Θάνος Νταϊλιάνης. Μακρο- και μικροταξινομική μελέτη. με κλασικές και μοριακές τεχνικές. των εμπορικών σπόγγων της Μεσογειου ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

Transcript

1 Μακρο- και μικροταξινομική μελέτη των εμπορικών σπόγγων της Μεσογειου με κλασικές και μοριακές τεχνικές Θάνος Νταϊλιάνης ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Θεσσαλονίκη 2011

2

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΗ ΕΠΕΤΗΡΙΔΑ ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Μακρο- και μικροταξινομική μελέτη των εμπορικών σπόγγων της Μεσογείου με κλασικές και μοριακές τεχνικές Θάνος Νταϊλιάνης ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ που υποβλήθηκε στο τμήμα Βιολογίας της Σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης Θεσσαλονίκη 2011

4 Η έγκριση της παρούσας διατριβής υπό του Τμήματος Βιολογίας της Σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλοί αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως (Ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2) Η έρευνα για την παρούσα διδακτορική διατριβή υλοποιήθηκε στο Τμήμα Βιολογίας του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης και στο Ινστιτούτο Θαλάσσιας Βιολογίας & Γενετικής του Ελληνικού Κέντρου Θαλασσίων Ερευνών. Χρηματοδότηση της έρευνας: Το Ινστιτούτο Θαλάσσιας Βιολογίας & Γενετικής του ΕΛΚΕΘΕ κάλυψε τον κύριο όγκο των λειτουργικών εξόδων για τις εργαστηριακές αναλύσεις και την υποτροφία του συγγραφέα. Το ερευνητικό πρόγραμμα Εφαρμογή καινοτόμων μέτρων στήριξης της σπογγαλιείας στο Αιγαίο (ΕΠΑΛ , Μέτρο Δράση 3) του Υπουργείου Αγροτικής Ανάπτυξης & Τροφίμων κάλυψε τη συλλογή δειγμάτων στο Αιγαίο. Το ερευνητικό πρόγραμμα ECIMAR (Ecologie Chimique Marine Indicateurs de Chimiodiversité et Valorisation) του Εθνικού Κέντρου Επιστημονικής Έρευνας της Γαλλίας (CNRS) κάλυψε μέρος των λειτουργικών εξόδων για τις εργαστηριακές αναλύσεις. Φωτογραφία εξωφύλλου: Λεπτομέρεια εξωτερικής μορφολογίας ατόμου Spongia που συλλέχθηκε στη Ν. Νάξο (Κυκλάδες) τον Αύγουστο του Φωτογραφία: Θάνος Νταϊλιάνης

5 ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI SCIENTIFIC ANNALS OF THE SCHOOL OF BIOLOGY OF THE FACULTY OF SCIENCES Macro- and microtaxonomic study of Mediterranean bath sponges with morphometric and molecular approaches Thanos Dailianis DOCTORATE THESIS submitted to the School of Biology of the Faculty of Sciences Aristotle University of Thessaloniki Thessaloniki 2011

6

7 Επιβλέπουσα: Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή: Ελένη Βουλτσιάδου Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ελένη Βουλτσιάδου Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Κώστας Ντούνας Διευθυντής Ερευνών Ζαχαρίας Σκούρας Καθηγητής Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή: Θεόδωρος Αμπατζόπουλος Καθηγητής Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Ελένη Βουλτσιάδου Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Δρόσος Κουτσούμπας Αναπληρωτής Καθηγητής Πανεπιστήμιο Αιγαίου Κώστας Ντούνας Διευθυντής Ερευνών Ελληνικό Κέντρο Θαλασσίων Ερευνών Ζαχαρίας Σκούρας Καθηγητής Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Αλέξανδρος Τριανταφυλλίδης Επίκουρος Καθηγητής Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Χαρίτων Χιντήρογλου Καθηγητής Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης

8 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Εισαγωγή και αιτιολόγηση της μελέτης 3 α. Γενικά 3 β. Σπόγγοι: στοιχεία βιολογίας 4 γ. Οι Μεσογειακοί σπόγγοι μπάνιου 5 γ.1. Σωματική δομή 6 γ.2. Θρέψη και διηθητική ικανότητα 8 γ.3. Αναπαραγωγή 9 γ.4. Γεωγραφική εξάπλωση 11 γ.5. Αλιεία, υπερεκμετάλλευση και ασθένειες 12 γ.6. Η αναγκαιότητα για εμπλουτισμό της υπάρχουσας γνώσης 13 δ. Σκοπός της παρούσας έρευνας 14 ε. Βιβλιογραφία 16 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: Ανασκόπηση της ταξινόμησης Κατάταξη και διαγνωστικοί χαρακτήρες των τάξων των σπογγων του μπάνιου Το φύλο Porifera (Σπόγγοι) H κλάση Demospongiae (Δημόσπογγοι) Η τάξη Dictyoceratida (Δικτυοκερατόσπογγοι) Η οικογένεια Spongiidae (Σπογγίδες) Τα γένη Spongia και Hippospongia με έμφαση στα Μεσογειακά τους είδη Ανασκόπηση της ταξινόμησης των γενών Spongia και Hippospongia Σύνοψη Βιβλιογραφία 37 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: Συλλογή και προετοιμασία δειγμάτων Συλλογή δειγμάτων στο Αιγαίο Ερευνητικοί πλόες και συμπληρωματικές δειγματοληψίες Επεξεργασία και συντήρηση των δειγμάτων Συλλογή δειγμάτων στη Δυτική Μεσόγειο Προσδιορισμός ειδών και μορφοτύπων Επιλογή δειγμάτων για ανάλυση Βιβλιογραφία 50 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: Ανάλυση της ποικιλότητας των μορφολογικών χαρακτήρων Εισαγωγή Μέθοδοι και υλικά Επιλογή δειγμάτων Εκτίμηση μακροσκοπικών μορφολογικών χαρακτήρων Εκτίμηση μικροσκοπικών μορφολογικών χαρακτήρων Στατιστική ανάλυση Αποτελέσματα 63

9 Διαειδική και ενδοειδική ποικιλομορφία Γεωγραφική μορφολογική ποικιλότητα Συζήτηση Βιβλιογραφία 88 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4: Ανάλυση της γενετικής ποικιλότητας στο επίπεδο του είδους Εισαγωγή Μέθοδοι και Υλικά Επιλογή των δειγμάτων Απομόνωση DNA Ενίσχυση του τμήματος COI Ανάγνωση πρωτοδιάταξης του COI Έλεγχος και στοίχιση των αλληλουχιών πρόσθετες αλληλουχίες Φυλογενετική ανάλυση Αποτελέσματα Συζήτηση Βιβλιογραφία 106 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5: Ανάλυση της γενετικής ποικιλότητας των πληθυσμών Εισαγωγή Μέθοδοι και Υλικά Απομόνωση και χαρακτηρισμός των μικροδορυφορικών δεικτών Εκτίμηση της ενδοειδικής ποικιλότητας με χρήση μικροδορυφορικών δεικτών Αποτελέσματα Ανάλυση για το Spongia officinalis Ανάλυση για το Hippospongia communis Συνδυαστική ανάλυση για τα είδη Spongia officinalis και Hippospongia communis Συζήτηση Βιβλιογραφία 155 Γενικά σχόλια Σύνοψη 163 α. Σχετικά με τη μακροταξινομία των σπόγγων μπάνιου 163 β. Σχετικά με τη μικροταξινομία των σπόγγων μπάνιου 164 γ. Ενδοπληθυσμιακή ποικιλότητα 166 δ. Συμπεράσματα για τη διαχείριση και μελλοντικές ερευνητικές προτεραιότητες 166 ε. Βιβλιογραφία 167 Περίληψη 173 Abstract 174 Παράρτημα Α 177 Παράρτημα Β 179 Παράρτημα Γ 185 Παράρτημα Δ 187

10

11 Πρόλογος Η ιστορία της έρευνας που θα παρουσιαστεί στις επόμενες σελίδες ξεκίνησε στην πράξη μετά από μια συζήτηση με το διευθυντή ερευνών Κώστα Ντούνα (ΕΛΚΕΘΕ), το καλοκαίρι του 2004 στο Ηράκλειο της Κρήτης. Στη συζήτηση αυτή ο Κώστας ας μου επιτραπεί η οικειότητα μετά από τόσα χρόνια στενής συνεργασίας είχε αναφερθεί με ενθουσιασμό στις νέες και συναρπαστικές δυνατότητες που μπορεί να προσφέρει ο συγκερασμός των παραδοσιακών ερευνητικών εργαλείων της βιολογίας, της μορφομετρίας και της στατιστικής δηλαδή, με τις σύγχρονες μεθόδους εφαρμοσμένης γενετικής, σε μια ενοποιημένη προσέγγιση της θαλάσσιας οικολογίας. Η νύξη αυτή, σε συνδυασμό με την αναφορά στο θέμα των δυσκολιών που χαρακτηρίζουν τον διαχωρισμό των ειδών στους κοινούς Μεσογειακούς σπόγγους μπάνιου, ήταν αρκετά για να θέσουν σε εκκίνηση ένα έντονο ενδιαφέρον και μια ερευνητική προσπάθεια με πολλές αναμενόμενες δυσκολίες, αλλά και ισάριθμες προκλήσεις. Οι ρίζες όμως της συγκεκριμένης έρευνας φτάνουν ακόμα πιο βαθιά στο χρόνο, πίσω στο 1997 στη Θεσσαλονίκη, στην αρχή της συνεργασίας μου, ως νεαρού τελειόφοιτου, με την αναπληρώτρια καθηγήτρια Ελένη Βουλτσιάδου (ΑΠΘ). Η Ελένη και ας μου επιτραπεί για άλλη μια φορά η οικειότητα, εφόσον έχω την τιμή να με αναγνωρίζει ως φίλο εμφύτευσε μέσα μου από τότε την αγάπη της για τη συστηματική βιολογία, αλλά και τη μελέτη αυτού του τόσο ιδιαίτερου ζωικού φύλου, των σπόγγων. Ως επιβλέπουσα της παρούσας διατριβής μοιράστηκε απλόχερα μαζί μου τη γνώση και την εμπειρία της, συνετέλεσε καθοριστικά στη γέννηση και την επεξεργασία των ιδεών, και έδωσε υποστήριξη και λύσεις εκεί που όλα φαίνονταν να οδηγούν σε αδιέξοδο. Δεν θα ήταν υπερβολή να πω ότι η συμβολή της είναι διακριτή σε κάθε πτυχή της ανάλυσης που θα ακολουθήσει. Αισθάνομαι τυχερός που δέχτηκα τη συνεχή καθοδήγηση και την αμέριστη συμπαράσταση των δύο αυτών ανθρώπων, χωρίς τους οποίους τίποτε δεν θα ήταν τελικά εφικτό. Η πρώτη σημαντική πρόκληση που έπρεπε να αντιμετωπιστεί, ήδη από την αρχή της έρευνας, ήταν η απόκτηση από τη μεριά μου γνώσης και εμπειρίας σχετικά με τις μοριακές μεθόδους ως εργαλείο για τη συστηματική και την οικολογία. Καθοριστικός υπήρξε εδώ ο ρόλος του ερευνητή Κώστα Τσιγγενόπουλου (ΕΛΚΕΘΕ), επίσης συνεργάτη και φίλου, ο οποίος εκτός από τις εκτενείς συζητήσεις στο πρώτο στάδιο σχετικά με τις δυνατότητες και τις ιδιαιτερότητες των γενετικών δεικτών, υπήρξε σταθερά παρών σε όλα τα επόμενα βήματα, με συνεχή υποστήριξη και πολύτιμες υποδείξεις τόσο σε τεχνικά ζητήματα στο εργαστήριο όσο και σε επίπεδο ανάλυσης και θεωρητικών προεκτάσεων. Σημαντική στον ίδιο τομέα υπήρξε επίσης η συμβολή του καθηγητή Ζαχαρία Σκούρα (ΑΠΘ) ο οποίος, ως μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, παρακολούθησε την έρευνα σε όλα τα στάδιά της και προσέφερε καθοριστική ενθάρρυνση και καθοδήγηση σε κρίσιμα σημεία. Και πάλι η υλοποίηση της εργασίας δεν θα ήταν εφικτή χωρίς την υποστήριξη του διευθυντή του Ινστιτούτου Θαλάσσιας Βιολογίας & Γενετικής του ΕΛΚΕΘΕ, Δρ Αντώνη Μαγουλά, ο οποίος αγκάλιασε έμπρακτα το αντικείμενο της έρευνας και στήριξε την παρουσία μου ως διδακτορικού υπότροφου στο φορέα, όπου υλοποιήθηκε το μεγαλύτερο τμήμα της παρούσας έρευνας. Η δεύτερη μεγάλη πρόκληση είχε να κάνει με τον εντοπισμό ικανών πληθυσμών σπόγγων για τη στήριξη της έρευνας σύμφωνα με το σχεδιασμό. Όπως ήταν αναμενόμενο από την αρχή, αυτό υπήρξε ιδιαίτερα δύσκολο: κατά τη διάρκεια της εκτεταμένης προκαταρκτικής έρευνας πεδίου στην Κρήτη, ένα από τα παραδοσιακά πλουσιότερα σπογγαλιευτικά πεδία στο Αιγαίο, ελάχιστοι φυσικοί πληθυσμοί μπόρεσαν να εντοπιστούν αποτέλεσμα της δραματικής μείωσης μετά τα

12 τελευταία περιστατικά ασθενειών. Ανεκτίμητη υπήρξε εδώ η συμβολή των καπετάνιων και δυτών των σπογγαλιευτικών σκαφών Καπ. Γιώργος (Νικόλας, Διονύσης, Γιώργος & Πέτρος Ξυλουράς, Χριστόδουλος Βαρβαρής) και Θέμελης (Μιχάλης Ορφανός, Μανώλης Καλλιδώνης), οι οποίοι με φιλοξένησαν στο σκάφος τους, με αποδέχτηκαν ως συνοδό στις καταδύσεις τους και μοιράστηκαν μαζί μου την πολύτιμη εμπειρία τους. Η εξεύρεση των περισσότερων πληθυσμών του Αιγαίου που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα έρευνα και η συλλογή δειγμάτων από αυτούς δεν θα ήταν δυνατή χωρίς τη συνεισφορά τους. Στην διάφορες φάσεις της εργασίας πεδίου και των δειγματοληψιών στο Αιγαίο, είχα επίσης την πολύτιμη βοήθεια του Ιούλιου Γλαμπεδάκη (επαγγελματία δύτη), του Αποστόλη Κρυσταλλά (χημικός μηχανικός, ΕΛΚΕΘΕ) και του Αλέξη Λόλα (υποψήφιος διδάκτορας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας). Δεν θα μπορούσα, τέλος, να μην αναφερθώ στη συμβολή του αναπληρωτή καθηγητή Δημήτρη Βαφείδη (Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας), ο οποίος συνέβαλε αποφασιστικά στην υλοποίηση του ερευνητικού προγράμματος ΕΠΑΛ το οποίο στήριξε το μεγαλύτερο μέρος των ερευνητικών πλόων στο Αιγαίο. Από την άλλη μεριά, κατά τα αρχικά στάδια της εκπόνησης της διδακτορικής διατριβής είχα την τύχη να έρθω σε επαφή με τον ερευνητή του CNRS στο Κέντρο Ωκεανολογίας της Μασσαλίας Δρ Τιερί Περέζ, με τον οποίο μας συνδέει ένα κοινό πάθος για τους Μεσογειακούς σπόγγους μπάνιου και τη μελέτη της βιολογίας και της ιστορίας τους. Είμαι ευγνώμων για την ευκαιρία που μου πρόσφερε να γνωρίσω από κοντά τον υποθαλάσσιο πλούτο της περιοχής της Μασσαλίας, αλλά ακόμα περισσότερο για την ευγενική παραχώρηση πρόσβασης στην πλούσια προσωπική συλλογή του από δείγματα σπόγγων από την περιοχή της Νότιας Γαλλίας, καθώς και το Γιβραλτάρ. Η μελέτη των δειγμάτων αυτών προσαύξησε σημαντικά την ευρύτητα της παρούσας έρευνας. Παρόλο που η περίοδος που αφιερώνεται κατά τη διάρκεια μιας ερευνητικής εργασίας στο εργαστήριο και στην ανάλυση των δεδομένων είναι κατά βάση μια επίπονη και μοναχική διαδικασία, όταν κοιτάζει κανείς πίσω είναι ανακουφιστικό να δει σε πόσο μεγάλο βαθμό αυτή εμπλουτίστηκε από τη συνεργασία και τη συμβολή ενός συνόλου ανθρώπων που ενεπλάκησαν σε διάφορα στάδιά της. Στα πρώτα μου βήματα στο εργαστήριο Γενετικής (αλλά και συχνά στη συνέχεια) είχα δίπλα μου τη Δρ Σίλια Αντωνίου, η οποία με καθοδήγησε με γνώση και υπομονή στις βασικότερες εργαστηριακές πρακτικές των μοριακών αναλύσεων. Όλα τα στάδια εργασίας στον πάγκο ή στον υπολογιστή έγιναν ευκολότερα ή αποδοτικότερα λόγω της πολύτιμης εμπειρίας και τεχνικής υποστήριξης του προσωπικού του εργαστηρίου Γενετικής & Μοριακής Βιοτεχνολογίας του ΙΘΑΒΙΓ, Στέλιου Δαριβιανάκη, Ζακ Λανιέλ, Κατερίνας Οικονομάκη και Βάσως Τερζόγλου, τους οποίους και ευχαριστώ θερμά. Η φοιτήτρια του Πανεπιστημίου του Μονπελιέ, Μυριέλ Μπερζέ, στο πλαίσιο της πρακτικής της άσκησης στο ΙΘΑΒΙΓ δούλεψε δίπλα μου με επιμέλεια και δεξιότητα κατά τη διάρκεια της ανάλυσης των μικροδορυφορικών δεικτών και η βοήθειά στην αναμέτρηση με τον όγκο της δουλειάς υπήρξε πολύτιμη. Στο στάδιο της ανάλυσης των αποτελεσμάτων και της διερεύνησης των στατιστικών μεθοδολογιών τόσο στις μοριακές όσο και στις μορφομετρικές μεθόδους οι συζητήσεις με έναν αριθμό εκλεκτών συναδέλφων άνοιξαν δρόμους στην πρόοδο της ερευνητικής εργασίας, αύξησαν την αυτοπεποίθηση όταν υπήρχαν αμφιβολίες και πρότειναν λύσεις όταν εμφανίζονταν προβλήματα. Θέλω λοιπόν να ευχαριστήσω τους Δρ Χρυσάνθη Αντωνιάδου και Δρ Σπύρο Γκέλη (ΑΠΘ) για την πολύτιμη βοήθεια στην επιλογή και την υλοποίηση των στατιστικών αναλύσεων, αλλά και την αποτελεσματική αξιοποίηση των μορφομετρικών δεδομένων τη Δρ Σίλια Αντωνίου (ΙΘΑΒΙΓ), για άλλη μια φορά, για τη βοήθεια στην αποκωδικοποίηση και την ερμηνεία των γονοτυπήσεων τη Δρ Ρέα Αλεξανδρή (ΑΠΘ) για την εισαγωγή στην ανάλυση της πληθυσμιακής συγκρότησης και τον Δρ Παναγιώτη Κασαπίδη (ΕΛΚΕΘΕ), αντίστοιχα, για την εισαγωγή στη φυλογενετική ανάλυση.

13 Ιδιαίτερες ευχαριστίες θα ήθελα επίσης να απευθύνω στα μέλη της εξεταστικής επιτροπής της διδακτορικής διατριβής, καθηγητή Θεόδωρο Αμπατζόπουλο (ΑΠΘ), αναπληρωτή καθηγητή Δρόσο Κουτσούμπα (Πανεπιστήμιο Αιγαίου), επίκουρο καθηγητή Αλέξανδρο Τριανταφυλλίδη (ΑΠΘ), και καθηγητή Χαρίτωνα Χιντίρογλου (ΑΠΘ). Η παρακολούθηση της πορείας των ερευνητικών βημάτων, οι διαφωτιστικές συζητήσεις μαζί τους σε διάφορα στάδια της υλοποίησης και οι πολύτιμες προτάσεις και υποδείξεις τους στο τελικό κείμενο της εργασίας, υπήρξαν καθοριστικές παράμετροι για την επιτυχή έκβαση της παρούσας διατριβής. Για το τέλος, ένα μεγάλο ευχαριστώ κρατάω για το στενό οικογενειακό μου κύκλο, τη σύντροφό μου Ειρήνη Γαλλή, τους γονείς μου Χάρη και Άννα, και την αδελφή μου Κατερίνα Νταϊλιάνη, που μου προσέφεραν απλόχερα την ηθική, συναισθηματική, αλλά και υλική συμπαράστασή τους από το ξεκίνημα του μακρόχρονου και απαιτητικού αυτού ταξιδιού μέχρι το αίσιο τέλος του. Ελπίζω η καλοσύνη και η αγάπη τους να με συνοδεύουν και στα επόμενα. Θάνος Νταϊλιάνης Ηράκλειο, Οκτώβριος 2011

14

15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

16

17 Εισαγωγή και αιτιολόγηση της μελέτης α. Γενικά Οι αλιευόμενοι σπόγγοι της οικογένειας των Σπογγιδών (Porifera: Dictyoceratida: Spongiidae) αποτελούν μία ομάδα οργανισμών που χρησιμοποιήθηκε από τον άνθρωπο από τις απαρχές της ιστορίας του πολιτισμού (Voultsiadou & Tatolas 2005, Voultsiadou et al. 2011). Το ποιοτικό τους χαρακτηριστικό που τους κατέστησε πολύτιμους είναι η δομή του σκελετού τους, ο οποίος σχηματίζεται από ένα δίκτυο πρωτεϊνικών ινών με ιδανικό πάχος, πυκνότητα και ελαστικότητα ώστε να απορροφά και να κατακρατά μεγάλες ποσότητες υγρών. Τα κύρια αλιευόμενα είδη είναι τα Spongia officinalis Linnaeus, 1759 και Hippospongia communis Lamarck, 1813 που εποικίζουν τη Μεσογειακή υποπαραλιακή ζώνη (Vacelet 1959, Pronzato & Manconi 2008, Voultsiadou et al. 2011). Τα είδη αυτά αφθονούν σχετικά στην ανατολική Μεσόγειο, όπου υπάρχουν ακόμη και σήμερα τα κύρια σπογγαλιευτικά πεδία, ενώ στη δυτική λεκάνη της Μεσογείου παρόλο που υπάρχουν σποραδικοί πληθυσμοί, αυτοί δεν είναι εμπορικά εκμεταλλεύσιμοι (Pronzato & Manconi 2008). Σήμερα, τα αποθέματα των σπόγγων μπάνιου (bath sponges) στη Μεσόγειο εμφανίζονται σημαντικά μειωμένα σε σχέση με το παρελθόν (Pronzato & Manconi 2008, Voultsiadou et al. 2011). Η εντατική αλιεία τους για πάνω από δύο αιώνες, σε συνδυασμό με μια διαδοχή επιδημικών φαινομένων τις τελευταίες δύο δεκαετίες (Webster 2007, Garrabou et al. 2009) υποβάθμισε σε μεγάλο βαθμό την πληθυσμιακή αφθονία τους. Τα είδη S. officinalis και H. communis, μαζί με τους υπόλοιπους Μεσογειακούς σπόγγους μπάνιου, περιλαμβάνονται στα είδη για τα οποία υπάρχει θεσμοθετημένη ανάγκη προστασίας και ρύθμισης των πρακτικών εκμετάλλευσης, όπως καθορίζεται από το Παράρτημα III της Συνθήκης της Βέρνης και το Παράρτημα II της Διακήρυξης της Βαρκελώνης. Παρά το γεγονός αυτό, η εκμετάλλευση εξακολουθεί να λαμβάνει χώρα χωρίς, πρακτικά, την ύπαρξη ενός εφαρμοζόμενου πλαισίου διαχείρισης. Παρά την υψηλή οικονομική αξία και την εντατική αλίευση στη Μεσόγειο για μεγάλες χρονικές περιόδους, η συστηματική τους ταξινόμηση υπήρξε πολύπλοκη και προβληματική, ήδη από το ξεκίνημά της. Η ταξινόμησή τους στο επίπεδο του είδους έχει σημαδευτεί από πολυάριθμες αλλαγές στο παρελθόν αλλά και πρόσφατα, λόγω της μεγάλης ποικιλομορφίας που τους χαρακτηρίζει. Για παράδειγμα, διαφορετικοί μορφότυποι της S. officinalis έχουν διαδοχικά χαρακτηριστεί ως ποικιλίες (Schulze 1879), υποείδη (Vacelet 1959) ή και είδη (Pronzato & Manconi 2008), με αποκλειστικό κριτήριο την εξωτερική τους μορφολογία (η οποία αποτελεί έναν ασθενή ταξινομικό χαρακτήρα στα Ποροφόρα). Η ασαφής ταξινόμηση, σε συνδυασμό με την ελλιπή καταγραφή της τρέχουσας εξάπλωσης και αφθονίας των πληθυσμών των σπόγγων μπάνιου στη Μεσόγειο (Milanese et al. 2008, Voultsiadou et al. 2011), καθιστούν ανέφικτη κάθε προσπάθεια για δημιουργία ενός αποτελεσματικού πλαισίου διαχείρισής τους. Η αναγκαιότητα για ένα τέτοιο πλαίσιο κρίνεται όμως επείγουσα λόγω των φαινομένων που σχετίζονται με την παγκόσμια κλιματική αλλαγή, τα οποία ευθύνονται για μια σειρά επιδημικών φαινομένων στη Μεσόγειο τα τελευταία χρόνια (Garrabou et 3

18 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ al. 2009), καθώς και για μια σειρά υπαρκτών και μελλοντικών απειλών για τη Μεσογειακή βιοποικιλότητα (Coll et al. 2010). Η χρήση μοριακών τεχνικών αποδεικνύεται τα τελευταία χρόνια ιδιαίτερα χρήσιμη για τη μελέτη ανάλογων ερωτημάτων στο φύλο των Ποροφόρων, καθώς μπορεί να απαντήσει σε ερωτήματα που σχετίζονται με την εκτίμηση της ενδο- και διαειδικής ποικιλότητας και τον προσδιορισμό της φυλογεωγραφικής εξάπλωσης (Knowlton 2000, Féral 2002, Chenuil 2006). Διάφοροι μοριακοί δείκτες έχουν χρησιμοποιηθεί για την αποσαφήνιση της συστηματικής (Pöppe et al. 2010, Cárdenas et al. 2010) και τη διερεύνηση της φυλογεωγραφίας (Duran et al. 2004a-b, DeBiasse et al. 2010) στους σπόγγους. Από το σύνολο αυτό, η πρωτοδιάταξη ακολουθιών DNA της υπομονάδας Ι της οξειδάσης του κυτοχρώματος c (cytochrome c oxidase subunit I, COI) στο μιτοχόνδριο αποτελεί έναν ευρέως χρησιμοποιούμενο δείκτη για τη γενετική διάκριση ειδών που έχουν διαχωριστεί βάσει μορφολογικών (Heim et al. 2007, Cárdenas et al. 2010) ή οικολογικών χαρακτήρων (Duran & Rützler 2006, Wulff 2006), αλλά και για την αποκάλυψη κρυπτικών ειδών (βλέπε τη σχετική σύνοψη από τους Xavier et al. 2010). Επιπρόσθετα, οι μικροδορυφορικοί δείκτες χρησιμοποιούνται εκτεταμένα κατά την τελευταία δεκαετία για την ανίχνευση της πληθυσμιακής δομής θαλάσσιων ασπονδύλων (Addison & Hart 2004, Guitiérrez-Rodríguez & Lasker 2004, Baums et al. 2005, Pérez-Portela & Turon 2008, Ledoux et al. 2010). Πολυμορφικοί μικροδορυφορικοί δείκτες έχουν αναπτυχθεί μέχρι σήμερα για έξι είδη σπόγγων, μεταξύ των οποίων και ο Μεσογειακός σπόγγος μπάνιου Spongia lamella (Noyer et al. 2009), και έχουν χρησιμοποιηθεί επιτυχώς για την πληθυσμιακή μελέτη ορισμένων από τα είδη αυτά (Duran et al. 2004c, Blanquer et al. 2009, Blanquer & Uriz 2010). β. Σπόγγοι: στοιχεία βιολογίας Τα Ποροφόρα (Porifera) ή απλά σπόγγοι, είναι μία πολυπληθής ταξινομική ομάδα που περιλαμβάνει πάνω από 8000 έγκυρα αρτίγονα είδη, σύμφωνα με τη βάση δεδομένων World Porifera Database (van Soest et al. 2008). Πρόκειται για εδραία, διηθηματοφάγα Μετάζωα, τα οποία απαντούν σε μεγάλη ποικιλία υδάτινων οικοσυστημάτων, κυρίως θαλάσσιων (Bergquist, 1978). Χαρακτηρίζονται από την ύπαρξη στο εσωτερικό τους ενός συστήματος κυκλοφορίας του νερού, που αποτελείται από ένα υδροφόρο δίκτυο καναλιών και θαλάμων (Reiswig 1975). Το σύστημα αυτό επικοινωνεί με το εξωτερικό περιβάλλον μέσω ανοιγμάτων (πόρων) στην επιφάνεια του οργανισμού, διατρέχεται από μονοκατευθυντικό ρεύμα νερού και εξυπηρετεί τις περισσότερες βασικές βιολογικές ανάγκες του σπόγγου, όπως την ανταλλαγή αερίων, την πρόσληψη τροφής, την απέκκριση και την αναπαραγωγή (Ruppert et al. 2004). Οι σπόγγοι, σύμφωνα με τις κυρίαρχες ενδείξεις (Dunn et al. 2008), βρίσκονται στη βάση της εξελικτικής ιστορίας των πολυκύτταρων ζωικών οργανισμών, μεταξύ των μονοκύτταρων Χοανομαστιγωτών και των υπόλοιπων Μεταζώων (Εικόνα Ε1). Ίχνη της παρουσίας πρόδρομων μορφών σπόγγων έχουν διασωθεί σε γεωλογικά στρώματα ηλικίας 750 εκατομμυρίων ετών (Müller et al. 2007). Το φύλο διαχωρίζεται σε τρεις κλάσεις: τους Ασβεστόσπογγους (Calcarea Bowerbank, 1864), τους Δημόσπογγους (Demospongiae Sollas, 1885) και τους Υαλόσπογγους (Hexactinellida Schmidt, 1870). Η απουσία συμμετρίας και σταθερής σωματικής δομής, η άνιση διαθεσιμότητα πληροφοριακών μορφολογικών χαρακτήρων και η ιδιαίτερα έντονη ποικιλομορφία που χαρακτηρίζει το Φύλο, έχουν ως αποτέλεσμα μία ευμετάβλητη και αμφιλεγόμενη ταξονομία, ακόμα και σε επίπεδο ανώτερων ομάδων 4

19 ΕΙΣΑΓΩΓΗ & ΑΙΤΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ (Boury-Esnault 2006). Η μονοφυλετικότητα των Ποροφόρων έχει συχνά αμφισβητηθεί, και υπάρχουν ενδείξεις ότι οι σπόγγοι αποτελούν μια παραφυλετική ομάδα, με τους Ασβεστόσπογγους να παρουσιάζουν μεγαλύτερη συγγένεια με τα υπόλοιπα Μετάζωα (Borchiellini et al. 2001) (Εικόνα Ε1Β). A B Εικόνα Ε1: Φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των τριών κλάσεων στο φύλο των Ποροφόρων και η θέση τους στο ζωικό βασίλειο σύμφωνα (Α) με την κλασική προσέγγιση και (Β) με τις σύγχρονες ενδείξεις με βάση τα μοριακά δεδομένα. Τροποποιημένο από Manuel et al Figure Ε1: Phylogenetic affinities between the three poriferan classes and their position within the animal kingdom, according to: (A) the classic approach and (B) current indications based on molecular data. From Manuel et al. 2003, modified. γ. Οι Μεσογειακοί σπόγγοι μπάνιου Οι σπόγγοι μπάνιου (bath sponges) αποτελούν μία άτυπη κατηγορία μέσα στην αφθονία ειδών και μορφών που χαρακτηρίζει το φύλο των Ποροφόρων. Πρόκειται για είδη που ανήκουν στα τέσσερα από τα έξι γένη της οικογένειας των Σπογγιδών: τα γένη Spongia, Hippospongia, Coscinoderma και Rhopaloeides. Παρόλο που ο σκελετός των Σπογγιδών αποτελείται αποκλειστικά από σπογγίνη, η αντοχή, η πυκνότητα και η ελαστικότητα του δικτύου των ινών διαφέρουν από είδος σε είδος (Louden et al. 2007) και, ως εκ τούτου, δεν έχουν όλοι οι εκπρόσωποι των γενών αυτών χαρακτηριστικά που να επιτρέπουν τη χρήση τους ως σπόγγων μπάνιου. Στη Μεσόγειο, οι αλιευόμενοι σπόγγοι μπάνιου ανήκουν αποκλειστικά στα γένη Spongia και Hippospongia. Συγκεκριμένα, η αλιεία, το εμπόριο και η χρήση επικεντρώνονται στα είδη S. officinallis Linnaeus, 1759, S. lamella Schulze, 1879, S. zimocca Schmidt, 1862 και Hippospongia communis (Lamarck, 1814) (Εικόνα Ε2). Παρά την ιδιαίτερη οικονομική τους σημασία, η έκταση της στοχευμένης έρευνας πάνω στη βιολογία των σπόγγων μπάνιου παραμένει εντυπωσιακά μικρή μέχρι σήμερα, ακόμη και λαμβάνοντας υπόψη την υπάρχουσα γνώση για το -ούτως ή άλλως ελλιπώς μελετημένο- φύλο των Ποροφόρων. Η περιορισμένη έρευνα για τη Μεσόγειο επικεντρώνεται στο είδος S. officinalis. 5

20 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Εικόνα Ε2: Τα τέσσερα καθιερωμένα Μεσογειακά είδη σπόγγων μπάνιου, όπως φαίνονται μετά την επεξεργασία για εμπορική χρήση, η οποία αφαιρεί τους ζωντανούς ιστούς και αφήνει εκτεθειμένο το σκελετό σπογγίνης. Figure Ε2: The four established Mediterranean bath sponge species, depicted after processing for commercial use; the latter consists of maceration of living tissues, exposing the spongin skeleton. Πρακτικά μηδαμινή είναι η πρωτογενής έρευνα (εμπειρική ή πειραματική) όσον αφορά τη δομή (εξαιρουμένης της δομής του σκελετού) και τις βιολογικές λειτουργίες των υπόλοιπων Μεσογειακών ειδών σπόγγων μπάνιου. γ.1. Σωματική δομή Τα γενικά χαρακτηριστικά της σωματικής δομής των σπόγγων μπάνιου ακολουθούν τα πρότυπα που ισχύουν για την πλειοψηφία των Δημόσπογγων (Bergquist 1978, Ruppert et al. 2004). Μια ιδιαιτερότητα των Δικτυοκερατόσπογγων είναι η συμβίωση με κυανοφύκη και ετερότροφα βακτήρια (Wulff 2006). Το χοανόσωμα των Σπογγιδών ειδικά, φιλοξενεί εντυπωσιακή ποικιλότητα βακτηριακών τύπων (Webster et al. 2001) που κατανέμονται σε όλη την έκταση της μεσοΰλης, καταλαμβάνοντας συχνά ποσοστό μεγαλύτερο του 30% επί της συνολικής βιομάζας (Vacelet et al. 1989). Τα κυρίαρχα μορφολογικά χαρακτηριστικά που έχουν μελετηθεί στους Μεσογειακούς σπόγγους μπάνιου αφορούν στην οργάνωση και δομή του σκελετού και του υδροφόρου δικτύου του S. officinalis. 6

21 ΕΙΣΑΓΩΓΗ & ΑΙΤΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Εικόνα Ε3: Κύρια ίνα του σκελετού της Spongia officinalis όπως φαίνεται στο οπτικό μικροσκόπιο. Η κατεύθυνσή της είναι από το εσωτερικό του σώματος (δεξιά) προς το εξωτερικό (αριστερά), χωρίς διακλαδώσεις. Δευτερεύουσες ίνες ενώνονται μ αυτήν κατά μήκος της. Η κύρια ίνα περιέχει έγκλειστα. Figure Ε3: Main skeletal fiber of Spongia officinalis as seen through the optical microscope. It is originating from the inner region of the sponge body (right) and is directed towards the exterior (left); it contains enclosed foreign material and lacks ramifications. Secondary fibers stem from it along its length. Ο σκελετός (Εικόνες Ε3, Ε4) αποτελείται κατά κύριο λόγο από ένα ενιαίο δίκτυο διακλαδιζόμενων και τεμνόμενων ινών σπογγίνης (δευτερεύουσες ίνες) πάχους περίπου μm, με μικρές αποκλίσεις μεταξύ των ειδών (Pronzato & Manconi 2008). Η επιφάνεια των δευτερευουσών ινών είναι λεία ή ελαφρώς περιστραμμένη και ο πυρήνας τους δεν φέρει έγκλειστα. Οι δευτερεύουσες ίνες κατά διαστήματα συνενώνονται στα άκρα τους σε μη διακλαδιζόμενες κύριες ίνες, οι οποίες είναι διακριτές λόγω της σχετικά ακανόνιστης επιφάνειας και του μεγαλύτερου πάχους τους, και διατρέχουν το σώμα σε ευθεία γραμμή, κάθετα προς την επιφάνεια. Το πάχος τους κυμαίνεται από 30 έως 100 μm. Ο πυρήνας τους συχνά φέρει έγκλειστα, που μπορεί να είναι κόκκοι πετρωμάτων ή σκληρίτες (πυριτικοί ή ασβεστιτικοί) άλλων ειδών σπόγγων (Pronzato et al. 1998). Κατά περιπτώσεις έχει αναφερθεί και η ύπαρξη μιας τρίτης, λεπτότερης κατηγορίας ινών (τριτεύουσες ίνες), με πάχος 5-20 μm (Castritsi-Catharios et al. 2011, Pronzato & Manconi 2008). Εικόνα Ε4: Το δίκτυο δευτερογενών ινών του σκελετού της Spongia officinalis όπως φαίνεται στο οπτικό μικροσκόπιο. Οι ίνες διακλαδίζονται και αναστομώνονται μεταξύ τους, δημιουργώντας βρόγχους ποικίλου μεγέθους. Figure E4: The secondary fiber network of Spongia officinalis skeleton, as seen through the optical microscope. Fibers are ramified and anastomosed, forming loops of varying size. 7

22 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Το υδροφόρο δίκτυο της S. officinalis αποτελείται από ένα εκτεταμένο δίκτυο καναλιών που ξεκινούν από τους πόρους εισόδου στην επιφάνεια του σπόγγου και διακλαδίζονται διαρκώς καθώς εισχωρούν στο εσωτερικό του σώματος μέχρις ότου αναστομωθούν ξανά στα απαγωγά κανάλια που εκβάλλουν στα στόμια εξόδου, τα όσκουλα (Burlando et al. 1990) (Εικόνα Ε5). Τα προσαγωγά κανάλια ξεκινούν αμέσως κάτω από το πινακόδερμα και σχηματίζουν δενδροειδείς δομές που συλλέγουν το νερό καθώς εισέρχεται από τα όστια. Διαδοχικά αναστομώνονται σε παχύτερα κανάλια πάχους ~70 μm, τα οποία εισχωρούν βαθιά. Από αυτά ξεπηδούν νέες διακλαδώσεις, οι οποίες μεταφέρουν το νερό σε όλη τη μάζα του σώματος και λεπταίνουν συνεχώς μέχρι να καταλήξουν στους χοανοκυτταρικούς θαλάμους. Οι τελευταίοι βρίσκονται διάσπαρτοι σε όλη την έκταση του χοανοσώματος σε εξαιρετικά μεγάλη πυκνότητα (περίπου ανά mm 3 ), καταλαμβάνοντας το 10% περίπου του συνολικού του όγκου. Το πρότυπο αυτό αντιστρέφεται για τα απαγωγά κανάλια, τα οποία ξεκινούν από τις εξόδους των χοανοκυτταρικών θαλάμων και καταλήγουν με μεγάλα κανάλια στα όσκουλα. Η διάμετρος των καναλιών αυτών αυξάνει λογαριθμικά σε περίπου 17 τάξεις διακλάδωσης (z) ανά κανάλι, ξεκινώντας από τα 16 μm και προσεγγίζοντας διαδοχικά το 1 εκατοστό. Αξιοσημείωτο είναι ότι εμφανίζονται σποραδικά δίαυλοι που ενώνουν απευθείας τα προσαγωγά με τα απαγωγά κανάλια, χωρίς τη μεσολάβηση των χοανοκυτταρικών θαλάμων. Οι δίαυλοι αυτοί εικάζεται ότι χρησιμεύουν στην εκτόνωση αυξομειώσεων στη ροή που προκαλούνται από την επίδραση των εξωτερικών ρευμάτων, ή ότι χρησιμεύουν στην αραίωση των καταβολικών παραπροϊόντων κατά την αποβολή τους. γ.2. Θρέψη και διηθητική ικανότητα Όπως έχει ήδη αναφερθεί, οι σπόγγοι τρέφονται με μικροσκοπικά σωματίδια ζώσας ή νεκρής οργανικής ύλης, διαμέτρου από < 0.1 έως 50 μm. Σύμφωνα με τις υπάρχουσες ενδείξεις, οι Δημόσπογγοι εκμεταλλεύονται κατά κύριο λόγο το κλάσμα του πικοπλαγκτού ( μm), που b a Εικόνα Ε5: Σχηματική απεικόνιση του υδροφόρου δικτύου της Spongia officinalis. Τα μπλε βέλη υποδηλώνουν την εισροή του νερού. ενώ τα κόκκινα την εκροή του. Το νερό εισέρχεται από τους κώνους εισροής (a), που σχηματίζονται ακριβώς κάτω από τους πόρους εισόδου (όστια), και μέσω προσαγωγών καναλιών μεταφέρεται στο εσωτερικό του σώματος. Τα κανάλια που καταλήγουν στους πόρους εξόδου (όσκουλα) (b) συγκεντρώνουν το νερό από τα απαγωγά κανάλια και το μεταφέρουν στο εξωτερικό. Παρατηρούνται κατά περιπτώσεις απευθείας συνδέσεις των προσαγωγών και απαγωγών καναλιών (c). Από Burlando et al. 1990, τροποποιημένο. c Figure E5: Illustration of the aquiferous network of Spongia officinalis. Blue and red arrows indicate water inflow and outflow, respectively. Water enters the network through inhalant structures (a) formed below the ostia, and is transferred to the body tissues through inhalant canals. Oscular ducts (b) collect the water from the exhalant canals and transfer it to the oscules. Mergings (c) of incurrent and excurrent canals are also observed. From Burlando et al. 1990, modified. 8

23 ΕΙΣΑΓΩΓΗ & ΑΙΤΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ αποτελείται κυρίως από βακτήρια (Pile et al. 1996, Ribes et al. 1999). Πράγματι, έχουν αναφερθεί σημαντικά υψηλότερες συγκεντρώσεις βακτηρίων στο σώμα ατόμων φυσικών πληθυσμών του S. officinalis σε σχέση με το περιβάλλον μέσο (Kefalas et al. 2003, Stabili et al. 2008), ειδικά σε περιοχές με υψηλό βακτηριακό φορτίο κάτι τέτοιο δεν παρατηρήθηκε για τους μύκητες (Kefalas et al. 2003). Σε πειραματικές συνθήκες, το S. officinalis έδειξε υψηλή ικανότητα διήθησης βακτηρίων από τη στήλη του νερού, που εκφράστηκε με ρυθμούς εκκαθάρισης (clearance rates) που κυμάνθηκαν από 34 έως 210 ml h -1 ανά γραμμάριο σπόγγου (Stabili et al. 2006), με ενδείξεις ότι ο οργανισμός έχει τη δυνατότητα να ρυθμίζει την ένταση της διήθησης ανάλογα με τη συγκέντρωση της τροφής στο μέσο. Οι Topçu et al. (2010), με μελέτη ατόμων στο φυσικό τους περιβάλλον, βρήκαν ότι το S. officinalis μπορεί να διηθεί επιλεκτικά κλάσεις μικροοργανισμών. Συγκεκριμένα, η κατακράτηση του πικοπλαγκτού (κυανοβακτήρια και μικρά πρώτιστα) ήταν υψηλότερη από την κατακράτηση νανοπλαγκτού (πρώτιστα μεγέθους > 2 μm). Παρά την αριθμητικά χαμηλότερη κατακράτησή της όμως, η κλάση του νανοπλαγκτού συνεισέφερε εν τέλει μεγαλύτερο ποσοστό οργανικού άνθρακα στο μεταβολισμό του σπόγγου, λόγω της υψηλότερης περιεκτικότητάς της. Συνεπώς, φαίνεται πως, παρόλο που ο μηχανισμός πρόσληψης τροφής του S. officinalis είναι βελτιστοποιημένος για την κατακράτηση ιδιαίτερα μικρών μεριδίων, κάτι που δίνει στον οργανισμό συγκριτικό πλεονέκτημα σε ένα ολιγότροφο περιβάλλον, μπορεί ευκαιριακά να αξιοποιεί τροφικά μεγαλύτερους οργανισμούς, βελτιστοποιώντας τα οφέλη. Μία πρόσθετη πηγή τροφής για το S. officinalis μπορεί, δυνητικά, να αποτελεί η διαλυμένη οργανική ύλη (DOM), μέσω καταβολισμού της από τα συμβιωτικά βακτήρια που αποτελούν σημαντικό ποσοστό της βιομάζας της (Weisz et al. 2007, De Goeij et al. 2008). Προς ενίσχυση της υπόθεσης αυτής, έχει παρατηρηθεί πειραματικά έντονη αποικοδόμηση συνθετικών οργανικών ενώσεων (linear alkylbenzenesulfonates - LAS) στη στήλη του νερού, παρουσία του S. officinalis (Pérez et al. 2002). γ.3. Αναπαραγωγή Εικόνα Ε6: Ωοκύτταρα σε διάφορες φάσεις ανάπτυξης (a-d) και σπερματοκύστεις (e) στο εσωτερικό του σώματος του Spongia officinalis. Η κλίμακα αντιστοιχεί σε 50 μm. Από Baldacconi et al Figure E6: Oocytes in different stages of development (a-d) and spermatic cysts. Bar: 50 μm. From Baldacconi et al Μελέτη του αναπαραγωγικού κύκλου του S. officinalis έχει μέχρι σήμερα πραγματοποιηθεί από τους Baldacconi et al. (2007) σε έναν φυσικό πληθυσμό στη Δυτ. Μεσόγειο. Σύμφωνα με τη μελέτη τους, πρόκειται για ένα γονοχωριστικό ( παρόλο που έχει παρατηρηθεί και ερμαφροδιτισμός), ωοζωοτόκο είδος. Τα θηλυκά και αρσενικά άτομα απαντούν σε αναλογία 1:1. Οι 9

24 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ θηλυκοί γαμέτες (ωάρια) εμφανίζονται καθ όλη τη διάρκεια του έτους, διάσπαρτοι σε χαμηλή πυκνότητα σε όλη την έκταση του σώματος (Eικόνα Ε6) και περνούν διαδοχικές φάσεις ανάπτυξης από τον Ιούλιο μέχρι τον Οκτώβριο. Οι σπερματοκύστεις εντοπίζονται στη χοανοσωμική περιοχή από το Σεπτέμβριο έως το Δεκέμβριο, ουσιαστικά συμπίπτοντας με το μέγιστο της ανάπτυξης των ωαρίων. Γονιμοποιημένα έμβρυα εμφανίζονται το Νοέμβριο, ενώ η ανάπτυξή τους σε προνύμφες ολοκληρώνεται το Μάιο. Η εξακριβωμένη ύπαρξη βακτηρίων στα έμβρυα και η επακόλουθη μεταφορά τους ενδοκυτταρικά στην αναπτυσσόμενη προνύμφη, υποδηλώνει απευθείας μεταβίβαση των συμβιωτικών βακτηρίων από το μητρικό άτομο στο γόνο. Οι προνύμφες απελευθερώνονται ασύγχρονα τους μήνες Ιούνιο και Ιούλιο, σε αριθμό που μπορεί να φτάσει τις 500 ανά 48 h από ένα μητρικό άτομο. Τα παραπάνω είναι ενδεικτικά, καθώς ο ρόλος των αβιοτικών παραμέτρων φαίνεται να επιδρά έντονα στον καθορισμό του αναπαραγωγικού κύκλου των εδραίων θαλάσσιων ασπονδύλων (Meroz-Fine et al. 2005). Από τους 9 συνολικά τύπους που έχουν καταγραφεί στα Ποροφόρα (Maldonado & Bergquist 2002), η προνύμφη των Σπογγιδών (Εικόνα Ε7) κατατάσσεται στον τύπο parenchymella (Mariani et al. 2005, Leys & Ereskovsky 2006). Ο τύπος αυτός διαθέτει πολικότητα, φωτοευαισθησία και καλύπτεται από ένα στρώμα βλεφαριδοφόρων κυττάρων τα οποία εξυπηρετούν την κίνησή της. Η προνύμφη του S. officinalis μετά την απελευθέρωση κινείται ελεύθερα παρουσιάζοντας αρνητικό φωτοτακτισμό και εγκαθίσταται στο υπόστρωμα εντός ωρών σε πειραματικό περιβάλλον (Gaino et al. 2007), ενώ ο χρόνος που μεσολαβεί για τη μεταμόρφωσή της σε νεαρό άτομο παραμένει αδιευκρίνιστος. Μεγαλύτεροι χρόνοι διάρκειας του ελεύθερου σταδίου (3-7 ημέρες), που πιθανόν όμως οφείλονται σε διαφορετικές εργαστηριακές συνθήκες, έχουν αναφερθεί για το H. communis (De Caralt et al. 2007). Η γνώση σχετικά με την ικανότητα διασποράς των προνυμφών των Σπογγιδών σε φυσικές συνθήκες είναι πολύ περιορισμένη και προέρχεται κυρίως από μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί σε άλλα είδη σπόγγων (Mariani et al. 2005, Maldonado 2006). Μοντέλα προσομοίωσης έχουν δείξει ότι οι προνύμφες των Σπογγιδών φαίνεται να έχουν Εικόνα Ε7: Η προνύμφη τύπου parenchymella του Δικτυοκερατόσπογγου Cacospongia. Α: Γενική μορφή. Β: Διακρίνεται η τούφα των βλεφαρίδων στο οπίσθιο άκρο, που χρησιμεύει στον έλεγχο της κίνησης. Γ: λεπτομέρεια του πρόσθιου πόλου, ο οποίος προάγει την εγκατάσταση στο υπόστρωμα. Από Maldonado Figure E7: Parenchymella-type larva of the genus Cacopongia (Dictyoceratida). A: general morphology; B: posterior pole of larva showing the ring of cilia; C: the protruding anterior pole anterior pole, where attachment to substrate occurs. From Maldonado

25 ΕΙΣΑΓΩΓΗ & ΑΙΤΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ περιορισμένη διασπορά κατά τη διάρκεια του ελεύθερου σταδίου, η οποία καθορίζεται σε μεγάλο βαθμό από την παράκτια κυκλοφορία (Cropper et al. 2001). γ.4. Γεωγραφική εξάπλωση Οι εκπρόσωποι των σπόγγων μπάνιου εξαπλώνονται γενικά σε όλη τη λεκάνη της Μεσογείου, παρουσιάζουν ωστόσο την τάση να εμφανίζουν εκτεταμένους πληθυσμούς σε συγκεκριμένες περιοχές. Πέρα από τις διάσπαρτες αναφορές στη βιβλιογραφία των σπόγγων της Μεσογείου, η μοναδική προσπάθεια αποτύπωσης της εξάπλωσής τους στη Μεσόγειο έχει δοθεί από τον Arndt (1937), όπως φαίνεται στην Εικόνα Ε8. Όπως είναι εμφανές, οι νότιες και ανατολικές περιοχές της λεκάνης αποτελούν την κύρια γεωγραφική περιοχή εξάπλωσης για τα Μεσογειακά είδη σπόγγων μπάνιου. Έμμεσες ενδείξεις υποστηρίζουν ότι η ανατολική Μεσόγειος αποτελεί ευνοϊκό περιβάλλον για τους Δικτυοκερατόσπογγους (Voultsiadou 2005), οι οποίοι εμφανίζουν στην περιοχή αυτή υψηλότερη ποικιλότητα ειδών σε σχέση με τις υπόλοιπες τάξεις των Ποροφόρων. Επιπρόσθετα, η σταδιακή μείωση της αφθονίας των σπόγγων μπάνιου από τα ανατολικά προς τα δυτικά συμβαδίζει με τα αντίστοιχα κλινή θερμοκρασίας και αλατότητας που επηρεάζουν την εξάπλωση των ειδών σπόγγων στη Μεσόγειο (Voultsiadou, 2009). Εικόνα Ε8: Η εξάπλωση των σπόγγων μπάνιου στη λεκάνη της Μεσογείου (και ταυτόχρονα τα κύρια σπογγαλιευτικά πεδία), όπως είχε καταγραφεί στο παρελθόν από τον W. Arndt (1937). Η αντιστοίχιση των τύπων που περιγράφονται με τα σημερινά είδη, είναι: Dalmatiner Schwamm = Spongia officinalis var. adriatica, Feiner Levantiner = S. officinalis var. mollissima, Elefantenohr = S. lamella, Zimokkaschwamm = S. zimocca, Pferdeschwamm = Hippospongia communis. Από Arndt Figure E8: Distribution of bath sponges and main sponge beds in the Mediterranean, as illustrated by W. Arndt (1937). The correspondence of mentioned types to current species is as follows: Dalmatiner Schwamm = Spongia officinalis var. adriatica; Feiner Levantiner = S. officinalis var. mollissima; Elefantenohr = S. lamella; Zimokkaschwamm = S. zimocca; Pferdeschwamm = Hippospongia communis. From Arndt

26 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ γ.5. Αλιεία, υπερεκμετάλλευση και ασθένειες Οι σπόγγοι μπάνιου αλιεύονται συστηματικά ήδη από τα προϊστορικά χρόνια στη Μεσόγειο (Voultsiadou et al. 2011), που για πολλούς αιώνες αποτέλεσε και το κύριο σπογγαλιευτικό πεδίο παγκόσμια (Pronzato et al. 2000), και τροφοδότησαν τη διεθνή αγορά βρίσκοντας χρήση στα νοικοκυριά για την ατομική και οικιακή υγιεινή, αλλά και στην τέχνη, τη βιοτεχνία, τη βιομηχανία και την ιατρική (Pronzato & Manconi 2008). Με τον τρόπο αυτό, αποτέλεσαν ένα σημαντικό βιολογικό πόρο με σταθερή ζήτηση και συνεχή εκμετάλλευση για πολλούς αιώνες. Σήμερα, τα φυσικά σφουγγάρια δεν αποτελούν πια είδος πρώτης ανάγκης, όμως η η αλιεία και η εμπορία τους δεν έχουν σταματήσει στη Μεσόγειο και παγκόσμια, αφού η ζήτηση παραμένει υψηλή (Pronzato 1999). Η αλιεία των σπόγγων γινόταν από την αρχαιότητα μέχρι και τους νεότερους χρόνους (περίπου μέχρι τα τέλη του 19ου αιώνα) με ελεύθερη κατάδυση από γυμνούς δύτες, ή με καμάκι από την επιφάνεια της θάλασσας (Voultsiadou 2007, Pronzato & Manconi 2008). Η υιοθέτηση του σκάφανδρου, καθώς και συρόμενων εργαλείων όπως η γκαγγάβα (Castritsi-Catharios et al. 2011), επέτρεψαν την εντατικότερη αλίευση και την εκμετάλλευση πληθυσμών που δεν ήταν προσβάσιμοι με τις παραδοσιακές μεθόδους, προκαλώντας δραματική αύξηση της παραγωγής, αλλά και της αλιευτικής πίεσης (Voultsiadou et al. 2011). Η αύξηση της πίεσης συνεχίστηκε με τη σταδιακή εφαρμογή πιο σύγχρονων μεθόδων κατάδυσης κατά το πρώτο μισό του 20ού αιώνα, ενώ από το δεύτερο μισό του και μετά, άρχισαν να γίνονται αισθητά τα φαινόμενα της υπεραλίευσης, με μια σταδιακή μείωση της παραγωγής (Εικόνα Ε9). Η υποβάθμιση των φυσικών πληθυσμών επιδεινώθηκε μετά από ένα μείζον περιστατικό ασθένειας που έπληξε τους Μεσογειακούς σπόγγους το 1986 (Vacelet 1991, Gaino et al. 1992), ενώ άλλα αντίστοιχα επιδημικά περιστατικά επηρέασαν διάφορες περιοχές στη Μεσόγειο κατά τις επόμενες δεκαετίες (Pérez et al. 2000, Cerrano et al. 2000, Garrabou et al. 2009). Η μείωση σε σχέση με το παρελθόν είναι έκδηλη σε ένα σύνολο προκαταρκτικών εκτιμήσεων των φυσικών πληθυσμών σπόγγων μπάνιου που Εικόνα Ε9: Διακύμανση στην παραγωγή σπόγγων μπάνιου στην Ελλάδα και άλλα Μεσογειακά κράτη κατά τη διάρκεια των 60 τελευταίων ετών. Η κατηγορία Υπόλοιπα Μεσογειακά Κράτη περιλαμβάνει τα κράτη Συρία, Λιβύη, Αίγυπτο, Λίβανο, Κροατία, Κύπρο, Ισπανία, Ιταλία και πρώην Γιουγκοσλαβία, τα οποία δεν είχαν σταθερή παραγωγή. Από Voultsiadou et al Figure E9: Bath sponge production (in tons of dry weight) during 60 years in Greece, Tunisia, Turkey and other Mediterranean countries (Syria, Libya, Egypt, Lebanon, Croatia, Cyprus, Spain, Italy and former Yugoslavia) which did not have a permanent sponge production through the years. From Voultsiadou et al

27 ΕΙΣΑΓΩΓΗ & ΑΙΤΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ πραγματοποιήθηκαν στις ακτές της Τυνησίας (Ben Mustapha & Vacelet, 1991), της Ιταλίας (Pronzato et al. 1996), της Αιγύπτου (Castritsi-Catharios et al. 2005), της Λιβύης (Milanese et al. 2008) και της Ελλάδας (Voultsiadou et al. 2008, 2011). Παραταύτα, μία ήπια τάση ανάκαμψης έχει επίσης σημειωθεί για τα χρόνια που ακολούθησαν το πρώτο μείζον περιστατικό ασθένειας (Voultsiadou et al. 2011, Castritsi-Catharios et al. 2011). Παρόλο που βακτηριακά στελέχη και μύκητες έχουν υποδειχθεί ως οι υπεύθυνοι αιτιολογικοί παράγοντες για την εκδήλωση ασθενειών στους σπόγγους (Webster 2007, Maldonado et al. 2010), το γενεσιουργό αίτιο της εκδήλωσης τέτοιων φαινομένων φαίνεται να εντοπίζεται σε περιστατικά αύξησης της θερμοκρασίας στο θαλάσσιο περιβάλλον (Garrabou et al. 2009, Coma et al. 2009). Οι συνθήκες αυτές επιδρούν δυσμενώς στους σπόγγους και άλλα εδραία ασπόνδυλα, λόγω επαγωγής στρες στις φυσιολογικές λειτουργίες (Lejeusne et al. 2010) (Εικόνα Ε10). Η ρύπανση του παράκτιου θαλάσσιου περιβάλλοντος δεν φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην εκδήλωση περιστατικών μαζικής θνησιμότητας, τουλάχιστον για τους σπόγγους μπάνιου, οι οποίοι παρουσιάζουν ανθεκτικότητα στους οργανικούς ρυπαντές και άλλους παράγοντες, όπως τα βαρέα μέταλλα (Pérez et al. 2005, Berthet et al. 2005, Gifford et al. 2007). γ.6. Η αναγκαιότητα για εμπλουτισμό της υπάρχουσας γνώσης Η τρέχουσα γνώση γύρω από τη βιολογία και την οικολογία των Μεσογειακών σπόγγων μπάνιου κρίνεται ανεπαρκής για την ανάπτυξη αποτελεσματικών διαχειριστικών σχεδίων που θα μπορούσαν να διασφαλίσουν την προστασία τους σε συνδυασμό με την αειφόρο εκμετάλλευσή τους (Voultsiadou et al. 2011). Προτεραιότητα για ένα τέτοιο σχέδιο έχει η αποσαφήνιση της συστηματικής στο επίπεδο του είδους και ο προσδιορισμός των πραγματικών ταξινομικών μονάδων (operational taxonomic units - OTUs) που προσελκύουν το εμπορικό ενδιαφέρον. Μια Εικόνα Ε10: Το τρέχον μοντέλο που περιγράφει την επίδραση της κλιματικής πίεσης στην εκδήλωση ασθενειών στα Μεσογειακά θαλάσσια ασπόνδυλα (στις φωτογραφίες ο σπόγγος Spongia officinalis και η γοργονία Paramuricea clavata). Από Lejeusne et al Figure E10: Current model describing the influence of climatic forcing to the Mediterranean marine invertebrates (photographs: the sponge Spongia officinalis and gorgonian Paramuricea clavata). From Lejeusne et al

28 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ πληθώρα μοριακών δεικτών είναι διαθέσιμη σήμερα για χρήση σ αυτόν τον τομέα και βρίσκει εκτεταμένη εφαρμογή στο φύλο των Ποροφόρων για τον προσδιορισμό των φυλογενετικών σχέσεων στο επίπεδο του είδους (π.χ. Reveillaud et al. 2010) και την αποκάλυψη κρυπτικών ειδών (π.χ. Xavier et al. 2010). Επίσης σημαντική είναι η σύγχρονη καταγραφή της κατανομής και του μεγέθους των πληθυσμών τους στη Μεσόγειο. Τα διαθέσιμα σχετικά στοιχεία (Arndt 1937) είναι οπωσδήποτε ξεπερασμένα, ειδικά κάτω από το πρίσμα των σύγχρονων περιστατικών ασθένειας, ενώ η ανάκτηση πληροφορίας από τους αλιείς και τους μεταπράτες είναι ιδιαίτερα δύσκολη λόγω της απουσίας κεντρικού ελέγχου και της αδιαφάνειας που χαρακτηρίζει την εμπορία των σπόγγων (Bernard 1976, Milanese et al. 2008). Ουσιαστική σημασία όμως στην εκτίμηση της φέρουσας ικανότητας των αποθεμάτων και της ευπάθειας των σπόγγων μπάνιου στα περιστατικά ασθένειας έχει η κατανόηση της γενετικής δομής των πληθυσμών τους στη Μεσόγειο και η εκτίμηση του βαθμού επιμειξίας μεταξύ τους. Ιδιαίτερη χρησιμότητα σε αυτό το επίπεδο παρουσιάζουν οι πολυμορφικοί μοριακοί δείκτες, οι οποίοι έχουν ήδη χρησιμοποιηθεί με επιτυχία σε θαλάσσια ασπόνδυλα εμπορικού ενδιαφέροντος (για παράδειγμα Ledoux et al. 2010). Η πρόσφατη ανάπτυξη μικροδορυφορικών δεικτών για δύο είδη Μεσογειακών σπόγγων μπάνιου (Noyer et al. 2009, Dailianis & Tsigenopoulos 2010) αποτελεί ένα πρώτο βήμα προς αυτή την κατεύθυνση. Επιπρόσθετα, σημαντικό κενό γνώσης υπάρχει σχετικά με τον αναπαραγωγικό κύκλο των σπόγγων μπάνιου κατά μήκος των περιβαλλοντικών διαβαθμίσεων που παρουσιάζονται στην έκταση της Μεσογειακής λεκάνης, καθώς και με την εκτίμηση της ικανότητας διασποράς των γαμετών και των προνυμφών. Ο ρυθμός αύξησης και η φυσική θνησιμότητα είναι, ουσιαστικά, άγνωστες παράμετροι, καθώς εκτίμησή τους έχει πραγματοποιηθεί μόνο σε συνθήκες καλλιέργειας (Corriero et al. 2004). Τέλος, οι αιτιολογικοί παράγοντες και ο ρόλος των περιβαλλοντικών παραμέτρων στην εκδήλωση ασθενειών στα Μεσογειακά είδη σπόγγων μπάνιου θα πρέπει να αποσαφηνιστεί επαρκώς (βλέπε Webster et al. 2008, Maldonado et al. 2010), ιδιαίτερα υπό το πρίσμα των περιβαλλοντικών κινδύνων που απειλούν τη Μεσογειακή βιοποικιλότητα (Coll et al. 2010) και ιδιαίτερα ενόψει της αναμενόμενης αύξησης ακραίων φαινομένων ως συνέπεια της παγκόσμιας κλιματικής αλλαγής (Coma et al. 2009). δ. Σκοπός της παρούσας έρευνας Με βάση τα παραπάνω, η σκοπιμότητα της παρούσας έρευνας εστιάζει στη διερεύνηση και αξιολόγηση της μορφολογικής και γενετικής ποικιλότητας που χαρακτηρίζει τους δύο τυπικούς εκπρόσωπους των σπόγγων μπάνιου στη Μεσόγειο, S. officinalis και H. communis, από το επίπεδο του είδους μέχρι το επίπεδο των πληθυσμών και του ατόμου. Οι κύριοι άξονες στους οποίους βασίστηκε αυτή η μελέτη είναι: i. Η αξιολόγηση της ταξινομικής κατάστασης των δύο ειδών: Τα αποτελέσματα πρόσφατης έρευνας σχετικά με την κατάσταση των αποθεμάτων των σπόγγων του μπάνιου στο Αιγαίο (Voultsiadou et al. 2011) δημιούργησαν ερωτηματικά σχετικά με την εγκυρότητα της ταξινόμησης που έχει δοθεί στην τελευταία αναθεώρηση (Pronzato & Manconi 2008). Ως εκ τούτου, κρίθηκε αναγκαία σε πρώτη φάση η ανασκόπηση της ιστορίας της συστηματικής τους, ώστε να αξιολογηθούν και να συνοψιστούν οι ιδιαιτερότητες που καθιστούν 14

