replikačná vidlica (ori), jednosmerná-dvojsmerná replikácia

Transcript

1 P4/1 Replikácia bakteriálneho (prokaryotického) genómu replikačná vidlica (ori), jednosmerná-dvojsmerná replikácia Dvojsmerná replikácia kruhovej chromozómovej DNA

2 P4/2 1. Iniciácia replikácie: rozoznanie miesta ori replikačnými proteínmi a vytvorenie replikačnej vidlice 2. Elongácia (predlžovanie) DNA reťazcov: pripájanie deoxyribonukleozid - 5 monofosfátov k 3 - koncu syntetizujúceho sa reťazca na matricovom reťazci 3. Terminácia replikácie: zakončenie replikácie príslušného replikónu v mieste ter, väzbou špecifického proteínu Tus nastane inhibícia helikázy, čím sa zastaví tvorba replikačnej vidlice Enzýmy podieľajúce sa na replikácii: DNA-polymerázy, DNA-ligáza, DNA-primáza, DNA-gyráza, DNA-helikáza

3 P4/3 DNA polymerázy: enzýmy katalyzujúce syntézu DNA z deoxibonukleozidfosfátov za prítomnosti DNA- alebo RNA-priméru, DNA-riadené-DNA-polymerázy (DNA-dependentné-DNA-polymerázy), polymerizácia musí začať vždy od 3 -konca krátkeho oligonukleotidu DNAalebo RNA - priméru. DNTP n + DNA n = 2 DNA n + npp an DNA-polymeráza I (Kornbergov enzým): m.h , 600N/min., 400 molekúl v jednej bunke E.coli, DNA-primér, obsahuje aj 5-3 a 3-5 exonukleázovú aktivitu, DNA-polymerázy A. Katalyzuje replikáciu DNA v medzerách, ktoré zostaly medzi Okazakiho fragmentami, zároveň odstraňuje RNA-priméry svojou 5 -exonukleázovou aktivitou DNA-polymeráza II: m.h , okrem polymerizačnej aktivity má aj 5-3 a 3-5 exonukleázovú aktivitu, DNA-polymerázy B DNA- polymeráza III: m.h , je zložená z viacerých monomérov, komplexný enzým dosahuje rýchlosť polymerizácie 500 N/s, replikuje sa ním celá molekula DNA DNA-ligáza (polydeoxyribonukleotidsyntetáza): katalyzuje ligáciu polynukleotidov (vznik fosfodiesterovej väzby medzi 5 - koncom a 3 koncom reťazcov alebo fragmentov), spája Okazakiho fragmenty do súvislého polynukleotidového reťazca DNA-primáza (DnaG - proteín, DNA-riadená RNA-polymeráza): katalyzuje v spojení s primozómom syntézu RNA-primérov (oligoribonukleotidov), od ktorých 3 - koncov začína syntéza krátkych polydeoxiribonukleotidov - Okazakiho fragmentov, katalytický účinok je aktivovaný DnaB - proteínom DNA-helikázy: katalyzujú odvíjanie komplementárnych reťazcov DNA v smere 5-3 kde prebieha syntéza Okazakiho fragmentov (ruší vodíkove väzby, zároveň hydrolyzuje nukleozid trifosfáty), helikáza I, II, III, IV, Rep-proteín, n, -proteín, DnaB-proteín, RecBCD-enzým, UvrAB-komplex DNA-gyráza: topoizomeráza II, počas semikonzervatívnej replikácii prevádza pred replikačnou vidlicou kladné nadzávitnice na záporné

4 P4/4 DNA-polymeráza III, PolIII * a-monomér- katalyzuje polymerizáciu (8N/s), nemá exonukleázovú aktivitu e-monomér exonukleázová aktivita q-(théta) monomér stimuluje účinok e- exonukleáz g-monomér- viaže ATP katalytické jadro polymerázy: a-e-q, slabá polymerizačná reakcia, spojením dvoch jadier pomocou t- monomérov vznikne dimér (PolIII * ) s väčšou procesivitou (20N/s). naviazaním monomérov d, d, c, y na dimér g vznikne g-komplex d-(sigma) monomér-viaže sa na b d -monomér- stimuluje účinok monoméru b c (chí) monomér- viažu sa neho proteíny SSB y (psí)monomér- tvorí mosty medzi g a c b-svorka (posuvná svorka) zvyšuje procesivitu PolIII *, je zložená z dvoch jednotiek b, obopína dsdna a RNA primér, posúva sa za katalytickým jadrom a drží pohromade syntetizovaný reťazec DNA, svorka sa naviaže na reťazec DNA pomocou g-komplexu (g 2 dd cy, hydrolyzuje ATP a nakladá b-svorku v mieste RNA-primérov). bakteriálna bunka obsahuje molekúl Pol III 500N/s

