ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΩΝ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΩΝ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΟΥ TNF-α ΣΤΗ ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ ΗΣΑΙΑ Β. ΣΥΜΕΩΝΙΔΟΥ ΚΤΗΝΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

2

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΩΝ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΩΝ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΟΥ TNF-α ΣΤΗ ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ ΗΣΑΙΑ Β. ΣΥΜΕΩΝΙΔΟΥ ΚΤΗΝΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΟΥ ΕΚΠΟΝΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΣΙΤΙΚΩΝ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ ΤΗΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Σ. Φρύδας Καθηγητής Επιβλέπων Μ.Χατζηστυλιανού Αν. Καθηγήτρια Μέλος Συμβουλευτικής Επιτροπής Η. Παπαδόπουλος Επικ. Καθηγητής Μέλος Συμβουλευτικής Επιτροπής Μ. Παπαζαχαριάδου Αν. Καθηγήτρια Μέλος Μ. Παπαναστασοπούλου Επικ. Καθηγήτρια Μέλος Κ. Αδαμαμά Μωραΐτου Επικ. Καθηγήτρια Μέλος Σ. Λαυρεντιάδου Λέκτορας Μέλος

4

5 Αφιερώνεται στους γονείς μου ως ελάχιστο δείγμα ευγνωμοσύνης για όσα μου έχουν προσφέρει

6

7

8 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ. 1 ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ A. Η λεϊσμανίωση στο σκύλο (ΛΣ) Εισαγωγή Επιζωοτιολογικά δεδομένα Παθογένεια Κλινική εικόνα - πρόγνωση Εργαστηριακά ευρήματα Διάγνωση της ΛΣ Παρασιτολογική εξέταση (άμεση μικροσκόπηση) Ορολογικές μέθοδοι Μοριακές μέθοδοι (αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης ή PCR) Άλλες μέθοδοι Θεραπεία Ανθεκτικότητα και ευαισθησία στη μόλυνση.18 Β. Η ανοσιακή απόκριση στη ΛΣ Μηχανισμοί επιβίωσης του παρασίτου Ανοσιακή απόκριση του ξενιστή Φυσική ανοσία Επίκτητη ανοσιακή απόκριση Κυτταρική ανοσιακή απόκριση Χυμική ανοσιακή απόκριση Κυτταροκίνες Δίκτυο κυτταροκινών στη ΛΣ Ο Παράγοντας Νέκρωσης Όγκων-άλφα (TNF-α) Ο ΤΝF-α στη λεϊσμανίωση Το γονίδιο του ΤΝF-α...41

9 4.3 Το γονίδιο του ΤΝF-α στο σκύλο Η πρωτεΐνη Slc11a1 (solute carrier family 11 member 1) ή Nramp1 (Natural resistance associated macrophage protein) Το γονίδιο της πρωτεΐνης Slc11a Ανοσογενετική Μονονουκλεοτιδικοί Πολυµορφισµοί Μελέτη των µονονουκλεοτιδικών πολυµορφισµών και ασθένειες.51 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ..52 ΜΕΡΟΣ ΔΕΥΤΕΡΟ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ...53 Α. Ομαδοποίηση των σκύλων Κριτήρια συμμετοχής των σκύλων στη μελέτη Στοιχεία ταυτότητας και ιστορικό σκύλων Κλινική εξέταση Αιμοληψία και χειρισμός των δειγμάτων αίματος Γενική εξέταση αίματος Βιοχημικές εξετάσεις Παρασιτολογική εξέταση για Leishmania sp. σε επιχρίσμα λεμφογαγγλίου Ορολογικές εξετάσεις για Leishmania sp Άλλες ορολογικές και κυτταρολογικές - παρασιτολογικές μέθοδοι Ανάλυση ούρων...60 Β. Τεχνικές μοριακής βιολογίας Απομόνωση DNA από ολικό αίμα Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) Ένθετη (nested) Ημιένθετη (semi-nested) PCR..64

10 Γ. Slc11α Επιλογή τμήματος του γονιδίου Slc11α1 προς ενίσχυση Πολλαπλασιασμός τμήματος του γονιδίου Slc11α1 με την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) Ανάλυση των προϊόντων της PCR με ηλεκτροφόρηση Μέθοδος ανάλυσης Πολυμορφισμού του μήκους των Περιοριστικών Θραυσμάτων (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) RFLP ανάλυση με την ενδονουκλεάση περιορισμού Hpy188I για τη διερεύνηση του SNP1 T151C RFLP ανάλυση με την ενδονουκλεάση περιορισμού Bsp1286Ι για τη διερεύνηση του SNP2 A180G RFLP ανάλυση με την ενδονουκλεάση περιορισμού AciI για τη διερεύνηση του SNP3 G318A Δ. TNF-α Προσδιορισμός της αλληλουχίας 1395 ζβ ανοδικά του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης (Open Reading Frame, ORF) του γονιδίου του TNF-α στο σκύλο Aλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του προϊόντος της PCR Ανάλυση των προϊόντων της PCR με ηλεκτροφόρηση Καθαρισμός των προϊόντων της PCR για τον προσδιορισμό της νουκλεοδιτικής αλληλουχίας Ποσοτικοποίηση των καθαρισμένων προϊόντων της PCR Προσδιορισμός της αλληλουχίας των βάσεων του DNA (DNA sequencing) και πολλαπλή στοίχιση των αλληλουχιών (multiple alignment) 81 Ε. Μέθοδοι στατιστικής Ανάλυσης...82 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Α. Slc11α Πολλαπλασιασμός τμήματος του γονιδίου Slc11α1 με την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) - Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης...83

11 2. Αποτελέσματα RFLP Hpy188I ανάλυσης για τη διερεύνηση του SNP1 T151C και συσχέτισή του με την ανθεκτικότητα ή την ευαισθησία στη μόλυνση Αποτελέσματα RFLP ανάλυσης Bsp1286Ι για τη διερεύνηση του SNP2 A180G και συσχέτισή του με την ανθεκτικότητα ή την ευαισθησία στη μόλυνση Αποτελέσματα RFLP AciI ανάλυσης για τη διερεύνηση του SNP3 G318A και συσχέτισή του με την ανθεκτικότητα ή την ευαισθησία στη μόλυνση Συσχέτιση της ανθεκτικότητας και της ευαισθησίας με το φύλο Συσχέτιση των SNPs του γονιδίου Scl11α1 με το φύλο Συσχέτιση των SNPs του γονιδίου Scl11α1 με την κλινική συμπτωματολογία Hardy Weinberg Ανισορροπία σύνδεσης 95 Β. TNF-α Ενίσχυση τμήματος του γονιδίου TNF-α με την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) - Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης Ανίχνευση πολυμορφικών θέσεων στην αλληλουχία του TNF-α Θέση Θέση Θέση Θέση Συσχέτιση των διαφορετικών γενότυπων των επισημασμένων πολυμορφικών θέσεων στο γονίδιο του TNF-α με το φύλο Συσχέτιση των διαφορετικών γενότυπων των επισημασμένων πολυμορφικών θέσεων στο γονίδιο του TNF-α με την κλινική συμπτωματολογία Hardy Weinberg Ανισορροπία σύνδεσης..108 ΣΥΖΗΤΗΣΗ. 111 ΠΕΡΙΛΗΨΗ.123 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΠΙΝΑΚΩΝ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ.150

12

13 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η λεϊσμανίωση αποτελεί ίσως το συχνότερο στην πράξη παρασιτικό νόσημα του σκύλου στην Ελλάδα και στις άλλες παραμεσόγειες χώρες της Ευρώπης. Παρά το γεγονός ότι καταγράφονται υψηλά ποσοστά μόλυνσης των σκύλων στις ενζωοτικές περιοχές, με την εφαρμογή των μοριακών τεχνικών, η κλινική εκδήλωση του νοσήματος δεν παρατηρείται σε όλους τους μολυσμένους σκύλους και ένα μεγάλο ποσοστό των σκύλων παραμένουν ασυμπτωματικοί. Πολλοί παράγοντες ενοχοποιούνται για τον καθορισμό της ανθεκτικότητας ή της ευαισθησίας στο νόσημα. Η έκβαση της ανοσιακής απόκρισης του ξενιστή, και συγκεκριμένα η εκλεκτική ενεργοποίηση ενός εκ των δύο υποκατηγοριών των CD4+ T λεμφοκυττάρων, θεωρείται ένας από τους κυριότερους. Σήμερα, είναι ευρέως αποδεκτό ότι η προστατευτική ανοσία ενάντια στο παράσιτο είναι αποτέλεσμα ανάπτυξης μίας ισχυρής Th1 κυτταρικής απόκρισης. Aντιθέτως, εάν υπερισχύσει η Th2 κυτταρική απόκριση, τότε το νόσημα εκδηλώνεται. Η κυτταροκίνη TNF-α κατέχει κεντρικό ρόλο στην ανοσιακή απόκριση του ξενιστή ενάντια στο παράσιτο. Σκοπός της μελέτης αυτής είναι η διερεύνηση του ρόλου των πολυμορφισμών του γονιδίου του TNF-α στη λεϊσμανίωση στο σκύλο. Παράλληλα διερευνήθηκαν οι πολυμορφισμοί του γονιδίου πρωτεΐνης Slc11a1, επαγωγέα του TNF-α. Στα σημεία που συνιστούν πρωτοτυπία της διδακτορικής αυτής διατριβής, αφού προηγουμένως διερευνήθηκε η μέχρι τη στιγμή του σχεδιασμού της σχετική διεθνής βιβλιογραφία, περιλαμβάνονται η επιδημιολογική μελέτη των πολυμορφισμών του γονιδίου του TNF-α του σκύλου και η συσχέτισή τους με τη λεϊσμανίωση. Το πρώτο μέρος της μελέτης περιλαμβάνει μία βιβλιογραφική ανασκόπηση της λεϊσμανίωσης του σκύλου και της ανοσιακής απόκρισης του ξενιστή, με ιδιαίτερη έμφαση στο ρόλο των κυτταροκινών, του TNF-α και της πρωτεΐνης Slc11a1. Ακόμη γίνεται αναφορά στη σημασία της ανοσογενετικής και στην έννοια των μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών των γονιδίων, καθώς και στην έννοια του μηχανισμού επαγωγής της μεταγραφής των ευκαρυωτικών κυττάρων. Στο δεύτερο μέρος περιγράφονται τα υλικά και οι μέθοδοι που εφαρμόστηκαν και τα αποτελέσματα που προέκυψαν. Aκολουθεί η συζήτηση των αποτελεσμάτων με βάση τα μέχρι σήμερα διεθνή επιστημονικά δεδομένα, η εξαγωγή των ανάλογων συμπερασμάτων, η περίληψη, το παράρτημα πινάκων και οι βιβλιογραφικές πηγές.

