SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE FAKULTA AGROBIOLÓGIE A POTRAVINOVÝCH ZDROJOV KATEDRA GENETIKY A ŠĽACHTENIA RASTLÍN

Transcript

1 SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE FAKULTA AGROBIOLÓGIE A POTRAVINOVÝCH ZDROJOV KATEDRA GENETIKY A ŠĽACHTENIA RASTLÍN Prednáška z Genetiky mikroorganizmov Informačné molekuly v mikroorganizmoch a nebunkových biologických systémoch. Štruktúra a syntéza nukleových kyselín v mikroorganizmoch. Štruktúra a syntéza nukleových kyselín nebunkových biologických systémov. prof. RNDr. Milan BEŽO, CSc.

2 Informačné molekuly v organizmoch a v NBS (nebunkové biologické systémy) V organizmoch a NBS majú informačnú a regulačnú funkciu nukleové kyseliny. Sú dve formy nukleových kyselín: a) deoxyribonukleová kyselina (), b) ribonukleová kyselina (RNA). *Informačnú hodnotu majú aj priony, určité bielkoviny.

3 Zdvojenie Prepis na RNA Spätný prepis RNA na RNA Preklad RNA na bielkovinu Bielkovina Bielkovina prion + bielkovina normálna bielkovina prion Prenos informácie v organizmoch Zdvojenie (replikácia ) syntéza podľa predlohy. Prepis na RNA (transkripcia) syntéza RNA podľa predlohy. Spätný prepis RNA na (reverzná transkripcia) syntéza podľa predlohy RNA. Preklad RNA na bielkovinu (translácia) syntéza bielkoviny podľa predlohy RNA. Prion bielkovina s informačnou hodnotou. deoxyribonukleová kyselina, RNA ribonukleová kyselina.

4 ds Organizmy ds ss (-) ssrna (+) ssrna Vírusy, satelity dsrna (+) ssrna Viroidy Štruktúra informačných molekúl v organizmoch a NBS (nebunkové biologické systémy) ds dvojreťazcová nukleová kyselina (double stranded) ss jednoreťazcová nukleová kyselina (single stranded) (+) a (-) reťazce sú podľa významu pri preklade genetickej informácie, (+) je predloha pre syntézu bielkovín, (-) je komplementárny reťazec k (+) reťazcu.

5 ds lineárna ds kružnicová Organely bunky, chromozóm baktérií, plazmidy baktérií, vírusy, satelity Jadro bunky, organely bunky, chromozóm baktérií, plazmidy baktérií, vírusy, satelity ss kružnicová Vírusy, satelity dsrna lineárna ssrna lineárna Vírusy, satelity Vírusy, satelity, viroidy ssrna kružnicová Viroidy Tvar informačných molekúl v organizmoch a NBS (nebunkové biologické systémy)

6 Organizácia informačných molekúl v organizmoch Baktéria, archea Jedna molekula kružnicovej (príležitostne viac) alebo lineárnej ds chromozómu (chromozómov). Väčší počet kružnicovej, prípadne lineárnej ds plazmidov. Eukarya Väčší počet molekúl lineárnej ds v jadre bunky. Diploidný (2n) počet chromozómov v jadre bunky. ds kružnicová aj lineárna v plastidoch a mitochondriách.

7 je polynukleotid zložený z deoxynukleozid-5-monofosfátov, damp, dcmp, dgmp, dtmp. V bunkách baktérií, archeí a v eukaryach je dvojreťazcová (ds). V nebunkových biologických systémoch je dvoj- alebo aj jednoreťazcová (ss). damp deoxyadenozín-monofosfát, dcmp deoxycytidín-monofosfát, dgmp deoxyguanozín-monofosfát, dtmp deoxytymidín-monofosfát, ds dvojreťazcová (double stranded ) ss jednoreťazcová (single stranded )

8 A G C Bázy deoxyribóza fosfát I Zložky nukleotida A adenín, G guanín, T tymín, C cytozín. A 3 G C II Nukleotidy ATP deoxyadenozín trifosfát, GTP deoxyguanozín trifosfát, TTP deoxytymidín trifosfát, CTP deoxycytidín trifosfát. A G A C 3 III Polynukleotid G C A T C G 3 IV ds Štruktúra Zložky nukleotida (I), nukleotidy (II), polynukleotid (III) a dvojreťazcová, ds (IV).