29 ΕΙΣΑΓΩΓΗ & ΑΙΤΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ασαφή μέχρι και τις μέρες μας τη διάκριση των ειδών που αυτοί εκπροσωπούν. Για το σκοπό αυτό συγκεντρώθηκε και μελετήθηκε το σύνολο της βιβλιογραφίας που αφορά τα εξεταζόμενα γένη στη Μεσόγειο και παγκόσμια, από την απαρχή των αρχών της ταξινομίας (18ος αι.) μέχρι σήμερα. Τα αποτελέσματα της έρευνας αυτής παρουσιάζονται στο Κεφάλαιο 1. ii. Η διερεύνηση των φυσικών πληθυσμών των δύο ειδών στις κύριες περιοχές εξάπλωσής τους: Καθώς η σημερινή παρουσία των σπόγγων μπάνιου στον παράκτιο χώρο της Μεσογείου είναι ασυνεχής και μειωμένη λόγω των ασθενειών και της παρελθούσας αλιευτικής πίεσης (Pronzato 1999) και πρακτικά μη καταγεγραμμένη, απαραίτητη προϋπόθεση για οποιοδήποτε περαιτέρω βήμα μελέτης κρίθηκε η εξεύρεση ικανού και αντιπροσωπευτικού αριθμού φυσικών πληθυσμών, ώστε να στηριχθούν οι επακόλουθες αναλύσεις. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε μία εκτενής διερεύνηση αντιπροσωπευτικών περιοχών του Αιγαίου, το οποίο αποτελεί μία κύρια περιοχή εξάπλωσης των υπό μελέτη ειδών. Δείγματα επίσης εξασφαλίστηκαν από ένα δίκτυο σταθμών στη δυτική Μεσόγειο (Ν. Γαλλία), καθώς από το δυτικότερο άκρο της κατανομής των ειδών, το Γιβραλτάρ. Η διαδικασία αυτή παρουσιάζεται αναλυτικά στο Κεφάλαιο 2. iii. Η καταγραφή και ανάλυση της μορφολογικής ποικιλότητας στο επίπεδο του είδους και του ατόμου: Η ανασκόπηση της μορφολογικής έρευνας στους σπόγγους μπάνιου, αλλά και η εμπειρία από την έρευνα στο πεδίο, κατέδειξαν την ανάγκη για μια ενδελεχή καταγραφή της ποικιλότητας που παρουσιάζει η μορφολογία των ειδών αυτών μεταξύ των ατόμων, αλλά και για τη διερεύνηση του δυνητικού συσχετισμού της τόσο με την ταξινομική όσο και με τη γεωγραφική διαφοροποίηση. Η μορφολογία παραμένει μία θεμελιώδης παράμετρος για τη συστηματική των οργανισμών παρά τη συνεχώς αυξανόμενη προσβασιμότητα σε μοριακές μεθόδους. Ιδιαίτερα σε συνδυασμό με τις τελευταίες (Giribet 2010), μπορεί να υποβοηθήσει σημαντικά την κατανόηση των εξεταζόμενων φαινομένων. Τα αποτελέσματα της μορφολογικής ανάλυσης παρουσιάζονται στο Κεφάλαιο 3. iv. H αποσαφήνιση των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ και εντός των ειδών: Το βιολογικό είδος αποτελεί παραδοσιακά τη βασική μονάδα εκτίμησης διαχείρισης της βιοποικιλότητας (Agapow et al. 2004). Στην περίπτωση των οργανισμών που μελετήθηκαν, μια διαφαινόμενη έντονη ποικιλομορφία καθιστά τα όρια μεταξύ των ειδών δυσδιάκριτα, ενώ έχει ως επιπλέον αποτέλεσμα την ύπαρξη ασαφών ταξινομικών μονάδων (π.χ. ποικιλίες, μορφότυποι). Η διερεύνηση, συνεπώς, της ποικιλότητας στο επίπεδο του είδους με έναν κατάλληλο μοριακό δείκτη (Chenuil 2006) κρίθηκε απαραίτητη για να εξακριβωθεί η ισχύς των παραπάνω τάξων και να διερευνηθούν οι φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ τους. Επιπρόσθετα, σχετικά αναμενόμενη ήταν η αποκάλυψη κρυπτικών τάξων (Radulovici et al. 2010), ειδικά λαμβάνοντας υπόψη το εκτεταμένο γεωγραφικό εύρος των εξεταζόμενων δειγμάτων. Τα αποτελέσματα της φυλογένεσης στο επίπεδο του είδους παρουσιάζονται στο Κεφάλαιο 4. v. Η εκτίμηση της γονιδιακής ροής και της διαφοροποίησης μεταξύ των πληθυσμών: Οι παράμετροι του φυσικού περιβάλλοντος επιδρούν καθοριστικά στο βαθμό της γενετικής επικοινωνίας μεταξύ των πληθυσμών των ειδών, ακόμα και στο -σχετικά συνεχές- θαλάσσιο οικοσύστημα. Η εκτίμηση της διαφοροποίησης μεταξύ των πληθυσμών είναι απαραίτητη για τον αξιόπιστο καθορισμό των μονάδων διαχείρισης (Palsbøll et al. 2007), ενώ επιτρέπει την κατανόηση 15

30 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ των φαινομένων που σχετίζονται με τη γονιδιακή ροή μεταξύ των ατόμων. Για τη διερεύνηση της γενετικής ποικιλότητας στο πληθυσμιακό και ατομικό επίπεδο στην παρούσα εργασία, κρίθηκε σκόπιμη η ανάπτυξη de novo ενός σετ μικροδορυφορικών δεικτών οι συγκεκριμένοι μοριακοί δείκτες αποτελούν ένα ιδιαίτερα αναλυτικό σύγχρονο εργαλείο για πληθυσμιακές μελέτες (Balloux & Lugon-Moulin 2002). Τα αποτελέσματα της διερεύνησης της πληθυσμιακής ποικιλότητας παρουσιάζονται στο Κεφάλαιο 5. Τα αποτελέσματα των παραπάνω προσεγγίσεων, που θα παρουσιαστούν αναλυτικά στη συνέχεια, κρίνονται απαραίτητα για να διαφωτίσουν βασικές συνιστώσες της βιολογίας και οικολογίας των σημαντικών αυτών, αλλά ελλιπώς μελετημένων ειδών. Οι κατανόηση των συνιστωσών αυτών αποτελεί βασική ανάγκη για την αποτελεσματική διαχείριση των σπόγγων μπάνιου ως φυσικών πόρων και την προστασία τους ως απειλούμενων ειδών. ε. Βιβλιογραφία Addison JA & Hart MW, Analysis of population genetic structure of the green sea urchin (Strongylocentrotus droebachiensis) using microsatellites. Marine Biology 144: Agapow P-M, Bininda-Emonds OR, Crandall KA, Gittleman JL, Mace GM, Marshall JC, Purvis A, The impact of species concept on biodiversity studies. The Quarterly Review of Biology 79: Arndt W, Schwämme. In: Die Rohstoffe des Tierreichs (ed. Pax F & Arndt W). Berlin: Gebrüder Borntraeger Baldacconi R, Nonnis Marzano C, Gaino E, Corriero G, Sexual reproduction, larval development and release in Spongia officinalis L. (Porifera, Demospongiae) from the Apulian coast. Marine Biology 15: Balloux F, Lugon-Moulin N, The estimation of population differentiation with microsatellite markers. Molecular Ecology 11: Baums IB, Miller MW, Hellberg ME, Regionally isolated populations of an imperiled Caribbean coral, Acropora palmata. Molecular Ecology 14: Ben Mustapha K, Vacelet J, Etat actuel des fonds spongiferes de Tunisie. In: Boudoureresque CF, Avon M, Gravez V (eds.), Les espéces marines a protéger en Méditerranée. GIS Posidonie Publications, Marseille p Bergquist PR, Sponges. Hutchinson & Co., London 268 pp. Bernard HR, Sponge markets of Kalymnos. Anthropologica 18: Berthet B, Mouneyrac C, Pérez T, Amiardtriquet C, Metallothionein concentration in sponges (Spongia officinalis) as a biomarker of metal contamination. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology 141: Blanquer A, Uriz MJ, Population genetics at three spatial scales of a rare sponge living in fragmented habitats. BMC Evolutionary Biology 10: 13 16

31 ΕΙΣΑΓΩΓΗ & ΑΙΤΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Blanquer A, Uriz MJ, Caujapé-Castells J, Small-scale spatial genetic structure in Scopalina lophyropoda, an encrusting sponge with philopatric larval dispersal and frequent fission and fusion events. Marine Ecology Progress Series 380: Borchiellini C, Manuel M, Alivon E, Boury-Esnault N, Vacelet J, Le Parco Y, Sponge paraphyly and the origin of Metazoa. Journal of Evolutionary Biology 14: Boury-Esnault N, Systematics and evolution of Demospongiae. Canadian Journal of Zoology 84: Burlando B, Bavestrello G, Sara M, Cocito S, The aquiferous systems of Spongia officinalis and Cliona viridis (Porifera) based on corrosion cast analysis. Bollettino di Zoologia 57: Cárdenas P, Rapp HT, Schander C, Tendal OS, Molecular taxonomy and phylogeny of the Geodiidae (Porifera, Demospongiae, Astrophorida) combining phylogenetic and Linnaean classification. Zoologica Scripta 39: Castritsi-Catharios J, van Soest RWM, Kefalas E, Vacelet J, Revised description of a poorly known Mediterranean Dictyoceratid bath sponge, Spongia (Spongia) zimocca (Schmidt, 1862) (Porifera: Demospongiae: Dictyoceratida). Zootaxa 2812: Castritsi-Catharios J, Miliou H, Pantelis J, Experimental sponge fishery in Egypt during recovery from sponge disease. Aquatic Conservation 15: Cerrano C, Bavestrello G, Bianchi CN, Cattaneo-Vietti R, Bava S et al., A catastrophic massmortality episode of gorgonians and other organisms in the Ligurian Sea (North-western Mediterranean), summer Ecology Letters 3: Chenuil A, Choosing the right molecular genetic markers for studying biodiversity: from molecular evolution to practical aspects. Genetica 127: Coll M, Piroddi C, Steenbeek J, Kaschner K, Ben Rais Lasram F, et al The Biodiversity of the Mediterranean Sea: estimates, patterns, and threats. PLoS ONE 5(8): e11842 Coma R, Ribes M, Serrano E, Jiménez E, Salat J, Pascual J, Global warming-enhanced stratification and mass mortality events in the Mediterranean. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 106: Corriero G, Longo C, Mercurio M, Nonnis Marzano C, Lembo G, Spedicato MT, Rearing performance of Spongia officinalis on suspended ropes off the Southern Italian coast (Central Mediterranean Sea). Aquaculture 238: Cropper WP, Lirman D, Tosini SC, DiResta D, Luo J, Wang J, Population dynamics of a commercial sponge in Biscayne Bay, Florida. Estuarine, Coastal and Shelf Science 53: Dailianis T, Tsigenopoulos CS, Characterization of polymorphic microsatellite markers for the endangered Mediterranean bath sponge Spongia officinalis L. Conservation Genetics 11: De Caralt S, Otjens H, Uriz MJ, Wijffels RH, Cultivation of sponge larvae: settlement, survival, and growth of juveniles. Marine Biotechnology 9: De Goeij JM, Moodley L, Houtekamer M, Carballeira NM, van Duyl FC, Tracing 13C-enriched 17

32 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ dissolved particulate organic carbon in the bacteria-containing coral reef sponge Halisarca caerulea: evidence for DOM feeding. Limnology and Oceanography 53: DeBiasse MB, Richards VP, Shivji MS, Genetic assessment of connectivity in the common reef sponge Callyspongia vaginalis (Demospongiae: Haplosclerida) reveals high population structure along the Florida reef tract. Coral Reefs 29: Dunn CW, Hejnol A, Matus DQ, Pang K, Browne WE, et al., Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life. Nature 452: Duran S, Rützler K, Ecological speciation in a Caribbean marine sponge. Molecular Phylogenetics and Evolution 40: Duran S, Giribet G, Turon X, 2004a. Phylogeographic history of the sponge Crambe crambe (Porifera: Poecilosclerida): range expansion and recent invasion of the Macaronesian islands from Mediterranean Sea. Molecular Ecology 73: Duran S, Pascual M, Turon X, 2004b. Low levels of genetic variation in mtdna sequences over the western Mediterranean and Atlantic range of the sponge Crambe crambe (Poecilosclerida). Marine Biology 144: Duran S, Pascual M, Estoup A, Turon X, 2004c. Strong population structure in the marine sponge Crambe crambe (Poecilosclerida) as revealed by microsatellite markers. Molecular Ecology 13: Féral JP, How useful are the genetic markers in attempts to understand and manage marine biodiversity? Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 268: Gaino E, Pronzato R, Corriero G, Buffa P, Mortality of commercial sponges: incidence in two Mediterranean areas. Bollettino di Zoologia 59: Gaino E, Baldacconi R, Corriero G, Post-larval development of the commercial sponge Spongia officinalis L. (Porifera, Demospongiae). Tissue & Cell 39: Garrabou J, Coma R, Bensoussan N, Bally M, Chevaldonné P et al Mass mortality in Northwestern Mediterranean rocky benthic communities: effects of the 2003 heat wave. Global Change Biology 15: Gifford S, Hugh Dunstan R, O'Connor W, Koller CE, MacFarlane GR, Aquatic zooremediation: deploying animals to remediate contaminated aquatic environments. Trends in Biotechnology 25: Giribet G, A new dimension in combining data? The use of morphology and phylogenomic data in metazoan systematics. Acta Zoologica 91: Gutiérrez-Rodríguez C, Lasker HR, Microsatellite variation reveals high levels of genetic variability and population structure in the gorgonian coral Pseudopterogorgia elisabethae across the Bahamas. Molecular Ecology 13: Heim I, Nickel M, Brümmer F, Phylogeny of the genus Tethya (Tethyidae : Hadromerida : Porifera): molecular and morphological aspects. Journal of the Marine Biological Association of the UK 87:

33 ΕΙΣΑΓΩΓΗ & ΑΙΤΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Kefalas E, Castritsi-Catharios J, Miliou H, Bacteria associated with the sponge Spongia officinalis as indicators of contamination. Ecological Indicators 2: Knowlton N, Molecular genetic analyses of species boundaries in the sea. Hydrobiologia 420: Ledoux J-B, Mokhtar-Jamai K, Roby C, Féral J-P, Garrabou J, Aurelle D, Genetic survey of shallow populations of the Mediterranean red coral [Corallium rubrum (Linnaeus, 1758)]: new insights into evolutionary processes shaping nuclear diversity and implications for conservation. Molecular Ecology 19: Lejeusne C, Chevaldonné P, Pergent-Martini C, Boudouresque CF, Pérez T, Climate change effects on a miniature ocean: the highly diverse, highly impacted Mediterranean Sea. Trends in Ecology & Evolution 25: Leys SP, Ereskovsky AV, Embryogenesis and larval differentiation in sponges. Canadian Journal of Zoology 84: Louden D, Inderbitzin S, Peng Z, de Nys R, Development of a new protocol for testing bath sponge quality. Aquaculture 271: Maldonado M, The ecology of the sponge larva. Canadian Journal of Zoology 84: Maldonado M, Sánchez-Tocino L. Navarro C, Recurrent disease outbreaks in corneous demosponges of the genus Ircinia: epidemic incidence and defense mechanisms. Marine Biology 1-14 Maldonado M, Bergquist PR, Phylum Porifera. In: Young CM, Sewell MA, Rice ME (eds.), Atlas of Marine Invertebrate Larvae. Academic Press, San Diego, pp Manuel M, Boury-Esnault N, Vacelet J, L éponge... une république. Pour la Science 310: Mariani S, Uriz MJ, Turon X, The dynamics of sponge larvae assemblages from northwestern Mediterranean nearshore bottoms. Journal of Plankton Research 27: Meroz-Fine E, Shefer S, Ilan M, Changes in morphology and physiology of an East Mediterranean sponge in different habitats. Marine Biology 147: Milanese M, Sarà A, Manconi R, Ben Abdalla A, Pronzato R, Commercial sponge fishing in Libya: Historical records, present status and perspectives. Fisheries Research 89: Müller WEG, Li J, Schröder HC, QiaoL, Wang X, The unique skeleton of siliceous sponges (Porifera; Hexactinellida and Demospongiae) that evolved first from the Urmetazoa during the Proterozoic: a review. Biogeosciences 4: Noyer C, Agell G, Pascual M, Becerro MA Isolation and characterization of microsatellite loci from the endangered Mediterranean sponge Spongia agaricina (Demospongiae: Dictyoceratida). Conservation Genetics 10: Palsbøll PJ, Bérubé M, Allendorf FW, Identification of management units using population genetic data. Trends in Ecology & Evolution 22: Pérez T, Longet D, Schembri T, Rebouillon P, Vacelet J, Effects of 12 years' operation of a sew- 19

34 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ age treatment plant on trace metal occurrence within a Mediterranean commercial sponge (Spongia officinalis, Demospongiae). Marine Pollution Bulletin 50: Pérez T, Sarrazin L, Rebouillon P, Vacelet J, First evidences of surfactant biodegradation by marine sponges (Porifera): an experimental study with a linear alkylbenzenesulfonate. Hydrobiologia 489: Pérez T, Garrabou J, Sartoretto S, Harmelin JG, Francour P, Vacelet J, Mass mortality of marine invertebrates: an unprecedented event in the Northwestern Mediterranean. Comptes Rendus de l Académie des Sciences Série III 323 : Pérez-Portela R, Turon X, Cryptic divergence and strong population structure in the colonial invertebrate Pycnoclavella communis (Ascidiacea) inferred from molecular data. Zoology 111: Pile AJ, Patterson MR, Witman JD, In situ grazing on plankton < 10 μm by the boreal sponge Mycale lingua. Marine Ecology Progress Series 141: Pöppe J, Sutcliffe P, Hooper JNA, Wörheide G, Erpenbeck D, COI Barcoding Reveals New Clades and Radiation Patterns of Indo-Pacific Sponges of the Family Irciniidae (Demospongiae: Dictyoceratida). PLoS ONE 5(4), 6pp. Pronzato R, Sponge-fishing, disease and farming in the Mediterranean Sea. Aquatic Conservation 9: Pronzato R, Rizzello R, Dessy E, Corriero G, Scalera-Liaci L, Distribuzione e pesca di Spongia officinalis lungo il litorale pugliese. Bollettino dei Musei e degli Istitutu Biologici dell Universita di Genova 60/61: Pronzato R, Bavestrello G, Cerrano C, Morpho-functional adaptations of three species of Spongia (Porifera, Demospongiae) from a Mediterranean vertical cliff. Bulletin of Marine Science 63: Pronzato R, Manconi R, Mediterranean commercial sponges: over 5000 years of natural history and cultural heritage. Marine Ecology 29: Pronzato R, Cerrano C, Cubeddu T, Magnino G, Manconi R, Pastore S, Sara A, Sidri M The millennial history of commercial sponges: from harvesting to farming and integrated aquaculture. Biologia Marina Mediterranea 7: Radulovici AE, Archambault P, Dufresne Fm DNA Barcodes for Marine Biodiversity: Moving Fast Forward? Diversity 2: Reiswig HM, The Aquiferous Systems of Three Marine Demospongiae. Journal Of Morphology 145: Reveillaud J, Remerie T, van Soest RWM, Erpenbeck D, Cardenas P, et al., Species boundaries and phylogenetic relationships between Atlanto-Mediterranean shallow-water and deepsea coral associated Hexadella species (Porifera, Ianthellidae). Molecular Phylogenetics and Evolution 56: Ribes M, Coma R, Gili JM, Natural diet and grazing rate of the temperate sponge Dysidea 20

35 ΕΙΣΑΓΩΓΗ & ΑΙΤΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ avara (Demospongiae, Dendroceratida) throughout an annual cycle. Marine Ecology Progress Series 176: Ruppert EE, Fox RS, Barnes RD, Invertebrate Zoology: a functional evolutionary approach, 7th Edition. Brooks/Cole, 928 pp. Schulze FE, Untersuchungen über den Bau und die Entwicklung der Spongien. Siebente Mittheilung. Die Familie der Spongidae. Zeitschrift für wissenschaftliche Zoologie 32: Stabili L, Licciano M, Giangrande A, Longo C, Mercurio M, Nonnis Marzano C, Corriero G, Filtering activity of Spongia officinalis var. adriatica (Schmidt) (Porifera, Demospongiae) on bacterioplankton: implications for bioremediation of polluted seawater. Water Research 40: Stabili L, Licciano M, Longo C, Corriero G, Mercurio M, Evaluation of microbiological accumulation capability of the commercial sponge Spongia officinalis var. adriatica (Schmidt) (Porifera, Demospongiae). Water Research 42: Topçu NE, Pérez T,, Gregori G, Harmelin-Vivien M, In situ investigation of Spongia officinalis (Demospongiae) particle feeding: Coupling flow cytometry and stable isotope analysis. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 389: Vacelet J, Status des éponges commerciales en Méditerranée. In: Boudoureresque CF, Avon M, Gravez V (eds.), Les espéces marines a protéger en Méditerranée. GIS Posidonie Publications, Marseille p Vacelet J, Répartition générale des éponges et systématique des éponges cornées de la région de Marseille et de quelques stations méditerranéennes. Recueil de travaux de la Station Marine d Endoume 16: Vacelet J, Boury-Esnault N, De Vos L, Donadey C, Comparative study of the choanosome of Porifera: II. The Keratose Sponges. Journal of Morphology 201: Van Soest RWM, Boury-Esnault N, Hooper JNA, Rützler K, de Voogd NJ, et al. (2008) World Porifera Database Voultsiadou E, Reevaluating sponge diversity and distribution in the Mediterranean Sea. Hydrobiologia 628: 1-12 Voultsiadou E, Demosponge distribution in the eastern Mediterranean: a NW SE gradient. Helgoland Marine Research 59: Voultsiadou E, Tatolas A, The fauna of Greece and adjacent areas in the Age of Homer: Evidence from the first written documents of Greek literature. Journal of Biogeography 32: Voultsiadou E, Vafidis D, Antoniadou C, Sponges of economical interest in the Eastern Mediterranean: an assessment of diversity and population density. Journal of Natural History 42: Voultsiadou E, Dailianis T, Antoniadou C, Vafidis D, Dounas C, Chintiroglou C, Aegean bath sponges: historical data and current status. Reviews in Fisheries Science 19:

36 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Webster NS, Sponge disease: a global threat? Environmental Microbiology 9: Webster NS, Cobb RE, Negri AP, Temperature thresholds for bacterial symbiosis with a sponge. The ISME Journal 2: Webster NS, Wilson KJ, Blackall LL, Hill RT, Phylogenetic diversity of bacteria associated with the marine sponge Rhopaloeides odorabile. Applied and Environmental Microbiology 67: Weisz JB, Hentschel U, Lindquist N, Martens CS, Linking abundance and diversity of spongeassociated microbial communities to metabolic differences in host sponges. Marine Biology 152: Wulff JL, Sponge systematics by starfish: predators distinguish cryptic sympatric species of Caribbean fire sponges, Tedania ignis and Tedania klausi n. sp. (Demospongiae, Poecilosclerida). The Biological Bulletin 211: Xavier JR, Rachello-Dolmen PG, Parra-Velandia F, Schönberg CHL, Breeuwer JAJ, van Soest RWM, Molecular evidence of cryptic speciation in the cosmopolitan excavating sponge Cliona celata (Porifera, Clionaidae). Molecular Phylogenetics and Evolution 56:

37 Κεφάλαιο 1 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗΣ

38

39 1. Ανασκόπηση της ταξινόμησης 1.1. Κατάταξη και διαγνωστικοί χαρακτήρες των τάξων των σπογγων του μπάνιου Παρόλο που οι σπόγγοι του μπάνιου είναι καλά γνωστοί, η ταξινόμησή τους παρουσιάζει μια εξαιρετικά πολύπλοκη και ταραχώδη ιστορία, κυρίως όσον αφορά στα τάξα των κατηγοριών του γένους και του είδους. Ο κοινός σπόγγος του μπάνιου (Spongia officinalis) αποτελεί ένα από τα πρώτα ασπόνδυλα και οπωσδήποτε το πρώτο είδος σπόγγου που αναγνωρίστηκε και περιγράφηκε επιστημονικά από το Λινναίο στο μνημειώδες έργο του Systema Naturae το Όπως όλοι οι σπόγγοι, οι σπόγγοι του μπάνιου κατατάσσονται στο φύλο Ποροφόρα. Η εμπεριστατωμένη ταξινόμηση του φύλου αυτού μέχρι το επίπεδο του γένους έχει δοθεί πρόσφατα στο εκτεταμένο έργο Systema Porifera (Hooper & van Soest 2002). Η σύγχρονη ταξινομική κατάταξή των σπόγγων του μπάνιου μέχρι το επίπεδο του γένους έχει ως εξής: Φύλο: Porifera Grant, 1836 Κλάση: Demospongiae Sollas, 1885 Τάξη: Dictyoceratida Minchin, 1900 Οικογένεια: Spongiidae Gray, 1867 Γένη: Spongia Linnaeus, 1759 Hippospongia Schulze, 1879 Coscinoderma Carter, 1883 Rhopaloeides Thompson, Murphy, Bergquist & Evans, Το φύλο Porifera (Σπόγγοι) Προσκολλημένα υδρόβια Μετάζωα που φέρουν ένα σύστημα κυκλοφορίας του νερού διαφοροποιημένο σε σύστημα εισόδου και εξόδου, με επιφανειακά ανοίγματα. Ένα στρώμα μαστιγοφόρων κυττάρων (χοανοκυττάρων) δημιουργεί ρεύμα νερού μονής κατεύθυνσης που διατρέχει το σώμα. Το σώμα αποτελείται από έναν πληθυσμό κυττάρων υψηλής κινητικότητας, ικανών να μετατρέπονται σε κύτταρα άλλης μορφής (πολυδυναμικά), γεγονός που προσδίδει στα μέλη του φύλου μορφολογική πλαστικότητα. Υπάρχει συνήθως υποστηρικτικός σκελετός από πυριτικούς ή ασβεστιτικούς σκληρίτες ή σπογγίνη. 25

40 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ H κλάση Demospongiae (Δημόσπογγοι) Σπόγγοι με σκελετό από πυριτικούς σκληρίτες και/ή σπογγίνη, ή ευκαιριακά χωρίς σκελετό. Οι σκληρίτες, όταν υπάρχουν, είναι μοναξονικοί ή τετραξονικοί, ποτέ τριαξονικοί. Περιλαμβάνουν το 85% των ειδών που έχουν περιγραφεί (περίπου 6000 έγκυρα αρτίγονα είδη), είναι κυρίως θαλάσσιοι και μερικοί ζουν στα γλυκά νερά Η τάξη Dictyoceratida (Δικτυοκερατόσπογγοι) Δημόσπογγοι με ελαστική υφή που οφείλεται σε ένα σκελετό από σπογγίνη που καταλαμβάνει μεγάλο μέρος της μάζας του σώματος και αποτελείται από δίκτυο ινών που διακλαδίζονται μεταξύ τους. Με την εξαίρεση δύο γενών, οι ίνες διακρίνονται σε κύριες και δευτερεύουσες και μερικές φορές τριτεύουσες. Η επιφάνεια φέρει κωνίδια και είναι συνήθως σκούρη ενώ το εσωτερικό ανοιχτόχρωμο. Περιλαμβάνει τέσσερις οικογένειες και 36 έγκυρα γένη Η οικογένεια Spongiidae (Σπογγίδες) Μέχρι πριν από είκοσι χρόνια η οικογένεια Spongiidae περιλάμβανε τα περισσότερα γένη που σήμερα εντάσσονται στις οικογένειες Spongiidae, Ircinnidae και Thorectidae. Ο σύγχρονος ορισμός της οικογένειας δόθηκε το 1980 από την Bergquist, η οποία περιόρισε το εύρος της αποφασίζοντας να παραμείνουν σε αυτήν μόνο τα γένη που χαρακτηρίζονται από ένα καλά αναπτυγμένο σκελετό, αποτελούμενο από απλές στη δομή τους ίνες σπογγίνης που διακρίνονται σε κύριες και δευτερεύουσες οι κύριες ίνες, που είναι σπανιότερες, περιέχουν έγκλειστα ξένα σώματα, ενώ οι δευτερεύουσες είναι πολυπληθείς και δομούν ένα πυκνό δίκτυο (Εικόνα 1.1). Σε αυτό οφείλεται η ελαστικότητα και συμπιεστότητα του σκελετού που δίνει στους σπόγγους αυτούς την εμπορική τους αξία, ενώ η απουσία πυριτικού σκελετού δυσχεραίνει ακόμη περισσότερο την ταξινόμησή τους.!! A B Εικόνα 1.1: Σχηματική αναπαράσταση αντιπροσωπευτικού σκελετικού δικτύου σπογγίνης των ειδών της οικογένειας Spongiidae. Διακρίνεται το πυκνό δίκτυο των δευτερευουσών ινών και οι ανερχόμενες κύριες ίνες που καταλήγουν στα κωνίδια της επιφάνειας. (Α) από τον Schulze, 1879 και (Β) από τον Arndt, Figure 1.1: Illustration of the spongin skeletal network representative of spongiid species. The dense reticulate network of the secondary fibers and the ascending primary fibers are evident. (A) form Schulze, 1879 and (Β) from Arndt,

41 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 - ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗΣ Η οικογένεια περιλαμβάνει 6 έγκυρα γένη (Cook & Bergquist 2002), σε μόνο 3 από τα οποία ανήκουν είδη που εξαπλώνονται στη Μεσόγειο. Πρόκειται για τα γένη Spongia, Hippospongia και Coscinoderma. Η παρουσία μάλιστα του τελευταίου στη Μεσόγειο σημειώθηκε σχετικά πρόσφατα, με την ανακάλυψη και πρώτη περιγραφή του είδους C. sporadense (Voultsiadou et al. 1991). Από αυτά, τα γένη Spongia και Coscinoderma είναι κοσμοπολιτικά, ενώ το Hippospongia έχει αναφερθεί μόνο από τη Μεσόγειο και την Καραϊβική. Από τα μη Μεσογειακά γένη της οικογένειας, το Rhopaloeides εξαπλώνεται αποκλειστικά στον Ειρηνικό Ωκεανό, το Leiosella στον Ινδο-Ειρηνικό και το Hyatella στον Ινδο-Ειρηνικό, την Ερυθρά Θάλασσα και την Καραϊβική. Τα κύρια χαρακτηριστικά για τη διάκριση των γενών της οικογένειας Spongiidae (Εικόνα 1.2) είναι η ενίσχυση της επιφάνειας με ξένα υλικά, η ύπαρξη κοιλοτήτων στην επιφάνεια και το εσωτερικό του σπόγγου, το πλάτος των δευτερευουσών ινών και ο βαθμός διακλάδωσης τους, καθώς και η ομαδοποίηση των κύριων ινών (fascicules) που στην ακραία της μορφή αποκτά την εμφάνιση διάτρητης πλάκας. Σύμφωνα με τους Cook & Bergquist (2002), η οικογένεια Spongiidae περιλαμβάνει 91 ονομαστικά είδη σε παγκόσμια κλίμακα, 54 από τα οποία εντάσσονται στο γένος Spongia και 3 στο γένος Hippospongia. 1.!$%&'( '&)*+µ,&- µ'.,&( +/0% ( %µµ2+, 0.(.)... 2!$%&'( *4563.,&( +/0% &1 8'+9'5':2& (1 (1 (*,3, 8(0/(8)µ,&'3 6&'3 7+0&1 8'+9'5':2& (1 (1 (*,3, 8(0/(8)µ,&'3 6&'3... Leiosella 7+0&1 8'+9'5':2& (1 2/: /'9,3, '5'/';µ,&'3 6&'3... Coscinoderma 3. <=µ( 92+ )1;;2+ > '.=8'5µ( µ' µ';%/'3 02/19-9' <1;;23 *4563 µ';%/'3 02/19-9' ?:5'3 6&'3 02&,3... Hyattella?:5'3 6&'3 /;19'52 02&,3,,43 )%&'3... Hippospongia 0:5'3 6&'3 )*-µ(96a2+& 'µ>0'3, (/,3 8%95-9'3 /%0'3... 0:5'3 6&'3 '6&( (/,3 0( 8'& )*-µ(96a2+& 8%95-9'3 /%0'3... Spongia Εικόνα 1.2: Κλειδικοί χαρακτήρες για τη διάκριση των γενών της οικογένειας Spongiidae (από Cook 2007). Figure 1.2: Key to the distinction of spongiid genera using morphologic characters (from Cook 2007) Τα γένη Spongia και Hippospongia με έμφαση στα Μεσογειακά τους είδη Οι σπόγγοι του μπάνιου της Μεσογείου ταξινομούνται στα γένη Spongia και Hippospongia. Στην μακρόχρονη ιστορία της ταξινόμησης των δύο αυτών γενών υπήρξε μεγάλη συζήτηση σχετικά με την ταυτότητά τους, αλλά και την ένταξη των διάφορων ειδών σε αυτά. Τα σήμερα αποδεκτά Μεσογειακά είδη των γενών αυτών είναι έξι, τα Hippospongia communis, Spongia officinalis, S. lamella, S. zimocca, S. virgultosa και S. nitens (Vacelet 1959). Στην Εικόνα 1.3 δίνονται οι ταξινομικοί χαρακτήρες που διακρίνουν τα είδη αυτά μεταξύ τους. Όπως 27

42 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ φαίνεται, πρόκειται κυρίως για εξωτερικούς (σχήμα του σπόγγου) και μόνο σε μια περίπτωση για ανατομικούς (μορφή του σκελετού) μορφολογικούς χαρακτήρες. Πρόσφατα, οι Pronzato & Manconi (2008) αναφέρουν ότι οι μικρο-χαρακτήρες του σκελετού δεν είναι αρκετοί για την ταξινόμησή των σπόγγων του μπάνιου σε επίπεδο είδους. Περισσότερη πληροφορία για τη διάκριση των ειδών δίνεται από τα εξωτερικά μορφολογικά χαρακτηριστικά, όπως ο τύπος της αύξησης, η σύσταση, το χρώμα, η διάταξη και το μέγεθος των κωνιδίων, η κατανομή και μορφολογία των στομίων εξόδου. 1.!$%&'( '&)*+µ,&- µ'.,&( +/0%... Coscinoderma sporadense!$%&'( *1234.,&( +/0% $(2064 )67784, 8+ 9(:2,*':( (6 0(&%/( 0( 08/6:-:'4 9(µ,:28+ (20':;& */8):;&... Hippospongia communis )$(2064, /(:+)µ,&84 < '/()µ(:8'9<4 µ' )=):()- +0&< µ' µ82$< '):2;µ(:84 8+ $,2' )1/<&'4 => cm µ' ):6µ( '.698+ ):-& 082+$<... Spongia virgultosa )+µ(7<4 < '/()µ(:8'9< ?=2'4 3&'4 *1234,70/'):(.,&( );µ(:( (µ6&8 µ' )0/-23:'4 %//1& )6771& 0%8'4 $82,4)... 5?=2'4 3&'4 µ',70/'):(.,&( );µ(:( ( %µµ8+) ?=2'4 3&'4 µ' µ+'/6. 50'/':64 8/= µ(/( Spongia nitens?=2'4 3&'4 *1234 µ+'/6. 50'/':64 (20':% ):(@' Spongia zimocca µ' µ82$< '/%)µ(:84 < 08=(4... Spongia lamella )+µ(7< A82$< +80+/&920<, µ' µ( '$%&'( '2))6:'28 < /76:'28 083/- ):8 '%&1 µ, $,2' :( ):6µ( ' Spongia officinalis mollissima A82$< )+µ(7<4 '2))6:'28 < /76:'28 /8B; Spongia officinalis adriatica Εικόνα 1.3: Κλειδικοί χαρακτήρες των Μεσογειακών ειδών της οικογένειας Spongiidae (τροποποιημένη από Vacelet 1983). Figure 1.3: Key to the distinction of Mediterranean spongiid species using morphologic characters (modified from Vacelet 1983) Ανασκόπηση της ταξινόμησης των γενών Spongia και Hippospongia Στη συνέχεια παρουσιάζονται με χρονολογική σειρά οι σημαντικότεροι σταθμοί στην ιστορία της ταξινόμησης των γενών Spongia και Hippospongia και των Μεσογειακών τους ειδών. Linnaeus 1759: Ίδρυση του είδους Spongia officinalis και του γένους Spongia. Τυπικά δείγματα δεν έχουν βρεθεί. Pallas 1766: Ίδρυση του είδους S. agaricina, στη βάση ενός δείγματος από τον Ινδικό Ωκεανό. Lamarck 1814: Ίδρυση των ειδών Spongia communis και Spongia usitatissima. 28

43 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 - ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗΣ Bronn 1859: Μετονομασία του γένους Spongia σε Euspongia. Schmidt 1862: Ίδρυση του είδους Spongia equina που σήμερα αναγνωρίζεται ως μεταγενέστερο συνώνυμο του H. communis (Lamarck, 1814). Ίδρυση ακόμη των ειδών S. adriatica (= συνώνυμο του μορφότυπου adriatica του είδους S. officinalis), S. mollissima (= συνώνυμο του μορφότυπου mollissima του είδους S. officinalis), S. quarnerensis (= μεταγενέστερο συνώνυμο του είδους S. officinalis) και S. zimocca (έγκυρο είδος). Hyatt 1877: Εξετάζοντας από κοινού σπόγγους του μπάνιου της Μεσογείου και των ακτών της Αμερικής, τονίζεται η μεγάλη σημασία της γεωγραφικής εξάπλωσης στην ταξινόμηση των σπόγγων του μπάνιου. Αναφέρεται αναλυτικά η εξάπλωση των διάφορων μορφών στις διάφορες περιοχές της Μεσογείου και επισημαίνεται ότι ο τρόπος με τον οποίο ο επιστήμονας καλείται να διακρίνει είδη και ποικιλίες είναι ακριβώς ο ίδιος με εκείνον των σπογγεμπόρων, δηλαδή αποκλειστικά πάνω στη βάση της εξωτερικής μορφής και ιδιαίτερα της επιφάνειας του σπόγγου δηλαδή της κατανομής και του μεγέθους των πόρων, των υποδερμικών κοιλοτήτων, των επιφανειακών καναλιών και των κυρίων ινών. Όλα αυτά τα χαρακτηριστικά είναι άμεσα συνδεδεμένα με την εσωτερική ανατομία του κάθε είδους και γι αυτό είναι πιο σημαντικοί χαρακτήρες από το μέγεθος, το σχήμα και τη διάταξη των ινών ή ακόμη και τη συνολική μορφή του σπόγγου η οποία μπορεί να διαφέρει από περιοχή σε περιοχή. Με αυτό το σκεπτικό ο συγγραφέας τοποθετεί όλες τις γνωστές μεσογειακές μορφές S. officinalis στο υποείδος mediterranea. Διακρίνει δε μέσα σε αυτό το υποείδος τις ποικιλίες adriatica, mollisima, tubuliformis και zimocciformis. Και για τις δύο πρώτες ισχυρίζεται ότι μπορεί να εμφανίζονται με τη μορφή κούπας, αυτό όμως που τις διακρίνει είναι η κάπως σκληρότερη υφή της πρώτης. Ξεχωριστά αντιμετωπίζει το είδος S. equina. Schulze 1879: Ίδρυση του γένους Hippospongia για το Μεσογειακό είδος Spongia equina Schmidt, 1862 (άρα και για το Spongia communis (Lamarck, 1814). Ορισμός του νέου γένους: Presence of a well developed system of canals penetrating the body of the sponge, often in such a manner that between them only comparatively thin partition walls can be found, and absence of primary fibres which are directed in Spongia and Cacospongia perpendicularly to the external surface, the later character being in causal connection with the first peculiarity. Ολότυπος δεν αναφέρεται, δίνεται μόνο μια φωτογραφία (pl. 35, fig. 14). Γίνεται αντικατάσταση των ειδών του Schmidt (1862) με τις ποικιλίες Euspongia officinalis var. adriatica, E. officinalis var. mollissima και E. officinalis var. lamella, και προσθήκη τριών ακόμη ποικιλιών, των irregularis, exigua και tubulosa. Tο τελευταίο θεωρείται σήμερα συνώνυμο με το S. virgultosa (Schmidt 1868). Polejaef 1884 (Challenger expedition): Αμφισβητείται η εγκυρότητα του γένους Hippospongia του Schulze. Έχοντας εξετάσει διάφορα δείγματα των γενών Spongia and Hippospongia που του έχει στείλει ο Schulze, ο Polejaef αδυνατεί να διακρίνει τα δύο γένη και βρίσκει ότι δείγματα Hippospongia από τον Ινδο-Ειρηνικό Ωκεανό είναι πολύ κοντά στο γένος Spongia. Γράφει χαρακτηριστικά: one classifier might place it in the Euspongia, another, and on ground of equal validity, among the Hippospongia. Προτείνει την τοποθέτηση όλων των ειδών Spongia και Euspongia σε ένα διευρυμένο γένος Spongia με τη δημιουργία υπογενών εφόσον κρίνεται απαραίτητο. Πιστεύει ότι κακώς χρησιμοποιείται για τη διάκριση γενών ένας χαρακτήρας που έχει αξία μόνο για τη διάκριση ποικιλιών. Και καταλήγει: his genus Hippospongia Schulze characterises by the presence of numerous channels, i.e. cavities breaking through the body in different directions. That this property is due to the necessity of enlarging the outer surface is perfectly 29

44 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ clear; and it is again to be asked whether this character can be adopted in a short space of time ( ) it is necessary to understand the faculty of certain characters to conform to existing influences, θέτοντας έτσι το ερώτημα εάν και κατά πόσο ένας χαρακτήρας όπως οι μεγάλες κοιλότητες στο σώμα του σπόγγου αποτελεί μια μορφολογική προσαρμογή σε συγκεκριμένες περιβαλλοντικές συνθήκες. Lendenfeld 1889: Δίνεται μια λεπτομερής αναθεώρηση της ταξινόμησης του γένους Euspongia. Η συστηματική περιγραφή του γένους κρίνεται δύσκολη αλλά και ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα εξαιτίας των πολυάριθμων δειγμάτων που είναι διαθέσιμα. Ο Lendenfeld υποστηρίζει ότι σε τάξα για τα οποία είναι διαθέσιμα λίγα δείγματα είναι εύκολο να οριστούν ακριβείς διαφορές, όμως αυτό είναι δύσκολο σε περιπτώσεις όπως των γενών Euspongia και Hippospongia, όπου έχουμε στη διάθεσή μας ένα μεγάλο εύρος μορφών που αλληλοεπικαλύπτονται. Διατηρεί τις ποικιλίες που έχει προτείνει ο Schulze, αλλά παρατηρεί ότι αλληλοεπικαλύπτονται μορφολογικά ώστε να σχηματίζουν μια συνεχή σειρά και θεωρεί τα δύο γένη πολύ συγγενικά, παρόλο που οι ακραίες μορφές τους είναι αρκετά διαφορετικές ώστε να επιτρέπουν τη διάκριση τους. Γενικεύοντας τονίζει: I consider the present system of descriptive zoology as entirely inadequate to deal with animals so variable as sponges. Every classification based on this system must therefore, eo ipso, be bad, and all existing arrangements are so. Topsent 1930, 1931: Εξετάζοντας εδώ τη συλλογή του Lamarck στο Μουσείο του Παρισιού, διαπιστώνει ότι για τα είδη Spongia communis και Spongia usitatissima που είχε περιγράψει ο πρώτος δεν σώζονται τα τυπικά δείγματα. Ωστόσο εξετάζοντας λεπτομερώς τις περιγραφές του καταλήγει ότι πρόκειται χωρίς αμφιβολία για τα είδη Hippospongia communis (με το οποίο συνωνυμίζει το H. equina (Schmidt, 1862)) και Euspongia officinalis var. usitatissima (με το οποίο συνωνυμίζει το E. officinalis var. mollissima Schulze, 1875), τεκμηριώνοντας έτσι την προτεραιότητα των ονομάτων που έδωσε ο Lamarck. Ταυτόχρονα ισχυρίζεται ότι οι τοποθεσίες που αναφέρει ο Lamarck ως θέσεις συλλογής των δειγμάτων του (Ερυθρά Θάλασσα και Ινδικός Ωκεανός για το πρώτο και Θάλασσες της Αμερικής για το δεύτερο) είναι λανθασμένες και ότι αυτά προέρχονται προφανώς από τη Μεσόγειο. Burton 1934: Επαναφορά του ονόματος Spongia για το γένος (αντί του Euspongia) και επιλογή νεοτύπου για το είδος Spongia officinalis. O Burton θεωρώντας ότι δεν υπάρχει ολότυπος για το είδος επέλεξε για το σκοπό αυτό ένα δείγμα του μορφότυπου adriatica που είχε κατατεθεί στο British Museum από τον Schulze, ορίζοντας έτσι το μορφότυπο adriatica ως τυπικό μορφότυπο του είδους. Χαρακτηριστικά αναφέρει για το είδος S. officinalis: ( ) it seems that no one specimen can be said more than any other to represent that elusive animal, the Bath Sponge, and no one can be regarded more than any other, as the type of the species. O Burton επέλεξε ακόμη ένα νεότυπο για το είδος Hippospongia equina, όμοιο με το απεικονιζόμενο δείγμα από τον Schulze (1879, pl.35, fig. 14), επειδή επίσης θεωρούσε ότι δεν υπήρχε ολότυπος. Eπειδή όμως, η εξέταση του σκελετού του δεν έδειξε καμία διαφορά από το σκελετό του νεοτύπου της S. officinalis, και συμφωνώντας με τους προηγούμενους ότι η ύπαρξη μεγάλων κοιλοτήτων δεν συνιστά διαγνωστικό χαρακτήρα για τη διάκριση γενών, πρότεινε τη συνωνύμιση του γένους Hippospongia με το γένος Spongia, γράφοντας: The genera Spongia and Hippospongia must be regarded as synonyms ( ) no author in the past seem to have been sure of the exact value of the two genera. 30

45 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 - ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗΣ De Laubenfels 1936: Εξετάζοντας υλικό από την Καραϊβική, o Launenfels επαναφέρει το θέμα της διάκρισης των γενών Spongia και Hippospongia, και ιδρύει νέο γένος με συναφές όνομα, το Hippiospongia, με τυπικό είδος το H. lachne, το οποίο περιγράφει για πρώτη φορά. Βασίζει τη διαφοροποίηση του γένους Hippiospongia στο γεγονός ότι στα είδη που εντάσσει σε αυτό δεν παρατηρείται διάκριση σε κύριες και δευτερεύουσες ίνες, όπως στα είδη της Spongia. Δεν υπάρχουν επίσης καθόλου έγκλειστα ξένα σώματα στο σκελετό του, και η υφή του είναι πολύ μαλακότερη, ακόμη και από τα μαλακότερα μέλη του γένους Spongia. Υπάρχουν, όπως παρατηρεί, τυπικά τεράστια υποδερμικά κανάλια τα οποία δημιουργούν ένα δίκτυο, είναι σχεδόν κυκλικά σε εγκάρσια τομή με διάμετρο 5-10 mm και διακλαδίζονται αμέσως κάτω από το εξώδερμα. Στα ξηραμένα δείγματα από τα οποία λείπει το εξώδερμα, οι επιφάνειες ανάμεσα στα κανάλια προεκβάλλουν με διάμετρο και ύψος 5-10 mm ή μερικές φορές μέχρι και mm. Κρίνοντας από την επαναπεριγραφή του Topsent (1930), από όλα Μεσογειακά είδη θεωρεί το Spongia communis Lamarck συγγενέστερο με το H. lachne. Topsent 1937: Αποκαθίσταται η αλήθεια σχετικά με την ύπαρξη των τυπικών δειγμάτων του Schmidt για τα είδη Spongia adriatica (= S. officinallis) και S. equina (= H. communis), τα οποία ήταν κατατεθειμένα στη συλλογή Landes-Museum Joanneum στο Graz. Φωτογραφίες των δειγμάτων του Schmidt που καταδεικνύουν σαφώς τη διάκριση μεταξύ των δύο ειδών έχουν δοθεί πρόσφατα από τις Desqueroux-Faundez and Stone 1992). Έτσι, ο Topsent καταδεικνύει αβάσιμη και τη συνωνύμιση του Hippospongia με το Spongia από τον Burton (1934), όπως και την ίδρυση του νέου γένους Hippiospongia από τον de Laubenfels (1936) και επαναφέρει το γένος Hippospongia (Schulze, 1879). Δίνει παράλληλα εκτενή περιγραφή της ποικιλίας H. communis (Lamarck) var. equina (Schmidt) που όπως υποστηρίζει εμφανίζεται σποραδικά στις Γαλλικές ακτές, αλλά με μεγάλη αφθονία στην Νοτιοανατολική Μεσόγειο, τονίζοντας την ύπαρξη εσωτερικών κοιλοτήτων για τη διάκρισή με τα είδη του γένους Spongia. De Laubenfels 1948: Δίνονται λεπτομερείς περιγραφές όλων των ειδών Spongia και Hippiospongia, με την αξιοσημείωτη παρατήρηση ότι η διαφορά ανάμεσα στους δύο τύπους (Spongia και Hippiospongia) είναι ξεκάθαρα ορατή στους σπόγγους της Καραϊβικής αλλά όχι στις περιοχές της Μεσογείου και της Αυστραλίας, και επομένως επιπρόσθετη μελέτη σε ζωντανά δείγματα από τις δύο αυτές περιοχές είναι αναγκαία. Σημειώνεται ότι ο συγγραφέας επιμένει στη διατήρηση του ονόματος Hippiospongia ισχυριζόμενος ότι, ναι μεν υπάρχει το δείγμα στη βάση του οποίου περιγράφηκε το S. equina από το Schmidt, αλλά δεν έχει οριστεί κατηγορηματικά ως ολότυπος του είδους. De Laubenfels & Storr 1958: Δίνεται λεπτομερής περιγραφή των χαρακτήρων που διακρίνουν το γένος Hippiospongia από το Spongia στις περιοχές της Καραϊβικής με έμφαση σε τέσσερα σημεία: (i) τα τεράστια υποδερμικά κανάλια, (ii) την πλήρη, ή σχεδόν πλήρη απουσία εγκλείστων στο σκελετό, (iii) την τέλεια προσκόλληση του εξωδέρματος στο σκελετό, σε αντίθεση με το εξώδερμα της Spongia που πολύ εύκολα αποσπάται και (iv) τα εμφανή στόμια εξόδου με τη μαύρη επένδυση στο εσωτερικό τους και στα κανάλια που οδηγούν σε αυτά. Αναγνωρίζεται, παρόλα αυτά, η δυσκολία που υπάρχει στην ταξινόμηση των εμπορικών ειδών λόγω της τεράστιας και επικαλυπτόμενης ποικιλομορφίας. Περιγράφεται ένα νέο είδος, το Hippiospongia kerion, στη βάση ενός δείγματος από τη Μεσόγειο, που όμως είναι μεταγενέστερο συνώνυμο του Hippospongia communis σύμφωνα με τους Vacelet (1959) και Pronzato & Manconi (2008). 31

46 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Vacelet 1959: Ο συγγραφέας παρατηρεί ότι είναι πολύ δύσκολο να δημιουργηθούν τάξα για όλες τις τοπικές ποικιλίες εμπορικών σπόγγων. Διακρίνει το γένος Spongia από το Hippospongia από την απουσία μεγάλων καναλιών και τη σχετική αφθονία των κύριων ινών που είναι πολύ σπάνιες στο δεύτερο. Δίνει ένα κατάλογο των ειδών του γένους Spongia στη Μεσόγειο μετατρέποντας όλες τις ποικιλίες του S. officinalis που είχε περιγράψει ο Schmidt (1862) σε υποείδη (S.o. adriatica, S.o. mollissima, S.o. irregularis, S.o. exigua, S.o. quarnerensis). Δέχεται ακόμη ως έγκυρα είδη τo S. zimocca Schmidt και το S. agaricina Pallas (θεωρώντας συνώνυμο του το S. officinalis. var. lamella Schulze). Αναφέρει ότι το υποείδος Spongia officinalis ssp. adriatica είναι το μόνο από τα υποείδη του είδους που βρήκε στην περιοχή της Μασσαλίας με μεγάλη ποικιλομορφία. Περιγράφει το Hippospongia communis ως το μοναδικό είδος του γένους από τη Μεσόγειο. Wiedenmayer 1977: Θεωρεί ότι για τους εμπορικούς σπόγγους των Δυτικών Ινδιών τα κοινά ονόματα είναι περισσότερο αξιόπιστα από τα επιστημονικά και αμφισβητεί τη διάκριση των ειδών του Spongia από τους de Laubenfels & Storr (1958), επειδή το υλικό που εξέτασαν δεν προερχόταν από ευρεία γεωγραφική περιοχή, θέτοντας και πάλι το θέμα της γεωγραφικής εξάπλωσης και της σημασίας του στην ταξινόμηση των ειδών του γένους. Διακρίνει το γένος Spongia από το Hippospongia από τη σχετική αφθονία των κύριων ινών (που είναι πολύ σπάνιες στη Hippospongia) και από την απουσία μεγάλων καναλιών και κοιλοτήτων που χαρακτηρίζουν το τελευταίο. Van Soest 1978: Εξετάζοντας μια συλλογή Spongiidae από την Καραϊβική αναφέρει 7 είδη Spongia και 2 είδη Hippospongia, δίνει ορισμούς για τα γένη διακρίνοντας τα με βάση κυρίως τα μεγάλα υποδερμικά κανάλια, μειώνοντας πολύ την αξία της ανυπαρξίας ή μεγάλης σπανιότητας εγκλείστων στις κύριες ίνες της Hippospongia ως διαγνωστικού χαρακτήρα, μιας και το ίδιο χαρακτηριστικό, όπως αναφέρει, μπορεί να εμφανίζεται και σε είδη του γένους Spongia. Bergquist 1980: Στην αναθεώρηση αυτή δίνονται ορισμοί για όλα τα γένη των Κερατόσπογγων (τάξεις Dictyoceratida, Dendroceratida και Verongida). Τα γένη Spongia και Hippospongia διακρίνονται για μια ακόμη φορά στη βάση του μειωμένου αριθμού κύριων ινών στο πρώτο και της σχεδόν παντελούς απουσίας τους στο δεύτερο, καθώς και της ύπαρξης κοιλοτήτων στο εσωτερικό του δεύτερου. Hooper & Wiedenmayer 1994: Αμφισβητείται από τους συγγραφείς η ισχύς του νεότυπου που επιλέχτηκε από τον Burton (1934), που δεν ήταν παρά ένα δείγμα S. officinalis var. adriatica κατατεθειμένο στο Βρετανικό Μουσείο από τον Schulze, καθώς η περιοχή από την οποία προερχόταν δεν ήταν ίδια με την τυπική περιοχή του δείγματος στο οποίο βασίστηκε η περιγραφή του είδους S. officinalis. Cook & Bergquist 2001: Εδώ προτείνεται η διάκριση τριών υπογενών στο γένος Spongia, αφού πολλά από τα είδη του γένους είναι ποικιλόμορφα και εξαιρετικά δύσκολο να περιγραφούν με ακρίβεια. Τα υπογένη είναι τα Spongia, Australospongia και Heterofibria. Στο πρώτο υπογένος εντάσσονται μόνο οι εμπορικοί σπόγγοι του γένους της περιοχής της Μεσογείου. Δίνεται λεπτομερής ορισμός για το γένος Spongia: Επιφάνεια χωρίς ενίσχυση, υφή μαλακή έως σταθερή και συμπιεστή. Με ένα σκελετικό δίκτυο από κύριες ίνες γεμάτες με έγκλειστα ξένα σώματα και δευτερεύουσες ίνες χωρίς έγκλειστα. Οι κύριες ίνες πιο εμφανείς κοντά στην επιφάνεια του σπόγγου, όπου μπορεί να διαπερνούν το εξώδερμα. Τα κωνίδια όταν υπάρχουν υποστηρίζονται από μεμονωμένες ή σε τούφες ανερχόμενες κύριες ίνες. Ο σκελετός αποτελείται κυρίως από ένα δίκτυο δευτερευουσών ινών που δίνει στο σπόγγο την ελαστικότητα και την ικανότητα 32

47 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 - ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗΣ συγκράτησης νερού. Το δίκτυο αυτό δημιουργείται από διχοτόμηση και διασταύρωση ινών και από κάθε κόμβο ξεκινούν τρεις ίνες. Ο αριθμός των κύριων ινών είναι ένας χαρακτήρας που χρειάζεται διερεύνηση σε ενδο- και διαειδικό επίπεδο. Ακόμη, στη βάση δειγμάτων από την Αυστραλία και τη Νέα Ζηλανδία, ένας αριθμός ειδών που είχαν ενταχθεί στο γένος Hippospongia μεταφέρονται σε άλλα γένη μεταξύ των οποίων και το Spongia. Τα όρια του γένους Hippospongia επανακαθορίζονται: Το γένος Hippospongia παραδοσιακά έχει διακριθεί από το πολύ συγγενικό Spongia από τη σχετική σπανιότητα των κύριων ινών και την παρουσία μεγάλων καναλιών, υποδερμικών κοιλοτήτων και θαλάμων στη μεσοΰλη, που δίνουν στο σπόγγο μια σπηλαιώδη υφή (Vacelet 1959, Wiedenmayer 1977, van Soest 1978, Berguist 1980). Οι de Laubenfels & Storr (1958) προσέθεσαν ότι στο Hippospongia το εξώδερμα είναι στενά προσκολλημένο στο σκελετό, ενώ στο Spongia εύκολα αποσπάται. Η νέα διάγνωση που δίνεται εδώ είναι: Spongiidae με ένα κυρίαρχο δευτερεύον δίκτυο. Οι κύριες ίνες είναι σπάνιες, μπορεί να είναι γεμάτες με έγκλειστα και συνήθως παρατηρούνται μόνο στην επιφάνεια του σπόγγου. Η περιοχή κάτω από την επιφάνεια φέρει κοιλότητες που επικαλύπτονται από πινακόδερμα. Τα στόμια εξόδου είναι μεγάλα, διαμέτρου μέχρι mm. Τα κανάλια που ξεκινούν από αυτά έχουν παρόμοια διάμετρο και μπορεί να διασχίζουν κυριολεκτικά το σπόγγο από την επιφάνεια μέχρι τη βάση, δημιουργώντας θαλάμους μέσα στη μεσοΰλη. Η επιφάνεια είναι καλυμμένη από κωνίδια που σχηματίζονται από μία ή περισσότερες ανερχόμενες ίνες που καταλήγουν σε τούφα. Όταν ο σκελετός στεγνωθεί ο σπόγγος φαίνεται περισσότερο τριχωτός σε αντίθεση με τη βελούδινη όψη των επεξεργασμένων ατόμων του Spongia. Εν κατακλείδι, προτείνεται ότι το γένος Spongia παρουσιάζει εμφανή ποικιλομορφία και απαιτεί σε βάθος αναθεώρηση. Η μορφολογία, διάταξη και ποιότητα των ινών της σπογγίνης θα πρέπει να εξεταστούν εξονυχιστικά, με ιδιαίτερη προσοχή στη σύγκριση ειδών από εύκρατες και τροπικές περιοχές. Cook & Bergquist 2002 (Systema Porifera): Η περιγραφή που γίνεται για τα γένη Spongia και Hippospongia και τα διακριτικά τους χαρακτηριστικά είναι βασισμένα στους Cook & Bergquist (2001). Για το γένος Hippospongia τονίζεται ότι εφόσον, εκτός από την ύπαρξη μεγάλων κοιλοτήτων στο εσωτερικό του σπόγγου, λαμβάνονται πια επιπλέον υπόψη ως διαγνωστικά χαρακτηριστικά του γένους η ύπαρξη επιφανειακών κοιλοτήτων και μεγάλης διαμέτρου καναλιών, πολλά από τα είδη χρειάζεται να επανεξεταστούν πριν τοποθετηθούν σε γένη. Καταμετρείται η ύπαρξη 54 ειδών της οικογένειας Spongiidae σε παγκόσμια κλίμακα και προτείνεται η διερεύνηση της εγκυρότητάς τους (η οποία και τίθεται υπό αμφισβήτηση με άλλα χαρακτηριστικά πλην των μορφομετρικών. Ακόμη δίνεται συνοπτική περιγραφή των τυπικών ειδών Spongia officinalis και Hippospongia communis στη βάση των δημοσιεύσεων των Vacelet (1959) και Castritsi-Catharios (1998). Cook 2007: Σε αυτή την πλέον πρόσφατη αναθεώρηση των γενών των Dictyoceratida και των διαγνωστικών τους χαρακτήρων, κλειδικός χαρακτήρας για τη διάκριση των γενών Spongia και Hippospongia είναι η ύπαρξη μεγάλων κοιλοτήτων στο σώμα του σπόγγου (Εικόνα 1.4), καθώς και η σχετική ποσότητα κύριων ινών στο σκελετό, ακολουθώντας τις προγενέστερες περιγραφές της Bergquist (1980). Εδώ δίνεται και η κλείδα των γενών της Εικόνας 1.2. Pronzato & Manconi 2008: Εδώ επιβεβαιώνεται η ταυτότητα του είδους Spongia officinalis με βάση τις περιγραφές του S. officinalis από το Linnaeus (1759) και του S. adriatica από το Schmidt (1862), καθώς και ο νεότυπος του Burton (1934) ως τυπικό δείγμα για το είδος. Διακρίνεται το υποείδος mollissima του είδους S. officinalis ως ξεχωριστό είδος με το όνομα S. mollissima. Η 33

48 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Εικόνα 1.4: Απεικόνιση της παρουσίας ή απουσίας μεγάλων κοιλοτήτων στο σώμα του σπόγγου ως κλειδικού χαρακτήρα για τη διάκριση των γενών Spongia (A) και Hippospongia (Β) (από Cook 2007). Figure 1.4: The presence or absence of large subdermal lacunae as a diagnostic character for the distinction between genera Spongia (A) and Hippospongia (B) (from Cook 2007). αναβάθμιση αυτή αιτιολογείται με βάση την εξωτερική μορφολογική του ιδιαιτερότητα, παρόλο που δεν υπάρχει διαθέσιμος ολότυπος. Έτσι ορίζεται ως νεότυπος, ένα δείγμα που έχει συλλεγεί στις ακτές της Συρίας και κατατεθεί στο Museo Civico di Storia Naturale Giacomo Doria στη Genova. Αμφισβητείται η ταυτότητα του μέχρι σήμερα έγκυρου είδους S. zimocca Schmidt, 1862, και προτείνεται να θεωρηθεί προς το παρόν ονομαστικό είδος λόγω του ότι έχουν δοθεί διαφορετικές περιγραφές για αυτό από διάφορους συγγραφείς, και τα υπάρχοντα τυπικά δείγματα που χρησιμοποιηθήκαν για τις πρώτες περιγραφές ανήκουν σε περισσότερα του ενός τάξα. Μετονομάζεται το γνωστό Μεσογειακό είδος S. agaricina Pallas, 1766 σε S. lamella Schulze, 1879 λόγω του ότι η αρχική περιγραφή του Pallas (1766) είχε βασιστεί σε δείγμα από τον Ινδικό Ωκεανό, που επιπλέον έχει χαθεί. Στόχος αυτής της ενέργειας είναι η τοποθέτηση των δειγμάτων από τη Μεσόγειο σε διαφορετικά είδη από ό,τι εκείνα που προέρχονται από τον Ινδικό Ωκεανό. Για το νέο είδος επιλέγεται ως νεότυπος ένα δείγμα από τις ακτές της Σικελίας που επίσης φυλάσσεται στο μουσείο Giacomo Doria. Καθιερώνεται ως νεότυπος για το είδος Hippospongia communis (Lamarck, 1814) ένα από τα δύο δείγματα του Schmidt (1862) για το είδος Hippospongia equina (μεταγενέστερο συνώνυμο του H. communis) που φυλάσσονται στο Μουσείο του Graz (βλέπε παραπάνω). Καθιερώνεται το είδος H. kerion De Laubenfels & Storr, 1958 ως «κενό όνομα», μιας και ο ολότυπός του ήταν ένα δείγμα H. communis (βλέπε παραπάνω). Με βάση όλα τα παραπάνω, τα συνώνυμα που έχουν κατά καιρούς δοθεί στα εξεταζόμενα γένη Spongia και Hippospongia, καθώς και στους Μεσογειακούς εκπροσώπους τους S. officinalis και H. communis, είναι τα ακόλουθα: Genus Spongia Linnaeus, 1759 Ditela Schmidt, 1862 Euspongia Bronn, 1859 Spongia officinalis morphotype adriatica Spongia officinalis, Linnaeus, 1759, p. 1348; Pronzato & Manconi, 2008 (figs. 3,4) 34