14 Η έρευνα αυτή πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Παρασιτολογίας και Παρασιτικών Νοσημάτων της Κτηνιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. με την καθοδήγηση του επιβλέποντα καθηγητή κ. Σταύρου Φρύδα, τον οποίο και ευχαριστώ θερμά για τη συνεχή επιστημονική καθοδήγηση, την άριστη συνεργασία, το ειλικρινές ενδιαφέρον και για την άμεση ανταπόκρισή του, οποτεδήποτε προέκυπτε κάποιο πρόβλημα κατά την εκπόνηση της διδακτορικής διατριβής. Επιπλέον του είμαι ευγνώμων γιατί μου έδωσε μοναδικές ευκαιρίες να γνωρίσω, να συμβουλευτώ και να συνεργαστώ με διακεκριμένους επιστήμονες της Ελλάδας και του εξωτερικού. Θερμές ευχαριστίες θα ήθελα να απευθύνω στην κ. Μ. Χατζηστυλιανού, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. για τις επιστημονικές συμβουλές της και για τη διαρκή συμπαράστασή της καθόλη τη διάρκεια της μελέτης. Οι παρατηρήσεις της, καθώς και οι πολύωρες συζητήσεις μας αποτέλεσαν βασικά ερεθίσματα που με βοήθησαν να οργανώσω και να αναπτύξω τη διατριβή αυτή. Επίσης θα ήθελα να εκφράσω ένα θερμό ευχαριστώ στον κ. Η. Παπαδόπουλο, για την εξαιρετική συνεργασία, την πολύτιμη βοήθεια, τις εύστοχες υποδείξεις του καθόλη τη διάρκεια της μελέτης, καθώς και για τη συνεχή ηθική υποστήριξη. Ιδιαίτερες ευχαριστίες θα ήθελα να απευθύνω στις κ.κ. Μ. Παπαζαχαριάδου, Μ. Παπαναστασοπούλου, Κ. Αδαμαμά-Μωραΐτου και Σ. Λαυρεντιάδου για την κριτική ανάγνωση του κειμένου της παρούσας μελέτης, τις εύστοχες επισημάνσεις και τον εποικοδομητικό επιστημονικό διάλογο. Από τον πρόλογο αυτό δε θα μπορούσα να παραλείψω να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες στον κ. Χ. Δόβα. Η συμβολή του στο σχεδιασμό και στην πραγματοποίηση του γενετικού τμήματος της μελέτης υπήρξε καθοριστική για την ολοκλήρωσή της. Τον ευχαριστώ για τις πολύωρες συζητήσεις, για την πολύτιμη καθοδήγηση αλλά και για τη διαρκή εμψύχωση. Σημαντική ήταν επίσης η βοήθεια της υποψήφιας διδάκτορα της Ιατρικής Σχολής, Παππά Στυλιανής στην πραγματοποίηση της μελέτης, την οποία και ευχαριστώ ιδιαίτερα για τη μύησή μου στις μεθόδους της μοριακής βιολογίας αλλά και για τη βοήθειά της στη στατιστική ανάλυση. Δεν θα μπορούσα να παραλείψω ένα θερμό ευχαριστώ στη Χρύσα Παντζαρτζή για τη βοήθεια που μου πρόσφερε αναφορικά με τη βιοπληροφορική ανάλυση. Ένα θερμό ευχαριστώ στους φίλους, συναδέλφους και υποψήφιους διδάκτορες της Κτηνιατρικής Σχολής, Ηλία Μπουζαλά και Ευαγγελία Χατζηνάσιου για τη διαρκή βοήθειά τους αλλά και για το ιδιαίτερα φιλικό κλίμα στο χώρο του 2

15 εργαστηρίου. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τους φίλους και υποψήφιους διδάκτορες, της Κτηνιατρικής Σχολής, Θωμαή Λάζου και του Τμήματος Βιολογίας, Ανδρέα Κουρελή για τη διαρκή υποστήριξή τους. Θερμά ευχαριστώ επίσης τους φίλους κτηνιάτρους για την ανιδιοτελή και πρόθυμη συμμετοχή τους στην πραγματοποίηση του κλινικού μέρους της μελέτης. Επίσης ευχαριστώ το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών που με στήριξε οικονομικά. Σε αυτό το σημείο, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά μου, τους γονείς μου Βασίλη και Μαργαρίτα και τους θείους μου Αντώνη και Σοφία για την αγάπη και την αμέριστη συμπαράστασή τους, με κάθε δυνατό τρόπο, ιδιαίτερα στις δύσκολες στιγμές κατά τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής αυτής. 3

16 ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ Α. Η ΛΕΙΣΜΑΝΙΩΣΗ ΣΤΟ ΣΚΥΛΟ 1. Εισαγωγή Τα πρωτόζωα που ανήκουν στο γένος Leishmania, φύλο Sarcomastigophora, τάξη Kinetoplastida, οικογένεια Trypanosomatidae (Kassai και συν., 1998) είναι ενδοκυττάρια παράσιτα και αποτελούν το αίτιο της λεϊσμανίωσης των ζώων και του ανθρώπου. Τα περίπου 30 είδη του γένους Leishmania, μπορεί να μολύνουν τον άνθρωπο, το σκύλο, τα άγρια είδη της οικογένειας των Canidae (π.χ. αλεπού, τσακάλι), το άλογο, το πρόβατο, τη γάτα και διάφορα είδη τρωκτικών, πτηνών και ερπετών (Hervas και συν., 1996, Sales και συν., 1998, Van der Lugt και συν., 1992, Ozon και συν., 1998, Barnes και συν., 1993, Slappendel και Ferrer 1998) και έχουν βρεθεί σε όλες τις ηπείρους της γης, εκτός από την Ωκεανία και την Ανταρκτική (World Health Organization 1990, Dereure και συν., 1999). 4

17 Η λεϊσμανίωση στο σκύλο (ΛΣ) προκαλείται από το είδος Leishmania infantum ή από το γενετικά ταυτόσημο είδος L. chagasi (Mauricio και συν., 1999, Mauricio και συν., 2001) και αποτελεί μία δυνητικά θανάσιμη νόσο ενζωοτικού χαρακτήρα σε περιοχές της Ευρώπης, της Αφρικής, της Ασίας και της Αμερικής (Baneth και συν., 2008, Solano-Gallego και συν., 2009). Τα παράσιτα του γένους Leishmania είναι διφασικά πρωτόζωα, που εναλλάσσονται μεταξύ της προμαστιγοφόρου και της αμαστιγοφόρου μορφής και ολοκληρώνουν το βιολογικό τους κύκλο σε σπονδυλωτούς και ασπόνδυλους ξενιστές (Ferrer 1992). Ως ενδιάμεσοι ξενιστές αναφέρονται οι θηλυκές σκνίπες του γένους Phlebotomus sp. στην Ευρώπη, στην Ασία και στην Αφρική και του γένους Lutzomyia sp. στην Αμερική (World Health Organization 1990, Ferrer 1992, Baneth 2005). Οι ωοειδείς αμαστιγοφόρες μορφές (2-5 μm x 1,5-2 μm) χαρακτηρίζονται από την παρουσία του ραβδοειδή κινητοπλάστη, ενός πλούσιου σε DNA μιτοχόνδριου, και παρασιτούν τα μακροφάγα κύτταρα του δέρματος, των βλεννογόνων και των σπλάχνων των τελικών ξενιστών (Trees και Shaw 1999, Διάκου 2000, Killick- Kendrick 2002). Οι αμαστιγοφόρες μορφές προσλαμβάνονται από τη σκνίπα κατά την απομύζηση αίματος, απελευθερώνονται στο πίσω τμήμα του μεσεντέρου, μετατρέπονται στις κινητές προμαστιγοφόρες μορφές, πολλαπλασιάζονται γρήγορα με δυαδική διχοτόμηση και προσκολλώνται σε αρκετά σημεία του τοιχώματος του μεσεντέρου του εντόμου μέσω μίας λιποφωσφογλυκάνης (Volf και συν., 2008). Στη συνέχεια μετατρέπονται στις μολύνουσες μετακυκλικές προμαστιγοφόρες μορφές, οι οποίες μεταναστεύουν στην οισοφαγική βαλβίδα του θωρακικού μεσεντέρου, στο φάρυγγα και στα στοματικά μόρια της σκνίπας (Killick-Kendrick 2002, Volf και συν., 2008). Το παράσιτο μεταδίδεται στους σπονδυλωτούς ξενιστές κατά τη διάρκεια του νύγματος των φλεβοτόμων, κυρίως με αναγωγή από το θωρακικό μεσέντερο στο δέρμα του ξενιστή (Killick-Kendrick 2002, Volf και συν., 2008). Ύστερα από τον ενοφθαλμισμό τους στο δέρμα του τελικού ξενιστή, οι προμαστιγοφόρες μορφές φαγοκυτταρώνονται από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα Langerhans (επιδερμίδα), από τα δενδριτικά κύτταρα (χόριο) και από τα μακροφάγα κύτταρα, όπου μεταπίπτουν στην ωοειδή αμαστιγοφόρο μορφή (Slappendel και Ferrer 1998, Molyneux και Killick-Kendric 1987, Gallego και συν., 2001). Οι θηλυκές φλεβοτόμοι με τη σειρά τους μολύνονται όταν, κατά τη μύζηση αίματος από μολυσμένους σκύλους, προσλαμβάνουν τις αμαστιγοφόρες μορφές. Στην Ελλάδα έχουν περιγραφεί 5