5 P4/5 Semidiskontinuálna syntéza dsdna pri replikácii...jeden reťazec sa syntetizuje na matrici kontinuálne až do konca (vedúci reťazec), druhý reťazec sa syntetizuje prerušovane cez Okazakiho fragmenty (O.f. krátky polydeoxyribonukleotid syntetizovaný na matricovom reťazci v smere 5-3 od 3 konca RNA priméra, N, opozdený reťazec), syntéza obidvoch reťazcov prebieha súčasne za katalytického účinku DNA-polymerázy III v smere pohybu replikačnej vidlice... ori každý O. f. vyžaduje vlastný RNA-primér, syntéza prebieha proti smeru replikačnej vidlice, RNA-priméry sa odbúrajú v smere 5-3 od 5 konca a vzniknuté medzery sa doplnia na matrici DNA tak, že O. f. sa predlžuje v medzere od 3 - konca Dvojsmerná replikácia bakteriálneho chromozómu

6 P4/6 Iniciácia replikácie Schéma štruktúry oric u E. coli rozpoznávací proces Špecifický proces - jedno miesto oric - raz za generačnú dobu bp musí byť rozpoznané medzi 4, bp. DnaA proteíny rozpoznávajú oric a zároveň ho otvárajú väzbou na AT páry, čím dochádza k narušeniu vodíkových väzieb-denaturácii. DnaB proteín v spoluúčasti DnaC proteínu sa naviaže na začiatok replikácie Odvíjanie reťaca DNA v smere 5-3 za vzniku replikačných vidlíc Väzba SSB proteínov na jednoreťazové DNA, udržujú matricové reťazce DNA v natiahnutom stave, bránia tvorbe vodíkových väzieb a vzniku dsdna

7 P4/7 Syntéza vedúceho reťazca DNA a Okazakiho fragmentov? (11 N) ( N) Ako môže DNA polymeráza III (dimérna molekula s dvomi katalytickými jadrami), ktorá sa pohybuje v smere replikačnej vidlice a v tomto smere syntetizuje aj vedúci reťazec DNA zároveň syntetizovať aj Okazakiho fragmenty, ktoré sa predlžujú v opačnom smere?

8 P4/8 Koordinácia syntézy vedúceho reťazca so syntézou Okazakiho fragmentov v smere pohybu replikačnej vidlice Predpokladaný mechanizmus: vytvorenie slučky Proces naloženia b-svorky na DNA pomocou g-komplexu

9 P4/9 a-monomér katalyzuje polymerizáciu (8N/s), nemá exonukleázovú aktivitu spojením dvoch jadier pomocou t-monomérov vznikne dimér (PolIII * ) s väčšou procesivitou (20N/s) naviazaním monomérov d, d, c, y na dimér g vznikne g-komplex b-svorka sa posúva za katalytickým jadrom a drží pohromade syntetizovaný reťazec DNA

10 P4/10 Procesivita DNA-polymerázy III v replikačnej vidlici Syntéza Okazakiho fragmentu trvá 1-2 sekundy, v bakteriálnych bunkách je dostatok molekúl b- svoriek, aby celý proces mohol prebiehať kontinuálne V procese syntézy Okazakiho fragmentov Pol III "skáče" medzi dvoma b svorkami, tj. medzi tou, ktorá je na konci O. f., ktorého syntéza skončila a tou, ktorá bola naložená na nový RNA-primér

11 P4/11 Tvorba súvislého reťazca z Okazakiho fragmentov

12 P4/12 Replikácia plazmidovej kruhovej DNA (obvod bakteriálneho chromozómu 1 mm, obvod F -plazmidu 31-32mm) je semikonzervatívna, semidiskontinuálna, väčšinou dvojsmerná Rep-proteín hydrolyzuje jednu fosfodiesterovú väzbu, čím sa uvoľní 5 -koniec pozitívneho reťazca, ktorý je vytlačovaný z kružnice s 3 koncom novo syntetizovaného reťazca Rep-proteín hydrolyzuje ešte jednu fosfodiesterovú väzbu v mieste ori kde sa spája vytlačený reťazec s novosyntetizovaným reťazcom Syntéza nového opozdeného reťazca cez Okazakiho fragmenty sa realizuje pomocou bunkových proteínov