9 RNA RNA je polynukleotid zložený z nukleozid monofosfátov, AMP, CMP, GMP, UMP. V bunkách baktérií, archeí a v eukaryách je RNA jednoreťazcová (ssrna). V nebunkových biologických systémoch je RNA jedno- alebo dvojreťazcová (dsrna). AMP adenozín monofosfát, CMP cytidín monofosfát, GMP guanozín monofosfát, UMP uridín monofosfát, ssrna jednoreťazcová RNA (single stranded RNA) dsrna dvojreťazcová RNA (double stranded RNA)

10 A G C ribóza fosfát Bázy I. Zložky nukleotida RNA A adenín, G guanín, U uracil, C cytozín. G A G A C 3 III. ssrna C II. Nukleotidy RNA ATP adenozín trifosfát, GTP guanozín trifosfát, UTP uridín trifosfát, CTP cytidín trifosfát. Štruktúra RNA Zložky nukleotida RNA (I.), nukleotidy (II.) a jednoreťazcová ssrna (III).

11 replikácia Syntéza makromolekúl na predlohe polynukleotidového reťazca. Katalýzou enzýmov sa na polynukleotidový reťazec viažu voľné nukleozidtrifosfáty podľa komplementarity báz nukleotidov. Replikácia dvojreťazcovej (ds) je: semikonzervatívna (dve kópie ds majú jeden reťazec pôvodný a druhý novo nasyntetizovaný), dvojsmerná/jednosmerná (pri dvojsmernej replikácii sa z jedného začiatku replikácie rozširujú dve replikačné vidlice, pri jednosmernej replikácii má jeden začiatok replikácie jednu replikačnú vidlicu) a neprerušovaná/prerušovaná (syntéza je neprerušovaná a syntéza oneskorujúceho sa reťazca je prerušovaná, po krátkych úsekoch, Okazakiho fragmentoch).

12 Nie Nie Áno Rozptýlená replikácia Konzervatívna replikácia Semikonzervatívna replikácia Semikonzervatívna replikácia Jeden reťazec je pôvodný a druhý je novo nasyntetizovaný.

13 Začiatok replikácie Replikačná bublina Replikačné vidlice Dvojsmerná replikácia ds Začiatok replikácie Replikačná bublina Replikačná vidlica Jednosmerná replikácia ds Dvojsmerná a jednosmerná replikácia dvojreťazcovej (ds) v bunke Dvojsmerná ds replikácia má jeden začiatok replikácie a dve replikačné vidlice. Jednosmerná replikácia má jeden začiatok replikácie a jednu replikačnú vidlicu.

14 ds 3 polymeráza 3 ligáza Okazakiho fragmenty 3 Replikačná vidlica Reťazec vedúci Reťazec oneskorujúci sa 3 polymeráza replikácia neprerušovaná a prerušovaná Dvojreťazcová (ds) má reťazce orientované v smere 3 a 3. Syntéza nového polynukleotida (červená čiara) je v smere 3. V smere posunu replikačnej vidlice je neprerušovaná syntéza reťazeca vedúceho. Smerom od replikačnej vidlice je prerušovaná syntéza reťazca oneskorujúceho sa. Syntéza reťazca oneskorujúceho sa je po krátkych Okazakiho fragmentoch. Enzým polymeráza katalyzuje syntézu nového reťazca a enzým ligáza spája nasyntetizované krátke polynukleotidy v reťazci oneskorujúcom sa.

15 dttp 3 A Čiastočne rozpletená molekula ds pri jej replikácii. G A C T G 3 dgtp C G Syntéza (replikácia) Na reťazcoch rozpletenej ds sa podľa párovania báz A T a G C viažu nukleozidtrifosfáty, deoxyadenozín trifosfát (datp), deoxycytidín trifosfát (dctp), deoxyguanozín trifosfát (dgtp), deoxytymidín trifosfát (dttp). Nukleotidy sa navzájom viažu fosfodiesterickou väzbou. Replikáciou vznikajú dve molekuly. (Vpravo).

16 I. Bunka Escherichia coli Bunka protist nukleozóm II. ds topo 3 3 replikačná vidlica Úprava na replikáciu I. V bunke baktérie Escherichia coli je ds v chromozóme a plazmidoch bez podporných bielkovín. V bunke eukaryí je ds v jadre bunky (nukleozómová organizácia), v chloroplastoch a mitochondriách. II. Pred replikáciou je dvojzávitnica ds rozvinutá naštiepením jednoreťazcových alebo dvojreťazcových zlomov topoizomerázami (topo). 3 Replikácia ds v skúmavke