18 12 είδη φλεβοτόμων, που εμφανίζουν έντονη δραστηριότητα από τις αρχές Μαΐου μέχρι το τέλος Νοεμβρίου (Molyneux και Killick-Kendric 1987). Παρόλο που οι σκνίπες είναι οι πιο καλά φυσικά προσαρμοσμένοι μεταδότες του παρασίτου, ένας πιθανός ρόλος στη μετάδοση αποδίδεται και σε άλλα αιματοφάγα αρθρόποδα, όπως οι κρότωνες και οι ψύλλοι. Η μετάδοση του παρασίτου σε άλλα θηλαστικά, μεσω του κρότωνα Rhipicephalus sanguineus και του ψύλλου Ctenocephalides felis, έχει αποδειχθεί σε πειραματικά μοντέλα αλλά όχι στη φυσική μόλυνση (Coutinho και συν., 2005, Coutinho και συν., 2007). Ομοίως, η κάθετη διαπλακούντια μετάδοση στο σκύλο, ενώ έχει αποδειχθεί πειραματικά (Rosypal και συν., 2005) τα δεδομένα σχετικά με τη φυσική μόλυνση παραμένουν περιορισμένα (Andrade και συν., 2002, Diniz και συν., 2005, Rosypal και συν., 2005). Τέλος, δεν μπορεί να αποκλειστεί η πιθανότητα της άμεσης μετάδοσης του παρασίτου είτε κατά τη μετάγγιση αίματος (Baneth 2005, de Freitas και συν., 2006), είτε μέσω των ανοιχτών τραυμάτων και των δερματικών ελκών (Owens και συν., 2001, Baneth 2005, Duprey και συν., 2006). 2. Επιζωοτιολογικά δεδομένα Στην Ελλάδα, στην Πορτογαλία και στις άλλες παραμεσόγειες χώρες, όπου έχουν απομονωθεί τα είδη L. infantum, L. tropica και L. major, το νόσημα έχει ενζωοτικό χαρακτήρα (Tzamouranis και συν., 1984, Belazzoug 1992). Σε οροεπιζωοτιολογικές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν στην Ιταλία, στην Ισπανία, στη Γαλλία και στην Πορτογαλία υπολογίζεται πως o αριθμός των μολυσμένων σκύλων ανέρχεται στα περίπου 2,5 εκατομμύρια (Moreno και Alvar 2002). Επιπλέον, υψηλά ποσοστά μόλυνσης, που αντιστοιχούν σε εκατομμύρια μολυσμένων σκύλων έχουν αναφερθεί σε περιοχές της Νοτίου Αμερικής (Baneth 2005). Η εκτίμηση του αριθμού των μολυσμένων σκύλων παρουσιάζει προβλήματα λόγω της ύπαρξης ασυμπτωματικών φορέων, της μεγάλης διάρκειας επώασης του νοσήματος, που μπορεί να φθάσει έως και τα 7 χρόνια, και της αδυναμίας των ορολογικών δοκιμών να ανιχνεύσουν τα μολυσμένα αλλά μη οροθετικά ζώα (Leontides και συν., 2002, Baneth 2005). Σήμερα ωστόσο με την ευρεία χρήση των μοριακών μεθόδων ανίχνευσης του γενετικού υλικού του πρωτοζώου προκύπτει ότι η συχνότητα της μόλυνσης είναι κατά πολύ υψηλότερη από τη συχνότητα εμφάνισης 6

19 της συμπτωματικής μορφής του νοσήματος (Baneth και συν., 2008, Solano-Gallego και συν., 2001α, Solano-Gallego και συν., 2009). Μελέτες σε χώρες της Μεσογείου έδειξαν υψηλά ποσοστά ορολογικών ή/και PCR θετικών ζώων της τάξης του 67% με 80% (Χαραλαμπίδης και Διάκου 1999, Solano Gallego και συν., 2001α, Leontides και συν., 2002, Baneth και συν., 2008). Πρόσφατες έρευνες επιβεβαιώνουν το γεγονός ότι όταν συντρέχουν συνθήκες που ευνοούν τη μετάδοση του παρασίτου, όπως υψηλές πυκνότητες πληθυσμών φλεβοτόμων και σκύλων, το νόσημα εξαπλώνεται γρήγορα και η συχνότητα της μόλυνσης αγγίζει το 97,3% (Oliva και συν., 2006, Baneth και συν., 2008). Η πρόσφατη αύξηση της εμφάνισης κρουσμάτων σε μη ενζωοτικές περιοχές, όπως η Ολλανδία, η Γερμανία και το Ηνωμένο Βασίλειο, αποδίδεται κυρίως στη μόλυνση των σκύλων κατά τη διάρκεια παραμονής τους σε ενζωοτικές περιοχές καθώς και στην εισαγωγή σκύλων από ενζωοτικές περιοχές της Νοτίου Ευρώπης, ενώ δεν αποκλείεται και η ύπαρξη αυτοχθόνων εστιών της L. infantum στη Βόρεια και στην Κεντρική Ευρώπη (Trees και Shaw 1999, Teske και συν., 2002, Gothe και συν., 1997, Shaw και συν., 2009). Αναφορικά με τη δημόσια υγεία, σήμερα είναι ευρέως αποδεκτό ότι ο σκύλος αποτελεί την κύρια δεξαμενή του παρασίτου στη φύση και υπεισέρχεται άμεσα στην επιδημιολογία ορισμένων μορφών της ανθρώπινης λεϊσμανίωσης σε διάφορες περιοχές του πλανήτη (ζωοανθρωπονόσος) (WHΟ 1990, Baneth και συν., 2008, Solano-Gallego και συν., 2009). Η παρουσία των μολυσμένων σκύλων σε κατοικημένες περιοχές σαφώς σχετίζεται με τη μετάδοση του νοσήματος στον άνθρωπο. Ωστόσο η ιδιοκτησία ενός μολυσμένου σκύλου δε φαίνεται να αυξάνει σημαντικά την πιθανότητα μόλυνσης των ιδιοκτητών σε περιοχές, όπου το νόσημα ενζωοτεί (Solano-Gallego και συν., 2009). 3. Παθογένεια Συνοπτικά η παθογόνος δράση της L. infantum συνίσταται α) στη διατάραξη της ομοιοστασίας (pη, ιοντικό φορτίο) του περιβάλλοντος ιστού, όταν κατά τη λύση των μολυσμένων κυττάρων απελευθερώνονται τοξικά ένζυμα και ελεύθερες ρίζες, β) στην παρατεταμένη ενεργοποίηση των φυσικών κυτταροτοξικών κυττάρων μέσω των κυτταροκινών των ενεργοποιημένων ανοσοαρμόδιων κυττάρων, γ) στην ανάπτυξη των αντιδράσεων υπερευαισθησίας και δ) στη χρόνια υψηλή συγκέντρωση 7