49 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 - ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗΣ Spongia adriatica Schmidt, 1862, p. 20, taf. 2(1) Spongia quarnerensis Schmidt, 1862, p. 22, taf. 2(2), 3(1) Spongia officinalis mediterranea var. adriatica Hyatt, 1877, p.151, pl. 16 (18, 19) Spongia officinalis mediterranea var. tubuliformis Hyatt, 1877, p.151, pl. 16 (18,19) Spongia officinalis mediterranea var. zimocciformis Hyatt, 1877, p.151, pl. 16 (18,19) Euspongia officinalis var. adriatica Schulze, 1879, p. 616, taf. 35(1,2); Carballo et al. 1994, p. 36, figs. 2b, 5a,c) Spongia officinalis adriatica Vacelet, 1959, p. 76, pl. 2(12); Castritsi-Catharios 1998, p. 60, 98, figs , 68, 69 Spongia (Spongia) officinalis Cook & Bergquist 2002, p. 1052, fig. 1A-C) Spongia officinalis morphotype mollissima Spongia usitassima Lamarck, 1814, p. 383 Spongia mollissima, Schmidt, 1862, p. 23; Pronzato & Manconi, 2008, p. 152, fig. 4D Spongia officinalis mediterranea var. mollissima Hyatt, 1877, p. 511, pl. 16 (21) Euspongia officinalis var. mollissima Schulze, 1879, p. 616, taf. 35(1,2) Euspongia officinalis var. usitassima Topsent, 1930, p. 47 Spongia officinalis mollissima Vacelet, 1959, p. 74; Castritsi-Catharios 1998, p. 64, 100, figs , 71-75) Genus Hippospongia Schulze, 1879 Spongia Burton, 1934 Hippiospongia De Laubenfels, 1936 Hippospongia communis (Lamarck, 1814) Spongia communis, Lamarck, 1814, p. 370 Spongia equina Schmidt, 1862, p. 23, taf. 2(5); Hyatt, 1877, p. 517, pl. 16 (1,9) Hippospongia equina Schulze 1879, p. 614, taf. 35(14) Hippospongia communis Topsent, 1930, p.10; Vacelet, 1959, p. 80; Castritsi-Catharios 1998, p. 54, figs ; Cook & Bergquist, 2002, p. 1056, fig. 1F-H; Pronzato & Manconi, 2008, p. 156, fig. 4 Hippospongia communis var. equina Topsent, 1937, p. 10 Hippiospongia kerion De Laubenfels & Storr, 1958, p. 117, figs. 3, Σύνοψη Το αναλυτικό ιστορικό της ταξινόμησης των γενών Spongia και Hippospongia που παρατέθηκε στην προηγούμενη ενότητα, μπορεί να συνοψιστεί ως εξής: Η ταξινόμηση των σπόγγων του μπάνιου ουσιαστικά ξεκινάει με τη δημοσίευση του Schmidt (1862) για τους σπόγγους της Αδριατικής και έτσι τα πρώτα είδη που περιγράφηκαν βασίστηκαν σε δείγματα από τη Μεσόγειο και κυρίως την Αδριατική. Ο ίδιος ο Schmidt δεν είχε κάνει διαχωρισμό γενών, αλλά κατέταξε όλα τα είδη στο γένος Spongia. Ο μεταγενέστερος διαχωρισμός του γένους 35

50 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Hippospongia από τον Schulze (1879) βασίστηκε στην ύπαρξη ενός συστήματος μεγάλων καναλιών και στην απουσία κύριων ινών σε κάποια δείγματα. Στη συνέχεια διακρίνονται δύο εμφανώς αντίθετες τάσεις: η μια, εξετάζοντας είδη από τον Κόλπο του Μεξικού και την Καραϊβική (de Laubenfels 1936, de Laubenfels & Storr 1958, Wiedenmayer 1977, van Soest 1978), επιμένει στη διάκριση των δύο γενών στη βάση χαρακτηριστικών όπως η ύπαρξη ενός συστήματος μεγάλων καναλιών και κοιλοτήτων και η απουσία ή ο περιορισμένος αριθμός κύριων ινών. Η άλλη (Polejaef 1884, Lendenfeld 1889, Burton 1934) αμφισβητεί το διαχωρισμό των γενών Spongia και Hippospongia και την εγκυρότητα του τελευταίου με το βάσιμο επιχείρημα ότι η εξέταση μεγάλου αριθμού δειγμάτων από τη Μεσόγειο και τον Ινδο-Ειρηνικό αποκαλύπτει την ύπαρξη επικαλυπτόμενων μορφολογικών χαρακτηριστικών που σχηματίζουν μια συνεχή σειρά και ότι η διάκριση των δύο γενών έχει βασιστεί στην εξέταση περιορισμένου αριθμού ακραίων δειγμάτων. Η αδυναμία διάκρισης ανάμεσα στα δύο γένη στην περιοχή της Μεσογείου και του Ινδο-Ειρηνικού αναγνωρίζεται και από τον υπέρμαχο της πρώτης τάσης de Laubenfels (1936). Οι πρόσφατες έρευνες σε είδη των δύο γενών του Ινδο-Ειρηνικού (Cook & Berguist 2001, 2002) φαίνεται να δικαιώνουν τις επιφυλάξεις των υποστηρικτών της δεύτερης τάσης με αποτέλεσμα το είδος Hippospongia να μην είναι πλέον αποδεκτό για τη συγκεκριμένη περιοχή. Επίσης κάποια από τα Ινδο-Ειρηνικά είδη του έχουν ήδη μεταφερθεί στο γένος Spongia, ενώ για τα υπόλοιπα εκκρεμεί η τοποθέτηση τους σε κάποιο γένος. Για τη διάκριση των δύο γενών σήμερα (Cook 2007) ο βασικός κλειδικός χαρακτήρας εξακολουθεί να είναι η ύπαρξη μεγάλων κοιλοτήτων, ενώ επιπρόσθετα λαμβάνεται υπόψη το σχετικό πλήθος των κύριων ινών στο σκελετό. Κανένα, πάντως, από τα δύο αυτά χαρακτηριστικά δεν μπορεί να θεωρηθεί ισχυρός κλειδικός χαρακτήρας, αφού είναι σχετικοί και όχι σταθεροί σε όλα τα δείγματα που εξετάζονται (Mayr & Ashlock 1991). Επιπλέον, για την περιοχή της Μεσογείου δεν έχει γίνει προς το παρόν καμία προσπάθεια να διαπιστωθεί αν πράγματι τα δύο γένη διακρίνονται στη βάση αξιόπιστων ταξινομικών χαρακτήρων. Η ταξινόμηση των εμπορικών σπόγγων της Μεσογείου στο επίπεδο του είδους παρουσιάζει επίσης δυσχέρειες και διχογνωμίες. Οι περισσότεροι ταξινόμοι συμφωνούν στο ότι είναι εξαιρετικά δύσκολο να δημιουργηθούν ταξινομικές ομάδες για όλες τις διαφορετικές μορφές σπόγγων που αλιεύονται (π.χ. Vacelet 1959, de Laubenfels & Storr 1958). Παρόμοιος προβληματισμός έχει διατυπωθεί και από τους επαγγελματίες σπογγαλιείς που στη διάρκεια των σπογγαλιευτικών πλόων έρχονται σε επαφή με πολυάριθμους και ποικιλόμορφους μορφοτύπους και με ενδιάμεσες μορφές που οι ίδιοι δεν μπορούν να τοποθετήσουν σε κάποια από τις γνωστές ομαδοποιήσεις. Το γένος Hippospongia αντιπροσωπεύεται στη Μεσόγειο από το είδος H. communis, που έχει παραμείνει αποδεκτό στην πάροδο του χρόνου ως μια ταξινομική οντότητα που διακρίνεται από τα είδη του γένους Spongia στη βάση των μορφολογικών χαρακτήρων που προαναφέρθηκαν. Από την άλλη, η ταξινόμηση του γένους Spongia έχει υποστεί ποικίλες ανακατατάξεις. H απουσία τυπικών δειγμάτων, η μεγάλη επικαλυπτόμενη ποικιλομορφία και η εξέταση, τις περισσότερες φορές, μικρού αριθμού δειγμάτων είχε ως αποτέλεσμα οι διάφοροι μορφότυποι να αναγνωριστούν κατά καιρούς ως ποικιλίες (Schulze 1879), υποείδη (Vacelet 1959) ή και ξεχωριστά είδη (Schmidt 1862, Pronzato & Manconi 2008), αλλά και να αμφισβητηθεί η ταυτότητα κάποιων παραδοσιακά αποδεκτών ειδών (Pronzato & Manconi 2008). 36

51 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 - ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗΣ 1.4. Βιβλιογραφία Bergquist PR, A revision of the supraspecific classification of the orders Dictyoceratida, Dendroceratida and Verongida (class Demospongiae). New Zealand Journal of Zoology 7(4): Bronn HG, Die Klassen und Ordnungen des Thierreichs: wissenschaftlich dargestellt in Wort und Bild. Amorphozoen. C.F. Winter, Leipzig and Heidelberg, 662 pp. Burton M, Sponges. Scientific Reports of the Great Barrier Reef Expedition (14): , pls. 1-2 Castritsi-Catharios J, Kalymnos and the secrets of the sea. Athens, 192 pp. Cook SDC, Clarification of dictyoceratid taxonomic characters, and determination of genera. In: Custódio MR, Lôbo-Hajdu G, Hajdu E, Muricy G (eds.), Porifera Research: biodiversity, innovation and sustainability. Série Livros 28, Museu Nacional, Rio de Janeiro, pp Cook SDC, Bergquist PR, New species of Spongia (Porifera: Demospongiae: Dictyoceratida) from New Zealand, and a proposed subgeneric structure. New Zealand Journal of Marine and Freshwater Research 35(1): Cook SDC, Bergquist PR, Family Spongiidae Gray, In: Hooper JNA, van Soest RWM (eds.), Systema Porifera: a guide to the classification of sponges. Kluwer Academic, New York, pp Desqueyroux-Faúndez R, Stone SM, O. Schmidt Sponge Catalogue. An illustrated guide to the Graz Museum Collection, with notes on additional material. Muséum d Histoire Naturelle, Geneva, 190 pp. & 49 pls. Hooper JNA, van Soest RWM (eds.), Systema Porifera: a guide to the classification of sponges. Kluwer Academic, New York, 1706 pp. Hooper JNA, Wiedenmayer F, Porifera. In: Wells A (ed.), Zoological Catalogue of Australia. Volume 12. CSIRO Editions, Melbourne, pp Hyatt A, Revision of the North American Poriferae with remarks upon foreign species. Part II. Memoirs of the Boston Society of Natural History 2: & pls Lamarck JBP de Monet, Comte De, Sur les polypiers empâtés. Suite du mémoire intitulé: Sur les Polypiers empâtés. Suite des éponges. Annales du Muséum national d histoire naturelle, Paris 20 (6): (published 1813), , (published 1814) Laubenfels MW de, A discussion of the sponge fauna of the Dry Tortugas in particular and the West Indies in general, with material for a revision of the families and orders of the Porifera. Carnegie Institute of Washington (Tortugas Laboratory Paper No. 467) 30: 1-225, pls Laubenfels MW de, The order Keratosa of the phylum Porifera: a monographic study. Occasional Papers of the Allan Hancock Foundation 3:

52 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Laubenfels MW de, Storr JF, The taxonomy of American commercial sponges. Bulletin of Marine Science of the Gulf and Caribbean 8(2): Lendenfeld R von, A Monograph of the Horny Sponges. Trübner and Co., London, 936 pp. & 50 pls. Linnaeus C, 1759 Systema naturae per regna tria naturae, secundum classes, ordines, genera, species, cum characteribus, differentiis, synonymis, locis. Tomus II. Editio decima, reformata. - pp. [1-4], Mayr E, Ashlock PD, Principles of Systematic Zoology. McGraw Hill, New York, 475 pp. Pallas PS, Elenchus Zoophytorum sistens generum adumbrations generaliores et specierum cognitarum succinctas descriptiones cum selectis auctorum synonymis. Van Cleef, Hague, 451 pp. Poléjaeff N, Report on the Keratosa collected by H.M.S. Challenger during the years Zoology 11: 1-88 & pls Pronzato R, Manconi R, Mediterranean commercial sponges: over 5000 years of natural history and cultural heritage. Marine Ecology 29: Schmidt O, Die Spongien des adriatischen Meeres. Engelmann, Leipzig, 88 pp. & 7 pls. Schulze FE, Untersuchungen über den Bau und die Entwicklung der Spongien - Siebente Mittheilung: die Familie der Spongidae. Zeitschrift für wissenschaftliche Zoologie 32: & pls Szymanski M, Hornschwämme von Aegina und Brioni bei Pola. Inaugural Dissertation, Breslau, 52 pp. & 4 pls. Topsent E, Eponges de Lamarck conservées au Museum de Paris. Archives du Museum Nationale d Histoire Naturelle 6(5): 1-56 Topsent E, Eponges de Lamarck conservées au Museum de Paris - deuxième partie. Archives du Museum Nationale d Histoire Naturelle 6(8): Topsent E, Notes diverses sur des Éponges. Bulletin de l'institut Océanographique (Monaco) 722: 1-15 Vacelet J, Répartition générale des éponges et systématique des éponges cornées de la région de Marseille et de quelques stations méditerranéennes. Recueil des Travaux de la Station marine d Endoume 16(26): & pls. 1-3 Vacelet J, Eponges. In: Fischer H, Schneider J, Bauchot F, (eds.), Fiches FAO d indentification des espèces pour les besoins de la pêche - Mediterranee et Mer Noire. Vol. I Vegetaux et invertebres. FAO, Rome, pp Van Soest RWM, Marine sponges from Curaçao and other Caribbean localities. Part I. Keratosa. In: Hummelinck PW, van der Steen LJ (eds.), Uitgaven van de Natuurwetenschappelijke Studiekring voor Suriname en de Nederlandse Antillen No. 94: Studies on the Fauna of Curaçao and other Caribbean Islands 56(179):

53 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 - ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗΣ Voultsiadou-Koukoura E, Van Soest RWM, Koukouras A, Coscinoderma sporadense sp.n. from the Aegean Sea with comments on Coscinoderma confragosum (Porifera, Dictyoceratida). Zoologica Scripta 20(3): Wiedenmayer F, Shallow-water sponges of the western Bahamas. Experientia Supplementum 28: & pls

54

55 Κεφάλαιο 2 ΣΥΛΛΟΓΗ & ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ

56

57 2. Συλλογή και προετοιμασία δειγμάτων Ένα σύνολο 705 δειγμάτων από άτομα των ειδών Spongia officinalis και Hippospongia communis συλλέχθηκαν από 41 σταθμούς δειγματοληψίας κατανεμημένους στο Αιγαίο Πέλαγος, τις ακτές της Νότιας Γαλλίας και το Γιβραλτάρ (Εικόνα 2.1) και χρησιμοποιήθηκαν για τις αναλύσεις της παρούσας μελέτης. Οι διαδικασίες συλλογής και επεξεργασίας των δειγμάτων περιγράφονται αναλυτικά παρακάτω. Εικόνα 2.1: Οι περιοχές δειγματοληψίας στη Μεσόγειο Θάλασσα: (A) Αιγαίο Πέλαγος, (B) α- κτές Νότιας Γαλλίας, (C) Γιβραλτάρ. Figure 2.1: Sampling regions in the Mediterranean: (A) Aegean Sea, (B) Provence, (C) Gibraltar 2.1. Συλλογή δειγμάτων στο Αιγαίο Ερευνητικοί πλόες και συμπληρωματικές δειγματοληψίες Η δειγματοληψία στο Αιγαίο πραγματοποιήθηκε κατά το μεγαλύτερο μέρος της στο πλαίσιο του ερευνητικού προγράμματος ΕΠΑΛ (Επιχειρησιακό Πρόγραμμα Αλιείας , Μέτρο Δράση 3) του Υπουργείου Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων, με αντικείμενο Εφαρμογή καινοτόμων μέτρων στήριξης της σπογγαλιείας στο Αιγαίο. Το πρόγραμμα υλοποιήθηκε το 2008 από τον Αλιευτικό Σύλλογο Παράκτιας Αλιείας Καλύμνου Παναγία Υπαπαντή, το Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας, το Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης και το Ελληνικό Κέντρο Θαλασσίων Ερευνών. Κατά το καλοκαίρι του 2008 (Ιούλιος έως Σεπτέμβριος) πραγματοποιήθηκε ερευνητικός πλους με το επαγγελματικό σπογγαλιευτικό σκάφος Καπ. Γιώργος (Ν. Καλύμνου 451), με πλήρωμα τεσσάρων επαγγελματιών δυτών, για την αναζήτηση φυσικών πληθυσμών σπόγγων μπάνιου. Η πορεία του πλου είχε ΝΑ κατεύθυνση στο Αιγαίο, ακολουθώντας τη διαβάθμιση που έχει διαπιστωθεί ότι χαρακτηρίζει την κατανομή των σπόγγων στη Μεσόγειο (Voultsiadou 2005, 2009). Διερευνήθηκαν συνολικά 17 νησιά, κατανεμημένα σε τρεις διακριτούς γεωγραφικούς τομείς (Εικόνα 2.2): (α) το αρχιπέλαγος των Σποράδων στο Βόρειο Αιγαίο, (β) τις Κυκλάδες και τα 43

58 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Δωδεκάνησα στο Κεντρικό Αιγαίο και (γ) το τόξο Κρήτης-Καρπάθου στο Νότιο Αιγαίο. Οι περιοχές αυτές παρουσιάζουν διακριτά γεωμορφολογικά (Sakellariou et al. 2005), φυσικοχημικά (Zervakis et al. 2005) και βιολογικά χαρακτηριστικά (Gotsis-Skretas & Ignatiades 2005, Voultsiadou 2005). Η επιλογή των νησιών σε κάθε τομέα βασίστηκε σε δημοσιευμένη πληροφορία σχετικά με την κατανομή των σπόγγων μπάνιου στο Αιγαίο (Castritsi-Catharios 1998, Voultsiadou et al. 2008), καθώς και σε προσωπική επικοινωνία με ενεργούς σπογγαλιείς. Η περιοχή του Εθνικού Θαλάσσιου Πάρκου της Αλοννήσου και των Βορείων Σποράδων συμπεριλήφθηκε στη δειγματοληψία, με σχετική άδεια από το φορέα. Δύο σταθμοί δειγματοληψίας διερευνήθηκαν αρχικά σε κάθε νησί για να διαπιστωθεί η παρουσία των ζητούμενων ειδών. Στην περίπτωση που οι υπάρχοντες πληθυσμοί ήταν ικανοί σε αφθονία, διερευνήθηκαν πρόσθετες περιοχές. Με αυτόν τον τρόπο, πραγματοποιήθηκε διερεύνηση σε 55 σταθμούς, εκ των οποίων πληθυσμοί των ζητούμενων ειδών βρέθηκαν σε 26, ενώ συλλέχθηκαν συνολικά 351 δείγματα (Εικόνα 2.2, Πίνακας 2.1). Η δειγματοληψία έγινε με κατάδυση σε βάθος έως 50 m από το συγγραφέα συνοδευόμενο από έναν επαγγελματία σπογγαλιέα, με την παραδοσιακή μέθοδο του ναργιλέ όπως περιγράφεται από τους Voultsiadou et al. (2011). Η διερεύνηση καθοδηγήθηκε από τον επαγγελματία αλιέα, σύμφωνα με την πρακτική που παραδοσιακά ακολουθείται: σε αραιά σπογγαλιευτικά πεδία ο δύτης κινείται ελεύθερα σε απόσταση 2-3 m από τον πυθμένα, ώστε να εποπτεύει μεγαλύτερη έκταση, και πλησιάζει το βυθό Εικόνα 2.2: Οι περιοχές δειγματοληψίας στο Αιγαίο Πέλαγος: (A) Βόρειες Σποράδες, (B) Κυκλάδες, (C) Δωδεκάνησα, (D) Κάρπαθος, (E) Ανατολική και Βόρεια Κρήτη, (F) Δυτική Κρήτη. Figure 2.2: Sampling locations in the Aegean Sea: (A) Sporades, (B) Cyclades, (C) Dodecanese, (D) Karpathos, (E) Eastern and Northern Crete, (F) Western Crete. 44

59 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 - ΣΥΛΛΟΓΗ & ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ!$%&' (µ/)*+,-µ.+' /01$-23 /45678µ&' 90:1. ;4<=-' 90:1. µ3%-' ><6-' SPOF HCOM?744.%=5' 02A /$;.1$ SPO N E ?/-AB 02B /$;.1$ SPO N E ?/-AB 02C /$;.1$ SPO N E ?/-AB 02D /$;.1$ SPO N E ?/-AB 03B /<1-' CYC N E ?/-AB 03F /<1-' CYC N E ?/-AB 04ABC /<1-' CYC N E ?/-AB 04D /<1-' CYC N E ?/-AB 05A B<C-' CYC N E ?/-AB 05B B<C-' CYC N E ?/-AB 06C KOS N E ?/-AB 06D KOS N E ?/-AB 07B KOS N E ?/-AB 09B KAR N E ?/-AB 09C KAR N E ?/-AB 10A KAR N E ?/-AB 10C KAR N E ?/-AB 15B >&10$+!13=5 NCR N E ?/-AB 15C >&10$+!13=5 NCR N E ?/-AB 15D >&10$+!13=5 NCR N E ?/-AB 17A >&10$+!13=5 NCR N E ?/-AB Afr D7=$%3!13=5 WCR N E AB Afr D7=$%3!13=5 WCR N E AB Sfin D7=$%3!13=5 WCR N E AB Ather ECR N E ?/ Kouf ECR N E ?/ P B&=$+ 9+44*+ Porquerolles PCP N 42 59' 23.34'' E 06 13' 11.72'' 6 10 TP P B&=$+ 9+44*+ La Ciotat LAC N 43 09' 49.68'' E 05 35' 56.70'' TP P B&=$+ 9+44*+ Marseille MAR N 43 12' 27.61'' E 05 20' 16.24'' TP P B&=$+ 9+44*+ Marseille MAR N 43 12' 42.74'' E 05 24' 29.79'' TP P B&=$+ 9+44*+ Marseille MAR N 43 11' 09.74'' E 05 23' 24.38'' TP P B&=$+ 9+44*+ Marseille MAR N 43 11' 50.04'' E 05 21' 46.16'' TP P B&=$+ 9+44*+ Marseille MAR N 43 10' 17.96'' E 05 23' 36.79'' TP P B&=$+ 9+44*+ Port-Cros PCP N 42 59' 17.54'' E 06 23' 42.36'' TP P B&=$+ 9+44*+ Port-Cros PCP N 43 01' 10.55'' E 06 24' 32.62'' TP P B&=$+ 9+44*+ Marseille MAR N 43 16' 42.98'' E 05 20' 04.07'' 32 5 TP P B&=$+ 9+44*+ Marseille SVE N 43 12' E 05 15' 15.09'' TP-AB P B&=$+ 9+44*+ Le Rove LRO N 43 20' 25.10'' E 05 15' 41.12'' TP-AB P B&=$+ 9+44*+ Le Rove LRO N 43 20' 15.86'' E 05 15' 21.75'' TP Gibr $E1+4=<1 Ceuta CEU N 35 52' W 05 18' TP Gibr $E1+4=<1 Ceuta CEU N 35 53' W 05 18' TP 45

60 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Πίνακας 2.1 (προηγούμενη σελίδα): Περιγραφή των σταθμών δειγματοληψίας στο Αιγαίο, τη Δυτική Μεσόγειο και το Γιβραλτάρ, και αριθμός δειγμάτων που συλλέχθηκαν από τον καθένα, ανά είδος (SPOF: Spongia officinalis, HCOM: Hippospongia communis). Αναφέρονται οι συλλέκτες για κάθε δειγματοληψία (ΣΠ: επαγγελματίες σπογγαλιείς, ΘΝ: Θάνος Νταϊλιάνης, TP: Thierry Pérez). Table 2.1 (previous page): Definition of the sampling locations in the Aegean Sea, Provence and Gibraltar indicating the number of samples collected from each, per species (SPOF: Spongia officinalis; HCOM: Hippospongia communis). Collectors are also indicated for each sampling (ΣΠ: professional sponge fishermen; ΘΝ: Thanos Dailianis; TP: Thierry Pérez). μόνο για να συλλέξει τα διάσπαρτα άτομα σε πλούσια σπογγαλιευτικά πεδία, ο δύτης παραμένει σε επαφή με το βυθό, συλλέγοντας σπόγγους και κινούμενος τυχαία προς το επόμενο πλησιέστερο άτομο. Συμπληρωματική δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε σε 4 επιπλέον περιοχές της Κρήτης. Δύο σταθμοί στο ανατολικό τμήμα του νησιού (Ather και Kouf) διερευνήθηκαν με το σπογγαλιευτικό σκάφος Θέμελης (Ν. Καλύμνου 168) τον Ιούνιο του 2007, σε βάθος μέχρι 50 m από δύο επαγγελματίες σπογγαλιείς με την παραδοσιακή μέθοδο (Εικόνα 2.2E). Επίσης, δείγματα συλλέχθηκαν από δύο σταθμούς στο δυτικό τμήμα της Κρήτης (Afr και Sfin), με αυτόνομη κατάδυση από το συγγραφέα (Εικόνα 2.2F). Από τις παραπάνω δειγματοληψίες συλλέχθηκαν συνολικά 107 δείγματα (Πίνακας 2.1). Στόχος σε όλες τις δειγματοληπτικές προσπάθειες ήταν η συλλογή 30 ατόμων S. officinalis και 30 H. communis, εφόσον η αφθονία το επέτρεπε. Σε αντίθετη περίπτωση, συλλέχθηκαν όσα ήταν εφικτό από κάθε είδος, εντός των ορίων μιας κατάδυσης λεπτών. Ο αριθμός των ατόμων που τελικά συλλέχθηκαν από κάθε σταθμό παρατίθεται στον Πίνακα 2.2. Τα άτομα συλλέχθηκαν τυχαία από κάθε πληθυσμό, με την προϋπόθεση να απέχουν τουλάχιστον 1-2 m μεταξύ τους, ώστε να αποφευχθεί η συλλογή κλώνων Επεξεργασία και συντήρηση των δειγμάτων Τα άτομα που συλλέχθηκαν ολόκληρα κατά τους σπογγαλιευτικούς πλόες φωτογραφήθηκαν στο σκάφος με χρήση κατάλληλης κλίμακας ώστε να υποστηριχθούν οι επακόλουθες αναλύσεις της εξωτερικής μορφολογίας. Επίσης μετρήθηκαν οι διαστάσεις τους (μήκος, πλάτος και ύψος). Στις δειγματοληψίες που έγιναν από το συγγραφέα, το κόψιμο και η κωδικοποίηση των δειγμάτων, η φωτογράφηση των ατόμων, καθώς και οι μετρήσεις των διαστάσεων έγιναν υποβρυχίως, ώστε να αποφευχθεί η συλλογή ολόκληρων των σπόγγων (Εικόνα 2.3). Από κάθε άτομο αποκόπηκε ένα τμήμα μεγέθους περίπου cm 3 για τις ανάγκες της μορφολογικής ανάλυσης του σκελετού, το οποίο συντηρήθηκε σε διάλυμα φορμαλδεΰδης. Δείγματα μικρότερων διαστάσεων (περίπου 2-6 cm 3 ) αποκόπηκαν επίσης από τα ίδια άτομα για τις ανάγκες των γενετικών αναλύσεων και συντηρήθηκαν σε αιθανόλη 95%. Δόθηκε ιδιαίτερη προσοχή ώστε να αποφευχθούν συνθήκες που θα μπορούσαν να προκαλέσουν αλλοίωση του γενετικού υλικού και να επηρεάσουν τα επακόλουθα πρωτόκολλα (Dawson et al. 1998). Συγκεκριμένα, τα δείγματα αυτά κόπηκαν και τοποθετήθηκαν στην αλκοόλη σε μικρό χρονικό διάστημα (μέγιστο 30 λεπτά) από τη συλλογή των ατόμων. Επίσης, η αιθανόλη αντικαταστάθηκε δύο φορές σε διάστημα 24 ωρών από τη συλλογή. Τέλος, τα δείγματα διατηρήθηκαν στο ψυγείο του σκάφους (4 C) μέχρι τη μεταφορά στο εργαστήριο, όταν αυτή δεν ήταν δυνατόν να γίνει άμεσα. Στο εργαστήριο συντηρήθηκαν στους -20 C μέχρι την εξαγωγή του γενετικού υλικού. 46

61 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 - ΣΥΛΛΟΓΗ & ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Εικόνα 2.3: Συλλογή δείγματος από άτομο Spongia officinalis υ- ποβρυχίως, στην περιοχή της Μασσαλίας. Φωτογραφία: Roland Graille. Figure 2.3: Underwater collection of sample from a specimen of Spongia officinalis in Provence (Marseille). Photo: Roland Graille Συλλογή δειγμάτων στη Δυτική Μεσόγειο Τα δείγματα από τον γεωγραφικό τομέα της Ν. Γαλλίας και το Γιβραλτάρ συλλέχθηκαν στο μεγαλύτερο μέρος τους από τον Dr. Thierry Pérez (Centre d Oceanologie de Marseille, Station Marine d Endoume, Μασσαλία, Γαλλία) και παραχωρήθηκαν για τις ανάγκες της παρούσας έρευνας. Δειγματοληψία σε δύο σταθμούς της Ν. Γαλλίας πραγματοποιήθηκε επίσης από το συγγραφέα. Συνολικά διερευνήθηκαν 14 σταθμοί σε βάθη από 6 μέχρι 32 μέτρα (Εικόνα 2.4, Πίνακας 2.1), από τους οποίους συλλέχθηκαν συνολικά 247 δείγματα. Η δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε με αυτόνομη κατάδυση και η αποκοπή και κωδικοποίηση των τμημάτων έγιναν υποβρυχίως, χωρίς να συλλεχθούν ολόκληρα άτομα σπόγγων. Τα δείγματα, μεγέθους 4-10 cm 3, συντηρήθηκαν σε αιθανόλη 95% και διατηρήθηκαν στους -20 C μέχρι τις επακόλουθες αναλύσεις Προσδιορισμός ειδών και μορφοτύπων Ο προσδιορισμός των ατόμων στο επίπεδο του είδους (S. officinalis και H. communis) ήταν εφικτός κατά τη διάρκεια της δειγματοληψίας σύμφωνα με τους καθιερωμένους ταξινομικούς χαρακτήρες, που σχετίζονται με την εξωτερική τους μορφολογία (Vacelet 1959). Τα άτομα του H. communis δεν παρουσίασαν εμφανείς μορφολογικές διαφοροποιήσεις μεταξύ τους (Εικόνα 2.5). Εντός του είδους S. officinalis, ήταν δυνατή μία διάκριση σε δύο μορφότυπους: το μορφότυπο adriatica και το μορφότυπο mollissima (Εικόνα 2.6Α-Β). Η διάκριση αυτή βασίστηκε κυρίως στη διευθέτηση (θέση και κατανομή) των στομίων εξόδου στην επιφάνειά τους (Pronzato & Manconi 2008). Τα στόμια εξόδου παρουσιάζουν μια τάση να διατάσσονται στην κορυφή λοβόσχημων προεξοχών στον πρώτο μορφότυπο, ενώ στο δεύτερο εμφανίζονται συγκεντρωμένα σε μια 47

62 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Εικόνα 2.4: Οι περιοχές δειγματοληψίας στη Δυτική Μεσόγειο και την περιοχή του Γιβραλτάρ. (A) Ακτές Νότιας Γαλλίας, (B) Θέουτα. Figure 2.4: Sampling locations in the Western Mediterranean and Gibraltar: (A) Provence; (B) Ceuta. κεντρική ή περισσότερες διάσπαρτες βαθύνσεις της ανώτερης επιφάνειας του ατόμου. Μια σημαντική επικάλυψη όμως μεταξύ των δύο μορφοτύπων εμφανίστηκε στα δείγματα (Voultsiadou et al. 2011), με αποτέλεσμα αρκετά άτομα να μην είναι δυνατόν να ενταχθούν σε κανένα από τους δύο μορφότυπους με βάση τα παραπάνω κριτήρια, καθώς παρουσίαζαν ανάμικτα χαρακτηριστικά: τα άτομα αυτά χαρακτηρίστηκαν ως ενδιάμεσα (Εικόνα 2.6C). Δείγματα του μορφότυπου mollissima, καθώς και ο ενδιάμεσος τύπος, παρατηρήθηκαν αποκλειστικά στην έκταση του Αιγαίου. Τα άτομα από τη Ν. Γαλλία και το Γιβραλτάρ ανήκαν σχεδόν αποκλειστικά στο είδος S. officinalis, με την εξαίρεση δύο εκπροσώπων του H. communis (Πίνακας 2.1). Η εξωτερική μορφολογία των ατόμων S. officinalis της Δ. Μεσογείου (Εικόνα 2.6D) υπήρξε σε γενικές γραμμές διαφοροποιημένη σε σχέση με τα αντίστοιχα δείγματα από το Αιγαίο, προσεγγίζοντας τον τύπο που περιγράφεται από τους Pronzato et al. (2003) για τη Δ. Μεσόγειο (περισσότερο λοβοειδές 48

63 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 - ΣΥΛΛΟΓΗ & ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ σχήμα σώματος και μεγάλοι πόροι εξόδου τοποθετημένοι στις κορυφές των λοβών). Eκπρόσωποι του μορφότυπου mollissima δεν παρατηρήθηκαν σε κανέναν πληθυσμό της Δ. Μεσογείου. Εικόνα 2.5: Τυπικό άτομο του είδους Hippospongia communis στο φυσικό του ενδιαίτημα. Φωτογραφία: Θάνος Νταϊλιάνης Figure 2.5: Typical specimen of Hippospongia communis photographed in situ. Photo: Thanos Dailianis Εικόνα 2.6: Διάκριση μορφολογικών τύπων εντός του είδους Spongia officinalis με βάση την εξωτερική τους μορφολογία. (A) Τυπική μορφή (τύπος adriatica ) στο Αιγαίο, (B) τύπος mollissima, (C) ενδιάμεση μορφή μεταξύ adriatica και mollissima, (D) τυπική μορφή (τύπος adriatica ) στη Δυτική Μεσόγειο. Φωτογραφίες: A-C: Θάνος Νταϊλιάνης D: Thierry Pérez Figure 2.6: Distinction of morphological types of Spongia officinalis according to external morphology. (A) Typical Aegean form ( adriatica type); (B) mollissima type; (C) intermediate type between adriatica and mollissima ; (D) typical Western Mediterranean form ( adriatica type). Photographs: A-C: Thanos Dailianis D: Thierry Pérez 49

64 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ 2.4. Επιλογή δειγμάτων για ανάλυση Όπως είναι εμφανές στον Πίνακα 2.1, ο αριθμός των δειγμάτων δεν υπήρξε σταθερός ανά σταθμό δειγματοληψίας, κάτι που είναι αποτέλεσμα των έντονων διακυμάνσεων στην αφθονία των φυσικών πληθυσμών των ειδών που μελετήθηκαν. Για την ισχυροποίηση των στατιστικών δεδομένων, αλλά και την απλούστευση των αποτελεσμάτων, τα δείγματα από τους επιμέρους σταθμούς δειγματοληψίας συνενώθηκαν ανά ευρύτερη γεωγραφική τοποθεσία σε ομαδοποιημένους πληθυσμούς για τις ανάγκες των αναλύσεων. Η κατάταξη των ατόμων σε πληθυσμούς δίνεται στον Πίνακα Α1 (Παράρτημα Α). Για τις ανάγκες των μορφολογικών και φυλογενετικών αναλύσεων, ένα υποσύνολο των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε, με κριτήρια αντιπροσωπευτικότητας σε επίπεδο είδους και μορφότυπου ανά γεωγραφική περιοχή (Πίνακας 2.2). Οι πληθυσμιακές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν επί του συνόλου των δειγμάτων. Πίνακας 2.2: Αριθμός δειγμάτων που επιλέχθηκαν για τις μορφολογικές και φυλογενετικές αναλύσεις από τους ομαδοποιημένους πληθυσμούς, ανά είδος που μελετήθηκε (WCR: Δυτική Κρήτη, ECR: Ανατολική Κρήτη, NCR: Βόρεια Κρήτη, KAR: Κάρπαθος, KOS: Κως, CYC: Νάξος και Πάρος, SPO: Β. Σποράδες, PCP: Port-Cros / Porquerolles, LAC: La Ciotat, MAR: Marseille, LRO: Le Rove, CEU: Ceuta). Table 2.2: Number of samples of each species from grouped populations selected for morphological and phylogenetic analyses (WCR: Western Crete, ECR: Eastern Crete, NCR: Northern Crete, KAR: Karpathos, KOS: Kos, CYC: Naxos and Paros, SPO: Sporades, PCP: Port-Cros / Porquerolles, LAC: La Ciotat, MAR: Marseille, LRO: Le Rove, CEU: Ceuta).!$%& '. ($))%$ - (*+$),-+ WCR ECR NCR KAR KOS CYC SPO PCP LAC MAR LRO CEU S. officinalis H. communis Βιβλιογραφία Castritsi-Catharios J, Kalymnos and the secrets of the sea. Athens, 192 pp. Dawson MN, Raskoff KA, Jacobs DK, Field preservation of marine invertebrate tissue for DNA analyses. Molecular Marine Biology And Biotechnology 7: Gotsis-Skretas O, Ignatiades L, Phytoplankton in pelagic and coastal waters. In: Papathanasiou E, Zenetos A (eds.), State of the Hellenic Marine Environment. Hellenic Center for Marine Research Publications, Athens, pp Pronzato R, Dorcier M, Sidri M, Manconi R, Morphotypes of Spongia officinalis (Demospongiae, Dictyoceratida) in two Mediterranean populations. Italian Journal Of Zoology 70(4):

65 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 - ΣΥΛΛΟΓΗ & ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Pronzato R, Manconi R, Mediterranean commercial sponges: over 5000 years of natural history and cultural heritage. Marine Ecology 29: Sakellariou D, Lykousis V, Karageorgis A, Anagnostou Ch, Geomorphology and tectonic structure. In: Papathanasiou E, Zenetos A (eds.), State of the Hellenic Marine Environment. Hellenic Center for Marine Research Publications, Athens, pp Vacelet J, Répartition générale des éponges et systématique des éponges cornées de la région de Marseille et de quelques stations méditerranéennes. Recueil des travaux de la Station marine d' Endoume 16: Voultsiadou E, Demosponge distribution in the eastern Mediterranean: a NW-SE gradient. Helgoland Marine Research 59: Voultsiadou E, Reevaluating sponge diversity and distribution in the Mediterranean Sea. Hydrobiologia 628: 1-12 Voultsiadou E, Antoniadou C, Vafidis D, Sponges of economical interest in the Eastern Mediterranean: an assessment of diversity and population density. Journal of Natural History 42: Voultsiadou E, Dailianis T, Antoniadou C, Dounas C, Chintiroglou CC, Aegean bath sponges: historical data and current status. Reviews in Fisheries Science 19: Zervakis V, Theocharis A, Georgopoulos D, Circulation and hydrography of the open seas. In: Papathanasiou E, Zenetos A (eds.), State of the Hellenic Marine Environment. Hellenic Center for Marine Research Publications, Athens, pp

66

67 Κεφάλαιο 3 ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΩΝ

68

69 3. Ανάλυση της ποικιλότητας των μορφολογικών χαρακτήρων 3.1. Εισαγωγή Η μορφολογία έχει αποτελέσει το βασικό εργαλείο της ταξινομίας από τις απαρχές της. Οι μορφολογικοί χαρακτήρες των οργανισμών (ο φαινότυπος) θεωρούνται συνδυαστικό προϊόν του γενότυπου και της επίδρασης του περιβάλλοντος. Κατ αυτή την έννοια, οι μορφολογικές διαφορές ανάμεσα στα άτομα μπορεί να αντανακλούν ως ένα βαθμό τη γενετική ποικιλότητα που χαρακτηρίζει γονιδίωμά τους, αλλά ενδέχεται να οφείλονται και σε διακυμάνσεις των περιβαλλοντικών παραμέτρων στο χώρο ή το χρόνο. Παρόλο που η χρήση των μορφολογικών χαρακτήρων στη συστηματική προϋποθέτει τον καθορισμό τους από εξελικτικά φαινόμενα, έχει διαπιστωθεί και είναι αποδεκτό από παλιά ότι μέρος της παρατηρούμενης μορφολογικής ποικιλότητας μπορεί να οφείλεται στην ανταπόκριση του γενότυπου ενός ατόμου σε διαφορετικά περιβάλλοντα. Η χάραξη μιας διαχωριστικής γραμμής ανάμεσα στη μορφολογική ποικιλότητα που αντανακλά ταξινομική διαφοροποίηση (διαφορετικά είδη ή γένη) και εκείνη που απλά χαρακτηρίζει άτομα ή πληθυσμούς του ίδιου είδους (ενδοειδική ποικιλομορφία), είναι συχνά πολύ δύσκολη. Παρόλα αυτά, επειδή η αντίληψη των μορφολογικών διαφορών είναι εύκολη και άμεση, η χρήση τους παραμένει αποδεκτή στη σύγχρονη ταξινομία, ιδιαίτερα όταν χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με πιο σύγχρονα εργαλεία προκειμένου να στηρίξουν υποθέσεις και να απαντήσουν ερωτήματα. Οι σπόγγοι είναι ζώα με απλή σωματική δομή, χωρίς τυπικούς ιστούς, που γενικά διαθέτουν λιγοστούς χαρακτήρες κατάλληλους να χρησιμοποιηθούν για την εκτίμηση της μορφολογικής ποικιλότητας. Αν και η εξωτερική μορφολογία των διαφόρων ειδών (σχήμα, μέγεθος, χρώμα, σύσταση) λαμβάνεται συνήθως υπόψη κατά τον προσδιορισμό τους, δεν μπορεί να παρέχει ισχυρούς ταξινομικούς χαρακτήρες καθώς έχει αποδειχτεί ότι μπορεί να παρουσιάζει μεγάλη ενδοειδική ποικιλομορφία ή ομοιότητες ανάμεσα σε διαφορετικά τάξα. Ο κύρια χρησιμοποιούμενος ταξινομικός χαρακτήρας στους σπόγγους είναι το είδος και η μορφολογία των πυριτικών ή ασβεστιτικών στοιχείων του σκελετού τους (σκληρίτες), που αποτελούν στήριγμα για το μαλακό σώμα των σπόγγων, καθώς και ο τρόπος διάταξής τους. Ωστόσο, ο βαθμός στον οποίο η ποικιλομορφία του σκελετού των Ποροφόρων μπορεί να αποτελέσει μετρήσιμο ταξινομικό χαρακτήρα ποικίλει πολύ μεταξύ των τάξεων του φύλου (Lévi 1973), δυσχεραίνοντας σημαντικά την ταξινόμηση κάποιων ομάδων. Ακόμη, τα Ποροφόρα παρουσιάζουν φαινοτυπική πλαστικότητα (López-Legentil et al. 2010, Carballo et al. 2006, Meroz-Fine et al. 2005), γεγονός που σημαίνει ότι ο γενότυπος ενός ατόμου ανταποκρινόμενος σε διαφορετικές τοπικές περιβαλλοντικές επιδράσεις παράγει διαφορετικούς φαινότυπους (Pigliucci 2005). Η φαινοτυπική πλαστικότητα εκτιμάται πως έχει ιδιαίτερη εξελικτική σημασία για οργανισμούς με περιορισμένη ή ανύπαρκτη ικανότητα μετακίνησης, όπως τα εδραία θαλάσσια ασπόνδυλα, επειδή μπορεί να αυξάνει την επιβίωση και την αναπαραγωγική επιτυχία των ατόμων βοηθώντας τα να αντιμετωπίσουν αλλαγές στο περιβάλλον και ενδεχομένως να προσαρμοστούν σε νέες οικοθέσεις (Prada et al. 2008). Έτσι, διατηρείται μέσα από τη φυσική 55

70 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ επιλογή, παρόλο που έχει κάποιο λειτουργικό κόστος για τους οργανισμούς (DeWitt et al. 1998), λόγω του υψηλού οικολογικού οφέλους (West-Eberhard 1989). Στους σπόγγους, η φαινοτυπική πλαστικότητα έχει εκτιμηθεί σε περιπτώσεις ανταπόκρισης σε συνθήκες διαβαθμισμένης διαφοροποίησης συγκεκριμένων περιβαλλοντικών παραγόντων, όπως η κυματική δράση (Palumbi 1984), το βάθος (Maldonado & Young 1998), η ένταση του φωτισμού (Meroz-Fine et al. 2005) ή ακόμη και η θήρευση (Carballo et al. 2005). Τα μέλη της τάξης Dictyoceratida (στην οποία ανήκουν και τα είδη Spongia officinalis και Hippospongia communis), όπως και τα μέλη των τάξεων Dendroceratida, Verongida και Halisarcida, αποτελούν ξεχωριστή περίπτωση μέσα στην κλάση Demospongiae, καθώς στερούνται ολοσχερώς ανόργανου (πυριτικού) σκελετού. Το γεγονός ότι σκελετός των Dictyoceratida αποτελείται αποκλειστικά από ένα δίκτυο διακλαδιζόμενων ινών πρωτεϊνικής σύστασης (Cook & Bergquist 2002) καθιστά την ταξινόμησή τους εξαιρετικά δύσκολη. Ως εκ τούτου, η ανάλυση μορφολογικών διαφορών για την επίλυση ταξινομικών προβλημάτων ή για την διερεύνηση γεωγραφικών διαφοροποιήσεων είναι εξαιρετικά σπάνια στην περίπτωση των Dictyoceratida. Οι Cook and Bergquist (1999, 2001) έχουν δώσει στοιχεία για τη μορφολογία του γένους Spongia, ενώ πρόσφατα, ο Cook (2007) έδωσε την πιο σύγχρονη παρουσίαση των ταξινομικών χαρακτήρων των γενών Spongia και Hippospongia (βλέπε αναλυτικά στο Κεφάλαιο 1). Ο σκελετός των ειδών S. officinalis και H. communis συγκεκριμένα, στερείται μικροχαρακτήρων που θα χρησίμευαν στη διάκριση και τον προσδιορισμό των ειδών. Για το λόγο αυτό η εξωτερική μορφολογία έχει χρησιμοποιηθεί ως βάση για την ταξινόμησή τους (Pronzato & Manconi 2008), κάτι που είναι εξαιρετικά ασυνήθιστο στους σπόγγους. Παρά το γεγονός ότι είναι από τα πλέον γνωστά είδη σπόγγων, υπάρχουν λίγες και ασαφείς περιγραφές τους, που παρουσιάζονται στο σύνολό τους στο Παράρτημα Β (Πίνακες Β1-Β4). Ξεχωρίζουν οι εργασίες των Pronzato & Manconi (2008) που δίνουν μια επισκόπηση και αναθεώρηση των μορφολογικών χαρακτήρων για τη διάκριση των ειδών των εμπορικών σπόγγων της Μεσογείου (συμπεριλαμβανομένων των S. officinalis και H. communis) και των Pronzato et al. (1998, 2003) που δίνουν τη μοναδική μέχρι σήμερα αξιολόγηση των μορφολογικών προσαρμογών των Spongiidae σε συγκεκριμένα ενδιαιτήματα. Σύμφωνα με τα παραπάνω, στόχος αυτού του κεφαλαίου της εργασίας ήταν η περιγραφή και ποσοτικοποίηση όσο το δυνατόν περισσότερων μορφολογικών χαρακτήρων των ειδών S. officinalis και H. communis, σε μακρο- και μικροσκοπικό επίπεδο, ώστε να διακριθούν εκείνοι που θα μπορούσαν να αποτελέσουν ταξινομικά γνωρίσματα για το διαχωρισμό στο επίπεδο του είδους και του γένους, αλλά και να εκτιμηθεί η διαφοροποίηση των υπό μελέτη ειδών μεταξύ γεωγραφικών περιοχών λόγω τοπικών περιβαλλοντικών συνθηκών Μέθοδοι και υλικά Επιλογή δειγμάτων Τα δείγματα που συλλέχθηκαν εντάχθηκαν αρχικά στα είδη S. officinalis και H. communis σύμφωνα με τους καθιερωμένους ταξινομικούς χαρακτήρες, που σχετίζονται με την εξωτερική τους μορφολογία. Στο είδος S. officinalis, έγινε μια επί πλέον διάκριση σε δύο μορφότυπους: το μορφότυπο adriatica (ADR) και το μορφότυπο mollissima (MOL) η διάκριση αυτή βασίστηκε 56

71 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 - ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΩΝ κυρίως στη διευθέτηση (θέση και κατανομή) των στομίων εξόδου του νερού στην επιφάνειά τους. Τα στόμια εξόδου παρουσιάζουν μια τάση να διατάσσονται στην κορυφή λοβωτών προεξοχών στον πρώτο μορφότυπο, ενώ στο δεύτερο εμφανίζονται συγκεντρωμένα σε μια κεντρική ή περισσότερες διάσπαρτες βαθύνσεις της ανώτερης επιφάνειας του ατόμου (βλέπε Pronzato & Manconi 2008). Αρκετά άτομα του είδους S. officinalis δεν ήταν δυνατόν να ενταχθούν σε κανένα από τους δύο μορφότυπους με βάση τα παραπάνω κριτήρια καθώς παρουσίαζαν ανάμικτα χαρακτηριστικά: τα άτομα αυτά χαρακτηρίστηκαν ως ενδιάμεσα (ADR-MOL). Τέλος, όλα τα άτομα του H. communis ταξινομήθηκαν σε ένα μοναδικό μορφότυπο (COM). Τα άτομα που εξετάστηκαν για τα μορφολογικά τους χαρακτηριστικά επιλέχθηκαν μεταξύ των ατόμων όλων των υπό μελέτη περιοχών σύμφωνα με τη σύνθεση του δείγματος κάθε περιοχή σε είδη και μορφότυπους (Πίνακας 3.1). Συνολικά 75 άτομα (15 H. communis και 60 S. officinalis) αναλύθηκαν για τη μορφολογική τους ποικιλομορφία. Πενήντα ένα άτομα προέρχονταν από το Αιγαίο (13 H. communis και 38 S. officinalis), 20 άτομα (2 H. communis και 18 S. officinalis) από τη Νότια Γαλλία και 4 (S. officinalis) από το Γιβραλτάρ. Τα ίδια δείγματα χρησιμοποιήθηκαν και για την επακόλουθη μοριακή ανάλυση με δείκτες μιτοχονδριακού DNA (βλέπε Κεφάλαιο 4). Πίνακας 3.1: Επιλεγμένα δείγματα Spongia officinalis και Hippospongia communis για ανάλυση των μορφολογικών χαρακτήρων, σύμφωνα με τη γεωγραφική τους προέλευση (WCR: Δυτική Κρήτη, ECR: Ανατολική Κρήτη, NCR: Βόρεια Κρήτη, KAR: Κάρπαθος, KOS: Κως, CYC: Νάξος και Πάρος, SPO: Β. Σποράδες, PCP: Port-Cros / Porquerolles, LAC: La Ciotat, MAR: Marseille, LRO: Le Rove, CEU: Ceuta). Table 3.1: Selected samples of Spongia officinalis and Hippospongia communis for analysis of morphologic characters, according to their geographic origin (WCR: Western Crete, ECR: Eastern Crete, NCR: Northern Crete, KAR: Karpathos, KOS: Kos, CYC: Naxos and Paros, SPO: Sporades, PCP: Port-Cros / Porquerolles, LAC: La Ciotat, MAR: Marseille, LRO: Le Rove, CEU: Ceuta).!$%& '. ($))%$ - (*+$),-+ WCR ECR NCR KAR KOS CYC SPO PCP LAC MAR LRO CEU S. officinalis H. communis Εκτίμηση μακροσκοπικών μορφολογικών χαρακτήρων Η ανάλυση των μακροσκοπικών μορφολογικών χαρακτηριστικών πραγματοποιήθηκε μόνο σε άτομα που συλλέχτηκαν στο Αιγαίο, αφού γι αυτά υπήρχαν δείγματα επαρκούς μεγέθους τα οποία και είχαν φωτογραφηθεί κατά τη συλλογή ώστε να είναι εφικτή η πραγματοποίηση μετρήσεων. Τα δείγματα που μελετήθηκαν, συντηρημένα σε διάλυμα φορμαλδεΰδης 10%, ήταν κομμάτια ατόμων μεγέθους περίπου 100 cm 3 που είχαν κοπεί υποβρυχίως κατά τη διάρκεια της δειγματοληψίας ή αμέσως μετά τη συλλογή. Τα δείγματα φωτογραφήθηκαν είτε υποβρύχια ή στο σκάφος, με χρήση κατάλληλης κλίμακας ώστε να υπάρχει δυνατότητα βαθμονόμησης για τις επακόλουθες μετρήσεις. Τα ποιοτικά μορφολογικά χαρακτηριστικά, όπως το χρώμα, η μορφή του σώματος και τα πρότυπα κατανομής των στομίων αξιολογήθηκαν από τις φωτογραφίες των ατόμων. Για κάθε 57

72 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ χαρακτήρα ορίστηκε ένας αριθμός κατηγοριών που κάλυπταν όλο το φάσμα της ποικιλομορφίας των ατόμων που μελετήθηκαν. Οι χαρακτήρες που εξετάστηκαν και οι κατηγορίες που χρησιμοποιήθηκαν για την περιγραφή τους δίνονται στον Πίνακα 3.2. Επίσης, οι καταστάσεις του χαρακτήρα «μορφή σώματος» απεικονίζονται σχηματικά στην Εικόνα 3.1., ενώ οι καταστάσεις του χαρακτήρα «κατανομή πόρων» στην Εικόνα 3.2. Όσον αφορά τους ποσοτικούς χαρακτήρες, οι διαστάσεις κάθε ατόμου (μήκος, πλάτος και ύψος) μετρήθηκαν στο πεδίο ή στο σκάφος μετά τη συλλογή. Ο όγκος υπολογίστηκε κατά προσέγγιση, από το γινόμενο των τριών διαστάσεων. Ο συνολικός αριθμός των στομίων εξόδου του νερού (oscula) υπολογίστηκε από φωτογραφίες ολόκληρων ατόμων με χρήση του λογισμικού!$%&' (%)*%*+ A.,-.& */µ%-' * $2 & 34%5*µ /:;' 3. (-<4-4. =%5>?%2 5. B.!/µ ;A?:6µ%-' 1.,B D324;5$- Πίνακας 3.2: Ποιοτικοί μακροσκοπικοί μορφολογικοί χαρακτήρες που μελετήθηκαν σε επιλεγμένα δείγματα των ειδών Spongia officinalis και Hippospongia communis και οι καταστάσεις αυτών που παρατηρήθηκαν. Table 3.2: Characterization of the qualitative macroscopic morphological characters examined in selected specimens of Spongia officinalis and Hippospongia communis in categories. C.!/µ >-7-*/µ%-' 1. C7-1$%2 $.6 2. D324;5$- 3. (;µ1:< D. (%7-µ& *%-µ<?7 ;A<:-5 *2 1. E5>< 2. 0; *5*%):;' E.!?-F6%+*+ *%-µ<?7 ;A2:-5 1. G3-5:&3-%; 2. 0; 3-;A->6' 3. 0; $-142%+%;' *1: H463; I1$. 3.1, *2: H463; I1$. 3.2 Photoshop (Adobe). Στο είδος H. communis παρατηρήθηκαν σχεδόν πάντα δύο κατηγορίες ορατών με γυμνό οφθαλμό πόρων: μία κατηγορία μεγάλου μεγέθους (στόμια εξόδου), οι οποίοι ήταν διάσπαρτοι στην επιφάνεια, και μία κατηγορία μικρού μεγέθους (στόμια εισόδου), οι οποίοι ήταν συγκεντρωμένοι σε ομάδες. Αυτές οι δύο κατηγορίες εξετάστηκαν ξεχωριστά. Το μέγεθος (μέγιστη διάσταση) των στομίων εξόδου μετρήθηκε με χρήση του Photoshop (Εικόνα 3.3). Στις περιπτώσεις που τα στόμια εμφανίζονταν σε συστάδες στο είδος S. officinalis, καταγραφόταν ο 58

73 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 - ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΩΝ αριθμός των ομάδων. Το ύψος και η πυκνότητα των χαρακτηριστικών κωνιδίων της επιφάνειας μετρήθηκαν στα συντηρημένα δείγματα. Η μέτρηση του ύψους έγινε με ψηφιακό παχύμετρο ακρίβειας 0,01 mm. Τριάντα τυχαίες μετρήσεις κωνιδίων γίνονταν και, ανάλογα με το μέσο όρο τους, κάθε άτομο σπόγγου τοποθετούνταν σε μια από τις τρεις ακόλουθες κατηγορίες: 0,5 έως 1,0 mm, 1,0 έως 1,5 mm και 1,5 έως 2,0 mm. Η πυκνότητα των κωνιδίων στην επιφάνεια του σπόγγου (αριθμός κωνιδίων ανά cm 2 ) εκτιμήθηκε με μέτρηση όλων των κωνιδίων που υπήρχαν σε μια επιφάνεια 1 cm 2 σε τρία τυχαία σημεία της επιφάνειας του ατόμου και υπολογισμό της μέσης τιμής. Η μέση απόσταση μεταξύ των κωνιδίων εκτιμήθηκε με μέτρηση της απόστασης ανάμεσα σε ένα κωνίδιο και το πιο κοντινό γειτονικό του. Τριάντα τυχαίες μετρήσεις έγιναν και υπολογίστηκε η μέση τιμή και η τυπική απόκλιση. Σε δύο αντιπροσωπευτικά άτομα των ειδών S. officinalis και H. communis υπολογίστηκε ο συνολικός όγκος του συστήματος καναλιών μέσα στο σώμα του σπόγγου. Αυτό πραγματοποιήθηκε με υπολογισμό της επιφάνειας που αντιστοιχεί στα κανάλια σε δύο τομές, μια κάθετη και μια οριζόντια, για κάθε άτομο σπόγγου (Εικόνα 3.4). Η ανάλυση των μετρήσεων έγινε με το λογισμικό Photoshop (Adobe). Για κάθε άτομο και κάθε τομή, η επιφάνεια που κάλυπταν τα κανάλια σκιάστηκε με ένα συμπαγές χρώμα και η συνολική χρωματισμένη επιφάνεια υπολογίστηκε, παράλληλα με τη συνολική επιφάνεια της τομής Εκτίμηση μικροσκοπικών μορφολογικών χαρακτήρων Εκόνα 3.1: Σχηματική απεικόνιση των καταστάσεων του χαρακτήρα μορφή σώματος για τα άτομα των Spongia officinalis και Hippospongia communis: (A) σφαιρικό ή πλατυσμένο, (B) λοβώδες, (C) κοίλο, (D) πτυχωτό, (E) πυργωτό. Ο σκελετός των σπόγγων της τάξης Dictyoceratida αποτελείται στο μεγαλύτερο μέρος του από ένα δίκτυο διακλαδιζόμενων δευτερευουσών ινών σπογγίνης. Μετρώντας το μέσο μήκος ανάμεσα σε δύο διαδοχικές διακλαδώσεις είναι δυνατόν να έχουμε μια εκτίμηση της πυκνότητας του σκελετικού δικτύου. Για το σκοπό αυτό κόπηκαν λεπτές τομές Figure 3.1: Illustration of the categories assigned to body shape for specimens of Spongia officinalis and Hippospongia communis: (A) globular or flattened; (B) lobate; (C) concave; (D) terraced; (E) chimneyed. από συντηρημένα δείγματα S. officinalis και H. communis και τα παρασκευάσματα φωτογραφήθηκαν σε οπτικό μικροσκόπιο σε μεγέθυνση 40X. Σε κάθε άτομο έγιναν πενήντα μετρήσεις του μήκους των ινών μεταξύ διαδοχικών διακλαδώσεων με το λογισμικό Macnification (Orbicule). Σε κάθε περίπτωση, μετριόταν και το πάχος της ίνας στο μέσο της (Εικόνα 3.5). Το μέσο πάχος των κύριων ινών σπογγίνης υπολογίστηκε μετρώντας τρεις ίνες σε κάθε άτομο σπόγγου. Επειδή οι κύριες ίνες χαρακτηρίζονται από διαφορές πάχους σε όλο τους το μήκος, το πάχος μετρήθηκε σε τυχαία σημεία και υπολογίστηκε η μέση τιμή (Εικόνα 3.6). 59

74 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Εκόνα 3.2: Σχηματική απεικόνιση των καταστάσεων του χαρακτήρα κατανομή στομίων εξόδου στη επιφάνεια του σώματος των ατόμων Spongia officinalis και Hippospongia communis. (A) τυχαία, (B) σε συστάδες, (C) σε γραμμές, (D) συγχωνευμένα. Figure 3.2: Illustration of the categories assigned to oscule distribution for specimens of Spongia officinalis and Hippospongia communis: (A) random; (B) clustered; (C) aligned; (D) fused. Η ύπαρξη εγκλείστων ξένων υλικών στο εσωτερικό των κύριων ινών καταγράφηκε με τη δημιουργία 4 κατηγοριών για το είδος των εγκλείστων (1: καθόλου έγκλειστα, 2: ξένοι σκληρίτες, 3: κόκκοι άμμου, 4: και σκληρίτες και κόκκοι άμμου) και άλλων τεσσάρων κατηγοριών για το βαθμό κάλυψης των ινών με έγκλειστα (1: 0%, 2: 1-30%, 3: 30-70%, 4: %) Στατιστική ανάλυση Η μέθοδος της μονόδρομης ανάλυσης διακύμανσης (οne-way ANOVA) εφαρμόστηκε για την ανάλυση του συσχετισμού μεταξύ των ποσοτικών μορφολογικών παραμέτρων και των τεσσάρων μορφοτύπων που μελετήθηκαν, ενώ η δοκιμή των ελάχιστα σημαντικών διαφορών του Fisher (Fisher s least significant difference test LSD) χρησιμοποιήθηκε post-hoc για να εκτιμήσει τη σημαντικότητα της διαφοροποίησης μεταξύ των ζευγών που αναλύθηκαν. Το μοντέλο της γραμμικής παλινδρόμησης (linear regression) επίσης χρησιμοποιήθηκε για το συσχετισμό του σωματικού μεγέθους (ως ανεξάρτητη μεταβλητή) με τον αριθμό και το μέγεθος των στομίων (εξαρτώμενες μεταβλητές) και για τα δύο είδη. Για την εκτίμηση του ρόλου της γεωγραφικής προέλευσης στις παραπάνω παραμέτρους χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της εμφωλευμένης ανάλυσης διακύμανσης (nested ANOVA), με τον γεωγραφικό πληθυσμό ως σταθερό παράγοντα και τον μορφότυπο ως εμφωλευμένο τυχαίο παράγοντα. Η μέθοδος αυτή επιλέχθηκε ούτως ώστε να επισημανθεί ή να αποκλειστεί ο δυνητικός ρόλος του μορφότυπου στη σημαντικότητα του συσχετισμού, καθώς διαφορετικοί μορφότυποι συχνά εμφανίζονται εντός μιας γεωγραφικής τοποθεσίας στα δείγματα που μελετήθηκαν. Για τις παραμέτρους που εμφανίζουν πολλαπλές τιμές στο ίδιο άτομο (όπως η διάμετρος των πόρων εξόδου και οι χαρακτήρες που σχετίζονται με τα κωνίδια και τις σκελετικές ίνες) εκτιμήθηκε επίσης η διαφοροποίηση μεταξύ ατόμων, εμφωλευμένη εντός του μορφότυπου. Για όλες τις παραπάνω αναλύσεις χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό πακέτο SPSS v17.0 (IBM). 60

75 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 - ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΩΝ Εκόνα 3.3: Απεικόνιση της διαδικασίας μέτρησης των διαστάσεων των στομίων εξόδου στην επιφάνεια ενός ατόμου Hippospongia communis με χρήση του λογισμικού Photoshop (Adobe). Μετρήθηκε η μέγιστη διάσταση κάθε πόρου ώστε να εξομαλυνθούν τυχόν διαφορές λόγω προοπτικής. Στην περίπτωση της H. communis, δύο διακριτές κατηγορίες επιφανειακών ανοιγμάτων παρατηρήθηκαν, που διέφεραν ως προς το μέγεθος και εξετάστηκαν ξεχωριστά (στην εικόνα σημειώνονται με κόκκινες και κίτρινες γραμμές μέτρησης). Figure 3.3: Measurement of oscule diameter at the surface of a Hippospongia communis specimen using Photoshop (Adobe). The maximum dimension was measured for each pore, to compensate for differences in perspective. For H. communis, two categories of visible pores were evidenced, distinguished by their size, which were treated independently (indicated by red and yellow lines, respectively). Εκόνα 3.4: Υπολογισμός της επιφάνειας του συστήματος καναλιών σε κάθετες (A, C) και οριζόντιες (B, D) τομές δειγμάτων των Spongia officinalis (A, B) και Hippospongia communis (C, D) με χρήση του λογισμικού Photoshop (Adobe). Οι χρωματισμένες με ιώδες περιοχές αντιστοιχούν στο σύστημα καναλιών, ενώ οι μη χρωματισμένες στο σκελετό του σπόγγου. Figure 3.4: Estimation of the area occupied by the canal system (indicated with magenta) in vertical (A; C) and horizontal (B; D) sections of specimens of Spongia officinalis (A-B) και Hippospongia communis (C-D) using Photoshop (Adobe). 61

76 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Εκόνα 3.5: Μέτρηση του μήκους και πάχους των δευτερευουσών ινών μεταξύ δύο διαδοχικών σημείων διακλάδωσης σε άτομο Spongia officinalis με χρήση του λογισμικού Macnification (Orbicule). Οι μετρήσεις σημειώνονται με ιώδεις γραμμές. Το πάχος κάθε ίνας μετρήθηκε στο μέσο της απόστασης μεταξύ των σημείων διακλάδωσης. Figure 3.5: Estimation of the length and thickness of secondary fibers between two adjacent anastomoses for a Spongia officinalis specimen, using Macnification (Orbicule). Measurements are indicated with magenta lines. The thickness of each fiber was measured at the middle of the distance between the anastomoses. Εκόνα 3.6: Μέτρηση του πάχους κύριας ίνας σε άτομο Spongia officinalis με χρήση του λογισμικού Macnification (Orbicule). Τα σημεία μέτρησης σημειώνονται με ιώδεις γραμμές. Δώδεκα μετρήσεις έγιναν σε τυχαία σημεία κατά μήκος της ίνας για να υπολογιστεί στη συνέχεια το μέσο πάχος. Figure 3.6: Estimation of the thickness of a primary fiber for a Spongia officinalis specimen, using Macnification (Orbicule). Measurements are indicated with magenta lines. Twelve sections were measured at random points along the fiber and used to estimate the average thickness. 62

