ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΙ ΠΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΙ ΠΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ"

Κλειώ Γούσιος
7 χρόνια πριν
Προβολές:

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΙ ΠΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών του ενδοσυμβιωτικού ιού του παρασιτοειδούς υμενόπτερου Cotesia congregata με πρωτεϊνες της ανοσολογικής απόκρισης των Λεπιδοπτέρων Περίληψη διδακτορικής διατριβής της ΧΡΙΣΤΙΑΝΑΣ-ΣΤΑΥΡΟΥΛΑΣ ΜΑΓΚΡΙΩΤΗ, Βιολόγού ΑΘΗΝΑ 2011

2 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Οι polydna ιοί είναι μια ομάδα ιών που ενδοσυμβιώνει με ενδοπαρασιτοειδή υμενόπτερα έντομα (σφήκες) και συμμετέχει στον παρασιτισμό λεπιδοπτέρων εντόμων από τα Υμενόπτερα. Τα σωματίδια των ιών ενίονται μαζί με τα γονιμοποιημένα αυγά των σφηκών στα λεπιδόπτερα έντομα-ξενιστές. Τα γονίδια των polydna ιών εκφράζονται στα κύτταρα τον λεπιδόπτερου ξενιστή και οι παραγόμενες πρωτεϊνες επιδρούν στη φυσιολογία τον ξενιστή καθυστερώντας την ανάπτυξή τον και καταστέλλοντας το ανοσοποιητικό τον σύστημα. Με αυτόν τον τρόπο τα αυγά και τα έμβρυα της σφήκας προστατεύονται από αντιδράσεις άμυνας τον ξενιστή και μπορούν να αναπτυχθούν. Στόχος της διατριβής ήταν η μελέτη μελών της οικογένειας πρωτεϊνών που περιέχουν επαναλήψεις αγκυρίνης (πρωτεΐνες Ank) τον polydna ιού CcBV (Cotesia congregata bracovirus), o οποίος ενδοσυμβιώνει με τη σφήκα Cotesia congregata και συμμετέχει στον παρασιτισμό των προνυμφών τον Λεπιδόπτερον Manduca sexta. Οι πρωτεϊνες Ank τον ιού CcBV είναι ομόλογες με μόρια ΙκΒ, δηλαδή δυνητικοί αναστολείς μεταγραφικών παραγόντων τύπον Rel/ΝF-κΒ. 'Εξι γονίδια ank του CcBV νποκλωνοποιήθηκαν σε φορείς κατάλληλους για έκφραση σε κύτταρα λεπιδοπτέρων εντόμων ώστε να γίνει συγκριτική μελέτη των ιδιοτήτων των κωδικοποιούμενων πρωτεϊνών. Με παροδικές διαμολύνσεις και ανοσοαποτυπώσεις κατά Western βρέθηκε ότι τα διάφορα μέλη της οικογένειας παρουσιάζουν άνισα επίπεδα έκφρασης, ενώ πειράματα ανοσοφθορισμού ανέδειξαν ετερογένεια στον υποκυτταρικό εντοπισμό τους, με κάποιες πρωτεΐνες να απαντώνται σε περισσότερα τον ενός νποκυτταρικά διαμερίσματα σε διαφορετικά κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο εντοπισμός και η έκφρασή τους υπόκεινται σε ρύθμιση. Με χρήση κατάλληλων λειτουργικών πειραμάτων, εξετάστηκε επίσης η επίδραση των πρωτεϊνών Ank στην ενεργότητα Rel/ΝF-κΒ παραγόντων τον καλλιεργούμενου μεταξοσκώληκα Bombyx mori σε κυτταρικές σειρές λεπιδοπτέρων εντόμων. Οι παράγοντες Rel/ΝF-κΒ ρυθμίζουν, μέσω των οδών μεταγωγής σήματος Imd και Toll, την έκφραση γονιδίων που ελέγχουν πολλαπλές πτυχές τον ανοσοποιητικού συστήματος των εντόμων, όπως την παραγωγή αντιμικροβιακών πεπτιδίων, καθώς και αποκρίσεις που αφορούν πιο άμεσα την αντιμετώπιση του παρασιτισμού, όπως η μελανοποίηση, η εγκύστωση, η παραγωγή ελευθέρων ριζών

3 και οι αντι-ιικές αποκρίσεις. Επομένως, πιθανολογείται ότι η αναστολή των παραγόντων Rel/ΝF-κΒ και η συνεπαγόμενη παρεμπόδιση των σηματοδοτικών οδών Toll και Imd τον ανοσοποιητικού συστήματος των λεπιδόπτερων ξενιστών από πρωτεϊνες των polydna ιών, και ειδικότερα από τις πρωτεΐνες Ank, είναι σημαντική για την επιβίωση των παρασιτοειδών. Για να διαπιστωθεί αν η συγκεκριμένη υπόθεση ευσταθεί και με δεδομένη τη μη διαθεσιμότητα των γονιδίων Rel/ΝF-κΒ παραγόντων τον φυσικού ξενιστή της C. congregata, M. sexta, χρησιμοποιήθηκε ένα ετερόλογο λειτουργικό σύστημα που περιέλαβε τα γονίδια των ετερόλογων μεταγραφικών παραγόντων Relishl και RelB τον B. mori, που συμμετέχουν στις οδούς μεταγωγής σήματος Imd και Toll, αντίστοιχα, σε συνδυασμό με την κυτταρική σειρά Hi5 του Λεπιδοπτέρον Trichoplusia ni. Σε λειτουργικές δοκιμασίες φωταύγειας διερευνήθηκε η επίδραση των έξι ιικών πρωτεϊνών Ank στη μεταγραφή ενός γονιδίού αναφοράς fireflg luciferase, που είχε τεθεί υπό τον έλεγχο υποκινητών με στοιχεία πρόσδεσης Rel/ΝF-κΒ για τους δύο μεταγραφικούς παράγοντες τον μεταξοσκώληκα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι πέντε από τις έξι πρωτεϊνες τον CcBV που ελέγχθηκαν προκάλεσαν αναστολή στην ενεργότητα τον μεταγραφικού παράγοντα R1d2, μια συστατικά ενεργή μορφή τον Relishl, στο μονοπάτι Imd, με την αναστολή να είναι διαφορική για τα έξι μέλη και δοσοεξαρτόμενη για τρία μέλη της οικογένειας που εξετάστηκαν σε σχετικά πειράματα δοσοεξάρτησης. Αντίθετα, η ενεργότητα τον μεταγραφικού παράγοντα Re1B, που ενεργοποιείται από το μονοπάτι Toll, βρέθηκε να αναστέλλεται μόνο από ένα από τα έξι μέλη της οικογένειας Ank που εξετάστηκαν. H διαφοροποίηση ανάμεσα στις δύο οδούς μεταγωγής σήματος υποδηλώνει την εξειδίκευση των διαφορετικών ιικών πρωτεϊνών Ank ως προς τα μόρια-στόχους τους και υποδεικνύει ότι τα περισσότερα μέλη στοχεύουν την οδό μεταγωγής σήματος Imd, γεγονός πιθανά ενδεικτικό τον ρόλου που η συγκεκριμένη οδός διαδραματίζει στην αντι-ιική προστασία των εντόμων. Σε κύτταρα Hi5 που υπερεκφράζονν παροδικά τις ιικές πρωτεϊνες και τους μεταγραφικούς παράγοντες παρατηρήθηκε πυρηνικός συνεντοπισμός τον μεταγραφικού παράγοντα R1d2 με αρκετές από τις πρωτεΐνες Ank που αναστέλλούν τη λειτουργία τον, ενώ ο παράγοντας Re1B παρουσίασε συνεντοπισμό με την πρωτεϊνη-αναστολέα τον στο κυτταρόπλασμα. Επιπλέον, πειράματα συγκατακρήμνισης έδειξαν αλληλεπίδραση ανάμεσα σε δύο πρωτεϊνες Ank και τον πλήρους μήκους παράγοντα Relishl, γεγονός που, σε συνδυασμό με την αναστολή

4 του Rld2 από τις ιικές πρωτεϊνες, υποδηλώνει ότι οι πρωτεϊνες Ank πιθανώς δρουν ως αναστολείς τον Relishl και in νίνο. Στα πλαίσια της προσπάθειας για διαλεύκανση πιθανής δράσης των πρωτεϊνών Ank του CcBV σε Rel/ΝF-κΒ παράγοντες Θηλαστικών, τα έξι ank γονίδια υποκλωνοποιήθηκαν σε φορέα κατάλληλο για έκφραση σε κύτταρα Θηλαστικών και εξετάστηκε η δράση των αντίστοιχων πρωτεϊνών στη λειτουργικότητα τον ενδογενούς μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ κυττάρων ΗΕΚ293. Χρησιμοποιώντας την κυτταροκίνη TNF-α ως επαγωγέα τον NF-κΒ, διαπιστώθηκε η ανασταλτική δράση δύο πρωτεϊνών στην ανοσολογική οδό μεταγωγής σήματος των θηλαστικών που ενεργοποιείται μέσω τον υποδοχέα τον παράγοντα νέκρωσης όγκων TNFR και είναι αντίστοιχη με την Imd οδό των εντόμων. Συμπεραματικά, με τις μελέτες που περιγράφονται σε αυτή τη διατριβή, επιχειρήθηκε για πρώτη φορά η σύγκριση ανάμεσα σε πολλά μέλη μιας οικογένειας πρωτεϊνών Ank των ενδοσυμβιωτικών polydna ιών σε επίπεδο έκφρασης και υποκυτταρικής κατανομής αλλά και σε λειτουργικό επίπεδο δίνοντας έτσι τη δυνατότητα κατανόησης της λειτουργικής ποικιλομορφίας που υπάρχει σε πρωτεϊνικές οικογένειες των polydna ιών. Τα αποτελέσματα είναι συμβατά με την υπόθεση ότι οι πρωτεϊνες επαναλήψεων αγκυρίνης των polydna ιών δρουν ως αναστολείς παραγόντων Rel/ΝF-κΒ, τόσο στα λεπιδόπτερα έντομα όσο και στα Θηλαστικά. Μάλιστα, στα έντομα, οι πρωτεϊνες Ank έχουν τη δυνατότητα να καταστέλλούν και τις δύο κύριες ανοσολογικές οδούς μεταγωγής σήματος, Toll και Imd. Επίσης, φαίνεται ότι τα μέλη της οικογένειας Ank τον ενδοσυμβιωτικού ιού ενός Υμενοπτέρού που παρασιτεί ένα συγκεκριμένο Λεπδδόπτερο μπορούν να παρεμποδίζουν τη λειτουργία ρυθμιστών της ανοσίας και άλλων Λεπιδοπτέρων πέραν του φυσικού τον ξενιστή. Επομένως, πρωτεϊνες των polydna ιών, όπως οι Ank, Θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την καταστολή του ανοσοποιητικού συστήματος των εντόμων στα πλαίσια ενίσχυσης ήδη υπάρχοντων στρατηγικών καταπολέμησης επιβλαβών εντόμων, οι οποίες βασίζονται στη χρήση εντομοπαθογόνων μικροοργανισμών.

5 Υποψήφια διδάκτωρ Χ.Μαγκριώτη 48nva) α8 Νήμ~,, αοί-f Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή Ε. Λεκανίδον Ομότιμη Καθηγήτρια (επιβλέπονσα) Δ. Σίδερης Αναπλ. Καθηγητής r. Ιατρού Ερευνητής A'

Σχετικά έγγραφα

κυηαραό κύκλο απουσία του Rb, ελέγχθηκαν τα επiπεδα του c-myc mrna

κυηαραό κύκλο απουσία του Rb, ελέγχθηκαν τα επiπεδα του c-myc mrna ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ο ERF (Ets-2 Repressor Factor) εiνaι μετaγpaφικός κaταστολέας της οικογέναας των ETS γονιδίων, ο οποίος ρυθμίζεται από το μονοπάπ RaslErk. Το 2 8kb mrna του Erf εκφράζεται ομοιόμορφα σε όλους