20 ανοσοσυμπλόκων στην κυκλοφορία του αίματος και στα όργανα του σώματος (Baneth και συν., 2008, Reis και συν., 2009). 4. Κλινική εικόνα πρόγνωση Η ΛΣ είναι ένα πολυσυστηματικό νόσημα με χρόνια εξέλιξη, που εκδηλώνεται με ευρύ φάσμα παθολογικών καταστάσεων και κλινικών συνδρόμων, των οποίων ο συνδυασμός και ο βαθμός έντασης χαρακτηρίζονται από μεγάλη ποικιλομορφία (Ciaramella και συν., 1997, Koutinas και συν., 1999β). Ο χρόνος επώασης του νοσήματος ποικίλλει από λίγους μήνες έως και 7 χρόνια (Slappendel και Ferrer 1998). Τα συμπτώματα της ΛΣ αποδίδονται κυρίως στη φλεγμονώδη αντίδραση που ακολουθεί την εναπόθεση των ανοσυμπλόκων στους διάφορους ιστούς και λιγότερο στην κοκκιωματώδη φλεγμονή των ιστών, εξαιτίας της άμεσης δράσης του παρασίτου (Engwerda και Kaye 2000). Σε πρόσφατη έρευνα διαπιστώθηκε συσχέτιση μεταξύ της έντασης της κλινικής εικόνας και της παρασιταιμίας (Rodriguez-Cortes και συν., 2007β). Σε μελέτες στις οποίες χρησιμοποιήθηκε η μεθόδος της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο συμβάντων (real-time PCR) αποδείχθηκε η θετική συσχέτιση μεταξύ του παρασιτικού φορτίου στα λεμφογγάγγλια (Manna και συν., 2009α, Alves και συν., 2009), στο δέρμα, στο μυελό των οστών και στο σπλήνα (Reis και συν., 2009) και της έντασης της συμπτωματολογίας. Ανεξαρτήτως της κλινικής εικόνας, ο σπλήνας και το δέρμα αποτελούν τις κυριότερες περιοχές έντονου παρασιτισμού στη ΛΣ (Reis και συν., 2009). Ωστόσο, ως πιο αξιόπιστος δείκτης της κλινικής εικόνας θεωρείται το παρασιτικό φορτίο στο σπλήνα και στο μυελό των οστών (Reis και συν., 2009). Τα συχνότερα αίτια προσκόμισης των προσβεβλημένων σκύλων στον κτηνίατρο είναι η μείωση της όρεξης, η εύκολη κόπωση, η προοδευτική απώλεια του σωματικού βάρους, οι δερματικές και οφθαλμικές αλλοιώσεις, η χρόνια νεφρική ανεπάρκεια, η επίσταξη και η χωλότητα (Ciaramella και συν., 1997, Koutinas και συν., 1999β, Βaneth και συν., 2006). Το συχνότερο εύρημα της κλινικής εξέτασης είναι η περιφερική λεμφογαγγλιομεγαλία, που συναντάται έως και στο 89% των ευαίσθητων σκύλων (Baneth και συν., 2008). Ωστόσο, δε φαίνεται να υφίσταται συσχέτιση μεταξύ του παρασιτικού φορτίου και του τύπου της λεμφαδενοπάθειας καθώς και της βαρύτητας 8

21 των αλλοιώσεων σε άλλα όργανα (Koutinas και συν., 1999β, Baneth και συν., 2008). Η προοδευτική απώλεια του σωματικού βάρους, με ή χωρίς ανορεξία, αποτελεί επίσης συχνό κλινικό εύρημα (Ciaramella και συν., 1997, Koutinas και συν., 1999β, Baneth και συν., 2005). Η συχνότερη δερματική αλλοίωση είναι η αποφολιδωτική δερματίτιδα, που εκδηλώνεται με υποτρίχωση αλωπεκία, ερύθημα ή υπερχρωμία, ψωριόμορφη ή/και πιτυρόμορφη φολίδωση, εφελκίδωση, ξηροδερμία και ξηροτριχία και εντοπίζεται κυρίως στην κεφαλή, στα πτερύγια των αυτιών και στα άκρα (Koutinas και συν., 1993, Koutinas και συν., 1999β). Στις άλλες συνήθεις δερματικές αλλοιώσεις συγκαταλέγονται τα άτονα έλκη (χείλη πτερυγίων των αυτιών, οστέϊνες προεξοχές ή σημεία συμπίεσης, βλεννογονοδερματικά όρια), τα δερματικά οζίδια ή πλάκες, η φλυκταινώδης δερματίτιδα, η υπερκεράτωση των πελματικών φυμάτων ή/και του ακρορρινίου, η παρονυχία και η ονυχογρύπωση (Koutinas και συν., 1993, Ferrer 1999). Σπανίως έχουν αναφερθεί η άσηπτη ή μη οζώδης υποδερματίτιδα και η βλαττιδώδης δερματίτιδα (Font και συν., 1996, Blavier και συν., 2001). Οι παθήσεις των εξαρτημάτων του οφθαλμού και του οφθαλμικού βολβού, οι οποίες εμφανίζονται με συχνότητα 16% έως 80,5% ορισμένες φορές αποτελούν τις μοναδικές κλινικές εκδηλώσεις του νοσήματος (Naranjo και συν., 2005, Peña και συν., 2008). Στις παθήσεις αυτές περιλαμβάνονται η πρόσθια ραγοειδίτιδα, η βλεφαρίτιδα (ελκώδης ή όχι), η φλεγμονή της οφθαλμικής κόγχης, η κοκκιωματώδης επιπεφυκίτιδα, η ξηρή κερατοεπιπεφυκίτιδα, το γλαύκωμα κλειστής γωνίας, η αποκόλληση ή/και ατροφία του αμφιβληστροειδή χιτώνα και η πανοφθαλμίτιδα (Roze 2002, Naranjo και συν., 2005, Peña και συν., 2000, Peña και συν., 2008). Οι αλλοιώσεις αυτές προκαλούνται κυρίως από την εναπόθεση ανοσοσυμπλόκων στα διάφορα ανατομικά στοιχεία του οφθαλμού (Garcia Alonso και συν., 1996, Naranjo και συν., 2005). Με την εξέλιξη του νοσήματος εμφανίζεται μία ποικιλία συμπτωμάτων από το ουροποιητικό σύστημα. Η χρόνια σπειραματονεφρίτιδα οφείλεται στην εναπόθεση ανοσοσυμπλόκων και είναι κυρίως μεμβρανώδους μεσαγγειοϋπερπλαστικού ή μεμβρανοϋπερπλαστικού τύπου (Zatelli και συν., 2003). Εκδηλώνεται με ασυμπτωματική πρωτεϊνουρία, χρόνια νεφρική ανεπάρκεια και σπανιότερα με νεφρωσικό σύνδρομο (Koutinas και συν., 1999α, Nieto και συν., 1992, Costa 2003). Στην πλειονότητα των περιστατικών με ΛΣ, ανεξάρτητα από την εμφάνιση ή όχι πρωτεϊνουρίας, παρατηρείται χρόνια διαμεσοσωληναριακή νεφρίτιδα (Koutinas και 9

22 συν., 1999α, Plevraki και συν., 2006). Ο ρυθμός της σπειραματικής διήθησης, αποτελεί έναν αξιόπιστο δείκτη εκτίμησης της απεκκριτικής λειτουργίας του νεφρού. Μελέτες αναφέρουν χαμηλό ρυθμό σπειραματικής διήθησης σε πρωτεϊνουρικούς, μη αζωθαιμικούς ή ήπια αζωθαιμικούς σκύλους, ενώ σε ορισμένες περιπτώσεις καταγράφηκε σπειραματική υπερδιήθηση (Cortadellas και συν., 2008). Η εγκατάσταση της χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας εκδηλώνεται με απίσχνανση ή καχεξία, κατάπτωση, μυϊκή αδυναμία, πολυουρία/πολυδιψία και σποραδικούς εμέτους (Baneth 2005, Plevraki και συν., 2006). Η χρόνια νεφρική ανεπάρκεια σε συνδυασμό με τον καχεξιογόνο χαρακτήρα του νοσήματος, που συνεπάγεται πολυοργανική ανεπάρκεια, αποτελούν τις κύριες αιτίες θανάτου των σκύλων από τη λεϊσμανίωση (Koutinas και συν., 1999α). Η επίσταξη, μία σημαντική κλινική εκδήλωση της ΛΣ, με συχνότητα που κυμαίνεται από 5 έως 15%, οφείλεται στη χρόνια λεμφοπλασμοκυτταρική ή/και κοκκιωματώδη ρινίτιδα, με ή χωρίς διαβρώσεις και έλκη, σε συνδυασμό με τη θρομβοκυτταροπενία ή/και τη θρομβοκυτταροπάθεια που αποδίδεται στη συνδυασμένη δράση της παραπρωτεϊναιμίας και της αζωθαιμίας (Juttner και συν., 2001, Petanides και συν., 2008). Ορισμένα ζώα παρουσιάζουν χωλότητα και δυσκολία στην ανέγερση και στη μετακίνηση εξαιτίας της πολυαρθρίτιδας, της οστεομυελίτιδας, της ονυχογρύπωσης παρονυχίας ή της υπερκεράτωσης εξέλκωσης των πελματικών φυμάτων (Koutinas και συν., 1993, Wolschrijn και συν., 1996, Koutinas και συν., 1999β). Η διαπιστούμενη προοδευτική συμμετρική ατροφία των μασητήριων μυών, οφείλεται σε χρόνια πολυμυΐτιδα (Vamvakidis και συν., 2000). Η εμφανιζόμενη σπληνομεγαλία συνοδεύεται από αλλαγές στην αρχιτεκτονική δομή του σπληνός, όπως ατροφία των λεμφικών θυλάκιων, αγγειοβρίθια και αυξημένες δικτυωτές ίνες (Santana και συν., 2007). Ομοίως, η ηπατομεγαλία συνοδεύεται από ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις, όπως φλεγμονή της ηπατικής κάψας, μεσολόβια κοκκιώματα, λεμφοπλασμοκυτταρική διήθηση και μερική ίνωση της πύλης του ήπατος (Giunchetti και συν., 2008). Η φλεγμονή ενδέχεται να μεταπέσει σε χρόνια, με πιθανή κατάληξη την κίρρωση του ήπατος (Rallis και συν., 2005) Λιγότερο συχνές εκδηλώσεις του νοσήματος είναι η χρόνια, συνήθως ασυμπτωματική πυοκοκκιωματώδης κολίτιδα και η κοκκιωματώδης εντερίτιδα, το 10

