ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΖΩΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΖΩΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΧΡΙΣΤΙΝΑΣ Μ. ΞΑΝΘΟΠΟΥΛΟΥ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΓΕΩΠΟΝΟΥ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΛΙΠΟΠΟΛΥΣΑΚΧΑΡΙΤΗ ΚΑΙ ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ TOLL-LIKE ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΣΕ IN-VITRO ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ SERTOLI ΑΡΣΕΝΙΚΩΝ ΟΡΝΙΘΙΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2016

2 ΧΡΙΣΤΙΝΑΣ Μ. ΞΑΝΘΟΠΟΥΛΟΥ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΛΙΠΟΠΟΛΥΣΑΚΧΑΡΙΤΗ ΚΑΙ ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ TOLL-LIKE ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΣΕ IN-VITRO ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ SERTOLI ΑΡΣΕΝΙΚΩΝ ΟΡΝΙΘΙΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στη Σχολή Γεωπονίας Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος Τμήμα: Γεωπονίας Τομέας: Ζωικής Παραγωγής Ημερομηνία Προφορικής Εξέτασης: 06/07/2016 Εξεταστική Επιτροπή Γεώργιος Μιχαηλίδης, Επίκουρος Καθηγητής του Τμήματος Γεωπονίας του Α.Π.Θ. και επιβλέπων Καθηγητής, Γεώργιος Βατζιάς, Επίκουρος Καθηγητής του Τμήματος Γεωπονίας του Α.Π.Θ. Αναγνώστης Αργυρίου, Ερευνητής Β του Ε.Κ.Ε.Τ.Α.

3 Χριστίνα Μ. Ξανθοπούλου Α.Π.Θ. ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΛΙΠΟΠΟΛΥΣΑΚΧΑΡΙΤΗ ΚΑΙ ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ TOLL-LIKE ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΣΕ IN-VITRO ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ SERTOLI ΑΡΣΕΝΙΚΩΝ ΟΡΝΙΘΙΩΝ «Η έγκριση της παρούσης Μεταπτυχιακής Διατριβής από το Τμήμα Γεωπονίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» (Ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2). 3

4 Ευχαριστίες Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε εξ ολοκλήρου στο Εργαστήριο Φυσιολογίας Αναπαραγωγής των Αγροτικών Ζώων στα πλαίσια του ΠΜΣ Επιστήμη Ζωικής Παραγωγής, του Τμήματος Γεωπονίας, της Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ. Θα ήθελα να εκφράσω τις ολόψυχες ευχαριστίες μου στον επιβλέποντα μου, κ. Μιχαηλίδη Γεώργιο, Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Γεωπονίας Α.Π.Θ. του τομέα Ζωικής Παραγωγής, για την ανάθεση της εκπόνησης της συγκεκριμένης εργασίας και την εμπιστοσύνη που μου έδειξε καθ όλη τη διάρκεια της προπτυχιακής και μεταπτυχιακής μου φοίτησης, καθώς και για την καθοδήγηση και την αμέριστη βοήθειά του. Η διαρκής στήριξη που μου παρείχε και οι πολύτιμες συμβουλές του με βοήθησαν να ολοκληρώσω τη διατριβή αυτή. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους καθηγητές του τομέα για τις γνώσεις που μας μεταλαμπάδευσαν μέσω των μαθημάτων τους. Πιο συγκεκριμένα οφείλω να εκφράσω τις εγκάρδιες ευχαριστίες μου στον κ. Βατζιά Γεώργιο, Επίκουρο Καθηγητή του τομέα, ο οποίος με βοήθησε ιδιαίτερα μέσα από τις διαλέξεις, αλλά και τις συμβουλές του. Επίσης ευχαριστώ θερμά τον κ. Αργυρίου Αναγνώστη για την τιμή που μου κάνει μετέχοντας στη συμβουλευτική επιτροπή μου. Επιπλέον, ευχαριστώ ιδιαίτερα το Λέκτορα του Τμήματος Κτηνιατρικής Α.Π.Θ., κ. Θεοδωρίδη Αλέξανδρο, για τη βοήθειά του στη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων. Ένα μεγάλο ευχαριστώ σε όλα τα άτομα του οικογενειακού μου περιβάλλοντος που στάθηκαν δίπλα μου κατά τη διάρκεια των σπουδαστικών μου χρόνων. Τέλος, θα ήθελα να αφιερώσω την παρούσα διατριβή στον αείμνηστο συμφοιτητή μου Χρήστο Τοξίδη, η σκέψη του οποίου θα με συντροφεύει πάντα. Θεσσαλονίκη 2016 Χ. ΞΑΝΘΟΠΟΥΛΟΥ Η χρηματοδότηση της διπλωματικής εργασίας έγινε από το Εργαστήριο Φυσιολογίας Αναπαραγωγής των Αγροτικών Ζώων του τομέα Ζωικής Παραγωγής του τμήματος Γεωπονίας Α.Π.Θ. 4

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ... 5 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ... 6 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ... 7 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΩΝ... 7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT Α. ΜΕΡΟΣ - ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΠΕΤΕΙΝΟΥ Η ΑΜΥΝΑ ΤΩΝ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΙΚΩΝ ΟΡΓΑΝΩΝ TO ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Έμφυτη Ανοσία Επίκτητη ανοσία ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΑΜΥΝΑΣ Αναγνώριση παθογόνων μικροοργανισμών Toll-like υποδοχείς (Toll-like Receptors - TLRs) Αναγνώριση συνδετών από τους TLRs Οι TLRs των πτηνών Κυτταροκίνες (Cytokines) ΚΥΤΤΑΡΑ SERTOLI Βιολογία των κυττάρων Ενδοκρινολογία των κυττάρων Ο ρόλος των κυττάρων στη σπερματογένεση ΛΙΠΟΠΟΛΥΣΑΚΧΑΡΙΤΗΣ LPS ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ (METFORMIN) Β. ΜΕΡΟΣ - ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΕΚΚΙΝΗΤΕΣ ΕΞΑΓΩΓΗ RNA ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ RNA ΜΕ ΔΕΟΞΥΡΙΒΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗ ΣΥΝΘΕΣΗ CDNA Η REAL-TIME PCR ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ

6 Γ. ΜΕΡΟΣ- ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ - ΣΥΖΗΤΗΣΗ - ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΑ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΚΑΙ ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΤΗΞΗΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΧΕΤΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ ΕΙΚΟΝΑ 1. ΣΧΗΜΑΤΙΚΗ ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗ ΤΩΝ ΟΡΓΑΝΩΝ ΤΟΥ ΟΥΡΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΠΕΤΕΙΝΟΥ ΕΙΚΟΝΑ 2. ΈΜΦΥΤΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΤΗΤΗ ΑΝΟΣΙΑ. ΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ ΠΑΡΕΧΟΥΝ ΤΗΝ ΑΡΧΙΚΗ ΑΜΥΝΑ ΕΝΑΝΤΙΑ ΣΤΙΣ ΜΟΛΥΝΣΕΙΣ. Η ΕΠΙΚΤΗΤΗ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΑΠΟΚΡΙΣΗ ΑΝΑΠΤΥΣΣΕΤΑΙ ΑΡΓΟΤΕΡΑ ΚΑΙ ΑΠΟΤΕΛΕΙΤΑΙ ΑΠΟ ΤΗΝ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ. Η ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΤΩΝ ΔΥΟ ΑΥΤΩΝ ΑΠΟΚΡΙΣΕΩΝ ΔΙΝΕΤΑΙ ΚΑΤΑ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΚΑΙ ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΠΟΙΚΙΛΕΙ ΣΤΙΣ ΔΙΑΦΟΡΕΣ ΜΟΛΥΝΣΕΙΣ. (ABBAS, A.K., LICHTMAN, A.H., PILLAI, S CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY. SAUNDERS, ELSEVIER, PHILADELPHIA. PAGE: 5) ΕΙΚΟΝΑ 3. ΔΟΜΗ TLR ΕΙΚΟΝΑ 4. ΣΠΕΡΜΑΤΙΚΟ ΣΩΛΗΝΑΡΙΟ ΑΡΟΥΡΑΙΟΥ. ΤΑ ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΡΙΑ (ΚΟΚΚΙΝΟ) ΕΙΝΑΙ ΕΝΣΩΜΑΤΩΜΕΝΑ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ SERTOLI (ΠΡΑΣΙΝΟ). ΤΑ ΣΠΕΡΜΑΤΟΓΟΝΙΑ ΚΑΙ ΤΑ ΣΠΕΡΜΑΤΟΚΥΤΤΑΡΑ ΕΙΝΑΙ ΧΡΩΜΑΤΙΣΜΕΝΑ ΜΠΛΕ ΚΑΙ ΜΩΒ, ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΑ. ΠΗΓΗ: 39 ΕΙΚΟΝΑ 5. ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗ ΕΝΟΣ ΣΠΕΡΜΑΤΙΚΟΥ ΣΩΛΗΝΑΡΙΟΥ ΚΑΙ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΔΙΑΜΕΣΟΥ ΙΣΤΟΥ ΠΟΥ ΒΡΙΣΚΟΝΤΑΙ ΕΞΩ ΑΠΟ ΑΥΤΟ. ΠΗΓΗ: HISTOLOGY GUIDE FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES, UNIVERSITY OF LEEDS ΕΙΚΟΝΑ 6. ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗ ΑΙΜΑΤΟ-ΟΡΧΙΚΟΥ ΦΡΑΓΜΟΥ, ΚΥΤΤΑΡΩΝ SERTOLI ΚΑΙ ΤΩΝ ΔΥΟ ΔΙΑΜΕΡΙΣΜΑΤΩΝ ΤΟΥ ΣΠΕΡΜΑΤΙΚΟΥ ΣΩΛΗΝΑΡΙΟΥ ΕΙΚΟΝΑ 7. ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΟΠΟΙΑ ΠΑΡΑΓΕΤΑΙ Η ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ ΕΙΚΟΝΑ 8. ΤΡΟΠΟΣ ΔΡΑΣΗΣ ΦΘΟΡΙΖΟΥΣΑΣ ΟΥΣΙΑΣ SYBR GREEN. Η ΟΥΣΙΑ SYBR GREEN I ΔΕΝ ΠΑΡΑΓΕΙ ΦΘΟΡΙΣΜΟ ΟΤΑΝ ΒΡΙΣΚΕΤΑΙ ΕΛΕΥΘΕΡΗ ΣΕ ΔΙΑΛΥΜΑ ΕΝΩ ΦΘΟΡΙΖΕΙ ΟΤΑΝ ΕΝΣΩΜΑΤΩΝΕΤΑΙ ΣΤΟ DNA, ΚΑΤΑ ΤΗ ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ ΕΙΚΟΝΑ 9. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΙΧΝΗΛΑΤΗ TAQMAN. Ο ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΑΥΤΟΣ ΒΑΣΙΖΕΤΑΙ ΣΤΗΝ 5-3 ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ ΤΗΣ DNA TAQ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ ΝΑ ΔΙΑΣΠΑ ΕΝΑΝ ΔΙΠΛΑ ΣΗΜΑΣΜΕΝΟ ΙΧΝΗΛΑΤΗ ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΥΒΡΙΔΟΠΟΙΗΣΗΣ ΜΕ ΤΗΝ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΗ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑ ΣΤΟΧΟ. (INTRODUCTION TO QUANTITATIVE PCR, 2012) ΕΙΚΟΝΑ 10. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΗ ΚΑΜΠΥΛΗ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ, ΟΠΟΥ ΔΙΑΚΡΙΝΟΝΤΑΙ Η ΕΚΘΕΤΙΚΗ, Η ΓΡΑΜΜΙΚΗ ΚΑΙ Η ΦΑΣΗ ΚΟΡΕΣΜΟΥ. ΣΤΟΝ ΟΡΙΖΟΝΤΙΟ ΑΞΟΝΑ ΠΑΡΙΣΤΑΝΕΤΑΙ Ο ΑΡΙΘΜΟΣ ΤΩΝ ΚΥΚΛΩΝ ΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ, ΕΝΩ ΣΤΟΝ ΚΑΤΑΚΟΡΥΦΟ Η ΤΙΜΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ ΕΙΚΟΝΑ 11. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΕΣ ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΤΗΞΗΣ. ΣΤΟ ΣΧΗΜΑ ΔΙΑΚΡΙΝΟΝΤΑΙ ΟΙ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΕΣ (TM) ΚΑΙ ΟΙ ΚΟΡΥΦΕΣ (MELTING PEAKS) ΤΗΞΗΣ ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ

7 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ ΠΙΝΑΚΑΣ 1. ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΔΡΑΣΕΙΣ ΤΗΣ ΩΟΘΥΛΑΚΙΟΤΡΟΠΟΥ ΟΡΜΟΝΗΣ (FSH) ΣΤΟ ΑΡΣΕΝΙΚΟ. (HORMONES, SECOND EDITION. ANTHONY W.NORMAN, GERALD LITWACK. 1997) ΠΙΝΑΚΑΣ 2. ΖΕΥΓΟΣ ΕΚΚΙΝΗΤΩΝ Β-ΑΚΤΙΝΗΣ ΠΙΝΑΚΑΣ 3. ΕΚΚΙΝΗΤΕΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ TLR ΟΡΝΙΘΩΝ ΠΙΝΑΚΑΣ 4. ΕΚΚΙΝΗΤΕΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΟΡΝΙΘΩΝ ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΩΝ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 1. ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΑΚΤΙΝΗΣ ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΚΥΚΛΩΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 2. ΚΟΡΥΦΕΣ ΤΗΞΗΣ ΑΚΤΙΝΗΣ ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 3. ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΤΟΥ TLR 1.1 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΚΥΚΛΩΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 4. ΚΟΡΥΦΕΣ ΤΗΞΗΣ ΤΟΥ TLR 1.1 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 5. ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΤΟΥ TLR 1.2 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΚΥΚΛΩΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 6. ΚΟΡΥΦΕΣ ΤΗΞΗΣ ΤΟΥ TLR 1.2 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 7. ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΤΟΥ TLR ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΚΥΚΛΩΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 8. ΚΟΡΥΦΕΣ ΤΗΞΗΣ ΤΟΥ TLR 2.1 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 9. ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΤΟΥ TLR ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΚΥΚΛΩΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 10. ΚΟΡΥΦΕΣ ΤΗΞΗΣ ΤΟΥ TLR 2.2 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 11. ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΤΟΥ TLR ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΚΥΚΛΩΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 12. ΚΟΡΥΦΕΣ ΤΗΞΗΣ ΤΟΥ TLR 3 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 13. ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΤΟΥ TLR ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΚΥΚΛΩΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ

8 ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 14. ΚΟΡΥΦΕΣ ΤΗΞΗΣ ΤΟΥ TLR 4 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 15. ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΤΟΥ TLR ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΚΥΚΛΩΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 16. ΚΟΡΥΦΕΣ ΤΗΞΗΣ ΤΟΥ TLR 5 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 17. ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΤΟΥ TLR ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΚΥΚΛΩΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 18. ΚΟΡΥΦΕΣ ΤΗΞΗΣ ΤΟΥ TLR 7 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 19. ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΤΟΥ TLR ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΚΥΚΛΩΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 20. ΚΟΡΥΦΕΣ ΤΗΞΗΣ ΤΟΥ TLR 15 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 21. ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΤΟΥ TLR ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΚΥΚΛΩΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 22. ΚΟΡΥΦΕΣ ΤΗΞΗΣ ΤΟΥ TLR 21 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 23. ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΤΟΥ IFNG ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΚΥΚΛΩΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 24. ΚΟΡΥΦΕΣ ΤΗΞΗΣ ΤΟΥ IFNG ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 25. ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΤΟΥ IL 1B ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΚΥΚΛΩΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 26. ΚΟΡΥΦΕΣ ΤΗΞΗΣ ΤΟΥ IL 1B ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 27. ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΤΟΥ IL ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΚΥΚΛΩΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 28. ΚΟΡΥΦΕΣ ΤΗΞΗΣ ΤΟΥ IL 6 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 29. ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΤΟΥ IL ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΚΥΚΛΩΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 30. ΚΟΡΥΦΕΣ ΤΗΞΗΣ ΤΟΥ IL 8 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 31. ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΤΟΥ IL 12 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΚΥΚΛΩΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 32. ΚΟΡΥΦΕΣ ΤΗΞΗΣ ΤΟΥ IL 12 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ

9 ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 33. ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΤΟΥ IL 15 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΚΥΚΛΩΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 34. ΚΟΡΥΦΕΣ ΤΗΞΗΣ ΤΟΥ IL 15 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 35. ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΤΟΥ IL 17 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΚΥΚΛΩΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 36. ΚΟΡΥΦΕΣ ΤΗΞΗΣ ΤΟΥ IL 17 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 37. ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΤΟΥ IL 18 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΚΥΚΛΩΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 38. ΚΟΡΥΦΕΣ ΤΗΞΗΣ ΤΟΥ IL 18 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (530 NM) ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 39. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΧΕΤΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ TLR 1-1 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΕΠΩΑΣΗΣ ΜΕ: Α. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ Β. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ ΚΑΙ LPS ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 40. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΧΕΤΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ TLR 1-2 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΕΠΩΑΣΗΣ ΜΕ : Α. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ Β. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ ΚΑΙ LPS ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 41. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΧΕΤΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ TLR 2-1 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΕΠΩΑΣΗΣ ΜΕ : Α. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ Β. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ ΚΑΙ LPS ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 42. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΧΕΤΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ TLR 2-2 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΕΠΩΑΣΗΣ ΜΕ : Α. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ Β. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ ΚΑΙ LPS ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 43. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΧΕΤΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ TLR 3 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΕΠΩΑΣΗΣ ΜΕ : Α. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ Β. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ ΚΑΙ LPS ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 44. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΧΕΤΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ TLR 4 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΕΠΩΑΣΗΣ ΜΕ : Α. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ Β. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ ΚΑΙ LPS ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 45. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΧΕΤΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ TLR 5 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΕΠΩΑΣΗΣ ΜΕ : Α. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ Β. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ ΚΑΙ LPS ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 46. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΧΕΤΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ TLR 7 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΕΠΩΑΣΗΣ ΜΕ : Α. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ Β. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ ΚΑΙ LPS ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 47. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΧΕΤΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ TLR 15 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΕΠΩΑΣΗΣ ΜΕ : Α. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ Β. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ ΚΑΙ LPS ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 48. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΧΕΤΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ TLR 21 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΕΠΩΑΣΗΣ ΜΕ : Α. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ Β. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ ΚΑΙ LPS ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 49. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΧΕΤΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ IFNG ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΕΠΩΑΣΗΣ ΜΕ : Α. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ Β. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ ΚΑΙ LPS ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 50. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΧΕΤΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ IL- 1Β ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΕΠΩΑΣΗΣ ΜΕ : Α. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ Β. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ ΚΑΙ LPS ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 51. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΧΕΤΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ IL-6 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΕΠΩΑΣΗΣ ΜΕ : Α. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ Β. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ ΚΑΙ LPS

10 ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 52. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΧΕΤΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ IL-8 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΕΠΩΑΣΗΣ ΜΕ : Α. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ Β. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ ΚΑΙ LPS ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 53. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΧΕΤΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ IL-12 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΕΠΩΑΣΗΣ ΜΕ : Α. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ Β. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ ΚΑΙ LPS ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 54. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΧΕΤΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ IL-15 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΕΠΩΑΣΗΣ ΜΕ : Α. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ Β. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ ΚΑΙ LPS ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 55. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΧΕΤΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ IL-17 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΕΠΩΑΣΗΣ ΜΕ : Α. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ Β. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ ΚΑΙ LPS ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 56. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΧΕΤΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ IL-18 ΩΣ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΕΠΩΑΣΗΣ ΜΕ : Α. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ Β. ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ ΚΑΙ LPS

11 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Οι όρνιθες αποτελούν ένα σημαντικό είδος ζωικού κεφαλαίου και εκτρέφονται ως πηγή ζωικών πρωτεϊνών παγκοσμίως. H προστασία των αναπαραγωγικών οργάνων τους από τα παθογόνα μικρόβια είναι μια σημαντική πτυχή της αναπαραγωγικής φυσιολογίας και κρίνεται απαραίτητη για τη διατήρηση της φυσιολογικής αναπαραγωγικής τους λειτουργίας. Η μειωμένη αναπαραγωγική ικανότητα είναι ένα από τα πιο σοβαρά βιολογικά προβλήματα που επηρεάζουν σημαντικά την αποδοτικότητα της κτηνοτροφίας, καθώς οδηγεί σε μείωση της παραγωγικότητας με αποτέλεσμα σημαντικές οικονομικές απώλειες. Επιπλέον, η μόλυνση του αναπαραγωγικού συστήματος μπορεί να προκαλέσει και μόλυνση προϊόντων που προορίζονται για ανθρώπινη κατανάλωση όπως είναι τα αυγά και το κρέας και έτσι προκύπτουν προβλήματα δημόσιας υγείας. Τα τελευταία χρόνια η έρευνα για την αντιμικροβιακή προστασία των αναπαραγωγικών οργάνων έχει υποδείξει τον κρίσιμο ρόλο του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος στον έλεγχο μικροβιακών λοιμώξεων του γεννητικού συστήματος. Ειδικότερα, το έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα και η παραγωγή των αντιμικροβιακών πεπτιδίων εντός της αναπαραγωγικής οδού έχουν αρχίσει να ταυτοποιούνται και έχει καταστεί πλέον σαφές ότι το αναπαραγωγικό σύστημα της όρνιθας είναι ικανό να αναγνωρίσει τους παθογόνους μικροοργανισμούς μέσω των TLRs και να ενεργοποιήσει ανοσολογικές αποκρίσεις, με αποτέλεσμα την παραγωγή αντιμικροβιακών πεπτιδίων, χημειοκινών και κυτταροκινών. Ωστόσο, χρειάζονται ακόμη πολλά βήματα για τη μελέτη και την πλήρη κατανόηση των μηχανισμών αυτών. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η χρονική πορεία μιας φλεγμονώδους απόκρισης σε κύτταρα Sertoli πετεινών, η οποία προκλήθηκε έπειτα από επώαση των υπό μελέτη κυττάρων με βακτηριακό λιποπολυσακχαρίτη (LPS), παρουσία μετφορμίνης και πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Στη συνέχεια μελετήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των TLRs και κυτταροκινών, γονιδίων που σχετίζονται με την ανοσολογική απόκριση. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την ανάλυση της έκφρασης υποδεικνύουν ότι και τα δέκα μέλη της οικογένειας TLRs καθώς και τα οκτώ μέλη της οικογένειας των κυτταροκινών, εκφράστηκαν στα 11

12 κύτταρα Sertoli των πετεινών. Επιπλέον, βρέθηκε ότι η προσθήκη μετφορμίνης στα υπό μελέτη κύτταρα οδήγησε σε στατιστικά σημαντική (P<0.05) αύξηση των επιπέδων έκφρασης των TLR 2-1, IFNg και IL-1β και μείωση της έκφρασης του TLR7, σε συγκεκριμένα πάντα χρονικά διαστήματα τα οποία και παρατίθενται. Όσον αφορά τον ταυτόχρονο χειρισμό με μετφορμίνη και επώαση με LPS, τρία μέλη της οικογένειας των TLRs παρουσίασαν στατιστικά σημαντική αύξηση της έκφρασής τους συναρτήσει χρόνου, οι TLR 1-2, TLR 2-1 και TLR 17, και άλλα τρία στατιστικά σημαντική μείωση της εκφρασης, οι TLR 2-2, TLR 4 και TLR 7. Τέλος, ο συνδυασμός μετφορμίνης και LPS οδήγησε 5 μέλη της οικογένειας των κυτταροκινών, τις IFNg, IL1-β, IL-6 IL-8 και, IL-18 σε στατιστικά σημαντική αύξηση των επιπέδων έκφρασης και μόνο την IL-17 σε στατιστικά σημαντική μείωση των επιπέδων έκφρασης. 12

13 ABSTRACT Chickens constitute an important kind of livestock economy and they are raised as a valuable source of animal proteins worldwide. Protection of their reproductive organs from pathogens is an important aspect of reproductive physiology and is essential for maintaining a normal reproduction. Reduced reproductive ability is one of the most serious biological problems that affect significantly profitability of livestock production, as it leads to reduced productivity resulting in significant economic losses. In addition, infection of the reproductive tract can cause infection of food products intended for human consumption such as eggs and meat and so public health problems arise. In recent years research on antimicrobial protection of reproductive organs has indicated the critical role of the innate immune system in controlling microbial infections of the genital tract. Specifically, the innate immune system and the production of antimicrobial peptides in the reproductive tract are beginning to be identified and it has become clear that the reproductive system of the chick is capable of recognizing pathogens via TLRs and activate immune responses, resulting in production of antimicrobial peptides, chemokines and cytokines. However, further research is still needed in order to fully understand these mechanisms. In this study, the time course of an inflammatory response in Sertoli cells of fowls, triggered after incubation of the studied cells with bacterial lipopolysaccharide (LPS), in the presence of metformin was investigated and measurements were performed at different time points. Then the expression levels of TLRs and cytokines, genes associated with the immune response were studied. The results obtained from the analysis of the expression indicate that all ten members of TLRs family and the eight members of the cytokines family, expressed in Sertoli cells of fowls. Moreover, it was found that adding metformin to the studied cells resulted in statistically significant (P <0.05) increase in the expression levels of TLR 2-1, IFNg and IL-1b and reduction in the expression of TLR7, in the specific time intervals listed. As for the simultaneous handling with metformin and incubation with LPS, three members of TLRs family showed statistically significant increase in their expression as a function of time, the TLR 1-2, TLR 2-1 and TLR 17, and three statistically significant reduction of 13

14 expression the TLR 2-2, TLR 4 and TLR 7. Finally, the combination of metformin and LPS resulted in a statistically significant increase in expression levels in five members of the cytokines family, the IFNg, IL1-b, IL-6 IL-8 and, IL-18 and only IL- 17 in a statistically significant decrease. 14

15 Α. ΜΕΡΟΣ - ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ 1. Εισαγωγή Οι όρνιθες αποτελούν ένα σημαντικό είδος ζωικού κεφαλαίου και εκτρέφονται ως πηγή ζωικών πρωτεϊνών παγκοσμίως. Τα πτηνά αυτά είναι σε θέση να προσαρμόζονται στις περισσότερες γεωγραφικές περιοχές και συνθήκες και δεν απαιτούν μεγάλες εκτάσεις γης. Επιπλέον, έχουν χαμηλό κόστος αγοράς, ταχεία γενιά και ένα υψηλό ποσοστό παραγωγικότητας. Παρ όλα αυτά, αντιμετωπίζουν ένα ευρύ φάσμα παθογόνων προκλήσεων και για να επιβιώσουν και να αναπαραχθούν χρειάζονται την κατάλληλη έμφυτη και επίκτητη ανοσολογική απόκριση (Marangon and Busani, 2006). H προστασία των αναπαραγωγικών οργάνων των πτηνών από τα παθογόνα μικρόβια είναι μια σημαντική πτυχή της αναπαραγωγικής φυσιολογίας και είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της φυσιολογικής αναπαραγωγικής τους λειτουργίας. Η υπογονιμότητα απασχολεί έντονα τη βιομηχανία των πουλερικών καθώς οδηγεί σε μείωση της παραγωγικότητας που έχει ως αποτέλεσμα σημαντικές οικονομικές απώλειες. Επιπρόσθετα, παγκόσμια ανησυχία αποτελεί το ενδεχόμενο μετάδοσης των σεξουαλικώς μεταδιδόμενων νοσημάτων στα αγροτικά ζώα γενικότερα, γεγονός το οποίο μπορεί να πάρει διαστάσεις επιδημίας μέσω της εξαγωγής γαμετών και εμβρύων των ζώων αυτών, από χώρα σε χώρα. Τα αναπαραγωγικά όργανα των αρσενικών πτηνών μπορούν να μολυνθούν από πολλούς παθογόνους μικροοργανισμούς, όπως διάφορα είδη βακτηρίων που κατά κύριο λόγο ανήκουν στα γένη Staphylococcus και Salmonella. Οι μολύνσεις αυτές μπορεί να προκαλέσουν ορχίτιδα καθώς και οξεία αλλά και χρόνια επιδιδυμίτιδα, οδηγώντας σε μείωση της γονιμότητας. Στην παρούσα εργασία για τη μελέτη της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με την ανοσολογική απόκριση, δε χρησιμοποιήθηκαν μικροβιακά στελέχη αλλά ένα τμήμα τους, αυτό του λιποπολυσακχαρίτη (LPS), ο οποίος έχει τη δυνατότητα να ενεργοποιεί το ανοσοποιητικό σύστημα, χωρίς όμως να υπάρχει κίνδυνος επιμόλυνσης του εργαστηριακού περιβάλλοντος ή και του ίδιου του ερευνητή. 15

16 2. Αναπαραγωγικό σύστημα πετεινού Το αναπαραγωγικό σύστημα του πετεινού αποτελείται από δύο όρχεις, δύο επιδιδυμίδες, τους σπερματικούς πόρους και το πέος. Ο πετεινός δεν έχει βοηθητικούς αδένες σαν εκείνους που περιέχονται στο γεννητικό σύστημα των αρσενικών θηλαστικών, δηλαδή στερείται του προστάτη, των σπερματοδόχων κύστεων και των αδένων του Cowper. Επίσης, οι όρχεις των πετεινών, εν αντιθέσει με αυτούς των θηλαστικών, είναι τοποθετημένοι μέσα στη σπλαχνική κοιλότητα, χωρίς να υπάρχουν δυσμενείς επιδράσεις για το παραγόμενο σπέρμα (Frandson et al., 2009). Οι όρχεις είναι αδένες με εξωκρινή και ενδοκρινή λειτουργία. Ως εξωκρινείς αδένες παράγουν τα σπερματοζωάρια, που αποτελούν τα γεννητικά κύτταρα του αρσενικού, ενώ ως ενδοκρινείς αδένες εκκρίνουν τις ανδρογόνες ορμόνες. Ανατομικά, ο κάθε όρχις αποτελείται από τον ινώδη χιτώνα, τα σπερματικά σωληνάρια, τη διάμεση ουσία, αγγεία και νεύρα (Μάγρας και Αντωνόπουλος, 2008), ενώ δεν παρουσιάζουν διαφραγμάτια, ούτε λόβωση. Το σχήμα των όρχεων χαρακτηρίζεται ως ωοειδές, ενώ το χρώμα και οι διαστάσεις τους μεταβάλλονται περιοδικά, σύμφωνα με την αναπαραγωγική δραστηριότητα του πτηνού. Κατά την περίοδο της γενετήσιας δραστηριότητας έχουν χρώμα σχεδόν λευκό, ενώ τον υπόλοιπο χρόνο το χρώμα τους είναι γκριζοκίτρινο (Μάγρας, 2004). Οι όρχεις του πετεινού περιλαμβάνουν χιλιάδες εσπειραμένα σπερματικά σωληνάρια, που περιέχουν γεννητικά κύτταρα σε διάφορα στάδια εξέλιξής τους κατά τη σπερματογένεση. Όπως στα θηλαστικά, το τοίχωμα των σπειροειδών σπερματικών σωληναρίων των όρχεων των πτηνών, αποτελείται από κύτταρα Sertoli και γεννητικά κύτταρα στα διάφορα στάδια εξέλιξής τους κατά τη σπερματογένεση (Μάγρας, 2004). Τα σπερματοζωάρια βρίσκονται σε ομάδες, με το κεφάλι τους προσκολλημένο στα κύτταρα του Sertoli και την ουρά τους να προβάλλει στον αυλό των σωληναρίων (εικόνα 4) (Ματσούκας, 1985). Οι δύο σπερματικοί αγωγοί είναι εσπειραμένοι και εκτείνονται κατά μήκος της σπονδυλικής στήλης, από την επιδιδυμίδα μέχρι την αμάρα. Οι αγωγοί αυτοί μεταφέρουν τα σπερματοζωάρια από τους όρχεις και την επιδιδυμίδα, στα όργανα συνουσίας, ενώ παράλληλα χρησιμοποιούνται και για την αποθήκευση του σπέρματος (Ματσούκας, 1985). Η εκσπερμάτωση αποτελείται από σπερματοζωάρια 16

17 και ελάχιστες πρόσθετες εκκρίσεις που παράγονται από τους όρχεις και τα τοιχώματα των αγωγών (Frandson et al., 2009). Η επιδιδυμίδες είναι σχετικά μικρές, όχι τόσο αναπτυγμένες όσο στα θηλαστικά και δε διακρίνονται σε αυτές κεφαλή, σώμα και ουρά. Μέσα σε κάθε επιδιδυμίδα υπάρχουν τρεις τύποι σωληναρίων, τα προσαγωγά σωληνάρια, τα συνδετικά ή εκφορητικά σωληνάρια και ο πόρος της επιδιδυμίδας (Μάγρας, 2004). Το όργανο της συνουσίας των πτηνών είναι ο φαλλός ή πέος. Στον πετεινό ο φαλλός δεν προέχει. Τοποθετείται στο κάτω χείλος της αμάρας. Η στύση οφείλεται στη ροή λέμφου μέχρι τα φαλλικά σώματα, τα οποία διογκώνονται και σχηματίζουν αύλακα για την εκροή του σπέρματος. Η εναπόθεση του σπέρματος διευκολύνεται με μια χαρακτηριστική κίνηση πίεσης, της αμάρας του πετεινού στην αμάρα της θηλυκής όρνιθας (Frandson et al., 2009). Επίσης το πέος των πετεινών χρησιμεύει μόνο για τη μεταφορά του σπέρματος και όχι γι αυτή των ούρων (Μάγρας, 2004). Εικόνα 1. Σχηματική απεικόνιση των οργάνων του ουροποιητικού και αναπαραγωγικού συστήματος του πετεινού. 17

18 3. Η άμυνα των αναπαραγωγικών οργάνων Η αναπαραγωγή είναι μια ουσιώδης λειτουργία για κάθε ζωικό οργανισμό, η οποία εξαρτάται από ένα σύνθετο και αλληλένδετο συνδυασμό νευρικών, ενδοκρινικών και ανοσοποιητικών αντιδράσεων. Η ανάπτυξη και η ωρίμανση των γαμετών είναι μια θεμελιώδης διαδικασία για την αποτελεσματική αναπαραγωγή στα αγροτικά ζώα. Η διαδικασία της αναπαραγωγής αποτελεί πηγή εσόδων για τις βιομηχανίες που σχετίζονται με τη ζωική παραγωγή. Τα υγιή και καλά τρεφόμενα ζώα, με σωστές συνθήκες εκτροφής και που έχουν υποστεί γενετική επιλογή, αυξάνονται γρηγορότερα και έχουν καλύτερες αποδόσεις. Για το λόγο αυτό η βελτίωση της αναπαραγωγικής δραστηριότητας των αγροτικών ζώων έχει ερευνηθεί σε βάθος. Ωστόσο, η μειωμένη αναπαραγωγική ικανότητα είναι ένα από τα πιο σοβαρά βιολογικά προβλήματα που επηρεάζουν σημαντικά την αποδοτικότητα της κτηνοτροφίας. Η μείωση της αναπαραγωγικής ικανότητας, που συνεπάγεται και την ταυτόχρονη μείωση της παραγωγικότητας των κτηνοτροφικών βιομηχανιών, οφείλεται κυρίως σε μικροβιακές λοιμώξεις των αναπαραγωγικών οργάνων των ζώων. Ενδεικτικό παράδειγμα αποτελούν οι οικονομικές απώλειες που προκύπτουν στη βιομηχανία των πουλερικών από τη μόλυνση των αναπαραγωγικών οργάνων των αρσενικών ορνίθων η οποία όχι μόνο οδηγεί σε μειωμένη γονιμότητα, αλλά και σε διακοπή του πρόγραμματος παραγωγής, και πολλές φορές σε απόρριψη παρτίδας καθώς υπάρχει ο κίνδυνος ενσωμάτωσης παθογόνων μικροοργανισμών σε προσφάτως σχηματίζομενα αυγά. Εκ πρώτης όψεως, το αναπαραγωγικό και το ανοσοποιητικό σύστημα φαίνονται λειτουργικώς διαχωρισμένα αλλά στην πραγματικότητα υπάρχουν πολύπλοκες διασυνδέσεις μεταξύ τους. Το ανοσοποιητικό σύστημα παίζει σημαντικό ρόλο όχι μόνο στην άμυνα ενάντια στη μόλυνση, αλλά και στον έλεγχο των λειτουργιών των αναπαραγωγικών οργάνων. Η μόλυνση του αναπαραγωγικού συστήματος έχει άμεσες συνέπειες για τη γονιμότητα των πτηνών και την αναπαραγωγική τους υγεία, γενικότερα (Girling and Hedger, 2007). Πληθώρα παθογόνων και δυνητικά παθογόνων μικροοργανισμών αποτελούν απειλή για το αναπαραγωγικό σύστημα των αγροτικών ζώων όπως για παράδειγμα οι Escherichia coli και Staphylococcus aureus. Από αυτούς τους μικροοργανισμούς ξεχωρίζει η 18

19 σαλμονέλλα με τους διάφορους ορότυπούς της, η οποία ανιχνεύεται συχνά τόσο στα ίδια τα πτηνά όσο και σε προϊόντα που προορίζονται για ανθρώπινη κατανάλωση όπως είναι τα αυγά και το κρέας και έτσι προκύπτουν προβλήματα δημόσιας υγείας (Wigley, 2013). Παράδειγμα της μεγάλης έξαρσης της νόσου από το παθογόνο Salmonella enteritidis αποτελεί η ανάκληση περισσότερων από 500 εκατομμυρίων αυγών στις Ηνωμένες Πολιτείες το Η αντιμικροβιακή προστασία των αναπαραγωγικών οργάνων των πετεινών είναι, ως εκ τούτου, μια σημαντική πτυχή της αναπαραγωγικής φυσιολογίας. Τα τελευταία χρόνια η έρευνα για την αντιμικροβιακή προστασία των αναπαραγωγικών οργάνων έχει υποδείξει τον κρίσιμο ρόλο του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος στον έλεγχο μικροβιακών λοιμώξεων του γεννητικού συστήματος του αρσενικού. Όσον αφορά τα πτηνά, τα αναπαραγωγικά όργανα των αρσενικών αποτελούνται από ένα ζεύγος όρχεων, την επιδιδυμίδα και το σπερματικό πόρο. Η μόλυνση αυτών των ιστών μπορεί να προκαλέσει ορχίτιδα, επιδιδυμίτιδα και επιδιδυμοορχίτιδα, ασθένειες που επάγουν την ανωμαλία του σπέρματος και συνεπώς μειώνουν τη γονιμότητα και εξαπλώνουν τη μόλυνση από παθογόνα μέσω του ζευγαρώματος και της τεχνητής σπερματέγχυσης. Η επιδιδυμίδα είναι ένα όργανο που εμπλέκεται στην ωρίμανση, τη μεταφορά και την αποθήκευση του σπέρματος πριν από την εκσπερμάτιση. Ο διαρκής κίνδυνος φλεγμονωδών καταστάσεων στις οποίες εκτίθεται το όργανο μπορεί να οδηγήσει σε παροδική ή μόνιμη στειρότητα και έτσι η προστασία αυτού από παθογόνα μικρόβια είναι απαραίτητη. Όσον αφορά τα θηλυκά ζώα, η μήτρα τους κατά τη διάρκεια της κύησης είναι προστατευμένη και αποστειρωμένη αλλά μετά τον τοκετό το σώμα της μήτρας είναι ευάλωτο σε μολύνσεις από ένα ευρύ φάσμα βακτηρίων. Τα ζώα με λοιμώξεις της μήτρας είναι λιγότερο πιθανό να παράξουν ωάρια, επειδή έχουν πιο αργή ανάπτυξη του κυρίαρχου ωοθυλακίου στην ωοθήκη, χαμηλότερες συγκεντρώσεις οιστραδιόλης στο πλάσμα του αίματος και παρουσιάζουν διαταραχές στη λειτουργία του υποθαλάμου και της υπόφυσης. Μεταξύ των θηλαστικών αγροτικών ζώων, μεγαλύτερη οικονομική σημασία έχει η μικροβιακή μόλυνση του αναπαραγωγικού συστήματος των θηλυκών βοοειδών. Ενδεικτικά, η οικονομική επίπτωση ενός κρούσματος μητρίτιδας στις αγελάδες (η οποία οδηγεί σε υπογονιμότητα), προέρχεται από την επιλεκτική θανάτωση του ζώου λόγω αποτυχίας κυοφορίας, τη μειωμένη παραγωγή γάλακτος και τέλος το κόστος 19

20 θεραπείας του. Το 2001 το οικονομικό κόστος μιας μεμονωμένης περίπτωσης μητρίτιδας υπολογίστηκε στα 292 ευρώ, ενώ το ετήσιο κόστος των μολύνσεων της μήτρας υπολογίστηκε για την Ευρωπαϊκή Ένωση και τις Η.Π.Α. στα 1,4 δις και 650 εκατομμύρια ευρώ αντίστοιχα. Όσον αφορά τις θηλυκές όρνιθες, λόγω της ιδιαιτερότητας της ανατομίας του κόλπου τους πολλοί μικροοργανισμοί δύνανται να εισέλθουν. Πιο συγκεκριμένα, καθώς ο κόλπος ανοίγει στην αμάρα για να αποτεθεί το αυγό, διάφοροι μικροοργανισμοί μπορούν να εισέλθουν στον αυλό του ωαγωγού. Όπως αναφέρεται σε έρευνες έχουν απομονωθεί από τις σάλπιγγες μολυσμένων πτηνών διάφορα παθογόνα βακτηριακά και ιογενή στελέχη όπως είδη του γένους Salmonella, ο ιός της βρογχίτιδας και ο ιός της γρίπης των πτηνών. Η εγκατάσταση μικροοργανισμών στον ωαγωγό μπορεί να προκαλέσει όχι μόνο διαταραχές αυτού του οργάνου, αλλά επίσης να μολύνει και τα αυγά. Έτσι, η τοπική ανοσία του ξενιστή στη σάλπιγγα είναι απαραίτητη για την άμυνα των ιστών και την παραγωγή υγειών αυγών. Οι γνώσεις της επιστημονικής κοινότητας για τις ανοσολογικές αποκρίσεις του αναπαραγωγικού συστήματος, τις απαντήσεις του στη μόλυνση καθώς και τη ρύθμισή του, έχουν διευρυνθεί τα τελευταία χρόνια. Ειδικότερα, το έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα και η παραγωγή των αντιμικροβιακών πεπτιδίων εντός της αναπαραγωγικής οδού έχουν αρχίσει να ταυτοποιούνται. Καθώς η ικανότητα του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος είναι ζωτικής σημασίας για την πρόληψη της μικροβιακής μόλυνσης, ένας αυξανόμενος αριθμός γνωστών ή υποθετικών αντιμικροβιακών αμυντικών συστημάτων έχει αναφερθεί πως είναι παρόντα στο γεννητικό σύστημα διαφόρων σπονδυλωτών ειδών. Ειδικότερα, στα αναπαραγωγικά όργανα και τα σπερματοζωάρια πολλών αγροτικών ζώων, έχει ανιχνευθεί ένα πλήθος αντιμικροβιακών πεπτιδίων, όπως τα μέλη της οικογένειας β-ντεφενσινών. Εκτός από τη συμβολή τους στην έμφυτη ανοσία των αρσενικών αναπαραγωγικών οργάνων, τα αντιμικροβιακά πεπτίδια διαδραματίζουν σπουδαίο ρόλο στη γονιμότητα του αρσενικού, στην επιβίωση του σπέρματος εντός του αναπαραγωγικού συστήματος του αρσενικού αλλά και στην αλληλεπίδραση σπέρματος-ωαρίου. Η άμυνα των αναπαραγωγικών οργάνων των πτηνών είχε ελάχιστα μελετηθεί μέχρι πρόσφατα. Τα τελευταία χρόνια, σημαντική πρόοδος σημειώθηκε στην κατανόηση του ρόλου του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος στο αναπαραγωγικό σύστημα, της σημασίας των εκκρινόμενων αντιμικροβιακών πεπτιδίων, όπως και της 20

21 συμβολής των Toll-like υποδοχέων (βλέπε κεφάλαιο 5). Έτσι, είναι πλέον σαφές ότι το αναπαραγωγικό σύστημα της όρνιθας είναι ικανό να αναγνωρίσει τους παθογόνους μικροοργανισμούς μέσω των TLRs και να ενεργοποιήσει ανοσολογικές αποκρίσεις, με αποτέλεσμα την παραγωγή αντιμικροβιακών πεπτιδίων, χημειοκινών και κυτταροκινών. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης των ντεφενσινών και των TLRs, εμφανίζονται σε κατώτερα τμήματα του αναπαραγωγικού συστήματος. Από αυτό συμπεραίνεται ότι τα τμήματα αυτά παρέχουν σημαντική προστασία στις αυξημένες λοιμώξεις που προέρχονται από την αμάρα (Wigley, 2013). Επίσης, έχει βρεθεί ότι οι πληθυσμοί των κυττάρων Β είναι σχετικά μικροι σε αυτά τα όργανα, υποδηλώνοντας ότι η ικανότητα της επιδιδυμίδας να συνθέτει αντισώματα μπορεί να είναι λιγότερο ανεπτυγμένη, πιθανώς για να αποφευχθεί η παραγωγή αντισωμάτων αντι-σπέρματος (Yoshimura et al., 2004). Πρόσφατες έρευνες έχουν αποδείξει τη σχέση του ανοσοποιητικού συστήματος στα αναπαραγωγικά όργανα των πτηνών, μέσω της έκφρασης των γονιδίων. Ενδεικτικά, έχει αποδειχθεί πως οι TLRs 1-2, 2-1, 2-2, 3, 4, 5, 7, 15 και 21, εκφράζονται στην ωοθήκη και τον κόλπο των πτηνών (Michailidis et al., 2010; Michailidis et al., 2011). Επίσης, οι TLRs 1-2, 2-1, 2-2, 3, 4, 5, και 7, εκφράζονται σε όλη την επιφάνεια του ωαγωγού, μολονότι τα επίπεδα έκφρασής τους ήταν υψηλότερα στη μήτρα και στον κόλπο (Ozoe et al., 2009). Έχει αποδειχθεί επίσης, πως η διέγερση με λιποπολυσακχαρίτη (LPS) οδηγεί σε αυξημένη έκφραση του TLR4 στη σάλπιγγα και στον κόλπο των πτηνών (Michailidis et al., 2011; Ozoe et al., 2009) και σε αυξημένη έκφραση τόσο του TLR4 όσο και του TLR15 στην ωοθήκη (Michailidis et al., 2010). Η διέγερση με LPS οδηγεί επιπρόσθετα στην έκφραση των προφλεγμονωδών κυτταροκινών IL-6 και IL-1β και της χημειοκίνης CXCLi2, στα ωοθυλάκια και στον ινώδη υμένα (Abdelsalam et al., 2011). Στο αναπαραγωγικό σύστημα του αρσενικού, αποδείχθηκε ότι η έκφραση των TLRs στους όρχεις, αυξάνει, ως απάντηση στη λοίμωξη από τη Salmonella enterica (Anastasiadou et al., 2011). Επίσης έπειτα από αντίστοιχη έρευνα βρέθηκε πως η λοίμωξη της επιδιδυμίδας σεξουαλικά ώριμων ορνίθων από σαλμονέλλα, οδηγεί σε σημαντική διέγερση των γονιδίων AvBD 1, 9, 10, 12 και 14, καθώς και των TLR 1-2, 2-1, 2-2, 4, 5 και 7, σε σύγκριση πάντα με υγιή πτηνά της ίδιας ηλικίας (Anastasiadou et al., 2014). 21

22 Συμπερασματικά, μπορεί κανείς να αναφέρει ότι το αναπαραγωγικό σύστημα αντιμετωπίζει διάφορες προκλήσεις συμπεριλαμβανομένων σεξουαλικώς μεταδιδόμενων λοιμώξεων, συστηματικών λοιμώξεων που επηρεάζουν τα αναπαραγωγικά όργανα και χρόνιων φλεγμονωδών καταστάσεων, οι οποίες μπορούν να ξεπεραστούν με τη βοήθεια του ανοσοποιητικού συστήματος (Kannaki et al., 2011). Η κατανόηση των μηχανισμών με τους οποίους συμπράττουν τα δυο συστήματα δεν έχουν ακόμη διευκρινιστεί πλήρως και κρίνονται αναγκαίες περεταίρω έρευνες. 22

23 4. To ανοσοποιητικό σύστημα Το ανοσοποιητικό σύστημα αποτελεί μια οργάνωση κυττάρων και μορίων με εξειδικευμένους ρόλους στην προάσπιση του ξενιστή ενάντια στη μόλυνση (Delves and Roitt, 2000). Ο συντονισμός των κυττάρων και των μορίων αυτών κατά την είσοδο των ξένων ουσιών στον οργανισμό καλείται ανοσολογική απόκριση (Abbas et al., 2007). Η φυσιολογική λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος είναι η άμυνα εναντίον μολυσματικών μικροβίων. Ωστόσο, ακόμα και μη μολυσματικές ξένες ουσίες μπορεί να προκαλέσουν ανοσολογικές αποκρίσεις. Ένας πιο περιεκτικός ορισμός της ανοσολογικής απόκρισης είναι: η αντίδραση στα συστατικά των μικροβίων όπως επίσης και στα μακρομόρια (πρωτεΐνες και πολυσακχαρίτες), και σε μικρές χημικές ουσίες που αναγνωρίζονται ως ξένες, ανεξάρτητα από τις φυσιολογικές ή παθολογικές συνέπειες που μπορεί να προκληθούν (Abbas et al., 2007). Υπάρχουν δύο διαφορετικές κατηγορίες αποκρίσεων για την αντιμετώπιση της εισβολής των μικροβίων, η έμφυτη (φυσική) και η επίκτητη (προσαρμοστική) ανοσία (Takeda and Akira, 2005). Ο όρος έμφυτη ανοσία αναφέρεται στο γεγονός ότι το είδος αυτό της άμυνας του ξενιστή υπάρχει στα υγιή άτομα, από τη στιγμή της γέννησής τους, έτοιμο να εμποδίσει την είσοδο των μικροβίων και να εξαλείψει γρήγορα όσα από αυτά καταφέρουν να εισέλθουν στους ιστούς του ξενιστή. Αντίθετα, η επίκτητη ανοσία είναι ο τύπος άμυνας του ξενιστή που διεγείρεται από τους μικροοργανισμούς οι οποίοι εισβάλλουν στους ιστούς, δηλαδή, προσαρμόζεται στην παρουσία των μικροβιακών εισβολέων (Abbas and Lichtman, 2004). Η άμυνα εναντίον των μικροβίων ρυθμίζεται από τις πρώτες αντιδράσεις της έμφυτης και τις μετέπειτα αποκρίσεις της επίκτητης ανοσίας (εικόνα 2). Έμφυτη και επίκτητη ανοσία είναι συστατικά ενός ολοκληρωμένου συστήματος άμυνας του ξενιστή στο οποίο πολλά κύτταρα και μόρια λειτουργούν συνεργατικά. Οι μηχανισμοί της φυσικής ανοσίας παρέχουν μια αποτελεσματική αρχική άμυνα ενάντια στις μολύνσεις. Ωστόσο, πολλά παθογόνα μικρόβια έχουν εξελιχθεί στο να αντιστέκονται στην έμφυτη ανοσία και η εξάλειψη τους απαιτεί τους πιο ισχυρούς μηχανισμούς της επίκτητης (Abbas et al., 2007). Οι ξένες ουσίες που προκαλούν τις ανοσολογικές αποκρίσεις ή είναι οι στόχοι αυτών, ονομάζονται αντιγόνα. 23

24 Εικόνα 2. Έμφυτη και επίκτητη ανοσία. Οι μηχανισμοί της φυσικής ανοσίας παρέχουν την αρχική άμυνα ενάντια στις μολύνσεις. Η επίκτητη ανοσολογική απόκριση αναπτύσσεται αργότερα και αποτελείται από την ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων. Η κινητική των δύο αυτών αποκρίσεων δίνεται κατά προσέγγιση και μπορεί να ποικίλει στις διάφορες μολύνσεις. (Abbas, A.K., Lichtman, A.H., Pillai, S Cellular and Molecular Immunology. Saunders, Elsevier, Philadelphia. Page: 5) 4.1 Έμφυτη Ανοσία Η έμφυτη ανοσία παρέχει την πρώτη γραμμή άμυνας του οργανισμού κατά των μικροβίων (Abbas et al., 2007), αναγνωρίζοντας την εισβολή των μικροοργανισμών και πυροδοτώντας την αντίδραση άμυνας του ξενιστή (Takeda and Akira, 2001). Επιπλέον, θεωρείται ότι ενεργεί ως φρουρός για το ανοσοποιητικό σύστημα και ενεργοποιείται αμέσως μετά την αναγνώριση των ποικίλων μικροβιακών παθογόνων (Kumar et al., 2009). Αποτελείται από μηχανισμούς κυτταρικής και βιοχημικής άμυνας οι οποίοι είναι σε ισχύ ακόμη και πριν από τη μόλυνση και είναι έτοιμοι να ανταποκριθούν άμεσα σε μολύνσεις. Η φυσική ανοσία πραγματοποιεί δύο σημαντικές λειτουργίες, την αρχική απόκριση ενάντια στα μικρόβια, η οποία εμποδίζει, ελέγχει ή εξαλείφει τη μόλυνση του ξενιστή, και τη διέγερση της επίκτητης ανοσολογικής απόκρισης και επιρροή της φύσης αυτής, ώστε να καταστεί περισσότερο αποτελεσματική έναντι διαφόρων τύπων μικροβίων (Abbas et al., 2007). 24

25 Το έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα αποτελείται από μηχανισμούς άμυνας που στερούνται ανοσολογικής μνήμης. Έτσι, ένα χαρακτηριστικό αυτού του είδους ανοσολογικής απόκρισης είναι ότι παραμένει αμετάβλητη, όσο συχνά και αν συναντήσει κάποιο αντιγόνο (Delves and Roitt, 2000). Οι μηχανισμοί της έμφυτης ανοσίας είναι εξειδικευμένοι για τις δομές που είναι κοινές στις διάφορες ομάδες των μικροβίων και μπορεί να μη διακρίνουν λεπτές διαφορές μεταξύ των ξένων ουσιών. Επίσης, ανταποκρίνονται ακριβώς με τον ίδιο τρόπο σε επαναλαμβανόμενες μολύνσεις (Abbas et al., 2007). Τα κύρια συστατικά της έμφυτης ανοσίας είναι: 1. Φυσιολογικοί και χημικοί φραγμοί, όπως τα επιθήλια και αντιμικροβιακές ουσίες που παράγονται στις επιφάνειες των επιθηλίων π.χ. λιπαρά οξέα, γαλακτικό οξύ, λυσοζύμη, ιντερφερόνες, ντεφενσίνες, καθελικιδίνες (Froy, 2005). 2. Φαγοκύτταρα (ουδετερόφιλα και μακροφάγα), κύτταρα που απελευθερώνουν μεσολαβητές της φλεγμονής (βασεόφιλα, μαστοκύτταρα, και ηωσινόφιλα) και φυσικά φονικά κύτταρα (Delves and Roitt, 2000). 3. Πρωτεΐνες αίματος, συμπεριλαμβανομένων μελών του συστήματος του συμπληρώματος και άλλων μεσολαβητών της φλεγμονής (Abbas et al., 2007) και 4. Πρωτεΐνες που καλούνται κυτταροκίνες, που ρυθμίζουν και συντονίζουν πολλές από τις δραστηριότητες των κυττάρων της φυσικής ανοσίας (π.χ. ιντερφερόνες) (Abbas et al., 2007). 25

26 4.2 Επίκτητη ανοσία Εκτός της έμφυτης ανοσίας, πολλοί ανώτεροι εξελικτικά οργανισμοί διαθέτουν έναν δεύτερο τύπο άμυνας που διεγείρεται από την έκθεση σε μολυσματικούς παράγοντες και αυξάνει σε μέγεθος και αμυντικές δυνατότητες με κάθε διαδοχική έκθεση σε ένα συγκεκριμένο αντιγόνο. Επειδή αυτή η μορφή ανοσίας αναπτύσσεται ως αντίδραση στη μόλυνση και προσαρμόζεται σε αυτήν, ονομάζεται προσαρμοστική ή επίκτητη ανοσία (Abbas et al., 2007). Τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα της επίκτητης ανοσίας είναι η εξαιρετική εξειδίκευση για διαφορετικά μόρια και η ικανότητα να "θυμάται" και να ανταποκρίνεται πιο δυναμικά σε περίπτωση επαναλαμβανόμενης έκθεσης στο ίδιο μικρόβιο (Abbas et al., 2007). Η επίκτητη ανοσία μπορεί να παράγει κύτταρα μεγάλου χρόνου ζωής, που εξακολουθούν να υπάρχουν σε μια φαινομενικά λανθάνουσα κατάσταση και να τα εκφράζει άμεσα έπειτα από μια άλλη συνάντηση με το ίδιο αντιγόνο (ανοσολογική μνήμη) (Chaplin, 2010). Επιπλέον, το επίκτητο ανοσοποιητικό σύστημα είναι σε θέση να αναγνωρίζει και να αντιδρά σε ένα μεγάλο αριθμό από μικροβιακές και μη ουσίες και έχει την εξαιρετική ικανότητα να διακρίνει μεταξύ των διαφορετικών, ακόμα και στενά συνδεόμενων, μικροβίων και μορίων (Abbas et al., 2007). Το επίκτητο ανοσοποιητικό σύστημα αποτελείται από δύο βασικούς κλάδους που αμύνονται κατά των εισβολέων. Αρχικά τη χυμική ανοσοαντίδραση, που μεσολαβείται από τα αντισώματα τα οποία καταστρέφουν τους εξωκυττάριους ή εξωγενείς εισβολείς και παράγονται από κύτταρα ονομαζόμενα ως Β-λεμφοκύτταρα. Ο άλλος μεγάλος κλάδος του ανοσοποιητικού συστήματος ονομάζεται κυτταροεξαρτημένη ή κυτταρική ανοσοαντίδραση και κατευθύνεται εναντίον των ενδοκυττάριων ή ενδογενών εισβολέων που προσβάλουν τα κύτταρα, μέσω εξειδικευμένων κυττάρων που ονομάζονται Τ-λεμφοκύτταρα (Κοπτόπουλος, 2008). Τα κύτταρα αυτά καταστρέφουν τα προσβεβλημένα ή μη φυσιολογικά κύτταρα του οργανισμού του ξενιστή, εκκρίνουν κυτοκίνες, και βοηθούν τα Β κύτταρα να δημιουργήσουν αντισώματα (Delves, 2006). 26

27 5. Μοριακοί μηχανισμοί άμυνας 5.1 Αναγνώριση παθογόνων μικροοργανισμών Αφότου οι μικροοργανισμοί ανέπτυξαν μηχανισμούς παθογένειας που τους έδωσαν τη δυνατότητα να μολύνουν ευκαρυωτικούς οργανισμούς, οι ξενιστές με τη σειρά τους εξέλιξαν διαφορετικούς μηχανισμούς οι οποίοι τους επιτρέπουν να αναγνωρίσουν την εισβολή του μικροβίου και να το καταπολεμήσουν. Ο πιο άμεσος τρόπος για τον ξενιστή να αναγνωρίσει έναν παθογόνο εισβολέα είναι να ανιχνεύσει συγκεκριμένα μόρια που διακρίνουν το μικροοργανισμό από τις δομές του ίδιου του ξενιστή. Αυτά τα μόρια ονομάζονται «ειδικά μοριακά πρότυπα των παθογόνων» (Pathogen Associated Molecular Patterns - PAMPs) ή όπως αναφέρουν σε πρόσφατη εργασία τους οι Di Gioia και Zanoni (Di Gioia and Zanoni, 2014), πιο γενικά, «ειδικά μοριακά πρότυπα των μικροβίων» (Microbial Associated Molecular Patterns - MAMPs) και αντιπροσωπεύουν δομές που είναι απαραίτητες για τη μικροβιακή επιβίωση, συνεπώς θεωρείται απίθανο να παρακαμφθούν από ταχείες εξελικτικές τροποποιήσεις, π.χ. συστατικά του βακτηριακού κυτταρικού τοιχώματος (λιποπολυσακχαρίτες, λιποπεπτίδια), πρωτεΐνες του βακτηριακού μαστιγίου ή ιϊκό δίκλωνο RNA (Oblak and Jerala, 2014). Οι δομές του ξενιστή που δεσμεύουν τα PAMPs ονομάζονται κυτταρικοί υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων (Pattern Recognition Receptors - PRRs). Διαφορετικές κατηγορίες μικροβίων (π.χ. ιοί, Gram- / Gram+ βακτήρια, μύκητες) εκφράζουν διαφορετικά PAMPs. Οι δομές αυτές περιλαμβάνουν ουσίες που βρίσκονται στους οργανισμούς των μικροβίων αλλά όχι των θηλαστικών, όπως: Νουκλεϊκά οξέα μοναδικά για μικροοργανισμούς (π.χ. δίκλωνο RNA ιών, μη μεθυλιωμένες CpG ακολουθίες βακτηρίων), Χαρακτηριστικά πρωτεϊνών μικροβίων, Σύνθετα λιπίδια και υδατάνθρακες που συντίθενται από μικρόβια, αλλά όχι από κύτταρα θηλαστικών (π.χ. οι λιποπολυσακχαρίτες των Gram- βακτηρίων, τειχοϊκά οξέα και πεπτιδογλυκάνη των Gram+ βακτηρίων). 27

28 Το έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα αναγνωρίζει μικροβιακά προϊόντα που είναι συχνά απαραίτητα για την επιβίωση των εν λόγω μικροβίων. Η λειτουργία αυτή είναι σημαντική επειδή εξασφαλίζει ότι οι στόχοι της έμφυτης ανοσίας δεν μπορούν να απορριφθούν από τα μικρόβια σε μια προσπάθεια να αποφύγουν την αναγνώριση από τον ξενιστή (Akira et al., 2006). Οι PRRs μπορούν επίσης να αναγνωρίσουν ενδογενή μόρια που απελευθερώνονται από κατεστραμμένο ή στρεσαρισμένο ιστό, συμπεριφερόμενοι έτσι ως ανιχνευτές αλαρμινών 1. Ως εκ τούτου οι PRRs ανιχνευούν PAMPs και αλαρμίνες, τα οποία μαζί αποτελούν τα σχετιζόμενα με τη βλάβη μοριακά πρότυπα (Damage-Associated Molecular Patterns - DAMPs) (Bianchi, 2007). Οι υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος κωδικοποιούνται από το γαμετικό DNA (Takeuchi and Akira, 2010) και δεσμεύουν μοριακά πρότυπα που σχετίζονται με μικροοργανισμούς ή ενδογενείς μεσολαβητές που απελευθερώνονται από ιστούς σε κατάσταση στρες. Μετά τη δέσμευση με το συνδέτη, οι PRRs επάγουν την ενεργοποίηση μιας φλεγμονώδους διαδικασίας που οδηγεί τελικά στην εξάλειψη του παθογόνου και την αποκατάσταση της ομοιόστασης του οργανισμού (Di Gioia and Zanoni, 2014). Οι PRRs μπορεί να είναι εκκρινόμενα μόρια που κυκλοφορούν στο αίμα και τη λέμφο, όπως συστατικά του συμπληρώματος, επιφανειακοί υποδοχείς που προσδένονται στο παθογόνο για εγκόλπωση και υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας που δεσμεύουν το παθογόνο και ενεργοποιούν ένα σήμα που οδηγεί στην απελευθέρωση μορίων, όπως οι ιντερλευκίνες, οι κυτοκίνες και αντιβακτηριδιακά πολυπεπτίδια. Μια ευρεία ποικιλία κυτταρικών τύπων εκφράζουν τέτοιους υποδοχείς και ως εκ τούτου συμμετέχουν στις αποκρίσεις του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος. Αυτοί περιλαμβάνουν τα ουδετερόφιλα, τα μακροφάγα, τα δενδριτικά κύτταρα, και τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Επιπροσθέτως, επιθηλιακά κύτταρα, λεμφοκύτταρα και άλλοι κυτταρικοί τύποι εκφράζουν επίσης υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων. Οι παραπάνω υποδοχείς είναι παρόντες στην κυτταρική επιφάνεια, σε ενδοσωμικά κυστίδια, και στο κυτόπλασμα, έτοιμοι να αναγνωρίσουν μικρόβια σε οποιαδήποτε από αυτές τις θέσεις (Abbas et al., 2007). 1 ενδογενή σήματα κινδύνου 28

29 Μέχρι σήμερα, έχουν προσδιοριστεί δύο διαφορετικές κατηγορίες οικογενειών PRRs. Η πρώτη κατηγορία περιλαμβάνει διαμεμβρανικές πρωτεΐνες, όπως οι Tolllike υποδοχείς (TLRs) και οι C-τύπου υποδοχείς λεκτίνης (CLRs) (Takeuchi and Akira, 2010), ενώ η δεύτερη περιλαμβάνει κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες όπως οι υποδοχείς RLRs και NLRs, μέλη της οικογένειας PYHIN και έναν αυξανόμενο αριθμό από μόρια ανίχνευσης DNA (Cerboni et al., 2013). Οι TLRs αναγνωρίζουν ένα ευρύ φάσμα από PAMPs και DAMPs, οι RLRs αντιλαμβάνονται το ριβονουκλεϊκό οξύ των ιών, οι NLRs ανιχνεύουν βακτήρια και DAMPs και τέλος, οι C-τύπου υποδοχείς λεκτίνης ανιχνεύουν μύκητες (Medzhitov, 2010). Οι υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων σχετίζονται με τις ενδοκυτταρικές οδούς μεταφοράς σήματος, οι οποίες ενεργοποιούν πληθώρα κυτταρικών αποκρίσεων που περιλαμβάνουν την παραγωγή μορίων τα οποία με τη σειρά τους προάγουν τη φλεγμονή και την άμυνα εναντίον των μικροβίων. Παρακάτω αναλύεται η πιο καλά μελετημένη κατηγορία των υποδοχέων αυτών, οι Toll-like receptors. 29

30 5.2 Toll-like υποδοχείς (Toll-like Receptors - TLRs) Οι TLRs είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που ανιχνεύουν την παρουσία συντηρημένων μικροβιακών δομών στο περιβάλλον τους και καθοδηγούν τα ευκαρυωτικά κύτταρα σε μια κατάλληλη απόκριση, η οποία είναι κυρίως η παραγωγή αντιμικροβιακών πεπτιδίων, κυτταροκινών και χημειοκινών (Kawai and Akira, 2007). Οι βασικοί κυτταρικοί τύποι στους οποίους εκφράζονται οι TLRs περιλαμβάνουν τα μακροφάγα, τα δενδριτικά κύτταρα, τα ουδετερόφιλα, τα επιθηλιακά κύτταρα του βλεννογόνου, και τα ενδοθηλιακά κύτταρα (Abbas et al., 2007). Οι υποδοχείς Toll like είναι εξελικτικά υψηλά συντηρημένοι 2 και μπορεί να είναι παρόντες σε όλους τους ζωντανούς πολυκύτταρους οργανισμούς (Roach et al., 2005). Το toll αρχικά αναγνωρίστηκε ως ένα γονίδιο της Drosophila που σχετιζόταν με τη δημιουργία του ραχιαίο-κοιλιακού άξονα κατά τη διάρκεια εμβρυογένεσης της μύγας (Valanne et al., 2011). Στα τέλη του 20 ου αιώνα αποδείχθηκε ένας απαραίτητος υποδοχέας για την άμυνα του οργανισμού της Drosophila (ο οποίος διαθέτει μόνο έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα), έναντι μυκητιάσεων (Lemaitre et al., 1996). Αυτή η κομβική παρατήρηση έστρεψε τους ερευνητές στην αναζήτηση ομόλογων ανθρώπινων πρωτεϊνών. Ένα χρόνο αργότερα, μια ομόλογη πρωτεΐνη του Toll υποδοχέα (που τώρα ονομάζεται TLR4) της Drosophila melanogaster, αποδείχθηκε πως επάγει την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται σε φλεγμονώδεις αντιδράσεις των θηλαστικών (Medzhitov et al., 1997). Ένα σύνολο δέκα διαφορετικών TLRs έχουν ταυτοποιηθεί στον άνθρωπο όμως ενδέχεται να υπάρχουν αρκετοί ακόμη στα υπόλοιπα είδη. Συγκριτικές βιολογικές μελέτες επιβεβαιώνουν σε μεγάλο βαθμό τη συντηρημένη φύση της οικογένειας των TLRs, αλλά έχουν αποκαλύψει και σημαντικές λειτουργικές διαφορές των υποδοχέων αυτών, μεταξύ των ειδών (Werling et al., 2009). Όσον αφορά τη δομή τους, οι Toll-like υποδοχείς αποτελούνται από τρία τμήματα (εικόνα 3). Έξω από το κύτταρο προέχει το πλούσιο σε λευκίνες τμήμα τους (Leucine-Rich Repeat, LRR), με 19 έως 27 επαναλήψεις λευκινών (Keestra et al., 2013). Στο εσωτερικό του κυττάρου βρίσκεται η C-τερματική κυτταροπλασματική ουρά του υποδοχέα, η οποία περιέχει μια σφαιρική περιοχή σηματοδότησης, που 2 Απαντώνται σε περισσότερο και λιγότερο εξελιγμένους οργανισμούς με πολύ μικρές αλλοιώσεις. 30

31 ονομάζεται TIR γιατί είναι ομόλογη με εκείνη του υποδοχέα της ιντερλευκίνης-1 (Toll/IL- 1 Receptor). Εικόνα 3. Δομή TLR Η περιοχή TIR είναι γενικά πιο συντηρημένη από την εξωτερική περιοχή, μεταξύ των διαφόρων μελών της οικογένειας των TLRs. Η εξωτερική περιοχή και η TIR περιοχή διαχωρίζονται χωροταξικά από μια διαμεμβρανική έλικα που τοποθετεί την πρωτεΐνη εντός της κυτταρικής μεμβράνης (Lee et al., 2012). Η αναγνώριση των PAMPs επιτυγχάνεται μέσω της σύνδεσής τους με το εξωκυτταρικό πλούσιο σε λευκίνες τμήμα, το οποίο είναι ειδικό για κάθε τύπο υποδοχέα (O'Neill, 2004). Ως απάντηση στην πρόσδεση του συνδέτη, ενεργοποιείται η σηματοδότηση από την κυτταροπλασματική περιοχή TIR, με αποτέλεσμα την έναρξη της φλεγμονώδους απόκρισης και την απελευθέρωση των κυτταροκινών (Temperley et al., 2008). Εν απουσία συνδέτη, τα μέλη της οικογένειας TLR βρίσκονται συνήθως είτε στην επιφάνεια των ευκαρυωτικών κυττάρων (π.χ. TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 θηλαστικών) ή στο ενδο-λυσοσωματικό διαμέρισμα (TLR3, TLR7-9 θηλαστικών) (Konat, 2008). Οι συνδέτες των TLRs των θηλαστικών είναι είτε προϊόντα μικροβιακής προέλευσης τα οποία έχουν μια ασυνήθιστη μοριακή ακολουθία, είτε ενδέχεται να προέρχονται από τον ίδιο τον ξενιστή. Σε γενικές γραμμές, οι συνδέτες είναι δομικά συντηρημένοι, σημαντικοί για την επιβίωση του μικροβίου και απουσιάζουν από τον ξενιστή. Τα χαρακτηριστικά αυτά επιτρέπουν την ασφαλή ανίχνευση από τον ξενιστή ενός ευρέος φάσματος βακτηρίων, ιών και μυκήτων με έναν μικρό αριθμό υποδοχέων TLRs (Keestra et al., 2013). Με μια πιο προσεκτική ματιά, αποκαλύπτεται πως οι προερχόμενοι από τον ξενιστή συνδέτες είναι συνήθως προστατευμένοι από το ανοσοποιητικό σύστημα και η εμφάνισή τους, για παράδειγμα μετά από τραυματισμό ιστού, υποδεικνύει πως απαιτείται η επέμβαση του ανοσοποιητικού συστήματος 31

32 (Rich, 2005). Ενδογενείς συνδέτες είναι μόρια όπως οι heat shock πρωτεΐνες, η φιμπρονεκτίνη, το ινωδογόνο, η β-ντεφενσίνη και τα ανοσοσύμπλοκα χρωματίνης. Από την άλλη, εξωγενείς συνδέτες αποτελούν τα συστατικά του βακτηριακού τοιχώματος, το DNA και RNA ιών, φαρμακευτικές ουσίες όπως οι ιμιδαζοκινολίνες κ.ά Αναγνώριση συνδετών από τους TLRs Κάθε ένας από τους TLRs έχει μια ξεχωριστή ειδικότητα σύνδεσης. Οι TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 και TLR10 εκφράζονται σε μεγάλο βαθμό στην κυτταρική επιφάνεια και αναγνωρίζουν μόρια τα οποία προέρχονται από διαφόρων τύπων μικρόβια (Kawai and Akira, 2009; Kumar et al., 2009). Οι ενδοκυτταρικοί TLRs, περιλαμβάνουν τους TLR3, TLR7, TLR8 και TLR9, και είναι εκ φύσεως ικανοί να ανιχνεύουν νουκλεϊκά οξέα. Για να γίνει διάκριση μεταξύ των νουκλεϊκών οξέων του ξενιστή έναντι αυτού των μικροβίων, αυτοί οι TLRs ενεργούν εντός του ενδοσωματικού διαμερίσματος, όπου το DNA του ξενιστή συνήθως απουσιάζει (Blasius and Beutler, 2010). Οι TLRs κατατάσσονται σε διάφορες ομάδες με βάση τους τύπους των PAMPs που αναγνωρίζουν. Πιο αναλυτικά, οι TLR1, TLR2, TLR4 και TLR6 αναγνωρίζουν λιπίδια (Kawai and Akira, 2007), ενώ ο TLR2 αναγνωρίζει επιπλέον διάφορα μόρια όπως οι πεπτιδογλυκάνες, το λιποτειχοϊκό οξύ (LTA) και η λιποαραβινομαννάνη, που προέρχονται από μυκοβακτήρια και τη γλυκάνη zymosan, από την επιφάνεια ζυμών και μυκήτων (Takeda and Akira, 2005). Η ποικιλία των συνδετών του TLR2 είναι η μεγαλύτερη ανάμεσα σε όλους τους υποδοχείς Toll-like και αυτό οφείλεται στον ετεροδιμερισμό που απαιτείται για τις αποκρίσεις που μεσολαβούνται από αυτό τον υποδοχέα. Ο TLR3 αναγνωρίζει το δίκλωνο RNA (Alexopoulou et al., 2001), ένα μοριακό πρότυπο που σχετίζεται με την ιϊκή μόλυνση. Ο TLR4 ταυτοποιεί τα Gram αρνητικά βακτήρια, αναγνωρίζοντας τον LPS ή το λιπίδιο Α, τα οποία είναι προϊόντα του κυτταρικού τους τοιχώματος. O TLR5 αναγνωρίζει τη βακτηριακή φλαγγελίνη, των θετικών και αρνητικών κατά Gram βακτηρίων (Gewritz et al., 2001). Οι TLR7 και TLR8 εμπλέκονται στην αναγνώριση μονόκλωνου RNA (Heil et al., 2003). Τέλος, ο TLR9 είναι ένας υποδοχέας για μη μεθυλιωμένο CpG DNA, τα μοτίβα του οποίου βρίσκονται γενικά στο βακτηριακό γονιδίωμα (Hemmi et al., 2000). Η 32

33 συχνότητα των μοτίβων αυτών στα σπονδυλωτά είναι μικρότερη από αυτή των μικροβίων και σε γενικές γραμμές μεθυλιώνονται. Μέχρι στιγμής, ο TLR10 είναι ο μόνος TLR για τον οποίο δεν έχουν βρεθεί συνδέτες (Di Gioia and Zanoni, 2014), παρ όλο που η L. monocytogenes σε πρόσφατη έρευνα των Regan et al. (Regan et al., 2013), ταυτοποιήθηκε ως πηγή συνδετών για τον υποδοχέα αυτό. Πολλά από τα μέλη της οικογένειας των TLRs σχηματίζουν ετεροδιμερή και ομοδιμερή με σκοπό την ενεργοποίηση της σηματοδότησης, με πιο κοινό το σχηματισμό ομοδιμερών συμπλόκων. Ανάμεσα στις εξαιρέσεις ανήκει ο TLR2 ο οποίος ενώνεται είτε με τον TLR1 είτε με τον TLR6, κάτι το οποίο επιτρέπει διαφορετική αναγνώριση των λιποπεπτιδίων. Το σύμπλοκο TLR1 - TLR2 αναγνωρίζει τριακυλο-λιποπεπτίδια ενώ το σύμπλοκο TLR2 - TLR6 ανταποκρίνεται στα διακυλο-λιποπεπτίδια (Keestra et al., 2013). Ο ετεροδιμερισμός των TLRs επεκτείνει το φάσμα των συνδετών που αναγνωρίζονται (Yu et al., 2010). Επίσης η ενεργοποίηση συγκεκριμένων TLRs οδηγεί σε διαφορετικό προφίλ έκφρασης γονιδίων. Για παράδειγμα η ενεργοποίηση των TLR3 και TLR4 προκαλεί την επαγωγή των ιντερφερονών τύπου Ι (IFNs), αλλά η ενεργοποίηση των TLR2 και TLR5 όχι. Τέλος μπορεί η ενεργοποίηση διαφορετικών TLRs να οδηγεί σε έκφραση των ίδιων γονιδίων αλλά από διαφορετικά σηματοδοτικά μονοπάτια, όπως συμβαίνει με τους TLRs των ενδοσωμάτων 7,8 και 9 που ενεργοποιούν την έκφραση τύπου Ι IFNs αλλά με διαφορετικό μηχανισμό από τους TLRs 3 και 4 (Takeda and Akira, 2005). 33

34 5.2.2 Οι TLRs των πτηνών Η αναγνώριση προτύπων των παθογόνων μέσω υποδοχέων όπως οι Toll-like υποδοχείς (TLRs) είναι σημαντική για την έμφυτη ανοσολογική ενεργοποίηση στις όρνιθες, ομοίως με τα θηλαστικά. Όπως οι άνθρωποι, τα κοτόπουλα έχουν 10 γνωστούς TLRs, αν και μόνο 5 είναι ορθόλογοι 3 με αυτούς των θηλαστικών, ένας κοινός με τους ιχθείς, ενώ τρεις φαίνεται να είναι μοναδικοί για τα πτηνά (Temperley et al., 2008). Στον άνθρωπο κωδικοποιούνται οι υποδοχείς Toll-like Οι όρνιθες έχουν ορθόλογα για τους TLR3, TLR4, TLR5 και TLR7 των θηλαστικών αλλά δεν έχουν τους TLR8 και TLR9. Οι TLRs 1,6 & 10 των θηλαστικών αντιστοιχούν στους TLR1-1 και TLR1-2 των πτηνών, ενώ ο TLR2 αντιστοιχεί στους TLR2-1 και TLR2-2, ως αποτέλεσμα επικάλυψης γονιδίων. Οι όρνιθες έχουν δύο επιπρόσθετα γονίδια Toll like υποδοχέων, τους TLR15 και TLR21 (St Paul et al., 2013). Ο TLR15 φαίνεται να είναι μοναδικός για τα πτηνά και ενεργοποιείται μετά από διάσπαση από μυκητιακές και βακτηριακές πρωτεάσες με λοιμογόνο δράση (de Zoete et al., 2011). Αντίθετα, ο TLR21 είναι ένας υποδοχέας CpG DNA, που διαφέρει από τον TLR9 των θηλαστικών, με υποθετικά ορθόλογα να βρίσκονται σε ιχθείς και αμφίβια (Brownlie and Allan, 2011; Brownlie et al., 2009; Keestra et al., 2010). Η χρωμοσωμική χαρτογράφηση των γονιδίων TLR των ορνίθων, δείχνει ότι βρίσκονται σε συντενικές θέσεις 4, συγκριτικά με άλλα ζώα. Το ήμισυ των TLR γονιδίων στα κοτόπουλα βρίσκονται στο χρωμόσωμα 4 (Temperley et al., 2008). 3 Ορθόλογα γονίδια: Ομόλογα μόρια που προήλθαν από μερική διαφοροποίηση περιοχών της αλληλουχίας του προγονικού γονιδίου, γεγονός, το οποίο συνιστά εξελικτική διαφοροποίηση των οργανισμών που τα φέρουν. 4 Η κατάσταση κατά την οποία δύο ή περισσότερα γονίδια βρίσκονται στο ίδιο χρωμόσωμα υπάρχει, δεν υπάρχει, αποδεδειγμένη σχέση μεταξύ τους. 34

35 5.3 Κυτταροκίνες (Cytokines) Σχεδόν όλες οι ανοσολογικές αποκρίσεις περιλαμβάνουν κύτταρα τα οποία επικοινωνούν μεταξύ τους στέλνοντας σήματα για διαίρεση, διαφοροποίηση, έκκριση αντισωμάτων και άλλες λειτουργίες. Η σηματοδότηση αυτή μπορεί να συμβεί είτε με την επαφή των κυττάρων, επιτρέποντας αλληλεπιδράσεις μεταξύ των υποδοχέων τους, είτε με την έκκριση μορίων τα οποία οδηγούνται από το ένα κύτταρο στο άλλο. Τα μόρια τα οποία εκτελούν αυτή τη λειτουργία σηματοδότησης ονομάζονται κυτταροκίνες (Playfair and Chain, 2013). Ο όρος κυτταροκίνη (cytokine) αναφέρεται σε μία πρωτεΐνη η οποία παράγεται από ένα κύτταρο (cyto) και δρα (kine) σε κύτταρα στόχους (St Paul et al., 2013). Οι κυτταροκίνες είναι πρωτεΐνες χαμηλού μοριακού βάρους, οι οποίες μπορούν να παραχθούν από όλα τα εμπύρηνα κύτταρα και γενικά έχουν ανοσορυθμιστική και αιματοποιητική 5 δράση (Ward and Rosenthal, 2014). Οι πρωτεΐνες αυτές, μεταδίδουν σήματα διαμέσου ειδικών υποδοχέων κυτταρικής επιφάνειας, είτε στο ίδιο κύτταρο που τις παρήγαγε (αυτοκρινής δράση), είτε σε άλλα κύτταρα (παρακρινής δράση) (Leonard, 2013). Τουλάχιστον 30 από αυτές είναι γνωστές και ο κατάλογος μπορεί να επεκταθεί αν συμπεριληφθεί κάθε μόριο που προέρχεται από ένα κύτταρο και δρα σε ένα άλλο. Ο όρος περιορίζεται συνήθως σε μόρια που παράγονται από κύτταρα με αναγνωρισμένη ανοσολογική λειτουργία, όπως τα λεμφοκύτταρα, τα μακροφάγα, τα δενδριτικά κύτταρα και τα φυσικά φονικά (ΝΚ) κύτταρα, ακόμη και αν κάποια από αυτά τα μόρια μπορούν επίσης να συντεθούν και να δράσουν σε μη ανοσολογικά κύτταρα (Chain and Playfair, 2013). Oι κυτταροκίνες ταξινομούνται σε οικογένειες με διάφορους τρόπους, ανάλογα με τις λειτουργίες τους, τον τύπο του κυττάρου από το οποίο παρήχθησαν (Κοπτόπουλος, 2008), το λειτουργικό τους ρόλο στη φλεγμονή ή τις δομικές τους ομοιότητες (St Paul et al., 2013). Η ορολογία μερικές φορές δεν είναι πολύ σαφής αφού, για παράδειγμα, ένας από τους πιο σημαντικούς ενεργοποιητές μακροφάγων ονομάζεται γ-ιντερφερόνη (ΙFΝγ), επειδή αυτή, και οι υπόλοιπες ιντερφερόνες, ανακαλύφθηκαν μέσω της επίδρασής τους στην παρεμπόδιση ανάπτυξης των ιών (Chain and Playfair, 2013). 5 Αιματοποίηση ή αιμοποίηση, ονομάζεται ο σχηματισμός κυτταρικών συστατικών του αίματος. 35

36 Μια απλή κατηγοριοποίηση των κυτταροκινών, γίνεται με βάση τον κυτταρικό τύπο από τον οποίον προήλθαν. Σύμφωνα με τον Κοπτόπουλο, οι κυτταροκίνες διακρίνονται σε: λεμφοκίνες (lymphokines), που παράγονται από τα Β και Τ λεμφοκύτταρα, μονοκίνες (monokines) που παράγονται από τα μονοκύτταρα και τα μακροφάγα, ιντερφερόνες (interferons) που παράγονται από τα Τ κύτταρα και άλλα λευκοκύτταρα, ινοβλάστες και επιθηλιακά κύτταρα, και τέλος στις ιντερλευκίνες (interleukins), που παράγονται από εμπύρηνα κύτταρα, κυρίως όμως ανοσοκύτταρα (Κοπτόπουλος, 2008). Παρακάτω αναλύονται κάποιες μεγάλες κατηγορίες κυτταροκινών: Μονοκίνες Οι μονοκίνες (monokines) παράγονται από μονοκύτταρα και μακροφάγα κύτταρα. Επηρεάζουν τη δραστηριότητα ορισμένων άλλων κυττάρων και ρυθμίζουν την ανοσολογική αντίδραση (Κοπτόπουλος, 2008). Ιντερφερόνες Οι ιντερφερόνες (IFNs) είναι γλυκοπρωτεΐνες με ισχυρή δράση εναντίον των ιών και αποτελούν μία από τις πρώτες γραμμές άμυνας του ξενιστή κατά την εισβολή παθογόνων (Lin and Young, 2014). Παράγονται ταχέως από πολλά κύτταρα, ως απάντηση στη μόλυνση από ιούς και εμποδίζουν την αντιγραφή τους, τόσο στα μολυσμένα κύτταρα όσο και στα γειτονικά τους (Chain and Playfair, 2013). Το όνομά τους προέρχεται από το γεγονός ότι παρεμβαίνουν (interfere) με το γενετικό υλικό των ιών, καθώς και με τη σύνθεση πρωτεϊνών (Κοπτόπουλος, 2008). Αυτές οι πρωτεΐνες ταξινομούνται σε τρεις τύπους (Ι, II και III), με βάση τη δομή των υποδοχέων τους στην κυτταρική επιφάνεια (Lin and Young, 2014). Τους πιο σημαντικούς εκπροσώπους των ιντερφερονών τύπου Ι αποτελούν η ιντερφερόνη-α (INF-α) και η ιντερφερόνη-β (INF-β). Μοναδικός εκπρόσωπος των ιντερφερονών τύπου ΙΙ αποτελεί η ιντερφερόνη-γ (INF-γ) (Κοπτόπουλος, 2008), ενώ οι ιντερφερόνες τύπου ΙΙΙ ανακαλύφθηκαν πιο πρόσφατα και σε αυτές κατατάσσονται οι ιντερφερόνες-λ (IFN-λ) (Hermant and Michiels, 2014; Vilcek, 2006). 36

37 Ιντερλευκίνες Οι ιντερλευκίνες (ILs) αποτελούν μία ομάδα κυτταροκινών με σύνθετες ανοσορυθμιστικές λειτουργίες, που περιλαμβάνουν τον πολλαπλασιασμό, την ωρίμανση, τη μετανάστευση και την πρόσφυση των κυττάρων (Brocker et al., 2010). Επίσης, διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση των ανοσοκυττάρων και την κυτταρική ενεργοποίηση, λειτουργίες οι οποίες τις διακρίνουν από τις χημειοκίνες, που κατευθύνουν κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος προς την περιοχή της φλεγμονής μέσω χημειοταξίας, και τις ιντερφερόνες (IFNs) που μεσολαβούν κυρίως κατά την κυτταρική απόκριση σε ιική μόλυνση (Commins et al., 2010). Οι ιντερλευκίνες αριθμούνται διαδοχικά ανάλογα με τη σειρά ανακάλυψής τους και αποτελούν ένα ετερογενές μείγμα πρωτεϊνών με λίγα κοινά χαρακτηριστικά μεταξύ τους, εκτός από το όνομά τους (Κοπτόπουλος, 2008). Χημειοκίνες Οι χημειοκίνες (chemokines) αποτελούν μία οικογένεια κυτταροκινών, υπεύθυνων για τη ρύθμιση της κυτταρικής κυκλοφορίας (Chain and Playfair, 2013). Διεγείρουν την κυκλοφορία και τη μετανάστευση των λευκοκυττάρων, από το αίμα προς τους ιστούς και δρουν ως χημειοτακτικοί παράγοντες, λειτουργία από την οποία έχουν πάρει και το όνομά τους (Abbas et al., 2007). Παράγοντες νέκρωσης των όγκων Οι παράγοντες νέκρωσης των όγκων (TNF), πήραν το όνομά τους από την ικανότητά τους να καταστρέφουν, σε υψηλές δόσεις, ορισμένους όγκους, αλλά κατά κύριο λόγο αποτελούν έναν βασικό διαμεσολαβητή της φλεγμονώδους απόκρισης. Οι TNFs αποτελούν μια ομάδα κυτταροκινών που απαρτίζεται από περίπου 12 μέλη και παράγονται κυρίως από μακροφάγα κύτταρα, ενώ οι περισσότεροι κυτταρικοί τύποι φέρουν υποδοχείς για αυτούς. Η σύνδεση ενός TNF με τον υποδοχέα του μπορεί να προκαλέσει είτε απόπτωση, είτε κυτταρική ενεργοποίηση/επιβίωση (Abbas et al., 2007). 37

38 Παρ όλο που οι κυτταροκίνες είναι δομικά διαφορετικές, μοιράζονται κάποιες κοινές ιδιότητες (Abbas et al., 2007): 1. Έχουν πλειοτροπική δράση (η ικανότητα μιας κυτταροκίνης να ασκεί πολλά διαφορετικά αποτελέσματα, συχνά σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους). 2. Χαρακτηρίζονται από πλεονασμό (πολλές διαφορετικές κυτταροκίνες μπορούν να προκαλέσουν παρόμοιες δράσεις). 3. Η έκκρισή τους είναι μια σύντομη και αυτοπεριοριζόμενη εκδήλωση. 4. Συχνά επηρεάζουν τη σύνθεση και τις δράσεις άλλων κυτταροκινών. 5. Δρουν συνήθως τοπικά αλλά πολλές φορές και συστημικά. 6. Οι δράσεις τους ξεκινούν κατόπιν σύνδεσής τους με ειδικούς διαμεμβρανικούς υποδοχείς στα κύτταρα-στόχους. 7. Εξωτερικά σήματα ρυθμίζουν την έκφραση των υποδοχέων των κυτταροκινών και έτσι την ανταπόκριση των κυττάρων σε αυτές. 8. Οι αποκρίσεις των κυττάρων στις περισσότερες κυτταροκίνες αποτελούνται από μεταβολές στην έκφραση γονιδίων τους, με αποτέλεσμα την εκδήλωση νέων λειτουργιών και μερικές φορές τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων-στόχων. 9. Οι αποκρίσεις των κυττάρων στη σηματοδότηση των κυτταροκινών είναι αυστηρά ρυθμιζόμενες, και υπάρχουν ανασταλτικοί μηχανισμοί για να τις σταματήσουν. 38

39 6. Κύτταρα Sertoli 6.1 Βιολογία των κυττάρων Τα κύτταρα Sertoli αποτελούν μια εξειδικευμένη ομάδα κυττάρων στους όρχεις και κατέχουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την ωρίμανση των γεννητικών κυττάρων, μια διαδικασία η οποία ονομάζεται σπερματογένεση. Η δράση τους έγκειται στην παροχή θρεπτικών ουσιών και ρυθμιστικών παραγόντων στα αναπτυσσόμενα σπερματικά κύτταρα καθώς και στη μεταφορά των άχρηστων προϊόντων της σπερματογένεσης. Επίσης, κατά την ωρίμανση των σπερματικών κυττάρων, φαγοκυτταρώνουν κάθε υπόλοιπο κυτταροπλάσματος αλλά και το υλικό από την εκφύλιση αυτών και παράγουν το υγρό που χρησιμοποιείται για τη μεταφορά του ώριμου σπέρματος. Τέλος, σχετίζονται με την έκκριση ορμονών για την προώθηση της σωστής ανάπτυξης των κυττάρων του σπέρματος (Skinner and Griswold, 2005). Τα εν λόγω κύτταρα ανακαλύφθηκαν το 1865 από τον ομώνυμο Ιταλό φυσιολόγο και ιστολόγο Enrico Sertoli. Ο Sertoli, με τη βοήθεια του μικροσκοπίου του παρατήρησε τα ξεχωριστά αυτά κύτταρα των όρχεων και διαπίστωσε ότι είναι διακλαδισμένα κύτταρα με ακανόνιστο κυλινδρικό ή κωνικό σχήμα, που από τη διάταξή τους φαίνεται να προστατεύουν τα αναπτυσσόμενα γεννητικά κύτταρα (εικόνα 4). Εικόνα 4. Σπερματικό σωληνάριο αρουραίου. Τα σπερματοζωάρια (κόκκινο) είναι ενσωματωμένα σε κύτταρα Sertoli (πράσινο). Τα σπερματογόνια και τα σπερματοκύτταρα είναι χρωματισμένα μπλε και μωβ, αντίστοιχα. Πηγή: 39

40 Μάλιστα, στη δημοσίευσή του χρησιμοποίησε τον όρο «mother cells», γεγονός που υποδηλώνει ότι οι προβλέψεις του ήταν αρκετά διορατικές για την πραγματική λειτουργία των κυττάρων αυτών. Πέραν του ρόλου των κυττάρων, ο Sertoli ήταν ο πρώτος που αναγνώρισε και ανέφερε την ύπαρξη σταγονιδίων λιπιδίων στο εσωτερικό τους και επισήμανε πολλές φορές ότι τα λιπίδια αυτά θα μπορούσαν να ασκούν πολύ σημαντικές λειτουργίες στο κύτταρο (Hess and França, 2005). Η μορφή των κυττάρων Sertoli είναι κιονοειδής και θεωρείται ότι εκτείνεται πάντοτε από τη βασική μεμβράνη μέχρι τον αυλό του σπερματικού σωληναρίου (Wang et al., 2012) (εικόνα 5). Το περίβλημά τους είναι ανώμαλο λόγω της παρεμβολής των σπερματογόνων κυττάρων, τα οποία αλλάζουν συνεχώς θέση και σχήμα κατά την πορεία της εξέλιξής τους. Η κυτταρική τους μεμβράνη σχηματίζει σχισμές στις οποίες βρίσκονται σφηνωμένες οι κεφαλές των σπερματοζωαρίων (Ρογδάκης, 2006). Εικόνα 5. Απεικόνιση ενός σπερματικού σωληναρίου και των κυττάρων του διάμεσου ιστού που βρίσκονται έξω από αυτό. Πηγή: Histology Guide Faculty of Biological Sciences, University of Leeds. Ιδιαιτερότητα των κυττάρων αυτών αποτελεί ο πυρήνας τους, ο οποίος μπορεί να λάβει πολλά διαφορετικά σχήματα που εξαρτώνται από το στάδιο του σπερματικού κύκλου (Russell et al., 1990) και την ηλικία της ανάπτυξης, ενώ είναι ιδιαίτερα φτωχός σε χρωματίνη (Ρογδάκης, 2006). Το κυτταρόπλασμα των κυττάρων Sertoli περιέχει αφθονία μιτοχονδρίων λόγω της υψηλής μεταβολικής τους δραστηριότητας (Russell, 1993). Το σχήμα των μιτοχονδρίων φαίνεται να ποικίλλει περισσότερο στα 40

41 κύτταρα Sertoli από ότι σε οποιονδήποτε άλλο επιθηλιακό κυτταρικό τύπο. Αυτή η μορφολογική ιδιαιτερότητα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διάκρισή τους έναντι των σπερματικών κυττάρων (Russell et al., 1996; Russell and Brinster, 1996). Το λείο ενδοπλασματικό δίκτυο είναι ένα κυρίαρχο οργανίδιο στα ενήλικα κύτταρα Sertoli, γεγονός που υποδηλώνει ότι έχουν μια βασική λειτουργία που σχετίζεται με το μεταβολισμό των λιπιδίων και των στεροειδών (Russell, 1993). Τα κύτταρα Sertoli συνδέονται μεταξύ τους με συνεχείς, στενές συνάψεις που χωρίζουν το σπερματικό σωληνάριο σε δυο διαμερίσματα, το βασικό (κοντά στη βασική μεμβράνη) και το παρα-αυλικό (κοντά στον αυλό) (εικόνα 6) (Lie et al., 2013). Το βασικό τμήμα περιέχει τα ανώριμα σπερματοζωάρια ή σπερματογόνια και το παρα-αυλικό τα υπόλοιπα γεννητικά κύτταρα (Norman and Litwack, 1997). Οι συνάψεις αυτές δεν αφήνουν τα μεγαλομόρια να περάσουν ανάμεσα από τα δυο διαμερίσματα δημιουργώντας έναν φραγμό, ο οποίος ονομάζεται αιματο-ορχικός και ο ρόλος του είναι να εμποδίζει την έκθεση των γαμετών στα συστατικά του ανοσοποιητικού συστήματος (Gupta, 2005). Ο ρόλος αυτός του αιματο-ορχικού φραγμού είναι μείζονος σημασίας για την προστασία των σπερματοζωαρίων. Δεδομένου ότι τα σπερματοζωάρια δημιουργούνται κατά τη διάρκεια της ενήβωσης, δηλαδή πολύ μετά την εγκατάσταση της ανοσίας στον οργανισμό, αναγνωρίζονται ως ξένα από τα ανοσολογικά κύτταρα. Έτσι, απουσία φραγμού, ο οργανισμός θα παρήγαγε αντισώματα κατά του ίδιου του σπέρματός του (Kopera et al., 2010). Επιπλέον, με αυτό τον τρόπο, τα κύτταρα Sertoli, όχι μόνο προστατεύουν τα αναπτυσσόμενα γεννητικά κύτταρα από το ανοσοποιητικό σύστημα, αλλά επίσης αποκτούν και τον πλήρη έλεγχο του ειδικού χυμικού και θρεπτικού περιβάλλοντός τους, το οποίο είναι απαραίτητο για την ανάπτυξη των γεννητικών κυττάρων στο παρα-αυλικό διαμέρισμα (Wong and Cheng, 2005). Τέλος, ο αιματο-ορχικός φραγμός είναι επίσης υπεύθυνος για την απόδοση πολικότητας στο κύτταρο και για τη ρύθμιση της παρακυτταρικής διάχυσης νερού, ηλεκτρολυτών, θρεπτικών συστατικών και βιομορίων, από τη συστηματική κυκλοφορία στο διάμεσο ιστό, προς τα αναπτυσσόμενα γεννητικά κύτταρα (Li et al., 2009). 41

42 Εικόνα 6. Απεικόνιση αιματο-ορχικού φραγμού, κυττάρων Sertoli και των δυο διαμερισμάτων του σπερματικού σωληναρίου. 6.2 Ενδοκρινολογία των κυττάρων Η ωοθυλακιοτρόπος ορμόνη (FSH) είναι η κύρια ορμόνη που ρυθμίζει τη λειτουργία των κυττάρων Sertoli (πίνακας 1) και μαζί με την τεστοστερόνη (Τ) εξασφαλίζουν τη φυσιολογική, ποιοτική και ποσοτική, σπερματογένεση (Huhaniemi and Toppari, 2005). Πίνακας 1. Βιολογικές δράσεις της Ωοθυλακιοτρόπου ορμόνης (FSH) στο αρσενικό. (Hormones, Second Edition. Anthony W.Norman, Gerald Litwack. 1997) Κύτταρο Ώριμο κύτταρο Sertoli Ανώριμο κύτταρο Sertoli Δράση Έναρξη σπερματογένεσης Έναρξη σύνθεσης ανασταλτίνης Διέγερση της παραγωγής νέων πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων των ABP, Gnr-H-like peptide, MIF, Plasminogen activator, transferrin. Προώθηση της μιτωτικής διαίρεσης Οι παραπάνω ορμόνες δρουν στα κύτταρα Sertoli των σπερματικών σωληναρίων κατά την ενήβωση του ζώου, προκαλούν την έκκριση ανασταλτίνης και εμμέσως ενεργοποιούν τη σπερματική παραγωγή (Verhoeven et al., 2010). Τα κύτταρα Sertoli 42

43 συνθέτουν περίπου 60 διαφορετικές πρωτεΐνες οι οποίες σχετίζονται με την αναπαραγωγή. Οι πιο σημαντικές είναι η ανασταλτίνη, δεσμευτική πρωτεΐνη των ανδρογόνων (ABP) και η αντιμυλλέρειος ορμόνη (AMH) (Ρογδάκης, 2006). Η ανασταλτίνη είναι η ορμόνη που αναστέλλει την απελευθέρωση γοναδοτρόπων ορμονών από τον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης. Απελευθερώνεται όταν η συγκέντρωση του σπέρματος είναι υψηλή και έτσι η ανάγκη για παραγωγή του είναι μειωμένη. Όταν ο αριθμός του σπέρματος πέφτει, τα επίπεδα ανασταλτίνης μειώνονται αντίστοιχα. Η ανασταλτίνη, αντανακλά επίσης τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Sertoli και τη δράση της FSH. Οι αλλαγές στα επίπεδα της ανασταλτίνης σχετίζονται με αλλαγές στον πολλαπλασιασμό των γεννητικών κυττάρων (Stukenborg et al., 2014). Η δεσμευτική πρωτεΐνη ABP των ανδρογόνων εκκρίνεται από τα κύτταρα Sertoli στο σπερματικό αυλό για να εξασφαλιστεί ότι η συγκέντρωση των ανδρογόνων του αυλικού υγρού διατηρείται σε υψηλά επίπεδα. Επιπλέον, ωθεί τα βλαστικά κύτταρα να δεσμεύσουν την τεστοστερόνη. Όσο η συγκέντρωση της τεστοστερόνης αυξάνεται, τα βλαστικά κύτταρα εκλαμβάνουν εντολή να αναπτυχθούν και να μετατραπούν σε ώριμα σπερματοζωάρια. Η ABP δεσμεύει εκλεκτικά την τεστοστερόνη και είναι πλούσια σε αρωματάση προς μετατροπή της τεστοστερόνης σε οιστρογόνα (Ρογδάκης, 2006). Η αντιμυλλέριος ορμόνη εκκρίνεται από τα κύτταρα Sertoli των εμβρύων (O'Shaughnessy and Fowler, 2011) και έχει ως κύρια δράση την υποστροφή του πόρου του Müller στα άρρενα έμβρυα κατά τη φυλετική διαφοροποίηση. Καταστέλλει, δηλαδή, την ανάπτυξη των πόρων αυτών και ακολούθως των γεννητικών οργάνων του θηλυκού. Αυτό το επιτυγχάνει συνδεόμενη με τους αντίστοιχους κυτταρικούς υποδοχείς των πόρων του Müller, επιταχύνοντας τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (απόπτωση). Ανεπάρκεια της ορμόνης ή μεταλλάξεις του αντίστοιχου υποδοχέα σε άρρενα έμβρυα έχουν ως συνέπεια την παραμονή των πόρων του Müller. Αυτό οδηγεί σε ανάπτυξη θηλυκών γεννητικών οργάνων, διαφοροποίηση δηλαδή των πόρων του Müller σε σάλπιγγες, μήτρα και άνω τμήμα του κόλπου (Griswold and Behringer, 2009), με ταυτόχρονη παρουσία όρχεων. 43

44 6.3 Ο ρόλος των κυττάρων στη σπερματογένεση Η παρουσία των κυττάρων Sertoli και η στενή τους σχέση με τα γεννητικά κύτταρα, είναι υποχρεωτική κατά την ανάπτυξη των όρχεων όπως επίσης και κατά τη διαδικασία της σπερματογένεσης (Papaioannou et al., 2009). Στους αναπτυσσόμενους όρχεις, τα κύτταρα Sertoli απομονώνουν τα γεννητικά κύτταρα στο εσωτερικό των νεοσχηματισθέντων σπερματικών σωληναρίων και έτσι αναστέλλουν την τάση των κυττάρων αυτών να προβούν στη διαδικασία της μείωσης. Με την ολοκλήρωση του σχηματισμού των όρχεων, τα κύτταρα Sertoli και τα γεννητικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται ταχέως, ενώ κατά την ενήβωση παύουν οι μιτωτικές διαιρέσεις των κυττάρων Sertoli, σχηματίζονται ισχυροί δεσμοί μεταξύ γειτονικών αυτών κυττάρων και μέσω της μειωτικής διαδικασίας εξελίσσονται και διαφοροποιούνται τα γεννητικά κύτταρα σε σπερματοζωάρια (Griswold, 2005). Κατά την έναρξη της μείωσης, τα πρωτογενή σπερματοκύτταρα διαπερνούν τις συνάψεις μεταξύ των κυττάρων Sertoli, τα οποία είναι πλέον υπεύθυνα για την εξασφάλιση των απαραίτητων συνθηκών προκειμένου να εξελιχθούν επιτυχώς σε ώριμα σπερματοζωάρια. Πιο αναλυτικά, παρέχουν στα σπερματικά κύτταρα φυσική στήριξη και αποτελούν ένα στρώμα προστασίας έναντι του ανοσοποιητικού συστήματος (Tarulli et al., 2012). Επίσης, προμηθεύουν τους παράγοντες που απαιτούνται για να τροφοδοτηθεί ο μεταβολισμός των γεννητικών κυττάρων, ρυθμιστικούς παράγοντες ανάπτυξης καθώς επίσης και ορμόνες που ρυθμίζουν την ανάπτυξη των δομών του αρσενικού αναπαραγωγικού συστήματος (Kaur, 2012). Τέλος, φαγοκυτταρώνουν κάθε περίσσευμα μετά τη διαδικασία μετατροπής των σπερματίδων σε ώριμα σπερματοζωάρια (σπερμιογένεση). Η φαγοκυτταρική αφαίρεση των αποπτωτικών κυττάρων και των υπολειμματικών σωμάτων, από τα κύτταρα Sertoli, είναι ζωτικής σημασίας για να προχωρήσουν τα υγιή γεννητικά κύτταρα, στη διαδικασία της σπερματογένεσης. H σημασία της φαγοκυττάρωσης δίνεται από τους Nakanishi και Shiratsuchi, ως εξής (Nakanishi and Shiratsuchi, 2004): 44

45 1. Η εξάλειψη των αποπτωτικών κυττάρων παρέχει τον κατάλληλο χώρο στο σπερματικό επιθήλιο για την κανονική σπερματογένεση. 2. Τα αποπτωτικά κύτταρα και τα υπολειμματικά σωμάτια πρέπει να απομακρύνονται πριν από τη δευτερογενή νέκρωση, η οποία μπορεί να απελευθερώσει επιβλαβή περιεχόμενα για τα υγιή κύτταρα. 3. Η απορρόφηση των υπολειμματικών σωματίων και αποπτωτικών κυττάρων από τα κύτταρα Sertoli, συνεισφέρει στην παραγωγή παραγόντων που είναι απαραίτητοι για τη σπερματογένεση. Η ικανότητα των κυττάρων Sertoli για τη ρύθμιση της σπερματογένεσης εξαρτάται από τις λειτουργίες και τον αριθμό τους. Ο αριθμός των κυττάρων Sertoli πιστεύεται εδώ και χρόνια ότι είναι σταθερός στα ενήλικα άτομα και δε μεγαλώνει αφού επιτευχθεί ο αριθμός των κυττάρων του ενηλίκου. Ωστόσο, έρευνες σε άλογα έδειξαν ότι ενήλικα άτομα δεν έχουν σταθερό αριθμό κυττάρων Sertoli, και νέες μελέτες δείχνουν ότι τα ενήλικα κύτταρα Sertoli μπορεί να εισέλθουν εκ νέου στη μιτωτική φάση υπό ορισμένες πειραματικές συνθήκες (Johnson et al., 2008). Εν κατακλείδι, τα κύτταρα αυτά αποτελούν ένα αναπόσπαστο κομμάτι της σπερματογένεσης. Έπειτα από έρευνες, διαπιστώθηκε ότι επιτυχής και ολοκληρωμένη σπερματογένεση που έχει ως αποτέλεσμα σπέρμα ικανό για γονιμοποίηση, απουσία κυττάρων Sertoli, δεν έχει ακόμη αποδειχθεί στα θηλαστικά. Έτσι, αν και τα γεννητικά κύτταρα εμφανίζουν μεγάλη αναπτυξιακή αυτονομία, φαίνεται πως απαιτούν την παρουσία των κυττάρων Sertoli για πλήρη και επιτυχημένη σπερματογένεση (Griswold, 2005). 45

46 7. Λιποπολυσακχαρίτης LPS Το μόριο του λιποπολυσακχαρίτη (LPS) απαντά στην εξωτερική μεμβράνη των αρνητικών κατά Gram βακτηρίων και παίζει ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο στη λειτουργία του κυττάρου του μικροοργανισμού. Η εξωτερική μεμβράνη των περισσότερων Gram- βακτηρίων λειτουργεί ως προστατευτικός φραγμός για το κύτταρο και είναι αδιαπέραστη σε μεγάλου μοριακού βάρους μόρια και σε υδρόφοβα μόρια του εξωτερικού περιβάλλοντος του κυττάρου. Η ύπαρξη του λιποπολυσακχαρίτη είναι απαραίτητη για τη λειτουργία της μεμβράνης αυτής, διότι αρχικά βοηθά στο σχηματισμό ενός διαπερατού, σε χαμηλού ΜΒ μόρια και σε υδρόφιλα μόρια, φραγμού, προστατεύοντας τα κύτταρα από χολικά άλατα και άλλα τοξικά μόρια του γαστρεντερικού συστήματος, και επιπλέον παρέχει προστασία έναντι της λυσοζύμης και άλλων αντιμικροβιακών παραγόντων. Όσον αφορά τη δομή του LPS, αποτελείται από τρία ομοιοπολικά συνδεδεμένα διακριτά τμήματα, τον Ο-ειδικό πολυσακχαρίτη, τον κεντρικό πολυσακχαρίτη και το λιπιδικό μέρος που ονομάζεται λιπίδιο Α. Το λιπίδιο Α, αποτελείται από ένωση λιπαρών οξέων με έναν δισακχαρίτη φωσφορικής Ν-ακετυλογλυξοζαμίνης. Ο δισακχαρίτης, ενώνεται με τον κεντρικό πολυσακχαρίτη του LPS με την βοήθεια του κετοδεοξυοκτονικού οξέος (KDO) (Madigan et al., 2013). Ο κεντρικός πολυσακχαρίτης, περιέχει εκτός από KDO και σάκχαρα C7 (επτόζες), γλυκόζη, γαλακτόζη και Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη. Το εξωτερικό επαναλαμβανόμενο τμήμα γλυκάνης στο μόριο του LPS συνδέεται με το Λιπίδιο Α μέσω ενός πυρήνα ολιγοσακχαρίτη ο οποίος αναφέρεται ως Ο- ειδικός πολυσακχαρίτης ή Ο-αντιγόνο. Το Ο-αντιγόνο αποτελεί το πιο μεταβλητό τμήμα του LPS και παρέχει ορολογική επιλεκτικότητα, η οποία χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό οροτύπου στα βακτήρια. Επίσης, ο Ο-ειδικός πολυσακχαρίτης παρέχει προστασία στους μικροοργανισμούς από δυσμενή περιβάλλοντα όπως για παράδειγμα η φαγοκύτωση και συμμετέχει σε αλληλεπιδράσεις βακτηρίων με φυτά και βακτηριοφάγους. Η λεπτομερής δομή του LPS διαφέρει από το ένα βακτήριο στο άλλο και η παραλλακτικότητα αυτή μπορεί να επηρεάσει την τοξικότητα των βακτηρίων. Εκτός από το δομικό της χαρακτήρα, η εξωτερική μεμβράνη των Gram αρνητικών βακτηρίων έχει και λειτουργικό ρόλο, εμφανίζοντας συχνά τοξικότητα έναντι ζωικών 46

47 κυττάρων. Πιο συγκεκριμένα, μέλη των γενών Salmonella, Shigella, Escherichia κ.α. είναι παθογόνα για τους ανθρώπους και για άλλα θηλαστικά. Οι τοξικές ιδιότητες, συνδέονται με το λιπιδικό τμήμα του LPS, το λιπίδιο Α και το τοξικό αυτό συστατικό αναφέρεται ως ενδοτοξίνη. Η βιοσύνθεση, η εξαγωγή και η συναρμολόγηση του LPS απαιτεί ένα μεγάλο αριθμό ενζύμων και δομικών πρωτεϊνών που κωδικοποιούνται από περισσότερα από 50 γονίδια (Raetz et al., 2002; Samuel et al., 2003). Τόσο το Λιπίδιο Α όσο και ο πυρήνας συντίθενται στην κυτοπλασματική πλευρά της εσωτερικής μεμβράνης και στη συνέχεια μετατοπίζονται διαμέσου του κυτοπλάσματος, με τη βοήθεια του μεταφορέα ABC (κασέτα δέσμευσης ATP). Το νεοσχηματισθέν LPS πρέπει στη συνέχεια να μεταφερθεί διαμέσου του περιπλάσματος. Αυτό γίνεται μέσω μιας σύνθετης πολύ-πρωτεϊνικής οδού ειδικής για την μεταφορά LPS, η οποία είναι επίσης υπεύθυνη για την εισαγωγή του LPS στο εξωτερικό στρώμα της εξωτερικής μεμβράνης. Το λιπίδιο Α αναγνωρίστηκε την δεκαετία του 1960 ως το υδρόφοβο τμήμα του LPS, αλλά η βιοενεργότητά του προσδιορίστηκε μετά από 20 χρόνια. Ο τρόπος με τον οποίο ο ξενιστής αναγνωρίζει τον λιποπολυσακχαρίτη, παρέμεινε άγνωστος μέχρι την ανακάλυψη των TLRs και πιο συγκεκριμένα του TLR4, στα τέλη της δεκαετίας του 1990 (Loppnow et al., 1990; Medzhitov et al., 1997; Poltorak et al., 1998). Ο LPS μπορεί να διεγείρει τη διαμεμβρανική πρωτεΐνη TLR4 η οποία αποτελεί έναν υποδοχέα LPS και εντοπίζεται στην επιφάνεια πολλών κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος όπως τα μονοκύτταρα, τα μακροφάγα και τα δενδριτικά κύτταρα (Akira et al., 2006; Poltorak et al.,1998). Ο υποδοχέας TLR4 λειτουργεί ως διμερές και εξαρτάται από μια μικρή πρωτεΐνη την MD-2 για την αναγνώριση του LPS (Triantafilou and Triantafilou, 2002). 47

48 8. Μετφορμίνη (Metformin) Η μετφορμίνη (metformin/ glucophage) είναι μια φαρμακευτική ουσία που ανήκει στην τάξη των διγουανιδίων 6. Η συνήθης σύνθεση της μετφορμίνης περιγράφηκε αρχικά το 1922 και αναπαράχθηκε έκτοτε σε πολλαπλά διπλώματα ευρεσιτεχνίας και δημοσιεύσεις. Αυτή περιλαμβάνει την αντίδραση της υδροχλωρικής διμεθυλαμίνης με την 2-κυανογουανιδίνη με θέρμανση, όπως απεικονίζεται ακολούθως (εικόνα 7) (Werner and Bell, 1921; Shapiro et al., 1959). Εικόνα 7. Αντίδραση κατά την οποία παράγεται η μετφορμίνη. Σύμφωνα με την Αμερικανική Διαβητολογική Εταιρεία (American Diabetes Association, 2009), η μετφορμίνη αποτελεί την πρώτη επιλογή φαρμάκου για τη θεραπεία του διαβήτη τύπου 2 και πιο συγκεκριμένα σε υπέρβαρους, παχύσαρκους ανθρώπους και σε ανθρώπους με φυσιολογική λειτουργία νεφρών. Επίσης χρησιμοποιείται για τη θεραπεία του συνδρόμου πολυκυστικών ωοθηκών και ερευνάται η χρήση της σε άλλες ασθένειες όπου η αντίσταση στην ινσουλίνη μπορεί να είναι σημαντικός παράγοντας. Ο σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2 είναι μια σύνθετη, χρόνια μεταβολική διαταραχή η οποία προκύπτει από αδυναμίες τόσο στην έκκριση ινσουλίνης όσο και στη δράση της (Schernthaner and Schernthaner, 2007). Η ασθένεια αυτή χαρακτηρίζεται από αύξηση της συγκέντρωσης του σακχάρου στο αίμα (υπεργλυκαιμία) και από διαταραχή του μεταβολισμού της γλυκόζης, των λιπιδίων και των πρωτεϊνών, είτε ως αποτέλεσμα ελαττωμένης έκκρισης ινσουλίνης είτε λόγω μείωσης της ευαισθησίας των κυττάρων του σώματος στην ινσουλίνη. Η ινσουλίνη είναι μια ορμόνη που 6 Διγουανίδιο ονομάζεται η οργανική ένωση με τύπο ΗΝ(C(NH)NH 2 ) 2. Πρόκειται για ένα άχρωμο στερεό το οποίο διαλύεται σε νερό δίνοντας πολύ βασικό διάλυμα. Το προκύπτον αυτό διάλυμα υδρολύεται αργά σε αμμωνία και ουρία. 48

49 εκκρίνεται από το πάγκρεας και είναι απαραίτητη για τη μεταφορά της γλυκόζης που λαμβάνεται από τις τροφές, μέσα στα κύτταρα. Όταν το πάγκρεας δεν παράγει αρκετή ινσουλίνη ή η ινσουλίνη που παράγει δε δρα σωστά, τότε η γλυκόζη που λαμβάνεται από τις τροφές δεν εισέρχεται στα κύτταρα και παραμένει στο αίμα, με αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων της και άρα την εκδήλωση της νόσου. Για τη θεραπεία του ΣΔ2 χρησιμοποιήθηκαν σε πολλές χώρες διάφορα διγουανίδια (π.χ. μετφορμίνη, φαινφορμίνη, μπουφορμίνη). Ωστόσο όλα, εκτός της μετφορμίνης, απομακρύνθηκαν από τη διεθνή αγορά το 1970 λόγω του συνδεδεμένου με αυτά, υψηλού κινδύνου γαλακτικής οξέωσης (Bailey and Turner, 1996). Ο μηχανισμός με τον οποίο η μετφορμίνη ασκεί την αντιυπεργλυκαιμική δράση δεν ήταν εντελώς σαφής μέχρι πρόσφατα (Zhou et al., 2001) και θεωρείτο ότι μπορεί να προκαλείται από την ενεργοποίηση της ηπατικής και μυϊκής μονοφωσφορικής αδενοσίνης - ενεργοποιημένης πρωτεϊνικής κινάσης (AMPK) η οποία είναι ένας κύριος ρυθμιστής του μεταβολισμού λιπιδίων και γλυκόζης. Όπως αναφέρουν οι Miller και Birnbaum (Miller and Birnbaum, 2010), η μετφορμίνη μειώνει την παραγωγή ATP, ενεργοποιώντας το συντηρημένο αισθητήρα του διατροφικού στρες, AMPK, παρέχοντας έτσι ένα αληθοφανές και γενικά αποδεκτό μοντέλο για την καταστολή της γλυκογενετικής γονιδιακής έκφρασης και παραγωγής γλυκόζης. Η μετφορμίνη ρυθμίζει την υπεργλυκαιμία χωρίς να διεγείρει την έκκριση ινσουλίνης, την αύξηση βάρους, ή την πρόκληση υπογλυκαιμίας (Stumvoll et al., 1995; Wiernsperger and Bailey, 1999). Επιπλέον, έχει ευεργετικά αποτελέσματα επί των λιπιδίων της κυκλοφορίας του αίματος, που συνδέονται άρρηκτα με αυξημένο καρδιαγγειακό κίνδυνο (Stumvoll et al., 1995; Wiernsperger and Bailey, 1999; Wu et al., 1990). Το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών (PCOS) είναι η κύρια αιτία ανωορρηκτικής υπογονιμότητας. Περισσότερο από το 60% των γυναικών με σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών (PCOS) έχουν αντίσταση στην ινσουλίνη, η οποία συνδέεται στενά με ανωορρηξία και υπερανδρογοναιμία. Οι περισσότερες από αυτές τις γυναίκες είναι παχύσαρκες, και η απώλεια βάρους είναι μια πολύ αποτελεσματική θεραπεία για αυτά τα συμπτώματα μειώνοντας τις συγκεντρώσεις ινσουλίνης και ανδρογόνων. Χρησιμοποιώντας την ίδια αρχή ότι δηλαδή η μείωση της ινσουλίνης και των ανδρογόνων βελτιώνει τα συμπτώματα, η μετφορμίνη, ένας καθιερωμένος αντιδιαβητικός παράγοντας, χρησιμοποιείται ευρέως για τη συμπτωματική θεραπεία 49

50 του PCOS. Μια δόση mg ημερησίως, είναι ικανή να αυξήσει την ευαισθησία στην ινσουλίνη και να μειώσει την ωοθηκική παραγωγή ανδρογόνων. Η μετφορμίνη έχει μία μέτρια ευεργετική επίδραση, σε φυσιολογικού βάρους γυναίκες, στην αύξηση της συχνότητας της ωορρηξίας, ενώ είναι λιγότερο αποτελεσματική στην αποκατάσταση της ωορρηξίας σε υπέρβαρες γυναίκες (Homburg, 2008). Πρόσφατες έρευνες έχουν δείξει την επίδραση της μετφορμίνης σε αναπαραγωγικές παραμέτρους και ανοσοποιητικούς μηχανισμούς. Στη συνέχεια παρατίθενται έρευνες οι οποίες συσχετίζουν τη δράση της μετφορμίνης με τέτοια χαρακτηριστικά. Σύμφωνα με έρευνα Πολωνών επιστημόνων, η μετφορμίνη, εκτός από την αποτελεσματικότητά της στη θεραπεία του διαβήτη τύπου 2, μπορεί επίσης να έχει θεραπευτικές δυνατότητες για την ίαση νευροφλεγμονωδών ασθενειών, στις οποίες τα αντιδραστικά μικρόγλοια 7 διαδραματίζουν ουσιαστικό ρόλο (Labuzek et al., 2010). Έπειτα από πειράματα που έγιναν από τον Labuzek και τους συνεργάτες του για την αξιολόγηση της επίδρασης της μετφορμίνης επί μη διεγερμένες αλλά και ενεργοποιημένες με LPS, πρωτογενείς μικρογλοιακές κυτταρικές καλλιέργειες αρουραίου, αποδείχθηκε ότι η μετφορμίνη επηρέασε την απελευθέρωση προφλεγμονωδών και αντιφλεγμονωδών κυτταροκινών και μείωσε την παραγωγή τοξικών μορίων (Labuzek et al., 2010). Το 2010 οι Zhang και Liao διερεύνησαν in vitro τις επιδράσεις της τεστοστερόνης και της μετφορμίνης επί του μεταβολισμού της γλυκόζης στο ενδομήτριο (Zhang and Liao, 2010). Χρησιμοποιώντας καλλιέργειες επιθηλιακών κυττάρων του αδένα του ενδομητρίου, από γυναίκες που υπέστησαν ολική κοιλιακή υστερεκτομή λόγω ινομυώματος, οι ερευνητές σημείωσαν ότι τα υψηλά επίπεδα ανδρογόνων σε ασθενείς με σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών θα μπορούσαν να προκαλέσουν αντίσταση στην ινσουλίνη στα αδενικά επιθηλιακά κύτταρα του ενδομήτριου, ενώ η μετφορμίνη είναι ικανή να δράσει ανασταλτικά. Μια μελέτη που πραγματοποιήθηκε το 2011 από τους Germeyer και συνεργάτες, δείχνει ότι η μετφορμίνη επηρεάζει τη διαδικασία αντίδρασης φθαρτοποίησης 7 Ομάδα των νευρογλοιακών κυττάρων του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος 50

51 (decidualization) 8 των στρωματικών κυττάρων in vitro. Η επίδραση αυτή εξετάστηκε με τον προσδιορισμό της προλακτίνης σε καλλιέργειες στρωματικών κυττάρων από ενδομήτριο γυναικών. Ως αποτέλεσμα, βρέθηκε ότι η αντίδραση φθαρτοποίησης μειώθηκε σημαντικά σε κύτταρα που επωάστηκαν με μετφορμίνη, σε συνδυασμό με σημαντική μείωση της έκκρισης προλακτίνης. Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε η έκφραση κάποιων ορμονών, κυτταροκινών και αυξητικών παραγόντων με τα αποτελέσματα να δείχνουν ότι η μετφορμίνη οδήγησε σε χαμηλότερη έκφραση προλακτίνης και IGFBP-1. Επιπλέον, βρέθηκε πως η μετφορμίνη μετέβαλλε την έκφραση των γονιδίων IL-8 και IL-1b, η οποία αυξήθηκε ιδιαίτερα βραχυπρόσθεσμα αλλά και μακροπρόθεσμα. Οι ερευνητές σημειώνουν ότι παραμένουν να εξεταστούν και άλλες κυτταροκίνες και αυξητικοί παράγοντες του ενδομητρίου, πέραν αυτών που μελετήθηκαν, υπό την επίδραση της μετφορμίνης, με στόχο την ανάπτυξη πιθανών νέων θεραπειών στην αναπαραγωγική ιατρική στο εγγύς μέλλον. Το 2012 σε μια πιο πρόσφατη έρευνα που πραγματοποιήθηκε, ο Lee και οι συνεργάτες του διερεύνησαν την επίδραση της μετφορμίνης πάνω στο μονοπάτι σηματοδότησης ινσουλίνης σε κοκκώδη κύτταρα χοίρου, ως ένα εναλλακτικό μοντέλο για την ανθρώπινη έρευνα (Lee et al., 2012). Πιο συγκεκριμένα, εξετάστηκε η δραστικότητα της μετφορμίνης και της ινσουλίνης επί του pgls in vitro και σε γενικές γραμμές βρέθηκε ότι η μετφορμίνη ενίσχυσε τη δράση της ινσουλίνης επί των ενδοκυτταρικών μονοπατιών σηματοδότησης. Όπως σημειώνεται στη δημοσίευση αυτή, τα αποτελέσματα που προέκυψαν υποδηλώνουν ότι η μετφορμίνη μπορεί να αλλάξει την λειτουργία των ωοθηκικών κοκκωδών κυττάρων (Lee et al., 2012). Έπειτα από έρευνα που πραγματοποιήθηκε από τους Tartarin και συνεργάτες (Tartarin et al., 2012) για την επίδραση της μετφορμίνης επάνω στις γονάδες, και πιο συγκεκριμένα την επίδραση της μετφορμίνης που χορηγείται κατά την κύηση για την ανάπτυξη και τη λειτουργία των εμβρυϊκών όρχεων, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μετφορμίνη μπορεί να μειώσει την παραγωγή τεστοστερόνης in vitro και πιθανώς in vivo κατά τη διάρκεια έκθεσης, καθώς και ότι in vivo το μέγεθος των όρχεων και ο 8 Στη φάση εμφύτευσης το ενδομήτριο υπόκειται σε αλλαγές, μια διαδικασία η οποία ονομάζεται αντίδραση φθαρτοποίησης (decidualization). Πηγή: Πρακτικά 19ου ετήσιου σεμιναρίου συνεχιζόμενης ιατρικής εκπαίδευσης Γ.Ν.Α. Ο ΕΥΑΓΓΕΛΙΣΜΟΣ Αθήνα 17-21/2/

52 πληθυσμός των κυττάρων Sertoli, τα οποία είναι απολύτως απαραίτητα για την ανάπτυξη των γεννητικών κυττάρων, είναι μειωμένα. Στα ωοκύτταρα των θηλαστικών, η μειωτική διαδικασία ξεκινά κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ζωής και στη συνέχεια διακόπτεται στο στάδιο της διπλοτενίας, της πρώτης μειωτικής διαίρεσης. Η ολοκλήρωση της πρώτης μειωτικής διαίρεσης στα προ-ωορρηκτικά ωοκύτταρα προκαλείται από την απότομη αύξηση της γοναδοτροπίνης και η μειωτική διαδικασία προχωρά στο στάδιο της μετάφασης ΙΙ, όπου διακόπτεται και πάλι μέχρι τη γονιμοποίηση. Παρ όλα αυτά, το 1935 ανακαλύφθηκε ότι τα ωοκύτταρα μπορούν να συνεχίσουν τη μειωτική ωρίμανση αυθόρμητα χωρίς ορμονική διέγερση, όταν απομακρύνονται από τα θυλάκια και καλλιεργούνται σε κατάλληλα μέσα, ένα εύρημα που υποδηλώνει ότι το ωοθυλάκιο παρέχει έναν ανασταλτικό παράγοντα (ες) που αποτρέπει τη μείωση. Μεταγενέστερες έρευνες απέδειξαν ότι οι ενεργοποιητές της AMPK, AICAR και μετφορμίνη, αναστέλλουν την επανέναρξη της μείωσης στα περιβαλλόμενα από ωοφόρο δίσκο ωοκύτταρα στους χοίρους (Mayes et al., 2007). Το 2013 δημοσιεύτηκε μελέτη από τους Bilodeau-Goeseels και συνεργάτες, η οποία είχε στόχο να χαρακτηρίσει το ανασταλτικό αποτέλεσμα της μετφορμίνης, στη μείωση των ωοκυττάρων των χοίρων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ανασταλτική δράση της μετφορμίνης κατά πάσα πιθανότητα δε σχετίζεται με την ενεργοποίηση της AMPK (Bilodeau-Goeseels et al., 2013). Πολλά αντιοξειδωτικά έχουν προστεθεί στα μέσα κρυοσυντήρησης με ποικίλη επιτυχία. Το διγουανίδιο μετφορμίνη, που χρησιμοποιούνται συνήθως για τη θεραπεία του διαβήτη τύπου II, έχει ιδιότητες που επηρεάζουν τον έλεγχο του μεταβολισμού και που δεν έχουν αξιολογηθεί ακόμη σε πρωτόκολλα κρυοσυντήρησης. Το 2014 δημοσιεύτηκε μια μελέτη από τον Bertoldo και τους συνεργάτες του (Bertoldo et al., 2014), στόχοι της οποίας ήταν: ο προσδιορισμός της επίδρασης της μετφορμίνης στις ιδιότητες του νωπού σπέρματος και η αξιολόγηση των θετικών ή αρνητικών αποτελεσμάτων της μετφορμίνης στη λειτουργία του σπέρματος μετά την απόψυξη αλλά και στη γονιμοποιητική ικανότητα των σπερματοζωαρίων του ποντικού, όταν χρησιμοποιείται σε μέσα κρυοσυντήρησης. Τα πειράματα έδειξαν ότι η παρουσία της μετφορμίνης στο νωπό σπέρμα δεν προκάλεσε αρνητικές επιδράσεις στην ποιότητα των σπερματοζωαρίων, εκτός από μια ελαφρά μείωση στην κινητικότητα του σπέρματος σε συγκέντρωση ΙΜ μετφορμίνης. 52

53 Ωστόσο, όταν η μετφορμίνη συμπεριλήφθηκε σε ένα πρωτόκολλο κρυοσυντήρησης, παρατηρήθηκε βελτίωση του ρυθμού γονιμοποίησης και μείωση του ποσοστού των ανώμαλων ζυγωτών μετά την in vitro γονιμοποίηση. Εν κατακλείδι, η μετφορμίνη δεν επηρέασε την ποιότητα του σπέρματος σε χαμηλές συγκεντρώσεις (50 LM), αλλά η παρουσία της στα μέσα κρυοσυντήρησης θα μπορούσε να αποτελέσει πλεονέκτημα για τη βελτίωση της ποιότητας του κατεψυγμένου σπέρματος (Bertoldo et al., 2014). Παρ όλο που οι νέες έρευνες που προσανατολίζονται στην αξιολόγηση της δράσης της μετφορμίνης επί των αναπαραγωγικών χαρακτηριστικών και ανοσοποιητικών μηχανισμών, συνήθως αφορούν τον άνθρωπο, η διερεύνηση συσχέτισης της μετφορμίνης με αναπαραγωγικά και ανοσοποιητικά χαρακτηριστικά στα αγροτικά ζώα, βρίσκεται ακόμη σε πρώιμο στάδιο. Η παρούσα διατριβή είχε ως σκοπό τη μελέτη συσχέτισης της μετφορμίνης με την έκφραση κυτταροκινών και Toll-like υποδοχέων στα «νοσοκόμα» κύτταρα Sertoli, στις όρνιθες. 53

54 Β. ΜΕΡΟΣ - ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 9. Κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν Για το συγκεκριμένο πείραμα χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα Sertoli, από αρσενικές όρνιθες, τα οποία απομονώθηκαν από τον ερευνητή Pascal Froment του Ινστιτούτου INRA της Γαλλίας. Συγκεκριμένα, τα κύτταρα Sertoli απομονώθηκαν από όρνιθες ηλικίας 6 εβδομάδων, καλλιεργήθηκαν in vitro, και σε κάποια από αυτά έγινε προσθήκη μετφορμίνης, ενώ σε άλλα ταυτόχρονη προσθήκη μετφορμίνης και επώαση με LPS. Πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα 6 ωρών, 12 ωρών, 24 ωρών και 48 ωρών. Παρακάτω παρουσιάζονται οι χειρισμοί των κυττάρων που χρησιμοποιήθηκαν: 1. Μάρτυρας (χωρίς επώαση) 2. 6 ώρες με μετφορμίνη 3. 6 ώρες με μετφορμίνη (10 ώρες) και επώαση με LPS (6 ώρες) ώρες με μετφορμίνη ώρες με μετφορμίνη (16 ώρες) και επώαση με LPS (12 ώρες) ώρες με μετφορμίνη ώρες με μετφορμίνη (28 ώρες) και επώαση με LPS (24 ώρες) ώρες με μετφορμίνη ώρες με μετφορμίνη (52 ώρες) και επώαση με LPS (48 ώρες) 54

55 10. Εκκινητές Για τον πολλαπλασιασμό αλληλουχιών DNA in vitro είναι απαραίτητoς ο σχεδιασμός και η χρήση των κατάλληλων εκκινητών. Οι εκκινητές αποτελούν αλληλουχίες DNA οι οποίες προσδένονται στα συμπληρωματικά άκρα του τμήματος στόχου με σκοπό την έναρξη της αντιγραφής από τη DNA πολυμεράση. Στους παρακάτω πίνακες παρουσιάζονται οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν κατά την πειραματική διαδικασία της παρούσας διατριβής για την ενίσχυση των γονιδίων. Πίνακας 2. Ζεύγος εκκινητών β-ακτίνης Πίνακας 3. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση γονιδίων TLR ορνίθων. 55

56 Πίνακας 4. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση γονιδίων κυτταροκινών ορνίθων. 56

57 11. Εξαγωγή RNA H απομόνωση RNA από τα κύτταρα Sertoli, τα οποία είχαν κατεργαστεί με τους ως άνω χειρισμούς, πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του πρωτοκόλλου NucleoSpin TriPrep της εταιρείας MACHEREY-NAGEL. Πιο συγκεκριμένα, ακολουθήθηκαν τα παρακάτω βήματα: 1. Ομογενοποίηση του δείγματος. Ο ιστός λειοτριβήθηκε σε γουδί παρουσία υγρού αζώτου, έως ότου έλαβε κοκκώδη μορφή (μορφή πούδρας). Στη συνέχεια συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση ένας αριθμός ευκαρυωτικών κυττάρων της καλλιέργειας και λύθηκαν με άμεση προσθήκη του ρυθμιστικού διαλύματος RP1. 2. Λύση των κυττάρων Στη συνέχεια προστέθηκαν 350 μl ρυθμιστικού διαλύματος RP1 και 3,5 μι β- μερκαπτοαιθανόλης (β-με) στο δείγμα και αναδεύτηκαν έντονα με τη χρήση του vortex. 3. Λύση του διηθήματος Με σκοπό να μειωθεί το ιξώδες και να καθαρίσει το κυτταρόλυμα χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος διήθησης μέσω του φίλτρου NucleoSpin. Τοποθετήθηκε το NucleoSpin Φίλτρο (με το βιολετί δακτύλιο) σε σωλήνα συλλογής (2 ml), προστέθηκε το μίγμα, και ακολούθησε φυγοκέντρηση (11000 x g/1min). Σε περίπτωση σχηματισμού ορατού ιζήματος, το υπερκείμενο διάλυμα μεταφέρθηκε ξεχωριστά σε ένα νέο σωλήνα φυγοκέντρησης 2 ml, χωρίς οποιοδήποτε στερεό υπόλειμμα. 57

58 4. Ρύθμιση των συνθηκών πρόσδεσης DNA και RNA Στη συνέχεια το φίλτρο NucleoSpin απορρίφθηκε και προστέθηκαν 350 μl αιθανόλης (70%) έτσι ώστε να ομογενοποιηθεί το προϊόν λύσεως. Το μίγμα αναδεύτηκε με πιπέτα περίπου 5 φορές. 5. Πρόσδεση DNA και RNA Για κάθε παρασκεύασμα, χρησιμοποιήθηκε από μια NucleoSpin TriPrep Στήλη (γαλάζιος δακτύλιος), τοποθετήθηκε σε σωλήνα συλλογής και φορτώθηκε το λύμα. Το δείγματα φυγοκεντρήθηκαν ( x g/ 30 sec). Έπειτα οι στήλες NucleoSpin TriPrep τοποθετήθηκαν σε νέα σωληνάρια χωρητικότητας 2 ml. Τα RNA και DNA δεσμεύτηκαν στη μεμβράνη της στήλης, ενώ η πρωτεΐνη στη διάμεση ροή. 6. Πλύση της μεμβράνης του πυριτίου 1η πλύση Προστέθηκαν 500 μl διαλύματος για πλύση DNA στη στήλη NucleoSpin TriPrep και ακολούθησε φυγοκέντρηση (11000 x g/1min).το υγρό που διέρρευσε απορρίφθηκε και ο σωλήνας συλλογής επαναχρησιμοποιήθηκε. 2η πλύση Προστέθηκαν και πάλι 500 μl διαλύματος για πλύση DNA στη στήλη NucleoSpin TriPrep. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν (11000 x g/1min) και το υγρό που διέρρευσε απορρίφθηκε. Με αυτά τα στάδια έκπλυσης απομακρύνθηκε το χαοτροπικό άλας. Το DNA και το RNA είναι ακόμη συνδεδεμένα με την μεμβράνη, η οποία είναι πλέον έτοιμη για την επακόλουθη έκλουση του DNA. 58

59 7. Ξήρανση της μεμβράνης Η στήλη NucleoSpin TriPrep εισήχθηκε σε μικροσωληνάριο φυγοκέντρου χωρητικότητας 1,5 ml. Το καπάκι της στήλης ανήχθηκε και αφέθηκε για 3 λεπτά σε φυσικό αέρα δωματίου. Αυτό το στάδιο διασφάλισε την απομάκρυνση της υπολειμματικής αιθανόλης. 8. Έκλουση DNA Σε αυτό το στάδιο προστέθηκαν 100 μl του διαλύματος DNA Elute απευθείας πάνω στη μεμβράνη και το μίγμα επωάστηκε για 1 λεπτό. Έπειτα πραγματοποιήθηκε η έκλουση του DNA με φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε στροφές x g. 9. Πέψη του υπολειμματικού DNA που απέμεινε στη στήλη Προετοιμάστηκε το μίγμα της αντίδρασης rdnase σε ένα αποστειρωμένο σωληνάριο με την προσθήκη 10 μl rdnase και 90 μl ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης για rdnase. Το μίγμα αναδεύτηκε με το τίναγμα του σωλήνα. Εν συνεχεία εφαρμόστηκαν 95 μl αυτού του μίγματος αντίδρασης rdnase κατευθείαν πάνω στο κέντρο της μεμβράνης πυριτίου, της στήλης. Ακολούθησε επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. 10. Πλύση και ξήρανση της μεμβράνης πυριτίου 1 η πλύση Προστέθηκαν 200 μl ρυθμιστικού διαλύματος RA2 στη στήλη NucleoSpin TriPrep. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν ( x g/ 30s). Η στήλη τοποθετήθηκε σε ένα νέο σωλήνα συλλογής χωρητικότητας 2 ml. Το ρυθμιστικό αυτό διάλυμα RA2 αποσκοπεί στην αδρανοποίηση της rdnase. 59

60 2 η πλύση Στη στήλη NucleoSpin TriPrep προστέθηκαν 600 μl ρυθμιστικού διαλύματος ΚΑ3. Το μίγμα φυγοκεντρήθηκε για 30 s σε x g. Το διάλυμα που διέρρευσε απορρίφθηκε και η στήλη τοποθετήθηκε πίσω, στο σωλήνα συλλογής. 3η πλύση Σε αυτή την πλύση προστέθηκαν 250 μl ρυθμιστικού διαλύματος ΚΑ3 στη στήλη. Στη συνέχεια τα δείγματα τοποθετήθηκαν στη φυγόκεντρο για 2 λεπτά στα x g, για να στεγνώσει η μεμβράνη εντελώς. Η στήλη NucleoSpin TriPrep τοποθετήθηκε σε ένα σωλήνα συλλογής RNase-free. 11. Έκλουση εξαιρετικά καθαρού RNA Η έκλουση του RNA έγινε με 60 μl RNase-free Η 2 Ο και τα δείγματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση (11000 x g/1min). 60

61 12. Καθαρισμός RNA με δεοξυριβονουκλεάση Το πρώτο βήμα πριν τη χρησιμοποίηση του RNA με σκοπό τη Real Time PCR (βλέπε σελίδα 41) είναι η απομάκρυνση τυχόν γενωμικού DNA, με τη χρήση του ενζύμου DNase. Ο σκοπός αυτού του χειρισμού είναι η αφαίρεση του προσμεμειγμένου DNA από τα RNA παρασκευάσματα για να μην προκύψουν λανθασμένα αποτελέσματα στο πείραμα. Στην παρούσα μελέτη έγινε προσθήκη της δεοξυριβονουκλεάσης (DNAase) της εταιρείας Fermentas, η οποία είναι μία ενδονουκλεάση που αποκοδομεί το DNA υπόστρωμα, σε όλα τα RNA δείγματα. Ο χειρισμός με DNase πραγματοποιήθηκε για την απομάκρυνση του γενωμικού DNA, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στη συνέχεια προστέθηκε στα δείγματα διάλυμα EDTA το οποίο κρίνεται απαραίτητο για την απομάκρυνση της ενδονουκλεάσης DNAse και των δισθενών κατιόντων που προστέθηκαν στο διάλυμα της αντίδρασης και τα οποία μπορούν να καταλύσουν την αποικοδόμηση του RNA στο δείγμα. Τέλος, ακολούθησε η μέθοδος της RT και η αντίδραση της Real-Time PCR. Το πρωτόκολλο της Fermentas εφαρμόστηκε ως εξής: 1. Σε μικροσωληνάριο προστέθηκαν τα παρακάτω αντιδραστήρια: RNA 8μl BUFFER 10x 1 μl H 2 O - DNase 1 μl Total 10 μl 2. Το μίγμα των αντιδραστηρίων επωάστηκε στους 37 C για 30 min σε θερμοκυκλοποιητή (μάρκα). 3. Έγινε προσθήκη 1μL EDTA σε κάθε δείγμα και επώαση στους 65 C για 10 min, σε θερμοκυκλοποιητή. 61

62 13. Σύνθεση cdna Η σύνθεση cdna γίνεται με τη μέθοδο της RT, η οποία βασίζεται στην εξής αρχή: χρησιμοποιώντας ως μήτρα RNA (συνήθως mrna), έναν εκκινητή και το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση (reverse transcriptase), συντίθεται cdna. Πιο αναλυτικά, στα μόρια RNA υβριδοποιούνται μόρια κατάλληλου εκκινητή, στα οποία η RTase προσθέτει τα συμπληρωματικά με το RNA δεοξυριβονουκλεοτίδια για τη δημιουργία του cdna. Κάθε εκκινητής καθορίζει την ειδικότητα της αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής, δηλαδή ποια μόρια θα μεταγραφούν αντίστροφα σε cdna. Η σύνθεση του cdna μπορεί να γίνει χρησιμοποιώντας διάφορα είδη εκκινητών, όπως τυχαία εξαμερή ολιγονουκλεοτίδια, oligo-dt, ή ειδικούς για το γονίδιο εκκινητές. Στη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν τα ολιγονουκλεοτίδια εξαμερών (random hexamer primers), που είναι μη ειδικά μόρια, με ικανότητα να ενισχύουν το RNA σε όλο το μήκος του, γι αυτό και προέκυψε cdna σε υψηλότερη ποσότητα. Όσον αφορά τις πειραματικές μετρήσεις που παγματοποιήθηκαν, μετά την απομόνωση των δειγμάτων RNA του προηγούμενου σταδίου, ακολουθούσε η σύνθεση του αντίστοιχου cdna με τη μέθοδο της Αντίστροφης Μεταγραφάσης (RT). Το ένζυμο που χρησιμοποιήθηκε για το σκοπό αυτό είναι το RT Bioscript ενώ τα στάδια της πειραματικής διαδικασίας που ακολουθούνταν είναι αυτά του πρωτοκόλλου της κατασκευάστριας εταιρείας (Bioline). 1. Το μίγμα της RT είχε συνολικό όγκο 20 μl για κάθε δείγμα 1μg ολικού RNA (~10,5 μl) και περιείχε: RNA (από DNase treatment) Random Hexamers dntps Buffer 5x H 2 O RT (Bioscript) Total 1μg ~ 10,5 μl 1 μl 1 μl 4 μl 3 μl 0,5 μl 20 μl 62

63 Οι συνθήκες ήταν οι ακόλουθες: Το μίγμα της αντίδρασης παρέμεινε για 10min στους 25 C και έπειτα ακολούθησε επώαση για μία ώρα (1h) στους 42 C και για 10min στους 70 C. Στη συνέχεια, όλες οι αντιδράσεις διατηρούνταν σε πάγο (4 C). Η ποιότητα του cdna ελέγχθηκε με ενίσχυση της β-ακτίνης μέσω της PCR. 63

64 14. Η Real-Time PCR Η real-time PCR βασίζεται στην επαναστατική μεθοδολογία της ποσοτικής PCR και πρωτοεμφανίστηκε το 1993 από τον Higuchi και τους συνεργάτες του. Είναι μια τεχνική για την ποσοτικοποίηση νουκλεϊκών οξέων, την ανίχνευση μεταλλάξεων, για προσδιορισμό γονοτύπων, αναλύσεις χιμαιρισμού κ.ά. (Wilhelm and Pingoud, 2003). Η ιδιαιτερότητα της real-time PCR είναι ότι η διαδικασία του πολλαπλασιασμού παρακολουθείται σε πραγματικό χρόνο με τη χρήση τεχνικών φθορισμού. Ο φθορισμός μετριέται σε κάθε κύκλο της PCR, με αποτέλεσμα να προκύπτει μια καμπύλη ενίσχυσης (amplification plot), γεγονός που επιτρέπει στον ερευνητή να παρακολουθεί όλη τη διαδικασία της αντίδρασης. Το διάλυμα της αντίδρασης αποτελείται από τα ίδια αντιδραστήρια με αυτά της συμβατικής PCR έκτος από τους μηχανισμούς ανίχνευσης DNA που αφορούν την προσθήκη συγκεκριμένων ανιχνευτών (Houghton and Cockerill, 2006). Σήμερα, χρησιμοποιείται αποκλειστικά ως μέθοδος ανίχνευσης στη real time PCR, ο φθορισμός (Kubista et al., 2006). Το φθορίζον μόριο αναφοράς που χρησιμοποιείται στις αντιδράσεις της real time PCR μπορεί να είναι είτε α) μια μη ειδική χρωστική δέσμευσης DNA όπως η SYBR Green I που φθορίζει όταν δεσμεύεται σε δίκλωνο DNA (που χρησιμοποιήθηκε και στο παρόν πείραμα), είτε β) ένας ιχνηλάτης ειδικής αλληλουχίας που αποτελείται από ένα ολιγονουκλεοτίδιο συνδεδεμένο με μια φθορίζουσα χρωστική και έναν αποσβέστη (π.χ. TaqMan probes, Molecular Beacons και Scorpions). Το απλούστερο σύστημα ανάλυσης περιλαμβάνει την ενσωμάτωση μιας ελεύθερης χρωστικής ουσίας στο πρόσφατα σχηματισμένο δίκλωνο προϊόν DNA. Η πλέον χρησιμοποιούμενη χρωστική ουσία για το σκοπό αυτό στη real time PCR είναι SYBR Green Ι. Η χρωστική SYBR Green I διεγείρεται με ακτινοβολία μήκους κύματος 497 nm και εκπέμπει στα 250 nm. Σημειώνεται ότι η ουσία αυτή δε φθορίζει όταν βρίσκεται ελεύθερη σε διάλυμα. Ωστόσο, η ενσωμάτωσή της στο DNA κατά τη σύνθεσή του, έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή φθορισμού (εικόνα 8). 64

65 Εικόνα 8. Τρόπος δράσης φθορίζουσας ουσίας SYBR Green. Η ουσία SYBR Green I δεν παράγει φθορισμό όταν βρίσκεται ελεύθερη σε διάλυμα ενώ φθορίζει όταν ενσωματώνεται στο DNA, κατά τη σύνθεσή του. Η δεύτερη μέθοδος, των ιχνηλατών ειδικής ακολουθίας, παρουσιάζει μεγαλύτερη ακρίβεια και εξειδίκευση σε σχέση με την μέθοδο της SYBR Green I. Ο ιχνηλάτης έχει συνδεδεμένη στο ένα άκρο του μια φθορίζουσα χρωστική και στο άλλο άκρο ένα μόριο-αποσβέστη του φθορισμού (quencher). Η εκπομπή φθορίζοντος σήματος από τους ιχνηλάτες γίνεται με το διαχωρισμό της φθορίζουσας χρωστικής από το μόριοαποσβέστη κατά την υβριδοποίηση του ιχνηλάτη στην αλληλουχία-στόχο (Gibson, 2006) (εικόνα 9). Εικόνα 9. Μηχανισμός χημείας ιχνηλάτη TaqMan. Ο μηχανισμός αυτός βασίζεται στην 5-3 δραστηριότητα της DNA Taq πολυμεράσης να διασπά έναν διπλά σημασμένο ιχνηλάτη κατά τη διάρκεια της υβριδοποίησης με την συμπληρωματική αλληλουχία στόχο. (Introduction to Quantitative PCR, 2012) 65

66 Η διαδικασία της PCR περνά μέσα από τρεις κύριες φάσεις καθώς ο αριθμός των κύκλων και η ποσότητα του παραγόμενου προϊόντος αυξάνονται. Αρχικά, όταν η ποσότητα του προϊόντος είναι μικρή και τα ένζυμα και τα αντιδραστήρια δεν είναι περιοριστικά, η παραγωγή του προϊόντος είναι εκθετική και η απόδοση της αντίδρασης πλησιάζει το 100% (VanGuilder et al., 2008). Καθώς συνεχίζεται η αντίδραση, επέρχεται η γραμμική φάση (linear phase) κατά την οποία κάποια από τα αντιδραστήρια αρχίζουν να εξαντλούνται, ενώ παράλληλα συσσωρεύονται, σταδιακά αναστολείς. Στη συγκεκριμένη φάση, ο πολλαπλασιασμός επιβραδύνεται, καθώς μειώνεται η αποδοτικότητά του, έτσι που το σήμα φθορισμού δεν αυξάνεται πια εκθετικά και τελικά σταματάει εντελώς, οπότε η καμπύλη φθορισμού φτάνει σε σημείο κορεσμού (plateau). Κατά τη φάση αυτή τα αντιδραστήρια έχουν εξαντληθεί και η αντίδραση δε μπορεί να παράξει περεταίρω φθορισμό. Το σημείο κορεσμού διαφέρει μεταξύ των δειγμάτων και εξαρτάται από τις κινητικές των αντιδράσεων. Τα παραπάνω στάδια απεικονίζονται με μια χαρακτηριστική καμπύλη ενίσχυσης του προϊόντος. Η καμπύλη αυτή αποτελείται από την περιοχή αναφοράς και τις τρεις φάσεις (εκθετική, γραμμική, κορεσμού) (εικόνα 10). Η περιοχή αναφοράς δείχνει τους αρχικούς κύκλους της PCR κατά τη διάρκεια των οποίων, παρά το θεωρητικό διπλασιασμό του προϊόντος, υπάρχει μικρή αλλαγή στο σήμα φθορισμού πάνω από το υπόβαθρο. Οι μετρήσεις για την ποσοτικοποίηση αφορούν την εκθετική φάση της αντίδρασης. Σημαντική παράμετρο για την ποσοτικοποίηση αποτελεί η τιμή Ct (threshold cycle). Πρόκειται για τον αριθμό των κύκλων της αντίδρασης ενίσχυσης που απαιτούνται ώστε η τιμή του παρατηρούμενου φθορισμού να προσεγγίζει ένα συγκεκριμένο όριο (threshold) (Kubista et al., 2006). Η τιμή του ορίου αυτού ορίζεται πάνω από την αντίστοιχη του μη-ειδικού σήματος (background). Η τιμή Ct είναι αντιστρόφως ανάλογη της αρχικής ποσότητας του υποστρώματος: όσο μικρότερη είναι η τιμή Ct τόσο υψηλότερη είναι η συγκέντρωση του αρχικού υποστρώματος (Bustin et al., 2005; Kubista et al., 2006). 66

67 Εικόνα 10. Χαρακτηριστική καμπύλη ενίσχυσης, όπου διακρίνονται η εκθετική, η γραμμική και η φάση κορεσμού. Στον οριζόντιο άξονα παριστάνεται ο αριθμός των κύκλων της αντίδρασης, ενώ στον κατακόρυφο η τιμή των επιπέδων φθορισμού. Οι καμπύλες τήξης αντιπροσωπεύουν τη θερμοκρασία στην οποία είτε το αμπλικόνιο ή οι ιχνηλάτες φθορισμού διαχωρίζονται (''λιώνουν'') από την αλληλουχία του DNA στόχου (Houghton and Cockerill, 2006). Οι διαφορετικές αλληλουχίες έχουν και διαφορετικές θερμοκρασίες τήξης οι οποίες επηρεάζονται από το μήκος των ολιγονουκλεοτιδίων και το περιεχόμενο γουανίνης/κυτοσίνης (GC) (Houghton and Cockerill, 2006). Έτσι, τα αμπλικόνια μπορούν να διακριθούν από τις καμπύλες τήξης τους (εικόνα 11). Μετά την ολοκλήρωση του πρωτοκόλλου πολλαπλασιασμού, η θερμοκρασία αυξάνεται σταθερά, ενώ ο φθορισμός παρακολουθείται. Σε μια ορισμένη θερμοκρασία, μια απότομη μείωση του φθορισμού μπορεί να παρατηρηθεί λόγω της τήξης του προϊόντος (ο φθορισμός μειώνεται καθώς η θερμοκρασία αυξάνεται). Η θερμοκρασία τήξεως ενός προϊόντος ορίζεται ως η θερμοκρασία στην οποία το ήμισυ του DNA είναι μονόκλωνο, και αντιπροσωπεύει την πιο απότομη μείωση του σήματος φθορισμού. Αυτό μπορεί να προσδιοριστεί εύκολα ως η μέγιστη τιμή στην αρνητική παράγωγο της καμπύλης τήξης. 67

68 Εικόνα 11. Χαρακτηριστικές καμπύλες τήξης. Στο σχήμα διακρίνονται οι θερμοκρασίες (Tm) και οι κορυφές (melting peaks) τήξης των προϊόντων. Η καμπύλη ενός προϊόντος PCR μπορεί να παρατηρηθεί κατά τη διάρκεια της αντίδρασης, παρακολουθώντας το φθορισμό της χρωστικής καθώς η θερμοκρασία ξεπερνά τη θερμοκρασία μετουσίωσης του προϊόντος. Οι καμπύλες τήξης μπορούν να συγκριθούν μεταξύ των δειγμάτων για την ανίχνευση της παρουσίας πολυμορφισμών αλληλουχίας τόσο μικρών όσο ενός ζεύγους βάσεων (Houghton and Cockerill, 2006). Η μέθοδος της PCR πραγματικού χρόνου (real-time PCR) μετρά το φθορισμό σε κάθε κύκλο, καθώς η ενίσχυση εξελίσσεται. Αυτό επιτρέπει στην ποσοτικοποίηση του υποστρώματος να βασίζεται στο σήμα φθορισμού κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης ενισχύσεως, πριν ο περιορισμός των αντιδραστηρίων, η συσσώρευση των αναστολέων, ή η αδρανοποίηση της πολυμεράσης αρχίσουν να επιδρούν στην αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης. Προκειμένου να είναι συγκρίσιμες μεταξύ τους, οι μετρήσεις σε διαφορετικά δείγματα κανονικοποιούνται με βάση τις μετρήσεις σε δείγματα αναφοράς (Russel, 2009). 68

69 15. Στατιστική Ανάλυση Για τη συγκριτική αξιολόγηση των παραμέτρων μεταξύ των δειγμάτων της έρευνας χρησιμοποιήθηκε η μεθοδολογία της ανάλυσης των διακυμάνσεων μιας κατεύθυνσης (one-way Analysis of Variance), σύμφωνα με το εντελώς τυχαιοποιημένο σχέδιο. Η κανονικότητα των πειραματικών δεδομένων ελέγχθηκε με το κριτήριο των Shapiro-Wilk, ενώ η ομοιογένεια των διακυμάνσεων ελέγχθηκε με το κριτήριο Levene. Όπου κρίθηκε αναγκαίο πραγματοποιήθηκε μετασχηματισμός των πρωτογενών δεδομένων σε λογάριθμους ή τετραγωνικές ρίζες, με στόχο την κανονικοποίησή τους και την ομοιογένεια των διακυμάνσεων. Στις περιπτώσεις όπου οι προϋποθέσεις αυτές (κανονικότητας και ομοιογένειας) επιτεύχθηκαν, με ή χωρίς μετασχηματισμό των δεδομένων και η ανάλυση διακύμανσης αξιολογήθηκε ως στατιστικώς σημαντική, χρησιμοποιήθηκαν οι έλεγχοι πολλαπλής σύγκρισης του Tukey και του Duncan με στόχο την αξιολόγηση της ακριβούς θέσης των στατιστικών διαφορών. 69

70 Γ. ΜΕΡΟΣ- ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ - ΣΥΖΗΤΗΣΗ - ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 16. Διαγράμματα ενίσχυσης και καμπύλες τήξης Για τη μελέτη έκφρασης των γονιδίων TLRs και κυτταροκινών, πραγματοποιήθηκε απομόνωση RNA από τα κύτταρα Sertoli που βρίσκονται στους όρχεις των αρσενικών ορνίθων, μετά από 0, 6, 12, 24 και 48 ώρες χειρισμού με μετφορμίνη και 0, 6, 12, 24 και 48 ώρες με ταυτόχρονη εφαρμογή LPS και μετφορμίνης, αντίστοιχα. Μετά την εξαγωγή RNA και τη σύνθεση cdna η ποσότητα και η ποιότητα του γενετικού υλικού ελέχθηκε με γονίδιο αναφοράς, που εν προκειμένω είναι η ακτίνη, με τη μέθοδο της Real Time PCR. Παρακάτω παρουσιάζονται τα διαγράμματα ενίσχυσης και οι καμπύλες τήξης, όπως καταγράφηκαν από το μηχάνημα του LightCycler (Roche). Διάγραμμα 1. Καμπύλες ενίσχυσης ακτίνης ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων και των κύκλων ενίσχυσης. 70

71 Διάγραμμα 2. Κορυφές τήξης ακτίνης ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων με τη θερμοκρασία. Όπως παρατηρείται, η ποσότητα και η ποιότητα της ακτίνης με βάση την ενίσχυση του γονιδίου κρίθηκαν ικανοποιητικές, ενώ δε βρέθηκαν παραπροϊόντα ούτε διμερή. Έτσι ακολούθησε η ποσοτικοποίηση της έκφρασης των υπό μελέτη γονιδίων, TLRs και κυτταροκινών. Παρακάτω ακολουθούν τα αντίστοιχα διαγράμματα για κάθε γονίδιο ξεχωριστά. 71

72 TLR 1.1 Διάγραμμα 3. Καμπύλες ενίσχυσης του TLR 1.1 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων και των κύκλων ενίσχυσης. Διάγραμμα 4. Κορυφές τήξης του TLR 1.1 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων με τη θερμοκρασία. TLR 1.2 Διάγραμμα 5. Καμπύλες ενίσχυσης του TLR 1.2 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων και των κύκλων ενίσχυσης. Διάγραμμα 6. Κορυφές τήξης του TLR 1.2 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων με τη θερμοκρασία. 72

73 TLR 2.1 Διάγραμμα 7. Καμπύλες ενίσχυσης του TLR 2.1 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων και των κύκλων ενίσχυσης. Διάγραμμα 8. Κορυφές τήξης του TLR 2.1 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων με τη θερμοκρασία. TLR 2.2 Διάγραμμα 9. Καμπύλες ενίσχυσης του TLR 2.2 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων και των κύκλων ενίσχυσης. Διάγραμμα 10. Κορυφές τήξης του TLR 2.2 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων με τη θερμοκρασία. 73

74 TLR 3 Διάγραμμα 11. Καμπύλες ενίσχυσης του TLR 3 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων και των κύκλων ενίσχυσης. Διάγραμμα 12. Κορυφές τήξης του TLR 3 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων με τη θερμοκρασία. TLR 4 Διάγραμμα 13. Καμπύλες ενίσχυσης του TLR 4 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων και των κύκλων ενίσχυσης. Διάγραμμα 14. Κορυφές τήξης του TLR 4 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων με τη θερμοκρασία. 74

75 TLR 5 Διάγραμμα 15. Καμπύλες ενίσχυσης του TLR 5 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων και των κύκλων ενίσχυσης. Διάγραμμα 16. Κορυφές τήξης του TLR 5 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων με τη θερμοκρασία. TLR 7 Διάγραμμα 17. Καμπύλες ενίσχυσης του TLR 7 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων και των κύκλων ενίσχυσης. Διάγραμμα 18. Κορυφές τήξης του TLR 7 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων με τη θερμοκρασία. 75

76 TLR 15 Διάγραμμα 19. Καμπύλες ενίσχυσης του TLR 15 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων και των κύκλων ενίσχυσης. Διάγραμμα 20. Κορυφές τήξης του TLR 15 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων με τη θερμοκρασία. TLR 21 Διάγραμμα 21. Καμπύλες ενίσχυσης του TLR 21 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων και των κύκλων ενίσχυσης. Διάγραμμα 22. Κορυφές τήξης του TLR 21 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων με τη θερμοκρασία. 76

77 IFNg Διάγραμμα 23. Καμπύλες ενίσχυσης του IFNg ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων και των κύκλων ενίσχυσης. Διάγραμμα 24. Κορυφές τήξης του IFNg ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων με τη θερμοκρασία. IL 1b Διάγραμμα 25. Καμπύλες ενίσχυσης του IL 1b ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων και των κύκλων ενίσχυσης. Διάγραμμα 26. Κορυφές τήξης του IL 1b ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων με τη θερμοκρασία. 77

78 IL 6 Διάγραμμα 27. Καμπύλες ενίσχυσης του IL 6 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων και των κύκλων ενίσχυσης. Διάγραμμα 28. Κορυφές τήξης του IL 6 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων με τη θερμοκρασία. IL 8 Διάγραμμα 29. Καμπύλες ενίσχυσης του IL 8 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων και των κύκλων ενίσχυσης. Διάγραμμα 30. Κορυφές τήξης του IL 8 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων με τη θερμοκρασία. 78

79 IL 12 Διάγραμμα 31. Καμπύλες ενίσχυσης του IL 12 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων και των κύκλων ενίσχυσης. Διάγραμμα 32. Κορυφές τήξης του IL 12 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων με τη θερμοκρασία. IL 15 Διάγραμμα 33. Καμπύλες ενίσχυσης του IL 15 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων και των κύκλων ενίσχυσης. Διάγραμμα 34. Κορυφές τήξης του IL 15 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων με τη θερμοκρασία. 79

80 IL 17 Διάγραμμα 35. Καμπύλες ενίσχυσης του IL 17 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων και των κύκλων ενίσχυσης. Διάγραμμα 36. Κορυφές τήξης του IL 17 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων με τη θερμοκρασία. IL 18 Διάγραμμα 37. Καμπύλες ενίσχυσης του IL 18 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων και των κύκλων ενίσχυσης. Διάγραμμα 38. Κορυφές τήξης του IL 18 ως συνάρτηση του φθορισμού (530 nm) των προϊόντων με τη θερμοκρασία. 80

81 17. Αποτελέσματα σχετικής έκφρασης Στη συνέχεια παρουσιάζονται τα διαγράμματα με τα αποτελέσματα της ποσοτικής έκφρασης των TLRs και κυτταροκινών έπειτα από χειρισμό τους με δύο ανεξάρτητες μεταβλητές. Στην πρώτη περίπτωση έγινε προσθήκη μετφορμίνης στα κύτταρα και πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις σε 0, 6, 12, 24 και 48 ώρες. Ενώ αντίστοιχα στη δεύτερη περίπτωση έγινε ταυτόχρονη προσθήκη μετφορμίνης αλλά και επώαση με LPS. Όλα τα διαγράμματα προέκυψαν έπειτα από τρεις επαναλήψεις σε κάθε σημείο. Η χρήση του αστερίσκου υποδηλώνει την ύπαρξη στατιστικά σημαντικής διαφοράς σε επίπεδο σημαντικότητας α=0,05 στον αντίστοιχο χειρισμό συγκριτικά πάντα με τη 0 ώρα, που χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. 81

82 TLR 1-1 α β Διάγραμμα 39. Αποτελέσματα σχετικής έκφρασης του γονιδίου TLR 1-1 ως συνάρτηση του χρόνου επώασης με: α. Μετφορμίνη β. Μετφορμίνη και LPS. TLR 1-2 α β Διάγραμμα 40. Αποτελέσματα σχετικής έκφρασης του γονιδίου TLR 1-2 ως συνάρτηση του χρόνου επώασης με : α. Μετφορμίνη β. Μετφορμίνη και LPS. 82

83 TLR 2-1 α β Διάγραμμα 41. Αποτελέσματα σχετικής έκφρασης του γονιδίου TLR 2-1 ως συνάρτηση του χρόνου επώασης με : α. Μετφορμίνη β. Μετφορμίνη και LPS. TLR 2-2 α β Διάγραμμα 42. Αποτελέσματα σχετικής έκφρασης του γονιδίου TLR 2-2 ως συνάρτηση του χρόνου επώασης με : α. Μετφορμίνη β. Μετφορμίνη και LPS. 83

84 TLR 3 α β Διάγραμμα 43. Αποτελέσματα σχετικής έκφρασης του γονιδίου TLR 3 ως συνάρτηση του χρόνου επώασης με : α. Μετφορμίνη β. Μετφορμίνη και LPS. TLR 4 α β Διάγραμμα 44. Αποτελέσματα σχετικής έκφρασης του γονιδίου TLR 4 ως συνάρτηση του χρόνου επώασης με : α. Μετφορμίνη β. Μετφορμίνη και LPS. 84

85 TLR 5 α β Διάγραμμα 45. Αποτελέσματα σχετικής έκφρασης του γονιδίου TLR 5 ως συνάρτηση του χρόνου επώασης με : α Μετφορμίνη β Μετφορμίνη και LPS TLR 7 α β Διάγραμμα 46. Αποτελέσματα σχετικής έκφρασης του γονιδίου TLR 7 ως συνάρτηση του χρόνου επώασης με : α. Μετφορμίνη β. Μετφορμίνη και LPS. 85

86 TLR 15 α β Διάγραμμα 47. Αποτελέσματα σχετικής έκφρασης του γονιδίου TLR 15 ως συνάρτηση του χρόνου επώασης με : α Μετφορμίνη β Μετφορμίνη και LPS TLR 21 α β Διάγραμμα 48. Αποτελέσματα σχετικής έκφρασης του γονιδίου TLR 21 ως συνάρτηση του χρόνου επώασης με : α. Μετφορμίνη β. Μετφορμίνη και LPS. 86

87 IFNg α β Διάγραμμα 49. Αποτελέσματα σχετικής έκφρασης του γονιδίου IFNg ως συνάρτηση του χρόνου επώασης με : α Μετφορμίνη β Μετφορμίνη και LPS IL- 1β α β Διάγραμμα 50. Αποτελέσματα σχετικής έκφρασης του γονιδίου IL- 1β ως συνάρτηση του χρόνου επώασης με : α. Μετφορμίνη β. Μετφορμίνη και LPS. 87

88 IL- 6 α β Διάγραμμα 51. Αποτελέσματα σχετικής έκφρασης του γονιδίου IL-6 ως συνάρτηση του χρόνου επώασης με : α Μετφορμίνη β Μετφορμίνη και LPS IL- 8 α β Διάγραμμα 52. Αποτελέσματα σχετικής έκφρασης του γονιδίου IL-8 ως συνάρτηση του χρόνου επώασης με : α. Μετφορμίνη β. Μετφορμίνη και LPS. 88

89 IL- 12 α β Διάγραμμα 53. Αποτελέσματα σχετικής έκφρασης του γονιδίου IL-12 ως συνάρτηση του χρόνου επώασης με : α Μετφορμίνη β Μετφορμίνη και LPS IL- 15 α β Διάγραμμα 54. Αποτελέσματα σχετικής έκφρασης του γονιδίου IL-15 ως συνάρτηση του χρόνου επώασης με : α. Μετφορμίνη β. Μετφορμίνη και LPS. 89

90 IL- 17 α β Διάγραμμα 55. Αποτελέσματα σχετικής έκφρασης του γονιδίου IL-17 ως συνάρτηση του χρόνου επώασης με : α. Μετφορμίνη β. Μετφορμίνη και LPS. IL- 18 α β Διάγραμμα 56. Αποτελέσματα σχετικής έκφρασης του γονιδίου IL-18 ως συνάρτηση του χρόνου επώασης με : α. Μετφορμίνη β. Μετφορμίνη και LPS. 90