77 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 - ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΩΝ Η μη-παραμετρική μέθοδος multidimensional scaling (MDS) χρησιμοποιήθηκε για την ομαδοποίηση των ατόμων που εξετάστηκαν ανάλογα με τους μικρο- και μακροσκοπικούς μορφολογικούς χαρακτήρες και δείκτες που εκτιμήθηκαν. Οι χαρακτήρες αυτοί παρατίθενται στον Πίνακα 3.3. Για τις ανάγκες της μεθόδου MDS, οι πραγματικές αριθμητικές τιμές των χαρακτήρων μετατράπηκαν σε ποσοστιαίες τιμές. Η τιμή 0 αντιστοιχήθηκε στην χαμηλότερη παρατηρούμενη τιμή για κάθε χαρακτήρα, ενώ η τιμή 100 στην αντίστοιχη υψηλότερη. Η μέθοδος MDS εφαρμόστηκε μέσω του λογισμικού PRIMER v6.0 (Clarke & Gorley 2006). Πίνακας 3.3: Μορφολογικοί χαρακτήρες που χρησιμοποιήθηκαν για την πολυδιάστατη κλιμακοποίηση (MDS) (SD: σταθερή απόκλιση). Table 3.3: Morphologic characters used in multi-dimensional scaling (MDS) analysis (SD: standard deviation).!$%&'()* µ)&+),)-'()*./&/($0&%1 2(%,%$'()*./&/($0&%1 1. (34)1 56µ/$)1) x (7-()1 56µ/$)1) ) :;.)1 (<&*= '=6= 2. (>&'?µ@1 5$)µ*= %@A)<) x (7-()1 56µ/$)1) '5$) :;.)1 (<&*= '=6= 3. (>&'?µ@1 )µ;a= :@&=) x (2<=),'(@1 /&'?µ@1 :@&=) >+?)=*/ %-(,%*5$= 5$'1 (B&'%1 *=% C A';µ%$&)1 5$)µ*= %@A)< ) µ0()1 A%<$%&%<)<56= '=6= 5. (895C A';µ%$&)1 5$)µ*= %@A)<) x SD (895) µ0()1 A%<$%&%<)<56= '=6=) x SD -1 6.!B&)1 B4)<1 (='A*= ) :;.)1 A%<$%&%<)<56= '=6= C /:@5$/5C µ%$/b -%'$)='(6= (='A*= 7. (895) :;.)1 A%<$%&%<)<56= '=6=) x SD C /:@5$/5C µ%$/b -%'$)='(6= (='A*= x SD C :<(=@$C$/ (='A*= 3.3. Αποτελέσματα Οι μετρήσεις και εκτιμήσεις όλων των χαρακτήρων για όλα τα άτομα που εξετάστηκαν δίνονται αναλυτικά στον Πίνακα Β5 του Παραρτήματος Β Διαειδική και ενδοειδική ποικιλομορφία α. Μακροσκοπικοί μορφολογικοί χαρακτήρες Ο όγκος του σώματος των ατόμων του S. officinalis κυμάνθηκε μεταξύ 0.1 και 8.4 L (μέσος όρος: 1,9 L ± 1,9 SD). Όταν οι μορφότυποι εξετάστηκαν ξεχωριστά, οι μέσες τιμές του όγκου ήταν παρόμοιες 1,7 L ± 1,2 SD για τη μορφή adriatica, 1,8 L ± 2,6 SD για την ενδιάμεση μορφή και 2,6 L ± 2,5 SD για τη μορφή mollissima ). Τα άτομα της H. communis ήταν κάπως μεγαλύτερα και 63

78 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ κυμαίνονταν από 1,4 έως 10,3 L (μέση τιμή: 4,2 L ± 2,9 SD). Τα μεγάλου μεγέθους άτομα (πάνω από 4 L για το S. officinalis και πάνω από 6 L για το H. communis) ήταν πολύ σπάνια και στις δύο περιπτώσεις. Η ανάλυση διακύμανσης κατέδειξε μια διαφοροποίηση του σωματικού μεγέθους ανάλογα με τον μορφότυπο (F3,47 = 3,751, p = 0,017). Η δοκιμή LSD έδειξε ότι η πηγή αυτής της διαφοροποίησης βρισκόταν ανάμεσα στο H. communis και τους μορφότυπους ADR και ADR-MOL του S. officinalis. Προκειμένου να εκτιμηθεί η ποικιλότητα στο σχήμα του σώματος ανάμεσα στους διάφορους μορφότυπους, υπολογίστηκαν: (α) ο λόγος μεταξύ πλάτους W και μέγιστης διαμέτρου D ώστε να προσδιοριστεί η επιμήκυνση του σώματος και (β) ο λόγος μεταξύ ύψους Η και μέγιστης διαμέτρου D ώστε να προσδιοριστεί η πλάτυνση του σώματος. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται στο διάγραμμα της Εικόνας 3.7 Α και Β αντίστοιχα, και δείχνουν σημαντική επικάλυψη ανάμεσα στα είδη και τους μορφότυπους με μικρές διαφορές ανάμεσά τους που αφορούσαν κυρίως στο εύρος των τιμών. Η ανάλυση διακύμανσης έδειξε ότι δεν υπάρχει σημαντική συσχέτιση του μορφότυπου με το σχήμα του σώματος, όπως η τελευταία υπολογίστηκε από τις δύο αναλογίες H/D και W/D (F3,47 = 1,404, p = 0,253 and F 3,47 = 0,523, p = 0,669, αντίστοιχα). Η μορφή του σώματος διέφερε ανάμεσα στα είδη και τους μορφότυπους (Πίνακας Β5, Παράρτημα Β). Στο H. communis ήταν κυκλικό σε όλες τις περιπτώσεις, ενώ στο S. officinalis παρουσίασε διαφοροποίηση μεταξύ των μορφοτύπων: τα άτομα του μορφότυπου adriatica ήταν κατά κύριο λόγο λοβώδη (75%), ενώ σε σπάνιες περιπτώσεις (10%) ήταν πυργωτά ή σφαιρικά (10%). Τα άτομα του μορφότυπου mollissima είχαν στην πλειονότητά τους (88%) κοίλο σχήμα. Τα ενδιάμεσα άτομα ήταν λοβώδη σε ποσοστό 60%, ενώ μερικά (30%) παρουσίαζαν κοίλο σχήμα. A B Εκόνα 3.7: Θηκογράμματα των δεικτών μορφής του σώματος για τα είδη και τους μορφότυπους που μελετήθηκαν: (A) λόγος πλάτους προς ύψος σώματος (0: επίπεδο - 1: σφαιρικό), (B) λόγος πλάτους προς μέγιστη διάμετρο σώματος (0: επίμηκες - 1: στρογγυλό). Figure 3.7: Box and whisker plots of body shape indices for the studied species and morphotypes: (A) body width to height ratio (0: flat - 1: spherical); (B) body width to maximum diameter (0: elongated - 1: circular). 64

79 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 - ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΩΝ Το χρώμα του εξωδέρματος ήταν μαύρο στις περισσότερες περιπτώσεις. Μόνο ένα μέρος των ατόμων του S. officinalis (16%) παρουσίαζε σκούρο ή ανοικτό γκρι χρώμα. Αντίστοιχα, το χρώμα του χοανοσώματος ποίκιλε ελαφρά από κρεμ έως ανοικτό καφέ χωρίς να διαφοροποιείται μεταξύ ειδών ή μορφοτύπων. Μερικά άτομα (31%) του H. communis, πάντως, είχαν μια κεραμιδί απόχρωση (χρώμα σκουριάς) στο χοανόσωμά τους (Πίνακας Β5, Παράρτημα Β). Όσον αφορά στο ορατά στόμια στην επιφάνεια των ατόμων του εξετάστηκαν, υπήρχε μια εμφανής διαφορά. Τα άτομα του S. officinalis παρουσίαζαν μόνο μια κατηγορία στομίων, ενώ του H. communis δύο: η μια περιελάμβανε μεγάλα, διάσπαρτα στόμια και η άλλη μικρότερα ομαδοποιημένα. Τα ανοίγματα της πρώτης κατηγορίας χαρακτηρίστηκαν ως στόμια εξόδου του νερού (oscules), ενώ εκείνα της δεύτερης ως στόμια εισόδου που οδηγούν σε μικρότερους πόρους (ostia) τοποθετημένους σε εσωτερικές, υποδερμικές κοιλότητες. Η κατανομή των στομίων εξόδου στην επιφάνεια παρουσίασε διαφορετικά πρότυπα μεταξύ ειδών και μορφοτύπων (Πίνακας Β5, Παράρτημα Β). Στο H. communis η κατανομή των στομίων εξόδου ήταν πάντα τυχαία. Στα άτομα του μορφοτύπου adriatica η κατανομή ήταν τυχαία, σε συστάδες ή γραμμές σε περίπου ίσες αναλογίες (30%, 40% και 30% αντίστοιχα). Τα στόμια εξόδου στο μορφότυπο mollissima ήταν πάντα συγχωνευμένα, χωρίς ξεκάθαρα όρια μεταξύ γειτονικών στομίων. Τα ενδιάμεσα άτομα έφεραν στόμια εξόδου διευθετημένα είτε σε συστάδες (30%), ή τυχαία (30%), ή συγχωνευμένα (30%). Στις περιπτώσεις στις οποίες τα στόμια εξόδου σχημάτιζαν συστάδες (άτομα S. officinalis), ο αριθμός των συστάδων ποίκιλε στα διάφορα άτομα, από 1 έως 13, με μια τάση να αυξάνεται ο αριθμός τους με το μέγεθος του σώματος. A B Εκόνα 3.8: Θηκογράμματα του αριθμού και του μεγέθους των επιφανειακών στομίων για τα είδη και τους μορφότυπους που μελετήθηκαν: (A) σχετικός αριθμός στομίων εξόδου (στόμια εξόδου ανά cm 3 σπόγγου), (B) διάμετρος στομίων εξόδου [COM(s): μικρά στόμια ειδόδου της H. communis]. Figure 3.8: Box and whisker plots of the number and size of oscules for the studied species and morphotypes: (A) standardized number of oscules (oscules per cm 3 of sponge volume); (B) diameter of oscules [COM(s): small inhalant pores of H. communis]. 65

80 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Η θέση των στομίων ήταν επίσης τυχαία στα άτομα του H. communis. Αντίθετα, στα άτομα του S. officinalis, η θέση των πόρων σχετιζόταν με τον μορφότυπο: τα στόμια εξόδου βρίσκονταν οπουδήποτε (50%) ή στην κορυφή προεξοχών (50%) για το μορφότυπο adriatica, σε κοιλότητες της επιφάνειας για το μορφότυπο mollissima, και οπουδήποτε (50%) ή σε κοιλότητες (50%) για τον ενδιάμεσο μορφότυπο (Πίνακας Β5, Παράρτημα Β). Ο αριθμός των στομίων εξόδου δεν διέφερε μεταξύ των μορφοτύπων του S. officinalis και κυμάνθηκε μεταξύ 14 και 167. Τα άτομα του H. communis εμφάνισαν μικρότερο αριθμό στομίων εξόδου γενικά, με εύρος μεταξύ 8 και 42 (Πίνακας Β5, Παράρτημα Β). Ο σχετικός αριθμός στομίων εξόδου (αριθμός ανά όγκο σπόγγου) επίσης κυμάνθηκε στα ίδια επίπεδα για τους τρεις μορφοτύπους του S. officinalis, με μέση τιμή 0,04 έως 0,05. Στο H. communis αντίθετα, η αντίστοιχη αναλογία ήταν πολύ μικρότερη, με μέση τιμή 0,01 (Εικόνα 3.8 A). Η ανάλυση διακύμανσης επιβεβαίωσε τη διαφοροποίηση του σχετικού αριθμού στομίων εξόδου στους διάφορους μορφότυπους (F3,47 = 4,754, p = 0,006). Η δοκιμή LSD υπέδειξε ότι η πηγή αυτής της διαφοροποίησης βρισκόταν μεταξύ του H. communis και των τριών μορφοτύπων του S. officinalis. Εκόνα 3.9: Σχέση μεταξύ του αριθμού των στομίων εξόδου και του όγκου του σπόγγου ξεχωριστά για τα άτομα των Spongia officinalis και Hippospongia communis που μελετήθηκαν. Figure 3.9: Regression between the number of exhalant pores and body volume for the studied Spongia officinalis and Hippospongia communis specimens, independently. 66

81 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 - ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΩΝ Το μέγεθος των στομίων εξόδου διαφοροποιήθηκε επίσης μεταξύ των δύο ειδών, με μέση τιμή 0,30 ± 0,12 cm στο S. officinalis και σημαντικά μεγαλύτερα στόμια (0,75 ± 0,32 cm) στο H. communis (Εικόνα 3.8B). Το μέγεθος των στομίων εισόδου στο H. communis ήταν παρόμοιο με εκείνο των στομίων εξόδου του S. officinalis, με μέση τιμή 0,24 ± 0,08 cm. Η ανάλυση διακύμανσης επιβεβαίωσε τη διαφοροποίηση της διαμέτρου των στομίων εξόδου στους μορφότυπους (F3,47 = 40,383, p < 0,001). Η δοκιμή LSD υπέδειξε ότι και εδώ η πηγή αυτής της διαφοροποίησης βρισκόταν μεταξύ του H. communis και των τριών μορφοτύπων του S. officinalis. Θετική συσχέτιση βρέθηκε ανάμεσα στον όγκο του σώματος και τον αριθμό των στομίων εξόδου για το S. officinalis (R 2 = 0,460, p < 0,001). Αντίθετα στο H. communis, ο αριθμός των στομίων εξόδου παρέμενε σταθερός παρά την αύξηση του όγκου (R 2 = 0,062, p = 0,412) (Εικόνα 3.9). Μια αντίστροφη σχέση παρατηρήθηκε όσον αφορά το μέγεθος των στομίων εξόδου: στα άτομα του S. officinalis, η διάμετρος τους παρέμενε σταθερή καθώς αυξανόταν ο όγκος (R 2 = 0,014, p = 0,479) (Εικόνα 3.10), ενώ στο H. communis, παρατηρήθηκε σημαντική παλινδρόμηση μεταξύ μεγέθους σώματος και διαμέτρου στομίων εξόδου (R 2 = 0,362, p = 0,030) (Εικόνα 3.11). Η επιφάνεια που καταλάμβανε το σύστημα καναλιών στο εσωτερικό του σπόγγου, όπως υπολογίστηκε από την αναλογία της επιφάνειας των καναλιών προς τη συνολική επιφάνεια, ήταν παρόμοια στις κάθετες και οριζόντιες τομές του ίδιου είδους. Διέφερε, πάντως, μεταξύ S. officinalis και H. communis (αναλογία 0,3 για το πρώτο και 0,55 για το δεύτερο (Πίνακας 3.4). Το σύστημα καναλιών, δηλαδή, καταλάμβανε περισσότερο χώρο στο σώμα του σπόγγου στην περίπτωση του H. communis, ξεπερνώντας το 50% του συνολικού όγκου. Εκόνα 3.10: Σχέση μεταξύ της διαμέτρου των στομίων εξόδου και του όγκου του σώματος για το είδος Spongia officinalis. Figure 3.10: Regression between the diameter of exhalant pores and body volume for Spongia officinalis. 67

82 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Εκόνα 3.11: Σχέση μεταξύ της διαμέτρου των στομίων εξόδου και του όγκου σώματος για το Hippospongia communis. Figure 3.11: Regression between the diameter of exhalant pores and body volume for Hippospongia communis. Πίνακας 3.4: Επιφάνεια εσωτερικού συστήματος καναλιών των Spongia officinalis και Hippospongia communis υπολογισμένη σε κάθετες και οριζόντιες τομές αντιπροσωπευτικών ατόμων. Table 3.4: Area occupied by the canal system of Spongia officinalis and Hippospongia communis, calculated from horizontal and vertical sections of representative specimens. S. officinalis H. communis.673&0( 0.µ/ )%8'09 0.µ/.673&0( 0.µ/ )%8'09 0.µ/!$%&'( )(&(*+& (cm 2 ),-&.*)/ '$%&'( 0.µ/1 (cm 2 ) ('$%&'( )(&(*+& / 5-&.*)/ '$%&'() Το ύψος των κωνιδίων για τα περισσότερα άτομα S. officinalis κυμαινόταν μεταξύ 0,5 και 1 mm. Σε ένα μικρό αριθμό ατόμων μόνο ήταν μεγαλύτερο από 1 mm. Στο H. communis το ύψος των κωνιδίων ποίκιλε περισσότερο, με το 54% των ατόμων να εντάσσεται στην κατηγορία 0,5-1 mm, το 31% στην κατηγορία 1,0-1,5 mm, και το 15% να είναι μεγαλύτερο από 1,5 mm (Πίνακας Β5, Παράρτημα Β). 68

83 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 - ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΩΝ Η μέση απόσταση μεταξύ διαδοχικών κωνιδίων ήταν αρκετά παρόμοια μεταξύ των ατόμων των ειδών S. officinalis και H. communis (1,36 ± 0,42 mm για το πρώτο και 1,73 ± 1,09 mm για το δεύτερο). Οι τιμές, πάντως παρουσίασαν σημαντικά μεγαλύτερη ποικιλότητα στην περίπτωση του H. communis, κυρίως όσον αφορά το ανώτερο όριο, καθώς κυμαίνονταν μεταξύ 0,1 και 6,3 mm (σε σύγκριση με το εύρος 0,4-2,8 mm του S. officinalis) (Εικόνα 3.12). Αυτό οφείλεται στο ότι τα κωνίδια του S. officinalis ήταν πιο ομοιόμορφα κατανεμημένα, ενώ αντίθετα στην επιφάνεια του H. communis συνήθως σχηματίζονταν συστάδες αρκετών πυκνά διατεταγμένων κωνιδίων. Αυτή η διαφοροποίηση που παρατηρήθηκε ανάμεσα στα δύο είδη επιβεβαιώθηκε από την ANOVA, που κατέδειξε σημαντική διαφοροποίηση στην απόσταση μεταξύ κωνιδίων στους διάφορους μορφότυπους, ενώ σύμφωνα με τη δοκιμή LSD η πηγή αυτής της διαφοροποίησης βρισκόταν μεταξύ του H. communis και των τριών μορφοτύπων του S. officinalis. Η πυκνότητα των κωνιδίων στην επιφάνεια του σπόγγου ήταν μεγαλύτερη για το S. officinalis (μέση τιμή: 40 ± 10 κωνίδια ανά cm 2 ) από ότι για το H. communis (21 ± 7 κωνίδια ανά cm 2 ) (Εικόνα 3.12). Αυτή η διαφοροποίηση μεταξύ των δύο ειδών επίσης επιβεβαιώθηκε από την ANOVA, που κατέδειξε σημαντική διαφοροποίηση στην πυκνότητα των κωνιδίων στους διάφορους μορφότυπους, ενώ σύμφωνα με τη δοκιμή LSD η πηγή αυτής της διαφοροποίησης βρισκόταν μεταξύ του H. communis και των τριών μορφοτύπων του S. officinalis. Η ανάλυση MDS για τα δείγματα από το Αιγαίο, χρησιμοποιώντας όλους τους εξωτερικούς μορφολογικούς χαρακτήρες, διαχώρισε δύο κύριες ομάδες ατόμων σε επίπεδο ομοιότητας 70% (Εικόνα 3.13). Οι ομάδες αυτές αντιστοιχούσαν ακριβώς στα άτομα των ειδών S. officinalis and H. communis που μελετήθηκαν. Στην προσπάθεια να αναδειχτεί ο ρόλος του κάθε μορφολογικού Εικόνα 3.12: Απόσταση μεταξύ γειτονικών κωνιδίων (θηκογράμματα) και μέση πυκνότητα κωνιδίων (ιστόγραμμα) για τα είδη και τους μορφότυπους που μελετήθηκαν. Figure 3.12: Distance between adjacent conules (box & whisker plots) and mean density of conules (histogram) for the studied species and morphotypes. 69

84 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Spongia officinalis adriatica morphotype Spongia officinalis mollissima morphotype Spongia officinalis intermediate morphotype Hippospongia communis 2D Stress: 0.13 Similarity Εικόνα 3.13: Διάγραμμα πολυδιάστατης κλιμάκωσης (MDS) για όλα τα δείγματα των S. officinalis και H. communis από το Αιγαίο, σύμφωνα με τα χαρακτηριστικά της εξωτερικής τους μορφολογίας. Figure 3.13: Multi-dimensional scaling (MDS) graph for all Aegean specimens of S. officinalis and H. communis, according to external morphologic characters. χαρακτήρα στη διάκριση των ειδών (Εικόνα 3.14), φάνηκε ότι ο αριθμός και η κατανομή των στομίων εξόδου στην επιφάνεια του σπόγγου αποτελούν τους κυριότερους παράγοντες διάκρισης μεταξύ των ατόμων του H. communis από εκείνα του S. officinalis, ακολουθούμενα από τη διάμετρο των στομίων εξόδου και την πυκνότητα των κωνιδίων. Ο διαχωρισμός των τεσσάρων ατόμων μέσα στην ομάδα του S. officinalis φαίνεται ότι οφείλεται στο πιο σφαιρικό τους σχήμα και στο μεγαλύτερο αριθμό στομίων εξόδου ανά μονάδα όγκου του σπόγγου σε σχέση με τα υπόλοιπα άτομα του είδους. β. Σκελετικοί χαρακτήρες Το πάχος των κύριων ινών του σκελετικού δικτύου ήταν σε γενικές γραμμές ομοιόμορφο στους μορφότυπους και τα είδη, με μέσες τιμές 65 έως 72 μm για το S. officinalis (65,73 μm για το μορφότυπο adriatica, 71,72 μm για το μορφότυπο mollissima, και 65,13 μm για τον ενδιάμεσο μορφότυπο), και κάπως μεγαλύτερη μέση τιμή (81,14 μm) για το H. communis (Εικόνα 3.15). Σχετικά με το είδος των εγκλείστων στο εσωτερικό των κύριων ινών, δεν παρατηρήθηκε κάποιο πρότυπο στους μορφότυπους και τα είδη. Οι κύριες ίνες κάθε ατόμου χαρακτηρίζονταν είτε από την παρουσία πυριτικών σκληριτών άλλων ειδών σπόγγων ή κόκκους άμμου (κάποιες φορές σε συνδυασμό), ή μερικές φορές από την απουσία εγκλείστων (Πίνακας Β5, Παράρτημα Β). Η αφθονία των εγκλείστων στο εσωτερικό των κύριων ινών ποίκιλε από μηδενική μέχρι υψηλή (70-100%) στα διάφορα άτομα, αλλά χωρίς να σχετίζεται με είδη ή μορφότυπους (Πίνακας Β5, Παράρτημα Β). Το μήκος και το πάχος των ινών του δευτερεύοντος δικτύου ποίκιλε ανάμεσα στα άτομα, αλλά και πάλι χωρίς να σχετίζεται με είδη ή μορφότυπους (Πίνακας Β5, Παράρτημα Β). Οι ατομικές μέσες τιμές και η τυπική απόκλιση και για τις δύο μετρήσεις δίνονται στο διάγραμμα της Εικόνας Όσον αφορά τη συνολική μέση τιμή, το S. officinalis είχε ελαφρά μικρότερες και παχύτερες 70

85 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 - ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΩΝ 71 Εκόνα 3.14: Διαγράμματα πολυδιάστατης κλιμάκωσης (MDS) για όλα τα δείγματα των S. officinalis και H. communis από το Αιγαίο σύμφωνα με τα χαρακτηριστικά της εξωτερικής τους μορφολογίας. Ο ρόλος του κάθε χαρακτήρα στη διαμόρφωση της κλιμάκωσης αναδεικνύεται με κύκλους διαφορετικών μεγεθών. Figure 3.14: Multi-dimensional scaling (MDS) graphs for for all Aegean specimens of S. officinalis and H. communis, according to external morphologic characters. The participation factor of each character to the scaling is indicated by circles of different sizes.!!!!! $! $! $!! $! $ $ $ $ Body Height / Body Volume ratio (%)!!!!! $! $! $!! $! $ $ $ $ Oscule Size SD (%)!!!!! $! $! $!! $! $ $ $ $ Oscule Size AVG. (%)!!!!! $! $! $!! $! $ $ $ $ Number of Oscule Groups / Number of Oscula ratio (%)!!!!! $! $! $!! $! $ $ $ $ Number of Oscula / Body Volume ratio (%)!!!!! $! $! $!! $! $ $ $ $ Conule Height category (%)!!!!! $! $! $!! $! $ $ $ $ Conule Density AVG. (%)!!!!! $! $! $!! $! $ $ $ $ Conule Distance SD / Conule Distance AVG ratio (%)!!!!! $! $! $!! $! $ $ $ $ Conule Distance AVG (%)

86 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Εικόνα 3.15: Μέσο πάχος κύριων ινών για τα είδη και τους μορφότυπους που μελετήθηκαν. Oι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν τις μέγιστες τιμές. Figure 3.15: Average thickness of primary fibers across studied species and morphotypes; error bars represent maximum values. δευτερεύουσες ίνες από ότι το H. communis (μέση τιμή: 213,53 μm ± 110,64 SD για το μήκος και 26,35 μm ± 6,03 SD για το πλάτος του πρώτου, και 261,18 μm ± 159,51 SD και 24,53 μm ± 5,52 SD αντίστοιχα για το δεύτερο). Στους μορφότυπους, το μήκος των ινών και το μέσο πάχος δεν παρουσίασαν αξιοσημείωτες διαφορές. Το μέσο μήκος ήταν 206,18 μm ± 104,02 SD για το μορφότυπο adriatica, 222,30 μm ± 114,72 SD για το μορφότυπο mollissima, και 236,32 μm ± 128,57 SD για τον ενδιάμεσο μορφότυπο. Το μέσο πάχος ήταν αντίστοιχα 26,67 μm ± 6,28 SD ( adriatica ), 24,48 μm ± 5,60 SD ( mollissima ), και 25,71 μm ± 5,15 SD (ενδιάμεσος τύπος). Η ANOVA παραταύτα υπέδειξε μία σημαντική διαφοροποίηση στο μήκος των δευτερογενών ινών βάσει του μορφοτύπου (F3,71 = 6,095, p = 0,001), η οποία όμως αφορούσε τη σύγκριση μεταξύ της H. communis και των μορφοτύπων ADR και MOL της S. officinalis. Σχετικά με το πάχος των δευτερογενών ινών δεν υπήρξε ένδειξη για διαφοροποίηση βάσει του μορφότυπου από την ANOVA (F3,71 = 1,312, p = 0,277). Η ανάλυση MDS για το σύνολο των σκελετικών χαρακτήρων δεν έδειξε κανενός είδους ομαδοποίηση των μορφοτύπων του Αιγαίου (Εικόνα 3.17Α) ούτε των δειγμάτων της Δυτικής Μεσογείου και του Αιγαίου (Εικόνα 3.17B) Γεωγραφική μορφολογική ποικιλότητα α. Μακροσκοπικοί μορφολογικοί χαρακτήρες Η ανάλυση όλων των ατόμων συλλογικά ανεξάρτητα από μορφότυπους και είδη έδειξε ότι το μέγεθος του σώματος ποίκιλε σημαντικά ανάμεσα στις γεωγραφικές περιοχές (Εικόνα 3.18). Τα μικρότερα άτομα παρατηρήθηκαν στις περιοχές της Δυτικής Κρήτης και της Καρπάθου, ενώ ένα 72

87 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 - ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΩΝ Εκόνα 3.16: Διαγραμματική απεικόνιση του μήκους και πάχους των δευτερευουσών ινών για όλους τους μορφότυπους που μελετήθηκαν. Κάθε σημείο αντιστοιχεί στις μέσες τιμές για κάθε άτομο, ενώ οι γραμμές σφάλματος αντιστοιχούν στην τυπική απόκλιση. Τα δείγματα από το Γιβραλτάρ σημειώνονται με αστερίσκο. Figure 3.16: Average secondary fibre length plotted versus thickness for studied individuals of all morphological types; error bars correspond to standard deviation. Samples from Gibraltar are indicated with an asterisk. μεγάλο εύρος μεγεθών παρατηρήθηκε στα άτομα των Κυκλάδων. Η ανάλυση διακύμανσης έδειξε σημαντική συσχέτιση του όγκου του σώματος με την περιοχή και το μορφότυπο με το δεύτερο εμφωλευμένο στο πρώτο. Η συσχέτιση αυτή δεν παρατηρήθηκε, όταν τα άτομα του H. communis δεν περιλαμβάνονταν στην ανάλυση (Πίνακας 3.5). Το σχήμα του σώματος, όπως υπολογίστηκε από τις αναλογίες W/D και H/D, επίσης ποίκιλε στις διάφορες περιοχές, όπως φαίνεται στις Εικόνες 3.19 και 3.20 αντίστοιχα. Ειδικότερα, τα άτομα του H. communis από την Κάρπαθο και τις Κυκλάδες παρουσίαζαν ένα λίγο-πολύ σφαιρικό σχήμα (μέση αναλογία H/D περίπου 0,7), ενώ τα άτομα του ίδιου είδους από την Ανατολική Κρήτη ήταν περισσότερο πλατυσμένα (αντίστοιχες αναλογίες περίπου 0,45 και 0,35, αντίστοιχα). Οι παρατηρήσεις αυτές επιβεβαιώθηκαν από την ANOVA που έδειξε σημαντική συσχέτιση της αναλογίας H/D με τη γεωγραφική περιοχή (Πίνακας 3.5). Ακόμη, τα άτομα από τη Βόρεια Κρήτη και τις Κυκλάδες είχαν πιο επιμήκη μορφή, με την αναλογία W/D μικρότερη από 0,75, ενώ στα άτομα 73

88 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ A B Similarity 2D Stress: 0.18 Similarity 65 PROVENCE AEGEAN Spongia officinalis adriatica morphotype Spongia officinalis adriatica morphotype Spongia officinalis mollissima morphotype Spongia officinalis intermediate morphotype Hippospongia communis 2D Stress: 0.19 Εκόνα 3.17: Διάγραμμα πολυδιάστατης κλιμάκωσης (MDS) με βάση τους σκελετικούς χαρακτήρες για όλα τα δείγματα που εξετάστηκαν από (A) το Αιγαίο Πέλαγος και (B) το Αιγαίο Πέλαγος και τη Νότια Γαλλία. Figure Multidimensional scaling (MDS) graph according to skeletal characters for all examined specimens from (A) the Aegean Sea with distinction of morphotypes and (B) the Aegean Sea and Provence. από τις άλλες περιοχές η αναλογία αυτή ποίκιλε μεταξύ 0,75 και 0,91, δείχνοντας έτσι ένα πιο κυκλικό σχήμα. Πάντως, η συσχέτιση μεταξύ της αναλογίας W/D και της περιοχής προέλευσης των ατόμων δεν υποστηρίχτηκε από την ANOVA (Πίνακας 3.5). Η γενική μορφή του σώματος ποίκιλε στις διάφορες περιοχές, αλλά αυτή η διαφοροποίηση ακολούθησε κυρίως τη διάκριση σε είδη και μορφότυπους (Πίνακας Β5, Παράρτημα Β). Αξίζει να σημειωθεί ότι η πυργωτή μορφή του μορφότυπου adriatica βρέθηκε μόνο σε μια περιοχή της Δυτικής Κρήτης. Το χρώμα του εξωδέρματος ήταν μαύρο στα περισσότερα άτομα. Παρόλα αυτά, αρκετά άτομα S. officinalis με γκρίζο εξώδερμα βρέθηκαν στην Κάρπαθο και τις Σποράδες (Πίνακας Β5, Παράρτημα Β). Το χρώμα του χοανοσώματος εμφάνισε έναν συσχετισμό με τη γεωγραφική προέλευση: τα περισσότερα ή και όλα τα άτομα κάθε περιοχής είχαν την ίδια απόχρωση, κρεμ ή ανοιχτό καφέ, ενώ μόνο τα άτομα από την Κω είχαν κεραμιδί χρώμα. Η θέση και η κατανομή των στομίων εξόδου στην επιφάνεια του σπόγγου ποίκιλε στις διάφορες περιοχές, κυρίως ακολουθώντας τη διάκριση σε είδη και μορφότυπους (Πίνακας Β5, Παράρτημα Β). Εντούτοις, η τάση των στομίων εξόδου να διατάσσονται σε γραμμές στο μορφότυπο ADR παρατηρήθηκε μόνο στα άτομα της Δυτικής Κρήτης και των Σποράδων. Όσον αφορά στο σχετικό αριθμό των στομίων εξόδου, τα άτομα του S. officinalis από τη Βόρεια και Δυτική Κρήτη παρουσίασαν υψηλές μέσες τιμές (0,07 και 0,09, αντίστοιχα), ενώ άτομα του ίδιου είδους από όλες τις άλλες περιοχές του Αιγαίου είχαν μέση τιμή 0,04 (Εικόνα 3.21). Οι αντίστοιχες τιμές για το H. communis ήταν σημαντικά χαμηλότερες και ποίκιλαν σημαντικά στις περιοχές που μελετήθηκαν (0,001-0,014). Η ανάλυση διακύμανσης έδειξε σημαντική 74

89 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 - ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΩΝ Εκόνα 3.18: Κατανομή μεγέθους σώματος για τα δείγματα που εξετάστηκαν, ανά γεωγραφική περιοχή του Αιγαίου. Figure Distribution of body size of the studied specimens, along the sampled locations in the Aegean Sea. Πίνακας 3.5: Εμφωλευμένη ανάλυση διακύμανσης (nested ANOVA) με την τοποθεσία ως κύριο παράγοντα και το μορφότυπο εμφωλευμένο, για τον όγκο και τους δείκτες σχήματος του σώματος (H: ύψος σώματος, W: πλάτος σώματος, D: μέγιστη διάμετρος σώματος, COM: ο μορφολογικός τύπος των ατόμων του Hippospongia communis). Table 3.5: Nested analysis of variance with location as main factor and morphotype as nested factor, for the body volume, as well as the ratios defining body form (H: height of individual; W: width of individual; D: maximum diameter of individual; COM: the morphologic type associated with Hippospongia communis).!$% &'µ()$% (*( +,$-% )$-% µ$./+)-0$-%) d.f. MS F p 1$0$23&4( E $./+)-0$* 3µ/6,3-µ78$* &)*% )$0$23&43% E < 0.001!$% &'µ()$% (96.4% )$ µ$./+)-0$ COM) d.f. MS F p 1$0$23&4( E $./+)-0$* 3µ/6,3-µ78$* &)*% )$0$23&43% E :+$% H/D (*( +,$-% )$-% µ$./+)-0$-%) d.f. MS F p 1$0$23&4( $./+)-0$* 3µ/6,3-µ78$* &)*% )$0$23&43% :+$% W/D (*( +,$-% )$-% µ$./+)-0$-%) d.f. MS F p 1$0$23&4( $./+)-0$* 3µ/6,3-µ78$* &)*% )$0$23&43%

90 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ διαφοροποίηση του σχετικού αριθμού στομίων εξόδου ανάλογα με την περιοχή (Πίνακας 3.6). Σημαντική διαφοροποίηση σύμφωνα με το μορφότυπο (εμφωλευμένο στη γεωγραφική περιοχή) παρατηρήθηκε επίσης, αλλά μόνο όταν τα άτομα του H. communis περιλαμβάνονταν στην ανάλυση. Το μέγεθος των πόρων εξόδου ποίκιλε κάπως ανάμεσα στις περιοχές για το S. officinalis, με μέσες τιμές 0,23 έως 0,37 cm και επικαλυπτόμενο εύρος (Εικόνα 3.22). Παρόμοιες ήταν και οι σχετικές παρατηρήσεις για το H. communis, με μέσες τιμές 0,51 έως 0,89. Η ανάλυση διακύμανσης Εκόνα 3.19: Μέση αναλογία του ύψους προς τη μέγιστη διάμετρο σώματος για τα δείγματα Spongia (S) και Hippospongia (H) ανά γεωγραφική περιοχή του Αιγαίου (οι γραμμές σφάλματος αντιστοιχούν στην τυπική απόκλιση). Figure Average ratio of sponge body height to maximum diameter along the sampled locations in the Aegean Sea (error bars represent standard deviation). Spongia (S) and Hippospongia (H) specimens within sampled locations were treated independently. Εκόνα 3.20: Μέση αναλογία του πλάτους προς τη μέγιστη διάμετρο σώματος για τα δείγματα Spongia (S) και Hippospongia (H) ανά γεωγραφική περιοχή του Αιγαίου (οι γραμμές σφάλματος αντιστοιχούν στην τυπική απόκλιση. Figure Average ratio of sponge body width to maximum diameter along the sampled locations in the Aegean Sea (error bars represent standard deviation). Spongia (S) and Hippospongia (H) specimens within sampled locations were treated independently 76

91 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 - ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΩΝ Εκόνα 3.21: Σχετικός αριθμός στομίων αξόδου (στόμια εξόδου ανά cm 3 σπόγγου) για τα δείγματα Spongia (S) και Hippospongia (H) στις γεωγραφικές περιοχές του Αιγαίου (οι γραμμές σφάλματος αντιστοιχούν στην τυπική απόκλιση). Figure Standardized number of exhalant pores (oscules per cm 3 of sponge volume) along the sampled locations in the Aegean Sea (error bars represent standard deviation). Spongia (S) and Hippospongia (H) specimens within sampled locations were treated independently Πίνακας 3.6: Εμφωλευμένη ανάλυση διακύμανσης (nested Anova) με κύριο παράγοντα την τοποθεσία και εμφωλευμένο το μορφότυπο και στη συνέχεια το άτομο, για τη διάμετρο και το σχετικό αριθμό στομίων εξόδου (COM: ο μορφολογικός τύπος των ατόμων του Hippospongia communis). Table 3.6: Nested analysis of variance with location as main factor and morphotype and individual as nested factors, for the diameter and standardized number of exhalant pores (COM: the morphologic type associated with Hippospongia communis).!µ$%&'( )%'µ*+, $-./'0 (12.3'0( %'0( µ'&4.%05'0() d.f. MS F p 6'5'7$)* < '&4.%05' $µ4+3$0µ9,' )%( %'5'7$)*$( < :%'µ2 $µ4+3$0µ9,2 )%'0( µ'&4.%05'0( ;2 )%( %'5'7$)*$( < 0.001!µ$%&'( )%'µ*+, $-./'0 (<+&*( %', µ'&4.%05' COM) d.f. MS F p 6'5'7$)* '&4.%05' $µ4+3$0µ9,' )%( %'5'7$)*$( :%'µ2 $µ4+3$0µ9,2 )%'0( µ'&4.%05'0( ;2 )%( %'5'7$)*$( < =<$%;.( 2&7µ.( )%'µ*+, $-./'0 (12.3'0( %'0( µ'&4.%05'0() d.f. MS F p 6'5'7$)* '&4.%05' $µ4+3$0µ9,' )%( %'5'7$)*$( =<$%;.( 2&7µ.( )%'µ*+, $-./'0 (<+&*( %', µ'&4.%05' COM) d.f. MS F p 6'5'7$)* '&4.%05' $µ4+3$0µ9,' )%( %'5'7$)*$(

92 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Εκόνα 3.22: Διάμετρος στομίων εξόδου για τα είδη που εξετάστηκαν (μαύρα θηκογράμματα) και διάμετρος στομίων εισόδου για το H. communis (κόκκινα θηκογράμματα) στις γεωγραφικές περιοχές του Αιγαίου. Τα δείγματα Spongia (S) και Hippospongia (H) από κάθε περιοχή εξετάστηκαν χωριστά. Figure Exhalant pore diameter for all studied species (black box & whisker plots) and inhalant pore diameter for H. communis (red box & whisker plots) per studied geographic location in the Aegean Sea. Spongia (S) and Hippospongia (H) specimens within sampled locations were treated independently έδειξε σημαντική διαφοροποίηση του μεγέθους των πόρων με την περιοχή (Πίνακας 3.6). Επίσης παρατηρήθηκε σημαντική διαφοροποίηση σύμφωνα με το μορφότυπο (εμφωλευμένο στη γεωγραφική περιοχή), μόνο όταν τα άτομα του H. communis περιλαμβάνονταν στην ανάλυση. Η διαφοροποίηση όμως μεταξύ ατόμων ήταν επίσης σημαντική μέσα στους μορφότυπους και τις περιοχές, είτε με ή χωρίς τα άτομα του H. communis. Η απόσταση μεταξύ των κωνιδίων στην επιφάνεια των ατόμων ποίκιλε εμφανώς, όσον αφορά στη μέση τιμή και το εύρος των τιμών που παρατηρήθηκε, μεταξύ των διαφορετικών περιοχών (Εικόνα 3.23). Η μέση απόσταση των κωνιδίων στις διάφορες γεωγραφικές περιοχές για το S. officinalis ποίκιλε μεταξύ 1,19 mm ± 0,28 SD (Ανατολική Κρήτη) και 1,51 mm ± 0,48 SD (Κάρπαθος). Το αντίστοιχο εύρος για το H. communis ήταν 1,33 mm ± 0,79 SD (Κυκλάδες) και 2,16 mm ± 0,61 SD (Ανατολική Κρήτη). Η ανάλυση διακύμανσης έδειξε σημαντική διαφοροποίηση της απόστασης των κωνιδίων σύμφωνα με τη γεωγραφική περιοχή, καθώς και μεταξύ των ατόμων της ίδιας περιοχής (Πίνακας 3.7). Δεν βρέθηκε πάντως σημαντική διαφοροποίηση μεταξύ μορφότυπων της ίδιας περιοχής. Η πυκνότητα των κωνιδίων επίσης κυμάνθηκε ανάμεσα στις γεωγραφικές περιοχές (Εικόνα 3.23). Οι μέσες τιμές της για το S. officinalis ήταν από 35 ± 6 κωνίδια / cm 2 (Σποράδες) και 55 ± 10 78

93 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 - ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΩΝ Εκόνα 3.23: Απόσταση μεταξύ γειτονικών κωνιδίων (θηκογράμματα) και μέση πυκνότητα κωνιδίων (ιστόγραμμα) στην επιφάνεια των δειγμάτων Spongia (S) and Hippospongia (H) για τις γεωγραφικές περιοχές του Αιγαίου. Figure Distance between adjacent conules (box & whisker plots) and average density of conules (histogram) on the sponge surface, per studied geographic location. Spongia (S) and Hippospongia (H) specimens within sampled locations were treated independently κωνίδια / cm 2 (Δυτική Κρήτη). Το αντίστοιχο εύρος για το H. communis ήταν 18 ± 3 και 27 ± 5 κωνίδια / cm 2 (Ανατολική Κρήτη και Σποράδες, αντίστοιχα). Η ανάλυση διακύμανσης έδειξε σημαντική διαφοροποίηση της πυκνότητας των κωνιδίων σύμφωνα με τη γεωγραφική περιοχή, καθώς και μεταξύ μορφοτύπων (εμφωλευμένων στις γεωγραφική περιοχή) και ατόμων (Πίνακας 3.7). Πάντως, η διαφοροποίηση μεταξύ μορφοτύπων έπαυε να είναι σημαντική όταν τα άτομα του H. communis εξαιρούνταν από την ανάλυση. β. Σκελετικοί χαρακτήρες Το μήκος και το πάχος των δευτερευουσών ινών του σκελετού παρουσίασαν ποικιλότητα μεταξύ των γεωγραφικών περιοχών, παρόλο που το εύρος των τιμών και για τους δύο χαρακτήρες παρουσίασε σημαντική επικάλυψη (Εικόνα 3.24). Τα δείγματα του Γιβραλτάρ είχαν τις παχύτερες δευτερεύουσες ίνες (μέσος πάχος 35,44 μm ± 6,93 SD - βλέπε και Εικόνα 3.16), ενώ για όλες τις άλλες περιοχές το μέσο πάχος ποίκιλε μεταξύ 22,58 και 27,49 μm (Δυτική Κρήτη και Σποράδες, αντίστοιχα). Το μέσο μήκος των ινών ποίκιλε μεταξύ περιοχών από 166,70 μm ± 71,83 SD (Δυτική Κρήτη) έως 275,87 μm ± 141,87 SD (Κως) χωρίς να παρουσιάζει ακραίες τιμές εντός των πληθυσμών. Σημαντική διαφοροποίηση στο μήκος και το πάχος των δευτερευουσών ινών στις 79

94 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Πίνακας 3.7: Εμφωλευμένη ανάλυση διακύμανσης (nested Anova) με κύριο παράγοντα την τοποθεσία και εμφωλευμένους το μορφότυπο και το άτομο, για την απόσταση ανάμεσα σε γειτονικά κωνίδια, και την πυκνότητα των κωνιδίων στην επιφάνεια του σπόγγου (COM: ο μορφολογικός τύπος των ατόμων του Hippospongia communis). Table 3.7: Nested analysis of variance with location as main factor and morphotype and individual as nested factors, for the distance between adjacent conules, as well as conule density on the sponge surface (COM: the morphologic type associated with Hippospongia communis).!$%&$' µ(%&)* +,-./0,- (1.& 2345 %345 µ367%4345) d.f. MS F p 8339($0& < :367%43. (µ7,2(4µ;-3. $%.5 %339($0( <%3µ& (µ7,2(4µ;-& $%345 µ367%4345 +&. $%.5 %339($0( < =4+-%'%& +,-./0,- (1.& 2345 %345 µ367%4345) d.f. MS F p 8339($0& < :367%43. (µ7,2(4µ;-3. $%.5 %339($0( < <%3µ& (µ7,2(4µ;-& $%345 µ367%4345 +&. $%.5 %339($0( < =4+-%'%& +,-./0,- (>,605 %3 µ367%43 COM) d.f. MS F p 8339($0& :367%43. (µ7,2(4µ;-3. $%.5 %339($0( <%3µ& (µ7,2(4µ;-& $%345 µ367%4345 +&. $%.5 %339($0( < διάφορες περιοχές αποκαλύφτηκε από την ανάλυση διακύμανσης (Πίνακας 3.8). Η διαφοροποίηση μεταξύ ατόμων και για τα δύο χαρακτηριστικά ήταν επίσης στατιστικά σημαντική. Σημαντική διαφοροποίηση βρέθηκε μεταξύ μορφοτύπων (εμφωλευμένων στη περιοχή) και όταν τα άτομα του H. communis χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση. Το μέσο πάχος των κύριων ινών του σκελετού, ποίκιλε ελαφρά μεταξύ των περιοχών (Εικόνα 3.25). Οι παχύτερες κύριες ίνες παρατηρήθηκαν στην Κω (μέση τιμή: 101,02 μm), ενώ οι λεπτότερες στη Ceuta (μέση τιμή: 45,65 μm). Στις υπόλοιπες περιοχές το μέσο πάχος ήταν 61,25 έως 79,17 μm. Η αφθονία των έγκλειστων υλικών στις κύριες ίνες του σκελετού ποίκιλε μεταξύ των περιοχών (Εικόνα 3.26). Οι Κυκλάδες, το Port-Cros και η Ceuta χαρακτηρίζονταν από μικρές ποσότητες εγκλείστων, ενώ οι Σποράδες, η Κως και η Marseille από μεγάλες. Ποικιλότητα και εντός γεωγραφικών περιοχών παρατηρήθηκε σε κάποιες περιπτώσεις, όπως στην Κάρπαθο και την Ανατολική Κρήτη, όπου βρέθηκαν άτομα με πολύ διαφορετικό ποσό έγκλειστου υλικού στις κύριες ίνες. 3.4 Συζήτηση Ένας αριθμός μορφολογικών χαρακτηριστικών που μπορούν να μετρηθούν στο πεδίο ή στο εργαστήριο με απλές μεθόδους μελετήθηκε στην παρούσα έρευνα με στόχο να περιγραφεί όσο το δυνατόν πιο ξεκάθαρα και λεπτομερειακά η συγκεχυμένη μορφολογία των κερατόσπογγων που εξετάστηκαν και να καθοριστούν εκείνοι οι χαρακτήρες που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν 80

95 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 - ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΩΝ Εκόνα 3.24: Πάχος και μήκος δευτερευουσών ινών για τα άτομα που μελετήθηκαν (τα δεδομένα για τους διαφορετικούς μορφότυπους εξετάστηκαν μαζί) ανά γεωγραφική περιοχή. Οι κάθετες και οριζόντιες γραμμές αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση). Figure Secondary fibre thickness plotted versus length for studied individuals (data for different morphological types combined) per geographic region. Horizontal and vertical bars represent standard deviation 81

96 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Πίνακας 3.8: Εμφωλευμένη ανάλυση διακύμανσης (nested Anova) με κύριο παράγοντα την τοποθεσία και εμφωλευμένους το μορφότυπο και το άτομο, για το μήκος και το πάχος των δευτερευουσών ινών του σκελετού (COM: ο μορφολογικός τύπος των ατόμων του Hippospongia communis). Table 3.8: Nested analysis of variance with location as main factor and morphotype and individual as nested factors, for the length and width of secondary skeletal fibers (COM: the morphologic type associated with Hippospongia communis).!$% &'()'*'($(+,-.-,- (/.0 12$(% )$(% µ$*31)(4$(%) d.f. MS F p 5$4$6' < 0.001!$*31)(4$. 'µ382'(µ9-$. +).% )$4$6'+7'% < :)$µ0 'µ382'(µ9-0 +)$(% µ$*31)(4$(% 0. +).% )$4$6'+7'% < 0.001!$% &'()'*'($(+,-.-,- (;8*7% )$ µ$*31)(4$ COM) d.f. MS F p 5$4$6' < 0.001!$*31)(4$. 'µ382'(µ9-$. +).% )$4$6'+7'% :)$µ0 'µ382'(µ9-0 +)$(% µ$*31)(4$(% 0. +).% )$4$6'+7'% < <=;$% &'()'*'($(+,-.-,- (/.0 12$(% )$(% µ$*31)(4$(%) d.f. MS F p 5$4$6' !$*31)(4$. 'µ382'(µ9-$. +).% )$4$6'+7'% :)$µ0 'µ382'(µ9-0 +)$(% µ$*31)(4$(% 0. +).% )$4$6'+7'% < <=;$% &'()'*'($(+,-.-,- (;8*7% )$ µ$*31)(4$ COM) d.f. MS F p 5$4$6' !$*31)(4$. 'µ382'(µ9-$. +).% )$4$6'+7'% :)$µ0 'µ382'(µ9-0 +)$(% µ$*31)(4$(% 0. +).% )$4$6'+7'% < για την αποτελεσματική διάκριση των ειδών H. communis και Spongia officinalis, καθώς και των μορφοτύπων του τελευταίου. Επιλέχθηκαν όσα από τα μορφολογικά χαρακτηριστικά μπορούσαν με κάποιον τρόπο να ποσοτικοποιηθούν, από το μέγεθος, το σχήμα και το χρώμα, μέχρι κάποιους χαρακτήρες που αφορούν στη δομή και οργάνωση του σκελετού (κύριες και δευτερεύουσες ίνες, κωνίδια) και του συστήματος κυκλοφορίας του νερού (στόμια εξόδου και εσωτερικά κανάλια). Πέρα όμως από τη διερεύνηση του ρόλου των παραπάνω μορφολογικών χαρακτήρων στη διάκριση ειδών και μορφοτύπων των Μεσογειακών εμπορικών σπόγγων, διερευνήθηκε και η γεωγραφική ποικιλότητα τους αλλά και η ποικιλότητα σε επίπεδο ατόμων, για πρώτη φορά, σε ένα μεγάλο εύρος της εξάπλωσής τους. Μορφολογική διάκριση μορφοτύπων και ειδών Τα αποτελέσματα της έρευνας αυτής δεν έδειξαν καμιά μορφολογική διαφοροποίηση μεταξύ των γνωστών μορφοτύπων adriatica, mollissima, καθώς και των ενδιάμεσων μορφών που βρέθηκαν σε πολλές από τις περιοχές μελέτης. Τα χαρακτηριστικά που μελετήθηκαν ποσοτικά έδειξαν μεγάλης έκτασης επικαλυπτόμενη ποικιλομορφία χωρίς σημαντική απόκλιση από τις μέσες τιμές, ενώ οι διαφορές που παρατηρήθηκαν στο εύρος τους θα πρέπει να αποδοθούν σε τυχαίους παράγοντες. Οι περισσότεροι ποιοτικοί χαρακτήρες, από την άλλη, δεν παρουσίασαν κανένα 82

97 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 - ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΩΝ Εκόνα 3.25: Μέσο πάχος κυρίων ινών για τα δείγματα που εξετάστηκαν, ανά γεωγραφική περιοχή της Μεσογείου (οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν τις μέγιστες τιμές). Figure 3.25: Average thickness of primary fibers along the studied geographic locations in the Mediterranean Sea; error bars represent average maximum values. εμφανές πρότυπο ομαδοποίησης. Από τους εξωτερικούς μορφολογικούς χαρακτήρες, μόνο το σχήμα του σώματος μαζί με την κατανομή και τη θέση των στομίων εξόδου παρουσίασαν ποικιλότητα ακολουθώντας τη διάκριση ειδών και μορφοτύπων. Αυτοί οι χαρακτήρες τυχαίνει να χρησιμοποιούνται και από τους αλιείς και εμπόρους των σπόγγων στη διάκριση μεταξύ εμπειρικών ποικιλιών (προσωπική παρατήρηση) και χρησιμοποιήθηκαν και στη μελέτη μας για μια a priori ένταξη των ατόμων που συλλέχτηκαν σε μορφότυπους και είδη. Θα πρέπει να σημειωθεί, πάντως, ότι παρατηρήθηκε σημαντική επικάλυψη και ως προς αυτούς τους χαρακτήρες, σε δείγματα που εντάχθηκαν στον ενδιάμεσο μορφότυπο, μεταξύ των καθιερωμένων adriatica και mollissima. Ακόμη, η εξέταση των σκελετικών χαρακτήρων δεν αποκάλυψε καμιά διάκριση μεταξύ του μορφότυπου adriatica που χαρακτηρίζει τις περιοχές της Δυτικής Μεσογείου και του αντίστοιχου μορφοτύπου της Ανατολικής Μεσογείου, όπως πρότειναν οι Pronzato et al. (2003). Παρατηρήθηκε, ωστόσο, μια αξιοσημείωτη απόκλιση στα δείγματα από το Γιβραλτάρ, τα οποία παρουσίασαν αρκετά παχύτερες δευτερεύουσες σκελετικές ίνες, καθώς και πλήρη απουσία εγκλείστων στο εσωτερικό των κύριων ινών τους. Αντίθετα, σημαντική διαφοροποίηση παρατηρήθηκε μεταξύ των ειδών S. officinalis και H. communis για αρκετούς από τους χαρακτήρες που μελετήθηκαν, τόσο εξωτερικούς μορφολογικούς (μέγεθος σώματος, χαρακτηριστικά στομίων εξόδου, πυκνότητα κωνιδίων) όσο και σκελετικούς (πάχος δευτερευουσών ινών). Ο μορφολογικός διαχωρισμός των δύο ειδών, πάντως, θα πρέπει να αποδοθεί κυρίως στους εξωτερικούς χαρακτήρες, με κυρίαρχο ρόλο αυτών που αφορούν στο σύστημα κυκλοφορίας του νερού. Τα μεγάλα χοανοσωμικά κανάλια καταλαμβάνουν περισσότερο από 50% του συνολικού όγκου του σώματος σε ένα τυπικό δείγμα του H. communis. Στο είδος αυτό παρατηρήθηκε η παρουσία λίγων, μεγάλων στομίων εξόδου του νερού στην επιφάνειά του, τα οποία παρουσίαζαν μια τάση για αύξηση της διαμέτρου τους, αλλά όχι του αριθμού τους, ως ανταπόκριση στην αύξηση του σωματικού μεγέθους του σπόγγου, σε αντίθεση με ό,τι συνέβαινε στο S. officinalis. Ακόμη, ομαδοποίηση των στομίων δεν παρατηρήθηκε ποτέ στο H. communis, ενώ στα άτομα του είδους αυτού πάντα υπήρχαν συστάδες από μικρότερους πόρους. 83

98 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ SPO CYC KOS KAR NCR WCR ECR LAC LRO MAR PCP CEU Εκόνα 3.26: Αφθονία εγκλείστων στις κύριες ίνες των δειγμάτων που εξετάστηκαν, ανά γεωγραφική περιοχή της Μεσογείου. 0% 0-30% 30-70% % Figure 3.26: Abundance of inclusions inside the primary fibers of the studied specimens, along the sampled locations in the Mediterranean Sea. Και αυτό το χαρακτηριστικό χρησιμοποιείται από αλιείς και εμπόρους στην εμπειρική διάκριση του καπάδικου (Hippospongia) από τους υπόλοιπους σπόγγους του μπάνιου (προσωπική παρατήρηση), ενώ οι υποδερμικές κοιλότητες που χαρακτηρίζουν την επιφάνειά των ατόμων του έχουν χρησιμοποιηθεί από τον Cook (2007) ως κλειδικός χαρακτήρας για τη διάκριση του γένους Hippospongia από το γένος Spongia. Οι διαφορές που παρατηρήθηκαν ανάμεσα στα Spongia και Hippospongia στην πυκνότητα των κωνιδίων και τη μέση απόστασή τους φανερά οφείλονται στην ύπαρξη των υποδερμικών κοιλοτήτων στο δεύτερο. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα η σκελετική μάζα ακριβώς κάτω από το εξώδερμα να μην είναι συνεχής στη Hippospongia αλλά να διακόπτεται από τις υποδερμικές κοιλότητες και έτσι τα κωνίδια (που αποτελούν τις απολήξεις των κύριων ινών του σκελετού) να είναι ακανόνιστα συγκεντρωμένα στην επιφάνεια του σπόγγου, αφού στο εσωτερικό ο σκελετός είναι κατά τόπους πυκνός και διακόπτεται από τις κοιλότητες. Οι κύριες ίνες τείνουν να συγκεντρώνονται στις περιοχές αυτές με τον πυκνό σκελετό, ενώ είναι εντελώς απούσες στις περιοχές των κοιλοτήτων. Αντίθετα, στο S. officinalis από τα άτομα του οποίου λείπουν οι υποδερμικές κοιλότητες, η κατανομή των κύριων ινών και επομένως των κωνιδίων εμφανίζεται ομοιόμορφη. Η διάκριση δύο εύκολα ορατών και καλά διακριτών κατηγοριών στομίων στην επιφάνεια του H. communis, που παρατηρήθηκε σε όλα σχεδόν τα άτομα που μελετήθηκαν από το Αιγαίο, δεν έχει μέχρι στιγμής αναφερθεί στη βιβλιογραφία γύρω από τη συστηματική των Dictyoceratida (Pronzato & Manconi 2008, Cook & Bergquist 2001, 2007). Προφανώς αυτό συμβαίνει επειδή τα μικρού μεγέθους στόμια ενώ είναι πολύ ευδιάκριτα στην επιφάνεια του ζωντανού σπόγγου στο πεδίο, ή σε άτομα που συλλέχτηκαν πολύ πρόσφατα, δεν διακρίνονται σε κατεργασμένους 84

99 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 - ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΩΝ σπόγγους, καθώς δεν οδηγούν απευθείας σε εσωτερικά κανάλια (όπως συμβαίνει με τα στόμια εξόδου). Προφανώς πρόκειται για στόμια εισόδου του νερού, όχι όμως για τους γνωστούς πόρους (ostia) που είναι συνήθως μικροσκοπικά καθώς προέρχονται από ποροκύτταρα (Reiswig 1975), δηλαδή σχηματίζονται από ένα μεμονωμένο συσταλτό κύτταρο στο πινακόδερμα του σπόγγου. Ακόμη, το υποκείμενο σύστημα κυκλοφορίας του νερού που επικοινωνεί με τους πόρους έχει περιγραφεί ως αρκετά ομοιόμορφο, από άποψη σχήματος και διαστάσεων, σε διάφορα τάξα των σπόγγων, των Dictyoceratida συμπεριλαμβανομένων (Burlando et al. 1990, Bavestrello et al. 1988). Οι ομάδες των μικρών στομίων φαίνεται ότι είναι στην πραγματικότητα ανοίγματα στο εξώδερμα που οδηγούν στο δίκτυο των υποδερμικών και χοανοσωμικών κοιλοτήτων και μεγάλων καναλιών που χαρακτηρίζουν το H. communis. Τα τελευταία αυτά γνωρίσματα είναι πολύ χαρακτηριστικά για το είδος και έχουν χρησιμοποιηθεί για τη διάκρισή του από το S. officinalis (Pronzato & Manconi 2008, Cook & Bergquist 2001), ενώ παρατηρήθηκαν και σε δύο αντιπροσωπευτικά δείγματα H. communis and S. officinalis της συλλογής μας, καθιστώντας τον όγκο του συστήματος κυκλοφορίας του νερού διπλάσιο στο πρώτο από τα δύο είδη. Είναι πιθανό ότι στο H. communis, οι πραγματικοί πόροι είναι τοποθετημένοι στις κοιλότητες αμέσως κάτω από το εξώδερμα ή επάνω στην επένδυση των καναλιών και κοιλοτήτων του χοανοσώματος. Σε κατεργασμένα δείγματα H. communis, παρατηρήθηκαν πόροι με διαστάσεις παρόμοιες με εκείνες των καναλιών εισόδου στην επιφάνεια του S. officinalis κατά μήκος των χοανοσωμικών καναλιών του H. communis (Εικόνα 3.27). Αυτό το πρότυπο δομής του συστήματος κυκλοφορίας του νερού του H. communis πιθανότατα σχετίζεται με τη διαβίωσή του σε ενδιαιτήματα με υψηλότερο ρυθμό ιζηματαπόθεσης ή πυκνότερη φυκοκάλυψη (Εικόνα 3.28). Η απόκτηση ενός ενδιάμεσου χώρου μεταξύ του εξωτερικού περιβάλλοντος και του κύριου συστήματος κυκλοφορίας του νερού δίνει στο σπόγγο τη δυνατότητα να αποφεύγει την αρνητική επίδραση της έντονης ιζηματαπόθεσης και την κάλυψή του από επιβιοτικούς οργανισμούς που θα μπορούσαν να προκαλέσουν συμφόρηση στα επιφανειακά στόμια. Ένα εναλλακτικό όφελος θα ήταν η δυνατότητα προσαρμογής σε ολιγότροφα περιβάλλοντα, με την αύξηση της επιφάνειας εσωτερικά διατηρώντας παράλληλα ένα συμπαγές σχήμα σώματος. Σε κάθε περίπτωση, αυτές οι υποθέσεις χρειάζεται να ελεγχθούν μελλοντικά με λεπτομερείς μικροσκοπικές μελέτες και πειραματικές προσεγγίσεις. Μορφολογική ποικιλότητα εντός και μεταξύ των πληθυσμών Αξιοπρόσεκτη και στατιστικά σημαντική ποικιλότητα παρατηρήθηκε ανάμεσα στις γεωγραφικές περιοχές για τους περισσότερους μορφολογικούς χαρακτήρες που ήταν δυνατόν να ελεγχθούν στατιστικά (με μοναδική εξαίρεση την αναλογία W/D που χρησιμοποιήθηκε για την περιγραφή του σχήματος τους σώματος). Ακόμη, παρατηρήθηκε σημαντική διαφοροποίηση μεταξύ ατόμων που προέρχονταν από την ίδια γεωγραφική περιοχή για όλους τους μορφολογικούς χαρακτήρες (διάμετρος στομίων εξόδου, απόσταση και πυκνότητα κωνιδίων, μήκος και πλάτος δευτερευουσών ινών), οι οποίοι εμφάνισαν ένα εύρος τιμών και μέσα στο ίδιο άτομο. Αυτή η ποικιλότητα μεταξύ ατόμων δεν μπορεί να αποδοθεί στη διαφοροποίηση των μορφοτύπων του S. officinalis, αφού σε περιοχές στις οποίες συλλέχτηκαν και τα δύο είδη και/ή περισσότεροι από ένας μορφότυποι του S. officinalis, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφοροποίηση των χαρακτήρων όταν τα άτομα του H. communis εξαιρούνταν από την ανάλυση. Η σημαντική ποικιλότητα στο μέσο μέγεθος του σώματος που βρέθηκε μεταξύ περιοχών συνοδευόταν χαρακτηριστικά από μια ουσιαστική διακύμανση του εύρους των τιμών: μερικοί 85

100 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Εικόνα 3.27: Πόροι εισόδου (ostia), όπως διακρίνονται (A) στο εσωτερικό των χοανοσωμικών καναλιών, σε κάθετη τομή του σπόγγου Hippospongia communis, (Β) στην επιφάνεια του σπόγγου Spongia officinalis. Figure 3.27: Inhalant pores (ostia) visible (A) inside the large choanosomal canals of Hippospongia communis, after vertical section of the body; (B) on the surface of Spongia officinalis. πληθυσμοί χαρακτηρίζονταν από σπόγγους λίγο-πολύ ίδιου μεγέθους (π.χ. Κάρπαθος και Δυτική Κρήτη), ενώ άλλοι παρουσίαζαν μεγάλο εύρος μεγεθών (π.χ. Κυκλάδες και Ανατολική Κρήτη). Οι πληθυσμοί με το μεγάλο εύρος μεγεθών ήταν αυτοί που περιελάμβαναν και τα μεγαλύτερα άτομα. Αυτό το γεγονός θα μπορούσε υποθετικά να συσχετιστεί και με την αλιευτική πίεση που ασκείται στους πληθυσμούς, με την έννοια ότι η απομάκρυνση των μεγαλύτερων κλάσεων μεγέθους παρατηρείται στους πληθυσμούς που αλιεύονται περισσότερο. Όμως κάτι τέτοιο δεν θα πρέπει να ισχύει, αφού οι πληθυσμοί των Σποράδων που παρουσίαζαν ένα μέσο μέγεθος, βρίσκονται σε καθεστώς απαγόρευσης της αλιείας. Ακόμη, οι πληθυσμοί της Δυτικής Κρήτης (με μικρό εύρος μεγεθών) είναι μικροί πληθυσμοί σε ρηχά νερά που πρακτικά δεν υφίστανται αλιευτική πίεση. Πρέπει να σημειωθεί επιπλέον πως καμία συσχέτιση μεταξύ του εύρους μεγέθους των ατόμων και της βαθυμετρίας των περιοχών δεν στάθηκε δυνατόν βρεθεί. Κατά συνέπεια, το εύρος μεγέθους των πληθυσμών των σπόγγων του μπάνιου μπορεί να θεωρηθεί τυχαίο, ή σχετιζόμενο με τους παράγοντες που επικρατούν σε κάθε περιοχή. Φαινόμενα, όπως τα πρόσφατα περιστατικά θνησιμότητας θα μπορούσαν επίσης να ευθύνονται για την απομάκρυνση γηραιών, μεγαλόσωμων ατόμων και την επικράτηση νεότερων, μικρόσωμων. Η ποικιλότητα στη μορφή του σώματος, έχοντας να κάνει με το πόσο μακρόστενα ή πεπλατυσμένα ήταν τα διάφορα άτομα, ήταν εμφανής στα αποτελέσματα. Αντίστοιχη ποικιλότητα σε πληθυσμούς του S. officinalis από την Κρήτη και το Portofino (Ιταλία) έχει αναδειχθεί και από τους Pronzato et al. (2003). Οι ερευνητές αυτοί βρήκαν σημαντική διαφοροποίηση μεταξύ των δύο περιοχών για την αναλογία D/H. Υψηλή ποικιλότητα στο σχήμα του σώματος ανάμεσα σε γεωγραφικές περιοχές καταγράφηκε επίσης πρόσφατα για το Μεσογειακό σπόγγο μπάνιου Spongia zimocca (Castritsi-Catharios et al. 2011). 86