23 νεφρωσικό σύνδρομο και η αγγειΐτιδα από ανοσοσύμπλοκα (Font και Closa 1997, Font και συν., 2004, Adamama-Moraitou και συν., 2007). Η πρόγνωση στη ΛΣ εξαρτάται από την έκταση και το βαθμό έντασης των αλλοιώσεων στα διάφορα όργανα τη στιγμή της διάγνωσης. Η αντιλεϊσμανιακή θεραπεία στις περισσότερες περιπτώσεις βελτιώνει αισθητά την κλινική εικόνα και περιορίζει ή αναστέλλει την εξέλιξη του νοσήματος. Όμως, η διακοπή της θεραπείας συνήθως συνοδεύεται από κλινικές υποτροπές και η μόνιμη παρασιτολογική ίαση δύσκολα επιτυγχάνεται (Baneth και συν., 2005). Για τους σκύλους που προσκομίζονται με τελικού σταδίου νεφρική ανεπάρκεια (ουραιμικό σύνδρομο), κίρρωση του ήπατος (από χρόνια ηπατίτιδα), χρόνια οστεοαρθρίτιδα (από πολυαρθρίτιδα) ή γλαύκωμα κλειστής γωνίας (από ραγοειδίτιδα) η πρόγνωση είναι δυσμενής εκ των προτέρων (Koutinas και συν., 1999β). 5. Εργαστηριακά ευρήματα Στις κυριότερες αιματολογικές διαταραχές συγκαταλέγονται η αναιμία και η θρομβοκυτταροπενία, που εμφανίζονται με συχνότητα 40-70% στο σύνολο των περιστατικών (Ciaramella και συν., 1997, Koutinas και συν., 1999β, Baneth και συν., 2005). Η αναιμία είναι συνήθως μη αναγεννητική, ορθόχρωμη και ορθοκυτταρική και αποδίδεται κυρίως στο χρόνιο φλεγμονώδη χαρακτήρα του νοσήματος και στη χρόνια νεφρική ανεπάρκεια, που συνεπάγεται καταστολή της ερυθροποίησης. Η αναιμία επιδεινώνεται στα περιστατικά όπου συνυπάρχουν οξεία ή χρόνια αιμορραγία κυρίως λόγω της επίσταξης, ανοσολογικής αιτιολογίας αιμόλυση των ερυθροκυττάρων και μυελοκαταστολή (Koutinas και συν., 1999β, Plevraki και συν., 2006, Baneth και συν., 2008). Η θρομβοκυτταροπενία οφείλεται στη φλεγμονή, στον εγκλωβισμό των αιμοπεταλίων στο σπλήνα και στην ανοσολογικής αιτιολογίας καταστροφή των αιμοπεταλίων στο αίμα, γεγονός που επιβεβαιώνεται από την ύπαρξη αντιαιμοπεταλιακών αντισώματων. Σπανιότερα η θρομβοκυτταροπενία οφείλεται στη μυελοκαταστολή (Baneth και συν., 2005, Terrazzano και συν., 2006). Σε μικρό ποσοστό των περιστατικών της ΛΣ αναφέρεται λευκοκυττάρωση (Ciaramella και συν., 1997, Koutinas και συν., 1999β) ή λευκοπενία (Slappendel και Ferrer 1998). 11

24 Ένα από τα συχνότερα εργαστηριακά εύρηματα στη ΛΣ είναι η πολυκλωνική υπεργαμμασφαιριναιμία, που σπάνια παρουσιάζεται ως μονοκλωνική β ή γ και δικλωνική β και γ (Baneth 2005, Baneth και συν., 2005). Η υπεργαμμασφαιριναιμία προκαλεί υπερπρωτεϊναιμία και ενδεχομένως σύνδρομο υπεριξώδους (Groulade και Person 1987, Koutinas και συν., 1999β, Baneth και συν., 2005). Ακόμη παρατηρείται υπολευκωματιναιμία, η οποία έχει ως επακόλουθο τη συχνή μείωση του λόγου λευκωματινών/σφαιρινών στον ορό του αίματος. Η υπολευκωματιναιμία αποδίδεται κυρίως στην έντονου βαθμού πρωτεϊνουρία λόγω της χρόνιας σπειραματονεφρίτιδας και λιγότερο στη μακροχρόνια μείωση της όρεξης ή τη χρόνια ηπατική ανεπάρκεια λόγω της χρόνιας ηπατίτιδας (Ciaramella και συν., 1997, Koutinas και συν., 1999β, Rallis και συν., 2005). Άλλες βιοχημικές διαταραχές, που συνδέονται με την προοδευτική εγκατάσταση της χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας είναι η αύξηση της συγκέντρωσης του αζώτου ουρίας και της κρεατινίνης στον ορό του αίματος, η υπερφωσφαταιμία και οι διαταραχές των ηλεκτρολυτών ή/και της οξεοβασικής ισορροπίας (Ciaramella και συν., 1997, Koutinas και συν., 1999α, Baneth 2005, Plevraki και συν., 2006). Η αυξημένη δραστηριότητα των ηπατικών ή/και των μυϊκών ενζύμων, που εμφανίζονται σπανιότερα, αποδίδονται στη χρόνια ηπατίτιδα και πολυμυΐτιδα αντίστοιχα (Ciaramella και συν., 1997, Koutinas και συν., 1999β, Vamvakidis και συν., 2000, Rallis και συν., 2005). Κατά την ανάλυση των ούρων τα συχνότερα ευρήματα είναι η πρωτεϊνουρία και το χαμηλό ειδικό βάρος, που οφείλονται στη σπειραματονεφρίτιδα και στην προοδευτικά εξελισσόμενη νεφρική ανεπάρκεια (Plevraki και συν., 2006, Koutinas και συν., 1999α). 6. Διάγνωση της ΛΣ Η ΛΣ παρουσιάζει υψηλή συχνότητα εμφάνισης στις ενζωοτικές περιοχές. Ωστόσο η διάγνωση συχνά δεν τίθεται εύκολα. Το γεγονός αυτό οφείλεται στο μεγάλο ποσοστό των σκύλων που παραμένουν ασυμπτωματικοί (αρχικό στάδιο του νοσήματος, μακρά περίοδος επώασης), στην απουσία παθογνωμονικών συμπτωμάτων και στην ύπαρξη άτυπων κλινικών μορφών του νοσήματος (Blavier και συν., 2001, Solano Gallego και συν., 2001α, Gradoni 2002, Lamothe 2002, Baneth και συν., 2005). 12

25 Η εργαστηριακή επιβεβαίωση της μόλυνσης επιτυγχάνεται με τη χρήση παρασιτολογικών, ορολογικών και μοριακών τεχνικών. Στις άλλες μεθόδους που χρησιμοποιούνται, κυρίως για ερευνητικούς σκοπούς, συγκαταλέγονται η καλλιέργεια παθολογικών δειγμάτων, καθώς και οι ανοσολογικές, οι ιστοπαθολογικές, οι ανοσοϊστοχημικές και οι ξενοδιαγνωστικές μέθοδοι (Σαριδομιχελάκης και Κουτίνας, 2002, Miró και συν., 2008). 6.1 Παρασιτολογική εξέταση (άμεση μικροσκόπηση) Η άμεση μικροσκοπική εξέταση για την ανεύρεση των αμαστιγοφόρων μορφών του παρασίτου σε βαμμένα με τη μέθοδο Giemsa επιχρίσματα από οπό λεμφογαγγλίου ή μυελό των οστών χρησιμοποιείται συχνά ως μέθοδος αναφοράς, καθότι παρουσιάζει απόλυτη ειδικότητα (100%) στους συμπτωματικούς σκύλους και είναι ταυτόχρονα εύκολη και ανέξοδη (Gradoni 2002, Saridomichelakis και συν., 2005). Αναφορικά με τους εξεταζόμενους ιστούς η μεθόδος, έπειτα από τη μικροσκοπική εξέταση 1000 οπτικών πεδίων (x1000), παρουσιάζει ευαισθησία έως 93% για τα λεμφογάγγλια και έως 88% για το μυελό των οστών (Saridomichelakis και συν., 2005, Giunchetti και συν., 2008). Ωστόσο η ευαισθησία της μεθόδου σε άλλους ιστούς, όπως το αρθρικό υγρό, ο σπλήνας, το ήπαρ, το δέρμα και το περιφερικό αίμα, παραμένει χαμηλή (Slappendel and Ferrer 1998, Giunchetti και συν., 2008). Στα κυριότερα μειονεκτήματα της άμεσης μικροσκοπικής εξέτασης σε οπό λεμφογαγγλίου ή μυελό των οστών συγκαταλέγονται η χαμηλή ευαισθησία στους ασυμπτωματικούς σκύλους, η ύπαρξη μεγάλου αριθμού σκύλων (>50%) με χαμηλό παρασιτικό φορτίο, ο χρονοβόρος χαρακτήρας της και η απαιτούμενη επαρκής εξοικείωση του εξεταστή (Gradoni 2002, Ciaramella και συν., 1997, Saridomichelakis και συν., 2005, Moreira και συν., 2007). 6.2 Ορολογικές μέθοδοι Οι ορολογικές μέθοδοι βασίζονται στην ανίχνευση των ειδικών αντισωμάτων κατά της L. infantum-chagasi στον ορό του αίματος (Solano Gallego και συν., 2009). Στις ορολογικές μεθόδους περιλαμβάνονται ο έμμεσος ανοσοφθορισμός (IFAT), η μέθοδος του ενζυμο-συνδεόμενου ανοσοπροσδιορισμού (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA), η dot ELISA, η ανταγωνιστική ELISA, η άμεση 13