17 3 3 Syntéza reťazca vedúceho RNA prajmer ligáza polymeráza I Syntéza reťazca oneskorujúceho sa polymeráza III Nový reťazec Okazakiho Fragment SSB bielkoviny Helikáza /primáza Gyráza SSB bielkoviny 3 syntéza. Gyráza uvoľňuje nadzávitnicové vinutie pri rozpletaní. helikáza pomocou ATP oddeľuje hydrolýzou dvojreťazcovú (ds) na dva reťazce. Bielkoviny viažúce sa na jeden reťazec, SSB bielkoviny, chránia opätovné spojenie reťazcov. Rozpletené reťazce sú vo vhodnej pozícii pre naviazanie polymerázy III. Enzým katalyzuje predlžovanie vedúceho a oneskorujúceho sa reťazca. polymeráza katalyzuje viazanie deoxynukleotid trifosfátov (dntp) v smere 3 na matrici pôvodného reťazca 3. Obidva reťazce sú syntetizované súčasne, vedúci reťazec súvisle a oneskorujúci sa reťazec prerušovane, po častiach Okazakiho fragmentoch. primáza spolu s ďalšími bielkovinami tvorí primozóm, ktorý pomáha pri syntéze RNA prajmera. RNA prajmerom začína každá syntéza reťazca. Okazakiho fragmenty sú ligázou spojené do súvislého reťazca. polymeráza I katalyzuje úpravu RNA prajmerov na.

18 polymerázy replikujúce jadra bunky eukaryí polymeráza alfa (α) primáza a polymerázová aktivita. polymeráza delta (δ) syntéza vedúceho a oneskorujúceho sa reťazca. polymeráza epsilon (ε) syntéza oneskorujúceho sa reťazca.

19 Skupina (rodina) polymerázy organizmov Doména Baktéria Archea Eukarya A pol I gama, théta B pol II Pol B1 C D X Y pol III Pol IV, Pol V Pol D ( Pol II) alfa, delta, epsilon, dzeta, fí beta, lambda, mí, sigma eta, jota, kappa, REV1 Kyoto University Bioinformatics Center (upravené)

20 Replikácia ds v bunke baktérií a eukaryí Baktérie Eukarya Replikácia ds Začiatok replikácie (oric) Väčší počet miest iniciácie replikácie Rýchlosť replikácie nt/sec 50 nt/sec nt nukleotid v molekule nukleovej kyseliny oric začiatok replikácie (Origin of Replication) ds

21 Začiatok replikácie ds v chromozóme baktérie Escherichia coli a miesta iniciácie replikácie v chromozómoch kvasinky (eukarya) Jeden začiatok replikácie (oric) v chromozóme E. coli je tvorený opakovanými poradiami nukleotidov v celkovej dĺžke 245 bp. OriC umožňuje oddeľovanie reťazcov ds. Miesta iniciácie replikácie kvasinky, majú autonómne sa replikujúce poradia nukleotidov (ARS Autonomous Replicating Sequences). ARS má dĺžku 180 bp a v 17 chromozómoch kvasinky je okolo 400 ARS. bp páry báz nukleotidov v ds

22 ds Začiatok replikácie (oric) kružnicovej ds Kružnicová dvojreťazcová (ds) Oddeľovaním reťazcov kružnicovej ds sa tvorí replikačná bublina Nové reťazce Syntéza nových reťazcov v rozšírenej replikačnej bubline Dve kópie kružnicovej ds ds ds Replikácia kružnicovej ds v bunke Escherichia coli Pri replikácii je len jeden začiatok replikácie.

23 Miesta iniciácie replikácie ds ds Replikačné bubliny Dve kópie lineárnej ds ds ds Replikácia lineárnej ds v bunke eukaryí V jednom chromozóme je niekoľko miest začiatku replikácie ds.

24 I. II. III. IV. Prehľad syntézy (replikácie) Replikácia je enzymaticky katalyzovaný proces vytvorenie dvoch kópií molekúl syntézou polynukleotidov na reťazcoch rozpletenej dvojreťazcovej (ds) semikonzervatívnym spôsobom. I. Replikácia kružnicovej ds v bunke baktérie predchádza deleniu bunky. II. Replikácia ds v bunke eukaryí pred nepriamym delením jadra a bunky. III. Replikácia ds vírusu v bunke baktérie. Bunka replikuje ds vírusu. IV. Replikácia ds v skúmavke. Polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) sa na denaturovaných reťazcoch syntetizujú krátke ds.

25 Syntéza RNA Základné črty mechanizmu RNA syntézy 1. Predloha polynukleotidového reťazca. 2. Určený presný začiatok syntézy RNA smer syntézy RNA. 4. Určený presný koniec syntézy RNA.

26 RNA polymeráza Escherichia coli RNA polymeráza (RNA poly) má päť podjednotiek: dve RNA alfa (α) podjednotky, RNA beta (β a β ) podjednotky a RNA sigma (σ) podjednotka. RNA sigma podjednotka je významná pri rozlišovaní iniciačného miesta transkripcie a pri ovládaní rozpletenej dvojzávitnice. Katalýzu syntézy RNA zabezpečujú zostávajúce štyri podjednotky, tvoriace jadro polymerázy. Holoenzým, funkčný enzým RNA poly, je zložený z jadra polymerázy a sigma faktora.

27 Triedy RNA polymeráz eukaryí V bunkách eukaryí sú tri triedy RNA polymeráz (RNA poly), RNA poly I, II, III. Každá RNA poly má dve veľké a dve menšie podjednotky. Dve veľké podjednotky sú podobné RNA beta (β a β ) podjednotkám Escherichia coli. Dve menšie podjednotky sú podobné RNA alfa (α) dodjednotkám Escherichia coli. RNA poly eukaryí nemajú podjednotku podobnú RNA sigma (σ) podjednotke RNA poly Escherichia coli. Iniciáciu transrkripcie zabezpečujú iné bielkoviny, transkripčné faktory. RNA poly I, II, III zabezpečujú syntézu odlišných tried RNA.

28 3 A Čiastočne rozpletená molekula ds pri syntéze RNA. G A C T /RNA G 3 dgtp C G RNA Syntéza RNA Na reťazcoch rozpletenej ds sa podľa párovania báz A U a G C viažu nukleozidtrifosfáty, adenozíntrifosfát (ATP), cytidíntrifosfát (CTP), guanozíntrifosfát (GTP) a uridíntrifosfát (UTP). Nukleotidy sa navzájom viažu fosfodiesterickou väzbou. (Vľavo). Syntézou RNA vzniká molekula RNA. Na molekule sa vodíkovými väzbami medzi bázami obnoví dvojzávitnica. (Vpravo).

29 I. II. III. IV. RNA c RNA ds RNA RNA ds ds Syntéza ribonukleovej kyseliny (RNA) Syntéza RNA je enzymaticky katalyzovaný proces vytvorenia jednej kópie molekuly polynukleotida na jednom reťazci rozpletenej dvojreťazcovej (ds) enzýmom RNA polymerázou závislou na alebo na predlohe RNA enzýmom RNA polymerázou závislou na RNA. I. Syntéza RNA podľa predlohy ds v bunke baktérie. II. Syntéza RNA podľa predlohy ds v jadre bunky eukaryí. Molekula RNA je zostrihom upravená. III. Syntéza RNA vírusu podľa predlohy RNA v bunke. Syntézu RNA katalyzuje enzým RNA polymeráza závislá na RNA. IV. Izolovaná RNA je v skúmavke spätne prepísaná na komplementárnu c, ktorá je predlohou pre syntézu ds. Nepriama syntéza RNA.

30 Organizácia informačných molekúl v nebunkových biologických systémoch (NBS) Vírusy a satelity ds, lineárna alebo kružnicová. ss, jedna, dve alebo viac kružnicových molekúl. dsrna, jedna alebo viac lineárnych molekúl. ssrna, jedna alebo viac lineárnych, pričom molekuly môžu byť (+) ssrna, (-) ssrna. Viroidy ssrna, kružnicová molekula.

31 Chromozóm Nukleová kyselina s funkčnými génmi "nosič génov genofor. Chromozóm v bunke baktérií tvorí do kruhu uzavretá, bez podporných bielkovín. V jadre bunky sú chromozómy tvorené chromatínom, čo sú, históny a iné bielkoviny. Základnou jednotkou špiralizácie chromatínu je nukleozóm.

32 Chromozóm v bunke baktérie Bunka s chromozómom. Chromozóm nemá podporné bielkovinové štruktúry.

33 2 nm Dvojzávitnica 11 nm Nukleozóm 30 nm Solenoid Jednotkové vlákno 300 nm Chromozóm 1400 nm Úrovne špiralizácie chromatínu v jadre bunky eukaryí

34 A 3 Nukleozómy G A C T Bunka protist C G 3 ds Organely bunky Lineárna a kružnicová ds Organizácia genómov v bunke eukaryí Bunka eukaryí má v organelách ds rozdielne organizovanú. V jadre bunky je ds vinutá okolo histónov (bielkoviny) do útvarov nazvaných nukleozómy. Ďalšou špiralizáciou nukleozómov sa tvorí vlákno chromozómu. Lineárna alebo kružnicová molekula ds chloroplastov a mitochondrií je bez podporných bielkovinových štruktúr.

35 Ďakujem za pozornosť