101 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 - ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΩΝ Εκόνα 3.28: Σπόγγος Hippospongia communis στο φυσικό του ενδιαίτημα. Η επιφάνεια του ατόμου είναι καλυμμένη στο μεγαλύτερο τμήμα της από φύκη και ίζημα, αφήνοντας ανοίγματα μόνο για τους πόρους εισόδου και εξόδου. Φωτογραφία: Θάνος Νταϊλιάνης Figure 3.28: Hippospongia communis in its common habitat. The surface of the sponge is extensively covered by algae and sediment, leaving openings only for the inhalant and exhalant pores. Photograph: Thanos Dailianis Το χρώμα δεν βρέθηκε να είναι διαφοροποιός παράγοντας μεταξύ μορφοτύπων/ειδών και πληθυσμών. Το μαύρο χρώμα του εξωδέρματος που παρατηρήθηκε στις περισσότερες περιπτώσεις, αποδίδεται στη χρωστική μελανίνη που είναι συσσωρευμένη κάτω από το εξώδερμα (Vacelet 1964). Οι πιο ανοιχτόχρωμοι τόνοι σε ένα μέρος των ατόμων S. officinalis από την Κάρπαθο υποδηλώνουν την έκθεση μεμονωμένων ατόμων σε περιορισμένης έντασης φωτισμό (π.χ. σε σχισμές βράχων). Συσχετισμός όμως παρατηρήθηκε μεταξύ του χρώματος του χοανοσώματος και της γεωγραφικής προέλευσης, υποδεικνύοντας έναν δυνητικό ρόλο του περιβάλλοντος. Συγκεκριμένα, το κεραμιδί χρώμα που παρατηρήθηκε στο χοανόσωμα κάποιων δειγμάτων από τη Κω, υποδηλώνει την ενσωμάτωση κόκκων λεπιδοκροκίτη (γ FeOOH) στις ίνες του σκελετού (Vacelet et al. 1988) και ο βαθμός συσσώρευσής τους αντανακλά τη συγκέντρωση του σιδήρου στο περιβάλλον μέσο. Η διαφοροποίηση που παρατηρήθηκε στην πυκνότητα και την απόσταση μεταξύ κωνιδίων είναι ενδεικτική των διαφορών που υπήρχαν στη διευθέτηση των κύριων ινών του σκελετού, αφού τα κωνίδια αποτελούν τις απολήξεις των ινών αυτών στην επιφάνεια των σπόγγων των ειδών που μελετήθηκαν. Η πυκνότητα των κύριων ινών έχει σχετιστεί με το μέγεθος και τη μορφή των κερατόσπογγων (Pronzato et al. 1998), με την έννοια ότι μικροί, συμπαγείς σπόγγοι δεν έχουν ανάγκη από άφθονες κύριες ίνες, ενώ αντίθετα η απόκτηση μεγάλου μεγέθους ευνοείται από την παρουσία ισχυρών, πολυάριθμων κύριων ινών. Ακόμη, έχει υποστηριχθεί ότι ο ρόλος της μηχανικής ισχύος της τάσης στο εξώδερμα, που προκύπτει από την απόληξη των κύριων ινών στα κωνίδια, επηρεάζει την αύξηση και το εξωτερικό σχήμα των κερατόσπογγων (Teragawa 1990, Uriz et al. 2003). Κατά συνέπεια, η ποικιλότητα που παρατηρήθηκε στα χαρακτηριστικά των κωνιδίων των ατόμων που εξετάστηκαν θα μπορούσε να αντανακλά την ποικιλότητα στο σχήμα και το μέγεθος του σώματος που παρατηρήθηκε στις διάφορες περιοχές ή, υποθετικά, μια διαφοροποίηση στο ρυθμό αύξησης στα διάφορα ενδιαιτήματα, σε συνάρτηση με διαφοροποιήσεις σε συνθήκες του περιβάλλοντος. Συμπερασματικά, η λεπτομερής εξέταση των μορφολογικών χαρακτηριστικών σε επιλεγμένα άτομα σπόγγων της συλλογής της παρούσας μελέτης, αποκάλυψε ουσιαστική 87

102 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ διαφοροποίηση, τόσο στο επίπεδο του πληθυσμού όσο και του ατόμου. Αυτό το εύρημα επιβεβαιώνει την πλαστικότητα της μορφολογίας των υπό μελέτη ειδών, γεγονός που έχει πολλές φορές επισημανθεί στη διάρκεια της μακράς ταξινομικής ιστορίας τους και που έχει προκαλέσει πολλές, έως και ανυπέρβλητες δυσχέρειες στην ακριβή περιγραφή και την ξεκάθαρη διάκριση των ειδών και των μορφοτύπων. Τα αποτελέσματα δείχνουν ξεκάθαρα ότι οι μέχρι σήμερα αποδεκτοί μορφότυποι adriatica και mollissima του S. officinalis αποτελούν στην πραγματικότητα δύο ακραίες μορφές ενός είδους με μεγάλη ενδογενή ποικιλομορφία, με ενδιάμεσες μορφές ιδιαίτερα κοινές σε όλη την έκταση του Αιγαίου Πελάγους. Με το ίδιο ακριβώς σκεπτικό, θα πρέπει να απορριφθεί, ως μη έγκυρη, η πρόσφατη αναβάθμιση των δύο μορφοτύπων στα ξεχωριστά είδη S. officinalis και S. mollissima από τους Pronzato & Manconi (2008). Από την άλλη, η διάκριση μεταξύ Hippospongia και Spongia υποστηρίζεται από τη μορφολογική ανάλυση στις περισσότερες περιπτώσεις, έχει όμως να κάνει με χαρακτηριστικά που αφορούν στη δομή του συστήματος κυκλοφορίας του νερού (κυρίως την ύπαρξη εκτεταμένων κοιλοτήτων στο χοανόσωμα). Η ύπαρξη των κοιλοτήτων αυτών έχει αποτελέσει τον κυριότερο μέχρι σήμερα ταξινομικό χαρακτήρα του γένους Hippospongia. Ωστόσο, κατά την άποψή μας, ένας τέτοιος χαρακτήρας δεν μπορεί να θεωρηθεί ισχυρός ταξινομικά, αφού οι σπόγγοι παρουσιάζουν μεγάλη ικανότητα αναδιάταξης της οργάνωσης των σώματός τους (Ereskovsky 2010) ανάλογα με τις συνθήκες του περιβάλλοντος και τις ιδιαίτερες απαιτήσεις των διαφορετικών ενδιαιτημάτων. Η διαφαινόμενη απουσία σαφούς διαφοροποίησης μεταξύ των δύο γενών βάσει της δομής του σκελετού, η οποία αποτελεί έναν πιο ισχυρό ταξινομικό χαρακτήρα, θέτει υπό μερική αμφισβήτηση τη διάκριση του Hippospongia και καταδεικνύει την ανάγκη για περαιτέρω έρευνα με πιο αντικειμενικές μεθόδους, όπως η διερεύνηση σε μοριακό επίπεδο και οι πειραματικές προσεγγίσεις Βιβλιογραφία Bavestrello G, Burlando B, Sarà M, The architecture of the canal systems of Petrosia ficiformis and Chondrosia reniformis studied by corrosion casts. Zoomorphology 108: Burlando B, Bavestrello G, Sarà M, Cocito S, The aquiferous systems of Spongia officinalis and Cliona viridis (Porifera) based on corrosion cast analysis. Bollettino di Zoologia 57: Carballo JL, Ávila E, Enríquez S, Camacho L, Phenotypic plasticity in a mutualistic association between the sponge Haliclona caerulea and the calcareous macroalga Jania adherens induced by transplanting experiments. I: Morphological responses of the sponge. Marine Biology 148(3): Castritsi-Catharios J, Van Soest RWM, Kefalas E, Vacelet J, Revised description of a poorly known Mediterranean Dictyoceratid bath sponge, Spongia (Spongia) zimocca (Schmidt, 1862) (Porifera: Demospongiae: Dictyoceratida). Zootaxa 2812: Clarke KR, Gorley NR, PRIMER v6: user manual/tutorial. Primer-E, Plymouth, 91pp. Cook LG, Edwards RD, Crisp MD, Hardy NB, Need morphology always be required for new species descriptions? Invertebrate Systematics 24:

103 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 - ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΩΝ Cook SDC, Bergquist PR, New species of Spongia (Porifera: Demospongiae: Dictyoceratida) from New Zealand, and a proposed subgeneric structure. New Zealand Journal Of Marine And Freshwater Research 35: Cook SDC, Bergquist PR, Order Dictyoceratida Minchin, In: Hooper JNA, van Soest RWM (eds.), Systema Porifera: a guide to the classification of sponges. Kluwer Academic, New York, p Cook SDC, Clarification of dictyoceratid taxonomic characters, and the determination of genera. In: Custódio MR, Lôbo-Hajdu G, Hajdu E, Muricy G (eds.), Porifera Research: biodiversity, innovation and sustainability. Série Livros 28, Museu Nacional, Rio de Janeiro, pp Cook SDC, Bergquist PR, New species of dictyoceratid sponges from New Zealand: Genus Ircinia (Porifera: Demospongiae: Dictyoceratida). New Zealand Journal Of Marine And Freshwater Research 33: DeWitt TJ, Sih A, Wilson DS, Costs and limits of phenotypic plasticity. Trends in Ecology & Evolution 13(2): Ereskovsky AV, The comparative embryology of sponges. Springer, 382 pp. Fusco G, Minelli A, Phenotypic plasticity in development and evolution: facts and concepts. Philosophical Transactions Of The Royal Society B: Biological Sciences 365: Gutiérrez-Rodríguez C, Barbeitos MS, Sánchez JA, Lasker HR, Phylogeography and morphological variation of the branching octocoral Pseudopterogorgia elisabethae. Molecular Phylogenetics and Evolution 50: 1-15 Kim E, Lasker HR, Coffroth MA, Kim K, Morphological and genetic variation across reef habitats in a broadcast-spawning octocoral. Hydrobiologia 530/531: Lévi C, Systématique de la classe des Demospongiaria (Démosponges). In: Grassé PP (ed.) Traité de Zoologie. Masson, Paris, pp López-Legentil S, Erwin PM, Henkel TP, Loh TL, Pawlik JR, Phenotypic plasticity in the Caribbean sponge Callyspongia vaginalis (Porifera: Haplosclerida). Scientia Marina 74(3): Maldonado M, Young CM, Limits on the bathymetric distribution of keratose sponges: a field test in deep water. Marine Ecology Progress Series 174: Mendola D, De Caralt S, Uriz MJ, Van Den End F, Van Leeuwen JL, Wijffels RH, Environmental flow regimes for Dysidea avara sponges. Marine Biotechnology 10: Meroz-Fine E, Shefer S, Ilan M, Changes in morphology and physiology of an East Mediterranean sponge in different habitats. Marine Biology 147(1): Palumbi SR, Tactics of Acclimation: Morphological changes of sponges in an unpredictable environment. Science 225: Pigliucci M, Evolution of phenotypic plasticity: where are we going now? Trends in Ecology & Evolution 20(9):

104 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Prada C, Schizas NV, Yoshioka PM, Phenotypic plasticity or speciation? A case from a clonal marine organism. BMC Evolutionary Biology 8: 47 Pronzato R, Manconi R, Mediterranean commercial sponges: over 5000 years of natural history and cultural heritage. Marine Ecology 29(2): Pronzato R, Bavestrello G, Cerrano C, Morpho-functional adaptations of three species of Spongia (Porifera, Demospongiae) from a Mediterranean vertical cliff. Bulletin of Marine Science 63(2): Pronzato R, Dorcier M, Sidri M, Manconi R, Morphotypes of Spongia officinalis (Demospongiae, Dictyoceratida) in two Mediterranean populations. Italian Journal of Zoology 70: Sánchez JA, Aguilar C, Dorado D, Manrique N, Phenotypic plasticity and morphological integration in a marine modular invertebrate. BMC Evolutionary Biology 7: 122 Teragawa CK, Mechanical function and regulation of the skeletal network in Dysidea. In: Rützler K (ed.) New perspectives in sponge biology. 3 rd International Conference on the Biology of Sponges. Smithsonian Institution Press, Washington DC: Uriz MJ, Turon X, Becerro MA, Agell G, Siliceous spicules and skeleton frameworks in sponges: origin, diversity, ultrastructural patterns, and biological functions. Microscopy Research and Technique 62: Vacelet J, Etude monographique de l éponge calcaire pharétronide de Méditerranée Petrobiona massiliana Vacelet et Levi. Les pharétronides actuelles et fossiles. Recueil des Travaux de la Station marine d Endoume 50: Vacelet J, Verdenal B, Perinet G, The iron mineralization of Spongia officinalis L. (Porifera, Dictyoceratida) and its relationships with the collagen skeleton. Biology of the Cell 62: West-Eberhard MJ, Phenotypic plasticity and the origins of diversity. Annual Review of Ecology and Systematics 20: Windsor PJ, Leys SP, Wnt signaling and induction in the sponge aquiferous system: evidence for an ancient origin of the organizer. Evolution & Development 12:

105 Κεφάλαιο 4 ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕΔΟ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ

106

107 4. Ανάλυση της γενετικής ποικιλότητας στο επίπεδο του είδους 4.1. Εισαγωγή Η μοριακή συστηματική στους σπόγγους ξεκίνησε ουσιαστικά στις αρχές της δεκαετίας του 1990 με σκοπό να αποσαφηνιστεί η φυλογένεσή τους στο επίπεδο του φύλου από τους Kelly- Borges et al. (1991) και τους Lafay et al. (1992) κάνοντας χρήση των ακολουθιών 18S και 28S rdna. Προηγουμένως, οι μοριακές τεχνικές είχαν χρησιμοποιηθεί αποσπασματικά, κυρίως με σκοπό τη διάκριση κρυπτικών ειδών εφαρμόζοντας την ενζυμική ηλεκτροφόρηση (Solé-Cava & Thorpe 1986, Solé-Cava et al 1991, 1992). Κατά τις δύο τελευταίες δεκαετίες, η ανάλυση των ακολουθιών 18S και 28S rdna βρήκε ευρεία χρήση και χρησιμοποιήθηκε αρκετά εκτεταμένα στη μοριακή φυλογένεση και τη συστηματική των σπόγγων, παράλληλα με τα αλλοένζυμα (π.χ. Chombard et al. 1998, Borchiellini et al. 2004). Η χρήση των τελευταίων σταδιακά εγκαταλείφθηκε καθώς η πρόσβαση στις ακολουθίες DNA γινόταν όλο και πιο εύκολη. Οι περιοχές των μεταγραφόμενων εσωτερικών διαχωριστών (Internal Transcribed Spacers) ITS1 και ITS2 χρησιμοποιήθηκαν σχετικά πρόσφατα σε φυλογενετικές και φυλογεωγραφικές μελέτες σε σπόγγους (π.χ. Duran et al. 2004a, Nichols & Barnes 2005). Όμως, διακυμάνσεις στο βαθμό πολυμορφισμού που εκδήλωσαν οι δείκτες αυτοί μεταξύ ταξινομικών ομάδων, έγειραν αμφιβολίες για τη δυνατότητα χρήσης τους ως φυλογενετικών εργαλείων (Wörheide et al. 2004, Redmond & McCormack 2009). Άλλοι δείκτες έχουν χρησιμοποιηθεί σχετικά σπανιότερα. Για παράδειγμα, οι ακολουθίες HSp70 χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη της ανώτερης φυλογένεσης των αρχέγονων Μεταζώων από τους Borchiellini et al. (1998) που ανέλυσαν αντιπροσωπευτικά τάξα των σπόγγων και άλλων διπλοβλαστικών φύλων, ενώ μια περιοχή του EF-1a έχει χρησιμοποιηθεί από τους Erpenbeck et al. (2005) για τη διερεύνηση της ανώτερης φυλογένεσης του φύλου των Δημόσπογγων. Οι μιτοχονδριακοί δείκτες, και κυρίως η περιοχή της υπομονάδας Ι της οξειδάσης του κυτοχρώματος c (cytochrome c oxidase subunit I COI), έχουν βρει ευρεία χρήση στη μοριακή συστηματική, ιδίως μετά την εμφάνιση της τάσης για την ανάπτυξη του γραμμωτού κώδικα της ζωής (barcode of life) στις αρχές της προηγούμενης δεκαετίας (Hebert et al. 2003a). Το τυπικό τμήμα του γονιδιώματος που χρησιμοποιείται ως δείκτης για την κωδικοποίηση αυτή έχει μήκος 640 bp και βρίσκεται κοντά στο 5' άκρο του γονιδίου COI στο μιτοχόνδριο. Ο δείκτης αυτός βρίσκεται σε όλους τους ευκαρυώτες και προσφέρει αρκετά πλεονεκτήματα για τους σκοπούς της συστηματικής: όντας τμήμα του μιτοχονδριακού γονιδιώματος σε μεγάλο αριθμό αντιτύπων ανά κύτταρο, κληρονομείται μόνο από τη μητέρα και δεν εμφανίζει ανασυνδυασμό. Επιπρόσθετα, παρουσιάζει συντηρημένη πρωτοδιάταξη ανάμεσα στα φύλα διευκολύνοντας την ανάπτυξη διαφυλετικών (universal) εκκινητών και παρουσιάζει υψηλά επίπεδα διαειδικής ποικιλότητας, σε αντίθεση με τη σχετικά μικρή ενδοειδική του ποικιλότητα. Το COI έχει χρησιμοποιηθεί στο φύλο Porifera για τη διερεύνηση της φυλογένεσης και την αποσαφήνιση της συστηματικής μεταξύ ταξινομικών ομάδων (Erpenbeck et al. 2007, Pöppe et al. 2010), τη διερεύνηση της φυλογεωγραφίας ειδών (Duran et al. 2004b, DeBiasse et al. 2010), την ανίχνευση περιπτώσεων κρυπτικής ειδογένεσης (Blanquer & Uriz 2007, Xavier et al. 2010), καθώς και τη σύγκριση της φυλογένεσης συμβιωτικών βακτηρίων με εκείνη των ξενιστών σπόγγων (Erpenbeck et al. 2002). 93

108 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Μία ιδιαιτερότητα στον πολυμορφισμό του COI έχει παρατηρηθεί στα διπλοβλαστικά φύλα, όπως τα Cnidaria, από την αρχή της χρήσης του στη γραμμική κωδικοποίηση (DNA barcoding) και αφορά τη μειωμένη διαφοροποίηση της πρωτοδιάταξης του δείκτη μεταξύ των ειδών (Hebert et al. 2003b). Η ιδιαιτερότητα αυτή έχει αποδοθεί στον χαμηλό εξελικτικό ρυθμό (evolutionary rate) του μιτοχονδριακού DNA αυτών των οργανισμών (Shearer et al. 2002). Ανάλογες παρατηρήσεις έχουν αναφερθεί και για τους σπόγγους, δείχνοντας χαμηλή ποικιλότητα του COI κάτω από το επίπεδο του γένους (Duran et al. 2004b, Wörheide 2005). Ως εκ τούτου, οι Erpenbeck et al. (2006) πρότειναν την παράλληλη αλληλούχηση μιας περιοχής που ακολουθεί το τυπικό τμήμα 5 COI (I3-M11 περιοχή), η οποία παρουσιάζει υψηλότερο ρυθμό αντικατάστασης και μπορεί κατ αυτό τον τρόπο να βοηθήσει τη φυλογένεση σε χαμηλότερα ταξινομικά επίπεδα. Αυτά τα επιχειρήματα έχουν υιοθετηθεί από το Sponge Barcoding Project ( που αποτελεί μια διεθνή προσπάθεια για το συντονισμό της γραμμικής κωδικοποίησης στους σπόγγους. Παρόλα αυτά, η περιοχή I3-M11 έχει προς το παρόν χρησιμοποιηθεί σε δύο μόνο μελέτες (López-Legentil & Pawlik 2009, Xavier et al. 2010). Η τρέχουσα τάση στη μοριακή συστηματική των σπόγγων είναι ο συνδυασμός ακολουθιών mtdna (κυρίως της περιοχής COI, αλλά επίσης και της I3-M11 ή του γονιδίου Atp8) από κοινού με πυρηνικούς δείκτες (π.χ. 18S και 28S rrna, ITS 1 & 2, ATPS intron). Η προσέγγιση αυτή έχει αποφέρει αξιοσημείωτα αποτελέσματα, φέρνοντας στο φως κρυμμένη βιοποικιλότητα μέσα από την ανακάλυψη κρυπτικών ειδών (cryptic species) τα οποία δεν θα μπορούσαν να ταυτοποιηθούν με τις συμβατικές μορφολογικές μεθόδους (π.χ. Blanquer & Uriz 2007, Xavier et al. 2010) και έχει δώσει νέα διάσταση στην προσπάθεια που ξεκίνησε στη δεκαετία του 1990 με τη χρήση της ηλεκτροφόρησης των πρωτεϊνών (βλέπε την ανασκόπηση των Xavier et al. 2010). Ο στόχος του συγκεκριμένου τμήματος της εργασίας αφορά στην αποσαφήνιση της ταξινομίας των ειδών Μεσογειακών σπόγγων μπάνιου που μελετήθηκαν και συγκεκριμένα τη διερεύνηση: (α) του επιπέδου διαφοροποίησης μεταξύ των ποικιλιών που εμπεριέχονται στο είδος Spongia officinalis στη Μεσόγειο, (β) του επιπέδου διαφοροποίησης μεταξύ των ειδών S. officinalis και Hippospongia communis, που παραδοσιακά αντιμετωπίζονται ως διακριτές ταξινομικές μονάδες και (γ) πιθανών φαινομένων κρυπτικής ειδογένεσης. Για το σκοπό αυτό, ο μοριακός δείκτης COI επιλέχθηκε ως ο πλέον κατάλληλος, λόγω της ευρείας χρήσης του στο φύλο των Ποροφόρων, που επιτρέπει σύγκριση των αποτελεσμάτων και την αξιολόγηση της παρατηρούμενης ποικιλότητας Μέθοδοι και Υλικά Επιλογή των δειγμάτων Αντιπροσωπευτικά δείγματα επιλέχθηκαν από όλες τις γεωγραφικές περιοχές που μελετήθηκαν, σύμφωνα με τα κριτήρια που αναφέρονται στο Κεφάλαιο 2 (Γενική Μεθοδολογία). Συνολικά 75 άτομα (15 H. communis και 60 S. officinalis) χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση του τμήματος του γονιδίου COI (Πίνακας 4.1). Τα δείγματα αυτά ήταν τα ίδια που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των μορφολογικών χαρακτήρων (βλέπε Κεφάλαιο 3). 94

109 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕΔΟ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ Πίνακας 4.1: Επιλεγμένα δείγματα Spongia officinalis και Hippospongia communis για τη διερεύνηση της ποικιλότητας στην πρωτοδιάταξη του δείκτη COI, σύμφωνα με τη γεωγραφική τους προέλευση. Οι αριθμοί σε παρένθεση υποδηλώνουν τα δείγματα για τα οποία επιτεύχθηκε ανάγνωση όλης της έκτασης της πρωτοδιάταξης. Table 4.1: Selected samples of Spongia officinalis and Hippospongia communis for analysis of COI sequence variation, according to their geographic origin. Numbers in parentheses correspond to samples that yielded a full COI consensus sequence.!$%& '. ($))%$ - (*+$),-+ WCR ECR NCR KAR KOS CYC SPO PCP LAC MAR LRO CEU S. officinalis H. communis 8 (4) 4 (2) 6 (6) 8 (7) 4 (2) 5 (3) 4 (3) 2 (2) 4 (2) 8 (4) 4 (3) 4 (2) 2 (2) 4 (3) 1 (1) 2 (2) 2 (1) WCR:./,01 2+1,3, ECR:!4$,&)01 2+1,3, NCR: 56+7$ 2+1,3, KAR: 2-+8$9&:, KOS: 2;:, CYC: '-<&: 0$ =-+&:, SPO: 5. >8&+-?7:, PCP: Port-Cros / Porquerolles, LAC: La Ciotat, MAR: Marseille, LRO: Le Rove, CEU: Ceuta) WCR: Western Crete, ECR: Eastern Crete, NCR: Northern Crete, KAR: Karpathos, KOS: Kos, CYC: Naxos and Paros, SPO: Sporades, PCP: Port-Cros / Porquerolles, LAC: La Ciotat, MAR: Marseille, LRO: Le Rove, CEU: Ceuta Απομόνωση DNA Ένα τμήμα ιστού από κάθε δείγμα, μεγέθους περίπου mm 3 χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση DNA, αφού ανατμήθηκε προσεκτικά σε στερεομικροσκόπιο για να επιβεβαιωθεί ότι δεν φιλοξενούσε συμβιωτικούς μακροπανιδικούς οργανισμούς που θα μπορούσαν να επιμολύνουν το γενετικό υλικό του οργανισμού-στόχου. Το γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε με τη βοήθεια του DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που προτείνει ο κατασκευαστής και αποθηκεύτηκε στους -20 C για το διάστημα που μεσολάβησε μέχρι την ενίσχυση Ενίσχυση του τμήματος COI Το τμήμα στο 5 άκρο του γονιδίου COI, όπως περιγράφεται από τους Folmer et al. (1994) ενισχύθηκε μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction PCR). Για την ενίσχυση χρησιμοποιήθηκαν οι εκφυλισμένοι εκκινητές (degenerate primers) dglco1490 και dghco2198 των Meyer et al. (2005), οι οποίοι αποτελούν παραλλαγή των καθιερωμένων εκκινητών που βρίσκουν χρήση σε εφαρμογές γραμμικής κωδικοποίησης. Η πρωτοδιάταξη των εκκινητών είναι: 5 - GGT CAA CAA ATC ATA AAG AYA TYG G - 3 (dglco1490) και 5 - TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAR AAY CA - 3 (dghco2198). Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε διάλυμα τελικού όγκου 50 μm που περιείχε 0,1 μm από κάθε εκκινητή, 0,05 mm μίγματος τριφωσφορικών δεσοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps), 0,02 U θερμοσταθερής DNA πολυμεράσης (Taq), 2,5 mm MgCl2 και περίπου 20 ng DNA σπόγγου. Οι αντιδράσεις PCR έγιναν σε αυτόματο θερμοκυκλοποιητή (thermal cycler) σε δύο συνεχόμενα σετ κύκλων: (α) ένα πρώτο, 6 κύκλων σε χαμηλή θερμοκρασία υβριδισμού (43 C) ώστε να διευκολυνθεί η σύνδεση των εκκινητών και (β) ένα δεύτερο, 36 κύκλων σε θερμοκρασία υβριδισμού 51 C για την τελική ενίσχυση της περιοχής. Οι κύκλοι αναλυτικά και στα δύο σετ περιλάμβαναν τα παρακάτω διαδοχικά βήματα: 30 δευτ. στους 94 C, 90 δευτ. στην εκάστοτε θερμοκρασία υβριδισμού και 1 λεπτό στους 72 o C. Οι κύκλοι αυτοί 95

110 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ πλαισιώθηκαν από ένα αρχικό στάδιο αποδιάταξης για 3 λεπτά στους 94 C και ένα τελικό στάδιο επιμήκυνσης για 5 λεπτά στους 72 C. Το προϊόν της PCR εξετάστηκε για επιβεβαίωση του μεγέθους με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης και καθαρίστηκε με τη μέθοδο της καθίζησης (precipitation), προσθέτοντας σε κάθε αντίδραση 5 μl διαλύματος οξικού νατρίου (NaOAc) 3M με ph=4,6, και 115 μl απόλυτης αιθανόλης. Το μίγμα παρέμεινε σε πάγο για 30 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε για 3 λεπτά στις 3700 rpm. Το ίζημα ξεπλύθηκε με προσθήκη 70 μl αιθανόλης (70%) και μία δεύτερη φυγοκέντρηση για 15 λεπτά στις 3700 rpm, και επαναδιαλύθηκε σε υπερκάθαρο νερό Ανάγνωση πρωτοδιάταξης του COI Η προετοιμασία των προϊόντων ενίσχυσης για την ανάγνωση της πρωτοδιάταξης (sequencing) του DNA, έγινε με το προϊόν BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (ABI), χρησιμοποιώντας τους ίδιους εκκινητές με το στάδιο της PCR (dglco1490 και dghco2198). Η ανάγνωση κάθε αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε και από τις δύο κατευθύνσεις. Οι αντιδράσεις προετοιμασίας πραγματοποιήθηκαν σε διάλυμα τελικού όγκου 10 μl που περιείχε 1 μl BigDye Sequencing Buffer, 2 μl BigDye Ready Reaction Premix, 0,5 μm ενός από τους εκκινητές και 3 μl καθαρισμένου προϊόντος PCR. Το μίγμα επωάστηκε σε αυτόματο θερμοκυκλοποιητή με το ακόλουθο πρόγραμμα συνθηκών: ένα αρχικό στάδιο στους 96 C για 3 λεπτά, 40 κύκλους διαδοχικών βημάτων (96 C για 20 δευτ., 48 C για 15 δευτ. και 60 C για 4 λεπτά) και άμεση μετάβαση στους 4 C. Τα προϊόντα καθαρίστηκαν με προσθήκη σε κάθε αντίδραση 22 μl απόλυτης αιθανόλης, 0,2 μl διαλύματος οξικού νατρίου (NaOAc) 3M με ph=4,6, και 0,1 μl EDTA (0,5M), επώαση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και επακόλουθη φυγοκέντρηση για 30 λεπτά στις 3700 rpm. Το ίζημα ξεπλύθηκε με προσθήκη 70 μl αιθανόλης (70%) και μία δεύτερη φυγοκέντρηση για 15 λεπτά στις 3700 rpm, και αφέθηκε να στεγνώσει. Η διαδικασία ανάγνωσης της πρωτοδιάταξης έγινε σε αυτόματο αναλυτή ABI PRISM 3700 Genetic Analyzer Έλεγχος και στοίχιση των αλληλουχιών πρόσθετες αλληλουχίες Τα γραφήματα πρωτοδιάταξης (electropherograms) που προέκυψαν από τον αναλυτή εξετάστηκαν για πιθανά σφάλματα με το λογισμικό BioEdit v (Hall 1999). Στο ίδιο πρόγραμμα πραγματοποιήθηκε η στοίχιση των αλληλουχιών για την επισήμανση της αντιστοιχίας στις νουκλεοτιδικές βάσεις, χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο ClustalW (Thompson et al. 1994). Οι συναινετικές (consensus) αλληλουχίες ελέγχθηκαν με αναζήτηση ομόλογων ακολουθιών στη βάση δεδομένων GenBank (NCBI) βάσει του αλγορίθμου BLAST (Altschul et al. 1990), ώστε να επιβεβαιωθεί ότι προέρχονταν από το γονιδίωμα των σπόγγων που εξετάστηκαν και να αποκλειστούν πιθανά προϊόντα επιμόλυνσης. Η μετάφραση των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών σε αλληλουχίες αμινοξέων έγινε με το εργαλείο NCBI ORF Finder (T. Tatusov & R. Tatusov, NCBI), χρησιμοποιώντας τον μιτοχονδριακό γενετικό κώδικα για μύκητες, πρωτόζωα και κοιλεντερόζωα. Οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες που προέκυψαν από την παρούσα μελέτη έχουν κατατεθεί στη βάση δεδομένων GenBank, με κωδικούς ανάκτησης (accession numbers) HQ έως HQ Πρόσθετες ομόλογες αλληλουχίες σπόγγων της οικογένειας Dictyoceratida ανακτήθηκαν από τη GenBank για να χρησιμοποιηθούν ως συγκριτικό υλικό στις επακόλουθες φυλογενετικές 96

111 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕΔΟ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ αναλύσεις. Πρόκειται για τις αλληλουχίες της περιοχής COI των ειδών Hippospongia lachne EU237484, Ircinia strobilina GQ και Vaceletia sp. EU Το είδος Plakortis angulospiculatus (EU237487) (Porifera: Homosclerophorida) χρησιμοποιήθηκε ως εξωομάδα (outgroup). Τέλος, νουκλεοτιδικές αλληλουχίες του γονιδίου των υπομονάδων 18S και 28S του ριβοσωμικού RNA των S. officinalis και H. communis ανακτήθηκαν επίσης από τη GenBank (κωδικοί ανάκτησης AY / AY και AF / AY αντίστοιχα). Οι αλληλουχίες αυτές προέρχονται από Μεσογειακά δείγματα των παραπάνω ειδών, όπως περιγράφονται στις σχετικές δημοσιεύσεις (Borchiellini et al. 2001, 2004) Φυλογενετική ανάλυση Φυλογενετικές ανακατασκευές χρησιμοποιώντας τους παραχθέντες απλότυπους COI κατασκευάστηκαν με τις ακόλουθες μεθόδους: (α) σύνδεσης γειτόνων (Neighbour-Joining NJ), (β) μέγιστης φειδωλότητας (Maximum Parsimony MP), (γ) μέγιστης πιθανότητας (Maximum Likelihood ML), καθώς και (δ) με κριτήρια Μπεϊεζιανής πιθανολογίας (Bayesian Inference BI). Οι ανακατασκευές με τις τρεις πρώτες μεθόδους πραγματοποιήθηκαν στο λογισμικό PAUP* v4.0b10 (Swofford 2002). Το εξελικτικό μοντέλο που ερμηνεύει καλύτερα τα δεδομένα προσδιορίστηκε από το πρόγραμμα jmodeltest v0.1.1 (Posada 2008), με χρήση του κριτηρίου του Akaike (Akaike Information Criterion AIC). Το προτεινόμενο μοντέλο νουκλεοτιδικών αντικαταστάσεων ήταν το General Time-Reversible με ένα ποσοστό μη-μεταβλητών θέσεων (GTR+I, I=0,52). Για την εύρεση των βέλτιστων φυλογενετικών δέντρων με τις αρχές MP και ML χρησιμοποιήθηκαν ευρετικοί αλγόριθμοι (heuristic searches) και η μέθοδος TBR (tree bisection and reconnection) για την αναδιευθέτηση των κλάδων. Η αξιοπιστία των κόμβων ελέγχθηκε με τη μέθοδο bootstrap (10,000 σειρές ψευδοδειγμάτων). Η φυλογενετική ανακατασκευή με κριτήρια BI πραγματοποιήθηκε στο λογισμικό MrBayes v3.1.2 (Ronquist & Huelsenbeck 2003). Η καταλληλότητα του εξελικτικού μοντέλου GTR+I, που χρησιμοποιήθηκε για τις προηγούμενες αναλύσεις, επιβεβαιώθηκε με το πρόγραμμα MrModelTest v2.2 (Nylander 2004). Η εύρεση του βέλτιστου δέντρου έγινε με ταυτόχρονο τρέξιμο τεσσάρων αλυσίδων Markov (Markov chain Monte Carlo MCMC) για 100,000 γενιές, ενώ δείγματα δέντρων σώζονταν κάθε 100 γενιές. Τα πρώτα 250 δέντρα απορρίπτονταν και τα υπόλοιπα χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή ενός συναινετικού δένδρου (consensus tree), με βάση το κριτήριο της πλειοψηφίας παρουσίας/απουσίας των κόμβων του δένδρου (majority rule) σε ποσοστό 50%. Οι διορθωμένες γενετικές αποστάσεις (p-distances) μεταξύ των απλότυπων υπολογίστηκαν στο PAUP* χρησιμοποιώντας το εξελικτικό μοντέλο GTR+I Αποτελέσματα Η ανάλυση των αντιπροσωπευτικών 60 ατόμων του είδους S. officinalis και 15 ατόμων του H. communis από το σύνολο των δειγμάτων όλων των περιοχών (Αιγαίο, Νότια Γαλλία και Γιβραλτάρ) απέφερε 49 ακολουθίες νουκλεοτιδίων (Πίνακας 4.1) μήκους 630 bp (που αντιστοιχούσαν σε

112 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ αμινοξέα μετά τη μετάφραση). Επειδή τα είδη που μελετήθηκαν φιλοξενούν πολυάριθμους συμβιώτες, υπάρχει το ενδεχόμενο της εσφαλμένης ενίσχυσης γενετικού υλικού διάφορου από αυτό των σπόγγων κατά τη διαδικασία. Παρόλα αυτά, η συγκριτική αναζήτηση στις κατατεθειμένες αλληλουχίες στη βάση δεδομένων GenBank έδειξε ότι οι απλότυποι ήταν καθαροί από εξωγενές DNA, καθώς η πιο συγγενική υπήρξε μία ομόλογη αλληλουχία ενός στενά συγγενικού είδους (Hippospongia lachne), ακολουθούμενου από άλλα είδη σπόγγων. Τόσο τα δείγματα του S. officinalis όσο και εκείνα του H. communis από τη συνολική έκταση της Μεσογείου (Αιγαίο και Νότια Γαλλία), συνολικά 46 δείγματα, παρουσίασαν αλληλουχίες με πανομοιότυπη πρωτοδιάταξη. Ο συγκεκριμένος απλότυπος στο εφεξής αναφέρεται ως MEDIT. Τα δείγματα από το Γιβραλτάρ (συνολικά 3) παρουσίασαν διαφορετική πρωτοδιάταξη από εκείνα της Μεσογείου και εμφάνισαν δύο διακριτούς απλότυπους (GIBR 1 και GIBR 2), που αντιστοιχούσαν στους δύο υποσταθμούς δειγματοληψίας (βλέπε Πίνακα 2.1). Η ποικιλομορφία στο επίπεδο των νουκλεοτιδίων, όπως προκύπτει από στοίχιση των παραπάνω απλότυπων μαζί με ομόλογες ακολουθίες ειδών Δικτυοκερατόσπογγων που ανακτήθηκαν από τη GenBank, αποδίδεται στην Εικόνα 4.1. Αντίστοιχα, η στοίχιση των αλληλουχιών αμινοξέων, όπως προέκυψαν από τη μετάφραση των απλότυπων, παρατίθεται στην Εικόνα 4.2. Οι αριθμητικές τιμές της διαφοροποίησης τόσο στο επίπεδο των νουκλεοτιδίων όσο και των αμινοξέων, δίνονται στον Πίνακα 4.2. Ένας σχετικά υψηλός βαθμός αντικατάστασης, που φτάνει τις 20 αντικαταστάσεις νουκλεοτιδίων, παρατηρήθηκε μεταξύ του απλοτύπου MEDIT και των GIBR 1 και 2. Οι μεταλλάξεις αυτές ήταν κατά βάση σιωπηρές, αφού δεν κατέληξαν σε εξίσου υψηλό αριθμό αντικατάστασης αμινοξέων. Ένα μέγιστο δύο τέτοιων αντικαταστάσεων παρατηρήθηκε μεταξύ των απλότυπων της Μεσογείου και του Γιβραλτάρ. Η διαφοροποίηση μεταξύ των δύο απλότυπων του Γιβραλτάρ ήταν μικρή, με δύο μόνο αντικαταστάσεις νουκλεοτιδίων, εκ των οποίων όμως η μία κατάληξε σε αντικατάσταση αμινοξέων. Οι αντικαταστάσεις νουκλεοτιδίων ανάμεσα στον απλότυπο MEDIT και τα υπόλοιπα είδη της οικογένειας Spongiidae που μελετήθηκαν (H. lachne και I. strobilina) ήταν κατά μέσο όρο 21 και 32 αντίστοιχα, αποδίδοντας σημαντικά λιγότερες ανταλλαγές αμινοξέων στην περίπτωση του H. lachne (μέσος αριθμός: 2) από ότι στο I. strobilina (μέσος αριθμός: 9). Ο μεγαλύτερος αριθμός αντικαταστάσεων νουκλεοτιδίων παρατηρήθηκε μεταξύ του απλότυπου MEDIT και του είδους Vaceletia sp. (μέσος αριθμός: 45) οι μεταλλάξεις αυτές ήταν επίσης στο μεγαλύτερο μέρος τους σιωπηρές, καταλήγοντας σε μικρό αριθμό ανταλλαγής αμινοξέων (μέσος αριθμός: 3). Οι κατά ζεύγη εκτιμήσεις της γενετικής απόστασης (p) μεταξύ των απλότυπων που μελετήθηκαν (Πίνακας 4.3) εμφάνισαν συγκρίσιμες τιμές, που κυμαίνονταν μεταξύ 0,029 και 0,054 για όλο το σετ των δεδομένων, με εξαίρεση το είδος Vaceletia sp. το οποίο παρουσιάζει τη μεγαλύτερη διαφοροποίηση από όλα τα τάξα που μελετήθηκαν, με τιμές p κυμαινόμενες μεταξύ 0,070 και 0,092. Αντίθετα, η διαφοροποίηση μεταξύ των απλότυπων του Γιβραλτάρ είναι χαμηλή, όπως εκφράζεται από την τιμή p = 0,003. Η απουσία διαφοροποίησης μεταξύ των ειδών S. officinalis και H. communis που διαπιστώθηκε με τη χρήση του δείκτη COI, παρατηρήθηκε επίσης εν μέρει στις ακολουθίες της ριβοσωμικής υπομονάδας 18S που ανακτήθηκαν από τη GenBank (Εικόνα Γ1, Παράρτημα Γ). Στην περιοχή του συγκεκριμένου γονιδίου παρατηρήθηκαν 6 αντικαταστάσεις νουκλεοτιδίων μεταξύ των απλότυπων των δύο ειδών, σε συνολικό μήκος ακολουθίας 1716 bp, κάτι που αντιπροσωπεύει ένα ποσοστό γενετικής διαφοροποίησης της τάξης του 0,35%. Ακόμη παρατηρήθηκαν τρία ελλείμματα. Όσον αφορά στις ακολουθίες του 28S γονιδίου (Εικόνα Γ2, Παράρτημα Γ), 98

113 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕΔΟ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ Εκόνα 4.1: Ευθυγράμμιση νουκλεοτιδικών αλληλουχιών των απλότυπων της περιοχής COI που μελετήθηκαν (MEDIT: Μεσογειακά S. officinalis και H. communis, GIBR 1-2: S. officinalis από την περιοχή του Γιβραλτάρ, Hlach: Hippospongia lachne EU237484, Istro: Ircinia strobilina GQ337013, Vacel: Vaceletia sp. EU237489). Figure 4.1: Sequence alignment of the studied haplotypes of the COI partition (MEDIT: Mediterranean S. officinalis and H. communis, GIBR 1-2: S. officinalis from Gibraltar region, Hlach: Hippospongia lachne EU237484, Istro: Ircinia strobilina GQ337013, Vacel: Vaceletia sp. EU237489). 99

114 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Εκόνα 4.2: Ευθυγράμμιση αμινοξικών αλληλουχιών των απλότυπων της περιοχής COI που μελετήθηκαν (MEDIT: Μεσογειακά S. officinalis και H. communis, GIBR 1-2: S. officinalis από την περιοχή του Γιβραλτάρ, Hlach: Hippospongia lachne EU237484, Istro: Ircinia strobilina GQ337013, Vacel: Vaceletia sp. EU237489). Figure 4.1: Amino acid alignment of the studied haplotypes of the COI partition (MEDIT: Mediterranean S. officinalis and H. communis, GIBR 1-2: S. officinalis from Gibraltar region, Hlach: Hippospongia lachne EU237484, Istro: Ircinia strobilina GQ337013, Vacel: Vaceletia sp. EU237489). παρατηρήθηκαν 4 αντικαταστάσεις σε συνολικό μήκος 356 bp (1,12% απόκλιση), καθώς και ένα έλλειμμα. Οι φυλογενετικές ανακατασκευές κατά ML και BI με βάση τους απλότυπους του δείκτη COI, εμφάνισαν ταυτόσημη τοπολογία (Εικόνα 4.3). Τρεις κύριοι κλάδοι σχηματίστηκαν: ένας για τους απλότυπους του Γιβραλτάρ, ένας δεύτερος που συγκεντρώνει τα Μεσογειακά άτομα των H. communis και S. officinalis μαζί με τα H. lachne και I. strobilina, και ένας τρίτος για το είδος Vaceletia sp. Οι τιμές bootstrap για όλους τους κλάδους ήταν μικρότερες από 90%, ενώ οι εκ των υστέρων πιθανότητες για την BI κυμάνθηκαν από 0,88 έως 1,00, με τη μέγιστη τιμή να υποστηρίζει το διαχωρισμό του κλάδου του Γιβραλτάρ. Τα φυλογενετικά δέντρα που κατασκευάστηκαν με τις μεθόδους NJ και MP (Εικόνα 4.4) εμφάνισαν μικρή διαφοροποίηση στην τοπολογία, με το δέντρο NJ να δείχνει ελαφρώς καλύτερη ανάλυση, τοποθετώντας το I. strobilina σε ένα διακριτό κλάδο με καλή υποστήριξη bootstrap (99,8%). Η διάκριση του κλάδου του Γιβραλτάρ παρέμεινε ισχυρή και με τα δύο κριτήρια (100,0% και 98,7% αντίστοιχα), ενώ ο κλάδος της Vaceletia δεν διαχωρίστηκε από τη βάση του δέντρου Συζήτηση Η ανάλυση του γονιδίου COI εμφάνισε μηδενική διαφοροποίηση, τόσο μεταξύ των δύο ειδών που εξετάστηκαν (H. communis και S. officinalis), όσο και μεταξύ των διαφορετικών περιοχών 100

115 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕΔΟ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ του Αιγαίου και της Νότιας Γαλλίας. Αυτό το εύρημα θα μπορούσε να οδηγήσει σε δύο υποθέσεις: είτε ο δείκτης COI δεν διαθέτει τον κατάλληλο πολυμορφισμό ώστε να επιτρέπει την διάκριση στο επίπεδο του είδους, ή όντως αντικατοπτρίζει μία υπαρκτή απουσία διαφοροποίησης ανάμεσα στα δείγματα που αναλύθηκαν. Τα χαμηλά επίπεδα πολυμορφισμού που εμφανίζει το τυπικό τμήμα του COI που χρησιμοποιείται σε εφαρμογές γραμμικής κωδικοποίησης στα κνιδόζωα και τους σπόγγους, τόσο σε ενδοειδικό επίπεδο όσο και μεταξύ ειδών, είναι κάτι που έχει επισημανθεί από τις απαρχές της χρήσης του ως δείκτη σε φυλογενετικές μελέτες. Οι Shearer et al. (2002) έχουν καταδείξει ένα ρυθμό εξέλιξης κατά φορές μειωμένο στα μιτοχονδριακά γονίδια των ανθοζώων σε σχέση με MEDIT GIBR1 GIBR2 Hlach Istro Vacel MEDIT GIBR1 GIBR2 Hlach Istro Vacel Πίνακας 4.2: Αντικαταστάσεις αμινοξέων (επάνω) και ζευγών βάσεων (κάτω) μεταξύ των α- πλότυπων της περιοχής COI που μελετήθηκαν. Table 4.2: Pairwise amino acid exchanges (upper section) and base pair exchanges (lower section) between the studied haplotypes of the CO1 partition. MEDIT:!$%&'() S. officinalis ('& H. communis, GIBR 1-2: S. officinalis '*+,-. */&$01,$2 3&4/'5,)/, Hlach: Hippospongia lachne EU237484, Istro: Ircinia strobilina GQ337013, Vacel: Vaceletia sp. EU MEDIT: Mediterranean S. officinalis ('& H. communis, GIBR 1-2: S. officinalis from Gibraltar region, Hlach: Hippospongia lachne EU237484, Istro: Ircinia strobilina GQ337013, Vacel: Vaceletia sp. EU MEDIT MEDIT GIBR1 GIBR2 Hlach Istro Πίνακας 4.3: Γενετικές αποστάσεις (p-distances) μεταξύ των α- πλότυπων της περιοχής COI που μελετήθηκαν. GIBR GIBR Hlach Table 4.3: Pairwise genetic divergence (as uncorrected p- distance) between the studied haplotypes of the CO1 partition Istro Vacel MEDIT:!$%&'() S. officinalis ('& H. communis, GIBR 1-2: S. officinalis '*+,-. */&$01,$2 3&4/'5,)/, Hlach: Hippospongia lachne EU237484, Istro: Ircinia strobilina GQ337013, Vacel: Vaceletia sp. EU MEDIT: Mediterranean S. officinalis ('& H. communis, GIBR 1-2: S. officinalis from Gibraltar region, Hlach: Hippospongia lachne EU237484, Istro: Ircinia strobilina GQ337013, Vacel: Vaceletia sp. EU

116 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Εκόνα 4.3: Φυλογενετικό δέντρο μέγιστης πιθανότητας (ML) και Μπεϊεζιανής πιθανολογίας (BI) για την περιοχή COI των ειδών που μελετήθηκαν (SPOF & HCOM Medit.: Μεσογειακά S. officinalis και H. communis, SPOF Gibr. 1-2: S. officinalis από τους σταθμούς 1 και 2 του Γιβραλτάρ), μαζί με άλλες αλληλουχίες από Spongiidae της ίδιας περιοχής (σημειώνεται ο κωδικός πρόσβασης στη GenBank). Οι αριθμοί πάνω από τους κλάδους δείχνουν τις τιμές bootstrap για το κριτήριο ML. Κάτω από τους κλάδους δίνονται οι τιμές ύστερης πιθανότητας BI. Figure 4.3: Maximum Likelihood (ML) and Bayesian Inference (BI) phylogenetic reconstruction for the COI partition of studied Spongia and Hippospongia species (SPOF & HCOM Medit.: Mediterranean S. officinalis και H. communis, SPOF Gibr. 1-2: S. officinalis from Gibraltar stations 1 and 2) alongside other Spongiidae sequences of the same region (GenBank accession numbers given). Numbers above branches indicate bootstrap values under ML criterion. Below branches are BI posterior probabilities. αυτόν που χαρακτηρίζει τα σπονδυλωτά. Στα περισσότερα ζωικά φύλα, εκτός των διπλοβλαστικών, η απόκλιση στις αλληλουχίες πρωτοδιάταξης του COI είναι πάντα μεγαλύτερη από 2% μεταξύ διακριτών ειδών του ίδιου γένους, ενώ οι μέσες τιμές είναι μεγαλύτερες από 10% (Hebert et al. 2003b). Οι Shearer & Coffroth (2008) όμως, εξετάζοντας ένα αντιπροσωπευτικό σύνολο δειγμάτων ειδών κοραλλιών του ίδιου γένους διαπίστωσαν ότι οι γενετικές αποστάσεις ήταν μικρότερες από 2% για τα περισσότερα ζεύγη ειδών, ενώ ένα μεγάλο μέρος τους δεν παρουσίασε καμία ένδειξη διαφοροποίησης. Ταυτόχρονα παρατήρησαν αξιοσημείωτα χαμηλά επίπεδα νουκλεοτιδικής ποικιλότητας μεταξύ ατόμων του ίδιου είδους (μέση τιμή 0,048%). Αντίστοιχα στους σπόγγους, χαμηλά επίπεδα ενδοειδικής γενετικής ποικιλότητας στον τυπικό δείκτη COI έχουν διαπιστωθεί σε έναν αριθμό σχετικών μελετών. Η μελέτη του είδους Crambe crambe στη Μεσόγειο και τον Ατλαντικό έδειξε πολύ μικρή ενδοειδική διαφοροποίηση σε επίπεδο νουκλεοτιδίων (π = 0,0006) ακόμα και μεταξύ απομακρυσμένων πληθυσμών με ενδιάμεση απόσταση km (Duran et al. 2004b). Μια παρόμοια μελέτη του σπόγγου Astrosclera willeyana αποκάλυψε τρεις μόνο απλότυπους σε όλο το εύρος της εξάπλωσης του είδους στον Ειρηνικό Ωκεανό (σε μήκος ακτογραμμής km), με μέγιστη γενετική απόσταση p = 0,0042 (Wörheide 2005). Παρομοίως, μικρή γενετική ποικιλότητα στο COI έχει πρόσφατα καταδειχθεί στα Dictyoceratida από τους Pöppe et al. (2010). Στη μελέτη αυτή, καταγράφεται η απουσία ενδοειδικής 102

117 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕΔΟ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ Εκόνα 4.4: Φυλογενετικά δέντρα που προέκυψαν (A) με τα κριτήρια σύνδεσης γειτόνων NJ και (Β) μέγιστης φειδολώτητας για την περιοχή COI των ειδών που μελετήθηκαν (SPOF & HCOM Medit.: Μεσογειακά S. officinalis και H. communis, SPOF Gibr. 1-2: S. officinalis από τους σταθμούς 1 και 2 του Γιβραλτάρ) μαζί με άλλες αλληλουχίες από Spongiidae της ίδιας περιοχής (σημειώνεται ο κωδικός πρόσβασης στη GenBank). Figure 4.4: Phylogenetic reconstructions under (A) Neigbor-Joining and (B) Parsimony criteria for the COI partition of studied Spongia and Hippospongia species (SPOF & HCOM Medit.: Mediterranean S. officinalis και H. communis, SPOF Gibr. 1-2: S. officinalis from Gibraltar stations 1 and 2) alongside other Spongiidae sequences of the same region (Gen- Bank accession numbers given). Numbers above branches are bootstrap values. διαφοροποίησης σε μια σειρά ειδών που ανήκουν στα γένη Ircinia και Psammocinia. Αξιοσημείωτη εξαίρεση αποτελεί η πρόσφατη πληθυσμιακή μελέτη του σπόγγου Callyspongia vaginalis στις ακτές της Φλόριντα (DeBiasse et al. 2010), όπου η χρήση του τυπικού τμήματος του COI αποδείχθηκε επαρκής για να ανιχνεύσει γεωγραφική γενετική διαφοροποίηση εντός του είδους. Παρά τα παραπάνω, στις περισσότερες μελέτες που εστιάζουν στη φυλογένεση σε επίπεδο είδους στους σπόγγους, το τυπικό τμήμα του COI έχει εκδηλώσει επαρκή πολυμορφισμό ώστε να επιτρέψει την αποτελεσματική διάκριση μεταξύ στενά συγγενικών ή κρυπτικών ειδών. Έτσι, σε μια μελέτη της φυλογένεσης του γένους Tethya με συνδυαστική χρήση μοριακών δεδομένων και μορφολογικών χαρακτήρων (Heim et al. 2007), το COI παρουσίασε εξαιρετική ανάλυση για τη διάκριση των ειδών και ανέδειξε την ανάγκη επαναξιολόγησης των μορφολογικών γνωρισμάτων. Οι Pöppe et al. (2010) αναφέρουν γενετικές αποστάσεις μεταξύ ειδών που φτάνουν τα 1,8 και 2,7% αντίστοιχα στα γένη Ircinia και Psammocinia (Dictyoceratida). Παρομοίως, διακριτή διαειδική διαφοροποίηση έχει διαπιστωθεί σε συμπάτρια κρυπτικά είδη του γένους Tedania για τα οποία 103

118 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ υπήρχαν ενδείξεις διαφοροποίησης βάσει οικολογικών χαρακτήρων (Wulff 2006). Κρυπτική ειδογένεση αποκαλύφθηκε επίσης στο γένος Scopalina, στο οποίο διαπιστώθηκε η ύπαρξη 3 νέων ειδών στη Μεσόγειο έναντι του ενός (Scopalina lophyropoda) που ήταν μέχρι πρότινος γνωστό (Blanquer & Uriz 2007). Στη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν παράλληλα και πυρηνικοί δείκτες, αλλά ο COI παρουσίασε μεγαλύτερη αναλυτική ικανότητα και ακρίβεια, όπως επίσης και απουσία αλληλεπικάλυψης μεταξύ ενδοειδικής και διαειδικής ποικιλότητας. Τα νέα είδη που αποκαλύφθηκαν με την προηγούμενη μελέτη επιβεβαιώθηκαν στη συνέχεια με ενδελεχή μορφολογική έρευνα (Blanquer & Uriz 2008). Παρόμοια αποτελέσματα, που όμως δεν έχουν τεκμηριωθεί μορφολογικά ακόμη, έχουν δοθεί από τους Xavier et al. (2010) για το γένος Cliona. Τέλος, σε μελέτη της οικογένειας Geodiidae, το COI χρησιμοποιήθηκε παράλληλα με τις περιοχές D1 & D2 του 28S rdna συμβάλλοντας στη διασαφήνιση φυλογενετικών θεμάτων και στην εκτίμηση της βαρύτητας των μορφολογικών ταξινομικών χαρακτήρων (Cárdenas et al. 2010). Οι συγγραφείς τονίζουν το παρόμοιο εξελικτικό πρότυπο που παρουσιάζουν οι δύο δείκτες, παρόλο που ο 28S (D1 & D2) εμφανίζει ελαφρώς ταχύτερο ρυθμό εξέλιξης (1,35Χ) έναντι του COI. Η απουσία ενδοειδικής ποικιλότητας, τόσο για το S. officinalis όσο και για το H. communis, που παρατηρήθηκε στα δεδομένα της παρούσας έρευνας μεταξυ περιοχών της Μεσογείου με ενδιάμεσες αποστάσεις που φτάνουν τα km, φανερώνει μια πιθανή ομοιογένεια των πληθυσμών στο μεγαλύτερο τμήμα της εξάπλωσης των ειδών αυτών. Αν και η παρουσία των πληθυσμών των ειδών που μελετήθηκαν είναι κατακερματισμένη και όχι συνεχής κατά μήκος της παράκτιας ζώνης, ο διαχωρισμός αυτός δεν είναι διακριτός σε γενετικό επίπεδο, τουλάχιστον όσον αφορά στον δείκτη COI. Εντούτοις, τα δείγματα του S. officinalis από το Γιβραλτάρ, που αντιπροσωπεύουν το δυτικό άκρο της εξάπλωσης του είδους, παρουσίασαν έναν έντονο διαχωρισμό που είναι φανερός τόσο στις αυξημένες τιμές γενετικής απόστασης (στο επίπεδο του 3%) όσο και στον ξεκάθαρο διαχωρισμό τους στις φυλογενετικές ανακατασκευές, με υψηλές τιμές υποστήριξης για όλα τα κριτήρια βελτιστότητας. Επιπρόσθετα, τα δείγματα από τους δύο υποσταθμούς που μελετήθηκαν στην περιοχή του Γιβραλτάρ, και χωρίζονται από απόσταση λίγων χιλιομέτρων, παρουσίασαν ένα βαθμό γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ τους (στο επίπεδο του 0,3%), ενώ διαχωρίζονται επίσης καλά σε όλα τα φυλογενετικά δέντρα. Με βάση τα παραπάνω, θα ήταν παράδοξο να υποθέσει κανείς ότι ο δείκτης COI μπορεί να ανιχνεύσει ποικιλότητα στα όρια της εξάπλωσης του είδους, αλλά όχι κατά μήκος της κύριας περιοχής εξάπλωσής του. Μια παρόμοια περίπτωση χαμηλής γενετικής ποικιλότητας με μικρές εντοπισμένες εξαιρέσεις έχει καταγραφεί για το σπόγγο Rhopaloeides odorabile στην περιοχή του Μεγάλου Κοραλλιογενούς Υφάλου (Whalan et al. 2008). Οι συγγραφείς εξέτασαν δείγματα εντός και μεταξύ των ατολλών, υποψιαζόμενοι ένα φραγμό στη γονιδιακή ροή μεταξύ των πληθυσμών. Παρόλα αυτά, οι αναλύσεις του COI και αλλοενζύμων έδειξαν ευρεία γενετική μίξη, με την εξαίρεση κάποιων μικρών γενετικών αποκλίσεων ανάμεσα σε τοπικούς πληθυσμούς που δεν αντιστοιχούν στο γενικότερο πρότυπο γεωγραφικής χωροθέτησης αλλά στην επικρατούσα κυκλοφορία των θαλάσσιων μαζών μεταξύ των υφάλων. Όσον αφορά τη διερεύνηση της διαειδικής ποικιλότητας με τον δείκτη COI στην παρούσα μελέτη, αξιοσημείωτη είναι η γενετική ομοιογένεια που παρατηρήθηκε μεταξύ των δειγμάτων των H. communis and S. officinalis, η οποία θέτει υπό αμφισβήτηση την εγκυρότητα δύο καθιερωμένων ειδών και γενών. Η ταυτοποίηση των δύο ειδών βάσει των χαρακτηριστικών του δικτύου σπογγίνης, όπως συνηθίζεται στα Dictyoceratida, παρουσιάζει ασάφειες λόγω έλλειψης ανόργανου σκελετού (Cook 2007). Ωστόσο, η διάκριση βάσει της εξωτερικής τους μορφολογίας είναι σχετικά 104

119 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕΔΟ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ σαφής (Pronzato & Manconi 2008) και είναι αυτή που συνήθως εφαρμόζεται στην πράξη. Η απουσία, εντούτοις, γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ των δύο ειδών, όπως διαφαίνεται από τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας, υποδηλώνει ότι αυτά αποτελούν κατά πάσα πιθανότητα μορφότυπους της ίδιας ταξινομικής μονάδας. Η τελευταία, σ αυτήν την περίπτωση, θα πρέπει να χαρακτηρίζεται από υψηλά επίπεδα φαινοτυπικής πλαστικότητας, ανταποκρινόμενη σε διαφορετικές συνθήκες του περιβάλλοντος. Η έντονη φαινοτυπική πλαστικότητα δεν αποτελεί ασύνηθες φαινόμενο στο φύλο των σπόγγων (Meroz-Fine et al. 2005, Palumbi 1984). Για παράδειγμα, πρόσφατα αμφισβητήθηκε η εγκυρότητα του διαχωρισμού δύο ειδών του σπόγγου Callyspongia και ενός αριθμού μορφοτύπων του C. vaginalis βάσει μοριακών δεδομένων (López- Legentil et al. 2010) τόσο οι μορφότυποι όσο και τα είδη αυτά διακρίνονταν μέχρι πρότινος βάσει έντονων διαφοροποιήσεων στην εξωτερική μορφολογία (χρώμα, σχήμα σώματος). Ειδικά για την περίπτωση του διαχωρισμού του Hippospongia όμως, που άπτεται και της παρούσας μελέτης, θα πρέπει να σημειωθεί ότι το γένος δεν είναι πλέον αποδεκτό στην περιοχή του Ινδο-Ειρηνικού και τα είδη που ήταν ενταγμένα σ αυτό έχουν μεταφερθεί σε άλλα γένη, μεταξύ των οποίων και το Spongia (Cook & Bergquist 2001, βλέπε Κεφάλαιο 1). Ένα δεύτερο αξιοσημείωτο εύρημα της παρούσας έρευνας είναι η διακριτή γενετική διαφοροποίηση των ατόμων που συλλέχθηκαν από το Γιβραλτάρ, τα οποία θα πρέπει να θεωρηθεί ότι ανήκουν σε ένα ξεχωριστό, άγνωστο μέχρι σήμερα είδος. Τα δείγματα αυτά είχαν καταταχθεί κατά το αρχικό στάδιο της μελέτης στο είδος S. officinalis, με βάση την εξέταση των εξωτερικών μορφολογικών τους χαρακτηριστικών αλλά και της δομής του σκελετού τους. Όμως η δομή του οργανικού σκελετού των Spongiidae και η απουσία ανόργανων σκληριτών καθιστά την ομάδα αυτή εξαιρετικά προβληματική από την άποψη της ταξινομίας (Cook 2007) και ευνοεί συνεπώς την ύπαρξη κρυπτικών ειδών. Η απόσταση της περιοχής του Γιβραλτάρ από τους υπόλοιπους σταθμούς της Μεσογείου που μελετήθηκαν και οι ιδιαίτερες υδρογραφικές συνθήκες που διαχωρίζουν τη Θάλασσα του Αλμποράν από την υπόλοιπη Μεσογειακή λεκάνη (Rohling et al. 2009), θα μπορούσαν να εγείρουν ένα φραγμό στη γονιδιακή ροή και, επακόλουθα, να προκαλέσουν αναπαραγωγική απομόνωση μεταξύ των πληθυσμών του Αλμποράν και της Μεσογείου, ευνοώντας την ειδογένεση. Οι τιμές της γενετικής απόστασης μεταξύ του Μεσογειακού κλάδου που περιλαμβάνει τα S. officinalis και H. communis από τη μία, και των δειγμάτων του Γιβραλτάρ από την άλλη, είναι απολύτως συγκρίσιμες με εκείνες μεταξύ του τελευταίου και των ειδών H. lachne και I. strobilina, που είναι και τα δύο έγκυρα είδη με εξάπλωση στις δυτικές ακτές του Ατλαντικού. Η ανακάλυψη κρυπτικών ειδών στους σπόγγους γίνεται όλο και συχνότερη με τις σύγχρονες μεθόδους γραμμικής κωδικοποίησης. Οι διαειδικές τιμές γενετικής απόστασης στους σπόγγους σπάνια φτάνουν το όριο του 10% που έχει προταθεί για τη διάκριση ειδών στα ανώτερα Μετάζωα (Hebert et al. 2003b), αλλά δεν είναι απαραίτητα χαμηλές, καθώς οι Xavier et al. (2010) αναφέρουν 6,2-8,4% COI απόκλιση αλληλουχιών μεταξύ τεσσάρων κλάδων του συμπλέγματος ειδών Cliona celata που εξαπλώνεται στη Μεσόγειο και το ΒΑ Ατλαντικό. Μια επίσης αξιοσημείωτη περίπτωση αποτελεί η εύρεση κρυπτικών ειδών του γένους Scopalina στη Μεσόγειο και το ΒΑ Ατλαντικό (Blanquer & Uriz 2007). Στην περίπτωση αυτή, νέα είδη (που παλαιότερα δεν μπορούσαν να αναγνωριστούν λόγω απουσίας ευδιάκριτων μορφολογικών διαφορών) βρέθηκαν να διαχωρίζονται με τιμές απόκλισης 13 έως 22%. Καθώς το Scopalina ζει σε κατακερματισμένα ενδιαιτήματα, παρουσιάζει φιλοπατρική συμπεριφορά και σχηματίζει ιδιαίτερα διαφοροποιημένους πληθυσμούς (Blanquer & Uriz 2010) η περίπτωσή του δείχνει ξεκάθαρα ότι τα 105