13 P4/13 Replikácia konjugatívnych plazmidov počas konjugácie

14 P4/14 Replikácia eukaryotického genómu zvláštnosti replikácie chromozómovej (jadrovej) dsdna v prebieha len v S-fáze bunkového cyklu, vo fáze G 1 a G 2 prebieha len transkripcia a translácia v ndna predstavuje veľký súbor replikónov (každý má svoje ori), každý replikón sa replikuje len jedenkrát, nie súčasne ale v určitom poradí Eukaryotické DNA-polymerázy: v DNA-polymeráza a - v komplexe s DNA-primázou katalyzuje syntézu Okazakiho fragmentov pri replikácii ndna, nevyznačuje sa 3 fi5 -exonukleázovou aktivitou v DNA-polymeráza b - uplatňuje sa pri syntéze krátkych reťazcov pri reparácii DNA v DNA-polymeráza g - katalyzuje syntézu mitochondriálnej DNA v DNA-polymeráza d - syntéza vedúceho reťazca, dokončuje syntézu opozdeného reťazca, 5 fi3 - polymerázová a 3 fi5 - exonukleázová aktivita, väzba na proliferačný bunkový antigén (PCNA-proteín) v DNA-polymeráza e - neznáma funkcia

15 P4/15 Replikačná vidlica Nukleozóm je základná jednotka chromatínu: oktamér histónov (H2A, H2B, H3, H4) 2, jednu molekulu H1, 200 bp úsek DNA, ktorý tvorí dve otáčky okolo histonóveho oktaméru

16 P4/16 Priebeh replikácie eukaryotickej jadrovej dsdna Aktivácia iniciácie replikácie viažu sa sem proteíny s helikázovou, DNA-polymerázovou aktivitou Súbor proteínov zúčastňujúcich sa v mieste ori iniciácie replikácie sa označuje ako orizóm

17

18 P4/17-1 Porovnanie zložiek replizómu prokaryotických a eukaryotických buniek Biologický význam kružnicových molekúl dsdna, spočíva v tom že sa zreplikujú celé, bez skracovania ako to môže byť u lineárnych molekúl ds DNA. Replikácia kružnicového bakteriálneho chromozómu končí v bode, kde sa konce replikačnej vidlice zídu.

19

20 Nie je jasný mechanizmus, ktorý zaisťuje to, že na 3 -konci zostane segment pôsobiace ako primer pre ďalšiu replikáciu Telomeráza pôsobí tak, že sa prostredníctvom svojej RNA-zložky komplementárne spojí s primérom na 3 -nedoreplikovanom konci. S RNA sa potom komplementárne spájajú ďalšie nukleotidy, napr. vytvorením sekvencie TTGGGG (Tetrahymena thermophila), ktorej tamdemová repetícia sa potom vytvorí tak, že prichádza k niekoľkonásobnej tranlokácii telomerázy.

21 Telomeráza sa vyskytuje v rýchle deliacich sa bunkách (prvoky, kvasinky), nevyskytuje sa v somatických bunkách cicavcov, vyskytuje sa však v pohlavných, embryonálnych a tiež v nádorových bunkách 3 násobná translokácia Novo nahradené nukleotidy sú vyjadrené malými písmenami Telomerické sekvencie: v niektorých somatických bunkách človeka sa v závislosti na veku dľžka telomér skracuje (neobsahujú telomerázu). Skracovaním dľžky telomerických sekvencií je indukovaný opravný mechanizmus DNA, ktorým sa zastavuje bunkový cyklus (hypotéza). Telomeráza je však potrebná, aby mohlo bunkové delenie prebehnúť. Prítomnosť telomerázy v rakovinových bunkách človeka túto hypotézu podporuje. Mohlo by zastavenie aktivity telomerázy v týchto bunkách zapríčiniť tiež zastavenie ich delenia?

22 P4/21 Replikácia mtdna cicavcov ( N) D-šmyčka je oblasť DNA v ktorej sa páruje krátky fragment DNA-primér s materským reťazcom, pričom vytesňuje rodičovský reťazec

23 Kontrolné otázky: 1. Charakterizujte enzýmy, ktoré sa podieľajú na replikácii bakteriálneho genómu 2. Vysvetlite mechanizmus replikácie bakteriálneho genómu 3. Replikácia eukaryotického genómu a enzýmy, ktoré sa na nej podieľajú 4. Vysvetlite mechanizmus zakončenia replikácie lineárnej ds DNA.