26 συγκόλληση (DAT), η έμμεση αιμοσυγκόλληση (IHAT) και η ανοσοαποτύπωση κατά Western (Ciaramella και Corona 2003, Baneth και συν., 2008). Στην πράξη, οι πλέον χρησιμοποιούμενες είναι οι μέθοδοι IFAT και ELISA με ευαισθησία που αγγίζει έως και το 100% στους συμπτωματικούς σκύλους (Alvar και συν., 2004, Baneth και συν., 2005). Οι πιθανές διασταυρούμενες αντιδράσεις με πρωτόζωα συγγενικά προς αυτά του γένους Leishmania (π.χ. Trypanosoma cruzi, T. rangeli) περιορίζουν σημαντικά την ειδικότητα των ορολογικών δοκιμών (Porrozzi και συν., 2007). Ωστόσο στην Ευρώπη, όπου το φαινόμενο των διασταυρούμενων αντιδράσεων δεν παρατηρείται, η μείωση της ευαισθησίας των ορολογικών μεθόδων σημειώνεται σε περιστατικά ασυμπτωματικών σκύλων (30%-66%) (Solano-Gallego και συν., 2001β, Leontides και συν., 2002, Porrozzi και συν., 2007), κατά τους πρώτους μήνες μετά τη μόλυνση (41%) (Baneth και συν., 2005), καθώς και σε ορισμένα περιστατικά που εμφανίζουν εντοπισμένες δερματικές αλλοιώσεις (Lamothe 2002). Η ευαισθησία των μεθόδων επηρεάζεται από το είδος του αντιγόνου που χρησιμοποιείται, τη μέθοδο και το όριο του θετικού τίτλου που ορίζει το εκάστοτε εργαστήριο (Gradoni 2002, Miró και συν., 2008). Τα αντιγόνα που κυρίως χρησιμοποιούνται είναι τα διαλυτά εκχυλίσματα προμαστιγοφόρων ή αμαστιγοφόρων μορφών και τα ανασυνδυασμένα αντιγόνα, που περιέχουν συγκεκριμένους επιτόπους του παρασίτου (Miró και συν., 2008). Η χρησιμοποίηση των ανασυνδυασμένων αντιγόνων rk26 (recombinant K26) και rk39 (recombinant K39) του παρασίτου, παρουσιάζει υψηλή ευαισθησία (94% και 100%, αντίστοιχα) για τους συμπτωματικούς σκύλους, αλλά χαμηλή (66%) για τους ασυμπτωματικούς (Scalone και συν., 2002, Mettler και συν., 2005, Porrozzi και συν., 2007). Το ανασυνδυασμένο αντιγόνο ra2 (recombinant A2) εμφανίζει για τους συμπτωματικούς σκύλους χαμηλή ευαισθησία (70%), αλλά για την ανίχνευση των μολυσμένων ασυμπτωματικών σκύλων υψηλή ευαισθησία (88%) και υψηλή ειδικότητα (98%). Τα στοιχεία δείχνουν ότι και οι τρεις ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες (rk26, rk39 και ra2) θα πρέπει να χρησιμοποιούνται παράλληλα για να ανιχνεύονται αποτελεσματικά όλοι οι μολυσμένοι σκύλοι (Porrozzi και συν., 2007). Παρόλο που στους συμπτωματικούς σκύλους η ευαισθησία των παραπάνω μεθόδων είναι μεγαλύτερη, δεν έχει καταγραφεί αντιστοιχία μεταξύ του τίτλου των αντισωμάτων και του βαθμού έντασης της κλινικής εικόνας (Ciaramella και Corona 2003, Σαριδομιχελάκης και Κουτίνας 2002). Το γεγονός αποδίδεται στο μεγάλο 14

27 χρονικό διαστήμα που παρεμβάλλεται μεταξύ της μόλυνσης και της ανίχνευσης των ειδικών αντισωμάτων στον ορό του αίματος (Gradoni 2002). Στην πράξη συχνά χρησιμοποιούνται οι ανοσοχρωματογραφικές μέθοδοι, που προσφέρουν το πλεονέκτημα μίας γρήγορης διάγνωσης. Ωστόσο η αξιοπιστία τους αμφισβητείται και η εκτίμηση του αποτελέσματος των μεθόδων αυτών πρέπει να γίνεται σε συνδυασμό με την κλινική εργαστηριακή εικόνα του ζώου και το αποτέλεσμα της παρασιτολογικής εξέτασης με άμεση μικροσκόπηση ή/και PCR (Σαριδομιχελάκης και Κουτίνας 2002, Mettler και συν., 2005). Μελέτες έδειξαν ότι η ειδικότητα των μεθόδων ήταν ικανοποιητική, ενώ η ευαισθησία τους κυμαινόταν μεταξύ 35% και 76% (Mancianti και συν., 2002, Mettler και συν., 2005, Ferroglio και συν., 2007). 6.3 Μοριακές μέθοδοι (αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης - PCR) Τα τελευταία χρόνια, η πρόοδος της μοριακής βιολογίας οδήγησε στην απλοποίηση και στην ευρεία εφαρμογή της μεθόδου της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR). Με τη μέθοδο αυτή ανιχνεύεται το γενετικό υλικό του πρωτοζώου σε ιστούς μολυσμένων σκύλων. Η PCR είναι εύκολη και γρήγορη μέθοδος και αποτελεί τη μέθοδο εκλογής για τη διαπίστωση των μολυσμένων αλλά οροαρνητικών και ασυμπτωματικών σκύλων, την επιβεβαίωση της κλινικής διάγνωσης σε οροαρνητικούς σκύλους με αρνητικές παρασιτολογικές εξετάσεις και τέλος τη διαπίστωση της παρασιτολογικής ίασης μετά από αντιλεϊσμανιακή θεραπεία (Solano Gallego και συν., 2001α, Reithinger και συν., 2000, Lachaud και συν., 2002, Saridomichelakis και συν., 2005). Η PCR χρησιμεύει και για την ταυτοποίηση των διαφόρων στελεχών του παρασίτου (Διάκου 2000, Cortes και συ. 2004, Quaresma και συν., 2009). Υπάρχουν πολλά πρωτόκολλα PCR, που στοχεύουν στην ανίχνευση διαφόρων γονιδίων στόχων της L. infantum, όπως το γονίδιο rrna, το οποίο κωδικοποιεί το ριβοσωματικό RNA, και τα γονίδια που κωδικοποιούν τον κινητοπλάστη (Lachaud και συν., 2002). H ευαισθησία της μεθόδου επηρεάζεται από τον αριθμό των αντιγράφων του εκάστοτε στοχευομένου τμήματος DNA στο γονιδίωμα του παρασίτου (Miró και συν., 2008). Η PCR που ανιχνεύει το DNA του κινητοπλάστη θεωρείται η πιο ευαίσθητη μέθοδος, επειδή τα γονίδια που κωδικοποιούν τον 15

28 κινητοπλάστη υπάρχουν περίπου σε αντίγραφα, σε αντίθεση με το γονίδιο του rrna, που παρουσιάζεται σε αντίγραφα (Miró και συν., 2008). Ένας ακόμη παράγοντας που επηρεάζει την ευαισθησία της μεθόδου είναι το είδος του χρησιμοποιούμενου βιολογικού υλικού (μυελός των οστών, οπός λεμφογαγγλίου, σπληνικός πολφός, δέρμα και περιφερικό αίμα). Η εφαρμογή της PCR σε περιφερικό αίμα και δέρμα εμφανίζει υψηλά ποσοστά ευαισθησίας της τάξης του 94% και 95% αντίστοιχα (Müller και συν., 2003, Manna και συν., 2004). Ωστόσο, επειδή κατά τη διάρκεια της μόλυνσης το παράσιτο περιορίζεται στους ιστούς, η ευαισθησία της μεθόδου, όπου χρησιμοποιείται περιφερικό αίμα μειώνεται στο 50 70% και το υλικό των βιοψιών από το δέρμα θεωρείται καταλλληλότερο (Manna και συν., 2004, Baneth και συν., 2005). Η χρησιμοποίηση άλλων ιστών, όπως ο οπός λεμφογαγγλίου και ο μυελός των οστών, αυξάνει την ευαισθησία της μεθόδου έως και 100% (Leontides και συν., 2002, Saridomichelakis και συν., 2005), αλλά παρουσιάζει το μειονέκτημα της λήψης του δείγματος με επεμβατικό τρόπο. Τέλος, η PCR σε έκκριμα του επιπεφυκότα παρουσιάζει υψηλή ευαισθησία (92%) και ειδικότητα (100%) και ενδέχεται να χρησιμοποιηθεί σε επιζωοτιολογικές μέλετες, καθώς και στη διάγνωση των κλινικών περιστατικών στην πράξη (Strauss-Ayali και συν., 2004). Προσφάτως έχει βελτιστοποιηθεί και η real-time PCR, μέθοδος που επιτρέπει τη ποσοτική εκτίμηση του παρασιτικού φορτίου. Η real-time PCR που ανιχνεύει το DNA του κινητοπλάστη είναι η πιο ευαίσθητη μέθοδος με δυνατότητα ανίχνευσης εξαιρετικά χαμηλών επίπεδών παρασιτισμού (<1 παράσιτο ανά ml μυελού των οστών ή αίματος) και χρησιμεύει στην παρακολούθηση της ανταπόκρισης των σκύλων στη θεραπεία (Francino και συν., 2006, Manna και συν., 2009α). 6.4 Άλλες μέθοδοι Η ιστοπαθολογική και ανοσοϊστοχημική εξέταση βιοψιών δέρματος ή άλλων ιστών χρησιμεύουν για την επιβεβαίωση της διάγνωσης σε σκύλους με χαμηλό παρασιτικό φορτίο (Moreira και συν., 2007). Η καλλιέργεια δειγμάτων από διάφορους ιστούς σε ειδικά υποστρώματα χρησιμεύει κυρίως στην έρευνα για την ταυτοποίηση του είδους ή/και του στελέχους του παρασίτου (Barrouin-Melo και συν., 2004, Baneth και συν., 2008). Άλλες επιπλέον διαγνωστικές μέθοδοι είναι ο ενοφθαλμισμός σε επίμυες, οι ξενοδιαγνωστικές τεχνικές και ο in vitro 16