120 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ επίπεδα ποικιλότητας του mtdna στους σπόγγους δεν είναι κατ ανάγκη χαμηλά, αλλά οι διακυμάνσεις τους πιθανότατα αντανακλούν διαφοροποιήσεις στην εξελικτική ιστορία κάθε ταξινομικής ομάδας. Συνοψίζοντας τα αποτελέσματα, η παρούσα μελέτη της γενετικής ποικιλότητας σε Μεσογειακούς πληθυσμούς των ειδών σπόγγων μπάνιου H. communis and S. officinalis με χρήση του μοριακού δείκτη COI στο μιτοχονδριακό DNA, αποκάλυψε: (α) την απουσία γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ των δύο αυτών αποδεκτών μέχρι σήμερα ταξινομικών μονάδων στη Μεσόγειο, και συνεπώς την προτεινόμενη συνένωσή τους σε ένα κοινό είδος, (β) την ύπαρξη ενός κρυπτικού είδους που, πιθανότατα ανήκει στο γένος Spongia και εξαπλώνεται τουλάχιστον στην περιοχή του Γιβραλτάρ, και (γ) την ακαταλληλότητα του COI για τη διερεύνηση της πληθυσμιακής ποικιλότητας των ειδών που μελετήθηκαν στη Μεσόγειο, καταδεικνύοντας την ανάγκη χρήσης ενός πιο αναλυτικού μοριακού δείκτη για το σκοπό αυτό Βιβλιογραφία Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ, Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Evolution 215: Blanquer A, Uriz MJ, Cryptic speciation in marine sponges evidenced by mitochondrial and nuclear genes: a phylogenetic approach. Molecular Phylogenetics & Evolution 45: Blanquer A, Uriz MJ, Α posteriori searching for phenotypic characters to describe new cryptic species of sponges revealed by molecular markers (Dictyonellidae: Scopalina). Invertebrate Systematics 22: Blanquer A, Uriz MJ, Population genetics at three spatial scales of a rare sponge living in fragmented habitats. BMC Evolutionary Biology 10: 13 Borchiellini C, Chombard C, Manuel M, Alivon E, Vacelet J, Boury-Esnault N, Molecular phylogeny of Demospongiae: implications for classification and scenarios of character evolution. Molecular Phylogenetics & Evolution 32: Borchiellini C, Manuel M, Alivon E, Boury-Esnault N, Vacelet J, Le Parco Y, Sponge paraphyly and the origin of Metazoa. Journal Of Evolutionary Biology 14: Borchiellini C, Boury-Esnault N, Vacelet J, Le Parco Y, Phylogenetic analysis of the Hsp70 sequences reveals the monophyly of Metazoa and specific phylogenetic relationships between animals and fungi. Molecular Biology and Evolution 15: Cárdenas P, Rapp HT, Schander C, Tendal OS, Molecular taxonomy and phylogeny of the Geodiidae (Porifera, Demospongiae, Astrophorida) combining phylogenetic and Linnaean classification. Zoologica Scripta 39: Chombard C, Boury-Esnault N, Tillier S, Reassessment of homology of morphological characters in tetractinellid sponges based on molecular data. Systematic Biology 47:

121 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕΔΟ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ Cook SDC, Clarification of dictyoceratid taxonomic characters, and the determination of genera. In: Custódio MR, Lôbo-Hajdu G, Hajdu E, Muricy G (eds.), Porifera Research: biodiversity, innovation and sustainability. Série Livros 28, Museu Nacional, Rio de Janeiro, pp Cook SDC, Bergquist PR, New species of Spongia (Porifera: Demospongiae: Dictyoceratida) from New Zealand, and a proposed subgeneric structure. New Zealand Journal of Marine and Freshwater Research 35: DeBiasse MB, Richards VP, Shivji MS, Genetic assessment of connectivity in the common reef sponge Callyspongia vaginalis (Demospongiae: Haplosclerida) reveals high population structure along the Florida reef tract. Coral Reefs 29: Duran S, Giribet G, Turon X, 2004a. Phylogeographic history of the sponge Crambe crambe (Porifera: Poecilosclerida): range expansion and recent invasion of the Macaronesian islands from Mediterranean Sea. Molecular Ecology 13, Duran S, Pascual M, Turon X, 2004b. Low levels of genetic variation in mtdna sequences over the western Mediterranean and Atlantic range of the sponge Crambe crambe (Poecilosclerida). Marine Biology 144: Erpenbeck D, Breeuwer JAJ, van der Velde HC, van Soest RWM, Unravelling host and symbiont phylogenies of halichondrid sponges (Demospongiae, Porifera) using a mitochondrial marker. Marine Biology 141: Erpenbeck D, Breeuwer JAJ, van Soest RWM, Identification, characterization and phylogenetic signal of an elongation factor-1 alpha fragment in demosponges (Metazoa, Porifera, Demospongiae). Zoologica Scripta 34: Erpenbeck D, Hooper JNA, Wörheide G, CO1 phylogenies in diploblasts and the 'Barcoding of Life' are we sequencing a suboptimal partition? Molecular Ecology Notes 6: Erpenbeck D, Duran S, Rützler K, Paul V, Hooper JNA, Wörheide G, Towards a DNA taxonomy of Caribbean demosponges: a gene tree reconstructed from partial mitochondrial CO1 gene sequences supports previous rdna phylogenies and provides a new perspective on the systematics of Demospongiae. Journal of the Marine Biological Association of the UK 87: Folmer O, Black M, Hoeh W, Lutz R, Vrijenhoek R, DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Molecular Marine Biology & Biotechnology 3: Hall TA, BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series 41: Hebert PDN, Cywinska A, Ball SL, dewaard JR, 2003a. Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings Of The Royal Society B: Biological Sciences 270, Hebert, PDN, Ratnasingham S, dewaard JR, 2003b. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings Of The Royal Society B: Biological Sciences 270, S96-S99 107

122 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Heim I, Nickel M, Brümmer F, Phylogeny of the genus Tethya (Tethyidae: Hadromerida: Porifera): molecular and morphological aspects. Journal of the Marine Biological Association of the UK 87: Kelly-Borges M, Bergquist PR, Bergquist PL, Phylogenetic relationships within the order Hadromerida (Porifera, Demospongiae, Tetractinomorpha) as indicated by ribosomal RNA sequence comparisons. Biochemical Systematics and Ecology 19: Lafay B, Boury-Esnault N, Vacelet J, Christen R, An analysis of partial 28S ribosomal RNA sequences suggests early radiations of sponges. BioSystems 28: López-Legentil S, Pawlik JR, Genetic structure of the Caribbean giant barrel sponge Xestospongia muta using the I3-M11 partition of COI. Coral Reefs 28: López-Legentil S, Erwin PM, Henkel TP, Loh TL, Pawlik JR, Phenotypic plasticity in the Caribbean sponge Callyspongia vaginalis (Porifera: Haplosclerida). Scientia Marina 74: Meroz-Fine E, Shefer S, Ilan M, Changes in morphology and physiology of an East Mediterranean sponge in different habitats. Marine Biology 147: Meyer CP, Geller JB, Paulay G, Fine scale endemism on coral reefs: archipelagic differentiation in turbinid gastropods. Evolution 59: Nichols SA, Barnes PAG, A molecular phylogeny and historical biogeography of the marine sponge genus Placospongia (Phylum Porifera) indicate low dispersal capabilities and widespread crypsis. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 323: 1-15 Nylander JAA, MrModeltest, Ver. 2.2 [Computer software and manual]. Uppsala: Evolutionary Biology Centre, Uppsala University. Palumbi SR, Tactics of acclimation: morphological changes of sponges in an unpredictable environment. Science 225: Pöppe J, Sutcliffe P, Hooper JNA, Wörheide G, Erpenbeck D, COI barcoding reveals new clades and radiation patterns of Indo-Pacific sponges of the family Irciniidae (Demospongiae: Dictyoceratida). PLoS ONE 5(4): e9950 Posada D, jmodeltest: phylogenetic model averaging. Molecular Biology & Evolution 25: Pronzato R, Manconi R, Mediterranean commercial sponges: over 5000 years of natural history and cultural heritage. Marine Ecology 29: Redmond NE, McCormack GP, Ribosomal internal transcribed spacer regions are not suitable for intra- or inter-specific phylogeny reconstruction in haplosclerid sponges (Porifera: Demospongiae). Journal of the Marine Biological Association of the UK 89: Rohling EJ, Abu-Zied RH, Casford JSL, Hayes A, Hoogakker BAA, The marine environment: present and past. In: Woodward JC (ed.), The Physical Geography of the Mediterranean. Oxford University Press, Oxford, pp Ronquist F, Huelsenbeck JP, MrBayes3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics 19,

123 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕΔΟ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ Shearer TL, Coffroth MA, Barcoding corals: limited by interspecific divergence, not intraspecific variation. Molecular Ecology Resources 8: Shearer TL, Van Oppen MJH, Romano SL, Wörheide G, Slow mitochondrial DNA sequence evolution in the Anthozoa (Cnidaria). Molecular Ecology 11: Solé-Cava AM, Thorpe JP, Genetic differentiation between morphotypes of the marine sponge Suberites ficus (Demospongiae: Hadromerida). Marine Biology 93: Solé-Cava AM, Klautau M, Boury-Esnault N, Borojevic R, Thorpe JP, Genetic evidence for cryptic speciation in allopatric populations of two cosmopolitan species of the calcareous sponge genus Clathrina. Marine Biology 111: Solé-Cava AM, Boury-Esnault N, Vacelet J, Thorpe JP, Biochemical genetic divergence and systematics in sponges of the genera Corticium and Oscarella (Demospongiae: Homoscleromorpha) in the Mediterranean Sea. Marine Biology 113: Swofford DL, PAUP* Phylogenetic Analysis Using Parsimony (* and Other Methods), Ver beta 10 [Computer software and manual]. Sinauer Associates, Sunderland, MA Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ, CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acid Research 22: Whalan S, de Nys R, Smith-Keune C, Evans BS, Battershill C, Jerry DR, Low genetic variability within and among populations of the brooding sponge Rhopaloeides odorabile on the central Great Barrier Reef. Aquatic Biology 3(2): Wörheide G, Low variation in partial cytochrome oxidase subunit I (COI) mitochondrial sequences in the coralline demosponge Astrosclera willeyana across the Indo-Pacific. Marine Biology 148(5): Wörheide G, Nichols SA, Goldberg J, Intragenomic variation of the rdna internal transcribed spacers in sponges (Phylum Porifera): implications for phylogenetic studies. Molecular Phylogenetics & Evolution 33: Wulff J, Sponge systematics by starfish: predators distinguish cryptic sympatric species of Caribbean fire sponges, Tedania ignis and Tedania klausi n.sp. (Demospongiae, Poecilosclerida). The Biological Bulletin 211: Xavier JR, Rachello-Dolmen PG, Parra-Velandia F, Schönberg CHL, Breeuwer JAJ, van Soest RWM, Molecular evidence of cryptic speciation in the cosmopolitan excavating sponge Cliona celata (Porifera, Clionaidae). Molecular Phylogenetics & Evolution 56:

124

125 Κεφάλαιο 5 ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ

126

127 5. Ανάλυση της γενετικής ποικιλότητας των πληθυσμών 5.1. Εισαγωγή Το μικροδορυφορικό DNA έχει βρει εκτεταμένη χρήση τις τελευταίες δύο δεκαετίες ως ένας ευέλικτος και ισχυρός μοριακός δείκτης που μπορεί να εφαρμοστεί για τη διερεύνηση μιας ποικιλίας ερωτημάτων που αφορούν στην εφαρμοσμένη οικολογία (Πίνακας 5.1). Οι μικροδορυφορικοί τόποι εμφανίζονται σε υψηλές συχνότητες στο γονιδίωμα των περισσότερων ταξινομικών ομάδων (Tóth et al. 2000). Γνωστοί επίσης και ως SSRs (Simple Sequence Repeats), STRs (Short Tandem Repeats) ή VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats), αποτελούνται από διαδοχικές επαναλήψεις μιας μικρής ακολουθίας ενός έως έξι νουκλεοτιδίων. Ο αριθμός των επαναλήψεων αυτών μπορεί να κυμαίνονται από πέντε έως περίπου εκατό. Οι περιοχές των επαναλήψεων περιβάλλονται από περιμετρικές κωδικοποιούσες ή μη ακολουθίες DNA (flanking regions), οι οποίες είναι συνήθως συντηρημένες. Μερικά παραδείγματα μικροδορυφορικών τόπων δίνονται στην Εικόνα 5.1. Το κύριο χαρακτηριστικό που καθιστά τους μικροδορυφορικούς τόπους κατάλληλους ως δείκτες για τη διερεύνηση της γενετικής ποικιλότητας είναι ο πολυμορφισμός τους (Tautz 1989). Ο υψηλός ρυθμός μεταλλάξεων που παρατηρείται στις περιοχές αυτές του γονιδιώματος (Bhargava & Fuentes 2010) καταλήγει σε ποικιλότητα μεταξύ ατόμων του ίδιου είδους, που εκδηλώνεται ως πολυμορφισμός στο μήκος των αλληλουχιών. Ο υψηλός βαθμός και η συχνότητα του πολυμορφισμού αυτού, καθιστά το μικροδορυφορικό DNA εξαιρετικά χρήσιμο σε πληθυσμιακές μελέτες και σε οποιοδήποτε ερώτημα σχετίζεται με τη διερεύνηση της γενετικής ποικιλότητας σε λεπτομερές επίπεδο (Goldstein et al. 1999). Συνήθως ένα σύνολο μικροδορυφορικών τόπων (5 έως 10, ή και περισσότεροι) αναλύονται ταυτόχρονα, ώστε να μειωθεί το δειγματοληπτικό σφάλμα που θα μπορούσε να υπάρχει, καθώς κάθε τόπος διαφοροποιείται ως προς την αναλυτική ικανότητά του. Επιπλέον, μια τέτοια προσέγγιση επιτρέπει πιο αξιόπιστες στατιστικές αναλύσεις (Davies et al. 1999). Οι μικροδορυφορικοί τόποι θεωρούνται γενικά ουδέτεροι ως προς την εξελικτική επιλογή, έχουν συγκυρίαρχη (codominant) συμπεριφορά και ακολουθούν τους Μενδελικούς νόμους της κληρονομικότητας. Τα χαρακτηριστικά αυτά είναι επιθυμητά σε ένα μοριακό δείκτη. Το κύριο μειονέκτημά τους είναι ότι συνήθως είναι αναγκαίο να αναπτύσσονται de novo για κάθε είδος οργανισμού που πρόκειται να μελετηθεί για πρώτη φορά (Zane et al. 2002). Αυτό απορρέει από το γεγονός ότι οι μικροδορυφορικοί τόποι συχνά εντοπίζονται σε μη-κωδικοποιούσες περιοχές του γονιδιώματος, κι έτσι οι περιμετρικές περιοχές που χρησιμοποιούνται για την ανάπτυξη των εκκινητών συχνά δεν είναι αρκετά συντηρημένες ώστε να επιτρέπουν διαειδική ενίσχυση (crossamplification) μεταξύ διαφορετικών ταξινομικών μονάδων. Ένα δεύτερο μειονέκτημα του μικροδορυφορικού DNA είναι ότι δεν υπάρχει ένα καθολικά αποδεκτό μοντέλο που να περιγράφει τον μηχανισμό των μεταλλάξεων που καθορίζει τον πολυμορφισμό του. Αντιθέτως, είναι ακόμη υπό συζήτηση ο σχετικός ρόλος των δύο κύριων μεταλλακτικών μοντέλων IAM (Infinite Allele Model) και SMM (Stepwise Mutation Model) (Bhargava & Fuentes 2010, Ellegren 2004). Μικροδορυφορικοί δείκτες έχουν αναπτυχθεί και χρησιμοποιηθεί σε πληθυσμιακές μελέτες για αρκετά θαλάσσια ασπόνδυλα (π.χ. Baums et al. 2005, Addison & Hart 2004, Le Goff-Vitry et al. 113

128 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Πίνακας 5.1: Περίληψη ενδεικτικών οικολογικών ερωτημάτων που μπορούν να απαντηθούν με χρήση πολλαπλών γενετικών δεικτών, κατά κύριο λόγο μικροδορυφορικών, ανάλογα με τις απαιτήσεις τους σε δεδομένα (από Selkoe & Toonen 2006). Table 5.1: Summary of the main ecological questions that can be addressed using multilocus genetic markers (e.g. microsatellite DNA). From Selkoe & Toonen !$%µ&$& '() &'&*$(+, -.-(µ/,& 0)1,2$3$&4 &5535(µ26, 7*& '(55&'5(+4 µ*8(-()6(*8(+4 $2'()4!$ %&'( )*+,-.µ/$ ()/ 0' )& )1213'0( 0( %4%0(5/µ%'( 60µ(;!/. 7(810& )*+,-.µ& -)613-'; 2.!$%µ&$& '() &'&*$(+, µ*8(-()6(*8( $.4 % /,$(,& '(5)µ(6*8/4,()85.($*-*8/4 &5535()19.4 9)2.0+.(' %4%0(5/µ%' )*+,-.µ& :('/µ%'( (;4+.+$ <.-11&8'=.+$.0 )1/.:(0 )(1%*,/'; >(:21-'.+µ%1'& %4%0(5/µ%' )*+,-.µ&.% µ2?%,$.3%086 µ% 0 )(1%*,/'; 3.!$%µ&$& '() &'&*$(+, '(0-*(*0µ2 7.,($+', 7*& '(55&'5(+4 µ*8(-()6(*8(+4 $2'()4!( %&'( +?%'%08<.-??2'%( µ%0(4; 0=' %4%0(5/µ%'=' (0/µ=';!( ()/ 0( %4%0(5/µ%'( 60µ( 23-' µ%0(8'+,%& ()/ 0+' (138< 0-$,2.+; (.% )%16µ(0(.<µ('.+$ 8( %)('(.;**+@+$)!( ()/ 0( %4%0(5/µ%'( 60µ( %&'( 8*A'; 4.!$%µ&$& '() µ'((+,,& &'&,$3:(+, µ. &8.$;.9-3 µ(*&8<, -.*8$<, (0)µ'.*5&µ=&,(µ/,, $, µ*8(-()6(*8<,).!( %&'( + ()/.0(.+ 7(.)16$ 0=' ()?/'=' (< 0='?(µ%0A');!=$ %)+1%65-' 0(?%=?1(:86 3(1( A1-0+' ()µ/'=.+ 0=' )*+,-.µa' 8( 0+ µ%0('6.0%-.+; 9)<14(' (**(?2$.0+?%'%08< ()µ/'=.+ < %)8'='&( µ%0(4; )*+,-.µa'.0 )(1%*,/'; 2004, Guitierrez-Rodriguez & Lasker 2004). Στο φύλο των Ποροφόρων, μικροδορυφορικοί τόποι έχουν αναπτυχθεί για 6 είδη (Πίνακας 5.2), ενώ οι μόνες πληθυσμιακές μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί με μικροδορυφορικούς δείκτες στους σπόγγους είναι εκείνες των Blanquer et al. (2009) και Blanquer & Uriz (2010). Οι πρώτοι συγγραφείς παρατήρησαν ισχυρή γενετική διαφοροποίηση μεταξύ και εντός των πληθυσμών στο είδος Crambe crambe, διερευνώντας ένα δείγμα από 11 τοποθεσίες στη γεωγραφική περιοχή της δυτικής Μεσογείου και του ανατολικού Ατλαντικού η γενετική διαφοροποίηση συνοδευόταν από την έντονη παρουσία κλωνικών ατόμων, υποδηλώνοντας την ύπαρξη αγενούς αναπαραγωγής. Η δεύτερη μελέτη αφορούσε στο είδος Scopalina lophyropoda, το οποίο είναι σπάνιο και χαρακτηρίζεται από φυσικά κατακερματισμένους πληθυσμούς (σε αντίθεση με το C. crambe που είναι πολύ κοινό και με συνεχή εξάπλωση) αποκάλυψε εξίσου υψηλά επίπεδα δια- και ενδοπληθυσμιακής συγκρότησης (structure), αλλά πολύ μικρή συμμετοχή κλωνικών ατόμων στο συνολικό πληθυσμό. Η γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των πληθυσμών αποδόθηκε σε περιορισμένη διασπορά προνυμφών και γαμετών και η υπόθεση αυτή επαληθεύτηκε πειραματικά και για τα δύο είδη. 114

129 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ! Sequence:!!!!!!!!! Repeat Motif:! A! ccgttacgtagtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtaacgactcg...-3!! (GT)11 B! accgacttcacgacgacgacgacgacgacgacgttgtactg...-3!! (CGA)7 C! ttgtacacacacacacgatcctgctgccacacacacgtcct...-3!! (AC)6(AC)4 Εικόνα 5.1: Παραδείγματα αλληλουχιών μικροδορυφορικών περιοχών στο γονιδίωμα. Οι περιοχές που αντιστοιχούν στις ολιγονουκλεοτιδικές επαναλήψεις επισημαίνονται με κόκκινο χρώμα, ενώ οι περιμετρικές περιοχές (flanking regions) με πράσινο. A: συνεχής δινουκλεοτιδική επανάληψη, B: συνεχής τρινουκλεοτιδική επανάληψη, C: ασυνεχής δινουκλεοτιδική επανάληψη. Figure 5.1: Examples of microsatellite loci showing actual sequence and repeat motif, as well as repeat regions (red color) and flanking regions (green color). A: dinucleotide, perfect; B: trinucleotide, perfect; C: dinucleotide, imperfect. Το θαλάσσιο περιβάλλον εκλαμβάνεται συχνά ως ένα συνεχές μέσο που ευνοεί τη γονιδιακή ροή (gene flow) μεταξύ των πληθυσμών που το κατοικούν. Αυτή η αντίληψη όμως έχει εξίσου συχνά τεθεί υπό αμφισβήτηση, καθώς η εξάπλωση, ιδιαίτερα σε οργανισμούς που χαρακτηρίζονται από τουλάχιστον μία πλαγκτονική φάση, ή διαθέτουν μονάδες διασποράς (propagules), επηρεάζεται έντονα από τα ρεύματα και μπορεί να παρεμποδίζεται από φυσικούς φραγμούς όπως για παράδειγμα οι διαβαθμισμένες μεταβολές της αλατότητας ή της θερμοκρασίας. Αυτό το επιχείρημα έχει επιβεβαιωθεί από γενετικές μελέτες σε θαλάσσιους οργανισμούς με ισχυρή πληθυσμιακή συγκρότηση (π.χ. DeBiasse et al σε σπόγγους Pérez-Portela & Turon 2008 σε σύνθετα ασκίδια Vollmer & Palumbi 2007 σε κοράλλια). Υπάρχουν, ωστόσο, και ευρήματα υπέρ της πρώτης άποψης, που καταδεικνύουν υψηλά επίπεδα διασύνδεσης μεταξύ πληθυσμών (π.χ. Hemond & Vollmer 2010). Συνεπώς, ο τρόπος διασποράς των θαλάσσιων οργανισμών φαίνεται να διαμορφώνεται από τάσεις και βιολογικά χαρακτηριστικά που διαφέρουν σε κάθε ταξινομική ομάδα. Οι σπόγγοι είναι εδραίοι στην ενήλικη φάση τους, γεγονός που σημαίνει ότι η ικανότητά τους για διασπορά περιορίζεται στα στάδια των γαμετών και των πελαγικών προνυμφών τους. Η αποκοπή κομματιών αποτελεί ένα εναλλακτικό τρόπο διασποράς, καθώς τα κομμάτια των ατόμων δύνανται να μεταφερθούν με τα ρεύματα και να εγκατασταθούν σε νέες περιοχές. Η προώθηση προϊόντων εγγενούς αναπαραγωγής, με τη μορφή τμημάτων σπόγγων που φέρουν έμβρυα, έχει επίσης προταθεί ως ένας τρόπος διασποράς (Maldonado & Uriz 1999), ωστόσο η έκταση στην οποία κάτι τέτοιο συμβαίνει στις διάφορες ταξινομικές ομάδες δεν είναι γνωστή. Οι στόχοι αυτού του τμήματος της εργασίας συνοψίζονται στα παρακάτω: (α) Ανάπτυξη ενός σετ μικροδορυφορικών δεικτών ειδικών για τα Μεσογειακά είδη σπόγγων μπάνιου Spongia officinalis και Hippospongia communis. (β) Εκτίμηση της γενετικής ποικιλότητας που χαρακτηρίζει τα άτομα των ειδών αυτών. (γ) Ανίχνευση του βαθμού γενετικής διαφοροποίησης και γονιδιακής ροής μεταξύ πληθυσμών κατά μήκος της κύριας εξάπλωσης των δύο ειδών στη Μεσόγειο. (δ) Διερεύνηση περαιτέρω ενδείξεων για τη διαφοροποίηση σε επίπεδο ταξινομίας μεταξύ των δύο ειδών. 115

130 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Πίνακας 5.2: Δημοσιευμένοι μικροδορυφορικοί δείκτες για είδη του φύλου Porifera και χαρακτηριστικά του κάθε τόπου. Table 5.2: Published sets of microsatellite loci for poriferan species.!$% &'(()*+,% -).,./012 3$04$,5*267898% Crambe crambe Halichondria panicea Scopalina lophyropoda Hymeniacidon sinapium Spongia agaricina Spongia officinalis Duran et al GT, AC, TC, GA, AATT Knowlton et al GT, AC Blanquer et al GT, AC, GA Hoshino & Fujita GT, AC Noyer et al GT, AC, CAA Dailianis & Tsigenopoulos GT, AC 5.2. Μέθοδοι και Υλικά Απομόνωση και χαρακτηρισμός των μικροδορυφορικών δεικτών Για την ανάπτυξη μικροδορυφορικών δεικτών στο είδος Spongia officinalis χρησιμοποιήθηκε με τροποποιήσεις ένα πρωτόκολλο εμπλουτισμού (Tsagkarakou & Roditakis 2003, Tsigenopoulos et al. 2003) που περιγράφεται σχηματικά στην Εικόνα 5.2. Ένα άτομο S. officinalis, προερχόμενο από έναν πληθυσμό στο Κολυμπάρι της Δυτικής Κρήτης (N 35 o / E 23 o ) αποτέλεσε την πηγή του γενετικού υλικού που χρησιμοποιήθηκε. α. Κατασκευή γονιδιωματικής βιβλιοθήκης Το τμήμα του οργανισμού που χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση του DNA ελέγχθηκε προσεκτικά σε οπτικό στερεομικροσκόπιο για να επιβεβαιωθεί ότι δεν φιλοξενούσε συμβιωτικούς μακροπανιδικούς οργανισμούς που θα μπορούσαν να επιμολύνουν το εξαχθέν γενετικό υλικό. Το γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε με τη βοήθεια του DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen) σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή (Εικόνα 5.2, βήμα 1). Στη συνέχεια, δέκα μικρογραμμάρια από το απομονωμένο DNA χρησιμοποιήθηκαν σε αντίδραση πέψης με 50 U του ενζύμου περιορισμού Rsa Ι (Minotech), με ένα αρχικό στάδιο επώασης στους 37 C για 2 ώρες, προσθήκη 10 U ενζύμου και επακόλουθη επώαση στην ίδια θερμοκρασία για άλλες 18 ώρες. Το ένζυμο Rsa Ι αποκόπτει το DNA στις θέσεις GT/AC. Οι παράγωγες τμηματικές αλυσίδες απομονώθηκαν από το μίγμα της αντίδρασης με χρήση του NucleoSpin Extract kit (Macherey- Nagel) (Εικ. 3.2, βήμα 2) και διαχωρίστηκαν σε κλάσεις μεγέθους με τη διαδικασία της ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης. Η περιοχή του πηκτώματος που περιείχε το κλάσμα με μέγεθος bp, που είναι το βέλτιστο για την φιλοξενία και ανάπτυξη μικροδορυφορικών περιοχών, αποκόπηκε και χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση των επιλεγμένων θραυσμάτων 116

131 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ DNA με χρήση του NucleoSpin Extract kit (Εικόνα 5.2, βήμα 3). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε σύνδεση δίκλωνων συζευκτών (linkers) στα άκρα των παραπάνω θραυσμάτων (Εικόνα 5.2, βήμα 4). O συζεύκτης που χρησιμοποιήθηκε αποτελείται από δύο συμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια (Rsa21: 5 -CTCTTGCTTACGCGTGGACTA-3 και Rsa25: Pho-5 -TAGTCCACGCGTAAGCAAGAGCACA-3 ) και έχει ένα φωσφορυλιωμένο λείο άκρο από τη μία μεριά ενώ από την αντίθετη φέρει μία μονόκλωνη προέκταση τεσσάρων βάσεων (-CACA). Για την αντίδραση χρησιμοποιήθηκαν 3 μg DNA σπόγγου και 1 nm συζευκτών, και ως καταλύτης το ένζυμο T4 DNA ligase (New England Biolabs). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε τρία στάδια επώασης μειούμενης θερμοκρασίας (1½ ώρα στους 37 C, 2 ώρες στους 16 C και 16 ώρες στους 4 C. Ακολούθησε μία διαδικασία επιλεκτικού υβριδισμού του συμπλόκου των θραυσμάτων DNA και των συζευκτών με ολιγονουκλεοτίδια αποτελούμενα από 12 επαναλήψεις του δινουκλεοτιδίου AC, τα οποία έφεραν στο 3 άκρο τους ένα μόριο βιοτίνης (Εικόνα 5.2, βήματα 5-6). Για το σκοπό αυτό προηγήθηκε ένα βήμα αποδιάταξης της διπλής αλυσίδας στους 95 C για 15 λεπτά και στη συνέχεια έγινε ο υβριδισμός σε ρυθμιστικό διάλυμα 0,5x SSC στους 60 C για 120 λεπτά. Τα σύμπλοκα θραυσμάτων του γονιδιώματος με επαναλήψεις AC και των ολιγονουκλεοτιδίων προσλήφθηκαν από το διάλυμα με χρήση παραμαγνητικών σφαιριδίων MagneSphere (Promega), τα οποία φέρουν επικάλυψη στρεπταβιδίνης. Η τελευταία σχηματίζει ισχυρό δεσμό με τη βιοτίνη των ολιγονουκλεοτιδίων (AC)12, οπότε στην ουσία σχηματίζονται σύμπλοκα μαγνητικών σωματιδίων και γονιδιωματικών θραυσμάτων που περιέχουν τις επιθυμητές μικροδορυφορικές αλληλουχίες (Εικόνα 5.2, βήμα 7). Το σύμπλοκο αυτό κατακρατήθηκε με χρήση ενός μαγνήτη και ξεπλύθηκε τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα 0,1x SSC. Στη συνέχεια το DNA απελευθερώθηκε από τα σφαιρίδια με τρεις διαδοχικές εκλούσεις με υπερκάθαρο νερό στους 50 C (Εικόνα 5.2, βήματα 8-9). Το αποτέλεσμα της παραπάνω διαδικασίας είναι μια γονιδιωματική βιβλιοθήκη του οργανισμού, εμπλουτισμένη σε θραύσματα μεγέθους bp που περιέχουν μικροδορυφορικές επαναλήψεις του τύπου (AC)Ν (Εικόνα 5.2, βήμα 9). Τα μονόκλωνα θραύσματα αυτά τροποποιήθηκαν σε δίκλωνα με PCR, χρησιμοποιώντας το ολιγονουκλεοτίδιο Rsa21 ως μόνο εκκινητή (Εικόνα 5.2, βήμα 10). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο 50 μl που περιείχε 1 μm του εκκινητή, 0,2 mm dntps, 1,5 mm MgCl2, 2,5 U Taq και 10 μl του προϊόντος έκλουσης. Ένα αρχικό βήμα 1 λεπτού στους 94 C προηγήθηκε και 30 κύκλοι των 93 C για 45 δευτ., 56 C για 45 δευτ. και 72 C για 105 δευτ. ακολούθησαν, με τελικό βήμα επιμήκυνσης 5 λεπτών στους 72 C. Τα προϊόντα της PCR εισήχθησαν σε βακτηριακά πλασμίδια και χρησιμοποιήθηκαν για τη διαδικασία κλωνοποίησης σε επιδεκτικά κύτταρα του Escherichia coli. Η διαδικασία αυτή πραγματοποιήθηκε με το TOPO TA Cloning kit (Invitrogen). Η καλλιέργεια των μεταμορφωμένων βακτηρίων έγινε σε άγαρ LB στο οποίο είχε προστεθεί το αντιβιοτικό καναμυκίνη (Εικόνα 5.2, βήματα 11-12). Το πλασμιδιακό DNA απομονώθηκε από τις ανασυνδυασμένες αποικίες με λύση των κυττάρων στους 98 C για 5 λεπτά και επακόλουθη φυγοκέντρηση στα 3200 g για 5 λεπτά για την απομάκρυνση των παραπροϊόντων λύσης (Εικόνα 5.2, βήμα 13), με τελικό αποτέλεσμα 246 ανασυνδυασμένα πλασμίδια προς περαιτέρω ανάλυση. β. Εύρεση της πρωτοδιάταξης των μικροδορυφορικών περιοχών Τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια ελέγχθηκαν για την ύπαρξη των επαναλήψεων AC με PCR, χρησιμοποιώντας τρεις εκκινητές: τους πλασμιδιακούς εκκινητές T7 και Sp6, καθώς και ένα ολιγονουκλεοτίδιο (AC)11. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε τελικό όγκο 20 μl που περιείχε 117

132 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Εικόνα 5.2: Σχηματική απεικόνιση του πρωτόκολλου εμπλουτισμού που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα έρευνα για την απομόνωση των μικροδορυφορικών τόπων από το είδος Spongia officinalis. Οι περιοχές ολιγονουκλεοτιδικών επαναλήψεων σημειώνονται με κόκκινο χρώμα. Βασισμένη σε μια εικόνα των Zane et al. (2002). Figure 5.2: Schematic representation of the enrichment protocol used in the present study for the isolation of microsatellite loci from Spongia officinalis. Short sequence repeats are indicated with red color. Modified from an illustration in Zane et al

133 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ 0,5 μm κάθε εκκινητή, 0,2 mm dntps, 1,5 mm MgCl 2 και 1 U Taq. Ένα αρχικό βήμα 3 λεπτών στους 94 C προηγήθηκε και 35 κύκλοι των 94 C για 60 δευτ., 48 C για 60 δευτ. και 72 C για 60 δευτ. ακολούθησαν, με τελικό βήμα επιμήκυνσης 5 λεπτών στους 72 C. Στην περίπτωση που το πλασμίδιο που χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο εμπεριέχει κατάλληλο μικροδορυφορικό ένθεμα, η παραπάνω ενίσχυση δίνει τρία διακριτά προϊόντα: ένα μεταξύ των εκκινητών T7 και Sp6 και δύο μεταξύ του εκκινητή (AC)11 και καθενός απο τους άλλους δύο. Με αυτό το σκεπτικό, τα προϊόντα των PCR για τα 246 ανασυνδυασμένα πλασμίδια ελέγχθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης για την επιλογή των βέλτιστων για το επόμενο στάδιο (Εικόνα 5.3). Κατά την επιλογή προτιμήθηκαν οι περιπτώσεις όπου τα τρία διακριτά προϊόντα διέφεραν στο μέγεθος κατά τουλάχιστον 100 bp, ούτως ώστε η επαναλαμβανόμενη αλληλουχία να αφήνει περιθώριο για το σχεδιασμό των εκκινητών. Συνολικά 91 αντίγραφα επιλέχθηκαν για ανάγνωση της πρωτοδιάταξης. Η προετοιμασία των προϊόντων ενίσχυσης για την ανάγνωση της πρωτοδιάταξης (sequencing) του DNA, έγινε με το προϊόν BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (ABI) σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή, χρησιμοποιώντας τους πλασμιδιακούς εκκινητές T7 και Sp6. Η ανάγνωση κάθε αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε και από τις δύο κατευθύνσεις. Η διαδικασία ανάγνωσης της πρωτοδιάταξης έγινε σε αυτόματο αναλυτή ABI PRISM 3700 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) και οι πρωτοδιατάξεις ελέγχθηκαν και διορθώθηκαν με το λογισμικό BioEdit (Hall 1999) (Εικόνα 5.4). γ. Σχεδιασμός και δοκιμή εκκινητών Εκκινητές σχεδιάστηκαν για 41 συνολικά από τις αλληλουχίες που περιείχαν μικροδορυφορικές επαναλήψεις, με το λογισμικό Primer 3 (Rozen & Skaletsky 2000) και εν συνεχεία συνετέθησαν από το Εργαστήριο Μικροχημείας του Ιδρύματος Τεχνολογίας και Έρευνας (Ι.Τ.Ε.). Μία πρώτη αξιολόγησή τους, με χρήση DNA από 4 άτομα S. officinalis πραγματοποιήθηκε, με PCR διαβαθμισμένων συνθηκών, ώστε να προσδιοριστούν αυτοί με την καλύτερη συμπεριφορά. Δέκα ζεύγη εκκινητών επιλέχθηκαν με αυτή τη διαδικασία, για κάθε ένα από τα οποία συνετέθησαν νέοι ανάδρομοι εκκινητές σημασμένοι με φθορίζουσες χρωστικές (FAM, HEX, ROX ή TAMRA) και βελτιστοποιήθηκαν οι συνθήκες ενίσχυσης (με PCR διαβαθμισμένων συνθηκών) για τις ανάγκες της επακόλουθης γενοτύπησης. δ. Εκτίμηση του πολυμορφισμού Οι εκκινητές που επελέγησαν χρησιμοποιήθηκαν για τη γενοτύπηση 28 ατόμων S. officinalis που προέρχονταν από τον ίδιο πληθυσμό με το άτομο που χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή της γονιδιωματικής βιβλιοθήκης. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε τελικό όγκο 10 μl που περιείχε 5-10 ng DNA S. officinalis, 0,2 mm μίγματος dntps, 0,35 μm από κάθε ζεύγος εκκινητών και 0,5 U Taq (Genaxxon BioScience). Η συγκέντρωση του MgCl2, καθώς και η θερμοκρασία υβριδισμού (Ta) ήταν ειδικές για κάθε μικροδορυφορικό τόπο, και δίνονται στον Πίνακα 5.3. Η διαδικασία ενίσχυσης σε θερμοκυκλοποιητή περιλάμβανε ένα πρώτο στάδιο αποδιάταξης στους 95 C για 3 λεπτά, 35 κύκλους του 1 λεπτού στους 93 C, 1 λεπτού στην εκάστοτε θερμοκρασία υβριδισμού (βλέπε Ta, Table 3.2) και 1 λεπτό στους 72 C, ακολουθούμενους από τελικό στάδιο επιμήκυνσης 10 λεπτών στους 72 C. Το μέγεθος των σημασμένων προϊόντων προσδιορίστηκε σε αυτόματο αναλυτή ABI Prism 3700 sequencer (Applied Biosystems) με χρήση του δείκτη 119

134 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Εικόνα 5.3: Έλεγχος των κλώνων που περιείχαν μικροδορυφορικές επαναλήψεις (AC) N με χρήση αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR), όπως οπτικοποιήθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Κάθε στήλη αντιστοιχεί σε ένα πλασμίδιο, του οποίου ο κωδικός δίνεται στο πάνω μέρος. Οι κλώνοι που επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση σημειώνονται με κόκκινη κηλίδα. Figure 5.3: Screening of clones containing microsatellite (AC) N repeats for S. officinalis using Polymerase Chain Reaction, as visualized with agarose gel electrophoresis. Each lane corresponds to a single colony, with coding appearing on top. Selected clones are indicated with red dot. 120

135 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ μοριακού μεγέθους GeneScan 500 LIZ (Applied Biosystems). Οι γενοτυπικές κορυφές προσδιορίστηκαν με χρήση το λογισμικό STRand v (UC Davis Veterinary Genetics Laboratory - Ο αριθμός αλληλομόρφων για κάθε μικροδορυφορικό τόπο, το εύρος του μεγέθους των αλληλομόρφων, και οι τιμές της αναμενόμενης και παρατηρούμενης ετεροζυγωτίας υπολογίστηκαν με το πρόγραμμα GENETIX v4.03 (Belkhir et al. 2000) και παρουσιάζονται στον Πίνακα 5.3. Ο αριθμός αλληλομόρφων για τους 10 δοκιμαζόμενους τόπους κυμάνθηκε από 5 έως 34 με μέσο όρο 17, ενώ το μέγεθός τους από 124 έως 395 bp. Οι τιμές αναμενόμενης ετεροζυγωτίας (HE) κυμάνθηκαν από 0,505 έως 0,964, ενώ της παρατηρούμενης ετεροζυγωτίας (HO) απο 0,444 έως 0,963. Δοκιμές για την απόκλιση από το ισοζύγιο Hardy-Weinberg για κάθε τόπο και για την ύπαρξη ανισορροπίας σύνδεσης (linkage disequilibrium) για κάθε ζεύγους τόπων πραγματοποιήθηκαν με το GENEPOP v3.3 (Raymond & Rousset 1995a). Η σημαντικότητα των δοκιμών έγινε στο διάστημα p = 0,05, ακολουθώντας τροποποίηση για πολλαπλές συγκρίσεις με τη Εικόνα 5.4: Ενδεικτικό γράφημα ανάλυσης πρωτοδιάταξης (electropherogram) για έναν κλώνο Spongia officinalis που περιείχε ολιγονουκλεοτιδικές επαναλήψεις (SOF 130). Η περιοχή επανάληψης, με μοτίβο (GT) 23, εμφανίζεται σκιασμένη. Οι περιμετρικές περιοχές που περιβάλλουν την επανάληψη χρησιμοποιήθηκαν για το σχεδιασμό εκκινητών (Spof_130). Μια χαρακτηριστική πτώση σήματος παρατηρείται μετά την περιοχή των νουκλεοτιδικών επαναλήψεων. Figure 5.4: Example electropherogram produced after sequencing a Spongia officinalis clone containing microsatellite repeat (SOF 130). Repeat region with a motif of (GT) 23 is highlighted in grey. The flanking regions surrounding the repeat were used for the design of primers (Spof_130). A characteristic drop of signal is observed after the repeat 121

136 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Locus GenBank Accession No. Repeat Motif Primer sequences (5ʼ to 3ʼ) Ta ( o C) MgCl2. (mm) Allele size range (bp) No. of alleles HE HO Spof_005 FJ (GT)12(GT)5 F: CATTCTCATTATGGAAGCCA R: TCTCTGTAGAGGCCATTAGTCC Spof_050 FJ (TG)12(TG)3(TG)3(TG)5 F: TAGCTGCAACTGCAGGAATC R: TCTACATGCCATCCTTGTGC Spof_054 FJ (CA)4(CA)3(CA)25 F: ACATGTCACTTGGCCACC R: ACTGATGCACCGATCAGAC Spof_057 FJ (GT)23(GT)4(GT)5 F: TGGTCTGGACCAAGACTAC R: TTAGTTAATGAATTGCTCACAA Spof_069 FJ (AC)11(AC)4(AC)5(AC)17 F: CATCGTAAGCTGATGCCATT R: AGCCTGACATTACATGGTTGG Spof_102 FJ (AC)3(AC)7(AC)3(AC)4 F: ACATAGCAAGCCTTCGTGTT R: AGTGTGCATGTGTATGCAGTG Spof_130 FJ (GT)23 F: AGCCATATGGTTGATACGACAC R: GGCACCGCCACTAGTTATTC Spof_136 FJ (CA)3(CA)5(CA)13 F: CGTAACCATTATCGTAATAAGTAGAA R: GACAGCCAAGACCATCTGAA Spof_148 FJ (AC)3(AC)7 F: CCATGTACAATCTTATGTAGC R: AATTCCTGTGATGGATTG Spof_240 FJ (CA)5(CA)3(CA)10(CA)4- (CA)11(CA)4(CA)6 F: GGTGTTGAATATGTTAGACGCAAG R: TGTCTCCACATTGGTGTGTG Ta: optimized annealing temperature; HE: expected heterozygosity; HO: observed heterozygosity Πίνακας 5.3: Χαρακτηριστικά των 10 μικροδορυφορικών τόπων που αναπτύχθηκαν για το είδος Spongia officinalis. Table 5.3: Characteristics of the 10 microsatellite loci isolated from Spongia officinalis. 122

137 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ μέθοδο Bonferroni (Rice 1989). Οι παραπάνω αναλύσεις έδειξαν συμφωνία με το ισοζύγιο Hardy- Weinberg σε όλες τις περιπτώσεις, ενώ δεν παρατηρήθηκε ένδειξη για ανισορροπία σύνδεσης μεταξύ τόπων. Το πρόγραμμα MICRO-CHECKER v2.2.3 (van Oosterhout et al. 2004) υπέδειξε πιθανότητα μηδενικών αλληλομόρφων (null alleles) στις αναλύσεις που χρησιμοποίησαν τους τόπους Spof050, Spof057 και Spof102, αν και χωρίς ενδείξεις για σφάλματα ανάγνωσης λόγω διαδοχικών κορυφών (stuttering) και παράβλεψης αλληλομόρφων μεγάλου μεγέθους (large allele dropout). Οι αλληλουχίες πρωτοδιάταξης των εκκινητών που αναπτύχθηκαν κατατέθηκαν στη βάση δεδομένων GenBank με κωδικούς ανάκτησης FJ έως FJ Εκτίμηση της ενδοειδικής ποικιλότητας με χρήση μικροδορυφορικών δεικτών Το σετ των μικροδορυφορικών δεικτών που αναπτύχθηκαν στο προηγούμενο στάδιο χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση της γενετικής σύστασης των πληθυσμών και την αξιολόγηση της ταξινόμησης των δύο ειδών Spongia officinalis και Hippospongia communis από δείγματα που είχαν συλλεχθεί στο Αιγαίο και τη Δυτική Μεσόγειο. α. Προέλευση και σύνθεση δειγμάτων Δείγματα των S. officinalis και H. communis από 13 διαφορετικές τοποθεσίες σε 3 ευρύτερες γεωγραφικές περιοχές (Αιγαίο Πέλαγος, Νότια Γαλλία και Γιβραλτάρ) συλλέχθηκαν για τη μελέτη αυτή (βλέπε Κεφάλαιο 2). Το είδος S. officinalis βρέθηκε σε όλες τις περιοχές, ενώ το H. communis αποκλειστικά στους σταθμούς του Αιγαίου (με την εξαίρεση 2 δειγμάτων σε σταθμό της Ν. Γαλλίας, τα οποία δεν συμπεριλήφθησαν στις πληθυσμιακές αναλύσεις). Οι θέσεις των σταθμών δειγματοληψίας και ο αριθμός των δειγμάτων που συλλέχτηκαν σε κάθε έναν παρουσιάζονται στην Εικόνα 5.5. Εκτιμήσεις των γεωγραφικών αποστάσεων μεταξύ των σταθμών δειγματοληψίας δίνονται στον Πίνακα 5.4. Τα κομμάτια των ατόμων που συλλέχθηκαν συντηρήθηκαν σε καθαρή αλκοόλη και αποθηκεύτηκαν στους -20 C μέχρι τη διεξαγωγή των αναλύσεων. β. Απομόνωση DNA ενίσχυση προσδιορισμός γενοτύπων Ένα τμήμα ιστού από κάθε δείγμα, μεγέθους περίπου mm 3 χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση DNA, αφού ελέγχθηκε προσεκτικά σε στερεομικροσκόπιο για να επιβεβαιωθεί ότι δεν φιλοξενούσε συμβιωτικούς μακροπανιδικούς οργανισμούς που θα μπορούσαν να επιμολύνουν το γενετικό υλικό του οργανισμού-στόχου. Το γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε με τη βοήθεια του DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που προτείνει ο κατασκευαστής και αποθηκεύτηκε στους -20 C για το διάστημα που μεσολάβησε μέχρι την ενίσχυση. Η ενίσχυση των περιοχών των μικροδορυφορικών δεικτών πραγματοποιήθηκε με την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction PCR). Στις αντιδράσεις χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές σημασμένοι με χρωστικές (FAM, HEX, TAMRA και ROX) για να επιτρέψουν την ανάλυση του προϊόντος σε αυτοματοποιημένο αναλυτή πρωτοδιάταξης (sequencer). Οι αντιδράσεις έγιναν σε τελικό όγκο 10 μl που περιείχε 5-10 ng απομονωμένου γονιδιωματικού DNA σπόγγου, 0,2 mm μίγματος τριφωσφορικών δεσοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps), 0,35 μm από κάθε εκκινητή (ειδικό για τον εκάστοτε υπό μελέτη μικροδορυφορικό τόπο) 123

138 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Εικόνα 5.5: Περιοχές συλλογής δειγμάτων των Spongia officinalis (SPOF) και Hippospongia communis (HCOM) που χρησιμοποιήθηκαν για την πληθυσμική ανάλυση. Οι σταθμοί ομαδοποιούνται σε τρεις ευρύτερες γεωγραφικές περιοχές στη Μεσόγειο (A: Αιγαίο Πέλαγος, B: Νότια Γαλλία, C: Γιβραλτάρ). Σημειώνεται ο αριθμός των ατόμων που συλλέχθηκαν σε κάθε περιοχή. (WCR: Δυτική Κρήτη, ECR: Ανατολική Κρήτη, NCR: Βόρεια Κρήτη, KAR: Κάρπαθος, KOS: Κως, CYC: Νάξος και Πάρος, SPO: Σποράδες, PCP: Port-Cros / Porquerolles, LAC: La Ciotat, MAR: Marseille, SVE: Sec du Veyron, LRO: Le Rove, CEU: Ceuta). Figure 5.5: Sampling locations for specimens of Spongia officinalis (SPOF) and Hippospongia communis (HCOM) used for population analysis. Stations are grouped into three broader geographic regions in the Mediterranean sea (A: Aegean Sea; B: Provence; C: Gibraltar). Number of individuals of each species collected from each location are presented. WCR: Western Crete; ECR: Eastern Crete; NCR: Northern Crete; KAR: Karpathos; KOS: Kos; CYC: Naxos and Paros; PIP: Piperi; PCP: Port-Cros / Porquerolles; LAC: La Ciotat; MAR: Marseille; SVE: Sec du Veyron; LRO: Le Rove; CEU: Ceuta. και 0,5 U θερμοσταθερής DNA πολυμεράσης (Taq). Η βέλτιστη συγκέντρωση της πηγής μαγνησίου (MgCl2) στο μίγμα, καθώς και η βέλτιστη θερμοκρασία του σταδίου υβριδισμού των εκκινητών (annealing temperature, Ta) προσδιορίστηκαν μετά από δοκιμαστικές αντιδράσεις και καθορίστηκε για κάθε τόπο σε τιμές που παρατίθενται στον Πίνακα 5.3. Οι αντιδράσεις PCR έγιναν σε αυτόματο θερμοκυκλοποιητή (thermal cycler) σε 35 κύκλους, σύμφωνα με το παρακάτω πρότυπο επαναλαμβανόμενων βημάτων: 1 λεπτό στους 93 C, 1 λεπτό στην ειδική για τον εκάστοτε μικροδορυφορικό τόπο Ta και 1 λεπτό στους 72 C. Οι κύκλοι αυτοί πλαισιώθηκαν από ένα αρχικό 124

139 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ Πίνακας 5.4: Γεωγραφική απόσταση (σε km) μεταξύ των σταθμών δειγματοληψίας όπου συλλέχθηκαν τα άτομα Spongia officinalis και Hippospongia communis. (WCR: Δυτική Κρήτη, ECR: Ανατολική Κρήτη, NCR: Βόρεια Κρήτη, KAR: Κάρπαθος, KOS: Κως, CYC: Νάξος και Πάρος, SPO: Σποράδες, PCP: Port-Cros / Porquerolles, LAC: La Ciotat, MAR: Marseille, SVE: Sec du Veyron, LRO: Le Rove, CEU: Ceuta). Table 5.4. Geographic distance (in Km) between sampling locations where specimens of Spongia officinalis and Hippospongia communis were collected. (WCR: Western Crete; ECR: Eastern Crete; NCR: Northern Crete; KAR: Karpathos; KOS: Kos; CYC: Naxos and Paros; PIP: Piperi; PCP: Port-Cros / Porquerolles; LAC: La Ciotat; MAR: Marseille; SVE: Sec du Veyron; LRO: Le Rove; CEU: Ceuta). WCR ECR NCR KAR KOS CYC SPO PCP LAC MAR SVE LRO CEU WCR ECR NCR KAR KOS CYC SPO PCP LAC MAR SVE LRO 1277 CEU στάδιο αποδιάταξης για 3 λεπτά στους 95 C και ένα τελικό στάδιο επιμήκυνσης για 10 λεπτά στους 72 C. Μερικοί τόποι δεν ήταν εφικτό να ενισχυθούν σε κάποια άτομα οι Spof005 και Spof050 (που ανήκαν στο αρχικό σετ δεικτών που αναπτύχθηκαν) έδειξαν υψηλές συχνότητες μη-ενίσχυσης και για το λόγο αυτό εξαιρέθηκαν από όλες τις αναλύσεις που ακολούθησαν. Η εκτίμηση του μεγέθους των αλληλομόρφων των μικροδορυφορικών περιοχών πραγματοποιήθηκε σε αυτόματο αναλυτή ABI Prism 3700 (Applied Biosystems) με χρήση του μάρτυρα μοριακού μεγέθους GeneScan 500 LIZ (Applied Biosystems). Ο προσδιορισμός των γενοτύπων έγινε με το λογισμικό STRand v (UC Davis Veterinary Genetics Laboratory - γ. Ανάλυση των δεδομένων Η ανάλυση των δεδομένων σε πρώτο στάδιο έγινε χωριστά για τα άτομα που ανήκαν στα είδη S. officinalis και H. communis. Καθώς όμως η φυλογενετική ανάλυση βάσει του δείκτη COI είχε ήδη υποδείξει ταυτοσημία ανάμεσα στα δύο είδη (βλέπε Κεφάλαιο 4), μία πρόσθετη ανάλυση πραγματοποιήθηκε, συνδυάζοντας τα δεδομένα και των δύο ειδών. Τα δεδομένα τοποθετήθηκαν σε μήτρες στο πρόγραμμα Excel (Microsoft) και στη συνέχεια μορφοποιήθηκαν κατάλληλα με 125

140 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ χρήση του λογισμικού CREATE v1.33 (Coombs et al. 2008) ώστε να τροφοδοτήσουν τα προγράμματα που χρησιμοποιήθηκαν στις επακόλουθες αναλύσεις. Η πιθανότητα ύπαρξης ανισορροπίας σύνδεσης (linkage disequilibrium) μεταξύ των μικροδορυφορικών δεικτών που χρησιμοποιήθηκαν διερευνήθηκε για όλα τα πιθανά ζεύγη με το λογισμικό GENEPOP v (Raymond & Rousset 1995a). Οι τιμές της αναμενόμενης και παρατηρούμενης ετεροζυγωτίας (HE expected heterozygosity και H O observed heterozygosity αντίστοιχα), καθώς και του συντελεστή ομομιξίας κατά Weir & Cockerham (1984) (FIS inbreeding coefficient) προσδιορίστηκαν με το λογισμικό GENETIX v (Belkhir et al. 2000). Το ίδιο πρόγραμμα χρησιμοποιήθηκε και για τον υπολογισμό των συχνοτήτων των αλληλομόρφων (allelic frequencies) καθώς και του αριθμού των αποκλειστικών αλληλομόρφων (Na private alleles) ανά μικροδορυφορικό τόπο και πληθυσμό. Η στατιστική σημαντικότητα μιας πιθανής απόκλισης από το ισοζύγιο Hardy-Weinberg (HWE - Hardy-Weinberg Equilibrium) προσδιορίστηκε με το λογισμικό GENEPOP για κάθε εξεταζόμενο δείκτη και πληθυσμό, καθώς και για το σύνολό τους, σύμφωνα με τη μέθοδο των Raymond & Rousset (1995b). Τέλος, έλεγχος για την παρουσία μηδενικών αλληλομόρφων (null alleles) πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό MICRO-CHECKER v2.2.3 (Van Oosterhout et al. 2004). Η γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των δειγμάτων προσδιορίστηκε μέσω των εκτιμητών FST (θ) των Weir & Cockerham (1984) και RST (ρ) του Rousset (1996). Οι δύο αυτοί εκτιμητές βασίζονται σε διαφορετικά θεωρητικά μοντέλα του τρόπου που επιδρούν οι μεταλλάξεις στην ποικιλότητα των μικροδορυφορικών περιοχών: ο FST βασίζεται στο μοντέλο των άπειρων αλληλομόρφων (Infinite Allele Model IAM) των Kimura & Crow (1964), ενώ ο RST στο μοντέλο κλιμακωτής μετάλλαξης (Stepwise Mutation Model SMM) του Slatkin (1995). Οι τιμές των εκτιμητών αυτών προσδιορίστηκαν αντίστοιχα με τα προγράμματα FSTAT v2.9.3 (Goudet 2001) και RST CALC v2.2 (Goodman 1997). Η εκτίμηση της στατιστικής σημαντικότητας των τιμών έγινε με δοκιμασία bootstrap για 1000 σειρές ψευδοδειγμάτων στο επίπεδο 95%, μετά από διορθωτική τροποπoίηση για συγκρίσεις πολλαπλών δειγμάτων σύμφωνα με τη μέθοδο Bonferroni (Rice 1989). Οι τιμές του FST χρησιμοποιήθηκαν για τη διερεύνηση της πιθανότητας επίδρασης του μοντέλου απομόνωσης λόγω απόστασης (isolation by distance) στη γονιδιακή ροή μεταξύ των πληθυσμών που εξετάστηκαν. Για το σκοπό αυτό αναλύθηκε ο συσχετισμός των τιμών της γενετικής διαφοροποίησης FST/(1-F ST) (Rousset 1997) με τη λογαριθμική γεωγραφική απόσταση μεταξύ ζευγών πληθυσμών. Η δοκιμασία Mantel χρησιμοποιήθηκε για την στατιστική εκτίμηση του συσχετισμού αυτού, με τη βοήθεια του προγράμματος IBD 1.52 (Bohonak 2002). Η διερεύνηση της κατανομής της γενετικής ποικιλότητας μεταξύ ατόμων και πληθυσμών έγινε μέσω της ανάλυσης AMOVA (Analysis of Molecular Variance Excoffier et al. 1992). Πραγματοποιήθηκαν δύο εκδοχές της ανάλυσης βασιζόμενες, αντίστοιχα, στα μεγέθη FST και R ST, με τη βοήθεια του προγράμματος ARLEQUIN v3.5 (Excoffier et al. 2005). Μία πρώτη διερεύνηση του συσχετισμού μεταξύ γενετικής σύστασης γεωγραφικής προέλευσης των πληθυσμών πραγματοποιήθηκε με εκτίμηση της γενετικής διαφοροποίησης ανά ζεύγη βάσει του μέτρου απόστασης χορδής (chord distance) (Cavalli-Sforza & Edwards 1967). Ο υπολογισμός του δείκτη έγινε με το πρόγραμμα GENETIX v και οι παραχθείσες τιμές χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή κλαδογράμματος σύμφωνα με τη μέθοδο neighbourjoining, στο πρόγραμμα MEGA v4.0 (Tamura et al. 2007). Περαιτέρω ανίχνευση της γενετικής σύστασης των πληθυσμών πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα STRUCTURE v2.3 (Pritchard et al. 2000), το οποίο βασίζεται σε 126

141 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ ανάλυση κατά Bayes για να προσδιορίσει τον αριθμό ομόλογων γενετικά ομάδων (genetically homologous groups K) στο σύνολο του δείγματος χωρίς την χρήση προκαθορισμένης πληροφορίας (π.χ. της ομαδοποίησης βάσει της γεωγραφικής προέλευσης) και στη συνέχεια υπολογίζει την πιθανότητα κάθε ατόμου να υπάγεται γενετικά σε κάθε μία από τις ομάδες αυτές. Ο αριθμός Κ στον οποίο βασίστηκαν οι αναλύσεις καθορίστηκε με χρήση του μέτρου ΔΚ σύμφωνα με τη μέθοδο των Evanno et al. (2005). Πρόσθετη ανίχνευση της γενετικής σύστασης των πληθυσμών έγινε με τη στατιστική μέθοδο DAPC (Discriminant Analysis of Principal Components, Jombart et al. 2010). Η μέθοδος αυτή συνδυάζει τις κλασικές στατιστικές προσεγγίσεις της ανάλυσης κυρίων συνιστωσών (Analysis of Principal Components PCA) και της διακρίνουσας ανάλυσης (Discriminant Analysis DA) για να περιγράψει τη γενετική διαφοροποίηση μεταξύ πληθυσμών. Η μέθοδος εφαρμόστηκε με χρήση του στατιστικού πακέτου adegenet (Jombart 2008) σε περιβάλλον R v (R Development Core Team 2009) Αποτελέσματα Οι αναλύσεις της ποικιλότητας των μικροδορυφορικών δεικτών έγιναν ξεχωριστά για τα είδη Spongia officinalis και Hippospongia communis. Επειδή, όμως, η μελέτη της διαειδικής ποικιλότητας που προηγήθηκε είχε δείξει απουσία διαφοροποίησης μεταξύ των δύο ειδών, και επειδή όλοι οι μικροδορυφορικοί δείκτες λειτούργησαν εξίσου και στα δύο είδη, οι αναλύσεις έγιναν και σε ένα τρίτο επίπεδο, δηλαδή από κοινού για τα S. officinalis και H. communis Ανάλυση για το Spongia officinalis α. Ποικιλότητα μικροδορυφορικών δεικτών Τα αποτελέσματα που αφορούν στην ποικιλότητα των μικροδορυφορικών δεικτών για το είδος S. officinalis συνοψίζονται στον Πίνακα 5.5. Όλοι οι μικροδορυφορικοί τόποι που αναλύθηκαν παρουσίασαν σημαντική ποικιλότητα στους εξεταζόμενους πληθυσμούς. Περισσότερο πολυμορφικοί ήταν οι Spof069 και Spof136, με μέσο αριθμό αλληλομόρφων 24,8 και για τους δύο η μικρότερη ποικιλότητα παρατηρήθηκε στον Spof148 με μέσο αριθμό αλληλομόρφων 11,8. Ο τόπος Spof057 που έδειξε υψηλό πολυμορφισμό κατά την αρχική εκτίμηση, παρουσίασε μέσο αριθμό αλληλομόρφων 22,5 στο σύνολο των πληθυσμών. Ο βαθμός πολυμορφισμού διαφοροποιήθηκε μεταξύ των γεωγραφικών περιοχών, φτάνοντας τον μέσο μέγιστο αριθμό αλληλομόρφων (29,3) στη Μασσαλία (MAR) και το μικρότερο (7,5) στη Νότια Κρήτη (NCR). Ο αριθμός των αποκλειστικών αλληλομόρφων (pa), δηλαδή των αλληλομόρφων που εμφανίζονται αποκλειστικά σε ένα πληθυσμό και απουσιάζουν από τους άλλους, ήταν υψηλός για όλους τους δείκτες και κυμαινόταν από 8 έως 18, με μέγιστη τιμή στον πληθυσμό της Μασσαλίας (MAR). Η νουκλεοτιδική ποικιλότητα, όπως εκφράζεται με την αναμενόμενη ετεροζυγωτία (HE), ήταν γενικά υψηλή στους πληθυσμούς, με μέση τιμή από 0,73 έως 0,90 χαμηλές έως μέσες τιμές παρουσίασε μόνο ο τόπος Spof148, που κυμάνθηκε από 0,43 έως 0,81, κυρίως στις περιοχές του Αιγαίου. Η παρατηρούμενη ετεροζυγωτία (HO) ήταν σταθερά χαμηλότερη από την H E με λίγες εξαιρέσεις, και η μέση τιμή της κυμάνθηκε από 0,53 έως 0,73. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει μια 127

142 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Πίνακας 5.5: Σύνοψη της γενετικής ποικιλότητας του Spongia officinalis στους οκτώ μικροδορυφορικούς τόπους που μελετήθηκαν και τις 12 γεωγραφικές περιοχές (για επεξήγηση των ακρωνυμίων βλέπε την Εικόνα 5.5). N: αριθμός ατόμων, N a: αριθμός αλληλομόρφων, HO: παρατηρούμενη ετεροζυγωτία, HE: αναμενόμενη ετεροζυγωτία, FIS: συντελεστής ομομιξίας, HWE: απόκλιση από το ισοζύγιο Hardy-Weinberg (*: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001), pa: αποκλειστικά αλληλόμορφα. Table 5.5: Summary of genetic variation for Spongia officinalis at the eight studied microsatellite loci and 12 geographic locations (for name abbreviations and designation of locations refer to Fig. 5.5). N: number of individuals; N a: number of alleles; H O: observed heterozygosity; HE: expected heterozygosity; FIS: inbreeding coefficient; HWE: departure from Hardy- Weinberg equilibrium (*: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001); pa: private alleles. 128

