εύκολα και εντελώς να διαχωριστεί από οποιοδήποτε συστατικό που έχει εκχυλίσει, λόγω της πολύ μεγάλης πτητικότητάς του έχει χαμηλό ιξώδες και υψηλή ικανότητα διάχυσης είναι απολύτως μη τοξικό δεν επιβαρύνει το περιβάλλον (σε σχέση με άλλους διαλύτες) δεν είναι εύφλεκτο είναι φθηνό (Κατσιώτης & Χατζοπούλου, 2010)

46 2.3. ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΕΚΠΙΕΣΗ Μια άλλη μέθοδος που χρησιμοποιείται κυρίως για τα εσπεριδοειδή φρούτα και τους ξηρούς καρπούς είναι η μηχανική εκπίεση του φλοιού των φρούτων ή των καρπών. Παλαιότερα αυτό γινόταν αποκλειστικά με τα χέρια. Ο φλοιός των φρούτων απομακρυνόταν από το φρούτο και εκπιεζόταν σε ένα υποδοχέα. Το έλαιο συλλεγόταν μαζί με μικρή ποσότητα χυμού. Οι συσκευές που χρησιμοποιούνται σήμερα για τους ξηρούς καρπούς μοιάζουν με τα πιεστήρια των ελαιοτριβείων. Για τους φλοιούς των εσπεριδοειδών διακρίνονται κυρίων δυο είδη: α) αυτές που επεξεργάζονται ολόκληρους τους καρπούς και διαχωρίζουν το αιθέριο έλαιο πριν τη χυμοποίηση και β) αυτές που επεξεργάζονται τους φλοιούς, αφού πρώτα τεμαχιστούν οι καρποί σε δυο ή περισσότερα μέρη και αφαιρεθεί ο χυμός (Κατσιώτης & Χατζοπούλου, 2010) ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΜΕ ΥΠΕΡΗΧΟΥΣ Στην εκχύλιση με υπέρηχους, το δείγμα τοποθετείται με κατάλληλο οργανικό διαλύτη σε λουτρό υπερήχων. Η διάδοση των υπερήχων χαρακτηρίζεται από ελάχιστη συχνότητα 16kHz και προκαλεί κίνηση του υγρού λόγω συμπίεσης και αραίωσης. Με την αύξηση της πίεσης επιτυγχάνονται φαινόμενα διείσδυσης και μεταφοράς, ενώ με την αύξηση της θερμοκρασίας επιταχύνονται φαινόμενα διάχυσης και διαλυτοποίησης. Με την χρήση των υπερήχων μειώνεται ο χρόνος εκχύλισης, χρησιμοποιούνται μικρότεροι όγκοι διαλυτών και εκχυλίζονται ταυτόχρονα πολλά δείγματα. Η εκχύλιση με υπέρηχους εφαρμόζεται στον προσδιορισμό ενώσεων που είναι θερμικά ασταθείς ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΜΕ ΜΙΚΡΟΚΥΜΑΤΑ (MAE: microwave assisted extraction). Τις τελευταίες δεκαετίες υπήρχε έντονο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη νέων τεχνικών παραλαβής των αιθερίων ελαίων, με την χρήση των οποίων έχει τελικά επέλθει σημαντική μείωση στο χρόνο εκχύλισης και στον όγκο δείγματος διαλύτη. Έτσι άρχισε η χρήση των μικροκυμάτων (MW) στην εκχύλιση. Με τα μικροκύματα υπάρχει σημαντική μείωση στο χρόνο εκχύλισης, σε σχέση με τις

47 κλασσικές μεθόδους (Soxhlet). Με τις συμβατικές μεθόδους η θερμότητα μεταδίδεται από την θερμαντική πλάκα στο δοχείο θέρμανσης και από εκεί στο διάλυμα. Αντίθετα με τα μικροκύματα η θέρμανση ξεκινάει από το δείγμα, μιας και το δοχείο δεν απορροφά την ακτινοβολία των μικροκυμάτων. Όπως φαίνεται παρακάτω, η θερμότητα, που παράγεται από τα MW, είναι εξάρτηση του διαλύματος. Αυτό συμβαίνει μιας και υπάρχουν διαλύτες που απορροφούν τα MW (π.χ μεθανόλη) και άλλοι που δεν την απορροφούν και επομένως δεν θερμαίνονται (π.χ εξάνιο). Με την ΜΑΕ υπάρχει επίσης και σημαντική μείωση στον όγκο δείγματος και διαλύτη, σε σχέση με την Soxhlet, λόγω της αποδοτικότερης εκχύλισης Solvent Free Microwave Extraction (SFME) H SFME είναι μια τεχνική που συνδυάζει την ακτινοβολία των μικροκυμάτων και την ξηρή απόσταξη. Με την τεχνική αυτή το φυτικό μέρος τοποθετείται σε δοχείο, μέσα σε φούρνο μικροκυμάτων, χωρίς την προσθήκη νερού ή κάποιου οργανικού διαλύτη. Τα μικροκύματα αλληλεπιδρούν με το εγκλωβισμένο (εσωτερικό) νερό, που υπάρχει στο φυτό, προκαλώντας την θέρμανσή του. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα τη διαστολή των κυττάρων του φυτού, τη ρήξη των αδένων των ελαιοφόρων υποδοχέων και τελικά την απελευθέρωση του αιθέριου ελαίου. Το αιθέριο έλαιο, στη συνέχεια εξατμίζεται μαζί με το εσωτερικό νερό και παραλαμβάνεται με την βοήθεια ψυκτήρα. ( 3. ΑΕΡΙΟΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ-ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ (GAS CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROSCOPY, GC-MS) H αέρια χρωματογραφία αναπτύχθηκε ως αναλυτική τεχνική τα τελευταία σαράντα χρόνια. Η τεχνική αυτή είναι σχετικά απλή και χρησιμοποιείται για την ανάλυση πτητικών ουσιών σε τρόφιμα, φάρμακα, προϊόντα πετρελαίου κ.λπ. Έτσι λοιπόν αποτελεί τη μέθοδο επιλογής για την ανάλυση των αιθερίων ελαίων αφού αυτά αποτελούνται συνήθως από μίγματα πτητικών συστατικών. Η διάταξη ενός αέριου χρωματογράφου δίνεται στο σχήμα

48 Σχήμα 7: Διάταξη αέριου χρωματογράφου Το φέρον αέριο (συνήθως Ν2, Ηe, H2, Ar) από τη φιάλη υψηλής πίεσης, μέσα από ρυθμιστές παροχής, οδηγείται στη στήλη. Η εισαγωγή του δείγματος γίνεται με μικροσύριγγα στη βαλβίδα εισαγωγής του δείγματος στην κορυφή της στήλης. Tα συστατικά του δείγματος συμπαρασύρονται από το φέρον αέριο κατά μήκος της στήλης και διαχωρίζονται. Τα κλάσματα στη συνέχεια ανιχνεύονται στον ανιχνευτή και τα σήματα ανίχνευσης καταγράφονται από καταγραφικό. Σε ορισμένες περιπτώσεις, στη συνέχεια υπάρχει μια διάταξη, όπου συλλέγονται τα διάφορα κλάσματα και ένα ροόμετρο για τον έλεγχο της ταχύτητας ροής του φέροντος αερίου. Εικόνα 6: Σύστημα GC χρωματογράφου- ηλεκτρονικού υπολογιστή

49 Ως φέρον αέριο μπορεί να χρησιμοποιηθεί κάθε αέριο σε υπερκάθαρη κατάσταση, το οποίο μπορεί να διαφοροποιηθεί στον ανιχνευτή, από τα διάφορα συστατικά του μίγματος. Το φέρον αέριο πρέπει να είναι αδρανές και απαλλαγμένο από προσμίξεις. Επίσης δεν πρέπει να περιέχει οξυγόνο, γιατί οξειδώνει τη στατική φάση και αυτό σημαίνει καταστροφή της στήλης, ιδιαίτερα όταν αυτή είναι τριχοειδής και η ποσότητα της στατικής φάσης είναι ελάχιστη. Ίχνη υγρασίας επίσης απενεργοποιούν τη στατική φάση, για αυτό το φέρον αέριο πρέπει να είναι απαλλαγμένο από υγρασία. Η επιλογή του φέροντος αερίου εξαρτάται κυρίως από τον τύπο του ανιχνευτή που χρησιμοποιείται. Η καρδιά του χρωματογράφου είναι η στήλη. Υπάρχουν δύο είδη στηλών οι πληρωμένες στήλες και οι τριχοειδείς. Αυτές που χρησιμοποιούνται ευρέως σήμερα είναι οι τριχοειδείς στήλες. Η στήλη αποτελείται από έναν επιμήκη σωλήνα, συνήθως με τη μορφή σπειράματος ή U, ώστε να καταλαμβάνει κατά το δυνατόν μικρότερο χώρο, από ανοξείδωτο χάλυβα, χαλκό, Εικόνα 7: Τριχοειδής στήλη αργίλιο, ύαλο ή πλαστικό, μήκους 1-2 m για της πληρωμένες στήλες, μέχρις αρκετών εκατοντάδων μέτρων για τις τριχοειδείς, εσωτερικής διαμέτρου της τάξεως των mm στις αναλυτικές στήλες, πολλών δεκάδων cm στις παρασκευαστικές στήλες. Το δείγμα, συνήθως όγκου 1μL εισάγεται στο ρεύμα του φέροντος αερίου στην αρχή της στήλης με μια μικροσύριγγα, διαμέσου μιας ελαστικής πλακέτας ή διαφράγματος (septum). H ταχύτητα και η ικανότητα του διαχωρισμού εξαρτώνται από τη θερμοκρασία. Για αυτό το λόγο η στήλη βρίσκεται σε φούρνο, του οποίου η θερμοκρασία ελέγχεται αυστηρά. Ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται εξαιτίας των διαφόρων δυνάμεων συγκράτησης και έκλουσης ανάμεσα στα συστατικά του μίγματος, το υλικό πλήρωσης της στήλης και της ροής του φέροντος αερίου