29 πολλαπλασιασμός των λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος (Gradoni 2002, Maia και Campino 2008). 7. Θεραπεία Στη ΛΣ προτείνεται η θεραπεία των συμπτωματικών σκύλων με στόχο την κλινική ίαση και τη βελτίωση της ποιότητας της ζώης των σκύλων, την αποκατάσταση των εργαστηριακών διαταραχών και τη μείωση του τίτλου των ειδικών αντισωμάτων (Solano-Gallego και συν., 2009). Παράλληλα, προτείνεται η θεραπεία και των ασυμπτωματικών σκύλων με στόχο την εξουδετέρωση του παρασίτου, τη μείωση του ποσοστού μόλυνσης των φλεβοτόμων και τη μείωση του βαθμού συχνότητας εμφάνισης του νοσήματος (Miró και συν., 2008). Η χρησιμοποίηση των διαφόρων αντιλεϊσμανιακών φαρμάκων, τις περισσότερες φορές, οδηγεί σε βελτίωση της κλινικής εικόνας ή/και σε πλήρη κλινική ίαση. Ωστόσο, μέχρι σήμερα δεν έχει βρεθεί ένα θεραπευτικό πρωτόκολλο, που να επιφέρει την παρασιτολογική ίαση (Noli και Auxilia 2005, Miró και συν., 2008). Οι σκύλοι παραμένουν φορείς του παρασίτου και συχνά παρατηρούνται υποτροπές (Koutinas και συν., 2001, Ikeda-Garcia 2007). Παρόλο που έχουν προταθεί διάφορα θεραπευτικά πρωτόκολλα, τα φάρμακα που κυρίως χρησιμοποιούνται είναι η αντιμονιούχος μεγλουμίνη, η αλλοπουρινόλη, ο συνδυασμός τους, η μιλτεφοσίνη και η αμφοτερικίνη Β (Miró και συν., 2008). Η αντιμονιούχος μεγλουμίνη δρα λεϊσμανιοκτόνα, αναστέλλοντας τη δράση των ενζύμων που καταλύουν την οξείδωση του γλυκογόνου και των λιπαρών οξέων στο παράσιτο (Baneth και Shaw 2002). Η αλλοπουρινόλη δρα λεϊσμανιοστατικά, καθότι ενσωματώνεται στο RNA της Leishmania sp. και αναστέλλει τη σύνθεση των πρωτεϊνών της (Plumb 2005, Baneth 2005). Ο συνδυασμός των δύο παραπάνω αποτελεί το φαρμακευτικό πρωτόκολλο εκλογής [αντιμονιούχος μεγλουμίνη (100 mg/kg ΣΒ, υποδόρια, κάθε 24 ώρες, για τουλάχιστον 3 4 εβδομάδες) και αλλοπουρινόλη (10 mg/kg ΣΒ, από το στόμα, κάθε 12 ώρες, για 6 μήνες)] (Denerolle και Bourdoiseau 1999, Baneth και Shaw 2002, Noli και Auxilia 2005). Η χορήγηση του παραπάνω θεραπευτικού σχήματος συνεπάγεται ένα ικανοποιητικό κλινικό αποτέλεσμα και μειώνει σημαντικά την πιθανότητα μελλοντικών υποτροπών. Στον άνθρωπο αποδείχθηκε η ανάπτυξη ανθεκτικών στελεχών του παρασίτου στις πεντασθενείς ενώσεις του αντιμονίου (Croft και συν., 2006). Τα δεδομένα σχετικά με 17

30 την εμφάνιση ανθεκτικών στελεχών του παρασίτου στο σκύλο παραμένουν περιορισμένα, παρόλο που έχει αναφερθεί η εμφάνιση ανθεκτικών στελεχών της L. infantum έναντι της αντιμονιούχου μεγλουμίνης, λόγω επαναλαμβανόμενων θεραπειών (Gramiccia και συν., 1992) ή λόγω υποδοσίας και βραχυχρόνιας θεραπείας (Baneth και Shaw 2002, Solano-Gallego και συν., 2009). Η μιλτεφοσίνη εκδηλώνει την αντιλεϊσμανιακή της δράση στοχεύοντας στο μεταβολισμό των φωσφολιπιδίων και στη σύνθεση της κυτταρικής μεμβράνης του παρασίτου (Murray και Delph- Etienne 2000). Λόγω των επιδράσεων αυτών στις μιτογενείς οδούς του παρασίτου, η μιλτεφοσίνη προκαλεί κυτταρικό θάνατο με μηχανισμό παρόμοιο εκείνου της απόπτωσης (Lux και συν., 1996). Επιπλέον, αυξάνει την παραγωγή μικροβιοκτόνων ελεύθερων ριζών οξυγόνου και μονοξειδίου του αζώτου από τα μακροφάγα (Murray και Delph- Etienne 2000). Επειδή η χορήγησή της στη ΛΣ συνοδεύτηκε από την εμφάνιση παρενεργειών δοκιμάζεται μία χημικά συγγενής με αυτήν ουσία, η αλκυλοφωσφοχολίνη (λιποσωμική ολεϊκή φωσφοχολίνη), η οποία φαίνεται να είναι καλώς ανεκτή από το σκύλο (Baneth και Shaw 2002). Πρόσφατες έρευνες προτείνουν την ταυτόχρονη χορήγηση μιλτεφοσίνης και αλλοπουρινόλης (Manna και συν., 2009β, Miró και συν., 2009). Η αμφοτερικίνη Β δρα λεϊσμανιοκτόνα δεσμεύοντας τις στερόλες της κυτταρικής μεμβράνης και μεταβάλλοντας τη διαπερατότητά της στο ενδοκυττάριο κάλιο και τις άλλες ενδοκυττάριες ουσίες που εξέρχονται στον εξωκυττάριο χώρο (Plotnick 2000). Άλλα φάρμακα που έχουν προταθεί με μέτρια αποτελεσματικότητα είναι η πενταμιδίνη, η αμινοσιδίνη (παρομομυκίνη), η κετοκοναζόλη, το στιβογλυκονικό νάτριο, ο συνδυασμός μετρονιδαζόλης σπιραμυκίνης και ο συνδυασμός μετρονιδαζόλης - ενροφλοξασίνης (Bianciardi και συν., 2004, Noli και Auxilia 2005, Pennisi και συν., 2005, Miró και συν., 2008). 8. Ανθεκτικότητα και ευαισθησία στη μόλυνση Μέχρι σήμερα δεν είναι γνωστοί οι μηχανισμοί που είναι υπεύθυνοι για την ανθεκτικότητα ή την ευαισθησία στη ΛΣ, ούτε ο τρόπος με τον οποίο παράγοντες όπως η ηλικία, το φύλο, η διατροφή, η γενετική ιδιοσυγκρασία του ξενιστή, οι συνυπάρχουσες λοιμώξεις, το περιβάλλον των κυτταροκινών, το παρασιτικό φορτίο, η μολυσματικότητα του στελεχών του παρασίτου και ο τρόπος μετάδοσης μπορούν 18

31 να επηρεάσουν την έκβαση της πορείας του νοσήματος και την εκδήλωση ή όχι της κλινικής συμπτωματολογίας (Solano-Gallego και συν., 2009). Ορισμένοι ερευνητές εκτιμούν ότι υπάρχει προδιάθεση στις φυλές Doberman, Boxer, Cocker spaniel, Rottweiler και German shepherd (Sideris και συν., 1999, Franca-Silva και συν., 2003), ενώ οι νανόσωμοι σκύλοι, καθώς και τα Collie και Ibizian hound θεωρούνται φυλές μειωμένου κινδύνου (Gaskin και συν 2002). Οι σκύλοι της ισπανικής φυλής Ibizan hound, σε σύγκριση με άλλες φυλές που ζουν στην ίδια περιοχή, παρουσιάζουν χαμηλότερη συχνότητα εμφάνισης της συμπτωματικής μορφής του νοσήματος επειδή η ανοσιακή απόκριση των ζώων της φυλής αυτής είναι κυρίως κυτταρικού τύπου (Solano Gallego και συν., 2000). Η ηλικία αποτελεί ένα σημαντικό παράγοντα και τα υψηλότερα ποσοστά συχνότητας εμφάνισης του νοσήματος έχουν αναφερθεί σε σκύλους κάτω των τριών και άνω των οκτώ ετών (Abranches και συν., 1991, Cardoso και συν., 2004). Αναφορικά με το αν οι αρσενικοί σκύλοι προσβάλλονται συχνότερα από τους θηλυκούς υπάρχει διχογνωμία (Solano-Gallego και συν., 2009). Υπάρχουν μελέτες που υποστηρίζουν την υπόθεση ότι υπάρχει προδιάθεση στους αρσενικούς σκύλους (Zivicnjak και συν., 2005, Ciaramella και συν 1997, Zaffaroni και συν., 1999) και άλλες που την απορρίπτουν (Koutinas και συν 1999β, Miró και συν., 2007). Μελέτη σε πειραματική μολύνση σκύλων απέδειξε ότι η οδός χορήγησης του παρασίτου, καθώς και το στάδιο του βιολογικού κύκλου στο οποίο βρίσκεται αποτελούν παράγοντες που καθορίζουν την πορεία του νοσήματος. Ο ενοφθαλμισμός προμαστιγοφόρων μορφών ενδοδερμικά συνεπαγόταν την ανάπτυξη υποκλινικής μόλυνσης, ενώ ο ενοφθαλμισμός αμαστιγοφόρων μορφών ενδοφλέβια, την εκδήλωση βαριάς συμπτωματολογίας (Moreno και Alvar 2002). Η ανοσιακή απόκριση του κάθε σκύλου επηρεάζεται όχι μόνο από κληρονομικούς παράγοντες, αλλά και από τις αντιπηκτικές, αγγειοδιασταλτικές και ανοσορρυθμιστικές (μαξαδιλάνη) ουσίες που ενοφθαλμίζονται στο δέρμα από τις σκνίπες τη στιγμή της αιμομύζησης. Με τον τρόπο αυτό καθορίζεται αν η L. infantum θα προκαλέσει ή όχι κλινική νόσο σε κάποια στιγμή της ζωής του σκύλου (Solano Gallego και συν., 2000, Day 2005). Ένας καθοριστικός παράγοντας για την εκδήλωση ευαισθησίας ή ανθεκτικότητας στη ΛΣ είναι ο τύπος της ανοσιακής απόκρισης των σκύλων που έχουν μολυνθεί από τη L. infantum, ο οποίος φαίνεται ότι προκαθορίζεται γενετικά (Brandonisio και συν., 2000, Baneth 2005, Solano-Gallego και συν., 2009). 19

32 Β. Η ΑΝΟΣΙΑΚΗ ΑΠΟΚΡΙΣΗ ΣΤΗ ΛΣ Στα πρωτοζωικά νοσήματα η ανοσιακή απόκριση εξαρτάται τόσο από το ίδιο το παράσιτο, όσο και από τον ξενιστή (Liese και συν., 2008). Τα πρωτόζωα παράσιτα αναπτύσσουν μηχανισμούς επιβίωσης και τρόπους διαφυγής από την ανοσιακή απόκριση του ξενιστή (Gregory και Olivier 2005). Ο ξενιστής δε, ανάλογα με την ανοσιακή απόκριση που αναπτύσσει και την ανοσοϊκανότητά του, ενδέχεται να εκδηλώσει τη μόλυνση (ευαίσθητος) ή όχι (ανθεκτικός στη μόλυνση) (Gregory και Olivier 2005, Dey και συν., 2007). 1. Μηχανισμοί επιβίωσης του παρασίτου Τα πρωτόζωα του γένους Leishmania διαθέτουν πολυάριθμους μηχανισμούς επιβίωσης και διαφυγής της ανοσίας του ξενιστή (Olivier και συν., 2005). Οι θηλυκές φλεβοτόμοι ενοφθαλμίζουν στους ευαίσθητους σκύλους έναν αριθμό ( ) προμαστιγοφόρων μορφών, ικανό για την πρόκληση του νοσήματος. Μετά από τον ενοφθαλμισμό τα περισσότερα παράσιτα καταστρέφονται στην περιοχή του νύγματος από τους μηχανισμούς της φυσικής ανοσίας (ένζυμα, παράγοντες του συμπληρώματος, φαγοκυττάρωση). Στην αρχική φάση της τοπικής φλεγμονώδους αντίδρασης που προκαλείται συμμετέχουν τα μονοκύτταρα, τα ουδετερόφιλα, τα εωσινόφιλα και τα κύτταρα φυσικοί φονείς (Natural killer cells, NK) (Cotran και συν., 1999). Ένας μικρός αριθμός παρασίτων φαγοκυτταρώνεται από τα πολυμορφοπύρηνα ουδετερόφιλα και κατορθώνει να επιβιώσει ενεργοποιώντας διάφορους μηχανισμούς, όπως η αναστολή των «μονοπατιών» ενεργοποίησης των ουδετεροφίλων και η καθυστέρηση της απόπτωσής τους. Τα μολυσμένα ουδετερόφιλα, που τελικά αποπίπτουν δύο έως τέσσερεις ημέρες μετά τη μόλυνση, χρησιμεύουν ως οχήματα εισόδου του παρασίτου στα μακροφάγα (Laskay και συν., 2008, John και Hunter 2008). Οσες προμαστιγοφόρες μορφές επιζήσουν προσκολλώνται, κυρίως μέσω των CR1 και CR3 υποδοχέων του συμπληρώματος, στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, όπως είναι τα κύτταρα Langerhans (δενδριτικά κύτταρα της επιδερμίδας), τα δενδριτικά και τα μακροφάγα κύτταρα (χόριο), όπου περιέχονται μέσα στα 20

33 φαγολυσοσώματα και μετατρέπονται στις ακίνητες αμαστιγοφόρες μορφές (Mosser και Edelson 1985, Killick-Kendrick και Rioux 2002). Μέσα στο φαγολυσόσωμα, το παράσιτο προστατεύεται από την αποδόμηση απορυθμίζοντας βασικές λειτουργίες των μονοκύτταρων / μακροφάγων και κυρίως τροποποιώντας τη διαδικασία μεταγωγής των μηνυμάτων (Ferrer 2002, Victoir και συν., 2002, Olivier και συν., 2005). Στους μηχανισμούς που επιτρέπουν την επιβίωση του παρασίτου στον ξενιστή περιλαμβάνονται η παθητική προστασία του παρασίτου από αντιλεϊσμανιακούς παράγοντες μέσα στα ασφαλή κύτταρα-στόχους, η ενεργητική καταστολή της σύνθεσης του οξειδίου του αζώτου (NO) στα μακροφάγα, η τροποποίηση των προστατευτικών κυτταροκινών και η αναστολή της έκφρασης των συνδιεγερτικών μορίων από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα με αποτέλεσμα τη μη ενεργοποίηση των ειδικών Τ-λεμφοκυττάρων (Carrera και συν., 1996, Brandonisio και συν 2000, Denkers και Butcher 2005, Olivier και συν., 2005). Ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες που συνεισφέρουν στη διατήρηση του παρασίτου είναι η πρωτεολυτική δράση των ισομορφών της κύριας πρωτεάσης επιφανείας του (Major Surface Protease, MSP), αναφερόμενης και ως γλυκοπρωτεΐνη gp63 (Yao και συν., 2003, Hsiao και συν., 2008). Η gp63 εμπλέκεται πολυεπίπεδα στη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων των μακροφάγων. Ένας μηχανισμός δράσης της είναι η διάσπαση της NF-κB p65 RelA υπομονάδας σε p35 RelA και η σύνθεση p35 RelA /p50 διμερών, γεγονός που συνεπάγεται την αδρανοποίηση ορισμένων λειτουργιών των μακροφάγων, όπως η παραγωγή κυτταροκινών (Gregory και συν., 2008). Ακόμη η πρωτεάση gp63 συμμετέχει στη διασφάλιση της επιβίωσης και του πολλαπλασιασμού του παρασίτου, αναστέλλοντας τα «μονοπάτια» ενεργοποίησης των MAP κινασών (Mitogen-activated Protein kinases) (ERK1/2, p38 και JNK) (Hallé και συν., 2009). Αναλυτικότερα, παρασιτικά μόρια με δράση φωσφατάσης, που εντοπίζονται στη μεμβράνη ή στη θήκη του μαστιγίου, αναστέλλουν τη φωσφορυλίωση και των τριών MAP κινασών (Privé και συν., 2000, Rotureau και συν., 2009). Η παρεμπόδιση της φωσφορυλίωσης συνεπάγεται τη μείωση αφενός της παραγωγής κυτταροκινών (Chandra και Naik 2008) και αφετέρου της μεταγραφής του ενζύμου inos (inducible nitric oxide synthetase), που είναι υπεύθυνο για τη σύνθεση του παρασιτοκτόνου μορίου NO (Mukbel και συν., 2007). 21