143 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ έλλειψη ετεροζυγωτών (heterozygote deficiency) στους πληθυσμούς που μελετήθηκαν, η οποία επικυρώνεται από τη σημαντική (p < 0,001) απόκλιση από το ισοζύγιο Hardy-Weinberg (HWE) που παρατηρήθηκε σε όλους τους πληθυσμούς για όλους τους δείκτες. Ο συντελεστής ομομιξίας FIS παρουσίασε κυρίως θετικές τιμές, κατά πλειοψηφία μεγαλύτερες από 0,1 οι συνδυαστικές τιμές του κυμάνθηκαν από 0,192 έως 0,352 μεταξύ των πληθυσμών που εξετάστηκαν. Οι υψηλότερες τιμές του συντελεστή ομομιξίας σημειώθηκαν στους πληθυσμούς της Καρπάθου και του Γιβραλτάρ (0,352 και 0,315, αντίστοιχα). Η εξέταση για σφάλματα ανάγνωσης φανέρωσε την παρουσία μηδενικών αλληλομόρφων στα δεδομένα όλων των δεικτών (Πίνακας 5.6), χωρίς όμως ενδείξεις για σφάλματα ανάγνωσης λόγω διαδοχικών κορυφών (stuttering) και παράβλεψης αλληλομόρφων μεγάλου μεγέθους (large allele dropout). Ο τόπος Spof136 εμφάνισε μηδενικά αλληλόμορφα μόνο σε ένα πληθυσμό, ενώ όλοι οι άλλοι σε έξι ή περισσότερους πληθυσμούς. Ανισορροπία σύνδεσης εμφανίστηκε επίσης μεταξύ αρκετών ζευγών δεικτών, που στις περισσότερες περιπτώσεις περιελάμβαναν τον τόπο Spof102 (Πίνακας 5.7). Πάντως, πρέπει να σημειωθεί ότι δεν είχε υποδειχθεί ανισορροπία σύνδεσης για κανένα ζεύγος κατά τη διάρκεια της αρχικής διαδικασίας αξιολόγησης των δεικτών (βλέπε ενότητα 5.2.1). β. Διαφοροποίηση και γονιδιακή ροή μεταξύ πληθυσμών Οι καθολικές (global) τιμές FST και R ST της γενετικής διαφοροποίησης για το σύνολο των πληθυσμών ανά μικροδορυφορικό δείκτη κυμάνθηκαν από 0,025 έως 0,143 και από 0,037 έως 0,588 αντίστοιχα. Οι τιμές του RST υπήρξαν υψηλότερες από τις αντίστοιχες του F ST για κάθε έναν από τους δείκτες, καθώς και όσον αφορά την συνδυαστική τιμή για το σύνολο των δεικτών. Στην τελευταία αυτή περίπτωση, το RST είχε έντονα υψηλότερη τιμή (0,195) από το F ST (0,065) (Πίνακας 5.8). Οι τιμές του FST μεταξύ των γεωγραφικών τοποθεσιών ήταν σημαντικά διάφορες του μηδενός στις περισσότερες περιπτώσεις και κυμάνθηκαν από 0,017 έως 0,161 (Πίνακας 5.9). Ποσοτικές Πίνακας 5.6: Ένδειξη για παρουσία μηδενικών αλληλομόρφων (σημειώνεται με + ) στους 8 μικροδορυφορικούς τόπους ανά πληθυσμό του Spongia officinalis όπως προέκυψε από το πρόγραμμα Micro-Checker. Για επεξήγηση των ακρωνυμίων γεωγραφικών περιοχών βλέπε την Εικόνα 5.5. Table 5.6: Indication for the presence of null alleles (depicted with a + ) across eight microsatellite loci and 12 geographic locations for Spongia officinalis as suggested by the program Micro-Checker. For name abbreviations and designation of locations refer to Figure 5.5. WCR ECR NCR KAR CYC SPO LAC LRO MAR PCP SVE CEU Spof Spof Spof Spof Spof Spof136 + Spof Spof

144 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Πίνακας 5.7: Ένδειξη για την παρουσία ανισορροπίας σύνδεσης μεταξύ των μικροδορυφορικών τόπων που αναλύθηκαν για το Spongia officinalis. Παρουσιάζονται οι τιμές στατιστικής πιθανότητας για την απουσία σύνδεσης μεταξύ των τόπων (*: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001). Table 5.7: Pairwise probability (p-values) for independent genotypes (no linkage disequilibrium) between microsatellite loci used for Spongia officinalis, tested for all populations (*: p < 0.05; **: p < 0.01; ***: p < 0.001). Spof054 Spof054 Spof057 Spof069 Spof102 Spof130 Spof136 Spof148 Spof240 Spof057 *** Spof069 *** *** Spof Spof130 *** *** *** Spof136 *** *** *** *** *** Spof *** *** * ** *** Spof *** *** *** *** Πίνακας 5.8: Καθολικές τιμές των δεικτών γενετικής διαφοροποίησης FST και RST για το σύνολο των δειγμάτων του Spongia officinalis, αναλόγως του μικροδορυφορικού δείκτη. CI: διάστημα εμπιστοσύνης. Table 5.8: Global single-locus and multi-locus F ST and RST values for all studied Spongia officinalis populations. CI: Confidence Interval. Locus Spof054 Spof057 Spof069 Spof102 Spof130 Spof136 Spof148 Spof240 Multilocus 95% CI FST RST Πίνακας 5.9: Τιμές των δεικτών γενετικής διαφοροποίησης FST (κάτω από τη διαγώνιο) και RST (πάνω από τη διαγώνιο) μεταξύ γεωγραφικών περιοχών για το Spongia officinalis από τη συνδυαστική ανάλυση όλων των μικροδορυφορικών τόπων. Με κόκκινη γραφή επισημαίνεται η στατιστικά μη σημαντική διαφορά από το μηδέν σε επίπεδο p < 0.05, μετά τη διόρθωση Bonferroni. Για επεξήγηση των ακρωνυμίων των γεωγραφικών περιοχών βλέπε την Εικόνα 5.5. Table 5.9: Pairwise F ST (below diagonal) and RST values (above diagonal) between geographic locations for Spongia officinalis estimated from analysis of all studied microsatellite loci. Numbers in red indicate non-significant difference from zero at the 0.05 level after Bonferroni correction. For name abbreviations and designation of locations refer to Figure 5.5. WCR ECR NCR KAR CYC SPO LAC LRO MAR PCP SVE CEU WCR ECR NCR KAR CYC SPO LAC LRO MAR PCP SVE CEU

145 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ διακυμάνσεις της γενετικής διαφοροποίησης παρατηρήθηκαν μεταξύ των ευρύτερων γεωγραφικών περιοχών. Οι τιμές FST εντός του Αιγαίου και της Νότιας Γαλλίας ήταν παρόμοιες, με μέσους όρους 0,047 (εύρος: 0,017-0,075) και 0,035 (εύρος: 0,017-0,065) αντίστοιχα. Ωστόσο, μεταξύ των περιοχών του Αιγαίου και της Νότιας Γαλλίας οι τιμές FST ήταν σχεδόν διπλάσιες (μέσος όρος: 0,080 εύρος: 0,056-0,117). Η γενετική διαφοροποίηση υπήρξε ακόμη μεγαλύτερη μεταξύ του Γιβραλτάρ και όλων των υπόλοιπων περιοχών (μέση τιμή: 0,126 εύρος: 0,099-0,161). Τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια όσον αφορά στην κατά ζεύγη εκτίμηση του δείκτη RST, με τη διαφορά ότι οι τιμές ήταν γενικά μεγαλύτερες μεταξύ όλων των πληθυσμών, ειδικά των πιο απομακρυσμένων (Πίνακας 5.9). Για τους πληθυσμούς εντός του Αιγαίου ή της Νότιας Γαλλίας οι μέσες τιμές του RST ήταν 0,048 (εύρος: 0,004-0,107) και 0,032 (εύρος: 0,009-0,087) αντίστοιχα. Μεταξύ των περιοχών του Αιγαίου και της Νότιας Γαλλίας, η μέση τιμή RST ήταν 0,252 (εύρος: 0,154-0,321), ενώ μεταξύ όλων των άλλων περιοχών ήταν μεγαλύτερη, φτάνοντας το 0,510 (εύρος: 0,473-0,571). Τα αποτελέσματα και για τους δύο δείκτες συγκρίνονται στην Εικόνα 5.6. Είναι φανερό ότι τα άτομα του Spongia officinalis που ανήκουν στους πληθυσμούς της Νότιας Γαλλίας ή του Αιγαίου παρουσιάζουν τα ίδια επίπεδα γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ τους, όπως αυτή υπολογίζεται με τους δείκτες FST και R ST. Όταν συγκρίνουμε την διαφοροποίηση μεταξύ πληθυσμών διακριτών γεωγραφικών περιοχών, ο F ST και ο R ST αυξάνουν κατά μια τάξη μεγέθους, σχηματίζοντας δύο ξεχωριστές ομάδες ζευγών σταθμών μεταξύ της Δυτικής και Ανατολικής Μεσογείου καθώς και μεταξύ του Γιβραλτάρ και της Μεσογείου αντίστοιχα. Η διάκριση αυτή εκφράζεται πιο έντονα με το δείκτη RST, οι τιμές του οποίου εμφανίζουν μεγαλύτερη αυξητική τάση μεταξύ πιο απομακρυσμένων περιοχών. Οι τιμές της παλινδρόμησης της γενετικής διαφοροποίησης βάσει του δείκτη FST / (1-F ST) σε σχέση με το λογάριθμο της γεωγραφικής απόστασης μεταξύ των περιοχών έδειξαν θετική Εικόνα 5.6: Συσχέτιση των τιμών των δεικτών γενετικής διαφοροποίησης F ST και RST για το Spongia officinalis μεταξύ των περιοχών δειγματοληψίας στη Μεσόγειο. Figure 5.6: Correlation of genetic differentiation based on estimates F ST and RST for Spongia officinalis microsatellite data from all sampled locations in the Mediterranean Sea. 131

146 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Εικόνα 5.7: Γενετική απομόνωση βάσει της γεωγραφικής απόστασης για τους πληθυσμούς του Spongia officinalis που μελετήθηκαν, όπως αυτή προκύπτει από τις τιμές του δείκτη F ST γενετικής διαφοροποίησης. (R 2 = 0.462, p < 0.001). Figure 5.7: Genetic isolation by geographic distance for the studied populations of Spongia officinalis inferred from multi-locus estimates of genetic differentiation F ST (R 2 = 0.462; p < 0.001). συσχέτιση (Εικόνα 5.7), η οποία αποδείχτηκε στατιστικά σημαντική (p < 0,001) με τη δοκιμασία Mantel. Σύμφωνα με την ανάλυση AMOVA (Πίνακας 5.10), το μεγαλύτερο μέρος της γενετικής ποικιλότητας εντοπίστηκε στο επίπεδο μεταξύ των ατόμων (εντός των γεωγραφικών τοποθεσιών). Το εκτιμώμενο ποσοστό γενετικής ποικιλότητας μεταξύ των τριών γεωγραφικών περιοχών ήταν χαμηλό όταν υπολογίστηκε βάσει του μέτρου FST (3,95%), ενώ φάνηκε υψηλότερο όταν η εκτίμηση έγινε με το μέτρο RST (33,39%). Η ποσοστιαία ποικιλότητα μεταξύ των 12 γεωγραφικών περιοχών ήταν χαμηλή και στις δύο περιπτώσεις, με τιμές 4,11% και 2,71% αντίστοιχα. Το δενδρόγραμμα που κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας την απόσταση χορδής ως μέτρο γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ των πληθυσμών αντανακλά τη γεωγραφική τους προέλευση με την εμφάνιση τριών κύριων κλάδων που αντιστοιχούν στις γεωγραφικές περιοχές του Αιγαίου, της Νότιας Γαλλίας και του Γιβραλτάρ (Εικόνα 5.8). Η ανάλυση της γενετικής σύστασης των πληθυσμών κατά Bayes, υπέδειξε τη μέγιστη πιθανοφάνεια για το μοντέλο με τις δύο ομόλογες γενετικά ομάδες ατόμων (Κ), όπως φαίνεται από την υψηλότερη τιμή του ΔΚ για Κ = 2 (Εικόνα 5.9). Τα αποτελέσματα της ανάλυσης για Κ = 2 έδειξαν διαχωρισμό των ατόμων σε δύο έντονα διακριτές συστάδες, που αντιστοιχούν στη Δυτική Μεσόγειο (Νότια Γαλλία Γιβραλτάρ) και στην Ανατολική Μεσόγειο (Αιγαίο Πέλαγος) αντίστοιχα (Εικόνα 5.10). Η μέθοδος DAPC αποκάλυψε έναν ξεκάθαρο διαχωρισμό της ομάδας του Γιβραλτάρ στο δεύτερο άξονα της PCA, ενώ οι ομάδες της Νότιας Γαλλίας και του Αιγαίου διαχωρίστηκαν επίσης μεταξύ τους στον πρώτο άξονα (Εικόνα 5.11Α). Επακόλουθη ανάλυση που έγινε χωρίς τα δείγματα του Γιβραλτάρ, διέκρινε καλύτερα τη δομή των πληθυσμών της Μεσογείου (Εικόνα 5.11Β). Μέσα στην ομάδα του Αιγαίου, η Κάρπαθος (KAR) διαχωρίστηκε ξεκάθαρα από όλους τους άλλους πληθυσμούς, ενώ ένας λιγότερο σαφής διαχωρισμός παρατηρήθηκε μεταξύ των πληθυσμών της 132

147 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ Πίνακας 5.10: Ανάλυση AMOVA μεταξύ γεωγραφικών περιοχών (Αιγαίο, Νότια Γαλλία, Γιβραλτάρ) και πληθυσμών (θέσεις δειγματοληψίας) για το Spongia officinalis (Α) βασιζόμενη στον αριθμό των διαφορετικών αλληλομόρφων (F ST) και (B) στο άθροισμα των τετραγωνισμένων διαφορών (R ST). Table 5.9: Analysis of molecular variance (AMOVA) among groups (geographic regions: Aegean Sea, Provence and Gibraltar) and populations (sampling locations) for Spongia officinalis based: (A) on the number of different alleles (F ST) and (B) on the sum of squared size differences (R ST). A./,0 '/1 2%34µ%56/1 (FST) Degrees of freedom Sum of squares Variance components Significance tests (P value) Variation (%) 78'%94,8:,$%;3<5 =8$->< ± '%94 =&/?@6µ< ± '%94 %'Aµ: ± B45-& B./,0 '/1 2%34µ%56/1 (RST) Degrees of freedom Sum of squares Variance components Significance tests (P value) Variation (%) 78'%94,8:,$%;3<5 =8$->< ± '%94 =&/?@6µ< ± '%94 %'Aµ: ± B45-& Εικόνα 5.8: Neighbour-Joining δενδρόγραμμα χωρίς ρίζα, βάσει των γενετικών αποστάσεων χορδής μεταξύ των πληθυσμών του Spongia officinalis. Για επεξήγηση των ακρωνυμίων των γεωγραφικών περιοχών, βλέπε την Εικόνα 5.5. ).!%&&*%!$%&'($ +,%*- Figure 5.8: Unrooted Neighbour- Joining tree constructed from estimates of chord distance among sampled populations of Spongia officinalis. For name abbreviations and designation of locations refer to Fig

148 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Κρήτης (WCR και ECR) από τη μια και των πληθυσμών των περιοχών των Σποράδων και των Κυκλάδων (SPO και CYC) από την άλλη. Εντός της περιοχής της Νότιας Γαλλίας δεν παρατηρήθηκε κάποιος διαχωρισμός. Εικόνα 5.9: Τιμές του δείκτη ΔΚ για κάθε αριθμό ομόλογων γενετικά ομάδων ατόμων (K) του Spongia officinalis. Figure 5.9: Values of ΔΚ plotted for each number of genetically homogenous groups (K) of Spongia officinalis individuals. Εικόνα 5.10: Γενετική σύσταση των ατόμων του Spongia officinalis για το σύνολο των πληθυσμών της Μεσογείου, όπως προκύπτει από την ανάλυση STRUCTURE για K = 2. Για επεξήγηση των ακρωνυμίων των γεωγραφικών περιοχών βλέπε την Εικόνα 5.5. Figure 5.10: Geographical subdivision of western end eastern Mediterranean populations of Spongia officinalis individuals as inferred using STRUCTURE for K = 2. For name abbreviations and designation of locations refer to Figure Ανάλυση για το Hippospongia communis α. Ποικιλότητα των μικροδορυφορικών δεικτών Σημαντική ποικιλότητα διαπιστώθηκε για τους εξεταζόμενους μικροδορυφορικούς δείκτες και στο είδος H. communis (Πίνακας 5.11) παρά το μικρότερο συνολικό αριθμό δειγμάτων που εξετάστηκαν. Μεγαλύτεροι αριθμοί διακριτών αλληλομόρφων παρατηρήθηκαν στους τόπους Spof069, Spof069 και Spof057 (όπως και στο S. officinalis), με πάνω από 20 αλληλόμορφα κατά μέσο όρο σε όλους τους πληθυσμούς που εξετάστηκαν. Τη μικρότερη ποικιλομορφία εμφάνισε ο τόπος Spof148, με μέση τιμή 6 αλληλομόρφων. Οι μέσοι αριθμοί αλληλομόρφων δεν διέφεραν αισθητά μεταξύ των τεσσάρων περιοχών δειγματοληψίας, και κυμάνθηκαν από 12,3 έως 19,1. 134

149 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ Α ).!%&&*%!$%&'($ Β +,%*- +,%*- ).!%&&*% Εικόνα 5.11: Διάκριση των πληθυσμών του Spongia officinalis σύμφωνα με τη μέθοδο DAPC: (A) για όλες τις περιοχές και (B) μόνο για τις περιοχές του Αιγαίου και της Νότιας Γαλλίας. Οι γεωγραφικές περιοχές προέλευσης των ατόμων σημειώνονται με διαφορετικά χρώματα. Οι κηλίδες αντιπροσωπεύουν διαφορετικά άτομα. (1: WCR, 2: ECR, 3: KAR, 4: CYC, 5: SPO, 6: LAC, 7: LRO, 8: MAR, 9: PCP, 10: SVE, 11: CEU). Figure 5.11: Subdivision of the studied Spongia officinalis populations according to the DAPC method: (A) for all areas and (B) for the Aegean and Provençal clusters. Sampled geographic locations are indicated with different colors; dots represent individuals; 95% inertia ellipses are included for each cluster. (1: WCR; 2: ECR; 3: KAR; 4: CYC; 5: SPO; 6: LAC; 7: LRO; 8: MAR; 9: PCP; 10: SVE; 11: CEU). Ο αριθμός των αποκλειστικών αλληλομόρφων (pa) ανά μικροδορυφορικό δείκτη ήταν γενικά υψηλός, όπως και στο S. officinalis, και κυμάνθηκε στο σύνολο των πληθυσμών από 2 έως 18, με την Ανατολική Κρήτη (ECR) και την Κω (KOS) να παρουσιάζουν τις υψηλότερες αθροιστικές τιμές στο σύνολο των δεικτών (36 και 33 αντίστοιχα). Η νουκλεοτιδική ποικιλότητα όπως εκφράζεται με την αναμενόμενη ετεροζυγωτία (HE) ήταν γενικά υψηλή σε όλους τους πληθυσμούς, 135

150 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ και οι μέσες τιμές της κυμάνθηκαν από 0,78 έως 0,87 ο τόπος Spof148 παρουσίασε τη μικρότερη συνολική τιμή HE αλλά παραταύτα είχε σχετικά υψηλές τιμές ανά τους πληθυσμούς, που κυμαίνονταν από 0,63 έως 0,76. Η παρατηρούμενη ετεροζυγωτία (HO) υπήρξε με λίγες εξαιρέσεις χαμηλότερη από την HE, με μέσες τιμές από 0,57 έως 0,71 το γεγονός αυτό έδειξε μια έλλειψη σε ετεροζυγώτες στους πληθυσμούς που μελετήθηκαν, που επιβεβαιώθηκε από τη σημαντική (p < 0,001) απόκλιση από το ισοζύγιο Hardy-Weinberg (HWE), που παρατηρήθηκε για όλους τους πληθυσμούς και τους τόπους (εκτός από τους Spof130 και Spof148 που σταθερά δεν έδειξαν Πίνακας 5.11: Σύνοψη της γενετικής ποικιλότητας του Hippospongia communis στους οκτώ μικροδορυφορικούς τόπους που μελετήθηκαν και τις 4 γεωγραφικές περιοχές (για επεξήγηση των ακρωνυμίων βλέπε την Εικόνα 5.5). N: αριθμός ατόμων, N a: αριθμός αλληλομόρφων, HO: παρατηρούμενη ετεροζυγωτία, H E: αναμενόμενη ετεροζυγωτία, F IS: συντελεστής ομομιξίας, HWE: απόκλιση από το ισοζύγιο Hardy-Weinberg (*: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001), pa: αποκλειστικά αλληλόμορφα. Table 5.11: Summary of genetic variation for Hippospongia communis at the 8 studied microsatellite loci and 4 geographic locations (for name abbreviations and designation of locations refer to Figure 5.5). N: number of individuals; N a: number of alleles; H O: observed heterozygosity; H E: expected heterozygosity; F IS: inbreeding coefficient; HWE: departure from Hardy- Weinberg equilibrium (*: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001); pa: private alleles. 136

151 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ κάποια απόκλιση από τη HWE, στις περιοχές που μελετήθηκαν). Ο συντελεστής ομομιξίας F IS είχε κυρίως θετικές τιμές, με μια εξαίρεση: ο τόπος Spof148 εμφάνισε αρνητικές τιμές FIS για τις περιοχές της Ανατολικής Κρήτη (ECR) και της Κω (KOS). Αντίθετα, πολύ υψηλές τιμές παρουσίασε ο τόπος Spof102 για τις περιοχές ECR και KOS. Οι μέσες συνδυαστικές τιμές FIS κυμάνθηκαν από 0,196 έως 0,291 στις τέσσερις περιοχές δειγματοληψίας. Ύπαρξη μηδενικών αλληλομόρφων διαπιστώθηκε στις αναλύσεις όλων των δεικτών (εκτός των Spof130 και Spof148) και για όλες τις περιοχές δειγματοληψίας (Πίνακας 5.12), χωρίς όμως ενδείξεις για σφάλματα ανάγνωσης λόγω διαδοχικών κορυφών και παράβλεψης αλληλομόρφων μεγάλου μεγέθους. Και εδώ, κάποιοι τόποι δεν ήταν δυνατόν να ενισχυθούν σε μερικά άτομα όπως και στο S. officinalis, οι δείκτες Spof005 και Spof050 έδειξαν υψηλές συχνότητες αποτυχίας ενίσχυσης και έτσι αφαιρέθηκαν από όλες τις επακόλουθες αναλύσεις. Ανισορροπία σύνδεσης παρατηρήθηκε επίσης μεταξύ των περισσότερων ζευγών τόπων (Πίνακας 5.13). ECR KOS CYC SPO Spof Spof Spof Spof Spof130 Spof Spof148 Spof Πίνακας 5.12: Ένδειξη για παρουσία μηδενικών αλληλομόρφων (σημειώνεται με + ) στους 8 μικροδορυφορικούς τόπους ανά πληθυσμό του Hippospongia communis. Για επεξήγηση των ακρωνυμίων γεωγραφικών περιοχών βλέπε την Εικόνα 5.5. Table 5.12: Indication for the presence of null alleles (depicted with a + ) across 8 microsatellite loci and 4 geographic locations for Hippospongia communis. For name abbreviations and designation of locations refer to Fig Πίνακας 5.13: Ένδειξη για την παρουσία ανισορροπίας σύνδεσης μεταξύ των μικροδορυφορικών τόπων που αναλύθηκαν για το Hippospongia communis. Παρουσιάζονται οι τιμές στατιστικής πιθανότητας για την απουσία σύνδεσης μεταξύ των τόπων (*: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001). Table 5.13: Pairwise probability (P-values) for independent genotypes (no linkage disequilibrium) between microsatellite loci used for Hippospongia communis, tested for all populations (*: p < 0.05; **: p < 0.01; ***: p < 0.001). Spof054 Spof057 Spof069 Spof102 Spof130 Spof136 Spof148 Spof240 Spof054 Spof Spof Spof Spof Spof *** Spof Spof

152 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ β. Διαφοροποίηση και γονιδιακή ροή μεταξύ πληθυσμών Οι καθολικές (global) τιμές των δεικτών γενετικής διαφοροποίησης F ST και R ST για το σύνολο των πληθυσμών ανά μικροδορυφορικό δείκτη κυμάνθηκαν από 0,015 έως 0,119 και από 0,005 έως 0,164 αντίστοιχα. Η συνδυαστική τιμή RST για το σύνολο των δεικτών ήταν υψηλότερη από την αντίστοιχη του FST (0,092 και 0,048 αντίστοιχα) (Πίνακας 5.14). Οι τιμές F ST κατά ζεύγη μεταξύ γεωγραφικών τοποθεσιών ήταν σημαντικά διάφορες του μηδενός σε όλες τις περιπτώσεις και κυμάνθηκαν από 0,039 μέχρι 0,070 (Πίνακας 5.15). Οι κατά ζεύγη τιμές του RST ήταν γενικά υψηλότερες από τις αντίστοιχες του FST, διαχωρίζοντας τις Σποράδες από όλες τις άλλες περιοχές με τιμές ίσες ή μεγαλύτερες από 0,100. Πίνακας 5.14: Καθολικές τιμές των δεικτών γενετικής διαφοροποίησης FST και RST για το σύνολο των δειγμάτων του Hippospongia communis, αναλόγως του μικροδορυφορικού δείκτη. CI: διάστημα εμπιστοσύνης. Table 5.14: Global single-locus and multi-locus FST and RST values for all studied Hippospongia communis populations. CI: Confidence Interval. Locus Spof054 Spof057 Spof069 Spof102 Spof130 Spof136 Spof148 Spof240 Multilocus 95% CI FST RST ECR KOS CYC SPO ECR KOS CYC SPO Πίνακας 5.15: Τιμές των δεικτών γενετικής διαφοροποίησης F ST (κάτω από τη διαγώνιο) και R ST (πάνω από τη διαγώνιο) μεταξύ γεωγραφικών περιοχών για το Hippospongia communis από τη συνδυαστική ανάλυση όλων των μικροδορυφορικών τόπων. Όλες οι τιμές ήταν στατιστικά διάφορες του μηδενός σε επίπεδο p < 0.05, μετά τη διόρθωση Bonferroni. Για επεξήγηση των ακρωνυμίων των γεωγραφικών περιοχών βλέπε την Εικόνα 5.5. Table 5.15: Pairwise F ST (below diagonal) and R ST values (above diagonal) between geographic locations for Hippospongia communis estimated from analysis of all studied microsatellite loci. All values were statistically different from zero at the 0.05 level after Bonferroni correction. For name abbreviations and designation of locations refer to Fig. 5.5 Οι τιμές της παλινδρόμησης της γενετικής διαφοροποίησης βάσει του δείκτη FST / (1-F ST) σε σχέση με το λογάριθμο της γεωγραφικής απόστασης μεταξύ των περιοχών έδειξαν θετική συσχέτιση (Εικόνα 5.12) αυτή η συσχέτιση, όμως, δεν υπήρξε στατιστικά σημαντική σύμφωνα με τη δοκιμασία Mantel (p = 0,247). Σύμφωνα με την ανάλυση AMOVA (Πίνακας 5.16), το μεγαλύτερο μέρος της ποικιλότητας εντοπίστηκε στο επίπεδο μεταξύ των ατόμων (εντός των γεωγραφικών τοποθεσιών). Ένα 138

153 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ Εικόνα 5.12: Γενετική απομόνωση βάσει της γεωγραφικής απόστασης για τους πληθυσμούς του Hippospongia communis που μελετήθηκαν, όπως αυτή προκύπτει από τις τιμές του δείκτη F ST γενετικής διαφοροποίησης. (R 2 = 0.154, p = 0.247). Figure 5.12: Genetic isolation by geographic distance for the studied populations of Hippospongia communis inferred from multi-locus estimates of genetic differentiation F ST (R 2 = 0.154; p = 0.247). Πίνακας 5.16: Ανάλυση AMOVA μεταξύ γεωγραφικών περιοχών (Βόρειο και Νότιο Αιγαίο) και πληθυσμών (θέσεις δειγματοληψίας) για το Hippospongia communis: (Α) βασιζόμενη στον αριθμό των διαφορετικών αλληλομόρφων (F ST) και (B) στο άθροισμα των τετραγωνισμένων διαφορών (R ST). Table 5.16: Analysis of molecular variance (AMOVA) among groups (North and South Aegean Sea), populations (sampling locations) and individuals for Hippospongia communis based: (A) on the number of different alleles (F ST) and (B) on the sum of squared size differences (R ST). A!$ %& '()*+µ),-& (FST) Degrees of freedom Sum of squares Variance components Significance tests (P value) Variation (%)./%)0+ /12)3(*4, 5/2(674, ± /%)0+ 589:-µ4, ± /%)0+ )%;µ1, ± <+, B!$ %& '()*+µ),-& (RST) Degrees of freedom Sum of squares Variance components Significance tests (P value) Variation (%)./%)0+ /12)3(*4, 5/2(674, ± /%)0+ 589:-µ4, ± /%)0+ )%;µ1, ± <+,

154 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ μικρότερο ποσοστό της συνολικής ποικιλότητας αποδόθηκε σε διαφορές μεταξύ των τοποθεσιών (μεταξύ πληθυσμών εντός των ομάδων), με παρόμοιες τιμές για τους δείκτες FST και R ST. Δεν παρατηρήθηκε διαφοροποίηση μεταξύ των περιοχών του Βορείου και Νοτίου Αιγαίου (μεταξύ ομάδων), όπως έδειξαν οι αρνητικές τιμές της ποσοστιαίας ποικιλότητας. Η ανάλυση της γενετικής σύστασης των πληθυσμών κατά Bayes υπέδειξε τη μέγιστη πιθανοφάνεια για το μοντέλο με τις δύο ομόλογες γενετικά ομάδες ατόμων (Κ), όπως φαίνεται από την υψηλότερη τιμή του ΔΚ για Κ = 2 (Εικόνα 5.13). Τα αποτελέσματα της ανάλυσης για K = 2 φανέρωσαν τη διάκριση των ατόμων σε δύο ομάδες, που αντιστοιχούν στο Νότιο Αιγαίο (Ανατολική Κρήτη, Δωδεκάνησος και Κυκλάδες) και στο Βόρειο Αιγαίο (Σποράδες) (Εικόνα 5.14). Η μέθοδος DAPC επιβεβαίωσε το διαχωρισμό μεταξύ των πληθυσμών του H. communis από το Βόρειο και το Νότιο Αιγαίο, αφήνοντας να φανεί και μια διαφοροποίηση των πληθυσμών της Κω και των Κυκλάδων από εκείνους της Κρήτης και των Σποράδων (Εικόνα 5.15). Εικόνα 5.13: Τιμές του δείκτη ΔΚ για κάθε αριθμό ομόλογων γενετικά ομάδων ατόμων (K) του Hippospongia communis. Figure 5.13: Values of ΔΚ plotted for each number of genetically homogenous groups (K) of Hippospongia communis individuals. Εικόνα 5.14: Γενετική σύσταση των ατόμων του Hippospongia communis για το σύνολο των πληθυσμών τους στο Αιγαίο, όπως προκύπτει από την ανάλυση STRUCTURE για K = 2. Για ε- πεξήγηση των ακρωνυμίων των γεωγραφικών περιοχών βλέπε την Εικόνα 5.5. Figure 5.14: Geographical subdivision of Aegean populations of Hippospongia communis individuals as inferred using STRUCTURE for K = 2. For name abbreviations and designation of locations refer to Figure Συνδυαστική ανάλυση για τα είδη Spongia officinalis και Hippospongia communis Η ανάλυση της ενδοειδικής ποικιλότητας του είδους S. officinalis στη Μεσόγειο υπέδειξε υψηλά επίπεδα γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ της ανατολικής και της δυτικής λεκάνης. Το είδος H. communis όμως, βρέθηκε μόνο στις περιοχές δειγματοληψίας του Αιγαίου. Κατά συνέπεια, 140

155 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ d = Εικόνα 5.15: Διάκριση των πληθυσμών του Hippospongia communis σύμφωνα με τη μέθοδο DAPC. Οι γεωγραφικές περιοχές προέλευσης των ατόμων σημειώνονται με διαφορετικά χρώματα. Οι κηλίδες αντιπροσωπεύουν διαφορετικά άτομα. (1: ECR, 2: KOS, 3: CYC, 4: SPO). Figure 5.15: Subdivision of the studied Hippospongia communis populations according to the DAPC method: Sampled geographic locations are indicated with different colors; dots represent individuals; 95% inertia ellipses are included for each cluster. (1: ECR; 2: KOS; 3: CYC; 4: SPO). στη συνδυαστική ανάλυση των δύο ειδών που ακολούθησε, περιλήφθηκαν μόνο τα δείγματα που προέρχονται από το Αιγαίο, ούτως ώστε να αποφευχθούν σφάλματα που θα μπορούσαν να προκύψουν από την αυξημένη διαφοροποίηση μεταξύ απομακρυσμένων πληθυσμών του S. officinalis. α. Ποικιλότητα των μικροδορυφορικών δεικτών Μια σύνοψη των τιμών που περιγράφουν τη γενετική ποικιλότητα στους πληθυσμούς των δύο ειδών από το Αιγαίο για τους 8 μικροδορυφορικούς δείκτες που μελετήθηκαν δίνεται στον Πίνακα Οι πιο πολυμορφικοί δείκτες ήταν και πάλι οι Spof069, Spof136 και Spof 057 με μέσο αριθμό αλληλομόρφων περίπου 24 για τον καθένα. Η χαμηλότερη ποικιλότητα παρατηρήθηκε στον τόπο Spof148 με μέση τιμή 6,7 αλληλομόρφων. Ο πολυμορφισμός των μικροδορυφορικών τόπων ήταν γενικά λίγο υψηλότερος στους πληθυσμούς του S. officinalis, φτάνοντας την μέση τιμή των 23,6 αλληλομόρφων στη Δυτική Κρήτη (WCR), ενώ στο H. communis έφτασε αντίστοιχα τα 19,1 αλληλόμορφα στη Δωδεκάνησο (KOS). Ο συνολικός αριθμός αποκλειστικών αλληλομόρφων (pa) ήταν και πάλι υψηλός σε όλους τους τόπους, από 8 έως 21, και σε όλες τις περιοχές δειγματοληψίας για τους πληθυσμούς τους S. officinalis κυμάνθηκε από 3 έως 21, ενώ για το H. communis από 4 έως 14. Η αναμενόμενη ετεροζυγωτία (HE) ήταν γενικά υψηλή στους πληθυσμούς και των δύο ειδών και η μέση τιμή της κυμάνθηκε από 0,78 έως 0,90 χαμηλές έως μέτριες τιμές, που κυμάνθηκαν από 0,43 έως 0,81 παρουσίασε μόνο ο τόπος Spof148. Η παρατηρούμενη ετεροζυγωτία (HO) ήταν σταθερά χαμηλότερη από τη H E με λίγες εξαιρέσεις, ενώ οι μέσες τιμές της κυμάνθηκαν από 0,54 έως 0,71 το γεγονός αυτό υποδηλώνει την έλλειψη ετεροζυγωτών στους πληθυσμούς που μελετήθηκαν και επιβεβαιώνεται από τη στατιστικά σημαντική (p < 0,001) απόκλιση από την 141

156 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Πίνακας 5.17: Σύνοψη της γενετικής ποικιλότητας του Spongia officinalis (WCR, ECR1, NCR, KAR, CYC1, SPO1) και του Hippospongia communis (ECR2, KOS, CYC2, SPO2) στους οκτώ μικροδορυφορικούς τόπους που μελετήθηκαν και τις 7 γεωγραφικές περιοχές του Αιγαίου (για επεξήγηση των ακρωνυμίων βλέπε την Εικόνα 5.5). N: αριθμός ατόμων, N a: αριθμός αλληλομόρφων, H O: παρατηρούμενη ετεροζυγωτία, HE: αναμενόμενη ετεροζυγωτία, FIS: συντελεστής ομομιξίας, HWE: απόκλιση από το ισοζύγιο Hardy-Weinberg (*: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001), pa: αποκλειστικά αλληλόμορφα. Table 5.17: Summary of genetic variation for Spongia officinalis (WCR, ECR1, NCR, KAR, CYC1, PIP1) and Hippospongia communis (ECR2, KOS, CYC2, PIP2) at the 8 studied microsatellite loci and 10 Aegean locations (for name abbreviations and designation of locations refer to Figure 5.5). N: number of individuals; N a: number of alleles; HO: observed heterozygosity; H E: expected heterozygosity; FIS: inbreeding coefficient; HWE: departure from Hardy-Weinberg equilibrium (*: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001); pa: private alleles. 142

157 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ ισορροπία Hardy-Weinberg (HWE) που παρατηρήθηκε σε όλους τους πληθυσμούς και τους τόπους. Αν και οι τιμές του μέσου συντελεστή ομομιξίας FIS ήταν ομοιόμορφες σε όλους τους πληθυσμούς των δύο ειδών, ο FIS για μερικούς τόπους ήταν σημαντικά χαμηλότερος στους πληθυσμούς του H. communis, αποκτώντας σε ορισμένες περιπτώσεις αρνητικές τιμές. Πιθανότητα ύπαρξης μηδενικών αλληλομόρφων διαγνώστηκε σε όλους τους δείκτες που μελετήθηκαν (Πίνακας 5.18), χωρίς ενδείξεις για σφάλματα ανάγνωσης λόγω διαδοχικών κορυφών και παράβλεψης αλληλομόρφων μεγάλου μεγέθους. Ανισορροπία σύνδεσης παρατηρήθηκε επίσης μεταξύ των περισσότερων ζευγών τόπων (Πίνακας 5.19). Πίνακας 5.18: Ένδειξη για παρουσία μηδενικών αλληλομόρφων (σημειώνεται με + ) στους 8 μικροδορυφορικούς τόπους ανά πληθυσμό του Spongia officinalis (WCR, ECR1, NCR, KAR, CYC1, SPO1) και του Hippospongia communis (ECR2, KOS, CYC2, SPO2). Για επεξήγηση των ακρωνυμίων γεωγραφικών περιοχών βλέπε την Εικόνα 5.5. Table 5.18: Indication for the presence of null alleles (depicted with a + ) across 8 microsatellite loci and 10 Aegean locations for Spongia officinalis (WCR, ECR1, NCR, KAR, CYC1, PIP1) and Hippospongia communis (ECR2, KOS, CYC2, PIP2). For name abbreviations and designation of locations refer to Figure 5.5. WCR ECR1 ECR2 NCR KAR KOS CYC1 CYC2 SPO1 SPO2 Spof Spof Spof Spof Spof Spof Spof Spof Πίνακας 5.19: Ανίχνευση παρουσίας ανισορροπίας σύνδεσης μεταξύ των μικροδορυφορικών τόπων που αναλύθηκαν για τα Spongia officinalis και Hippospongia communis. Παρουσιάζονται οι τιμές στατιστικής πιθανότητας για την απουσία σύνδεσης μεταξύ των τόπων (*: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001). Table 5.19: Pairwise probability (P-values) for independent genotypes (no linkage disequilibrium) between microsatellite loci used for Spongia officinalis and Hippospongia communis (*: p < 0.05; **: p < 0.01; ***: p < 0.001). Spof054 Spof057 Spof069 Spof102 Spof130 Spof136 Spof148 Spof240 Spof054 Spof057 *** Spof069 *** Spof Spof Spof136 *** *** *** *** Spof Spof *** *** ***

158 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ β. Διαφοροποίηση και γονιδιακή ροή μεταξύ πληθυσμών Οι καθολικές (global) τιμές των δεικτών γενετικής διαφοροποίησης F ST και R ST συμπεριλαμβάνοντας και τα δύο είδη, ποίκιλαν από 0,017 έως 0,182 και από 0,031 έως 0,358 αντίστοιχα. Οι τιμές RST ανά μικροδορυφορικό τόπο υπήρξαν υψηλότερες από εκείνες του F ST σε όλες τις περιπτώσεις εκτός από τον Spof130 το ίδιο παρατηρήθηκε και για τις συνδυαστικές τιμές τους, με το RST να είναι μεγαλύτερο (0,129) από το F ST (0,059) (Πίνακας 5.20). Οι τιμές του F ST κατά ζεύγη μεταξύ γεωγραφικών τοποθεσιών ήταν σημαντικά διάφορες του μηδενός σε όλες τις περιπτώσεις και κυμαίνονταν από 0,017 έως 0,114 (Πίνακας 5.21). Ομοιομορφία όσον αφορά στις τιμές της γενετικής διαφοροποίησης παρατηρήθηκε εντός των ειδών. Οι κατά ζεύγη τιμές FST Πίνακας 5.20: Καθολικές τιμές των δεικτών γενετικής διαφοροποίησης FST και RST για το σύνολο των δειγμάτων των Spongia officinalis και Hippospongia communis, αναλόγως του μικροδορυφορικού δείκτη. CI: διάστημα εμπιστοσύνης. Table 5.20: Global single-locus and multi-locus F ST and RST values for all studied Spongia officinalis and Hippospongia communis populations. CI: Confidence Interval. Locus Spof054 Spof057 Spof069 Spof102 Spof130 Spof136 Spof148 Spof240 Multilocus 95% CI FST RST Πίνακας 5.21: Τιμές των δεικτών γενετικής διαφοροποίησης F ST (κάτω από τη διαγώνιο) και R ST (πάνω από τη διαγώνιο) μεταξύ γεωγραφικών περιοχών για το Spongia officinalis (WCR, ECR1, NCR, KAR, CYC1, SPO1) και το Hippospongia communis (ECR2, KOS, CYC2, SPO2) από τη συνδυαστική ανάλυση όλων των μικροδορυφορικών τόπων. Με κόκκινη γραφή επισημαίνεται η στατιστικά μη σημαντική διαφορά από το μηδέν σε επίπεδο p < 0.05, μετά τη διόρθωση Bonferroni. Για επεξήγηση των ακρωνυμίων των γεωγραφικών περιοχών βλέπε την Εικόνα 5.5. Table 5.21: Pairwise F ST (below diagonal) and R ST values (above diagonal) between geographic locations for Spongia officinalis (WCR, ECR1, NCR, KAR, CYC1, PIP1) and Hippospongia communis (ECR2, KOS, CYC2, PIP2) estimated from analysis of all studied microsatellite loci. Numbers in red indicate non-significant difference from zero at the 0.05 level after Bonferroni correction. For name abbreviations and designation of locations refer to Figure 5.5. WCR ECR1 ECR2 NCR KAR KOS CYC1 CYC2 SPO1 SPO2 WCR ECR ECR NCR KAR KOS CYC CYC SPO SPO

159 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ μεταξύ των περιοχών WCR, ECR1, NCR, KAR, CYC1 και SPO1, όπου βρέθηκε το S. officinalis είχαν μέσο όρο 0,047 και εύρος 0,017-0,075. Οι αντίστοιχες τιμές μεταξύ των περιοχών ECR2, KOS, CYC2 και SPO2, όπου βρέθηκε το H. communis, ήταν παρόμοιες (μέσος όρος 0,049 και εύρος 0,039-0,070). Οι τιμές του δείκτη FST ήταν γενικά υψηλότερες μεταξύ ζευγών τοποθεσιών που χαρακτηρίζονται από την παρουσία διαφορετικών ειδών, με μέση τιμή 0,071 και εύρος 0,041-0,114). Παρόμοια αποτελέσματα προέκυψαν και για τις μέσες τιμές του RST. Η μέση τιμή του R ST μεταξύ των τοποθεσιών με S. officinalis ήταν 0,083 (εύρος: 0,035-0,178), και μεταξύ τοποθεσιών με H. communis ήταν 0,086 (εύρος: 0,053-0,128). Μεταξύ ζευγών που χαρακτηρίζονταν από την παρουσία διαφορετικών ειδών η μέση τιμή RST έφτανε τα 0,157 (εύρος: 0,070-0,283). Τα παραπάνω αποτελέσματα συνοψίζονται στην Εικόνα 5.16, στην οποία φαίνεται η συσχέτιση μεταξύ των δεικτών FST και R ST για το σύνολο των πληθυσμών του Αιγαίου. Αν και οι υψηλότερες τιμές των δύο δεικτών εμφανίζονται γενικά μεταξύ τοποθεσιών που χαρακτηρίζονται από την παρουσία διαφορετικών ειδών, το χαμηλότερο κλάσμα τους επικαλύπτεται με το νέφος των αντίστοιχων τιμών που παρατηρούνται μεταξύ μονοειδικών πληθυσμών. Επίσης, δεν σχηματίζονται διακριτά νέφη τιμών, όπως στο αντίστοιχο διάγραμμα για το S. officinalis στις τρεις περιοχές της Μεσογείου (Εικόνα 5.6). Οι τιμές της παλινδρόμησης της γενετικής διαφοροποίησης βάσει του δείκτη FST / (1-F ST) σε σχέση με το λογάριθμο της γεωγραφικής απόστασης μεταξύ των περιοχών έδειξαν αρνητική συσχέτιση μεταξύ τους (Εικόνα 5.17), αλλά αυτή η συσχέτιση δεν αποδείχτηκε στατιστικά σημαντική (p = 0,201). Η αρνητική συσχέτιση ήταν εμφανώς αποτέλεσμα του γεγονότος ότι συμπεριλήφθηκαν τοποθεσίες κοντινές μεταξύ τους που όμως χαρακτηρίζονται από διαφορετικά είδη και άρα έχουν σχετικά υψηλές τιμές FST. Εικόνα 5.16: Συσχέτιση των τιμών των δεικτών γενετικής διαφοροποίησης F ST και RST μεταξύ πληθυσμών των ειδών Spongia officinalis και Hippospongia communis. Figure 5.16: Correlation of genetic differentiation based on estimates F ST and RST for Spongia officinalis and Hippospongia communis populations. 145

160 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Εικόνα 5.17: Γενετική απομόνωση βάσει της γεωγραφικής απόστασης για τους πληθυσμούς των Spongia officinalis και Hippospongia communis στο Αιγαίο, όπως αυτή προκύπτει από τις τιμές του δείκτη F ST γενετικής διαφοροποίησης. (R 2 = 0.011, p = 0.201). Figure 5.17: Genetic isolation by geographic distance for the studied populations of Spongia officinalis and Hippospongia communis inferred from multi-locus estimates of genetic differentiation F ST (R 2 = 0.011; p = 0.201). Σύμφωνα με την ανάλυση AMOVA (Πίνακας 5.22), το μεγαλύτερο μέρος της ποικιλότητας εντοπίστηκε στο επίπεδο μεταξύ των ατόμων (εντός των πληθυσμών), τόσο όταν η ανάλυση βασίστηκε στο μέτρο FST (90,52%) όσο και όταν βασίστηκε στο μέτρο R ST (92,90%). Ένα μέρος της ποικιλότητας αποδόθηκε σε διαφορές μεταξύ των γεωγραφικών τοποθεσιών (μεταξύ πληθυσμών, εντός των ομάδων) και ήταν 5,95% και 4,26% για τις δύο μεθόδους αντίστοιχα. Ένα ακόμη μικρότερο μέρος αποδόθηκε σε διαφορές μεταξύ των δύο ειδών (μεταξύ ομάδων), 3,53% και 2,85% αντίστοιχα. Το δενδρόγραμμα που προέκυψε βάσει της απόστασης χορδής μεταξύ των περιοχών δειγματοληψίας διαχωρίζει τα δύο είδη, με διάκριση των πληθυσμών τους σε δύο κλάδους, χωρίς ωστόσο μεγάλη γενετική απόσταση μεταξύ τους (Εικόνα 5.18). Η ανάλυση της γενετικής σύστασης των πληθυσμών κατά Bayes, υπέδειξε τη μέγιστη πιθανοφάνεια για το μοντέλο με τις έξι ομόλογες γενετικά ομάδες ατόμων (K), όπως φαίνεται από την υψηλότερη τιμή ΔK για K = 6 (Εικόνα 5.19). Μία δεύτερη σχετικά υψηλή κορυφή εμφανίζεται για K = 2, μια περίπτωση που επίσης εξετάστηκε. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης STRUCTURE για K = 2 (Εικόνα 5.20 A) έδειξαν διάκριση των ατόμων σε δύο ομάδες που χονδρικά αντιστοιχούν στα δύο είδη, αλλά χωρίς να διαχωρίζονται εντελώς ξεκάθαρα μεταξύ τους. Ο σταθμός KAR, που χαρακτηρίζεται από την παρουσία του S. officinalis, ταυτίζεται με την ομάδα του H. communis, ενώ για τους σταθμούς WCR και ECR1 (που και οι δύο χαρακτηρίζονται από την παρουσία του S. officinalis) τα άτομα δείχνουν να ανήκουν εξίσου και στις δύο ομάδες. Όταν ο αριθμός των γενετικά ομόλογων ομάδων λαμβάνεται ως 6 (Εικόνα 5.20 B), τα δύο είδη και πάλι χονδρικά διαχωρίζονται, ενώ παρατηρείται συγκρότηση των πληθυσμών σε κάποιο βαθμό, σύμφωνα με τη γεωγραφική προέλευση: τα άτομα του H. communis σχηματίζουν δύο ομάδες, μια με τους σταθμούς KOS, CYC2 και SPO2, και μια μόνο με το σταθμό ECR2. Αντίστοιχα, τα άτομα του S. officinalis σχηματίζουν 146

161 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ Πίνακας 5.22: Ανάλυση AMOVA μεταξύ ταξινομικών ομάδων (είδη Spongia officinalis και Hippospongia communis) και πληθυσμών (θέσεις δειγματοληψίας στο Αιγαίο): (Α) βασιζόμενη στον αριθμό των διαφορετικών αλληλομόρφων (F ST) και (B) στο άθροισμα των τετραγωνισμένων διαφορών (R ST). Table 5.22: Analysis of molecular variance (AMOVA) among groups (species Spongia officinalis and Hippospongia communis), populations (Aegean sampling locations) and individuals for Spongia officinalis and Hippospongia communis based: (A) on the number of different alleles (F ST) and (B) on the sum of squared size differences (RST). A!$ %& '()*+µ),-& (FST) Degrees of freedom Sum of squares Variance components Significance tests (P value) Variation (%)./%)0+ %)0(,1µ(*2, 1µ3'4, ± /%) µ2, ± /%)0+ )%9µ4, ± :+, B!$ %& '()*+µ),-& (RST) Degrees of freedom Sum of squares Variance components Significance tests (P value) Variation (%)./%)0+ %)0(,1µ(*2, 1µ3'4, ± /%) µ2, ± /%)0+ )%9µ4, ± :+, Εικόνα 5.18: Neighbour-Joining δενδρόγραμμα χωρίς ρίζα, βάσει της απόστασης χορδής μεταξύ πληθυσμών του Spongia officinalis (WCR, ECR1, NCR, KAR, CYC1, SPO1) και του Hippospongia communis (ECR2, KOS, CYC2, SPO2). Για επεξήγηση των ακρωνυμίων των γεωγραφικών περιοχών βλέπε την Εικόνα 5.5. Figure 5.18: Unrooted Neighbour- Joining tree constructed from estimates of chord distance among sampled Aegean populations of Spongia officinalis (WCR, ECR1, NCR, KAR, CYC1, SPO1) and Hippospongia communis (ECR2, KOS, CYC2, SPO2). For name abbreviations and designation of locations refer to Figure

162 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Εικόνα 5.19: Τιμές του δείκτη ΔΚ για κάθε αριθμό ομόλογων γενετικά ομάδων ατόμων (K) των Spongia officinalis και Hippospongia communis στο Αιγαίο. Figure 5.19: Values of ΔΚ plotted for each number of genetically homogenous groups (K) of Spongia officinalis and Hippospongia communis individuals of Aegean origin. Εικόνα 5.20: Γενετική σύσταση των ατόμων των Spongia officinalis (WCR, ECR1, NCR, KAR, CYC1, SPO1) και Hippospongia communis (ECR2, KOS, CYC2, SPO2 για το σύνολο των πληθυσμών τους στο Αιγαίο, όπως προκύπτει από την ανάλυση STRUCTURE: (Α) για K = 2 και (Β) για Κ = 6. Για επεξήγηση των ακρωνυμίων γεωγραφικών περιοχών βλέπε την Εικόνα 5.5. Figure 5.20: Geographical subdivision of North and South Aegean populations of Spongia officinalis (WCR, ECR1, NCR, KAR, CYC1, SPO1) and Hippospongia communis (ECR2, KOS, CYC2, SPO2) individuals as inferred using STRUCTURE: (A) for K = 2 and (B) for K = 6. For name abbreviations and designation of locations refer to Figure 5.5. τέσσερεις ομάδες, μια με τους σταθμούς WCR, ECR1 και NCR τρεις με τους σταθμούς KAR, CYC1 και SPO1 αντίστοιχα. Η μέθοδος DAPC έδειξε μέτρια διαφοροποίηση μεταξύ των πληθυσμών του S. officinalis και του H. communis στον πρώτο άξονα PCA (Εικόνα 5.21). Αυτό ήταν φανερό από την τάση των συστάδων να ομαδοποιούνται κυρίως σύμφωνα με τη σύνθεση των ειδών, και δευτερευόντως σύμφωνα με τη γεωγραφική προέλευση. Όμως η απόσταση μεταξύ των δύο κύριων ομάδων που σχηματίζονται δεν φαίνεται ιδιαίτερα μεγάλη, αφού οι ομάδες του S. officinalis, ιδιαίτερα αυτές από 148

163 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ την Κρήτη, αναμιγνύονται μερικώς με εκείνες του H. communis. Ένας ξεκάθαρος όμως διαχωρισμός του πληθυσμού της Καρπάθου (που αποτελείται από S. officinalis) από όλες τις άλλες ομάδες ήταν φανερός στο δεύτερο άξονα PCA. d = Εικόνα 5.21: Διάκριση των πληθυσμών των Spongia officinalis και Hippospongia communis σύμφωνα με τη μέθοδο DAPC. Οι γεωγραφικές περιοχές προέλευσης των ατόμων σημειώνονται με διαφορετικά χρώματα. Οι κηλίδες αντιπροσωπεύουν διαφορετικά άτομα. (1: WCR, 2: ECR1, 3: ECR2, 4: NCR, 5: KAR, 6: KOS, 7: CYC1, 8: CYC2, 9: SPO1, 10: SPO2) Hippospongia Spongia 7 9 Figure 5.21: Subdivision of the studied Spongia officinalis and Hippospongia communis populations according to the DAPC method. Sampled geographic locations are indicated with different colours; dots represent individuals; 95% inertia ellipses are included for each cluster. (1: WCR; 2: ECR1; 3: ECR2; 4: NCR; 5: KAR; 6: KOS; 7: CYC1; 8: CYC2; 9: SPO1; 10: SPO2). 5.4 Συζήτηση Η ανάλυση των μικροδορυφορικών δεικτών στους σπόγγους S. officinalis και H. communis έδειξε υψηλό βαθμό πολυμορφισμού και στα δύο είδη, τόσο στο επίπεδο του ατόμου όσο και μεταξύ των πληθυσμών τους. Ανάλογος πολυμορφισμός δεν είχε παρατηρηθεί στις αναλύσεις του μιτοχονδριακού γονιδίου COI, το οποίο εμφανίστηκε συντηρητικό και δεν επέτρεψε καμία διάκριση πληθυσμών εντός της Μεσογειακής λεκάνης (βλέπε Κεφάλαιο 4). α. Ποικιλότητα εντός των πληθυσμών Η γενετική ποικιλότητα, όπως εκφράζεται με την αναμενόμενη ετεροζυγωτία (HE) ήταν υψηλή για όλες τις γεωγραφικές περιοχές και τους τόπους που μελετήθηκαν η μέση HE σε όλους τους πληθυσμούς ήταν 0,84 ± 0,05 SD, υψηλότερη από την αντίστοιχη για τους Μεσογειακούς πληθυσμούς των σπόγγων Crambe crambe (0,61 ± 0,05 SD) (Duran et al. 2004) και Scopalina lophyropoda (0,41 ± 0,06 SD) (Blanquer & Uriz 2010). Χαρακτηριστικά υψηλή γενετική ποικιλότητα 149

164 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ παρατηρήθηκε επίσης και με τη μορφή του πλήθους των αλληλομόρφων. Ένας μέσος αριθμός 17,8 (± 6,2 SD) αλληλομόρφων υπολογίστηκε ανά πληθυσμό για όλους τους τόπους. Αυτός ο αριθμός είναι σημαντικά μεγαλύτερος από εκείνον που έχει υπολογιστεί για το Crambe crambe (5,9 ± 0,9 SD) (Duran et al. 2004) ή το Scopalina lophyropoda (3,6 ± 0,8 SD) (Blanquer & Uriz 2010). Ο μέσος αριθμός αλληλομόρφων που αναφέρθηκε στην παρούσα έρευνα, πάντως, ήταν πιο κοντά σε εκείνους που έχουν βρεθεί για άλλα θαλάσσια ασπόνδυλα, όπως ο αχινός Strongylocentrotus droebachiensis με Νa = 13,4 ± 3,6 SD (Addison & Hart 2004) ή το κοράλλι Acropora palmata με Ν a = 12,4 ± 3,0 SD (Baums et al. 2005). Αν και ο αριθμός των αλληλομόρφων δεν μπορεί να επιτρέψει ακριβείς συγκρίσεις, αφού μπορεί να εξαρτάται από το μέγεθος του δείγματος (σε αντίθεση με την HE), οι διαφορές ή οι ομοιότητες στα απόλυτα μεγέθη που διαφαίνονται από τις παραπάνω αντιπαραβολές είναι αρκετά εμφανείς. Ένας αυξημένος αριθμός ομοζυγωτών (homozygote excess) παρατηρήθηκε στις περισσότερες περιπτώσεις, συνοδευόμενος από υψηλές θετικές τιμές του συντελεστή ομομιξίας FIS. Η τιμή του F IS είναι ενδεικτική του επιπέδου ενδογαμίας (δηλαδή της διασταύρωσης μεταξύ συγγενικών ατόμων) μέσα σε ένα πληθυσμό και μπορεί ακόμη να χρησιμοποιηθεί ως μέτρο της απόκλισης από το θεωρητικό ισοζύγιο Hardy-Weinberg. Η μέση τιμή FIS σε όλους τους πληθυσμούς των ειδών που μελετήθηκαν ήταν 0,252 ± 0,050 SD, πολύ κοντά στη μέση τιμή 0,211 ± 0,105 SD που υπολογίστηκε από τους Duran et al. (2004) για το C. crambe. Το είδος αυτό σχηματίζει πυκνούς και συνεχείς πληθυσμούς κατά μήκος των ακτών της Δυτικής Μεσογείου. Οι συγγραφείς απέδωσαν τις υψηλές τιμές FIS και την παρατηρούμενη έλλειψη ετεροζυγωτών (heterozygote deficiency) κυρίως στη διασταύρωση μεταξύ συγγενικών ατόμων, εξαιτίας της περιορισμένης δυνατότητας για διασπορά των προνυμφών και των γαμετών που έχει διαπιστωθεί για το είδος. Αντίθετα, οι Blanquer & Uriz (2010) ανέφεραν αρνητικές τιμές FIS (-0,055 ± 0,045 SD) και περίσσεια ετεροζυγωτών στο S. lophyropoda, ένα είδος που χαρακτηρίζεται εγγενώς από μικρούς, κατακερματισμένους πληθυσμούς και επομένως είναι αναμενόμενο να παρουσιάζει υψηλά επίπεδα ενδογαμίας. Η περιορισμένη ενδογαμία αποδόθηκε στην περίπτωση αυτή σε άγνωστους, προς το παρόν, εξελικτικούς μηχανισμούς που θα μπορούσαν να παρεμποδίζουν τη σύζευξη συγγενικών ατόμων ή να προωθούν την επιλογή των ετεροζυγωτών. Ωστόσο, ένα ποσοστό ενδογαμίας και έλλειψης ετεροζυγωτών αναφέρεται αρκετά συχνά για τα θαλάσσια ασπόνδυλα, ιδίως εκείνα που ζουν προσκολλημένα και έχουν πελαγικές προνύμφες, όπως τα κοράλλια και τα ασκίδια (π.χ. Gutiérrez- Rodríguez & Lasker 2004, Le Goff-Vitry et al. 2004, Pérez-Portela & Turon 2008). Επίσης, οι Addison & Hart (2005) κατέγραψαν σημαντικά αυξημένες τιμές του δείκτη FIS σε θαλάσσια είδη που απελευθερώνουν αρσενικούς γαμέτες στο πλαγκτό (όπως οι σπόγγοι). Τα είδη S. officinalis και H. communis στην παρούσα έρευνα ανταποκρίθηκαν σ αυτήν την τάση, παρουσιάζοντας υψηλά επίπεδα ενδογαμίας και σημαντική απόκλιση από το ισοζύγιο Hardy-Weinberg λόγω έλλειψης ετεροζυγωτών. Αυτό μπορεί να αποδοθεί στη μικρή ικανότητα διασποράς των προνυμφών (ή των γαμετών), που ευνοεί τη διασταύρωση ανάμεσα σε γειτονικά και άρα συγγενικά άτομα. Μια άλλη αιτία θα μπορούσε να είναι η επίδραση του φαινομένου Wahlund (Allendorf & Luikart 2007), το οποίο μπορεί να προκληθεί από εσφαλμένη σύμπτυξη γενετικά διακριτών υποπληθυσμών κατά τη στατιστική ανάλυση. Μια τέτοια υπόθεση θα μπορούσε να ισχύει για την παρούσα μελέτη, αφού η χαμηλή αφθονία ατόμων των ειδών που μελετήθηκαν στις περιοχές δειγματοληψίας επέβαλε την συνένωση δειγμάτων από γειτονικές τοποθεσίες. Πάντως, στις περιπτώσεις που δείγματα από γειτονικές τοποθεσίες αναλύθηκαν συγκεντρωτικά (π.χ. οι περιπτώσεις SPO, ECR, KAR), δεν παρατηρήθηκαν αξιοσημείωτες διαφορές στις τιμές FIS ή την απόκλιση από το ισοζύγιο HWE. 150

165 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ Μια επιπλέον εξήγηση για τα ποσοστά ομομιξίας και έλλειψης ετεροζυγωτών που παρατηρήθηκαν θα μπορούσε να είναι η παρουσία σφαλμάτων που εκδηλώθηκαν στην ανάλυση υπό τη μορφή των μηδενικών αλληλομόρφων (Selkoe & Toonen 2006). Πράγματι, η πιθανότητα για ύπαρξη μηδενικών αλληλομόρφων (δηλαδή μικροδορυφορικών περιοχών που δεν ενισχύονται με την PCR, οδηγώντας έτσι σε εσφαλμένο χαρακτηρισμό κάποιων ετεροζυγωτικών ατόμων ως ομοζυγωτικών) ήταν υπαρκτή στις αναλύσεις των ειδών S. officinalis και H. communis. Τα μηδενικά αλληλόμορφα εμφανίζουν αυξημένη συχνότητα εμφάνισης στα ασπόνδυλα (Launey & Hedgecock 2001) και η παρουσία τους συνήθως αποδίδεται σε μεταλλάξεις στις συντηρημένες περιοχές εκατέρωθεν των μικροδορυφορικών (flanking regions) (Callen et al. 1993). Ωστόσο, τα μηδενικά αλληλόμορφα εμφανίζονται συνήθως σε συγκεκριμένους πληθυσμούς, ενώ στην παρούσα ανάλυση υπήρχαν στις περισσότερες τοποθεσίες, χωρίς κάποιο συγκεκριμένο πρότυπο, και η έλλειψη ετεροζυγωτών υπήρξε σχετικά ομοιογενής μεταξύ των πληθυσμών. Ακόμη, δεν παρατηρήθηκαν στις αναλύσεις σφάλματα σχετιζόμενα με παράβλεψη αλληλομόρφων μεγάλου μεγέθους (large allele dropout), δηλαδή προτίμηση για ενίσχυση αλληλομόρφων των μικρών κλάσεων μεγέθους κατά την PCR, ή με λανθασμένη ανάγνωση λόγω διαδοχικών κορυφών (stuttering), δηλαδή πλασματικών αποτελεσμάτων PCR λόγω λαθών στην αντιγραφή. Πιθανότητα για ύπαρξη ανισορροπίας σύνδεσης (linkage disequilibrium), δηλαδή φυσική ή λειτουργική συσχέτιση ενός ζεύγους τόπων που οδηγεί στη μεταφορά τους ως ζεύγους στους απογόνους, φάνηκε να υπάρχει σε αρκετά ζεύγη των μικροδορυφορικών περιοχών που εξετάστηκαν, αλλά η πιθανότητα αυτή δεν κατανεμήθηκε ομοιόμορφα στα τρία επίπεδα της ανάλυσης. Ακόμη, πρέπει να σημειωθεί ότι δεν παρατηρήθηκαν ενδείξεις για την ύπαρξη μηδενικών αλληλομόρφων κατά τον αρχικό χαρακτηρισμό των μικροδορυφορικών δεικτών. Καθώς η ανισορροπία μεταξύ μη συνδεδεμένων τόπων μπορεί να προκύψει από ενδογαμία (Hartl & Clarke 1997), μπορεί να θεωρηθεί ότι τα παρατηρούμενα φαινόμενα σύνδεσης οφείλονται σε ενδογενή χαρακτηριστικά των πληθυσμών που μελετήθηκαν. Για παράδειγμα, ο υψηλός βαθμός ομομιξίας που ανιχνεύθηκε στον πληθυσμό S. officinalis της Καρπάθου, θα μπορούσε να σχετιστεί με το σαφή διαχωρισμό του από τους υπόλοιπους πληθυσμούς του ίδιου είδους στο Αιγαίο, που διαπιστώθηκε στις περισσότερες στατιστικές αναλύσεις. β. Ποικιλότητα μεταξύ πληθυσμών Ο ευρύτερα χρησιμοποιούμενος δείκτης εκτίμησης της γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ πληθυσμιακών μονάδων είναι ο FST (Wright 1951), ο οποίος αποτελεί μέτρο της απόκλισης στη συχνότητα των αλληλομόρφων μεταξύ πληθυσμών. Οι τιμές που παίρνει ο FST ακολουθούν το μοντέλο άπειρων αλληλομόρφων (Infinite Allele Model - IAM, Kimura & Crow 1964), σύμφωνα με το οποίο κάθε μεταλλακτικό φαινόμενο καταλήγει στη δημιουργία ενός νέου αλληλομόρφου, χωρίς να λαμβάνεται υπόψη η ομοπλασία (Bhargava & Fuentes 2010). Η ομοπλασία στην περίπτωση των μικροδορυφορικών περιοχών αφορά στο μέγεθος των αλληλομόρφων, εκφράζεται δηλαδή ως σύγκλιση στο μέγεθος εξελικτικά διακριτών αλληλομόρφων. Ένα δεύτερο ευρέως χρησιμοποιούμενο μοντέλο, που θεωρείται πιο εξειδικευμένο για την περιγραφή των μεταλλάξεων στο μικροδορυφορικό DNA, είναι το μοντέλο κλιμακωτής μετάλλαξης (Stepwise Mutation Model - SMM, Ohta & Kimura 1973), σύμφωνα με το οποίο κάθε μεταλλακτικό φαινόμενο προσθέτει ή διαγράφει μία μονάδα επανάληψης (π.χ. ένα δινουκλεοτίδιο) στην αλληλουχία με τον τρόπο αυτό, το μοντέλο διαθέτει ένα είδος μνήμης του μεγέθους των αλληλομόρφων. Το μοντέλο αυτό 151