50 Το δεύτερο μέρος του χρωματογράφου περιλαμβάνει τον ανιχνευτή, ο οποίος τοποθετείται στο τέλος της στήλης. Τα σήματα ενισχύονται και καταγράφονται στο καταγραφικό σύστημα. H μέθοδος αυτή μας προσφέρει πλήθος πλεονεκτημάτων, μερικά από τα οποία είναι τα εξής: o ταχύτητα, o ακρίβεια, o χρήση μικροποσότητας αιθέριου ελαίου για την ανάλυση, o εύκολη διεξαγωγή, o χαμηλό κόστος. Παρόλα αυτά όμως η μέθοδος παρουσιάζει και κάποια μειονεκτήματα όπως είναι η αδυναμία εφαρμογής της σε θερμοευαίσθητα συστατικά και η αδυναμία ανάλυσης ιδιαίτερα πολύπλοκων μιγμάτων. Συνοψίζοντας, για την ανάλυση των πτητικών αιθέριων ελαίων, η αέριος χρωματογραφία είναι η μέθοδος επιλογής λόγω της ταχύτητας, της υψηλής διαχωριστικής ικανότητας και της εύκολης διεξαγωγής της. Όταν η αέρια χρωματογραφία, που είναι μέθοδος διαχωρισμού και όχι ταυτοποίησης των συστατικών ενός δείγματος, συνδυαστεί με τη φασματομετρία μαζών, γίνεται ένα ισχυρότατο μέσο ταυτοποίησης πολύπλοκων δειγμάτων. Αρκετοί κατασκευαστές οργάνων προσφέρουν αεριοχρωματογράφους, που μπορούν να συζευχθούν άμεσα με φασματόμετρα μαζών (ΜS) ταχείας σάρωσης. Η αρχή λειτουργίας της φασματομετρίας μαζών στηρίζεται στη δημιουργία ιόντων (κυρίως θετικών) μιας ένωσης, το διαχωρισμό τους με βάση το λόγο της μάζας προς φορτίο (m/z) και την καταγραφή τους. Με αυτόν τον τρόπο είναι δυνατό να προσδιοριστεί το μοριακό βάρος (ΜΒ) της ένωσης και ο τρόπος σύνδεσης των διαφόρων ομάδων μεταξύ τους. Τα φασματόμετρα μαζών αποτελούνται από: 1. Το θάλαμο ιοντισμού, όπου μετατρέπεται η ένωση σε ιόντα, συνήθως κατιόντα με απόσπαση ενός ηλεκτρονίου,

51 2. Τον αναλυτή μαζών, όπου γίνεται διαχωρισμός των ιόντων με βάση το λόγω m/z, 3. Toν ανιχνευτή. Ο χώρος όπου δημιουργούνται και επιταχύνονται τα ιόντα διατηρείται σε κατάσταση υψηλού κενού. Με το υψηλό κενό δημιουργούνται σε χαμηλές θερμοκρασίες θέρμανσης ατμοί της προς προσδιορισμό ουσίας χωρίς τη διάσπασή της, που οδηγούνται στο θάλαμο ιοντισμού. Επίσης απομακρύνονται τα μόριά της και τα ουδέτερα προϊόντα της διάσπασης από το χώρο της ανάλυσης μετά από κάθε μέτρηση. Ο αναλυτής αποτελείται από ένα σωλήνα σε σχήμα τόξου, που βρίσκεται μέσα σε ομογενές μαγνητικό πεδίο μεγάλης έντασης ( gauss) και σε διεύθυνση κάθετη προς τις δυναμικές γραμμές του μαγνητικού πεδίου. Με δύο κυκλικές οπές διαφράγματα μεταβλητής ακτίνας στην αρχή και στο τέλος του σωλήνα ένα μέρος από τα ιόντα που δεν εστιάζονται στο κέντρο των διαφραγμάτων απορρίπτεται. Σχήμα 8: Σχηματική απεικόνιση φασματομέτρου μάζας Ο συνηθέστερος τρόπος ιοντισμού είναι με βομβαρδισμό των αερίων μορίων της ένωσης με δέσμη ηλεκτρονίων (ΕΙ). Κατά τον ιοντισμό της ένωσης με ηλεκτρόνια, ο οποίος επιτυγχάνεται με βομβαρδισμό μορίων αυτής με δέσμη ηλεκτρονίων μεγάλης ενέργειας (συνήθως 70 ev), δημιουργείται με απώλεια ενός ηλεκτρονίου από μέρους της ένωσης μια κατιονική ρίζα, που αντιστοιχεί στο μοριακό ιόν. Οι κατιονικές αυτές ρίζες επιταχύνονται αρχικά με ηλεκτρικό πεδίο και στη συνέχεια κινούνται μέσα στο μαγνητικό πεδίο, οπότε εκτρέπονται και διαχωρίζονται με βάση το

52 m/z. Το ρεύμα το οποίο παράγεται μετράται με τη βοήθεια κατάλληλου ανιχνευτή. Το διάγραμμα που θα προκύψει από την ένταση του μετρούμενου ρεύματος συναρτήσει του λόγου m/z, αποτελεί το φάσμα μαζών. Άλλοι τρόποι σχηματισμού ιόντων είναι : ο χημικός ιοντισμός (CI), η εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου (FI), ο βομβαρδισμός με γρήγορα ουδέτερα άτομα Xe ή Ar ή ιόντα Cs (FIB). Oι συνηθέστεροι αναλυτές είναι: αναλυτής τομέα, τετραπολικός αναλυτής, παγίδα ιόντων, αναλυτής χρόνου πτήσης (Αργυρόπουλος et al. 1997) Η ποιοτική ανάλυση των συστατικών του δείγματος, δηλαδή η ταυτοποίησή τους μπορεί να γίνει: 1. Με τον προσδιορισμό του δείκτη κατακράτησης Kovats (Kovats Retention Index), ανάλυση του οποίου θα ακολουθήσει στη συνέχεια. 2. Με τη σύγκριση του χρόνου κατακράτησης (Retention Time - RT) των άγνωστων συστατικών, με το χρόνο κατακράτησης πρότυπων ενώσεων. 3. Με τη σύγκριση των φασμάτων μάζας των συστατικών του δείγματος με τα φάσματα μάζας προτύπων ενώσεων. 4. Με τη σύγκριση των φασμάτων μάζας των συστατικών του δείγματος με αντίστοιχα της βιβλιογραφίας και των βιβλιοθηκών φασμάτων (Adams, NIST κ.α.) που υπάρχουν στο λογισμικό των φασματομέτρων μάζας. 3.1 Κοvats Retention Index System. Για την ταυτοποίηση των πτητικών ουσιών που συνιστούν το προς ανάλυση δείγμα, μία σημαντική παράμετρος που μελετάμε είναι ο χρόνος παραμονής (retention time) της κάθε ουσίας στη χρωματογραφική στήλη. Είναι γεγονός, βέβαια, πως οι εργαστηριακές συνθήκες από ένα ερευνητικό εργαστήριο σε κάποιο άλλο ή ακόμη και στο ίδιο, δεν είναι πανομοιότυπες και απόλυτα ελεγχόμενες κάθε φορά. Έτσι, συχνά συναντάμε αποκλίσεις και

53 σφάλματα κατά την χρήση των απλών χρόνων παραμονής των ουσιών στη χρωματογραφική στήλη. Ενδεικτικά, στην αέριο χρωματογραφία οι συνθήκες που μπορεί να διαφέρουν είναι η θερμοκρασία, ο τύπος της στατικής φάσης, το μήκος της χρωματογραφικής στήλης, η ροή του φέροντος αερίου και άλλοι παράγοντες. Έτσι γίνεται χρήση μιας άλλης παραμέτρου, η οποία σχετίζεται με το χρόνο παραμονής (retention time) της ουσίας στη στήλη σε σχέση με τον χρόνο παραμονής n-αλκανίων, αλλά είναι ανεξάρτητη των εργαστηριακών συνθηκών, εξαλείφοντας τις αποκλίσεις και παρέχοντας σταθερά κι επαναλήψιμα αποτελέσματα. Πρώτος ο Kovats πρότεινε το Σύστημα Δεικτών Κατακράτησης (Kovats'Retention Index System) και η τροποποίηση του σε συνθήκες θερμοκρασίας που δεν είναι σταθερή, επιτρέπει τα αποτελέσματα που έχουν μετρηθεί σε κάποιο εργαστήριο να χρησιμοποιηθούν από κάποιο άλλο. Το σύστημα αυτό συνδυάζει δύο θεμελιώδεις ιδιότητες της αέριου χρωματογραφίας: το σχετικό χρόνο κατακράτησης και τον ειδικό όγκο κατακράτησης. Μεταφορικά θα λέγαμε, ότι ο Kovats πρότεινε ένα χημικό κανόνα για να χαρακτηρίσει διαφορετικές χημικές ενώσεις με βάση μια κλίμακα ειδικού χρόνου με στόχο την ταυτοποίηση των ενώσεων. Σύμφωνα με τον Kovats o ο δείκτης ενός αναλυτή, μιας ουσίας, είναι ο σχετικός χρόνος ανάμεσα στα πλησιέστερα n- αλκάνια τα οποία εκλούονται αμέσως πριν και αμέσως μετά από τον άγνωστο αναλυτή. Οι δείκτες κατακράτησης του Kovats ή Kovats Retention Index για ισοθερμικές αναλύσεις δίνονται από τη μαθηματική σχέση: IX=100n+100[log(t'x )-log(t'n)]/[log(t'n+1)-log(t'n)] όπου t'n : ο χρόνος κατακράτησης του n-αλκανίου που εκλούεται αμέσως πριν από την άγνωστη ένωση. t'n+1 : ο χρόνος κατακράτησης του n-αλκανίου που εκλούεται αμέσως μετά από την άγνωστη ένωση. t'x : ο χρόνος κατακράτησης της άγνωστης ένωσης. Στην περίπτωση μη ισοθερμικών αναλύσεων η μαθηματική αυτή σχέση, σύμφωνα με τον ορισμό των Van den Dool και Kratz για μετρήσεις επί προγραμματισμένων θερμοκρασιών διαμορφώνεται ως εξής:

54 IX=100n+100(tx -tn)/(tn+1 -tn) όπου tn, tn+1 και tx οι χρόνοι κατακράτησης του n-αλκανίου που εκλούεται αμέσως πριν την έκλουση της άγνωστης ένωσης, του n- αλκανίου που εκλούεται αμέσως μετά την άγνωστη ένωση και της άγνωστης ένωσης αντίστοιχα (Babushok et al., 2011). 4. DITTRICHIA VISCOSA (L.W. Greuther) ή INULA VISCOSA (L. Aiton) 4.1. Γενικά Το γένος Inula της οικογένειας Compositae (Asteraceae) είναι ένα μεγάλο γένος που ανήκει στην τάξη Inuleae ή Αsterales με περισσότερα από 100 είδη. Το γένος αυτό υπάρχει κυρίως στην Αφρική, στην Ασία (20 είδη υπάρχουν στην Κίνα) και στην Ευρώπη, κυρίως στη λεκάνη της Μεσογείου. Πολλά υποείδη του γένους Inula έχουν χρησιμοποιηθεί στην παραδοσιακή ιατρική παντού στον κόσμο, παρόλα αυτά όμως πιο συνηθισμένα είναι στην παραδοσιακή κινέζικη ιατρική. Έτσι το γένος Inula περιλαμβάνει πολλά είδη με υποτιθέμενη φαρμακευτική αξία. Για παράδειγμα, η Inula helenium L. κοινώς γνωστή ως "elecampane", η Inula racemosa Hook.f και η Inula britannica L. συχνά χρησιμοποιήθηκαν στην παραδοσιακή ιατρική. Εξαιτίας των σημαντικών εθνοϊατρικών χρήσεων μερικά υποείδη υπάρχουν σε εμπορικά φυτικά σκευάσματα, όπως η Inula japonica Thunb. στις ταμπλέτες "Huang-Lian-Shang-Qing" (Hann et al., 2010), η Inula helenium στο φάρμακο Ventrofit κατά του έλκους (Nikolaev et al., 2006) ή σε συμπληρώματα με ιατρικές εφαρμογές, για παράδειγμα το Pancreophyt, το Relaxing Balm ή σε σιρόπι για καπνιστές (Ghedira et al., 2011, Nikolaev et al., 2011), και μερικά από Εικόνα 8: D. viscosa ssp viscosa

55 αυτά υπάρχουν επίσημα στις λίστες διαφόρων Ευρωπαϊκών Φαρμακοποιιών (Stojakowska et al., 2006, Trendafilova et al., 2010). Στην εργασία αυτή θα ασχοληθούμε με τη μελέτη της χημικής σύστασης του αιθερίου ελαίου του φυτού Dittrichia viscosa που ανήκει στην παραπάνω οικογένεια, στον κύκλο βλάστησής του καθώς και με τη σύγκριση των κυριότερων συστατικών του ελαίου με αυτά από αιθέρια έλαια που απομονώθηκαν από το φυτό D. viscosa σε άλλες χώρες της λεκάνης της Μεσογείου κατά την περίοδο της ανθοφορίας. Θα συγκρίνουμε επίσης τα συστατικά του αιθερίου ελαίου του φυτού που συλλέχθηκε τον μήνα Οκτώβριο των ετών 2013 και Στην μία περίπτωση η απόσταξη έγινε σε ξηρό φυτό και στην άλλη σε φρέσκο φυτό προκειμένου να ερευνήσουμε αν υπάρχουν αλλοιώσεις στα συστατικά των δύο ελαίων. Στο σημείο αυτό θα παραθέσουμε κάποια γενικά στοιχεία για το φυτό. 4.2 Ονομασία, βοτανική ταξινόμηση του φυτού και εξάπλωσή του Η Dittrichia viscosa L. (W.Greuther) ή Inula viscosa L. (Aiton) ή κοινώς false yellowhead, Ακονιζέα, ή κονυζός ή κόνυζα ή ψυλλίστρα ή ψυλλήθρα ή Διττριχία η ιξώδης της οικογένειας Compositae (Asteraceae) πήρε το όνομά της από τον βοτανικό Γερμανό Manfred Dittrich (1934-) ενώ το viscosa προέρχεται από το viscous που σημαίνει ιξώδης, κολλώδης και Εικόνα 9: Άνθη του φυτού αναφέρεται κυρίως στην κολλώδη έκκριση των αδενωδών τριχών. Το έκκριμα αυτό είναι ένα πολύπλοκο μίγμα οργανικών ενώσεων το οποίο είναι πλούσιο κυρίως σε τερπένια, άγλυκα φλαβονοειδή και απλές φαινολικές ενώσεις. Είναι ένα είδος αειθαλούς, πολυετούς θάμνου της Μεσογείου. Είναι φυτό με βλαστό όρθιο, ύψους εκ. Τα φύλλα είναι λογχοειδή, ακέραια, οδοντωτά, ημιπερίβλαστα. Τα φύλλα αυτά και ο κορμός παράγουν μία κολλώδη ουσία, και εκκρίνουν μία πολύ έντονη βαριά μεθυστική μυρουδιά

56 Τα άνθη είναι κίτρινα σε ακραία κεφάλια και πολλές ταξιανθίες, κύριο γνώρισμα της οικογένειας στην οποία ανήκουν. Είναι ερμαφρόδιτα που γονιμοποιούνται από τα έντομα. Ο καρπός του είναι αχαίνιο με τριχωτό πάππο που αποτελείται από 15 τρίχες. Η κόνυζα είναι πολύ σημαντική πηγή τροφής για τις κάμπιες, τις πεταλούδες και τους σκώρους. Αυτά τρέφονται από τον χυμό του φυτού και αναπτύσσονται. Πίνακας 9 ΚΑΤΑΤΑΞΗ ΒΑΣΙΛΕΙΟ: PLANTAE ΥΠΟΒΑΣΙΛΕΙΟ: TRACHEOBIONTA ΥΠΕΡΔΙΑΙΡΕΣΗ: SPERMATOPHYTA ΔΙΑΙΡΕΣΗ: MAGNOLIOPHYTA ΚΛΑΣΗ: MAGNOLIOPSIDA ΥΠΟΚΛΑΣΗ: ASTERIDAE ΤΑΞΗ: ASTERALES ή INULEAE ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ: ASTERACEAE ΓΕΝΟΣ: INULA GREUTER ΕΙΔΟΣ: DITTRICHIA VISCOSA (L.) GREUTER ή INULA VISCOSA (L.) AITON Στον πίνακα 9 φαίνεται η συστηματική ταξινόμηση του φυτού. Έχουν ταξινομηθεί δύο υποείδη και μία ποικιλία. Έτσι η D. revoluta(= συνώνυμη με την Inula viscosa subsp. revoluta=d. viscosa subsp. revoluta) υπάρχει μόνο στη ΒΔ Πορτογαλία και η D. orientalis (=I.viscosa var. angustifolia) που υπάρχει στην Α. Μεσόγειο (Brullo & De Marco, 2000) μαζί με τη D. viscosa και άλλα είδη όπως η D. graveolens και η D. maritima που είναι κοινά στη περιοχή της Μεσογείου. Η D. viscosa απαντάται σε χέρσα περιβάλλοντα και πετρώδεις τόπους, γενικά σε περιβάλλοντα υποβαθμισμένα λόγω ανθρωπογενών δραστηριοτήτων (π.χ. κατά μήκος των δρόμων, σε αποξηραμένες κοίτες ποταμών, σε τέλματα και εγκαταλελειμμένα χωράφια, σε μονοπάτια κλπ) σε όλη την Ελλάδα. Προσαρμόζεται εύκολα σ' αυτές τις συνθήκες και στο κλίμα της Μεσογείου (ξηρό, μακρύ, ζεστό και με πολύ ακτινοβολία καλοκαίρι). Εξαπλώνεται στις ακτές της Νότιας Ευρώπης- Ιταλία, Γαλλία, Πορτογαλία, Ισπανία καθώς επίσης στην Αλβανία, Βουλγαρία και πρώην Γιουγκοσλαβία. Θα τη βρούμε ακόμα στη Τουρκία και στη Μέση Ανατολή (Ισραήλ, Ιορδανία, Λίβανο, Συρία) και Β. Αφρική (Αλγερία, Αίγυπτο, Λιβύη, Μαρόκο, Τυνησία,). Πρόσφατη μελέτη έγινε σε φυτό της Κύπρου γεγονός που δείχνει ότι το φυτό φύεται και εκεί (Polatoglou et al., 2015)

57 4.3. Κύκλος βλάστησης του φυτού Η D. viscosa αρχίζει να βλασταίνει τέλος Μαρτίου αρχές Απριλίου (πρόωρη Ευρωπαϊκή άνοιξη). Η κύρια ανάπτυξη ολοκληρώνεται τον Μάιο και η συσσώρευση αμύλου καταλήγει τον Ιούνιο (Meletiou- Christou et al., 1998, Scott et al., 2008, Parolin et al., 2013a). Υπάρχει μία δευτερογενής ανάπτυξη του φυτού την περίοδο Οκτωβρίου- Νοεμβρίου (Ευρωπαϊκό φθινόπωρο) και τα φύλλα πέφτουν τον Δεκέμβριο (χειμώνας) (Meletiou-Christou et al., 1998). Στο τέλος του Ιουλίου (Ευρωπαϊκό καλοκαίρι) αρχίζουν να εμφανίζονται μπουμπούκια. Από τον Σεπτέμβριο, συνυπάρχουν άνθη και καρποί. Η παρατεταμένη ανθοφορία διαρκεί για μια μεγάλη περίοδο, μέχρι το τέλος της ζεστής περιόδου, από τον Αύγουστο μέχρι τον Οκτώβριο. Οι καρποί του φυτού είναι ώριμοι τον Οκτώβριο και τον Νοέμβριο και διασκορπίζονται με τον άνεμο (Parolin et al., 2013a) Aναπαραγωγή και καλλιέργεια Τα άνθη είναι ερμαφρόδιτα και επικονιάζονται με τα έντομα. Η αναπαραγωγή μπορεί να συμβεί με τους σπόρους που συνήθως διασκορπίζονται με τη βοήθεια του ανέμου και του νερού. Η διασπορά μπορεί να γίνει ακόμα και με την μεταφορά χώματος από το έδαφος. Στο εργαστήριο σε συνθήκες έλλειψης φωτός (Sinden et al., 2004) υπήρξε μεγάλη αδράνεια των σπόρων. Όμως η μακροβιότητα και βιωσιμότητα των σπόρων δεν είναι γνωστή. Διασπορά συμβαίνει όταν ο πάππος εξανεμίζεται ή το φυτό κυλάει με το τρεχούμενο νερό. Από τη στιγμή που παράγει γόνιμους σπόρους εμφανίζεται η απειλή ενός επεκτατικού είδους. Από τη φύση της η D. viscosa βλασταίνει κυρίως μετά τις φθινοπωρινές βροχοπτώσεις αλλά αν υπάρχει επαρκής υγρασία αυτό μπορεί να συμβεί οποιαδήποτε στιγμή (Perez-Fernandez et al., 2006). H βλάστηση φαίνεται να ευνοείται από τη υποβάθμιση του εδάφους και τη φωτιά. Η βλάστηση των σπόρων συμβαίνει σε θερμοκρασία από 15 o C μέχρι 30 o C με μέγιστη βλάστηση στους 25 o C. Πειράματα ανάπτυξης σε μεταβαλλόμενη θερμοκρασία έδειξαν ότι η ιδανική θερμοκρασία είναι μεταξύ 10 o C και 24 o C (Scott et al., 2008). Ένας άλλος πιο γρήγορος τρόπος για να αναπαραχθεί το φυτό είναι μέσω μοσχευμάτων τα οποία φυτεύουμε σε γλάστρες. Και μία τρίτη επιλογή είναι να μεταφυτεύσουμε ολόκληρο το φυτό. Μεταφύτευση φυτών ύψους 10cm τους μήνες Φεβρουάριο-Μάρτιο

58 είναι πολύ χρήσιμη για να επιβεβαιωθεί η εγκατάσταση του φυτού και είναι πολύ αποτελεσματικό διότι τα φυτά αποκτούν άνθη από τον πρώτο κιόλας χρόνο. Όμως η εξαγωγή του ριζικού συστήματος για μεταφύτευση δεν είναι εύκολη (Parolin et al., 2014) ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΡΑΣΗ-ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΧΡΗΣΕΙΣ Iστορική αναδρομή Στην περιοχή της Μεσογείου, η D. viscosa, χρησιμοποιήθηκε για πολλά χρόνια στην παραδοσιακή ιατρική για τις αντιφλεγμονώδεις ιδιότητές της, για την αντιπυρετική, αντισηπτική, αντιφλογιστική, μαλακτική και επουλωτική δράση της. Χρησιμοποιήθηκε επίσης κατά της ψώρας, του έλκους στομάχου και των γαστροεντερικών διαταραχών (Lauro & Rolih, 1990, Fontana et al., 2007, Celik & Aslanturk, 2010, Musthaba et al., 2011). Στην Ελληνο-Αραβική και Ισλαμική παραδοσιακή ιατρική οι ρίζες του φυτού "Tayon" χρησιμοποιήθηκαν κατά του βήχα και της καταρροής, σαν αντισηπτικό και αποχρεμπτικό (Saad & Said, 2011). Οι Άραβες, στην ιερή Γη θεωρούσαν την D. viscosa ένα από τα πιο σημαντικά φαρμακευτικά φυτά επειδή θεράπευε 40 διαφορετικές ασθένειες. (Palevitch & Yaniv, 1991). Στο Μαρόκο χρησιμοποιήθηκε ως ανθελμινθικό, διουρητικό, κατά της αναιμίας και σαν κατάπλασμα για ρευματικούς πόνους. Επίσης βρήκε εφαρμογή στη φυματίωση και σαν αποχρεμπτικό στη βρογχίτιδα. Στη ΝΑ περιοχή του Μαρόκο το αφέψημα των φύλλων και της ρίζας χρησιμοποιήθηκε κατά της υπέρτασης (Tahraoui et al., 2007) ενώ το αφέψημα των φύλλων και των ανθέων μαζί με την Inula helenium και την Inula conyza συμπεριλαμβανόταν στη λίστα των φαρμακευτικών φυτών που παραδοσιακά χρησιμοποιούνταν για τη θεραπεία του σακχαρώδη διαβήτη (Eddouks et al., 2007) Ο Διοσκουρίδης μας αναφέρει τις χρήσεις του: Τα φύλλα γίνονται αποτελεσματικό κατάπλασμα στα δαγκώματα από φίδια, στις νεοπλασίες και στα τραύματα. Στην παραδοσιακή ιατρική μαζί με κρασί πίνεται το άνθος και τα φύλλα για την πρόκληση της έμμηνου ρύσεως, την αποβολή των εμβρύων, τη στραγγουρία, τους κολικούς και τον ίκτερο, ενώ όταν πίνονται μαζί με ξύδι βοηθάνε τους επιληπτικούς και το αφέψημά τους με ατμόλουτρα θεραπεύει τις παθήσεις της μήτρας. Το φυτό εάν επαλείφεται μαζί με λάδι κάνει καλό στα ρίγη. Η λεπτή θεραπεύει και τους πονοκεφάλους εάν γίνει κατάπλασμα. Επίσης

59 είναι διουρητικό, εμμηναγωγό και αποχρεμπτικό (Lauro & Rolih, 1990, Fontana et al., 2007). Χρησιμοποιήθηκε σε πολλές ακόμη περιοχές για διάφορες άλλες χρήσεις. Πολυάριθμες δημοσιεύσεις αποδεικνύουν την ιατρική και φαρμακολογική δυναμική του φυτού D. viscosa επιβεβαιώνοντας την τόσο διαδεδομένη χρήση της στην παραδοσιακή ιατρική κατά τους προηγούμενους χρόνους. Μελέτες που έγιναν τόσο στη δράση του αιθερίου ελαίου όσο και σε εκχυλίσματα έδειξαν ότι η D. viscosa εμφανίζει τις παρακάτω δράσεις: αντιοξειδωτική αντιμικροβιακή, αντιική και αντιμυκητιασική αντιδιαβητική αντιφλεγμονώδη κατά του έλκους και της κολίτιδας κλπ εκτρωτική α. ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗ ΔΡΑΣΗ Οι ενώσεις της D. viscosa είναι ικανές να τροποποιούν την ενζυμική δραστηριότητα του αραχιδονικού οξέος (AA), μεταβολίζοντας ένζυμα όπως την φωσφολιπάση Α2 (PLA2), την κυκλοοξυγενάση (COX) και την λιποξυγενάση (LOX) και το οξείδιο του αζώτου (ΝΟ) παράγοντας το ένζυμο συνθετάση του οξειδίου του αζώτου (ΝΟS). Αναστολή αυτών των ενζύμων προκαλεί μείωση της παραγωγής του αραχιδονικού οξέος, των προσταγλανδινών (PG), των λευκοτριενίων (LT) και του μονοξειδίου του αζώτου, σημαντικών παραγόντων της φλεγμονής (Seca et al., 2014). Η αντιοξειδωτική δράση του αιθερίου ελαίου και του εκχυλίσματος του φυτού (υδατικό ή αλκοολικό) είναι διαφορετική. (Bekkara et al., 2008). Αυτό είναι φυσιολογικό λόγω της διαφορετικής σύστασης των δύο προϊόντων. Η δράση είναι άμεσα εξαρτημένη από την σύνθεση του ελαίου ή του εκχυλίσματος. Διαφορετική θα είναι και η δράση ανάμεσα σε αιθέρια έλαια που έχουν ληφθεί από φυτά που αναπτύχθηκαν σε διαφορετικές περιοχές. Έτσι μελέτη που έγινε στο Πανεπιστήμιο της Αλγερίας έδειξε ότι το αιθέριο έλαιο είχε μικρή αντιοξειδωτική δράση σε σύγκριση με τα αντιοξειδωτικά του εμπορίου, Trolox και ασκορβικό οξυ. Το αιθανολικό εκχύλισμα είχε αντιοξειδωτική δράση η οποία αυξανόταν με την αύξηση της συγκέντρωσης του εκχυλίσματος

60 β. ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ & ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΣΙΚΗ ΔΡΑΣΗ Το αιθέριο έλαιο από την D. viscosa της Κορσικής μελετήθηκε ως προς την αντιμικροβιακή του δράση. Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική αντιμικροβιακή δράση έναντι τριών Gram (+) βακτηρίων (Staphyloccocus aureus, S. epidermidis και Streptococcus faecalis), έναντι δύο Gram (-) βακτηρίων (E. coli και Proteus vulgaris) και έναντι δύο ζυμών (Candida albicans και Cryptococcus neoformans. Επίσης, εμφάνισε δράση κατά των νηματοειδών μυκήτων - Cladosporium cladosporioides -Aspergillus niger (Blanc et al., 2005). Άλλη μελέτη που εκπονήθηκε με αιθέριο έλαιο από φυτό της περιοχής Tlemcen της Αλγερίας έδειξε ότι αυτό είχε ασθενή αντιμικροβιακή δράση έναντι των Gram (+) βακτηρίων και ακόμη πιο ασθενή στα Gram (-) βακτήρια. Η δραστικότητα αυτή πιθανό να οφείλεται στη παρουσία των φαινολικών ενώσεων. Από την άλλη πλευρά το αιθανολικό εκχύλισμα δεν φαίνεται να έχει δράση σε καμιά βακτηριακή αλυσίδα από αυτές που ελέγχτηκαν. Το υδατικό εκχύλισμα των φύλλων είχε αντιμυκητιασική δράση κατά των δερματόφυτων (Microsporium canis, Candida albicans κ.ά.). Ο ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός του αιθερίου ελαίου με GC- MS χρωματογραφία επιβεβαίωσε την αντιμυκητιασική δράση η οποία οφείλεται στην υψηλή συγκέντρωση σεσκιτερπενίων και ιδιαίτερα του καρβοξυ ευδεσμανίου στα φύλλα του συγκεκριμένου φυτού (Bekkara et al., 2008). Πολλές ακόμη μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί με σκοπό να αποδειχθεί η αντιβακτηριακή και αντιμυκητιασική δράση αυτού του φυτού χρησιμοποιώντας διαφορετικά στελέχη μικροβίων (Seca et al., 2014). γ. ΑΝΤΙΔΙΑΒΗΤΙΚΗ ΔΡΑΣΗ Αναφέρθηκε πιο πάνω η χρήση της D. viscosa ως αντιδιαβητικό φάρμακο στην παραδοσιακή ιατρική στο Μαρόκο. Την χρήση αυτή έρχεται να επιβεβαιώσει μελέτη των Zhang et al., 2010b. Στη μελέτη αυτή απομονώθηκε η ουσία flavanone 7-O-methylaromadendrin από εκχυλίσματα του φυτού D. viscosa το οποίο είχαν προμηθευτεί από το Jilin Agricultural University in China. Η ένωση αυτή αξιολογήθηκε και βρέθηκε να έχει σημαντική αντιδιαβητική δράση. Η μελέτη έδειξε ότι η flavanone 7-O-methylaromadendrin πρέπει να διεγείρει την πρόσληψη της γλυκόζης αυξάνοντας τόσο το γονίδιο όσο και τα επίπεδα πρωτεΐνης του PPARγ2 και να βελτιώνει την αντίσταση της

61 ινσουλίνης με την επαναδραστηριοποίηση της ινσουλινοεξαρτώμενης φωσφορυλίωσης του PI13K και ΑΜΡΚ, καταλήγοντας ότι αυτή η φλαβανόνη μπορεί να είναι ένα εν δυνάμει φάρμακο για την διαχείριση του σακχαρώδους διαβήτη τύπου 2. δ. ΔΡΑΣΗ ΚΑΤΑ ΤΟΥ ΕΛΚΟΥΣ ΤΟΥ ΣΤΟΜΑΧΟΥ ΚΑΙ ΤΗΣ ΕΛΚΩΔΟΥΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑΣ O Miguel και οι συνεργάτες του στη μελέτη που έκαναν το 2006 κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι το ακατέργαστο αιθέριο έλαιο του φυτού D. viscosa εμφανίζει μείωση στον πληθυσμό του Helicobacter pylori. Επίσης στο ίδιο συμπέρασμα κατέληξε η μελέτη του (Stamatis et al., 2003) μόνο που αυτή η ομάδα χρησιμοποίησε εκχύλισμα του φυτού και όχι το αιθέριο έλαιό του. Σύμφωνα με τη μελέτη των Οhta et al., 2005b τα τερπενοειδή που έχουν δράση κατά του έλκους είναι περισσότερο κυτταροπροστατευτικά. Αυξάνουν την παραγωγή βλέννης στο στομάχι μέσω διαφόρων μηχανισμών, μεταξύ των οποίων είναι: η αύξηση των περιεχόμενων προσταγλανδινών της βλέννας βελτιώνοντας έτσι την ροή του αίματος στη γαστρικό βλεννογόνο, την έκκριση γαστρικού διοξειδίου του άνθρακα και την βλέννα που επιταχύνει την επούλωση του έλκους. Δρουν επίσης ως αντιοξειδωτικά, μειώνουν το επίπεδο της λιπιδικής υπεροξειδάσης και αυξάνουν τα αντιοξειδωτικά ένζυμα όπως την υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) και την καταλάση (CAT) στο γαστρικό βλεννογόνο (Rodriguez et al., 2006, Kim et al., 2005). Οι φαινολικές ενώσεις εκπροσωπούν μια ομάδα διαφόρων ενώσεων όπως τα φλαβονοειδή, οι κινόνες, οι ταννίνες και οι φαινολικοί γλυκοσίδες. Πολλές φαινολικές ενώσεις εμφανίζουν αντιελκωτική δράση δρώντας με διαφορετικούς μηχανισμούς. Οι φαινολικοί γλυκοσίδες έχουν αντιεκκριτικό αποτέλεσμα (Severi et al., 2009) ενώ οι κινόνες κυτταροπροστατευτικό αυξάνοντας τη σύνθεση των προσταγλανδινών (Lee et al., 2010). Τα φλαβονοειδή κατέχουν τόσο κυτταροπροστατευτική όσο και αντιεκκριτική δράση. Αυτά ασκούν κυτταροπροστατευτική δράση στα θηλαστικά αυξάνοντας τα ενδογενή επίπεδα προσταγλανδίνης, μειώνοντας την έκκριση ισταμίνης, αναστέλλοντας το ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού (Helicobacter pylori) και σαρώνοντας τις ελεύθερες ρίζες. Ο αντιεκκριτικός μηχανισμός περιλαμβάνει και την αντιοξειδωτική ιδιότητα (Coehlo et al., 2006). Οι πολυσακχαρίτες

62 είναι κυτταροπροστατευτικές ενώσεις, διεγείρουν την αναγέννηση και τον πολλαπλασιασμό του βλεννογόνου και αυξάνουν την σύνθεση των προσταγλανδινών αποκαθιστώντας τα επίπεδα του γαστρικού βλεννογόνου (Gao et al., 2004). ε. ΔΡΑΣΗ ΚΑΤΑ ΤΗΣ ΨΩΡΙΑΣΗΣ ΚΑΙ ΦΛΕΓΜΟΝΩΔΩΝ ΔΕΡΜΑΤΟΠΑΘΕΙΩΝ Η ψωρίαση είναι μια από τις πιο σημαντικές χρόνιες παθολογίες του δέρματος και αγγίζει περίπου το 1-3% του παγκόσμιου πληθυσμού. Το 5-10% περίπου των ασθενών αναπτύσσουν ψωριασική αρθρίτιδα που προκαλεί φλεγμονή και πρήξιμο στα χέρια, στα πόδια και τις αρθρώσεις. Εθνοβοτανολογικές έρευνες στο Sicily αναφέρουν τη χρήση αρκετών φυτικών θεραπειών για την ανακούφιση των συμπτωμάτων της ψωρίασης. Αυτές περιλαμβάνουν διάφορα φυτά της οικογένειας Asteraceae και μαζί μ' αυτά και τη D. viscosa. Τα φυτά αυτά συλλέγονται την περίοδο της άνοιξης και συνηθίζεται να τα κάνουν αφέψημα αφού τα συνθλίψουν και τα εμβαπτίσουν σε κρύο νερό και μη επεξεργασμένο κρασί. Η χρήση του Α. mollis και Achillea ligustica αναφέρονται ως θεραπεία επιλογής για τις δερματικές παθήσεις στην περιοχή της Σαρδηνίας (Bruni et al., 1997) ενώ το αφέψημα της ρίζας της D. viscosa χρησιμοποιείται στη Καλαβρία με το τοπικό όνομα "spulitru" για την ανακούφιση δερματικών παθήσεων αλλεργικής αιτιολογίας (Passalacqua et al., 2007). Στα εικοσανοειδή έχει ανατεθεί ένας σημαντικός ρόλος στις φλεγμονώδεις δερματικές παθήσεις όπως είναι η ψωρίαση και η ατοπική δερματίτιδα. Τα ουδετερόφιλα κινούνται πολύ γρήγορα στην φλεγμαίνουσα επιδερμίδα και έρχονται σε επαφή με τα κύτταρα της κεράτινης στοιβάδας απελευθερώνοντας λευκοτριένια Α4 (LTA4) στον εξωκυττάριο χώρο. Από αυτό το υπόστρωμα, διακυτταρική σύνθεση λευκοτριενίου μπορεί συνεπώς να είναι ένας σημαντικός μηχανισμός με τον οποίο η ανθρώπινη επιδερμίδα μπορεί να συμβάλλει σημαντικά στον σχηματισμό λευκοτριενίων Β4 (LTΒ4 ). Eπιπρόσθετα το 12(S)-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-tetranoic acid (12(S)-HETE) φαίνεται να είναι ένα από τα κύρια εικοσανοειδή που σχηματίζονται από την επιδερμίδα και έχει ανιχνευθεί σε μεγάλες ποσότητες στις ανθρώπινες ψωριασικές πλάκες (Iversen & Kragballe, 2000). Έτσι, η υποθετική δραστικότητα των εκχυλισμάτων που συνταγογραφούνται για τέτοιες διαταραχές

63 μπορεί να προκύψει -τουλάχιστον εν μέρει- από την ικανότητα να αναστείλει- άμεσα ή έμμεσα- τη δραστηριότητα των ενζύμων που είναι υπεύθυνα για τη σύνθεσή τους. Ορισμένες πτυχές της φυτοχημείας και φαρμακολογίας γι' αυτά τα είδη έχουν ήδη δημοσιευθεί κάπου αλλού αλλά για το καλύτερο της γνώσης μας, δεν υπάρχει συγκριτική εκτίμηση ακόμα για την δράση τους στα μονοπάτια της COX και LOX σε ανέπαφα προ-φλεγμονώδη κύτταρα θηλαστικών (Bader et al., 2015) στ. ΕΚΤΡΩΤΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΚΑΙ ΔΡΑΣΗ ΚΑΤΑ ΤΗΣ ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗΣ Σύμφωνα με τη Dafni et al., (1984) οι γυναίκες κάθονταν πάνω από μπάνιο του φυτού για λίγο, τρεις ημέρες μετά την επαφή ή τις χορηγούνταν ενδοπρωκτικά με σκοπό τη στειρότητα φύλλα του εδάφους. Μέχρι την μελέτη αυτή δεν υπήρχαν δεδομένα που να υποστηρίζουν τον τερματισμό της υποτιθέμενης εγκυμοσύνης από την D. viscosa. ζ. ΑΛΛΗΛΟΠΑΘΗTΙKH ΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΦΥΤΟΥ D. VISCOSA Κανονικά η D. viscosa είναι το φυτό ξενιστής για ωφέλιμα αρπακτικά όπως τα mirid bugs του γένους Macrolophus και ωφέλιμων εντόμων τα οποία ελέγχουν τον δάκο της ελιάς (Fimiani et al., 1993 & Perdikis et al., 2007). Για το λόγο αυτό έχει χρησιμοποιηθεί σε μερικά αγρο-οικοσυστήματα της Μεσογείου ώστε να μειώσουν τον αριθμό μερικών παρασίτων των σπαρτών. (Perdikis et al., 2007). Η D. viscosa έχει προφανώς ένα υψηλό δυναμικό να αντιστρέφει και να αυξάνει την παρουσία των βλαβερών εντόμων. Λόγω της ιδιομορφίας της να έλκει και να τρέφει κάμπιες και έντομα εισβολείς καθώς επίσης λόγω της μεγάλης ανοχής που εμφανίζει στο περιβαλλοντικό stress την κάνει δυνητικά κατάλληλη για τον βιολογικό έλεγχο της περιοχής της Μεσογείου. Από τότε που το είδος αυτό είναι πολύ ανθεκτικό στις δυσμενείς συνθήκες και υπάρχει σε υποβαθμισμένα περιβάλλοντα, είναι ικανό να γίνει ένα ζιζάνιο εισβολέας. Για το λόγο αυτό, η χρήση του για τον βιολογικό έλεγχο της Μεσογείου πρέπει να είναι αυστηρά στο φυσικό του περιβάλλον, τη Μεσόγειο (Sinden et al., 2004). Το φυτό αυτό συνεισφέρει πάρα πολλά αυτή την εποχή και στην μελισσοκομία, διότι δεν υπάρχουν άλλα λουλούδια με γύρη. Επίσης οι μελισσουργοί το χρησιμοποιούν για να καταπολεμούν τα

64 παράσιτα των μελισσών. Θεωρείται πολύ εντομοκτόνο φυτό και για τα κουνούπια. Το φυτό εμφανίζει το φαινόμενο της Αλληλοπάθειας. (Parolin et al.,2014). Ο όρος της αλληλοπάθειας αναφέρεται στην απελευθέρωση χημικών ουσιών από ένα φυτό οι οποίες επιδρούν με κάποιο τρόπο σ ένα άλλο. Αυτές οι χημικές ουσίες συντίθενται είτε από διαφορετικά μέρη ενός φυτού, είτε απελευθερώνονται μέσω διαδικασιών φυσικής αποσύνθεσης. Η αλληλοπάθεια αποτελεί έναν μηχανισμό επιβίωσης που επιτρέπει σε πολλά φυτά να ανταγωνιστούν γειτονικά για θρεπτικά στοιχεία. Εκτός από τα φυτά και άλλοι οργανισμοί όπως τα βακτήρια, οι ιοί και οι μύκητες έχουν αλληλοπαθητικές ιδιότητες. Συνήθως οι αναφορές σε αλληλοπαθητικά φαινόμενα σχετίζονται με αρνητικές επιδράσεις, αλλά αυτό δεν είναι απόλυτα σωστό. Πολλές φορές η αρνητική επίδραση σε ένα φυτό σημαίνει ωφέλεια για ένα άλλο. Για παράδειγμα οι αλληλοπαθητικές ιδιότητες πολλών φυτών κάλυψης ή χλοοταπήτων συμβάλλουν στην καταπολέμηση των ανεπιθύμητων ζιζανίων. Το πιο γνωστό παράδειγμα αλληλοπαθητικής δράσης είναι εκείνο της καρυδιάς. Σε όλα τα μέρη του δένδρου παράγεται η ουσία υδροζουγκλόνη η οποία μετατρέπεται σε αλληλοτοξίνη όταν εκτεθεί στο οξυγόνο. Οι ρίζες, τα φύλλα και τα κλαδιά που αποσυντίθενται απελευθερώνουν την ζουγκλόνη στο έδαφος αναχαιτίζοντας την ανάπτυξη πολλών φυτών και ιδιαίτερα της οικογένειας Solanaceae (τομάτες, πιπεριές, κτλ). Τα φλαβονοειδή που υπάρχουν στο φυτό καθώς και άλλες ενώσεις του εξιδρώματος στις αδενικές τρίχες είναι υπεύθυνα για την ισχυρή αντιμικροβιακή και αλληλοπαθητική δράση του φυτού. η. ΑΛΛΕΣ ΧΡΗΣΕΙΣ Μελισσοκομικό φυτό. Επιπλέον σαν βαφικό δίνει ωραίες πράσινες αποχρώσεις για τις βαφές των ρούχων. Τέλος ο θάμνος μαζί με τα φύλλα έχει τη δυνατότητα, όταν μπαίνει σαν στρώμα να γίνεται θυμίαμα, να διώχνει τα φίδια, να απομακρύνει τα κουνούπια και να σκοτώνει και τους ψύλλους

65 Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Β.1 ΓΕΝΙΚΑ Προκειμένου λοιπόν να προβούμε σε μελέτη της χημικής σύστασης του αιθερίου ελαίου στο κύκλο ζωής του φυτού προέκυψε η ανάγκη περισσότερων της μιας συλλογών του φυτού στη διάρκεια ενός έτους. Έτσι από τον Οκτώβριο του 2013 μέχρι τον Οκτώβριο του 2014 πραγματοποιήθηκαν έξι συλλογές του φυτού. Εικόνα 10 : Άγιος Γεώργιος, Αμμουλιανή Χαλκιδικής Η συλλογή του φυτού έγινε στη τοποθεσία Αγ. Γεώργιος, στο νησί της Αμμουλιανής, στη Χαλκιδική. Η περιοδικότητα των συλλογών δεν ήταν ιδιαίτερα εφικτή λόγω των έντονων βροχοπτώσεων τη συγκεκριμένη χρονιά. Παρόλα αυτά έγιναν συλλογές τον Οκτώβριο και Δεκέμβριο του 2013 και τον Μάρτιο, Αύγουστο, Σεπτέμβριο και Οκτώβριο του Φυτικό υλικό υπάρχει επίσης αποθηκευμένο στο εργαστήριο Φαρμακογνωσίας του τομέα Φαρμακογνωσίας-Φαρμακολογίας της Φαρμακευτικής Σχολής του Α.Π.Θ. Η αναγνώριση του φυτού έγινε από τη κα Τουπλικιώτου Δήμητρα στο Κέντρο Γεωργικής Έρευνας Βορείου Ελλάδος, Ελληνικός Γεωργικός Οργανισμός «ΔΗΜΗΤΡΑ»

66 Β.1.1 ΦΥΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ Έγιναν έξι συλλογές του φυτού στη διάρκεια ενός έτους. Συγκεκριμένα, συλλέχθηκαν τα υπέργεια τμήματα του φυτού (άνθη, καρποί, φύλλα, λεπτά κλαδάκια). Οι συλλογές πραγματοποιήθηκαν τους μήνες Οκτώβριο και Δεκέμβριο του έτους 2013 καθώς επίσης και τους μήνες Μάρτιο, Αύγουστο, Σεπτέμβριο και Οκτώβριο του έτους Το φυτικό υλικό των τριών πρώτων μηνών αφέθηκε να ξηραθεί για ένα μήνα περίπου, σε χώρο δροσερό και σκιερό και χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια. Αντίθετα, το φυτικό υλικό που συλλέχθηκε τους τρεις επόμενους μήνες χρησιμοποιήθηκε φρέσκο. Για τις ανάγκες της μελέτης θα ονομάζουμε στο εξής τα δείγματα των αιθερίων ελαίων με κάποιες συντομογραφίες ανάλογα με τον μήνα που συλλέχθηκε το φυτό. Έτσι : DV10 : To αιθέριο έλαιο που λήφθηκε με την απόσταξη του φυτού που συλλέχθηκε τον Οκτώβριο DV12 : To αιθέριο έλαιο που λήφθηκε με την απόσταξη του φυτού που συλλέχθηκε τον Δεκέμβριο DV'3 : To αιθέριο έλαιο που λήφθηκε με την απόσταξη του φυτού που συλλέχθηκε τον Μάρτιο DV'8 : αιθέριο έλαιο που λήφθηκε με την απόσταξη του φυτού που συλλέχθηκε τον Αύγουστο DV'9 : To αιθέριο έλαιο που λήφθηκε με την απόσταξη του φυτού που συλλέχθηκε τον Σεπτέμβριο DV'10 :Το αιθέριο έλαιο που λήφθηκε με την απόσταξη του φυτού που συλλέχθηκε τον Οκτώβριο Β.1.2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β Διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν Οι διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: n-pentane Carlo Erba (PA) για την παραλαβή του αιθερίου ελαίου n- Hexane Carlo Erba (PA) για την αραίωση των δειγμάτων των αιθερίων ελαίων προκειμένου να χρησιμοποιηθούν για ανάλυση στο GC-MS. Toluol Ethyl acetate ester (EtA)

67 Β.1.3. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Β Παραλαβή των πτητικών συστατικών Μετά τη συλλογή των δειγμάτων και την ξήρανση κάποιων εξ' αυτών χρησιμοποιήθηκε η κλασσική μέθοδος της υδροαπόσταξης για την απομόνωση και παραλαβή του αιθερίου ελαίου του φυτού. Τα υπέργεια τμήματα του φυτού D. viscosa αφού αρχικά κατατμήθηκαν τοποθετήθηκαν μέσα σε γυάλινη σφαιρική φιάλη (άμβυκας) μαζί με νερό και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε μανδύα θερμότητας. Ο άμβυκας συνδέθηκε με ψυκτήρα. Με τη θέρμανση του νερού το φυτικό υλικό άρχισε να βράζει και το πτητικό αιθέριο έλαιο να υγροποιείται και να συλλέγεται με τη βοήθεια n-pentane από συγκεκριμένο σημείο της συσκευής Clevenger. O χρόνος παραμονής του υλικού στην εστία θερμότητας υπολογίζεται σε 4 ώρες. Στο αιθέριο έλαιο που συλλέχθηκε προστέθηκε άνυδρο θειικό νάτριο και στη συνέχεια άζωτο για να μην συμβούν αλλοιώσεις. Κατόπιν τοποθετήθηκε το έλαιο στην κατάψυξη μέχρι να γίνει η ανάλυσή του. Η ίδια διαδικασία ακολουθήθηκε για κάθε φυτικό υλικό που συλλεγόταν. Στη συνέχεια με την TLC θέλαμε να έχουμε μια πρώτη εικόνα για την ποιοτική σύσταση των δειγμάτων. Η απόδοση του αιθερίου ελαίου σε κάθε απόσταξη ήταν διαφορετική αφού όπως αναφέραμε στην αρχή αυτή εξαρτάται από πολλούς παράγοντες. Επίσης η χημική ένωση που υπήρχε σε μεγαλύτερη % συγκέντρωση διέφερε από δείγμα σε δείγμα. Β Ποιοτική και ποσοτική ανάλυση των πτητικών συστατικών. Η ανάλυση των αιθερίων ελαίων, έγινε με αέριο χρωματογραφίαφασματοσκοπία μάζας (GC-MS). Για τη GC-MS ανάλυση, χρησιμοποιήθηκε σύστημα SHIMADZU GC GCMS-QP2010 και η μέθοδος παραγωγής ιόντων ήταν ιονισμός με ηλεκτρόνια (70 ev). Χρησιμοποιήθηκε μία άπολη στήλη HP-5MS (30 m x 0.25 mm, film thickness: 0.25 μm), με θερμικό πρόγραμμα από τους 50 ο C (ισόθερμο έως 5 min) μέχρι τους 290 ο C, με ρυθμό αύξησης της θερμοκρασίας 4 ο C/min. Ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε το αδρανές αέριο ήλιο (Ηe, 1.0 ml/min)

68 Eπίσης χρησιμοποιήθηκε και μία πολική στήλη ΑΤ-WAX (60m x 0.32mm, film thickness: 0,25μm), με θερμικό πρόγραμμα από τους 50 οc (ισόθερμο έως 20 min) μέχρι τους 260 ο C (ισόθερμο 2 min) με ρυθμό αύξησης της θερμοκρασίας 3 οc/min. Ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε το αδρανές αέριο ήλιο (Ηe, 2,02 ml/min). Ο ενέσιμος όγκος για κάθε δείγμα αιθερίου ελαίου ήταν 1 μl. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των συστατικών βασίστηκε στον ολικό αριθμό θραυσμάτων (total ion count) των μεταβολιτών, όπως αυτά ανιχνεύτηκαν από το φασματογράφο μάζας. Το λογισμικό που χρησιμοποιήθηκε ήταν Shimadzu Lab Solutions Software (GC-MS solution version 2.5). Η ταυτοποίηση των χημικών συστατικών έγινε με βάση το χρόνο παρακράτησης κάθε συστατικού (Rt) σε σχέση με τους χρόνους παρακράτησης προτύπων ενώσεων και μελέτη των φασμάτων μάζας, με τη βοήθεια των βιβλιοθηκών NIST/NBS (Massada, 1976) και των δεδομένων βιβλιογραφίας (Adams, 2007) καθώς και με υπολογισμό των συντελεστών AI (Arithmetic indexes) σύμφωνα με την εργασία των Van den Dool and Kratz (1963), σε σχέση με τους χρόνους παρακράτησης προτύπων υδρογονανθράκων (C9-C25). Επίσης, σε ορισμένες περιπτώσεις, έγινε συγχρωματογράφηση με πρότυπες ενώσεις. Στη συνέχεια θα δούμε τα χρωματογραφήματα των έξι δειγμάτων που προέκυψαν από την ανάλυση στο GC-MS (με την ΗP-5MS στήλη) καθώς επίσης και ένα συγκεντρωτικό πίνακα με όλες τις ενώσεις που ταυτοποιήθηκαν κατά την ανάλυση του κάθε δείγματος χωριστά. Ακολούθως, θα μελετήσουμε την ανάλυση των ίδιων δειγμάτων αλλά σε GC-MS με την στήλη πολικού υποστρώματος (ΑΤ-WAX) (x1,000,000) TIC Χρωματογράφημα 1. Δείγμα DV10 Στο χρωματογράφημα 1 μπορούμε να διακρίνουμε τις δύο μέγιστες κορυφές που αντιστοιχούν στην βορνεόλη, μια

69 μονοτερπενική αλκοόλη, και στον οξικό βορνυλεστέρα, έναν μονοτερπενικό εστέρα με ποσοστά % αντίστοιχα στο συγκεκριμένο δείγμα 33.1 και Ζυγίστηκαν 250g αποξηραμένου φυτικού υλικού και η απόδοση σε αιθέριο έλαιο αυτού % είναι 0.5% (ml/100g). To αιθέριο έλαιο έχει υποκίτρινο χρώμα (x1,000,000) TIC Χρωματογράφημα 2. Δείγμα DV12 Και στο χρωματογράφημα 2 οι δύο εξέχουσες κορυφές αντιστοιχούν στην βορνεόλη και τον εστέρα της με ποσοστά % 17.1 και Ζυγίστηκαν 308.2g αποξηραμένου φυτικού υλικού και η απόδοση % σε αιθέριο έλαιο ήταν 0.13% (ml/100g). (x1,000,000) TIC Χρωματογράφημα 3. Δείγμα DV'3 Στο χρωματογράφημα 3 πάλι η βορνεόλη και ο εστέρας της εμφανίζονται με υψηλά ποσοστά % 27.6 και 28.8 αντίστοιχα, όμως

70 εμφανίζεται με υψηλό ποσοστό % 22.5 και μόνο στο δείγμα του Μαρτίου η (Ε)-ανηθόλη, παράγωγο του φαινυλοπροπανίου και ισομερές της εστραγκόλης. H ανηθόλη πιθανό να δημιουργείται από συνυπάρχοντα στο φυτό φαινολικά παράγωγα που αποικοδομούνται και τα οποία στη διάρκεια συνθέτουν την ανηθόλη. Ζυγίστηκαν g αποξηραμένου φυτικού υλικού και η απόδοση αυτού σε αιθέριο έλαιο ήταν μόνο 0.046ml/100g. (x1,000,000) TIC (Ε)-Anethole Χρωματογράφημα 4. Δείγμα DV'8 H βορνεόλη και ο εστέρας της εξακολουθούν να είναι τα κύρια συστατικά του δείγματος και κατά τον μήνα Αύγουστο με ποσοστά % αντίστοιχα 18.9 και Ζυγίστηκαν 292g φρέσκου φυτικού υλικού και η απόδοση σε αιθέριο έλαιο ήταν 0.136ml/100g φυτού

71 7.5 (x1,000,000) TIC Χρωματογράφημα 5. Δείγμα DV'9 Τον μήνα Σεπτέμβριο παρόλο που παραμένουν τα κύρια συστατικά του αιθερίου ελαίου η βορνεόλη και ο εστέρας της είναι οφθαλμοφανές ότι η κορυφή του εστέρα είναι πολύ υψηλότερη από αυτή της αλκοόλης. Αυτό αποδίδεται και αριθμητικά με τα ποσοστά τους που είναι 76.2 για τον εστέρα και 8.4 για την αλκοόλη αντίστοιχα. Ζυγίστηκαν 150g φρέσκου φυτικού υλικού και η απόδοση σε έλαιο ήταν 0.4 ml/100g. Να σημειωθεί ότι τον Σεπτέμβριο έχουμε την μέγιστη ανθοφορία. (x1,000,000) 7.5 TIC Χρωματογράφημα 6. Δείγμα DV'10 Στο χρωματογράφημα αυτό βλέπουμε ότι το ποσοστό της βορνεόλης αρχίζει να αυξάνεται στο έλαιο ενώ του εστέρα αρχίζει να μειώνεται.ζυγίστηκε 265g φρέσκου φυτικού υλικού και η απόδοση σε έλαιο ήταν 0.26ml/100g. Από τον αναλυτικό συγκεντρωτικό πίνακα που παρατίθεται στη συνέχεια μπορούν να εξαχθούν κι άλλα συμπεράσματα που θα συζητηθούν παρακάτω

72

73 DITTRICHIA VISCOSA HP-5ΜS α/α COMPOUNDS RT ΑI DV10 DV12 DV ' 3 DV ' 8 DV ' 9 DV ' 10 OKT 2013 ΔΕΚ 2013 ΜΑΡ 2014 ΑΥΓ 2014 ΣΕΠΤ 2014 ΟΚΤ 2014 Ταυτοποίηση 1 α-pinene AI, MS, Co-GC 2 Camphene AI, MS 3 β-pinene AI, MS, Co-GC 4 <dehydro-1,8-> Cineole AI, MS 5 p-cymene t t - AI, MS, Co-GC 6 Limonene AI, MS 7 Benzene acetaldehyde AI, MS 8 (2E)-Octen-1-al AI, MS 9 Acetophenone AI, MS 10 p-tolualdehyde AI, MS 11 p-cymenene AI, MS 12 Nonalal AI, MS 13 o-methyl acetophenone AI, MS 14 Camphor AI, MS, Co-GC 15 Nerol oxide AI, MS 73

74 α/α COMPOUNDS RT ΑI DV10 DV12 DV ' 3 DV ' 8 DV ' 9 DV ' 10 OKT 2013 ΔΕΚ 2013 ΜΑΡ 2014 ΑΥΓ 2014 ΣΕΠΤ 2014 ΟΚΤ 2014 Ταυτοποίηση 16 Camphene hydrate AI, MS 17 trans-pinocamphone AI, MS 18 (2E)-Nonen-1-al AI, MS 19 Isoborneol AI, MS 20 Borneol AI, MS, Co-GC 21 4-Terpineol AI, MS, Co-GC 22 p-cymen-8-ol t AI, MS 23 a-phellandren-8-ol AI, MS 24 Bornyl formate t - - AI, MS 25 n-decanal AI, MS 26 Carvomenthenal AI, MS 27 Isobornyl formate t AI, MS 28 Coahuilensol, methyl ether AI, MS 29 Pulegone t AI, MS 30 (2E,4E)-Nonadienal AI, MS 31 n-decanol t AI, MS 32 (2E)-Decenal AI, MS 33 Bornyl acetate AI, MS, Co-GC 74

75 α/α COMPOUNDS RT ΑI DV10 DV12 DV ' 3 DV ' 8 DV ' 9 DV ' 10 OKT 2013 ΔΕΚ 2013 ΜΑΡ 2014 ΑΥΓ 2014 ΣΕΠΤ 2014 ΟΚΤ 2014 Ταυτοποίηση 34 (E)-Anethole AI, MS, Co-GC 35 (2E,4Z)-Decadienal AI, MS 36 (2E,4E)-Decadienal AI, MS 37 Isobutyl benzoate AI, MS 38 n-undecanol AI, MS 39 (2E)-Undecenal AI, MS 40 Isobornyl propanoate AI, MS 41 (E)-β-Damascenone AI, MS 42 n-tetradecane AI, MS 43 2-Dodecanone AI, MS 44 (E)-Caryophyllene AI, MS 45 3-buten-1-ol,3-methyl, benzoate AI, MS 46 Geranyl acetone AI, MS 47 a-caryophyllene t - - AI, MS, Co-GC 48 a-muurolene AI, MS 49 <Dehydro>aromadendrene AI, MS 50 γ-irone AI, MS 75

76 α/α COMPOUNDS RT ΑI DV10 DV12 DV ' 3 DV ' 8 DV ' 9 DV ' 10 OKT 2013 ΔΕΚ 2013 ΜΑΡ 2014 ΑΥΓ 2014 ΣΕΠΤ 2014 ΟΚΤ 2014 Ταυτοποίηση 51 Germacrene-D AI, MS 52 Geranyl propanoate AI, MS 53 Neryl isobutanoate AI, MS 54 δ-guaiene AI, MS 55 β-selinene AI, MS 56 Prenyl benzoate AI, MS 57 γ-cadinene AI, MS 58 δ-cadinene AI, MS 59 Geranyl butanoate t AI, MS 60 Geranyl-2-methyl, butanoate AI, MS 61 (3Z)-Hexenyl benzoate AI, MS 62 Neryl isovalerate AI, MS 63 Caryophyllene oxide AI, MS 64 Caryophylla-4(12),8(13)- dien-5a-ol ή 5β-ol AI, MS 65 tau-cadinol AI, MS 66 δ-cadinol AI, MS 67 Selin-11-en-4-a-ol t - AI, MS 76

77 α/α COMPOUNDS RT ΑI DV10 OKT 2013 DV12 ΔΕΚ 2013 DV ' 3 ΜΑΡ 2014 DV ' 8 ΑΥΓ 2014 DV ' 9 ΣΕΠΤ 2014 DV ' 10 ΟΚΤ 2014 Ταυτοποίηση 68 (Ζ)-Nerolidyl-acetate AI, MS 69 Pentadecanal AI, MS 70 Hexahydrofarnesyl acetone AI, MS Total Area % % Moνοτερπενικοί 1,7 2,8 0,4 9,3 6,7 4,9 Υδρογονάνθρακες % Μονοτερπενικές αλκοόλες 35,2 20,0 33,3 22,6 12,3 35,9 % Μονοτερπενικές κετόνες 0,3 0,7 1,2 0,7-0,2 % Μονοτερπενικές αλδεΰδες - - 0, % Μονοτερπενικοί εστέρες 56,2 66,0 29,0 64,1 76,7 50,9 % Λοιπά οξυγονωμένα - 0,3 23,0 0,1 1,7 - μονοτερπένια % Σεσκιτερπενικοί 1,3 1,2 0,7 1,6 2,2 3,3 Υδρογονάνθρακες % Οξυγονωμένα Σεσκιτερπένια 3,3 4,4 2,8 1,4 0,1 3,7 % Λοιπά 0,7 2,5 7,8 0,2 0,1 0,8 Απόδοση αιθερίου ελαίου (ml/100gr) RT: o χρόνος κατακράτησης (Retention Time), AΙ= Arithmetic index, MS=Φάσμα μάζης, Co-GC= συγχρωματογράφηση με πρότυπη ουσία. 77

78 ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ Παρατηρούμε ότι τα % ποσοστά των μονοτερπενικών εστέρων και των μονοτερπενικών αλκοολών σε όλα τα παραπάνω δείγματα είναι πολύ υψηλότερα σε σύγκριση με τα υπόλοιπα συστατικά του αιθερίου ελαίου. Επίσης είναι κάτι που συμβαίνει σε όλη τη διάρκεια του έτους. Επίσης είναι φανερό ότι η % απόδοση του αιθερίου ελαίου είναι υψηλότερη κατά την περίοδο ανθοφορίας του φυτού σε σχέση με το % ποσοστό στην υπόλοιπη διάρκεια του έτους (Σχήμα 10). ΚΥΡΙΟΤΕΡΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΟΛΩΝ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ α/α COMPOUNDS DV10 OKT 2013 DV12 ΔΕΚ 2013 DV ' 3 ΜΑΡ 2014 DV ' 8 ΑΥΓ 2014 DV ' 9 ΣΕΠΤ 2014 DV ' 10 ΟΚΤ Camphene ,8-dehydro-cineole Borneol Bornyl acetate tau-cadinol (E)-Anethole

79 Μονοτ. αλκοόλες Μονοτ. εστέρες Μονοτ. Υδρογ. Σεσκ.υδρογ. Οξυγ. Σεσκιτ. Λοιπά Οκτ-13 Νοε-13 Δεκ-13 Ιαν-14 Φεβ-14 Μαρ-14 Απρ-14 Μαϊ-14 Ιουν-14 Ιουλ-14 Αυγ-14 Σεπ-14 Οκτ-14 Σχήμα 9: Απεικόνιση της % ποσοστιαίας κατανομής των τερπενίων στην άπολη στήλη (HP-5MS) 79

80 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 % Απόδοση αιθ. ελαίου 0,1 0,05 0 Οκτ-13 Νοε-13 Δεκ-13 Ιαν-14 Φεβ-14 Μαρ-14 Απρ-14 Μαϊ-14 Ιουν-14 Ιουλ-14 Αυγ-14 Σεπ-14 Οκτ-14 Σχήμα 10: % Απόδοση αιθερίου ελαίου Όπως γίνεται αντιληπτό τα κυριότερα συστατικά του αιθερίου ελαίου εμφανίζουν διακυμάνσεις ανάλογα με το στάδιο ανάπτυξης του φυτού. Τα δύο κυριότερα συστατικά είναι η βορνεόλη και ο εστέρας της τα οποία βρίσκονται σε υψηλή % συγκέντρωση συγκριτικά με τα υπόλοιπα συστατικά του αιθερίου ελαίου. Έτσι στην περίοδο της μέγιστης ανθοφορίας που είναι τον Σεπτέμβριο η βορνεόλη βρίσκεται σε ποσοστό 8.4%, ο εστέρας της σε ποσοστό 76.2% και ακολουθούν το καμφένιο (5.5%), η 1,8-dehydro-cineole (2.5%) και η tau-καδινόλη (0.8%). Επειδή η συλλογή φυτού άρχισε τον Οκτώβριο του έτους 2013 και ολοκληρώθηκε τον Οκτώβριο του έτους 2014 υπάρχει δυνατότητα να εκτιμήσουμε τα συστατικά του αιθερίου ελαίου τους δύο αυτούς μήνες. Τα δεδομένα παρατίθενται στο πίνακα που ακολουθεί. Πίνακας 10. ΣΥΓΚΡIΣΗ ΤΩΝ ΚΥΡΙΟΤΕΡΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΑΝΑΜΕΣΑ ΣΤΟΝ ΟΚΤ 2013 ΚΑΙ ΟΚΤ 2014 α/α COMPOUNDS OKT 2013 OKT Camphene ,8-dehydro-cineole Borneol Bornyl acetate tau-cadinol