166 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ εκφράζει ο δείκτης R ST (Slatkin 1995), που αποτελεί ένα εναλλακτικό μέτρο προσδιορισμού της γενετικής διαφοροποίησης. Παρόλο που κανένας από τους δύο παραπάνω δείκτες (και τα σχετιζόμενα μοντέλα) δεν θεωρείται ότι αποδίδει με ακρίβεια το λειτουργικό πρότυπο των μεταλλάξεων στο μικροδορυφορικό DNA και για το λόγο αυτόν έχουν προταθεί εναλλακτικά μοντέλα (Balloux & Lugon-Moulin 2002), οι εκτιμητές FST και R ST είναι οι συχνότερα χρησιμοποιούμενοι δείκτες μέτρησης της γενετικής διαφοροποίησης στις μελέτες πληθυσμιακής γενετικής, προσφέροντας με τον τρόπο αυτό δυνατότητα σύγκρισης και αξιολόγησης των αποτελεσμάτων. Πληθυσμιακή συγκρότηση (population structure) παρατηρήθηκε στα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας τόσο στις περιπτώσεις που τα είδη S. officinalis και H. communis εξετάστηκαν χωριστά, όσο και όταν τα δεδομένα των δύο ειδών εξετάστηκαν από κοινού. Οι καθολικές (global) τιμές του FST για όλους τους μικροδορυφορικούς δείκτες κυμάνθηκαν από 0,048 έως 0,065 και ήταν σημαντικά μικρότερες από τις αντίστοιχες καταγεγραμμένες τιμές για τους σπόγγους Crambe crambe (0,18) (Duran et al. 2004) και Scopalina lophyropoda (0,122) (Blanquer & Uriz 2010) που έχουν μελετηθεί σε παρόμοια γεωγραφική κλίμακα. Πρέπει ωστόσο να σημειωθεί ότι, σύμφωνα με τους αντίστοιχους συγγραφείς, και τα δύο παραπάνω είδη χαρακτηρίζονται από ισχυρή πληθυσμιακή συγκρότηση. Η διακύμανση του καθολικού FST σε μεμονωμένους μικροδορυφορικούς δείκτες που παρατηρήθηκε στην παρούσα έρευνα δείχνει ότι η πληροφορία που εμπεριέχεται σε κάθε τόπο είναι διαφορετική, γεγονός συνηθισμένο στους συγκεκριμένους δείκτες (Selkoe & Toonen 2006). Οι καθολικές τιμές RST υπήρξαν έντονα υψηλότερες από τις αντίστοιχες τιμές FST, φτάνοντας σε ακραίες διαφοροποιήσεις κατά την εξέταση του S. officinalis από όλες τις περιοχές της Μεσογείου. Αυτό καταδεικνύει ότι οι μικροδορυφορικοί δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν συμπεριφέρονται διαφορετικά κάτω από τις προϋποθέσεις των δύο διαφορετικών εξελικτικών μοντέλων που περιγράφηκαν νωρίτερα. Αυτό θα μπορούσε να εξηγηθεί από το γεγονός ότι το μοντέλο SMM, που υποστηρίζει θεωρητικά τον RST, θεωρεί τα αλληλόμορφα που έχουν μεγάλη διαφορά στο μέγεθος ως λιγότερο συγγενικά μεταξύ τους σε σχέση με εκείνα που έχουν παρόμοιο μέγεθος (Balloux & Lugon-Moulin 2002). Όπως φαίνεται από τις συχνότητες των αλληλομόρφων που παρουσιάζονται στον Πίνακα Δ1 (Παράρτημα Δ), στους περισσότερους μικροδορυφορικούς δείκτες παρατηρούνται αλληλόμορφα που διαφέρουν κατά μεγάλο αριθμό επαναλήψεων, και αυτό γίνεται περισσότερο φανερό όταν συγκρίνονται οι πληθυσμοί της Δυτικής Μεσογείου με εκείνους του Αιγαίου στην περίπτωση αυτή υπάρχουν κλάσεις μεγέθους που χαρακτηρίζουν κάθε μία από τις δύο περιοχές και που είναι εντελώς απούσες από την άλλη. Η παρατήρηση αυτή μπορεί να εξηγήσει την έμφαση που χαρακτηρίζει τις καθολικές τιμές του δείκτη RST έναντι αυτών του F ST. Ένα σαφές πρότυπο πληθυσμιακής συγκρότησης εμφανίζεται όταν η γενετική διαφοροποίηση εκτιμάται μεταξύ των γεωγραφικών τοποθεσιών κατά ζεύγη. Ο δείκτης FST για το S. officinalis εμφανίζει μέγιστες τιμές μεταξύ των πληθυσμών του Αιγαίου και της Νότιας Γαλλίας, με μέση τιμή 0,080 ± 0,018 SD, η οποία μπορεί να αντιστοιχηθεί σε ένα μέσο επίπεδο γενετικής διαφοροποίησης (Hartl & Clarke 1997), παρόλο που χρειάζεται προσοχή στην ερμηνεία των τιμών του FST καθαυτών (Balloux & Lugon-Moulin 2002). Ακόμη μεγαλύτερες τιμές γενετικής διαφοροποίησης παρατηρούνται σταθερά μεταξύ των πληθυσμών του Γιβραλτάρ και όλων των Μεσογειακών περιοχών με μέση τιμή FST 0,126 ± 0,016 SD. Οι τιμές αυτές θα πρέπει οπωσδήποτε να ληφθούν υπόψη με προσοχή, αφού ο πληθυσμός που εξετάστηκε από το Γιβραλτάρ αποτελείται από μικρό αριθμό ατόμων (N = 13). Ωστόσο, αυτή η παρατήρηση ενισχύεται από τον σαφή διαχωρισμό της ομάδας των ατόμων του Γιβραλτάρ που έδωσε η ανάλυση DAPC, ενώ συμφωνεί 152

167 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ και με τα αποτελέσματα της ποικιλότητας του γονιδίου COI που αποκάλυψε ισχυρή διαφοροποίηση του αντίστοιχου κλάδου (βλέπε Κεφάλαιο 4). Ακόμη, σχετικά υψηλές τιμές FST (0,278) έχουν αναφερθεί από τους Noyer et al. (2009) μεταξύ δύο πληθυσμών του Spongia agaricina από τη Νότια Γαλλία και το Γιβραλτάρ με χρήση μικροδορυφορικών δεικτών. Οι παραπάνω παρατηρήσεις βρίσκονται σε συμφωνία με τη διαπιστωμένη ύπαρξη ενός φυλογεωγραφικού κλινούς μεταξύ της δυτικής και ανατολικής λεκάνης της Μεσογείου, καθώς και ενός φυλογεωγραφικού φραγμού μεταξύ της Μεσογείου και της Θάλασσας του Αλμποράν, όπως έχουν δείξει στην πρόσφατη επισκόπησή τους οι Patarnello et al. (2007). Η γενετική διαφοροποίηση που καταγράφηκε μεταξύ των πληθυσμών του Αιγαίου, τόσο για το είδος S. officinalis όσο και για το H. communis, ήταν σε γενικές γραμμές χαμηλή (μέση τιμή FST: 0,047 ± 0,016 SD και 0,049 ± 0,012 SD αντίστοιχα). Παρόμοιες ήταν και οι σχετικές τιμές για τους πληθυσμούς του S. officinalis από τη Νότια Γαλλία (0,035 ± 0,015 SD). Όμως, στο σύνολό τους σχεδόν, οι τιμές του FST μεταξύ των πληθυσμών των περιοχών αυτών ήταν σημαντικά διάφορες του μηδενός, γεγονός που δείχνει ότι η γενετική διαφοροποίηση μεταξύ πληθυσμών είναι υπαρκτή (αν και ασθενής) εντός των καθορισμένων γεωγραφικών περιοχών της Μεσογείου. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι μικρή μόνο γενετική διαφοροποίηση παρατηρήθηκε μεταξύ των ειδών S. officinalis και H. communis, όταν οι πληθυσμοί τους εξετάστηκαν κατά ζεύγη (μέση τιμή F ST = 0,071 ± 0,017 SD). Η τιμή αυτή είναι σαφώς μικρότερη από την αντίστοιχη μεταξύ των πληθυσμών του S. officinalis από τη Δυτική και την Ανατολική Μεσόγειο, ενώ είναι οριακά μόνο μεγαλύτερη από τη γενετική διαφοροποίηση που καταγράφηκε μεταξύ μονοειδικών πληθυσμών του S. officinalis στο Αιγαίο. Αυτό βρίσκεται σε συμφωνία με τα αποτελέσματά της ποικιλότητας του γονιδίου COI (βλέπε Κεφάλαιο 4), που δεν έδειξαν διάκριση μεταξύ των δύο ειδών, καθώς επίσης και με την ομαλή ενίσχυση των μικροδορυφορικών τόπων που αναπτύχθηκαν αρχικά για το S. officinalis, στο H. communis (cross-amplification). Τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι τα δύο αυτά παραδοσιακά διακριτά είδη, θα μπορούσαν να θεωρηθούν ως μία ενιαία ταξινομική μονάδα (taxonomic unit). Παραταύτα, ένας βαθμός γενετικής διαφοροποίησης παρατηρήθηκε μεταξύ γειτονικών πληθυσμών S. officinalis και H. communis, όπως οι πληθυσμοί ECR1 και ECR2, με μέση γεωγραφική απόσταση περίπου 9 Km και τιμή FST 0,062 μεταξύ τους. Αυτό σημαίνει ότι η γονιδιακή ροή περιορίζεται μεταξύ πληθυσμών των δύο ειδών σε γειτονικές περιοχές, με μηχανισμούς που θα πρέπει να είναι ανεξάρτητοι από τη γεωγραφική απόσταση. Για παράδειγμα, το γεγονός ότι το H. communis, όταν απαντά στην ίδια γεωγραφική περιοχή με το S. officinalis, εντοπίζεται σε διαφορετικά μικροενδιαιτήματα (π.χ. ανάμεσα σε συστάδες φανερογάμων), θα μπορούσε να προκαλεί μια διαφοροποίηση στις στενές περιβαλλοντικές συνθήκες που καθορίζουν τον αναπαραγωγικό κύκλο ή την απελευθέρωση των προνυμφών, επάγοντας σε ένα βαθμό φραγμό στη γονιδιακή ροή. Σε κάθε περίπτωση, η γεωγραφική απόσταση αποδείχθηκε παράγοντας που επηρεάζει τη γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των πληθυσμών του S. officinalis όπως φάνηκε από τη θετική και στατιστικά σημαντική παλινδρόμηση (R 2 = 0,462) μεταξύ τους (Εικόνα 5.7). Παρόμοια επίπεδα απομόνωσης με την απόσταση (isolation by distance) έχουν καταγραφεί για το σπόγγο Scopalina lophyropoda (R 2 = 0,458) από τις Blanquer & Uriz (2010), ενώ μικρότερες τιμές (R 2 = 0,292) χαρακτηρίζουν το Crambe crambe (Duran et al. 2004) σε ανάλογη γεωγραφική κλίμακα στη Μεσόγειο. Παρόλο που η ικανότητα διασποράς των προνυμφών και των γαμετών στην οικογένεια των Σπογγιδών δεν έχει μελετηθεί μέχρι σήμερα, θα πρέπει να είναι σε γενικές γραμμές περιορισμένη, κάτι που θεωρείται κανόνας στα Ποροφόρα λόγω των λεκιθότροφων, σχετικά 153

168 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ βραχύβιων προνυμφών τους (Maldonado 2006, Shanks 2009). Στην περίπτωση του Scopalina lophyropoda, έχει αποδειχτεί πειραματικά ότι οι προνύμφες έχουν φιλοπατρική συμπεριφορά (Uriz et al. 1998). Για τους πληθυσμούς του H. communis από το Αιγαίο, πάντως, η συσχέτιση μεταξύ γενετικής διαφοροποίησης και γεωγραφικής απόστασης είναι μικρότερη, με το R 2 να κατέρχεται στο 0,154 χωρίς στατιστικά σημαντική συσχέτιση, γεγονός που δείχνει ασθενέστερη συγκρότηση των πληθυσμών του είδους θα μπορούσε, βέβαια, αυτό να είναι αποτέλεσμα του πολύ πιο περιορισμένου γεωγραφικού εύρους των δειγμάτων που εξετάστηκαν. Στην ανάλυση και των δύο ειδών από κοινού, η αντίστοιχη συσχέτιση ήταν ελαφρά αρνητική (R 2 = 0,011). Αυτή η εικόνα διαμορφώνεται εμφανώς από την ύπαρξη ζευγών πληθυσμών των δύο ειδών, με μικρή ενδιάμεση γεωγραφική απόσταση και μέτρια επίπεδα γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ τους, όπως εξηγήθηκε στην προηγούμενη παράγραφο. Το μέγιστο ποσοστό γενετικής ποικιλότητας αποδόθηκε από την ανάλυση AMOVA εντός των πληθυσμών των δύο ειδών, τόσο στην περίπτωση που αυτά εξετάστηκαν ξεχωριστά και κατά τη συνδυαστική τους ανάλυση. Αυτό συμφωνεί με την υψηλή ενδοειδική ποικιλότητα που αποκαλύφθηκε με τον υπολογισμό της παρατηρούμενης και αναμενόμενης ετεροζυγωτίας. Πάντως, στην περίπτωση του S. officinalis σημαντικό ποσοστό ποικιλότητας αποδόθηκε επίσης μεταξύ των δώδεκα τοποθεσιών δειγματοληψίας και μεταξύ των τριών ευρύτερων γεωγραφικών περιοχών (Αιγαίο, Νότια Γαλλία και Γιβραλτάρ). Η μέθοδος ομαδοποίησης του STRUCTURE όμως, κατάφερε να διακρίνει μόνο δύο ομοιογενείς ομάδες, που αντιστοιχούν στο Αιγαίο και τη Δυτική Μεσόγειο. Το ίδιο προέκυψε και από το δενδρόγραμμα βάσει της απόστασης χορδής μεταξύ των υποπληθυσμών του S. officinalis, στο οποίο διακρίθηκαν δύο κλάδοι που αντιστοιχούν στις δύο λεκάνες της Μεσογείου, ενώ η περιοχή του Γιβραλτάρ φαίνεται επίσης να διαχωρίζεται ως διακριτός κλάδος. Αντίθετα, για το H. communis δεν προέκυψε διαφοροποίηση με την AMOVA μεταξύ των περιοχών του Νότιου και Βόρειου Αιγαίου όπου βρέθηκε το είδος. Υψηλά και σημαντικά επίπεδα διαφοροποίησης παρατηρήθηκαν, ωστόσο, μεταξύ των τεσσάρων περιοχών δειγματοληψίας, προς επίρρωση της υψηλής πληθυσμιακής συγκρότησης που έδειξαν οι δείκτες FST και R ST. Το ίδιο έδειξε και η ανάλυση DAPC, με την οποία διαχωρίστηκαν οι πληθυσμοί του Αιγαίου. Αντίθετα, η Μπεϊεζιανή ανάλυση υπέδειξε την ύπαρξη δύο γενετικά διακριτών ομάδων που αντιστοιχούν στο βόρειο και το νότιο Αιγαίο, χωρίς όμως σαφή διαχωρισμό των ατόμων που ανήκουν σ αυτές. Το συγκεκριμένο πρότυπο για το είδος H. communis, καθώς και οι διαφορές στα αποτελέσματα μεταξύ των αναλύσεων AMOVA / DAPC και της ανάλυσης κατά Bayes καταδεικνύουν την απουσία ενός ισχυρού φραγμού στη γονιδιακή ροή στο Αιγαίο, όπως για παράδειγμα αυτός που παρατηρήθηκε μεταξύ Δυτικής και Ανατολικής Μεσογείου για το S. officinalis. Τα ευρήματα υπήρξαν πιο πολύπλοκα όταν οι πληθυσμοί των δύο ειδών από το Αιγαίο εξετάστηκαν από κοινού. Στην περίπτωση αυτή, ένας βαθμός διαφοροποίησης μεταξύ των δύο ειδών ανιχνεύθηκε από την AMOVA και την ανάλυση των αποστάσεων χορδής πάντως, το επίπεδο ποικιλότητας που παρατηρήθηκε με την πρώτη ανάλυση και οι αποστάσεις μεταξύ των δύο ομάδων στο δέντρο που κατασκευάστηκε με τη δεύτερη είναι μικρότερα από τα αντίστοιχα μεγέθη για τους πληθυσμούς του S. officinalis της Δυτικής και Ανατολικής Μεσογείου. Ειδικά για την AMOVA, το ποσοστό διαφοροποίησης μεταξύ των δύο ειδών, αν και σημαντικό, είναι μικρότερο από το αντίστοιχο που καταγράφηκε μεταξύ των δέκα πληθυσμών και των δύο ειδών στο Αιγαίο. Η ανάλυση κατά Bayes δεν έδειξε ξεκάθαρο πρότυπο όσον αφορά το διαχωρισμό, ενώ η DAPC έδειξε 154

169 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ ελαφρά διαφοροποίηση μεταξύ των δύο ειδών, με αποστάσεις όμως που αναλογούν σε διαφοροποίηση πληθυσμών και όχι διαχωρισμό ειδών. Συμπερασματικά, υψηλή ενδοπληθυσμιακή ποικιλότητα και γενετική συγκρότηση των πληθυσμών διαπιστώθηκαν για το S. officinalis στη Μεσόγειο και το H. communis στο Αιγαίο. Η γενετική διαφοροποίηση μεταξύ γεωγραφικά διακριτών πληθυσμών και για τα δύο είδη είναι στατιστικά σημαντική αλλά ποσοτικά ασθενής, όπως είναι αναμενόμενο για το σχετικά συνεχές Μεσογειακό θαλάσσιο οικοσύστημα, και καθορίζεται σε μεγάλο βαθμό από τη γεωγραφική απόσταση. Αυτή η συγκρότηση πιθανόν οφείλεται στις περιορισμένες ικανότητες διασποράς των προνυμφών και των γαμετών του είδους, σε συνδυασμό με τις υδρολογικές συνθήκες που επικρατούν στη Μεσόγειο. Η ανάλυση των μικροδορυφορικών δεικτών αποκάλυψε μικρή διαφοροποίηση μεταξύ των δύο ειδών που μελετήθηκαν, μικρότερη από εκείνη που βρέθηκε μεταξύ γεωγραφικά απομακρυσμένων πληθυσμών του είδους S. officinalis. Το εύρημα αυτό ενισχύει τα ευρήματα από την ανάλυση του μιτοχονδριακού DNA, που υποδεικνύουν ότι τα είδη S. officinalis και H. communis θα πρέπει να θεωρηθούν ως ένα ενιαίο είδος. Ωστόσο, η διαπίστωση μιας αξιοσημείωτης διαφοροποίησης μεταξύ γειτονικών πληθυσμών των S. officinalis και H. communis υπαινίσσεται την ύπαρξη κάποιου φραγμού, πιθανότατα οικολογικής φύσης, που επηρεάζει τη μεταξύ τους γονιδιακή ροή. 5.5 Βιβλιογραφία Addison JA, Hart MW, Analysis of population genetic structure of the green sea urchin (Strongylocentrotus droebachiensis) using microsatellites. Marine Biology 144(2): Addison JA, Hart MW, Spawning, copulation and inbreeding coefficients in marine invertebrates. Biology letters 1: Allendorf FW, Luikart G, Conservation and the Genetics of Populations. Blackwell, 642pp. Balloux F, Lugon-Moulin N, The estimation of population differentiation with microsatellite markers. Molecular Ecology 11(2): Baums IB, Miller MW, Hellberg ME, Regionally isolated populations of an imperiled Caribbean coral, Acropora palmata. Molecular Ecology 14(5): Belkhir K, Borsa P, Chikhi L, et al., GENETIX 4.05, logiciel sous Windows TM pour la génétique des populations. Laboratoire Génome, Populations, Interactions, CNRS UMR 5000, Université de Montpellier II, Montpellier Bhargava A, Fuentes FF, Mutational Dynamics of Microsatellites. Molecular Biotechnology 44(3): Blanquer A, Uriz MJ, Population genetics at three spatial scales of a rare sponge living in fragmented habitats. BMC Evolutionary Biology 10: 13 Blanquer A, Uriz MJ, Pascual M, Polymorphic microsatellite loci isolated from the marine sponge Scopalina lophyropoda (Demospongiae: Halichondrida). Molecular Ecology Notes 5(3):

170 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Blanquer A, Uriz MJ, Caujapé-Castells J, Small-scale spatial genetic structure in Scopalina lophyropoda, an encrusting sponge with philopatric larval dispersal and frequent fission and fusion events. Marine Ecology Progress Series 380: Bohonak AJ, IBD (Isolation By Distance): a program for analyses of isolation by distance. Journal of Heredity 93: Callen DF, Thompson AD, Shen Y, Phillips HA, Richards RI, Mulley JC, Sutherland GR, Incidence and origin of null alleles in the (AC)n microsatellite markers. American Journal of Human Genetics 52: Cavalli-Sforza LL, Edwards AWF, Phylogenetic analysis. Models and estimation procedures. American Journal of Human Genetics 19: Coombs JA, Letcher BH, Nislow KH, CREATE: a software to create input files from diploid genotypic data for 52 genetic software programs. Molecular Ecology Resources 8: Dailianis T, Tsigenopoulos CS, Characterization of polymorphic microsatellite markers for the endangered Mediterranean bath sponge Spongia officinalis L. Conservation Genetics 11(3): Davies N, Villablanca FX, Roderick GK, Determining the source of individuals: multilocus genotyping in nonequilibrium population genetics. Trends in Ecology & Evolution 14(1): DeBiasse MB, Richards VP, Shivji MS, Genetic assessment of connectivity in the common reef sponge, Callyspongia vaginalis (Demospongiae: Haplosclerida) reveals high population structure along the Florida reef tract. Coral Reefs 29(1): Duran S, Pascual M, Estoup A, Turon X, Polymorphic microsatellite loci in the sponge Crambe crambe (Porifera: Poecilosclerida) and their variation in two distant populations. Molecular Ecology Notes 2(4): Duran S, Pascual M, Estoup A, Turon X, Strong population structure in the marine sponge Crambe crambe (Poecilosclerida) as revealed by microsatellite markers. Molecular Ecology 13(3): Ellegren H, Microsatellites: simple sequences with complex evolution. Nature Reviews Genetics 5: Evanno G, Regnaut S, Goudet J, Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study. Molecular Ecology 14: Excoffier L, Smouse PE, Quattro JM, Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics 131: Excoffier L, Laval G, Schneider S, Arlequin ver. 3.0: An integrated software package for population genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics Online 1:

171 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ Goldstein DB, Roemer GW, Smith DA, Reich DE, Bergman A, Wayne RK, The use of microsatellite variation to infer population structure and demographic history in a natural model system. Genetics 151(2): Goodman SJ, RST CALC: a collection of computer programs for calculating unbiased estimates of genetic differentiation and determining their significance for microsatellite data. Molecular Ecology 6: Goudet J, FSTAT (Version 1.2): A Computer Program to Calculate F-Statistics. Journal of Heredity 86: Goudet J, FSTAT, a program to estimate and test gene diversities and fixation indices (version 2.9.3). Available from Gutiérrez-Rodríguez C, Lasker HR, Microsatellite variation reveals high levels of genetic variability and population structure in the gorgonian coral Pseudopterogorgia elisabethae across the Bahamas. Molecular Ecology 13(8): Hall TA, BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series 41: Hartl DL, Clarke AG, Principles of population genetics. Sinauer, 542pp. Hemond EM, Vollmer SV, Genetic diversity and connectivity in the threatened staghorn coral (Acropora cervicornis) in Florida. PLoS ONE 5(1): e8652 Hoshino S, Fujita T, Isolation of polymorphic microsatellite markers from Hymeniacidon sinapium (Porifera: Demospongiae: Halichondrida). Molecular Ecology Notes 6(3): Jombart T, adegenet: a R package for the multivariate analysis of genetic markers. Bioinformatics 24: Jombart T, Devillard S, Balloux F, Discriminant analysis of principal components: a new method for the analysis of genetically structured populations. BMC Genetics 11: 94 Kimura M, Crow JF, The number of alleles that can be maintained in a finite population. Genetics 49: Knowlton AL, Pierson BJ, Talbot SL, Highsmith RC, Isolation and characterization of microsatellite loci in the intertidal sponge Halichondria panicea. Molecular Ecology Notes 3(4): Launey S, Hedgecock D, High genetic load in the Pacific oyster Crassostrea gigas. Genetics 159: Le Goff-Vitry MC, Pybus OG, Rogers AD, Genetic structure of the deep-sea coral Lophelia pertusa in the Northeast Atlantic revealed by microsatellites and internal transcribed spacer sequences. Molecular Ecology 13: Maldonado M, The ecology of the sponge larva. Canadian Journal of Zoology 84: Maldonado M, Uriz MJ, Sexual propagation by sponge fragments. Nature 398:

172 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Noyer C, Agell G, Pascual M, Becerro MA, Isolation and characterization of microsatellite loci from the endangered Mediterranean sponge Spongia agaricina (Demospongiae: Dictyoceratida). Conservation Genetics 10: Ohta T, Kimura M, A model of mutation appropriate to estimate the number of electrophoretically detectable alleles in a finite population. Genetics Research 22: Patarnello T, Volckaert FAM, Castilho R, Pillars of Hercules: is the Atlantic-Mediterranean transition a phylogeographical break? Molecular Ecology 16: Peakall R, Smouse PE, GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Molecular Ecology Notes 6: Pérez-Portela R, Turon X, Cryptic divergence and strong population structure in the colonial invertebrate Pycnoclavella communis (Ascidiacea) inferred from molecular data. Zoology 111: Pritchard JK, Stephens M, Donnelly P, Inference of population structure using multilocus genotype data. Genetics 155(2): R Development Core Team, R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria Raymond M, Rousset F, 1995a. GENEPOP Version 1.2: A population genetics software for exact tests and ecumenism. Journal of Heredity 86: Raymond M, Rousset F, 1995b. An exact test for population differentiation. Evolution 49: Rice WR, Analyzing tables of statistical tests. Evolution 43: Rousset F, Equilibrium values of measures of population subdivision for stepwise mutation processes. Genetics 142: Rousset F, Genetic differentiation and estimation of gene flow from F-statistics under isolation by distance. Genetics 145: Rozen S, Skaletsky H, Primer 3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods in Molecular Biology 132: Selkoe KA, Toonen RJ, Microsatellites for ecologists: a practical guide to using and evaluating microsatellite markers. Ecology Letters 9(5): Shanks AL, Pelagic larval duration and dispersal distance revisited. The Biological Bulletin 216(3): Slatkin M, A measure of population subdivision based on microsatellite allele frequencies. Genetics 139(1): Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S, MEGA 4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology & Evolution 24: Tautz D, Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Research 17(16):

173 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ Tóth G, Gáspári Z, Jurka J, Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis. Genome Research 10(7): Tsagkarakou A, Roditakis N, Isolation and characterization of microsatellite loci in Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Molecular Ecology Notes 3: Tsigenopoulos CS, Hellemans B, Christiakov DA, Libertini A, Kotoulas G, Völckaert F, Eleven new microsatellites of the sea bass (Dicentrarchus labrax L.). Molecular Ecology Notes 3: Uriz MJ, Maldonado M, Turon X, Marti R, How do reproductive output, larval behaviour, and recruitment contribute to adult spatial patterns in Mediterranean encrusting sponges? Marine Ecology Progress Series 167: Van Oosterhout C, Hutchinson WF, Wills DPM, Shipley P, MICRO-CHECKER: software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data. Molecular Ecology Notes 4: Vollmer SV, Palumbi SR, Restricted gene flow in the Caribbean staghorn coral Acropora cervicomis: Implications for the recovery of endangered reefs. Journal of Heredity 98(1): Weir BS, Cockerham CC, Estimating F-statistics for the analysis of population structure. Evolution 38: Wright S, The genetical structure of populations. Annals of Eugenics 15: Zane L, Bargelloni L, Patarnello T, Strategies for microsatellite isolation: a review. Molecular Ecology 11(1):

174

175 ΓΕΝΙΚΑ ΣΧΟΛΙΑ & ΣΥΝΟΨΗ

176

177 Γενικά σχόλια Σύνοψη α. Σχετικά με τη μακροταξινομία των σπόγγων μπάνιου Ο μοναδικός απλότυπος του μιτοχονδριακού μοριακού δείκτη COI που χαρακτηρίζει τα Μεσογειακά δείγματα του S. officinalis δείχνει ότι οι μορφότυποι adriatica και mollissima, καθώς και οι διαφορετικές μορφές του adriatica από την Ανατολική και τη Δυτική Μεσόγειο δεν αποτελούν ταξινομικές οντότητες σε κανένα επίπεδο της ταξινόμησης του Λινναίου και κατά συνέπεια το S. officinalis θα πρέπει να θεωρείται ως ένα ενιαίο, αλλά μορφολογικά ποικιλόμορφο είδος. Το εύρημα αυτό υποστηρίζεται και από τα αποτελέσματα των μικροδορυφορικών δεικτών: η γενετική διαφοροποίηση υπήρξε ομοιόμορφα χαμηλή μεταξύ των περιοχών δειγματοληψίας στο Αιγαίο, ανεξάρτητα από τη συμμετοχή των μορφοτύπων adriatica ή mollissima. Οι μορφολογικοί χαρακτήρες που εξετάστηκαν, τέλος, ήταν επίσης σύμφωνοι την εικόνα αυτή μιας και δεν επέτρεψαν τη σαφή διάκριση μεταξύ των μορφών, ιδιαίτερα με τα πιο αξιόπιστα κριτήρια, που είναι εκείνα που σχετίζονται με τη δομή του σκελετού. Επιπρόσθετα, η ύπαρξη ενδιάμεσων μορφολογικών τύπων λειτουργεί αρνητικά σχετικά με την υπόθεση μιας εξελικτικά παγιωμένης διαφοροποίησης. Όλα τα παραπάνω μας επιτρέπουν να θεωρήσουμε ότι η μορφολογική ποικιλότητα που χαρακτηρίζει το S. officinalis δεν οφείλεται σε γενετικά καθορισμένη διαφοροποίηση, αλλά θα πρέπει μάλλον να αποδοθεί σε φαινοτυπική πλαστικότητα. Πολλά θαλάσσια ασπόνδυλα διαπιστωμένα χαρακτηρίζονται από υψηλό βαθμό φαινοτυπικής πλαστικότητας, κυρίως τα αποικιακά, όπως τα ανθόζωα (Gutiérrez-Rodríguez et al. 2009, Sánchez et al. 2007, Kim et al. 2004) και αυτά που δεν διαθέτουν αυστηρή σωματική αρχιτεκτονική, όπως οι σπόγγοι. Ιδιαίτερα όμως για τους τελευταίους, η πλαστικότητα φαίνεται να αποτελεί μια εγγενή ιδιότητα που διατηρείται καθ όλη τη διάρκεια ζωής τους, όπως έχει αποδειχθεί από πειραματικές προσεγγίσεις μεταφύτευσης (Maldonado & Young 1998). Η διαδικασία αυτή, που ενέχει συχνά αλλαγές στη διάταξη του υδροφόρου δικτύου και την χωροθέτηση των πόρων (Windsor & Leys 2010), γίνεται εφικτή μέσω της αναδιοργάνωσης των μαλακών ιστών του σπόγγου και των ινιδίων κολλαγόνου, που αποτελούν το μεγαλύτερο μέρος του σώματος των οργανισμών αυτών. Ενδείξεις υπάρχουν επίσης για τη δυνατότητα αυτο-αποικοδόμησης και τροποποίησης του σκελετού σπογγίνης στους Δικτυοκερατόσπογγους (Vacelet 1988). Μια ποικιλία αβιοτικών και βιοτικών παραγόντων έχουν σχετιστεί πειραματικά με την προαγωγή μορφολογικών μεταβολών στους σπόγγους, με κύριους την ταχύτητα των ρευμάτων (Mendola et al. 2008), τα χαρακτηριστικά του υποστρώματος (Mercurio et al. 2006) και τις συμβιωτικές σχέσεις (Carballo et al. 2006). Ωστόσο, πολύ λίγες μελέτες έχουν αποκαλύψει έλλειψη γενετικής ποικιλότητας μεταξύ καθιερωμένων μορφοτύπων ή ξεχωριστών ειδών σπόγγων (López-Legentil et al. 2010). Από την άλλη, η μεγάλη γενετική απόκλιση που παρατηρήθηκε στο COI μεταξύ των ατόμων του S. officinalis από τη Μεσόγειο και το Γιβραλτάρ συνοδευόμενη από σαφή διαχωρισμό σε όλες τις φυλογενετικές ανακατασκευές είναι ανάλογη με εκείνη που παρατηρείται μεταξύ των Μεσογειακών Δικτυοκερατόσπογγων και των ειδών που εξαπλώνονται στο Δυτικό Ατλαντικό. Η γενετική διαφοροποίηση των ατόμων από το Γιβραλτάρ υποστηρίζεται και από την εξέταση των μικροδορυφορικών δεικτών, όπως φαίνεται από την ανάλυση DAPC, καθώς και τον υψηλό βαθμό 163

178 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ ομομιξίας που χαρακτήρισε την περιοχή αυτή. Όλα τα παραπάνω συνηγορούν στην ύπαρξη ενός κρυπτικού είδους το οποίο εξαπλώνεται τουλάχιστον στην περιοχή του Γιβραλτάρ η διαφοροποίησή του μπορεί να αποδοθεί στο φυλογεωγραφικό φραγμό που εκδηλώνεται στο όριο της Θάλασσας του Alboran λόγω των προτύπων θαλάσσιας κυκλοφορίας στην περιοχή, ο οποίος προάγει φαινόμενα ειδογένεσης (Patarnello et al. 2007). Εντούτοις, ο αμφιλεγόμενος διαχωρισμός αυτού του κλάδου με τη Μπεϊεζιανή πληθυσμιακή ανάλυση, καθώς και η έλλειψη εμφανούς διαφοροποίησης με βάση τα σκελετικά μορφολογικά γνωρίσματα, καταδεικνύουν την ανάγκη για μια στοχευμένη δειγματοληψία και λεπτομερή μορφολογική εξέταση, εκ παραλλήλου με την ανάλυση πρόσθετων γενετικών δεικτών, προκειμένου να διασαφηνιστεί η ταυτότητα, οι ταξινομικές σχέσεις και το εύρος εξάπλωσης του ανακαλυφθέντος αυτού κλάδου. Εξίσου αξιοσημείωτη, όμως, υπήρξε η αποκάλυψη της απουσίας γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ των γενών Spongia και Hippospongia κατά την παρούσα έρευνα, τουλάχιστον στο επίπεδο που να δικαιολογεί το διαχωρισμό τους σε επίπεδο γένους, αλλά ενδεχομένως και είδους. Τα γένη αυτά μοιράστηκαν έναν κοινό απλότυπο για το μιτοχονδριακό δείκτη COI στο σετ δειγμάτων που εξετάστηκε από τις γεωγραφικές περιοχές του Αιγαίου και της Νότιας Γαλλίας. Το εύρημα αυτό μπορεί να υποστηρίξει την κατάργηση του γένους Hippospongia Schulze, 1879 και την ενσωμάτωση του τύπου αυτού στο γένος Spongia, τουλάχιστον όσον αφορά τη Μεσογειακή του εξάπλωση. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι κάτι τέτοιο είχε προταθεί στο παρελθόν από αρκετούς μελετητές που εξέτασαν μορφολογικά συλλογές δειγμάτων μεγάλου εύρους, τόσο από τη Μεσόγειο όσο και από τον Ατλαντικό, όπως καταδεικνύεται στη σχετική ανασκόπηση της ταξινομικής έρευνας. Τα δείγματα που εξετάστηκαν μορφολογικά στο πλαίσιο της παρούσας μελέτης έδειξαν εν μέρει διαχωρισμό των τύπων spongia και hippospongia, αλλά αυτός στηρίχθηκε κατά κύριο λόγο στους μορφολογικούς χαρακτήρες που σχετίζονται με τη μορφή του σώματος και τα εξωτερικά γνωρίσματα, που επιβεβαιωμένα δεν αποτελούν ισχυρά ταξινομικά κριτήρια στη συστηματική των σπόγγων. Αντίθετα, τα σκελετικά γνωρίσματα έδειξαν μειωμένο ή και ανύπαρκτο βαθμό διαχωρισμού. Πιο διαφωτιστική, όμως, υπήρξε η εικόνα από τους ιδιαίτερα αναλυτικούς μικροδορυφορικούς δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν: εδώ διαφάνηκε ένας διαχωρισμός μεταξύ των δύο τύπων στις περιοχές του Αιγαίου, εκφρασμένος ως μικρής κλίμακας γενετική διαφοροποίηση (που θα μπορούσε ποσοτικά να αντιστοιχεί σε σχετικά απομονωμένους πληθυσμούς του ίδιου είδους και όχι σε διακριτές ταξινομικές μονάδες), η οποία όμως ήταν ανεξάρτητη της γεωγραφικής απόστασης. Τα αίτια της γενετικής διαφοροποίησης αυτής, αν υποτεθεί ότι δεν υπάρχει εγγενής αναπαραγωγικός φραγμός, θα πρέπει να διερευνηθούν στο μέλλον με πειραματικές προσεγγίσεις. β. Σχετικά με τη μικροταξινομία των σπόγγων μπάνιου Η ανάλυση των μικροδορυφορικών δεικτών αποκάλυψε χαμηλά επίπεδα διαφοροποίησης σε μικρή και ενδιάμεση γεωγραφική κλίμακα, αλλά υψηλή διαφοροποίηση σε μεγάλη κλίμακα (μεταξύ των δύο Μεσογειακών λεκανών). Ο εμφανής περιορισμός στη γονιδιακή ροή μεταξύ των πληθυσμών του Αιγαίου και της Νότιας Γαλλίας ενδεχομένως φανερώνει την ύπαρξη δύο διακριτών ομάδων πληθυσμών του S. officinalis, που αντιστοιχούν γεωγραφικά στην Ανατολική και Δυτική Μεσόγειο. Ο δίαυλος της Σικελίας, που διαχωρίζει τις δύο λεκάνες, θεωρείται ένα εμπόδιο στη γονιδιακή ροή που επηρεάζει τη γενετική σύσταση των πληθυσμών αρκετών θαλάσσιων ειδών 164

179 ΓΕΝΙΚΑ ΣΧΟΛΙΑ & ΣΥΝΟΨΗ που εξαπλώνονται εκατέρωθεν του στενού (e.g. Bahri-Sfar et al. 2000, Arnaud-Haond et al. 2007, Tarnowska et al. 2010). Χρειάζεται, όμως, περαιτέρω διερεύνηση προκειμένου να ελεγχθεί αν και κατά πόσο η γενετική διαφοροποίηση που παρατηρήθηκε στους ανατολικούς πληθυσμούς του S. officinalis αντανακλά όντως ένα διαχωρισμό μεταξύ των δύο λεκανών ή περιορίζεται στους πληθυσμούς του Αιγαίου, ως αποτέλεσμα της υδρογραφικής του απομόνωσης από την υπόλοιπη Μεσόγειο (Borrero-Pérez et al. 2011). Όπως και να χει, η χωρική γενετική διαφοροποίηση που παρατηρείται στις διάφορες περιοχές της Μεσογείου αποδίδεται σε γεγονότα που συνέβησαν στη διάρκεια της γεωλογικής της ιστορίας προκαλώντας διαχωρισμό των πληθυσμών, αλλά επίσης και στις σύγχρονες ωκεανογραφικές διεργασίες (Arnaud-Haond et al. 2007). Οι στατιστικά σημαντικές τιμές της γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ των πληθυσμών τόσο του S. officinalis όσο και του H. communis εντός των δύο λεκανών της Μεσογείου φανερώνουν την ύπαρξη πληθυσμιακής συγκρότησης λόγω περιορισμένης γονιδιακής ροής. Παρόλο που οι λεκιθότροφες προνύμφες των Δικτυοκερατόσπογγων έχουν επιδείξει αυξημένη κολυμβητική ικανότητα σε σχέση με τις προνύμφες άλλων τάξεων (Mariani et al. 2006), η δυνατότητά διασποράς τους θα πρέπει να παραμένει μικρή, όπως θεωρείται ο κανόνας για τα Porifera (Maldonado 2006, Shanks 2009). Πάντως, η γενετική διαφοροποίηση που καταγράφηκε εντός των λεκανών υπήρξε εν γένει χαμηλή ποσοτικά και άνισα κατανεμημένη μεταξύ των πληθυσμών. Για παράδειγμα, η Κάρπαθος εμφανίζεται περισσότερο διαχωρισμένη από τις υπόλοιπες περιοχές του Αιγαίου ενώ, αντιθέτως, γενετική επικοινωνία διαφαίνεται μεταξύ των πληθυσμών των Β. Σποράδων και των Κυκλάδων. Μια πιο σαφής και ισχυρή πληθυσμιακή συγκρότηση σε αντιστοιχία με ανάλογες μελέτες για άλλα είδη σπόγγων (Duran et al. 2004, Blanquer & Uriz 2010) θα ήταν αναμενόμενη για τους πληθυσμούς του Αιγαίου, λόγω της εκτεταμένης και ασυνεχούς ακτογραμμής του, αλλά και της σποραδικής εμφάνισης των πληθυσμών των S. officinalis και H. communis (βλέπε Voultsiadou et al. 2011). Υπάρχουν σαφείς ενδείξεις ότι τα υδρογραφικά πρότυπα μπορούν να επηρεάσουν το δυναμικό εξάπλωσης των φορέων διασποράς των σπόγγων και, κατά συνέπεια, είτε να θέσουν φραγμούς στη γονιδιακή ροή ή να υπερπηδήσουν τους περιορισμούς λόγω απόστασης ή μορφολογίας του τοπίου, προάγοντας φαινόμενα παμμιξίας (Whalan et al. 2008). Έτσι, η γενετική επικοινωνία που παρατηρήθηκε μεταξύ Κυκλάδων και Σποράδων παρά τη γεωγραφική απόσταση τους και την ασυνέχεια των ενδιαιτημάτων, μπορεί να αποδοθεί στην επίδραση του ψυχρού και χαμηλής αλατότητας ρεύματος που ρέει από βορρά προς νότο στο Αιγαίο (Zervakis et al. 2005). Από την άλλη, ο διαχωρισμός των πληθυσμών της Καρπάθου οφείλεται πιθανότατα στην επίδραση του ισχυρού ρεύματος υψηλής θερμοκρασίας και αλατότητας που ρέει από την Λεβαντίνη προς τα βόρεια. Στην περίπτωση του Αιγαίου Πελάγους, όπου το είδος S. officinalis αλιεύεται συστηματικά εδώ και αιώνες, η ίδια η αλιεία θα μπορούσε να έχει δράσει ενισχυτικά στη διασπορά των φορέων διάδοσης του είδους. Οι αλιείς ταξιδεύουν σε μεγάλες αποστάσεις και επεξεργάζονται τη συγκομιδή επί του σπογγαλιευτικού σκάφους, πιέζοντας το σώμα των σπόγγων ώστε να διαχωριστεί ο σκελετός από τη ζωντανή μάζα τους. Καθώς το S. officinalis είναι είδος γονοχωριστικό, αναπαραγωγικά δραστήριο σε όλη τη διάρκεια του έτους και φέρει έμβρυα και προνύμφες από το Νοέμβριο μέχρι και τον Ιούλιο (Baldacconi et al. 2007), εμπίπτοντας εν μέρει στην περίοδο αλίευσης, η απελευθέρωση σπέρματος και προνυμφών από τοποθεσία σε τοποθεσία μέσω των αλιέων θα μπορούσε ενδεχομένως να ενισχύει τη διασπορά. Με παρόμοιο τρόπο μπορεί να συνεισφέρει στη διασπορά και η μεταφορά αναπαραγωγικών φορέων που φέρουν έμβρυα (Maldonado & Uriz 1999) πράγματι, συχνά εμφανίζονται αποκομμένα τμήματα του S. officinalis 165

180 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ ελεύθερα στο βυθό (προσωπική παρατήρηση του συγγραφέα), τα οποία έχουν πιθανότατα προκύψει από τμηματική αποκοπή ή αποκόλληση ολόκληρων ατόμων από το υπόστρωμα. Οι παραπάνω υποθέσεις σε κάθε περίπτωση αναμένουν επιβεβαίωση με πειραματικές διαδικασίες. γ. Ενδοπληθυσμιακή ποικιλότητα Μια σταθερά υψηλή γενετική ποικιλότητα ανιχνεύθηκε με τους μικροδορυφορικούς δείκτες στο ενδοπληθυσμιακό επίπεδο. Αυτό παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον καθώς οι πληθυσμοί των S. officinalis και H. communis στο Αιγαίο, τουλάχιστον στα μικρά βάθη, έχουν υποστεί μακροχρόνια αλιευτική πίεση και αλλεπάλληλα επεισόδια μαζικής θνησιμότητας που έχουν επηρεάσει την αφθονία τους δραστικά και σε μεγάλη γεωγραφική κλίμακα (βλέπε Voultsiadou et al. 2011). Παρόλο που το πρώτο τεκμηριωμένο επεισόδιο ασθένειας στην περιοχή του Αιγαίου είναι σχετικά πρόσφατο (εκδηλώθηκε αρχικά το 1986), επαναλαμβανόμενες μαζικές επιδημίες των σπόγγων του μπάνιου έχουν αναφερθεί από άλλες περιοχές του κόσμου ήδη από τα τέλη του 19ου αιώνα (Webster 2007) και συνεπώς μπορούμε να υποθέσουμε μια περιοδική εμφάνιση τέτοιων φαινομένων και στη Μεσόγειο. Κάτω από αυτές τις συνθήκες, η γενετική ποικιλότητα των ειδών αυτών θα αναμενόταν να έχει μειωθεί μέσω πληθυσμιακών στενωπών και γενετικής παρέκκλισης. Η παρατηρούμενη διατήρηση υψηλής ενδοπληθυσμιακής γενετικής ποικιλότητας στους πληθυσμούς που εξετάστηκαν θα μπορούσε να εξηγηθεί από: (i) την επαρκή γενετική επικοινωνία μεταξύ των πληθυσμών, κάτι που επιβεβαιώθηκε σε ένα βαθμό από τα αποτελέσματά της παρούσας μελέτης, (ii) την ενδεχόμενη αναγέννηση των ατόμων που συλλέγονται κατά την αλιεία από εναπομείναντα τμήματα που παραμένουν στο υπόστρωμα, και (iii) την ύπαρξη εύρωστων πληθυσμών που δεν επηρεάζονται από την αλιεία ή τα περιστατικά θνησιμότητας και θα μπορούσαν να τροφοδοτούν την επανεποίκιση προσβεβλημένων περιοχών. Η τελευταία αυτή υπόθεση ενισχύεται από την ύπαρξη πληθυσμών που εμφανίζονται ανθεκτικοί στις ασθένειες, πιθανόν λόγω της επίδρασης ευνοϊκών ρευμάτων (Voultsiadou et al. 2011). Μια πιο σημαντική, όμως, πηγή ανανέωσης των πληθυσμών ενδέχεται να αποτελούν οι πληθυσμοί που καταλαμβάνουν το κατώτερο όριο εξάπλωσης του είδους (> 40 m βάθος) και ως εκ τούτου είναι λιγότερο ευάλωτοι στην αλιευτική πίεση, αλλά και στην επίδραση της αύξησης της θερμοκρασίας καθώς ζουν κάτω από το θερμοκλινές. δ. Συμπεράσματα για τη διαχείριση και μελλοντικές ερευνητικές προτεραιότητες Τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας δείχνουν ότι οι πληθυσμοί των κοινών ειδών σπόγγων μπάνιου στα μικρά βάθη της Μεσογείου, παρά την παρατηρούμενη μειωμένη αφθονία και κατακερματισμένη εξάπλωση λόγω αλιείας και περιστατικών θνησιμότητας μεγάλης κλίμακας, χαρακτηρίζονται από αξιοσημείωτα υψηλή γενετική ποικιλότητα υφίσταται συνεπώς δυνατότητα αναγέννησης των αποθεμάτων τους, υπό την προϋπόθεση της λήψης αποτελεσματικών διαχειριστικών μέτρων. Η εφαρμογή μέτρων που θα στοχεύουν στον περιορισμό της αλιευτικής πίεσης και την προώθηση της διατήρησης των φυσικών πληθυσμών σε επιλεγμένες περιοχές θα μπορούσαν να βοηθήσουν την επανεποίκιση σε ευρεία κλίμακα, όπως δείχνουν και οι 166

181 ΓΕΝΙΚΑ ΣΧΟΛΙΑ & ΣΥΝΟΨΗ παρατηρούμενες τάσεις ανάμιξης των πληθυσμών εντός των δύο λεκανών της Μεσογείου. Επιπλέον, ο τεχνητός εμπλουτισμός των αποθεμάτων διάφορων περιοχών (Baldacconi et al. 2010) από γειτονικούς ή απομακρυσμένους πληθυσμούς δεν αναμένεται να επιφέρει αλλοιώσεις στους γηγενείς πληθυσμούς, αφού η γενετική ταυτότητα του S. officinalis δείχνει να είναι ενιαία εντός της λεκάνης της Μεσογείου. Ως επιτακτική και επείγουσα ανάγκη προβάλλει η έρευνα για τη συσχέτιση των υδρογραφικών παραμέτρων με τους παράγοντες που ασκούν πίεση στους πληθυσμούς των σπόγγων του μπάνιου, ώστε να τοποθετηθούν οι υπάρχοντες πληθυσμοί τους σε μια κλίμακα διαβάθμισης ανάλογα με την ευαισθησία τους στις απειλές, να τεθούν προτεραιότητες, και να καθοριστούν πιθανές πηγές προέλευσης ατόμων για επανεποίκιση. Όλες αυτές οι ενέργειες είναι ζωτικής σημασίας για τους πληθυσμούς στα μικρά βάθη καθόσον αυτοί είναι που ενδέχεται να υποστούν ανεπανόρθωτες βλάβες στο μέλλον υπό την επίδραση της κλιματικής αλλαγής (Lejeusne et al. 2010). Η παρούσα έρευνα δίνει για πρώτη φορά στοιχεία για τα πρότυπα της γενετικής ποικιλότητας δύο ελάχιστα μελετημένων ειδών με μεγάλη πολιτισμική και οικονομική αξία εντούτοις, ένα πλήθος πρόσθετων ερωτημάτων σχετικά με τους σπόγγους μπάνιου της Μεσογείου αναμένουν διερεύνηση, τόσο όσον αφορά την ταξινομία τους όσο και τα πληθυσμιακά χαρακτηριστικά τους. Η περαιτέρω διερεύνηση της απουσίας διαφοροποίησης μεταξύ των γενών Spongia και Hippospongia είναι επείγουσα, ούτως ώστε να διευκρινιστεί αν θα πρέπει να οριστικοποιηθεί η αντιμετώπισή τους ως μία ενιαία ταξινομική (και διαχειριστική) μονάδα. Δύο ακόμη είδη (Spongia lamella και S. zimocca) χρειάζεται να μελετηθούν, ενώ αναγκαία είναι μια εκτεταμένη έρευνα σε επίπεδο Μεσογείου και μεγάλο εύρος βάθους, ώστε να καθοριστούν με ακρίβεια τόσο οι βιογεωγραφικοί φραγμοί όσο και οι περιοχές μεταγωγής όσον αφορά τη γενετική επικοινωνία μεταξύ των πληθυσμών, κατά μήκος της εξάπλωσής τους. Επιπλέον, οι ενδείξεις για την ύπαρξη άδηλης βιοποικιλότητας στην περιοχή του Γιβραλτάρ θα πρέπει να διερευνηθούν περαιτέρω, με μελέτες στοχευμένες σε πληθυσμούς Σπογγιδών που εξαπλώνονται στις ακτές του Ανατολικού Ατλαντικού (σε γειτνίαση με το Στενό του Γιβραλτάρ), ώστε να αποσαφηνιστεί η συστηματική κατάταξη των δειγμάτων της περιοχής, που μέχρι σήμερα εντάσσονταν στο είδος S. officinalis. Τέλος, η συγγένεια ανάμεσα στα Spongiidae της Μεσογείου και εκείνα του Δυτικού Ατλαντικού θα πρέπει επίσης να εξεταστεί, ώστε να διαλευκανθούν οι φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ τους, προάγοντας την κατανόηση της εξελικτικής ιστορίας των σπόγγων του μπάνιου. ε. Βιβλιογραφία Arnaud-Haond S, Migliaccio M, Diaz-Almela E, Teixeira S, van de Vliet MS, Alberto F, Procaccini G, Duarte CM, Serrão EA, Vicariance patterns in the Mediterranean Sea: East-West cleavage and low dispersal in the endemic seagrass Posidonia oceanica. Journal of Biogeography 34: Bahri-Sfar L, Lemaire C, Hassine OKB, Bonhomme F, Fragmentation of sea bass populations in the western and eastern Mediterranean as revealed by microsatellite polymorphism. Proceedings of the Royal Society of London Series B: Biological Sciences 267:

182 ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΑΞΙΝΟΜΙΑ ΤΩΝ ΕΜΠΟΡΙΚΩΝ ΣΠΟΓΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Baldacconi R, Nonnis-Marzano C, Gaino E, Corriero G, Sexual reproduction, larval development and release in Spongia officinalis L. (Porifera, Demospongiae) from the Apulian coast. Marine Biology, 152, Baldacconi R, Cardone F, Longo C, Mercurio E, Corriero G, Transplantation of Spongia officinalis L. (Porifera, Demospongiae): a technical approach for restocking this endangered species. Marine Ecology 31: Blanquer A, Uriz M, Population genetics at three spatial scales of a rare sponge living in fragmented habitats. BMC Evolutionary Biology 10: 13 Borrero-Pérez GH, González-Wangüemert M, Marcos C, Pérez-Ruzafa A, Phylogeography of the Atlanto-Mediterranean sea cucumber Holothuria (Holothuria) mammata: the combined effects of historical processes and current oceanographical pattern. Molecular Ecology 20: Carballo JL, Avila E, Enriquez S, Camacho L, Phenotypic plasticity in a mutualistic association between the sponge Haliclona caerulea and the calcareous macroalga Jania adherens induced by transplanting experiments. I: morphological response of the sponge. Marine Biology 148: Duran S, Pascual M, Estoup A, Turon X, Strong population structure in the marine sponge Crambe crambe (Poecilosclerida) as revealed by microsatellite markers. Molecular Ecology 13: Gutiérrez-Rodríguez C, Lasker HR, Microsatellite variation reveals high levels of genetic variability and population structure in the gorgonian coral Pseudopterogorgia elisabethae across the Bahamas. Molecular Ecology 13: Kim E, Lasker HR, Coffroth MA, Kim K, Morphological and genetic variation across reef habitats in a broadcast-spawning octocoral. Hydrobiologia 530: Lejeusne C, Chevaldonné P, Pergent-Martini C, Boudouresque CF, Pérez T, Climate change effects on a miniature ocean: the highly diverse, highly impacted Mediterranean Sea. Trends in Ecology & Evolution 25: López-Legentil S, Erwin PM, Henkel TP, Loh TL, Pawlik JR, Phenotypic plasticity in the Caribbean sponge Callyspongia vaginalis (Porifera: Haplosclerida). Scientia Marina 74: Maldonado M, The ecology of the sponge larva. Canadian Journal of Zoology 84: Maldonado M, Young CM, Limits on the bathymetric distribution of keratose sponges: a field test in deep water. Marine Ecology Progress Series 174: Maldonado M, Uriz MJ, Sexual propagation by sponge fragments. Nature 398: Mariani S, Uriz MJ, Turon X, Alcoverro T, Dispersal strategies in sponge larvae: integrating the life history of larvae and the hydrologic component. Oecologia 149: Mendola D, De Caralt S, Uriz MJ, Van Den End F, Van Leeuwen JL, Wijffels RH, Environmental flow regimes for Dysidea avara sponges. Marine Biotechnology 10:

183 ΓΕΝΙΚΑ ΣΧΟΛΙΑ & ΣΥΝΟΨΗ Mercurio M, Corriero G, Gaino E, Sessile and non-sessile morphs of Geodia cydonium (Jameson) (Porifera, Demospongiae) in two semi-enclosed Mediterranean bays. Marine Biology 148: Patarnello T, Volckaert FAM, Castilho R, Pillars of Hercules: is the Atlantic-Mediterranean transition a phylogeographical break? Molecular Ecology 16: Sánchez JA, Aguilar C, Dorado D, Manrique N, Phenotypic plasticity and morphological integration in a marine modular invertebrate. BMC Evolutionary Biology 7: 122 Selkoe KA, Toonen RJ, Microsatellites for ecologists: a practical guide to using and evaluating microsatellite markers. Ecology Letters 9: Shanks AL, Pelagic larval duration and dispersal distance revisited. The Biological Bulletin 216: Tarnowska K, Chenuil A, Nikula R, Féral JP, Wolowicz M, Complex genetic population structure of the bivalve Cerastoderma glaucum in a highly fragmented lagoon habitat. Marine Ecology Progress Series 406: Vacelet J, Verdenal B, Perinet G, The iron mineralization of Spongia officinalis L. (Porifera, Dictyoceratida) and its relationships with the collagen skeleton. Biology of the Cell 62: Voultsiadou E, Dailianis T, Antoniadou C, Dounas C, Chintiroglou CC, Aegean bath sponges: historical data and current status. Reviews in Fisheries Science 19: Webster NS, Sponge disease: a global threat? Environmental Microbiology 9: Whalan S, de Nys R, Smith-Keune C, Evans BS, Battershill C, Jerry DR, Low genetic variability within and among populations of the brooding sponge Rhopaloeides odorabile on the central Great Barrier Reef. Aquatic Biology 3: Windsor PJ, Leys SP, Wnt signaling and induction in the sponge aquiferous system: evidence for an ancient origin of the organizer. Evolution & Development 12: Zervakis V, Theocharis A, Georgopoulos D, Circulation and hydrography of the open seas. In: Papathanasiou E, Zenetos A (eds.), State of the Hellenic Marine Environment. Hellenic Center for Marine Research Publications, Athens, pp

184

185 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT

186

187 Περίληψη Οι Μεσογειακοί σπόγγοι μπάνιου αποτελούν ένα βιολογικό πόρο υψηλής οικονομικής αξίας και η αλιεία τους στην περιοχή, με ιστορία πολλών αιώνων, έχει δημιουργήσει μια αξιοσημείωτη πολιτισμική κληρονομιά. Εντούτοις, τις τελευταίες δεκαετίες, οι πληθυσμοί των σπόγγων αυτών έχουν μειωθεί δραματικά λόγω της συνδυαστικής δράσης της αλιευτικής πίεσης και μιας σειράς επιδημικών φαινομένων. Παρόλο που η αλιεία τους ασκείται ακόμα στην Ανατολική Μεσόγειο, η βιολογία και η οικολογία τους έχουν μελετηθεί ελάχιστα, ενώ δεν υπάρχει σε εφαρμογή κάποιο διαχειριστικό πλαίσιο που να διαφυλάσσει την αειφορία τους. Επιπρόσθετα, η μελέτη της σχετικής βιβλιογραφίας αποκαλύπτει μια αμφιλεγόμενη ταξινομία για τα κύρια είδη τα οποία, παρόλο που περιγράφηκαν για πρώτη φορά πάνω από δύο αιώνες πριν, υπόκεινται ακόμα και σήμερα σε αναθεωρήσεις. Η παρούσα έρευνα επιχειρεί να διασαφηνίσει τις αβεβαιότητες σε συστηματικό επίπεδο στα κύρια Μεσογειακά είδη σπόγγων μπάνιου, το Spongia officinalis (και τους δύο μορφότυπους που σχετίζονται μ αυτό: adriatica και mollissima ) και το Hippospongia communis, και να εκτιμήσει τη γενετική και μορφολογική τους ποικιλότητα σε διαφορετικές γεωγραφικές κλίμακες κατά μήκος της εξάπλωσής τους. Για το σκοπό αυτό, αναλύθηκε μια συλλογή 700 περίπου δειγμάτων από 11 τοποθεσίες στην Ανατολική Μεσόγειο (Αιγαίο), τη Δυτική Μεσόγειο (ακτές Νότιας Γαλλίας) και το Γιβραλτάρ. Στο πρώτο μέρος της μελέτης εξετάστηκε ένα σύνολο 25 μορφολογικών χαρακτήρων, εξωτερικών και σκελετικών, και επιχειρήθηκε ο συσχετισμός της ποικιλομορφίας τους με την ταξινομία και τη βιογεωγραφία των ειδών. Τα αποτελέσματα έδειξαν μια σημαντική διαφοροποίηση των περισσότερων γνωρισμάτων σε πληθυσμιακό και ατομικό επίπεδο, καταδεικνύοντας τη μορφολογική πλαστικότητα που χαρακτηρίζει τα είδη. Αντιθέτως, ο διαχωρισμός των δύο μορφότυπων του S. officinalis δεν ήταν ξεκάθαρος, ενώ η διάκριση μεταξύ των γενών Spongia και Hippospongia ήταν εφικτή μόνο με τους χαρακτήρες που σχετίζονταν με τη δομή του υδροκυκλοφορικού συστήματος. Το δεύτερο μέρος αφορά τη διερεύνηση των φυλογενετικών σχέσεων ανάμεσα στα είδη με χρήση του μιτοχονδριακού γενετικού δείκτη COI. Από τις αναλύσεις διαφάνηκε η απουσία γενετικής διαφοροποίησης τόσο μεταξύ των γενών Spongia και Hippospongia όσο και μεταξύ των μορφότυπων του S. officinalis στο φυλογενετικό επίπεδο. Επίσης αποκάλυψε την ύπαρξη ενός κρυπτικού είδους Spongia, στην περιοχή του Γιβραλτάρ, το οποίο απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Το τρίτο μέρος περιλαμβάνει την ανάπτυξη πολυμορφικών μικροδορυφορικών δεικτών για τα είδη που εξετάστηκαν και την εφαρμογή τους για την εκτίμηση της γονιδιακής ροής μεταξύ των πληθυσμών. Οι αναλύσεις έδειξαν μια σχετικά ασθενή αλλά σημαντική πληθυσμιακή συγκρότηση εντός των περιοχών του Αιγαίου και της Νότιας Γαλλίας παράλληλα όμως διαφάνηκε ένας ισχυρός περιορισμός στη γονιδιακή ροή ανάμεσα στις δύο αυτές περιοχές, υποδεικνύοντας την ύπαρξη ενός βιογεωγραφικού φραγμού μεταξύ των δύο συστημάτων. Επιπρόσθετα, υψηλός βαθμός γενετικής ποικιλότητας καταγράφηκε εντός των πληθυσμών, αντίθετα με το αναμενόμενο λαμβάνοντας υπόψη την αλιευτική πίεση και την επίδραση των επιδημικών φαινομένων. Η παρούσα μελέτη επιχειρεί για πρώτη φορά τη διερεύνηση της γεωγραφικής και φυλογενετικής ποικιλότητας των Μεσογειακών σπόγγων συνδυάζοντας μορφομετρικά και μοριακά δεδομένα. Τα αποτελέσματά της μπορούν να φανούν χρήσιμα στην οριοθέτηση των αποθεμάτων των αλιευόμενων αυτών οργανισμών και τον προσδιορισμό των χαρακτηριστικών της γεωγραφικής συγκρότησης των πληθυσμών τους. Τα παραπάνω αποτελούν κρίσιμες παραμέτρους για το σχεδιασμό και την υλοποίηση αποτελεσματικών διαχειριστικών στρατηγικών και δράσεων για την προστασία και την αειφορία των οργανισμών αυτών. 173

188 Abstract The endemic Mediterranean bath sponges constitute a natural resource of high commercial value and their centuries-long fishery has created an important cultural heritage in the area. However, their populations have dramatically declined during the last decades, due to the combined effect of uncontrolled harvesting and a series of epidemics. While their harvesting is still exercised in the Eastern Mediterranean, their biology and ecology are surprisingly understudied and practically no management plan has been implemented to safeguard their sustainability. Additionally, the relevant literature reveals a controversial taxonomic status for the main species which, although first described more than two centuries ago, are still currently subject to taxonomic debate. The present study attempts to resolve systematic issues regarding the main Mediterranean bath sponge species, Spongia officinalis (including its two acknowledged morphotypes, adriatica and mollissima ) and Hippospongia communis, and estimate their genetic and morphologic variation at different geographic distance scales along their distribution. For this purpose, a collection of approximately 700 samples was employed, originating from 11 locations in the Eastern Mediterranean (Aegean Sea), Western Mediterranean (Provence coast) and the Strait of Gibraltar. The first part of the study regards the examination of a set of 25 morphologic characters, external and skeletal, and the correlation of their variation to taxonomic and biogeographic traits. The results show a significant diversity of most morphologic characters both at the population and the individual level, highlighting the morphologic plasticity of the species. On the contrary, no clear distinction between the two morphotypes of S. officinalis was evident, while the genera Spongia and Hippospongia could only be distinguished with characters related to the structure of the aquiferous system. The second part attempts the investigation of the phylogenetic affinities between species, using the standard barcoding mitochondrial DNA marker COI. This analysis revealed a lack of genetic diversity at the phylogenetic level, both between the genera Spongia and Hippospongia, and between the two morphotypes of S. officinalis; it also uncovered the existence of a cryptic Spongia species, presumably distributed at the vicinity of Gibraltar, which requires further surveys before considered valid. The third part comprises the development of a set of polymorphic microsatellite markers for the studied species and their application for the estimation of gene flow following geographic patterns. This analysis revealed a moderate though significant population structure for the studied species within both studied Mediterranean regions; on the other hand, restriction to gene flow was evidenced between the Aegean Sea and Provence giving two well-defined regional clusters and suggesting the existence of a biogeographic break between the two systems. Additionally, high genetic diversity was manifested within populations, contrastingly to expectations due to pressure from harvesting and the influence of devastating epidemics. The implemented study is the first to investigate the geographical and phylogenetic variation of Mediterranean bath sponges integrating morphometric and molecular approaches. Such data will be valuable in identifying actual stocks of these harvested organisms and revealing patterns regarding their geographical structure and population connectivity; these are critical requirements to establish comprehensive management strategies and actions towards their protection and sustainable presence in the future. 174

189 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑΤΑ