ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΧΡΗΣΗ ΜΙΚΡΟΦΥΚΩΝ ΓΙΑ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΩΝ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΠΟΛΥΤΕΧΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΜΗΜΑ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΟΡΩΝ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΧΡΗΣΗ ΜΙΚΡΟΦΥΚΩΝ ΓΙΑ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΩΝ ΟΛΓΑ ΤΣΟΛΧΑ ΑΓΡΙΝΙΟ 2017

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΠΟΛΥΤΕΧΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΜΗΜΑ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΟΡΩΝ ΧΡΗΣΗ ΜΙΚΡΟΦΥΚΩΝ ΓΙΑ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΩΝ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Υποβληθείσα στο Τμήμα Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων του Πανεπιστημίου Πατρών Υπό ΟΛΓΑ Ν. ΤΣΟΛΧΑ Για την απόκτηση του Τίτλου του Διδάκτορα του Τμήματος Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων του Πανεπιστημίου Πατρών ΑΓΡΙΝΙΟ 2017

3 Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής από το Τμήμα Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων της Πολυτεχνικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα. Ν.5343/1932, άρθρο 202

4 Τα φύκη εκδικούνται επειδή τα ώθησαν στο πυρ το εξώτερον, όταν τα 'βαλαν στο ζύγι, με τις μεταξωτές κορδέλες.

5 ΧΡΗΣΗ ΜΙΚΡΟΦΥΚΩΝ ΓΙΑ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΩΝ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ

6 Πρόλογος Πρόλογος Η παρούσα διδακτορική διατριβή με τίτλο «Χρήση μικροφυκών για επεξεργασία αποβλήτων και παραγωγή βιοκαυσίμων» εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Περιβαλλοντικών Συστημάτων του Τμήματος Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων σε συνεργασία με το Εργαστήριο Μικροβιολογίας του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. Η ολοκλήρωση αυτού του έργου επιτεύχθηκε με πολύχρονη, εξαντλητική προσπάθεια και προσωπική αφιέρωση στο αντικείμενο της έρευνας. Από τη θέση αυτή θα ήθελα να ευχαριστήσω ανθρώπους που με βοήθησαν ώστε να φέρω εις πέρας το δύσκολο αυτό έργο. Αρχικά, την επιβλέπουσά μου Αθανασία Τεκερλεκοπούλου για την εμπιστοσύνη, την υπομονή και τη συνεχή επιστημονική καθοδήγηση. Από την αρχή της συνεργασίας μας στάθηκε θερμός υποστηρικτής και συμπαραστάτης στην υλοποίηση των επιστημονικών αναζητήσεων. Η αυθόρμητη συμπαράσταση οδήγησε όχι μόνο σε μια παραγωγική συνεργασία αλλά και στην ανάπτυξη μιας φιλικής σχέσης. Θερμά ευχαριστώ τα μέλη της τριμελούς επιτροπής μου, τον Καθηγητή του Τμήματος Χημικών Μηχανικών του Πανεπιστημίου Πατρών, κ. Δημήτριο Βαγενά καθώς και τον Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, κ. Γεώργιο Αγγελή για τις πολύτιμες συμβουλές και τις προοδευτικές ιδέες τους, καθώς και στην εποικοδομητική συνεργασία μας. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τους αξιότιμους Επίκουρους Καθηγητές από το Τμήμα Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων του Πανεπιστημίου Πατρών, κ. Χρήστο Ακράτο, κ. Γεώργιο Κεχαγιά καθώς και τον κ. Γεώργιο Τσιάμη για την τιμή που μου έκαναν και το χρόνο που αφιέρωσαν με τη συμμετοχή τους στην Επταμελή Επιτροπή Αξιολόγησης της Διδακτορικής μου Διατριβής. Ιδιαίτερα ευχαριστώ οφείλω στην Καθηγήτρια κ. Μαρία Μουστάκα Γούνη από το Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης για την άψογη συνεργασία μας και την πολύτιμη βοήθειά της. Σημαντική συνεισφορά στην διεξαγωγή των πειραμάτων είχαν οι εταιρείες Παπαθανασίου Α.Β.Ε.Ε (Βιομηχανία γάλακτος), Γρίβας Ν.&Ν. Ο.Ε. (Οινοποιείο) και η Παναιγιάλειος Ένωση Συνεταιρισμών (Π.Ε.Σ.) (Τυποποίηση αποξηραμένων i

7 Πρόλογος φρούτων) καθώς χωρίς την χρήση των αποβλήτων τους και την πολύτιμη συνεργασία τους δεν θα ήταν δυνατή η πραγματοποίηση των πειραμάτων της παρούσας διατριβής. Ξεχωριστά ευχαριστώ στους ανθρώπους, υποψήφιους διδάκτορες, μεταπτυχιακούς, φοιτητές και μη, που συνάντησα κατά τη διάρκεια των διδακτορικών σπουδών μου, οι οποίοι αποτέλεσαν συμπαραστάτες και φίλους διαμορφώνοντας ένα ευχάριστο κλίμα συνεργασίας. Τέλος, ευχαριστώ ολόψυχα την οικογένειά μου, Νίκο, Μαρία, Θεοφάνη καθώς και τον Κωνσταντίνο για την υλική υποστήριξη, την αμέριστη συμπαράσταση, την υπομονή και την συνεχή ενθάρρυνσή τους καθ όλη τη διάρκεια της ερευνητικής αυτής προσπάθειας. Ο καθένας με τον τρόπο του ήταν δίπλα μου σε αυτό το μονοπάτι με την διαρκή και ουσιαστική στήριξή του. ii

8 Περίληψη Περίληψη Η αύξηση του πληθυσμού της Γης, η υπέρμετρη κατανάλωση ενέργειας με την συνεχώς απαιτητική αγορά προϊόντων, έχουν οδηγήσει σε σημαντική υποβάθμιση του φυσικού περιβάλλοντος, επιβάλλοντας την εύρεση εναλλακτικών πηγών ενέργειας καθώς και τη χρήση νέων τεχνολογιών που δεν θα επιβαρύνουν την αρμονία των οικοσυστημάτων. Έχει επισήμως πλέον αμφισβητηθεί η εξάρτηση της σύγχρονης κοινωνίας από τα ορυκτά καύσιμα καθώς εξαντλούνται συνεχώς οι φυσικές πηγές και επιδεινώνεται βαθμιαία το φυσικό περιβάλλον. Επίσης, τα υγρά απόβλητα που προκύπτουν από την παραγωγική διαδικασία και κυρίως από τον αγροτοβιομηχανικό τομέα παραγωγής και μεταποίησης προϊόντων απελευθερώνουν σημαντικά ποσά οργανικού και ανόργανου φορτίου, με συνέπεια την αναζήτηση συνεχώς νέων τεχνολογιών για την ευνοϊκότερη προς το περιβάλλον διαχείρισή τους. Συνεπώς, τα μέτρα πρόληψης της ρύπανσης του περιβάλλοντος και η αποτελεσματική χρήση των υλικών και της ενέργειας, καθώς και η χρήση ανανεώσιμων πηγών ενέργειας μπορούν να συμβάλουν σημαντικά στην αποτελεσματική επεξεργασία ή/και μείωση των εκπομπών αερίων καθώς και των υγρών αποβλήτων. Τις τελευταίες δεκαετίες, ιδιαίτερο ενδιαφέρον για την επεξεργασία των υγρών αποβλήτων παρουσιάζουν τα βιολογικά συστήματα επεξεργασίας. Συγκεκριμένα, η τεχνολογία που βασίζεται στη χρήση μεικτών καλλιεργειών μικροφυκών και βακτηρίων χρήζει ιδιαίτερης προσοχής, καθώς η βιομάζα που προκύπτει κατά την επεξεργασία των αποβλήτων θεωρείται αειφόρα πηγή για την παραγωγή βιοκαυσίμων, γεωργικών λιπασμάτων ή ζωοτροφών. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η βιολογική επεξεργασία υγρών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων με χρήση μιξότροφων, μεικτών καλλιεργειών μικροφυκών/κυανοβακτηρίων υπό μη ασηπτικές, αερόβιες συνθήκες, σε εργαστηριακής κλίμακας φωτοβιοαντιδραστήρες διαλείποντος έργου (αιωρούμενης και προσκολλημένης ανάπτυξης), καθώς και η δυνατότητα ταυτόχρονης παραγωγής βιοκαυσίμων (βιοαιθανόλη, βιοντίζελ) από την παραγόμενη βιομάζα. Συγκεκριμένα, διερευνήθηκε η ικανότητα μεικτής καλλιέργειας με κυρίαρχο είδος το χλωροφύκος Choricystis sp. καθώς και της μεικτής καλλιέργειας με κυρίαρχο είδος το κυανοβακτήριο Leptolyngbya sp. ως προς την ικανότητά τους να απομακρύνουν iii

9 Περίληψη οργανικά και ανόργανα συστατικά από διάφορα αγροτοβιομηχανικά απόβλητα. Πραγματοποιήθηκαν σειρές πειραμάτων για τη μελέτη της συμπεριφοράς των μεικτών καλλιεργειών χωρίς ή με προσθήκη (σε διάφορες αναλογίες) υγρών αποβλήτων από διάφορες βιομηχανίες, όπως παραγωγής τυροκομικών προϊόντων, οινοποιείου, τυποποίησης σταφίδας καθώς και μείγμα αποβλήτων οινοποιείουσταφίδας. Με τη χρήση μεικτού αποβλήτου και αποβλήτου τυροκομείου, τα ποσοστά απομάκρυνσης οργανικού φορτίου άγγιξαν το 94% στα πειράματα αιωρούμενης ανάπτυξης ενώ έφτασαν μέχρι και 97% για τα πειράματα προσκολλημένης ανάπτυξης. Ομοίως σημαντικά ποσοστά απομάκρυνσης σημειώθηκαν και για τα θρεπτικά συστατικά ολικού αζώτου και φωσφόρου που κυμάνθηκαν μεταξύ 50100% για το σύνολο των πειραματικών σειρών. Παράλληλα, εξετάστηκε η ικανότητα των μικροφυκών/κυανοβακτηρίων να συσσωρεύουν στη βιομάζα τους λιπίδια. Αξιολογήθηκε η δυνατότητα χρήσης του παραγόμενου από την αιωρούμενη και προσκολλημένη βιομάζα μικροβιακού ελαίου ως πρώτη ύλη για παραγωγή βιοντίζελ (μέσω προσδιορισμού της ποσοστιαίας κατανομής μεθυλεστέρων λιπαρών οξέων σε αυτό). Αν και το προφίλ των λιπαρών οξέων ήταν ποιοτικά κατάλληλο για εφαρμογές βιοντίζελ και στα δύο εφαρμοζόμενα συστήματα, η ποσότητα παραγόμενου ελαίου σημείωσε υψηλότερες τιμές για τα συστήματα προσκολλημένης ανάπτυξης καθώς έφτασε σε ποσοστό 23.2% επί της ξηρής βιομάζας έναντι του 14.8% επί ξηρής βιομάζας για τα αιωρούμενα συστήματα ανάπτυξης. Τέλος, εξετάστηκε η δυνατότητα ανάκτησης ζυμώσιμων σακχάρων από την μικροβιακή βιομάζα. Εξετάστηκαν τρεις διαφορετικές βιομάζες προερχόμενες από την ανάπτυξη των μεικτών καλλιεργειών σε υποστρώματα όπως τεχνητό χημικό μέσο, απόβλητο τυροκομείου καθώς και μεικτό απόβλητο οινοποιείουσταφίδας. Πειράματα όξινης υδρόλυσης των εν λόγω βιομαζών πραγματοποιήθηκαν με χρήση διαλυμάτων θειικού οξέος διαφορετικής συγκέντρωσης σε διάφορους χρόνους υδρόλυσης σε σταθερή θερμοκρασία και πίεση. Στη συνέχεια πειράματα αλκοολικής αναερόβιας ζύμωσης με χρήση του στελέχους Saccharomyces cerevisiae AXAZ1 οδήγησαν στον προσδιορισμό της απόδοσης σε βιοαιθανόλη για όλα τα εξεταζόμενα υποστρώματα σακχάρων. Σημειώθηκαν αποδόσεις αιθανόλης πάνω από 70% επί της θεωρητικής απόδοσης υποδεικνύοντας την δυνητική χρήση του υποστρώματος ως πρώτη ύλη για παραγωγή βιοαιθανόλης. iv

10 Abstract Abstract Population growth and excessive energy consumption due to a continuous demand for products have led to substantial deterioration of the natural environment, urging for the search of alternative energy sources and the use of new technologies that do not harm ecosystems. The dependence of modern society on fossil fuels has formally been questioned, due to the continuous exhaustion of natural resources and the steady destruction of the natural environment. In addition, the wastewater derived from the production process and mainly from the agroindustrial production and processing sector releases vast amounts of organic and inorganic load, resulting in a constant search for new environmentally friendly treatment technologies. Therefore, pollution prevention measures, effective use of materials and energy as well as the use of renewable energy sources can help reduce waste and emissions. In recent years, attention has been drawn on biotreatment wastewater systems. In particular, the microalgaebacteria based technology deserves special notice while the biomass resulting from the wastewater treatment process has been considered as a sustainable source for biofuels production, agricultural fertilizer or animal feed. In this thesis, the biological treatment of agroindustrial wastewater was studied using mixed microalgae / cyanobacterial cultures, under aerobic nonaseptic conditions, in batch photobioreactors of suspended and attached growth, as well as the simultaneous production of biofuels (bioethanol, biodiesel). Firstly, a mixed culture of green algae Choricystis sp. and then a mixed culture of cyanobacterium Leptolyngbya sp. were examined in terms of removing organic and inorganic load from different agroindustrial wastewater. Several experimental series were conducted in order to study the behavior of mixed cultures in the presence or absence of wastewater effluents (in different ratios) from dairy, winery and raisin industries. A mixture of wineryraisin effluent was also used as a growth medium for the mixedleptolyngbya culture in suspended and attached systems. The mixed effluent and the dairy waste, achieved organic load removal rates up to 94% in suspended growth while in attached growth the removal rates reached 97%. Similarly, significant removal rates between v

11 Abstract 50100% for total nitrogen and phosphorus were also achieved for all experiments conducted. Furthermore, the feasibility of using the produced microbial oil by the suspended and the attached microbial biomass was evaluated, as raw material for biodiesel production (by analyzing the profile of fatty acid methyl esters in all conducted experiments). Although the fatty acid profile was suitable for biodiesel in both applied systems, the amount of oil produced achieved higher values up to 23.2% on dry biomass in attached growth systems versus 14.8% on dry biomass in suspended growth systems. Finally, the capability of recovering fermentable sugars from the microbial biomass after biotreatment in the suspended growth systems was tested. Three different biomasses derived from the growth of mixed cultures on chemical medium, dairy wastewater and mixed wineryraisin effluent were examined. Acid hydrolysis experiments of these biomasses using different concentrations of sulfuric acid were performed at different hydrolysis times with constant temperature and pressure. Subsequently, anaerobic alcoholic fermentation experiments were carried out using the Saccharomyces cerevisiae AXAZ1 in order to determine the bioethanol yield for all sugar substrates used. The results stand up to 70% out of the theoretical ethanol yield indicating the potential use of microbial microalgaebased biomass as feedstock for bioethanol production. vi

12 Περιεχόμενα Περιεχόμενα Πρόλογος... i Περίληψη... iii Abstract... v Περιεχόμενα... vii Κατάλογος Εικόνων... xi Κατάλογος Σχημάτων... xiii Κατάλογος Πινάκων... xvi 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ιστορική αναδρομή : Μικροφύκη Απόβλητα Βιοενέργεια Απόβλητα Επεξεργασία αποβλήτων με τη χρήση μικροφυκών Αστικά απόβλητα Αγροτοβιομηχανικά απόβλητα Απόβλητα ελαιοτριβείου Γαλακτοκομικά απόβλητα Κτηνοτροφικές μονάδες Άλλες βιομηχανικές μονάδες Μικροφύκη Βιολογία μικροφυκών Μικροφύκη σε μεικτές κοινότητες Συστήματα καλλιέργειας μικροφυκών Ανοιχτά συστήματα Κλειστοί βιοαντιδραστήρες Υβριδικά συστήματα Τεχνολογίες παραγωγής βιομάζας μικροφυκών Αυτότροφη παραγωγή Ετερότροφη παραγωγή Μιξότροφη παραγωγή Τεχνολογίες συγκομιδής βιομάζας μικροφυκών Τεχνολογίες μετατροπής μικροφυκών σε βιοκαύσιμα Θερμοχημική μετατροπή Βιοχημική μετατροπή με αλκοολική ζύμωση Χημική μετατροπή με μετεστεροποίηση vii

13 Περιεχόμενα Εταιρείες παραγωγής μικροφυκών ανά τον κόσμο Άλλες εμπορικές χρήσεις μικροφυκών Βιώσιμα βιοκαύσιμα από μικροφύκη Βιοκαύσιμα Νομοθετικό πλαίσιο Πηγές βιομάζας προς παραγωγή βιοκαυσίμων Επεξεργασία βιομάζας Υδρόλυση βιομάζας Παραγωγή βιοκαυσίμων ανά τον κόσμο Βιοντίζελ Βιοαιθανόλη Αντικείμενο της διδακτορικής διατριβής ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ Εισαγωγή Αύξηση μικροοργανισμών Περιγραφή του χλωροφύκους Choricystis sp Περιγραφή του κυανοβακτηρίου Leptolyngbya sp Πειραματικές διατάξεις Περιγραφή πειραμάτων αλκοολικής ζύμωσης Χημικές αναλύσεις και προσδιορισμοί συστατικών Ποσοτικός προσδιορισμός COD Ποσοτικός προσδιορισμός νιτρικού αζώτου Ποσοτικός προσδιορισμός νιτρώδους αζώτου Ποσοτικός προσδιορισμός ολικού αζώτου κατά Kjeldahl Ποσοτικός προσδιορισμός ολικού φωσφόρου Ποσοτικός προσδιορισμός ορθοφωσφορικών Προσδιορισμός ph Ποσοτικός προσδιορισμός ολικών σακχάρων Ποσοτικός προσδιορισμός αναγόντων σακχάρων Ποσοτικός προσδιορισμός βιομάζας Ποσοτικός προσδιορισμός ελαίου Μεθυλεστεροποίηση Ανάλυση σε σύστημα αέριας χρωματογραφίας Ανάλυση σε σύστημα χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης Στατιστική Ανάλυση viii

14 Περιεχόμενα 3. ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ ΜΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΜΙΚΡΟΦΥΚΩΝ ΣΕ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΕΣ ΑΙΩΡΟΥΜΕΝΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟΝΤΙΖΕΛ Γενικά Πειράματα κινητικής με χρήση καλλιέργειας Choricystis sp Επεξεργασία αποβλήτων τυροκομείου με καλλιέργεια Choricystis sp Πειράματα κινητικής με χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp Πειράματα κινητικής σε απόβλητο τυροκομείου με χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp Πειράματα κινητικής σε απόβλητο οινοποιείου με χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp Πειράματα κινητικής σε απόβλητο από μονάδα τυποποίησης σταφίδας με χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp Πειράματα κινητικής σε μεικτό απόβλητο οινοποιείου σταφίδας με χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp Ανάλυση λιπιδίων Ανάλυση λιπαρών οξέων από καλλιέργειες με Choricystis sp Ανάλυση λιπαρών οξέων από καλλιέργειες με Leptolyngbya sp Συζήτηση Αποτελέσματα πειραμάτων στα συστήματα αιωρούμενης ανάπτυξης ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ ΜΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΜΙΚΡΟΦΥΚΩΝ ΣΕ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΕΣ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΜΕΝΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟΝΤΙΖΕΛ Γενικά Πειράματα κινητικής προσκολλημένης ανάπτυξης με χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. και τεχνητό χημικό μέσο Πειράματα κινητικής προσκολλημένης ανάπτυξης σε απόβλητο τυροκομείου με χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp Πειράματα κινητικής προσκολλημένης ανάπτυξης σε απόβλητο οινοποιείου με χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp Πειράματα κινητικής προσκολλημένης ανάπτυξης σε μεικτό απόβλητο οινοποιείου σταφίδας με χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp Ανάλυση λιπιδίων Συζήτηση Πειραματικών Αποτελεσμάτων ΧΡΗΣΗ ΒΙΟΜΑΖΑΣ ΓΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟΑΙΘΑΝΟΛΗΣ Εισαγωγή Επεξεργασία βιομάζας και ποσοστά ζυμώσιμων σακχάρων Αλκοολική ζύμωση και παραγωγή βιοαιθανόλης Παραγωγή βιοαιθανόλης σε υψηλές αρχικές συγκεντρώσεις σακχάρων Παραγωγή βιοαιθανόλης σε χαμηλές αρχικές συγκεντρώσεις σακχάρων ix

15 Περιεχόμενα 5.4 Συζήτηση Πειραματικών Αποτελεσμάτων ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣυζήτησηΣυμπεράσματα Προτάσεις για μελλοντική εργασία ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ x

16 Κατάλογος Εικόνων Κατάλογος Εικόνων Εικόνα 1.1: Διάφορες μέθοδοι επεξεργασίας αποβλήτων... 6 Εικόνα 1.2: Λύματα με ελαιογόνα μικροφύκη σε δεξαμενή μονάδας επεξεργασίας αποβλήτων στο Σαν Φραντσίσκο, όπου η NASA έχει συγκροτήσει εγκαταστάσεις για το πρόγραμμα OMEGA Εικόνα 1.3: Φωτογραφίες μικροσκοπίου (μεγέθυνση 1:1000) διαφορετικών ειδών Α: Anabaena (κυανοβακτήριο), Β: C.reinhardtii (Χλωρόφυτα), C: P.tricornutum (Διάτομα), D: C. sorokiniana (Χλωρόφυτα) Εικόνα 1.4: Διάφορες μορφές κυανοβακτηρίων Εικόνα 1.5: Πιθανές θετικές και αρνητικές αλληλεπιδράσεις που αναπτύσσονται μεταξύ μικροφυκών και βακτηρίων Εικόνα 1.6: Ανοιχτά συστήματα ανάπτυξης μικροφυκών: Μη αρόσιμη έκταση στη Κίνα (αριστερά) και επιμήκης λεκάνες της Cyanotech στη Χαβάη (δεξιά) Εικόνα 1.7: Κλειστά συστήματα ανάπτυξης μικροφυκών. Επίπεδος βιομηχανικού μεγέθους γυάλινος φωτοβιοαντιδραστήρας (αριστερά) και κλειστός αυλωτός φωτοβιοαντιδραστήρας της IGVBiotech (δεξιά) Εικόνα 1.8: Μέθοδοι ακινητοποίησης μικροφυκών για παραγωγή βιομάζας κατά σειρά εμφάνισης: τεχνητός χλοοτάπητας (αριστερά), συνθετικό πλαστικό πλέγμα (μέση) και διογκωμένο πολυστυρένιο ή φελιζόλ (δεξιά) Εικόνα 1.9: Διαδικασίες μετατροπής της βιομάζας των μικροφυκών σε μορφές ενέργειας Εικόνα 1.10 Τμήματα από την εγκατάσταση παραγωγής καυσίμων της εταιρείας Eni στην Γέλα της Σικελίας Εικόνα 1.11: Διεθνείς προοπτικές, μέχρι το 2020 για την παραγωγή των βιοκαυσίμων σύμφωνα με την οδηγία 2009/28/ΕΚ Εικόνα 1.12: Διάφορες πηγές βιομάζας Εικόνα 2.1: Φωτογραφίες οπτικού μικροσκοπίου με τα στελέχη των μικροοργανισμών από τις καλλιέργειες που χρησιμοποιήθηκαν στη παρούσα μελέτη. Ωοειδή κύτταρα Choricystis sp. (αριστερά) (x400) και συσσωμάτωμα νηματοειδούς κυανοβακτηρίου Leptolyngbya sp. (νήματα στα μαύρα βέλη) (x200) (δεξιά) Εικόνα 2.2: Συντήρηση σε γυάλινα ενυδρεία των αυτότροφων μεικτών καλλιεργειών Choricystis sp. (αριστερά) και Leptolyngbya sp. (δεξιά) Εικόνα 2.3: Διάταξη συστήματος για αιωρούμενη (αριστερά) και προσκολλημένη (δεξιά) ανάπτυξη μικροοργανισμών Εικόνα 2.4: Φωτογραφία οπτικού μικροσκοπίου με αναπτυσσόμενες υφές της ζύμης Saccharomyces cereviviae (αριστερά) και καλλιέργεια του ζυμομύκητα σε κωνικές φιάλες (δεξιά) Εικόνα 2.5: Μονάδα χώνευσης (αριστερά) και φασματοφωτόμετρο (δεξιά) για τον προσδιορισμό του COD Εικόνα 2.6: Η εμφάνιση ροζ χρώματος υποδεικνύει την παρουσία νιτρωδών Εικόνα 2.7: Μονάδα χώνευσης (αριστερά) και μονάδα απόσταξης Kjeldahl (δεξιά) Εικόνα 2.8: Εκχύλιση ελαίου με διαχωριστική χοάνη Εικόνα 3.1: Μικρογραφία καλλιέργειας με επικρατέστερο το χλωροφύκος Choricystis sp. (x400) Εικόνα 3.2: Σταδιακή αύξηση μικροβιακής βιομάζας με επικρατών το Choricystis sp. χρησιμοποιώντας υπόστρωμα υγρό απόβλητο τυροκομείου xi

17 Κατάλογος Εικόνων Εικόνα 3.3 : Φωτογραφίες μικροσκοπίου της αυτότροφης καλλιέργειας όπου διακρίνονται τα συσσωματώματα των τριχωμάτων Leptolyngbya (Κλίμακα 50μm) (αριστερά) και τα ευκαρυωτικά μικροφύκη γένους Ochromonas ως σφαιρικάωοειδή ελεύθερα κύτταρα (Κλίμακα 10μm) (δεξιά) Εικόνα 3.4: Σταδιακή αύξηση μικροβιακής βιομάζας με χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp χρησιμοποιώντας υγρό απόβλητο οινοποιείου Εικόνα 4.1: Σταδιακή αύξηση της μικροβιακής βιομάζας στα προσκολλημένα συστήματα αυτότροφης καλλιέργειας Leptolyngbya με χρήση τεχνητού χημικού μέσου Εικόνα 4.2: Σταδιακή αύξηση μικροβιακής βιομάζας με απόβλητο τυροκομείου σε συστήματα προσκολλημένης ανάπτυξης Leptolyngbya Εικόνα 4.3: Αύξηση της μικροβιακής βιομάζας πάνω στις ράβδους στα προσκολλημένα συστήματα καλλιέργειας Leptolyngbya με απόβλητο τυροκομείου Εικόνα 4.4: Σταδιακή αύξηση μικροβιακής βιομάζας προσκολλημένου συστήματος καλλιέργειας Leptolyngbya με απόβλητο οινοποιείου Εικόνα 4.5: Σταδιακή αύξηση μικροβιακής βιομάζας στα προσκολλημένα συστήματα ανάπτυξης καλλιέργειας Leptolyngbya με α) αραιό μεικτό απόβλητο και β) πυκνό μεικτό απόβλητο Εικόνα 4.6: Αύξηση της μικροβιακής βιομάζας πάνω στις ράβδους για τα προσκολλημένα συστήματα καλλιέργειας Leptolyngbya με μεικτό απόβλητο xii

18 Κατάλογος Σχημάτων Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα 1.1: Αντίδραση μετεστεροποίησης των τριγλυκεριδίων με τη χρήση μεθανόλης και καταλύτη Σχήμα 1.2: Εκπομπές αερίων θερμοκηπίου Σχήμα 3.1: Αποτελέσματα πειραμάτων κινητικής της αυτότροφης καλλιέργειας Choricystis sp. με διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις αλάτων (Α, B, C) για την α) αύξηση της βιομάζας, β) απομάκρυνση ΝΟ 3, γ) απομάκρυνση PO 4 3 και δ) παραγωγή σακχάρων Σχήμα 3.2: Μεταβολή της συγκέντρωσης της ολικής βιομάζας καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με απόβλητο τυροκομείου, πέντε διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Choricystis sp Σχήμα 3.3: Μεταβολή συγκέντρωσης COD καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με απόβλητο τυροκομείου, πέντε διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Choricystis sp Σχήμα 3.4: Μεταβολή συγκέντρωσης σακχάρων καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με απόβλητο τυροκομείου, πέντε διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Choricystis sp Σχήμα 3.5: Μεταβολή συγκέντρωσης α) ΝΟ 3, β) NO 2, γ) ΤΝ και δ) PO 4 3 καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με απόβλητο τυροκομείου, πέντε διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Choricystis sp Σχήμα 3.6: Μέγιστα ποσοστά περιεχόμενου ελαίου επί ξηρής βιομάζας με απόβλητο τυροκομείου, πέντε διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Choricystis sp Σχήμα 3.7: Αποτελέσματα πειραμάτων κινητικής της αυτότροφης καλλιέργειας Leptolyngbya sp. με διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών συστατικών για την α) μεταβολή της βιομάζας β) απομάκρυνση NO 3 γ) απομάκρυνση PO 4 3 και δ) παραγωγή σακχάρων Σχήμα 3.8: Μεταβολή στη συγκέντρωση της ολικής βιομάζας καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με απόβλητο τυροκομείου σε δύο διαφορετικές αραιώσεις και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp Σχήμα 3.9: Μεταβολή στη συγκέντρωση του COD καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με απόβλητο τυροκομείου σε δύο διαφορετικές αραιώσεις και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp Σχήμα 3.10: Μεταβολή στις συγκεντρώσεις των α) NO 3, β) NO 2, γ) PO 4 3 και δ) ολικών σακχάρων καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με απόβλητο τυροκομείου δύο διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp Σχήμα 3.11: Μεταβολή συγκέντρωσης ολικής βιομάζας καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με απόβλητο οινοποιείου τριών διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp Σχήμα 3.12: Μεταβολή συγκέντρωση COD καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με απόβλητο οινοποιείου τριών διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp Σχήμα 3.13: Μεταβολή συγκέντρωσης των α) ολικών σακχάρων, β) NO 3, γ) NO 2, δ) ΤΝ και ε) PO 4 3 καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με απόβλητο οινοποιείου τριών διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp Σχήμα 3.14: Μεταβολή της συγκέντρωσης βιομάζας στα πειράματα κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης με απόβλητο σταφίδας τριών διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp xiii

19 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα 3.15: Μεταβολή της συγκέντρωσης COD καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με απόβλητο σταφίδας τριών διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp Σχήμα 3.16: Μεταβολή της συγκέντρωσης των α) ολικών σακχάρων, β) NO 3, γ) NO 2, δ) PO 4 3 και ε) TN καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης με απόβλητο σταφίδας τριών διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp Σχήμα 3.17: Μεταβολή συγκέντρωσης βιομάζας καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με μεικτό απόβλητο τεσσάρων διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp Σχήμα 3.18: Μεταβολή συγκέντρωσης COD καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με μεικτό απόβλητο τεσσάρων διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp Σχήμα 3.19: Μεταβολή της συγκέντρωσης των α) ολικών σακχάρων, β) NO 3, γ) NO 2, δ) ΤΝ και ε) PO 4 3 καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης με μεικτό απόβλητο τεσσάρων διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp Σχήμα 3.20: Είδη λιπαρών οξέων που παράχθηκαν από καλλιέργεια Choricystis σε υπόστρωμα α) τεχνητό χημικό μέσο και β) αραιωμένο απόβλητο τυροκομείου (σειρά πειράματος C, Πίνακας 3.5) Σχήμα 3.21: Είδη λιπαρών οξέων που παρήχθησαν από καλλιέργεια αιωρούμενης ανάπτυξης Leptolyngbya με υπόστρωμα α) απόβλητο τυροκομείου, β) απόβλητο οινοποιείου, γ) απόβλητο σταφίδας, δ) μεικτό απόβλητο (οινοποιείοσταφίδας) και ε) τεχνητό χημικό μέσο Σχήμα 4.1: Μεταβολή της α) ολικής και β) προσκολλημένης βιομάζας για τις αυτότροφες καλλιέργειες Leptolyngbya στα προσκολλημένα συστήματα, με διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών αλάτων Σχήμα 4.2: Μεταβολή της συγκέντρωσης των α) ΝΟ 3, β) PO 4 3 και γ) ολικών σακχάρων καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής στα προσκολλημένα συστήματα, με διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών αλάτων και χρήση αυτότροφης καλλιέργειας Leptolyngbya Σχήμα 4.3: Μεταβολή της α) ολικής βιομάζας και β) προσκολλημένης βιομάζας για την καλλιέργεια Leptolyngbya στα προσκολλημένα συστήματα με απόβλητο τυροκομείου τριών διαφορετικών αραιώσεων Σχήμα 4.4: Μεταβολή συγκέντρωσης COD καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων με απόβλητο τυροκομείου τριών διαφορετικών αραιώσεων στα προσκολλημένα συστήματα ανάπτυξης καλλιέργειας Leptolyngbya Σχήμα 4.5: Μεταβολή της συγκέντρωσης των α) ΝΟ 3, β) NO 2, γ) PO 4 3 και δ) ολικών σακχάρων καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων με απόβλητο τυροκομείου τριών διαφορετικών αραιώσεων και χρήση προσκολλημένων συστημάτων καλλιέργειας Leptolyngbya Σχήμα 4.6: Μεταβολή της α) ολικής και β) προσκολλημένης βιομάζας για τα προσκολλημένα συστήματα ανάπτυξης καλλιέργειας Leptolyngbya με απόβλητο οινοποιείου τριών διαφορετικών αραιώσεων Σχήμα 4.7: Μεταβολή της συγκέντρωσης COD καθ όλη τη διάρκεια των προσκολλημένων συστημάτων ανάπτυξης καλλιέργειας Leptolyngbya με απόβλητο οινοποιείου τριών διαφορετικών αραιώσεων xiv

20 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα 4.8: Μεταβολή της συγκέντρωσης των α) ΝΟ 3, β) ΝΟ 2, γ) PO 4 3 και δ) ολικών σακχάρων καθ όλη τη διάρκεια των προσκολλημένων συστημάτων ανάπτυξης καλλιέργειας Leptolyngbya με απόβλητο οινοποιείου τριών διαφορετικών αραιώσεων Σχήμα 4.9: Μεταβολή της α) ολικής και β) προσκολλημένης βιομάζας για τα προσκολλημένα συστήματα της καλλιέργειας Leptolyngbya με μεικτό απόβλητο τριών διαφορετικών αραιώσεων Σχήμα 4.10: Μεταβολή της συγκέντρωσης COD καθ όλη τη διάρκεια των προσκολλημένων συστημάτων ανάπτυξης καλλιέργειας Leptolyngbya με μεικτό απόβλητο τριών διαφορετικών αραιώσεων Σχήμα 4.11: Μεταβολή της συγκέντρωσης α) NO 3, β) ΝΟ 2, γ) PO 4 3 και δ) ολικών σακχάρων καθ όλη τη διάρκεια των προσκολλημένων συστημάτων ανάπτυξης καλλιέργειας Leptolyngbya με μεικτό απόβλητο τριών διαφορετικών αραιώσεων Σχήμα 4.12: Τα είδη των λιπαρών οξέων που παράγονται από την προσκολλημένη μικροβιακή βιομάζα καλλιέργειας Leptolyngbya με τεχνητό χημικό μέσο, απόβλητο τυροκομείου, οινοποιείου και μεικτό απόβλητο Σχήμα 5.1: Κινητική ανάπτυξης Saccharomyces cerevisiae σε υδρόλυμα από βιομάζα καλλιέργειας μικροφυκών με τεχνητό χημικό θρεπτικό υπόστρωμα. Συνθήκη υδρόλυσης 2.5Ν Η 2 SO 4, 120 λεπτά (ΒΜ120) Σχήμα 5.2: Κινητική ανάπτυξης Saccharomyces cerevisiae σε υδρόλυμα από βιομάζα μετά από επεξεργασία μεικτού αποβλήτου (οινοποιείουσταφίδας). Συνθήκη υδρόλυσης 2.5Ν Η 2 SO 4, 120 λεπτά (Μ120) Σχήμα 5.3: Κινητική ανάπτυξης Saccharomyces cerevisiae σε υδρόλυμα από βιομάζα μετά από επεξεργασία μεικτού αποβλήτου (οινοποιείουσταφίδας). Συνθήκη υδρόλυσης 2.5Ν H 2 SO 4, 180 λεπτά (Μ180) Σχήμα 5.4: Κινητική ανάπτυξης Saccharomyces cerevisiae σε υδρόλυμα από βιομάζα μετά από επεξεργασία αποβλήτου τυροκομείου. Συνθήκη υδρόλυσης 2.5Ν H 2 SO 4, 120 λεπτά (Τ120) Σχήμα 5.5: Κινητική ανάπτυξης Saccharomyces cerevisiae σε όλα τα εξεταζόμενα υποστρώματα (Μ120: μεικτό απόβλητο 120 λεπτά υδρόλυση, Μ180: μεικτό απόβλητο 180 λεπτά υδρόλυση, ΒΜ120: βιομάζα μικροφυκών 120 λεπτά υδρόλυση, Τ120: απόβλητο τυροκομείου 120 λεπτά υδρόλυση) xv

21 Κατάλογος Πινάκων Κατάλογος Πινάκων Πίνακας 1.1: Ενδεικτικές τιμές για την σύσταση ακατέργαστων υγρών αστικών αποβλήτων σε διάφορες χώρες του κόσμου Πίνακας 1.2: Χαρακτηριστικά υγρών αποβλήτων τυροκομείων στην Ελλάδα Πίνακας 1.3: Χαρακτηριστικά και ενδεικτικές τιμές υγρών βιομηχανικών αποβλήτων Πίνακας 1.4: Βιβλιογραφική ανασκόπηση χρήσης μικροφυκών για επεξεργασία αποβλήτων και παραγωγή βιομάζας Πίνακας 1.5: Σύγκριση διαφόρων ειδών μικροφυκών ως προς το λιπιδικό περιεχόμενο Πίνακας 1.6: Ρυθμός παραγωγής βιομάζας και λιπιδίων για Chlorella sp. υπό αυτότροφη, ετερότροφη και μιξότροφη καλλιέργεια Πίνακας 1.7: Παγκόσμια παραγωγή προϊόντων από μικροφύκη Πίνακας 1.8: Σύγκριση βιομάζας μικροφυκών και ελαιούχων φυτών σε σχέση με τις απαιτήσεις διαθέσιμης έκτασης και απόδοση ελαίου Πίνακας 1.9: Παραγωγή βιοενέργειας από διάφορα υποστρώματα βιομάζας Πίνακας 1.10: Οι πρώτες 15 χώρες παραγωγής υγρών βιοκαυσίμων το Πίνακας 1.11: Είδη και ποσοστά λιπαρών οξέων που προτείνονται για βιοντίζελ Πίνακας 1.12: Εταιρείες παραγωγής και εισαγωγής βιοντίζελ στην Ελλάδα και οι ποσότητες που κατανεμήθηκαν τα έτη Πίνακας 2.1: Θρεπτικά μεταλλικά συστατικά για την συντήρηση των αυτότροφων καλλιεργειών Πίνακας 3.1: Αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών συστατικών του χημικού θρεπτικού μέσου που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα κινητικής με την αυτότροφη καλλιέργεια Choricystis sp Πίνακας 3.2: Ποσοστό απομάκρυνσης NO 3 και PO 4 3, ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, παραγωγικότητα βιομάζας και περιεχόμενο έλαιο ξηρής βιομάζας στα πειράματα κινητικής της αυτότροφης καλλιέργειας Choricystis sp. με διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών αλάτων Πίνακας 3.3: Χαρακτηριστικά δευτερογενή ορρού γάλακτος από παραγωγή τυριού τύπου cottage της μονάδας Παπαθανασίου ΑΕΒΕ Πίνακας 3.4: Αρχικές συγκεντρώσεις COD, βιομάζας και θρεπτικών συστατικών του τυροκομικού αποβλήτου που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα κινητικής με την αυτότροφη καλλιέργεια Choricystis sp Πίνακας 3.5: Ποσοστό απομάκρυνσης COD και θρεπτικών συστατικών, ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, παραγωγικότητα βιομάζας/λιπιδίων και περιεχόμενο έλαιο ξηρής βιομάζας στα πειράματα κινητικής της αυτότροφης καλλιέργειας Choricystis sp. με διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών συστατικών Πίνακας 3.6: Αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών συστατικών του χημικού θρεπτικού μέσου που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης με την αυτότροφη καλλιέργεια Leptolyngbya sp Πίνακας 3.7: Ποσοστά απομάκρυνσης NO 3 και PO 4 3, ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, παραγωγικότητα βιομάζας και περιεχόμενο έλαιο ξηρής βιομάζας στα πειράματα κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης της αυτότροφης καλλιέργειας Leptolyngbya sp. με διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών αλάτων Πίνακας 3.8: Αρχικές συγκεντρώσεις COD, βιομάζας και θρεπτικών συστατικών του τυροκομικού αποβλήτου που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης με την αυτότροφη καλλιέργεια Leptolyngbya sp xvi

22 Κατάλογος Πινάκων Πίνακας 3.9: Ποσοστό απομάκρυνσης COD και θρεπτικών συστατικών, ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, παραγωγικότητα βιομάζας και λιπιδίων και περιεχόμενο έλαιο ξηρής βιομάζας στα πειράματα κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης με απόβλητο τυροκομείου και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp Πίνακας 3.10: Χαρακτηριστικά πυκνού αποβλήτου οινοποιείου της μονάδας Ν.&Ν. Γρίβας Ο.Ε Πίνακας 3.11: Αρχικές συγκεντρώσεις COD, βιομάζας και θρεπτικών συστατικών του αποβλήτου οινοποιείου που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης με την αυτότροφη καλλιέργεια Leptolyngbya sp Πίνακας 3.12: Ποσοστό απομάκρυνσης COD και θρεπτικών συστατικών, ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, παραγωγικότητα βιομάζας και λιπιδίων και περιεχόμενο έλαιο ξ.β. στα πειράματα κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης της καλλιέργειας Leptolyngbya sp. με χρήση αποβλήτου οινοποιείου Πίνακας 3.13: Αρχικές συγκεντρώσεις COD, βιομάζας και θρεπτικών συστατικών του αποβλήτου σταφίδας που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης με καλλιέργεια Leptolyngbya sp Πίνακας 3.14: Χημική ανάλυση σε αραιωμένα απόβλητα τυροκομείου, οινοποιείου και μονάδας τυποποίησης σταφίδας Πίνακας 3.15: Ποσοστό απομάκρυνσης COD και θρεπτικών συστατικών, ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, παραγωγικότητα βιομάζας και λιπιδίων και περιεχόμενο έλαιο ξ.β. στα πειράματα κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης με καλλιέργεια Leptolyngbya sp. και χρήση αποβλήτου σταφίδας Πίνακας 3.16: Αρχικές συγκεντρώσεις COD, βιομάζας και θρεπτικών συστατικών του μεικτού αποβλήτου που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης με την καλλιέργεια Leptolyngbya sp Πίνακας 3.17: Ποσοστό απομάκρυνσης COD, βιομάζας και θρεπτικών συστατικών, ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, παραγωγικότητα βιομάζας και λιπιδίων και περιεχόμενο έλαιο ξηρής βιομάζας στα πειράματα κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης με καλλιέργεια Leptolyngbya sp. και χρήση μεικτού αποβλήτου Πίνακας 3.18: Συγκριτικός πίνακας λειτουργικών συνθηκών από αιωρούμενα συστήματα καλλιέργειας μικροφυκών με διάφορα υποστρώματα ανάπτυξης Πίνακας 4.1: Αρχικές συγκεντρώσεις βιομάζας και θρεπτικών συστατικών του τεχνητού χημικού μέσου που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα κινητικής προσκολλημένης ανάπτυξης με την αυτότροφη καλλιέργεια Leptolyngbya Πίνακας 4.2: Ποσοστό απομάκρυνσης θρεπτικών συστατικών, ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, παραγωγικότητες βιομάζας και περιεχόμενο έλαιο ξηρής βιομάζας στα πειράματα κινητικής προσκολλημένης ανάπτυξης με την αυτότροφη καλλιέργεια Leptolyngbya σε διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών αλάτων Πίνακας 4.3: Αρχικές συγκεντρώσεις COD, βιομάζας και θρεπτικών συστατικών του αποβλήτου τυροκομείου που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα κινητικής προσκολλημένης ανάπτυξης με την αυτότροφη καλλιέργεια Leptolyngbya Πίνακας 4.4: Ποσοστό απομάκρυνσης COD και θρεπτικών συστατικών, ειδικός ρυθμός προσκολλημένης ανάπτυξης, παραγωγικότητα βιομάζας και περιεχόμενο έλαιο ξ.β. στα προσκολλημένα συστήματα ανάπτυξης καλλιέργειας Leptolyngbya με απόβλητο τυροκομείου xvii

23 Κατάλογος Πινάκων Πίνακας 4.5: Αρχικές συγκεντρώσεις COD, βιομάζας και θρεπτικών συστατικών των προσκολλημένων συστημάτων ανάπτυξης καλλιέργειας Leptolyngbya με απόβλητο οινοποιείου Πίνακας 4.6: Ποσοστό απομάκρυνσης COD και θρεπτικών συστατικών, ειδικός ρυθμός προσκολλημένης ανάπτυξης, παραγωγικότητα βιομάζας και περιεχόμενο έλαιο ξηρής βιομάζας στα προσκολλημένα συστήματα καλλιέργειας Leptolyngbya με απόβλητο οινοποιείου Πίνακας 4.7: Αρχικές συγκεντρώσεις COD, βιομάζας και θρεπτικών συστατικών από τα προσκολλημένα συστήματα της καλλιέργειας Leptolyngbya με μεικτό απόβλητο Πίνακας 4.8: Ποσοστό απομακρύνσεων COD και θρεπτικών συστατικών, ειδικός ρυθμός προσκολλημένης ανάπτυξης, παραγωγικότητα βιομάζας και περιεχόμενο έλαιο στα προσκολλημένα συστήματα ανάπτυξης καλλιέργειας Leptolyngbya με μεικτό απόβλητο Πίνακας 4.9: Συγκριτικός πίνακας λειτουργικών συνθηκών από προσκολλημένα συστήματα καλλιέργειας μικροφυκών με διάφορα υποστρώματα ανάπτυξης Πίνακας 5.1: Αποδόσεις σακχάρων από την όξινη υδρόλυση βιομάζας αυτότροφης καλλιέργειας μικροφυκών/ κυανοβακτηρίων Πίνακας 5.2: Αποδόσεις σακχάρων για την όξινη υδρόλυση βιομάζας από μιξότροφες καλλιέργειες με απόβλητα ως υπόστρωμα ανάπτυξης Πίνακας 5.3: Είδη βιομαζών, συνθήκες υδρόλυσης, αρχική συγκέντρωση σακχάρων και αποδόσεις αιθανόλης από βιβλιογραφική ανασκόπηση Πίνακας 6.1: Συνοπτικά αποτελέσματα των αποδόσεων από το σύνολο των πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν στη παρούσα διατριβή Πίνακας 8.1: Σχετική αφθονία των πιο άφθονων ταξινομικών μονάδων (Operational Taxonomic Units, OTUs) (%) βακτηρίων σύμφωνα με πυροαλληλούχιση (Illumina MiSeq pyrosequencing) τμήματος του 16SrRNA γονιδίου στην αυτότροφη προσκολλημένη καλλιέργεια και στα απόβλητα που χρησιμοποιήθηκαν ως υπόστρωμα ανάπτυξης (τυροκομείο, οινοποιείο) xviii

24 ΘΕΩΡΗΤΙΚΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ

25 Εισαγωγή 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Ιστορική αναδρομή : Μικροφύκη Απόβλητα Βιοενέργεια Η εκμετάλλευση και η χρήση της ενέργειας, με την αξιοποίηση των δυνατοτήτων που προσφέρει, επέβαλαν στον άνθρωπο καθ όλη την εξέλιξή του τον τρόπο ζωής του καθώς και την άμεση εξάρτησή του από αυτή. Αρχικά, οι κυριότερες πηγές ενέργειας που εκμεταλλευόταν ο άνθρωπος ήταν η μυϊκή του δύναμη ή των ζώων, η βιομάζα, οι υδατοπτώσεις, η αιολική και η ηλιακή ενέργεια. Στις αρχές του 19 ου αιώνα, με τη βιομηχανική επανάσταση, άρχισε η συστηματική χρήση ορυκτών καυσίμων, γαιανθράκων, πετρελαίου και στη συνέχεια φυσικού αερίου. Στον 20 ο αιώνα, οι γαιάνθρακες έχασαν τον πρωταγωνιστικό τους ρόλο λόγω της διάδοσης και της ευρείας χρήσης του αργού πετρελαίου. Οι αυξανόμενες όμως απαιτήσεις οδηγούσαν στη χρήση και άλλων πηγών όπως το φυσικό αέριο και η πυρηνική ενέργεια. Ωστόσο, οι συνεχόμενες ενεργειακές ανάγκες της βιομηχανίας και των μεταφορών επέβαλαν την εντατική εξόρυξη του άνθρακα που σε συνδυασμό με την πετρελαϊκή κρίση (1973) κατέστησαν σαφές ότι τα ορυκτά καύσιμα δεν είναι ανεξάντλητη πηγή. Παράλληλα, η τάση αύξησης των συγκεντρώσεων διοξειδίου του άνθρακα στην ατμόσφαιρα (καύσεις, υλοτόμηση, εκχερσώσεις), παρουσιάζοντας τα πρώτα συμπτώματα φαινομένου του θερμοκηπίου, έστρεψε το ενδιαφέρον στην μελέτη και αξιοποίηση εναλλακτικών ανανεώσιμων πηγών ενέργειας όπως η υδροηλεκτρική, η ηλιακή, η αιολική, η γεωθερμική αλλά και η ενέργεια από βιομάζα. Η βιομάζα είναι η αρχαιότερη και πιο διαδεδομένη ανανεώσιμη πηγή ενέργειας. Ο πρωτόγονος άνθρωπος, για να καλύψει τις βασικές του ανάγκες, χρησιμοποίησε την ενέργεια που προερχόταν από την καύση φυτικών υλικών, που είναι ένα είδος βιομάζας. Γενικά, ως βιομάζα ορίζεται η ύλη βιολογικής προέλευσης, που συμπεριλαμβάνει οποιοδήποτε υλικό προέρχεται άμεσα ή έμμεσα από το φυτικό κόσμο όπως φυτικές ύλες, υποπροϊόντα και κατάλοιπα της φυτικής, ζωικής, δασικής και αλιευτικής παραγωγής, τα υποπροϊόντα από τη μεταποίηση ή την επεξεργασία των υλικών αυτών αλλά και το βιολογικής προέλευσης μέρος των αποβλήτων. Οι τεχνολογικά και οικονομικά αναπτυγμένες χώρες επιβάλλουν την αξιοποίηση της 2

26 Εισαγωγή βιομάζας με νέες τεχνολογίες, ώστε να παράγεται ενέργεια υψηλής απόδοσης με ελάχιστη περιβαλλοντική επιβάρυνση. Πιο συγκεκριμένα, η βιομάζα προερχόμενη από καλλιέργειες μικροφυκών αποτελεί δυνητική πηγή βιοενέργειας καθώς πληροί τις προϋποθέσεις των ανανεώσιμων εναλλακτικών πηγών. Η χρήση των φυκών από τον άνθρωπο δρομολογείται πριν από 2000 χρόνια στην Αρχαία Κίνα όπου οι κάτοικοι χρησιμοποιούσαν το είδος Nostoc για να επιβιώσουν κατά τις περιόδους του λιμού. Παρόλα αυτά, η μελέτη των μικροφυκών ως προς την φυσιολογία αυτών ξεκίνησε στα τέλη του 19 ου αιώνα και ως προς τη βιοτεχνολογία στα μέσα του 20 ου αιώνα (Spolaore et al., 2006). Το 1890 ο Beijerinck πραγματοποίησε την πρώτη καλλιέργεια ενός μόνο είδους μικροφύκους, της Chlorella vulgaris. Αρχικά, τέτοιες καλλιέργειες χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη της φυσιολογίας των οργανισμών, όπως το 1919 στο Warburg της Γερμανίας. Όμως, η μαζική καλλιέργεια τους ξεκίνησε στο πανεπιστήμιο Stanford των Ηνωμένων Πολιτειών, το Essen της Γερμανίας (Witsch, 1948) και το Τόκυο της Ιαπωνίας με τις αντίστοιχες μελέτες να συνοψίζονται στο βιβλίο του Burlew (1953). Η χρήση των μικροφυκών για παραγωγή καυσίμων προτάθηκε κατά την πρώτη συνεδρίαση της Ηλιακής Ενέργειας (ΗΠΑ), όπου παρουσιάστηκε ένα πρόγραμμα για τη μετατροπή της βιομάζας μικροφυκών σε μεθάνιο (Meier, 1955). Αξιοσημείωτη είναι η πρώτη πιλοτική μονάδα ανάπτυξης μικροφυκών σε μία ταράτσα στο πανεπιστήμιο MIT των Ηνωμένων Πολιτειών το 1951 από την εταιρία του Arthur D. Little με χρήση του στελέχους Chlorella pyrenoidosa, με σκοπό τη συνεχή ανάπτυξη των μικροφυκών, τη μελέτη των συνθηκών της ανάπτυξης αυτής, την αποτίμηση της οικονομικής βιωσιμότητας ενός παρόμοιου έργου και της χρήσης των προϊόντων της καλλιέργειας (Burlew, 1953; Gibbs et al., 1974; Benemann et al., 1982; Borowitzka, 1999). Το ενδιαφέρον της χρήσης των μικροφυκών ως εναλλακτική πηγή ενέργειας αυξήθηκε κατά τη διάρκεια της δεκαετίας του 1970 λόγω της πρώτης πετρελαϊκής κρίσης. Στην αρχή της δεκαετίας πραγματοποιείτο συλλογή και καλλιέργεια του είδους Arthrospira στο εργοστάσιο της Sosa Texcoco S.A. στη λίμνη Texcoco της πόλης του Μεξικού. Μέχρι το 1980 υπήρχαν 46 μονάδες παραγωγής μικροφυκών στην Ασία οι οποίες παρήγαγαν περισσότερα από 1000 kg μικροφυκών σε μηνιαία βάση (κυρίως Chlorella). Η παραγωγή του μικροφύκους Dunaliella salina, ως πηγή βκαροτίνης, αναπτύχθηκε στην Αυστραλία το 1986 από τις εταιρίες Western Biotechnology και Betatene (πλέον Cognis Nutrition & Health). Την ίδια εποχή ξεκίνησε η παραγωγή 3

27 Εισαγωγή των μικροφυκών από εταιρίες στο Ισραήλ και τις Ηνωμένες Πολιτείες, καθώς και η παραγωγή κυανοβακτηρίων στην Ινδία. Πρόσφατα, αρκετές μονάδες παραγωγής του μικροφύκους Haematococcus pluvialis σε μεγάλες ποσότητες έχουν δημιουργηθεί σε Ινδία και Ηνωμένες Πολιτείες. Το συγκεκριμένο στέλεχος αποτελεί πηγή ασταξανθίνης, η οποία χρησιμοποιείται ως χρωστική για τον χρωματισμό των τροφίμων. Την περίοδο , το Εθνικό Εργαστήριο Ανανεώσιμων Πηγών Ενέργειας των Ηνωμένων Πολιτειών, μέσω του προγράμματος υδάτινων ειδών ASP (Aquatic Species Program), έθεσε σε ισχύ ένα εξειδικευμένο πρόγραμμα έρευνας και ανάπτυξης σχετικά με τις ανανεώσιμες πηγές καυσίμων, το οποίο περιελάμβανε, εκτός των άλλων, και την παραγωγή βιοντίζελ από μικροφύκη (Sheehan et al., 1998). Παράλληλα, στις Ηνωμένες Πολιτείες και την Ευρώπη από την δεκαετία του 50 πραγματοποιήθηκαν δραστηριότητες στην παραγωγή μικροφυκών ως μέρος της επεξεργασίας των λυμάτων (Oswald and Gotass, 1957). Καθώς στη βιομηχανία πραγματοποιούνταν αλματώδεις τεχνολογικές αλλαγές, ανάλογες μετατροπές συνέβησαν και στις παραγόμενες ενώσεις και στα χαρακτηριστικά των αποβλήτων τους. Γι αυτό το λόγο, η προεπεξεργασία των αποβλήτων επιβάλλονταν στη μείωση του βιοαποδομήσιμου κλάσματος προτού αποδοθούν σε υδάτινους αποδέκτες ή εξετάζονταν η δυνατότητα επαναχρησιμοποίησής τους. Εφόσον τα συστατικά που περιέχονται στα περισσότερα λύματα περιέχουν θρεπτικά στοιχεία (λιπίδια, υδατάνθρακες, αμινοξέα, πρωτεΐνες, ανόργανα άλατα), η χρήση των μικροφυκών ως μέσω επεξεργασίας αλλά και παραγωγής βιοενέργειας θα αποτελούσε εφαλτήριο νέας ενεργειακής πολιτικής. Τα τελευταία χρόνια, η παραγωγή ελαίων και υδρογονανθράκων από μικροφύκη ως πιθανή πηγή βιοκαυσίμων έχει γνωρίσει σημαντική δραστηριότητα στον τομέα της έρευνας και της τεχνολογίας. Αρκετά ιδιωτικά συμφέροντα, συμπεριλαμβανομένων των πολυεθνικών εταιρειών πετρελαίου έχουν προωθήσει ενεργά προγράμματα στον τομέα αυτό, αλλά δεν έχουν προκύψει ακόμα συγκεκριμένα στοιχεία από αυτές τις προσπάθειες. 4

28 Εισαγωγή 1.2 Απόβλητα Σύμφωνα με τις Οδηγίες της Ευρωπαϊκής Ένωσης 75/442/EEC και 91/156/EEC, ο όρος «απόβλητα» περιλαμβάνει όλες τις ουσίες και τα αντικείμενα τα οποία απορρίπτονται ή προβλέπεται να απορριφθούν ή απαιτείται να απορριφθούν: α) Βιομηχανικά υγρά απόβλητα, β) Αστικά και βιομηχανικά στερεά απόβλητα και ιλύς, γ) Αστικά λύματα, δ) Στερεά και υγρά παραπροϊόντα της εκμετάλλευσης ορυκτών πόρων, ε) Απόβλητα κτηνοτροφικών εκμεταλλεύσεων, καθώς και λοιπές ανθρώπινες ενέργειες όπως γεωργικές δραστηριότητες, ατυχήματα από μεταφορά χημικών ουσιών, αστοχία τεχνικών έργων, ανεξέλεγκτη απόρριψη αποβλήτων ή και τυχαίες διαφυγές ρύπων από χώρους αποθήκευσης. Η σύνθεση των αποβλήτων είναι μια αντανάκλαση του τρόπου ζωής και των τεχνολογιών που εφαρμόζονται σε μια κοινωνία. Για την αποκατάσταση του περιβάλλοντος, σε ότι αφορά τις φυσικές διεργασίες, η ίδια η φύση έχει αναπτύξει, δια μέσου των αιώνων, διάφορους μηχανισμούς «αυτοκαθαρισμού» που εξισορροπούν τη ρύπανση που προκαλείται από αυτές. Αντίθετα, η ρύπανση που προκαλείται από ανθρώπινες δραστηριότητες είναι επικίνδυνη επειδή συνήθως συγκεντρώνεται σε περιορισμένους χώρους (βιομηχανικά και αστικά κέντρα), όπου οι υψηλές συγκεντρώσεις ρύπων προκαλούν μη αντιστρεπτές καταστάσεις. Η ρύπανση αποτελεί παγκοσμίως ένα από τα σημαντικότερα περιβαλλοντικά προβλήματα και προκαλείται από τις οργανικές και ανόργανες ουσίες που απελευθερώνονται στο περιβάλλον ως αποτέλεσμα των οικιακών, γεωργικών και βιομηχανικών δραστηριοτήτων. Ως αποτέλεσμα της όλο και αυξανόμενης ανάγκης για αντιμετώπιση της ρύπανσης του περιβάλλοντος, σε συνδυασμό με τη μελέτη και την κατανόηση των μηχανισμών μεταφοράς και μετατροπής των ρύπων μέσα σε αυτό, αναπτύχθηκαν πολλές αποτελεσματικές μέθοδοι απορρύπανσης εδάφους και υδάτων. Οι μέθοδοι απορρύπανσης μπορεί να ορισθούν ως αυτές που καταστρέφουν, απομακρύνουν ή αποδυναμώνουν την τοξικότητα των ρύπων. Οι μηχανισμοί που χρησιμοποιούνται για κάθε μέθοδο στην απομάκρυνση του εκάστοτε ρύπου, μπορεί να είναι φυσικοί, χημικοί ή βιολογικοί (Εικόνα 1.1). Οι μηχανισμοί αυτοί μπορεί να χρησιμοποιούνται και σε συνδυασμό ώστε να μειωθούν τα επίπεδα των ρύπων στα ασφαλή και νομοθετικά αποδεκτά επίπεδα (Βαγενάς, 2003). Φυσικές θεωρούνται οι 5

29 Εισαγωγή μέθοδοι που αποσκοπούν στην απομάκρυνση χονδρόκοκκων αιωρούμενων και επιπλεόντων στερεών συστατικών, καθώς και στην ομογενοποίηση ή διακίνηση των αποβλήτων. Χημικές θεωρούνται οι μέθοδοι που αποσκοπούν στην απομάκρυνση λεπτόκοκκων, κυρίως, αιωρούμενων και διαλυμένων συστατικών μετά από συσσωμάτωση και κατακρήμνισή τους στον πυθμένα της εγκατάστασης. Βιολογικές θεωρούνται οι μέθοδοι, που βασίζονται στη δράση μικροοργανισμών, οι οποίοι διασπούν τα οργανικά συστατικά των αποβλήτων προς απλούστερα, αβλαβή και ενεργειακά σταθερότερα προϊόντα (CO 2, CH 4, H 2 O). Οι κατηγορίες των μικροοργανισμών που εμπλέκονται στις βιολογικές διεργασίες περιλαμβάνουν (αν)αερόβιους, ανάλογα με τις μεταβολικές απαιτήσεις σε οξυγόνου, αυτότροφους, ετερότροφους ή και μιξότροφους μικροοργανισμούς, ανάλογα με τις μεταβολικές απαιτήσεις σε φωτεινή ενέργεια και οργανικές ενώσεις. Εικόνα 1.1: Διάφορες μέθοδοι επεξεργασίας αποβλήτων Η επεξεργασία των αποβλήτων εξελίχθηκε χρονικά και ιστορικά περνώντας από διάφορα στάδια. Η διαδικασία αναπτύχθηκε σε βαθμίδες, γνωστές ως πρωτοβάθμια, δευτεροβάθμια και τριτοβάθμια επεξεργασία. Το είδος του εξοπλισμού των εγκαταστάσεων που απαιτούνται για την επεξεργασία μπορεί να διαφοροποιείται ανάλογα με τα χαρακτηριστικά και την προέλευση των αποβλήτων. Ενδεικτικά, στα αστικά λύματα, οι συγκεντρώσεις του N και του P κυμαίνονται στα mg L 1, ενώ στα γεωργικά απόβλητα είναι >1000 mg L 1. Η πρωτοβάθμια και δευτεροβάθμια διαδικασία επεξεργασίας των λυμάτων χρησιμοποιείται εκτενώς προκειμένου να 6

30 Εισαγωγή εξαλειφθούν υλικά που καθιζάνουν εύκολα και να οξειδωθεί η οργανική ύλη. Το τελικό αποτέλεσμα είναι μια διαυγής, φαινομενικώς καθαρή εκροή που απορρίπτεται σε φυσικά υδάτινους αποδέκτες. Ωστόσο, ακόμη και αυτή η δευτερογενής εκροή μπορεί να περιέχει ποσότητες ουσιών που είναι σε θέση να προκαλέσουν διατάραξη της ποιότητας του νερού, ρύπανση των υπόγειων και επιφανειακών υδάτων και κυρίως ευτροφισμό. Γι αυτό, τα υγρά απόβλητα πρέπει να υποβάλλονται, πριν από τη απόρριψή τους, σε κατάλληλη επεξεργασία ώστε να αμβλύνονται οι επιπτώσεις στους αποδέκτες. Ο κύριος όγκος των αποβλήτων αποτελείται από ενώσεις οργανικού άνθρακα, υδατάνθρακες, λίπη, πρωτεΐνες, αμινοξέα, πτητικά οξέα αλλά περιέχουν επίσης και ανόργανα συστατικά με μεγάλες συγκεντρώσεις νατρίου, ασβεστίου, καλίου, μαγνησίου, χλωρίου, θείου, φωσφόρου, αμμωνίου και άλλων αλάτων. Γι αυτό, τα απόβλητα αποτελούν ένα ιδανικό μέσο ανάπτυξης για ένα ευρύ φάσμα μικροοργανισμών όπως βακτήρια, μύκητες, πρωτόζωα ακόμα και μικροφύκη. Έτσι, οι βιολογικές μέθοδοι επεξεργασίας κερδίζουν έδαφος ως λιγότερο απαιτητικές και ρυπογόνες ως προς το κόστος και το περιβάλλον, αντίστοιχα Επεξεργασία αποβλήτων με τη χρήση μικροφυκών Τα τελευταία χρόνια η χρήση των μικροφυκών στην επεξεργασία και την ανακύκλωση των λυμάτων έχει προσελκύσει μεγάλο ενδιαφέρον λόγω του κεντρικού ρόλου τους στη δέσμευση του διοξειδίου του άνθρακα. Η βιοαξιοποίηση των θρεπτικών συστατικών των λυμάτων για την παραγωγή βιομάζας μικροφυκών έχει θεωρηθεί ως μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική, η οποία μπορεί να ικανοποιήσει ταυτόχρονα και τις ενεργειακές ανάγκες και την επεξεργασία των λυμάτων. Έτσι, τα μικροφύκη αποτέλεσαν μια κομψή λύση επεξεργασίας χάριν της ικανότητάς τους να χρησιμοποιούν το ανόργανο Ν και P για την ανάπτυξή τους, απομακρύνοντας παράλληλα βαρέα μέταλλα καθώς και ορισμένες τοξικές οργανικές ενώσεις χωρίς να οδηγούν σε δευτερογενή μόλυνση εφόσον η παραχθείσα βιομάζα αποτελεί χρήσιμη πρώτη ύλη βιοπροϊόντων. Έχουν χρησιμοποιηθεί στην επεξεργασία αστικών, αγροτοβιομηχανικών και άλλων βιομηχανικών αποβλήτων, απομακρύνοντας σε μεγάλο βαθμό το οργανικό φορτίο και τους παθογόνους μικροοργανισμούς (Abdel Raouf et al., 2012). Για το λόγο αυτό, η καλλιέργεια μικροφυκών μπορεί να παρέχει 7

31 Εισαγωγή μια τριτοταγή βιοεπεξεργασία σε συνδυασμό με την παραγωγή δυνητικά πολύτιμης βιομάζας, η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για διάφορους ενεργειακούς σκοπούς. Συνεπώς, η χρήση των υγρών αποβλήτων για την παραγωγή βιοκαυσίμων με μικροφύκη αποτελεί μια σημαντική πρόκληση που μπορεί να διασφαλίσει την οικονομική βιωσιμότητα και την αειφορία της όλης διαδικασίας παραγωγής βιοκαυσίμων. Αυτή η ιδέα ξεκίνησε πριν από εξήντα χρόνια στις Ηνωμένες Πολιτείες και έχει έκτοτε δοκιμαστεί εντατικά σε πολλές χώρες, όπως στην Αυστραλία, στη Ταϊλάνδη, στη Ταϊβάν και στο Μεξικό. Η χρήση των μικροφυκών είναι επιθυμητή, δεδομένου ότι είναι σε θέση να εξυπηρετεί ένα διττό ρόλο, αυτό του βιολογικού καθαρισμού των λυμάτων καθώς και της παραγωγής βιομάζας, που αποτελεί την πρώτη ύλη παραγωγής βιοκαυσίμων. Επιπλέον, ο καθαρισμός των λυμάτων με μικροφύκη είναι μια διαδικασία φιλική προς το περιβάλλον, εφόσον η βιομάζα που παράγεται επαναχρησιμοποιείται και επιτρέπει την αποτελεσματική ανακύκλωση των θρεπτικών συστατικών. Η παραγωγή βιομάζας με τη χρήση αποβλήτων κυμαίνεται έντονα ανάλογα με το είδος του μικροφύκους και το είδος του αποβλήτου (Lincoln et al., 1996; Wilkie and Mulbry, 2002). Έχουν χρησιμοποιηθεί κατά καιρούς διάφορα στελέχη μικροφυκών που ανήκουν στα γένη των Chlorella sp., Scenedesmus sp., Phormidium sp., Botryococcus sp., Chlamydomonas sp., Spirulina sp., και Anabaena sp.. Τα αερόβια συστήματα που βασίζονται σε δράση μικροφυκών μπορούν σημαντικά να μειώσουν τόσο οργανική ύλη όσο και θρεπτικά συστατικά με ελάχιστο ενεργειακό κόστος σε απλούς φωτοβιοαντιδραστήρες (Mulbry et al., 2005). Η αναερόβια επεξεργασία, αν και κατάλληλη για μεγάλο εύρος συγκεντρώσεων οργανικής ύλης που εμφανίζονται στα απόβλητα, δεν είναι αποτελεσματική στην απομάκρυνση των ανόργανων θρεπτικών αλάτων. Μάλιστα, πολλοί δυσδιάλυτοι και τοξικοί παράγοντες είναι ευκολότερο να αποικοδομηθούν με αερόβιες παρά σε αναερόβιες διαδικασίες (Muñoz and Guieysse, 2006). Εκτός από τον οργανικό άνθρακα, στα απόβλητα υπάρχουν σημαντικές ποσότητες αζώτου, φωσφόρου και άλλων ανόργανων αλάτων τα οποία προκαλούν ευτροφισμό στα υδάτινα οικοσυστήματα. Τα μικροφύκη είναι οργανισμοί που διαθέτουν κάποιους μηχανισμούς απομάκρυνσης μεταλλικών στοιχείων καθώς απορροφούν εύκολα άζωτο και φώσφορο από ένα πλούσιο θρεπτικό υπόστρωμα αυξάνοντας γρήγορα τη βιομάζα τους. 8

32 Εισαγωγή Η αποτελεσματική ανάπτυξή τους στα λύματα εξαρτάται από διάφορες μεταβλητές όπως είναι το pη, η θερμοκρασία του μέσου ανάπτυξης, η συγκέντρωση των απαραίτητων θρεπτικών συστατικών καθώς και οι αναλογίες αυτών (αζώτου, φωσφόρου) αλλά και η διαθεσιμότητα του φωτός, του O 2 και του CO 2. Η παρουσία των μετάλλων όπως το κάδμιο ή ο υδράργυρος ή οργανικών χημικών ουσιών είναι ένας άλλος κρίσιμος παράγοντας ανάπτυξης των μικροφυκών στα λύματα. Βιοτικοί παράγοντες που μπορεί επίσης να επηρεάσουν αρνητικά την ανάπτυξη των μικροφυκών είναι τα παθογόνα βακτήρια ή το επιθετικό ζωοπλαγκτόν οι οποίοι συχνά ανταγωνίζονται τα μικροφύκη για τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά. Τέλος, η αρχική πυκνότητα των μικροφυκών στα λύματα είναι εξίσου πιθανό να είναι ένας κρίσιμος παράγοντας για την ανάπτυξη του συνολικού πληθυσμού. Όλοι οι παραπάνω παράγοντες μεταβάλλονται ανάλογα με τον τύπο των λυμάτων και τον χώρο επεξεργασίας τους Αστικά απόβλητα Τα αστικά υγρά απόβλητα προέρχονται από διαφορετικές ροές και περιέχουν νερά από εσωτερική οικιακή χρήση, απορροές τουαλέτας (περιττώματα, ουρία, υλικά καθαρισμού) αλλά και νερά της βροχής μαζί με το σύνολο του αποχετευτικού δικτύου. Στα λύματα αυτά απαντάται ένας μεγάλος αριθμός παθογόνων μικροοργανισμών καθώς και θρεπτικά συστατικά οργανικής και μη φύσεως με άζωτο, φώσφορο, κάλιο κτλ. Βέβαια, η σύσταση των οικιακών υγρών αποβλήτων ποικίλει ανά τον κόσμο σύμφωνα με το είδος διαβίωσης που αναπτύσσεται κάθε φορά (Πίνακας 1.1). Πίνακας 1.1: Ενδεικτικές τιμές για την σύσταση ακατέργαστων υγρών αστικών αποβλήτων σε διάφορες χώρες του κόσμου (Van Haandel and Lettinga, 1994; Βαγενάς, 2003). Χαρακτηριστικά Βραζιλία Κολομβία Ολλανδία Γκάνα Ελλάδα TSS (mgl 1 ) VSS (mgl 1 )

33 Εισαγωγή BOD (mgl 1 ) COD (mgl 1 ) TN (mgl 1 ) TP (mgl 1 ) Αλκαλικότητα (mg CaCO 3 L 1 ) Η συμβατική επεξεργασία αστικών λυμάτων περιλαμβάνει τη πρωτοβάθμια φάση επεξεργασίας στην οποία πραγματοποιείται ιζηματοποίηση των στερεών υλικών, τη δευτεροβάθμια φάση επεξεργασίας στην οποία οξειδώνονται τα οργανικά υλικά και τη τριτοβάθμια στην οποία γίνεται επιπλέον επεξεργασία του νερού πριν την απόρριψή του στο περιβάλλον. Κατά τη διάρκεια της τριτοβάθμιας φάσης πραγματοποιείται η απομάκρυνση πολλών διαλυμένων ανόργανων ενώσεων, όπως του αζώτου και του φωσφόρου και κατ επέκταση είναι το καταλληλότερο σημείο για τη χρήση καλλιέργειας μικροφυκών (Bellou et al., 2014). Για την επεξεργασία τέτοιων λυμάτων είχαν χρησιμοποιηθεί μικροφύκη σε ανοιχτές λίμνες ήδη από το 1970 (Gloyna E. F., 1976). Ωστόσο, υπήρχε το θεμελιώδες πρόβλημα του υψηλού κόστους συγκομιδής των μικροφυκών με τη χρήση χημικών κροκιδωτικών μέσων. Μέχρι τώρα, η τεχνολογία χρήσης μικροφυκών χρησιμοποιείται σε προεπεξεργασμένα αστικά και ορισμένα βιομηχανικά υγρά απόβλητα, στην τριτοβάθμια επεξεργασία ή σε άλλα προχωρημένα στάδια (Εικόνα 1.2) (Safonova et al., 2004; Muñoz and Guieysse, 2006; Wang et al., 2010; Wen et al., 2016). Μερικά είδη μικροφυκών είναι ιδιαίτερα ανεκτικά σε συνθήκες αστικών υγρών αποβλήτων, κυρίως από τα γένη Chlorella και Scenedesmus όπου και εστιάζονται οι περισσότερες μελέτες (Oswald et al., 1957; Martıńez et al., 2000; Wang et al., 2010; Cai et al., 2013; Taşkan, 2016). Σύμφωνα με τους Lau et al. (1995) το στέλεχος C. vulgaris κατάφερε να απομακρύνει πάνω από το 90% του αζώτου και το 80% του φωσφόρου από την πρωτοβάθμια επεξεργασία λυμάτων. Σε μελέτη των Bhatnagar et al. (2010) διερευνήθηκε το είδος Chlorella minutissima, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την βιοαποικοδόμηση αστικών λυμάτων σε λίμνες οξείδωσης στην Ινδία, όπου βρέθηκε ότι μπορεί να αναπτυχθεί ετερότροφα (στο σκοτάδι) και μιξότροφα (στο φως), αξιοποιώντας διαφορετικά υποστρώματα οργανικού άνθρακα σε ευρεία κλίμακα ph. Η καλλιέργεια αυτού του είδους έδειξε σε μιξότροφες 10

34 Εισαγωγή συνθήκες παραγωγή βιομάζας που άγγιζε τα 379 mg L 1 και 14.9% λιπίδια ξηρού βάρους, σε σύγκριση με τη βιομάζα των mg L 1 που παράχθηκε σε φωτοαυτότροφες συνθήκες με μόλις 5.4% λιπίδια ξηρού βάρους. Η παραγωγικότητα της βιομάζας και των λιπιδίων υπό μιξότροφες συνθήκες έφτασε τα 27.7 και 4.1 t ha 1 y 1, αντίστοιχα ενώ υπό φωτότροφες συνθήκες είναι μόλις 5.3 και 0.29 t ha 1 y 1, αντίστοιχα. Σε παρόμοιες μελέτες με χρήση των αστικών λυμάτων ως υπόστρωμα για την καλλιέργεια μικροφυκών, το είδος Chlamydomonas reinhardtii βρέθηκε να συσσωρεύει μέχρι και 25.25% λιπίδια ανά ξηρό βάρος ενώ απομάκρυνε ταυτόχρονα 83% αζώτου και 14.5% φωσφόρου, φτάνοντας σε 2 g (L d) 1 παραγωγικότητα βιομάζας (Kong et al., 2010). Εικόνα 1.2: Λύματα με ελαιογόνα μικροφύκη σε δεξαμενή μονάδας επεξεργασίας αποβλήτων στο Σαν Φραντσίσκο, όπου η NASA έχει συγκροτήσει εγκαταστάσεις για το πρόγραμμα OMEGA ( Αγροτοβιομηχανικά απόβλητα Οι αγροτοβιοµηχανίες είναι µονάδες, οι οποίες επεξεργάζονται προϊόντα µε στόχο την παραγωγή εδώδιμων αγαθών. Στην Ελλάδα αλλά και στην ευρύτερη περιοχή της μεσογείου υπάρχει πληθώρα αγροτοβιομηχανικών μονάδων, μικρές, μικρομεσαίες αλλά και αρκετές μεγάλες μονάδες, κυρίως κτηνοτροφίας, γαλακτοκομίας και ελαιοτριβεία, τα οποία απελευθερώνουν μεγάλες ποσότητες 11

35 Εισαγωγή λυμάτων. Η μεγάλη διασπορά στις περισσότερες εγκαταστάσεις δυσχεραίνει την μαζική επεξεργασία τους, γι αυτό και η κάθε μονάδα αναλαμβάνει αυτόνομα την διαχείριση των αποβλήτων της. Συνολικά, ανάλογα µε το είδος των παραγόμενων αγαθών μπορεί να γίνει η κατηγοριοποίησή τους ως εξής: α) γαλακτοβιομηχανίες, β), κονσερβοποιίες γ) ζυθοποιίες και οινοποιίες, δ) βιομηχανίες παραγωγής και συσκευασίας κρέατος (συμπεριλαμβανομένων των κτηνοτροφικών μονάδων και των ορνιθοτροφείων), ε) βιομηχανίες παραγωγής ποικίλων τροφών όπως ζάχαρη, καφές, ρύζι, σταφίδα κλπ.. Η σταφίδα, πιο συγκεκριμένα, αποτελεί έως και το 75% του συνόλου των ελληνικών εξαγωγών καθώς αρκετοί νομοί στην Ελλάδα (Αχαΐας, Ηρακλείου, Κορινθίας) έχουν καλλιεργήσιμες εκτάσεις αμπελιών που οδηγούνται προς τυποποίηση κορινθιακής σταφίδας ή σουλτανίνας σε αντίστοιχες μονάδες της Κρήτης και της Πελοποννήσου. Τα αγροτοβιομηχανικά απόβλητα περιέχουν οργανικό φορτίο σε συγκεντρώσεις που ποικίλουν σημαντικά, ανάλογα µε την πρώτη ύλη που χρησιμοποιείται, αλλά και ανάλογα µε το είδος του παραγόμενου προϊόντος. Σε πολλές περιπτώσεις οι αγροτοβιομηχανίες έχουν περιοδική λειτουργία κατά τη διάρκεια του έτους, µε συνέπεια την εποχιακή παραγωγή αποβλήτων, γεγονός που καθιστά δύσκολη την επεξεργασία τους. Η εντατικοποίηση της αγροτοβιομηχανικής παραγωγής και η διάθεση στην ξηρά των αποβλήτων και των λυμάτων που δημιουργούνται έθεσαν μια σειρά από περιβαλλοντικά ζητήματα, μεταξύ των οποίων είναι ο ευτροφισμός, η επιφανειακή και η υπόγεια ρύπανση των υδάτων, οι οσμές, οι εκπομπές αερίων κλπ. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία έχουν αναπτυχθεί διάφορες μέθοδοι για την επεξεργασία αυτών των αποβλήτων. Αυτές που παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον είναι οι βιολογικές διεργασίες, όπως η αερόβια και η αναερόβια χώνευση, με την αερόβια να πλεονεκτεί καθώς συνδυάζει υψηλές αποδόσεις με χαμηλό πάγιο και λειτουργικό κόστος (Paraskeva and Diamadopoulos, 2006; Michailides et al., 2011). Ωστόσο, αυτές οι τεχνικές επιτυγχάνουν μόνο δευτεροβάθμια επεξεργασία των αποβλήτων, πράγμα που σημαίνει ότι αφαιρούν τους οργανικούς ρύπους και ελάχιστα τους ανόργανους. Η αφαίρεση των ανόργανων ρύπων απαιτεί πολύ ακριβές φυσικοχημικές μεθόδους και ειδικά η αφαίρεση του φωσφόρου, ο οποίος είναι από τους πιο δύσκολος ρύπος που μπορεί να απομακρυνθεί (Morse et al., 1998; Boyer et al., 2011). 12

36 Εισαγωγή Ωστόσο, κάποια είδη μικροοργανισμών (π.χ. κυανοβακτήρια) κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες καλλιέργειας (π.χ. μιξότροφες) μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη βιολογική αποδόμηση τόσο οργανικών όσο και των ανόργανων ρύπων, υποστηρίζοντας μια δευτεροβάθμια/τριτοβάθμια επεξεργασία αποβλήτων με χαμηλό σχετικά κόστος. Αρκετά υψηλές αποδόσεις βιολογικής επεξεργασίας των αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων, μπορούν επίσης να επιτευχθούν και με την χρήση πολυκαλλιέργειας, δηλαδή τη χρήση ενός μείγματος διαφόρων ειδών μικροοργανισμών (όπως μικροφυκών και βακτηρίων). Κάθε ένα από τα είδη στην πολυκαλλιέργεια είναι περισσότερο αποδοτικό στην απομάκρυνση συγκεκριμένων ενώσεων σε σχέση με τα υπόλοιπα, επιτυγχάνοντας συνολικά καλύτερες απομακρύνσεις ρυπογόνων συστατικών (Markou and Georgakakis, 2011). Ανασκόπηση της βιβλιογραφίας υποδεικνύει ότι αρκετή μελέτη έχει γίνει πάνω στην επεξεργασία αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων με τη βοήθεια των μικροφυκών (σε εργαστηριακή επί τω πλείστον κλίμακα), με σκοπό όχι μόνο την εύρεση λύσης για τη διαχείρισή τους, αλλά και την παραγωγή βιομάζας που στη συνέχεια μπορεί να χρησιμοποιηθεί για παραγωγή βιοενέργειας. Παρακάτω δίνονται αναλυτικά όλες οι κατηγορίες αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων που έχουν εξεταστεί μέχρι σήμερα Απόβλητα ελαιοτριβείου Η ετήσια παγκόσμια παραγωγή βρώσιμων ελιών και ελαιολάδου έχει υπολογιστεί σε 8 και 1.6 εκατομμύρια τόνους αντίστοιχα, από ελαιοτριβεία. Στην περιοχή της Μεσογείου εντοπίζεται το 98% της συνολκής επιφάνειας που καλλιεργείται με ελαιόδεντρα (Sayadi et al., 2000). Στην Ελλάδα καλλιεργούνται περίπου ελαιόδεντρα που συνιστούν το 15% της παγκόσμιας ελαιοπαραγωγής. Η παραγωγή του ελαιολάδου, ανεξάρτητα διαδικασίας εξαγωγής του, συνοδεύεται και από σημαντικές ποσότητες υγρών και στερεών αποβλήτων παραπροϊόντων πλούσια σε ανόργανα και οργανικά στοιχεία. Ο όγκος των υγρών αποβλήτων που παράγεται κυμαίνεται από 0.55 έως 2 L kg 1 ελαιοκάρπου και εξαρτάται από την μεθοδολογία εξαγωγής του ελαιολάδου και τον τύπο ελαιοτριβείου (Λουτατίδου Σ., 2013). Κατ εκτίμηση, η μέση ετήσια παραγωγή υγρών αποβλήτων 13

37 Εισαγωγή στην Ελλάδα είναι περίπου 15x10 8 L (Γεωργακαράκος K., 2013). Στις ελαιοπαραγωγικές χώρες της Μεσογείου, η παραγωγή υγρών αποβλήτων των ελαιοτριβείων έχει υπολογιστεί ότι ξεπερνά τα 300x10 8 L κάθε χρόνο (Niaounakis and Halvadakis, 2004). Τα απόβλητα των ελαιουργείων είναι από τα πιο τοξικά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα (χαμηλό ph, υψηλή συγκέντρωση λιπαρών οξέων, υψηλή ηλεκτρική αγωγιμότητα) δημιουργώντας ιδιαίτερα προβλήματα στις ελαιοπαραγωγικές χώρες της Μεσογείου. Κυρίως, χαρακτηρίζονται από υψηλή περιεκτικότητα σε πολυφαινόλες ( g L 1 ) και από υψηλό βαθμό οργανικής ρύπανσης (BOD, COD φθάνουν τα και mg L 1 αντίστοιχα) (Niaounakis and Halvadakis, 2004). Η διαχείριση των υγρών αποβλήτων των ελαιοτριβείων αποτελεί ένα χρόνιο και δισεπίλυτο πρόβλημα, λόγω της ιδιαίτερης σύστασής τους, της έντονης εποχικότητας αλλά και του όγκου παραγωγής. Οι βιολογικές μέθοδοι για την επεξεργασία τυγχάνουν παγκόσμιας εφαρμογής και βασίζονται στη χρήση συγκεκριμένων μικροοργανισμών ανάλογα με τις συνθήκες (αναερόβια, αερόβια) (Paraskeva and Diamadopoulos, 2006; Tziotzios et al., 2007; Michailides et al., 2011). Η ποσότητα των σακχάρων που περιέχονται στο απόβλητο επιτρέπει την χρήση του ως υπόστρωμα για την ανάπτυξη ποικιλίας μικροοργανισμών (όπως βακτήρια, μύκητες και ζύμες) οι οποίοι βιοαποικοδομούν μεγάλο μέρος των αρωματικών ενώσεων (Ξυπτέρας, 2008). Ωστόσο, η τοξικότητα των φαινολικών ενώσεων δεν επιτρέπει την ανάπτυξη σε πολλά είδη μικροοργανισμών περιορίζοντας με εκλεκτικό τρόπο ένα φάσμα ορισμένων κατηγοριών. Έτσι, τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά αυτών των αποβλήτων περιορίζουν τη χρήση των μικροφυκών ως μέθοδο βιολογικής επεξεργασίας τους. Γι αυτό, υπάρχουν σχετικά λίγες βιβλιογραφικές αναφορές οι οποίες κυρίως χρησιμοποιούν είτε επεξεργασμένο απόβλητο είτε αρκετά αραιωμένο ώστε να μειωθεί η συγκέντρωση των φαινολών και η θολερότητα του λύματος (Sánchez Villasclaras et al., 1996; Sánchez et al., 2001; Hodaifa et al., 2008; Markou et al., 2012). Η χρήση των Chlorella vulgaris, Scenedesmus ή Arthrospira platensis για παραγωγή βιομάζας με χρήση απόβλητο ελαιοτριβείου ως υπόστρωμα ανάπτυξης από τους Cicci et al. (2013) και αργότερα από τους De Benedetti et al. (2015) ανέδειξε την ανάγκη προεπεξεργασίας (φιλτράρισμα, αποστείρωση και αραίωση) του εν λόγο αποβλήτου πετυχαίνοντας παρόλα αυτά χαμηλά ποσοστά απομάκρυνσης COD (36.7%). Μέχρι τώρα, η χρήση διάφορων στελεχών μικροφυκών στοχεύει κυρίως στην απομάκρυνση των 14

38 Εισαγωγή φαινολικών συστατικών που εμπεριέχονται στο απόβλητο και όχι τόσο στην δυνατότητα απομάκρυνσης άλλων οργανικών και ανόργανων συστατικών (Pinto et al., 2003; Chiaiese et al., 2011) Γαλακτοκομικά απόβλητα Η βιομηχανία γαλακτοκομικών προϊόντων είναι μία από τις κύριες πηγές παραγωγής βιομηχανικών αποβλήτων στην Ευρώπη. Μαζί με τα απόβλητα ελαιοτριβείου, τα υγρά απόβλητα από τη βιομηχανία γάλακτος θεωρούνται από τα πιο επιβαρυμένα απόβλητα όσον αφορά τα ποιοτικά και ποσοτικά χαρακτηριστικά τους και μπορούν να προκαλέσουν ανάλογα με τη σύστασή τους 5 έως 15 φορές μεγαλύτερη ρύπανση από τα αστικά απόβλητα (Ανυφαντάκης, 2004). Η παραγωγή βασίζεται στην επεξεργασία του νωπού γάλακτος για την παρασκευή προϊόντων όπως γιαούρτι, παγωτό, βούτυρο, τυρί και διάφορα είδη επιδορπίων μέσω διαφορετικών διαδικασιών, όπως η παστερίωση, η πήξη, η διήθηση, η φυγοκέντρηση, η ψύξη κλπ.. Ο παραγόμενος όγκος των υγρών αποβλήτων είναι ευμετάβλητος και ανάλογος με τους διάφορους τύπους της βιομηχανίας, των τεχνικών διαδικασιών και του χρησιμοποιούμενου εξοπλισμού. Ο όγκος τους κυμαίνεται από 0.1 έως 10 λίτρα ανά λίτρο επεξεργαζόμενου γάλακτος (Μακρής et al., 2001; Balannec et al., 2005). Χαρακτηρίζονται από έντονο χρώμα, δυσάρεστη οσμή, υψηλό BOD, COD και μεταβλητό ph καθώς και από υψηλές συγκεντρώσεις αζώτου και φωσφόρου, απαραίτητα για τη βιολογική ανάπτυξη (Πίνακας 1.2) (Kothari et al., 2011; Carvalho et al., 2013). Συγκεκριμένα, τα υγρά απόβλητα τυροκομείου περιέχουν κυρίως τον ορρό γάλακτος, που προκύπτει από την παραγωγή του τυριού, τον δευτερογενή ορρό γάλακτος, που προκύπτει από την παραγωγή άλλων τυριών τύπου cottage (μυζήθρα) και το νερό που χρησιμοποιείται για την πλύση των αγωγών νερού και των δεξαμενών αποθήκευσης (απόνερα). Η ποσότητα των υγρών αποβλήτων τυροκομείου ποικίλλει ανάλογα με τη χώρα, το εργοστάσιο, τη μεθοδολογία που εφαρμόζει και τον τύπο του τυριού που παράγεται. Τα απόβλητα των τυροκομικών μονάδων έχουν συνήθως μια ασυνεχή παραγωγή, με αποτέλεσμα ο ρυθμός απορροής τους να αλλάζει σημαντικά (συνήθως μεγαλύτερη την καλοκαιρινή περίοδο). Οι συγκεντρώσεις των ρυπαντικών συστατικών στα απόβλητα εξαρτώνται από τη σύσταση του γάλακτος 15

39 Εισαγωγή από το οποίο προέρχεται (αγελαδινό, αίγειο, πρόβειο) και από τις τεχνολογικές επεμβάσεις που γίνονται κατά την επεξεργασία του (πήξη με ένζυμα, προσθήκη οξέων, θερμοκρασία αναθέρμανσης) (Vidal et al., 2000; Ανυφαντάκης, 2004; Καραδήμα, 2009). Τα υγρά γαλακτοκομικά απόβλητα προκαλούν σοβαρά περιβαλλοντικά προβλήματα (κυρίως λόγω του ορρού γάλακτος που απελευθερώνεται) καθώς περιέχουν μεγάλες ποσότητες οργανικών (κυρίως λακτόζη και πρωτεΐνες) και ανόργανων ουσιών αλλά και μικρότερες ποσότητες σε μη πρωτεϊνικές αζωτούχες ενώσεις (ουρία, ουρικό οξύ), κιτρικό οξύ και βιταμίνες συμπλέγματος Β. Μάλιστα, από 10 κιλά γάλα παράγεται 1 κιλό τυρί και 9 κιλά ορρός γάλακτος, δημιουργώντας προβλήματα διαχείρισης στην αντίστοιχη βιομηχανία παραγωγής (Pintado et al., 2001). Στην Ελλάδα μέχρι το 1998, τόνοι ορρού γάλακτος οδηγούνταν στην παραγωγή τυριών (μυζήθρα, ανθότυρο, μανούρι), τόνοι χρησιμοποιούνταν ως ζωοτροφή ενώ η υπόλοιπη ποσότητα ( τόνοι) απορρίπτονταν στο περιβάλλον (Philippopoulos and Papadakis, 2001; Ανυφαντάκης, 2004). Χαρακτηριστικό παράδειγμα ρύπανσης αποτελεί το ποτάμι του Βουραϊκού αλλά και ο παραπόταμος του Πηνειού ποταμού που δέχεται περίπου 700 τόνους ορρού γάλακτος το χρόνο από τα 60 περίπου τυροκομεία του νομού Λαρίσης (Καραδήμα, 2009; Χρήστου, 2011). Πίνακας 1.2: Χαρακτηριστικά υγρών αποβλήτων τυροκομείων στην Ελλάδα (Μακρής et al., 2001). Χαρακτηριστικά αποβλήτων Εύρος τιμών BOD5 (mg L 1 ) COD (mg L 1 ) Ολικά αιωρούμενα στερεά (TSS) (mg L 1 ) Ολικά Στερεά (TS) (mg L 1 ) Λίπη (mg L 1 ) Άζωτο (Ν) (mg L 1 ) Φώσφορος με τη μορφή ΡΟ4 (mg L 1 ) 3 70 Ασβέστιο (Ca) (mg L 1 ) Νάτριο (Na) (mg L 1 ) Κάλιο (Κ) (mg L 1 ) Συντελεστής Φόρτισης κιλά BOD5 / κιλό ανεπεξέργαστου γάλακτος 16

40 Εισαγωγή Όγκος Αποβλήτων m 3 / m 3 ανεπεξέργαστου γάλακτος ph Θερμοκρασία 0 C Με την ανάπτυξη της βιομηχανίας γαλακτοκομικών προϊόντων, η επεξεργασία των γαλακτοκομικών λυμάτων γίνεται μια σημαντική περιβαλλοντική πρόκληση σε πολλές χώρες. Οι κυριότερες μέθοδοι επεξεργασίας που έχουν εφαρμοστεί μέχρι σήμερα είναι φυσικοχημικής φύσης (Siso, 1996) ή βιολογικής αποικοδόμησης όπου συμμετέχουν διάφοροι μικροοργανισμοί (Metcalf, 2003; Τατούλης, 2012; Tatoulis et al., 2015; Sultana et al., 2016). Για την ανάπτυξη των μικροφυκών χρησιμοποιούνται ευρέως, μετά τα αστικά λύματα, τα γαλακτοκομικά απόβλητα στοχεύοντας όχι μόνο στην βιοαποικοδόμηση των συστατικών των λυμάτων αλλά και στην παραγωγή πολύτιμων βιοπροϊόντων από τη βιομάζα των μικροφυκών. Πληθώρα εργασιών αναφέρεται στη δυνατότητα επεξεργασίας ποικίλων γαλακτοκομικών υποστρωμάτων (από μονάδες βοοειδών, τυροκομείων, τυποποίησης κτλ.) με μονοκυτταρικές καλλιέργειες μικροφυκών ή συγκαλλιέργειες, σημειώνοντας υψηλά ποσοστά απομάκρυνσης θρεπτικών συστατικών με ταυτόχρονη παραγωγή λιπιδίων (Ayala and Vargas, 1987; Blier et al., 1995; Woertz et al., 2009; Kothari et al., 2012; Kothari et al., 2013). Ωστόσο, τα περισσότερα βιβλιογραφικά αναφερόμενα υποστρώματα ανάπτυξης αποτελούν εκροές από αναερόβια προεπεξεργασία με ήδη χαμηλές αρχικές συγκεντρώσεις COD και ανόργανων συστατικών (Wilkie and Mulbry, 2002; Levine et al., 2011; Chen et al., 2012). Εξίσου συχνή είναι η χρήση επεξεργασμένων αποβλήτων από μονάδες εκτροφής βοοειδών και παραγωγής γάλακτος (συνήθως αποστειρωμένα), όμως οι μελέτες αυτές στοχεύουν κυρίως μόνο στην απομάκρυνση του ρυπαντικού φορτίου τους από τα μικροφύκη και λιγότερο στη παραγωγή βιομάζας για ενεργειακούς σκοπούς (Lincoln et al., 1996; Kothari et al., 2013; Qin et al., 2014; Ummalyma and Sukumaran, 2014). Βιβλιογραφική ανασκόπηση δείχνει επίσης ότι η χρήση αποβλήτων τυροκομείου ή ορρού γάλακτος είναι περιορισμένη και επικεντρώνεται κυρίως στην παραγωγή μονοκυτταρικής βιομάζας και λιπιδίων (Abreu et al., 2012; EspinosaGonzalez et al., 2014; Girard et al., 2014; Girard et al., 2017). Για αυτό το λόγο, αναδεικνύεται η ανάγκη περαιτέρω εξέτασης των αποβλήτων τυροκομείου ως προς τη δυνατότητα βιοεπεξεργασίας τους με χρήση μικροφυκών με μια βιώσιμη τεχνική. 17

41 Εισαγωγή Κτηνοτροφικές μονάδες Απόβλητα χοιροστασίου Κύριο χαρακτηριστικό των χοιροτροφικών μονάδων είναι η εκτροφή μεγάλου αριθμού ζώων σε πολύ μικρό χώρο, γεγονός που δημιουργεί σημαντικά προβλήματα. Μέσα στη προσπάθεια αύξησης της παραγωγής δημιουργούνται εκτός από περιβαλλοντικά προβλήματα και σοβαρά θέματα δημόσιας υγιεινής. Τα απόβλητα των χοιροστασίων αποτελούνται κυρίως από τα κόπρανα, τα ούρα και τα νερά πλύσης, τα οποία σχηματίζουν ένα υλικό πολτού που περιέχει υψηλές ποσότητες οργανικών αλλά και ανόργανων συστατικών (Χαρτσά, 2007). Συνήθως, τα υγρά απόβλητα δημιουργούν σηπτικές καταστάσεις (ανάπτυξη μικροοργανισμών, δυσάρεστες οσμές) με αποτέλεσμα ο τελικός αποδέκτης να γίνεται ακατάλληλος για το οικοσύστημα. Η βιολογική επεξεργασία των χοιροτροφικών απόβλητων, προς το παρόν, δεν είναι ευρέως χρησιμοποιούμενη για την ανάπτυξη βιομάζας μικροφυκών. Ωστόσο, υπάρχουν εργασίες που βασίζονται σε επεξεργασμένα ή αραιωμένα λύματα χοιροτροφικών μονάδων για την παραγωγή βιομάζας και άλλων βιοπροϊόντων (πρωτεΐνες, λιπίδια) από κυανοβακτήρια και μικροφύκη (Chung et al., 1978; Kim et al., 2007). Ορισμένα είδη μάλιστα αντέχουν στις υψηλές συγκεντρώσεις των ανόργανων συστατικών όπως για παράδειγμα, το πράσινο μικροφύκος Botryococcus braunii όπου αναπτύχθηκε σε λύματα που περιείχαν 788 mg L 1 NO 3 και κατάφερε να απομακρύνει το 80% της αρχικής περιεκτικότητας. Η απόδοση λιπιδίων έφτασε το 17.85% επί της ξηρής βιομάζας (An et al., 2003). Στην έρευνα των de la Noue and Basséres (1989) εξετάστηκαν διάφορα στελέχη μικροφυκών (Chlorella, Scenedesmus, Phormidium bonheri) ως προς την δυνατότητα επεξεργασίας αραιωμένου, αναερόβια χωνεμένου λύματος χοιροστασίου, όπου επιτεύχθηκε 90% απομάκρυνση ορθοφωσφορικών αλλά και απομάκρυνση COD μεταξύ 6090% ανάλογα με το είδος που χρησιμοποιήθηκε. Η παραγωγικότητα της βιομάζας επίσης μεταβλήθηκε ανάλογα με το εξεταζόμενο είδος μεταξύ 3153 mg (L d) 1. Σχετικά πρόσφατα, οι Hu et al. (2012) και οι Zhu et al. (2013) χρησιμοποίησαν επεξεργασμένα και αποστειρωμένα υγρά λύματα χοιροστασίου για να εξετάσουν τα ποσοστά απομάκρυνσης COD, αζώτου και φωσφόρου με τα στελέχη Chlorella sp., ενώ 18

42 Εισαγωγή ταυτόχρονα αξιολογήθηκε και η παραγωγή ελαίου. Το ποσοστό απομάκρυνσης για το COD κυμάνθηκε μεταξύ 5873%, για το ολικό άζωτο έφτασε μέχρι και την τιμή του 82%, ενώ για το φώσφορο μέχρι και 100%. Η παραγωγή ελαίου ήταν μεγαλύτερη για τους Zhu et al. (2013) με 45.8% ξηρής βιομάζας ενώ για τους Hu et al. (2012) ήταν 27%. Επίσης ικανοποιητικά ποσοστά απομάκρυνσης επετεύχθησαν (σε 50% αραιωμένο απόβλητο χοιροστασίου) και με το κυανοβακτήριο Spirulina maxima από τους Canizares and Dominguez (1993), φτάνοντας σε 98% για τα ορθοφωσφορικά (53% ολικού φωσφόρου) και 75% για τα αμμωνιακά άλατα, χωρίς ωστόσο να αξιολογηθεί η παραγωγή ελαίων. Πτηνοτροφικά απόβλητα Tα απόβλητα πτηνοτροφείου αποτελούνται κυρίως από κοπριά και απόβλητα σφαγείων πουλερικών. Τα απόβλητα αυτά περιέχουν υψηλές συγκεντρώσεις ολικού αζώτου (46 g kg 1 κοπριάς) και αμμωνίας (14.4 g kg 1 κοπριάς) με αποτέλεσμα να είναι απαραίτητη η αραίωση για να χρησιμοποιηθούν ως μέσο καλλιέργειας στα μικροφύκη. Ως εκ τούτου, η επεξεργασία αποβλήτων πουλερικών με τη χρήση μικροφυκών είναι σπάνια ή εξετάζεται η χρήση τους σε ανάμειξη με άλλα είδη αποβλήτων (Bhatnagar et al., 2011). Συνήθως, γίνεται χρήση του λύματος που προκύπτει από την αναερόβια χώνευση πτηνοτροφικών αποβλήτων για την ανάπτυξη βιομάζας μικροφυκών (Singh et al., 2011b). Αναφέρεται η μελέτη από τους Mahadevaswamy and Venkataraman (1986), οι οποίοι χρησιμοποίησαν το στέλεχος Spirulina platensis σε λύματα πουλερικών (2% απόβλητο) και κατέγραψαν συγκέντρωση βιομάζας περίπου 110 mg L 1, που ήταν περίπου 20% χαμηλότερη από τη βιομάζα που επιτεύχθηκε στην καλλιέργεια με χρήση συνθετικού αποβλήτου Άλλες βιομηχανικές μονάδες Τα υγρά βιομηχανικά απόβλητα περιέχουν περισσότερα είδη ρυπαντών σε σχέση με τα υγρά αστικά απόβλητα και πρέπει να προσδιορίζονται για κάθε βιομηχανική δραστηριότητα χωριστά. Τα υγρά βιομηχανικά απόβλητα μεταφέρουν κατά κανόνα σημαντικό ρυπαντικό φορτίο, που διαφοροποιείται τόσο από κλάδο σε 19

43 Εισαγωγή κλάδο βιομηχανίας, όσο και μεταξύ παρόμοιων βιομηχανιών, ανάλογα με τις πρώτες ύλες που χρησιμοποιούνται και με την παραγωγική διαδικασία που εφαρμόζεται. Σε ορισμένες περιπτώσεις, κάποια ρεύματα αποβλήτων απαιτούν ειδική διαχείριση σε σχέση με τα υπόλοιπα και είτε ανακυκλώνονται μετά από κατάλληλη επεξεργασία (π.χ. όξινα υγρά απόβλητα από διεργασίες παραγωγής στη σιδηροβιομηχανία και τις επιμεταλλώσεις), είτε αποθηκεύονται και εν συνεχεία υπόκεινται σε χωριστή επεξεργασία και διάθεση όπως τα τοξικά απόβλητα. Έτσι, τα προκύπτοντα βιομηχανικά υγρά απόβλητα είναι ετερογενή ως προς τη σύσταση και τον όγκο τους καθώς κάθε μονάδα επεξεργασίας εμπλέκει διαφορετικές ενώσεις με την πλειοψηφία των βιομηχανιών με μη συνεχόμενη λειτουργία και αποτέλεσμα έντονες διακυμάνσεις μεταξύ τους αλλά και με το χρόνο (Γεωργιοπούλου, 2007). Ενδεικτικά χαρακτηριστικά φαίνονται στον Πίνακα 1.3. Πίνακας 1.3: Χαρακτηριστικά και ενδεικτικές τιμές υγρών βιομηχανικών αποβλήτων (Rajeshwari et al., 2000; De Mes et al., 2003) Όγκος m 3 / τόνο παραγόμενου προϊόντος BOD COD 3060 g L g L 1 ph 312 Θερμοκρασία o C Ρυπαντές Φαινόλες, πίσσα, άργιλος, γύψος, βαρεά μέταλλα, κυανιούχα άλατα, θειούχα, απορρυπαντικά, λιπαρά Οι κλάδοι βιομηχανίας που επιβαρύνουν το περιβάλλον με νιτρικά ή άλλες αζωτούχες ενώσεις είναι η βιομηχανία τροφίμων και ποτών (αλλαντοποιία, ζυθοποιία, γαλακτοκομία) και η βιομηχανία χημικών (χαρτοποιία, λιπασμάτων, λιπαντικών) (Ghafari et al., 2008). Συγκεκριμένα, τα απόβλητα από τις βιομηχανίες τροφίμων είναι πλούσια σε οργανικές ενώσεις (7090% των ολικών στερεών) αλλά περιέχουν μεγάλες ποσότητες νερού (πάνω από 90% κατά βάρος) που τα καθιστούν συνήθως αραιότερα από άλλα απόβλητα (π.χ. πτηνοκτηνοτροφικά). Έχει αναφερθεί ότι μέχρι το έτος 2003 οι βιομηχανίες σε όλο τον κόσμο κατανάλωναν περίπου 665 δισεκατομμύρια τόνους νερού ετησίως. Αν και οι ποσότητες νερού ποικίλλουν ανάλογα με την χρήση για την οποία προορίζονται τα περισσότερα βιομηχανικά απόβλητα περιέχουν περισσότερα βαρέα μέταλλα και λιγότερο άζωτο ή φώσφορο 20

44 Εισαγωγή από άλλα υγρά απόβλητα. Κατ επέκταση υπάρχουν λιγότερες δυνατότητες αξιοποίησης των βιομηχανικών λυμάτων για παραγωγή βιομάζας σε μεγάλη κλίμακα. Σημαντική όμως είναι η συνεισφορά των μικροφυκών στην αποκατάσταση των βιομηχανικών υγρών αποβλήτων και από βαρέα μέταλλα (κάδμιο, χρώμιο, ψευδάργυρο κτλ.) αλλά και χημικές τοξικές ουσίες (βιοκτόνα κτλ.). Στα βιομηχανικά απόβλητα λόγω των χαμηλών συγκεντρώσεων αζώτου και φωσφόρου και των υψηλών συγκεντρώσεων τοξικών, οι ρυθμοί ανάπτυξης των μικροφυκών είναι χαμηλότεροι και για το λόγο αυτό, η συμμετοχή ποικίλων ειδών με διαφορετικά μεταβολικά μονοπάτια, καθιστά πιο βιώσιμη την ανάπτυξη βιομάζας σε μεγαλύτερη κλίμακα. Η επιλογή στελεχών μικροφυκών με υψηλή ικανότητα απορρόφησης μετάλλων είναι ζωτικής σημασίας για την επίτευξη υψηλής αποδοτικότητας στην αφαίρεση αυτών. Μέχρι στιγμής μόνο λίγα είδη φυκών έχουν μελετηθεί ως προς την ικανότητα απορρόφησης μετάλλων. Ωστόσο αρκετές έρευνες αξιολογούν την αφαίρεση αζώτου, φωσφόρου και βαρέων μετάλλων από βιομηχανικά απόβλητα, ως μέσο ανάπτυξης φυκών (Cai et al., 2013). Στην έρευνα των Chinnasamy et al. (2010) χρησιμοποιήθηκε πολυκαλλιέργεια (15 στελέχη) μικροφυκών, μεταξύ των οποίων στελέχη των Botryococcus, Chlorella, Dunaliella, Nannochloris και Spirulina, για την επεξεργασία αναμεμειγμένου αποβλήτου ταπητοποιείας (8590%) με αστικό απόβλητο (1015%). Η πολυκαλλιέργεια κατάφερε να απομακρύνει μέχρι και το 99.8% των νιτρικών αλλά και το 99.1% των φωσφορικών αλάτων. Επίσης, επιτεύχθηκε παραγωγικότητα βιομάζας μεταξύ τόνους ανά εκτάριο το χρόνο, αλλά η απόδοση σε έλαιο έφτασε μόλις το 6.82% ξηρής βιομάζας. Αργότερα, σε έρευνα των Wu et al. (2012) χρησιμοποιήθηκε απόβλητο από βιομηχανικό πάρκο στη Ταϊβάν όπου επιτεύχθηκε αφαίρεση 100% αμμωνίας και νιτρικών αλάτων καθώς και 33% ορθοφωσφορικών, όταν χρησιμοποιήθηκε στέλεχος του Chlamydomonas sp. Παράλληλα, προσδιορίστηκε και η παραγωγή ελαίου που έφτασε τα 18.4% ξηρής βιομάζας, κατάλληλο για βιοντίζελ. Η χρήση μικροφυκών στην βιολογική επεξεργασία αποβλήτων από τη βιομηχανία παραγωγής τροφίμων και ποτών είναι σπάνια ή εξετάζεται συνήθως σε συνδυασμό με άλλα είδη αποβλήτων (Cai et al., 2013; Ji et al., 2015). Για παράδειγμα, οι Shin et al. (2015) χρησιμοποίησαν αναερόβια χωνεμένο απόβλητο βιομηχανίας τροφίμων σε μείξη με αστικό απόβλητο ως υπόστρωμα ανάπτυξης του 21

45 Εισαγωγή Scenedesmus bijuga και κατέγραψαν παραγωγικότητα βιομάζας μέχρι και mg (L d) 1. Επίσης, επιτεύχθηκε παραγωγή 35.06% ελαίου ξηρής βιομάζας κατάλληλο για βιοντίζελ ενώ, παράλληλα, σημειώθηκε απομάκρυνση COD, ολικού αζώτου και φωσφόρου μέχρι και 66.4%, 90.7% και 90.5%, αντίστοιχα. Αξίζει να αναφερθεί η εργασία των Rodrigues and Oliveira (1987), οι οποίοι χρησιμοποίησαν βιομάζα μικροφυκών σε ανοιχτές δεξαμενές για να επεξεργαστούν απόβλητα τοματοβιομηχανίας. Η παραγωγικότητα που επιτεύχθηκε ήταν g ξηρής βιομάζας/m 2 d, με απομάκρυνση COD και αμμωνίας μέχρι 94.6% και 96.2%, αντίστοιχα. Να αναφερθεί ότι, κάποια είδη βιομηχανικών αποβλήτων, όπως είναι τα απόβλητα από βιομηχανίες παραγωγής αποξηραμένων φρούτων (π.χ. σταφίδας κλπ.) έχουν εξεταστεί ελάχιστα, και μάλιστα μόνο υπό ασηπτικές συνθήκες με χρήση συγκεκριμένων ειδών μονοκαλλιέργειας. Στην εργασία των Kim and Im (2012) για την ανάπτυξη των στελεχών Botryococcus και Neochloris χρησιμοποιήθηκε (υπό ασηπτικές συνθήκες) απόβλητο σταφίδας, το οποίο ενισχύθηκε με νιτρικά άλατα, και καταγράφηκε η μέγιστη ανάπτυξη βιομάζας των 4 g L 1 και 1.5 g L 1, για τα δύο είδη αντίστοιχα. Βιομηχανία παραγωγής ποτών (οινοποιείο/ζυθοποιείο/αποστακτήριο) Η βιομηχανίες αυτές παράγουν μεγάλες ποσότητες αποβλήτων με υψηλό οργανικό φορτίο. Επί του παρόντος, υπάρχουν αρκετές τεχνολογίες για την επεξεργασία των εν λόγω αποβλήτων, ωστόσο το πιο σημαντικό κριτήριο για την επιλογή του συστήματος είναι η ευελιξία που θα παρέχει προκειμένου να ξεπερνιέται το πρόβλημα των συνεχών διακυμάνσεων του οργανικού φορτίου, διατηρώντας τη διεργασία επεξεργασίας οικονομικά βιώσιμη. Tα απόβλητα αυτά χαρακτηρίζονται από χαμηλό ph, ίχνη μετάλλων (Κ, Na, Ca, Mg) και βιοαποικοδομήσιμους οργανικούς άνθρακες. Γι αυτό συνήθως προεπεξεργάζονται με αναερόβια χώνευση ώστε να μειωθεί το υψηλό οργανικό φορτίο και στη συνέχεια το εναπομείναν να μπορεί να αποτελέσει μια εν δυνάμει πηγή οργανικού άνθρακα για την ανάπτυξη των μικροφυκών (Travieso et al., 2008). Ωστόσο, οι πιο πολλές εργασίες έχουν πραγματοποιηθεί με τεχνητά απόβλητα οινοποιείων / ζυθοποιείων (Mata et al., 2012b). Επίσης, εξετάστηκαν κυρίως στελέχη του γένους Chlorella επιτυγχάνοντας απομακρύνσεις οργανικών και ανόργανων συστατικών από απόβλητα ζυθοποιίας 22

46 Εισαγωγή μέχρι και 70% για το COD, 90% για το άζωτο και 80% για το φώσφορο (de J. Raposo et al., 2010; Farooq et al., 2013). Η παραγωγή ελαίου σημείωσε ικανοποιητικά ποσοστά μεταξύ 10.7 και 18.8% ξηρής βιομάζας (Πίνακας 1.4). Το Chlorella vulgaris εξετάστηκε επίσης μαζί με το Arthrospira platensis (Spirulina) από τους Casazza et al. (2016) σε απόβλητα οινοποιείου προς παραγωγή βιομάζας που έφτασε στα 0.65g L 1 και 1.5 g L 1 για τα δύο είδη, αντίστοιχα. Επίσης, τα ποσοστά απομάκρυνσης αζώτου άγγιξαν το 100 και 90% για τα δύο είδη, αντίστοιχα. Η παραγωγή μεθυλεστέρων λιπαρών οξέων έφτασε τα 19.7 mg / 100 g ξηρής βιομάζας C.vulgaris ενώ 16.4 mg / 100 g ξηρής βιομάζας A. platensis. Πίνακας 1.4: Βιβλιογραφική ανασκόπηση χρήσης μικροφυκών για επεξεργασία αποβλήτων και παραγωγή βιομάζας. 23

47 Εισαγωγή Μικροοργανισμοί Θρεπτικό υπόστρωμα Συνθήκες Chlorella vulgaris UTEX2714 με βακτήρια γηγενή του αποβλήτου Νηματοειδή κυανοβακτήρια, Bacteroidia, Flavobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria Chlorella vulgaris, βακτήρια Phormidium autumnale, Pseudanabaena sp., Chrococcus sp., Scenedesmus acutus, Monoraphidium contortum, Cymbella minuta Oscillatoria sp., Spirulina platensis Leptolyngbya sp. ISTCY101 Υψηλά συμπυκνωμένο υγρό αστικών αποβλήτων χωρίς στερεά (με ή χωρίς αποστείρωση) Επεξεργασμένο αστικό απόβλητο Επεξεργασμένα στραγγίσματα των ΧΥΤΑ Τεχνητό αστικό απόβλητο Συνθετικό λύμα από δευτερεύουσα ενεργός ιλύς + 1% NaHCO 3 Επεξεργασμένο αστικό απόβλητο (διήθηση, αποστείρωση) Διαλείπουσα λειτουργία, 25±2 o C, φως έντασης 50μmol m 2 s 1 Διαλείπουσα λειτουργία, 360μΕ m 2 s 1, Φως: σκοτάδι 12:12h, μmol m 2 s 1, 1012h φως Προσκολλημένα συστήματα με τσιμεντένια πλάκα, 1924 o C, Ακτινοβολία MJ m 2 d 1 Ανοιχτή συνεχής καλλιέργεια, συνεχής φωτισμός, 3033 o C Διαλείπουσα και ημισυνεχής λειτουργία, Μαρμάρινη πλάκα προσκόλλησης, Συνεχής φωτισμός 50μΕ m 2 s 1, 30 o C Απομάκρυνση % % COD Άζωτο Φώσφορος Ελαίου Επιπλέον στοιχεία Μεγαλύτερη παραγωγή βιομάζας στο μη αποστειρωμένο TKN 64.8 Παραγωγικότητα βιομάζας 10.9 g m 2 d 1 Βιβλιογραφία Ma et al. (2014) Su et al. (2011) Gutzeit et al. (2005) 3697 Παραγωγικότητα βιομάζας g m 2 d 1, Υψηλότερες αποδόσεις στο συνεχή φωτισμό Sukačová et al. (2015) 96 NO 3 82 PO 4 μ= 0.910d 1 Hashimoto and Furukawa (1989) 100 ΝΟ ΝΗ w/w μ= d 1, παραγωγικότητα βιομάζας 2.93 g m 2 d 1 Singh and Thakur (2015) 24

48 Εισαγωγή Leptolyngbya sp. JPMTW1 (KF977831) Chlorococcum sp. Neochloris vigensis Scenedesmus rubescens Micractinium sp., Chlorella sp. (Μεικτή καλλιέργεια) Coelastrum microporum Ετερότροφα βακτήρια Desmodesmus sp. Μεικτή καλλιέργεια Actinastrum, Chlorella sp., Chlorococcum sp. Closterium sp. Golenkinia sp. Micractinium sp. Nitzschia sp. Scenedesmus, Spirogyra Arthrospira platensis, Chlorella Αστικά απόβλητα (στραγγίσματα ΧΥΤΑ), Ακατέργαστο απόβλητο Συνθετικό απόβλητο (αποστειρωμένο) Ακατέργαστα οικιακά λύματα και απόβλητα εμπορικής βιομηχανίας Αστικά απόβλητα αναερόβιας χώνευσης (αραίωση) Εκροή χωρίς αφρό από λιμνοδεξαμενή επεξεργασίας Αστικά λύματα, Γαλακτοκομικά απόβλητα Aναερόβια επεξεργασμένα λύματα κοπριάς βοοειδών Συνεχής φωτισμός 1837lux, 27±2 o C, 21±2 o C, διαλείπουσα λειτουργία, συνεχής φωτισμός μmol m 2 s 1 Διαλείπουσα λειτουργία, 21 o C, C/N =5, Φως 925μmol m 2 s 1, DO <1.9 mgl 1 120μmol m 2 s 1, DO=9.4 mgl 1, N/P= 1216, 20 o C, Φως:σκοτάδι 12:12h, 36:12h, 60:12h Ανοιχτή διαλείπουσα λειτουργία 20L, Φως: σκοτάδι 12:12h, DO= mgl 1 16:8h φως: σκοτάδι, 4300lux, Ημισυνεχής καλλιέργειες με αραιώσεις και προσθήκη CO 2 Υπαίθρια, μικρής κλίμακας 20L διαλείπουσα λειτουργία 1525 o C, 34W φως, αραίωση 50%, προσθήκη ΝαHCO 3 0.5% w/w w/w w/w Παραγωγικότητα βιομάζας mg (L d) 1, Μείωση TDS 12.85% Παραγωγικότητα βιομάζας 31 g m 2 d C Καλύτερες αποδόσεις σε 12:12h φως : σκοτάδι PO NH 4 ~95 NH 3 ~51 NO PO w/w 814 (10% αραίωσ η) 1029 (25% αραίωση) Μείωση 99.8 ολικών κολοβακτηριδίων Παραγωγικότητα λιπιδίων 24 mg (L d) 1 για αστικά, 17 mg (L d) 1 για γαλακτοκομικά Maity et al. (2014) Aravantinou et al. (2013) Valigore et al. (2012) Lee et al. (2015) Komolafe et al. (2014) Woertz et al. (2009) ~41 Lincoln et al. (1996) 25

49 Εισαγωγή Chlamydomonas polypyrenoideum Chlorella, Scenedesmus, Synechocystis, Phormidium, Pseduanabaena, Limnothrix Chlorella sp. (μεικτή καλλιέργεια με βακτήρια) Chlorella pyrenoidosa Microspora willeana, Oedogonium sp., Rhizoclonium hieroglyphicum Ulothrix ozonata Chlorella protothecoides Chlorella vulgaris Απόβλητα βιομηχανίας γαλακτοκομικών με αραίωση Λύμα από αναερόβια χώνευση γαλακτοκομικών αποβλήτων και χημικά προεπεξεργασμένο αναερόβιας χώνευσης Γαλακτοκομικά απόβλητα σε αερόβιες συνθήκες Ακατέργαστα και επεξεργασμένα γαλακτοκομικά απόβλητα (αραιωμένα, αποστειρωμένα) Ακατέργαστα λύματα γαλακτοβιομηχανίας Αναερόβια χωνεμένα λύματα γαλακτοβιομηχανίας Υδρολυμένο διήθημα ορρού γάλακτος, μίγμα γλυκόζης και γαλακτόζης Επεξεργασμένα λύματα γαλακτοβιομηχανίας με UV ή ΝαClO Διαλείπουσα λειτουργία, 28±2 o C, ένταση φωτός 10W/m 2, Φωτοπερίοδος 12:12h Ημιδιαλείπουσα λειτουργία, 18±2 ο C, Συνεχής φωτισμός 100μΕ m 2 s 1, N/P =7276 Διαλείπουσα λειτουργία, 2031 ο C, φως: σκοτάδι 15:9h Διαλείπουσα λειτουργία, 25±1 o C, φως 10 W/m 2, Φως: σκοτάδι 12:12h Εξωτερικά προσκολλημένα συστήματα με τσιμέντο, Προσθήκη CO 2, C/N = 412, 1520 ο C Φωτοπερίοδος 12:12h, C/N=100/1, ημιδιαλείπουσα και διαλείπουσα λειτουργία 25±1 o C, συνεχής φωτισμός 300±10 μmol /m 2 s, 30ppm ΝαClO 90 NH 3 90 ΝΟ 3 74 ΝΟ TDN 70 PΟ 4 58 TDP w/w 42 w/w Μείωση Cl 61%, F 58% Παραγωγικότητα βιομάζας 6.83 g m 2 d 1 Kothari et al. (2013) Chen et al. (2012) μ= 0.10 d 1 Tricolici et al. (2014) 60 ΝΟ 3 42 ΝΟ 2 Ρυθμός απομάκρυ νσης 1.8 g/m 2 d 87 PO 4 6.7ml βιοντίζε λ Ρυθμός απομάκρυνσ ης 0.3 g/m 2 d 20.5, 42 w/w NH w/w Απομάκρυνση Cl 61%, F 58% Παραγωγικότητα βιομάζας την άνοιξη g m 2 d 1 Παραγωγικότητα βιομάζας λιπιδίων 436 mg (L d) 1 51 mg (L d) 1 Kothari et al. (2012) Mulbry et al. (2008b) Espinosa Gonzalez et al. (2014) Qin et al. (2014) Chlorella vulgaris Υδρολυμένο και μη Προσθήκη CO 2 (2%v/v), Μείωση μ= d 1, Abreu et al. 26

50 Εισαγωγή Chlorella vulgaris Scenedesmus obliquus Neochloris oleabundans Chlorella sp. Chlorococcum sp. RAP13 Microspora willeana, Oedogonium sp., Rhizoclonium hieroglyphicum Ulothrix zonata, Ulothrix aequalis Neochloris oleabundans διάλυμα ορρού γάλακτος, Καθαρή μίξη γλυκόζης γαλακτόζης Μείγμα από αναερόβια διάσπαση περιττωμάτων βοοειδών (35%) και ορρού γάλακτος (65%) (με ή χωρίς αποστείρωση) Διηθημένα γαλακτοκομικά απόβλητα (αποστειρωμένα) Γαλακτοκομικό λύμα με απόβλητο γλυκερόλης από βιομηχανία παραγωγής Biodiesel Αναερόβια χωνεμένα ή μη λύματα γαλακτοβιομηχανίας αγελάδων Αναερόβια χωνεμένα λύματα γαλακτοβιομηχανίας Αποστειρωμένα και μη, Αραίωση 1: o C, 70μmol /m 2 s ένταση φωτός, 25±2 o C, συνεχής φωτισμός 200μmol /m 2 s, 1:10 αραίωση, COD σταθερό λόγω αυτότροφης ανάπτυξης Προσκολλημένη συστήματα με φελιζόλ, 20 o C, μmol m 2 s 1 30±2 o C, 13:11h φως: σκοτάδι, 3000lux, αποστειρωμένα Ημιδιαλείπουσα λειτουργία, 16:8h φως: σκοτάδι, 22 ο C, μmol m 2 s 1 Διαλείπουσα λειτουργία, Προσθήκη 23% CO 2, 14:10h φως :σκοτάδι, ένταση φωτός 200μmol m 2 s % γλυκόζης 5096% γαλακτόζη ΝH 4 παραγωγικότητα λιπιδίων (2012) 253 mg (L d) PO 4 μ= d 1, παραγωγικότητα βιομάζας mg (L d) w/w λιπαρά οξέα 73 31μιξότ ροφα, Παραγωγικότητα βιομάζας 2.57 g m 2 d 1 Απομάκρυνση BOD 82%, C16:0(4454%), C18:1 (2127%) Franchino et al. (2013) Johnson and Wen (2010) Ummalyma and Sukumaran (2014) 42ετερό τροφα Wilkie and Mulbry (2002) 9095 ΝΟ 3 και ΝΗ w/w Παραγωγικότητα Βιομάζας 43.8 mg(l d) 1 Levine et al. (2011) Phormidium bohneri, Αναερόβιο λύμα 21 ο C, ένταση φωτός NH PO 4 μ= d 1 Blier et al. 27

51 Εισαγωγή Micractinium pusillum τυροκομείου, αραίωση 5%v/v μmol m 2 s 1, 15:9h φως: σκοτάδι Scenedesmus obliquus Ορρός γάλακτος 22.5 ο C, ένταση φωτός 100μmol m 2 s 1 Chlorella sp.umn271 Ζυμωμένο υγρό Διαλείπουσα λειτουργία, χοιροστασίου, 25±2 o C, συνεχής ακατέργαστο ή φωτισμός 60μmol m 2 s 1 χωνεμένο υγρό χοιροστασίου (αποστειρωμένα) Chlorella zofingiensis Rhizoclonium hieroglyphicum Coelastrella QY01 Chlorella vulgaris, Scenedesmus quadricauda Chlamydomonas globosa, Chlorella minutissima, Scenedesmus bijuga Επεξεργασμένα απόβλητα χοιροστασίου (αποστείρωση) Aναερόβια χωνεμένη εκροή γαλακτοκομικών αποβλήτων, Ακατέργαστη εκροή χοιροστασίων (Αν)αερόβια χωνεμένα λύματα χοιροστασίου (αποστείρωση, αραίωση) Απόβλητα ελαιοτριβείου (προεπεξεργασμένα) Εκχύλισμα αποβλήτων πτηνοτροφίας και ταπητοβιομηχανίας 25±1 o C, Συνεχής φωτισμός 230μmol m 2 s 1, Προσθήκη 56% CO 2 Ημισυνεχής, Προσκολλημένα συστήματα, 1828 o C, 390μmol m 2 s 1, 23:1h φωςσκοτάδι Διαλείπουσα λειτουργία, 25 o C, 100±10μmol m 2 s 1 12:12h φως: σκοτάδι 20±2 ο C, φως: σκοτάδι 14:10h 25±1 ο C, Φως: σκοτάδι 12:12h, μmol/m 2 s, ανοιχτή δεξαμενή 750L Μείωση λακτόζης 54.4% TN 3299 NH 3 Παραγωγή 3.6 g L 1 ξηρής βιομάζας,παραγωγικότητ α λιπιδίων 37.8 mg(l d) PO w/w w/w w/w λιπαρά οξέα μ= d 1 μ= d 1, παραγωγικότητα βιομάζας mg(l d) 1 Παραγωγικότητα βιομάζας 521 g m 2 d NH w/w μ= d 1, παραγωγικότητα βιομάζας mg(l d) 1 Μη πόσιμα ή αρόσιμα νερά μειώνουν τον περιβαλλοντικό αντίκτυπο (1995) Girard et al. (2014) Hu et al. (2012) Zhu et al. (2013) Mulbry et al. (2008a) Luo et al. (2016) De Benedetti et al. (2015) Παραγωγή βιομάζας Bhatnagar et mg L 1 al. (2011) 28

52 Εισαγωγή Chladophora sp., βακτήρια, διάτομα, κυανοβακτήρια (Microsystis aeruginosa) Scenedesmus obliquus Chlorella vulgaris UTEX 265, Chlorella sp. Chlorella vulgaris SR/2 Rhodopseudomonas Υγρά απόβλητα από οδικές επιφάνειες και δάση ή λιβάδια Συνθετικό απόβλητο ζυθοποιίας (αποστείρωση) Απόβλητα ζυθοποιίας από αναερόβια χώνευση και μη χωνεμένο (αποστείρωση) Απόβλητα αναερόβιας χώνευσης ποτοποιίας Τεχνητό σακχαρώδες απόβλητο (αποστειρωμένο) Υβριδικός βιοαντιδραστήρας συνεχής λειτουργίας, 8 31 ο C, DO=01.8 mgl 1 30±3 o C, Φως σκοτάδι 12:12h, lux Διαλείπουσα λειτουργία, 25 o C, 100 μmol/m 2 s Ανοιχτή εξωτερική δεξαμενή 30L, 2732 o C, ηλιακή ενέργεια kwh m 2 d 1, DO= mgl 1 DO <0.5mgL 1, 2630 o C 79 NO 3 86 NH 4 82 TN 57.5, 56.9 TC 81 TP, 74 TDP Wu et al. (2011) 20.8 Mata et al. (2012b) 70 ~87 TN ~80 TP w/w ON 84.1 ΝΗ TP 87.3 OP μ= d 1 Farooq et al. (2013) Απομάκρυνση BOD 98.8%, TS 93.2%, TSS 92.6% lux :αυξημένη βιομάζα=2645 mg L 1, 8000 lux:αυξημένα καροτενοειδή 1455 mg L 1 Travieso et al. (2008) Zhou et al. (2014) 29

53 Εισαγωγή Από όλα τα παραπάνω γίνεται αντιληπτό πως η επεξεργασία αστικών/ αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων με μικροφύκη μπορεί να οδηγήσει σε υψηλές απομακρύνσεις οργανικών και ανόργανων συστατικών, καθώς κάποιοι μικροοργανισμοί ανταπεξέρχονται στις συνθήκες των αποβλήτων παράγοντας ικανοποιητική ποσότητα βιομάζας, ικανή να αξιοποιηθεί στην παραγωγή βιοκαυσίμων ή άλλων βιοπροϊόντων. Ωστόσο βιβλιογραφικά, όπως παρουσιάζεται και στον Πίνακα 1.4, η έρευνα δεν επεκτείνεται στην μελέτη πολλών διαφορετικών ειδών μικροοργανισμών, αλλά επικεντρώνεται κυρίως στα είδη από τα γένη Chlorella, Scenedesmus, Botryococcus και Chlorococcum (Preiss and Kowalski, 2010; Chen et al., 2011; Lam and Lee, 2012; CuellarBermudez et al., 2015). Επίσης, είναι εμφανής η χρήση κυρίως των αστικών αποβλήτων και ορισμένων αγροτοβιομηχανικών, όπως των γαλακτοκομικών (Pittman et al., 2011; Cai et al., 2013). Να αναφερθεί επίσης, ότι οι διαφορετικές συνθήκες λειτουργίας των εργαστηριακής κλίμακας πειραμάτων που εξετάστηκαν (κυρίως κάτω από αποστειρωμένες συνθήκες με χρήση μονοκαλλιεργειών) καθώς και τα διαφορετικά συστήματα που χρησιμοποιήθηκαν (αντιδραστήρες και τρόποι λειτουργίας τους, Πίνακας 1.4), καθιστούν ιδιαίτερα δύσκολη την σύγκριση των αποτελεσμάτων μεταξύ τους και ακόμη πιο δύσκολη τη διεξαγωγή συμπερασμάτων για εκτίμηση εφαρμογής της διεργασίας επεξεργασίας αποβλήτων με μικροφύκη σε συστήματα βιομηχανικής κλίμακας. Γίνεται, λοιπόν αντιληπτή, η ανάγκη για περαιτέρω μελέτη, με σκοπό την διερεύνηση βιολογικής επεξεργασίας με μικροφύκη/ κυανοβακτήρια διαφόρων αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων από εγχώριες μονάδες παραγωγής που δεν έχουν μελετηθεί εκτεταμένα ή και καθόλου (όπως ο δευτερογενής ορρός γάλακτος, απόβλητα οινοποιείου, απόβλητα από μονάδα τυποποίησης σταφίδας κλπ.), κάτω από μη ασηπτικές συνθήκες, αξιοποιώντας ταυτόχρονα και την παραγόμενη βιομάζα για ενεργειακούς σκοπούς. Η χρήση αυτών των αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων ως υποστρώματα για την ανάπτυξη μικροφυκών/ κυανοβακτηρίων, υπό μη ασηπτικές συνθήκες (χρήση μεικτών καλλιεργειών), θα βοηθήσει σημαντικά στην εφαρμογή της διεργασίας σε συστήματα βιομηχανικής κλίμακας, καθιστώντας βιώσιμη τη λειτουργία τέτοιων μονάδων. 30

54 Εισαγωγή 1.3 Μικροφύκη Τα μικροφύκη είναι υδρόβιοι, ταχύτατα αναπτυσσόμενοι φωτοσυνθετικοί μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται αυτότροφα, ετερότροφα ή μιξότροφα. Τα αυτότροφα μπορούν να αξιοποιούν το CO 2 και το ηλιακό φως για ανάπτυξη της βιομάζας τους, ενώ τα ετερότροφα χρησιμοποιούν οργανικές πηγές άνθρακα που τους εξασφαλίζει συνήθως υψηλότερη ανάπτυξη βιομάζας. Η χρήση και η εφαρμογή των μικροφυκών μελετάται τα τελευταία 60 χρόνια και θεωρούνται μια από τις πιο ελπιδοφόρες πηγές για την παραγωγή βιοκαυσίμων καθώς υπάρχουν ήδη εταιρείες που κατασκευάζουν και θέτουν προς πώληση ολοκληρωμένα συστήματα ανάπτυξης μικροφυκών (Mata et al., 2010). Μάλιστα, πολλά είδη μικροφυκών, όπως τα Botryococcus braunii, Nannochloropsis sp., Dunaliella primolecta, Neochloris oleoabundans, Chlorella sp. και άλλα παράγουν μεγάλες ποσότητες υδατανθράκων και λιπιδίων, με την περιεκτικότητα ελαίων να φτάνει μέχρι 75% (Chisti, 2007; Choi et al., 2011; Shi et al., 2011). Τα μικροφύκη χρησιμοποιούνται ως πρώτη ύλη για μια ευρεία ποικιλία πρακτικών και μεταβολικών προϊόντων, όπως τα συμπληρώματα διατροφής, τα φαρμακευτικά σκευάσματα (πρωτεΐνες, βιταμίνες, θρεπτικά συστατικά και καροτενοειδή), τα λιπίδια, τα ένζυμα, η βιομάζα, τα πολυμερή, οι τοξίνες, και οι χρωστικές. Ξεχωρίζουν από τις άλλες πηγές ενέργειας στα εξής: έχουν υψηλή απόδοση ανά μονάδα φωτός και έκτασης, υψηλή περιεκτικότητα σε έλαιο ή σάκχαρα, μηδενικές απαιτήσεις σε καλλιεργήσιμη γη, δεν χρειάζονται απαραίτητα καθαρό νερό για ανάπτυξη αλλά χρησιμοποιούν και λύματα ως θρεπτικά συστατικά ενώ επίσης μπορούν να δεσμεύουν εύκολα CO 2. Παρόλα αυτά, η καλλιέργεια τους αποτελεί μια δαπανηρή διαδικασία και για αυτό η έρευνα στράφηκε στην αναζήτηση φθηνότερων διαδικασιών παραγωγής βιομάζας μικροφυκών όπως η χρήση υγρών αποβλήτων ως θρεπτικό υπόστρωμα. Τα μικροφύκη, όπως ήδη αναφέρθηκε σε προηγούμενη ενότητα, μπορούν να επεξεργαστούν αστικά, οικιακά, ζωικά, αγροτοβιομηχανικά, βιομηχανικά, εκροές από εργοστάσια μεταποίησης τροφίμων και άλλα γεωργικά απόβλητα, απομακρύνοντας σε μεγάλο βαθμό το ρυπαντικό φορτίο τους (Abdel Raouf et al., 2012). Επίσης, έχουν την δυνατότητα απομάκρυνσης βαρέων μετάλλων και ορισμένων τοξικών οργανικών ενώσεων χωρίς να οδηγούν σε δευτερογενή 31

55 Εισαγωγή μόλυνση καθώς η βιομάζα τους χρησιμοποιείται για την παραγωγή βιοπροϊόντων. Έτσι, προσφέρουν μια κομψή λύση τριτοταγούς βιοεπεξεργασίας σε συνδυασμό με την παραγωγή δυνητικά πολύτιμης βιομάζας. Οι χρήσεις της βιομάζας των μικροφυκών αφορούν τους εξής τομείς της αγοράς: ζωοτροφές, λιπάσματα, χρωστικές και παραγωγή βιοκαυσίμων. Η παραγωγή βιοκαυσίμων από μικροφύκη μπορεί να είναι περιβαλλοντικά βιώσιμη, οικονομικά αποδοτική, και κερδοφόρα αν συνδυαστεί με απόβλητα και καυσαέρια, εφόσον το γλυκό νερό και τα ανόργανα θρεπτικά συστατικά θα αντικατασταθούν με λύματα ενώ τα καυσαέρια θα χρησιμοποιούνται ως πηγή του άνθρακα. Η διαθεσιμότητα επαρκούς CO 2 από την καύση άνθρακα ή άλλων ορυκτών καυσίμων εξακολουθεί να αποτελεί σοβαρό εμπόδιο για την παραγωγή των μικροφυκών σε μεγαλύτερη κλίμακα. Παρά το γεγονός ότι το σύνολο της παραγωγής βιοκαυσίμων από μικροφύκη, συμπεριλαμβανομένης της επιλογής των ειδών, της καλλιέργειας, της καταπολέμησης των παρασίτων, της συγκομιδής, της παραγωγής και της επεξεργασίας των λιπιδίων, έχουν μελετηθεί εκτενώς κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών, το κόστος παραγωγής είναι πολύ υψηλό για την εκβιομηχάνιση, και η τιμή του βιοντίζελ από μικροφύκη παραμένει εντυπωσιακά υψηλότερη ($2.76 / L) από εκείνη του συμβατικού ντίζελ ($0.95 / L) (Monlau et al., 2014) Βιολογία μικροφυκών Τα φύκη είναι αναγνωρισμένα ως μία από τις αρχαιότερες μορφές ζωής. Ο όρος «alga,ae» προέρχεται από τη λατινική λέξη που σημαίνει «θαλάσσιο γρασίδι». Η ελληνική λέξη για τα άλγη είναι «φύκος», και η μελέτη τους λέγεται φυκολογία. Ο όρος «φύκη» περιλαμβάνει δύο μεγάλες κύριες μορφολογικές κατηγορίες: τα μακροφύκη, συνήθως θαλάσσια είδη, και τα μικροφύκη. Τα μακροφύκη είναι πολυκύτταροι οργανισμοί και έχουν μήκος μερικών εκατοστών, το οποίο σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να φτάσει και πολλά μέτρα (5070) όπως στα γιγάντια Φαιοφύκη. Αντίθετα, τα περισσότερα μικροφύκη έχουν μήκος μερικά μικρόμετρα, συνήθως μm (Markou and Georgakakis, 2011). Οι βασικότερες ομάδες μικροφυκών (φύλα ή διαιρέσεις) ανάλογα με τη σύνθεση των χρωστικών, τον κύκλο ζωής και τη βασική κυτταρική δομή τους είναι: τα Χλωροφύκη, τα Πρασινοφύκη, τα Ετεροκοντόφυτα, με κύριες υποδιαιρέσεις τα Χρυσοφύκη, τα Διάτομα, τα 32

56 Εισαγωγή Ευστιγματοφύκη και τα Ραφιδοφύκη, τα Απτόφυτα, τα Κρυπτοφύκη, τα Δινομαστιγωτά και τα Κυανοβακτήρια (Εικόνα 1.3). Τα κυανοβακτήρια, παρόλο που είναι προκαρυωτικοί οργανισμοί, σε αρκετές περιπτώσεις θεωρούνται ότι ανήκουν στα μικροφύκη επειδή είναι φωτοσυνθέτοντες οργανισμοί. Η δομή των μικροφυκών και η έλλειψη εξειδίκευσης κάνουν την καλλιέργειά τους εύκολη και ελεγχόμενη, ενώ το μικρό τους μέγεθος καθιστά τη μετέπειτα συγκομιδή τους πιο περίπλοκη (van Iersel et al., 2009). Εκτιμάται ότι υπάρχουν περισσότερα από διαφορετικά είδη μικροφυκών στον πλανήτη, αλλά μόνο περίπου τα από αυτά έχουν μελετηθεί (PérezMartínez et al., 2010). Τα μικροφύκη αναπτύσσονται σε ένα ευρύτατο φάσμα περιβαλλοντικών συνθηκών, από υγρά εδάφη και επιφάνειες βράχων μέχρι οικοσυστήματα υψηλής αλατότητας ή και ερημικά. Κοινό χαρακτηριστικό τους είναι η παρουσία ειδικών ενώσεων στα κύτταρά τους, χρωστικών ουσιών (χλωροφύλλη a, b, c καροτενοειδή) όπου οφείλουν το χρώμα τους εφόσον τους δίνουν φωτοχημικές ιδιότητες (απορροφούν μια περιοχή του ηλιακού φάσματος). Τα μεταβολικά τους συστήματα ανταποκρίνονται είτε στην αυτότροφη είτε στην ετερότροφη αλλά και στην μιξότροφη ανάπτυξη όπου και έχουν την ικανότητα φωτοσύνθεσης αλλά χρειάζονται επίσης μια εξωτερική πηγή οργανικών θρεπτικών (Walker et al., 2005; Lee et al., 2008; Brennan L. and Owende P., 2010). 33

57 Εισαγωγή Εικόνα 1.3: Φωτογραφίες μικροσκοπίου (μεγέθυνση 1:1000) διαφορετικών ειδών Α: Anabaena (κυανοβακτήριο), Β: C.reinhardtii (Χλωρόφυτα), C: P.tricornutum (Διάτομα), D: C. sorokiniana (Χλωρόφυτα) ( AllRounders.html) Συνθήκες ανάπτυξης μικροφυκών Τα μικροφύκη είναι παρόντα σε όλα τα οικοσυστήματα και η βίωσή τους σε διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες υποδεικνύει την τεράστια ποικιλότητα που εμφανίζουν σαν ομάδα. Αβιοτικοί (θερμοκρασία, διαλυμένο οξυγόνο, ph, φως, ανάδευση, αναλογίες θρεπτικών στοιχείων) και βιοτικοί (σχέσεις μικροοργανισμών, συγκέντρωση εμβολίου) παράγοντες επηρεάζουν το ρυθμό αύξησης και τη χημική σύσταση των μικροφυκών οδηγώντας σε διαφορετική συμπεριφορά επεξεργασίας των λυμάτων. Οι καλλιέργειες των μικροφυκών, αν και αρκετά πολύπλοκα συστήματα, καταγράφουν τον κύκλο ζωής των κυττάρων. Η ανάπτυξη των μικροφυκών περιλαμβάνει τη λανθάνουσα φάση, την εκθετική φάση, τη φάση του φθίνοντα ρυθμού ανάπτυξης, τη στατική φάση και τη φάση θανάτου. Κατά τη λανθάνουσα φάση πραγματοποιείται πολύ μικρή αύξηση της πυκνότητας της καλλιέργειας εφόσον ο κυτταρικός μεταβολισμός προσαρμόζεται στο περιβάλλον. Στη συνέχεια, η πυκνότητα των κυττάρων αυξάνεται εκθετικά συναρτήσει του χρόνου ενώ κατά τη φάση του φθίνοντα ρυθμού, ο ρυθμός της κυτταρικής ανάπτυξης μειώνεται. Στη στατική φάση επικρατεί ισορροπία του ρυθμού ανάπτυξης και της δράσης των περιοριστικών παραγόντων. Τέλος, στη φάση του θανάτου, η ποιότητα του υποστρώματος υποβαθμίζεται και τα θρεπτικά συστατικά εξαντλούνται. Η πυκνότητα των κυττάρων μειώνεται και τελικά η καλλιέργεια καταρρέει. Οι παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη των καλλιεργειών είναι: Φως: Η διάρκεια, η ένταση και η ποιότητα του φωτισμού είναι καθοριστικοί παράγοντες για την ανάπτυξη των μικροφυκών καθώς η φωτοσύνθεση συνδέεται άμεσα με την φωτεινή ενέργεια. Τα μικροφύκη περιέχουν σε διαφορετικές αναλογίες τις φωτοσυνθετικές χρωστικές ουσίες και ως εκ τούτου αξιοποιούν 34

58 Εισαγωγή διαφορετικά τα μήκη κύματος. Τα περισσότερα υφίστανται κορεσμό σε ένταση μεγαλύτερη από 200 με m 2 s 1 (Liang et al., 2009). Σε ορισμένα συστήματα γίνεται ταυτόχρονη χρήση φυσικού ηλιακού φωτός αλλά και τεχνητού φωτός. Υπάρχουν μελέτες από τις οποίες προκύπτει ότι μέσω τεχνητού φωτισμού παράγεται προϊόν κατάλληλο για βιοκαύσιμα υψηλότερης ποιότητας (Ugwu et al., 2008). Οι τεχνητές πηγές φωτός βρίσκονται είτε εκτός είτε εντός των βιοαντιδραστήρων ανάπτυξης (Ryan et al., 2009). Η ανάπτυξη των μικροφυκών μπορεί να περιοριστεί ως αποτέλεσμα πολύ υψηλού φωτισμού (φωτοαναστολή) ή πολύ μικρού φωτισμού (φωτοπεριορισμός) (Kesaano and Sims, 2014). Η αναλογία φως / σκοτάδι (φωτοπερίοδος) είναι μία άλλη παράμετρος που επηρεάζει την ανάπτυξη των μικροφυκών και ως εκ τούτου την απόδοση των φωτοβιοαντιδραστήρων καθώς τα διαφορετικά είδη μικροοργανισμών έχουν και διαφορετικές απαιτήσεις σε φωτισμό (Mata et al., 2012a). Θερμοκρασία: Η θερμοκρασία είναι ο πιο καθοριστικός παράγοντας για την ανάπτυξη των μικροφυκών μετά τον φωτισμό καθώς επηρεάζει τη σύνθεση της βιομάζας και την περιεκτικότητα σε λιπίδια (Markou and Georgakakis, 2011). Πολλά μικροφύκη μπορούν να αντέξουν θερμοκρασίες μέχρι και 15 C χαμηλότερα από την βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξής τους (2030 C) ενώ τιμές υψηλότερες από 35 o C είναι ανασταλτικές για τα περισσότερα είδη (αν και υπάρχουν και θερμόφιλα στελέχη των 4042 C). Οι βέλτιστες θερμοκρασίες για την ανάπτυξη συνήθως ποικίλουν ανάμεσα στα είδη και εξαρτώνται από το περιβάλλον εγκλιματισμού (Nations, 1998; Demirbas, 2011). Σε συμβιωτικές καλλιέργειες μικροφυκών βακτηρίων έχει αναφερθεί από τους Koller et al. (2012) ότι η αύξηση της θερμοκρασίας από 25 ο C σε 30 o C διπλασίασε την ικανότητα απομάκρυνσης των θρεπτικών συστατικών. Θολερότητα: Η θολερότητα είναι ένας σημαντικός παράγοντας στην καλλιέργεια μικροφυκών καθώς επηρεάζει τη διάχυση του φωτός μέσα σε αυτή. Η ανάμειξη και η ομογενοποίηση της καλλιέργειας είναι υπεύθυνες για τη σωστή κατανομή των θρεπτικών, τη μεταφορά του CO 2 αλλά και την κυκλοφορία των κυττάρων των μικροφυκών από το σκοτάδι στη ζώνη του φωτός (Bεργίνη, 2014). 35

59 Εισαγωγή Αλατότητα: Kάθε είδος μικροφύκους έχει διαφορετικό επιθυμητό εύρος αλατότητας. Ωστόσο, η αυξημένη αλατότητα επηρεάζει αρνητικά την ανάπτυξη των μικροφυκών επιδρώντας άμεσα στο σύστημα της φωτοσύνθεσης. Το εύρος κυμαίνεται μεταξύ Μ NaCl (23 58 g L 1 NaCl) αλλά μπορεί να φτάσει και τα 4Μ για τα είδη που έχουν ανθεκτικότητα (Xu and Beardall, 1997; Takagi and Yoshida, 2006). ph: Τα περισσότερα μικροφύκη αναπτύσσονται σε περιβάλλοντα με ph που κυμαίνεται μεταξύ 6 και 9 (Yang et al., 2011). Παρόλα αυτά υπάρχουν είδη που είναι οξύφιλα (όπως το Chlamydomonas acidophila) αλλά και αλκαλόφιλα (όπως το Arthrospira). Απότομη αλλαγή στο ph μπορεί να έχει καταστροφικές επιπτώσεις στην καλλιέργεια. Μια υψηλή αναλογία ανόργανων / οργανικών συστατικών μπορεί να οδηγήσει σε υψηλό ph και αντίστροφα (Van Den Hende et al., 2011b). Στην επεξεργασία αποβλήτων με μεικτές καλλιέργειες μικροφυκών βακτηρίων αρκετοί παράγοντες επηρεάζουν το ph όπως η αλκαλικότητα λόγω της πρόσληψης νιτρικών και CO 2 από τα μικροφύκη (Gutzeit et al., 2005). Επίσης, η κατανάλωση αμμωνίας και η νιτροποίηση οδηγούν σε μείωση του ph εξαιτίας των Η + που απελευθερώνονται (Lincoln et al., 1996). Τελικά το ph διαμορφώνεται ως αποτέλεσμα του συνδυασμού των παραπάνω διαδικασιών. Θρεπτικά συστατικά: Τα κυριότερα θρεπτικά στοιχεία που είναι αναγκαία για την ανάπτυξη των μικροφυκών είναι ο άνθρακας, το άζωτο, ο φώσφορος, το κάλιο και το πυρίτιο (για τα διάτομα). Το άζωτο (N) απαντάται στα εσωτερικά ύδατα με ποικίλες μορφές, όπως αμμωνιακά (NH + 4 ), νιτρώδη (NO 2 ) ή νιτρικά (NO 3 ) άλατα, αέριο άζωτο (N 2 ) και οργανικές ενώσεις (αμίνες, αμινοξέα, πρωτεΐνες και χουμικά συστατικά). Οι συγκεντρώσεις όλων των αζωτούχων ενώσεων ποικίλλουν έντονα στις διάφορες υδατοσυλλογές εφόσον ο εμπλουτισμός αυτών με αζωτούχες ενώσεις γίνεται από ποικίλες πηγές. Τα νιτρώδη ιόντα βρίσκονται γενικά σε χαμηλές συγκεντρώσεις (<60μg N /l), ενώ σε περιοχές με μικρή περιεκτικότητα σε οξυγόνο μπορεί να αυξάνονται. Παράγονται είτε με την αναγωγή των νιτρικών είτε με την οξείδωση των αμμωνιακών ιόντων μέσω της χημικής διαδικασίας ή της βακτηριακής δράσης (Khin and Annachhatre, 2004). Η αυτότροφη νιτροποίηση και η ετερότροφη απονιτροποίηση είναι οι 36

60 Εισαγωγή συμβατικές βιοτικές μέθοδοι που πραγματοποιούνται στις μονάδες επεξεργασίας αποβλήτων. Τα αμμωνιακά ιόντα είναι η κύρια πηγή αζώτου για τα Ευγληνοειδή φύκη. Ο φώσφορος (P), με τη σειρά του, ως δομικό συστατικό βιολογικών μακρομορίων, είναι τελείως απαραίτητος για όλες τις μορφές ζωής. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με τη μικρή διαθεσιμότητά του στην υδρόσφαιρα καθορίζουν την οικολογική του σημασία. Αντίθετα, από το άζωτο που είναι πιο άφθονο και διαθέσιμο στους οργανισμούς από διάφορες πηγές, ο φωσφόρος αποτελεί συνήθως περιοριστικό παράγοντα της πρωτογενούς παραγωγικότητας. Η σημαντικότερη μορφή με την οποία απαντάται ο φώσφορος στα ύδατα είναι τα ορθοφωσφορικά (PO 3 4 ). Οι Mujtaba et al. (2012) και Liang et al. (2013a) ανέδειξαν τη σημασία του φωσφόρου στην ανάπτυξη ορισμένων υπό μελέτη μικροφυκών όπου αποδείχτηκε ότι για τα γένη της Chlorella η περιεκτικότητα της βιομάζας σε λιπίδια μειώνεται καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση του φωσφόρου, συγκεκριμένα σε 23 mg L 1 η συσσώρευση λιπιδίων φτάνει το 50% ξηρής βιομάζας. Αναγκαία αλλά σε μικρότερες ποσότητες είναι στοιχεία όπως το θείο, το πυρίτιο, το ασβέστιο, το μαγνήσιο, ο σίδηρος, το μολυβδαίνιο, το μαγγάνιο, το νικέλιο, το βόριο, το χλώριο, ο ψευδάργυρος, ο χαλκός και το κοβάλτιο (Christenson and Sims, 2011). Τα μικροφύκη χρησιμοποιούν διαλυτό ανόργανο άνθρακα υπό τη μορφή CO 2 και HCO 3 καθώς και οργανικό άνθρακα, όταν βρίσκονται σε λύματα από την βακτηριακή αποικοδόμηση (Kesaano and Sims, 2014). Η αναλογία συγκεντρώσεων N:P όταν κυμαίνεται μεταξύ θεωρείται βέλτιστη για την ανάπτυξη των μικροφυκών σύμφωνα με τον Olguín (2012), ενώ οι Chen and Walker (2011) ανέδειξαν την αναλογία N:P ίση με 30 ως βέλτιστη για την μέγιστη δυνατότητα απορρόφησης. Φαίνεται ότι οι βέλτιστες τιμές εξαρτώνται από τα είδη των μικροοργανισμών που χρησιμοποιούνται και από την πηγή αζώτου (Zhang and Hu, 2011). Η αναλογία C:N:P κατά Redfield (106:16:1), ως δείκτης θρεπτικού ορίου στις κοινότητες μικροφυκών, θεωρείται η βέλτιστη για την ανάπτυξη φυτοπλαγκτού (Geider and La Roche, 2002). Σε περιπτώσεις θρεπτικής στέρησης τα μικροφύκη επιβραδύνουν την ανάπτυξη τους και τείνουν να χρησιμοποιούν τα διαθέσιμα θρεπτικά συστατικά για την παραγωγή λιπιδίων ή υδατανθράκων αντί πρωτεϊνών. 37

61 Εισαγωγή Διαλυμένο οξυγόνο (DO): Η συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου (Dissolved Oxygen, DO) αυξάνεται κατά τη διάρκεια της φωτοσύνθεσης, καθώς η αύξηση 1g κυττάρων μικροφυκών συνοδεύεται από απελευθέρωση 1.587g διαλυμένου μοριακού οξυγόνου (Κόλλιας, 2013). Το παραγόμενο οξυγόνο καταναλώνεται άμεσα από ετερότροφα βακτήρια ή ετερότροφα μικροφύκη για την αποικοδόμηση του οργανικού άνθρακα. Το τελικό διαλυμένο οξυγόνο είναι αποτέλεσμα συνδυασμού παραγωγής και κατανάλωσης οξυγόνου. Οι υψηλές τιμές οξυγόνου μπορεί να παρεμποδίζουν την διαδικασία της φωτοσύνθεσης, γι αυτό ως παραπροϊόν πρέπει να αφαιρείται ώστε να αποφεύγεται η φωτοοξειδωτική παρεμπόδιση που μειώνει τη δυνατότητα επεξεργασίας των λυμάτων (Christenson and Sims, 2011) Λιπίδια των μικροφυκών Με τον όρο λιπίδια περιγράφονται όλες οι δυσδιάλυτες ή αδιάλυτες ενώσεις στο νερό, αλλά διαλυτές σε οργανικούς διαλύτες. Απαντώνται με μια μεγάλη ποικιλία δομών και συνεπώς χαρακτηρίζονται από μια μεγάλη ποικιλία λειτουργικών ρόλων στα μικροβιακά κύτταρα. Οι ιδιότητες των λιπιδίων οφείλονται στα λιπαρά οξέα που περιέχουν, τα οποία αποτελούνται από μια αλειφατική αλυσίδα μεθυλομάδων (CH 2 ) ισχυρά μη πολική που καταλήγει σε μια πολική καρβοξυλική ομάδα (COOH). Ανάλογα το μέγεθος της ανθρακικής αλυσίδας και το είδος των δεσμών που εμφανίζονται έχουμε τα κορεσμένα, μονοακόρεστα ή πολυακόρεστα λιπαρά οξέα. Τα κύρια συστατικά των βιολογικών μεμβρανών περιλαμβάνουν πολικά/σύνθετα (φωσφολιπίδια, σφιγγολιπίδια, γλυκολιπίδια) αλλά και ουδέτερα/απλά (στερόλες) λιπίδια. Τα πολικά λιπίδια είναι αμφίφιλα μόρια και σχηματίζουν διπλοστιβάδες δίνοντας την απαραίτητη ρευστότητα στις μεμβράνες. Η περιεκτικότητα της μεμβράνης σε λιπίδια μπορεί να φτάσει το 50% (Losel, 1988). Οι προκαρυωτικοί μικροοργανισμοί μπορούν να ρυθμίζουν την ρευστότητα των μεμβρανών τους μεταβάλλοντας τον αριθμό των διπλών δεσμών και το μήκος των αλυσίδων των λιπαρών οξέων. Οι ευκαρυωτικοί διαθέτουν έναν επιπλέον μηχανισμό ρύθμισης, το είδος και την περιεκτικότητα σε στερόλες (Suutari et al., 1997). Οι ρόλοι των λιπιδίων περιλαμβάνουν τη συμμετοχή στην παθητική διάχυση των μορίων διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης, ρυθμίζουν τη λειτουργικότητα των ενζύμων της 38

62 Εισαγωγή μεμβράνης, λειτουργούν ως μεταφορείς ουσιών ενώ ακόμα συμμετέχουν και στην κινητική δραστηριότητα των μικροοργανισμών (Russell, 1989). Επίσης, καθοριστικό ρόλο παίζουν στις φωτοσυνθετικές μεμβράνες, όπου εμπλέκονται στην απορρόφηση, την μετατροπή και τη μεταφορά ενέργειας (χλωροφύλλες, καροτενοειδή, κινόνες) (Raven, 1989). Ορισμένοι μικροοργανισμοί μπορούν να αποθηκεύουν μεγαλύτερο ποσοστό λιπιδίων από το μέσο όρο που απαιτείται για τις ανάγκες των μικροοργανισμών προκειμένου να εφοδιάσουν τις μεμβράνες και τις υπόλοιπες λειτουργικές δομές τους. Οι μικροοργανισμοί αυτοί χαρακτηρίζονται ως ελαιογόνοι καθώς έχουν την ικανότητα να συσσωρεύουν λιπίδια σε ποσοστό μεγαλύτερο του 2025% της συνολικής βιομάζας τους (Ratledge, 1982). Μεταξύ των ελαιογόνων μικροοργανισμών, τα μικροφύκη είναι οι πιο γνωστοί παραγωγοί πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (Polyunsaturated Fatty Acids PUFAs) αφού βιοσυνθέτουν λιπαρά οξέα όπως το εικοσιπεντανοϊκό (EPA) και το εικοσιδυοεξαενοϊκό οξύ (DHA) (Makri et al., 2011; Bellou et al., 2014). Μάλιστα, τα τελευταία χρόνια με την πρόοδο της γενετικής μηχανικής έχει επιτευχθεί η βιοσύνθεση πολυακόρεστων λιπαρών οξέων από ελαιογόνους μικροοργανισμούς που δεν είχαν την ικανότητα να βιοσυνθέτουν υψηλής ακορεστότητας λιπαρά οξέα (Gong et al., 2014). Οι μη ελαιογόνοι μικροοργανισμοί που καλλιεργούνται σε θρεπτικά υποστρώματα με περίσσεια άνθρακα αλλά έλλειψη αζώτου, τείνουν να αφομοιώνουν τον άνθρακα μετατρέποντάς τον σε πολυσακχαρίτες, οπότε το έλαιο δεν ξεπερνά το 10% της βιομάζας τους. Τα διαφορετικά είδη μικροφυκών ποικίλλουν ως προς την παραγωγή λιπιδίων (Πίνακας 1.5), ανάλογα με το φωτοσυνθετικό τους σύστημα και την προσαρμογή τους στο μέσο της καλλιέργειας. Τα λιπίδια που παράγονται μπορεί να είναι πολικά (φωσφολιπίδια) και ουδέτερα λιπίδια (καροτενοειδή, τριγλυκερίδια) (Gong and Jiang, 2011). Επιπλέον, η βιομάζα τους είναι πλούσια σε μακροστοιχεία (Na, K, Ca, Mg, Fe, Zn), ιχνοστοιχεία και βιταμίνες (θειαμίνη, καροτένια, φυλλικό οξύ) (Becker and Richmond, 2004) γι αυτό και οι εφαρμογές τους ποικίλουν από τη διατροφή έως τις βιομηχανίες και την παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Πίνακας 1.5: Σύγκριση διαφόρων ειδών μικροφυκών ως προς το λιπιδικό περιεχόμενο (Mata et al., 2010; Gong and Jiang, 2011; Malcata, 2011). Είδος Λιπιδικό Περιεχόμενο Παραγωγικότητα 39

63 Εισαγωγή (% κ.β. ξηρής βιομάζας) Λιπιδίων (mg L 1 d 1 ) Botryococcus braunni Chlorella emersonii Chlorella protothecoides Chlorella sorokiniana Chlorella vulgaris Chlorella sp Chlorococcum sp Dunaliella salina Dunaliella sp Haematococcus pluvialis 25.0 Isochrysis sp Nannochloris sp Nannochloropsis oculata Nannochloropsis sp Neochloris oleoabundans Pavlova salina Porphyridium cruentum Scenedesmus obliquus Scenedesmus sp Spirulina platensis Tetraselmis suecica Tetraselmis sp Η έκταση της συσσώρευσης των λιπιδίων στα μικροφύκη επηρεάζεται συχνά από το μικροπεριβάλλον στο οποίο εκτίθενται τα κύτταρα. Γενικά, η συνολική παραγόμενη περιεκτικότητα λιπιδίων στα μικροφύκη ποικίλει από περίπου 185% του ξηρού βάρους, με τιμές υψηλότερες από το 40% να επιτυγχάνονται συνήθως υπό περιορισμό θρεπτικών συστατικών (Chisti, 2007; Li et al., 2008a). Συγκεκριμένα, υπό συνθήκες έλλειψης αζώτου το ποσοστό λιπιδίων που συσσωρεύεται αυξάνεται σημαντικά. (Spoehr and Milner, 1949). Ο περιορισμός του αζώτου, έχει σαν αποτέλεσμα όχι μόνο την συσσώρευση λιπιδίων, αλλά επίσης οδηγεί και σε μια σταδιακή αλλαγή της σύνθεσης των λιπιδίων από ελεύθερα λιπαρά οξέα σε 40

64 Εισαγωγή τριγλυκερίδια που είναι πιο χρήσιμα για την μετατροπή σε βιοντίζελ. Τα μικροφύκη μπορούν ακόμα να μεταβάλλουν την ποιότητα των λιπιδίων αλλάζοντας την σύνθεση των λιπαρών οξέων ανάλογα με την ποσότητα CO 2 που παρέχεται στις καλλιέργειες, καθώς η διαθεσιμότητα του CO 2 επηρεάζει το μέγεθος της ανθρακικής αλυσίδας και τον αριθμό των διπλών δεσμών των λιπιδίων (Nascimento et al., 2015). Επίσης, παράγοντες όπως η θερμοκρασία και η ακτινοβολία έχουν αποδειχθεί ότι επηρεάζουν τόσο την λιπιδική σύνθεση όσο και το περιεχόμενο των λιπιδίων σε πολλά μικροφύκη. Η θερμοκρασία επηρεάζει σημαντικά την σύνθεση των λιπαρών οξέων των ελαίων με τις χαμηλότερες τιμές να οδηγούν στον σχηματισμό μακρών αλυσίδων πολυακόρεστων λιπαρών οξέων. Ο κορεσμός, επίσης, του φωτός στα μικροφύκη είναι μια σημαντική μεταβλητή για την παραγωγή ελαίων και οι τυπικές συνθήκες κορεσμού κυμαίνονται στα 15 μεm 1 s 1. Οι ελαιογόνοι μικροοργανισμοί (ζύμες, μύκητες, μικροφύκη) θεωρούνται, σήμερα, ως πιθανοί υποψήφιοι για την παραγωγή λιπιδίων που θα οδηγήσουν στα «2 ης γενιάς βιοκαύσιμα» (Angerbauer et al., 2008; Papanikolaou and Aggelis, 2009) (με πρώτης γενιάς εκείνα που προκύπτουν από ενεργειακές καλλιέργειες). Για την αύξηση των ελαιογόνων μικροοργανισμών έχουν χρησιμοποιηθεί ποικίλα υποστρώματα ως πηγή άνθρακα στα οποία συμπεριλαμβάνονται σάκχαρα υψηλής καθαρότητας ή προερχόμενα από βιομηχανικές δραστηριότητες, τυρόγαλα, παραπροϊόντα βιομηχανιών, εκχυλίσματα φυτικών υπολειμμάτων αλλά και οργανικά οξέα ή αιθανόλη (Aggelis, 1996; Huang et al., 2009; Chatzifragkou et al., 2010; Economou et al., 2010; Vamvakaki et al., 2010; Fei et al., 2011). Σημαντικό είναι πως η διαφορετικότητα της σύστασης του μέσου καλλιέργειας δεν επηρεάζει μόνο την απόδοση λιπίδια/βιομάζα αλλά και την σύσταση των λιπιδίων όσο αναφορά την αναλογία κορεσμένων, μονοακόρεστων και πολυακόρεστων λιπαρών οξέων. Ωστόσο, η βιολογία των μικροφυκών, η βιοσύνθεση των λιπιδίων τους καθώς και η πλήρη κατανόηση των μηχανισμών δεν είναι πλήρως αποσαφηνισμένα οπότε οι βιοτεχνολογικές εφαρμογές των μικροφυκών δεν έχουν μελετηθεί επαρκώς Κυανοβακτήρια Τα κυανοβακτήρια, αν και δεν ανήκουν στα μικροφύκη με την ακριβή έννοια του όρου έχουν συμπεριληφθεί ευρύτερα στα μικροφύκη στη βιοτεχνολογία καθόσον 41

65 Εισαγωγή επικράτησε η αρχική ταξινόμησή τους ως bluegreen algae (μπλεπράσινα φύκη). Αποτελούν μια εξαιρετικά ποικιλόμορφη ομάδα gram αρνητικών προκαρυωτικών οργανισμών, που εμφανίσθηκαν 3.5 δισεκατομμύρια χρόνια πριν και θεωρούνται ότι έπαιξαν καίριο ρόλο στο σχηματισμό του ατμοσφαιρικού οξυγόνου και ότι έχουν εξελιχθεί στους σημερινούς χλωροπλάστες των φυτικών οργανισμών (Grewe and Pulz, 2012). Είναι μονοκύτταροι οργανισμοί αλλά οι μορφές των ατόμων είναι είτε ένα κύτταρο είτε πολλά σε αποικίες και νήματα απλά και διακλαδισμένα. Μπορεί να είναι άχρωμα ή έντονα χρωματισμένα, αυτότροφα ή ετερότροφα, ψυχρόφιλα ή θερμόφιλα, οξύφιλα ή αλκαλόφιλα και μπορούν να εμφανίζονται σχεδόν σε κάθε βιότοπο στη γη (Ανταρκτική, ερήμους) είτε πρόκειται για θαλασσινά, γλυκά ή υπεραλμυρά νερά (αλυκές) (Εικόνα 1.4) (Mur et al., 1999). Η κύρια διαφορά τους με τα υπόλοιπα βακτήρια είναι ότι είναι οξυγονοπαραγωγικά φωτότροφοι οργανισμοί, λόγω των χρωστικών που περιέχουν (π.χ. χλωροφύλλες). Τα κυανοβακτήρια συναντώνται συχνά σε μεγάλες αποικίες ή στρώματα ως ελεύθερα ή ενδοσυμβιωτές. Τα κύτταρά τους συχνά διατάσσονται σε σειρές με αποτέλεσμα να σχηματίζουν μια επίπεδη πλάκα, ή ακτινικά σε σφαιρικές αποικίες. Οι νηματώδεις μορφές δημιουργούν σειρές κυττάρων, που ονομάζονται τριχώματα. Έχουν καταγραφεί πάνω από είδη αλλά ο πραγματικός αριθμός τους μάλλον είναι κατά πολύ μεγαλύτερος (Badger and Price, 2003). Τα κυανοβακτήρια μπορεί να αποτελέσουν εξαιρετικά κυτταρικά εργοστάσια τα οποία συλλέγουν την ηλιακή ενέργεια και μετατρέπουν το ατμοσφαιρικό διοξείδιο του άνθρακα σε χρήσιμα προϊόντα. Συγκεκριμένα, μετατρέπουν το 10% της ηλιακής ενέργειας σε βιομάζα ενώ οι συμβατικές ενεργειακές σοδιές, όπως το ζαχαροκάλαμο μετατρέπει το 1% και τα μικροφύκη το 5% (Markou and Georgakakis, 2011). Παλαιότερα, είχε επισημανθεί η χρησιμότητά τους και ως βιολίπασμα από τους Roychoudhury et al. (1979). Τα τελευταία χρόνια, η καλλιέργειά τους παρουσιάζει εντυπωσιακή ανάπτυξη σε παγκόσμιο επίπεδο, ιδιαίτερα στο χώρο των τροφίμων όπου παρατηρείται συνεχής αύξηση της ζήτησης ως συμπληρώματα διατροφής, αντικατοπτρίζοντας το πρότυπο υγιεινής διατροφής με υψηλές περιεκτικότητες σε πρωτεΐνες αλλά χαμηλό ενεργειακό περιεχόμενο. Επιπλέον, έχουν κερδίσει την προσοχή ως μια πλούσια πηγή βιολογικών δραστικών ενώσεων με αντισηπτική και αντικαρκινική δραστηριότητα. Αρκετά στελέχη βρέθηκαν να συσσωρεύουν πολυυδροξυαλκανοϊκά, τα οποία μπορεί να χρησιμοποιηθούν ως υποκατάστατα για 42

66 Εισαγωγή μη βιοαποικοδομήσιμα πετροχημικά πλαστικά (βιοπλαστικά) (Dahms et al., 2006; Abed et al., 2009). Εικόνα 1.4: Διάφορες μορφές κυανοβακτηρίων ( tutorvista.com/ content/biology/biologyiii/kingdomslivingworld/cyanobacteria.php) Τα κυανοβακτήρια, ως μια ετερογενής ομάδα μικροοργανισμών, έχουν την ικανότητα να προσαρμόζονται στις περιβαλλοντικές συνθήκες κάτι που αντικατοπτρίζεται στην εξαιρετική ποικιλία λιπιδικού προφίλ που εμφανίζουν. Αν και η συσσώρευση λιπιδίων στη βιομάζα τους είναι σχετικά χαμηλή, η σύνθεση των λιπαρών οξέων τους είναι κατάλληλη για την παραγωγή βιοντίζελ (Demirbas and Demirbas, 2011). Είναι γνωστά για την εμπορική τους αξία ως πηγές πολυσακχαριτών και την ικανότητά τους να αναπτύσσονται σε φτωχά θρεπτικά υποστρώματα (Leite and Hallenbeck, 2014). Εμφανίζουν πολλά πλεονεκτήματα για την παραγωγή βιοκαυσίμων (Dutta et al., 2005), συμπεριλαμβανομένων της εύκολης γενετικής τροποποίησης λόγω του μικρότερου γονιδιώματος που τα καθιστά λιγότερο περίπλοκα από άλλα ευκαρυωτικά μικροφύκη (Rittmann, 2008). Στοχεύουν, έτσι, στην αύξηση της φωτοσυνθετικής ικανότητας και τον γρήγορο ρυθμό ανάπτυξής τους (Thajuddin and Subramanian, 2010). Η χρήση των κυανοβακτηρίων στην αξιοποίηση της ηλιακής ακτινοβολίας μπορεί να αποτελέσει ένα καθαρότερο σύστημα στην παραγωγή βιώσιμης ενέργειας. Είναι σημαντική η κατανόηση της ποικιλομορφίας τους για την περαιτέρω εκμετάλλευσή τους σε βιομηχανικές εφαρμογές Μικροφύκη σε μεικτές κοινότητες 43

67 Εισαγωγή Η εφαρμογή και η χρήση των μικροφυκών μελετώνται τα τελευταία 50 χρόνια και αποτελούν μια κατηγορία οργανισμών στην οποία στρέφεται το ενδιαφέρον της βιομηχανίας διεθνώς για την παραγωγή νέων προϊόντων. Τα μικροφύκη αποτελούν σημαντικό μέρος των φυσικών υδάτινων οικοσυστημάτων στα οποία συνυπάρχουν με άλλες μορφές μικροοργανισμών όπως βακτήρια, μύκητες, ζύμες, πρωτόζωα αλλά και με ανώτερους οργανισμούς. Όσο αναφορά τα βακτήρια, είναι αποκλειστικά προκαρυωτικά κύτταρα που περιβάλλονται από ένα άκαμπτο κυτταρικό τοίχωμα, και εμφανίζονται κυρίως σε τρεις μορφές: σφαίρες (κόκκοι), σπειρύλλια, και ράβδοι (βάκιλοι). Είναι τα πιο απλά και τα μικρότερα των μικροβιακών κυττάρων στη βιόσφαιρα. Γενικά, τα κύτταρα είναι 110 pg σε μάζα και 2 μm σε διάμετρο. Υπάρχουν βακτήρια ως ζεύγη, αλυσίδες, και συστάδες, και μπορούν να είναι κινητικά ή μη κινητικά. Κοινά γένη σε αερόβια αστικά λύματα είναι τα Zooglea, Pseudomonas, Chromobacter, Achromobacter, Alcaligenes, και Flavobacterium (Mara and Horan, 2003). Κάτω από ιδανικές συνθήκες ανάπτυξης, ορισμένα βακτήρια μπορούν να διπλασιάσουν τον πληθυσμό τους σε λιγότερο από 30 λεπτά, γεγονός που τα καθιστά τους ταχύτερους αναπτυσσόμενους οργανισμούς που είναι γνωστοί. Επιπλέον, ορισμένα γένη αερόβιων ετερότροφων βακτηρίων (Mycobacterium, Acinetobacter, Streptomyces, Rhodococcus, Nocardia, Gordonia) μπορούν να συσσωρεύουν τριγλυκερίδια σε υψηλές συγκεντρώσεις υπό συγκεκριμένες συνθήκες περιβάλλοντος (Alvarez and Steinbüchel, 2002). Ο μέσος όρος περιεκτικότητας του ελαίου των βακτηριδίων είναι περίπου 2040% της ξηρής βιομάζας, αντιπροσωπευτικό παράδειγμα είναι τα Arthrobacter sp. και Acinetobacter calcoaceticus των οποίων η περιεκτικότητα σε έλαιο είναι 40% και 38% αντίστοιχα (Meng et al., 2009; Azócar et al., 2010). Οι συνθέσεις και οι δομές των βακτηριακών τριγλυκεριδίων ποικίλλουν ανάλογα με τον μικροοργανισμό και την πηγή άνθρακα ενώ η σύσταση των παραγόμενων λιπαρών οξέων είναι παρόμοια με τη δομή των προτεινόμενων λιπαρών οξέων για βιοντίζελ (Meng et al., 2009). Ωστόσο, δεν συσσωρεύουν όλα τα βακτήρια μεγάλες ποσότητες λιπαρών οξέων και γενικότερα δεν θεωρούνται παραγωγοί ελαίων διότι είναι δύσκολο να εκχυλιστούν τα λιποειδή που παράγονται στην εξωτερική μεμβράνη τους και έτσι μειώνεται η βιομηχανική τους αξία ως πρώτη ύλη. 44

68 Εισαγωγή Κοινότητες μικροοργανισμών όπως τα φωτότροφα βιοφίλμ είναι στρώματα αποτελούμενα από αυτότροφα (κυανοβακτήρια, μικροφύκη) και ετερότροφα (βακτήρια, μύκητες, πρωτόζωα) είδη που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στον αυτοκαθαρισμό των υδάτινων οικοσυστημάτων (Jackson and Jackson, 1972; Sabater et al., 2002). Τα οφέλη μπορεί να περιλαμβάνουν ισχυρή προσκόλληση στις επιφάνειες, ανθεκτικότητα σε τοξικούς παράγοντες, επιβίωση σε αντίξοες συνθήκες ή και την εύκολη ανταλλαγή θρεπτικών συστατικών. Υπάρχουν διάφορα μοντέλα που προτείνουν τον τρόπο σχηματισμού βιοφίλμ για κάποιους μικροοργανισμούς (βακτήρια, ζύμες) (Blankenship and Mitchell, 2006). Γι αυτό, τα φωτότροφα βιοφίλμ αποτελούν μια καινοτόμο προσέγγιση στα συστήματα επεξεργασίας μικροφυκών καθώς επιτρέπουν ταυτόχρονα την παραγωγή βιομάζας ελεύθερη λύματος (εξαιτίας των χαρακτηριστικών καθίζησης των κροκιδωμάτων μικροφυκώνβακτηρίων) και την προστασία των μικροφυκών έναντι των ρυπογόνων ουσιών ως αποτέλεσμα της διαβαθμισμένης διάχυσης εντός των νιφάδων (Hoffmann, 1998; Nicolella et al., 2000). Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ αυτότροφων μικροφυκών και ετερότροφων μικροοργανισμών μπορούν να είναι συνεργιστικές ή ανταγωνιστικές. Στα φυσικά ενδιαιτήματα των μικροφυκών εντοπίζονται αερόβια ή αναερόβια βακτήρια, υποδεικνύοντας τη σχέση μεταξύ μικροφυκώνβακτηρίων (Subashchandrabose et al., 2011). Υπό συνεργιστικές αλληλεπιδράσεις το μοριακό οξυγόνο (Ο 2 ) από την φωτοσύνθεση των μικροφυκών χρησιμοποιείται ως δέκτης ηλεκτρονίων από τα βακτήρια ώστε να αποικοδομήσουν την οργανική ύλη μέσω της βακτηριακής αναπνοής. Το διοξείδιο του άνθρακα (CO 2 ) που παράγεται από την αποδόμηση της οργανικής ύλης ολοκληρώνει τον φωτοσυνθετικό κύκλο των μικροφυκών (Muñoz and Guieysse, 2006). Ωστόσο, τα μικροφύκη και τα βακτήρια δεν περιορίζουν τις αλληλεπιδράσεις τους σε μια απλή ανταλλαγή CO 2 /O 2 (Εικόνα 1.5). Τα μικροφύκη μπορούν να έχουν αρνητικές συνέπειες για τη βακτηριακή δραστηριότητα με την αύξηση του ph, τη συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου (DO) ή τη θερμοκρασία του υγρού καλλιέργειας, ή ακόμα εκκρίνοντας ανασταλτικούς μεταβολίτες. Μπορούν, ωστόσο, να ενισχύουν τη βακτηριακή δραστηριότητα με την απελευθέρωση εξωκυτταρικών ενώσεων. Ομοίως, η βακτηριακή ανάπτυξη μπορεί να ενισχύσει τον μεταβολισμό των μικροφυκών με την απελευθέρωση παραγόντων που βοηθούν στην ανάπτυξη των μικροφυκών σε μάζα και όγκο (Gonzalez & Bashan, 2000) ή με τη 45

69 Εισαγωγή μείωση της συγκέντρωσης O 2 στο μέσο καλλιέργειας (Mouget et al., 1995; Paerl & Kellar,1978). Για παράδειγμα, συγκεκριμένα βακτήρια (Azospirillum brasilense) μπορούν να εκκρίνουν βιταμίνες και αυξητικούς παράγοντες που δρουν ως αρωγοί στην ανάπτυξη των κυττάρων των μικροφυκών (DeBashan et al., 2004; Medipally et al., 2015) ενώ κάποια άλλα στελέχη αερόβιων βακτηρίων (Pseudomonas diminuta, P. vesicularis) μειώνουν το φωτοσυνθετικά παραγόμενο οξυγόνο διευκολύνοντας, επίσης, την ανάπτυξη των μικροφυκών (Du et al., 2010). Τα βακτήρια μπορούν επίσης να αναστέλλουν τα μικροφύκη με την παραγωγή εξωκυττάριων μεταβολιτών. Εικόνα 1.5: Πιθανές θετικές και αρνητικές αλληλεπιδράσεις που αναπτύσσονται μεταξύ μικροφυκών και βακτηρίων. Οι μονοκυτταρικές τεχνολογίες παραγωγής αντιμετωπίζουν πολλά προβλήματα όπως το υψηλό κόστος για την προμήθεια οξυγόνου, τη δημιουργία δευτερογενών ρύπων, καθώς και τεχνική αδυναμία σε ορισμένες περιπτώσεις. Οι μεικτές καλλιέργειες (consortium) είναι ένα ιδανικό αυτοσυντηρούμενο σύστημα που είναι φθηνότερο και τεχνικά ανώτερο. Στη φύση υπάρχουν πολλά παραδείγματα τέτοιων κοινοτήτων που είναι είτε απολιθωμένες ή αποικούν μαζί. Στους κλειστούς φωτοβιοαντιδραστήρες η φωτοσύνθεση αναστέλλεται από το υπερβολικά διαλυμένο 46

70 Εισαγωγή οξυγόνο που μπορεί να φθάσει σε ποσοστό έως 400 % με αποτέλεσμα να εμποδίζεται η περαιτέρω ανάπτυξη των μικροφυκών. Στην περίπτωση όμως που η καλλιέργεια είναι μιξότροφη, η βακτηριακή κατανάλωση του Ο 2 χαμηλώνει την ποσότητά του, μέσα στο μικροπεριβάλλον των κυττάρων των μικροφυκών οδηγώντας σε πιο ευνοϊκές συνθήκες για την ανάπτυξη (Subashchandrabose et al., 2011). Οι συνεργιστικές σχέσεις μεταξύ των διαφόρων ειδών παρατηρούνται συχνά σε μιξότροφα συστήματα καθώς ο συγκεκριμένος μεταβολισμός συνδυάζει την αυτότροφη και την ετερότροφη μορφή ανάπτυξης με αποτέλεσμα να αυξάνεται η παραγωγικότητα της βιομάζας και να μειώνεται ο κύκλος της καλλιέργειας (Wang et al., 2014). Οι μιξότροφες καλλιέργειες έχουν πολλά πλεονεκτήματα έναντι των άλλων τύπων παραγωγής όπως το ότι: 1) έχουν μικρότερη ευαισθησία στον κορεσμό του φωτός, 2) απαιτούν λιγότερο φωτισμό για την ανάπτυξή τους, 3) έχουν καλύτερους ρυθμούς ανάπτυξης και μικρότερες απώλειες βιομάζας κατά την διάρκεια της νύχτας, 4) είναι πιο σταθερά συστήματα και έχουν χαμηλότερο κίνδυνο εισβολής από τις μονοκαλλιέργειες και 5) έχουν υψηλότερη παραγωγή βιομάζας και παραγωγικότητας λιπιδίων. Κατά την επεξεργασία των αποβλήτων, η συμβιωτική σχέση είναι η βάση για να ολοκληρωθεί η διαδικασία καθώς επιτυγχάνεται αποτοξικοποίηση των οργανικών και ανόργανων ρύπων και υψηλότερα ποσοστά απομάκρυνσης θρεπτικών στοιχείων σε σχέση με τις μονοκαλλιέργειες. Τα βακτήρια ανταγωνίζονται τα μικροφύκη για τα διαθέσιμα θρεπτικά συστατικά ιδιαίτερα σε ολιγοτροφικά περιβάλλοντα (φωτότροφα), γι αυτό και η ανάπτυξη των μικροφυκών είναι βραδύτερη, ενώ επίσης μπορούν να αξιοποιούν εκκρίματα των μικροφυκών, πολύπλοκης οργανικής φύσης (Lakaniemi et al., 2012). Επίσης, τα βακτήρια, αυξάνουν τη διαλυτότητα των θρεπτικών ουσιών και των ιχνοστοιχείων έτσι ώστε να είναι βιοδιαθέσιμα στα μικροφύκη (Olguín, 2012). Επιπλέον, τα μικροφύκη για να επιβιώσουν στο ανταγωνιστικό αυτό περιβάλλον έχουν αναπτύξει στρατηγικές άμυνας παράγοντας μια τεράστια ποικιλία ενώσεων μέσα από διαφορετικές μεταβολικές οδούς, συμμετέχοντας έτσι με προϊόντα στους τομείς της διατροφής, της φαρμακευτικής βιομηχανίας και της δημόσιας υγείας (Cardozo et al., 2007). Τα συστήματα τα οποία χρησιμοποιούν μεικτές καλλιέργειες μικροφυκώνβακτηρίων για την επεξεργασία των λυμάτων και την παραγωγή βιοντίζελ και χημικών προϊόντων κερδίζουν τη δημοτικότητα καθώς αποτελούν μια ελκυστική 47

71 Εισαγωγή εναλλακτική λύση στη χρήση μικροφυκών που βασίζονται σε συστήματα που στοχεύουν αποκλειστικά στην παραγωγή βιοντίζελ. Η συμβίωση μικροφυκών και βακτηρίων μπορεί να προωθήσει την αμοιβαία ανάπτυξη και ως εκ τούτου να οδηγήσει σε υψηλότερη απόδοση απομάκρυνσης από ένα σύστημα που θα είχε μόνο φύκη ή μόνο βακτήρια (DeBashan et al., 2004). Τα απόβλητα περιέχουν ένα σύνολο από πολύπλοκες οργανικές ενώσεις, δύσκολα βιοαποικοδομήσιμες μόνο από μικροφύκη. Έτσι, με την πολυκαλλιέργεια το κάθε είδος μπορεί να απορροφήσει συγκεκριμένες ουσίες διαφορετικές από τα άλλα είδη. Έρευνες αποδεικνύουν την θετική συνέργεια των μικροοργανισμών μιας μεικτής καλλιέργειας στις οποίες απομακρύνονται τα περισσότερα συστατικά όταν στο υπόστρωμα συνυπάρχουν διαφορετικά είδη μικροοργανισμών (Pouliot et al., 1989; Blier et al., 1995; Liang et al., 2013b). Συνήθως, τα βακτήρια που βρίσκονται στα λύματα είναι χημειοετερότροφα και τα μικροφύκη φωτοαυτότροφα. Η απομάκρυνση των θρεπτικών συστατικών με το σύστημα μικροφυκώνβακτηρίων μπορεί να επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες, όπως το ph, το φωτισμό, το διαλυμένο οξυγόνο καθώς και την αναλογία φυκών και βακτηρίων. Λόγω της συμβίωσης τους, τα φωτοαυτότροφα μικροφύκη και τα χημειοετερότροφα βακτήρια συχνά συνεργάζονται (μαζί με άλλα μικρόβια) σχηματίζοντας συμπαγή κροκιδώσεις, τα οποία με αυτόν τον τρόπο ενισχύουν την ανταλλαγή CO 2 και O 2, σε συνδυασμό με την ανάπτυξή τους (Εικόνα 1.5) (Muñoz and Guieysse, 2006) Συστήματα καλλιέργειας μικροφυκών Τα μικροφύκη ως υδρόβιοι συγγενείς των χερσαίων φυτών, ευδοκιμούν σε αεριζόμενες, υγρές καλλιέργειες όπου τα κύτταρα έχουν επαρκή πρόσβαση σε φως, διοξείδιο του άνθρακα, και άλλα θρεπτικά συστατικά. Κυρίως καλλιεργούνται φωτοαυτοτροφικά αλλά μερικά είδη είναι σε θέση να επιβιώσουν ετερότροφα καταναλώνοντας οργανικές ουσίες. Σε αντίθεση με τα χερσαία φυτά, τα μικροφύκη δεν απαιτούν καλλιεργήσιμο έδαφος ή άρδευση ενώ, επιπλέον, επειδή καταναλώνουν διοξείδιο του άνθρακα, η μεγάλης κλίμακας καλλιέργεια μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως αποκατάσταση της εξάτμισης από καύση σε εργοστάσια ηλεκτρισμού (Benemann and Oswald, 1996). 48

72 Εισαγωγή Οι συνθήκες καλλιέργειας διαφοροποιούνται ανάλογα με τα τελικά επιθυμητά προϊόντα. Τα μικροφύκη μπορούν να καλλιεργηθούν είτε σε ανοιχτά, είτε σε κλειστά ελεγχόμενα συστήματα με διαφορετικές λειτουργικές απαιτήσεις και κόστος. Ανάλογα με το είδος του καλλιεργούμενου οργανισμού εντοπίζονται δύο διαφορετικές προσεγγίσεις για την παραγωγή ενέργειας από τη βιομάζα: α) τη βιολογική μετατροπή των θρεπτικών στοιχείων σε λιπίδια ή υδατάνθρακες και β) τη θερμοχημική υγροποίηση της βιομάζας τους σε υδατάνθρακες. Η ανάπτυξη εξαρτάται από πολλούς παράγοντες και μπορεί να βελτιστοποιηθεί όσον αναφορά τη θερμοκρασία, τη χρήση ηλιακού ή τεχνητού φωτός, το ph, τη μηχανική των ρευστών και άλλα. Τα συστήματα παραγωγής μικροφυκών μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο διακριτές κατηγορίες: ανοικτές λίμνες και κλειστούς φωτοβιοαντιδραστήρες. Στη συνέχεια της ενότητας δίνεται μια σύντομη σύγκριση των ανοικτών συστημάτων και του κλειστού φωτοβιοαντιδραστήρα Ανοιχτά συστήματα Οι αντιδραστήρες ανοικτών συστημάτων είναι τα πιο απλά συστήματα ανάπτυξης μικροφυκών που μπορούν να κατασκευαστούν λόγω του χαμηλού κόστους. Υπάρχουν διάφοροι τύποι ανοικτών συστημάτων τα οποία διαφοροποιούνται κυρίως με βάση το μέγεθος, το σχήμα, το υλικό που χρησιμοποιείται για την κατασκευή τους, το είδος της ανάδευσης και την κλίση. Οι αντιδραστήρες περιλαμβάνουν απλές δεξαμενές, αβαθείς λίμνες με μικρές κοιλότητες μέσα στο έδαφος, μερικές φορές επενδύονται με πλαστικό (σαν θερμοκήπια) και συνήθως σχεδιάζονται κυκλικές ή σαν τεχνητά κανάλια (τεχνητές λίμνες ελισσόμενου στίβου). Το πιο συχνά χρησιμοποιούμενο σύστημα είναι αυτό των τεχνητών καναλιών που αποτελείται από ένα κλειστού βρόχου κανάλι επανακυκλοφορίας με περίπου μισό μέτρο βάθος όπου η ανάμιξη παράγεται από ένα πτερυγωτό τροχό αποτρέποντας την καθίζηση (Medipally et al., 2015) (Εικόνα 1.6). Η απλότητα των συστημάτων αυτών οδηγεί σε προβλήματα όσο αναφορά τον έλεγχο του περιβάλλοντος ανάπτυξης (θερμοκρασία, ph) και τις συνθήκες λειτουργίας παρέχοντας λιγότερο ιδανικές αποδόσεις για τα μικροφύκη, δηλαδή χαμηλότερη παραγωγικότητα βιομάζας σε σχέση με τους κλειστούς βιοαντιδραστήρες. Τα περισσότερα ανοικτά συστήματα, περιορίζονται από 49

73 Εισαγωγή αβιοτικούς παράγοντες ανάπτυξης όπως είναι η θερμοκρασία, το pη, η ένταση του φωτός, η συγκέντρωση διαλυμένου οξυγόνου, ενώ υπόκεινται εύκολα και σε μόλυνση. Η θερμοκρασία επίσης είναι δύσκολο να διατηρηθεί σταθερή ενώ τα θρεπτικά συστατικά και το οξυγόνο επηρεάζουν σημαντικά τα επίπεδα του ph στο νερό. Το CO 2 μπορεί να μεταφέρεται μέσα στις λίμνες μέσω της φυσικής διάχυσης από την ατμόσφαιρα στο νερό, ωστόσο το φως του ήλιου ελαττώνεται κάτω από την επιφάνεια του νερού αφήνοντας τα κύτταρα των μικροφυκών στον πυθμένα της λίμνης με μικρότερη ενέργεια για ανάπτυξη. Παρ όλα αυτά εφαρμογή συστήματος ανάδευσης μπορεί να επιτρέπει στα κύτταρα των μικροφυκών την επαρκή έκθεσή τους σε φως. Επιπλέον, η έκθεση στην ατμόσφαιρα επιτρέπει να εισέλθουν στα συστήματα ανεπιθύμητα ή ανταγωνιστικά στελέχη μικροοργανισμών με ανασταλτικές ιδιότητες (Wogan et al., 2008). Αυτά τα ανταγωνιστικά στελέχη μπορούν δυνητικά να εγκατασταθούν στη λίμνη καθιστώντας έτσι δύσκολη τη συγκομιδή της επιθυμητής καλλιέργειας, γι αυτό και το μεγαλύτερο μέρος των ειδών που καλλιεργούνται στα συστήματα αυτά αναπτύσσονται υπό ελεγχόμενα περιβάλλοντα (Medipally et al., 2015). Συγκεκριμένα, χρησιμοποιούνται στελέχη ανθεκτικά σε αντίξοες περιβαλλοντικές συνθήκες, όπως είδη των Dunaliella, Spirulina και Chlorella sp. που καλλιεργούνται σε υψηλή αλατότητα, αλκαλικότητα και περιορισμένα θρεπτικά συστατικά, οδηγώντας μάλιστα σε υψηλούς ρυθμούς παραγωγής. Εικόνα 1.6: Ανοιχτά συστήματα ανάπτυξης μικροφυκών: Μη αρόσιμη έκταση στη Κίνα (αριστερά) και επιμήκης λεκάνες της Cyanotech στη Χαβάη (δεξιά) ( 50

74 Εισαγωγή Ωστόσο, τα συστήματα ανοιχτών λιμνών είναι η φθηνότερη μέθοδος για μεγάλης κλίμακας καλλιέργεια μικροφυκών καθώς είναι εύκολη η κατασκευή και η συντήρησή τους, καταναλώνοντας ελάχιστη ενέργεια (Medipally et al., 2015). Στα συστήματα ανοικτών τεχνητών λιμνών μπορούν να χρησιμοποιηθούν διάφορα είδη υδάτων όπως το γλυκό νερό, το υφάλμυρο, το θαλασσινό ακόμα και το νερό που εμφανίζει ευτροφισμό. Επίσης είναι δυνατή η αξιοποίηση διαφόρων μιγμάτων νερού αλλά και αποβλήτων ανάλογα με τα επιθυμητά προϊόντα. Τα σύγχρονα συστήματα σχεδιάζονται σαν υψηλού αερισμού λίμνες, ελισσόμενου στίβου με κουπιά ανάδευσης, αντλίες κυματισμών ή διαφράγματα για την κυκλοφορία του νερού, των θρεπτικών και των αερίων. Συνοπτικά, τα χαρακτηριστικά των ανοιχτών συστημάτων αποτελούν οι χαμηλοί ρυθμοί ανάπτυξης, ο κίνδυνος μολύνσεων, η αυξημένη πιθανότητα εξάτμισης και η χρήση σημαντικών εκτάσεων γης (Hase et al., 2000) Παρόλα αυτά, η χρήση τους είναι εκτεταμένη λόγω του χαμηλού κόστους κατασκευής και συντήρησης καθώς η τεχνολογία των κλειστών συστημάτων δεν έχει ακόμα βελτιστοποιηθεί και το κόστος τους είναι αποτρεπτικό (Chisti, 2007; Preiss and Kowalski, 2010; Cai et al., 2013) Κλειστοί βιοαντιδραστήρες Οι κλειστοί βιοαντιδραστήρες αποτελούν κλειστά δοχεία καλλιέργειας που έχουν σχεδιαστεί ώστε να αξιοποιούν το μέγιστο του ηλιακού φωτός και να χρησιμοποιούν μια ποικιλία από θρεπτικά μέσα καλλιέργειας. Τα προβλήματα εξάτμισης, θερμοκρασίας, ανταλλαγής αερίων και μικροβιακού ανταγωνισμού ρυθμίζονται ευκολότερα σε σχέση με τα ανοιχτά συστήματα (Pulz, 2001). H καλλιέργεια με κλειστά συστήματα μπορεί να γίνεται σε άγονες περιοχές ή σε περιοχές που οι συνθήκες δεν επιτρέπουν ανοιχτά συστήματα. Χαρακτηριστικά των συστημάτων αυτών αποτελούν: οι μικρότερες απαιτήσεις χώρου, η δυνατότητα συνεχούς λειτουργίας, το υψηλό επίπεδο ελέγχου των συνθηκών και η αυξημένη συγκέντρωση βιομάζας άρα χαμηλότερο κόστος συγκομιδής ανά τόνο βιομάζας. Παρ όλα αυτά, οι κλειστοί βιοαντιδραστήρες δεν μπορούν να αποτελέσουν το μοναδικό τρόπο καλλιέργειας καθώς εμφανίζουν μειονεκτήματα όπως η υπερθέρμανση, η τοξική συσσώρευση οξυγόνου, το υψηλό κόστος εγκατάστασης, η 51

75 Εισαγωγή δυσκολία καθαρισμού, η διάβρωση λόγω αυξημένης πίεσης κ.α. (Christenson and Sims, 2011). Υπάρχουν διαφορετικοί τύποι βιοαντιδραστήρων που εξυπηρετούν διαφορετικούς σκοπούς όπως είναι οι κατακόρυφοι ή κεκλιμένοι, οι κυλινδρικοί με επιμήκεις αγωγούς ή ελικοειδούς μορφής (Εικόνα 1.7). Κατασκευάζονται επίσης από διάφορα διαφανή υλικά όπως γυαλί και πλαστικό (Richmond and ChengWu, 2001; Chisti, 2007; Eriksen, 2008; Brennan and Owende, 2010). Συνοπτικά, τα πιο κοινά χρησιμοποιούμενα κλειστά συστήματα εμπεριέχουν: Αντιδραστήρες κατακόρυφης στήλης (φυσαλίδων ή ανύψωσης αέρα) Συστήματα σωληνοειδών αντιδραστήρων (Molina et al., 2001) Επίπεδους φωτοβιοαντιδραστήρες (Ugwu et al., 2008) Εικόνα 1.7: Κλειστά συστήματα ανάπτυξης μικροφυκών. Επίπεδος βιομηχανικού μεγέθους γυάλινος φωτοβιοαντιδραστήρας (αριστερά) (ChengWu et al., 2001) και κλειστός αυλωτός φωτοβιοαντιδραστήρας της IGVBiotech (δεξιά) ( Υβριδικά συστήματα Τα υβριδικά συστήματα αποτελούνται από δύο στάδια παραγωγής που συνδυάζουν τους φωτοβιοαντιδραστήρες και τις ανοιχτές λίμνες. Το πρώτο στάδιο της καλλιέργειας πραγματοποιείται μέσα στο φωτοβιοαντιδραστήρα όπου οι ελεγχόμενες συνθήκες ελαχιστοποιούν τη μόλυνση και βοηθούν την συνεχή κυτταρική ανάπτυξη. Το δεύτερο στάδιο της καλλιέργειας έχει ως στόχο την έκθεση των κυττάρων υπό συνθήκες στέρησης θρεπτικών συστατικών οι οποίες ενισχύουν τη σύνθεση των λιπιδίων. Κατάλληλες για το σκοπό αυτό είναι οι ανοιχτές λίμνες όπου οι φυσικές συνθήκες του περιβάλλοντος μπορούν να οδηγήσουν στο επιθυμητό 52

76 Εισαγωγή αποτέλεσμα (Brennan and Owende, 2010). Ωστόσο, τα υβριδικά συστήματα δεν ενδείκνυνται κατάλληλα για την παραγωγή βιοκαυσίμων καθώς είναι δαπανηρά και δεν μπορούν να έχουν συνεχή λειτουργία (Medipally et al., 2015) Τεχνολογίες παραγωγής βιομάζας μικροφυκών Ο ρυθμός ανάπτυξης και η μέγιστη παραγωγή βιομάζας στις καλλιέργειες των μικροφυκών επηρεάζονται από αβιοτικούς (φως, θερμοκρασία, ph, αλατότητα, O 2, CO 2 και θρεπτικά συστατικά), βιοτικούς (παθογόνοι μικροοργανισμοί και ανταγωνισμός), αλλά και λειτουργικούς (εξάτμιση, συχνότητα συγκομιδής) παράγοντες. Συνήθως, τα μικροφύκη μπορούν να καλλιεργηθούν με τέσσερις τρόπους καλλιέργειας: αυτότροφα, ετερότροφα, μιξότροφα ή φωτοετερότροφα Αυτότροφη παραγωγή Στην (φωτο)αυτότροφη καλλιέργεια, τα μικροφύκη χρησιμοποιούν το φως του ήλιου ως πηγή ενέργειας και ανόργανα συστατικά, όπως το CO 2, ως πηγή άνθρακα ώστε να σχηματίσουν βιομάζα μέσω της διεργασίας της φωτοσύνθεσης. Η καλλιέργεια των μικροφυκών μπορεί να πραγματοποιηθεί σε ανοικτούς ή κλειστούς τύπους βιοαντιδραστήρων. Υπάρχει πληθώρα εργασιών που μελετά την αυτότροφη καλλιέργεια των μικροφυκών για διαφορετικά στελέχη μικροοργανισμών εστιάζοντας είτε στη παραγωγή βιομάζας και βιοκαυσίμων είτε και στη δυνατότητα παραγωγής προϊόντων υψηλής αξίας. Η φωτότροφη καλλιέργεια είναι η πιο κοινά χρησιμοποιούμενη για την ανάπτυξη των μικροφυκών στην οποία παρουσιάζεται μια τεράστια ποικιλία στο λιπιδικό περιεχόμενο των μικροοργανισμών που κυμαίνεται από 568% ξηρού βάρους ανάλογα με τον τύπο καλλιέργειας και το είδος των μικροφυκών (Chen et al., 2011). Συνήθως, η έλλειψη αζώτου χρησιμοποιείται για να προκληθεί αύξηση στο λιπιδικό περιεχόμενο των μικροφυκών και να μειωθεί η διαφορά κόστους από την χαμηλή παραγωγικότητα στη βιομάζα (Mata et al., 2010). Σημαντικό προσόν της αυτότροφης καλλιέργειας αποτελεί το γεγονός ότι μειώνεται η πιθανότητα μολύνσεων και επιτρέπεται έτσι η χρήση της σε μεγαλύτερης κλίμακας συστήματα (ανοιχτές λίμνες). Επίσης, κύριο πλεονέκτημα από την χρήση φωτότροφης καλλιέργειας για παραγωγή ελαίου από μικροφύκη είναι η κατανάλωση CO 2 ως οργανική πηγή κυτταρικής ανάπτυξης. Η εγκατάσταση κοντά σε εργοστάσια 53

77 Εισαγωγή παραγωγής ηλεκτρικής ενέργειας μπορεί να παρέχει τεράστιες ποσότητες CO 2 διευκολύνοντας την αύξηση της βιομάζας τους Ετερότροφη παραγωγή Στην ετερότροφη παραγωγή τα μικροφύκη χρησιμοποιούν υπό συνθήκες έλλειψης φωτός, οργανικό άνθρακα ταυτόχρονα ως πηγή ενέργειας και ως θρεπτικό συστατικό. Τα μικροφύκη μπορούν να απορροφήσουν για ανάπτυξη ποικιλία οργανικών πηγών όπως η γλυκόζη, η γλυκερόλη, η φρουκτόζη, η λακτόζη και η μαννόζη (Liang et al., 2009). Η ετερότροφη ανάπτυξη πλεονεκτεί ως προς τον αυτότροφο τρόπο καλλιέργειας καθώς επικρατούν ελεγχόμενες συνθήκες, μηδενίζεται η ανάγκη για φωτισμό, επιτυγχάνονται υψηλότερα επίπεδα παραγωγής βιομάζας και μειώνεται έτσι το κόστος συγκομιδής της (Huang et al., 2010; Chen et al., 2011). Μάλιστα, ορισμένα είδη μικροφυκών παρουσιάζουν μεγαλύτερο περιεχόμενο σε λιπίδια κατά την ανάπτυξη τους υπό συνθήκες ετερότροφης καλλιέργειας, όπως για παράδειγμα στη Chlorella protothecoides όπου η ετερότροφη ανάπτυξη αύξησε σε 40% το περιεχόμενο έλαιο σε σχέση με την φωτότροφη καλλιέργειά της (Xu et al., 2006). Ωστόσο, στα ετερότροφα συστήματα παρουσιάζονται κάποια μειονεκτήματα όπως ο περιορισμένος αριθμός ειδών ικανά για ετερότροφη παραγωγή, η έντονη μόλυνση από άλλους μικροοργανισμούς που οφείλεται στην παρουσία του οργανικού υποστρώματος, η χρήση γλυκόζης ως οργανικό υπόστρωμα που οδηγεί σε ανταγωνισμό με τα τρόφιμα καθώς είναι βρώσιμη. Για αυτό το λόγο, οι μελέτες στοχεύουν στην αναζήτηση φθηνότερων οργανικών πηγών, όπως υδρολύματα φυτικών υλών, γλυκερόλη και υγρά απόβλητα (PerezGarcia et al., 2011; CerónGarcía et al., 2013) Μιξότροφη παραγωγή Στην μιξότροφη παραγωγή τα μικροφύκη χρησιμοποιούν τόσο αυτότροφα όσο και ετερότροφα μεταβολικά μονοπάτια για την ανάπτυξή τους, καθώς είναι ικανά να φωτοσυνθέτουν και να αξιοποιούν ταυτόχρονα την οργανική ύλη. Σε αυτά τα συστήματα οι μικροοργανισμοί μπορούν να επιβιώσουν είτε αυτότροφα είτε ετερότροφα ανάλογα με τη διαθεσιμότητα του οργανικού άνθρακα και την ένταση του φωτός. Οι μικροοργανισμοί χρησιμοποιούν το φως για να φωτοσυνθέτουν ενώ 54

78 Εισαγωγή μέσω της αερόβιας αναπνοής χρησιμοποιούν μια οργανική πηγή άνθρακα για την ανάπτυξή τους. Συγκριτικές μελέτες φανερώνουν τον αυξημένο ρυθμό ανάπτυξης βιομάζας σε μιξότροφες συνθήκες καθώς η συνέργεια φωτός και οργανικού άνθρακα κατά τη διάρκεια του ημερήσιου κύκλου μειώνει την απώλεια βιομάζας κατά τη διάρκεια της νύχτας (Chojnacka and Noworyta, 2004). Στον Πίνακα 1.6 παρουσιάζονται αναλυτικά οι αποδόσεις και των τριών μεθόδων καλλιέργειας για το είδος Chlorella sp. (αυτότροφη, ετερότροφη και μιξότροφη) ως προς την παραγωγικότητα της βιομάζας, το λιπιδικό περιεχόμενο και την παραγωγικότητα των λιπιδίων. Παραλλαγή της μιξότροφης καλλιέργειας αποτελεί η φωτοετερότροφη καλλιέργεια όπου αφορά συστήματα τα οποία απαιτούν φωτισμό ως πηγή ενέργειας και χρησιμοποιούν οργανικές ενώσεις ως πηγή άνθρακα. Η κύρια διαφορά της φωτοετερότροφης καλλιέργειας με τη μιξότροφη καλλιέργεια είναι ότι η πρώτη χρησιμοποιεί φωτισμό ως πηγή ενέργειας, ενώ η τελευταία χρησιμοποιεί οργανικές ενώσεις για τον ίδιο σκοπό. Επομένως, η φωτοετερότροφη καλλιέργεια χρειάζεται ταυτόχρονα σάκχαρα και φωτισμό για την ανάπτυξή της. Η χρήση των συνθηκών αυτών για την παραγωγή βιοντίζελ δεν έχει μελετηθεί εκτεταμένα (Wang et al., 2014). Πίνακας 1.6: Ρυθμός παραγωγής βιομάζας και λιπιδίων για Chlorella sp. υπό αυτότροφη, ετερότροφη και μιξότροφη καλλιέργεια (Medipally et al., 2015). Μέθοδος καλλιέργειας Αυτότροφη Ετερότροφη Μιξότροφη Μικροφύκος Παραγωγικότητα βιομάζας (g L 1 d 1 ) Λιπιδικό περιεχόμενο (% ξηρού βάρους) Παραγωγικότητα λιπιδίων (mg L 1 d 1 ) Chlorella vulgaris Chlorella protothecoides Chlorella sorokiniana Βιβλιογραφία Mata et al. (2010) Chlorella vulgaris Liang et al. (2009) Chlorella Chen and protothecoides Walker (2011) Chlorella sorokiniana Zheng (2013) Chlorella vulgaris Chlorella Wang et al protothecoides (2014) 55

79 Εισαγωγή Chlorella sorokiniana Τεχνολογίες συγκομιδής βιομάζας μικροφυκών Βασικό πλεονέκτημα της βιομάζας των μικροφυκών αποτελεί η δυνατότητα επαναχρησιμοποίησής της, χαρακτηριστικό που σχετίζεται άμεσα με την διαδικασία της συγκομιδής της. Η ευκολία στη συγκομιδή εξαρτάται κυρίως από το μέγεθος των μικροοργανισμών, το οποίο καθορίζει πόσο εύκολα τα είδη μπορούν να διευθετηθούν και να φιλτραριστούν. Το μέσο μήκος των περισσότερων ειδών μικροφυκών μετράται σε μικρόμετρα (μm). Η συγκομιδή συμβάλει 2030% στο συνολικό κόστος παραγωγής της βιομάζας (Molina Grima et al., 2003). Προκειμένου να μειωθεί το κόστος παραγωγής, είναι απαραίτητο να συμπυκνωθεί η βιομάζα των μικροφυκών ώστε να περιέχει λιγότερο νερό και να επιτευχθεί η εκχύλιση του ελαίου. Έτσι, είναι απαραίτητο να διατηρηθεί μια αποτελεσματική αλληλεπίδραση μεταξύ της ανάπτυξης των τεχνολογιών συγκομιδής και της επιλογής των στελεχών μικροφυκών για μαζική καλλιέργεια (Adagha, 2009). Οι τεχνικές συγκομιδής χωρίζονται σε δύο στάδια. Πρώτον, πραγματοποιείται διαχωρισμός της βιομάζας από το μέσο καλλιέργειας, όπου αυτό επιτυγχάνεται με ιζηματοποίηση και τεχνολογίες επίπλευσης και στη συνέχεια, ακολουθούν συστήματα πύκνωσης της προηγούμενης υδαρούς φάσης μέσω φυγοκέντρησης ή φιλτροπρεσσών (Wiley et al., 2009). Η κατάλληλη τεχνολογία συγκομιδής επιλέγεται σύμφωνα με το είδος των μικροοργανισμών, το θρεπτικό μέσο καλλιέργειας και τα τελικά επιθυμητά προϊόντα. Παρακάτω δίνεται μια σύντομη ανασκόπηση των βασικών μεθόδων συγκομιδής: Καθίζηση Η καθίζηση θεωρείται ευρέως ως η πιο τεχνικά απλή μέθοδος συγκομιδής μικροφυκών για συστήματα επεξεργασίας αποβλήτων εξαιτίας της χαμηλής αξίας βιομάζας που προκύπτει από την επεξεργασία (Brennan and Owende, 2010). Οι εγκαταστάσεις που απαιτούνται χρειάζονται σημαντικό επιπρόσθετο χώρο και γενικά η διαδικασία που ακολουθείται εξαρτάται από τα είδη των μικροοργανισμών που επιλέγονται (Christenson and Sims, 2011). Για να ενισχυθεί η αποτελεσματικότητα 56

80 Εισαγωγή της μεθόδου πραγματοποιείται συνήθως και χρήση χημικών κροκιδωτικών μέσων (Chen et al., 2011). Ωστόσο, η προσθήκη χημικών, όπως τα Ca 2+ ή προϊόντων ασβεστίου, προκαλεί δευτερεύουσα ρύπανση (Nurdogan and Oswald, 1995). Διήθηση Η διήθηση είναι μια μέθοδος insitu διαχωρισμού μικροφυκών από το μέσο ανάπτυξης. Συνήθως πραγματοποιείται σε μεμβράνες από τροποποιημένη κυτταρίνη με τη βοήθεια μιας αντλίας αναρρόφησης. Αρκετές τεχνικές έχουν περιγραφεί από ερευνητές που περιλαμβάνουν διαφορετικά υλικά, χρήση κενού, πίεση και διήθηση περιστροφής. Η χρήση της είναι πιο πρακτική για τα συσσωματώματα των μικροφυκών, αλλά όχι για τα μονοκύτταρα στελέχη (Benemann and Oswald, 1996; Molina Grima et al., 2003). Η διήθηση θεωρείται ότι πλεονεκτεί έναντι άλλων μεθόδων συγκομιδής καθώς είναι σε θέση να συλλέγει μικροφύκη ή κύτταρα πολύ χαμηλής πυκνότητας. Ωστόσο, η συμπύκνωση με διήθηση κενού περιορίζεται για μικρούς όγκους και οδηγεί στην ενδεχόμενη απόφραξη του φίλτρου από τα συμπιεσμένα κύτταρα. Επίσης, το κόστος άντλησης και αλλαγής μεμβρανών είναι αρκετά υψηλό (Grima et al., 2003). Η διήθηση με κοκκώδη φίλτρα προτείνεται για χρήση σε μικρές λίμνες επεξεργασίας αποβλήτων με μικροφύκη (Middlebrooks et al., 1974). Φυγοκέντρηση Η φυγοκέντρηση είναι μία διαδικασία διαχωρισμού των μικροφυκών από το μέσο ανάπτυξης με τη χρήση φυγόκεντρου. Συχνά χρησιμοποιείται για τη συγκέντρωση των μικροφυκών υψηλής αξίας, και γενικά θεωρείται ακριβή και ενεργοβόρα αλλά γρήγορη και σταθερή μέθοδος (Adagha, 2009). Η διαδικασία συλλογής της βιομάζας σε υψηλή πυκνότητα είναι αποτελεσματική αλλά δεν εφαρμόζεται συχνά σε μεγάλης κλίμακας παραγωγή (Grima et al., 2003; Pittman et al., 2011). Η βιομάζα ανακτάται με την απομάκρυνση του υπερκείμενου μέρους από την επιφάνεια. Επίπλευση Η επίπλευση είναι μια μέθοδος συγκομιδής όπου τα κύτταρα επιπλέουν στην επιφάνεια του θρεπτικού μέσου σε διάσπαρτες φυσαλίδες και απομακρύνονται ως 57

81 Εισαγωγή απόβρασμα (Brennan and Owende, 2010). Στο πιο κοινό σύστημα που χρησιμοποιείται, ένας αεροσυμπιεστής παρέχει λεπτές φυσαλίδες όπου τα κύτταρα των μικροφυκών προσκολλώνται και επιπλέουν στην επιφάνεια. Προστίθενται κροκιδωτικά για να βελτιώσουν την αποτελεσματικότητα της συγκομιδής. Οι οικονομικές πτυχές αυτής της διαδικασίας φαίνονται ευνοϊκές για μαζική συγκομιδή καθώς τα μικροφύκη παράγουν οξυγόνο που συσσωρεύεται σε φυσαλίδες στην επιφάνεια και βοηθά την διαδικασία. Για αυτό, η διαδικασία της επίπλευσης έχει αξιολογηθεί ως εμπορικά βιώσιμη μέθοδος και έχει εφαρμοστεί όταν γίνεται επεξεργασία μεγάλων όγκων αποβλήτων από μικροφύκη (Chen et al., 2011; Christenson and Sims, 2011). Κροκίδωση Η κροκίδωση είναι μια μέθοδος διαχωρισμού μικροφυκών από το μέσο ανάπτυξης με τη χρήση χημικών ουσιών που «αναγκάζουν» τα μικροφύκη να σχηματίζουν συσσωματώματα. Το χλωριούχο αργίλιο και ο χλωριούχος σίδηρος είναι χημικά κροκιδωτικά που χρησιμοποιούνται για την συγκομιδή των μικροφυκών (Brennan and Owende, 2010). Αν και είναι αποτελεσματική σε μεγάλης κλίμακας εγκαταστάσεις, η προσθήκη χημικών κροκιδωτικών μετατρέπει μια σημαντική πρώτη ύλη σε λάσπη αποβλήτων που πρέπει να απορριφθεί, για αυτό η διαδικασία έχει κάποιους περιορισμούς καθώς υπάρχει δυσκολία στο διαχωρισμό των μικροφυκών από τις πρόσθετες χημικές ουσίες. Αν και η μέθοδος της κροκίδωσης έχει χαμηλό κόστος, τα προστιθέμενα άλατα οδηγούν σε αύξηση της αλατότητας και δευτερογενή ρύπανση (Jiang et al., 1993; Christenson and Sims, 2011). Στις περισσότερες εγκαταστάσεις επεξεργασίας λυμάτων με μικροφύκη χρησιμοποιείται ως μέθοδος συγκομιδής η χημική κροκίδωση η οποία ακολουθείται από ιζηματοποίηση ή επίπλευση μέσω αέρα (Friedman et al., 1977; Teixeira and Rosa, 2006). Ωστόσο, η εύρεση μιας χαμηλού κόστους τεχνικής για τις μεγάλες εγκαταστάσεις επεξεργασίας αποβλήτων με μικροφύκη που θα επιτρέπει την δημιουργία βιοπροϊόντων αποτελεί ακόμα πρόκληση (Christenson and Sims, 2011; Pittman et al., 2011). Συστήματα ακινητοποίησης Η ακινητοποίηση αποτελεί αποτελεσματική μέθοδο συγκομιδής γι αυτό έχει περιγραφεί ευρέως στην βιολογική επεξεργασία απομάκρυνσης θρεπτικών 58

82 Εισαγωγή συστατικών αλλά και βαρέων μετάλλων (DeBashan et al., 2004; PérezMartínez et al., 2010). Υπάρχουν διάφοροι τύποι μεθόδων ακινητοποίησης: ομοιοπολική σύζευξη, ακινητοποίηση συγγένειας, προσρόφηση, περιορισμός σε γαλάκτωμα υγρούυγρού, συγκράτηση σε ημιδιαπερατές μεμβράνες και παγίδευση (ή ενθυλάκωση) σε πολυμερή (Mallick, 2002; debashan and Bashan, 2010). Τα πολυμερή που επιλέγονται θα πρέπει να είναι υδρόφιλα, μη τοξικά και να κρατούν ζωντανά τα κύτταρα για όσο το δυνατόν μεγαλύτερο χρόνο. Αρκετά συνθετικά πολυμερή (ακρυλαμίδιο, πολυουρεθάνη, πολυβινυλοχλωρίδιο, ρητίνες, κλπ) και φυσικά πολυμερή (άγαρ, αλγινικό, καραγενάνη, κολλαγόνο κυτταρίνη, αγαρόζη, κ.λπ.), έχουν χρησιμοποιηθεί ως υλικό ακινητοποίησης (Olguín, 2012). Σημαντική αύξηση μικροφυκών έχει παρατηρηθεί σε συγκαλλιέργεια Chlorella vulgaris με το βακτήριο Azospirillum brasilense όπου ακινητοποιήθηκαν σε μικρά σφαιρίδια αλγινικού άλατος (Gonzalez and Bashan, 2000). Σε σύγκριση με τα φυσικά πολυμερή, τα συνθετικά είναι πιο σταθερά στο πέρασμα του χρόνου και δεν είναι εύκολα αποικοδομήσιμα από τα μικρόβια. Ωστόσο, έρευνες παρουσιάζουν μεγαλύτερη ανάπτυξη μικροφυκών σε επιφάνειες φυσικών πολυμερών σε σχέση με τα συνθετικά πολυμερή καθώς είναι λιγότερο επικίνδυνα στη διάρκεια της επεξεργασίας (Christenson and Sims, 2012). Επίσης, η χρήση μεταλλικών υλικών και κραμάτων (χαλκού, αλουμινίου) αυξάνει τις πιθανότητες τοξικότητας στα προσκολλημένα κύτταρα. Μέχρι στιγμής δεν υπάρχουν συγκεκριμένα προτεινόμενα υλικά για την ανάπτυξη βιομάζας μικροφυκών. Το κόστος, η διάρκεια, η διαθεσιμότητα και η αξιοπιστία είναι παράγοντες που λαμβάνονται υπόψη για την επιλογή των υλικών. Εικόνα 1.8: Μέθοδοι ακινητοποίησης μικροφυκών για παραγωγή βιομάζας κατά σειρά εμφάνισης: τεχνητός χλοοτάπητας (αριστερά), συνθετικό πλαστικό πλέγμα (μέση) και διογκωμένο πολυστυρένιο ή φελιζόλ (δεξιά) 59

83 Εισαγωγή ( 2009; Das et al., 2015). (Johnson, Επειδή οι διαδικασίες, στα αιωρούμενα συστήματα ανάπτυξης, παρουσίαζαν μεγάλο ενεργειακό αντίκτυπο, αναπτύχθηκε μια παραλλαγή προσκολλημένης καλλιέργειας (Algal turf scrubber ATS) όπου τα μικροφύκη αναπτύσσονται σε στερεές υποστηρικτικές επιφάνειες. Οι τεχνητοί χλοοτάπητες (ATS) είναι σύνηθες συστήματα που χρησιμοποιούνται για τα νηματοειδή μικροφύκη καθώς μειώνουν το κόστος της συγκομιδής (Εικόνα 1.8). Το ATS είναι ένα κατασκευαστικά οικολογικό σύστημα (παρομοιάζεται με τους κοραλλιογενείς υφάλους) όπου απόβλητα ρέουν παλμικά πάνω σε επικλινείς επιφάνειες που έχουν προσκολληθεί νηματοειδή μικροφύκη. Αυτή η κατασκευή επεξεργασίας έχει αποδειχθεί επιτυχής σε τριτογενή λύματα, απόβλητα γεωργικών εκμεταλλεύσεων και μεγάλα συστήματα υδατοκαλλιέργειας. Η βιομάζα που παράγεται σε ποσοστά 5 με 10 φορές μεγαλύτερα από εκείνη των άλλων τύπων επίγειας καλλιέργειας, μπορεί να υποστεί περαιτέρω επεξεργασία για παραγωγή βιοκαυσίμων μειώνοντας παράλληλα το απαιτούμενο κόστος (Adey et al., 2011). Η μέση παραγωγικότητα σε αυτές τις εγκαταστάσεις φτάνει τα 35 g m 2 d 1. Ωστόσο, οι συγκεντρώσεις των θρεπτικών στοιχείων (άζωτο, φώσφορος) στις εισροές αυτών των συστημάτων είναι σχετικά χαμηλές σε σχέση με τις αρχικές συγκεντρώσεις των αποβλήτων και σε μεγαλύτερα ποσοστά φόρτωσης παρατηρείται μείωση στα ποσοστά απομάκρυνσής τους (Adey et al., 2011) Τεχνολογίες μετατροπής μικροφυκών σε βιοκαύσιμα Οι τεχνολογικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται σήμερα για τη παραγωγή ενέργειας από τη βιομάζα μικροφυκών μπορούν να ταξινομηθούν σε βιοχημικές, θερμοχημικές ή και χημικές (Εικόνα 1.9). Η βιοχημική μετατροπή μπορεί να υποδιαιρεθεί περαιτέρω σε ζύμωση, α(να)ερόβια χώνευση, βιοηλεκτροχημικές κυψέλες καυσίμου και άλλες διαδικασίες παραγωγής καυσίμου που χρησιμοποιούν τον μεταβολισμό των οργανισμών. Οι θερμοχημικές διεργασίες μετατροπής ταξινομούνται περαιτέρω σε αεριοποίηση, πυρόλυση και υγροποίηση ή περιλαμβάνουν την άμεση καύση της βιομάζας ενώ στις χημικές διεργασίες ανήκει η (μετ)εστεροποίηση. 60

84 Εισαγωγή Η επιλογή των διαδικασιών μετατροπής της βιομάζας των μικροφυκών σε βιοκαύσιμα εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το είδος της πρώτης ύλης της βιομάζας που χρησιμοποιείται (περιεκτικότητα σε νερό, χημική σύνθεση), τη διαδικασία συγκομιδής και το επιθυμητό τελικό προϊόν. Οι ενεργειακές απαιτήσεις και οι αποδόσεις καθορίζονται από τις διαδικασίες διαχωρισμού και τα περαιτέρω βήματα βελτίωσης των προϊόντων. Σύμφωνα με τους Posten and Schaub (2009) οι βιοτεχνολογικές διεργασίες μετατροπής οδηγούν γενικά σε υψηλότερες αποδόσεις παραγωγής ενέργειας από τις χημικές διεργασίες μετατροπής. Επίσης, λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι τα μικροφύκη έχουν υψηλή περιεκτικότητα σε νερό (80 90%), γίνεται αντιληπτό ότι όλες οι διαδικασίες μετατροπής της βιομάζας σε βιοκαύσιμα δεν είναι εφαρμόσιμες. Πράγματι, η άμεση καύση μικροφυκών μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο όταν στην η εν λόγω βιομάζα η περιεκτικότητα σε υγρασία είναι κάτω από 50% (Amin, 2009). Στη συνέχεια, παρουσιάζονται περιεκτικά οι τεχνικές της θερμοχημικής μετατροπής ενώ δίνονται αναλυτικότερα στοιχεία για τη διαδικασία της αλκοολικής ζύμωσης (βιοχημική μετατροπή) και τη μετεστεροποίηση (χημική μετατροπή). Εικόνα 1.9: Διαδικασίες μετατροπής της βιομάζας των μικροφυκών σε μορφές ενέργειας (Rawat et al., 2011; Razzak et al., 2013; Medipally et al., 2015). 61

85 Εισαγωγή Θερμοχημική μετατροπή Η θερμοχημική μετατροπή περιλαμβάνει βήματα μετατροπής της πρώτης ύλης, δηλαδή βιομάζας σε βιοκαύσιμα και χημικά προϊόντα. Αεριοποίηση: Η αεριοποίηση είναι ένας όρος που περιγράφει μια χημική μέθοδο με την οποία ανθρακούχα υλικά (βιομάζα) μετατρέπονται σε αέριο με τη βοήθεια μερικής οξείδωσης με αέρα, οξυγόνο ή/και ατμού σε υψηλές θερμοκρασίες, τυπικά στην περιοχή ο C. Το παραγόμενο μίγμα αερίων αποτελείται από μονοξείδιο του άνθρακα, υδρογόνο και μεθάνιο (Li et al., 2008b; SanchezSilva et al., 2013). Υγροποίηση: Τα υπολείμματα των κυττάρων των μικροφυκών που προέρχονται από τη φυγοκέντρηση και έχουν υψηλή περιεκτικότητα σε υγρασία, θεωρούνται καλές πρώτες ύλες για τη διαδικασία της υγροποίησης. Η υγροποίηση πραγματοποιείται σε ένα υδατικό διάλυμα αλκαλίων ή αλκαλικών γαιών σε ο C και 10 ΜΡα απουσία αναγωγικού αερίου όπως υδρογόνο ή μονοξείδιο του άνθρακα. Το διχλωρομεθάνιο χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό του κλάσματος ελαίου από την βιομάζα των μικροφυκών. Το κόστος του εξοπλισμού που απαιτείται για αυτές τις διεργασίες είναι υψηλό, καθώς κατά τη διάρκεια αναπτύσσονται υψηλές πιέσεις, ενώ τεχνικά προβλήματα παρουσιάζονται επίσης και κατά την λειτουργία του τροφοδοτούμενου πολτού (Biller and Ross, 2011; Bahadar and Bilal Khan, 2013). Πυρόλυση: Είναι η θερμική επεξεργασία της βιομάζας, σε περίπου 500 ο C ή με θέρμανση παρουσία ενός καταλύτη, απουσία αέρα, παράγοντας στερεό (κάρβουνο), υγρό και αέριο καύσιμο. Οι παραδοσιακές μέθοδοι επικεντρώνονται μόνο στη παραγωγή του κάρβουνου, η οποία αντιστοιχεί στη καλύτερη περίπτωση στο 1/3 της ενέργειας που εμπεριέχεται στη βιομάζα. Το παραγόμενο συνθετικό αέριο, πλούσιο σε υδρογόνο και μονοξείδιο του άνθρακα, μπορεί να συλλεχθεί με χρήση μεθόδων αεριοποίησης. Δεδομένου ότι τα μικροφύκη έχουν συνήθως υψηλή περιεκτικότητα σε υγρασία, η 62

86 Εισαγωγή διαδικασία ξήρανσης απαιτεί πολύ ενέργεια θέρμανσης (Amin, 2009). Τα προϊόντα στη συνέχεια διαχωρίζονται σε ξυλάνθρακα, βιοκαύσιμα και αέριο. Υδρογόνωση: Η υδρογόνωση είναι μια αναγωγική χημική αντίδραση που οδηγεί στην προσθήκη υδρογόνου (Η 2 ), συνήθως για να κορεστούν οργανικές ενώσεις. Τα φύκη υπόκεινται σε υψηλή θερμοκρασία και πίεση παρουσία καταλύτη (μολυβδαινικού κοβαλτίου) και διαλύτη σε αυτόκαυστο και η παραγωγή υδρογόνου πραγματοποιείται σε μία τριών φάσεων λειτουργία (Amin, 2009). Εναλλακτικά, η παραγωγή βιουδρογόνου από τα μικροφύκη απαιτεί κάποια λεπτά έως κάποιες ώρες σε αναερόβια επώαση στο σκοτάδι ώστε να προκληθεί η σύνθεση και/ή ενεργοποίηση ενζύμων που εμπλέκονται στην παραγωγή υδρογόνου (υδρογονάση) (Hwang et al., 2016). Η διαδικασία περιλαμβάνει συνήθως δύο στάδια και φαίνεται ότι κάποιοι παράγοντες μπορούν να ενισχύουν τη μεταβολική αυτή οδό (περιορισμός θειούχων) (Kruse and Hankamer, 2010; Koller et al., 2012) Βιοχημική μετατροπή με αλκοολική ζύμωση Η βιομάζα, με κατάλληλη επεξεργασία, μπορεί να χρησιμοποιηθεί και ως υπόστρωμα στη διεργασία της αλκοολικής ζύμωσης. Στην διεργασία της ζύμωσης τα σάκχαρα που υπάρχουν στη βιομάζα ή παράγονται κατά την μικροβιακή διάσπαση, μετατρέπονται σε αλκοόλη. Η αιθανόλη για χιλιάδες χρόνια παραγόταν για να καλύψει ανθρώπινες διατροφικές ανάγκες ενώ η εκτεταμένη παραγωγή της με τη διαδικασία της ζύμωσης ξεκίνησε με την ανάπτυξη της βιομηχανικής μικροβιολογίας. Τα υποστρώματα που θεωρούνται κατάλληλα για την παραγωγή αιθανόλης είναι : Τα σακχαρώδη, τα οποία είναι κυρίως σάκχαρα από το ζαχαροκάλαμο, το ζαχαρότευτλο, το γλυκό σόργο κ.τ.λ. Τα αμυλώδη, τα οποία περιέχουν κυρίως άμυλο όπως τα δημητριακά, η κασάβα και οι πατάτες. Οι κυτταρινούχες πρώτες ύλες όπως τα αγροτικά υπολείμματα, τα υπολείμματα ξυλείας και ο πολτός χαρτιού. 63

87 Εισαγωγή Η αρχή της παραγωγής αιθανόλης από μικροφύκη απαιτεί την καλλιέργεια των μικροφυκών, τη συγκομιδή τους, την προετοιμασία του πολτού της βιομάζας, τη ζύμωση και τη διαδικασία διαχωρισμού της αιθανόλης. Έχουν δοκιμαστεί διάφορα είδη μικροφυκών για την χρήση της βιομάζας τους ως πρώτη ύλη παραγωγής αιθανόλης, εξετάζοντας ποικιλία συνθηκών επεξεργασίας (Ueno et al., 1998; Choi et al., 2010; Harun and Danquah, 2011b; Huang et al., 2011; Ho et al., 2013c). Πιο αναλυτικά, η περιεχόμενη κυτταρίνη, ημικυτταρίνη και λιγνίνη, στα διάφορα είδη βιομάζας, μπορεί να διασπαστεί μικροβιακά από κατάλληλους μικρoοργανισμούς (βακτήρια, μύκητες, πρωτόζωα) που έχουν την ιδιότητα να παράγουν υδρολυτικά ένζυμα (κυτταρινάση, υπεροξειδάση, γλυκοσιδάση) και να διασπούν αυτά τα πολυμερή (Kirk and Farrell, 1987; Malburg Jr et al., 1992). Τα ένζυμα ενεργούν στη βιομάζα μετατρέποντας τα πολυμερή υποστρώματα σε μονοσακχαρίτες που διασπώνται σε αλκοόλες με τη βοήθεια ζυμομυκήτων. Ωστόσο, υπάρχουν και φυσικοχημικοί τρόποι για την απελευθέρωση των σακχάρων οι οποίοι διαφέρουν ανάλογα με το είδος της βιομάζας που χρησιμοποιείται και περιλαμβάνουν διαδικασίες όπως άλεσμα, διάσπαση με ατμό, υψηλή θερμοκρασία και πίεση. Για την παραγωγή της αλκοόλης, με τη διαδικασία της μικροβιακής ζύμωσης, χρησιμοποιούνται ως υπόστρωμα οι μονοσακχαρίτες που απελευθερώνονται με την προεπεξεργασία. Οι ζυμομύκητες (Saccharomyces) είναι κυρίως τα είδη που χρησιμοποιούνται συχνότερα στη βιομηχανική παραγωγή της αιθανόλης, λόγω του ότι μετατρέπουν σχεδόν στοιχειομετρικά τη γλυκόζη σε αλκοόλη. Υπό αναερόβιες συνθήκες, η γλυκόζη μετατρέπεται σε αλκοόλη και διοξείδιο του άνθρακα μέσω της γλυκόλυσης. Η συνολική αντίδραση απελευθέρωσης ενέργειας για βιοσύνθεση παράγει 2 moles αιθανόλης και 2 moles CO 2 για κάθε mole γλυκόζης που καταναλώνεται (Εξίσωση 1.1) (Jarvis, 1992). C 6 H 12 O 6 2 CH 3 CH 2 OH + 2 CO 2 + ενέργεια (ΑΤΡ) (1.1) Κάθε γραμμάριο γλυκόζης θεωρητικά μπορεί να αποδώσει g αιθανόλης (Εξίσωση 1.3). Ωστόσο, η πραγματική απόδοση της αιθανόλης ανέρχεται περίπου στο 90% της θεωρητικής, αφού ένα μέρος της γλυκόζης χρησιμοποιείται ως πηγή άνθρακα για τη σύνθεση νέας κυτταρικής βιομάζας (Εξίσωση 1.2) (Siqueira et al., 2008). 64

88 Εισαγωγή C 6 H 12 O 6 2 CH 3 CH 2 OH + 2 CO 2 1g 0.46g g + 0.1g (νέα κύτταρα) (1.2) 1g 0.511g g (θεωρητικά) (1.3) Υπό αερόβιες συνθήκες, η γλυκόζη μετατρέπεται ολοκληρωτικά σε διοξείδιο του άνθρακα και σε νέα κυτταρική βιομάζα, χωρίς να παράγεται αιθανόλη. Οι βασικοί παράγοντες που επηρεάζουν τη διεργασία της αλκοολικής ζύμωσης πέρα από το ph, τη θερμοκρασία και το είδος των θρεπτικών συστατικών που προστίθενται είναι: η συγκέντρωση της γλυκόζης (συνήθως υψηλές συγκεντρώσεις παρεμποδίζουν την δράση των ενζύμων), η παρουσία οξυγόνου (να είναι η ελάχιστη δυνατή ώστε να αποφεύγεται ο αερόβιος μεταβολισμός βοηθώντας συνάμα την ανάπτυξη των ζυμομυκήτων) και τέλος η συγκέντρωση της παραγόμενης αιθανόλης (Maiorella et al., 1981). Έτσι, ο ρυθμός παραγωγής επηρεάζεται από μια σειρά μεταβολών που μπορεί να είναι αθροιστικές αλλά και συνεργιστικές (Aldiguier et al., 2004). Η επίδραση αυτών των παραγόντων εξαρτάται από το είδος του ζυμομύκητα και για το λόγο αυτό η επιλογή του κατάλληλου στελέχους είναι ζήτημα μεγάλης σημασίας (Kasavi et al., 2012; Lin et al., 2012). Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία ο S.cerevisiae θεωρείται ένας ανθεκτικός αιθανολογόνος ζυμομύκητας της τάξης μέχρι και 1820% (v/v) συγκεντρώσεις αιθανόλης (Devantier et al., 2005; Dinh et al., 2008). Τελικά, με τη διεργασία της αλκοολικής ζύμωσης παράγεται ένα αλκοολικό διάλυμα, που συνήθως περιέχει 710% κ.ο. αιθανόλη και μικρές ποσότητες ανώτερων αλκοολών, εστέρων, αλδεϋδών και άλλων ουσιών. Στη συνέχεια, ακολουθεί συμπύκνωση και καθαρισμός της αιθανόλης με τη διεργασία της απόσταξης. Σε βιομηχανική κλίμακα, για υψηλής απόδοσης διαχωρισμό αιθανόλης, πραγματοποιείται αρχικά διαχωρισμός της αλκοόλης από το μίγμα της ζύμωσης και στη συνέχεια ο ατμός που προκύπτει (περιέχει περίπου το 5060% του μίγματος), συμπυκνώνεται και περνάει από στήλη δευτερογενούς απόσταξης όπου και συλλέγεται πλέον με σύσταση περίπου 95.6% κ.ο. (Adams and Flynn, 1982). Με απλές διεργασίες μπορεί να επιτευχθεί παραγωγή αλκοόλης συγκέντρωσης 95%, ωστόσο για την ανάμιξη της με βενζίνη θα πρέπει να είναι 100% άνυδρη (Glazer and Nikaido, 1995). Η άνυδρη αλκοόλη περιέχει ενέργεια ίση με τα 2/3 της ενέργειας της βενζίνης και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως καύσιμο σε βενζινοκινητήρες (Δραβίλλας, 2007). Ωστόσο, η χαμηλή πτητικότητά της δημιουργεί προβλήματα στην εκκίνηση 65

89 Εισαγωγή των κινητήρων, όταν η θερμοκρασία φτάνει κάτω των 10 ο C. Η παραγόμενη αλκοόλη για να είναι ανταγωνιστική σε σχέση με τις άλλες πηγές καυσίμων/χημικών θα πρέπει να έχει προκύψει από απλά και οικονομικά στάδια παραγωγής με υπόστρωμα άφθονο, πλούσιο σε σάκχαρα που να δίνει υψηλές αποδόσεις στη παραγωγή αιθανόλης Χημική μετατροπή με μετεστεροποίηση Η μέθοδος παραγωγής βιοντίζελ που εφαρμόζεται σε όλο τον κόσμο σε βιομηχανικό επίπεδο είναι αυτή της μεθυλεστεροποίησης (ή αλκοόληση) των τριγλυκεριδίων που είναι το κύριο συστατικό των φυτικών ελαίων και των ζωικών λιπών. Κατάλληλες πρώτες ύλες για την παραγωγή του θεωρούνται ο βαμβακόσπορος, η σόγια, η αγριοκράμβη, η ινδική καρύδα, το φιστίκι, η φοινικιά, ο ηλιόσπορος κ.α. Το φυτικό λάδι που λαμβάνεται από την εκχύλιση ελαίου των σπόρων είναι ακατάλληλο για χρήση σε μηχανές, εξαιτίας του υψηλού ιξώδους του. Για το λόγο αυτό, το έλαιο αναμιγνύεται με κάποια αλκοόλη παρουσία ενός καταλύτη (μετεστεροποίηση) (Σχήμα 1.1), παράγοντας εστέρες και γλυκερόλη (παραπροϊόν της αντίδρασης που μπορεί να μειώσει τη ζωή του κινητήρα), η οποία απομακρύνεται και χρησιμοποιείται περαιτέρω στην παραγωγή σαπουνιών και άλλων προϊόντων. Στη συνέχεια, η φυτική ψίχα των σπόρων, εφόσον εμπλουτιστεί με κατάλληλα αμινοξέα, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ζωοτροφή. Πιο συγκεκριμένα, στη μετεστεροποίηση τα έλαια αντιδρούν με αλκοόλη (αιθανόλη, μεθανόλη, βουτανόλη) παρουσία καταλύτη (ΝαΟΗ, ΚΟΗ) και σχηματίζονται αλκυλεστέρες των λιπαρών οξέων (βιοντίζελ) και γλυκερόλη (παραπροϊόν) η οποία απομακρύνεται με τη βοήθεια της βαρύτητας. Αρχικά τα τριγλυκερίδια (έλαια) διασπώνται σε διγλυκερίδια, αυτά σε μονογλυκερίδια και τελικά σε γλυκερίνη. Σε κάθε βήμα παράγεται ένα μόριο εστέρα την φορά. Οι αλυσίδες αλκυλεστέρων που παράγονται χαρακτηρίζονται ως βιοντίζελ. Στο τέλος της διεργασίας, το βιοντίζελ υπόκειται σε καθαρισμό για την απομάκρυνση ιχνών αλκοόλης, καταλύτη και γλυκερίνης. Υπάρχουν διάφοροι παράγοντες που επηρεάζουν την διαδικασία της μετεστεροποίησης όπως ο τύπος του καταλύτη (αλκαλικός ή όξινος, ενζυμικός), η αναλογία αλκοόλης/ελαίου, η θερμοκρασία, η 66

90 Εισαγωγή καθαρότητα των αντιδραστηρίων και η περιεκτικότητα σε ελεύθερα λιπαρά οξέα και νερό. Τριγλυκερίδια Μεθανόλη Εστέρες Γλυκερόλη (Έλαιο) (Βιοντίζελ) Σχήμα 1.1: Αντίδραση μετεστεροποίησης των τριγλυκεριδίων με τη χρήση μεθανόλης και καταλύτη Εταιρείες παραγωγής μικροφυκών ανά τον κόσμο Στην παρούσα ενότητα δίνονται στοιχεία που αφορούν την καλλιέργεια μικροφυκών σε διάφορες περιοχές του κόσμου, με υπεύθυνους παραγωγής τόσο κυβερνητικές υπηρεσίες όσο και ιδιωτικές επιχειρήσεις. Αξίζει να σημειωθεί ότι μέχρι και σήμερα, δεν υπάρχει καμία ολοκληρωμένη μονάδα βιομηχανικής κλίμακας (full scale unit) που να παράγει βιοντίζελ από μικροφύκη. Ηνωμένο Βασίλειο Το «Carbon Trust Project» και το «Biomara» είναι δύο ενεργά προγράμματα (2009 τρέχων) που χρηματοδοτούν Πανεπιστήμια ή/και ιδιωτικές εταιρείες για την παραγωγή βιοκαυσίμων από μικροφύκη. Μέρος αυτού περιλαμβάνει η έρευνα για την εξαγωγή λιπιδίων από μικροφύκη και τεχνικές ενίσχυσης της παραγωγής. Το Carbon Trust ανακοίνωσε σχέδιο για να παράγει βιοκαύσιμα από μικροφύκη μέχρι το 2020 και εκτιμάται ότι 26 εκατομμύρια θα δαπανηθούν για την ανάπτυξη της τεχνολογίας και των υποδομών ώστε να διασφαλιστεί ότι τα «βιολογικά» καύσιμα θα αντικαταστήσουν ένα σημαντικό ποσοστό των ορυκτών καυσίμων που χρησιμοποιούνται από τους Βρετανούς οδηγούς ( 67

91 Εισαγωγή com/home/). Το «Biomara» ξεκίνησε στη Σκωτία και θα διερευνήσει τόσο τα μακροφύκη όσο και τα μονοκύτταρα μικροφύκη ως πιθανές πηγές βιοκαυσίμων. Το έργο περιλαμβάνει μια τεχνοοικονομική μελέτη των πιθανών συστημάτων, εκτίμηση των περιβαλλοντικών επιπτώσεων και μια συνεχή διαδικασία συμμετοχής ενδιαφερόμενων ομάδων ώστε να εξασφαλιστεί ότι τα τελικά ευρήματα της έρευνας θα έχουν ευρεία εφαρμογή ( Για την ανάπτυξη των μικροφυκών μπορεί να χρησιμοποιούνται αλμυρά ή υφάλμυρα νερά καθώς και υγρά απόβλητα αστικής ή βιομηχανικής προέλευσης. Για παράδειγμα, το Πανεπιστήμιο του Leeds χρησιμοποιεί ανοιχτές δεξαμενές και επεξεργάζεται βιομηχανικά λύματα ενώ το Πανεπιστήμιο του Bristol (σε συνεργασία με την Aragreen ) επεξεργάζεται στραγγίσματα ΧΥΤΑ σε πιλοτική μονάδα φωτοβιοαντιδραστήρων. Αρκετές εταιρείες χρησιμοποιούν ως υπόστρωμα ανάπτυξης εκροές αναερόβιων λυμάτων για την ανάπτυξη των μικροφυκών (π.χ. «Merlin Biodevelopment») (SchlarbRidley, 2011; Smith and Higson, 2012). Ο τομέας της επεξεργασίας αποβλήτων με μικροφύκη είναι ραγδαία αναπτυσσόμενος στο Ηνωμένο Βασίλειο και δέχεται σημαντικές ευκαιρίες για περαιτέρω ανάπτυξη. Ισπανία Το 2007 η Aurantia μια επιχείρηση ανανεώσιμων πηγών ενέργειας με βάση την Ισπανία και η «Green Fuel Tech» (ΗΠΑ), ένωσαν τις δυνάμεις τους για την παραγωγή βιοκαυσίμων από μικροφύκη. Το έργο των $92 εκατομμυρίων χρησιμοποιούσε 100 εκτάρια θερμοκηπίων μικροφυκών που παράγουν τόνους βιομάζας μικροφυκών ανά έτος (Mizuno et al., 2008). Η εγκατάσταση χρησιμοποιούσε, μέχρι το 2009, το CO 2 από ένα εργοστάσιο παραγωγής τσιμέντου κοντά στο Jerez, στην Ισπανία. Αρχικά είχε εξεταστεί η ανάπτυξη των μικροφυκών σε πλαστικές σακούλες αλλά λόγω προβλήματος συγκομιδής της βιομάζας αναπτύχθηκε, στη συνέχεια, ένας πρωτότυπος κατακόρυφος λεπτού στρώματος ηλιακός βιοαντιδραστήρας. Ωστόσο, η εταιρεία δεν παρέχει περισσότερα στοιχεία για αυτό το εγχείρημα ( 100squaremetersofalgae5031). Ιταλία 68

92 Εισαγωγή Η εταιρεία ενέργειας «Eni», μαζί με το εργοστάσιο διύλισης πετρελαίου, λειτουργεί μια πιλοτική εγκατάσταση (Εικόνα 1.10), με 1 εκτάριο στην Γέλα της Σικελίας, από το 2010, διερευνώντας τη βιωσιμότητα νέων φωτοβιοαντιδραστήρων, καθώς και ανοικτές λίμνες για παραγωγή μικροφυκών με χρήση βιομηχανικών αποβλήτων. Εικόνα 1.10 Τμήματα από την εγκατάσταση παραγωγής καυσίμων της εταιρείας Eni στην Γέλα της Σικελίας (Perego, 2015; Rispoli, 2015). Γερμανία Η «RWE» ξεκίνησε, το 2008, μια πιλοτική μονάδα παραγωγής βιοκαυσίμων από μικροφύκη στο Niederaussem της Γερμανίας. Η εταιρεία συνεργάζεται με το Πανεπιστήμιο Jacobs, στη Βρέμη, το Ερευνητικό Κέντρο Juelich and Phytolutions για το σχεδιασμό, την έρευνα και την υλοποίηση του έργου. Για την ανάπτυξη των μικροφυκών χρησιμοποιείται CO 2 που παράγεται από εγκαταστάσεις παραγωγής ηλεκτρικής ενέργειας. Η εταιρεία προσδοκά μέχρι το 2020 να εξετάσει ποικιλία μεθόδων απομάκρυνσης του CO 2 από την ατμόσφαιρα και τρόπους αποθήκευσης του (RWE, 2009). Γαλλία Στη Γαλλία η «Air FranceKLM» υπέγραψε μια συμφωνία με την Algae Link για να προμηθεύονται βιοκαύσιμα από μικροφύκη ώστε να αναμειγνύεται με τα καύσιμα για τα τζετ, χρησιμοποιώντας μια εγκατάσταση (περίπου 200km) με πλαστικούς διάφανους σωλήνες για ανάπτυξη μικροφυκών (Nautiyal et al., 2013). Η Algae Link είναι μια ολλανδική εταιρεία που εμπορεύεται κυρίως κλειστούς βιοαντιδραστήρες για ταχεία ανάπτυξη μικροφυκών. 69

93 Εισαγωγή Κίνα Η κινεζική κυβέρνηση εργάζεται σε συνεργασία με την Algae LLC, μια θυγατρική της BioCentric Energy Inc με έδρα την Καλιφόρνια, για την ανάπτυξη ενός έργου παραγωγής καυσίμων από μικροφύκη στην Guangdong της Κίνας. Η κινεζική κυβέρνηση, από το 2008, έχει χορηγήσει στην εταιρεία 50 εκτάρια γης (110 στρέμματα) δίπλα σε μια βιομηχανική περιοχή στο Wahan της Κίνας. Η εταιρεία συλλέγει το εκπεμπόμενο CO 2 από την βιομηχανική περιοχή, που υπολογίζεται σε τόνους ετησίως, και το διοχετεύει σε σωλήνες ανάπτυξης μικροφυκών. Το παραγόμενο έλαιο από την βιομάζα των μικροφυκών πωλείται στην αγορά βιοντίζελ ενώ η εναπομένουσα βιομάζα μετατρέπεται σε βιοαέριο ( biomassmagazine. com/article.jsp?article_id=2091). Αυστραλία Δύο αυστραλιανές εταιρείες, η «Linc Energy» και η «Bio Clean Coal», από το 2007 συνεργάζονται στην παραγωγή βιοντίζελ από μικροφύκη χρησιμοποιώντας τις εκπομπές CO 2 από μονάδα παραγωγής ηλεκτρικής ενέργειας με καύση άνθρακα. Η εγκατάσταση του φωτοβιοαντιδραστήρα βρίσκεται στην πόλη Chinchilla της Αυστραλίας ( Επίσης, το 2009 τέθηκε σε λειτουργία ένα πιλοτικό πρόγραμμα για δέσμευση CO 2 και μεγάλης κλίμακας παραγωγή βιοκαυσίμων όπου η OriginOil χρησιμοποιεί το CO 2 από την MBD Energy για παραγωγή ελαίου από μικροφύκη και η εναπομένουσα βιομάζα οδηγείται στην παραγωγή βιοπλαστικών ( ΗΠΑ Η Αμερική έχει ανακοινώσει τα περισσότερα προγράμματα για χρήση μικροφυκών στην παραγωγή βιοκαυσίμων (π.χ. Ηνωμένες Πολιτείες, 2001: MIT και GreenFuel Technology, Λουιζιάνα, 2007: NRG Energy και GreenFuel Technology, Ουάσινγκτον, 2008: CEP&PGE, Αριζόνα, 2009: Arizona Public Service Co) (Schmidt, 2012). Αξίζει να αναφέρουμε ότι η «ExxonMobil» σε συνεργασία με την «Synthetic Genomics Inc», από το 2009 μέχρι και σήμερα (2017), διερευνά την παραγωγή επόμενης γενιάς (4 ης ) βιοκαυσίμων από μικροφύκη μέσω της καλύτερης 70

94 Εισαγωγή κατανόησης των γενετικών μηχανισμών των φυκών και των χαρακτηριστικών ανάπτυξής τους Άλλες εμπορικές χρήσεις μικροφυκών Οι έρευνες σχετικά με τα μικροφύκη δεν εστιάζουν μόνο στην παραγωγή βιοκαυσίμων αλλά παρουσιάζουν ένα γενικότερο εύρος εφαρμογών. Λόγω της πλούσιας σύνθεσής τους, τα μικροφύκη μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην ανθρώπινη διατροφή, ως ζωοτροφές και τροφές σε υδατοκαλλιέργειες, ως φάρμακα, καλλυντικά, χρωστικές ουσίες, ως βιολιπάσματα και εδαφοβελτιωτικά (Becker, 1994; CuellarBermudez et al., 2015). Τα κυριότερα στελέχη που καλλιεργούνται ανήκουν στα γένη Chlorella, Dunaliella, Arthrospira, Nannochloropsis, Isochrysis, Aphanizomenon, Haematococcus και Schizochytrium (Πίνακας 1.7). Τα μικροφύκη που προορίζονται για κατανάλωση από τον άνθρωπο βρίσκονται σε μορφή ταμπλέτας, κάψουλας ή υγρή και μπορούν να αναμιχθούν με διάφορα τρόφιμα όπως μακαρόνια, σνακ, καραμέλες, τσίχλες και ροφήματα (Liang et al., 2004). Το περιεχόμενο σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, όπως εικοσαπεντανοϊκό (ΕPA), αραχιδονικό (AA) και το δεκαεξανοϊκό οξύ (DHA) είναι μεγάλης σημασίας για την ανάπτυξη των οργανισμών. Πάνω από 50% της παγκόσμιας παραγωγής Arthrospira χρησιμοποιείται ως διατροφικό πρόσθετο ενώ το 30% για την τροφή ζώων καθώς αποτελεί σημαντική πηγή πρωτεϊνών (de la Noue and de Pauw, 1988; Becker, 2004). Είδη φυκών όπως Chlorella, Nannochloropsis, Scenedesmus και Spirulina χρησιμοποιούνται ως τροφές σε ιχθυοκαλλιέργειες γιατί έχουν ευεργετικές δράσεις στο ανοσοποιητικό σύστημα και βελτιώνουν την γονιμότητα και τον έλεγχο του βάρους των ψαριών (Chuntapa et al., 2003). To 1999 η παραγωγή μικροφυκών για χρήση σε ιχθυοκαλλιέργειες έφτασε τους 1000 τόνους (62% για μαλάκια, 21% για γαρίδες, 16% για ψάρια) (Brown et al., 1997). Επίσης, τα μικροφύκη λόγω των χημικών ιδιοτήτων τους μπορούν να χρησιμοποιηθούν και ως φυσική πηγή χρωστικής για χρωματισμό των τροφίμων (Soletto et al., 2005; Koller et al., 2012). Άλλη μία κατηγορία όπου τα μικροφύκη μπορούν να βρουν εφαρμογή είναι η βιομηχανία των φαρμάκων, λόγω των καροτενοειδών, όπως η βκαροτίνη, η οποία δρα ως αντικαρκινικός παράγοντας ενώ η παρουσία των πολυακόρεστων λιπαρών 71

95 Εισαγωγή οξέων λειτουργεί και για θεραπευτικούς σκοπούς καθώς μειώνουν τον κίνδυνο της καρδιαγγειακής νόσου (Brennan and Owende, 2010; Koller et al., 2012). Στη βιομηχανία των καλλυντικών βρίσκουν εφαρμογές, κυρίως, τα είδη Arthrospira και Chlorella. Αυτές οι εφαρμογές αφορούν κυρίως σε κρέμες, αντηλιακά και σαμπουάν, από την επεξεργασία των πρωτεϊνών καθώς και άλλων ουσιών, υψηλής αξίας, που εξάγονται από τα μικροφύκη (Spolaore et al., 2006). Στην γεωργία το βιοκάρβουνο είναι στερεό κατάλοιπο που παράγεται κατά την διαδικασία μετατροπής της βιομάζας φυκών μέσω της πυρόλυσης και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως βιολίπασμα ή ακόμα ως οργανικό λίπασμα καθώς περιέχουν μεγάλες ποσότητες αζώτου και φωσφόρου. Μελέτες, σε βιομηχανική κλίμακα, έδειξαν ότι 1 kg μικροφυκών που χρησιμοποιείται ως λίπασμα μπορεί να αντικαταστήσει 60 kg συμβατικού λιπάσματος αζώτου (de la Noue and de Pauw, 1988). Ως πηγή πολυακόρεστων λιπαρών οξέων τα μικροφύκη μπορούν να προμηθεύσουν ολόκληρες τροφικές αλυσίδες με αυτά τα ζωτικής σημασίας συστατικά, καθώς τα ανώτερα φυτά και ζώα δεν διαθέτουν τα απαραίτητα ένζυμα για τη σύνθεση τους. Πίνακας 1.7: Παγκόσμια παραγωγή προϊόντων από μικροφύκη (Brennan and Owende, 2010). Μικροφύκος Ετήσια παραγωγή Χώρα Παραγωγής Χρήση Τιμή (ευρώ) Spirulina 3000 τόνοι ξηρού βάρους Κίνα, Ινδία, Βιρμανία, ΗΠΑ, Ιαπωνία Διατροφή, Κοσμετολογία 36 kg 1 Chlorella 2000 τόνοι ξηρού βάρους Ταιβάν, Γερμανία, Ιαπωνία Διατροφή, Κοσμετολογία, Ιχθυοκαλλιέργεια 36 kg 1 50 l 1 Dunalliella salina 1200 τόνοι ξηρού βάρους Αυστραλία, Ισραήλ, ΗΠΑ, Ιαπωνία Διατροφή, Κοσμετολογία, βκαροτίνη kg 1 Haematococcus pluvialis 300 τόνοι ξηρού βάρους Ισραήλ, ΗΠΑ, Ινδία Ιχθυοκαλλιέργεια, Ασταξανθίνη 50 l kg 1 72

96 Εισαγωγή Crypthecodinium cohnii 240 τόνοι ελαίου DHA ΗΠΑ Λιπαρά οξέα (DHA) 43 g 1 Schizochytrium 10 τόνοι ελαίου DHA ΗΠΑ Λιπαρά οξέα (DHA) 43 g 1 Aphanizomenon flosaquae 500 τόνοι ξηρού βάρους ΗΠΑ Διατροφή Βιώσιμα βιοκαύσιμα από μικροφύκη Τα μικροφύκη έχουν κερδίσει το ενδιαφέρον ως εναλλακτική πηγή παραγωγής βιοκαυσίμων εφόσον εμφανίζουν σημαντικά πλεονεκτήματα ως προς τον τρόπο ανάπτυξης και καλλιέργειας σε σχέση με τα ενεργειακά φυτά. Η παραγωγή βιοκαυσίμων από μικροφύκη θα μπορούσε να είναι εμπορικά βιώσιμη, καθώς είναι οικονομικά ανταγωνιστική προς τα ορυκτά καύσιμα και δεν απαιτεί επιπλέον εδάφη, ενώ επίσης βελτιώνει την ποιότητα του αέρα απορροφώντας το CO 2 της ατμόσφαιρας (Medipally et al, 2014). Επιπλέον, η βιομάζα των μικροφυκών μπορεί να διπλασιαστεί σε 24 ώρες (στην εκθετική φάση μπορεί να διπλασιαστεί σε 3.5 ώρες) (Chisti, 2007; Shi et al., 2011). Τα μικροφύκη αναπτύσσονται όπου υπάρχει αρκετή ηλιοφάνεια ανεξαρτήτως εποχής και γεωγραφικής θέσης ενώ το έλαιο που παράγουν είναι 200 φορές (ανά στρέμμα) περισσότερο από ότι η παραγωγή του πιο αποδοτικού φυτικού ελαίου (Πίνακας 1.8). Πίνακας 1.8: Σύγκριση βιομάζας μικροφυκών και ελαιούχων φυτών σε σχέση με τις απαιτήσεις διαθέσιμης έκτασης και απόδοση ελαίου (Chisti, 2007; Ahmad et al., 2011). Καλλιέργεια Απόδοση Ελαίου Απαιτούμενη έκταση (L/ha) (Mha) Καλαμπόκι Σόγια Ελαιοκράμβη (Canola) Jatropha Έλαιο καρύδας Φοινικέλαιο Καστορέλαιο

97 Εισαγωγή Ηλιοτρόπιο 1070 Μικροφύκη 70% έλαιο κ.β Μικροφύκη 30% έλαιο κ.β Παρ 'όλα αυτά, η εκμετάλλευση των μικροφυκών για βιοκαύσιμα δεν έχει μια βραχυπρόθεσμη εμπορική προοπτική. Μέχρι και σήμερα, αποτελεί πρόκληση το υψηλό κόστος, ακόμη και για το πιο απλό σύστημα παραγωγής μικροφυκών, αλλά και η υποανάπτυκτη φύση των τεχνολογιών μαζικής καλλιέργειας. Σημαντική είναι επίσης η σωστή επιλογή των στελεχών των μικροφυκών που μπορούν να διατηρηθούν αποτελεσματικά στις ανοικτές δεξαμενές για συγκομιδή χαμηλού κόστους. Κρίσιμο σημείο αποτελεί και η ανάγκη για υψηλές παραγωγικότητες βιομάζας και ελαίων ή άλλων πρόδρομων ουσιών βιοκαυσίμων, ώστε να ισορροπήσει το κόστος κεφαλαίου και λειτουργίας της παραγωγής. Ερευνητές, εταιρείες και κυβερνητικοί οργανισμοί έχουν αξιολογήσει με διαφορετικό τρόπο ο καθένας τους τα οικονομικά/ αποδοτικά σχέδια παραγωγής συστημάτων μικροφυκών. Τα πιο δημοφιλή σχέδια περιλαμβάνουν ανοικτές λίμνες, τεχνητά κανάλια ελισσόμενου στίβου, και κλειστούς φωτοβιοαντιδραστήρες. Σε γενικές γραμμές, αυτές οι αξιολογήσεις έχουν επικεντρωθεί σε μεγάλο βαθμό στο κόστος του κεφαλαίου, τις δραστηριότητες και τη συντήρηση. Οι δαπάνες συνήθως κατανέμονται σε δαπάνες που συνδέονται με την αύξηση της βιομάζας, τη συγκομιδή, την αποστράγγιση, και τα συστήματα εξαγωγής του ελαίου. Το κόστος λειτουργίας και συντήρησης περιλαμβάνει έξοδα για τα θρεπτικά συστατικά, τη διανομή του CO 2, και την αναπλήρωση του νερού λόγω εξάτμισης, βοηθητικά προγράμματα, αντικατάσταση εξαρτημάτων, και το κόστος εργασίας. Επιπλέον, γίνεται προσπάθεια να κατανοήσουν τις μακροπρόθεσμες απαιτήσεις και άλλα ζητήματα σχετικά με την προώθηση σε εμπορική κλίμακα βιοκαυσίμων από μικροφύκη. Ένα ευρύ φάσμα βιοκαυσίμων μπορεί να παραχθεί από τη βιομάζα μικροφυκών για να παρέχει εν μέρει μια αποτελεσματική λύση στην παγκόσμια ενεργειακή πρόκληση. Σε σύγκριση με άλλες πρώτες ύλες για βιοκαύσιμα (π.χ. ελαιοκράμβη, καλαμπόκι, κλπ), η βιομάζα των μικροφυκών μπορεί να προσφέρει πολλά πλεονεκτήματα (Brennan and Owende, 2010; Olguín, 2012) όπως: υψηλή περιεκτικότητα και παραγωγικότητα λιπιδίων (Singh et al., 2011a), 74

98 Εισαγωγή μικρότερη έκταση σε σύγκριση με τις χερσαίες καλλιέργειες, ακόμα και τη χρήση άγονων εκτάσεων, αποφεύγοντας παράλληλα τη χρήση ζιζανιοκτόνων και φυτοφαρμάκων, την ικανότητα να ανακυκλώνουν τα θρεπτικά συστατικά από τους μη συμβατικούς υδάτινους πόρους (π.χ. λύματα, υφάλμυρο νερό, ρυπασμένα νερά) μειώνοντας παράλληλα τις απαιτήσεις σε γλυκό νερό, την ικανότητα να δεσμεύει CO 2 από τις εκπομπές καυσαερίων και άλλες εμπλουτισμένες πηγές (1 kg ξηρής βιομάζας φυκών δεσμεύει περίπου 1.83 kg CO 2 ) (Da Rosa et al., 2011; Sahoo et al., 2012), δυνατότητες για συνεχή παραγωγή όλο το χρόνο, ανεξάρτητα από το κλίμα, δεν περιέχει λιγνίνη και άλλα μεγάλα βιοπολυμερή, τα οποία μπορεί να προκαλέσουν προβλήματα στη επεξεργασία και τη μετατροπή της βιομάζας, παραγωγή πολύτιμων συνπροϊόντων, όπως λιπάσματα και ζωοτροφές και προσιτή και γρήγορη έρευνα και ανάπτυξη που οφείλεται στους ταχείς ρυθμούς ανάπτυξής της. Η παραγωγή βιοκαυσίμων από μικροφύκη έχει ερευνηθεί με ποικίλη ένταση από το Η αρχική έρευνα επικεντρώθηκε στην αναερόβια χώνευση των μικροφυκών για την παραγωγή μεθανίου (CH 4 ). Οι Oswald and Golueke (1960) οραματίστηκαν ένα βιώσιμο σύστημα που περιλαμβάνει τη διεργασία της χώνευσης για την παραγωγή ηλεκτρισμού. Επιπλέον, πρότειναν τη χρήση αστικών αποβλήτων (π.χ. αποχέτευση), CO 2 από τις εκπομπές σταθμού ηλεκτροπαραγωγής καθώς και υπολειμματικής βιομάζας από τη διαδικασία της πέψης για την ανάπτυξη μικροφυκών. Αυτή η ιδέα μέσα στην πρώτη πετρελαϊκή κρίση της δεκαετίας του 1970 οδήγησε στην ταυτόχρονη επεξεργασία των λυμάτων και παραγωγής βιοκαυσίμων με τη χρήση μικροφυκών. Αρκετοί είναι οι ερευνητές που μετά από διάφορες μελέτες κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η μεγάλης κλίμακας μονάδες παραγωγής βιοντίζελ από μικροφύκη θα μπορούν να βελτιώσουν την οικονομική και περιβαλλοντική προοπτική τους χρησιμοποιώντας υγρά απόβλητα, εξυπηρετώντας έτσι ένα ακόμη κομμάτι, εκείνο της επεξεργασίας των αποβλήτων (Chisti, 2007). Έτσι, με το πέρασμα των χρόνων, στον τομέα παραγωγής βιοενέργειας η καλλιέργεια των μικροφυκών με χρήση αποβλήτων κερδίζει όλο και πιο πολύ έδαφος καθώς βελτιώνει την βιωσιμότητα του εγχειρήματος (Pittman et al., 2011). Το 2002, δημιουργήθηκε το Διεθνές Δίκτυο για 75

99 Εισαγωγή την βιοδέσμευση του CO 2 και τη μείωση των αερίων του θερμοκηπίου με μικροφύκη όπου και καθοδήγησε την ανάπτυξη των έργων για την μετατροπή των αερίων του θερμοκηπίου σε βιομάζα μικροφυκών. Ωστόσο, εντοπίστηκαν ορισμένες βασικές πτυχές στις οποίες απαιτείται περαιτέρω έρευνα, όπως : 1) η επιλογή στελέχους και η συντήρηση, 2) η γενετική μηχανική, 3) η φυσιολογία των μικροοργανισμών, 4) η παραγωγή εμβολίου, 5) η σταθερότητα της καλλιέργειας, 6) η παραγωγικότητα, 7) η συλλογή, 8) οι διαδικασίες μετατροπής, 9) τα παραπροϊόντα και συνδιαδικασίες, και τέλος 10) κάποιες λεπτομέρειες των μηχανολογικών σχεδίων (π.χ. τοποθεσία). Η επιλογή του είδος των μικροφυκών που μπορεί να προσαρμοστεί στις κλιματικές συνθήκες μιας περιοχής, τα βασικά του χαρακτηριστικά του (αντοχή, ευκολία συγκομιδής, παραγωγικότητα βιομάζας), καθώς και το πώς ανταπεξέρχεται στο εφαρμοζόμενο σύστημα (ανοιχτό, κλειστό σύστημα), αποτελούν καίρια σημεία για τη σωστή ανάπτυξη της μεθόδου παραγωγής βιομάζας μικροφυκών με σκοπό την παραγωγή βιοκαυσίμων (Gong and Jiang, 2011). Επίσης, η τεχνολογία εξαγωγής των λιπιδίων από τη βιομάζα πρέπει να παρουσιάζει εκλεκτικότητα ως προς τα λιπίδια, ώστε να μην πραγματοποιείται ταυτόχρονη εξαγωγή ανταγωνιστικών παραγόντων όπως πρωτεΐνες και υδατάνθρακες. Παράμετρος βελτίωσης για την επέκταση της καλλιέργειας σε μεγαλύτερη κλίμακα αποτελεί και η εύρεση ενός οικονομικά αποτελεσματικού τρόπου συγκομιδής. Για το λόγο αυτό, αρκετές ερευνητικές προσπάθειες έχουν επικεντρωθεί στην ανάπτυξη κατάλληλων τεχνολογιών προκειμένου να επιτευχθούν αξιόπιστοι και, χαμηλού κόστους τρόποι συγκομιδής της βιομάζας. Αν και η έρευνα είναι ακόμη σε εξέλιξη πάνω στο θέμα αυτό, φαίνεται ότι οι πιο επιτυχημένες τεχνικές είναι η φυγοκέντρηση, η διήθηση και η κροκίδωση/επίπλευση αλλά και ο συνδυασμός τους (Benemann and Oswald, 1996). Η μεγάλη πρόκληση της έρευνας επικεντρώνεται στη βελτίωση ελέγχου της διεργασίας της βιοκροκίδωσης, προκειμένου να αποτελέσει μια πιο αξιόπιστη και αποτελεσματική μέθοδο συγκομιδής, οδηγώντας σε ποσοστό ανάκτησης βιομάζας πάνω από 95%. Τέλος, σημαντικό όφελος έχουν τα παραπροϊόντα, καθώς ορισμένα είναι ακριβά στην αγορά, βελτιώνοντας το κόστος από την συνολική διαδικασία παραγωγής μικροφυκών. Η τεχνολογία στα συστήματα παραγωγής βιοκαυσίμων από μικροφύκη βρίσκεται ακόμα σε πρώιμο στάδιο ανάπτυξης και οι παραδοχές που γίνονται για την απόδοση σε ενέργεια διαφέρουν σημαντικά μεταξύ διαφορετικών τόπων. Προσπάθειες 76

100 Εισαγωγή συσχετισμού της ενεργειακής απόδοσης της βιομάζας από μικροφύκη σε σχέση με τα ορυκτά καύσιμα φανερώνουν την ανάγκη να περιοριστούν ορισμένες ενεργοβόρες τεχνικές (π.χ. εκχύλιση ελαίου, ξήρανση) στην παραγωγή βιοκαυσίμων (Shimako et al., 2016). Η επικρατούσα άποψη υποδεικνύει ότι το 1kg βιομάζας μικροφυκών έχει την «χαμηλότερη θερμαντική αξία» περίπου μεταξύ ΜJ όταν η ίδια παράμετρος για τα ορυκτά καύσιμα είναι στα 20MJ (Yang et al., 2011; Shimako et al., 2016). Επίσης, τρέχουσες μελέτες δείχνουν ότι το κόστος παραγωγής βιοκαυσίμων από κυανοβακτήρια δεν είναι ακόμη ανταγωνιστικό σε σχέση με τα ορυκτά καύσιμα ή με τα συμβατικά βιοκαύσιμα. Υπάρχουν βέβαια και αρκετές μελέτες που δείχνουν ένα θετικό ισοζύγιο ενέργειας για παραγωγή βιοκαυσίμων από μικροφύκη (Medeiros et al., 2015). Έτσι φαίνεται ότι η ανάγκη για χρήση «καθαρότερων» συστημάτων παραγωγής ενέργειας μπορεί να οδηγήσει την παραγωγή μικροφυκών σε μια πιο βιώσιμη διαδρομή. Μπορεί να επιτευχθεί σημαντική μείωση του κόστους (>50%) εάν οι πηγές άνθρακα, τα υπόλοιπα θρεπτικά συστατικά και το νερό εξασφαλίζονται με χαμηλό κόστος (PardoCárdenas et al., 2013; Slade and Bauen, 2013). Αυτά παρέχονται με τη χρήση αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων ως υπόστρωμα για την ανάπτυξη κυανοβακτηρίων. Η κατά τόπους παραγωγή μικροφυκών και η μεταποίηση της βιομάζας τους σε βιοκαύσιμα μπορεί να ξεπεράσει πολλά κόστη καθώς και θέματα που σχετίζονται με την αγορά τροφίμων, λόγω μη χρήσης πλέον γεωργικών καλλιεργειών. Παράλληλα, παρέχεται μια πολύτιμη βοήθεια στον τομέα της επεξεργασίας αποβλήτων με συνοδά περιβαλλοντικά οφέλη στις επαρχιακές περιοχές καθώς η χρήση των μικροφυκών θα μπορούσε να αποτελέσει μια ελκυστική εναλλακτική λύση σαν επιπρόσθετο στάδιο στις συμβατικές διαδικασίες επεξεργασίας αποβλήτων. Η στρατηγική λοιπόν που πρέπει να ακολουθηθεί προκειμένου να επιτευχθεί εμπορική παραγωγή βιοκαυσίμων από μικροφύκη πρέπει να περιλαμβάνει διεργασίες που να στοχεύουν στη αποδοτικότερη δυνατή αξιοποίηση των μικροφυκών ως πρώτες ύλες για παραγωγή ενέργειας, ελαχιστοποιώντας το κόστος και την παραγωγή παραπροϊόντων που προκύπτουν από αυτές. 1.4 Βιοκαύσιμα 77

101 Εισαγωγή Η μείωση των αποθεμάτων πετρελαίου και οι αυξανόμενες περιβαλλοντικές ανησυχίες έχουν υποκινήσει την αναζήτηση των εναλλακτικών ανανεώσιμων καυσίμων που μπορούν να απαντήσουν στην αυξανόμενη ενεργειακή ζήτηση. Απαιτείται σταδιακή αντικατάσταση των παραδοσιακών καυσίμων από νέες «εναλλακτικές» μορφές ενέργειας. Στην κατηγορία των «εναλλακτικών καυσίμων» ανήκουν και τα βιοκαύσιμα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν καθαρά ή ως μείγματα με τα συμβατικά καύσιμα. Ο όρος «βιοκαύσιμα» ή βιολογικά καύσιμα αναφέρεται σε καύσιμα στερεής, υγρής και αέριας μορφής προερχόμενα άμεσα ή έμμεσα από βιοανανεώσιμες πρώτες ύλες. Τα βιοκαύσιμα είναι «φιλικά» προς το περιβάλλον σε σχέση με τα συμβατικά καύσιμα καθώς εμφανίζουν χαμηλότερες εκπομπές αερίων και προέρχονται από ανανεώσιμες πρώτες ύλες (Σχήμα 1.2). Τα βιοκαύσιμα και τα βιοπροϊόντα εξομαλύνουν το φαινόμενο του θερμοκηπίου εφόσον το CO 2 που απελευθερώνεται κατά την καύση ισοδυναμεί με το CO 2 που δεσμεύεται από τα φυτά κατά τη φωτοσύνθεση με αποτέλεσμα να μην υπάρχει συσσώρευση στην ατμόσφαιρα (Naik et al., 2010). Μέχρι σήμερα, τα βιοκαύσιμα προκύπτουν κατά κύριο λόγο από γεωργικά προϊόντα όπως το καλαμπόκι, τη σόγια (Ηνωμένες Πολιτείες), το λιναρό ή σιναπόσπορο (Ευρώπη), το ζαχαροκάλαμο (Βραζιλία) και το φοινικέλαιο (ΝΑ Ασία). Τα κυριότερα είδη βιοκαυσίμων σύμφωνα με την οδηγία 2003/30/ΕΚ (Ευρωπαϊκή Επιτροπή, 2003) που παράγονται σήμερα είναι : Βιοαιθανόλη Βιομεθανόλη Βιοντίζελ Βιοαέριο Βιοδιμεθυλαιθέρας ΒιοΕΤΒΕ (αιθυλοτριτοβουτυλαιθέρας) ΒιοΜΤΒΕ (μεθυλοτριτοβουτυλαιθέρας) Συνθετικά βιοκαύσιμα (συνθετικοί υδρογονάνθρακες ή μίγματα συνθετικών υδρογονανθράκων που παράγονται από βιομάζα) Βιοϋδρογόνο Τα βιοκαύσιμα που προορίζονται για τις μετακινήσεις διαχωρίζονται σε βιοκαύσιμα 1 ης, 2 ης και 3 ης γενιάς. 78

102 Εισαγωγή Σχήμα 1.2: Εκπομπές αερίων θερμοκηπίου (Θεοχάρης, 2010). Βιοκαύσιμα 1 ης γενιάς: Τα κύρια βιοκαύσιμα 1 ης γενιάς που βρίσκονται στο εμπόριο είναι βιοντίζελ, βιοαιθανόλη και βιοαέριο που έχουν ως χαρακτηριστικό τη δυνατότητα να αναμιγνύονται με ορυκτά καύσιμα και να χρησιμοποιούνται στις ήδη υπάρχουσες μηχανές και υποδομές ή και σε εναλλακτικής τεχνολογίας οχήματα όπως πχ. FFVs (Flexible Fuel Vehicles) και οχήματα φυσικού αερίου. Οι πρώτες ύλες των 1 ης γενιάς καυσίμων είναι συνήθως εδώδιμα φυτά, όπως αραβόσιτος (καλαμπόκι), ζαχαροκάλαμο, σιτάρι κ.α.. Διατυπώνονται, όμως αμφιβολίες όσον αφορά στον αντίκτυπο που θα έχουν στη βιοποικιλότητα και στην ανταγωνιστική χρήση της γης για τροφή. Για να καλυφθούν οι ανάγκες έχουν αποψιλωθεί τεράστιες εκτάσεις δασών ώστε να καλλιεργηθούν σοδιές που προορίζονται για βιοκαύσιμα. Αυτό έχει οδηγήσει σε πολύ σοβαρές περιβαλλοντικές και οικολογικές επιπτώσεις. Υποστηρίζεται ότι, ο περιορισμός των αερίων του θερμοκηπίου (GHGs) μπορεί να αντιμετωπιστεί με πιο αποτελεσματικές εναλλακτικές, βασισμένες και στη συμβατική τεχνολογία και στις ανανεώσιμες πηγές. Αυτός ο λόγος οδήγησε στην ανάπτυξη δεύτερης γενιάς βιοκαυσίμων (Group and Management, 2009; Naik et al., 2010). Βιοκαύσιμα 2 ης γενιάς: Στις πρώτες ύλες για τα καύσιμα 2 ης γενιάς περιλαμβάνονται απόβλητα βιομάζας, στελέχη σιταριού και καλαμποκιού, ξύλο, ειδικές ενεργειακές σοδιές (μη εδώδιμες), ζωικά λίπη και διάφορα άλλα λιγνοκυτταρινούχα υλικά τα οποία είναι άφθονα και μη εδώδιμα συστατικά. Η φυτική βιομάζα είναι μια από τις αφθονότερες 79

103 Εισαγωγή πηγές στο πλανήτη και πολλά υποσχόμενη όσον αφορά στην παραγωγή των υγρών βιοκαυσίμων. Παρόλα αυτά, η παραγωγή βιοκαυσίμων από αγροτικά και δασικά παραπροϊόντα δεν καλύπτει παρά μόνο ένα μέρος των απαιτήσεων για υγρά βιοκαύσιμα. Για το λόγο αυτό, το ενδιαφέρον έχει στραφεί και στη καλλιέργεια σοδιών που προορίζονται αποκλειστικά και μόνο για τη παραγωγή βιοκαυσίμων (ενεργειακές καλλιέργειες). Στόχος τους είναι μεγάλες αποδόσεις με χαμηλές απαιτήσεις, καθώς πράγματι κάποια είδη βιοντίζελ 2 ης γενιάς εμφανίζουν βελτιωμένη απόδοση σε κινητήρες, ενώ παράλληλα χρησιμοποιούνται φυτά ικανά να αναπτυχθούν σε άγονα εδάφη (Naik et al., 2010). Βιοκαύσιμα 3 ης γενιάς: Τα καύσιμα 1 ης και 2 ης γενιάς παρουσιάζουν μειονεκτήματα ως προς την πλήρη εμπορευματοποίησή τους, σε μεγάλη κλίμακα, λόγω υψηλών δαπανών στις καλλιέργειες, φόβους ανεπάρκειας και έλλειψη αειφόρου ανάπτυξης. Πρώτες ύλες για τα βιοκαύσιμα 3 ης γενιάς αποτελούν τα (μικρο)φύκη διότι η βιομάζα τους εμφανίζει υψηλότερη παραγωγικότητα σε σχέση με τα ελαιούχα φυτά, υψηλότερη περιεκτικότητα σε έλαιο, έχουν υψηλό ρυθμό φωτοσύνθεσης, δυνατότητα ανάπτυξης σε υγρά απόβλητα καθώς και λιγότερες απαιτήσεις σε καλλιεργήσιμες εκτάσεις εφόσον δεν ανταγωνίζονται την παραγωγή τροφίμων, ζωοτροφών και άλλων προϊόντων που προέρχονται από φυτικές καλλιέργειες (Zhu and Ketola, 2012; Zhu et al., 2014). Αξίζει να επισημάνουμε ότι σύμφωνα με κάποιες μελέτες τα βιοκαύσιμα προερχόμενα από μικροφύκη κατατάσσονται και στα 2 ης γενιάς βιοκαύσιμα (Naik et al., 2010). Βιοκαύσιμα 4 ης γενιάς: Τα καύσιμα 4 ης γενιάς προέρχονται από γενετικά τροποποιημένες καλλιέργειες που στοχεύουν στο να καταναλώνεται περισσότερο ατμοσφαιρικό CO 2 σε σχέση με το ποσό που θα παράγεται κατά την καύση τους ως βιοκαύσιμα. Η τεχνολογία 4 ης γενιάς περιλαμβάνει αναβαθμισμένη πυρόλυση, αεριοποίηση και γενετική τροποποίηση των οργανισμών να εκκρίνουν περισσότερους υδρογονάνθρακες. Γενικά, οι τεχνικές βασίζονται στη μετατροπή των φυτικών ελαίων και του βιοντίζελ σε βιοβενζίνη, χρησιμοποιώντας περισσότερο αναβαθμισμένη τεχνολογία (Demirbas, 2011). 80

104 Εισαγωγή Νομοθετικό πλαίσιο Η Οδηγία 2003/30/ΕΚ/ της Ευρωπαϊκής Επιτροπής στοχεύει στην παραγωγή της χρήσης βιοκαυσίμων ή εναλλακτικών ανανεώσιμων καυσίμων προς αντικατάσταση του συμβατικού πετρελαίου ντίζελ ή της βενζίνης στις μεταφορές σε κάθε κράτοςμέλος. Η Οδηγία συμβάλλει στην ικανοποίηση των δεσμεύσεων του πρωτοκόλλου του Κιότο (Nations, 1998) σχετικά με τις κλιματικές αλλαγές, στη φιλική προς το περιβάλλον ασφάλεια του εφοδιασμού και τη διασφάλιση της αγροτικής παραγωγής. Στα πλαίσια αυτής της αρχής, τα κράτημέλη θα πρέπει να διασφαλίσουν ότι μία ελάχιστη αναλογία βιοκαυσίμων και άλλων ανανεώσιμων καυσίμων διατίθενται στις αγορές τους (Εικόνα 1.11). Συγκεκριμένα, σε κάθε κράτοςμέλος, μέχρι το 2010 έπρεπε να επιτευχθεί αύξηση του ποσοστού βιοκαυσίμων κατά 5.75%, ενώ μέχρι το 2020 να φτάσει το 20%. Σύμφωνα με την παραπάνω Οδηγία η ποσότητα των βιοκαυσίμων που πρέπει να παραχθούν σε χιλιόλιτρα για βιοαιθανόλη και βιοντίζελ είναι και χλτ ως το 2020, αντίστοιχα. Η ενσωμάτωση της εν λόγω οδηγίας στην εθνική νομοθεσία με την ουσιαστική κυβερνητική πρόθεση για την «προώθηση των βιοκαυσίμων προς όφελος της αγροτικής οικονομίας» δημιουργεί σημαντικές προσδοκίες στο γεωργικό πληθυσμό ο οποίος αναζητά νέες παραγωγικές και προσοδοφόρες διεξόδους. H Ελλάδα είναι η πλέον εξαρτημένη από το εισαγόμενο πετρέλαιο χώρα της Ε.Ε., τόσο για την κίνηση όσο και για την παραγωγή ενέργειας γενικότερα. Το νομοθετικό πλαίσιο για τα βιοκαύσιμα στην Ε.Ε. και την Ελλάδα τροποποιήθηκε αρκετές φορές. Η Ελληνική Αγορά Πετρελαιοειδών ρυθμίζεται από το νόμο 3054/ 2002 (όπως τροποποιήθηκε με το νόμο 3335/2005) και το σχετικό Κανονισμό Αδειών. Με το νόμο που ψηφίστηκε το Νοέμβριο του 2005 εναρμονίστηκε η Εθνική Νομοθεσία με την Κοινοτική Οδηγία 2003/30/ΕΚ. Τα οφέλη από τη διάθεση των βιοκαυσίμων στη χώρα μας συμπεριλάμβαναν σημαντικό συναλλαγματικό όφελος, μείωση των εκπομπών CO 2 και δημιουργία νέων θέσεων εργασίας. Παράλληλα, μετά από σχετικές παρεμβάσεις εταιρειών αλλά και της κατεύθυνσης της Ε.Ε., ξεκίνησε μια στροφή παραγωγής βιοκαυσίμων από απόβλητα (τηγανέλαια, ζωικά λίπη). Η συγκεκριμένη κίνηση προσφέρει προηγμένη περιβαλλοντική ανάπτυξη και πολιτική αλλά και ουσιαστική οικονομική λύση στην παραγωγή βιοκαυσίμων. Το 2009 ψηφίστηκε ο νόμος 3769 (ΦΕΚ 105/Α/ ) (εισαγωγή της βιοαιθανόλης στην 81

105 Εισαγωγή αγορά) και το 2012 ψηφίστηκε ο νόμος 4062 (ΦΕΚ 70/Α/ ), με τον οποίο γίνεται η ενσωμάτωση της οδηγίας 2009/28 της Ε.Ε. (κριτήρια αειφορίας βιοκαυσίμων) στην ελληνική νομοθεσία και η κατάργηση της οδηγίας 2003/30. Εικόνα 1.11: Διεθνείς προοπτικές, μέχρι το 2020 για την παραγωγή των βιοκαυσίμων σύμφωνα με την οδηγία 2009/28/ΕΚ (Λάμπρου και Λόης, 2007). Αξίζει να αναφέρουμε ότι, μετά τη λήξη του προγράμματος αποφορολόγησης του αυτούσιου βιοντίζελ στις , το εν λόγω ενεργειακό προϊόν από την φορολογείται, δυστυχώς, με τον ίδιο Ειδικό Φόρο Κατανάλωσης (ΕΦΚ) με τον οποίο φορολογείται και το συμβατικό ντίζελ και γενικότερα του επιβάλλεται το ίδιο φορολογικό καθεστώς με αυτό του συμβατικού πετρελαϊκού ντίζελ Πηγές βιομάζας προς παραγωγή βιοκαυσίμων Η τεχνολογία παραγωγής βιομάζας μικροφυκών ανήκει σε μία κατηγορία συστημάτων που περιλαμβάνει και άλλα οργανικά κλάσματα προς ενεργειακή αξιοποίηση. Γενικά, η βιομάζα θεωρείται μία από τις σημαντικότερες ανανεώσιμες πηγές ενέργειας, λόγω της οικονομικής βιωσιμότητας και της φιλικότητας προς το περιβάλλον. Η λέξη βιομάζα καλύπτει ένα ευρύ φάσμα εννοιών, αλλά στα πλαίσια της Βιοτεχνολογίας, ορίζεται ως την οργανική ύλη που αναπτύσσεται με τη 82

106 Εισαγωγή φωτοσυνθετική μετατροπή της ηλιακής ενέργειας. Η ισχύς της ηλιακής ενέργειας μετατρέπεται σε χρήσιμη οργανική μορφή βιομάζα από τα πράσινα φυτά, τα φύκη και τα φωτοσυνθετικά βακτήρια ως εξής: Η 2 Ο + CO 2 + Ηλιακή ενέργεια + Ανόργανα στοιχεία Βιομάζα + Ο 2 Τα δάση, οι καλλιεργήσιμες εκτάσεις, οι θαλάσσιες πηγές άνθρακα, η σαβάνα και τα λιβάδια έχουν τη μεγαλύτερη συνεισφορά σε αποθέματα άνθρακα υπό μορφή βιομάζας και στην δέσμευση του άνθρακα στην βιόσφαιρα. Επίσης, κάποια από τα παραπροϊόντα ή τα υπολείμματα που δημιουργούνται σε αγροτικές και αστικές περιοχές καθώς και στον αγροτοβιομηχανικό τομέα ή στην βιομηχανία τροφίμων, μπορούν να χρησιμοποιηθούν με περαιτέρω επεξεργασία στην παραγωγή νέων προϊόντων ή μορφών ενέργειας (Klass, 1983). Μερικά από τα πολυάριθμα είδη βιομάζας μπορεί να είναι τα κλαδιά των δέντρων, τα ζωικά περιττώματα ακόμα και τα υπολείμματα από τον εκκοκκισμό του βαμβακιού (Εικόνα 1.12). Εικόνα 1.12: Διάφορες πηγές βιομάζας Η βιομάζα, το 1990 ήταν ήδη ανάμεσα στις τέσσερις μεγαλύτερες πηγές ενέργειας στον κόσμο, εφοδιάζοντας το 13% της χρησιμοποιούμενης αρχικής 83

107 Εισαγωγή ενέργειας (Hall, 1997). Προσφέρει ιδιαίτερη ευελιξία στην προμήθεια καυσίμων χάρη στην εμβέλεια και την ποικιλομορφία των ειδών καυσίμων που μπορούν να παραχθούν από αυτή με διάφορες διεργασίες. Μπορεί να καεί απευθείας για την παραγωγή θερμότητας και ηλεκτρισμού ή μπορεί να μετατραπεί σε στερεό, αέριο ή υγρό καύσιμο χρησιμοποιώντας τεχνολογίες μετατροπής όπως η ζύμωση για την παραγωγή αλκοολών, βακτηριακή ζύμωση για την παραγωγή βιοαερίου και αεριοποίηση για την παραγωγή υποκατάστατων φυσικού αερίου (Πίνακας 1.9). Το πλεονέκτημα της βιομάζας και των βιοκαυσίμων, σε σχέση με τις άλλες ανανεώσιμες τεχνολογίες, είναι ότι μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε όλες τις εφαρμογές οι οποίες σήμερα χρησιμοποιούν ορυκτά καύσιμα. Οι γαιάνθρακες που χρησιμοποιούνται για θέρμανση και παραγωγή ενέργειας θα μπορούσαν να αντικατασταθούν από βιομάζα, καθώς και το φυσικό αέριο ή προϊόντα πετρελαίου (βενζίνη, ντίζελ) που χρησιμοποιούνται σε εφαρμογές, απαιτούν την μετατροπή της βιομάζας σε κατάλληλη μορφή (αέρια, υγρά βιοκαύσιμα). Οι ενεργειακές καλλιέργειες με φυτική βιομάζα συνδράμουν επίσης στη λύση ενεργειακών προβλημάτων καλύπτοντας φάσμα εφαρμογών καθημερινής ζωής αλλά και εξειδικευμένων επιστημονικών και βιομηχανικών τεχνολογιών. Η καύση της βιομάζας έχει μηδενικό ισοζύγιο CO 2 χωρίς να συνεισφέρει στο φαινόμενο του θερμοκηπίου, επειδή οι ποσότητες CO 2 που απελευθερώνονται κατά την καύση δεσμεύονται πάλι από τα φυτά για τη δημιουργία βιομάζας. Επίσης, η μηδαμινή ύπαρξη θείου στη βιομάζα συμβάλλει σημαντικά στον περιορισμό του SO 2 που είναι υπεύθυνο για την όξινη βροχή. Η ενεργειακή αξιοποίηση της συμβάλλει στη μείωση της εξάρτησης από εισαγόμενα καύσιμα και αυξάνει την απασχόληση σε αγροτικές περιοχές που συνεπάγεται την κοινωνικοοικονομική ανάπτυξη μιας περιοχής (Hall and Scrase, 1998). Ως εκ τούτου, αν αντιμετωπιστούν προβλήματα όπως η μεγάλη περιεκτικότητά της σε υγρασία ή οι δυσκολίες κατά τη συλλογή, τη μεταφορά και την αποθήκευση που θα μειώσουν το κόστος της αξιοποίησής της, εύκολα θα αποτελέσει την επόμενη ενεργειακή λύση. Στην Ελλάδα η χρήση της βιομάζας για ενεργειακούς σκοπούς βρίσκεται ακόμα σε πρώιμο στάδιο εφόσον δεν υπάρχει κάποιο εθνικό δυναμικό πρόγραμμα για την διαχείριση της βιομάζας που προκύπτει ή κάποια ξεκάθαρη αγροτική πολιτική για ενεργειακές καλλιέργειες. Ενδεικτικά προτεινόμενα σχήματα ώστε να αξιοποιηθούν οι ανανεώσιμες πηγές ενέργειας, συμπεριλαμβανομένου και της βιομάζας, 84

108 Εισαγωγή καταχωρήθηκαν από τους Mardikis et al. (2004), Alexopoulou et al. (2015) και Alexopoulou and Chatziathanassiou (1999) όπου προβλέπεται: α) η αξιοποίηση τοπικών ενεργειακών τομέων, ώστε να συνδράμουν σημαντικά στην κοινωνικοοικονομική ανάπτυξη της χώρας, β) η περιβαλλοντική προστασία με μειωμένη χρήση ορυκτών καυσίμων για παραγωγή ηλεκτρισμού και γ) η παραγωγή αξιόπιστων και ανταγωνιστικών ενεργειακών προϊόντων. Πίνακας 1.9: Παραγωγή βιοενέργειας από διάφορα υποστρώματα βιομάζας Είδος βιομάζας Μορφή βιοενέργειας Βιβλιογραφία Γλυκό σόργο Βιοαέριο Antonopoulou et al. (2008) Φύκη Βιοαέριο Dębowski et al. (2013) Μικροφύκη Βιοαιθανόλη Ho et al. (2013c) Μίσχοι Βαμβακιού Βιοαιθανόλη Shi et al. (2009) Φλοιός ρυζιού Βιοαιθανόλη Saha et al. (2005) Στελέχη καλαμποκιού Βιοαιθανόλη Sedlak and Ho (2004) Φλούδα πορτοκαλιού Βιοαιθανόλη Plessas et al. (2007) Ελαιογόνα μικρόβια Βιοντίζελ Meng et al. (2009) Μικροφύκη Βιοντίζελ Mata et al. (2010) Κατά το γε νυν έχον, η παραγωγή εν αφθονία τροφίμων, καυσίμων και χημικών προϊόντων από την κυτταρίνη που βρίσκεται στη φυτική βιομάζα, στα αστικά απορρίμματα και στα υπολείμματα που παραμένουν από δασοκαλλιέργειες, γεωργικές εργασίες και την βιομηχανία τροφίμων μπορεί δυνητικά: 1. Να βοηθήσει στην επίλυση των σύγχρονων προβλημάτων της διάθεσης των απορριμμάτων και να μειώσει τη ρύπανση του περιβάλλοντος, 2. Να μειώσει την εξάρτηση του ανθρώπου από τα ορυκτά καύσιμα, 3. Να βοηθήσει στην βελτίωση της διαχείρισης των δασών και της οριοθέτησης των καλλιεργήσιμων εκτάσεων, παρέχοντας μια αγορά για την χαμηλής ποιότητας ξυλεία και άλλων αποβλήτων φυτικής προέλευσης και 4. Να βελτιώσει το βιοτικό επίπεδο του ανθρώπου. 85

109 Εισαγωγή Επεξεργασία βιομάζας Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την επεξεργασία της βιομάζας μπορεί να είναι φυσικές, χημικές, βιολογικές ή και συνδυασμός τους. Οι διαδικασίες μπορεί να περιλαμβάνουν σύνθλιψη, τεμαχισμό, υδρόλυση (χημική ή ενζυμική), οζόνωση, θέρμανση ή και αναερόβια χώνευση (Segneanu et al., 2013). Οι τεχνικές αυτές αποβλέπουν στην μέγιστη απόδοση των ανακτώμενων στοιχείων από τα λιγνοκυτταρικά σύμπλοκα ώστε να χρησιμοποιηθούν στην παραγωγή βιοενέργειας. Τις τελευταίες δεκαετίες έχει αναφερθεί ένα ευρύ φάσμα μεθόδων προκατεργασίας (Downey et al., 2006; Lee et al., 2008; TomasPejo et al., 2008; Kumar et al., 2009; Christ and Burritt, 2013) οι οποίες διακρίνονται σε: α. φυσικές (άλεση, κονιορτοποίηση, ακτινοβόληση κτλ), β. χημικές (αλκάλια, οξέα, οξειδωτικές ενώσεις, όζον, οργανικοί διαλύτες κτλ), γ. φυσικοχημικές (προκατεργασία με ατμό, υδροθερμόλυση, υγρή οξείδωση κτλ) δ. βιολογικές (χρήση μικροοργανισμών), ή ακόμα και συνδυασμός των παραπάνω. Η χρήση βιολογικών συστημάτων με την παρουσία μυκήτων ή χρήση αλκαλικών αντιδραστηρίων οδηγούν σε απώλειες σακχάρων, καθιστώντας τα εν λόγω συστήματα μη ικανοποιητικά για υψηλές αποδόσεις παραγωγής βιοαιθανόλης (Saha et al., 2005). Η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος επεξεργασίας της βιομάζας είναι η υδρόλυση είτε με χημικά μέσα (κυρίως οξέα) είτε με τη δράση ενζύμων. Το είδος της υδρόλυσης που θα επιλεχθεί προκειμένου να επιτευχθούν οι μέγιστες αποδόσεις παραγωγής βιοαιθανόλης, εξαρτάται από τον τύπο της βιομάζας. Για να παραχθεί βιοαιθανόλη με χρήση βιομάζας μικροφυκών, ως υπόστρωμα ζύμωσης, θα πρέπει οι υδατάνθρακές τους να υδρολυθούν προς μονομερή, δεδομένου ότι οι ζυμομύκητες μπορούν να ζυμώνουν μόνο μονομερή σάκχαρα. Συνοπτικά η υδρόλυση πρέπει να στοχεύει στα εξής (Sedlak and Ho, 2004): 1. Στη βέλτιστη εκμετάλλευση της ποσότητας των σακχάρων ώστε να μειώνεται η απώλεια σακχάρων. 2. Στην αποφυγή παραγωγής παραπροϊόντων που μπορεί να δράσουν ανασταλτικά στους ζυμομύκητες και την ανάπτυξή τους. 3. Να είναι οικονομική διαδικασία. 86

110 Εισαγωγή Υδρόλυση βιομάζας Με την υδρόλυση οι πολυσακχαρίτες της βιομάζας εκτίθενται σε χημικό μέσο για ένα χρονικό διάστημα, σε συγκεκριμένη θερμοκρασία, καταλήγοντας σε μονομερή σάκχαρα. Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί με χρήση οξέων, βάσεων ή ενζύμων. Οι αλκαλικές υδρολύσεις, στις οποίες χρησιμοποιείται συνήθως NaOH ή KOH, δεν αποδίδουν υψηλά ποσοστά σακχάρων όπως τα όξινα μέσα (Sarris et al., 2014; Hernandez et al., 2015). Η αλκαλική υδρόλυση διασπά ενδομοριακές ενώσεις μεταξύ πολύπλοκων πολυσακχαριτών και απελευθερώνει αλυσίδες υδατανθράκων καθώς και άλλα συστατικά πολυμερών στο μέσο αλλά δεν διασπά πολυσακχαρίτες σε απλά σάκχαρα (Zheng et al., 2009). Ωστόσο, στην όξινη υδρόλυση οι μακρές αλυσίδες της κυτταρίνης και της ημικυτταρίνης διασπώνται σε μικρότερα ολιγομερή και μονομερή που απελευθερώνουν γλυκόζη και άλλους μονοσακχαρίτες. Στην όξινη υδρόλυση, τα οξέα που χρησιμοποιούνται συνήθως είναι HNO 3, HCl, H 3 PO 4 και H 2 SO 4, με τα τρία πρώτα να σημειώνουν τους υψηλότερους ρυθμούς απόδοσης σακχάρων και το H 2 SO 4 να εμφανίζει τις υψηλότερες αποδόσεις παραγωγής αιθανόλης (Markou et al., 2013). Επίσης, τα ποσοστά των απλών σακχάρων που προκύπτουν από την υδρόλυση με πυκνά οξέα είναι σχετικά υψηλότερα (με άμεσο αποτέλεσμα την επίτευξη υψηλών αποδόσεων αιθανόλης), συγκρίσει της υδρόλυσης με αραιά οξέα (Razzak et al., 2013). Τα πυκνά οξέα έχουν τη δυνατότητα να δρουν σε χαμηλές θερμοκρασίες (4050 o C) σε σχέση με τα αραιά και χρειάζονται συνήθως λιγότερο χρόνο δράσης στη βιομάζα. Ωστόσο, η υψηλή συγκέντρωση του οξέος, σε συνδυασμό με την θέρμανση, καθιστά το υπόστρωμα εξαιρετικά διαβρωτικό μέσο. Για το λόγο αυτό, η συγκεκριμένη διαδικασία απαιτεί αντιδραστήρα κατασκευασμένο από κράματα όπως είναι τα κεραμικά. Ένα ακόμα μειονέκτημα της μεθόδου αποτελεί και η ανάγκη απομάκρυνσης του οξέος πριν την παραγωγή βιοαιθανόλης, καθώς κατά τη διαδικασία εξουδετέρωσης του παράγεται γύψος (Saha et al., 2005; Downey et al., 2006; Razzak et al., 2013). Για τους παραπάνω λόγους η μέθοδος χημικής υδρόλυσης που χρησιμοποιείται ευρέως είναι εκείνη στην οποία γίνεται χρήση αραιών οξέων. Η συγκεκριμένη μέθοδος χρησιμοποιείται είτε σε φάση προεπεξεργασίας, πριν την ενζυματική υδρόλυση, είτε ως μεμονωμένη μέθοδος υδρόλυσης. Το μειονέκτημα της υδρόλυσης με αραιά οξέα είναι ότι λόγω των υψηλών θερμοκρασιών που απαιτούνται μέρος των σακχάρων 87

111 Εισαγωγή καταστρέφεται. Επίσης, οι υψηλές θερμοκρασίες οδηγούν στην παραγωγή παραπροϊόντων όπως φαινολικά στοιχεία και φουρφουράλες, τα οποία οδηγούν στην παρεμπόδιση της βιοδιεργασίας στην αλκοολική ζύμωση. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, το κόστος που απαιτείται για τη μείωση των παρεμποδιστικών αυτών παραγόντων είναι πολύ υψηλό (Palmqvist and HahnHägerdal, 2000; Saha et al., 2005). Προκειμένου, να μειωθεί η επίδραση της παρεμποδιστικής δράσης των παραπροϊόντων έχουν αναπτυχθεί διάφορες μέθοδοι απομάκρυνσής τους, όπως η πραγματοποίηση της υδρόλυσης σε δύο φάσεις. Στην πρώτη φάση οι συνθήκες που επικρατούν είναι ήπιες και υπάρχει μετατροπή των πολυσακχαριτών σε μονοσακχαρίτες, ενώ κατά το δεύτερο στάδιο οι συνθήκες είναι εντονότερες και η κυτταρίνη υδρολύεται (Christenson and Sims, 2011). Ωστόσο, η σακχαροποίηση μέσω ενζυματικής υδρόλυσης τείνει να εκτοπίσει τη χημική υδρόλυση λόγω της τάσης για αποφυγή χημικών στην παραγωγή. Η μέθοδος αυτή εφαρμόζεται όλο και περισσότερο χρησιμοποιώντας μεγάλη ποικιλία ενζύμων (Iconomou et al., 1995). Η ενζυματική υδρόλυση στην ανάκτηση σακχάρων, οδηγεί σε αποδόσεις μέχρι και 7585%, αποτελώντας μια συνεχώς εξελισσόμενη μέθοδος (Sedlak and Ho, 2004). Στον αντίποδα, σημαντικό μειονέκτημα της ενζυματικής υδρόλυσης είναι ο αργός ρυθμός της διεργασίας που μπορεί να κυμαίνεται από 48 μέχρι και 72h (Sun and Cheng, 2005; Yang and Wyman, 2006; Sun and Chen, 2008). Μικροοργανισμοί ικανοί να παράγουν απαραίτητα ένζυμα για την υδρόλυση πολυσακχαριτών ανήκουν στα είδη: Clostridium, Cellulomonas, Thermonospora, Bacillus, Bacteriodes, Ruminococcus, Erwinia, Acetovibrio, Microbispora, Streptomyces καθώς και πολλοί μύκητες, όπως Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Phanerochaete, Humicola, Schizophillum sp. (Bisaria and Ghose, 1981; Howard et al., 2003) Παραγωγή βιοκαυσίμων ανά τον κόσμο Σήμερα, τα βασικότερα βιοκαύσιμα που κυκλοφορούν στο εμπόριο είναι η βιοαιθανόλη, το βιοντίζελ και το βιοαέριο. Η παγκόσμια παραγωγή βιοαιθανόλης το 2009 ήταν 73.9 δισεκατομμύρια λίτρα, μια αύξηση της τάξης του 400% σε σχέση με το 2000 η οποία ήταν μόνο 17 δισεκατομμύρια λίτρα (Renewable Fuels Association (RFA), 2010). Με βάση την 88

112 Εισαγωγή πρόοδο αυτή, η παγκόσμια παραγωγή βιοαιθανόλης το 2017 θα είναι διπλάσια από εκείνη του Οι Ηνωμένες Πολιτείες και η Βραζιλία παραμένουν οι κυρίαρχες χώρες παραγωγής βιοαιθανόλης στον κόσμο. Στη Βραζιλία, με εξαίρεση την βιοαιθανόλη που παράγεται από ζαχαροκάλαμο, τα άλλα βιοκαύσιμα δεν είναι οικονομικά ανταγωνιστικά προς τα ορυκτά καύσιμα χωρίς αυτά να περιέχουν προσμίξεις. Η παγκόσμια παραγωγή βιοντίζελ κατά το έτος 2003 ήταν περίπου 1.8 δισεκατομμύρια λίτρα. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων χρόνων, παρατηρήθηκε μία αύξηση λόγω της αυξημένης ζήτησης για καύσιμα, της ζήτησης για καθαρότερη ενέργεια σε παγκόσμιο επίπεδο, και για να εκπληρωθούν το σχέδιο δράσης του Μπαλί και οι απαιτήσεις του πρωτοκόλλου του Κιότο για καθιέρωση εναλλακτικών πηγών ενέργειας. Η Ευρώπη είναι μια σημαντική ήπειρος παραγωγής βιοκαυσίμων στην παγκόσμια αγορά. Επί του παρόντος, οι χώρες της Ευρωπαϊκής Ένωσης έχουν ένα μικρό ποσοστό (6%) συμμετοχής στην παγκόσμια παραγωγή βιοκαυσίμων. Η Γερμανία αποτελεί τη σημαντικότερη χώρα παραγωγής βιοκαυσίμων στην Ευρώπη και ακολουθείται από την Γαλλία, την Ιταλία και την Τσεχία (Πίνακας 1.10). Η αιθανόλη πρωτοεισήχθη στη Γαλλία, σαν καύσιμο κίνησης αναμεμιγμένο σε περιορισμένες ποσότητες με βενζίνη. Σήμερα συναντάμε συνεχώς αυξανόμενη χρήση της με τη μορφή ΕΤΒΕ σε ανάμιξη με το πετρέλαιο. Στη Σουηδία, έχει εισαχθεί η χρήση της αιθανόλης ως καύσιμο κίνησης στα λεωφορεία ενώ γίνεται προσπάθεια προώθησης και σε άλλες κατηγορίες οχημάτων. Η Ισπανία αύξησε τη παραγωγική ικανότητα αιθανόλης και ΕΤΒΕ με την κατασκευή μιας νέας μονάδας παραγωγής αιθανόλης και δύο μονάδων παραγωγής ΕΤΒΕ. Στις ευρωπαϊκές χώρες, το βιοντίζελ χρησιμοποιείται γενικά εφαρμόζοντας διάφορα μείγματα με ντίζελ. Περίπου 1.4 εκατομμύρια εκτάρια καλλιεργήσιμης γης χρησιμοποιούνται για παραγωγή βιοντίζελ σε ορισμένες χώρες, όπως η Γερμανία, η Σουηδία και η Αυστρία, καθώς το καθαρό βιοντίζελ χρησιμοποιείται στα οχήματα στρατού. Μέχρι το 2010 υπήρχαν περίπου 40 εργοστάσια στην ΕΕ που παρήγαγαν έως τόνους βιοντίζελ ετησίως και βρίσκονταν κυρίως στην Ιταλία, στη Γερμανία, την Αυστρία, την Σουηδία και τη Γαλλία. 89

113 Εισαγωγή Πίνακας 1.10: Οι πρώτες 15 χώρες παραγωγής υγρών βιοκαυσίμων το (Η σειρά κατάταξης είναι σύμφωνη με τη συνολική παραγωγή βιοκαυσίμων REN21, Renewable Global Status Report 2009 update Sawin et al., 2009) (Cordano et al., 2010). Χώρα Υγρή βιοαιθανόλη Βιοντίζελ (10 9 λίτρα) (10 9 λίτρα) Ηνωμένες Πολιτείες Βραζιλία Γερμανία Αργεντινή Γαλλία Κίνα Καναδάς Ινδονησία Ισπανία Ταϋλάνδη Βέλγιο Ολλανδία Ιταλία Κολομβία Αυστρία Συνολικά στην ΕΕ Σύνολο παγκοσμίως Τα προσφορότερα για την Ελλάδα βιοκαύσιμα είναι το βιοντίζελ και η βιοαιθανόλη. Σήμερα, για βιοντίζελ στην Ελλάδα, παράγονται σπορέλαια σε διάφορες ποσότητες όπως το ηλιέλαιο, και το βαμβακέλαιο, ενώ τα τελευταία έτη έχουν ξεκινήσει προσπάθειες ανάπτυξης καλλιεργειών νέων ελαιούχων φυτών για τα ελληνικά δεδομένα, όπως της ελαιοκράμβης. Για τη βιοαιθανόλη σημαντικό ρόλο θα έχει το γλυκό σόργο που καταγράφει υψηλότερη στρεμματική απόδοση σε βιοαιθανόλη από το ζαχαρότευτλο. Προσπάθειες γίνονται επίσης για την οικονομική εκτίμηση της παραγωγής βιοαιθανόλης από καλαμπόκι. Στο πρώτο στάδιο εφαρμογής, το βιοντίζελ προορίζεται µόνο για ανάμιξη µε το πετρέλαιο κίνησης σε 90

114 Εισαγωγή ποσοστό µέχρι 5% κατ όγκο. Ακολουθεί, σε δεύτερο στάδιο, η διάθεσή του ως αυτούσιο στη λιανική αγορά, καθώς και η ανάμιξή του σε μεγαλύτερο ποσοστό µε το πετρέλαιο κίνησης, προοριζόμενο για στόλους αυτοκινήτων (όπως οχήματα δηµόσιων μεταφορών, κλπ.). Παράλληλα εξετάζεται η δυνατότητα χρησιμοποίησης του ως καύσιµο θέρμανσης, για βιομηχανική ή άλλες χρήσεις, ακόµη και για παραγωγή ηλεκτρικής ενέργειας ή συµπαραγωγή ηλεκτρισµού και θερµότητας. Η διάθεση βιοντίζελ στην Ελλάδα ξεκίνησε το 2005, όταν οι πρώτες ποσότητες διακινήθηκαν από την εταιρία ΕΛ.ΒΙ. προς τα διυλιστήρια της χώρας, για ανάµιξη µε το πετρέλαιο κίνησης. Το µείγµα 2% κατ όγκο βιοντίζελ σε πετρέλαιο κίνησης διατέθηκε σε όλους τους τελικούς καταναλωτές από τον Φεβρουάριο του 2006 και συνεχίζει να διατίθεται µέχρι σήµερα. Στη χώρα μας δραστηριοποιούνται εταιρείες εµπορίας βιοντίζελ, καθώς και εταιρείες παραγωγής στις οποίες παρατηρείται αυξανόμενη παραγωγή τα τελευταία χρόνια. Οι πρώτες ύλες που χρησιμοποιούν, οι ανωτέρω εγχώριες μονάδες παραγωγής και εισαγωγής βιοντίζελ, είναι τόσο εισαγόμενα λάδια (σογιέλαιο, κραμβέλαιο, κλπ.), τόσο από άλλα κράτη µέλη της Ε.Ε. όσο και από τρίτες χώρες, σε ποσοστό 70% περίπου, όσο και εγχώρια παραγόμενα λάδια (βαμβακέλαιο, ηλιέλαιο, κραμβέλαιο, χρησιμοποιημένα μαγειρικά έλαια και τηγανέλαια, κλπ.) σε ποσοστό 30% περίπου. Παράλληλα, πολλαπλασιάζονται οι προσπάθειες για εντατικοποίηση των εγχώριων καλλιεργειών ηλίανθου και ελαιοκράμβης, µε στόχο οι εγχώρια παραγόμενες πρώτες ύλες να ξεπεράσουν σε ποσοστό τις εισαγόμενες, προσέχοντας ωστόσο να µην διαταραχθεί ο τοµέας των τροφίµων. Σημαντικό βήμα για την προώθηση της χρήσης βιοκαυσίμων ήταν η αποφορολόγηση της ελαχίστης ποσότητας βιοκαυσίμου σύμφωνα με το άρθρο 4 της οδηγίας 2003/30/ΕΚ (ΥΠΕΚΑ, 2008) Βιοντίζελ Το ντίζελ (diesel) είναι ένα από τα μεσαία κλάσματα απόσταξης του αργού πετρελαίου και αποτελείται κυρίως από υδρογονάνθρακες με C 14 C 18 και σημεία ζέσεως μεταξύ o C. Αντίστοιχα, ο όρος βιοντίζελ αποτελεί τον μονοαλκυλικό εστέρα μίας μακράς αλυσίδας λιπαρών οξέων που προέρχονται κυρίως από ελαιούχους σπόρους (ηλίανθος, σόγια, ελαιοκράμβη, καλαμπόκι) ή ζωικά λίπη και μπορούν να χρησιμοποιηθούν έναντι συμβατικού ντίζελ, πετρελαϊκής προέλευσης 91

115 Εισαγωγή στις μηχανές ντίζελ με ανάμειξη ή και καθόλου τροποποίηση. Ο βαθμός ανάμειξης με το ορυκτό ντίζελ αναφέρεται ως Βxx, όπου το xx υποδηλώνει το ποσοστό του βιοντίζελ που έχει αναμιχθεί (π.χ. Β15: 15% βιοντίζελ, 85% ντίζελ) (Agarwal, 2007). Το παραγόμενο καύσιμο έχει φυσικοχημικά χαρακτηριστικά παρόμοια με αυτά του ντίζελ χωρίς να είναι τοξικό, εφόσον δεν περιέχει αρωματικές ενώσεις, είναι εύκολα βιοδιασπώμενο και σε σύγκριση με το συμβατικό ντίζελ έχει χαμηλότερες εκπομπές σωματιδίων, μονοξειδίου του άνθρακα, υδρογονανθράκων και αιωρούμενων σωματιδίων οδηγώντας σε εξάλειψη των εκπομπών οξειδίων του θείου, καθώς και στη μείωση του φαινομένου του θερμοκηπίου (Syassen, 1996). Οι εκπομπές σε οξείδια του θείου, σε μονοξείδιο του άνθρακα, σε άκαυστους υδρογονάνθρακες και σε αιθάλη είναι αρκετά χαμηλές συμβάλλοντας στην μείωση της θολότητας των καυσαερίων και στην μείωση των επικαθίσεων στον κινητήρα. Το βιοντίζελ, κερδίζει έδαφος ως δυναμικά αναπτυσσόμενο βιοκαύσιμο εφόσον πλεονεκτεί έναντι του συμβατικού ντίζελ, καθώς: Έχει παρόμοιες φυσικοχημικές ιδιότητες με το συμβατικό ντίζελ. Έχει μηδενικό περιεχόμενο σε θείο και σε βαρέα μέταλλα συμβάλλοντας στην χαμηλή φθορά των εξαρτημάτων (διάβρωση). Έχει υψηλό αριθμό κετανίου (δείκτη ποιότητας ανάφλεξης ενός μίγματος) που βοηθά στην εύκολη ανάφλεξη στο κρύο και στο χαμηλό θόρυβο του κινητήρα. Μειώνει, αν και δεν εξαλείφει, την εξάρτηση των χωρών από το εισαγόμενο πετρέλαιο. Είναι μη τοξικό (διασπάται 4 φορές γρηγορότερα από το συμβατικό ντίζελ) και δεν συμβάλλει στη παγκόσμια αύξηση της θερμοκρασίας λόγω του κλειστού κύκλου του άνθρακα (Zhang et al., 1988; Pasqualino et al., 2006). Περιέχει 1011% κατά βάρος οξυγόνο, το οποίο καθιστά τις καύσεις λιγότερο ατελής οπότε οι εκπομπές του άκαυστων υδρογονανθράκων και των αιωρούμενων σωματιδίων (αιθάλη), τοξικών και μεταλλαξιγόνων αερίων είναι σχετικά χαμηλότερες (αρωματικές ενώσεις) από ότι αυτές των ορυκτών καυσίμων (Carraretto et al., 2004; Demirbas, 2008). Μπορεί να χρησιμοποιηθεί είτε αυτούσιο, είτε ως πρόσμιξη με συμβατικό ντίζελ σε οποιαδήποτε αναλογία. Κατά την πρόσμιξη του με συμβατικά καύσιμα ακόμη και σε χαμηλό ποσοστό της τάξεως 12% μπορεί να 92

116 Εισαγωγή μετατρέψει τα καύσιμα που χαρακτηρίζονται από χαμηλή λιπαντική ικανότητα σε αποδεκτά καύσιμα. Οι κίνδυνοι από το χειρισμό, τη μεταφορά και την αποθήκευση του είναι λιγότεροι από εκείνους που σχετίζονται με τα συμβατικά καύσιμα. Ωστόσο, το βιοντίζελ μειονεκτεί σε σχέση με το συμβατικό ντίζελ εφόσον παρουσιάζει : Υψηλότερη τιμή λόγω ακριβών πρώτων υλών και υψηλότερης φορολογίας. Υψηλό ιξώδες, δημιουργώντας προβλήματα στον κινητήρα. Χαμηλότερο ενεργειακό περιεχόμενο. Χαμηλή πτητικότητα. Χρήση μεθανόλης για την παραγωγή του. Χαμηλή δραστικότητα των ακόρεστων αλυσίδων και σχηματισμός ρητινωδών προϊόντων. Τα συνηθέστερα λιπαρά οξέα που συναντώνται σε φυτικά και ζωικά έλαια και χρησιμοποιούνται στην παραγωγή βιοντίζελ παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.11 (UNEEN14214, 2004; Knothe, 2008). Πίνακας 1.11: Είδη και ποσοστά λιπαρών οξέων από έλαια που προτείνονται για βιοντίζελ. Όνομα λιπαρού οξέος Αριθμός ατόμων άνθρακα % (w/ολικά λιπίδια) Οδηγία ΕΝ14214 (%) Καπρυλικό C8:0 410 Καπρικό C10:0 510 Λαυρικό C12:0 037 Μυριστικό C14: Παλμιτικό C16: Παλμιτελεϊκο C16: Στεατικό C18:

117 Ελαϊκό C18: Λινελαϊκό C18: Λινολενικό C18: Εισαγωγή Άλλα C20:0, C20:1, C22:0, C22:1 2.9 Οι πρώτες ύλες για την παραγωγή βιοντίζελ εξαρτώνται από το κλίμα, τις εδαφικές συνθήκες και τη διαθεσιμότητα κάθε χώρας. Τυπικές πρώτες ύλες είναι το κραμβέλαιο, το σογιέλαιο, το ηλιέλαιο και το φοινικέλαιο. Το 75% των εξόδων παραγωγής βιοντίζελ αποτελεί η απόκτηση της πρώτης ύλης, η οποία είναι μια σοβαρή απειλή για τη βιωσιμότητα της βιομηχανίας του βιοντίζελ (Meng et al., 2009). Κατά συνέπεια, το τελικό κόστος θα επισημάνεται από την αρχική τιμή της πρώτης ύλης. Οι νέες πρώτες ύλες χρήσης των μικροφυκών είναι η πλέον ελπιδοφόρες (Gallagher, 2011). Η παγκόσμια παραγωγή εκτιμάται ότι έφτασε τα 37 δισεκατομμύρια γαλόνια μέχρι το 2006 και αναπτύσσεται με μέσο ετήσιο ρυθμό 42% (Li et al., 2008a). Η Γερμανία φαίνεται να είναι ο κυριότερος παραγωγός βιοντίζελ στον κόσμο κατέχοντας το 47% της παγκόσμιας παραγωγής ακολουθούμενη από τις Η.Π.Α. με 14% και έπονται Γαλλία, Ιταλία, Βραζιλία, Κίνα κλπ. (Takahashi and Ortega, 2010). Το κόστος παραγωγής της καλλιέργειας στην Ευρώπη, αντιπροσωπεύει περίπου το 80% του τελικού κόστους του βιοντίζελ. Ωστόσο, η ανάγκη για οικονομικά πιο ανταγωνιστικό καύσιμο οδηγεί στην εύρεση φθηνότερων πρώτων υλών όπως τα χρησιμοποιημένα έλαια και τα ζωικά λίπη (Van Kasteren and Nisworo, 2007). Όμως, τα ακατέργαστα φυτικά έλαια δημιουργούν προβλήματα στις μηχανές, λόγω του υψηλού ιξώδους κάτι που αντιμετωπίζεται με τη χημική διεργασία της μετεστεροποίησης. Για την εγχώρια παραγωγή βιοντίζελ πρώτες ύλες είναι το ηλιέλαιο, το κραμβέλαιο και το βαμβακέλαιο. Το βαμβάκι καλλιεργείται συστηματικά σε πολλές περιοχές της χώρας ενώ ο ηλίανθος και η ελαιοκράμβη άρχισαν να καλλιεργούνται εντός του 2007, κυρίως στη Θράκη και τη Μακεδονία. Σήμερα στη χώρα μας υπάρχουν ήδη και δραστηριοποιούνται για βιοντίζελ 24 εταιρείες (Πίνακας 1.12). Οι 17 δραστηριοποιούνται στην παραγωγή του βιοκαυσίμου χρησιμοποιώντας ως πρώτη ύλη κυρίως εξευγενισμένα φυτικά έλαια και ζωικά λίπη, ενώ κάποιες 94

118 Εισαγωγή δραστηριοποιούνται στην εισαγωγή και εμπορία βιοντίζελ κυρίως από χώρες της Ε.Ε. Το παρήχθησαν στην Ελλάδα και διατέθηκαν στα διυλιστήρια για ανάμειξη με το συμβατικό ντίζελ m 3 βιοντίζελ, ενώ το το ποσό αυξήθηκε στις m 3 βιοντίζελ. Το παρήχθησαν στη χώρα μας m 3 ενώ το ποσό αυξήθηκε σε m 3 στον επόμενο χρόνο. Ωστόσο, από το 2010 και μετά η παραγωγή είναι σταθερή η ελαφρώς μειωμένη φτάνοντας το μέσο όρο των m 3 μέχρι και το 2012 ( Στα πλαίσια μείωσης του κόστους, η βιομηχανία βιοντίζελ διερευνά νέες πρώτες ύλες που δεν προέρχονται από καλλιέργειες ενεργειακών φυτών ώστε να μειωθούν οι απαιτήσεις σε εκτάσεις γης και ο χρόνος ανάπτυξης. Οι μικροοργανισμοί αποτέλεσαν μια εναλλακτική πηγή για παραγωγή βιοντίζελ εφόσον υπερτερούν στα παραπάνω, συγκριτικά με τα φυτά, καθώς επίσης δεν ανταγωνίζονται την παραγωγή τροφίμων και χρησιμοποιούν για την ανάπτυξή τους αρκετά παραπροϊόντα. Μάλιστα, ορισμένοι μικροοργανισμοί μπορούν να συσσωρεύουν υψηλά ποσά λιπιδίων στη βιομάζα τους, κάτω από κατάλληλες συνθήκες καλλιέργειας (Li et al., 2008a). Οι βασικότεροι μικροοργανισμοί που εξετάζονται για αυτό το σκοπό είναι τα μικροφύκη, οι μύκητες, οι ζύμες και τα βακτήρια (Meng et al., 2009). Ωστόσο, για τις καλλιέργειες αυτές απαιτούνται ασηπτικές συνθήκες που αυξάνουν το κόστος παραγωγής ελαίων. Πίνακας 1.12: Εταιρείες παραγωγής και εισαγωγής βιοντίζελ στην Ελλάδα και οι ποσότητες που κατανεμήθηκαν τα έτη (ΦΕΚ Β , ΚΥΑ Δ1/Α/17970 ( ), ΦΕΚ Β , ΚΥΑ Δ1/Α/18571 ( )). Εταιρεία Προέλευση Βιοντίζελ Βιοντίζελ (1000L) 2012 ΕΛ.ΒΙ. ΕΛΛΗΝΙΚΑ ΒΙΟΠΕΤΡΕΛΑΙΑ Α.Β.Ε.Ε. Σταυροχώρι Ν. Κιλκίς ΠΑΥΛΟΣ Ν. ΠΕΤΤΑΣ Α.Β.Ε.Ε. ΒΙ.ΠΕ. Πατρών VERT OIL A.E Αγ. Αθανάσιος Ν. Θεσσαλονίκης AGROINVEST Α.Β.Ε.Ε. Αχλάδι Ν. Φθιώτιδας STAFF COLOUR ENERGY Α.Β.Ε.Ε. ΒΙ.ΠΕ. Ν. Λάρισας 349 ΕΚΚΟΚΚΙΣΤΗΡΙΑ ΚΛΩΣΤΗΡΙΑ Βιστωνίδα Ν. Ξάνθης 5215 ΒΟΡΕΙΟΥ ΕΛΛΑΔΟΣ Α.Ε ΒΙΟΝΤΙΖΕΛ Ε.Π.Ε. Άσσηρος Ν. Θεσσαλονίκης 7118 ΕΛΙΝ ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΑ Α.Ε. ΒΙ.ΠΕ. Ν. Μαγνησίας ΒΙΟΕΝΕΡΓΕΙΑ ΠΑΠΑΝΤΩΝΙΟΥ Α.Ε. ΒΙ.ΠΑ. Λάκκωμα Ν. Χαλκιδικής 1099 MIL OIL HELLAS Α.Ε. ΒΙ.ΠΕ. Ν. Σερρών 2795 ΦΥΤΟΕΝΕΡΓΕΙΑ Α.Ε. Παραλίμνιο Ν. Σερρών GF ENERGY Α.Ε. Αγ. Θεόδωροι Κορινθίας

119 Εισαγωγή BIODIESEL Α.Ε. Εισαγωγή από Ιταλία DP LUBRIFICANTI SRL Εισαγωγή από Ιταλία 239 CAFFARO CHIMICA SRL Εισαγωγή από Ιταλία ΜΑΝΟΣ Α.Ε. ΒΙ.ΠΕ. Ν. Μαγνησίας 3975 BIODIESEL VIENNA Εισαγωγή από Αυστρία OIL B.S.R.L Εισαγωγή από Ιταλία 344 MOTOR OIL ΔΙΥΛΙΣΤΗΡΙΑ ΚΟΡΙΝΘΟΥ Α.Ε. Εισαγωγή από Ιταλία/Ρουμανία/Αυστρία/Τσεχία ΚΑΤΟΙΛ ΑΕΒΕ Εισαγωγή από Ιταλία 280 ΑΔΡΙΑΤΙΚΑ ΟΙΛ ΑΕ Εισαγωγή από Ιταλία 334 ΠΕΤΡΟΙΛ ΑΕ Εισαγωγή από Ιταλία 285 ΕΛΛΑΣ ΟΙΛ ΑΕ Εισαγωγή από Ιταλία και Βέλγιο 259 ΕΛ.ΠΕ. ΑΕ Εισαγωγή από Ιταλία/Ρουμανία/Αυστρία ΒΙΟPOWER ΒΙΟΚΙΝΗΤΙΚΗ ΕΠΕ Τρίκαλα Για την αποδοχή του βιοντίζελ θα πρέπει να ακολουθούνται τα ισχύοντα πρότυπα χρήσης. Στις Ηνωμένες Πολιτείες το σχετικό πρότυπο είναι το ASTM Biodiesel Standard D Στην Ευρωπαϊκή Ένωση υπάρχουν ξεχωριστά πρότυπα που προορίζονται για χρήση βιοντίζελ για την κίνηση οχημάτων (Standard EN 14214) και για την χρήση ως πετρέλαιο θέρμανσης (Standard EN 14213). Τα πρότυπα Standard EN και Standard EN απαιτούν η τιμή του ιωδίου στο βιοντίζελ να μην υπερβαίνει τα 120 με 130g ιωδίου / 100g βιοντίζελ, αντίστοιχα. Επίσης, το ευρωπαϊκό πρότυπο Standard EN περιορίζει το περιεχόμενο μεθυλεστέρα λινολενικού οξέος του βιοντίζελ για χρήση σε οχήματα στο 12%. Επιπλέον, τα ευρωπαϊκά πρότυπα για το βιοντίζελ περιορίζουν το περιεχόμενό του σε μεθυλεστέρες λιπαρών οξέων με τέσσερις και περισσότερους διπλούς δεσμούς, με ανώτατο όριο στο 1%. Η παραγωγή μικροφυκών πρέπει να έχει χαμηλό κεφαλαιουχικό και λειτουργικό κόστος για να ανταγωνιστεί με άλλες καλλιέργειες και τις εναλλακτικές πηγές ενέργειας προκειμένου να διαδραματίσει κυρίαρχο ρόλο στο ενεργειακό μείγμα των μελλοντικών συστημάτων. Τα ιδανικά στελέχη για την παραγωγή βιοντίζελ με χρήση υγρών αποβλήτων θα πρέπει να οδηγούν σε υψηλές πυκνότητες βιομάζας, υψηλή περιεκτικότητα σε λιπίδια με περιορισμένες θρεπτικές απαιτήσεις και να είναι ανεκτικοί σε κάθε χημική παραλλαγή των λυμάτων. Ειδικά για καλλιέργειες μεγάλης 96

120 Εισαγωγή κλίμακας, θα πρέπει να υπομένουν τις περιβαλλοντικές αλλαγές (εντάσεις φωτός, θερμοκρασία, ph), καθώς και να επικρατούν στην καλλιέργεια, να έχουν δυνατότητα αυτόκροκίδωσης ή να έχουν άλλα χαρακτηριστικά που θα διευκολύνουν την διαδικασία συγκομιδής της βιομάζας. Συνήθως, η επιλογή των ειδών για την επεξεργασία υγρών αποβλήτων και την ακόλουθη παραγωγή βιοπροϊόντων κρίνεται από τους ρυθμούς απομάκρυνσης των θρεπτικών συστατικών, την παραγωγικότητα της βιομάζας και το λιπιδικό περιεχόμενο (Mallick, 2002; debashan and Bashan, 2010; Subashchandrabose et al., 2011). Το λιπιδικό περιεχόμενο αποτελεί σημαντική παράμετρο στην ανάπτυξη της τεχνολογίας βιοκαυσίμων, το οποίο μπορεί να τροποποιηθεί ανάλογα με τις εφαρμοζόμενες συνθήκες καλλιέργειας (Sharma et al., 2012). Αυτή η τροποποίηση στη σύνθεση των λιπαρών οξέων μπορεί να αντανακλά την προσαρμογή της καλλιέργειας στο αντίστοιχο θρεπτικό υπόστρωμα (Ummalyma and Sukumaran, 2014). Ως εκ τούτου, η ρύθμιση των συνθηκών καλλιέργειας, θα μπορούσε να θεωρηθεί μια στρατηγική για την επίτευξη του επιθυμητού λιπιδικού προφίλ για βιοκαύσιμα ή άλλες χημικές βιομηχανίες. Επιπλέον, η πρόοδος της γενετικής μηχανικής μπορεί να βελτιώσει την παραγωγή των λιπαρών οξέων προς υψηλής ακορεστότητας λιπαρά οξέα οδηγώντας στη επόμενη γενιά βιοντίζελ Βιοαιθανόλη Η βιοαιθανόλη (αιθυλική αλκοόλη) είναι ένα υγρό καύσιμο υψηλής ενεργειακής περιεκτικότητας, «καθαρότερο» περιβαλλοντικά από την βενζίνη. Παράγεται είτε από σακχαρούχα, κυτταρινούχα και αμυλούχα φυτά (π.χ. ζαχαροκάλαμο, ζαχαρότευτλα, καλαμπόκι, σόγια, σιτάρι, σόργο, πατάτα) είτε με εξελιγμένη τεχνολογία από βιομάζα (π.χ. βιομηχανικά παραπροϊόντα όπως μελάσα) (Hill et al., 2006; Sarris et al., 2014; Chen and Fu, 2016). Οι αμυλούχες και οι κυτταρινούχες πρώτες ύλες χρειάζονται υδρόλυση για να απελευθερώσουν τα ζυμώσιμα σάκχαρα και να χρησιμοποιηθούν ως υπόστρωμα παραγωγής αιθανόλης. Ωστόσο, οι σακχαρούχες γεωργικές πρώτες ύλες συνεπάγονται τη δέσμευση σημαντικών εκτάσεων γης που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για παραγωγή τροφίμων. Τα βήματα για την παραγωγή της βιοαιθανόλης περιλαμβάνουν την παραλαβή των περιεχόμενων ζυμώσιμων σακχάρων από τις πρώτες ύλες μέσω φυσικών, 97

121 Εισαγωγή χημικών ή φυσικοχημικών τεχνικών. Ακολουθεί αλκοολική ζύμωση για μετατροπή σακχάρων σε αιθανόλη η οποία ανακτάται μέσω της απόσταξης. Η αιθανόλη αναμιγνύεται με βενζίνη σε ποσοστά 1% έως 85% ενώ οι κύριοι τύποι μίγματος αιθανόληςβενζίνης που υπάρχουν στην αγορά για τις μεταφορές είναι ο Ε10 (10% αιθανόλη και 90% βενζίνη) και ο Ε85 (85% αιθανόλη και 15% βενζίνη). Η Ευρωπαϊκή νομοθεσία επιτρέπει την πώληση βενζίνης με αιθανόλη μέχρι 5% (Orchard et al., 2007). Με τη χρήση αιθανόλης στο μίγμα μειώνονται τα αέρια του μονοξειδίου και του διοξειδίου του άνθρακα καθώς και οι εκπομπές πτητικών οργανικών ενώσεων. Η καύσιμη βιοαιθανόλη επίσης, μειώνει τη χρήση ενεργειακών πόρων και το φαινόμενο της παγκόσμιας αύξησης της θερμοκρασίας (Von Blottnitz and Curran, 2007). Στη Βραζιλία είναι η κύρια παραγωγός βιοαιθανόλης, κυρίως από ζαχαροκάλαμο, ακολουθώντας την οι ΗΠΑ όπου χρησιμοποιούν ως πρώτη ύλη κυρίως αραβόσιτο. Στην Ελλάδα, μπορεί να παραχθεί από σιτηρά, αραβόσιτο, ζαχαρότευτλα και γλυκό σόργο. Αξίζει να συνοψίσουμε τα χαρακτηριστικά πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα της αιθανόλης έναντι των συμβατικών καυσίμων. Συγκεκριμένα, η αιθανόλη: είναι μη ορυκτό καύσιμο του οποίου η προέλευση και η καύση του δεν επιβαρύνει το φαινόμενο του θερμοκηπίου σε μίγμα βενζίνης με ποσοστό 10% μειώνει κατά 2530% και 610% τις εκπομπές CO και CO 2, αντίστοιχα οξυγονώνει το καύσιμο με αποτέλεσμα να μειώνονται κατά 7% οι εκπομπές πτητικών οργανικών ενώσεων δεν περιέχει θείο, προστατεύοντας τους καταλυτικούς μετατροπείς των οχημάτων έχει την ικανότητα να αυξάνει τον αριθμό των οκτανίων με μικρό κόστος αντικαθιστώντας άλλα επιβλαβή στοιχεία (όπως ο Pb) επιτυγχάνει καλύτερη απόδοση κινητήρα, λόγω υψηλότερης συμπίεσης και καθαρότερο σύστημα καύσης μειώνει τις απαιτήσεις των κρατών για ορυκτά καύσιμα σε περίπτωση διαρροής δεν προκαλεί αρνητικές επιπτώσεις στο περιβάλλον γιατί είναι μη τοξική, βιοαποικοδομήσιμη και διαλυτή στο νερό. Ωστόσο: 98

122 Εισαγωγή Η χρήση των πρώτων υλών για την παραγωγή της είναι συνήθως εδώδιμα προϊόντα Το ενεργειακό περιεχόμενο της αιθανόλης, ισοδυναμεί με τα 2/3 του αντίστοιχου της βενζίνης απαιτώντας μεγαλύτερες ποσότητες παραγωγής και Το κόστος παραγωγής της, σήμερα σε πολλές χώρες, είναι μεγαλύτερο σε σχέση με την βενζίνη. Η παραγωγή βιοαιθανόλης από μικροφύκη δεν είναι διαδεδομένη καθώς βρίσκεται σε ερευνητικό στάδιο και δεν έχει περάσει ακόμα σε εμπορικό επίπεδο. Ωστόσο, σε αντίθεση με την μέχρι τώρα χρησιμοποιούμενη πρώτη ύλη παραγωγής βιοαιθανόλης (λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα), ορισμένα μικροφύκη μπορούν να συσσωρεύουν μεγάλες ποσότητες υδατανθράκων (άμυλο, κυτταρίνη) σε δύσκολες περιβαλλοντικές συνθήκες (John et al., 2011). Για αυτό και υπάρχει αξιοσημείωτο ενδιαφέρον στη χρήση μικροφυκών ως μια εναλλακτική πηγή βιοαιθανόλης. Μάλιστα, είδη όπως τα Chlorella, Scenedesmus και Chlamydomonas έχουν αναφερθεί ότι συσσωρεύουν σημαντικές ποσότητες σακχάρων που φτάνουν πάνω από το 50% του ολικού ξηρού βάρους της βιομάζας τους (Harun and Danquah, 2011a; Ho et al., 2013b; Ho et al., 2013c). Επιπλέον, οι υδατάνθρακες που παράγονται από τα μικροφύκη είναι κυρίως άμυλο και κυτταρίνη, χωρίς λιγνίνη, τα οποία μετατρέπονται εύκολα σε απλά ζυμώσιμα σάκχαρα σε αντίθεση με την λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα. Για αυτό και αρκετοί ερευνητές δίνουν έμφαση στη χρήση μικροφυκών για παραγωγή βιοαιθανόλης (Wang et al., 2011b). Στην παραγωγή βιοαιθανόλης, οι διαδικασίες ποικίλουν ανάλογα με τον τύπο της βιομάζας και περιλαμβάνουν σακχαροποίηση, ζύμωση και ανάκτηση του προϊόντος. Η προεπεξεργασία της βιομάζας αποτελεί ένα κρίσιμο σημείο καθώς είναι σημαντικό για το σχηματισμό των σακχάρων που θα χρησιμοποιηθούν στην διαδικασία της ζύμωσης. Η όξινη υδρόλυση είναι ευρέως χρησιμοποιούμενη ως στάδιο προεπεξεργασίας καθώς είναι αποτελεσματική και έχει χαμηλή κατανάλωση ενέργειας (Harun and Danquah, 2011b). Άλλες τεχνικές προεπεξεργασίας περιλαμβάνουν την ενζυματική υδρόλυση, τη χρήση ακτινοβολίας ακόμα και υδρόλυση με χρήση μυκήτων ή συνδυασμό των παραπάνω (Schneider et al., 2012; Hernandez et al., 2015). Οι αποδόσεις βιοαιθανόλης ποικίλουν ανάλογα με τις συνθήκες που εφαρμόζονται αλλά και με το είδος των μικροοργανισμών που 99

123 Εισαγωγή χρησιμοποιείται. Για παράδειγμα, έχει καταγραφεί παραγωγή αιθανόλης 8% w/w υποστρώματος βιομάζας Spirogyra από τους Eshaq et al. (2010), 23.3 % w/w για είδη Chlorella vulgaris FSPE από τους Ho et al. (2013c) ενώ 38% w/w για είδη Chlorococcum από τους Harun et al. (2010). Για τα περισσότερα χρησιμοποιούμενα είδη οι αποδόσεις σε ξηρή βιομάζα μικροφυκών κυμαίνονται από 3 μέχρι και 52% w/w (g αιθανόλης/g μικροφυκών) (Harun and Danquah, 2011b; Harun et al., 2011; Miranda et al., 2012a; Markou et al., 2013) για αυτό και γίνονται ερευνητικές προσπάθειες βελτιστοποίησης των συνθηκών καλλιέργειας (ώστε να γίνεται συσσώρευση μεγαλύτερων ποσοτήτων υδατανθράκων) αλλά και των μεθόδων σακχαροποίησης και ζύμωσης (Miranda et al., 2012b; Karatay et al., 2016). Η χρησιμοποίηση της βιομάζας των μικροφυκών για παραγωγή βιοαιθανόλης είναι αναμφισβήτητα μια βιώσιμη και φιλική προς το περιβάλλον προσέγγιση για την παραγωγή βιοκαυσίμων. Υπάρχει ακόμα η δυνατότητα να καλλιεργηθούν τα μικροφύκη σε υπεράλμυρα ή αλμυρά νερά ακόμα και σε απόβλητα προς παραγωγή βιοαιθανόλης (Doan et al., 2012). Επίσης, στα σχέδια της ερευνητικής προσπάθειας είναι η χρήση τεχνικών γενετικής μηχανικής επιλεγμένων στελεχών για να ανταπεξέρχονται σε αντίξοες συνθήκες καθώς και η ανάπτυξη νέων βιοαντιδραστήρων για αποδοτική παραγωγή βιομάζας και ανάκτηση της βιοαιθανόλης έτσι ώστε να υπάρξει η δυνατότητα εμπορευματοποίησης της τεχνολογίας (John et al., 2011). 100

124 Εισαγωγή 1.5 Αντικείμενο της διδακτορικής διατριβής Τις τελευταίες δεκαετίες η χρήση των μικροφυκών ως πρώτη ύλη για την παραγωγή βιοκαυσίμων αναδεικνύεται όλο και περισσότερο εξαιτίας της συνεχώς αυξανόμενης ανάγκης για εναλλακτικές πηγές ενέργειας. Αν και η κύρια χρήση των μικροφυκών αρχικά στόχευε στην παραγωγή διατροφοδραστικών προϊόντων, η πολυμορφία και η δυνατότητές τους έστρεψαν το ενδιαφέρον στην παραγωγή βιοκαυσίμων. Στην προσπάθεια για κάλυψη των σημερινών ενεργειακών απαιτήσεων δημιουργήθηκε η ανάγκη για εύρεση διαφορετικών πηγών που θα προσφέρουν μια αειφόρα εναλλακτική λύση στο περιβαλλοντικό και ενεργειακό πρόβλημα. Παράλληλα, ο τομέας της αγροτοβιομηχανίας απελευθερώνει τεράστιες ποσότητες αποβλήτων, πλούσια σε θρεπτικά συστατικά, για τα οποία αναζητούνται οικονομικοί τρόποι επεξεργασίας που δεν θα επιβαρύνουν το περιβάλλον. Γι αυτό η δυνατότητα ανακύκλωσης των χρήσιμων συστατικών που περιέχονται στα λύματα με την ταυτόχρονη παραγωγή βιοκαυσίμων αποτελεί το κύριο μέλημα της ερευνητικής αυτής προσπάθειας. Στη διεθνή βιβλιογραφία έχει μελετηθεί εκτεταμένα η επεξεργασία αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων, με διάφορες φυσικοχημικές και βιολογικές μεθόδους, με την βιολογική να παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον λόγω του χαμηλού κόστους και την μη επιβάρυνση του περιβάλλοντος με περαιτέρω παραπροϊόντα. Βιβλιογραφική ανασκόπηση δείχνει ότι έχει πραγματοποιηθεί αρκετή μελέτη στη βιολογική επεξεργασία με χρήση μικροφυκών σε διάφορα συστήματα, ωστόσο όμως στα περισσότερα από αυτά γίνεται χρήση αμιγών καλλιεργειών μικροφυκών ή/και συνθετικών λυμάτων/ χημικών θρεπτικών υποστρωμάτων για παραγωγή βιοπροϊόντων και βιοκαυσίμων, χωρίς να έχουν τη δυνατότητα εφαρμογής σε μεγαλύτερη κλίμακα. Γι αυτό προτείνεται η χρήση εναλλακτικών, φθηνότερων υποστρωμάτων ανάπτυξης των μικροφυκών, όπως τα αστικά ή αγροτοβιομηχανικά απόβλητα με συγκεκριμένο εύρος αρχικών συγκεντρώσεων, προκειμένου να αποτελέσουν τη πηγή πρόσληψης όλων των απαραίτητων οργανικών και ανόργανων θρεπτικών συστατικών. Επίσης, προτείνεται η χρήση μεικτών καλλιεργειών που θα βοηθήσουν στην αποτελεσματικότερη απομάκρυνση των θρεπτικών συστατικών που υπάρχουν στο απόβλητουπόστρωμα, καθώς θα απορροφώνται/ αφομοιώνονται από μεγαλύτερη ομάδα μικροοργανισμών. Οι μεικτές καλλιέργειες μικροφυκών στις 101

125 Εισαγωγή οποίες συνυπάρχουν τα μικροφύκη με τους εκάστοτε μικροοργανισμούς του αποβλήτου (βακτήρια, μύκητες και πρωτόζωα) πλεονεκτεί επίσης και στο γεγονός ότι δεν απαιτούνται ασηπτικές συνθήκες, δίνοντας τη δυνατότητα εφαρμογής της μεθόδου και σε βιομηχανικής κλίμακας μονάδες. Ανασκόπηση της βιβλιογραφίας δείχνει ότι η χρήση τέτοιων μεικτών καλλιεργειών έχει μελετηθεί για επεξεργασία αστικών αποβλήτων, όχι όμως τόσο για αγροτοβιομηχανικά απόβλητα, καθώς η έρευνα επικεντρώνεται κυρίως σε απόβλητα προερχόμενα από γαλακτοκομικές και κτηνοτροφικές μονάδες (εκτροφής βοοειδών ή χοιροστασίων). Επίσης, οι περισσότερες από τις παραπάνω εργασίες επικεντρώνονται κυρίως στη διεργασία επεξεργασίας των αποβλήτων (αναφέροντας στοιχεία απομάκρυνσης οργανικού φορτίου και θρεπτικών συστατικών) χωρίς να κάνουν ιδιαίτερη αναφορά στην αξιοποίηση της παραγόμενης βιομάζας ως πρώτης ύλης για βιοκαύσιμα (βιοντίζελ και ακόμη περισσότερο για βιοαιθανόλη). Η παρούσα ερευνητική εργασία έρχεται να συμπληρώσει και να επεκτείνει το πεδίο μελέτης των βιολογικών μεθόδων επεξεργασίας αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων με χρήση μικροφυκών, εξετάζοντας ταυτόχρονα και τη δυνατότητα αξιοποίησης της παραγόμενης βιομάζας σε βιοκαύσιμα (βιοντίζελ αλλά και βιοαιθανόλη). Μελετήθηκαν διάφορα αγροτοβιομηχανικά απόβλητα όπως ο δευτερογενής ορρός γάλακτος, απόβλητα οινοποιείου, λύματα από μονάδα τυποποίησης σταφίδας καθώς και μείξη των δύο τελευταίων, ενώ εξετάστηκαν δύο διαφορετικά συστήματα επεξεργασίας, αιωρούμενης και προσκολλημένης ανάπτυξης. Να επισημανθεί πως η επεξεργασία των εν λόγω αποβλήτων με μικροφύκη έχει μελετηθεί ελάχιστα έως καθόλου, καθιστώντας την έρευνα στο αντικείμενο αυτό ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα. Συγκεκριμένα, ο ορρός γάλακτος από τυροκομικές μονάδες έχει εξεταστεί υπό ασηπτικές συνθήκες μόνο από τα στελέχη μικροφυκών των Scenedesmus obliquus, ενώ για τα απόβλητα οινοποιείου υπάρχει μόνο μια μελέτη στην οποία επίσης έχει χρησιμοποιηθεί συγκεκριμένη ομάδα μικροφυκών των Spirulina και Chlorella. Όσον αφορά στα απόβλητα σταφίδας και οινοποιείου έχουν δοκιμαστεί μόνο μαζί με προσθήκη τεχνητού χημικού υποστρώματος, υπό ασηπτικές συνθήκες, με επιλεγμένα στελέχη Botryococcus και Neochloris (χωρίς να γίνεται αναφορά στο ρυθμό παραγωγής βιομάζας). Επίσης, σε όλες τις παραπάνω αναφερόμενες μελέτες πραγματοποιήθηκαν πειράματα μόνο σε αντιδραστήρες αιωρούμενης ανάπτυξης μικρών λειτουργικών όγκων (μόλις μέχρι 250ml). 102

126 Εισαγωγή Στη βιολογική διεργασία επεξεργασίας των αποβλήτων τυροκομείου (δευτερογενής ορρός γάλακτος) της παρούσας διατριβής, αρχικά χρησιμοποιήθηκε καλλιέργεια μικροφυκών με κυρίαρχο στέλεχος, το χλωροφύκος Choricystis sp., η οποία προήλθε από τη μονάδα τριτοβάθμιας επεξεργασίας λυμάτων του Δήμου Αγρινίου. Να επισημανθεί ότι το είδος αυτό (Choricystis sp.), εξετάστηκε πρώτη φορά ως προς την ικανότητά του να επεξεργάζεται αγροτοβιομηχανικά απόβλητα. Στη συνέχεια, μελετήθηκε το κυανοβακτήριο Leptolyngbya sp. ως προς την ικανότητά του να απομακρύνει υπό μη ασηπτικές συνθήκες οργανικό φορτίο και θρεπτικά συστατικά από τα απόβλητα τυροκομείου, οινοποιείου, τυποποίησης σταφίδας και μεικτού αποβλήτου οινοποιείουσταφίδας, τόσο σε συστήματα αιωρούμενης όσο και σε προσκολλημένης ανάπτυξης. Τέλος, η παραγόμενη βιομάζα από όλα τα πειράματα εξετάστηκε ως προς την ποσότητα αλλά και την ποιότητα του συσσωρευμένου ελαίου της για την παραγωγή βιοντίζελ. Πιο συγκεκριμένα, στο πρώτο κεφάλαιο γίνεται ανασκόπηση της διεθνούς βιβλιογραφίας για την παρούσα κατάσταση στην επεξεργασία αποβλήτων με μικροφύκη, στις τεχνολογίες καλλιέργειας των μικροφυκών, στην εξέλιξη παραγωγής βιοκαυσίμων ανά τον κόσμο, καθώς και τη δυνατότητα παραγωγής βιοκαυσίμων από βιομάζα προερχόμενη από επεξεργασία αποβλήτων με μικροφύκη. Οι πειραματικές διατάξεις που χρησιμοποιήθηκαν για τη διεξαγωγή των πειραμάτων (αιωρούμενης και προσκολλημένης ανάπτυξης), η ανάπτυξη των μεικτών καλλιεργειών καθώς και οι αναλυτικές μέθοδοι προσδιορισμού των παραμέτρων περιγράφονται αναλυτικά στο δεύτερο κεφάλαιο. Στα επόμενα κεφάλαια τρίτο και τέταρτο παρουσιάζονται τα πειράματα που διεξήχθησαν για την επεξεργασία των αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων με τις μεικτές καλλιέργειες μικροφυκών (μεικτή καλλιέργεια Choricystis sp. και μεικτή καλλιέργεια Leptolyngbya sp.). Συγκεκριμένα, στο τρίτο κεφάλαιο παρατίθενται όλες οι σειρές πειραμάτων που διεξήχθησαν στους αντιδραστήρες αιωρούμενης ανάπτυξης υπό αερόβιες συνθήκες με την καλλιέργεια Choricystis sp. για την επεξεργασία ορρού γάλακτος καθώς και της καλλιέργειας Leptolyngbya sp. για την επεξεργασία ορρού γάλακτος, αποβλήτων οινοποιείου, αποβλήτων μονάδας σταφίδας καθώς και μεικτού λύματος οινοποιείουσταφίδας. Στη συνέχεια, τα ποσοστά απομάκρυνσης οργανικού φορτίου και θρεπτικών στοιχείων αζώτου/φωσφόρου που επετεύχθησαν καθώς και η παραγόμενη βιομάζα, συγκρίθηκαν με τη βιβλιογραφία. Επίσης, εξετάστηκε η 103

127 Εισαγωγή προοπτική χρησιμοποίησης της παραγόμενης βιομάζας, ως πρώτης ύλης για βιοντίζελ. Στο τέταρτο κεφάλαιο παρουσιάζονται όλες οι σειρές πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της μεικτής καλλιέργειας Leptolyngbya sp. για την επεξεργασία ορρού γάλακτος, αποβλήτων οινοποιείου καθώς και μεικτού λύματος οινοποιείουσταφίδας στους αντιδραστήρες προσκολλημένης ανάπτυξης. Εξετάστηκαν ομοίως οι αποδόσεις απομάκρυνσης οργανικών και ανόργανων συστατικών, η παραγωγή βιομάζας καθώς και η δυνατότητα αξιοποίησής της για βιοντίζελ. Στο επόμενο κεφάλαιο (πέμπτο κεφάλαιο), παρουσιάζονται πειράματα που έλαβαν χώρα με σκοπό τη χρήση της παραγόμενης βιομάζας (που προέκυψε από την επεξεργασία αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων με μεικτή καλλιέργεια Leptolyngbya sp.) για παραγωγή βιοαιθανόλης. Συγκεκριμένα, εξετάστηκαν διάφορες συνθήκες υδρόλυσης της βιομάζας προκειμένου να επιτευχθούν οι μέγιστες αποδόσεις έκλυσης σακχάρων, που στη συνέχεια μετά την αλκοολική ζύμωση τους με το στέλεχος Saccharomyces cerevisiae AXAZ1, θα οδηγήσουν στη μεγαλύτερη παραγωγή βιοαιθανόλης. Στο τελευταίο και έκτο κεφάλαιο, συζητούνται συνολικά τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης, παρατίθενται συνοπτικά τα προκύπτοντα συμπεράσματα και γίνονται προτάσεις για μελλοντική εργασία. 104

128 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 105

129 Μέθοδοι και υλικά 2. ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ 2.1 Εισαγωγή Στο κεφάλαιο αυτό περιγράφονται όλες οι πειραματικές διατάξεις και οι αναλυτικές μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν κατά την εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Στην εργασία αυτή πραγματοποιήθηκαν χημικοί προσδιορισμοί διαλυτού χημικά απαιτούμενου οξυγόνου (dcod), ολικού αζώτου, ορθοφωσφορικών, υδατανθράκων, ολικών αιωρούμενων στερεών και λιπαρών οξέων. Πραγματοποιήθηκαν επίσης μετρήσεις ph, θερμοκρασίας και διαλυτού οξυγόνου (DO). Οι ποσοτικοί προσδιορισμοί των ολικών στερεών καθώς και του ph και του DO γίνονταν σε δείγμα των συστημάτων χωρίς να έχουν υποστεί καμία διεργασία, ενώ οι υπόλοιπες παράμετροι των ανόργανων στοιχείων, των ολικών σακχάρων και του dcod γίνονταν στο διήθημα του υπερκείμενου της φυγοκέντρησης των δειγμάτων. Η φυγοκέντρηση γινόταν σε 4200 rpm για 20 λεπτά, ενώ η διήθηση πραγματοποιούνταν υπό κενό μέσω ηθμών PALL/GN6, διαμέτρου πόρων 0.45μm. Στην συνέχεια ακολουθεί σύντομη περιγραφή της κάθε μεθόδου χωριστά ενώ οι αναλυτικές τεχνικές παρουσιάζονται λεπτομερώς στο Παράρτημα. 2.2 Αύξηση μικροοργανισμών Αρχικά, συλλέχθηκε δείγμα αποβλήτων από αγροτοβιομηχανικές μονάδες (τυροκομείου, οινοποιείου) και από τη μονάδα τριτοβάθμιας επεξεργασίας λυμάτων του Δήμου Αγρινίου, τα οποία διηθήθηκαν για απομάκρυνση στερεών και ζωοπλαγκτού. Στη συνέχεια, τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε κωνικές φιάλες Erlenmeyer 0.25L για αυτότροφη αιωρούμενη ανάπτυξη με θρεπτικό υπόστρωμα 50ml, όπως περιγράφεται στον Πίνακα 2.1, εφαρμόζοντας σταθερές συνθήκες θερμοκρασίας 25±2 o C, συνεχούς φωτισμού (24h) από λαμπτήρες φθορισμού (200 μmolm 2 s 1, 2529 Wm 2 ) υπό συνεχή ανάδευση. Οι φιάλες με τα αγροτοβιομηχανικά απόβλητα παρουσίασαν δυσκολία στην ανάπτυξη επιθυμητών μικροοργανισμών ενώ στις φιάλες με τα αστικά λύματα αναπτύχθηκε ένας μεικτός αυτότροφος πληθυσμός 106

130 Μέθοδοι και υλικά μικροοργανισμών, ο οποίος μεταφέρθηκε στη συνέχεια σε γυάλινες δεξαμενές (ενυδρεία) όγκου 510L (Ενότητα 2.3) με σύσταση των θρεπτικών αλάτων του Πίνακα 2.1 και εφαρμόστηκαν οι ίδιες παραπάνω σταθερές συνθήκες με ανάδευση από φυγοκεντρικές μινιαντλίες (ρυθμός ροής L h 1 ). Η αυτότροφη καλλιέργεια ταυτοποιήθηκε προς αναγνώριση των επικρατούντων μικροοργανισμών. Η αρχική ανάλυση της καλλιέργειας ανέδειξε ως επικρατών το χλωροφύκος Choricystis sp. (με 99% αφθονία) με το οποίο διεξήχθησαν τα πειράματα της Ενότητας 3.2, ενώ με το πέρασμα του χρόνου η δυναμικότητα της καλλιέργειας ανέδειξε ως επικρατών το κυανοβακτήριο Leptolyngbya sp. (με 95% αφθονία) με το οποίο διεξήχθησαν όλα τα υπόλοιπα πειράματα των Ενοτήτων 3, 4 και 5 (Εικόνα 2.1). Η αυτότροφη καλλιέργεια στο ενυδρείο ανανεώνονταν κρατώντας 1020ml της αυτότροφης προκαλλιέργειας και προσθήκης θρεπτικών αλάτων συγκέντρωσης ίδιας του Πίνακα 2.1, με ατμοσφαιρικό CO 2. Το ph ρυθμίζονταν σε 7.5±1 με κατάλληλη ποσότητα αντιδραστηρίων NaOH ή HCl (1N). Πίνακας 2.1: Θρεπτικά μεταλλικά συστατικά για την συντήρηση των αυτότροφων καλλιεργειών (Wang et al., 2010; Economou et al., 2015) Θρεπτικά συστατικά Συγκέντρωση (mgl 1 ) KNO MgSO 4.7H 2 O 100 CaCl 2.2H 2 O 50 K 2 HPO KH 2 PO 4 56 Η αυτότροφη καλλιέργεια διατηρούνταν υπό μηασηπτικές συνθήκες καθώς η παρουσία βακτηρίων όχι μόνο δεν επηρέαζε αρνητικά την αύξηση των μικροφυκών αλλά είχε τη δυνατότητα να απαλλάσσει το περιβάλλον από μεταβολικά προϊόντα που μπορούσαν τυχόν να δράσουν ανασταλτικά στην ανάπτυξη (Danger et al., 2007). 107

131 Μέθοδοι και υλικά Εικόνα 2.1: Φωτογραφίες οπτικού μικροσκοπίου με τα στελέχη των μικροοργανισμών από τις καλλιέργειες που χρησιμοποιήθηκαν στη παρούσα μελέτη. Ωοειδή κύτταρα Choricystis sp. (αριστερά) (x400) και συσσωμάτωμα νηματοειδούς κυανοβακτηρίου Leptolyngbya sp. (νήματα στα μαύρα βέλη) (x200) (δεξιά) Περιγραφή του χλωροφύκους Choricystis sp. Το χλωροφύκος ανήκει στην κατηγορία χλωρόφυτα, της κλάσης Trebouxiophyceae (παλαιότερα καταταγμένα ChlorococcalesChlorophyceae) που συχνά συγχέονται με το στενό συγγενή του Nannochloris (παλαιότερα καταταγμένα UlothrichalesUlvophyceae) ενώ έχουν επίσης παρόμοια μορφολογία με το στενό συγγενή τους Chlorella (Krienitz et al., 1996). Τα χλωροφύκη χαρακτηρίζονται από την παρουσία χλωροφυλλών α και β. Περιέχουν επίσης διάφορες άλλες χρωστικές, όπως καροτένια, ξανθοφύλλες κ.ά. Τα κύτταρά τους, που μπορεί να είναι πολυπύρηνα ή μονοπύρηνα, περιέχουν χλωροπλάστες όπου στα διαφορετικά είδη παρουσιάζουν διαφορετική μορφή (δισκοειδής, πλακοειδής, δικτυωτή κ.α.) καθώς και πυρηνοειδή. Τα χλωροφύκη μπορεί να είναι μονοκύτταρα ή πολυκύτταρα. Είναι γνωστά περισσότερα από 400 γένη και είδη. Τα περισσότερα από αυτά ζουν στα γλυκά νερά και σε υγρές τοποθεσίες (βράχους και φλοιούς δέντρων), ενώ μόνο ένα ποσοστό γύρω στο 10% συναντάται στη θάλασσα. Κάποια είδη των Choricystis sp. είναι πικοπλαγκτονικά γλυκού νερού, βρίσκονται σε όλο τον κόσμο και είναι ιδιαίτερα συχνά σε λίμνες φτωχές σε θρεπτικά στοιχεία. Σε φυσικούς οικοτόπους, παρουσιάζουν συνήθως καλή ανοχή σε αλλαγές στο ph, τη θερμοκρασία και το διατροφικό περιεχόμενο του νερού. Οι βέλτιστες 108

132 Μέθοδοι και υλικά θερμοκρασίες για την ανάπτυξη των Choricystis sp. που έχουν παρατηρηθεί είναι μεταξύ 2530 ο C. Δεν υπάρχουν επαρκή δεδομένα για τη καλλιέργεια αυτού του μικροφύκους σε φωτοβιοαντιδραστήρες, για την παραγωγικότητα του ελαίου του, για τα βιοχημικά χαρακτηριστικά των λιπιδίων του, και για το πώς η παραγωγή των λιπιδίων του μπορεί να ανταποκριθεί στις συνθήκες καλλιέργειας. Ενδεικτικά, η καλλιέργειά του σε χημικό θρεπτικό υλικό (BG11), παρουσίασε ειδικό ρυθμό ανάπτυξης περίπου d 1 ενώ σημείωσε μέγιστες τιμές παραγωγικότητας βιομάζας και λιπιδίων τα 351 mg (L d) 1 και τα 82 mg (L d) 1, αντίστοιχα (Sobczuk and Chisti, 2010). Το μικροφύκος παρουσίασε τέσσερις φορές υψηλότερη παραγωγικότητα λιπιδίων από εκείνη του φοινικέλαιου, καθιστώντας το ένα δυνητικά ελκυστικό είδος για την παραγωγή λιπιδίων και τη μετατροπή τους σε υγρά καύσιμα μεταφορών Περιγραφή του κυανοβακτηρίου Leptolyngbya sp. Τα κυανοβακτήρια είναι μια μεγάλη και μορφολογικά ετερογενής ομάδα φωτοτροφικών βακτηρίων. Το κυανοβακτήριο Leptolyngbya sp. ανήκει στην τάξη των Oscillatoriales. Το Leptolyngbya sp. ευδοκιμεί σε ασβεστολιθικά και ανθρακικά πετρώματα, σε μαρμάρινα μνημεία, σε ασβεστολιθικά σπήλαια (Albertano et al., 2000) ενώ σε υδάτινα μέσα ευδοκιμεί σε γλυκό και θαλασσινό νερό, σε θερμές και ιαματικές πηγές αλλά και σε βραχώδεις επιφάνειες. Τα κύτταρα του Leptolyngbya sp. έχουν μέγεθος που κυμαίνεται από 0.5 έως 3.2μm και ζουν αυτοτελή ή σχηματίζουν συστάδες ή στρώματα. Το Leptolyngbya έχει περιγραφεί ως νηματοειδές, μιξότροφο κυανοβακτήριο με εκθετική αύξηση από την 6η έως την 15η ημέρα (Khemka and Saraf, 2015). Τα περισσότερα είδη των κυανοβακτηρίων παρουσιάζουν ανοχή σε υψηλά επίπεδα pη και σε υψηλή συγκέντρωση αλατότητας. Αναπτύσσεται δυναμικά σε θερμοκρασιακό εύρος από 20 έως 45 ο C με βέλτιστη θερμοκρασία τους 30 ο C. Ακόμη, μπορεί να αναπτυχθεί σε ph 7 έως 11 (αλκαλόφιλο είδος). Επίσης, όταν καλλιεργείται σε κλειστούς αντιδραστήρες τα κύτταρα του σχηματίζουν συστάδες και προσκολλώνται στα τοιχώματα. Ως εκ τούτου, το Leptolyngbya sp. είναι ένα ευέλικτο στέλεχος που μπορεί να αναπτύσσεται κάτω από διαφορετικές συνθήκες θρεπτικών ουσιών, θερμοκρασίας, pη και αλατότητας και ταυτόχρονα να γίνεται εύκολα η συγκομιδή του ώστε νε είναι κατάλληλο για εμπορική εκμετάλλευση. Τα 109

133 Μέθοδοι και υλικά Leptolyngbya sp. έχουν διερευνηθεί για πιθανή χρήση τους στην ανακύκλωση CO 2 και παραγωγής βιοντίζελ σε τεχνολογίες επεξεργασίας αστικών λυμάτων (Beetul et al., 2014; Singh et al., 2014; Singh and Thakur, 2015) αλλά μέχρι τώρα όχι σε πολλά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα. Η παραγωγικότητα βιομάζας που έχει παρατηρηθεί για αυτό το στέλεχος με χρήση τεχνητού θρεπτικού μέσου είναι 79.8 mg (L d) 1 ενώ η συνολική περιεκτικότητα λιπιδίων επί της ξηρής βιομάζας κυμαίνεται στο % (Beetul et al., 2014; Singh et al., 2014; Singh and Thakur, 2015). Ωστόσο, αποτελούν έναν ιδανικό υποψήφιο για παραγωγή βιομάζας κατά την διάρκεια της επεξεργασίας αποβλήτων, καθώς μπορούν να φτάσουν σε παραγωγικότητα 480 mg (L d) 1 με την βιομάζα τους να χρησιμοποιείται περαιτέρω ως πρώτη ύλη βιοκαυσίμων (Maity et al., 2014). 2.3 Πειραματικές διατάξεις Τόσο για τη συντήρηση της αυτότροφης καλλιέργειας όσο και για τα πειράματα αιωρούμενης ανάπτυξης χρησιμοποιήθηκαν φωτοβιοαντιδραστήρες, διαλείπουσας λειτουργίας (batch), από διαφανές γυαλί, τύπου ανοιχτής δεξαμενής (open pond) ενεργού όγκου 3.5L και 6L (ολικού όγκου 5 L και 10 L, αντίστοιχα) (Εικόνα 2.2 και 2.3). Οι βιοαντιδραστήρες ήταν ενυδρεία διαστάσεων: μήκος 29.5cm, πλάτος 11 cm, ύψος 15 cm (όγκου 5 L) και μήκος 30 cm, πλάτος 19.6 cm, ύψος 20 cm (όγκου 10 L). Οι φωτοβιοαντιδραστήρες ήταν τοποθετημένοι σε χώρο θερμοκρασίας 27±2 o C και η συνεχής ανάδευση γινόταν με κυκλοφορητή, ρυθμού ροής L h 1. Ο ρυθμός ροής για τα προσκολλημένα συστήματα ανάπτυξης προσαρμόστηκε στις συγκεκριμένες πειραματικές σειρές στα 50 L h 1 ώστε να διευκολυνθεί η προσκόλληση των κυττάρων στις ράβδους και στα τοιχώματα του βιοαντιδραστήρα. Ο φωτισμός με λευκές λάμπες, έντασης 200 μmol m 2 s 1, ήταν συνεχής, κατάλληλος για ανάπτυξη μικροφυκών (Tang et al., 2011; Zamalloa et al., 2013) και παρεχόταν από απόσταση περίπου 25 cm μακριά από την επιφάνεια των δοχείων. Διαφανές γυαλί πάχους 5 mm τοποθετούνταν στην επιφάνεια της δεξαμενής ώστε να ελαχιστοποιηθεί η εξάτμιση του θρεπτικού υλικού αλλά και να περιοριστούν πιθανές εισβολές από θηρευτές. 110

134 Μέθοδοι και υλικά Εικόνα 2.2: Συντήρηση σε γυάλινα ενυδρεία των αυτότροφων μεικτών καλλιεργειών Choricystis sp. (αριστερά) και Leptolyngbya sp. (δεξιά). Τα πειράματα προσκολλημένης ανάπτυξης πραγματοποιήθηκαν στους ίδιους φωτοβιοαντιδραστήρες με τα αιωρούμενης ανάπτυξης συστήματα με τη διαφορά ότι είχαν τοποθετηθεί 36 κυλινδρικοί γυάλινοι ράβδοι (Εικόνα 2.3). Ο ρόλος των ράβδων στους αντιδραστήρες επιτρέπει την ανάπτυξη και την προσκόλληση των μικροοργανισμών σε μεγαλύτερη επιφάνεια. Κάθε ράβδος είχε διάμετρο 0.5 cm και εμβαδό επιφάνειας cm 2 (συνολική επιφάνεια ράβδων στο ενυδρείο 685 cm 2 ), ώστε να παρέχεται σημαντική επιφάνεια για προσκολλημένη ανάπτυξη βιομάζας. Παράλληλα, τα διαφανή γυαλιά παρείχαν διαπερατότητα στο φως, κατά μήκος όλου του βιοαντιδραστήρα για να επιτυγχάνεται η φωτοαυτότροφη ανάπτυξη. Οι ράβδοι συγκρατούνταν σε κάθετη στάση με υποστήριξη ενός μεταλλικού πλέγματος τοποθετημένου στην κορυφή των ενυδρείων. Αυτή η διάταξη επέτρεπε την εύκολη απομάκρυνση κάθε ράβδου αλλά και την επακόλουθη συγκομιδή της βιομάζας. Η διαφορετική διάταξη των δύο αερόβιων συστημάτων για τους φωτοβιοαντιδραστήρες που χρησιμοποιήθηκαν παρουσιάζεται στην Εικόνα 2.3. Εικόνα 2.3: Διάταξη συστήματος για αιωρούμενη (αριστερά) και προσκολλημένη (δεξιά) ανάπτυξη μικροοργανισμών (Economou et al., 2015). 111

135 Μέθοδοι και υλικά 2.4 Περιγραφή πειραμάτων αλκοολικής ζύμωσης Η ξηρή βιομάζα με το τέλος των πειραμάτων συλλέγονταν, ξηραίνονταν και υδρολύονταν ώστε να προκύψει ένα υγρό διάλυμα ως υπόστρωμα αλκοολικής ζύμωσης για παραγωγή βιοαιθανόλης. Για τις ανάγκες των αλκοολικών ζυμώσεων, χρησιμοποιήθηκαν στελέχη του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae AXAZ1 από τη συλλογή του Εργαστηρίου Μικροβιολογίας του Τμήματος Βιολογίας (Εικόνα 2.4) τα οποία διατηρούνταν σε κεκλιμένους σωλήνες καλλιέργειας επί θρεπτικού υλικού PDA (Potato Dextose Agar) σε θερμοκρασία 7±1 ο C (Hitachi Minus Zero Cooling) και ανανεώνονταν κάθε μήνα. Στη συνέχεια, καλλιεργούνταν σε κωνικές φιάλες Erlenmeyer των 250 ml, με όγκο θρεπτικού υλικού 50 ml. Ως θρεπτικό υλικό χρησιμοποιήθηκε PDB (Potato Dextrose Broth) το οποίο εμπλουτίστηκε με ανόργανες πηγές θειικού αμμωνίου ((NH 4 ) 2 SO 4, 0.5 g L 1 ) και όξινου φωσφορικού καλίου (HK 2 PO 4, 1 g L 1 ). Ο εμβολιασμός των φιαλών πραγματοποιήθηκε υπό ασηπτικές συνθήκες, σε θάλαμο γραμμικής ροής (MINIFLO) (Εικόνα 2.4). Το εμβόλιο ήταν 1 ml, 48ωρης προκαλλιέργειας, για τη ζύμη Saccharomyces cerevisiae, το οποίο ελέγχονταν με μικροσκοπικό παρασκεύασμα για επιμολύνσεις. Η μέτρηση της συγκέντρωσης των κυττάρων πραγματοποιούνταν σε αιμοκυτταρόμετρο τύπου Neubauer (PolyOptic) όπου και μετρήθηκε η αρχική συγκέντρωση μέσου όρου 11.67x10 7 κύτταρα ml 1. Εικόνα 2.4: Φωτογραφία οπτικού μικροσκοπίου με αναπτυσσόμενες υφές της ζύμης Saccharomyces cerevisiae (αριστερά) και καλλιέργεια του ζυμομύκητα σε κωνικές φιάλες (δεξιά). 112

136 Μέθοδοι και υλικά 2.5 Χημικές αναλύσεις και προσδιορισμοί συστατικών Ποσοτικός προσδιορισμός COD Ως χημικά απαιτούμενο οξυγόνο (COD) ορίζεται η ισοδύναμη ποσότητα οξυγόνου που απαιτείται για την οξείδωση των συστατικών ενός δείγματος από ισχυρά οξειδωτικό μέσο. Ο προσδιορισμός του COD βασίζεται στο γεγονός ότι όλες οι οργανικές ενώσεις, με ελάχιστες εξαιρέσεις μπορούν να οξειδωθούν από ισχυρά οξειδωτικά. Η οξείδωση του οργανικού υλικού ενός διαλύματος, γίνεται από περίσσεια διχρωμικού καλίου (Κ 2 Cr 2 O 7 ) με θέρμανση σε ισχυρά όξινες συνθήκες. Ως καταλύτης χρησιμοποιείται θειικός άργυρος (Ag 2 SO 4 ). Για την αποφυγή της δέσμευσης των ιόντων αργύρου από χλωριούχα, βρωμιούχα και ιωδιούχα ιόντα, τα οποία συνήθως υπάρχουν στα απόβλητα, γίνεται προσθήκη ιόντων υδραργύρου, με τη μορφή θειικού υδραργύρου (HgSO 4 ), τα οποία συμπλοκοποιούνται με τα ιόντα αλογόνων, οδηγώντας σε ίζημα. Ο προσδιορισμός του χημικά απαιτούμενου οξυγόνου, πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται στο Standard Methods for the Εxamination of Water and Wastewater (APHA, 1998) με φωτομέτρηση στα 600nm των ιόντων Cr 3+ που προκύπτουν από την οξείδωση του οργανικού υλικού (Εικόνα 2.5), εκφρασμένα σε mg O 2 /L. Η αναλυτική διεργασία της μεθόδου παρατίθεται στο Παράρτημα. Εικόνα 2.5: Μονάδα χώνευσης (αριστερά) και φασματοφωτόμετρο (δεξιά) για τον προσδιορισμό του COD Ποσοτικός προσδιορισμός νιτρικού αζώτου 113

137 Μέθοδοι και υλικά Το άζωτο αποτελεί το κύριο θρεπτικό συστατικό για την αύξηση της βιομάζας των μικροοργανισμών και κατά συνέπεια την παραγωγή λιπιδίων στα κύτταρά τους. Ως εκ τούτου, στη διάρκεια όλων των πειραμάτων πραγματοποιούνταν καθημερινές αναλύσεις για τον προσδιορισμό των νιτρικών και των νιτρωδών αλάτων. Τα υγρά δείγματα χρησιμοποιούνταν μετά από διήθηση με φίλτρα 0.45μm. Αρχικά, τα δείγματα φυγοκεντρούνταν (φυγόκεντρο ΝF 800) (4200 στροφές, 20 ), ώστε να διαχωριστεί πλήρως η βιομάζα. Στη συνέχεια, το υπερκείμενο υγρό διηθούνταν και με κατάλληλη αραίωση προσδιορίζονταν φασματοφωτομετρικά η συγκέντρωση των νιτρικών σε μήκος κύματος 220nm (Boeco S22 UV/Vis, Germany). Για τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων του νιτρικού αζώτου ήταν απαραίτητη η κατασκευή πρότυπης καμπύλης βαθμονόμησης, όπου χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος 4500NO 3 Β σύμφωνα με το Standards Methods for the examination of Water and Wastewater (APHA, 1998) η οποία δίνεται στο Παράρτημα Ποσοτικός προσδιορισμός νιτρώδους αζώτου Πέρα από την μέτρηση των νιτρικών απαραίτητος ήταν ο προσδιορισμός των παραγόμενων νιτρωδών. Μετά από φυγοκέντρηση, συλλογή του υπερκείμενου υγρού και διήθηση (0.45μm) πραγματοποιούνταν η κατάλληλη αραίωση στα δείγματα για τον φασματοφωτομετρικό προσδιορισμό των νιτρωδών αλάτων. Σε κάθε δείγμα όγκου 25ml προσθέτονταν 1ml διαλύματος Color reagent (βλ. Παράρτημα) και τα δείγματα φωτομετρούνταν σε μήκος κύματος 543 nm (Εικόνα 2.6). Για τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων του νιτρώδους αζώτου ήταν απαραίτητη η κατασκευή πρότυπης καμπύλης βαθμονόμησης, σύμφωνα με το Standards Methods for the examination of Water and Waste Water (APHA, 1998) (βλ. Παράρτημα). Εικόνα 2.6: Η εμφάνιση ροζ χρώματος υποδεικνύει την παρουσία νιτρωδών Ποσοτικός προσδιορισμός ολικού αζώτου κατά Kjeldahl 114

138 Μέθοδοι και υλικά Ο προσδιορισμός του ολικού αζώτου (οργανικού αζώτου και αμμωνίας) έγινε κατά Kjeldahl (Total Kjeldahl Nitrogen, TKN) σύμφωνα με τη μέθοδο της απόσταξης, όπως περιγράφεται στο Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, (1995) και εκφράζει το άθροισμα του οργανικού και του αμμωνιακού αζώτου ενός δείγματος. ΤΚΝ = (οργανικό άζωτο) + NΗ 4 N (αμμωνιακό άζωτο) Επομένως, TN (ολικό άζωτο) = TKN + NO 3 N + NO 2 N Η βασική αρχή προσδιορισμού είναι η εξής: παρουσία θειικού οξέος (H 2 SO 4 ), θειικού καλίου (K 2 SO 4 ), θειικού υδραργύρου (HgSO 4 ) και κάτω από θερμοκρασία βρασμού του θειικού οξέος (340 o C), το οργανικό άζωτο και η ελεύθερη αμμωνία μετατρέπονται σε αμμωνιακό άλας (NH 4 HSO 4 ), αφού προηγηθεί χώνευση του οργανικού υλικού. Ως παράδειγμα της αντίδρασης που λαμβάνει χώρα είναι η οξείδωση της αλανίνης όπως περιγράφεται από την παρακάτω εξίσωση (Sawyer and CARTY, 1994): CH 3 CHNH 2 COOH + 7H 2 SO 4 3CO 2 + 6SO 2 + 8H 2 O + NH 4 HSO 4 Με το τέλος της χώνευσης προσθέτονταν αντιδραστήριο υδροξειδίου του νατρίου για την ανύψωση της τιμής του ph και ακολουθούσε απόσταξη (Εικόνα 2.7). Η αποσταχθείσα αμμωνία κατακρατούνταν από διάλυμα βορικού οξέος και δείκτη. Η ποσότητα της αμμωνίας προσδιοριζόταν με τιτλοδότηση με πρότυπο διάλυμα υδροχλωρικού οξέος 0.1Ν στο κάθε δείγμα. Πιο αναλυτικά, παρατίθεται η διαδικασία στο Παράρτημα. Εικόνα 2.7: Μονάδα χώνευσης (αριστερά) και μονάδα απόσταξης Kjeldahl (δεξιά) 115

139 2.5.5 Ποσοτικός προσδιορισμός ολικού φωσφόρου Μέθοδοι και υλικά Ο φώσφορος απαντάται είτε με τη μορφή ορθοφωσφορικών ιόντων (PO 3 4, HPO 2 4, H 2 PO 4 ), είτε πολυφωσφορικών ιόντων [(PO 3 ) 3 6, (P 3 O 10 ) 5, (P 2 O 7 ) 4 ] είτε εμπεριέχεται σε οργανικές ενώσεις. Όλες οι οργανικές και ανόργανες μορφές φωσφόρου οξειδώνονται σε ορθοφωσφορικά ιόντα κάτω από τον βρασμό των δειγμάτων με την προσθήκη θειικού οξέος και υπερθεϊικού καλίου (K 2 S 2 O 8 ). Για την προσδιορισμό τη συγκέντρωσης του ολικού φωσφόρου σε ένα δείγμα πρέπει να προηγηθεί μετατροπή όλων των μορφών σε ορθοφωσφορικά ιόντα. Για την μετατροπή των πολυφωσφορικών ιόντων αρκεί η υδρόλυση τους σε όξινες συνθήκες και θερμοκρασία 100 o C. Η μετατροπή του οργανικού φωσφόρου σε ορθοφωσφορικά ιόντα απαιτεί χώνευση του οργανικού υλικού. Η μέθοδος χώνευσης βασίστηκε στις οξειδωτικές ιδιότητες των υπερθειϊκών ιόντων και έγινε σύμφωνα με τις οδηγίες του Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, (1995). Αναλυτικά παρατίθεται στο Παράρτημα Ποσοτικός προσδιορισμός ορθοφωσφορικών Ο προσδιορισμός των ορθοφωσφορικών ιόντων έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο του ασκορβικού οξέος (Apha (1995)).Το μολυβδαινικό αμμώνιο [(NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 ] και το τρυγικό αντιμονιακό κάλιο [K(SbO)C 4 H 4 O 6 1/2H 2 O] αντιδρούν κάτω από όξινες συνθήκες με τα ορθοφωσφορικά ιόντα σχηματίζοντας φωσφομολυβδαινικό οξύ [(NH 4 ) 3 PO 4 12MoO 3 ], το οποίο ανάγεται από το ασκορβικό οξύ, παράγοντας μία έγχρωμη ένωση ( molybdenum blue ) με μέγιστο απορρόφησης τα 880nm. Η ένταση του μπλε χρώματος είναι ανάλογη της συγκέντρωση του φωσφόρου. Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης των ορθοφωσφορικών ιόντων και συνεπώς και της συγκέντρωσης του ολικού φωσφόρου γινόταν με καμπύλη βαθμονόμησης η οποία προέκυπτε από απορροφήσεις πρότυπων διαλυμάτων δισόξινου φωσφορικού καλίου (KH 2 PO 4 ). Η αναλυτική διεργασία της μεθόδου παρατίθεται στο Παράρτημα Προσδιορισμός ph 116

140 Μέθοδοι και υλικά Η ενεργός οξύτητα (pη), είναι μία καθοριστική ιδιότητα των υδατικών διαλυμάτων και κατ επέκταση μία σημαντική παράμετρος του ελέγχου των υγρών αποβλήτων. Η μέτρηση του pη γινόταν με την χρήση πεχαμέτρου τoυ οίκου Hanna (ΗΙ 2211) Ποσοτικός προσδιορισμός ολικών σακχάρων Τα σάκχαρα διακρίνονται σε μονοσακχαρίτες, ολιγοσακχαρίτες και πολυσακχαρίτες. Οι μονοσακχαρίτες είναι χημικές ενώσεις άχρωμες, διαλυτές στο νερό που δεν μπορούν να υδρολυθούν σε απλούστερα σάκχαρα. Στους μονοσακχαρίτες που είναι και ανάγοντα σάκχαρα ανήκουν η γλυκόζη, η γαλακτόζη, η φρουκτόζη και η μαννόζη. Οι ολιγοσακχαρίτες περιέχουν 28 μονάδες μονοσακχαριτών. Οι πλέον κοινοί είναι οι δισακχαρίτες όπως σακχαρόζη και λακτόζη. Οι ολιγοσακχαρίτες και οι αφομοιώσιμοι πολυσακχαρίτες υδρολύονται ενζυμικώς σε όξινο περιβάλλον. Οι πολυσακχαρίτες είναι μεγαλύτερα μόρια με πολλές μονάδες μονοσακχαριτών που ενώνονται μεταξύ τους σχηματίζοντας ευθείες η διακλαδισμένες αλυσίδες. Οι πολυσακχαρίτες αποβάλλονται από τα κύτταρα φωτοσυνθετικών οργανισμών στο υγρό μέσο καλλιέργειάς τους κατά τη διαδικασία της φωτοσύνθεσης. Για το λόγο αυτό κρίθηκε απαραίτητος ο προσδιορισμός τους κατά τη διάρκεια των πειραμάτων, καθώς η μείωση της συγκέντρωσής τους από το μέσο καλλιέργειας υποδηλώνει την ύπαρξη βακτηρίων (Hulatt and Thomas, 2010). Επίσης, τα ολικά σάκχαρα προσδιορίστηκαν και στην αρχή κάθε αλκοολικής ζύμωσης προκειμένου να εξεταστεί εάν η συγκέντρωσή τους είναι επαρκής για να πραγματοποιηθεί ικανοποιητικά η διαδικασία. Σε ισχυρά όξινο περιβάλλον υπό θέρμανση, η υδρόλυση είναι πλήρης και τα προϊόντα που προκύπτουν, δηλαδή οι μονοσακχαρίτες, μετατρέπονται με ενδομοριακή συμπύκνωση σε φουρανικά παράγωγα. Τα τελευταία αντιδρούν με φαινολικές ενώσεις προς έγχρωμα προϊόντα (πορτοκαλί κίτρινο χρώμα). Η αντίδραση είναι ευαίσθητη και το χρώμα είναι σταθερό. Αυτή η ιδιότητα των μονοσακχαριτών επιτρέπει τον προσδιορισμό όλων των αφομοιώσιμων υδατανθράκων με χρωματομετρικές μεθόδους. Στην παρούσα εργασία ο προσδιορισμός των πολυσακχαριτών πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη χρωματομετρική μέθοδο των DuBois et al. (1956) και ήταν απαραίτητη η κατασκευή 117

141 Μέθοδοι και υλικά πρότυπης καμπύλης βαθμονόμησης (βλ. Παράρτημα). Η οπτική απορρόφηση για τα δείγματα μετρήθηκε σε φασματοφωτόμετρο (Thermoscientific, Genesys 10S UVVis) με μήκος κύματος 490nm. Αναλυτικά, η μέθοδος παρατίθεται στο Παράρτημα Ποσοτικός προσδιορισμός αναγόντων σακχάρων Ο προσδιορισμός των αναγόντων σακχάρων πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο DNS (Miller, 1959), η οποία ανιχνεύει το σύνολο των αναγόντων σακχάρων (μονοσακχαρίτες) σε ένα δείγμα. Η προσθήκη διαλύματος DNS γινόταν για να προαχθεί η αναγωγική δράση των σακχάρων στο αλκαλικό περιβάλλον. Η μέθοδος είναι χρωματομετρική και στηρίζεται στην αναγωγή του 3.5 δινιτροσαλικυλικού οξέος προς 3αμινο 5 νιτροσαλικυλικό οξύ, παρουσία NaOH και την ταυτόχρονη οξείδωση της γλυκόζης προς γλυκονικό οξύ. Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης των αναγόντων σακχάρων δινόταν από πρότυπη καμπύλη συγκέντρωσης που εκφραζόταν σε ισοδύναμα γλυκόζης έναντι απορρόφησης σε μήκος κύματος 540nm (βλ. Παράρτημα) Ποσοτικός προσδιορισμός βιομάζας Ο προσδιορισμός της βιομάζας, δηλαδή το σύνολο των αυτότροφων και ετερότροφων μικροοργανισμών, πραγματοποιούνταν με μέτρηση του ξηρού βάρους όπου τα δείγματα συγκεκριμένου όγκου καλλιέργειας κατακρημνίζονταν με φυγοκέντρηση. Το υπερκείμενο συλλέγονταν για περαιτέρω αναλύσεις ενώ το ίζημα μεταφερόταν σε προζυγισμένο φιαλίδιο τύπου McCartney. Η βιομάζα αφήνονταν για ξήρανση στους 105 ο C (συνήθως για 24 ώρες) μέχρι να σταθεροποιηθεί το βάρος και στη συνέχεια επαναζυγίζονταν σε ζυγό ακριβείας ώστε να βρεθεί η τελική ποσότητα βιομάζας από την διαφορά των τιμών εκφρασμένη σε mg L 1 (Μέθοδος Ολικών Αιωρούμενων ΣτερεώνTSS) (APHA, 1998). Έμμεσος προσδιορισμός της νωπής αυτότροφης βιομάζας πραγματοποιούνταν με εκτίμηση της οπτικής πυκνότητας (OD) της καλλιέργειας σε μήκος κύματος 650 nm και 680 nm (όπου είχε προηγουμένως βρεθεί ότι παρατηρείται η μέγιστη απορρόφηση), ώστε να εκτιμηθεί η φάση ανάπτυξης από την τιμή της συγκέντρωσης 118

142 Μέθοδοι και υλικά της βιομάζας στο βιοαντιδραστήρα. Η συγκέντρωση της βιομάζας προσδιοριζόταν με τη βοήθεια καμπύλης αναφοράς (Παράρτημα) Ποσοτικός προσδιορισμός ελαίου Ο προσδιορισμός των ενδοκυτταρικών λιπιδίων πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με την μέθοδο Folch (Folch et al., 1957), όπου γνωστή ποσότητα ξηρής βιομάζας ομογενοποιούταν με την προσθήκη διαλύματος Folch (χλωροφόρμιο : μεθανόλη, 2:1 v/v) και στη συνέχεια εκχυλιζόταν εις τριπλούν για να παραληφθούν τα ολικά λιπίδια (Η αρχή της μεθόδου αναλυτικά στο Παράρτημα). Ακολουθούσε απομάκρυνση της βιομάζας με διήθηση (φίλτρα Whatman No40) και μεταφορά του εκχυλίσματος σε διαχωριστική χοάνη (Εικόνα 2.8). Η έκλουση του ελαίου πραγματοποιούνταν με τη βοήθεια διαλύματος KCl 0.88% (w/v), ώστε να απομακρυνθούν τυχόν προσμίξεις μη λιπιδιακών συστατικών. Στη συνέχεια πραγματοποιούνταν διαχωρισμός φάσεων, συλλογή της υποκείμενης φάσης που περιείχε το έλαιο και προσθήκη άνυδρου Na 2 SO 4 για απομάκρυνση της υγρασίας. Το διαλυμένο καθαρό έλαιο συλλεγόταν σε προζυγισμένο φιαλίδιο από το οποίο εξατμίζονταν ο διαλύτης (45 μέρες) και ακολουθούσε ζύγιση για τον υπολογισμό του συσσωρευμένου ενδοκυτταρικού ελαίου. Τα λιπίδια προσδιορίζονταν σε g ανά 100g ξηρής βιομάζας αλλά και σε mg L 1 καλλιέργειας. Εικόνα 2.8: Εκχύλιση ελαίου με διαχωριστική χοάνη Μεθυλεστεροποίηση Ο προσδιορισμός της σύστασης των λιπιδίων σε λιπαρά οξέα με χρωματογράφο αερίων (GC) προϋποθέτει τη μετατροπή των τελευταίων σε μεθυλεστέρες, μόρια περισσότερο πτητικά και λιγότερο πολικά των αντιστοίχων 119

143 Μέθοδοι και υλικά λιπαρών οξέων. Η αντίδραση μεθυλεστεροποίησης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη γενικευμένη μέθοδο Association Francaise de Normalisation AFNOR (1984). Η εν λόγω μέθοδος υπερτερεί έναντι άλλων λιγότερο χρονοβόρων μεθόδων, διότι δεν επιτρέπει την μετατροπή των cis ισομερών των λιπαρών οξέων σε trans, τα οποία υπό φυσιολογικές συνθήκες δεν απαντούν στα μικροβιακά λιπίδια. Πρόκειται για μία διαδικασία η οποία τελείται σε δύο διακριτά στάδια, το πρώτο σε αλκαλικό περιβάλλον και το δεύτερο σε όξινο. Οι αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα αναλύονται στο Παράρτημα Ανάλυση σε σύστημα αέριας χρωματογραφίας Η αέρια χρωματογραφία (GC) χρησιμοποιείται ευρέως για την ανίχνευση, την ταυτοποίηση και τον ποσοτικό προσδιορισμό οργανικών ενώσεων σε πολύπλοκα δείγματα καθώς επίσης και για τον προσδιορισμό διάφορων φυσικοχημικών μεθόδων. Προϋπόθεση για την εφαρμογή είναι η πτητικότητα και η σταθερότητα της προς ανάλυσης ουσίας στη θερμοκρασία της στήλης. Η κινητή φάση είναι ένα αδρανές αέριο ενώ η ακίνητη φάση είναι ένα μη πτητικό υγρό που καλύπτει το στερεό υπόστρωμα, αν έχουμε στήλες πλήρωσης, ή το εσωτερικό τοίχωμα, αν έχουμε τριχοειδείς στήλες. Ο διαχωρισμός οφείλεται στην κίνηση των συστατικών του μίγματος διαμέσου της στήλης με διαφορετικές ταχύτητες, εξαρτώμενες από την τάση ατμών των συστατικών και από τις αλληλεπιδράσεις τους από την στατική φάση. Για τον ποιοτικό προσδιορισμό των μεθυλεστέρων των λιπιδίων χρησιμοποιήθηκε χρωματογράφος αερίων που ήταν εξοπλισμένος με στήλη HP88 J8W Scientific διαστάσεων 60m x 0.25 mm και ανιχνευτή ιονισμού φλόγας (Flame Ionization DetectorFID). Ως φέρον αέριο χρησιμοποιήθηκε το ήλιο με ροή 2 ml/min. Οι συνθήκες της ανάλυσης ήταν: θερμοκρασία στήλης 200 C, θερμοκρασία συστήματος εξαέρωσης και ανιχνευτή 250 C, ενώ η διάρκεια της ανάλυσης ήταν 20 min. Τα λιπαρά οξέα ταυτοποιήθηκαν με τη βοήθεια πρότυπων μεθυλεστέρων, ενώ ο ποσοτικός προσδιορισμός των δειγμάτων έγινε με τη βοήθεια πρότυπου διαλύματος μαργαρικού οξέος (C17:0), το οποίο προσθέτονταν πριν τη μεθυλεστεροποίηση Ανάλυση σε σύστημα χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης 120

144 Μέθοδοι και υλικά Η υγρή χρωματογραφία πραγματοποιείται με κινητή φάση ένα υγρό, ενώ η στατική φάση μπορεί να είναι στερεά ή ακινητοποιημένη πάνω σε ένα αδρανές υπόστρωμα. Οι μηχανισμοί κατανομής μεταξύ των δύο φάσεων μπορεί να είναι προσρόφηση, ιοντοανταλλαγή, σχετική διαλυτοποίηση, στερική παρεμπόδιση κτλ. Ο διαχωρισμός βασίζεται στις διαφορές των ουσιών λόγω διαφορετικού μεγέθους, σχήματος και πυκνότητας φορτίου των σωματιδίων στα διαλύματα. Ευρέως εφαρμόσιμη είναι η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης/πίεσης η οποία χρησιμοποιεί υψηλές πιέσεις και χαμηλές θερμοκρασίες φυσικού περιβάλλοντος προσδίδοντάς της το πλεονέκτημα του μειωμένου χρόνου αναλύσεων αλλά και τη χρήση της στο διαχωρισμό ευπαθών ουσιών. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της αιθανόλης πραγματοποιήθηκε με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography HPLC, Ultimate 3000, Dionex, Germany), εξοπλισμένης με ανιχνευτή δείκτη διάθλασης (Reflective index, RI101, Shodex, Kawasaki, Japan) (με την οποία έγινε και η ανίχνευση της αιθανόλης) και στήλη Aminex HPX87H (διαστάσεων: 300mm x 7,8mm, BioRad, USA). Ο όγκος των προς ανάλυση δειγμάτων ήταν 20μl μέσου καλλιέργειας, που προηγουμένως είχε διηθηθεί μέσω μεμβρανών Whatman διαμέτρου πόρων 0.2 μm. Η κινητή φάση αποτελούνταν από υδατικό διάλυμα mgl 1 H 2 SO 4 (Sigma) και η ροή της ήταν 0.6 ml min 1 σε θερμοκρασία στήλης 65 ο C με χρόνο παραμονής έκλουσης της αιθανόλης 25min. Η ποσοτικοποίηση τους έγινε με τη βοήθεια καμπυλών αναφοράς, οι οποίες χαράχτηκαν χρησιμοποιώντας πρότυπα διαλύματα. Η καμπύλη αναφοράς για την αιθανόλη γίνεται με τη χρήση πρότυπων διαλυμάτων αιθανόλης 250 g L 1 η οποία παρατίθεται αναλυτικά στο Παράρτημα. 2.6 Στατιστική Ανάλυση Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως εξής : μέσος όρος ± τυπική απόκλιση. Στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των στοιχείων παραγωγής βιομάζας, περιεχόμενου ελαίου και φυσικοχημικών παραμέτρων αξιολογήθηκαν με τη χρήση στατιστικού λογισμικού ANOVA (SPSS 22.0 ή Origin Pro 7.0, μέθοδος διακύμανσης: oneway ANOVA) με καθορισμένο επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας το ρ <

145 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 122

146 3. ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ ΜΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΜΙΚΡΟΦΥΚΩΝ ΣΕ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΕΣ ΑΙΩΡΟΥΜΕΝΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟΝΤΙΖΕΛ 3.1 Γενικά Αποτελέσματα Αρχικά, πραγματοποιήθηκαν πειράματα κινητικής σε αντιδραστήρες αιωρούμενης ανάπτυξης, για την μελέτη της συμπεριφοράς της αυτότροφης καλλιέργειας με επικρατών το χλωροφύκος Choricystis sp. σε τεχνητό θρεπτικό μέσο. Στη συνέχεια, εξετάστηκε η συμπεριφορά της καλλιέργειας στα ίδια συστήματα, με χρήση αποβλήτου τυροκομείου ως θρεπτικό μέσο ανάπτυξης (υπόστρωμα), προερχόμενο από τυροκομική μονάδα. Πειράματα σε αντιδραστήρες αιωρούμενης ανάπτυξης έλαβαν χώρα και με τη δεύτερη αυτότροφη καλλιέργεια με επικρατών το κυανοβακτήριο Leptolyngbya sp., και μελετήθηκε η συμπεριφορά της τόσο σε τεχνητό θρεπτικό μέσο, όσο και σε απόβλητα τυροκομείου, οινοποιείου, μονάδας τυποποίησης σταφίδας καθώς και σε μεικτό απόβλητο οινοποιείουσταφίδας. Σε όλα τα παραπάνω πειράματα προσδιορίστηκαν οι ρυθμοί απομάκρυνσης των θρεπτικών συστατικών (αζώτου, φωσφόρου) και του οργανικού φορτίου (COD), για κάθε απόβλητο που χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα ανάπτυξης. Επίσης, σε κάθε σειρά πειραμάτων καταγράφηκε η παραγωγικότητα της βιομάζας και τα επίπεδα των παραγόμενων ελαίων επί της ξηρής βιομάζας. Τέλος, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της σύστασης του παραγόμενου ελαίου, έτσι ώστε να εξεταστεί η καταλληλότητά του για την παραγωγή βιοντίζελ. 123

147 Αποτελέσματα 3.2 Πειράματα κινητικής με χρήση καλλιέργειας Choricystis sp. Μετά την ανάπτυξη αυτότροφης καλλιέργειας που παρουσιάστηκε λεπτομερώς στην Ενότητα 2.2 και πριν τη διεξαγωγή οποιονδήποτε πειραμάτων πραγματοποιήθηκε ταυτοποίηση της καλλιέργειας στο Εργαστήριο Βοτανικής του Τμήματος Βιολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης όπου και προσδιορίστηκε η συμμετοχή και η αφθονία των φωτοσυνθετικών μικροοργανισμών του μεικτού πληθυσμού χρησιμοποιώντας ένα ανάστροφο μικροσκόπιο επιφθορισμού NikonECLIPSE TE2000S και σχετικές ταξινομικές κλείδες ταυτοποίησης. Στο μεικτό πληθυσμό καταγράφηκαν δύο φωτοσυνθετικοί μικροοργανισμοί: το κυρίαρχο είδος (αφθονία > 99% στο συνολικό πληθυσμό) ήταν το χλωροφύκος Choricystis sp. (Trebouxiophyceae) (Εικόνα 3.1) ενώ το δεύτερο ήταν στέλεχος Pseudanabaena sp. (κυανοβακτήριο). Το κυρίαρχο είδος είχε μήκος κυττάρων 48 μm, σχήματος φασολιού και εμφανίζονταν ως μονοκύτταρος οργανισμός (χαρακτηριστικό του είδους Choricystis). Εικόνα 3.1: Μικρογραφία καλλιέργειας με επικρατέστερο το χλωροφύκος Choricystis sp. (x400) Έπειτα, πραγματοποιήθηκαν πειράματα κινητικής με τεχνητό χημικό μέσο ως υπόστρωμα ανάπτυξης, με διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών αλάτων, για να μελετηθεί η συμπεριφορά της εν λόγω καλλιέργειας χωρίς την παρουσία άλλων μικροοργανισμών (Πίνακας 3.1). Συγκεκριμένα, έλαβαν χώρα τρία σετ πειραμάτων (Α, Β, C) με αναλογίες N:P παρόμοιες με εκείνες που θα εξεταστούν αργότερα και στα υπόλοιπα υποστρώματα ανάπτυξης. Χρησιμοποιήθηκαν ενυδρεία 124

148 Βιομάζα (mg L 1 ) Αποτελέσματα λειτουργικού όγκου 3.5 L τα οποία εμβολιάστηκαν με ποσότητα 20% της παραπάνω αυτότροφης καλλιέργειας (όγκος εμβολίου/τελικός όγκος) (αρχικής συγκέντρωσης 128.9±16.5 mgl 1 ) και αφέθηκαν προς ανάπτυξη στις ίδιες συνθήκες που είχαν χρησιμοποιηθεί και για την συντήρηση της αυτότροφης καλλιέργειας [συνεχής φωτισμός (200 μmolm 2 s 1, 2529 Wm 2 ), T = 25±2 ο C, ανάδευση (ρυθμός ροής 385 L h 1 )]. Σύμφωνα με το Σχήμα 3.1, οι διαφορετικές αναλογίες θρεπτικών αλάτων οδήγησαν σε διαφορετικούς ρυθμούς αύξησης βιομάζας και σε διαφορετικά ποσά συσσωρευμένου ελαίου στη ξηρή βιομάζα. Πίνακας 3.1: Αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών συστατικών του χημικού θρεπτικού μέσου που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα κινητικής με την αυτότροφη καλλιέργεια Choricystis sp. Σειρά Αρχικές συγκεντρώσεις (mg L 1 ) πειραμάτων NO 3 PO 4 3 Σάκχαρα Βιομάζα Α 23.74± ± ± ±7.86 B 22.90± ± ± ±39.6 C 9.90± ± ± ± A B C Μέγιστη περιεκτικότητα ελαίου % A B C NO 3 (mg L1 ) A B C (α) Χρόνος (d) (β) Χρόνος (d) 125

149 Σάκχαρα (mg L 1 ) Αποτελέσματα C B A A B C PO 3 4 (mg L1 ) (γ) Χρόνος (d) (δ) Χρόνος (d) Σχήμα 3.1: Αποτελέσματα πειραμάτων κινητικής της αυτότροφης καλλιέργειας Choricystis sp. με διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις αλάτων (Α, B, C) για την α) αύξηση της βιομάζας, β) απομάκρυνση ΝΟ 3, γ) απομάκρυνση PO 3 4 και δ) παραγωγή σακχάρων. Να σημειωθεί πως σε όλες τις σειρές πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν οι συγκεντρώσεις των σακχάρων αυξάνονταν με το χρόνο (Σχήμα 3.1δ), εξαιτίας της φωτοσυνθετικής δραστηριότητας της καλλιέργειας. Στον Πίνακα 3.2 που ακολουθεί παρουσιάζονται αναλυτικά όλα τα αποτελέσματα των τριών αυτών πειραμάτων, τα οποία στη συνέχεια θα αποτελέσουν έναυσμα συζήτησης για την συμπεριφορά της καλλιέργειας όταν σε αυτή χρησιμοποιηθεί άλλο υπόστρωμα ανάπτυξης, όπως το απόβλητο τυροκομείου στο οποίο περιέχονται πληθώρα γηγενών μικροοργανισμών. Πίνακας 3.2: Ποσοστό απομάκρυνσης NO 3 και PO 3 4, ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, παραγωγικότητα βιομάζας και περιεχόμενο έλαιο ξηρής βιομάζας στα πειράματα κινητικής της αυτότροφης καλλιέργειας Choricystis sp. με διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών αλάτων Σειρά πειραμάτων Απομάκρυνση % NO 3 PO 4 3 % Μέγιστο περιεχόμενο έλαιο Παραγωγικότητα Βιομάζας mg (L d) 1 Ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (d 1 ) Α Β C

150 Αποτελέσματα Επεξεργασία αποβλήτων τυροκομείου με καλλιέργεια Choricystis sp. Το απόβλητο που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία χορηγήθηκε από την τυροκομική μονάδα της Παπαθανασίου ΑΒΕΕ (Καμαρούλα, Δήμου Αγρινίου) και περιείχε τα απόνερα της τυροκομικής μονάδας αλλά και τον δευτερογενή ορρό γάλακτος. Τα χαρακτηριστικά του δευτερογενή ορρού γάλακτος της συγκεκριμένης μονάδας δίνονται στον Πίνακα 3.3. Να επισημανθεί ότι το απόβλητο που χρησιμοποιήθηκε σε όλα τα πειράματα που ακολουθούν είχε υποστεί αερόβια βιολογική επεξεργασία από βιολογικά φίλτρα που είναι ήδη εγκατεστημένα στην μονάδα. Η συλλογή των αποβλήτων για τα πειράματα πραγματοποιήθηκε σε διαφορετικές χρονικές στιγμές κατά τη διάρκεια της ημέρας προκειμένου να επιτευχθεί όσο το δυνατό καλύτερη προσομοίωση (σε πραγματικές συνθήκες λειτουργίας της μονάδας), για τη μελέτη της μετεπεξεργασίας των ήδη βιολογικώς επεξεργασμένων αποβλήτων με μικροφύκη και να ελεγχθεί η αντοχή τους και οι αποδόσεις τους σε ευρύ φάσμα συνθηκών. Η συντήρηση του αποβλήτου γίνονταν σε καταψύκτη θερμοκρασίας 20 ο C. Πίνακας 3.3: Χαρακτηριστικά δευτερογενή ορρού γάλακτος από παραγωγή τυριού τύπου cottage της μονάδας Παπαθανασίου ΑΕΒΕ (Tatoulis et al., 2015). Παράμετρος Μη αραιωμένο απόβλητο ph 4.56 dcod (mg L 1 ) 43000±2000 BOD (mg L 1 ) 20000±1000 Ολικά Στερεά (g L 1 ) 49.3 Ολικά Αιωρούμενα Στερεά (g L 1 ) 19.4 TKN (g L 1 ) 1.1 TP (g L 1 ) 0.34 Αλατότητα (Sal) 5.25 Αγωγιμότητα (μs/cm) 8455±1000 Για τη μελέτη της ικανότητας της καλλιέργειας Choricystis sp. να απομακρύνει θρεπτικά συστατικά και οργανικό φορτίο από τα απόβλητα τυροκομείου πραγματοποιήθηκαν πέντε σειρές πειραμάτων (A, B, C, D, E) που προέκυψαν από πέντε διαφορετικές αραιώσεις του αποβλήτου με νερό βρύσης. Η αραίωση από τη σειρά Α προς τις επόμενες Β, C, D και Ε μειώνεται σταδιακά, συνεπώς το υπόστρωμα 127

151 Αποτελέσματα ανάπτυξης γίνεται πυκνότερο. Για τον εμβολιασμό όλων των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε αυτότροφη καλλιέργεια Choricystis sp. σε εκθετική φάση ανάπτυξης (που εξετάστηκε με μέτρηση οπτικής απορρόφησης στα 650nm), αρχικής συγκέντρωσης βιομάζας ±16.44 mg L 1. Οι διαφορετικές αναλογίες αραίωσης του αποβλήτου είχαν ως αποτέλεσμα τις διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών συστατικών και οργανικού φορτίου (Πίνακας 3.4). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν χωρίς προσθήκη CO 2, υπό διαλείπουσα λειτουργία, σε ενυδρεία αιωρούμενης ανάπτυξης, όπου και συλλέγονταν ημερήσια δείγματα για την ανάλυση διαφόρων παραμέτρων. Το pη αρχικά ρυθμίζονταν στο 7.2±0.3 με τη χρήση διαλύματος NaOH 5Μ, ενώ κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας κυμαίνονταν πάντα μεταξύ 79, όντας κατάλληλο τόσο για αυτότροφη όσο και ετερότροφη ανάπτυξη. Πίνακας 3.4: Αρχικές συγκεντρώσεις COD, βιομάζας και θρεπτικών συστατικών του τυροκομικού αποβλήτου που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα κινητικής με την αυτότροφη καλλιέργεια Choricystis sp. Πειραματική σειρά Αρχικό COD (mg L 1 ) NO 3 Αρχικές συγκεντρώσεις (mgl 1 ) TN PO 4 3 Ολικά Σάκχαρα Αρχική συγκέντρωση βιομάζας (mg L 1 ) A 1100±97 3.8± ± ± ± ± B 2288± ± ± ± ± ± C 1815± ± ±5 19.6± ± ± D 5962± ± ±5 30.5± ± ± E 7295± ± ± ± ± ± C/N Η προσθήκη του εμβολίου της καλλιέργειας των μικροφυκών στο απόβλητο οδήγησε στο σχηματισμό μιας ομάδας μικροοργανισμών που αναπτύχθηκαν συμβιωτικά, έχοντας ως αποτέλεσμα την κατανάλωση των ανόργανων και οργανικών συστατικών του αποβλήτου. Η δυναμική αυτή μεικτή καλλιέργεια που απαρτίζεται από αυτότροφους (μικροφύκη) και ετερότροφους (βακτήρια) μικροοργανισμούς, παρουσίασε αλληλεπιδράσεις που ενίσχυσαν την παραγωγή βιομάζας. Η σταδιακή αύξηση της βιομάζας με το χρόνο παρουσιάζεται στο Σχήμα

152 Αποτελέσματα Σε όλα τα πειράματα που διεξήχθησαν σε αυτή τη μελέτη, το αρχικό διαλυμένο οξυγόνο (DO) ήταν πάνω από 7 mg L 1. Ωστόσο, οι συγκεντρώσεις DO μειώνονταν με το χρόνο φτάνοντας στο τέλος των πειραμάτων μέχρι και στην τιμή των 0.3 mg L 1. Παρόμοια συμπεριφορά μεταβολής του DO παρατηρήθηκε και από τους Muñoz and Guieysse (2006) και Valigore et al. (2012). Η τελική τιμή του DO καθορίζεται από την ισορροπία οξυγόνου που δημιουργείται κατά τη διάρκεια της φωτοσύνθεσης των μικροφυκών και της ταυτόχρονης κατανάλωσης από τα βακτήρια (ετερότροφη αναπνοή). Σε κάθε σειρά πειραμάτων οι αρχικές τιμές pη ρυθμίζονταν στη τιμή 7 προκειμένου να εξασφαλιστεί η βιοδιεργασία των μικροφυκών. Ωστόσο, σε όλες τις σειρές πειραμάτων το ph αυξάνονταν (μέχρι και την τιμή 9), εξαιτίας της δέσμευσης CO 2 από τα μικροφύκη και πιθανόν την απελευθέρωση αλκαλικών μεταβολιτών (π.χ. NH 4 ) από την βιοαποικοδόμηση της οργανικής ύλης A B C D E Βιομάζα (mgl 1 ) Χρόνος (d) Σχήμα 3.2: Μεταβολή της συγκέντρωσης της ολικής βιομάζας καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με απόβλητο τυροκομείου, πέντε διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Choricystis sp. Το σύνολο των μικροοργανισμών που αναπτύχθηκε (αυτόχθονες πληθυσμοί του λύματος και μικροφύκη) οδήγησε σε αύξηση της ολικής βιομάζας, αγγίζοντας ρυθμό παραγωγής μέχρι και 229 mg (L d) 1 (Πίνακας 3.5). Αξίζει να επισημανθεί ότι 129

153 Αποτελέσματα τα πειράματα που διεξήχθησαν με υπόστρωμα τεχνητό θρεπτικό υλικό σε παρόμοιες αρχικές συγκεντρώσεις νιτρικών αλάτων, τα οποία περιγράφηκαν στην αρχή της Ενότητας 3.2, παρουσίασαν μικρότερους ρυθμούς παραγωγής βιομάζας, φτάνοντας μόνο μέχρι την τιμή των 124 mg (L d) 1 (Πίνακας 3.2). Σύμφωνα με το Σχήμα 3.2, οι υψηλές αρχικές συγκεντρώσεις των θρεπτικών συστατικών στο υπόστρωμααπόβλητο βοηθούν την ανάπτυξη των κυττάρων της βιομάζας, παρατήρηση που σημειώθηκε επίσης και από άλλους ερευνητές όπως Woertz et al. (2009) και Levine et al. (2011). Στις σειρές πειραμάτων A, B, C και D ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης κυμάνθηκε από 0.23 d 1 μέχρι 0.29 d 1, ενώ ο μέγιστος ρυθμός σημειώθηκε στην σειρά Ε με τιμή 0.45 d 1, στην οποία είχαμε τις υψηλότερες αρχικές συγκεντρώσεις COD και θρεπτικών συστατικών (Πίνακας 3.5). Η αύξηση της βιομάζας με το πέρασμα του χρόνου παρουσιάζεται και στην Εικόνα 3.2, με την αλλαγή του χρώματος που διακρίνεται στο υπόστρωμα του αποβλήτου στους φωτοβιοαντιδραστήρες Εικόνα 3.2: Σταδιακή αύξηση μικροβιακής βιομάζας με επικρατών το Choricystis sp. χρησιμοποιώντας υπόστρωμα υγρό απόβλητο τυροκομείου Πίνακας 3.5: Ποσοστό απομάκρυνσης COD και θρεπτικών συστατικών, ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, παραγωγικότητα βιομάζας/λιπιδίων και περιεχόμενο έλαιο ξηρής βιομάζας στα πειράματα κινητικής της αυτότροφης καλλιέργειας Choricystis sp. με διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών συστατικών. 130

154 Αποτελέσματα Πειραματι κή σειρά NO 3 Απομάκρυνση % TN 3 PO 4 Ολικά Σάκχαρα Παραγωγικότητες Μέγιστο (mgl 1 d 1 ) περιεχόμε νο έλαιο COD % Λιπιδίων Βιομάζας Ειδικός ρυθμός ανάπτυξ ης (d 1 ) A 77.4± ±4 95.5± ±2 36.1±9 12.3±2 8.84± ± B 82.0± ± ± ±1 83.3±1 12.9± ± ± C 66.3± ±4 88.2±1 91.1±1 88.9±2 13.4± ± ± D 74.3± ± ± ± ±1 9.2± ± ± E 64.0± ± ± ± ±2 9.5± ± ± Στη συνέχεια εξετάστηκε η ικανότητα της μικροβιακής βιομάζας (με επικρατών το Choricystis sp.) να απομακρύνει οργανική και ανόργανη ύλη από το απόβλητο τυροκομείου. Μια βασική παράμετρος για την παρακολούθηση της ποιότητας των λυμάτων είναι το COD το οποίο συνδέεται άμεσα με το συνολικό ρυπαντικό φορτίο, υπό τη μορφή οργανικής ύλης. Οι αρχικές τιμές COD σε όλα τα πειράματα που έλαβαν χώρα ήταν υψηλότερες του επιτρεπόμενου ορίου των 250 mgl 1 για τις αστικές και βιομηχανικές εκροές (Ummalyma and Sukumaran, 2014), με σκοπό τη μελέτη της προτεινόμενης διεργασίας ως μέθοδο μετεπεξεργασίας του εν λόγου αποβλήτου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3.3 το COD μειώνεται με το χρόνο σε όλες τις πειραματικές σειρές, φτάνοντας σε ποσοστά απομάκρυνσης μέχρι και 90% (Πίνακας 3.5). Γίνεται λοιπόν αντιληπτό πως το σύνολο των μικροοργανισμών χρησιμοποίησε οργανικό άνθρακα από το υπόστρωμααπόβλητο για την ανάπτυξή του μέσω αερόβιου ετερότροφου μεταβολισμού. Με εξαίρεση το πείραμα Α, το COD απομακρύνθηκε σημαντικά (με μέση τιμή ποσοστού απομάκρυνσης κατά 88.4%) μέσα σε 47 ημέρες. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές στατιστικές διαφορές μεταξύ των πειραμάτων Β και C (p=0.585), Β και D (p=0.555) όπως και Β και Ε (p=0.557) αλλά μόνο μεταξύ Β και Α (p=0). Στο πείραμα Α οι αρχικές συγκεντρώσεις νιτρικών και ορθοφωσφορικών αλάτων ήταν αρκετά χαμηλές και πιθανόν παρεμποδιστικές για την ομαλή αύξηση της μικροβιακής βιομάζας. Μάλιστα, με το πέρας του χρόνου το ποσοστό απομάκρυνσης του COD αυξανόταν. Συγκεκριμένα, κατά τις πρώτες μέρες επεξεργασίας (ημέρες 12), το ποσοστό απομάκρυνσης COD ήταν σχετικά χαμηλό (λιγότερο από 40%), ωστόσο στη συνέχεια αυξάνονταν, ιδιαίτερα προς το τέλος της 131

155 dcod (mg L 1 ) Αποτελέσματα διεργασίας, αγγίζοντας τελικά τις υψηλές τιμές που παρουσιάζονται στον Πίνακα 3.5. Αυτό οφείλεται πιθανώς στο απαραίτητο διάστημα προσαρμογής του μικροβιακού πληθυσμού στο καινούργιο περιβάλλον ανάπτυξης κάτι που διακρίνεται και από το Σχήμα 3.2 για την παραγωγή βιομάζας με τα χαμηλότερα επίπεδα ανάπτυξής της τις πρώτες μέρες επεξεργασίας. Να αναφερθεί πως τα ποσοστά απομάκρυνσης COD που επιτεύχθηκαν (μέχρι 92%) είναι από τα υψηλότερα που έχουν αναφερθεί στη βιβλιογραφία (Πίνακας 3.17) σε αντίστοιχες περιπτώσεις χρήσης μικροφυκών για επεξεργασία αποβλήτων. Επίσης, τα υψηλά ποσοστά απομάκρυνσης COD οδήγησαν σε τελικές τιμές συγκεντρώσεων COD ιδιαίτερα χαμηλές (κάτω από 600 mg L 1 ), ακόμα και στην περίπτωση που εξετάστηκε η υψηλή αρχική συγκέντρωση COD των 7295±80.9 mg L Χρόνος (d) Σχήμα 3.3: Μεταβολή συγκέντρωσης COD καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με απόβλητο τυροκομείου, πέντε διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Choricystis sp. A B C D E Ο δευτερογενής ορρός γάλακτος που εξετάστηκε στην παρούσα διατριβή ως απόβλητο εκτός από τις πρωτεΐνες περιέχει και λακτόζη σε υψηλή συγκέντρωση, καθώς παρουσιάζει χαρακτηριστικά παρόμοια με εκείνα του ορρού γάλακτος (Carvalho et al., 2013). Για το λόγο αυτό, κρίθηκε σημαντική η καταγραφή και των συγκεντρώσεων των ολικών σακχάρων κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας του 132

156 Αποτελέσματα συγκεκριμένου αποβλήτου (Σχήμα 3.4). Παρατηρήθηκε ότι μέσα στις πρώτες τρεις μέρες το σύνολο των πολυσακχαριτών μειώθηκε σημαντικά με τον χρόνο, ιδιαίτερα στα πειράματα C, D και Ε, όπου χρησιμοποιήθηκαν μικρότερες αραιώσεις αποβλήτου. Η περίοδος κατανάλωσης των σακχάρων αντιστοιχεί σε εκείνη με τη χαμηλότερη μείωση του COD και η απομάκρυνσή τους (των σακχάρων) οφείλεται κυρίως στα ετερότροφα βακτήρια και λιγότερο στο μεταβολισμό των μικροφυκών. Οι Muñoz and Guieysse (2006) ανέφεραν επίσης ότι τα μικροφύκη είναι γενικά πιο ευαίσθητα σε επικίνδυνους ρύπους και αναπτύσσονται με βραδύτερους ρυθμούς από ότι τα συμβιωτικά ρυποαποικοδομητικά βακτήρια. Τα ποσοστά απομάκρυνσης αζώτου και φωσφόρου ποικίλουν ανάλογα με τις διαφορετικές αναλογίες αραίωσης του υποστρώματοςαποβλήτου που εξετάστηκαν και τις εποχιακές αλλαγές στην σύσταση του δευτερογενή ορρού γάλακτος. Η μείωση του αζώτου και του φωσφόρου συμπίπτει με την παραγωγή βιομάζας καθώς αυτά είναι τα απαραίτητα στοιχεία για την βιοσύνθεση πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων στους ζωντανούς οργανισμούς (Mulbry et al., 2008a). Για την καλύτερη κατανόηση της αφομοίωσης αζώτου/φωσφόρου αλλά και για την αξιολόγηση των θρεπτικών που θα οδηγήσουν σε μεγιστοποίηση της παραγωγικότητας των μικροφυκών, καταγράφηκαν οι συγκεντρώσεις των NO 3 N, ΝΟ 2 Ν, ΡΟ 3 4 και ΤΝ συναρτήσει του χρόνου A B C D E Σάκχαρα (mgl 1 ) Χρόνος (d) Σχήμα 3.4: Μεταβολή συγκέντρωσης σακχάρων καθ όλη τη διάρκεια των 133

157 TKN (mgl 1 ) PO 4 3 (mgl 1 ) NO 3 (mgl1 ) NO 2 (mgl1 ) Αποτελέσματα πειραμάτων κινητικής με απόβλητο τυροκομείου, πέντε διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Choricystis sp A B C D E 0,16 0,14 0,12 A B C D E , , ,06 6 0, , Χρόνος (d) (α) 0, Χρόνος (d) (β) A B C D E A B C D E (γ) Χρόνος (d) (δ) Χρόνος (d) Σχήμα 3.5: Μεταβολή συγκέντρωσης α) ΝΟ 3, β) NO 2, γ) ΤΝ και δ) PO 4 3 καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με απόβλητο τυροκομείου, πέντε διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Choricystis sp. 134

158 Αποτελέσματα Διαπιστώνεται ότι οι συγκεντρώσεις αζώτου και ορθοφωσφορικών σε όλες τις σειρές πειραμάτων μειώνονταν με τον χρόνο εμφανίζοντας παρόμοια συμπεριφορά, παρά τις διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις τους (Σχήμα 3.5 (α), (β), (γ), και (δ)). Σε κάθε πείραμα η απομάκρυνση του ΤΝ ήταν μεγαλύτερη από εκείνη της αντίστοιχης απομάκρυνσης των NO 3 N (ιδιαίτερα στις περιπτώσεις των υψηλών αρχικών συγκεντρώσεων ΤΝ, φθάνοντας μέχρι και την τιμή των 97%) μιας και αφομοιώνεται τόσο από ετερότροφους όσο και από αυτότροφους μικροοργανισμούς. Η απομάκρυνση των νιτρικών παρουσίασε τις υψηλότερες τιμές στα πειράματα Α και Β αγγίζοντας τις τιμές των 77.4% και 82%, αντίστοιχα (χωρίς σημαντική στατιστική διαφορά p=0.291). Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι στα πειράματα αυτά (Α, Β) χρησιμοποιήθηκαν μεγαλύτερες αραιώσεις του αποβλήτου, με αποτέλεσμα τα κύτταρα των μικροφυκών, που κατά προτίμηση αφομοιώνουν νιτρικά (Kothari et al., 2013), να κυριαρχούν. Γενικά, παρατηρήθηκε μείωση της απομάκρυνσης των νιτρικών με τη μείωση της αραίωσης του αποβλήτου. Η στατιστική ανάλυση δεν παρουσίασε σημαντική διαφορά μεταξύ των πειραμάτων Β, D και Α (p=0.134) ή μεταξύ των Β και D (p=0.120) αλλά παρουσιάστηκε μεταξύ των Β με Ε (p=0.001) και 3 Β με C (p=0.003). Τα υψηλότερα ποσοστά απομάκρυνσης ΤΝ (97.3%) και ΡΟ 4 (99.7%,) καταγράφηκαν στην πειραματική σειρά Β (Πίνακας 3.5), που θα μπορούσε να είναι αποτέλεσμα της μεγαλύτερης διαύγειας του υποστρώματος ανάπτυξης (εξαιτίας της μεγάλης αραίωσης του αποβλήτου), ενισχύοντας την αυτότροφη ανάπτυξη και κατ επέκταση την αποτελεσματικότερη αφομοίωση των εν λόγω θρεπτικών συστατικών (Ma et al., 2014). Όσο αφορά στην στατιστική ανάλυση του ΤΝ, σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν μεταξύ Β με Α (p=0), B με C (p=0.007) ενώ οι στατιστικές διαφορές μεταξύ D, E και Β (p=0.07) ήταν κοντά στο κατώτατο όριο των Σημαντικές στατιστικές διαφορές παρατηρήθηκαν και για τις απομακρύνσεις των ΡΟ 3 4 μεταξύ Β και Α (p=0) και μεταξύ των D, E και Β (p=0.003) ενώ δεν παρατηρήθηκαν μεταξύ Β και C (p=0.091). Αξίζει να επισημανθεί, ότι η συγκέντρωση των νιτρωδών σε όλες τις μετρήσεις ήταν πάντα κάτω από 0.15 mg L 1 (Σχήμα 3.5 β) που είναι μικρότερο από τα επιτρεπόμενα ευρωπαϊκά όρια. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, οι απομακρύνσεις αζώτου και φωσφόρου που καταγράφηκαν για διάφορα απόβλητα κυμαίνονται μεταξύ 3095% και 5099%, αντίστοιχα (Franchino et al., 2013; Ma et al., 2014). Στην παρούσα ενότητα, παρουσιάστηκαν ποσοστά απομάκρυνσης αζώτου και φωσφόρου μεταξύ 7697% και %, αντίστοιχα, τα 135

159 Αποτελέσματα οποία είναι από τα υψηλότερα που έχουν καταγραφεί μέχρι σήμερα στη βιβλιογραφία. Τέλος, σε όλα τα διεξαχθέντα πειράματα A, B, C, D και E υπολογίστηκε η συγκέντρωση ελαίων που συσσωρεύτηκε στη μικροβιακή βιομάζα. Παρατηρήθηκε μια θετική αλληλεπίδραση μεταξύ παραγωγικότητας ελαίου και βιομάζας. Ωστόσο, η παραγωγικότητα των ελαίου και της βιομάζας δεν είναι ανάλογη με την περιεκτικότητα των λιπιδίων στη μικροβιακή ξηρή βιομάζα (Πίνακας 3.5). Αυτό μπορεί να αποδοθεί στο υψηλό μεταβολικό κόστος για τη βιοσύνθεση λιπιδίων (Rodolfi et al., 2009). Όπως ήδη έχει αναφερθεί η χαμηλή συγκέντρωση θρεπτικών (αζώτου και φωσφόρου) που είναι προαπαιτούμενη για τη συσσώρευση ελαίων, μειώνει το ρυθμό αύξησης των μικροφυκών και κατά συνέπεια την τελική συγκέντρωση βιομάζας (Griffiths et al., 2014). Ως εκ τούτου, παρατηρήθηκε ασυμβατότητα μεταξύ περιεκτικότητας ελαίου στα κύτταρα και στη παραγωγή της βιομάζας, εφόσον σε χαμηλές αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών στοιχείων, μπορεί να παρατηρείται μικρότερη παραγωγή βιομάζας αλλά τα κύτταρα Choricystis έχουν τη δυνατότητα να συσσωρεύουν μεγαλύτερες ποσότητες ελαίου (Πίνακας 3.4 και 3.5). Τα μέγιστα ποσοστά περιεχόμενου ελαίου στη ξηρή βιομάζα που επετεύχθησαν για όλες τις πειραματικές σειρές παρουσιάζονται στο Σχήμα 3.6. Το μέγιστο ποσοστό που καταγράφηκε ήταν 13.4% επί ξηρής βιομάζας (ξ.β.) στη πειραματική σειρά C, ενώ στα πειράματα αυτότροφης καλλιέργειας το ποσοστό έφτασε μόλις στο 9.6% ξ.β. (Πίνακας 3.2). Υψηλά ποσοστά καταγράφηκαν επίσης στις σειρές Α και Β (12.3% και 12.9% ξ.β., αντίστοιχα), ενώ χαμηλότερα ποσοστά σημειώθηκαν στις σειρές D και E (9.2% και 9.5% ξ.β., αντίστοιχα) όπου το υπόστρωμα ανάπτυξης είχε υποστεί τη μικρότερη αραίωση. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικά στατιστικές διαφορές μεταξύ C, A και Β (p=0.525) ενώ μεταξύ C και D (p=0.049) όπως και μεταξύ C και Ε (p=0.051), οι τιμές του p ήταν κοντά στο κατώτατο όριο Η συσσώρευση ελαίου στα μικροβιακά κύτταρα που επιτεύχθηκε στην παρούσα ενότητα ήταν σχετικά χαμηλή σε σχέση με τα βιβλιογραφικά δεδομένα (1040%) (Chen et al., 2011; Pittman et al., 2011), ωστόσο θεωρείται ικανοποιητική δεδομένου των παραμέτρων που διαφοροποιούνται, όπως το είδος των μικροοργανισμών, το εφαρμοζόμενο σύστημα, το υπόστρωμα ανάπτυξης (με τις υψηλές συγκεντρώσεις οργανικού φορτίου που εξετάστηκαν), καθώς και οι συνθήκες καλλιέργειας (θερμοκρασία, ph) 136

160 Αποτελέσματα που επηρεάζουν την διαδικασία (Bellou and Aggelis, 2013; EspinosaGonzalez et al., 2014) Μέγιστη περιεκτικότητα ελαίου % A B C D E Σειρά πειράματος Σχήμα 3.6: Μέγιστα ποσοστά περιεχόμενου ελαίου επί ξηρής βιομάζας με απόβλητο τυροκομείου, πέντε διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Choricystis sp. 3.3 Πειράματα κινητικής με χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. Στις επόμενες σειρές πειραμάτων ως εμβόλιο για την επεξεργασία διαφόρων αποβλήτων χρησιμοποιήθηκε αυτότροφη καλλιέργεια με επικρατές το κυανοβακτήριο Leptolynbgya sp.. Ο εν λόγω μεικτός αυτότροφος πληθυσμός αναπτύσσονταν, όπως και η μεικτή αυτότροφη καλλιέργεια με επικρατέστερο το χλωροφύκος Choricystis sp., σε γυάλινες δεξαμενές (ενυδρεία) λειτουργικού όγκου 3.5 L που περιείχαν θρεπτικά άλατα συγκεντρώσεων, όπως παρουσιάζονται στην Ενότητα 2.2. Πριν την έναρξη των νέων πειραμάτων πραγματοποιήθηκε ταυτοποίηση της καλλιέργειας στο Εργαστήριο Βοτανικής του Τμήματος Βιολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης με τη βοήθεια ενός ανάστροφου μικροσκοπίου επιφθορισμού Nikon ECLIPSE TE2000S και σχετικές ταξινομικές κλείδες ταυτοποίησης. Στον μεικτό πληθυσμό, οι μικροοργανισμοί αναγνωρίστηκαν χρησιμοποιώντας μορφολογικά κριτήρια (διάσταση των κυττάρων και μορφολογία, αριθμός και μορφολογία των μαστιγίων, αριθμός χρωματοφόρων, κυτταρικά σφαιρίδια), συμπεριφορά κίνησης και σίτισης (Lund et al., 1958). Καταγράφηκε με 137

161 Αποτελέσματα περισσότερο από 95% αφθονία (στη συνολική φωτοσυνθετική βιομάζα) το νηματοειδές κυανοβακτήριο Leptolyngbya sp. το οποίο σχημάτιζε μεγάλα συσσωματώματα (Εικόνα 3.3). Επίσης, εντοπίστηκε το μιξότροφο χρυσοφύκος Ochromonas/Poterioochromonas sp. (Εικόνα 3.3) (το οποίο τρέφεται με σπασμένα νήματα του Leptolyngbya) συμβάλλοντας σε λιγότερο από 5% στη συνολική φωτοσυνθετική βιομάζα. Όπως και στην προηγούμενη σειρά πειραμάτων, αρχικά πραγματοποιήθηκαν πειράματα κινητικής με τεχνητό χημικό μέσο ως μέσο ανάπτυξης, με διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών αλάτων προκειμένου να μελετηθεί η συμπεριφορά της παραπάνω καλλιέργειας χωρίς την παρουσία άλλων μικροοργανισμών (Πίνακας 3.6). Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν ενυδρεία λειτουργικού όγκου 3.5 L τα οποία εμβολιάστηκαν με ποσότητα 20% της παραπάνω αυτότροφης καλλιέργειας (όγκος εμβολίου/τελικός όγκος) και αφέθηκαν προς ανάπτυξη στις ίδιες συνθήκες: που είχαν χρησιμοποιηθεί και για τη συντήρηση της αυτότροφης καλλιέργειας [συνεχής φωτισμός (200 μmolm 2 s 1, 2529Wm 2 ), T=27±2 ο C, ανάδευση (ρυθμός ροής 385 L h 1 )]. Το εμβόλιο λαμβάνονταν πάντα από την πρώιμη εκθετική φάση ανάπτυξης, η οποία βρέθηκε ότι είναι μεταξύ 4 ης και 6 ης ημέρας επώασης έπειτα από παρακολούθηση με μέτρηση οπτικής πυκνότητας σε μήκος κύματος λ=650nm. Οι διαφορετικές αναλογίες θρεπτικών αλάτων οδήγησαν σε διαφορετική αύξηση βιομάζας καθώς και σε διαφορετικά ποσά συσσωρευμένου ελαίου στη ξηρή βιομάζα (Σχήμα 3.7). Εικόνα 3.3 : Φωτογραφίες μικροσκοπίου της αυτότροφης καλλιέργειας όπου διακρίνονται τα συσσωματώματα των τριχωμάτων Leptolyngbya (Κλίμακα 50μm) (αριστερά) και τα ευκαρυωτικά μικροφύκη γένους Ochromonas ως σφαιρικάωοειδή ελεύθερα κύτταρα (Κλίμακα 10μm) (δεξιά) 138

162 PO 3 4 (mgl1 ) NO 3 (mgl1 ) Αποτελέσματα A B C D D C B A Βιομάζα (mgl 1 ) (α) Χρόνος (d) Χρόνος (d) (β) D C B A A B C D Σάκχαρα (mg/l) (γ) Χρόνος (d) Χρόνος (d) (δ) Σχήμα 3.7: Αποτελέσματα πειραμάτων κινητικής της αυτότροφης καλλιέργειας Leptolyngbya sp. με διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών συστατικών για την α) μεταβολή της βιομάζας β) απομάκρυνση NO 3 γ) απομάκρυνση PO 3 4 και δ) παραγωγή σακχάρων 139

163 Αποτελέσματα Πίνακας 3.6: Αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών συστατικών του χημικού θρεπτικού μέσου που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης με την αυτότροφη καλλιέργεια Leptolyngbya sp. Σειρά πειραμάτων Αρχικές συγκεντρώσεις (mg L 1 ) NO 3 PO 4 Σάκχαρα Βιομάζα Α 7.2± ± ± ±11.3 B 11.5± ± ± ±7.07 C 5.5± ± ± ±4.24 D 19.6± ± ± ±9.9 Στον Πίνακα 3.7 παρουσιάζονται αναλυτικά τα ποσοστά απομάκρυνσης των θρεπτικών συστατικών καθώς και οι μέγιστες τιμές ρυθμού παραγωγής βιομάζας και συσσωρευμένου ελαίου στη ξηρή βιομάζα. Σε όλες τις σειρές πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν, οι συγκεντρώσεις των σακχάρων αυξάνονταν με το χρόνο εξαιτίας της φωτοσυνθετικής δραστηριότητας της καλλιέργειας. Πίνακας 3.7: Ποσοστά απομάκρυνσης NO 3 και PO 3 4, ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, παραγωγικότητα βιομάζας και περιεχόμενο έλαιο ξηρής βιομάζας στα πειράματα κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης της αυτότροφης καλλιέργειας Leptolyngbya sp. με διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών αλάτων Ειδικός Απομάκρυνση % % Μέγιστο Παραγωγικότητα Σειρά ρυθμός περιεχόμενο Βιομάζας πειραμάτων ανάπτυξης έλαιο (mg L 1 d 1 ) NO 3 PO 4 (d 1 ) Α 99.9± ± ± Β 96.1± ±0.04 6± C 95.6± ±0 8± D 92.7± ± ± Στη συνέχεια, εξετάστηκε η συμπεριφορά της αυτότροφης καλλιέργειας χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα ανάπτυξης μία σειρά από διαφορετικά είδη αποβλήτων. Μελετήθηκαν εκ νέου οι ρυθμοί παραγωγής βιομάζας και 140

164 Αποτελέσματα συσσωρευμένου ελαίου, καθώς και οι ρυθμοί απομάκρυνσης των περιεχόμενων συστατικών Πειράματα κινητικής σε απόβλητο τυροκομείου με χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. Το απόβλητο που χρησιμοποιήθηκε στα επόμενα πειράματα προήλθε επίσης από την τυροκομική μονάδα της Παπαθανασίου ΑΒΕΕ, ποιοτικής σύστασης και χαρακτηριστικών του Πίνακα 3.3. Για τη μελέτη της ικανότητας της καλλιέργειας Leptolyngbya sp. να απομακρύνει θρεπτικά συστατικά και οργανικό φορτίο από τα απόβλητα τυροκομείου πραγματοποιήθηκαν δύο σειρές πειραμάτων (Α, Β) που προέκυψαν από δύο διαφορετικές αραιώσεις του αποβλήτου με νερό βρύσης. Για τον εμβολιασμό των πειραμάτων αυτών χρησιμοποιήθηκε η αυτότροφη καλλιέργεια Leptolyngbya sp. σε εκθετική φάση ανάπτυξης (που εξετάστηκε με μέτρηση οπτικής απορρόφησης στα 650nm) αρχικής συγκέντρωσης βιομάζας μέσης τιμής των 70±9.6 mgl 1. Οι διαφορετικές αναλογίες αραίωσης του αποβλήτου είχαν ως αποτέλεσμα τις διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών συστατικών και οργανικού φορτίου (Πίνακας 3.8). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν χωρίς προσθήκη CO 2 υπό διαλείπουσα λειτουργία σε ενυδρεία αιωρούμενης ανάπτυξης, όπου και συλλέγονταν ημερήσια δείγματα για την ανάλυση διαφόρων παραμέτρων. Το pη αρχικά ρυθμίζονταν στο 7.2±0.3 με τη χρήση διαλύματος NaOH 5Μ, ενώ κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας κυμαίνονταν μεταξύ 79, όντας κατάλληλο τόσο για αυτότροφη όσο και ετερότροφη ανάπτυξη. Πίνακας 3.8: Αρχικές συγκεντρώσεις COD, βιομάζας και θρεπτικών συστατικών του τυροκομικού αποβλήτου που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης με την αυτότροφη καλλιέργεια Leptolyngbya sp. Πειραματική σειρά Αρχικό COD (mg L 1 ) NO 3 Αρχικές συγκεντρώσεις (mg L 1 ) Ολικά 3 TN PO 4 Σάκχαρα Αρχική συγκέντρωση βιομάζας (mg L 1 ) C/N N/P 141

165 Αποτελέσματα A 3240± ± ± ± ± ± B 1578± ± ± ± ± ± Η προσθήκη της αυτότροφης καλλιέργειας στο απόβλητο οδήγησε στο σχηματισμό μιας ομάδας μικροοργανισμών (που αναπτύχθηκαν συμβιωτικά) (Σχήμα 3.8) ικανής να απομακρύνει ανόργανα και οργανικά συστατικά από το απόβλητο (Σχήμα ). Το σύνολο των μικροοργανισμών που αναπτύχθηκε (αυτόχθονες πληθυσμοί του λύματος και μικροφύκη) οδήγησε σε αύξηση της βιομάζας αγγίζοντας ρυθμό παραγωγής μέχρι και 303 mg (L d) 1 (Πίνακας 3.9), η οποία ξεπερνά τις καταγεγραμμένες τιμές παραγωγικότητας βιομάζας από συγκαλλιέργεια Leptolyngbya των Silaban et al. (2014) (156 mg (L d) 1 ) και μονοκαλλιέργειας των Singh et al. (2014) (79 mg (L d) 1 ). Τα είδη Leptolyngbya φαίνεται να είναι κατάλληλοι υποψήφιοι μικροοργανισμοί για παραγωγή βιομάζας, καθώς σύμφωνα με τους Maity et al. (2014) μπορούν να οδηγήσουν σε πολύ υψηλούς ρυθμούς παραγωγής βιομάζας, μέχρι και 480 mg (L d) 1 όταν χρησιμοποιηθούν για επεξεργασία αστικών αποβλήτων. Να επισημανθεί ότι σχεδόν όλες οι έρευνες με Leptolyngbya sp. έχουν πραγματοποιηθεί με τεχνητά ή αστικά λύματα υπό ασηπτικές συνθήκες, χωρίς να υπάρχουν δεδομένα για μη ασηπτικές συνθήκες ώστε να γίνει άμεση σύγκριση των αποτελεσμάτων της παρούσας μελέτης με τη βιβλιογραφία A B 1200 Βιομάζα (mgl 1 ) Χρόνος (d) Σχήμα 3.8: Μεταβολή στη συγκέντρωση της ολικής βιομάζας καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με απόβλητο τυροκομείου σε δύο διαφορετικές αραιώσεις και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. 142

166 dcod (mgl 1 ) Αποτελέσματα B A Χρόνος (d) Σχήμα 3.9: Μεταβολή στη συγκέντρωση του COD καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με απόβλητο τυροκομείου σε δύο διαφορετικές αραιώσεις και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. Σύγκριση των ρυθμών παραγωγής βιομάζας με υπόστρωμα χημικό θρεπτικό μέσο και αραιωμένο απόβλητο τυροκομείου, δείχνει ότι το απόβλητο οδηγεί σε υψηλότερους ρυθμούς, καθώς φτάνει την τιμή των 303 mg (L d) 1 (Πίνακας 3.9) έναντι εκείνης του χημικού μέσου που μόλις αγγίζει τα 84 mg (L d) 1 (Πίνακας 3.7). Επίσης, ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης στα πειράματα με Leptolyngbya και χρήση τυροκομικού αποβλήτου κυμάνθηκε από 0.47 d 1 μέχρι 0.49 d 1 που είναι από του μεγαλύτερους ρυθμούς που σημειώθηκαν για όλα τα πειράματα με τυροκομικό απόβλητο στην παρούσα διατριβή (Πίνακας 3.9). Όσον αφορά την απομάκρυνση του οργανικού φορτίου, παρά τις υψηλές αρχικές τιμές COD, σημειώθηκαν ποσοστά απομάκρυνσης φτάνοντας μέχρι και την τιμή των 94% μέσα σε 711 μέρες (Σχήμα 3.9). Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία τόσο υψηλά ποσοστά απομάκρυνσης COD καταγράφονται συνήθως σε μιξότροφα συστήματα κυανοβακτηρίων/μικροφυκών που χρησιμοποιούν μόνο αστικά απόβλητα ως υπόστρωμα ανάπτυξης (Gupta et al., 2016a). Σε εργασία παρόμοια της παρούσας μελέτης, δηλαδή με χρήση αγροτοβιομηχανικού αποβλήτου ως υπόστρωμα για ανάπτυξη μικροφυκών, είναι εκείνη των Khemka and Saraf (2015) οι οποίοι ωστόσο χρησιμοποίησαν μονοκαλλιέργεια Leptolyngbya σε γαλακτοκομικά απόβλητα 143

167 PO 3 4 (mgl1 ) NO 3 (mgl1 ) NO 2 (mgl1 ) Αποτελέσματα καταγράφοντας μόλις 52.4% απομάκρυνση του COD, πολύ μικρότερο ποσοστό σε σχέση με την παρούσα μελέτη (94%) A B 0,20 0,18 0,16 A B 12 0, ,12 8 0, ,08 0,06 0,04 0, (α) Χρόνος (d) 0, (β) Χρόνος (d) (γ) Χρόνος (d) A B Σάκχαρα (mgl 1 ) (δ) Χρόνος (d) Σχήμα 3.10: Μεταβολή στις συγκεντρώσεις των α) NO 3, β) NO 2, γ) PO 4 3 και δ) ολικών σακχάρων καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με απόβλητο τυροκομείου δύο διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. A B Αντίστοιχα, η μείωση των ολικών σακχάρων έφτασε επίσης σε αρκετά υψηλά ποσοστά (μέχρι και την τιμή των 85%), με το ρυθμό απομάκρυνσης να είναι μεγαλύτερος τις πρώτες 2 μέρες ως αποτέλεσμα του γρήγορου μεταβολικού ρυθμού των ετερότροφων βακτηρίων (Σχήμα 3.10δ), όπως έχει επισημανθεί και από τους 144

168 Αποτελέσματα Muñoz and Guieysse (2006). Η πολύ μικρή άνοδος που παρατηρήθηκε τις τελευταίες ημέρες των πειραμάτων στις συγκεντρώσεις των σακχάρων (κάτι που παρατηρήθηκε και παλαιότερα από τους HerediaArroyo et al. (2011)), πιθανόν να οφείλεται σε αποσύνθεση των κυττάρων, καθώς η συγκέντρωση κυττάρων της βιομάζας το χρονικό αυτό διάστημα προσεγγίζει τα μέγιστα. Πίνακας 3.9: Ποσοστό απομάκρυνσης COD και θρεπτικών συστατικών, ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, παραγωγικότητα βιομάζας και λιπιδίων και περιεχόμενο έλαιο ξηρής βιομάζας στα πειράματα κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης με απόβλητο τυροκομείου και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. Πειραματ ική σειρά NO 3 Απομάκρυνση % Ολικά 3 TN PO 4 Σάκχαρα Παραγωγικότητες Μέγιστο (mgl 1 d 1 ) COD περιεχόμενο έλαιο % Λιπιδίων Βιομάζας Ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (d 1 ) A 70.2± ± ± ± ± ± B 54.5± ± ± ± ± ± Οι απομακρύνσεις των θρεπτικών συστατικών διαφέρουν ανάλογα με τις αρχικές συγκεντρώσεις που έχουν προκύψει μετά την αραίωση του αποβλήτου (Πίνακας 3.9). Αν και η πρώτη σειρά πειραμάτων (Α) είχε σχεδόν διπλάσιες αρχικές συγκεντρώσεις αζώτου και φωσφόρου σε σχέση με τη δεύτερη (Β) (Πίνακας 3.8), παρατηρήθηκαν υψηλότερα ποσοστά απομάκρυνσης αζώτου (70.2% έναντι 54.5% για τα Α και Β, αντίστοιχα), τα οποία συμπίπτουν και με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση βιομάζας για την σειρά αυτή (Α). Η είσοδος δηλαδή μεγαλύτερης ποσότητας αποβλήτου, άρα και η εισαγωγή μεγαλύτερου αριθμού μικροοργανισμών, οδήγησε σε υψηλότερα ποσοστά απομάκρυνσης των θρεπτικών στοιχείων που βρίσκονται στο απόβλητο, εφόσον αυτά αποτελούν απαραίτητα στοιχεία για την βιοσύνθεση των μακρομορίων των μικροοργανισμών. Οι συγκεντρώσεις αζώτου και φωσφόρου μειώνονταν με τον χρόνο εμφανίζοντας παρόμοια συμπεριφορά, με τη διαφορά μόνο στον απαιτούμενο χρόνο επεξεργασίας τους, καθώς το πυκνότερο υπόστρωμα (Α) χρειάστηκε περισσότερο χρόνο επεξεργασίας από το αραιότερο (Β) (11 μέρες και 7 ημέρες, αντίστοιχα) (Σχήμα 3.10 α και γ). Η απομάκρυνση ΤΝ παρουσίασε μεγαλύτερο ποσοστό (φθάνοντας μέχρι και την τιμή των 91%) σε σχέση με το 145

169 Αποτελέσματα αντίστοιχο των NO 3 N (70.2%), ακόμη και για τις υψηλές αρχικές συγκεντρώσεις ΤΝ μιας και αφομοιώνεται τόσο από ετερότροφους όσο και από αυτότροφους μικροοργανισμούς. Όσον αφορά τα νιτρώδη η συγκέντρωσή τους ήταν πάντα κάτω από τη τιμή των 0.2 mg L 1 καθ όλη τη διάρκεια όλων των πειραμάτων (Σχήμα 3.10 β). Τα ορθοφωσφορικά, ως η πιο αφομοιώσιμη μορφή φωσφόρου, εμφάνισε αυξημένα ποσοστά απομάκρυνσης, κοντά στο 83% και για τις δύο σειρές πειραμάτων. Η χρησιμότητά του στη σύνθεση πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων για όλους τους μικροοργανισμούς εξηγεί τα υψηλά ποσοστά απομάκρυνσής του, που μάλιστα είναι παρόμοια ή και μεγαλύτερα σε σύγκριση με αντίστοιχες μελέτες (Maity et al., 2014; Khemka and Saraf, 2015). Τέλος, στις δύο πειραματικές σειρές Α και Β υπολογίστηκε η συγκέντρωση ελαίων που συσσωρεύτηκε στη μικροβιακή βιομάζα. Παρατηρήθηκε μια θετική αλληλεπίδραση μεταξύ παραγωγικότητας ελαίου και βιομάζας, εφόσον η παραγωγικότητα των ελαίου ήταν ανάλογη με την περιεκτικότητα των λιπιδίων στη μικροβιακή ξηρή βιομάζα (Πίνακας 3.9). Τα μέγιστα ποσοστά περιεχόμενου ελαίου στη ξηρή βιομάζα που επετεύχθησαν παρουσιάζονται αναλυτικά στο Πίνακα 3.9. Το μέγιστο ποσοστό που καταγράφηκε ήταν εκείνο των 14.8% ξηρής βιομάζας στη πειραματική σειρά Β, καθώς σε αυτήν χρησιμοποιήθηκε μεγαλύτερη αραίωση του αποβλήτου που οδήγησε σε καλύτερη διαύγεια του υγρού υποστρώματος, βοηθώντας σημαντικά την αυτότροφη ανάπτυξη (Ma et al., 2014). Στα πειράματα αυτότροφης καλλιέργειας Leptolyngbya sp. (Ενότητα 3.3) με ίδια αναλογία N:P (~3) το ποσοστό συσσωρευμένου ελαίου έφτασε μόλις στο 6% ξηρής βιομάζας. Οι επιτευχθείσες τιμές ελαίου στα τυροκομικά απόβλητα είναι σχετικά χαμηλές σε σχέση με τα ποσοστά που έχουν επιτευχθεί για το Leptolyngbya χρησιμοποιώντας αστικά απόβλητα (1925%) (Singh and Thakur, 2015), παρόλα αυτά είναι αρκετά ικανοποιητικές δεδομένου των διαφορετικών συνθηκών καλλιέργειας. Ωστόσο, όσον αφορά την παραγωγικότητα των λιπιδίων που κυμάνθηκε κοντά στο 30 mg (L d) 1 στη παρούσα μελέτη, είναι υψηλότερη από εκείνη που έχει καταγραφεί από τους Rós et al. (2013) για τα Leptolyngbya sp. σε συνθετικό χημικό υπόστρωμα ανάπτυξης. 146

170 Αποτελέσματα Πειράματα κινητικής σε απόβλητο οινοποιείου με χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. Το απόβλητο οινοποιείου που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα που ακολουθούν συλλέχθηκε από το τοπικό οινοποιείο Γρίβας στο Αγρίνιο (Ν.&Ν. Γρίβας Ο.Ε.), παραγωγικότητας περίπου 350 τόνους το χρόνο. Τα λύματα του οινοποιείου προέρχονται κυρίως από τα νερά που χρησιμοποιούνται για το πλύσιμο των δεξαμενών μετά την μεταποίηση των σταφυλιών και την παραγωγή του κρασιού (Πίνακας 3.10). Η συλλογή των αποβλήτων για τα πειράματα έγινε σε διαφορετικές ώρες τις μέρας και διαφορετικές εποχές προκειμένου να επιτευχθεί όσο το δυνατό καλύτερη προσομοίωση για τη μελέτη της μετεπεξεργασίας των αποβλήτων οινοποιείου με μικροφύκη και να ελεγχθεί η αντοχή τους και οι αποδόσεις τους σε ευρύ φάσμα συνθηκών. Η συντήρηση του αποβλήτου γίνονταν σε καταψύκτη θερμοκρασίας 20 ο C. Πίνακας 3.10: Χαρακτηριστικά πυκνού αποβλήτου οινοποιείου της μονάδας Ν.&Ν. Γρίβας Ο.Ε. Παράμετρος Μη αραιωμένο απόβλητο ph 3.55 dcod (mg L 1 ) BOD (mg L 1 ) Ολικά Αιωρούμενα Στερεά (mg L 1 ) TKN (mg L 1 ) Αγωγιμότητα (μs cm 1 ) 2700 Για τη μελέτη της ικανότητας της καλλιέργειας Leptolyngbya sp. να απομακρύνει θρεπτικά συστατικά και οργανικό φορτίο από τα απόβλητα οινοποιείου πραγματοποιήθηκαν τρεις σειρές πειραμάτων (A, B και C), που προέκυψαν από διαφορετικές αραιώσεις αποβλήτου με νερό βρύσης (Πίνακας 3.11). Για τον εμβολιασμό των πειραμάτων αυτών χρησιμοποιήθηκε αυτότροφη καλλιέργεια Leptolyngbya sp. (βλέπε Ενότητα 3.3.1) σε εκθετική φάση ανάπτυξης ίδιας αρχικής συγκέντρωσης βιομάζας μέσης τιμής 70±9.6 mgl 1. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν χωρίς προσθήκη CO 2, υπό διαλείπουσα λειτουργία σε ενυδρεία αιωρούμενης ανάπτυξης, όπου και συλλέγονταν ημερήσια δείγματα για την ανάλυση διαφόρων παραμέτρων. Το pη αρχικά ρυθμίζονταν σε τιμή 7.2±0.3 με τη χρήση 147

171 Αποτελέσματα διαλύματος NaOH 5Μ, ενώ κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας κυμαίνονταν μεταξύ 79, όντας κατάλληλο τόσο για αυτότροφη όσο και ετερότροφη ανάπτυξη. Οι αρχικές τιμές DO κυμαίνονταν μεταξύ 6.8 και 8.7 mg L 1, αλλά μειώνονταν με το χρόνο φτάνοντας μέχρι και την τιμή των 0.5 mg L 1, εξαιτίας πιθανόν της ετερότροφης αναπνοής (Zhou et al., 2014). Πίνακας 3.11: Αρχικές συγκεντρώσεις COD, βιομάζας και θρεπτικών συστατικών του αποβλήτου οινοποιείου που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης με την αυτότροφη καλλιέργεια Leptolyngbya sp. Πειραματι κή σειρά Αρχικό COD (mg L 1 ) NO 3 Αρχικές συγκεντρώσεις (mg L 1 ) TN PO 4 3 Ολικά Σάκχαρα Αρχική συγκέντρωση βιομάζας (mg L 1 ) A 7750± ± ±3 10± ± ± B 2043± ± ± ± ± ± C 1732± ± ± ± ± ± C/N N/P Μετά την προσθήκη του εμβολίου (αυτότροφη καλλιέργεια Leptolyngbya sp.) στο ενυδρείο που περιείχε ήδη αραιωμένο απόβλητο οινοποιείου, αναπτυσσόταν (σε κάθε σειρά πειραμάτων) μια μεικτή ομάδα αυτότροφων, ετερότροφων και μιξότροφων μικροοργανισμών σχηματίζοντας μεταξύ τους συσσωματώματα (Εικόνα 3.4). Τα συσσωματώματα αυτά αποτελούν ένα σημαντικό χαρακτηριστικό των μικροοργανισμών καθώς διευκολύνουν την αυτοκαθίζηση, και ως εκ τούτου μειώνουν το κόστος συγκομιδής της βιομάζας, ειδικά σε συστήματα ανοικτών λιμνών. Για το λόγο αυτό η σημασία της αυτοκαθιζούμενης βιομάζας αναφέρεται εκτεταμένα στη βιβλιογραφία, καθώς έτσι μπορεί να διαμορφωθεί ένα βιώσιμο και εφαρμόσιμο σύστημα παραγωγής βιομάζας (Gutzeit et al., 2005). Το σύνολο των μικροοργανισμών που αναπτύχθηκε οδήγησε σε αύξηση της βιομάζας αγγίζοντας την τιμή παραγωγικότητας των 216 mg (L d) 1 (Σχήμα 3.11). Στα πειράματα με χρήση τεχνητού χημικού μέσου με παρόμοιες αρχικές συγκεντρώσεις νιτρικών και φωσφορικών αλάτων, η παραγωγικότητα της βιομάζας έφτασε μόλις τα 49 mg (L d) 1 (Ενότητα 3.3). Όσο αφορά τον ειδικό ρυθμό ανάπτυξης σε όλες τις σειρές πειραμάτων κυμάνθηκε μεταξύ 0.24 d 1 και 0.3 d 1 (Πίνακας 3.11). 148

172 Αποτελέσματα Εικόνα 3.4: Σταδιακή αύξηση μικροβιακής βιομάζας με χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp χρησιμοποιώντας υγρό απόβλητο οινοποιείου A B C 1000 Βιομάζα (mgl 1 ) Χρόνος (d) Σχήμα 3.11: Μεταβολή συγκέντρωσης ολικής βιομάζας καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με απόβλητο οινοποιείου τριών διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. 149

173 dcod (mgl 1 ) Αποτελέσματα Το Σχήμα 3.12 που ακολουθεί παρουσιάζει τη μεταβολή της συγκέντρωσης COD με το χρόνο για όλες τις σειρές πειραμάτων που εξετάστηκαν. Τα ποσοστά απομάκρυνσης του COD που επετεύχθησαν κυμάνθηκαν περίπου μεταξύ 22 και 86% σε χρονικό διάστημα 57 ημερών, με τη μέγιστη τιμή (85.8%) να αντιστοιχεί στο πιο αραιωμένο απόβλητο (σειρά C). Tα ποσοστά απομάκρυνσης των ολικών σακχάρων, όπως παρουσιάζονται στον Πίνακα 3.11, κυμάνθηκαν σε σχετικά υψηλές τιμές (μεταξύ 6481%), με το ρυθμό απομάκρυνσης να είναι μεγαλύτερος τις πρώτες 23 μέρες ως αποτέλεσμα του γρήγορου μεταβολικού ρυθμού των ετερότροφων βακτηρίων (Σχήμα 3.13α) B C A Χρόνος (d) Σχήμα 3.12: Μεταβολή συγκέντρωση COD καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με απόβλητο οινοποιείου τριών διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. Τα ποσοστά απομάκρυνσης νιτρικού αζώτου κινήθηκαν σε χαμηλότερες τιμές σε σχέση με εκείνες των COD και σακχάρων, με υψηλότερη των 51.2% που σημειώθηκε στο αραιωμένο υπόστρωμα ανάπτυξης της πειραματικής σειράς Β. Η πρόσληψη του νιτρικού αζώτου από τους μικροοργανισμούς είναι φωτοεξαρτώμενη, με αποτέλεσμα σε αυτού του είδους απόβλητα με σκούρο χρώμα, η διέλευση φωτεινής ενέργειας να είναι περιορισμένη, οδηγώντας σε μικρότερα ποσοστά απομάκρυνσης νιτρικού αζώτου. Αυτό εξηγεί και γιατί στο πιο πυκνό υπόστρωμα ανάπτυξης (δηλαδή με τη μικρότερη αραίωση αποβλήτου σειρά Α) παρατηρήθηκε η μικρότερη τιμή ποσοστού απομάκρυνσης νιτρικού αζώτου (Πίνακας 3.11). Η 150

174 NO 2 (mgl1 ) TN (mgl 1 ) NO 3 (mgl1 ) Αποτελέσματα μεταβολή της συγκέντρωσης του νιτρικού αζώτου με το χρόνο δίνεται στο Σχήμα 3.13β. Όσο αφορά τη συγκέντρωση των νιτρωδών κυμάνθηκε κάτω από την τιμή των 0.2 mgl 1 σε όλες τις πειραματικές σειρές (Σχήμα 3.13γ). Όπως και στα υπόλοιπα υποστρώματα που εξετάστηκαν, έτσι και εδώ η απομάκρυνση ΤΝ σε κάθε σειρά πειραμάτων ήταν πάντα μεγαλύτερη εκείνης των αντίστοιχων NO 3 N, φθάνοντας σε ποσοστό μέχρι και 83.6% για την σειρά C, που αντιστοιχεί στο πιο αραιωμένο απόβλητο B C A B A C Σάκχαρα (mgl 1 ) (α) Χρόνος (d) (β) Χρόνος (d) 0,22 0,20 0,18 A B C A B C 0, ,14 0,12 0, , ,06 0, , , (γ) Χρόνος (d) (δ) Χρόνος (d) 151

175 Αποτελέσματα A B C 8 7 PO 3 4 (mgl1 ) (ε) Χρόνος (d) Σχήμα 3.13: Μεταβολή συγκέντρωσης των α) ολικών σακχάρων, β) NO 3, γ) NO 2, δ) ΤΝ και ε) PO 4 3 καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με απόβλητο οινοποιείου τριών διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. Ο φώσφορος με τη σειρά του σημείωσε υψηλά ποσοστά απομάκρυνσης που κυμάνθηκαν από 85% μέχρι και 97%, για ένα εύρος αρχικών συγκεντρώσεων μεταξύ 4 και 10 mg L 1. H μεταβολή της συγκέντρωσής του με το χρόνο παρουσιάζεται στο Σχήμα 3.13ε, όπου παρατηρείται ότι το μεγαλύτερο ποσοστό απομάκρυνσης λαμβάνει χώρα κατά τις 23 πρώτες μέρες, εφόσον η μορφή των ορθοφωσφορικών μπορεί να καταναλωθεί άμεσα από τα περισσότερα είδη των παρόντων μικροοργανισμών. Τέλος, σε όλα τα διεξαχθέντα πειράματα A, B, C υπολογίστηκε η συγκέντρωση ελαίων που συσσωρεύτηκε στη μικροβιακή βιομάζα. Δεν παρατηρήθηκε θετική αλληλεπίδραση μεταξύ παραγωγικότητας ελαίου και βιομάζας εφόσον η αύξηση της βιομάζας δεν απέδωσε σε συσσωρευμένο έλαιο (Πίνακας 3.12). Ωστόσο, η παραγωγικότητα του ελαίου ήταν ανάλογη με την περιεκτικότητα των λιπιδίων στη μικροβιακή ξηρή βιομάζα (Πίνακας 3.12). Το μέγιστο ποσοστό που καταγράφηκε ήταν 11% ξηρής βιομάζας στη πειραματική σειρά C, εξαιτίας της μεγαλύτερης αραίωσης του αποβλήτου που οδηγεί σε μεγαλύτερη διαύγεια, όπως αναφέρθηκε αναλυτικά και στην Ενότητα

176 Αποτελέσματα Πίνακας 3.12: Ποσοστό απομάκρυνσης COD και θρεπτικών συστατικών, ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, παραγωγικότητα βιομάζας και λιπιδίων και περιεχόμενο έλαιο ξηρής βιομάζας στα πειράματα κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης της καλλιέργειας Leptolyngbya sp. με χρήση αποβλήτου οινοποιείου Πειραμα τική σειρά NO 3 Απομάκρυνση % Ολικά 3 TN PO 4 Σάκχαρα Παραγωγικότητες Μέγιστο (mgl 1 d 1 ) περιεχόμενο έλαιο % COD Λιπιδίων Βιομάζας Ειδικός ρυθμός ανάπτυξη ς (d 1 ) A 31± ± ± ± ±8 3.06± B 51.2± ±2.3 97± ± ± ± C 38.4± ± ± ± ±9.4 11± Πειράματα κινητικής σε απόβλητο από μονάδα τυποποίησης σταφίδας με χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. Το απόβλητο στα πειράματα της ενότητας αυτής χορηγήθηκε από τη μονάδα τυποποίησης σταφίδας της Ένωσης Αγροτικών Συνεταιρισμών (Αίγιο) (Π.Ε.Σ. Α.Ε.), η οποία επεξεργάζεται και συσκευάζει κορινθιακή σταφίδα, σουλτανίνα, ελαιόλαδο και μίγματα αποξηραμένων φρούτων. Τα λύματα της εγκατάστασης προέρχονται από νερά που χρησιμοποιούνται για πλύσιμο των αποξηραμένων φρούτων (κυρίως σταφίδας) καθώς και νερά από τον καθαρισμό της μονάδας επεξεργασίας. Η συλλογή των αποβλήτων και η συντήρηση του αποβλήτου γίνονταν σε καταψύκτη θερμοκρασίας 20 ο C. Πραγματοποιήθηκαν τρεις σειρές πειραμάτων (A, B και C) στις οποίες χρησιμοποιήθηκαν τρεις διαφορετικές αραιώσεις του αποβλήτου με νερό βρύσης (Πίνακας 3.13). Για τον εμβολιασμό των πειραμάτων αυτών χρησιμοποιήθηκε εμβόλιο αυτότροφης καλλιέργειας (βλέπε αναλυτικά στην Ενότητα 3.3.1) στην εκθετική φάση ανάπτυξής της, αρχικής συγκέντρωσης 70±9.6 mgl 1. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν χωρίς προσθήκη CO 2, υπό διαλείπουσα λειτουργία σε ενυδρεία αιωρούμενης ανάπτυξης, όπου και συλλέγονταν ημερήσια δείγματα για την ανάλυση διαφόρων παραμέτρων. Το pη αρχικά ρυθμίζονταν στο 7.2±0.3, ενώ κατά τη 153

177 Αποτελέσματα διάρκεια της επεξεργασίας κυμαίνονταν μεταξύ 79, όντας κατάλληλο τόσο για αυτότροφη όσο και ετερότροφη ανάπτυξη. Οι αρχικές τιμές DO που καταγράφηκαν ήταν κάτω από 5 mg L 1 και μειώνονταν με το χρόνο μέχρι και την τιμή των 0.5 mg L 1, εξαιτίας της ετερότροφης αναπνοής (Lakaniemi et al., 2012; Zhou et al., 2014). Πίνακας 3.13: Αρχικές συγκεντρώσεις COD, βιομάζας και θρεπτικών συστατικών του αποβλήτου σταφίδας που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης με καλλιέργεια Leptolyngbya sp. Πειραματι κή σειρά Αρχικό COD (mg L 1 ) NO 3 Αρχικές συγκεντρώσεις (mg L 1 ) Ολικά 3 TN PO 4 Σάκχαρα Αρχική συγκέντρωση βιομάζας (mg L 1 ) C/N N/P A 8942± ± ± ± ± ± B 3660± ± ± ± ± ± C 1633± ± ± ± ± ± Στα εν λόγω πειράματα ο μέγιστος ρυθμός παραγωγής βιομάζας έφτασε μέχρι και την τιμή των mg (L d) 1. Οι ρυθμοί παραγωγής βιομάζας που σημειώθηκαν με το συγκεκριμένο απόβλητο είναι από τις μικρότερες που καταγράφηκαν σε σύγκριση με όλα τα προηγούμενα απόβλητα, δηλαδή τυροκομείου και οινοποιείου. Ωστόσο, είναι μεγαλύτεροι από το ρυθμό παραγωγής βιομάζας που σημειώθηκε με τη χρήση χημικού θρεπτικού μέσου (46 mg (L d) 1 ) για παρόμοιες αρχικές συγκεντρώσεις νιτρικών και φωσφορικών αλάτων, όπως παρουσιάστηκαν στην Ενότητα 3.3. Χημική ανάλυση των αραιωμένων υποστρωμάτων (Πίνακας 3.14) έδειξε ότι το απόβλητο της σταφίδας είναι «φτωχότερο» θρεπτικό μέσο από τα απόβλητα τυροκομείου και του οινοποιείου και δεν είχε τη δυνατότητα να παρέχει όλα τα απαραίτητα θρεπτικά στοιχεία για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών. Πίνακας 3.14: Χημική ανάλυση σε αραιωμένα απόβλητα τυροκομείου, οινοποιείου και μονάδας τυποποίησης σταφίδας 154

178 Αποτελέσματα Χημικές παράμετροι (mg L 1 ) 5% οινοποιείο 30% σταφίδα 16% τυροκομείο K Na Ca Mg F Li Br Cl SO COD TN Ολικά Σάκχαρα Για το λόγο αυτό η αύξηση της βιομάζας που καταγράφηκε συναρτήσει του χρόνου δεν παρουσίασε μεγάλη άνοδο (Σχήμα 3.14). Ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης κυμάνθηκε από 0.27d 1 μέχρι και 0.47d 1 (Πίνακας 3.14) A B C Βιομάζα (mgl 1 ) Χρόνος (d) Σχήμα 3.14: Μεταβολή της συγκέντρωσης βιομάζας στα πειράματα κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης με απόβλητο σταφίδας τριών διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. 155

179 dcod (mgl 1 ) Αποτελέσματα Η μεταβολή του COD συναρτήσει του χρόνου απεικονίζεται στο Σχήμα 3.15, όπου και διακρίνεται η δυσκολία απομάκρυνσης του οργανικού φορτίου στο πείραμα Α με την υψηλή αρχική συγκέντρωση COD (8942 mgl 1 ). Ωστόσο, για αρχικές συγκεντρώσεις COD κάτω από 4000 mg L 1 επιτυγχάνονται υψηλότερα ποσοστά απομάκρυνσης, πάνω από 60% μέσα σε 89 ημέρες (Πίνακας 3.13) A B C Χρόνος (d) Σχήμα 3.15: Μεταβολή της συγκέντρωσης COD καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με απόβλητο σταφίδας τριών διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. Όσον αναφορά την απομάκρυνση των θρεπτικών στοιχείων από το απόβλητο, των οποίων οι συγκεντρώσεις τους συναρτήσει του χρόνου απεικονίζονται αναλυτικά στο Σχήμα 3.16, η κατανάλωσή τους από τους μικροοργανισμούς ποικίλει. Συγκεκριμένα, η απορρόφηση των ολικών σακχάρων σημείωσε τα υψηλότερα ποσοστά (93.4%) στο πιο πυκνό υπόστρωμα ανάπτυξης, δηλαδή στο πείραμα Α που χρησιμοποιήθηκε απόβλητο με την μικρότερη αραίωση. Παρόμοια ποσοστά καταγράφηκαν και στην επόμενη σειρά Β (92.3%), που επίσης υπήρχαν υψηλές αρχικές τιμές σακχάρων. Μάλιστα και για τις δύο σειρές πειραμάτων το 90% της απομάκρυνσης πραγματοποιήθηκε τις πρώτες 45 ημέρες (Σχήμα 3.16α). Ωστόσο, στο αραιότερο υπόστρωμα ανάπτυξης, με την μικρότερη αρχική συγκέντρωση σακχάρων, καταγράφηκε το μικρότερο ποσοστό απομάκρυνσης, μόλις 48%. 156

180 NO 2 (mgl1 ) PO 3 4 (mgl1 ) NO 3 (mgl1 ) Αποτελέσματα Οι απομακρύνσεις νιτρικού αζώτου κινήθηκαν σε ποσοστά απομακρύνσεων μεταξύ 2338% ενώ το ολικό άζωτο, το οποίο καταναλώνεται από περισσότερα είδη μικροοργανισμών, σημείωσε μεγαλύτερη μείωση από 52 μέχρι και 70% (Σχήμα 3.16β και ε). Η συγκέντρωση των νιτρωδών καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων ήταν πάντα κάτω από την τιμή των 0.15 mg L 1 (Σχήμα 3.16γ). Ο φώσφορος σημείωσε υψηλά ποσοστά απομάκρυνσης που κυμάνθηκαν από 78 μέχρι 81% για ένα εύρος αρχικών συγκεντρώσεων από 3 και 9 mg L 1, αντίστοιχα. H μείωση της συγκέντρωσης του φωσφόρου με το χρόνο παρουσιάζεται στο Σχήμα 3.16δ. Να επισημανθεί ότι η αρχική συγκέντρωση ορθοφωσφορικών κοντά στα 2 mg L 1, δυσκολεύει την αύξηση βιομάζας στο συγκεκριμένο σύστημα καλλιέργειας A B C A B C Σάκχαρα (mgl 1 ) (α) Χρόνος (d) (β) Χρόνος (d) 0,16 0,14 0,12 A B C C A B 0,10 6 0,08 5 0,06 4 0, ,02 1 0, (γ) Χρόνος (d) Χρόνος (d) (δ) 157

181 TN (mgl 1 ) Αποτελέσματα A B C (ε) Χρόνος (d) Σχήμα 3.16: Μεταβολή της συγκέντρωσης των α) ολικών σακχάρων, β) NO 3, γ) NO 3 2, δ) PO 4 και ε) TN καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης με απόβλητο σταφίδας τριών διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. Τέλος, υπολογίστηκε η συγκέντρωση ελαίων που συσσωρεύτηκε στη μικροβιακή βιομάζα σε όλες τις πειραματικές σειρές. Η παραγωγικότητα του ελαίου δεν ήταν ανάλογη με την περιεκτικότητα των λιπιδίων στη μικροβιακή ξηρή βιομάζα εφόσον σε υψηλό περιεχόμενο έλαιο σημειώθηκαν χαμηλές παραγωγικότητες ελαίου και αντιστρόφως (Πίνακας 3.15). Τα μέγιστα ποσοστά περιεχόμενου ελαίου στη ξηρή βιομάζα που επετεύχθησαν παρουσιάζονται στον Πίνακα 3.15, όπου παρατηρείται αύξηση του συσσωρευμένου ελαίου με τη χρήση πιο αραιωμένου αποβλήτου. Το μέγιστο ποσοστό που καταγράφηκε ήταν 11.6% επί ξηρής βιομάζας στη πειραματική σειρά C, το οποίο όπως αναφέρθηκε και στις Ενότητες και οφείλεται στη μεγαλύτερη διαύγεια του υποστρώματος ανάπτυξης, εξαιτίας της μεγαλύτερης αραίωσης του αποβλήτου. Πίνακας 3.15: Ποσοστό απομάκρυνσης COD και θρεπτικών συστατικών, ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, παραγωγικότητα βιομάζας και λιπιδίων και περιεχόμενο έλαιο ξηρής βιομάζας στα πειράματα κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης με καλλιέργεια Leptolyngbya sp. και χρήση αποβλήτου σταφίδας 158

182 Αποτελέσματα Πειραματ ική σειρά NO 3 Απομάκρυνση % Ολικά 3 TN PO 4 Σάκχαρα Παραγωγικότητες Μέγιστο (mgl 1 d 1 ) περιεχόμεν COD ο έλαιο % Λιπιδίων Βιομάζας Ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (d 1 ) A 23.4± ± ± ±0.8 11±6 3.2± B 38.8± ± ± ± ± ±0.35 C 36± ± ± ± ± Πειράματα κινητικής σε μεικτό απόβλητο οινοποιείου σταφίδας με χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. Στην ενότητα αυτή χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα ανάπτυξης της καλλιέργειας Leptolyngbya sp. μείγμα αποβλήτων οινοποιείου και σταφίδας. Η ιδέα αυτή προέκυψε από την ανάγκη μείωσης του πόσιμου νερού ως μέσο αραίωσης, αλλά και από την χαμηλή περιεκτικότητα του αποβλήτου σταφίδας σε θρεπτικά στοιχεία (Πίνακας 3.14). Ως εκ τούτου, θέλοντας να μειωθεί η θολερότητα του αποβλήτου οινοποιείου (που είχε έντονο σκούρο χρώμα) χωρίς να γίνει χρήση πόσιμου νερού για αραίωση, αξιοποιήθηκε το απόβλητο σταφίδας. Με τον τρόπο αυτό προέκυψε μείγμα αποβλήτου (οινοποιείου και σταφίδας) με νέα πλέον χαρακτηριστικά. Η αναλογία μίξης των αποβλήτων που χρησιμοποιήθηκε ήταν 90% (σταφίδας) 10% (οινοποιείου) για όλες τις σειρές πειραμάτων που διεξήχθησαν. Η συντήρηση των μειγμάτων αποβλήτου γίνονταν στους 20 ο C. Πραγματοποιήθηκαν τέσσερις σειρές πειραμάτων (A, B, C και D), στις οποίες χρησιμοποιήθηκαν τέσσερις διαφορετικές αραιώσεις μείγματος αποβλήτου με νερό βρύσης ως υπόστρωμα για την ανάπτυξη της αυτότροφης καλλιέργειας. Οι διαφορετικές αναλογίες αραίωσης είχαν ως αποτέλεσμα τη δημιουργία αποβλήτου με διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών συστατικών και οργανικού φορτίου (Πίνακας 3.16). Για τον εμβολιασμό των πειραμάτων αυτών χρησιμοποιήθηκε (βλέπε Ενότητα 3.3.1) καλλιέργεια στην εκθετική φάση ανάπτυξης αρχικής συγκέντρωσης 70±9.6 mgl 1. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν χωρίς προσθήκη CO 2, υπό διαλείπουσα λειτουργία σε ενυδρεία αιωρούμενης ανάπτυξης όπου και συλλέγονταν ημερήσια δείγματα για την ανάλυση διαφόρων παραμέτρων. Το pη αρχικά 159

183 Αποτελέσματα ρυθμίζονταν στην τιμή 7.2 ± 0.3 με τη χρήση διαλύματος NaOH 5Μ, ενώ κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας κυμαίνονταν μεταξύ 79. Οι αρχικές τιμές DO κυμαίνονταν μεταξύ 6.8 και 8.7 mg L 1 μειώνονταν όμως με το χρόνο φτάνοντας μέχρι και 0.5 mg L 1, πιθανόν λόγω της ετερότροφης αναπνοής (Lakaniemi et al., 2012; Zhou et al., 2014). Πίνακας 3.16: Αρχικές συγκεντρώσεις COD, βιομάζας και θρεπτικών συστατικών του μεικτού αποβλήτου που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης με την καλλιέργεια Leptolyngbya sp. Αρχικές συγκεντρώσεις Πειραματικ ή σειρά Αρχικό COD (mg L 1 ) NO 3 (mg L 1 ) Ολικά 3 TN PO 4 Σάκχαρα Αρχική συγκέντρωσ η βιομάζας (mg L 1 ) C/N N/P A 7817± ± ±10 8.7± ± ± B 6389± ± ± ± ±77.7 C 2644± ± ± ± ± ± ± D 1731± ± ± ± ± ± Στο Σχήμα 3.17 απεικονίζεται η μεταβολή της συγκέντρωσης της βιομάζας με το χρόνο. Ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης σε αυτές τις σειρές πειραμάτων κυμάνθηκε από 0.17d 1 μέχρι και 0.382d 1 (Πίνακας 3.17). Ο μέγιστος ρυθμός παραγωγής βιομάζας άγγιξε την τιμή των mg (L d) 1 που είναι μεγαλύτερος σε σύγκριση με τα πειράματα στα οποία χρησιμοποιήθηκε χημικό θρεπτικό μέσο ανάπτυξης με παρόμοιες αρχικές συγκεντρώσεις νιτρικών και φωσφορικών αλάτων (μόλις 83.8 mg (L d) 1 ) (Ενότητα 3.3). 160

184 Αποτελέσματα A B C D 1200 Βιομάζα (mgl 1 ) Χρόνος (d) Σχήμα 3.17: Μεταβολή συγκέντρωσης βιομάζας καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με μεικτό απόβλητο τεσσάρων διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. Στα πειράματα με το μεικτό απόβλητο οι αρχικές τιμές COD κυμάνθηκαν από 1700 μέχρι και 7800 mgl 1. Στο Σχήμα 3.18 που ακολουθεί παρουσιάζεται η μεταβολή του COD με το χρόνο όπου γίνεται αντιληπτό πως για υψηλές αρχικές τιμές COD το συγκεκριμένο σύστημα είναι σε θέση να απομακρύνει λιγότερο από το 50% του οργανικού φορτίου του μεικτού αποβλήτου, ενώ στα πειράματα με τις χαμηλότερες αρχικές συγκεντρώσεις το ποσοστό αυτό αυξάνεται πάνω από την τιμή των 90%. Το μέγιστο ποσοστό απομάκρυνσης (94.3%) επιτεύχθηκε στο πείραμα D που αντιστοιχεί στην μικρότερη εφαρμοζόμενη αρχική τιμή COD των 1731 mgl 1 (Πίνακας 3.17). Στο Σχήμα 3.19 που ακολουθεί παρουσιάζονται οι μεταβολές συγκέντρωσης των θρεπτικών συστατικών με το χρόνο. Η κατανάλωση των ολικών σακχάρων σημείωσε τα υψηλότερα ποσοστά στα πιο πυκνά υποστρώματα ανάπτυξης (σειρές Α και Β). Μάλιστα και για τις δύο σειρές το 90% της απομάκρυνσης πραγματοποιήθηκε τις πρώτες 4 ημέρες (Σχήμα 3.19α). 161

185 dcod (mgl 1 ) Αποτελέσματα A B C D Χρόνος (d) Σχήμα 3.18: Μεταβολή συγκέντρωσης COD καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής με μεικτό απόβλητο τεσσάρων διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. Στο αραιότερο υπόστρωμα ανάπτυξης με την μικρότερη αρχική συγκέντρωση σακχάρων (62 mg L 1 ) καταγράφηκε το μικρότερο ποσοστό απομάκρυνσης σακχάρων (μόλις 23%) για όλα τα διεξαχθέντα πειράματα της παρούσας διατριβής. Οι απομακρύνσεις νιτρικού αζώτου κυμάνθηκαν επίσης σε χαμηλά ποσοστά, περίπου 28% για τα πιο πυκνά υποστρώματα (σειρές Α, Β), ενώ για τα αραιότερα υποστρώματα ανάπτυξης (σειρές C, D) σημειώθηκαν μεγαλύτερα ποσοστά φτάνοντας μέχρι και την τιμή των 63%. Όπως και στα προηγούμενα απόβλητα το ολικό άζωτο εμφάνισε τις υψηλότερες τιμές απομάκρυνσής του στα πιο αραιά υποστρώματα ανάπτυξης, φτάνοντας την τιμή των 78%. Ο φώσφορος σημείωσε υψηλότερα ποσοστά απομάκρυνσης από τα σάκχαρα και το νιτρικό άζωτο, με τιμές πάνω από 95% για τις περισσότερες πειραματικές σειρές. Το μέγιστο ποσοστό (99%) επιτεύχθηκε στην πειραματική σειρά C όπου υπολογίστηκε η μικρότερη αναλογία C/N (Πίνακας 3.16). H μείωση των ορθοφωσφορικών σε σχέση με το χρόνο παρουσιάζεται στο Σχήμα 3.19ε. Επίσης, η συγκέντρωση των νιτρωδών ήταν πάντα κάτω από την τιμή των 0.15 mgl 1 σε όλες τις πειραματικές σειρές καθ όλη τη διάρκειά τους (Σχήμα 3.19γ). 162

186 PO 3 4 (mgl1 ) NO 2 (mgl1 ) TN (mgl 1 ) NO 3 (mgl1 ) Αποτελέσματα A B C D A B C D Σάκχαρα (mgl 1 ) (α) Χρόνος (d) (β) Χρόνος (d) 0,14 0,12 A B C D A B C D 0, ,08 0,06 0,04 0,02 0, (γ) Χρόνος (d) (δ) A B C D Χρόνος (d) (ε) Χρόνος (d) 163

187 Αποτελέσματα Σχήμα 3.19: Μεταβολή της συγκέντρωσης των α) ολικών σακχάρων, β) NO 3, γ) NO 3 2, δ) ΤΝ και ε) PO 4 καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης με μεικτό απόβλητο τεσσάρων διαφορετικών αραιώσεων και χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. Αξίζει να επισημανθεί, ότι η πειραματική σειρά C με τη μικρότερη αναλογία C/N (55.6) εμφάνισε τα υψηλότερα ποσοστά απομάκρυνσης ολικού αζώτου, ορθοφωσφορικών, COD και παραγόμενου ελαίου. Επίσης στην ίδια σειρά, παρουσιάστηκε και η μέγιστη αναλογία N/P (10.35) όταν στις υπόλοιπες (Α, Β και D) οι λόγοι που σημειώθηκαν ήταν 4.5, 4.8 και 6.3, αντίστοιχα. Ανασκόπηση της βιβλιογραφίας, δείχνει ότι όταν ο λόγος N/P είναι 14/1 ή μεγαλύτερος, ευνοούνται οι ρυθμοί απομάκρυνσης οργανικών και ανόργανων συστατικών καθώς και η παραγωγικότητα της βιομάζας (Su et al., 2011; Chen et al., 2012; Singh and Thakur, 2015). Πίνακας 3.17: Ποσοστό απομάκρυνσης COD, βιομάζας και θρεπτικών συστατικών, ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, παραγωγικότητα βιομάζας και λιπιδίων και περιεχόμενο έλαιο ξηρής βιομάζας στα πειράματα κινητικής αιωρούμενης ανάπτυξης με καλλιέργεια Leptolyngbya sp. και χρήση μεικτού αποβλήτου Πειραμα τική σειρά NO 3 Απομάκρυνση % TN PO 4 3 Ολικά Σάκχαρα Παραγωγικότητες Μέγιστο (mgl 1 d 1 ) COD περιεχόμεν ο έλαιο % Λιπιδίων Βιομάζας Ειδικός ρυθμός ανάπτυξ ης (d 1 ) A 28.3± ± ±3.6 86± ± ± B 28.7± ± ± ± ± ± C 62.4± ±2.5 99± ± ± ± D 63.72± ± ± ±7 94.3±2.5 5± Τέλος, υπολογίστηκε η συγκέντρωση ελαίων που συσσωρεύτηκε στη μικροβιακή βιομάζα. Δεν παρατηρήθηκε θετική αλληλεπίδραση μεταξύ παραγωγικότητας ελαίου και βιομάζας καθώς η αύξηση της βιομάζας δεν οδήγησε σε συσσώρευση περισσότερου ελαίου (Πίνακας 3.17). Ομοίως, ούτε η παραγωγικότητα ελαίου ήταν ανάλογη με την περιεκτικότητα των λιπιδίων στη μικροβιακή ξηρή 164

188 Αποτελέσματα βιομάζα (Πίνακας 3.17). Το μέγιστο ποσοστό που καταγράφηκε ήταν 12.9% ξηρής βιομάζας στη πειραματική σειρά C ακολουθώντας η πειραματική σειρά Β με 12.5% ξηρής βιομάζας. Αξίζει να σημειωθεί, ότι τα συγκεκριμένα ποσοστά ήταν από τα υψηλότερα που επιτεύχθηκαν για όλες τις σειρές πειραμάτων με όλα τα απόβλητα που εξετάστηκαν στις προηγούμενες ενότητες. 3.4 Ανάλυση λιπιδίων Η καταλληλότητα του ελαίου που προέρχεται από τις καλλιέργειες μικροφυκών για εφαρμογές βιοντίζελ δεν εξαρτάται μόνο από την ποσότητα του ελαίου που παράγεται, αλλά και από τον τύπο και τη δομή των λιπαρών οξέων (FAs) που είναι παρόντα στο έλαιο. Συνήθως, η παρουσία ακόρεστων λιπαρών οξέων οδηγεί σε χαμηλό αριθμό κετανίων και αυξημένες εκπομπές οξειδίων του αζώτου (NOx). Από την άλλη, τα ακόρεστα λιπαρά οξέα είναι επιρρεπή στην οξείδωση, το οποίο επίσης επηρεάζει τη λιπαντικότητα του βιοντίζελ (Hakalin et al., 2014). Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό το βιοντίζελ να έχει υψηλά επίπεδα κορεσμένων και μονοακόρεστων λιπαρών οξέων αλλά χαμηλά επίπεδα πολυακόρεστων λιπαρών οξέων. Τα λιπαρά οξέα που ενδείκνυται για βιοντίζελ περιλαμβάνουν C14:0, C16:0, C16:1, C18:0, C18:1 και C18:2 (Knothe, 2008; Ummalyma and Sukumaran, 2014). Συγκεκριμένα, το C18:1 θεωρείται ιδανικό για βιοντίζελ, διότι παρέχει καλύτερες ιδιότητες ψυχρής ροής, χωρίς απώλειες οξειδωτικής αποικοδόμησης (Mittelbach and Remschmidt, 2004). Επιπλέον, με βάση τα Ευρωπαϊκά Πρότυπα Βιοντίζελ EN14214 για χρήση οχημάτων, το περιεχόμενο του λινολενικό (18:3) πρέπει να περιορίζεται σε ένα μέγιστο 12% (Knothe, 2005) Ανάλυση λιπαρών οξέων από καλλιέργειες με Choricystis sp. Σύμφωνα με τους Krienitz and Wirth (2006) το Choricystis minor, το οποίο είναι ένα άφθονο και παραγωγικό χλωρόφυτο του πικοπλαγκτού στις λίμνες γλυκού νερού, είναι πλούσιο σε αλινολενικό οξύ (C18:3a). Για το λόγο αυτό, στα είδη των λιπαρών οξέων που συσσωρεύτηκαν στη μικροβιακή βιομάζα (κυριαρχούσα από Choricystis) η οποία είχε αναπτυχθεί σε τεχνητό θρεπτικό μέσο (σειρά πειραμάτων 165

189 Αποτελέσματα Ενότητας 3.2) εμφανίστηκε ένα ποσοστό C18:3 17% (Σχήμα 3.20 (α)), το οποίο σύμφωνα με τα Ευρωπαϊκά Πρότυπα Βιοντίζελ είναι αρκετά υψηλό. Οι συγκεντρώσεις των C18:1, C16:0, C18:2, C16:1 και C18:0 ήταν 26.6, 21.8, 16.1, 7.4 και 5.0%, αντίστοιχα. Στο Σχήμα 3.20(β) παρουσιάζεται το προφίλ των λιπαρών οξέων που συσσωρεύτηκε στη μικροβιακή βιομάζα (κυριαρχούσα από Choricystis) όταν αυτή καλλιεργήθηκε με υπόστρωμα αραιωμένο απόβλητο τυροκομείου (συγκεκριμένα για την πειραματική σειρά C της Ενότητας στην οποία καταγράφηκε και η μέγιστη περιεκτικότητα ελαίου ξηρής βιομάζας). Τα κυρίαρχα λιπαρά οξέα που εντοπίστηκαν ήταν το C18:1 και C16:0 με αναλογίες 43% και 24%, αντίστοιχα. Επίσης, τα C18:3, C18:2, C18:0 και C16:1 ήταν παρόντα σε σημαντικά ποσοστά των 11%, 9.4%, 4.5% και 4%, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα εμφανίζουν αυξημένες αναλογίες των C18:1 και C16:0, σε σύγκριση με τα ποσοστά από καλλιέργεια με τεχνητό θρεπτικό υλικό για το Choricystis, ενώ παράλληλα το ποσοστό του C18:3 μειώθηκε σημαντικά από 17% σε 11%. Αυτή η τροποποίηση στη σύνθεση των λιπαρών οξέων μπορεί να αντανακλάται στην προσαρμογή της καλλιέργειας στο αντίστοιχο θρεπτικό υπόστρωμα (Ummalyma and Sukumaran, 2014). Παρόμοια υψηλά ποσοστά για το C16:0 (μέχρι και 36%), το C18:1(μέχρι και 32%) και το C18:2 (μέχρι και 36%), κατέγραψαν για το Choricystis minor και οι Sobczuk and Chisti (2010), όταν εξετάστηκε το προφίλ των λιπαρών οξέων που παράγει σε διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας με τεχνητό χημικό υπόστρωμα ανάπτυξης. Η απουσία λιπαρών οξέων μακράς αλειφατικής αλυσίδας, οι υψηλές αναλογίες κορεσμένων και μονοακόρεστων λιπαρών οξέων (σχεδόν 79%) στο λιπιδικό περιεχόμενο καθώς και η χαμηλή τιμή του C18:3 υποδεικνύουν ότι το έλαιο που λαμβάνεται είναι κατάλληλο για παραγωγή βιοντίζελ. Αυτό το προφίλ λιπαρών οξέων είναι ανάλογο με τα προφίλ λιπαρών οξέων που έχουν αναφερθεί βιβλιογραφικά για μία ποικιλία χλωροφυκών που καλλιεργούνται σε παρόμοια υποστρώματα, όπως διήθημα ορρού γάλακτος (EspinosaGonzalez et al., 2014) και αναερόβια επεξεργαζόμενα γαλακτοκομικά απόβλητα (Levine et al., 2011). 166

190 Αποτελέσματα (α) (β) Λιπαρά οξέα % Λιπαρά οξέα % C10:0 C12:0 C14:0 C14:1 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 alpha 0 C10:0 C12:0 C14:0 C14:1 C16:0 C16:1 C18:0 Σχήμα 3.20: Είδη λιπαρών οξέων που παράχθηκαν από καλλιέργεια Choricystis σε C18:1 C18:2 C18:3 alpha υπόστρωμα α) τεχνητό χημικό μέσο και β) αραιωμένο απόβλητο τυροκομείου (σειρά πειράματος C, Πίνακας 3.5) Ανάλυση λιπαρών οξέων από καλλιέργειες με Leptolyngbya sp. Προκειμένου να εκτιμηθεί η ποιότητα του βιοντίζελ από τις καλλιέργειες Leptolyngbya sp., εξετάστηκε η περιεκτικότητα του ελαίου που συσσωρεύτηκε στα μικροβιακά κύτταρα της εν λόγω καλλιέργειας. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση σύστασης των ολικών λιπιδίων σε λιπαρά οξέα και το προφίλ των λιπαρών οξέων για κάθε σύστημα καλλιέργειας παρουσιάζεται αναλυτικά στο Σχήμα Γίνεται αντιληπτό πως ο τρόπος καλλιέργειας των Leptolyngbya sp. επηρεάζει το πρότυπο αύξησης της βιομάζας καθώς και την ποιότητα και την ποσότητα των προϊόντων βιοντίζελ. Τα κύρια λιπαρά οξέα που ανιχνεύθηκαν σε όλα τα υποστρώματα των υγρών αποβλήτων ήταν τα: C18:1 (1939%), C16:0 (2031%), C16:1 (718%), C18:2 (717%) και C18:0 (39%), τα οποία είναι τα πιο κοινά λιπαρά οξέα που απαντούν σε βιοντίζελ (Knothe, 2008). Το Leptolyngbya ταξινομικά έχει μεγάλη ετερογένεια (Komárek, 2016) και δεν έχει μελετηθεί επαρκώς για την δυνατότητα χρησιμοποίησής του ως πρώτη ύλη για παραγωγή βιοντίζελ. Τα είδη των μεθυλεστέρων λιπαρών οξέων που παρουσιάζονται στη παρούσα μελέτη είναι σύμφωνα με προηγούμενες δημοσιευμένες μελέτες για το Leptolyngbya sp. (Rós et al., 2013; Singh and Thakur, 2015), στις οποίες το μέγεθος της ανθρακικής αλυσίδας κυμαίνεται από 12 έως 18 άτομα άνθρακα, με κυρίαρχα ωστόσο τα λιπαρά οξέα C16 και C18. Όταν το Leptolyngbya 167

191 Αποτελέσματα sp. αναπτύσσεται σε απόβλητα, το παλμιτικό (C16:0) και το στεατικό οξύ (C18:0) αποτελούν ένα σημαντικό ποσοστό του συνόλου των κορεσμένων λιπαρών οξέων, σε αντίθεση με εκείνο που παράγονται όταν στελέχη του ίδιου γένους αναπτύσσονται σε τεχνητά θρεπτικά υποστρώματα, υποδεικνύοντας ότι το στέλεχος αποτελεί κατάλληλη πρώτη ύλη βιοντίζελ (Bai et al., 2013; Singh and Thakur, 2015). Σύμφωνα με το Σχήμα 3.21, η μικροβιακή καλλιέργεια με υπόστρωμα ανάπτυξης απόβλητο οινοποιείου παρουσίασε το υψηλότερο ποσοστό σε ελαϊκό οξύ (C18:1) (39.12%), ακολουθούμενο από αυτό του υποστρώματος τυροκομείου (28.1%) (Σχήμα 3.21β, 3.21α, αντίστοιχα). Τα μιξότροφα ή ετερότροφα μικροβιακά κύτταρα εμφανίζουν πολύ υψηλότερο περιεχόμενο ελαϊκού οξέος (18:1) που ισορροπεί την οξειδωτική σταθερότητα σε χαμηλές θερμοκρασίες. Στα πειράματα με χρήση μεικτού αποβλήτου όπου επετεύχθη παραγωγή σχεδόν 13% ελαίου επί ξηρής βιομάζας, το περιεχόμενο σε παλμιτικό οξύ (C16:0) ήταν υψηλότερο σε σχέση με εκείνο που καταγράφηκε για τα υπόλοιπα υποστρώματα (τυροκομείου, σταφίδας, οινοποιείου και συνθετικών χημικών μέσων) υποδεικνύοντας ότι το βιοντίζελ που παράγεται έχει υψηλότερη οξειδωτική σταθερότητα. Είναι επίσης αξιοσημείωτη η διαφορά στο προφίλ των λιπαρών οξέων, όσο αναφορά την παραγωγή καπρικού οξέος (C10:0), στη περίπτωση χρήσης συνθετικών υποστρωμάτων ανάπτυξης καθώς με αυτά παρατηρείται μεγαλύτερη παραγωγή του σε σχέση με τη χρήση αποβλήτων (Σχήμα 3.21(α, β, γ, δ) και Σχήμα 3.21ε). Επιπλέον, το περιεχόμενο σε λινολενικό οξύ (C18:3) ήταν κάτω από 12% σε όλα τα πειράματα που διεξήχθησαν, υποδεικνύοντας την καταλληλότητα των συντιθέμενων λιπιδίων για χρήση σε οχήματα, σύμφωνα με τα ευρωπαϊκά πρότυπα βιοντίζελ (Knothe, 2005). Τέλος, ακολουθώντας τα πρότυπα του ιδανικού βιοντίζελ από τους Schenk et al. (2008) και Josephine et al. (2015), περιέχει όχι μόνο μικρές ανθρακικές αλυσίδες από 16 μέχρι 18 άτομα άνθρακα με κορεσμένα, μονο ή διακόρεστα λιπαρά οξέα, αλλά και ένα σημαντικό ποσοστό αθροίσματος C14:0, C16:0, C16:1, C18:0, C18:1 και C18:2. Υπολογίζοντας το παραπάνω άθροισμα για όλες τις πειραματικές ομάδες, το υψηλότερο ποσοστό (89.13%) παρατηρήθηκε με τη χρήση υποστρώματος μεικτού αποβλήτου, ενώ ακολούθησε η χρήση αποβλήτου σταφίδας, οινοποιείου και τυροκομείου με 88.8%, 85.4%, 85.3%, αντίστοιχα. Τα πειράματα με χρήση χημικού συνθετικού μέσου έδωσαν ποσοστό του αθροίσματος μόλις 75.8%. Η αλλαγή στην σύνθεση των λιπαρών οξέων του μικροβιακού ελαίου που παράγεται στα 168

192 Λιπαρά οξέα % Λιπαρά οξέα % Λιπαρά οξέα % Λιπαρά οξέα % Αποτελέσματα υποστρώματα των αποβλήτων μπορεί να έχει προστατευτικό ρόλο ώστε να επιτρέπει στα μικρόβια να προσαρμόζονται στις μεταβαλλόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες. Ως εκ τούτου, οι συνθήκες καλλιέργειας θα πρέπει να ρυθμίζονται προκειμένου να λαμβάνεται το επιθυμητό προφίλ λιπαρών οξέων για βιοκαύσιμα. Όλα τα προαναφερόμενα χαρακτηριστικά του προφίλ των λιπαρών οξέων που καταγράφηκαν από τη συλλεγόμενη μικροβιακή βιομάζα (όπως οι υψηλές ποσότητες κορεσμένων και μονοακόρεστων λιπαρών οξέων, χαμηλές τιμές λινολενικού οξέος), υποδεικνύουν την καταλληλότητα του συστήματος των μικροοργανισμών για την παραγωγή υψηλής ποιότητας βιοντίζελ (α) (β) C10:0 C12:0 C14:0 C14:1 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 alpha 0 C10:0 C12:0 C14:0 C14:1 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 alpha others (γ) (δ) C10:0 C12:0 C14:0 C14:1 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 alpha others 0 C10:0 C12:0 C14:0 C14:1 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 alpha others 169

193 Λιπαρά οξέα % Αποτελέσματα (ε) C10:0 C12:0 C14:0 C14:1 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 alpha Σχήμα 3.21: Είδη λιπαρών οξέων που παρήχθησαν από καλλιέργεια αιωρούμενης ανάπτυξης Leptolyngbya με υπόστρωμα α) απόβλητο τυροκομείου, β) απόβλητο οινοποιείου, γ) απόβλητο σταφίδας, δ) μεικτό απόβλητο (οινοποιείοσταφίδας) και ε) τεχνητό χημικό μέσο others 3.5 Συζήτηση Αποτελέσματα πειραμάτων στα συστήματα αιωρούμενης ανάπτυξης Στο Κεφάλαιο 3 μελετήθηκε η ικανότητα μεικτών αυτότροφων καλλιεργειών που βασίζονται σε μικροφύκη/κυανοβακτήρια να απομακρύνουν από μη αποστειρωμένα απόβλητα θρεπτικά συστατικά και οργανικό φορτίο, σε συστήματα αιωρούμενης ανάπτυξης. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν απόβλητα τυροκομείου, οινοποιείου, απόβλητα από βιομηχανία τυποποίησης σταφίδας αλλά και μείγμα των δύο τελευταίων αποβλήτων. Παράλληλα, μελετήθηκε η δυνατότητα παραγωγής μικροβιακών ελαίων από την παραγόμενη βιομάζα, μέσω προσδιορισμού της περιεκτικότητας ελαίου στην ξηρή μικροβιακή βιομάζα. Αρχικά, εξετάστηκε η χρήση καλλιέργειας του μικροφύκους Choricystis sp. για τη δυνατότητα παραγωγής βιομάζας και ταυτόχρονης επεξεργασίας αποβλήτου τυροκομείου. Στη συνέχεια, εξετάστηκε το ίδιο απόβλητο με χρήση καλλιέργειας του κυανοβακτηρίου Leptolyngbya sp., ενώ για την ίδια καλλιέργεια ακολούθησε η χρήση αποβλήτων οινοποιίας, σταφίδας και μείγματος αυτών ως υποστρώματα ανάπτυξης. Πρέπει να αναφερθεί ότι τα δύο παραπάνω είδη δεν είναι επαρκώς μελετημένα στη βιβλιογραφία ως προς την ικανότητά τους να απομακρύνουν ρυπαντικό φορτίο από υγρά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα αλλά ούτε υπάρχουν δεδομένα που αφορούν την 170

194 Αποτελέσματα ποσότητα και την ποιότητα του ελαίου που μπορούν να παράγουν όταν καλλιεργούνται σε αυτά. Τα εξεταζόμενα λύματα είναι ιδιαίτερα ρυπογόνα, όξινα, με σημαντικά υψηλές τιμές COD, BOD και συγκεντρώσεις θρεπτικών συστατικών. Λόγω των αυστηρών νομοθετικών πλαισίων για την ποιότητα των εκροών, τα λύματα θα πρέπει να επεξεργάζονται πριν απορριφθούν στους αστικούς αγωγούς. Οι μέθοδοι επεξεργασίας που συνήθως χρησιμοποιούνται είναι είτε φυσικοχημικές ή βιολογικές. Η βιολογική επεξεργασία των υγρών αποβλήτων παρουσιάζει αρκετά πλεονεκτήματα και πραγματοποιείται από διαφορετικές ομάδες μικροοργανισμών (Tatoulis et al., 2015). Στις βιολογικές μεθόδους περιλαμβάνεται και η χρήση μικροφυκών με τα οποία έχουν γίνει αρκετές μελέτες (Πίνακας 3.18). Ως υποστρώματα ανάπτυξης μικροφυκών έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορα απόβλητα όπως είναι τα αστικά λύματα (AbdelRaouf et al., 2012; Ma et al., 2014), τα απόβλητα χοιροστασίων (Mulbry et al., 2008a; Zhu et al., 2013) και άλλα αγροτοβιομηχανικά απόβλητα (Markou and Georgakakis, 2011; Cicci et al., 2013; Van Wagenen et al., 2015). Στις περισσότερες μελέτες, χρησιμοποιήθηκαν ασηπτικές συνθήκες καλλιέργειας μειώνοντας έτσι τη δυνατότητα χρήσης της εφαρμογής της μεθόδου σε μεγαλύτερη κλίμακα. Ανασκόπηση της βιβλιογραφίας δείχνει ότι πολλές μελέτες χρησιμοποίησαν γαλακτοκομικά απόβλητα ως υπόστρωμα ανάπτυξης μικροφυκών αλλά μόνο λίγες έχουν επικεντρωθεί στη χρήση ορρού γάλακτος, ενώ μόνο μία αναφέρεται στη χρήση τυροκομικού ορρού γάλακτος (Girard et al., 2014). Η επεξεργασία δευτερογενή ορρού γάλακτος από τυροκομική μονάδα με τη χρήση του χλωροφύκους Choricystis και του κυανοβακτηρίου Leptolyngbya αναφέρεται για πρώτη φορά στην παρούσα εργασία. Επίσης, οι περισσότερες έρευνες σχετίζονται με την επεξεργασία γαλακτοκομικών αποβλήτων που έχουν προκύψει από αναερόβια προεπεξεργασία των γαλακτοκομικών εκροών χρησιμοποιώντας αξενικές καλλιέργειες (Πίνακας 3.18). Αν και οι μολύνσεις μπορεί να μειώσουν την παραγωγικότητα των μικροφυκών, διάφορες αναφορές δείχνουν ότι ορισμένα βακτήρια μπορεί να έχουν θετικές επιδράσεις στην ανάπτυξη των μικροφυκών και την παραγωγικότητά τους (Bellou and Aggelis, 2013). Αυτό μπορεί να οφείλεται στη συμβιωτική σχέση μεταξύ μικροφυκών και βακτηρίων στην οποία τα μικροφύκη παρέχουν O 2 στα ετερότροφα αερόβια βακτήρια που βιοδιασπούν την οργανική ύλη, όπου στη συνέχεια, με τη σειρά τους καταναλώνουν το CO 2 που απελευθερώνεται κατά τη διάρκεια της 171

195 Αποτελέσματα βακτηριακής αναπνοής (Muñoz and Guieysse, 2006). Η παρούσα ενότητα αναδεικνύει θετική επίδραση συνύπαρξης μικροφυκών με τους γηγενείς μικροβιακούς πληθυσμούς των αποβλήτων, καθώς εκτός από τις υψηλές αποδόσεις που επιτυγχάνονται υπάρχει η δυνατότητα εφαρμογής της διεργασίας σε βιομηχανικής κλίμακας μονάδες (μιας και δεν απαιτούνται αποστειρωμένες συνθήκες). Στην ενότητα αυτή μελετήθηκε η δυνατότητα βιολογικής επεξεργασίας αποβλήτων, υψηλού οργανικού φορτίου και θρεπτικών, με μικροφύκη. Το σύστημα μικροοργανισμών που αναπτύχθηκε σε όλα τα πειράματα που αναφέρθηκαν πιο πάνω, μπορεί να χαρακτηριστεί ως μιξότροφο εφόσον δινόταν τόσο εξωτερική πηγή άνθρακα (από το ίδιο το απόβλητο) όσο και ατμοσφαιρικό διοξείδιο του άνθρακα μαζί με φωτεινή ενέργεια, για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών. Η βιομάζα που παραγόταν αποτελούνταν από όλα τα γηγενή είδη μικροβίων που προϋπήρχαν στο κάθε απόβλητο αλλά και από τους αυτότροφους μικροοργανισμούς που προστίθεντο ως εμβόλιο στην αρχή κάθε επεξεργασίας αποβλήτου. Γενικά, η παραγωγή βιομάζας επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες όπως η διαθεσιμότητα θρεπτικών συστατικών στο περιβάλλον ανάπτυξης όσο και οι περιβαλλοντικές συνθήκες (Harwati et al., 2012). Συγκεκριμένα, οι μιξότροφες καλλιέργειες συνήθως εμφανίζουν υψηλότερη παραγωγικότητα ελαίου λόγω των υψηλότερων ρυθμών ανάπτυξης σε σχέση με ετερότροφες ή αυτότροφες καλλιέργειες (HerediaArroyo et al., 2011). Μάλιστα, η μεγαλύτερη παραγωγή βιομάζας επιτυγχάνεται σε μικρότερους λειτουργικούς κύκλους ανάπτυξης (μέχρι και 10 φορές μεγαλύτερη παραγωγικότητα βιομάζας σε σχέση με φωτοαυτότροφες καλλιέργειες), γεγονός που θα επέτρεπε την εφαρμογή της διεργασίας για μεγάλης κλίμακας παραγωγή μικροβιακού βιοντίζελ (Wang et al., 2014). Από την άλλη, οι ετερότροφες καλλιέργειες παρουσιάζουν αρκετά μειονεκτήματα δεδομένου ότι ο αριθμός των ειδών που μπορούν να αναπτυχθούν ετερότροφα είναι περιορισμένος, ενώ επίσης δεν μπορούν να παραχθούν οι μεταβολίτες που ενεργοποιούνται με το φως (PerezGarcia et al., 2011). Στη παρούσα μελέτη, αρχικά η χρήση του Choricystis sp. οδήγησε σε πολύ ικανοποιητικές τιμές παραγόμενης βιομάζας [μέχρι και 229 mg(l d) 1 με ειδικό ρυθμό ανάπτυξης 0.45d 1 ] σε σχέση με παρόμοιες εργασίες χρήσης τυροκομικών αποβλήτων με μεικτές καλλιέργειες μικροφυκών (0.10d 1 ) (Tricolici et al., 2014), ενώ στη συνέχεια η χρήση του κυανοβακτηρίου Leptolyngbya sp. για το ίδιο απόβλητο βοήθησε ακόμη περισσότερο στην αύξηση της παραγωγής βιομάζας φτάνοντας μέχρι 172

196 Αποτελέσματα και την τιμή των 303 mg(l d) 1 (ειδικός ρυθμός ανάπτυξης 0.47d 1 ) (Πίνακας 3.18). Τα τελευταία χρόνια, τα κυανοβακτήρια προσελκύουν το ενδιαφέρον ως προς την πιθανή εφαρμογή τους στην απομάκρυνση οργανικών ρύπων από αστικά, βιομηχανικά και γεωργικά λύματα, συμπεριλαμβανομένης της απομάκρυνσης υψηλών συγκεντρώσεων αζώτου και φωσφόρου, λόγω της ικανότητάς τους να συμμετέχουν σε αυτότροφη, ετερότροφη ή μιξότροφη μεταβολική διεργασία (Singh and Thakur, 2015). Επιπλέον, τα κυανοβακτήρια είναι ευρέως γνωστά για την εμπορική χρήση τους ως πηγή πολυσακχαριτών καθώς και την ικανότητά τους να αποικούν δυσμενή περιβάλλοντα (αλατότητας έως 35gL 1 NaCl), με ελάχιστες θρεπτικές απαιτήσεις (Leite and Hallenbeck, 2014). Η αντοχή τους σε συνθήκες αποβλήτων, η ταχεία ανάπτυξή τους, ο σχηματισμός κροκίδων (που βοηθά σημαντικά στην εύκολη συγκομιδή) και η ικανότητά τους να συνυπάρχουν με βακτήρια, καθιστά τα κυανοβακτήρια επιθυμητά είδη για επεξεργασία αποβλήτων (Gutzeit et al., 2005). Τα είδη κυανοβακτηρίων Leptolyngbya είναι εξαιρετικοί υποψήφιοι για την παραγωγή βιομάζας (επιτυγχάνουν τιμές παραγωγικότητας βιομάζας έως 480 mg (L d) 1 για αστικά απόβλητα) κατά τη διάρκεια επεξεργασίας λυμάτων, ενώ ταυτόχρονα είναι αποτελεσματική πρώτη ύλη για την παραγωγή βιοκαυσίμων (Maity et al., 2014). Στα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στη παρούσα ενότητα με τη χρήση μεικτής καλλιέργειας Leptolyngbya, η παραγωγικότητα της βιομάζας και ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης που επετεύχθη κυμάνθηκε μεταξύ mg (L d) 1 και d 1, αντίστοιχα (Πίνακας 3.18), τιμές οι οποίες ξεπερνούν τις καταγεγραμμένες της βιβλιογραφίας για το εν λόγω κυανοβακτήριο (Singh et al., 2014). Να επισημανθεί ότι, τα είδη Leptolyngbya δεν έχουν μελετηθεί εκτεταμένα για επεξεργασία αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων, ενώ το γένος τους δεν έχει χαρακτηριστεί πλήρως για τη δυνατότητα χρήσης του ως πρώτη ύλη στην παραγωγή βιοντίζελ. Προηγούμενες έρευνες έχουν επικεντρωθεί κυρίως στην επεξεργασία αστικών, γαλακτοκομικών και υγρών αποβλήτων χοιροστασίου (Hu et al., 2012; Cai et al., 2013), χρησιμοποιώντας προεπεξεργασμένα λύματα ή ασηπτικές συνθήκες (Zhu et al., 2013). Μόνο οι Kim and Im (2012) χρησιμοποίησαν λύματα σταφίδας και οινοποιείου (προσθέτοντας και τεχνητό χημικό μέσο), καταγράφοντας μάλιστα παραγωγή βιομάζας 4gL 1 και 7gL 1, αντίστοιχα, ωστόσο υπό ασηπτικές συνθήκες. Στην παρούσα ενότητα, ο μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης καταγράφηκε στα πειράματα με τη χρήση αποβλήτων τυροκομείου και χρήση καλλιέργειας 173

197 Αποτελέσματα Leptolyngbya sp. (0.47 d 1 ), ενώ ακολούθησε η χρήση λυμάτων σταφίδας (0.46 d 1 ) και οινοποιείου (0.29 d 1 ) (Πίνακας 3.18). Η χρήση καλλιέργειας Choricystis sp. με χρήση αποβλήτου τυροκομείου οδήγησε επίσης σε υψηλό ειδικό ρυθμό ανάπτυξης, αγγίζοντας την τιμή του 0.45 d 1. Οι διακυμάνσεις των τιμών αυτών μεταξύ των αποβλήτων οφείλονται κυρίως στην περιορισμένη διείσδυση του φωτός στα απόβλητα οινοποιείου (σκούρα και θολά απόβλητα οινοποιείου) καθώς και στη πλούσια θρεπτική σύσταση των αποβλήτων του τυροκομείου σε σχέση με τα υπόλοιπα λύματα (Πίνακας 3.14). Λαμβάνοντας υπόψη τις σχετικά δύσκολες συνθήκες ανάπτυξης του μικροβιακού συστήματος σε όλες τις πειραματικές σειρές επεξεργασίας, οι παραπάνω τιμές είναι πολύ ικανοποιητικές, εφόσον παρόμοιες τιμές ειδικού ρυθμού ανάπτυξης καταγράφονται ακόμη και σε ασηπτικές συνθήκες καλλιέργειες μικροφυκών (Abreu et al., 2012; CuellarBermudez et al., 2015; Singh and Thakur, 2015). Το σύνολο των μικροοργανισμών προκειμένου να αναπτυχθεί στα εξεταζόμενα υποστρώματα χρησιμοποίησε τα θρεπτικά συστατικά που περιέχονται στα ίδια τα απόβλητα. Έτσι παρατηρήθηκε μείωση του αζώτου, του φωσφόρου και του οργανικού φορτίου, επιτυγχάνοντας υψηλά ποσοστά απομάκρυνσης για τα περισσότερα υποστρώματα (Πίνακας 3.18). Οι αρχικές τιμές COD κυμαίνονταν από 1600 μέχρι 8900 mg L 1 στο σύνολο των πειραματικών σειρών που διεξήχθησαν οι οποίες είναι από τις υψηλότερες αρχικές συγκεντρώσεις COD που έχουν εφαρμοστεί σε συστήματα ανάπτυξης μικροφυκών (Πίνακας 3.18). Τα υψηλότερα ποσοστά απομάκρυνσης COD που σημειώθηκαν ήταν 94% και 93.5% στο απόβλητο τυροκομείου, 93.3% στο απόβλητο σταφίδας, με αρχικές συγκεντρώσεις COD 3240 mg L 1, 1580 mg L 1 και 3660 mg L 1, αντίστοιχα. Μάλιστα οι ρυθμοί απομάκρυνσης των παραπάνω COD ήταν κατά σειρά mg (L d) 1, mg (L d) 1 και mg (L d) 1, αντίστοιχα. Ακολούθησαν το 92.8% (μεικτό απόβλητο) (με εξίσου σημαντικό ρυθμό απομάκρυνσης mg (L d) 1 ) και το 92.3% (απόβλητο τυροκομείου με Choricystis sp.) με αρχικές τιμές COD τα 2650 mg L 1 και τα 7300 mg L 1, αντίστοιχα. Μεταξύ των σειρών με τα υψηλότερα ποσοστά απομάκρυνσης COD δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p=0.48). Γίνεται αντιληπτό, ότι δεν μπορεί να υπάρξει ένα ξεκάθαρο όριο αρχικών συγκεντρώσεων COD που μπορεί να οδηγήσει σε βέλτιστες αποδόσεις απομάκρυνσης, καθώς το κάθε απόβλητο έχει δικά του χαρακτηριστικά που καθιερώνουν ένα συγκεκριμένο κάθε 174

198 Αποτελέσματα φορά σύστημα μικροοργανισμών (όπου μικροφύκη και βακτήρια μπορούν εξίσου να χρησιμοποιούν οργανικό άνθρακα από υγρά απόβλητα μέσω του αερόβιου μιξότροφου μεταβολισμού (Bhatnagar et al., 2011)). Στις περισσότερες πειραματικές σειρές το COD απομακρύνονταν μέσα στις πρώτες 78 ημέρες, συμπεριλαμβανομένης της περιόδου προσαρμογής. Ο σχετικά αργός ρυθμός απομάκρυνσης, καθώς και η παρουσία υπολειμματικού COD μπορεί να αποδοθεί σε ανθρακικές μορφές κολλοειδών ή στην παρουσία αργά βιοαποικοδομήσιμου υλικού (Beevi and Sukumaran, 2015). Αρκετοί περιβαλλοντικοί παράγοντες επηρεάζουν τον ρυθμό πρόσληψης θρεπτικών συστατικών από τα διάφορα είδη μικροφυκών/κυανοβακτηρίων, συμπεριλαμβανομένων των αρχικών συγκεντρώσεων των θρεπτικών συστατικών, την ένταση του φωτός, το ρυθμό ροής του αέρα, το εξωκυτταρικό ph, τη θερμοκρασία και την πυκνότητα του εμβολίου. Οι ρυθμοί απομάκρυνσης του αζώτου και του φωσφόρου καταγράφηκαν μέσω του προσδιορισμού συγκεντρώσεων νιτρικών, νιτρωδών και ορθοφωσφορικών αλάτων καθώς και με μετρήσεις ολικού αζώτου και ολικού φωσφόρου. Τα ποσοστά απομάκρυνσης των νιτρικών κυμάνθηκαν για όλες τις πειραματικές σειρές από 25 μέχρι 82% ενώ η συγκέντρωση των νιτρωδών παρέμενε κάτω από 0.2 mg L 1. Η απορρόφηση των νιτρικών που εξαρτάται συνήθως από την παρεχόμενη φωτεινή ενέργεια, παρουσίασε τα μικρότερα ποσοστά απομάκρυνσης εξαιτίας της δυσκολίας διείσδυσης της φωτεινής ενέργειας στα συστήματα επεξεργασίας των έγχρωμων αποβλήτων. Τα ποσοστά απομάκρυνσης ολικού αζώτου ήταν μεγαλύτερα από εκείνα των νιτρικών και κυμάνθηκαν από 42 μέχρι και 97%. Επίσης, δεν παρατηρηθήκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των πειραμάτων για τα ποσοστά απομάκρυνσης ΤΝ (p=0.167). Μεγάλες διακυμάνσεις στα ποσοστά απομάκρυνσης ολικού αζώτου αναφέρθηκαν και από τους Chen et al. (2012) (58 έως 98%), πιθανόν λόγω των υψηλών συγκεντρώσεων αμμωνίας όπου υπάρχουν στα απόβλητα, η οποία είναι τοξική για τα μικροφύκη καθώς αναστέλλει την ανάπτυξή τους. Τα ορθοφωσφορικά που είναι η ευκολότερα αφομοιώσιμη μορφή φωσφόρου (Travieso et al., 2008; Khemka and Saraf, 2015) για τα περισσότερα μικροβιακά είδη (τόσο για τη σύνθεση πρωτεϊνών όσο και νουκλεϊκών οξέων) παρουσίασαν πολύ υψηλά ποσοστά απομάκρυνσης μεταξύ 46 και 99.7% στο σύνολο των πειραματικών σειρών. Τα μικρότερα ποσοστά απομάκρυνσης παρουσιάστηκαν επί τω πλείστων στις 175

199 Αποτελέσματα σειρές με την υψηλότερη αρχική συγκέντρωση φωσφόρου. Στατιστικά σημαντικές διαφορές δεν παρατηρήθηκαν μεταξύ των πειραμάτων με απόβλητο οινοποιείου ή μεταξύ των πειραμάτων μεικτού αποβλήτου αλλά σημειώθηκαν μεταξύ των πειραμάτων με απόβλητο σταφίδας (p=0.004). Τα ποσοστά απομάκρυνσης που επιτεύχθηκαν στην παρούσα ενότητα είναι είτε παρόμοια είτε υψηλότερα από εκείνα που αναφέρθηκαν σε προηγούμενες ερευνητικές εργασίες για τα είδη Leptolyngbya sp. (Maity et al., 2014; Khemka and Saraf, 2015) και Choricystis sp. (Πίνακας 3.18). Η βέλτιστη αναλογία των θρεπτικών στοιχείων (C: N: Ρ) για την αύξηση των μικροβιακών πληθυσμών ποικίλει, λόγω των μεταβαλλόμενων μεταβολικών οδών που χρησιμοποιούν οι μικροοργανισμοί στο κάθε υπόστρωμα (απόβλητα). Οι αναλογίες των θρεπτικών στοιχείων που απαιτούνται για ανάπτυξη διαφέρουν επίσης σημαντικά μεταξύ των ειδών που χρησιμοποιούνται στις καλλιέργειες (Klausmeler et al., 2004; Wang et al., 2010; Zhang and Hu, 2011). Ωστόσο, η κατάλληλη τροποποίηση στις αρχικές συγκεντρώσεις των θρεπτικών συστατικών μπορεί να δώσει τις επιθυμητές αναλογίες, οι οποίες μπορούν να καθορίσουν τη περιεκτικότητα συσσωρευμένου ελαίου και την αναλογία ακόρεστων και κορεσμένων λιπαρών οξέων (MoralesSánchez et al., 2013; Markou et al., 2014). Επίσης, η αναλογία C:N:P έχει σημαντικό αντίκτυπο και στο ρυθμό αύξησης της βιομάζας επηρεάζοντας ακόμα και την αποτελεσματικότητα της απομάκρυνσης των θρεπτικών στοιχείων (Lee et al., 2013; Zamalloa et al., 2013; Hadiyanto and Azimatun Nur, 2014). Για παράδειγμα, στα πειράματα της παρούσας ενότητας με χρήση μεικτού αποβλήτου, οι υψηλότερες τιμές στα ποσοστά απομάκρυνσης νιτρικών (62%), ορθοφωσφορικών (99%) και COD (93%) παρατηρήθηκαν σε πειράματα στα οποία σημειώθηκε η μεγαλύτερη αναλογία N:P και η μικρότερη αναλογία C:N (Πίνακας 3.18). Οι Mata et al. (2012b) χρησιμοποιώντας συνθετικά λύματα ζυθοποιείου με συνεχή φωτισμό και αεριζόμενη καλλιέργεια του χλωροφύκους Scenedesmus obliquus, πέτυχαν έως 66.8% και 20% απομάκρυνση του COD και ΤΝ, αντίστοιχα. Σε παρόμοια μελέτη, οι Maity et al. (2014) χρησιμοποίησαν καλλιέργειες ειδών Leptolyngbya για την επεξεργασία αστικών λυμάτων αναφέροντας ωστόσο χαμηλότερες τιμές απομάκρυνσης COD, φωσφόρου και αζώτου (56.07%, 99.3% και 8%, αντίστοιχα) (Πίνακας 3.18). Πρέπει να επισημανθεί ότι οι αρχικές συγκεντρώσεις των θρεπτικών συστατικών που χρησιμοποιήθηκαν στις προαναφερόμενες εργασίες (Maity et al., 2014; Khemka and Saraf, 2015; Singh and Thakur, 2015; Casazza et al., 176

200 Αποτελέσματα 2016; Gupta et al., 2016b) είναι σχετικά χαμηλότερες από αυτές της παρούσας μελέτης, υποδεικνύοντας ότι το σύστημα που εξετάστηκε στα πλαίσια της διατριβής αυτής, αποτελεί ένα αποδοτικό σύστημα απομάκρυνσης οργανικών και ανόργανων συστατικών από αγροτοβιομηχανικά απόβλητα. Ωστόσο, παρά τα υψηλά ποσοστά απομάκρυνσης COD και θρεπτικών ουσιών που επετεύχθησαν σε αυτή τη μελέτη, στο τέλος των περισσότερων πειραμάτων οι συγκεντρώσεις ΤΝ και COD ήταν πάνω από το ανώτατο επιτρεπόμενο όριο των 15 mgl 1 και 125 mgl 1, αντίστοιχα, που ορίζεται από την Ευρωπαϊκή Οδηγία ΕΕ91/271/ΕΟΚ για τα απορριπτόμενα ύδατα σε υδάτινους αποδέκτες. Επομένως, θα ήταν απαραίτητο ένα ακόμη βήμα μετεπεξεργασίας των αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων προκειμένου να βελτιωθεί η ποιότητα των τελικών εκροών. Η μετεπεξεργασία αυτή μπορεί να περιλαμβάνει ένα αερόβιο βιολογικό φίλτρο (Tatoulis et al., 2015) ή/και ένα τεχνητό υγροβιότοπο (Sultana et al., 2016). Η προτεινόμενη τεχνολογία μπορεί επίσης να εφαρμοστεί είτε ως δευτεροβάθμια ή τριτοβάθμια φάση επεξεργασίας των αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων για να βοηθήσει την περαιτέρω επεξεργασία τους πριν αυτά απορριφθούν σε φυσικούς υδάτινους αποδέκτες. Η ωφελιμότητα αυτής της φάσης έγκειται επίσης στην δυνατότητα παραγωγής πολύτιμης μικροβιακής βιομάζας για την παραγωγή βιοκαυσίμων. Όσον αφορά τις περιεκτικότητες των ελαίων στη μικροβιακή βιομάζα που παρουσιάστηκαν στην παρούσα εργασία (814.8% ξηρής βιομάζας), ήταν σχετικά χαμηλότερες από τις τιμές που αναφέρονται στη βιβλιογραφία (Πίνακας 3.18), δεδομένου ότι πολλές παράμετροι, όπως το είδος των μικροοργανισμών, η θερμοκρασία, τα μακροθρεπτικά (όπως Ν, Ρ), τα ιχνοστοιχεία (Κ, Na, Fe, Mg, κλπ) και το pη, μπορεί να επηρεάσουν σημαντικά τη διαδικασία συσσώρευσης ελαίων στη βιομάζα (Bellou and Aggelis, 2013; EspinosaGonzalez et al., 2014). Η επιλογή του είδους πρέπει να συνδυάζει την αντοχή του σε συνθήκες αποβλήτων, την υψηλή παραγωγή βιομάζας αλλά και τη δυνατότητα παραγωγής ελαίων. Σύμφωνα με τους Sobczuk and Chisti (2010), η παραγωγικότητα ελαίων του Choricystis (82 mg (L d) 1 ) είναι τέσσερις φορές υψηλότερη από εκείνη του φοινικέλαιου, καθιστώντας το στέλεχος μια πιθανή πηγή για παραγωγή λιπιδίων. Τα αποτελέσματα της παρούσας ενότητας υποδεικνύουν ότι η ανάπτυξη του Choricystis sp. σε απόβλητο τυροκομείου μπορεί να οδηγήσει σε υψηλά ποσοστά παραγωγής ελαίου (13.4% ξ.β.) κατάλληλο για βιοντίζελ. Αντίστοιχα, οι τιμές περιεκτικότητας ελαίων που επετεύχθησαν στη 177

201 Αποτελέσματα μελέτη αυτή για το Leptolyngbya sp., συμφωνούν με τη βιβλιογραφία μη υπερβαίνοντας την τιμή του 31% ξηρής βιομάζας (Maity et al., 2014). Οι μέγιστες περιεκτικότητες ελαίου στην ξηρή βιομάζα που καταγράφηκαν μεταξύ όλων των εξεταζόμενων τύπων λυμάτων ήταν στο απόβλητο τυροκομείου, με την καλλιέργεια Choricystis sp. και με την καλλιέργεια Leptolyngbya sp., 13.4% και 14.8%, αντίστοιχα. Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των πειραμάτων με απόβλητο οινοποιείου ή μεταξύ των πειραμάτων με μεικτό απόβλητο αλλά σημειώθηκαν διαφορές μεταξύ των πειραμάτων με απόβλητο σταφίδας (p=0.003). Σύμφωνα με τους πίνακες της ενότητας 3.3 για τα πειράματα Leptolyngbya sp., οι παραγωγικότητες ελαίων της παρούσας ενότητας κυμάνθηκαν μεταξύ 7 και 32.2 mg (L d) 1. Οι τιμές αυτές είναι υψηλότερες από εκείνες που αναφέρθηκαν από τους Rós et al. (2013) (0.8 mg (L d) 1 ), οι οποίοι επίσης χρησιμοποίησαν Leptolyngbya sp.. Λαμβάνοντας υπόψη τόσο τα αποτελέσματα της παρούσας ενότητας όσο και παλιότερων ερευνών, το στέλεχος Leptolyngbya αποτελεί ένα πιθανό είδος για την επεξεργασία αποβλήτων και την ταυτόχρονη παραγωγή βιοκαυσίμων (Maity et al., 2014). Οι παραγωγικότητες ελαίου που καταγράφηκαν στην παρούσα ενότητα είναι μέσα στο εύρος τιμών που αναγράφονται στη βιβλιογραφία και αφορούν υποστρώματα αποβλήτων, ενώ είναι λίγο μικρότερες σε σχέση με εκείνες που αφορούν καλλιέργειες τεχνητών θρεπτικών υποστρωμάτων (Chen et al., 2011). Εξάλλου, η παραγωγικότητα των ελαίων εξαρτάται από το είδος των μικροοργανισμών, τις πειραματικές συνθήκες και τις παραλλαγές στην αναλογία C:N (Markou et al., 2014). Για παράδειγμα, οι Li et al. (2014) ανέφεραν ότι για τη Chlorella sorokiniana και σταθερή αρχική συγκέντρωση γλυκόζης, η μιξότροφη καλλιέργεια παρουσίασε υψηλότερη περιεκτικότητα ελαίου από ότι η ετερότροφη καλλιέργεια. Ομοίως, οι HerediaArroyo et al. (2011) παρατήρησαν παρόμοια με την παρούσα εργασία ποσοστά για το συσσωρευμένου ελαίου (1214%) σε μιξότροφη καλλιέργεια Chlorella vulgaris. Τέλος, τα χαρακτηριστικά του προφίλ των λιπαρών οξέων που καταγράφηκαν από τη συλλεγόμενη μικροβιακή βιομάζα και των δύο μικροοργανισμών (Leptolyngbya, Choricystis) (όπως οι υψηλές ποσότητες κορεσμένων και μονοακόρεστων λιπαρών οξέων, χαμηλές τιμές λινολενικού οξέος), υποδεικνύουν την καταλληλότητα του συστήματος των μικροοργανισμών για την παραγωγή υψηλής ποιότητας βιοντίζελ. 178

202 Αποτελέσματα Πίνακας 3.18: Συγκριτικός πίνακας λειτουργικών συνθηκών από αιωρούμενα συστήματα καλλιέργειας μικροφυκών με διάφορα υποστρώματα ανάπτυξης Υπόστρωμα Απόβλητο τυροκομείου Απόβλητο τυροκομείου Απόβλητο οινοποιείου Απόβλητο βιομηχανίας τυποποίησης σταφίδας Απόβλητο μεικτό οινοποιείουσταφίδας Απόβλητο γαλακτοβιομηχανίας Αστικά απόβλητα Προεπεξεργασία υποστρώματ ος Αερόβια επεξεργασμέ νο Αερόβια επεξεργασμέ νο Συνθήκες καλλιέργειας Μιξότροφη Μιξότροφη Μιξότροφη Μιξότροφη Μιξότροφη Είδη μικροοργανισμών Μεικτή καλλιέργεια μικροφυκών, Choricystis sp. Μεικτή καλλιέργεια κυανοβακτηρίου Leptolyngbya sp. Μεικτή καλλιέργεια κυανοβακτηρίου Leptolyngbya sp. Μεικτή καλλιέργεια κυανοβακτηρίου Leptolyngbya sp. Μεικτή καλλιέργεια κυανοβακτηρίου Leptolyngbya sp. Αρχικό COD / % απομάκρυνσης 7300 mg L 1 / mg L 1 / mg L 1 / mg L 1 / mg L 1 / mg L 1 / mg L 1 / mg L 1 / mg L 1 / mg L 1 / 92.8 Μιξότροφη Leptolyngbya sp mg L 1 / 52.4 Φωτότροφη Leptolyngbya sp. 255 mg L 1 / 56 % Μέγιστο ποσοστό ελαίου στη ξηρή βιομάζα % Απομάκρυνσης θρεπτικών συστατικών NH 4 + NO TN PO TP C/N Παραγωγικότητ α βιομάζας (mg L 1 d 1 )/ Ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (d 1 ) 229/ / / / / / / / / / / Βιβλιογραφ ία Παρούσα μελέτη Παρούσα μελέτη Παρούσα μελέτη Παρούσα μελέτη Παρούσα μελέτη Khemka and Saraf (2015) / Maity et al. (2014) 179

203 Αποτελέσματα Αστικά απόβλητα Θρεπτικό μέσο BG11 (+NaHCO 3 ) Τεχνητό θαλασσινό νερό Αναερόβια εκροή τυροκομείου Παραπροϊόντ α βιομηχανίας βιοντίζελ (γλυκερόλη) Απόβλητο γαλακτοβιομηχανίας Διήθημα ορρού γάλακτος Απόβλητο γαλακτοβιομηχανίας και γλυκερόλη Υγρά Απόβλητα γαλακτοβιο Αποστείρωση Φωτότροφη Leptolyngbya sp. 428 mg L 1 Αποστείρωση Φωτότροφη Leptolyngbya sp. Αραίωση Ουδετεροποί ηση, Υδρόλυση, Διήθηση UV ακτινοβολία Αυτότροφη Ετερότροφη Μιξότροφη Αυτότροφη Ετερότροφη Ετερότροφη Μιξότροφη Phormidium bohneri Micractinium pusillum Chlorella vulgaris Chlorella sp. Μεικτή καλλιέργεια μικροφυκών και βακτηρίων Chlorella protothecoides Chlorococcum sp. RAP13 / 300 mg L 1 / 30 g L 1 γλυκόζη / mg L 1 / 1426 mg L 1 /91 10 g L 1 ολικά σάκχαρα / 30 g L 1 ολικά σάκχαρα / 250 g L 1 γλυκόζη / 984 mg L 1 / 73 (3d) Ετερότροφη 984 mg L 1 / 93 (12d) Chlorella vulgaris 1535 mg L 1 / 75 (10 UV) / ±1.5 42± ± (15 UV) (5 UV) (15 UV) 50/1 100/1 78.9/ / / / / /0.13 / / (15 UV) Singh and Thakur (2015) Singh et al. (2014) Blier et al. (1995) Heredia Arroyo et al. (2011) Tricolici et al. (2014) Espinosa Gonzalez et al. (2014) Ummalyma and Sukumaran (2014) Qin et al. (2014) 180

204 Αποτελέσματα μηχανίας Υγρά Απόβλητα γαλακτοβιομηχανίας Ορρός γάλακτος Χρήση NaClO Λίμνη Οξείδωσης Μη υδρολυμένη σκόνη ορρού γάλ. Φωτότορφη Μιξότροφη Μιξότροφη Chlamydomonas polypyrenoideum Chlorella vulgaris 1273 mg L 1 / 66 (10 mg L 1 ) 6000 mg L 1 / 55 10gL 1 σάκχαρα / (30 mgl 1 ) 99.6 (10 mgl 1 ) (10 mgl 1 ) / (70mgL 1 ) 100/ / 0.12 Kothari et al. (2013) Abreu et al. (2012) Αγροζωοτεχνικό υπόλειμμα Κοπριά γαλακτοκομικ ών Υδρολυμένη σκόνη ορρού γαλ. Μείγμα γλυκόζηςγαλακτόζης Πιλοτικός αναερόβιος χωνευτήρας με κοπριά βοοειδών (35%) και ορρό γάλακτος (65%) Αναερόβιο Αποστειρωμέ νο αναερόβιο Μιξότροφη Μη αποστειρωμένο Neochloris oleoabundans Chlorella vulgaris Scenedesmus obliquus Neochloris oleoabundans 10gL 1 σάκχαρα /~98 10gL 1 σάκχαρα /~65 COD σταθερό λόγω αυτότροφου μεταβολισμού 9.5± ± / / / / / ±7.9/ 43.8±18/ Franchino et al. (2013) Levine et al. (2011) Απόβλητο γαλακτοβιομη Συνθετικό μέσο Αναερόβιος χωνευτήρας Actinastrum, Scenedesmus, 29.7±1 158±25.5/ Woertz et al. (2009) 181

205 Αποτελέσματα χανίας Αστικά απόβλητα Αστικά απόβλητα Αστικά απόβλητα Διηθημένα αστικά Chlorella, Nitzscia Micractinium, Spirogyra, Golenkinia, Chlorococcum, Closterium, Euglena Φιλτράρισμα Chlorella sp mg L 1 Ακατέργαστο Αποστειρωμέ νο Συνεργιστική δράση Chlorella vulgaris, γηγενή βακτήρια του λύματος / mg L 1 / mg L 1 / / Wang et al. (2010) Ma et al. (2014) Συνθετικό απόβλητο ζυθοποιείου Απόβλητο οινοποιείου Απόβλητο ποτοποιείου Συνθετικό απόβλητο Αποστείρωση 40% απόβλητο Αναερόβια χώνευση Αποστειρωμέ νο Μιξότροφη Scenedesmus obliquus Spirulina and Chlorella vulgaris 3635 mg L 1 / 57.5 Chlorella vulgaris mg L 1 Scenedesmus rubescens Neochloris vigensis / / / / / / Mata et al. (2012b) Casazza et al. (2016) Travieso et al. (2008) Aravantinou et al. (2013) Θρεπτικό μέσο BG11 Τεχνητό θρεπτικό F/2 Αποστειρωμέ νο Φωτότροφη Chlorococcum sp. Choricystis minor Chlorella vulgaris, Leptolyngbya sp / / Sobczuk and Chisti (2010) Bai et al. (2013) 182

206 Αποτελέσματα 4. ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ ΜΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΜΙΚΡΟΦΥΚΩΝ ΣΕ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΕΣ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΜΕΝΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟΝΤΙΖΕΛ 4.1 Γενικά Στον κύκλο πειραμάτων αυτής της ενότητας πραγματοποιήθηκαν πειράματα κινητικής σε συστήματα προσκολλημένης ανάπτυξης (Εικόνα 2.13), για τη μελέτη της συμπεριφοράς της αυτότροφης καλλιέργειας του κυανοβακτηρίου Leptolyngbya sp.. (που παρουσίασε και τις μεγαλύτερες αποδόσεις απομάκρυνσης οργανικού/ανόργανου φορτίου καθώς και παραγωγή ελαίου στα συστήματα αιωρούμενης ανάπτυξης). Αρχικά, χρησιμοποιήθηκε ως θρεπτικό υπόστρωμα τεχνητό χημικό μέσο ενώ στη συνέχεια εξετάστηκε η συμπεριφορά της ίδιας καλλιέργειας σε απόβλητο τυροκομείου, οινοποιείου καθώς και σε μεικτό απόβλητο οινοποιείουσταφίδας. Σε όλα τα παραπάνω πειράματα προσδιορίστηκαν οι ρυθμοί απομάκρυνσης των θρεπτικών συστατικών (αζώτου, φωσφόρου) καθώς και του οργανικού φορτίου (COD) για το κάθε υπόστρωμα ανάπτυξης. Επίσης, καταγράφηκε η παραγωγικότητα της βιομάζας και των παραγόμενων ελαίων από την ξηρή βιομάζα για την κάθε σειρά πειραμάτων. Τέλος, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της σύστασης του παραγόμενου ελαίου έτσι ώστε να εξεταστεί η καταλληλότητά του για παραγωγή βιοντίζελ. 4.2 Πειράματα κινητικής προσκολλημένης ανάπτυξης με χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. και τεχνητό χημικό μέσο 183

207 Αποτελέσματα Αρχικά, μελετήθηκε η ανάπτυξη της αυτότροφης καλλιέργειας με το κυανοβακτήριο Leptolyngbya sp. (Ενότητα 3.3) σε συστήματα προσκολλημένης ανάπτυξης (Ενότητα 2.3), με χρήση τεχνητού χημικού μέσου διαφορετικών αρχικών συγκεντρώσεων (Πίνακας 4.1). Η μεικτή αυτότροφη καλλιέργεια (Παράρτημα) αναπτύσσονταν σε γυάλινες δεξαμενές (ενυδρεία) όγκου 10L και συντηρούνταν σύμφωνα με τις συνθήκες της Ενότητας 2.2. Ενυδρεία λειτουργικού όγκου 3.5L, εφοδιασμένα με κυλινδρικές γυάλινες ράβδους, εμβολιάστηκαν με αυτή την αυτότροφη καλλιέργεια (σε ποσοστό 20%, όγκος εμβολίου/τελικός όγκος) και τεχνητό χημικό μέσο, ενώ εφαρμόστηκαν οι ίδιες συνθήκες ανάπτυξης των αιωρούμενων συστημάτων με τη διαφορά μόνο στο ρυθμό ροής ανάδευσης που μειώθηκε στα 50 L h 1 για να διευκολυνθεί η προσκόλληση της βιομάζας στις ράβδους και στα τοιχώματα. Οι διαφορετικές αναλογίες θρεπτικών αλάτων (N : P) οδήγησαν τόσο σε διαφορετική αύξηση ολικής βιομάζας όσο και σε διαφορετικά ποσά συσσωρευμένου ελαίου στη ξηρή βιομάζα (Σχήμα 4.1). Ως ολική βιομάζα για όλες τις επόμενες πειραματικές σειρές αναφέρεται το σύνολο αιωρούμενης και προσκολλημένης βιομάζας (για τις ράβδους), ενώ οι τιμές της προσκολλημένης παραγωγικότητας βιομάζας και ελαίων αναφέρονται στο μέσο όρο ανάπτυξης στις ράβδους και στα τοιχώματα των βιοαντιδραστήρων. Επίσης, να σημειωθεί, ότι οι τιμές της προσκολλημένης βιομάζας προσδιορίζονταν όχι μόνο σε μονάδες επιφάνειας (g m 2 ) αλλά και σε μονάδες όγκου (mg L 1 ), καθώς το βάρος της προσκολλημένης βιομάζας φυγοκεντρούνταν πάντα σε συγκεκριμένο όγκο 100ml υγρού δείγματος, σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται αναλυτικά από τους Economou et al. (2015). Πίνακας 4.1: Αρχικές συγκεντρώσεις βιομάζας και θρεπτικών συστατικών του τεχνητού χημικού μέσου που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα κινητικής προσκολλημένης ανάπτυξης με την αυτότροφη καλλιέργεια Leptolyngbya Σειρά πειραμάτων Αρχικές συγκεντρώσεις (mg L 1 ) NO 3 PO 4 Σάκχαρα Βιομάζα N/P Α ± ± ± ± B 13.78± ± ± ± C 8.77± ± ± ±

208 Αποτελέσματα Οι ρυθμοί παραγωγής ολικής βιομάζας που σημειώθηκαν για όλες τις σειρές πειραμάτων ήταν γύρω από την τιμή των 87 mg (L d) 1, ενώ το μέγιστο ποσοστό περιεχομένου ελαίου στη ξηρή βιομάζα δεν ξεπέρασε τα 8% (Πίνακας 4.2). Καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής πραγματοποιούνταν προσδιορισμός των συγκεντρώσεων των θρεπτικών συστατικών, προκειμένου να υπολογιστούν τα ποσοστά απομάκρυνσής τους. Σύμφωνα με το Σχήμα 4.2 παρουσιάστηκε σχεδόν πλήρη απομάκρυνσή τους εκτός από την πρώτη σειρά πειραμάτων (σειρά Α) όπου η αρχική συγκέντρωση αζώτου ήταν πολύ υψηλή (272 mg L 1 ). Σε όλες τις πειραματικές σειρές που πραγματοποιήθηκαν οι συγκεντρώσεις των σακχάρων αυξάνονταν με το χρόνο λόγω της φωτοσυνθετικής δραστηριότητας της καλλιέργειας (Πίνακας 4.2) A B C 700 Ολική Βιομάζα (mgl 1 ) (α) Χρόνος (d) 30 A B C Προσκολλημένη Βιομάζα (gm 2 ) (β) Χρόνος (d) 185

209 NO 3 (mgl1 ) NO 3 (mgl1 ) PO 3 4 (mgl1 ) Αποτελέσματα Σχήμα 4.1: Μεταβολή της α) ολικής και β) προσκολλημένης βιομάζας για τις αυτότροφες καλλιέργειες Leptolyngbya στα προσκολλημένα συστήματα, με διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών αλάτων B C A A B C (α) Χρόνος (d) (β) Χρόνος (d) 10 9 B C A Σάκχαρα (mgl 1 ) Σάκχαρα (mgl 1 ) (γ) Χρόνος (d) Σχήμα 4.2: Μεταβολή της συγκέντρωσης των α) ΝΟ 3 3, β) PO 4 και γ) ολικών σακχάρων καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κινητικής στα προσκολλημένα συστήματα, με διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών αλάτων και χρήση αυτότροφης καλλιέργειας Leptolyngbya 186

210 Αποτελέσματα Πίνακας 4.2: Ποσοστό απομάκρυνσης θρεπτικών συστατικών, ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, παραγωγικότητες βιομάζας και περιεχόμενο έλαιο ξηρής βιομάζας στα πειράματα κινητικής προσκολλημένης ανάπτυξης με την αυτότροφη καλλιέργεια Leptolyngbya σε διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών αλάτων Σειρά πειραμάτ ων Απομάκρυνση % % Μέγιστο περιεχόμενο έλαιο NO 3 PO 4 Ολικό Προσκολλημένο Ολική mg (L d) 1 Παραγωγικότητα Βιομάζας Προσκολλημένη g (m 2 d) 1 Ειδικός ρυθμός προσ/νης ανάπτυξης (d 1 ) Α 8±0.7 94±1.65 8± ± Β 97.9± ± ± ± C 97± ± ±0.07 7± Στην Εικόνα 4.1 παρουσιάζεται η σταδιακή αύξηση της ολικής μικροβιακής βιομάζας στα προσκολλημένα συστήματα. Αξίζει να επισημανθεί ότι παρουσιάστηκε μεγάλη ανάπτυξη της προσκολλημένης βιομάζας σε όλο το μήκος της επιφάνειας των ράβδων καθώς και στα τοιχώματα του φωτοβιοαντιδραστήρα

211 Αποτελέσματα Εικόνα 4.1: Σταδιακή αύξηση της μικροβιακής βιομάζας στα προσκολλημένα συστήματα αυτότροφης καλλιέργειας Leptolyngbya με χρήση τεχνητού χημικού μέσου Στη συνέχεια εξετάστηκε η συμπεριφορά της αυτότροφης καλλιέργειας χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα για την ανάπτυξή της απόβλητα τυροκομείου, οινοποιείου καθώς και μεικτού λύματος (οινοποιείουσταφίδας). Μελετήθηκαν εκ νέου οι ρυθμοί παραγωγής βιομάζας και ελαίου καθώς και τα ποσοστά απομάκρυνσης των περιεχόμενων συστατικών. 4.3 Πειράματα κινητικής προσκολλημένης ανάπτυξης σε απόβλητο τυροκομείου με χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. Το απόβλητο που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα που ακολουθούν προήλθε από την τυροκομική μονάδα της Παπαθανασίου ΑΒΕΕ και είχε την ίδια σύσταση και χαρακτηριστικά που αναφέρθηκαν αναλυτικά στον Πίνακα 3.3. Πραγματοποιήθηκαν τρεις σειρές πειραμάτων προσκολλημένης ανάπτυξης (Α, Β, C), στις οποίες χρησιμοποιήθηκαν τρεις διαφορετικές αραιώσεις του αποβλήτου με νερό βρύσης. Για τον εμβολιασμό των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε η αυτότροφη καλλιέργεια Leptolyngbya sp. σε εκθετική φάση ανάπτυξης (που εξετάστηκε με μέτρηση οπτικής απορρόφησης στα 650nm) ίδιας αρχικής συγκέντρωσης βιομάζας μέσης τιμής των 56±11.9 mgl 1. Οι διαφορετικές αναλογίες αραίωσης του αποβλήτου είχαν ως αποτέλεσμα τις διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις θρεπτικών συστατικών και οργανικού φορτίου (Πίνακας 4.3). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν χωρίς προσθήκη CO 2 υπό διαλείπουσα λειτουργία, σε ενυδρεία όπου και συλλέγονταν ημερήσια δείγματα από την υγρή αιωρούμενη και προσκολλημένη καλλιέργεια για την ανάλυση διαφόρων παραμέτρων. Το pη αρχικά ρυθμίζονταν στο 7±0.5 με τη χρήση διαλύματος NaOH 5Μ, ενώ κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας κυμαίνονταν μεταξύ 7 9.5, όντας κατάλληλο τόσο για αυτότροφη όσο και ετερότροφη ανάπτυξη. 188

212 Αποτελέσματα Πίνακας 4.3: Αρχικές συγκεντρώσεις COD, βιομάζας και θρεπτικών συστατικών του αποβλήτου τυροκομείου που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα κινητικής προσκολλημένης ανάπτυξης με την αυτότροφη καλλιέργεια Leptolyngbya. Πειραμα τική σειρά Αρχικό COD (mg L 1 ) NO 3 Αρχικές συγκεντρώσεις (mg L 1 ) TN PO 4 3 Ολικά Σάκχαρα Αρχική συγκέντρωση βιομάζας (mg L 1 ) C/N Ν/P A 4081± ± ±4.9 26± ± ± B 3075± ± ± ± ± ± C 2420± ± ± ± ± ± Η προσθήκη του εμβολίου της αυτότροφης καλλιέργειας στο αιωρούμενο απόβλητο οδήγησε στο σχηματισμό μιας ομάδας μικροοργανισμών που βρισκόταν τόσο σε αιώρηση όσο και προσκολλημένη (Σχήμα 4.3), σχηματίζοντας βιοφίλμ πάνω στις ράβδους και στα τοιχώματα του φωτοβιοαντιδραστήρα (Εικόνα 4.2 και 4.3). Ολική Βιομάζα (mgl 1 ) (α) Χρόνος (d) A B C 189

213 Αποτελέσματα Προσκολλημένη Βιομάζα (gm 2 ) A B C (β) Χρόνος (d) Σχήμα 4.3: Μεταβολή της α) ολικής βιομάζας και β) προσκολλημένης βιομάζας για την καλλιέργεια Leptolyngbya στα προσκολλημένα συστήματα με απόβλητο τυροκομείου τριών διαφορετικών αραιώσεων Εικόνα 4.2: Σταδιακή αύξηση μικροβιακής βιομάζας με απόβλητο τυροκομείου σε συστήματα προσκολλημένης ανάπτυξης Leptolyngbya 190

214 dcod (mgl 1 ) Αποτελέσματα Εικόνα 4.3: Αύξηση της μικροβιακής βιομάζας πάνω στις ράβδους στα προσκολλημένα συστήματα καλλιέργειας Leptolyngbya με απόβλητο τυροκομείου Οι αρχικές τιμές COD των αποβλήτων που εξετάστηκαν (μέχρι και 4000 mg L 1 ), αν και ήταν αρκετά υψηλές, δεν εμπόδισαν τη σημαντική απομάκρυνσή του με το χρόνο, αγγίζοντας ποσοστά απομάκρυνσης μέχρι και 93.6% μέσα στο χρονικό διάστημα των 56 ημερών (Σχήμα 4.4). Παρόμοια ποσοστά απομάκρυνσης έχουν καταγραφεί και σε μεικτές καλλιέργειες με χρήση αστικών ή αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων αλλά με πολύ μικρότερες αρχικές συγκεντρώσεις COD (90.6% για αρχική συγκέντρωση μόλις 298 mg L 1 και 98.2% για αρχική συγκέντρωση μόλις 191 mg L 1 ) (Travieso et al., 2006; Su et al., 2011) A B C Χρόνος (d) Σχήμα 4.4: Μεταβολή συγκέντρωσης COD καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων με απόβλητο τυροκομείου τριών διαφορετικών αραιώσεων στα προσκολλημένα συστήματα ανάπτυξης καλλιέργειας Leptolyngbya 191

215 NO 3 (mgl1 ) NO 2 (mgl1 ) Αποτελέσματα Αντίστοιχα, η μείωση των ολικών σακχάρων έφτασε σε αρκετά υψηλά ποσοστά μέχρι και 85.2%, με τον ρυθμό απομάκρυνσής τους να είναι μεγαλύτερος τις πρώτες 23 μέρες, ως αποτέλεσμα του γρήγορου μεταβολικού ρυθμού των ετερότροφων βακτηρίων (Σχήμα 4.5δ) (Muñoz and Guieysse, 2006). Η μικρή άνοδος που παρατηρήθηκε τις τελευταίες ημέρες στις συγκεντρώσεις των σακχάρων πιθανόν να οφείλεται σε αποσύνθεση των κυττάρων, καθώς η συγκέντρωση κυττάρων της βιομάζας στο χρονικό αυτό διάστημα προσεγγίζει τη στατική φάση (Σχήμα 4.3α). Παρόμοια συμπεριφορά παρατηρήθηκε και σε παλαιότερες ερευνητικές εργασίες από τους HerediaArroyo et al. (2011). Οι απομακρύνσεις νιτρικού αζώτου παρουσιάζονται αναλυτικά στο Σχήμα 4.5 καθώς και στον Πίνακα 4.4. Τα ποσοστά απομάκρυνσής του κυμάνθηκαν μεταξύ % ενώ η απομάκρυνση του ΤΝ που παρατηρήθηκε στο σύνολο των πειραμάτων ήταν μεγαλύτερη (φθάνοντας το 89.3%) από εκείνη των αντίστοιχων NO 3 καθώς καταναλώνεται τόσο από ετερότροφους όσο και από αυτότροφους μικροοργανισμούς. Τα ποσοστά απομάκρυνσης ολικού αζώτου κυμάνθηκαν σε υψηλότερες ή ίδιες τιμές με εκείνες της βιβλιογραφίας για προσκολλημένα συστήματα, χρησιμοποιώντας ωστόσο διαφορετικές καλλιέργειες (Πίνακας 4.9). Όσον αφορά την συγκέντρωση των νιτρωδών ήταν πάντα κάτω από τα 0.2 mgl 1 σε όλες τις μετρήσεις (Σχήμα 4.5β) A B C 0,20 0,18 0,16 A B C , (α) Χρόνος (d) 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0, (β) Χρόνος (d) 192

216 PO 3 4 (mg L1 ) Αποτελέσματα A B C A B C (γ) Χρόνος (d) Σάκχαρα (mgl 1 ) (δ) Χρόνος (d) Σχήμα 4.5: Μεταβολή της συγκέντρωσης των α) ΝΟ 3, β) NO 2, γ) PO 3 4 και δ) ολικών σακχάρων καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων με απόβλητο τυροκομείου τριών διαφορετικών αραιώσεων και χρήση προσκολλημένων συστημάτων καλλιέργειας Leptolyngbya Στο Σχήμα 4.5γ παρουσιάζεται η μεταβολή της συγκέντρωσης του φωσφόρου με το χρόνο για όλες τις πειραματικές σειρές που εξετάστηκαν. Για το υπόστρωμα με την μεγαλύτερη αρχική συγκέντρωση COD, που περιείχε και την υψηλότερη αρχική συγκέντρωση φωσφορικών, παρουσιάστηκε μεγάλο ποσοστό απομάκρυνσης P, περίπου 81%. Ωστόσο, και για τις υπόλοιπες σειρές πειραμάτων το ποσοστό απομάκρυνσης ήταν επίσης υψηλό ξεπερνώντας την τιμή των 68% (Πίνακας 4.4). Το σύνολο των μικροοργανισμών κατανάλωνε θρεπτικά συστατικά του αποβλήτου για να αναπτυχθεί, σημειώνοντας ρυθμό παραγωγής βιομάζας μέχρι και την τιμή των 250 mg (L d) 1. Η προσκολλημένη βιομάζα σημείωσε ρυθμό παραγωγής περίπου 5.03 g m 2 d 1, η οποία ήταν και η μεγαλύτερη τιμή παραγωγικότητας βιομάζας που καταγράφηκε στη παρούσα εργασία για τα συστήματα προσκολλημένης ανάπτυξης. Οι παρούσες επιτευχθείσες τιμές παραγωγικότητας ξεπερνούν τις μοναδικές καταγεγραμμένες τιμές για τα είδη Leptolyngbya, με χρήση αστικού αποβλήτου από τους Singh and Thakur (2015) σε μελέτη που χρησιμοποιήθηκε μαρμάρινη πλάκα ως μέσο προσκόλλησης της βιομάζας (2.93 g m 2 d 1 ) αλλά και από 193

217 Αποτελέσματα τους Singh et al. (2014) με χρήση τεχνητού χημικού μέσου και ανοξείδωτη πλάκα ως μέσο προσκόλλησης ( gm 2 d 1 ). Επίσης, χαμηλότερη τιμή παραγωγικότητας βιομάζας (1.11 g m 2 d 1 ) σημειώθηκε και από τους Economou et al. (2015) που χρησιμοποίησαν ίδιο σύστημα προσκολλημένης ανάπτυξης για καλλιέργεια κυανοβακτηρίων αλλά με συνθετικό απόβλητο. Αξίζει να επισημανθεί ότι στα πειράματα αιωρούμενης ανάπτυξης με χρήση τυροκομικού αποβλήτου (Ενότητα 3.3.1) με παρόμοια αρχική αναλογία C:N (σειρά Β αιωρούμενων συστημάτων και σειρά Α προσκολλημένων συστημάτων) η παραγωγικότητα βιομάζας δεν παρουσίασε σημαντική διαφορά με το σύστημα προσκολλημένης ανάπτυξης με τιμές mg (L d) 1 και 293 mg (L d) 1, αντίστοιχα. Στην παρούσα ενότητα, ο ειδικός ρυθμός προσκολλημένης ανάπτυξης έφτασε σε πολύ υψηλές τιμές για όλες τις πειραματικές σειρές που εξετάστηκαν (μέχρι και d 1 ), ενώ τα αντίστοιχα πειράματα αιωρούμενης ανάπτυξης και χρήση τυροκομικού αποβλήτου οδήγησαν σε ρυθμούς μεταξύ 0.47d d 1. Πίνακας 4.4: Ποσοστό απομάκρυνσης COD και θρεπτικών συστατικών, ειδικός ρυθμός προσκολλημένης ανάπτυξης, παραγωγικότητα βιομάζας και περιεχόμενο έλαιο ξηρής βιομάζας στα προσκολλημένα συστήματα ανάπτυξης καλλιέργειας Leptolyngbya με απόβλητο τυροκομείου Πειραμ ατική Απομάκρυνση % % Μέγιστο περιεχόμενο έλαιο Παραγωγικότητα Βιομάζας Ειδικός ρυθμός προς/νης σειρά NO 3 TN PO 4 3 Ολικά Σάκχαρα COD Ολικό Προσκολ λημένο Ολική mg (L d) 1 Προσκολλη μένη g (m 2 d) 1 ανάπτυξ ης (d 1 ) A 53.7± ± ± ± ± ± ± B 87.5± ± ± ± ± ± ± C 49.4±9 73.4± ± ± ± ± ± Τέλος, σε όλες τις πειραματικές σειρές υπολογίστηκε η συγκέντρωση ολικού και προσκολλημένου ελαίου που συσσωρεύτηκε στη μικροβιακή βιομάζα. Τα ποσοστά ολικού ελαίου στη ξηρή βιομάζα στα συστήματα προσκολλημένης ανάπτυξης παρουσίασαν υψηλότερες τιμές ( %) σε σχέση με τα αντίστοιχα πειράματα αιωρούμενης ανάπτυξης ( %) με το απόβλητο τυροκομείου (Πίνακας 3.9). 194

218 Αποτελέσματα Σημειώθηκαν τιμές μέχρι και 16.1% ξηρής ολικής βιομάζας, ενώ η προσκολλημένη βιομάζα παρουσίασε ακόμα υψηλότερες τιμές φτάνοντας το 19% ξ.β.. Παρόμοια υψηλά ποσοστά ελαίου ξηρής βιομάζας Leptolyngbya καταγράφηκαν και από τους Singh and Thakur (2015) με τη χρήση αστικού αποβλήτου σε μαρμάρινη πλάκα ανάπτυξης. Επίσης, παρατηρήθηκε ότι το μέγιστο ποσοστό ελαίου προσκολλημένης βιομάζας σημειώθηκε στη πειραματική σειρά C με τη μέγιστη παραγωγικότητα προσκολλημένης βιομάζας. Πιθανόν, η μεγαλύτερη αραίωση του αποβλήτου που οδήγησε σε καλύτερη διαύγεια του υποστρώματος βοήθησε την αυτότροφη ανάπτυξη (Ma et al., 2014). Αξίζει να επισημανθεί ότι, στα πειράματα αυτότροφης ανάπτυξης με Leptolyngbya (Ενότητα 4.2) και αναλογίες N/P κοντά στο 2, το ποσοστό ελαίου στη ξηρή βιομάζα έφτασε μόλις την τιμή του 7.4%. 4.4 Πειράματα κινητικής προσκολλημένης ανάπτυξης σε απόβλητο οινοποιείου με χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. Το απόβλητο οινοποιείου που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα αυτής της ενότητας συλλέχθηκε από το τοπικό οινοποιείο Γρίβας (Ν.&Ν. Γρίβας Ο.Ε.), έχοντας την ποιοτική σύσταση και τα χαρακτηριστικά του Πίνακα Πραγματοποιήθηκαν τρεις σειρές πειραμάτων (A, B, C) στις οποίες χρησιμοποιήθηκαν τρεις διαφορετικές αραιώσεις αποβλήτου με νερό βρύσης (Πίνακας 4.5). Για τον εμβολιασμό των πειραμάτων αυτών χρησιμοποιήθηκε η αυτότροφη καλλιέργεια Leptolyngbya sp. σε εκθετική φάση ανάπτυξης αρχικής συγκέντρωσης βιομάζας μέσης τιμής των 56±11.9 mgl 1. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν χωρίς προσθήκη CO 2 υπό διαλείπουσα λειτουργία σε ενυδρεία, όπου και συλλέγονταν ημερήσια δείγματα από την υγρή αιωρούμενη και προσκολλημένη καλλιέργεια για την ανάλυση διαφόρων παραμέτρων. Το pη αρχικά ρυθμίζονταν στην τιμή των 7.0±0.5 με τη χρήση διαλύματος NaOH 5Μ, ενώ κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας κυμαίνονταν μεταξύ 79.5, κατάλληλο τόσο για αυτότροφη όσο και ετερότροφη ανάπτυξη. 195

219 Αποτελέσματα Πίνακας 4.5: Αρχικές συγκεντρώσεις COD, βιομάζας και θρεπτικών συστατικών των προσκολλημένων συστημάτων ανάπτυξης καλλιέργειας Leptolyngbya με απόβλητο οινοποιείου Πειραματ ική σειρά Αρχικό COD (mg L 1 ) NO 3 Αρχικές συγκεντρώσεις (mg L 1 ) TN PO 4 3 Ολικά Σάκχαρα Αρχική συγκέντρωση βιομάζας (mg L 1 ) A 4675± ± ± ± ± ± B 3806±74,3 8.56± ± ± ±2.5 64± C 2385± ± ±2 5.5± ± ± C/N Ν/P Η προσθήκη του εμβολίου της αυτότροφης καλλιέργειας οδήγησε στο σχηματισμό μιας ομάδας μικροοργανισμών που σχημάτισαν στρώματα βιοφίλμ τόσο στα τοιχώματα των βιοαντιδραστήρων όσο και επάνω στις ράβδους (Σχήμα 4.6) (Εικόνα 4.4). Το σύνολο των μικροοργανισμών κατανάλωσε σημαντικές ποσότητες θρεπτικών συστατικών του αποβλήτου (Σχήμα 4.8) παρουσιάζοντας ικανοποιητικό ρυθμό παραγωγής ολικής βιομάζας 99 mg (L d) 1, με την προσκολλημένη βιομάζα να σημειώνει παραγωγικότητα έως και 3.08 g m 2 d 1. Πρέπει να επισημανθεί ότι οι συγκεκριμένες τιμές παραγωγικότητας (όπως και οι προηγούμενες με τη χρήση αποβλήτου τυροκομείου) ξεπερνούν τις βιβλιογραφικές τιμές για το είδος Leptolyngbya με χρήση χημικού υποστρώματος ανάπτυξης και αστικών αποβλήτων από τους Singh et al. (2014) και από τους Singh and Thakur (2015), αντίστοιχα (Πίνακας 4.9). Ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης κυμάνθηκε σε υψηλές τιμές για όλες τις πειραματικές σειρές, μεταξύ d 1, σε αντίθεση με τα αντίστοιχα πειράματα αιωρούμενης ανάπτυξης με χρήση αποβλήτου οινοποιείου, όπου σημειώθηκαν τιμές ειδικού ρυθμού μεταξύ d 1 (Πίνακας 4.6)

220 Αποτελέσματα dcod (mg L 1 ) Εικόνα 4.4: Σταδιακή αύξηση μικροβιακής βιομάζας προσκολλημένου συστήματος καλλιέργειας Leptolyngbya με απόβλητο οινοποιείου Ολική Βιομάζα (mgl 1 ) A B C (α) Χρόνος (d) Προσκολλημένη Βιομάζα (gm 2 ) (β) Χρόνος (d) Σχήμα 4.6: Μεταβολή της α) ολικής και β) προσκολλημένης βιομάζας για τα προσκολλημένα συστήματα ανάπτυξης καλλιέργειας Leptolyngbya με απόβλητο οινοποιείου τριών διαφορετικών αραιώσεων. A B C A B C Χρόνος (d) Σχήμα 4.7: Μεταβολή της συγκέντρωσης COD καθ όλη τη διάρκεια των προσκολλημένων συστημάτων ανάπτυξης καλλιέργειας Leptolyngbya με απόβλητο οινοποιείου τριών διαφορετικών αραιώσεων. 197

221 Αποτελέσματα Όσον αφορά το COD, τα εν λόγω πειράματα οδήγησαν σε σημαντικά ποσοστά μείωσής του, μέχρι και την τιμή των 97.4% (κυρίως μέσα στις πρώτες 67 ημέρες), παρά τις υψηλές αρχικές συγκεντρώσεις που εξετάστηκαν (μεταξύ mg L 1 ) (Σχήμα 4.7). Παρόμοια ποσοστά απομάκρυνσης έχουν καταγραφεί σε μεικτές καλλιέργειες με χρήση αστικών ή αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων σε προσκολλημένα συστήματα ανάπτυξης, αλλά με πολύ μικρότερες αρχικές τιμές οργανικού φορτίου, μόλις 300 mg L 1 (Πίνακας 4.9). Η κατανάλωση των σακχάρων ακολούθησε την ίδια περίπου συμπεριφορά του COD, όπου μέσα στις πρώτες 67 μέρες παρατηρήθηκε το μεγαλύτερο ποσοστό απομάκρυνσής τους. Στη συνέχεια ωστόσο, παρατηρήθηκε αύξηση της συγκέντρωσής τους στο υπόστρωμα, καθώς στη βιομάζα έχει ξεκινήσει ήδη η λύση κάποιων κυττάρων (όπως υπέδειξαν οι HerediaArroyo et al. (2011)) (Σχήμα 4.8δ). Οι απομακρύνσεις αζώτου, νιτρικού και ολικού, παρουσιάζονται στον Πίνακα 4.6. Υψηλότερα ποσοστά απομάκρυνσης νιτρικού αζώτου παρατηρήθηκαν στην σειρά C με τη χαμηλότερη αρχική συγκέντρωση (5.4 mg L 1 ). Η πρόσληψη του νιτρικού αζώτου από τους μικροοργανισμούς είναι φωτοεξαρτώμενη, με αποτέλεσμα η μεγαλύτερη αραίωση του αποβλήτου (στη σειρά C) να διευκολύνει τη διέλευση φωτεινής ενέργειας και να αυξάνει το ρυθμό απορρόφησης του νιτρικού αζώτου. Σε κάθε σειρά πειραμάτων η απομάκρυνση ΤΝ ήταν μεγαλύτερη εκείνων των αντίστοιχων NO 3 N μιας και καταναλώνεται τόσο από ετερότροφους όσο και από αυτότροφους μικροοργανισμούς. Τα ποσοστά απομάκρυνσης ολικού αζώτου που επετεύχθησαν (μέχρι και 87.7%) ήταν λίγο υψηλότερα ή ίδια με εκείνα της βιβλιογραφίας για προσκολλημένα συστήματα παρά τις διαφορές στις καλλιέργειες και τα απόβλητα που εξετάζονταν (Πίνακας 4.9). Όσον αναφορά την συγκέντρωση των νιτρωδών ήταν κάτω από τα 0.22 mgl 1 σε όλες τις μετρήσεις (Σχήμα 4.8β). Οι συγκεντρώσεις ορθοφωσφορικών μειώθηκαν με τον χρόνο χωρίς όμως να εμφανίζουν υψηλά ποσοστά απομάκρυνσης, κάτι που αποδίδεται στις σχετικά χαμηλές αρχικές τιμές συγκεντρώσεων (μόλις τα 5.5 mg L 1 ) (Σχήμα 4.8γ). 198

222 PO 3 4 (mgl1 ) NO 3 (mgl1 ) NO 2 (mg L1 ) Αποτελέσματα A B C 0,24 0,22 0,20 A B C 9 0,18 8 0, (α) Χρόνος (d) 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0, (β) Χρόνος (d) 7 6 A B C A B C Σάκχαρα (mg L 1 ) (γ) Χρόνος (d) Χρόνος (d) (δ) Σχήμα 4.8: Μεταβολή της συγκέντρωσης των α) ΝΟ 3, β) ΝΟ 2, γ) PO 4 3 και δ) ολικών σακχάρων καθ όλη τη διάρκεια των προσκολλημένων συστημάτων ανάπτυξης καλλιέργειας Leptolyngbya με απόβλητο οινοποιείου τριών διαφορετικών αραιώσεων. Τέλος, υπολογίστηκε η συγκέντρωση ολικού και προσκολλημένου ελαίου που συσσωρεύτηκε στη μικροβιακή βιομάζα σε όλες τις πειραματικές σειρές. Τα ποσοστά ολικού ελαίου στη ξηρή βιομάζα έφτασαν σε υψηλότερες τιμές σε σχέση με τα πειράματα αιωρούμενης ανάπτυξης για το απόβλητο οινοποιείου. Συγκεκριμένα, 199

223 Αποτελέσματα σημειώθηκαν τιμές μέχρι και 21% στη ξηρή ολική βιομάζα ενώ η προσκολλημένη βιομάζα παρουσίασε ακόμα υψηλότερα ποσοστά φτάνοντας μέχρι και το 23.2%. Παρόμοια υψηλά ποσοστά ελαίου ξηρής βιομάζας Leptolyngbya κατέγραψαν και οι Singh and Thakur (2015) με τη χρήση αστικού αποβλήτου ως θρεπτικό μέσο ανάπτυξης σε προσκολλημένο σύστημα μαρμάρινης πλάκας (Πίνακας 4.9). Παρατηρήθηκε ότι το μικρότερο ποσοστό προσκολλημένου ελαίου (Σειρά Γ), σημειώθηκε στη σειρά με τη μέγιστη προσκολλημένη παραγωγικότητα βιομάζας υποδεικνύοντας (όπως επισημάνθηκε και παραπάνω) ότι η παραγωγικότητα δεν συμφωνεί με τη συσσώρευση ελαίου στη μικροβιακή βιομάζα. Αξίζει να αναφερθεί ότι στα πειράματα αιωρούμενης ανάπτυξης με Leptolyngbya (Ενότητα 3.3.2) και χρήση αποβλήτου οινοποιείου ως μέσο ανάπτυξης, τα ολικά ποσοστά ελαίου στη ξηρή βιομάζα έφτασαν μόλις το 11%. Πίνακας 4.6: Ποσοστό απομάκρυνσης COD και θρεπτικών συστατικών, ειδικός ρυθμός προσκολλημένης ανάπτυξης, παραγωγικότητα βιομάζας και περιεχόμενο έλαιο ξηρής βιομάζας στα προσκολλημένα συστήματα καλλιέργειας Leptolyngbya με απόβλητο οινοποιείου Πειραμ ατική Απομάκρυνση % % Μέγιστο περιεχόμενο έλαιο Παραγωγικότητα Βιομάζας Ειδικός ρυθμός προς/νης σειρά NO 3 TN PO 4 3 Ολικά Σάκχαρα COD Ολικό Προσκολλη μένο Ολική mg (L d) 1 Προσκολλη μένη g (m 2 d) 1 ανάπτυξη ς (d 1 ) A 54.6±4.5 80±2 34.2± ± ± ± ± B 37.8± ± ± ± ± ± ± C 77.7± ± ± ± ± ± ± Πειράματα κινητικής προσκολλημένης ανάπτυξης σε μεικτό απόβλητο οινοποιείου σταφίδας με χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya sp. 200

224 Αποτελέσματα Στην ενότητα αυτή χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα ανάπτυξης μείγμα αποβλήτων οινοποιείου και σταφίδας με χαρακτηριστικά ίδια με εκείνα που αναφέρθηκαν στην Ενότητα Πραγματοποιήθηκαν τρεις σειρές πειραμάτων (A, B, C) με διαφορετικές αραιώσεις του μείγματος με νερό βρύσης (Πίνακας 4.7). Για τον εμβολιασμό των πειραμάτων αυτών χρησιμοποιήθηκε η αυτότροφη καλλιέργεια Leptolyngbya sp. σε εκθετική φάση ανάπτυξης αρχικής συγκέντρωσης βιομάζας μέσης τιμής των 56±11.9 mg L 1. Όπως και όλα τα προηγούμενα πειράματα πραγματοποιήθηκαν χωρίς προσθήκη CO 2, υπό διαλείπουσα λειτουργία σε ενυδρεία. Το pη αρχικά ρυθμίζονταν στο 7.0±0.5 με τη χρήση διαλύματος NaOH 5Μ, ενώ κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας κυμαίνονταν μεταξύ Πίνακας 4.7: Αρχικές συγκεντρώσεις COD, βιομάζας και θρεπτικών συστατικών από τα προσκολλημένα συστήματα της καλλιέργειας Leptolyngbya με μεικτό απόβλητο Πειραμ ατική σειρά Αρχικό COD (mg L 1 ) NO 3 Αρχικές συγκεντρώσεις (mg L 1 ) Ολικά 3 TN PO 4 Σάκχαρα Αρχική συγκέντρωση βιομάζας (mg L 1 ) C/N N/P A 5091± ± ± ± ± ± B ± ± ± ± ±4 105± C ± ± ± ± ± ± A B C A B C Ολική Βιομάζα (mgl 1 ) Προσκολλημένη Βιομάζα (gm 2 ) Χρόνος (d) (α) Χρόνος (d) (β) 201

225 Αποτελέσματα Σχήμα 4.9: Μεταβολή της α) ολικής και β) προσκολλημένης βιομάζας για τα προσκολλημένα συστήματα της καλλιέργειας Leptolyngbya με μεικτό απόβλητο τριών διαφορετικών αραιώσεων. Για τα εν λόγω πειράματα παρατηρήθηκε αύξηση της ολικής βιομάζας (Σχήμα 4.9) μέχρι και την τιμή των mg (L d) 1, ενώ η προσκολλημένη βιομάζα σημείωσε παραγωγικότητα περίπου 4.12 g m 2 d 1 (Εικόνα 4.5 και 4.6) η οποία ήταν η δεύτερη μεγαλύτερη τιμή παραγωγικότητας βιομάζας που καταγράφηκε στη παρούσα εργασία για τα προσκολλημένα συστήματα (η υψηλότερη ήταν για το απόβλητο τυροκομείου). Οι επιτευχθείσες τιμές παραγωγικότητας ξεπερνούν τις ήδη καταγεγραμμένες τιμές με χρήση αστικού αποβλήτου για τα είδη Leptolyngbya σε μελέτες που χρησιμοποιήθηκε μαρμάρινη πλάκα ως μέσο προσκόλλησης της βιομάζας (2.93 g m 2 d 1 ) από τους Singh and Thakur (2015). Ο ειδικός ρυθμός προσκολλημένης ανάπτυξης για όλες τις πειραματικές σειρές κυμάνθηκε μεταξύ d 1, καταγράφοντας υψηλότερες τιμές από τις αντίστοιχες των αιωρούμενων συστημάτων ανάπτυξης καλλιέργειας Leptolyngbya με μεικτό απόβλητο ( d 1 ) (Ενότητα 3.3.4). 1α 2α 3α 4α 202

226 Αποτελέσματα 1β 2β 3β Εικόνα 4.5: Σταδιακή αύξηση μικροβιακής βιομάζας στα προσκολλημένα συστήματα ανάπτυξης καλλιέργειας Leptolyngbya με α) αραιό μεικτό απόβλητο και β) πυκνό μεικτό απόβλητο Εικόνα 4.6: Αύξηση της μικροβιακής βιομάζας πάνω στις ράβδους για τα προσκολλημένα συστήματα καλλιέργειας Leptolyngbya με μεικτό απόβλητο Οι αρχικές τιμές COD, αν και αρκετά υψηλές (5000 mgl 1 ), μειώθηκαν με το χρόνο αγγίζοντας ποσοστά απομάκρυνσης με τη διεργασία μέχρι και 91.5% μέσα σε 7 8 μέρες (Σχήμα 4.10). Παρόμοια υψηλά ποσοστά απομάκρυνσης είχαν καταγραφεί και στις μεικτές καλλιέργειες αιωρούμενης ανάπτυξης, με το ίδιο υπόστρωμα ανάπτυξης της παρούσας ενότητας, έχοντας ωστόσο μικρότερες αρχικές τιμές συγκέντρωσης (αρχικές τιμές COD περίπου 2000 mg L 1 ) (Ενότητα 3.3.4). 203

227 dcod (mg L 1 ) Αποτελέσματα A B C Χρόνος (d) Σχήμα 4.10: Μεταβολή της συγκέντρωσης COD καθ όλη τη διάρκεια των προσκολλημένων συστημάτων ανάπτυξης καλλιέργειας Leptolyngbya με μεικτό απόβλητο τριών διαφορετικών αραιώσεων. Όσον αναφορά την απορρόφηση των θρεπτικών συστατικών παρουσιάζονται στο Σχήμα Η μείωση των ολικών σακχάρων ήταν μεγαλύτερη τις 34 πρώτες μέρες, ως αποτέλεσμα του γρήγορου μεταβολικού ρυθμού των βακτηρίων. Ωστόσο, στη συνέχεια ο ρυθμός απομάκρυνσής τους μειωνόταν, πιθανόν λόγω της αποσύνθεσης των κυττάρων (Σχήμα 4.11δ). Μεγάλα ποσοστά απομάκρυνσης νιτρικού αζώτου (8090%) παρατηρήθηκαν στις πειραματικές σειρές με τις υψηλές αρχικές συγκεντρώσεις νιτρικών (18 και 17 mgl 1 ) (Πίνακας 4.7). Η απομάκρυνση ΤΝ παρουσίασε υψηλότερα ποσοστά (μεταξύ 7897%) σε σχέση με εκείνα των NO 3 N, καθώς καταναλώνεται από το σύνολο των μικροοργανισμών. Τα ποσοστά απομάκρυνσης ολικού αζώτου που σημειώθηκαν στο συγκεκριμένο υπόστρωμα (μεικτό απόβλητο) ήταν από τα υψηλότερα που έχουν καταγραφεί στη βιβλιογραφία μέχρι σήμερα για προσκολλημένα συστήματα (Πίνακας 4.9). Όσο αναφορά την συγκέντρωση των νιτρωδών ήταν κάτω από τα 0.1 mg L 1 σε όλες τις μετρήσεις (Σχήμα 4.11β). Για τις συγκεντρώσεις ορθοφωσφορικών παρατηρήθηκε χαμηλός ρυθμός αφομοίωσης (Σχήμα 4.11γ), σημειώνοντας ποσοστά απομάκρυνσης μεταξύ 53 87%. 204

228 PO 3 4 (mgl1 ) NO 3 (mgl1 ) NO 2 (mg L1 ) Αποτελέσματα A B C 0,08 0,06 A B C , , (α) Χρόνος (d) 0, (β) Χρόνος (d) (γ) Χρόνος (d) A B C Σάκχαρα (mg L 1 ) (δ) Χρόνος (d) A B C Σχήμα 4.11: Μεταβολή της συγκέντρωσης α) NO 3, β) ΝΟ 2, γ) PO 4 3 και δ) ολικών σακχάρων καθ όλη τη διάρκεια των προσκολλημένων συστημάτων ανάπτυξης καλλιέργειας Leptolyngbya με μεικτό απόβλητο τριών διαφορετικών αραιώσεων. Τέλος, υπολογίστηκε η συγκέντρωση ολικού και προσκολλημένου ελαίου που συσσωρεύτηκε στη μικροβιακή βιομάζα σε όλες τις πειραματικές σειρές (Πίνακας 4.8). Τα ποσοστά ολικού ελαίου στη ξηρή βιομάζα έφτασαν σε υψηλότερες τιμές (μέχρι και 18.6%) σε σχέση με τα πειράματα αιωρούμενης ανάπτυξης για μεικτό 205

229 Αποτελέσματα απόβλητο (μέχρι και 12.9%). Η προσκολλημένη βιομάζα παρουσίασε παρόμοιες υψηλές τιμές φτάνοντας μέχρι και την τιμή του 17.4% (Σχήμα 4.9 α και β). Ομοίως, υψηλά ποσοστά ελαίου ξηρής βιομάζας Leptolyngbya καταγράφηκαν και από τους Singh and Thakur (2015) με τη χρήση αστικού αποβλήτου σε μαρμάρινη πλάκα ανάπτυξης. Παρατηρήθηκε επίσης ότι η μέγιστη προσκολλημένη παραγωγικότητα βιομάζας (4.12 g m 2 d 1 ) σημειώθηκε μαζί με το μέγιστο ποσοστό προσκολλημένου ελαίου (17.4%) (Σειρά A), ενώ το μεγαλύτερο ποσοστό ολικού συσσωρευμένου ελαίου σημειώθηκε στο αραιότερο υπόστρωμα ανάπτυξης. Πιθανόν η μεγαλύτερη αραίωση του αποβλήτου στη σειρά αυτή (Γ) οδήγησε σε μεγαλύτερη διαφάνεια, κάτι που προώθησε την αυτότροφη ανάπτυξη (Ma et al., 2014). Πίνακας 4.8: Ποσοστό απομακρύνσεων COD και θρεπτικών συστατικών, ειδικός ρυθμός προσκολλημένης ανάπτυξης, παραγωγικότητα βιομάζας και περιεχόμενο έλαιο ξηρής βιομάζας στα προσκολλημένα συστήματα ανάπτυξης καλλιέργειας Leptolyngbya με μεικτό απόβλητο Πειραμα τική σειρά NO 3 Απομάκρυνση % TN PO 4 3 Ολικά Σάκχαρα COD % Μέγιστο περιεχόμενο έλαιο Προσκολλ Ολικό ημένο Παραγωγικότητα Ολική mg (L d) 1 Βιομάζας Προσκολλ ημένη g (m 2 d) 1 Ειδικός ρυθμός προς/νης ανάπτυξης (d 1 ) A 79.6± ± ± ± ± ± ± B 55± ±4 60.2±2.1 49± ± ± ± C 90.53± ± ± ± ± ±2 11.5± Ανάλυση λιπιδίων Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η καταλληλότητα του ελαίου που προέρχεται από τις μεικτές μικροβιακές καλλιέργειες μικροφυκών δεν εξαρτάται μόνο από την ποσότητα του ελαίου που παράγεται, αλλά και από τον τύπο και τη δομή των λιπαρών οξέων (FAs) που είναι παρόντα σε αυτό. Έτσι, είναι σημαντικό το βιοντίζελ να έχει υψηλά επίπεδα κορεσμένων και μονοακόρεστων λιπαρών οξέων αλλά και χαμηλά επίπεδα πολυακόρεστων λιπαρών οξέων. 206

230 Αποτελέσματα Για την εκτίμηση της ποιότητας του βιοντίζελ από τις μεικτές προσκολλημένες καλλιέργειες Leptolyngbya sp., εξετάστηκε η περιεκτικότητα του ελαίου που συσσωρεύτηκε στα μικροβιακά κύτταρα. Το προφίλ των λιπαρών οξέων για κάθε σύστημα καλλιέργειας παρουσιάζεται στο Σχήμα 4.12 όπου φαίνεται ότι ο τρόπος καλλιέργειας επηρεάζει εκτός από την ποσότητα και την ποιότητα των προϊόντων βιοντίζελ. Τα κύρια λιπαρά οξέα που ανιχνεύθηκαν σε όλα τα υποστρώματα των υγρών αποβλήτων ήταν: C18:1 (739%), C16:0 (2023%), C16:1 (418%), C18:2 (7 29%) και C18:0 (28%), τα πιο κοινά λιπαρά οξέα που απαντούν σε βιοντίζελ (Knothe, 2008). Τα είδη των μεθυλεστέρων λιπαρών οξέων που παρουσιάζονται στην παρούσα ενότητα είναι σύμφωνα με προηγούμενες δημοσιευμένες μελέτες για το Leptolyngbya sp. (Rós et al., 2013; Maity et al., 2014), στις οποίες το μέγεθος της ανθρακικής αλυσίδας κυμαίνεται από 12 έως 18 άτομα άνθρακα, με κυρίαρχα τα λιπαρά οξέα C16 και C18. Μάλιστα, όταν το Leptolyngbya sp. αναπτύσσεται σε απόβλητα, το παλμιτικό (C16:0) και το στεατικό οξύ (C18:0) αποτελούν ένα σημαντικό ποσοστό του συνόλου των κορεσμένων λιπαρών οξέων (σε αντίθεση με εκείνο που παράγονται όταν στελέχη του ίδιου γένους αναπτύσσονται σε τεχνητά θρεπτικά υποστρώματα), υποδεικνύοντας ότι το στέλεχος αποτελεί κατάλληλη πρώτη ύλη βιοντίζελ (Bai et al., 2013; Singh and Thakur, 2015). Σύμφωνα με το Σχήμα 4.12, η μικροβιακή καλλιέργεια με υπόστρωμα ανάπτυξης απόβλητο οινοποιείου, στην οποία παρατηρήθηκε η μεγαλύτερη παραγωγή ελαίου ξηρής προσκολλημένης βιομάζας (σχεδόν 23%), παρουσίασε το υψηλότερο ποσοστό σε ελαϊκό οξύ (C18:1), όπως συνέβη και στα αντίστοιχα πειράματα αιωρούμενης ανάπτυξης (Σχήμα 3.21β). Το επόμενο υψηλό ποσοστό ελαϊκού οξέος εμφανίστηκε στην επίσης υψηλή παραγωγή ελαίου ξηρής προσκολλημένης βιομάζας (σχεδόν 17%) με τη χρήση υποστρώματος μεικτού αποβλήτου. Το περιεχόμενο παλμιτικού οξέος (C16:0) φαίνεται να μην επηρεάζεται ιδιαίτερα από την αλλαγή υποστρώματος ανάπτυξης καθώς τα ποσοστά κυμάνθηκαν από 2023% για όλες τις ομάδες πειραμάτων, υποδεικνύοντας ότι το βιοντίζελ που παράγεται παρουσιάζει υψηλή οξειδωτική σταθερότητα. Ωστόσο, παρατηρήθηκε μεταβολή των ποσοστών παραγωγής παλμιτελεϊκού οξέος (C16:1) (μεταξύ τεχνητού χημικού υποστρώματος και αποβλήτων) καθώς μειώθηκαν με τη χρήση οποιουδήποτε αποβλήτου. Σε αντίθεση, τα ποσοστά του μυριστικού οξέος (C14:0) αυξήθηκαν, όταν αντί για χημικό υπόστρωμα 207

231 Αποτελέσματα χρησιμοποιήθηκε απόβλητο. Επίσης, με τη χρήση αποβλήτων ως υπόστρωμα ανάπτυξης παρατηρήθηκε ελαφρώς αυξημένη παραγωγή στεατικού οξέος (C18:0) όπως συμβαίνει και στις καλλιέργειες Leptolyngbya sp. των Singh and Thakur (2015). Είναι επίσης αξιοσημείωτη η διαφορά στην παραγωγή καπρικού οξέος (C10:0), όπου με χρήση τεχνητού υποστρώματος ανάπτυξης και μεικτού αποβλήτου φτάνει τα 9.8% και 11.5%, αντίστοιχα, ενώ είναι μόλις στο 3.31% και 0.22% με χρήση αποβλήτου οινοποιείου και χρήση τυροκομείου, αντίστοιχα. Επιπλέον, το περιεχόμενο σε λινολενικό οξύ (C18:3) ήταν κάτω από 12% σε όλα τα πειράματα που διεξήχθησαν, υποδεικνύοντας την καταλληλότητα των συντιθέμενων λιπιδίων για χρήση σε οχήματα, σύμφωνα με τα ευρωπαϊκά πρότυπα βιοντίζελ (Knothe, 2005) Απόβλητο τυροκομείου Απόβλητο οινοποιείου Μεικτό απόβλητο Αυτότροφη καλλιέργεια 35 Λιπαρά οξέα % C10:0 C12:0 C14:0 C14:1 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 alpha others Σχήμα 4.12: Τα είδη των λιπαρών οξέων που παράγονται από την προσκολλημένη μικροβιακή βιομάζα καλλιέργειας Leptolyngbya με τεχνητό χημικό μέσο, απόβλητο τυροκομείου, οινοποιείου και μεικτό απόβλητο Σύμφωνα με τα πρότυπα του ιδανικού βιοντίζελ από τους Schenk et al. (2008) και Josephine et al. (2015), θα πρέπει να περιέχει όχι μόνο μικρές ανθρακικές αλυσίδες (κορεσμένα από 16 έως 18 άτομα άνθρακα), μονο ή διακόρεστα λιπαρά οξέα, αλλά και ένα σημαντικό ποσοστό αθροίσματος C14:0, C16:0, C16:1, C18:0, C18:1 και C18:2. Επομένως, υπολογίζοντας το παραπάνω άθροισμα (C14:0, C16:0, C16:1, 208

232 Αποτελέσματα C18:0, C18:1 και C18:2) για όλες τις πειραματικές ομάδες, το υψηλότερο ποσοστό παρατηρήθηκε με χρήση αποβλήτου οινοποιείου (85.3%), ενώ ακολούθησε η χρήση μεικτού αποβλήτου και τυροκομείου με 78.7%, 77.7%, αντίστοιχα. Τα πειράματα με χρήση χημικού συνθετικού μέσου έδωσαν ποσοστό αθροίσματος 77%. Να επισημανθεί ότι το υψηλότερο ποσοστό για το παραπάνω άθροισμα λιπαρών οξέων στα αιωρούμενα συστήματα της καλλιέργειας Leptolyngbya καταγράφηκε με τη χρήση μεικτού αποβλήτου (89.13%), ενώ στα συστήματα προσκολλημένης ανάπτυξης εμφανίστηκε με τη χρήση οινοποιείου παρουσίασε παραπλήσιο ποσοστό (85.4%). Επίσης, στα συστήματα αιωρούμενης ανάπτυξης, για το απόβλητο τυροκομείου το άθροισμα ήταν μεγαλύτερο (85.3%) σε σχέση με τα προσκολλημένα συστήματα. Η χρήση τεχνητού χημικού υποστρώματος στα προσκολλημένα συστήματα δεν επηρέασε πολύ το άθροισμα των παραπάνω λιπαρών οξέων, καθώς ήταν παρόμοιο με αυτό των αιωρούμενων συστημάτων (75.8%). Γενικά, η αλλαγή στην σύνθεση των λιπαρών οξέων του μικροβιακού ελαίου που παράγεται στα υποστρώματα των αποβλήτων που εξετάστηκαν και για τα δύο συστήματα (αιωρούμενηςπροσκολλημένης ανάπτυξης) μπορεί να έχει προστατευτικό ρόλο ώστε να επιτρέπει στα μικρόβια να προσαρμόζονται στις μεταβαλλόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες. Ως εκ τούτου, οι συνθήκες καλλιέργειας θα πρέπει να ρυθμίζονται κάθε φορά προκειμένου να λαμβάνεται το επιθυμητό προφίλ λιπαρών οξέων για βιοκαύσιμα. Όλα τα προαναφερόμενα χαρακτηριστικά του προφίλ των λιπαρών οξέων που καταγράφηκαν από τη συλλεγόμενη προσκολλημένη μικροβιακή βιομάζα (όπως οι υψηλές ποσότητες κορεσμένων και μονοακόρεστων λιπαρών οξέων, χαμηλές τιμές λινολενικού οξέος), υποδεικνύουν την καταλληλότητα του προσκολλημένου συστήματος των μικροοργανισμών για την παραγωγή υψηλής ποιότητας βιοντίζελ. 4.7 Συζήτηση Πειραματικών Αποτελεσμάτων Στο παρόν κεφάλαιο μελετήθηκε η ικανότητα μεικτής καλλιέργειας του Leptolyngbya sp. να απομακρύνει υπό μη ασηπτικές συνθήκες οργανικά και ανόργανα συστατικά από διάφορα υγρά απόβλητα σε συστήματα προσκολλημένης ανάπτυξης, καθώς και η ικανότητά του να παράγει βιοκαύσιμα. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν απόβλητα τυροκομείου, οινοποιείου και μείγμα αποβλήτων προερχόμενα από οινοποιείο και βιομηχανία τυποποίησης σταφίδας. 209

233 Αποτελέσματα Όπως ήδη έχει αναφερθεί, τα αγροτοβιομηχανικά απόβλητα είναι ιδιαίτερα ρυπογόνα, όξινα, με χαρακτηριστικές υψηλές συγκεντρώσεις COD, BOD και θρεπτικών συστατικών. Η βιολογική επεξεργασία τους με χρήση κυανοβακτηρίων/ μικροφυκών έχει μελετηθεί αρκετά, ωστόσο οι περισσότερες από αυτές τις μελέτες επικεντρώνονται κυρίως σε συστήματα αιωρούμενης ανάπτυξης (Πίνακας 3.18). Από την άλλη, η επεξεργασία αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων με χρήση μικροφυκών σε συστήματα προσκολλημένης ανάπτυξης είναι ελάχιστα μελετημένη, περιορίζοντας έτσι τη δυνατότητα σχεδιασμού και ανάπτυξης συστημάτων βιομηχανικής κλίμακας. Να επισημανθεί επίσης ότι οι περισσότερες από αυτές τις μελέτες στόχευαν κυρίως στην απομάκρυνση των θρεπτικών συστατικών, χωρίς να λαμβάνουν υπόψη την παραγωγή βιοπροϊόντων από τη συσσωρευμένη βιομάζα (Kesaano and Sims, 2014). Διάφορα υποστρώματα έχουν χρησιμοποιηθεί ως θρεπτικό μέσο ανάπτυξης μικροφυκών στα προσκολλημένα συστήματα ανάπτυξης, κυρίως τεχνητά χημικά μέσα (Liu et al., 2013; Houser et al., 2014), οικιακά/ αστικά λύματα (Su et al., 2011; Sukačová et al., 2015), γαλακτοκομικά απόβλητα (Mulbry et al., 2008b) και απόβλητα χοιροστασίων (Godos et al., 2009). Ωστόσο, στις πιο πολλές μελέτες, χρησιμοποιήθηκαν ασηπτικές συνθήκες καλλιέργειας, μειώνοντας έτσι τη δυνατότητα εφαρμογής της διεργασίας σε μεγαλύτερη κλίμακα. Επιπλέον, στις περισσότερες έρευνες χρησιμοποιήθηκαν εκροές που είχαν προκύψει από αναερόβια προεπεξεργασία των αποβλήτων, εφόσον με αυτό τον τρόπο μειωνόταν σημαντικά η συγκέντρωση του οργανικού φορτίου όχι όμως των ανόργανων αλάτων που είναι χρήσιμα για την ανάπτυξη των μικροφυκών. Αρκετές μελέτες επίσης, χρησιμοποίησαν γαλακτοκομικά απόβλητα ως υπόστρωμα προσκολλημένης ανάπτυξης μικροφυκών αλλά καμία (μέχρι σήμερα) δεν έχει αναφερθεί στη χρήση (δευτερογενούς) ορρού γάλακτος, όπως πραγματοποιήθηκε στην παρούσα ενότητα. Επίσης, σημαντικό είναι να αναφερθεί πως στη παρούσα ενότητα, για πρώτη φορά, πραγματοποιήθηκε επεξεργασία αποβλήτων οινοποιείου και σταφίδας σε συστήματα προσκολλημένης ανάπτυξης με χρήση μικροφυκών/ κυανοβακτηρίων. Στόχος των πειραμάτων του παρόντος κεφαλαίου ήταν η μελέτη της βιολογικής επεξεργασίας αποβλήτων με υψηλές συγκεντρώσεις οργανικού φορτίου και θρεπτικών στοιχείων, τα οποία δεν έχουν μελετηθεί εκτεταμένα σε συστήματα προσκολλημένης ανάπτυξης μικροφυκών. Η ομάδα μικροοργανισμών που αναπτύχθηκε σε όλες τις περιπτώσεις μπορεί να χαρακτηριστεί από μιξότροφο μεταβολισμό, εφόσον δινόταν 210

234 Αποτελέσματα εξωτερική πηγή άνθρακα (από το ίδιο το απόβλητο) αλλά και ατμοσφαιρικό διοξείδιο του άνθρακα, μαζί με φωτεινή ενέργεια, για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών. Η μικροβιακή βιομάζα που παράχθηκε αποτελούντο από όλα τα γηγενή είδη μικροβίων που προϋπήρχαν στο κάθε απόβλητο αλλά και από αυτότροφους μικροοργανισμούς που προστέθηκαν ως εμβόλιο στην αρχή κάθε επεξεργασίας αποβλήτου. Σε όλα τα διεξαχθέντα πειράματα υπολογίστηκε ο ρυθμός παραγωγής της ολικής βιομάζας (άθροισμα αιωρούμενης και προσκολλημένης) αλλά και ο ρυθμός παραγωγής της προσκολλημένης βιομάζας. Οι τιμές παραγωγικότητας για την προσκολλημένη βιομάζα που επετεύχθησαν κυμάνθηκαν από 1.23 μέχρι και 5.03 g m 2 d 1 και παρουσιάζονται αναλυτικά στους Πίνακες 4.2 και 4.4 του παρόντος κεφαλαίου. Ανασκόπηση της βιβλιογραφίας (Πίνακας 4.9) αναδεικνύει το μεγάλο εύρος τιμών στο ρυθμό παραγωγής βιομάζας που οφείλεται κυρίως στα διαφορετικά εφαρμοζόμενα συστήματα προσκολλημένης ανάπτυξης (Harwati et al., 2012). Πράγματι, σε κάθε ένα από τα εφαρμοζόμενα συστήματα χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικά υλικά προσκόλλησης (γυαλί, πλαστικό, πλεξιγκλάς, τσιμέντο, μάρμαρο, ύφασμα), διαφορετικό υπόστρωμα ανάπτυξης (αστικό απόβλητο, αγροτοβιομηχανικά απόβλητα, τεχνητά χημικά μέσα) αλλά και μια ποικιλία αρχικών συγκεντρώσεων θρεπτικών συστατικών καθώς και εφαρμοζόμενων συνθηκών ανάπτυξης. Σύγκριση των πειραμάτων της παρούσας ενότητας με μελέτες της βιβλιογραφίας παρόμοιων συστημάτων προσκολλημένης ανάπτυξης με Leptolyngbya δείχνει ότι οι ρυθμοί παραγωγής της μεικτής προσκολλημένης βιομάζας που επετεύχθησαν είναι υψηλότεροι (μέχρι και 5.03 g m 2 d 1 ) από εκείνους που σημειώθηκαν με χρήση μονοκαλλιέργειας Leptolyngbya sp. (2 3 g m 2 d 1 ) και υπόστρωμα ανάπτυξης τεχνητό χημικό μέσο ή αστικό απόβλητο (Singh et al., 2014; Singh and Thakur, 2015). Ωστόσο, τα είδη Leptolyngbya δεν έχουν μελετηθεί ακόμα αρκετά στην βιβλιογραφία για επεξεργασία διαφορετικών ειδών αποβλήτων, ώστε να εξεταστεί εκτενέστερα η δυνατότητα παραγωγής βιομάζας τους σε συστήματα βιομηχανικής κλίμακας, με κύριο σκοπό όχι μόνο την επεξεργασία των αποβλήτων αλλά και την αξιοποίηση της παραγόμενης βιομάζας. Ο μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, σημείωσε εύρος τιμών μεταξύ d 1 για τα διαφορετικά υποστρώματα ανάπτυξης, με την μέγιστη τιμή (0.925 d 1 ) να καταγράφεται στο υπόστρωμα του τυροκομικού αποβλήτου. Το απόβλητο τυροκομείου παρουσίασε την ίδια συμπεριφορά και στα πειράματα αιωρούμενης ανάπτυξης, όπου και σε εκείνες τις σειρές πειραμάτων (Ενότητα 3.3) 211

235 Αποτελέσματα σημείωσε την υψηλότερη τιμή ειδικού ρυθμού (0.49 d 1 ) σε σχέση με τα υπόλοιπα υποστρώματα αποβλήτων που εξετάστηκαν. Ωστόσο, στα συστήματα προσκολλημένης ανάπτυξης της μεικτής καλλιέργειας Leptolyngbya σημειώθηκαν υψηλότερες τιμές ειδικού ρυθμού ανάπτυξης από εκείνες των αιωρούμενων συστημάτων, για όλα τα υποστρώματα των αποβλήτων που εξετάστηκαν. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν την προτίμηση της μεικτής καλλιέργειας Leptolyngbya για ανάπτυξη σε προσκολλημένα συστήματα. Είναι επίσης σημαντικό να αναφερθεί ότι στη βιβλιογραφία οι καταγεγραμμένες τιμές ειδικού ρυθμού σε συστήματα προσκολλημένης ανάπτυξης Leptolyngbya (Singh and Thakur, 2015) είναι μικρότερες από τις επιτευχθείσες τιμές της παρούσας ενότητας, υποδεικνύοντας και την αποτελεσματικότητα του εφαρμοζόμενου συστήματος. Η αύξηση της μικροβιακής βιομάζας στα προσκολλημένα συστήματα επιτεύχθηκε με την χρησιμοποίηση των θρεπτικών στοιχείων που προϋπήρχαν στο κάθε υπόστρωμα ανάπτυξης. Έτσι, κατά τη βιοδιεργασία αυτή παρατηρήθηκε μείωση του αζώτου, του φωσφόρου και του οργανικού φορτίου σε κάθε απόβλητο, που οδήγησε σε υψηλά ποσοστά απομάκρυνσής τους στα περισσότερα από τα εφαρμοζόμενα υποστρώματα (Πίνακας 4.9). Αν και χρησιμοποιήθηκαν υψηλές αρχικές τιμές COD, σε όλες τις σειρές πειραμάτων που διεξήχθησαν (μεταξύ 1900 και 5000 mg L 1 ), παρατηρήθηκαν υψηλά ποσοστά απομάκρυνσης του COD αγγίζοντας το 97.4% για το απόβλητο οινοποιείου, το 93.6% για το απόβλητο τυροκομείου και το 91.5% στο μεικτό απόβλητο (με αρχικές συγκεντρώσεις COD 4675 mg L 1, 3075 mgl 1 και 1930 mgl 1, αντίστοιχα). Μάλιστα οι ρυθμοί απομάκρυνσης των παραπάνω COD ήταν σχετικά υψηλότεροι σε σχέση με τα πειράματα αιωρούμενης ανάπτυξης και έφτασαν σε τιμές mg (L d) 1, mg (L d) 1 και mg (L d) 1, αντίστοιχα. Σε κάθε απόβλητο δημιουργούνταν μια συγκεκριμένη ομάδα μικροοργανισμών που είχε τη δυνατότητα να προσαρμόζεται καλύτερα στα εκάστοτε χαρακτηριστικά του υποστρώματος, επιτυγχάνοντας τη δημιουργία βιοφίλμ. Να σημειωθεί ότι για υψηλότερες αρχικές συγκεντρώσεις απαιτούνταν μεγαλύτεροι χρόνοι επεξεργασίας. Για το απόβλητο του τυροκομείου καταγράφηκαν απομακρύνσεις COD μεταξύ % ενώ για το οινοποιείο σημειώθηκαν υψηλότερες τιμές μεταξύ %. Το ίδιο υψηλές απομακρύνσεις COD καταγράφηκαν και στο υπόστρωμα μεικτού αποβλήτου με τιμές μεταξύ %. Η χρήση αποβλήτου οινοποιείου στα συστήματα προσκολλημένης ανάπτυξης επέφερε υψηλότερο ποσοστό απομάκρυνσης από εκείνο 212

236 Αποτελέσματα των αιωρούμενων συστημάτων ανάπτυξης της καλλιέργειας Leptolyngbya, για παρόμοιες αρχικές συγκεντρώσεις COD. Να αναφερθεί ότι με μεικτή ομάδα μικροοργανισμών (μικροφύκηβακτήρια) σε σύστημα προσκολλημένης ανάπτυξης, παρόμοιων αρχικών τιμών COD ( mg L 1 ), από τους Godos et al. (2009), η απομάκρυνση που επετεύχθη ήταν μόλις 76%, αρκετά μικρότερη από τα ποσοστά της παρούσας ενότητας. Σημαντικό είναι επίσης να αναφερθεί ότι οι περισσότερες μεικτές ομάδες μικροοργανισμών που έχουν εξεταστεί στην βιβλιογραφία με αστικά ή αγροτοβιομηχανικά απόβλητα και επιτυγχάνουν υψηλά ποσοστά απομάκρυνσης COD (9098%), εφαρμόζονται σε απόβλητα μικρές αρχικές συγκεντρώσεις COD (μόλις mg L 1 ) (Travieso et al., 2006; Su et al., 2011), υποδεικνύοντας την δυσκολία τους να εφαρμοστούν σε μεγαλύτερη κλίμακα. Οι ρυθμοί απομάκρυνσης των θρεπτικών συστατικών καταγράφηκαν με τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων των νιτρικών, των νιτρωδών και των ορθοφωσφορικών αλάτων καθώς και με μετρήσεις του ολικού αζώτου και ολικού φωσφόρου. Τα ποσοστά απομάκρυνσης των νιτρικών κυμάνθηκαν για όλες τις πειραματικές σειρές από 38 μέχρι 90.5% ενώ η συγκέντρωση των νιτρωδών παρέμενε κάτω από την τιμή των 0.2 mg L 1. Τα ποσοστά απομάκρυνσης ολικού αζώτου ήταν σχετικά μεγαλύτερα από εκείνα των νιτρικών και κυμάνθηκαν από 70.5 μέχρι 97%. Όσο αναφορά τα ορθοφωσφορικά, παρουσίασαν υψηλά ποσοστά απομάκρυνσης όταν η αρχική συγκέντρωσή τους στο υπόστρωμα ήταν πάνω από 6 mg L 1. Τα ποσοστά απομάκρυνσής τους κυμάνθηκαν από 10 έως και 99% στο σύνολο των πειραματικών σειρών. Αξίζει να επισημανθεί η διαφορά στα ποσοστά απομάκρυνσης των θρεπτικών μεταξύ των πειραμάτων με παρόμοιες αρχικές συγκεντρώσεις COD, του αποβλήτου οινοποιείου και μεικτού αποβλήτου (4675 mgl 1 και 5090 mgl 1, αντίστοιχα) όπου τα νιτρικά, το ολικό άζωτο και τα φωσφορικά απομακρύνθηκαν περισσότερο με τη χρήση μεικτού αποβλήτου ως υπόστρωμα ανάπτυξης. Αυτό πιθανόν οφείλεται στην διαφορετική αρχική αναλογία N:P αλλά και στην μεγαλύτερη διαύγεια που απέκτησε το υπόστρωμα ανάπτυξης με την χρήση αποβλήτου σταφίδας σε σχέση με το απόβλητο οινοποιείου. Στο μεικτό σύστημα μικροοργανισμών (μικροφύκη βακτήρια) προσκολλημένης ανάπτυξης των Godos et al. (2009) με χρήση αποβλήτου χοιροστασίου επιτεύχθηκε απομάκρυνση ολικού αζώτου μέχρι 69%, ενώ του φωσφόρου κάτω από 10%, τιμές πολύ μικρότερες από εκείνες της παρούσας ενότητας. Σε άλλο μεικτό σύστημα προσκολλημένης ανάπτυξης με αστικά απόβλητα των 213

237 Αποτελέσματα Posadas et al. (2013), οι τιμές απομάκρυνσης αζώτου και φωσφόρου ήταν παρόμοιες με την παρούσα ενότητα (Πίνακας 4.9). Ωστόσο, οι διαφορές στα εφαρμοζόμενα συστήματα είναι αρκετά μεγάλες ώστε είναι δύσκολο να γίνει άμεση σύγκριση. Στα αποτελέσματα των συστημάτων προσκολλημένης ανάπτυξης της παρούσας διατριβής, οι απομακρύνσεις των νιτρικών κυμαίνονται μεταξύ % ενώ στα συστήματα αιωρούμενης ανάπτυξης είναι λίγο χαμηλότερα μεταξύ 3570%. Την ίδια εικόνα παρουσιάζουν και τα ποσοστά απομάκρυνσης ολικού αζώτου, όπου στα προσκολλημένα συστήματα κυμαίνονται μεταξύ % ενώ στα αιωρούμενης ανάπτυξης μεταξύ 5591%. Για την απομάκρυνση των ορθοφωσφορικών καταγράφηκε παρόμοιο ποσοστό απομάκρυνσης, περίπου στο 90% και για τα δύο συστήματα ανάπτυξης. Παρά τα υψηλά ποσοστά απομάκρυνσης COD και θρεπτικών ουσιών που επετεύχθησαν, στο τέλος ορισμένων πειραμάτων (Ενότητα 4.3) οι συγκεντρώσεις COD ήταν πάνω από τα ανώτατα επιτρεπόμενα όρια που ορίζει η νομοθεσία προκειμένου να διατεθούν οι εκροές σε μια μονάδα επεξεργασίας αστικών λυμάτων (500 mgl 1 ) ή απευθείας στους υδάτινους αποδέκτες (π.χ. θάλασσα, ρεύματα) (125 mgl 1 ) (Ευρωπαϊκή Οδηγία ΕΕ91/271/ΕΟΚ). Για το λόγο αυτό προτείνεται ένα βήμα μετεπεξεργασίας προκειμένου να βελτιωθεί η ποιότητα των τελικών εκροών, που θα μπορούσε να περιλαμβάνει ένα αερόβιο βιολογικό φίλτρο είτε ένα τεχνητό υγροβιότοπο. Η αναλογία C:N:P που θεωρείται η βέλτιστη για την ανάπτυξη φυτοπλαγκτού κατά Geider and La Roche (2002) είναι 106:16:1. Ωστόσο, η αναλογία αυτή διαφέρει μεταξύ των μικροβιακών πληθυσμών που αναπτύσσονται κάθε φορά, λόγω των μεταβαλλόμενων συνθηκών στα εφαρμοζόμενα συστήματα. Ο αντίκτυπος της αναλογίας C:N στον ρυθμό ανάπτυξης και στη συσσώρευση λιπιδίων παρουσιάζεται στις περισσότερες πειραματικές σειρές της παρούσας ενότητας (Ενότητα 4) όπου οι υψηλότερες τιμές C:N οδήγησαν σε υψηλότερους ειδικούς ρυθμούς ανάπτυξης και σε μεγαλύτερα ποσοστά συσσωρευμένου ελαίου στη ξηρή βιομάζα (Πίνακας 4.9). Οι περιεκτικότητες των λιπιδίων στη μικροβιακή βιομάζα που επετεύχθησαν στην παρούσα ενότητα κυμαίνονταν μεταξύ 821% επί ξηρής ολικής βιομάζας και % επί ξηρής προσκολλημένης βιομάζας (Πίνακας 4.9). Αντίστοιχες εργασίες με χρήση καλλιέργειας Leptolyngbya σε προσκολλημένα συστήματα ανάπτυξης με αστικό απόβλητο από τους Singh and Thakur (2015) έδωσαν παραγωγή λιπιδίων 214

238 Αποτελέσματα μεταξύ % ξ.β.. Ωστόσο, εργασία των Singh et al. (2014) με τεχνητό χημικό μέσο ανάπτυξης για καλλιέργεια Leptolyngbya απέδωσε μικρότερα ποσοστά λιπιδίων μεταξύ 1621% ξ.β. Αξίζει να αναφερθεί η εργασία των Economou et al. (2015) με συνθετικό απόβλητο, όπου χρησιμοποιήθηκε η ίδια πειραματική διάταξη προσκολλημένης ανάπτυξης κυανοβακτηρίων καταγράφοντας ποσοστά συσσωρευμένου ελαίου περίπου 21% ξ.β.. Η διαδικασία συσσώρευσης λιπιδίων στα μικροβιακά κύτταρα επηρεάζεται από πολλές μεταβλητές, είτε των συνθηκών καλλιέργειας που εφαρμόζονται (π.χ. θερμοκρασία, αναλογίες θρεπτικών συστατικών) είτε από τις γονιδιακές δυνατότητες των στελεχών που αναπτύσσονται (Bellou and Aggelis, 2013; EspinosaGonzalez et al., 2014). Οι υψηλότερες τιμές συσσωρευμένου ελαίου ολικής ξηρής βιομάζας καταγράφηκαν στις πειραματικές σειρές που χρησιμοποιήθηκε απόβλητο οινοποιείου καθώς σημείωσε 19.6% ξ.β. για αρχική συγκέντρωση COD 2385 mgl 1 και 21% ξ.β. για COD 4675 mgl 1. Ακολούθησαν τα ποσοστά ελαίου 18.6% και 16.2% που επετεύχθησαν με χρήση μεικτού αποβλήτου σε συγκεντρώσεις COD 1930 mgl 1 και 5090 mgl 1, αντίστοιχα. Στα πειράματα αιωρούμενης ανάπτυξης με καλλιέργεια Leptolyngbya (Ενότητα 3.3), τα υψηλότερα ποσοστά συσσωρευμένου ελαίου καταγράφηκαν με τη χρήση αποβλήτου τυροκομείου ( %, όταν το αρχικό COD ήταν 3240 mgl 1 και 1578 mgl 1, αντίστοιχα) ενώ ακολούθησαν οι τιμές ελαίου από το μεικτό απόβλητο ( %, με αρχικό COD 6390 mgl 1 και 2644 mgl 1, αντίστοιχα). Όλες οι παραπάνω παρατηρήσεις όσο αναφορά τις τιμές σε απομακρύνσεις οργανικού φορτίου και θρεπτικών συστατικών, ειδικού ρυθμού ανάπτυξης αλλά και συσσωρευμένου ελαίου ξηρής βιομάζας, ενισχύουν α) την άποψη για χρήση των ειδών Leptolyngbya ως πιθανά στελέχη για την επεξεργασία διαφόρων αποβλήτων και την ταυτόχρονη παραγωγή βιοκαυσίμων (Maity et al., 2014; Singh and Thakur, 2015) και β) αναδεικνύουν την προτίμηση της συγκεκριμένης επικρατούσας ομάδας μικροοργανισμών για ανάπτυξη σε προσκολλημένα συστήματα. Η παρατήρηση αυτή ενισχύεται επίσης και από τις προσαρμογές του γένους και προτιμήσεις σε βενθικό (ανάπτυξη σε υπόστρωμα) παρά πλαγκτικό (σε αιώρηση στο νερό) τρόπο ζωής, σχηματίζοντας ευκολότερα βιοφίλμ σε επιφάνειες. Ο σχηματισμός του βιοφίλμ μπορεί να διευκολύνει επίσης και τις μεθόδους συγκομιδής της βιομάζας, μειώνοντας το συνολικό κόστος παραγωγής βιοκαυσίμων. 215

239 Αποτελέσματα Πίνακας 4.9: Συγκριτικός πίνακας λειτουργικών συνθηκών από προσκολλημένα συστήματα καλλιέργειας μικροφυκών με διάφορα υποστρώματα ανάπτυξης Υπόστρωμ α Απόβλητο τυροκομείο υ Απόβλητο οινοποιείου Απόβλητο μεικτό οινοποιείουσταφίδας Συνθετικό απόβλητο Αστικό απόβλητο Μείγμα από απόβλητα χοιροστασίο υ Αστικό απόβλητο Υγρή γαλακτοκομ Προεπεξεργασία υποστρώματ ος Αερόβια επεξεργασμέν ο Screening, εξάμμωση Διήθηση με πλέγμα 2mm Κοσκίνισμα για άμμο και λίπη Ακατέργαστη Συνθήκες καλλιέργειες / Σύστημα προσκόλλησης Batch / κυλινδρικές γυάλινες ράβδους Batch / κυλινδρικές γυάλινες ράβδους Batch / κυλινδρικές γυάλινες ράβδους Batch / κυλινδρικές γυάλινες ράβδους Batch / διαφανές PVC Continuous / Δεξαμενή από ακρυλικό πλαστικό Batch / Plexiglas Outdoor / Είδη μικροοργανισμών Μεικτή καλλιέργεια Leptolyngbya sp. Μεικτή καλλιέργεια Leptolyngbya sp. Μεικτή καλλιέργεια Leptolyngbya sp. Limnothrix sp. Filamentousbluegreen, Bacteroidia, Flavobacteria, Beta/Gammaproteobacteria Chlorella vulgaris, Αερόβια βακτήρια Κροκιδώσεις από μικροφύκη και αερόβια βακτήρια Rhizoclonium hieroglyphicum, Αρχικό COD / % Απομάκρυνσης 3075 mg L 1 / mg L 1 / mg L 1 / mg L 1 / mg L 1 / mg L 1 / 91.5 % Ποσοστό ελαίου ολικής ξηρής βιομάζας (προσκ/νης) 16.1 (11.5) 16.1 (19) 21 (23.2) 19.6 (10.9) 16.2 (17.4) 18.6 (11.5) NH 4 + % Απομάκρυνση θρεπτικών συστατικών NO TN PO TP C/N Παραγωγικότη τα Βιομάζας (g m 2 d 1 ) / Ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (d 1 ) 2.89 / / / / / / Βιβλιογραφ ία Παρούσα μελέτη Παρούσα μελέτη Παρούσα μελέτη Σάκχαρα / Economou < 4.5 mg L 1 et al. (2015) mg L 1 / mg L 1 / / Su et al. (2011) / Travieso et al. (2006) ~55 ~ / Van Den Hende et al. (2011a) / Mulbry et al. (2008b) 216

240 Αποτελέσματα ική κοπριά Γαλοκτοκομ ικό απόβλητο Γαλακτοκομ ικό απόβλητο Αναερόβια χώνευση Διήθηση Αναερόβια χώνευση Επιμήκεις κανάλια χλοοτάπητα Semicontinous / αφρώδες πολυστυρένιο Indoor/ ATS * Outdoor/ATS * Microspora willeana, Ulothrix ozonata, Oedogonium sp Chlorella sp / Johnson and Wen (2010) Rhizoclonium hieroglyphicum / 7.6/ Mulbry et al. (2008a) Ακατέργαστο Indoor/ATS * / Outdoor/ATS * / Απόβλητο χοιροστασίο υ Ιλυώδες διάλυμα χοιροστασίο υ Ακατέργαστο Φυγοκέντρησ η Indoor/ATS * Continuous / διαφανής σωλήνας PVC Chlorella sorokiniana, γηγενής βακτηριακή κοινότητα De Godos et al. (2009) 10.7/ Κοπριά χοιροστασίο υ Οικιακά απόβλητα Οικιακά απόβλητα Κοσκίνισμα με 0.15mm, Αραίωση Αναερόβια χωνεμένη ιλύς, πρωτοβάθμιας καθίζησης λύμα Continuous outdoor / Εύκαμπτο λευκό PVC Continuous/ Παχύ πορώδες PVC Fed batch, Φωτοαυτότροφη, Bench / περιστρεφόμενος κύλινδρος PVC, Medium, Μεικτή ομάδα αλγών βακτηρίων Μεικτή καλλιέργεια αλγών βακτηρίων Μεικτή καλλιέργεια Chlorella, Scenedesmus, Pediastrum, Nitzschia, Navicula, 1220 mgl mgl 1 / 76 TOC:76 mgl 1 / 50 TOC:180 mgl 1 / < / Godos et al. (2009) / / 20 / Posadas et al. (2013) Christenson and Sims (2012) 217

241 Αποτελέσματα Οικιακά απόβλητα Αστικό απόβλητο Αστικό απόβλητο Αστικό απόβλητο Θρεπτικό μέσο BG11 (NaHCO 3 ) Pilot / αλουμινένιος τροχός με βαμβακερά καλώδια Φίλτρο άμμου Continuous / Πολυανθρακικός τοίχος Αποστείρωση Semicontinuos / Μαρμάρινη πλάκα Continuous / Τσιμεντένια πλάκα Συνθετικό και πραγματικό Αποστείρωση Συνεχής / πλαστικό φύλλο Semicontinous / Ανοξείδωτο πλέγμα Crucigenia, Synedra και πολλά άλλα διάτομα Scenedesmus obliquus Ολικό: 143 mgl 1 / 73 Διαλυτό: 59 mgl 1 / 43 Leptolyngbya sp. 428 mg L 1 Phormidium autumnale, Pseudanabaena sp., Chrococcus sp., Scenedesmus acutus Cymbella minuta Nitzschia sp., green filaments / / / Zamalloa et al. (2013) / Singh and Thakur (2015) / Sukačová et al. (2015) / Boelee et al. (2011) Leptolyngbya sp / Singh et al. (2014) Τεχνητό θαλασσινό νερό Θρεπτικό μέσο F2 Θρεπτικό μέσο BG11 Continuous / Βαμβακερό ύφασμα Indoor Outdoor / Γυαλί με διηθητικό χαρτί Chlorella vulgaris / Houser et al. (2014) Scenedesmus obliquus 47.9 ΑΤS * = algal turf scrubber (τεχνητός χλοοτάπητας από μικροφύκη) 1.87/ 5.2 / 5080 / Liu et al. (2013) 218

242 5. ΧΡΗΣΗ ΒΙΟΜΑΖΑΣ ΓΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟΑΙΘΑΝΟΛΗΣ 5.1 Εισαγωγή Αποτελέσματα Στην παρούσα ενότητα, μελετήθηκε η δυνατότητα παραγωγής βιοαιθανόλης από τη μικροβιακή βιομάζα που προέκυψε κατά την επεξεργασία αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων με καλλιέργειες μικροφυκών/κυανοβακτηρίων στα συστήματα αιωρούμενης ανάπτυξης (Κεφάλαιο 3). Χρησιμοποιήθηκαν τρία είδη βιομάζας προερχόμενες από τις σειρές πειραμάτων με υπόστρωμα απόβλητο τυροκομείου, οινοποιείου και μεικτό απόβλητο οινοποιείουσταφίδας. Μετά την ολοκλήρωση της βιοεπεξεργασίας κάθε αποβλήτου, το υγρό αιώρημα απομακρύνονταν και στη συνέχεια ακολουθούσε μηχανική συλλογή της αναπτυσσόμενης βιομάζας καθώς και ξήρανσή της στους 108 o C. Η ξηρή βιομάζα που προέκυπτε επεξεργάζονταν κατάλληλα ώστε να χρησιμοποιηθεί ως υπόστρωμα ανάπτυξης ζυμομυκήτων για την παραγωγή βιοαιθανόλης. 5.2 Επεξεργασία βιομάζας και ποσοστά ζυμώσιμων σακχάρων Σε όλα τα είδη βιομάζας που αναφέρθηκαν παραπάνω ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία επεξεργασίας τους που μετά την ξήρανση περιελάμβανε, όξινη υδρόλυση, διήθηση και εν συνεχεία χρήση του υδρολύματος ως υπόστρωμα ανάπτυξης για το ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae AXAZ1. Στο πρώτο στάδιο της όξινης υδρόλυσης διερευνήθηκε ο χρόνος υδρόλυσης και η συγκέντρωση του οξέος, προκειμένου να εντοπιστούν οι βέλτιστες συνθήκες που θα οδηγήσουν στις μέγιστες αποδόσεις εκχυλισμένων σακχάρων. Ως υδρολυτικό μέσο χρησιμοποιήθηκε το θειικό οξύ (H 2 SO 4 ) καθώς σύμφωνα με τη βιβλιογραφία παρουσιάζει τις υψηλότερες αποδόσεις παραγωγής βιοαιθανόλης έναντι άλλων οξέων, όπως HNO 3, HCl, και H 3 PO 4 (Markou et al., 2013). Στα ξηρά δείγματα βιομάζας εξετάστηκε θειικό οξύ δύο συγκεντρώσεων, 1.5N και 2.5N, τιμές συγκεντρώσεων που απαντώνται στη βιβλιογραφία σε ανάλογα πειράματα παραγωγής βιοαιθανόλης με επεξεργασία βιομάζας μικροφυκών (Nguyen et al., 2009; Harun and Danquah, 2011b; 219

243 Αποτελέσματα Ho et al., 2013c; Hernandez et al., 2015). Η προσθήκη του οξέος στη βιομάζα ήταν συγκεκριμένη σε όλα τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν, με περιεκτικότητα 5% (w/v) στερεής βιομάζας/υγρής φάσης (Nguyen et al., 2009). Η διεργασία της υδρόλυσης, πραγματοποιούνταν σε σταθερές συνθήκες θερμοκρασίας (116 C) και πίεσης (0.8bar) εφαρμόζοντας διαφορετικούς χρόνους υδρόλυσης, που κυμαίνονταν από 30 έως 180 λεπτά (Schneider et al., 2012). Με την ολοκλήρωση της υδρόλυσης, ακολουθούσε διήθηση των δειγμάτων για απομάκρυνση των στερεών και μέτρηση ph. Στα προκύπτοντα υδρολύματα οι τιμές του ph κυμαίνονταν μεταξύ Ακολούθως, πραγματοποιούνταν προσδιορισμός των ολικών και αναγόντων σακχάρων καθώς και της αναλογίας τους (ανάγοντα/ολικά σάκχαρα) ώστε να εξεταστεί η βέλτιστη απόδοση (%) ζυμώσιμων σακχάρων για κάθε είδος υποστρώματος. Τα πρώτα πειράματα έλαβαν χώρα με βιομάζα μικροφυκών που αναπτύχθηκε σε υπόστρωμα με χημικό θρεπτικό μέσο. Κατά τη διεργασία της υδρόλυσης εξετάστηκαν τέσσερις χρόνοι υδρόλυσης (30, 60, 120 και 180 λεπτών) και για τις δύο συγκεντρώσεις θειικού οξέος των 1.5 και 2.5Ν, με σκοπό τον προσδιορισμό των βέλτιστων συνθηκών (και την επιλογή τους για τη συνέχιση των πειραμάτων) που θα οδηγήσουν στις μέγιστες συγκεντρώσεις των εκχυλιζόμενων σακχάρων. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τα εν λόγω πειράματα συνοψίζονται στον Πίνακα 5.1. Παρατηρείται ότι στα 30 λεπτά υδρόλυσης η συγκέντρωση του οξέος δεν επηρεάζει τις αποδόσεις σακχάρων, ενώ στα 180 λεπτά υδρόλυσης οι αποδόσεις τους μειώνονται ως αποτέλεσμα, πιθανόν, της πλήρους αποικοδόμησης της ανθρακικής αλυσίδας των μορίων τους (Badger, 2002). Επίσης, η εφαρμογή των 120 λεπτών υδρόλυσης φαίνεται να οδηγεί σε σχετικά υψηλότερες αποδόσεις σακχάρων (για την βιομάζα των μικροφυκών) σε σχέση με τα 60 λεπτά χρόνου υδρόλυσης. Το σύνολο των σακχάρων που υπολογίστηκε σε όλες τις συνθήκες υδρολύσεων κυμαίνονταν μεταξύ g L 1 που αντιστοιχεί σε εύρος % g/ ξηρής βιομάζας και συμφωνεί με τα ποσοστά που καταγράφονται στη βιβλιογραφία για βιομάζες μικροφυκών (John et al., 2011). Η υδρόλυση με χρήση 0% Η 2 SO 4 σε 120 min οδήγησε σε συγκεντρώσεις σακχάρων μόλις των 3 g L 1 και σε ποσοστά αναγόντων/ολικών σακχάρων της τάξης των 20.5±3.8 %. 220

244 Αποτελέσματα Πίνακας 5.1: Αποδόσεις σακχάρων από την όξινη υδρόλυση βιομάζας αυτότροφης καλλιέργειας μικροφυκών/ κυανοβακτηρίων Υπόστρωμα % ανάγοντα / ολικά σάκχαρα Συγκέντρωση βιομάζας οξέος Τεχνητό χημικό μέσο 86.8±4 86.7±0.9 80± ± ± ± ±2.5 47± Ν 2.5Ν Καθώς η βιομάζα που προέκυπτε από την επεξεργασία των αποβλήτων δεν επαρκούσε για την μελέτη όλων των παραπάνω συνθηκών υδρόλυσης επιλέχθηκαν (για το κάθε απόβλητο) συγκεκριμένες πειραματικές συνθήκες. Στον Πίνακα 5.2 που ακολουθεί παρατίθενται αναλυτικά οι σειρές πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν μαζί με τα αποτελέσματα που προέκυψαν. Πίνακας 5.2: Αποδόσεις σακχάρων για την όξινη υδρόλυση βιομάζας από μιξότροφες καλλιέργειες με απόβλητα ως υπόστρωμα ανάπτυξης % ανάγοντα / ολικά σάκχαρα Συγκέντρωση Υπόστρωμα βιομάζας οξέος 83±6 1.5Ν Απόβλητο τυροκομείου 93±7 2.5Ν 91± Ν Απόβλητο οινοποιείου 87.5±2 98±1 51.8±3 2.5Ν 46.6 ±3 1.5Ν Μεικτό απόβλητο 84.3± ± ±1 2.5Ν Από τον Πίνακα 5.2 για το κάθε υπόστρωμα γίνεται αντιληπτό ότι: Για την βιομάζα από καλλιέργεια με απόβλητο τυροκομείου, η υψηλότερη απόδοση των 93±7% επιτεύχθηκε με χρήση θειικού οξέος 2.5Ν στα 120. Το σύνολο των σακχάρων που υπολογίστηκε για τις δύο συνθήκες υδρολύσεων που έλαβαν χώρα κυμαίνονταν μεταξύ g L 1 με τη χρήση 1.5Ν θειικού οξέος και μεταξύ g L 1 με τη χρήση 2.5Ν θειικού οξέος. Για την βιομάζα από καλλιέργεια με απόβλητο οινοποιείου, η υψηλότερη απόδοση των 98±1% επιτεύχθηκε με χρήση θειικού οξέος 2.5Ν στα 120. Τα σάκχαρα κυμάνθηκαν σε συγκεντρώσεις g L 1 για όλες τις συνθήκες υδρόλυσης. 221

245 Αποτελέσματα Για την βιομάζα από καλλιέργεια με μεικτό απόβλητο, η υψηλότερη απόδοση των 98.1±1.9% επιτεύχθηκε με χρήση θειικού οξέος 2.5Ν στα 120. Οι συγκεντρώσεις των σακχάρων που υπολογίστηκαν σε αυτή τη συνθήκη υδρόλυσης κυμανθήκαν μεταξύ g L 1. Ομοίως υψηλές συγκεντρώσεις σακχάρων υπολογίστηκαν και με τη χρήση θειικού οξέος 1.5Ν στα 120 ( g L 1 ). Γίνεται αντιληπτό, ότι στο χρόνο υδρόλυσης των 120 προέκυπταν οι μεγαλύτερες τιμές εκχυλιζόμενων σακχάρων και μάλιστα οι βιομάζες προερχόμενες από απόβλητο τυροκομείου και μεικτού υποστρώματος έδωσαν τις υψηλότερες συγκεντρώσεις σακχάρων (μέχρι και 40.4 g L 1 ). 5.3 Αλκοολική ζύμωση και παραγωγή βιοαιθανόλης Στην επόμενη φάση πειραμάτων πραγματοποιήθηκαν αλκοολικές ζυμώσεις χρησιμοποιώντας το στέλεχος του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae AXAZ1, προκειμένου να διερευνηθεί η δυνατότητα παραγωγής βιοαιθανόλης. Επιλέχθηκαν τα υδρολύματα τα οποία αφενός παρουσίασαν το υψηλότερο ποσοστό αναγώγιμων σακχάρων και αφετέρου υπήρχε επαρκής ποσότητά τους για την υλοποίηση της ζύμωσης. Ως εκ τούτου, εξετάστηκαν τέσσερα υποστρώματα που προέκυψαν από δύο διαφορετικές συνθήκες υδρολύσεων και απαριθμούνται ως εξής: 1. Βιομάζα καλλιέργειας με μεικτό απόβλητο σε 2.5N Η 2 SO 4, 120 λεπτά χρόνο υδρόλυσης (Μ120), 2. Βιομάζα καλλιέργειας με μεικτό απόβλητο σε 2.5N Η 2 SO 4, 180 λεπτά χρόνο υδρόλυσης (Μ180), 3. Βιομάζα καλλιέργειας με απόβλητο τυροκομείου σε 2.5Ν Η 2 SO 4, 120 λεπτά χρόνο υδρόλυσης (Τ120), 4. Βιομάζα καλλιέργειας με τεχνητό χημικό μέσο σε 2.5Ν Η 2 SO 4, 120 λεπτά χρόνο υδρόλυσης (Χ120). Μετρήσεις των αρχικών ολικών σακχάρων στα υδρολύματα πριν την έναρξη των ζυμώσεων έδειξαν ότι οι αρχικές συγκεντρώσεις σακχάρων τους δεν ήταν επαρκείς για την διασφάλιση των απαιτήσεων της ζύμωσης μιας και η υψηλότερη ζυμωτική ικανότητα του S.cerevisiae παρατηρείται σε συγκεντρώσεις αρχικών σακχάρων 222

246 Αποτελέσματα ανώτερες των 50 g L 1 (Laplace et al., 1991). Για το λόγο αυτό επιλέχθηκε η ενίσχυση των υποστρωμάτων με απόβλητο σταφιδοποιίας. Συγκεκριμένα, στις εγκαταστάσεις τυποποίησης σταφίδας προκύπτουν απύρηνες σταφίδες, μη βρώσιμες, οι οποίες απορρίπτονται ή χρησιμοποιούνται για παραγωγή ενέργειας (βιοαιθανόλη). Αυτού του τύπου τα απόβλητα (απορριπτέες σταφίδες) μετά από σύνθλιψη και βράσιμο χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα αυτής της ενότητας ως ενισχυτικό σακχάρων. Το πυκνό προϊόν (σταφιδόζουμο) που προέκυψε από την παραπάνω διεργασία είχε αρχική συγκέντρωση σακχάρων περίπου ± 137 g L 1. Σε όλες τις περιπτώσεις των εξεταζόμενων υδρολυμάτων, προστέθηκε τόση ποσότητα σταφιδόζουμο ώστε να είναι συγκρίσιμα τα αποτελέσματά τους, ξεκινώντας δηλαδή με την ίδια συγκέντρωση σακχάρων και εφαρμόζοντας τις ίδιες συνθήκες περιβάλλοντος για την ανάπτυξη της ζύμης. Οι ζυμώσεις πραγματοποιήθηκαν αναερόβια και όλα τα υποστρώματα εμβολιάστηκαν με τον ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae AXAZ1 σε συγκέντρωση 11.76± cells/ml. Το είδος αυτό αποτελεί τον πιο συχνά χρησιμοποιούμενο ζυμομύκητα αλκοολικής ζύμωσης στη βιομηχανία λόγω σειράς από πλεονεκτήματα που κατέχει, όπως η ανθεκτικότητα του σε υψηλές συγκεντρώσεις αιθανόλης καθώς και η ικανότητά του να αναπτύσσεται γρήγορα κάτω από αναερόβιες συνθήκες (Guimarães et al., 2010; Kasavi et al., 2012). Η θερμοκρασία κατά τη ζύμωση διατηρήθηκε σταθερή στους 28 o C, με βάση το γεγονός ότι η βέλτιστη θερμοκρασία για την ανάπτυξη του στελέχους κυμαίνεται μεταξύ 2830 ο C, ενώ η ανάπτυξη της ζύμης επηρεάζεται αρνητικά σε υψηλότερες θερμοκρασίες (Mehdikhani et al., 2011). Κατά τη διάρκεια των ζυμώσεων γίνονταν συνεχείς μετρήσεις του ph το οποίο κυμαίνονταν από , γεγονός που επιβεβαιώνει την ομαλότητα της εξέλιξης της ζύμωσης, καθώς ο ζυμομύκητας αναπτύσσεται σε εύρος ph με βέλτιστο μεταξύ Να σημειωθεί επίσης ότι η πλειοψηφία των επιμολυντικών βακτηρίων δεν αναπτύσσονται σε ph κοντά στο Στην πορεία διεξαγωγής της ζύμωσης πραγματοποιούνταν τόσο μετρήσεις της κυτταρικής ανάπτυξης του Saccharomyces cerevisiae όσο και των συγκεντρώσεων των αναγόντων σακχάρων. Με τον τρόπο αυτό συσχετίστηκε η αύξηση των κυττάρων του ζυμομύκητα και η μείωση της συγκέντρωσης των αναγόντων σακχάρων, εφόσον τα πρώτα κατανάλωναν τα δεύτερα. Τέλος, με την ολοκλήρωση της κάθε ζύμωσης, όταν δηλαδή η περιεκτικότητα των 223

247 Αποτελέσματα σακχάρων σταθεροποιούνταν σε χαμηλό επίπεδο, ακολουθούσε μέτρηση των συγκεντρώσεων αιθανόλης που επιτυγχάνονταν σε κάθε περίπτωση Παραγωγή βιοαιθανόλης σε υψηλές αρχικές συγκεντρώσεις σακχάρων Σε αυτή την ενότητα, εξετάστηκε η δυνατότητα πραγματοποίησης αναερόβιας αλκοολικής ζύμωσης από το στέλεχος Saccharomyces cerevisiae AXAZ1 σε αρχικές συγκεντρώσεις σακχάρων μεγαλύτερες των 100 g L 1. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκε υδρόλυμα από βιομάζα καλλιέργειας μικροφυκών με τεχνητό χημικό θρεπτικό υπόστρωμα αρκετά ενισχυμένο με απόβλητο σταφιδοποιίας (σταφιδόζουμο). Το υδρόλυμα της εν λόγω βιομάζας είχε προκύψει από όξινη επεξεργασία με 2.5Ν Η 2 SO 4 και 120 χρόνο υδρόλυσης. Οι συνθήκες της ζύμωσης περιγράφονται στην αρχή της Ενότητας 5.3 και τα αποτελέσματα της κινητικής ανάπτυξης παρουσιάζονται στο Σχήμα 5.1 όπου και διαπιστώθηκαν τα εξής: Η αρχική συγκέντρωση των σακχάρων ήταν g L 1 και μειώθηκε μέχρι την τιμή των 7.53 g L 1, που αντιστοιχεί σε ποσοστό κατανάλωσης 97%. Η διάρκεια της ζύμωσης ήταν περίπου 13 ημέρες καθώς από τις 320 ώρες και μετά σημειώθηκε σταθερότητα στις τιμές όλων των μετρήσεων. Η μέγιστη συγκέντρωση αιθανόλης που επετεύχθη ήταν g L 1. Η απόδοση αιθανόλης προς ολικά σάκχαρα ήταν 0.43g g 1 (Αιθανόλη / Σάκχαρα). Η απόδοση αιθανόλης με βάση το σύνολο των διαθέσιμων αρχικών ζυμώσιμων σακχάρων υπολογισμένη με βάση την Εξίσωση 1.3 έφτασε το ποσοστό των 85.9%. Βιομάζα (log κύτταρα/ml) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Βιομάζα 0, Χρόνος (h) 224 Σάκχαρα Αιθανόλη Σάκχαρα και αιθανόλη (gl 1 )

248 Αποτελέσματα Σχήμα 5.1: Κινητική ανάπτυξης Saccharomyces cerevisiae σε υδρόλυμα από βιομάζα καλλιέργειας μικροφυκών με τεχνητό χημικό θρεπτικό υπόστρωμα. Συνθήκη υδρόλυσης 2.5Ν Η 2 SO 4, 120 λεπτά (ΒΜ120) Παραγωγή βιοαιθανόλης σε χαμηλές αρχικές συγκεντρώσεις σακχάρων Στη συνέχεια εξετάστηκε η δυνατότητα πραγματοποίησης αναερόβιας αλκοολικής ζύμωσης από το στέλεχος Saccharomyces cerevisiae AXAZ1 σε αρχικές συγκεντρώσεις σακχάρων μικρότερες των 100 g L 1. Το συγκεκριμένο στέλεχος αν και έχει χρησιμοποιηθεί σε πληθώρα υποστρωμάτων με παρόμοιες αρχικές συγκεντρώσεις, είναι η πρώτη φορά που εξετάζεται η ανάπτυξή του σε υδρολύματα από βιομάζα καλλιέργειας μικροφυκών προερχόμενη από επεξεργασία αποβλήτων. Συγκεκριμένα, εξετάστηκαν οι βιομάζες από επεξεργασία μεικτού αποβλήτου, έπειτα από υδρόλυση σε δύο διαφορετικές συνθήκες, των 2.5Ν Η 2 SO 4 με 120 λεπτά χρόνο υδρόλυσης και 2.5Ν Η 2 SO 4 με 180 λεπτά χρόνο υδρόλυσης. Επίσης, έλαβαν χώρα πειράματα και με χρήση βιομάζας από επεξεργασία αποβλήτου τυροκομείου που είχαν υποστεί υδρόλυση με 2.5Ν Η 2 SO 4 και 120 λεπτά χρόνο υδρόλυσης. Στα Σχήματα 5.2 έως 5.5 που ακολουθούν δίνονται αναλυτικά τα αποτελέσματα από τα πειράματα κινητικής με τα εν λόγω υδρολύματα. 2,0 1,8 Βιομάζα Σάκχαρα Αιθανόλη Βιομάζα (log κύτταρα/ml) 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0, Σάκχαρα και αιθανόλη (gl 1 ) 0,2 10 0, Χρόνος (h) 225

249 Βιομάζα(log κύτταρα/ml) Αποτελέσματα Σχήμα 5.2: Κινητική ανάπτυξης Saccharomyces cerevisiae σε υδρόλυμα από βιομάζα μετά από επεξεργασία μεικτού αποβλήτου (οινοποιείουσταφίδας). Συνθήκη υδρόλυσης 2.5Ν Η 2 SO 4, 120 λεπτά (Μ120). Από την πορεία της ζύμωσης με χρήση υδρολύματος (συνθήκες 120 λεπτά, 2.5Ν Η 2 SO 4 ) από μεικτό απόβλητο και με τη βοήθεια του Σχήματος 5.2 συμπεραίνονται συνοπτικά τα ακόλουθα: Η αρχική συγκέντρωση των σακχάρων ήταν 87.2 g L 1 και μειώθηκε μέχρι τα 5.1 g L 1, που αντιστοιχεί σε ποσοστό κατανάλωσης 94.2%. Η διάρκεια της ζύμωσης ήταν περίπου 10 ημέρες καθώς από τις 250 ώρες και μετά σημειώθηκε σταθερότητα στις τιμές όλων των μετρήσεων. Η μέγιστη συγκέντρωση αιθανόλης που επετεύχθη ήταν g L 1. Η απόδοση αιθανόλης προς ολικά σάκχαρα ήταν 0.37g g 1 (Αιθανόλη / Σάκχαρα). Η απόδοση αιθανόλης με βάση το σύνολο των διαθέσιμων αρχικών ζυμώσιμων σακχάρων υπολογισμένη με βάση την Εξίσωση 1.3 έφτασε το ποσοστό των 73.8%. 2,0 1,8 Βιομάζα Σάκχαρα Αιθανόλη ,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0, Σάκχαρα και αιθανόλη (gl 1 ) 0,2 10 0, Χρόνος (h) Σχήμα 5.3: Κινητική ανάπτυξης Saccharomyces cerevisiae σε υδρόλυμα από βιομάζα μετά από επεξεργασία μεικτού αποβλήτου (οινοποιείου σταφίδας). Συνθήκη υδρόλυσης 2.5Ν H 2 SO 4, 180 λεπτά (Μ180) 226

250 Αποτελέσματα Ομοίως, από την πορεία της ζύμωσης με χρήση υδρολύματος (συνθήκες 180 λεπτών, 2.5Ν Η 2 SO 4 ) από μεικτό απόβλητο και με τη βοήθεια του Σχήματος 5.3 συμπεραίνονται συνοπτικά τα ακόλουθα: Η αρχική συγκέντρωση των σακχάρων ήταν 85.5 g L 1 και μειώθηκε στα 5.2 g L 1, που αντιστοιχεί σε ποσοστό κατανάλωσης 90.5%. Η διάρκεια της ζύμωσης ήταν περίπου 7 ημέρες καθώς από τις 160 ώρες και μετά σημειώνονται σταθερές τιμές σε όλες τις μετρήσεις. Η μέγιστη συγκέντρωση αιθανόλης που επετεύχθη ήταν g L 1. Η απόδοση αιθανόλης προς ολικά σάκχαρα 0.38 g g 1 (Αιθανόλη / Σάκχαρα). Η απόδοση αιθανόλης με βάση το σύνολο των διαθέσιμων αρχικών ζυμώσιμων σακχάρων υπολογισμένη με βάση την Εξίσωση 1.3 που έφτασε το ποσοστό των 76.5%. Βιομάζα (log κύτταρα/ml) 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 Βιομάζα Σάκχαρα Αιθανόλη Σάκχαρα και αιθανόλη (gl 1 ) 0, Χρόνος (h) 0 Σχήμα 5.4: Κινητική ανάπτυξης Saccharomyces cerevisiae σε υδρόλυμα από βιομάζα μετά από επεξεργασία αποβλήτου τυροκομείου. Συνθήκη υδρόλυσης 2.5Ν H 2 SO 4, 120 λεπτά (Τ120). Αντίστοιχα, από την πορεία της ζύμωσης με χρήση υδρολύματος (συνθήκες 120 λεπτά, 2.5Ν Η 2 SO 4 ) από απόβλητο τυροκομείου και με τη βοήθεια του Σχήματος 5.4 συμπεραίνονται συνοπτικά τα ακόλουθα: Η αρχική συγκέντρωση σακχάρων ήταν 87.2 g L 1 και μειώθηκε στα 2.77 g L 1, που αντιστοιχεί σε ποσοστό κατανάλωσης 96.8%. 227

251 Αποτελέσματα Η διάρκεια της ζύμωσης ήταν περίπου 4 ημέρες καθώς από τις 100 ώρες και μετά σημειώνονται σταθερές τιμές σε όλες τις μετρήσεις. Η μέγιστη συγκέντρωση αιθανόλης που επετεύχθη ήταν 31.5 g L 1. Η απόδοση αιθανόλης προς ολικά σάκχαρα ήταν 0.36 g g 1 (Αιθανόλη / Σάκχαρα). Η απόδοση αιθανόλης με βάση το σύνολο των διαθέσιμων αρχικών ζυμώσιμων σακχάρων υπολογισμένη με βάση την Εξίσωση 1.3 έφτασε το ποσοστό των 70.7%. 5.4 Συζήτηση Πειραματικών Αποτελεσμάτων Στο παρόν κεφάλαιο διερευνήθηκε η δυνατότητα παραγωγής βιοαιθανόλης, χρησιμοποιώντας ως υποστρώματα ανάπτυξης του ζυμομύκητα, βιομάζες που προέκυψαν από επεξεργασία αποβλήτων. Συγκεκριμένα, οι μεικτές καλλιέργειες Leptolyngbya sp. που αναπτύχθηκαν στα αιωρούμενα συστήματα του 3 ου κεφαλαίου συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε διάφορες συνθήκες όξινης υδρόλυσης. Τα υδρολύματα που προέκυψαν εξετάστηκαν ως προς το ποσοστό ζυμώσιμων σακχάρων που περιέχονται σε αυτές. Τα θρεπτικά συστατικά που περιέχονται στα απόβλητα και απορροφώνται από τους μικροοργανισμούς (οδηγώντας στην αύξηση της βιομάζας), μπορεί εν συνεχεία να χρησιμοποιηθούν εκ νέου, εκχυλίζοντας την παραγόμενη βιομάζα προς παραγωγή βιοκαυσίμων. Το εκχύλισμα αυτό περιείχε ανάγοντα σάκχαρα που προέκυψαν μετά την επεξεργασία υδρόλυσης και χρησιμοποιήθηκαν ως υπόστρωμα ανάπτυξης σε αναερόβια αλκοολική ζύμωση από τον Saccharomyces cerevisiae προς παραγωγή βιοαιθανόλης. Στη διεργασία της υδρόλυσης χρησιμοποιήθηκαν βιομάζες προερχόμενες από ανάπτυξη μεικτής καλλιέργειας μικροφυκών σε απόβλητα τυροκομείου και μεικτού αποβλήτου (οινοποιείουσταφίδας) καθώς και βιομάζα που προέκυψε από «καθαρή» καλλιέργεια μικροφυκών χρησιμοποιώντας τεχνητό χημικό μέσο ως υπόστρωμα ανάπτυξης. Οι συνθήκες υδρόλυσης που εξετάστηκαν ήταν οι ακόλουθες: θερμοκρασία στους C, πίεση στην τιμή των 0.8bar, χρήση Η 2 SO 4 συγκέντρωσης 1.5 ή 2.5Ν καθώς και δύο χρόνοι υδρόλυσης (120 και 180λεπτά). Η συγκέντρωση του οξέος κατά την υδρόλυση, οδήγησε σε διαφορετικές αποδόσεις των ζυμώσιμων σακχάρων (Πίνακας 5.1 και 5.2). Σε όλα τα υδρολύματα που προέκυψαν ακολούθησε ρύθμιση του ph, ενώ στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν ως υποστρώματα για την αναερόβια ζύμωση του 228

252 Αποτελέσματα στελέχους Saccharomyces cerevisiae ΑΧΑΖ1. Στο Σχήμα 5.5 που ακολουθεί παρουσιάζεται η ανάπτυξη των κυττάρων για όλα τα υποστρώματα που εξετάστηκαν. Η ανάπτυξη των κυττάρων παρά την ίδια αρχική ποσότητα εμβολίου που χρησιμοποιήθηκε, εμφανίζει διαφορές σε κάθε ένα από τα εξεταζόμενα υποστρώματα. Η μέγιστη παραγωγή βιομάζας παρατηρήθηκε στο υπόστρωμα με τη μεγαλύτερη αρχική συγκέντρωση σακχάρων των g L 1 (βιομάζα που προέκυψε από «καθαρή» καλλιέργεια μικροφυκών σε ανάπτυξη με τεχνητό θρεπτικό υπόστρωμα), ενώ ακολούθησαν τα υποστρώματα με μικρότερες αρχικές συγκεντρώσεις σακχάρων όπως η βιομάζα τυροκομείου και μεικτού αποβλήτου. Πιθανόν, η χρήση των υδρολυμάτων από βιομάζες αποβλήτων να περιείχε περισσότερους χημικούς ανασταλτικούς παράγοντες που απελευθερώθηκαν κατά την προεπεξεργασία (υδρόλυση), κάτι που ωστόσο απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Η ποιότητα των σακχάρων της βιομάζας τυροκομείου διαπιστώθηκε ότι είναι πιο αρεστή στο ζυμομύκητα, καθώς στο απόβλητο αυτό περιέχονται μεγαλύτερα ποσά εξοζών, όπως η γλυκόζη και η γαλακτόζη, που μπορεί να καταναλώσει εύκολα ο Saccharomyces cerevisiae σε αντίθεση με τις πεντόζες. Όσον αφορά την αύξηση της βιομάζας με χρήση μεικτού αποβλήτου στις δύο εφαρμοζόμενες συνθήκες υδρόλυσης παρατηρήθηκε ότι είναι ελαφρώς μεγαλύτερη στο χρόνο υδρόλυσης των 180 λεπτών έναντι των 120 λεπτών, αν και η παραγωγή αιθανόλης κυμάνθηκε και στις δύο περιπτώσεις περίπου στα 32.8 ± 1gL 1. Αξίζει να σημειωθεί ότι η μέγιστη παραγωγή βιομάζας σημειώθηκε για όλες τις πειραματικές σειρές κοντά στα 80 λεπτά ζυμωτικής διαδικασίας. 2,5 2,0 M120 M180 BM120 T120 Βιομάζα (log κύτταρα/ml) 1,5 1,0 0,5 0, Χρόνος (h) 229

253 Αποτελέσματα Σχήμα 5.5: Κινητική ανάπτυξης Saccharomyces cerevisiae σε όλα τα εξεταζόμενα υποστρώματα (Μ120: μεικτό απόβλητο 120 λεπτά υδρόλυση, Μ180: μεικτό απόβλητο 180 λεπτά υδρόλυση, ΒΜ120: βιομάζα μικροφυκών 120 λεπτά υδρόλυση, Τ120: απόβλητο τυροκομείου 120 λεπτά υδρόλυση). Ανασκόπηση της βιβλιογραφίας δείχνει ότι έχει μελετηθεί πληθώρα βιομαζών για παραγωγή βιοαιθανόλης οι οποίες προκύπτουν κυρίως από υπολείμματα της βιομηχανίας αγροτικής παραγωγής αλλά και βιομάζες από καλλιέργειες διαφόρων ειδών μικροφυκών υπό ποικίλες συνθήκες. Στον παρακάτω Πίνακα 5.3 δίνονται ενδεικτικά κάποια είδη βιομαζών με τις αντίστοιχες συνθήκες υδρόλυσης και ανάπτυξης καθώς και τις αποδόσεις σακχάρων και αιθανόλης. Πίνακας 5.3: Είδη βιομαζών, συνθήκες υδρόλυσης, αρχική συγκέντρωση σακχάρων και αποδόσεις αιθανόλης από βιβλιογραφική ανασκόπηση Είδος Βιομάζας Άχυρο σιταριού Υπολείμματα καλαμποκιού Μελάσα Απόβλητο ελαιοτριβείου με μελάσα Συνθήκες υδρόλυσης 0.2% v/v H 2 SO 4, 300bar, 190 o C, 10 Ατμός 50 o C 24h ph % HCl 1Μ 100 o C 30, ΚΟΗ 1Μ Αρχική συγκέντρωση σακχάρων (g L 1 ) Μέγιστη συγκέντρωση αιθανόλης (g L 1 ) Απόδοση αιθανόλης σε ολικά σάκχαρα (%) / (g/g) Βιβλιογραφία / 0.35 Olofsson et al. (2010) ~ / Chen and Fu ~100 ~ / 0.44 / 0.41 (2016) Sarris et al. (2014) Μελάσα με 20% απόβλητο ελαιοτριβείου Απόβλητο ελαιοτριβείου +γλυκόζη Chlorococcum sp. Spirogyra Εκχυλισμένη από λιπίδια Άθικτη βιομάζα Ανεπεξέργαστη Επεξεργασμένη 1% ΝaOH 2h Dunaliella sp 1%v/v H 2 SO ο C 15 ~100 ~135 ~75 ~40 ~75 ~115 ~ / 0.49 / 0.48 / 0.36 / 0.47 / 0.45 / 0.46 Sarris et al. (2013) Harun et al. (2010a) ~100 ~1.6 8 g/100g Eshaq et al. υποστρώματος (2010) 3.86 g/100g υποστρώματος 7.26 Karatay et al. (2016) 230

254 Αποτελέσματα Chlorella vulgaris FSPE Scenedesmus obliquus Chlorococcum sp. Chlorella sorokiniana, Nannochloropsis gaditana, Scenedesmus almeriensis Scenedesmus obliquus Σιτηρά Ζυθοποιίας και Μελάσα Σιτηρά Ζυθοποιίας και Μελάσα Μικροβιακή βιομάζα με Leptolyngbya από απόβλητο σταφίδας Μικροβιακή βιομάζα με Leptolyngbya από μεικτό απόβλητο οινοποιείουσταφίδας Μικροβιακή βιομάζα με Leptolyngbya από μεικτό απόβλητο οινοποιείουσταφίδας Μικροβιακή βιομάζα με Leptolyngbya από απόβλητο τυροκομείου 1%v/v H 2 SO ο C 20 5%v/v H 2 SO o C 30 1% v/v H 2 SO o C 30, 3% v/v H 2 SO o C 15 4%v/v H 2 SO o C 90, 4%v/v H 2 SO o C 45, 4%v/v H 2 SO o C 60, 5M NaOH 90 o C 30, Microwave 150W 40, Acid and Enzymatic 5%v/v H 2 SO o C 30, 1% NaOH, βρασμός 3h Αποστειρωμένη Μη αποστειρωμένη 2.5N H 2 SO ο C 0.8bar 2.5N H 2 SO ο C 0.8bar 2.5N H 2 SO ο C 0.8bar 2.5N H 2 SO ο C 0.8bar 136mg/g DW 97mg/g DW 88mg/g DW Zymomonas mobilis Ho et al. (2013a) 23g/g DW Miranda et al. (2012b) 7.20 Harun and Danquah 6 (2011b) 8mg/g,14mg/g,15mg/g 21mg/g,8mg/g,2mg/g 128mg/g,129mg/g,62mg/g Kluyveromyces marxianus 11.2 S.carlsbergensis 187 (AXAZ1) (AXAZ1) (AXAZ1) (AXAZ1) (AXAZ1) (AXAZ1) Hernandez et al. (2015) Miranda et al. (2012a) / 0.35 Kopsahelis et al. (2007) Kopsahelis et al. (2012) 85.9/ 0.43 Παρούσα εργασία 73.8/ 0.37 Παρούσα εργασία 76.5/ 0.38 Παρούσα εργασία 70.7/ 0.36 Παρούσα εργασία 231

255 Αποτελέσματα Η μικροβιακή βιομάζα που βασίζεται στα μικροφύκη δεν έχει μελετηθεί επαρκώς στη βιβλιογραφία ως πρώτη ύλη για παραγωγή βιοαιθανόλης αν και ορισμένα μικροφύκη περιέχουν μεγάλη ποσότητα (>50% του ξηρού βάρους) σε άμυλο, κυτταρίνη και γλυκογόνο, οι οποίες είναι πρώτες ύλες για την παραγωγή αιθανόλης. Επίσης, η μηδενική ή μικρή παρουσία της λιγνίνης κάνει πολύ απλή την ενζυματική υδρόλυση της κυτταρινούχας βιομάζας τους, όπου μετά την εκχύλιση της μπορεί να υδρολυθεί για την παραγωγή αιθανόλης (CuellarBermudez et al., 2015). Υπάρχει πληθώρα εργασιών που αναφέρεται στην παραγωγή αιθανόλης μέσω λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας χρησιμοποιώντας υγρά και στερεά απόβλητα της (αγροτο)βιομηχανίας, όπως φλοιό ρυζιού (da CunhaPereira et al., 2011), άχυρα ηλίανθου (Antonopoulou et al., 2016), μίσχοι βαμβακιού (Shi et al., 2009) ή φλούδες πορτοκαλιών (Plessas et al., 2007). Η επεξεργασία αυτής της βιομάζας με όξινα μέσα οδηγεί συνήθως στο σχηματισμό προϊόντων, όπως φουρφουράλες από την αφυδάτωση των πεντοζών και των εξοζών, αλλά και το οξικό οξύ. Τα συστατικά αυτά κατά την αλκοολική ζύμωση παρεμποδίζουν την ανάπτυξη των μικροοργανισμών και μειώνουν την παραγωγή αιθανόλης (Palmqvist et al., 1999; Zhang et al., 2011). Οι περισσότερες μελέτες, μέχρι σήμερα, αναφέρονται στους τρόπους βελτιστοποίησης των συνθηκών προεπεξεργασίας, ώστε να επιτευχθούν τα καλύτερα ποσοστά απόδοσης αιθανόλης. Πολύ λίγες είναι εκείνες που χρησιμοποιούν ως υπόστρωμα μικροφυκώνμικροβιακή βιομάζα (προερχόμενη από επεξεργασία αποβλήτων) ως πρώτη ύλη (Ellis et al., 2012), παρόλο που οι μικροοργανισμοί αυτοί έχουν την ικανότητα να συσσωρεύουν σάκχαρα καθώς και να δομούν τις μεμβράνες τους με πληθώρα σακχάρων που θα μπορούσαν στην πορεία να αποτελέσουν πηγή παραγωγής αιθανόλης. Η χρήση μικροβιακής βιομάζας που προκύπτει από επεξεργασία αποβλήτων αποτελεί ένα ακόμη βήμα στην ανάπτυξη μιας βιώσιμης τεχνολογίας. Οι διακυμάνσεις που παρατηρούνται στις συγκεντρώσεις σακχάρων και αιθανόλης του Πίνακα 5.3 έγκειται στη χρήση μια τεράστιας ποικιλίας συνθηκών και υποστρωμάτων που καθιστούν δύσκολη την άμεση σύγκριση των αποτελεσμάτων. Ωστόσο, παρατηρείται ότι στην πλειονότητα των εργασιών κατά τη διάρκεια της ζύμωσης καταναλώνεται περίπου το 50% της αρχικής συγκέντρωσης των σακχάρων. Επίσης, οι αποδόσεις της αιθανόλης σε ολικά σάκχαρα κυμαίνονται μεταξύ 7085%, όπως επιτεύχθηκε και στην παρούσα εργασία με τιμές μεταξύ 7086%. 232

256 Αποτελέσματα Αρχικά εξετάστηκε η παραγωγή αιθανόλης με υπόστρωμα βιομάζας μικροφυκών σε τεχνητό χημικό μέσο καλλιέργειας, η οποία υδρολύθηκε με 2.5Ν H 2 SO 4 για 120 λεπτά. Το υδρόλυμα που προέκυψε ενισχύθηκε με απόβλητο σταφιδοποιίας δίνοντας αρχική συγκέντρωση σακχάρων την τιμή των g L 1 που οδήγησε σε μεγάλη παραγωγή αιθανόλης (111.1 g L 1 ). Υπάρχει πληθώρα εργασιών που εξετάζει την αντοχή του Saccharomyces cerevisiae με πραγματοποίηση ζυμώσεων σε υψηλές τιμές αρχικών σακχάρων κυμαινόμενοι μεταξύ g L 1 (Iconomou et al., 1995; Najafpour et al., 2004; Plessas et al., 2007). Οι Bely et al. (2008) μελέτησαν ζύμωση σε γλεύκη με Saccharomyces cerevisiae σε συγκαλλιέργεια, έχοντας αρχικές συγκεντρώσεις σακχάρων τα 360 g L 1, όπου η ζύμωση ολοκληρώθηκε σε 11 μέρες και απέδωσε 0.48 αιθανόλη/σάκχαρα (g/g). Παρόμοιες μελέτες με υψηλές αρχικές συγκεντρώσεις σακχάρων (250 g L 1 ) αναφέρονται και από τους Sarris et al. (2009) όπου χρησιμοποίησαν μούστο σταφυλιών επιτυγχάνοντας παραγωγή αιθανόλης g L 1 με το στέλεχος Saccharomyces cerevisiae ΜΑΚ1. Ωστόσο, εργασία των Kopsahelis et al. (2007) όπου χρησιμοποιήθηκε το ίδιο στέλεχος με την παρούσα εργασία (Saccharomyces cerevisiae AXAZ1) σε μελάσα με αρχική συγκέντρωση σακχάρων περίπου 216 g L 1, επετεύχθη μικρότερη παραγωγή αιθανόλης (71.3 g L 1 ) σε σχέση με την παρούσα μελέτη (111 g L 1 ). Όπως φαίνεται και στον Πίνακα 5.3 έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορα είδη μικροφυκών, διαφορετικοί τρόποι υδρόλυσης δίνοντας ποικιλία στις συγκεντρώσεις σακχάρων και αιθανόλης. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας είναι ενθαρρυντικά αναφορικά με την παραγωγή βιοαιθανόλης, αν και επετεύχθησαν σε μεγάλους χρόνους υδρόλυσης και ζύμωσης. Το γεγονός αυτό προβληματίζει και αποτελεί έναυσμα για περαιτέρω έρευνα, προκειμένου να εφαρμοστεί η μέθοδος της παρούσας διατριβής σε ευρεία κλίμακα. Σύμφωνα όμως με σχετικές μελέτες ανάλυσης κύκλους ζωής, η χρήση αποβλήτων για τις ανάγκες αύξησης της βιομάζας μπορεί σαν εγχείρημα να βελτιώσει το οικονομικό και ενεργειακό κόστος των διαδικασιών (Clarens et al., 2010; Razon and Tan, 2011; Soratana and Landis, 2011; Resurreccion et al., 2012). Υπάρχουν περιθώρια διερεύνησης της διαδικασίας τόσο σε τεχνολογικό όσο και σε βιολογικό επίπεδο (χρήση μικροοργανισμών που θα αποδίδουν περισσότερα σάκχαρα) προκειμένου να βελτιωθούν τα αποτελέσματα και να προκύψει εφαρμογή πέρα από το πλαίσιο ενός εργαστηρίου, επιλέγοντας, για παράδειγμα, το κατάλληλο είδος μικροφυκών ανάλογα με το περιβάλλον που μπορεί να αναπτυχθεί. 233

257 Αποτελέσματα Η μεγάλη βιοποικιλότητα των μικροφυκών και η εκτεταμένη ερευνητική ικανότητα πολλών χωρών, συνηγορούν στο ότι οι συνθήκες για βιώσιμη παραγωγή μικροφυκών μπορεί να επιτευχθούν οπουδήποτε. Επιπρόσθετα, μια σημαντική παράμετρος για την εφαρμογή σε βιομηχανική κλίμακα είναι η σύνθεση και ο όγκος των αποβλήτων που θα χρησιμοποιηθούν. Επομένως, η εφαρμογή θα πρέπει να είναι ανάλογη με τις ανάγκες κάθε περιοχής σε είδος βιοκαυσίμου αλλά κυρίως ανάλογα με τη διαθέσιμη πρώτη ύλη (σύνθεση και όγκος αποβλήτων). Η παραγωγή των βιοκαυσίμων από μικροφύκη/κυανοβακτήρια που αναπτύχθηκαν στα απόβλητα της παρούσας μελέτης, αποτελεί ενδιαφέρουσα εναλλακτική μέθοδο, η βελτίωση της οποίας μελλοντικά, θα μπορέσει ενδεχομένως να καλύψει τις ανάγκες σε «καθαρές» μορφές ενέργειας, συμβάλλοντας ταυτόχρονα στις αρχές της αειφορίας. 6. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ 6.1 ΣυζήτησηΣυμπεράσματα Καθώς η παγκόσμια δραστηριότητα αυξάνεται, λόγω της έντονης αστικοποίησης και βιομηχανοποίησης και ο συνολικός ανθρώπινος πληθυσμός πολλαπλασιάζεται ταχύτατα, η παραγωγή αποβλήτων ακολουθεί την ίδια πορεία. Ο ρυθμός διάθεσης των αποβλήτων είναι συνεχώς μεγαλύτερος από τον ρυθμό απορρόφησής τους, προκαλώντας σημαντικές διαταραχές στην οικολογική ισορροπία. Η ανάγκη, επομένως, για τεχνολογική παρέμβαση που θα αναπληρώσει, θα υποβοηθήσει ή θα επιταχύνει τις φυσικές διεργασίες που καθιστούν τα απόβλητα της ανθρώπινης δραστηριότητας ακίνδυνα για το περιβάλλον είναι άμεση και επιτακτική. Η ορθολογική επαναχρησιμοποίηση των αποβλήτων μπορεί να συνεισφέρει στην αντιμετώπιση της λειψυδρίας, στην εξοικονόμηση υδατικών πόρων και στην προστασία του περιβάλλοντος, με την προϋπόθεση ότι απόβλητα έχουν υποστεί προεπεξεργασία απορρύπανσης ώστε το μικροβιακό φορτίο να βρίσκεται στα προβλεπόμενα, από τους διεθνείς οργανισμούς, όρια ασφαλείας (Βαγενάς, 2003; Καλαβρουζιώτης, 2006). Υπάρχουν πολλοί διαθέσιμοι τρόποι επεξεργασίας σε όλο τον κόσμο (βιολογικές και φυσικοχημικές), που διαφέρουν σε σχέση με την 234

258 Αποτελέσματα αποτελεσματικότητα, το κόστος και την αξιοπιστία (Mosse et al., 2011). Ωστόσο, πολλές από αυτές είναι δαπανηρές (με υψηλό σταθερό ή / και λειτουργικό κόστος) και απαιτούν ειδικευμένο προσωπικό για τη λειτουργία των συστημάτων επεξεργασίας. Οι μακροχρόνιες πρακτικές των μικρών αγροτοβιομηχανικών μονάδων περιλαμβάνουν τη διάθεση των λυμάτων στην ξηρά ή σε ποτάμια, λίμνες και θάλασσες χωρίς στάδια προεπεξεργασίας. Όμως, λόγω των αυστηρών νομοθετικών απαιτήσεων για την ποιότητα των εκροών, τα λύματα θα πρέπει να επεξεργάζονται πριν από την απόρριψή τους στα υδάτινα οικοσυστήματα. Η εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής είχε ως στόχο τη διερεύνηση αερόβιας βιολογικής επεξεργασίας αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων με χρήση αυτότροφων μικροοργανισμών (μικροφύκη, κυανοβακτήρια), με ταυτόχρονη παραγωγή βιοκαυσίμων. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν απόβλητα του αγροτοβιομηχανικού τομέα που αποκτήθηκαν από τοπικές μικρές και μεγαλύτερες μονάδες παραγωγής τυροκομικών προϊόντων, κρασιού και τυποποίησης σταφίδας. Οι διαθέσιμες ποσότητες αποβλήτων αραιώνονταν κατάλληλα με νερό και εμβολιάζονταν με ποσότητα αυτότροφης καλλιέργειας, ώστε να εξεταστεί η αποτελεσματικότητα της βιοεπεξεργασίας και η παραγωγή βιοκαυσίμων. Οι τυροκομικές μονάδες παράγουν τεράστιες ποσότητες υγρών αποβλήτων που μολύνουν το περιβάλλον και καταστρέφουν τους φυσικούς πόρους. Συγκεκριμένα, ο δευτερογενής ορρός γάλακτος ως παραπροϊόν της βιομηχανίας παραγωγής τυριού συνεισφέρει στον αρνητικό αντίκτυπο των εκροών αυτών καθώς έχει όξινα χαρακτηριστικά (ph 36) και περιέχει σημαντική περιεκτικότητα οργανικής ύλης (COD μέχρι και 80 g L 1 ). Ωστόσο, ο ορρός γάλακτος περιέχει επίσης και πολύτιμες ουσίες (σάκχαρα, πρωτεΐνες, βιταμίνες κτλ.) που μπορούν να ενισχύσουν την κυτταρική ανάπτυξη δίνοντας έτσι ώθηση στην βιολογική επεξεργασία. Αν και έχει μελετηθεί αρκετά η επεξεργασία του σε ετερότροφα βιολογικά συστήματα (Carvalho et al., 2013; Tatoulis et al., 2015) δεν υπάρχουν καθόλου στοιχεία που αφορούν τη χρήση μικροφυκών για επεξεργασία του. Στην παρούσα εργασία, μελετήθηκε για πρώτη φορά η χρήση μεικτών καλλιεργειών με στελέχη μικροφυκών/ κυανοβακτηρίων για την επεξεργασία δευτερογενή ορρού γάλακτος. Αν και τα δεδομένα της βιβλιογραφίας δεν είναι άμεσα συγκρίσιμα (λόγω των διαφορετικών συστημάτων ανάπτυξης), ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης των μικροοργανισμών που καταγράφηκε (0.45d 1 και 0.925d 1, για τις μεικτές καλλιέργειες των Choricystis και Leptolyngbya, 235

259 Αποτελέσματα αντίστοιχα) ήταν από τους υψηλότερους που έχουν αναφερθεί μέχρι σήμερα για παρόμοιους μεικτούς πληθυσμούς (Πίνακας ). Συγκεκριμένα, ο Abreu et al. (2012) ανέφερε υψηλούς ειδικούς ρυθμούς ανάπτυξης των 0.43 και 0.47 d 1, με μιξότροφες συνθήκες ανάπτυξης του Chlorella vulgaris χρησιμοποιώντας ωστόσο υδρολυμένη σκόνη ορρού γάλακτος και ένα μείγμα γλυκόζηςγαλακτόζης, αντίστοιχα. Ο Franchino et al. (2013) με τον ίδιο μικροοργανισμό (Chlorella vulgaris) πέτυχε επίσης υψηλό ειδικό ρυθμό ανάπτυξης, 0.52 d 1 (Πίνακας 3.18), αλλά με χρήση αραιωμένου μείγματος κοπριάς βοοειδών και ορρού γάλακτος. Όσο αναφορά την επεξεργασία του αποβλήτου, το ποσοστό απομάκρυνσης του οργανικού φορτίου που σημειώθηκε στην παρούσα μελέτη με τη χρήση μεικτής καλλιέργειας Choricystis sp. (92.3% COD) είναι από τα υψηλότερα που έχουν καταγραφεί στη βιβλιογραφία για παρόμοια υγρά απόβλητα και με τόσο υψηλή αρχική συγκέντρωση COD (7300 mgl 1 ). Το είδος Leptolyngbya το οποίο έχει χρησιμοποιηθεί για παραγωγή βιομάζας με γαλακτοκομικό απόβλητο μόνο από τους Khemka and Saraf (2015), σε μιξότροφες συνθήκες απομάκρυνε μικρότερη ποσότητα COD (μόλις 52.4%), παρά τις σχετικά χαμηλές αρχικές συγκεντρώσεις οργανικού φορτίου που εξετάστηκαν (2470 mgl 1 ). Στη παρούσα μελέτη αν και στα πειράματα με τη μεικτή καλλιέργεια Leptolyngbya χρησιμοποιήθηκαν υψηλότερες αρχικές συγκεντρώσεις COD (3240 mgl 1 ) επετεύχθη ποσοστό απομάκρυνσης από το δευτερογενή ορρό γάλακτος μέχρι και 94% (Πίνακας 3.18). Εξίσου υψηλές συγκεντρώσεις οργανικού φορτίου περιέχονται και στα απόβλητα άλλων μονάδων παραγωγής τροφίμων/ ποτών (π.χ. οίνος, σταφίδα). Ορισμένα από αυτά τα απόβλητα ανακτώνται παραδοσιακά εφόσον χρησιμοποιούνται ως πρώτες ύλες σε άλλους βιομηχανικούς τομείς (Ruggieri et al., 2009). Η βιομηχανία κρασιού και σταφίδας είναι υψηλής οικονομικής σπουδαιότητας για αρκετές χώρες. Συγκεκριμένα, τα σταφύλια είναι από τις πιο δημοφιλείς γεωργικές καλλιέργειες στην περιοχή της Μεσογείου, λόγω του ιδανικού κλίματος. Τα σταφύλια ξηραίνονται για να προκύψουν οι σταφίδες ή συνθλίβονται για να οδηγήσουν στην παραγωγή κρασιού. Η συνολική ετήσια παραγωγή σταφυλιών στην Ελλάδα είναι περίπου 1.6 εκατομμύρια τόνους, ενώ η παραγωγή κρασιού είναι περίπου 5 εκατομμύρια εκατόλιτρα, παράγοντας 2 λίτρα λάσπης για κάθε λίτρο κρασιού που προκύπτει (Haroutounian, 2007). Συγκεκριμένα, το οινοποιείο Γρίβας, από το οποίο και προήλθε το απόβλητο της παρούσας μελέτης, έχει ετήσια παραγωγή περίπου 350 τόνους. Τα απόβλητα των 236

260 Αποτελέσματα οινοποιείων περιέχουν σάκχαρα, αιθανόλη, οργανικά οξέα, αλδεΰδες, σάπωνες και άλλα απορρυπαντικά από την διαδικασία καθαρισμού, οδηγώντας έτσι σε ιδιαίτερα υψηλές τιμές COD. Οι σταφίδες είναι επίσης ένα ελληνικό εθνικό προϊόν που φτάνει μέχρι και τους τόνους ετήσιας εξαγόμενης ποσότητας. Η Παναιγιάλειος Ένωση Αγροτικών Συνεταιρισμών (Π.Ε.Σ.), από την οποία προερχόταν το απόβλητο σταφίδας που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα της διατριβής αυτής, εξάγει βιολογικά προϊόντα σε όλο τον κόσμο και παρέχει το 60% της συνολικής ελληνικής ετήσιας παραγωγής σταφίδας. Οι ελληνικές σταφίδες ανταγωνίζονται την παγκόσμια αγορά, μαζί με την Τουρκία, τις ΗΠΑ, την Κίνα και την Αυστραλία. Τα απόβλητα της σταφιδοποιίας περιέχουν σάκχαρα, κυρίως γλυκόζη και φρουκτόζη, μαζί με μικρές ποσότητες αζωτούχων συστατικών, λιπίδια, μέταλλα, οργανικά οξέα, τανίνες και πηκτίνες. Στην Ελλάδα, η ρύπανση που προκαλείται από την απόρριψη των προϊόντων των διαδικασιών παραγωγής, είναι ισοδύναμη με λύματα από πληθυσμό ατόμων (Athanasopoulos and Athanasopoulos, 1998). Η παρουσία υψηλού οργανικού φορτίου και φαινολικών ενώσεων (τανίνες), υψηλής οξύτητας και μεγάλης διακύμανσης στις εκροές (λόγω της εποχιακής παραγωγής) στα παραπροϊόντα του σταφυλιού (συμπεριλαμβανομένων των αποβλήτων σταφίδας και οινοποιείου) περιορίζουν τη χρησιμοποίηση αυτών των αποβλήτων ως ζωοτροφές. Η αξιοποίηση αυτών των αποβλήτων χρησιμοποιώντας συστήματα βασισμένα σε μικροφύκη αποτελεί μια ελκυστική προσέγγιση εφόσον συνδυάζει την επεξεργασία τους και την παραγωγή χρήσιμης βιομάζας. Έτσι, επιτυγχάνεται η απορρύπανση των εκροών αλλά και η παραγωγή προϊόντων προστιθέμενης αξίας από τα μεταβολικά προϊόντων των μικροοργανισμών (λίπη, πρωτεΐνες, σάκχαρα). Επιτυχημένα παραδείγματα αποτελούν οι εργασίες των Travieso et al. (2008) με χρήση αποβλήτων ποτοποιείου και των Farooq et al. (2013) ή Mata et al. (2012b) με χρήση αποβλήτων ζυθοποιείου. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, επεξεργασία αποβλήτων σταφιδοποιίας και οινοποιείου με βοήθεια μικροφυκών έχει αναφερθεί μόνο από τους Kim and Im (2012) και Casazza et al. (2016). Στην μελέτη των Kim and Im (2012) χρησιμοποιήθηκαν υπό ασηπτικές συνθήκες στελέχη των ειδών Botryoccocus και Neochloris σε τεχνητό μέσο καλλιέργειας όπου προστέθηκε απόβλητο οινοποιείου ή σταφίδας, χωρίς όμως να αναφέρονται ποσοστά απομάκρυνσης οργανικού φορτίου και θρεπτικών συστατικών παρά μόνο η παραγωγή βιομάζας. Επίσης, η εργασία των Casazza et al. (2016) περιελάμβανε τη χρήση ειδών Spirulina και Chlorella στην παραγωγή ελαίων (

261 Αποτελέσματα 13.6%) με απόβλητο οινοποιείου ως θρεπτικό υπόστρωμα, χωρίς να αναφέρονται ποσοστά απομάκρυνσης οργανικού φορτίου. Η παραγωγή ελαίου ήταν σχετικά υψηλότερη από αυτή που επετεύχθη στην παρούσα εργασία με τη χρήση αποβλήτου οινοποιείου, ωστόσο παρατηρήθηκε χαμηλότερος ειδικός ρυθμός ( d 1 ) σε σχέση με τα πειράματα της παρούσας διατριβής ( d 1 ). Πολλά είδη μικροφυκών έχουν εξεταστεί ως προς τη ικανότητά τους να επεξεργάζονται λύματα και να παράγουν βιομάζα και έλαιο (Πίνακες 3.18 και 4.9). Ωστόσο, οι αποδόσεις τους είναι δύσκολο να συγκριθούν καθώς προκύπτουν από διαφορετικά συστήματα καλλιέργειας (βιοαντιδραστήρες) και ποικίλες λειτουργικές συνθήκες. Ανάμεσα στα είδη ξεχωρίζουν τα Chlorella, Chlamydomonas και Scenedesmus για την ανοχή που παρουσιάζουν σε διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες καθώς εντοπίζονται συχνά σε μονάδες επεξεργασίας αποβλήτων (Olguín, 2012; Zheng, 2013). Το ιδανικό είδος μικροφύκους κατάλληλο για επεξεργασία αποβλήτων και παραγωγή βιοκαυσίμων (Brennan and Owende, 2010) θα πρέπει να χαρακτηρίζεται από: υψηλό περιεχόμενο ελαίου και παραγωγικότητα, υψηλή ανοχή σε εύρος περιβαλλοντικών συνθηκών (θερμοκρασία, φωτισμός), καλή δυνατότητα καθίζησης για συγκομιδή, ικανότητα ταχείας ανάπτυξης, εύκολη καλλιέργεια, δυνατότητα να επικρατεί σε ανοικτά συστήματα, αντοχή σε τοξικούς ρύπους. Όμως, κανένα γνωστό είδος δεν ικανοποιεί όλες τις παραπάνω απαιτήσεις και η επιλογή των στελεχών εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το σκοπό της χρήσης τους. H ιδέα χρήσης μεικτών καλλιεργειών (μικροφυκώνβακτηρίων) κερδίζει έδαφος τα τελευταία χρόνια ως μηχανικό σύστημα επεξεργασίας κυρίως οικιακών και αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων (DeBashan et al., 2004; Gutzeit et al., 2005; Su et al., 2011; Wang et al., 2011a; Lee et al., 2015). Η πιθανή αξιοποίηση της παραχθείσας μικροβιακής βιομάζας ως λίπασμα είτε ως πηγή παραγωγής βιοκαυσίμων ή ως συμπλήρωμα διατροφής των ζώων μπορεί να αντισταθμίσει ένα σημαντικό κλάσμα του λειτουργικού κόστους της διαδικασίας. Ωστόσο, οι αλληλεπιδράσεις που αναπτύσσονται μεταξύ αυτότροφων και ετερότροφων μικροοργανισμών, όταν συνυπάρχουν στα υποστρώματα ανάπτυξης, είναι αρκετά πολύπλοκες και δεν είναι 238

262 Αποτελέσματα απόλυτα διασαφηνισμένες, δεδομένου ότι οι συνθήκες αλλάζουν συνεχώς, μέχρι να δημιουργηθεί ένα σταθερό περιβάλλον (Varnam and Evans, 2000; Subashchandrabose et al., 2011). Οι σχέσεις συμβίωσης των μικροοργανισμών μεταξύ τους δεν είναι πάντοτε αρμονικές, παρόλα αυτά είναι καθοριστικές για τη λειτουργία των οικοσυστημάτων. Το οικοσύστημα που αναπτύσσεται κάθε φορά είναι μοναδικό ανά περίπτωση, εξαρτώμενο από την σύσταση του αποβλήτου, τις συνθήκες του περιβάλλοντος και το σχεδιασμό των αντιδραστήρων. Για αυτό το λόγο, οι αποδόσεις στα ποσοστά απομάκρυνσης του οργανικού φορτίου αλλά και των θρεπτικών συστατικών διαφέρουν μεταξύ των υποστρωμάτων ακόμα και όταν οι αρχικές συγκεντρώσεις των παραμέτρων είναι παρόμοιες ή ίδιες (Πίνακας ). Οι μεικτές μικροβιακές κοινότητες (consortium) μπορούν να βελτιώσουν την επεξεργασία των αποβλήτων (ειδικά των αγροτοβιομηχανικών που είναι πλούσια σε ανόργανα και οργανικά στοιχεία) καθώς ενισχύεται η ανάπτυξη όλων των μικροοργανισμών της κοινότητας, με αποτέλεσμα να διευκολύνεται η συγκομιδή της βιομάζας λόγω βιοκροκίδωσης (Pires et al., 2013). Ωστόσο, στην επεξεργασία των αποβλήτων με χρήση τέτοιων μεικτών κοινοτήτων αναφέρονται εκτενώς κοινά μελετημένα είδη όπως Chlorella και Scenedesmus sp. (Razzak et al., 2013), ενώ ελάχιστες είναι οι αναφορές για τα είδη μικροφυκών/ κυανοβακτηρίων όπως το Choricystis/ Leptolyngbya. Στη παρούσα εργασία, οι αυτόχθονες μικροβιακοί πληθυσμοί του κάθε είδους αποβλήτου (Παράρτημα Ταυτοποίηση μικροοργανισμών) και η προστιθέμενη μεικτή καλλιέργεια ειδών, Choricystis και Leptolyngbya, φαίνεται ότι παρουσίασαν μια συνεργιστική σχέση καθώς τις περισσότερες φορές καταγράφηκε σημαντική αύξηση βιομάζας, υψηλό ποσοστό απομάκρυνσης για όλα τα θρεπτικά συστατικά (άνθρακας, άζωτο, φώσφορος) αλλά και σημαντική περιεκτικότητα συσσωρευμένου ελαίου στη ξηρή βιομάζα (Πίνακας 6.1α). Το άζωτο και ο φώσφορος ως απαραίτητα θρεπτικά στοιχεία για τους μικροοργανισμούς καταναλώθηκαν από το υπόστρωμα ανάπτυξης και σημείωσαν υψηλά ποσοστά απομάκρυνσης και για τα δύο εφαρμοζόμενα συστήματα (αιωρούμενης και προσκολλημένης ανάπτυξης). Μάλιστα, για τη μεικτή καλλιέργεια Choricystis, που τα ποσοστά απομάκρυνσης αζώτου και φωσφόρου από το απόβλητο τυροκομείου άγγιξαν το 100% και το 99.7%, αντίστοιχα, αποτελούν και μοναδικά δεδομένα (μέχρι τώρα) στη βιβλιογραφία για την ικανότητα του συγκεκριμένου στελέχους χλωροφύκους να απομακρύνει θρεπτικά συστατικά από απόβλητα. Η χρήση 239

263 Αποτελέσματα του κυανοβακτηρίου Leptolyngbya για επεξεργασία αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων έχει αναφερθεί μόνο από τους Khemka and Saraf (2015) όπου και κατέγραψαν χαμηλότερα ποσοστά απομάκρυνσης αζώτου και φωσφόρου σε σχέση με αυτά που επιτεύχθηκαν στην παρούσα εργασία με το ίδιο στέλεχος (Πίνακας 3.18). Μάλιστα, η σύγκριση αιωρούμενων και προσκολλημένων συστημάτων ανάπτυξης φανερώνει την ικανότητα της καλλιέργειας να επιτυγχάνει υψηλότερα ποσοστά απομάκρυνσης ολικού αζώτου στα συστήματα προσκολλημένης ανάπτυξης (70.597%) σε σχέση με τα συστήματα αιωρούμενης ανάπτυξης (5591%) (Πίνακας 6.1α). Ο φώσφορος (P), σημείωσε επίσης υψηλά ποσοστά απομάκρυνσης που άγγιξαν το 99%, πολύ υψηλότερες τιμές σε σχέση με τις αναφερόμενες από τους Khemka and Saraf (2015) για επεξεργασία αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων με χρήση Leptolyngbya (μόλις 52.3%). Η διαδικασία της απομάκρυνσης του φωσφόρου ενισχύθηκε και από τον μηχανισμό αυτοκαθίζησης, λόγω της παρουσίας των δισθενών κατιόντων του ασβεστίου και του μαγνησίου που αντιδρούν με το φώσφορο και καθιζάνουν σαν σύμπλεγμα μικροφύκημετάλλων (Moutin et al., 1992; Nurdogan and Oswald, 1995). Ο μηχανισμός αυτός της αυτοκαθίζησης συνεισφέρει στην μείωση της συγκέντρωσης του φωσφόρου και ταυτόχρονα βοηθά στην συγκομιδή των αιωρούμενων μικροφυκών από το υγρό μέσο. Γι αυτό και η ισχυρή παρουσία αυτών των ιόντων στα υγρά απόβλητα που εξετάστηκαν (Πίνακας 3.14) ενισχύει την αποτελεσματικότητα της απομάκρυνσης του φωσφόρου. Ωστόσο, μαθηματική μοντελοποίηση από τους Mesplé et al. (1996) υποδεικνύει ότι η πρόσληψη του φωσφόρου που συμβαίνει από τους μικροοργανισμούς (μικροφύκη) είναι σε μεγαλύτερη ποσότητα από την απομάκρυνση του φωσφόρου λόγω χημικής καθίζησης. Η δυναμικότητα των μικροφυκών ως πρώτη ύλη για βιοκαύσιμα είναι ευρέως αποδεκτή και αυξάνεται στην αγορά βιοκαυσίμων. Ωστόσο, υπάρχει έλλειψη συστηματικής σύγκρισης ορισμένων ειδών καθώς οι περισσότεροι ερευνητές πραγματοποιούν ξεχωριστές μελέτες σε διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες και με διαφορετικό σχεδιασμό βιοαντιδραστήρων. Στην παρούσα εργασία, η χρήση συστημάτων προσκολλημένης ανάπτυξης επέτρεπε τον πιο εύκολο διαχωρισμό της μικροβιακής βιομάζας από το θρεπτικό μέσο, εφόσον σημαντική ποσότητα των μικροοργανισμών συγκεντρώνονταν σε μικρή περιοχή. Τα νηματοειδή κυανοβακτήρια, όπως τα είδη μικροοργανισμών που αναπτύχθηκαν στα προσκολλημένα συστήματα (Παράρτημα Ταυτοποίηση μικροοργανισμών) είναι 240

264 Αποτελέσματα κατάλληλοι οργανισμοί για εύκολη συγκομιδή μιας και παράγουν εξωκυτταρικά πολυμερή που συμβάλλουν στην αυτοκροκίδωση (Ruggieri et al., 2009). Στη παρούσα μελέτη, οι μικροοργανισμοί που αναπτύχθηκαν στις ράβδους και στα τοιχώματα των βιοαντιδραστήρων σχημάτισαν στρώματα βιοφίλμ, κάτι που χαρακτηρίζει την μικροβιακή εξέλιξη ως ένα σημαντικό χαρακτηριστικό για την επιβίωση των μικροοργανισμών σε μεταβαλλόμενα περιβάλλοντα. Γι αυτό εμφανίστηκαν παραλλαγές στην παραγωγικότητα των κυττάρων ανάλογα με το θρεπτικό υπόστρωμα (Πίνακας 6.1α). Η παρουσία των νηματοειδούς φύσης κυανοβακτηρίων και άρα ο ευκολότερος σχηματισμός βιοφίλμ πάνω στις ράβδους οδήγησε και σε υψηλότερα ποσοστά συσσωρευμένου ελαίου στα συστήματα προσκολλημένης ανάπτυξης σε σχέση με αυτά της αιωρούμενης που κυμάνθηκαν από % ξηρής βιομάζας (Πίνακας 6.1α). Η προτίμηση της μικροβιακής κοινότητας στα προσκολλημένα συστήματα φανερώνεται και από τον ειδικό ρυθμό προσκολλημένης ανάπτυξης που σημείωσε τιμές από d 1 για το σύνολο των υποστρωμάτων στα πειράματα προσκολλημένης ανάπτυξης ενώ κυμάνθηκε από d 1 για τα πειράματα αιωρούμενης ανάπτυξης (Πίνακας 6.1α). Εξίσου υψηλό ειδικό ρυθμό ανάπτυξης (0.97 d 1 ) έχει σημειωθεί από τους Silaban et al. (2014) σε μιξότροφη συγκαλλιέργεια του Leptolyngbya sp. (με Chlorella vulgaris), ωστόσο χρησιμοποιώντας τεχνητό χημικό υπόστρωμα ανάπτυξης. Αξίζει να επισημάνουμε ότι το βιολογικό σύστημα επεξεργασίας που αναπτύχθηκε στη παρούσα διατριβή με τη χρήση αιωρούμενων και προσκολλημένων συστημάτων ανάπτυξης επιτυγχάνει σημαντικούς ρυθμούς παραγωγικότητας βιομάζας με υψηλές απομακρύνσεις ρυπαντικού φορτίου έχοντας ελάχιστο ενεργειακό κόστος καθώς χρησιμοποιήθηκε μόνο μια μικρή ηλεκτρική αντλία ανάδευσης (46W) και λάμπες με ένταση φωτός (12000lux) μικρότερη από την αντίστοιχη ηλιακή ένταση στο φως της ημέρας ( lux). Στο τελευταίο μέρος της παρούσας διδακτορικής διατριβής, με γνώμονα την σύσταση όσο το δυνατόν μιας αειφόρας διαδικασίας, εξετάστηκε η δυνατότητα της παραχθείσας βιομάζας, μετά την επεξεργασία των εκάστοτε αποβλήτων, να χρησιμοποιηθεί ως υπόστρωμα για παραγωγή βιοαιθανόλης. Μελετήθηκε η ανάπτυξη του ζυμομύκητα σε υδρολυμένο υπόστρωμα βιομάζας από επεξεργασία αποβλήτων τυροκομείου, οινοποιείου καθώς και μεικτού αποβλήτου οινοποιείουσταφίδας, όπου με αρχικές συγκεντρώσεις σακχάρων μεταξύ g L 1. Έγινε μια προσπάθεια διερεύνησης και κατανόησης των συνθηκών υδρόλυσης που θα οδηγήσουν στη 241

265 Αποτελέσματα μέγιστη παραγωγή βιοαιθανόλης. Οι αποδόσεις αιθανόλης σε ολικά σάκχαρα κυμάνθηκαν μεταξύ αιθανόλη/ σάκχαρα (g/g) ή % για όλα τα εξεταζόμενα υποστρώματα υποδεικνύοντας την χρήση της εξεταζόμενης βιομάζας ως εν δυνάμει υπόστρωμα παραγωγής αιθανόλης (Πίνακας 6.1β). Οι ικανοποιητικές αυτές αποδόσεις φανερώνουν το φιλικό περιβάλλον ανάπτυξης για το ζυμομύκητα, παρόλο που το υπόστρωμα είχε προέλθει από όξινη επεξεργασία με 2.5Ν Η 2 SO 4 και 120 χρόνο υδρόλυσης. Τα ευρήματα της παρούσας εργασίας ενδέχεται να διασαφηνίσουν πτυχές στην ανάπτυξη μεικτής μικροοργανισμικής βιομάζας σε υποστρώματα αποβλήτων που δεν είχαν μελετηθεί μέχρι σήμερα ενώ θα μπορούσαν επίσης να συμβάλλουν στην κατανόηση των μηχανισμών δράσης των μικροβίων σε συστήματα προσκολλημένης ανάπτυξης που επίσης δεν έχουν μελετηθεί επαρκώς μέχρι σήμερα. Οι μεικτές μικροβιακές καλλιέργειες (βασισμένες σε μικροφύκη / κυανοβακτήρια) που αναπτύχθηκαν σε κάθε απόβλητο, θα μπορούσαν να προσφέρουν μια κομψή λύση επεξεργασίας των δοθέντων λυμάτων με ταυτόχρονη παραγωγή χρήσιμης βιομάζας για βιοκαύσιμα. Πίνακας 6.1: Συνοπτικά αποτελέσματα των αποδόσεων από το σύνολο των πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν στη παρούσα διατριβή 242

266 Αποτελέσματα (α) Σύστημα καλλιέργειας Αιωρούμενης ανάπτυξης Προσκολλημέ νης ανάπτυξης Υπόστρωμα αποβλήτου Τυροκομείου Τυροκομείου Οινοποιείου Σταφίδας Μεικτού Τυροκομείου Οινοποιείου Μεικτού Είδη μικροοργανισμών στις μεικτές καλλιέργειες Choricystis sp. Leptolyngbya sp. Leptolyngbya sp. Leptolyngbya sp. Leptolyngbya sp. Leptolyngbya sp. Leptolyngbya sp. Leptolyngbya sp. Αρχικό COD (mg L 1 ) / Απομάκρυνση % / / / / / / / / % Ελαίου στη ξηρή βιομάζα Απομακρύνσεις θρεπτικών συστατικών % Παραγωγικότητα βιομάζας 3 ΝΟ 3 ΤΝ PO 4 Ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (d 1 ) mg(ld) mg(ld) mg(ld) mg(ld) mg(ld) gm 2 d gm 2 d gm 2 d (β) Υπόστρωμα μικροβιακής βιομάζας με Leptolyngbya μετά από επεξεργασία Αρχική συγκέντρωση σακχάρων (g L 1 ) Συγκέντρωση αιθανόλης (g L 1 ) % Απόδοση σε ολικά σάκχαρα Μεικτού αποβλήτου Μεικτού αποβλήτου Αποβλήτου τυροκομείου

267 Αποτελέσματα 6.2 Προτάσεις για μελλοντική εργασία Ο συνδυασμός επεξεργασίας των λυμάτων με την παραγωγή μικροβιακού βιοντίζελ μπορεί όχι μόνο να περιορίσει τους περιβαλλοντικούς κινδύνους αλλά και να μειώσει σημαντικά την οικονομική πίεση στην διαδικασία παραγωγής βιοντίζελ. Ωστόσο, είναι απαραίτητη εκτεταμένη μελλοντική έρευνα για τη βελτίωση της επεξεργασίας των λυμάτων ώστε να ενισχυθεί η παραγωγικότητα της βιομάζας σε επίπεδα επαρκή για την βιώσιμη παραγωγή ενέργειας. Αρχικά, προτείνεται η μελέτη σε συστήματα προσκολλημένης ανάπτυξης χρησιμοποιώντας διαφορετικά υλικά, όπως πλαστικό και ύφασμα, που θα επιτρέπουν τη διέλευση του φωτός και θα ενισχύουν την ανάπτυξη της καλλιέργειας στα συστήματα αυτά καθώς επίσης και τη μελέτη ανάπτυξης των καλλιεργειών με επιπρόσθετη παροχή CO 2. Η εξέταση των παρόντων ειδών μικροφυκών/ κυανοβακτηρίων σε άλλα είδη αποβλήτων (χοιροστασίου, ελαιοτριβείου) θα αποτελούσε επίσης ένα βήμα. Μια αρκετά ενδιαφέρουσα μελέτη θα αποτελούσε η διερεύνηση της εξέλιξης της μικροβιακής ποικιλότητας κατά την διάρκεια της βιοεπεξεργασίας των αποβλήτων. Επίσης, σημαντική είναι η μελέτη των προτεινόμενων συστημάτων σε πραγματικό περιβάλλον (μέσω δημιουργίας μονάδων ημιβιομηχανικής κλίμακας), με σκοπό τη μελέτη της επίδρασης ηλιακού φωτός και διακυμάνσεως της θερμοκρασίας περιβάλλοντος στην εύρυθμη λειτουργία των συστημάτων. Η ολοκλήρωση αυτής της μελέτης θα απαντούσε για την δυνατότητα εφαρμογής της διεργασίας ως μέθοδο βιολογικής επεξεργασίας αποβλήτων με χαμηλό οικονομικό και περιβαλλοντικό κόστος, παράγοντας ταυτόχρονα βιοκαύσιμα. Αναφορικά με την παραγωγή βιοαιθανόλης, προτείνεται περαιτέρω μελέτη στην διενέργεια των όξινων υδρολύσεων με χρήση διαφορετικών οξέων (HNO 3, HCl, H 3 PO 4 ) καθώς και χρήση διαφορετικών συγκεντρώσεών τους (1%, 3%, 5%, 6% v/v). Επιπλέον, θα μπορούσαν να εξεταστούν διαφορετικοί χρόνοι και μικρότερες θερμοκρασίες υδρόλυσης πέραν όσων δοκιμάστηκαν στην παρούσα μελέτη ώστε να διερευνηθεί εκτενέστερα η απόδοση των σακχάρων. Τέλος, έρευνα θα μπορούσε να γίνει με τη χρήση διαφορετικών ειδών ζυμομυκήτων για την παραγωγή βιοαιθανόλης. 244

268 Βιβλιογραφία 7. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Ελληνικές αναφορές Ανυφαντάκης, Ε., Τυροκομία: Χημεία, Φυσικοχημεία, Μικροβιολογία. Εκδόσεις Σταμούλη, Αθήνα. Βαγενάς, Δ., Διαχείριση υγρών αποβλήτων. Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Βεργίνη Σοφία 2014, Καλλιέργεια μικροφυκών σε προσομοιωμένα λύματα και συλλογή τους με χρήση κροκιδωτικών και μαγνητικών υλικών, Μεταπτυχιακή εργασία, Τμήμα Πολιτικών Μηχανικών, Πανεπιστήμιο Πατρών. Γεωργιοπούλου, Μ., Ανάπτυξη μεθόδων για την επιλογή της καλύτερης διαθέσιμης τεχνολογίας για την επεξεργασία υγρών βιομηχανικών αποβλήτων. Τμήμα Χημικών Μηχανικών. Πανεπιστήμιο Πατρών Ευρωπαϊκή Επιτροπή 2003, Επίσημη εφημερίδα της Ευρωπαϊκής Ένωσης, Οδηγία 2003/30/ΕΚ, L 123/42. Θεοχάρης Αδριανός 2010, Βιοκαύσιμα στην Ελλάδα, Ελίν Βιοκαύσιμα. 4η εβδομάδα ενέργειας ΙΕΝΕ (Ινστιτούτο ενέργειας Νοτιοανατολικής Ευρώπης) επιχειρηματική συνάντηση «ενέργεια β2β» 2527 Νοεμβρίου 2010 πρόγραμμα παρουσιάσεων και workshops Καλαβρουζιώτης, Κ., Ι.,, Αειφορική διαχείριση εδαφικών πόρων. Αγρίνιο. Καραδήμα, Κ., Εκτίμηση της τοξικότητας διαφόρων σταδίων επεξεργασίας αποβλήτων τυροκομικών μονάδων με χρήση βιοδεικτών. Τμήμα Βιολογίας. Πανεπιστήμιο Πατρών, Πάτρα. Κόλλιας, Λ., Παραγωγή Βιοντίζελ από Μικροφύκη. Τμήμα Χημικών Μηχανικών. Εθνικό Μετσόβειο Πολυτεχνείο, Αθήνα, p Λόης Ε., Αναστασόπουλος Γ., 2006 «Χρήση του Βιοντίζελ και της Βιοαιθανόλης ως υποκατάστατων του πετρελαίου κίνησης και της βενζίνης», ΕΜΠ, Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Εργαστήριο Τεχνολογίας Καυσίμων και Λιπαντικών Λόης Ε., Λάμπρου Α., 2007 Τα βιοκαύσιμα στην Ελλάδα, Τ.Ε.Ε. Κεντρικής & Δυτικής Θεσσαλίας, Διημερίδα για τις Ανανεώσιμες Πηγές Ενέργειας, Λάρισα Μακρής, Γ., Χαραλάμπους, Α., Χατζηευσταθίου, Μ., Πρόληψη της ρύπανσης στη βιομηχανία παραγωγής γαλακτοκομικών προϊόντων παγωτού. Ηράκλειο. Ξυπτέρας, Ν., Μικροβιακή αποδόμηση φαινολικών ενώσεων σε περιβαλλοντικά δείγματα: απομόνωση και μοριακός χαρακτηρισμός αλόφιλων βακτηρίων, Τμήμα Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων, Αγρίνιο. Οδηγία 75/442/EEC, Council directive of 15 July 1975 on waste, 31975L0442, Official Journal, L 194, p , Greek special edition: Chapter 03, Volume 11, p Τατούλης, Τ., Βιολογική επεξεργασία υγρών αποβλήτων τυροκομείου. Τμήμα Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων, Αγρίνιο. ΥΠΕΚΑ 2008, Διεύθυνση πετρελαϊκής πολιτικής, σχετικά με την προώθηση της χρήσης των βιοκαυσίμων ή άλλων ανανεώσιμων καυσίμων για μεταφορές στην Ελλάδα, 5η εθνική έκθεση Φύλλο Εφημερίδος της Κυβερνήσεως, Νο1700/Δ1/Α/17970/29 Ιουλίου Κατανομή για το έτος 2011 ποσότητας χιλιολίτρων αυτούσιου βιοντίζελ. 245

269 Βιβλιογραφία Φύλλο Εφημερίδος της Κυβερνήσεως, Νο2590/Δ1/Α/18571/25 Σεπτεμβρίου Τροποποίηση της υπ αριθμ. Δ1/Α/23603/ απόφασης «Κατανομή για το έτος 2011 ποσότητας χιλιολίτρων αυτούσιου βιοντίζελ και ρύθμιση θεμάτων παράτασης της περιόδου κατανομής. Χαρτσά, Α., Περιβαλλοντικές επιπτώσεις χοιροτροφικών εκµεταλλεύσεων νοµού Ευβοίας. Τμήμα Περιβάλλοντος. Πανεπιστήμιο Αιγαίου. Χρήστου, Ι., Διαχείριση αποβλήτων βιομηχανίας τυροκομείων. Ελληνικό Ανοικτό Πανεπιστήμιο, Πάτρα. Διεθνής αναφορές AbdelRaouf, N., AlHomaidan, A.A., Ibraheem, I.B.M., Microalgae and wastewater treatment. Saudi J. Biol. Sci. 19, Abed, R.M., Dobretsov, S., Sudesh, K., Applications of cyanobacteria in biotechnology. Journal of Applied Microbiology 106, 112. Abreu, A.P., Fernandes, B., Vicente, A.A., Teixeira, J., Dragone, G., Mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris using industrial dairy waste as organic carbon source. Bioresource Technology 118, Adagha, O., A Roadmap to Commercially Viable AlgaeBiofuel Production. University of Aberdeen. Adams, M.R., Flynn, G., Fermentation ethanol: an industrial profile. Natural resources institute, London. Adey, W.H., Kangas, P.C., Mulbry, W., Algal turf scrubbing: Cleaning surface waters with solar energy while producing a biofuel. BioScience 61, AFNOR, Recueil de normes françaises des corps gras, graines oléagineuses, produits dérivés. Association Française de Normalisation eds, Paris, 95. Agarwal, A.K., Biofuels (alcohols and biodiesel) applications as fuels for internal combustion engines. Progress in energy and combustion science 33, Aggelis, G., Two alternative pathways for substrate assimilation bymucor circinelloides. Folia microbiologica 41, Ahmad, A.L., Yasin, N.H.M., Derek, C.J.C., Lim, J.K., Microalgae as a sustainable energy source for biodiesel production: A review. Renewable Sustainable Energy Rev 15, Albertano, P., Barsanti, L., Passarelli, V., Gualtieri, P., A complex photoreceptive structure in the cyanobacterium Leptolyngbya sp. Micron 31, Aldiguier, A., Alfenore, S., Cameleyre, X., Goma, G., Uribelarrea, J., Guillouet, S., MolinaJouve, C., Synergistic temperature and ethanol effect on Saccharomyces cerevisiae dynamic behaviour in ethanol biofuel production. Bioprocess and biosystems engineering 26, Alexopoulou, E., Chatziathanassiou, A., Description of growing experience on sweet sorghum in Greece. Greece, European Energy Crops InterNetwork, Biobase. Alexopoulou, E., Zanetti, F., Scordia, D., ZegadaLizarazu, W., Christou, M., Testa, G., Cosentino, S.L., Monti, A., Longterm yields of switchgrass, giant 246

270 247 Βιβλιογραφία reed, and miscanthus in the Mediterranean basin. BioEnergy Research 8, Alvarez, H., Steinbüchel, A., Triacylglycerols in prokaryotic microorganisms. Applied microbiology and biotechnology 60, Amin, S., Review on biofuel oil and gas production processes from microalgae. Energy Conversion and Management 50, An, J.Y., Sim, S.J., Lee, J.S., Kim, B.W., Hydrocarbon production from secondarily treated piggery wastewater by the green alga Botryococcus braunii. Journal of Applied Phycology 15, Angerbauer, C., Siebenhofer, M., Mittelbach, M., Guebitz, G., Conversion of sewage sludge into lipids by Lipomyces starkeyi for biodiesel production. Bioresource Technology 99, Antonopoulou, G., Gavala, H.N., Skiadas, I.V., Angelopoulos, K., Lyberatos, G., Biofuels generation from sweet sorghum: Fermentative hydrogen production and anaerobic digestion of the remaining biomass. Bioresource Technology 99, Antonopoulou, G., Vayenas, D., Lyberatos, G., Ethanol and hydrogen production from sunflower straw: The effect of pretreatment on the whole slurry fermentation. Biochemical Engineering Journal 116, APHA, Standard methods for the examination of water and wastewater, 20th edn. American Public Health Association, Washington, USA. APHAAWWA WEF. Apha, A., WPCF, Standard methods for the examination of water and wastewater. American Public Health Association, Washington, DC, 456. Aravantinou, A.F., Theodorakopoulos, M.A., Manariotis, I.D., Selection of microalgae for wastewater treatment and potential lipids production. Bioresource Technology 147, Athanasopoulos, N.S., Athanasopoulos, J.S., Currantwastewater treatment using biological and physicochemical processes. Bioresource Technology 66, Ayala, F., Vargas, T., Experiments on Spirulina culture on wasteeffluent media and at the pilot plant. Twelfth International Seaweed Symposium. Springer, pp Azócar, L., Heipieper, H.J., Navia, R., Biotechnological processes for biodiesel production using alternative oils. Applied microbiology and biotechnology 88, Badger, M.R., Price, G.D., CO 2 concentrating mechanisms in cyanobacteria: molecular components, their diversity and evolution. Journal of experimental botany 54, Badger, P., Ethanol from cellulose: A general review. Trends in new crops and new uses 1, Bahadar, A., Bilal Khan, M., Progress in energy from microalgae: A review. Renewable Sustainable Energy Rev 27, Bai, R., Silaban, A.G., GutierrezWing, M.T., Benton, M.G., Negulescu, I.I., Rusch, K.A., Silver nanofiber assisted lipid extraction from biomass of a Louisiana Chlorella vulgaris/leptolyngbya sp. coculture. Chemical Engineering Journal 225, Balannec, B., Vourch, M., RabillerBaudry, M., Chaufer, B., Comparative study of different nanofiltration and reverse osmosis membranes for dairy effluent treatment by deadend filtration. Separation and Purification Technology 42,

271 Βιβλιογραφία Becker, E.W., Microalgae: biotechnology and microbiology. Cambridge University Press. Becker, W., Microalgae in Human and Animal Nutrition. p Becker, W., Richmond, A., Handbook of microalgal culture. Microalgae in human and animal nutrition, Beetul, K., Bibi Sadally, S., TalebHossenkhan, N., Bhagooli, R., Puchooa, D., An investigation of biodiesel production from microalgae found in Mauritian waters. Biofuel Research Journal 1, Beevi, U.S., Sukumaran, R.K., Cultivation of the fresh water microalga Chlorococcum sp. RAP13 in sea water for producing oil suitable for biodiesel. Journal of Applied Phycology 27, Bellou, S., Aggelis, G., Biochemical activities in Chlorella sp. and Nannochloropsis salina during lipid and sugar synthesis in a labscale open pond simulating reactor. Journal of biotechnology 164, Bellou, S., Baeshen, M.N., Elazzazy, A.M., Aggeli, D., Sayegh, F., Aggelis, G., Microalgal lipids biochemistry and biotechnological perspectives. Biotechnol. Adv. 32, Bely, M., Stoeckle, P., MasneufPomarède, I., Dubourdieu, D., Impact of mixed Torulaspora delbrueckii Saccharomyces cerevisiae culture on highsugar fermentation. International Journal of Food Microbiology 122, Benemann, J., Goebel, R., Weissman, J., Augenstein, D., Microalgae as a source of liquid fuels. Proceedings of the June 1982 SERI Biomass Program Principal Investigators Review Meeting, Aquatic Species Program Reports, pp Benemann, J.R., Oswald, W.J., Algal mass culture systems. Systems and economic analysis of microalgae ponds for conversion of CO 2 to biomass. Other Information: PBD: 21 Mar 1996, p. Medium: ED; Size: 214 p. Bhatnagar, A., Bhatnagar, M., Chinnasamy, S., Das, K.C., Chlorella minutissimaa promising fuel alga for cultivation in municipal wastewaters. Springer, pp Bhatnagar, A., Chinnasamy, S., Singh, M., Das, K., Renewable biomass production by mixotrophic algae in the presence of various carbon sources and wastewaters. Appl. Energy 88, Biller, P., Ross, A., Potential yields and properties of oil from the hydrothermal liquefaction of microalgae with different biochemical content. Bioresource Technology 102, Bisaria, V.S., Ghose, T.K., Biodegradation of cellulosic materials: Substrates, microorganisms, enzymes and products. Enzyme and Microbial Technology 3, Blankenship, J.R., Mitchell, A.P., How to build a biofilm: a fungal perspective. Current opinion in microbiology 9, Blier, R., Laliberte, G., De la Noüe, J., Tertiary treatment of cheese factory anaerobic effluent with Phormidium bohneri and Micractinum pusillum. Bioresource Technology 52, Boelee, N.C., Temmink, H., Janssen, M., Buisman, C.J.N., Wijffels, R.H., Nitrogen and phosphorus removal from municipal wastewater effluent using microalgal biofilms. Water Research 45, Borowitzka, M.A., Commercial production of microalgae: ponds, tanks, tubes and fermenters. Journal of biotechnology 70,

272 Βιβλιογραφία Boyer, T.H., Persaud, A., Banerjee, P., Palomino, P., Comparison of lowcost and engineered materials for phosphorus removal from organicrich surface water. Water Research 45, Brennan, L., Owende, P., Biofuels from microalgaea review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and coproducts. Renewable and Sustainable Energy Reviews 14, Brennan L., Owende P., Biofuels from microalgaea review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and coproducts. Renewable Sustainable Energy Rev 14, Brown, M.R., Jeffrey, S.W., Volkman, J.K., Dunstan, G.A., Nutritional properties of microalgae for mariculture. Elsevier, pp Burlew, J.S., Algal culture: from laboratory to pilot plant., Carnegie Institution of Washington. Cai, T., Park, S.Y., Li, Y., Nutrient recovery from wastewater streams by microalgae: Status and prospects. Renewable Sustainable Energy Rev 19, Canizares, R., Dominguez, A., Growth of Spirulina maxima on swine waste. Bioresource technology 45, Cardozo, K.H.M., Guaratini, T., Barros, M.P., Falcão, V.R., Tonon, A.P., Lopes, N.P., Campos, S., Torres, M.A., Souza, A.O., Colepicolo, P., Pinto, E., Metabolites from algae with economical impact. Comparative Biochemistry and Physiology C Toxicology and Pharmacology 146, Carraretto, C., Macor, A., Mirandola, A., Stoppato, A., Tonon, S., Biodiesel as alternative fuel: experimental analysis and energetic evaluations. Energy 29, Carvalho, F., Prazeres, A.R., Rivas, J., Cheese whey wastewater: Characterization and treatment. Sci. Total Environ , Casazza, A.A., Pier F., F., Bahar, A., Mattia, C., Patrizia, P., Microalgae growth using winery wastewater for energetic and environmetal purposes. Chemical Engineering Transactions 49, CerónGarcía, M., MacíasSánchez, M., SánchezMirón, A., GarcíaCamacho, F., MolinaGrima, E., A process for biodiesel production involving the heterotrophic fermentation of Chlorella protothecoides with glycerol as the carbon source. Appl. Energy 103, Chatzifragkou, A., Fakas, S., Galiotou Panayotou, M., Komaitis, M., Aggelis, G., Papanikolaou, S., Commercial sugars as substrates for lipid accumulation in Cunninghamella echinulata and Mortierella isabellina fungi. European Journal of Lipid Science and Technology 112, Chen, C.Y., Yeh, K.L., Aisyah, R., Lee, D.J., Chang, J.S., Cultivation, photobioreactor design and harvesting of microalgae for biodiesel production: A critical review. Bioresource Technology 102, Chen, H., Fu, X., Industrial technologies for bioethanol production from lignocellulosic biomass. Renewable Sustainable Energy Rev 57, Chen, R., Li, R., Deitz, L., Liu, Y., Stevenson, R.J., Liao, W., Freshwater algal cultivation with animal waste for nutrient removal and biomass production. Biomass Bioenergy 39, Chen, Y.H., Walker, T.H., Biomass and lipid production of heterotrophic microalgae Chlorella protothecoides by using biodieselderived crude glycerol. Biotechnology letters 33,

273 Βιβλιογραφία ChengWu, Z., Zmora, O., Kopel, R., Richmond, A., An industrialsize flat plate glass reactor for mass production of Nannochloropsis sp. (Eustigmatophyceae). Aquaculture 195, Chiaiese, P., Palomba, F., Tatino, F., Lanzillo, C., Pinto, G., Pollio, A., Filippone, E., Engineered tobacco and microalgae secreting the fungal laccase POXA1b reduce phenol content in olive oil mill wastewater. Enzyme and microbial technology 49, Chinnasamy, S., Bhatnagar, A., Hunt, R.W., Das, K.C., Microalgae cultivation in a wastewater dominated by carpet mill effluents for biofuel applications. Bioresource Technology 101, Chisti, Y., Biodiesel from microalgae. Biotechnol. Adv. 25, Choi, G.G., Kim, B.H., Ahn, C.Y., Oh, H.M., Effect of nitrogen limitation on oleic acid biosynthesis in Botryococcus braunii. Journal of applied phycology 23, Choi, S.P., Nguyen, M.T., Sim, S.J., Enzymatic pretreatment of Chlamydomonas reinhardtii biomass for ethanol production. Bioresource Technology 101, Chojnacka, K., Noworyta, A., Evaluation of Spirulina sp. growth in photoautotrophic, heterotrophic and mixotrophic cultures. Enzyme and Microbial Technology 34, Christ, K.L., Burritt, R.L., Critical environmental concerns in wine production: an integrative review. Journal of Cleaner Production 53, Christenson, L., Sims, R., Production and harvesting of microalgae for wastewater treatment, biofuels, and bioproducts. Biotechnol. Adv. 29, Christenson, L.B., Sims, R.C., Rotating algal biofilm reactor and spool harvester for wastewater treatment with biofuels by products. Biotechnol. Bioeng. 109, Chung, P., Pond, W., Kingsbury, J., Walker, E., Krook, L., Production and nutritive value of Arthrospira platensis, a spiral bluegreen alga grown on swine wastes. Journal of Animal Science 47, Chuntapa, B., Powtongsook, S., Menasveta, P., Water quality control using Spirulina platensis in shrimp culture tanks. Elsevier, pp Cicci, A., Stoller, M., Bravi, M., Microalgal biomass production by using ultraand nanofiltration membrane fractions of olive mill wastewater. Water Research 47, Clarens, A.F., Resurreccion, E.P., White, M.A., Colosi, L.M., Environmental life cycle comparison of algae to other bioenergy feedstocks. Environmental Science and Technology 44, Cordano, M., Marshall, R.S., Silverman, M., How do Small and Medium Enterprises Go Green? A Study of Environmental Management Programs in the U.S. Wine Industry. Journal of Business Ethics 92, CuellarBermudez, S.P., GarciaPerez, J.S., Rittmann, B.E., ParraSaldivar, R., Photosynthetic bioenergy utilizing CO 2 : an approach on flue gases utilization for third generation biofuels. Journal of Cleaner Production 98, da CunhaPereira, F., Hickert, L.R., Sehnem, N.T., de SouzaCruz, P.B., Rosa, C.A., Ayub, M.A.Z., Conversion of sugars present in rice hull hydrolysates into ethanol by Spathaspora arborariae, Saccharomyces cerevisiae, and their cofermentations. Bioresource Technology 102,

274 251 Βιβλιογραφία Da Rosa, A.P.C., Carvalho, L.F., Goldbeck, L., Costa, J.A.V., Carbon dioxide fixation by microalgae cultivated in open bioreactors. Energy Conversion and Management 52, Dahms, H.U., Ying, X., Pfeiffer, C., Antifouling potential of cyanobacteria: a minireview. Biofouling 22, Danger, M., Oumarou, C., Benest, D., Lacroix, G., Bacteria can control stoichiometry and nutrient limitation of phytoplankton. Functional Ecology 21, Das, A.A., Esfahani, M.M., Velev, O.D., Pamme, N., Paunov, V.N., Artificial leaf device for hydrogen generation from immobilised C. reinhardtii microalgae. Journal of Materials Chemistry A 3, debashan, L.E., Bashan, Y., Immobilized microalgae for removing pollutants: review of practical aspects. Bioresource technology 101, DeBashan, L.E., Hernandez, J.P., Morey, T., Bashan, Y., Microalgae growthpromoting bacteria as "helpers" for microalgae: A novel approach for removing ammonium and phosphorus from municipal wastewater. Water Research 38, De Benedetti, B., Barbera, A.C., Freni, P., Tecchio, P., Wastewater valorization adopting the microalgae accelerated growth. Desalin. Water Treat. 53, De Godos, I., González, C., Becares, E., GarcíaEncina, P.A., Muñoz, R., Simultaneous nutrients and carbon removal during pretreated swine slurry degradation in a tubular biofilm photobioreactor. Applied microbiology and biotechnology 82, de J. Raposo, M.F., Oliveira, S.E., Castro, P.M., Bandarra, N.M., Morais, R.M., On the utilization of microalgae for brewery effluent treatment and possible applications of the produced biomass. Journal of the Institute of Brewing 116, de la Noue, J., Basséres, A., Biotreatment of anaerobically digested swine manure with microalgae. Biological Wastes 29, de la Noue, J., de Pauw, N., The potential of microalgal biotechnology: a review of production and uses of microalgae. Biotechnol Adv 6, De Mes, T., Stams, A., Reith, J., Zeeman, G., Methane production by anaerobic digestion of wastewater and solid wastes. Biomethane & Biohydrogen, Dębowski, M., Zieliński, M., Grala, A., Dudek, M., Algae biomass as an alternative substrate in biogas production technologies Review. Renewable Sustainable Energy Rev 27, Demirbas, A., Biodiesel. Springer, London. Demirbas, A., Demirbas, M.F., Importance of algae oil as a source of biodiesel. Energy conversion and management 52, Demirbas, M.F., Biofuels from algae for sustainable development. Appl. Energy 88, Devantier, R., Pedersen, S., Olsson, L., Characterization of very high gravity ethanol fermentation of corn mash. Effect of glucoamylase dosage, presaccharification and yeast strain. Applied microbiology and biotechnology 68, Dinh, T.N., Nagahisa, K., Hirasawa, T., Furusawa, C., Shimizu, H., Adaptation of Saccharomyces cerevisiae cells to high ethanol concentration and changes in fatty acid composition of membrane and cell size. PLoS One 3, e2623.

275 Βιβλιογραφία Directive, H.A.T., Council directive 75/442/EEC of 15 July 1975 on waste. Official Journal L 194, Doan, Q.C., Moheimani, N.R., Mastrangelo, A.J., Lewis, D.M., Microalgal biomass for bioethanol fermentation: Implications for hypersaline systems with an industrial focus. Biomass Bioenergy 46, Downey, M.O., Dokoozlian, N.K., Krstic, M.P., Cultural practice and environmental impacts on the flavonoid composition of grapes and wine: a review of recent research. American Journal of Enology and Viticulture 57, Du, B., Sharma, L.N., Becker, C., Chen, S.F., Mowery, R.A., van Walsum, G.P., Chambliss, C.K., Effect of varying feedstock pretreatment chemistry combinations on the formation and accumulation of potentially inhibitory degradation products in biomass hydrolysates. Biotechnol. Bioeng. 107, DuBois, M., Gilles, K.A., Hamilton, J.K., Rebers, P.A., Smith, F., Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances. Analytical Chemistry 28, Dutta, D., De, D., Chaudhuri, S., Bhattacharya, S.K., Hydrogen production by cyanobacteria. Microbial Cell Factories 4, 1. Economou, C.N., Makri, A., Aggelis, G., Pavlou, S., Vayenas, D., Semisolid state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil. Bioresource Technology 101, Economou, C.N., Marinakis, N., MoustakaGouni, M., Kehayias, G., Aggelis, G., Vayenas, D.V., Lipid production by the filamentous cyanobacterium Limnothrix sp. growing in synthetic wastewater in suspendedand attachedgrowth photobioreactor systems. Annals of Microbiology 65, Ellis, J.T., Hengge, N.N., Sims, R.C., Miller, C.D., Acetone, butanol, and ethanol production from wastewater algae. Bioresource Technology 111, Eriksen, N.T., The technology of microalgal culturing. Springer, pp Eshaq, F.S., Ali, M.N., Mohd, M.K., Spirogyra biomass a renewable source for biofuel (bioethanol) production. Int. J. Eng. Sci. Technol 2, EspinosaGonzalez, I., Parashar, A., Bressler, D.C., Heterotrophic growth and lipid accumulation of Chlorella protothecoides in whey permeate, a dairy byproduct stream, for biofuel production. Bioresource Technology 155, Farooq, W., Lee, Y.C., Ryu, B.G., Kim, B.H., Kim, H.S., Choi, Y.E., Yang, J.W., Twostage cultivation of two Chlorella sp. strains by simultaneous treatment of brewery wastewater and maximizing lipid productivity. Bioresource Technology 132, Fei, Q., Chang, H.N., Shang, L., Kim, N., Kang, J., The effect of volatile fatty acids as a sole carbon source on lipid accumulation by Cryptococcus albidus for biodiesel production. Bioresource technology 102, Folch, J., Lees, M., SloaneStanley, G., A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J biol Chem 226, Franchino, M., Comino, E., Bona, F., Riggio, V.A., Growth of three microalgae strains and nutrient removal from an agrozootechnical digestate. Chemosphere 92, Friedman, A., Peaks, D.A., Nichols, R., Algae separation from oxidation pond effluents. Journal (Water Pollution Control Federation),

276 Βιβλιογραφία Gallagher, B.J., The economics of producing biodiesel from algae. Renewable Energy 36, Geider, R.J., La Roche, J., Redfield revisited: Variability of C:N:P in marine microalgae and its biochemical basis. European Journal of Phycology 37, 117. Ghafari, S., Hasan, M., Aroua, M.K., Bioelectrochemical removal of nitrate from water and wastewater a review. Bioresource Technology 99, Gibbs, M., Indiana, U., National Science, F., Proceedings of the Workshop on Biosolar Conversion. s.n., Bethesda, Maryland. Girard, J.M., Tremblay, R., Faucheux, N., Heitz, M., Deschênes, J.S., Phycoremediation of cheese whey permeate using directed commensalism between Scenedesmus obliquus and Chlorella protothecoides. Algal Research 22, Girard, J.M., Roy, M.L., Hafsa, M.B., Gagnon, J., Faucheux, N., Heitz, M., Tremblay, R., Deschênes, J.S., Mixotrophic cultivation of green microalgae Scenedesmus obliquus on cheese whey permeate for biodiesel production. Algal Research 5, Glazer, A., Nikaido, H., Microbial Biotechnology. New York: W. H. Freeman and Company. Gloyna E. F., M.J.J.F., Davis M., Pond as Wastewater Treatment Alternative. Water Resources Symposium Number Nine, Center for Research in Water Resources, The University of Texas at Austin. Godos, I.d., Blanco, S., GarcíaEncina, P.A., Becares, E., Muñoz, R., Longterm operation of high rate algal ponds for the bioremediation of piggery wastewaters at high loading rates. Bioresource Technology 100, Gong, Y., Jiang, M., Biodiesel production with microalgae as feedstock: from strains to biodiesel. Biotechnology letters 33, Gong, Y., Wan, X., Jiang, M., Hu, C., Hu, H., Huang, F., Metabolic engineering of microorganisms to produce omega3 very longchain polyunsaturated fatty acids. Progress in lipid research 56, Gonzalez, L.E., Bashan, Y., Increased Growth of the Microalga Chlorella vulgaris when Coimmobilized and Cocultured in Alginate Beads with the PlantGrowthPromoting Bacterium Azospirillum brasilense. Applied and Environmental Microbiology 66, Grewe, C.B., Pulz, O., The biotechnology of cyanobacteria. Ecology of Cyanobacteria II. Springer, pp Griffiths, M.J., Van Hille, R.P., Harrison, S.T.L., The effect of degree and timing of nitrogen limitation on lipid productivity in Chlorella vulgaris. Applied Microbiology and Biotechnology 98, Grima, E.M., Belarbi, E.H., Fernández, F.A., Medina, A.R., Chisti, Y., Recovery of microalgal biomass and metabolites: process options and economics. Biotechnol. Adv. 20, Group, U.N.E.P.B.W., Management, U.N.E.P.I.P.f.S.R., Towards sustainable production and use of resources: assessing biofuels. UNEP/Earthprint. Guimarães, P.M., Teixeira, J.A., Domingues, L., Fermentation of lactose to bioethanol by yeasts as part of integrated solutions for the valorisation of cheese whey. Biotechnol. Adv. 28, Gupta, P.L., Choi, H.J., Lee, S.M., 2016a. Enhanced nutrient removal from municipal wastewater assisted by mixotrophic microalgal cultivation using glycerol. Environmental Science and Pollution Research,

277 Βιβλιογραφία Gupta, S.K., Ansari, F.A., Shriwastav, A., Sahoo, N.K., Rawat, I., Bux, F., 2016b. Dual role of Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus for comprehensive wastewater treatment and biomass production for biofuels. Journal of Cleaner Production 115, Gutzeit, G., Lorch, D., Weber, A., Engels, M., Neis, U., Bioflocculent algal bacterial biomass improves lowcost wastewater treatment. Water science and technology 52, 918. Hadiyanto, Azimatun Nur, M.M., Lipid extraction of microalga Chlorella sp. cultivated in palm oil mill effluent (POME) medium. World Applied Sciences Journal 31, Hakalin, N.L., Paz, A.P., Aranda, D.A., Moraes, L.M.P., Enhancement of cell growth and lipid content of a freshwater microalga Scenedesmus sp. by optimizing nitrogen, phosphorus and vitamin concentrations for biodiesel production. Natural Science Hall, D., Biomass energy in industrialised countries a view of the future. Forest ecology and management 91, Hall, D., Scrase, J., Will biomass be the environmentally friendly fuel of the future? Biomass Bioenergy 15, Haroutounian, S., DIONYSOS: New uses for wine wastes. LIFE03 ENV/GR/ Harun, R., Danquah, M.K., 2011a. Enzymatic hydrolysis of microalgal biomass for bioethanol production. Chemical Engineering Journal 168, Harun, R., Danquah, M.K., 2011b. Influence of acid pretreatment on microalgal biomass for bioethanol production. Process Biochemistry 46, Harun, R., Danquah, M.K., Forde, G.M., Microalgal biomass as a fermentation feedstock for bioethanol production. J. Chem. Technol. Biotechnol. 85, Harun, R., Jason, W.S.Y., Cherrington, T., Danquah, M.K., Exploring alkaline pretreatment of microalgal biomass for bioethanol production. Appl. Energy 88, Harwati, T.U., Willke, T., Vorlop, K.D., Characterization of the lipid accumulation in a tropical freshwater microalgae Chlorococcum sp. Bioresource Technology 121, Hase, R., Oikawa, H., Sasao, C., Morita, M., Watanabe, Y., Photosynthetic production of microalgal biomass in a raceway system under greenhouse conditions in Sendai city. Journal of bioscience and bioengineering 89, Hashimoto, S., Furukawa, K., Nutrient removal from secondary effluent by filamentous algae. Journal of Fermentation and Bioengineering 67, HerediaArroyo, T., Wei, W., Ruan, R., Hu, B., Mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris and its potential application for the oil accumulation from nonsugar materials. Biomass Bioenergy 35, Hernandez, D., Riano, B., Coca, M., GarciaGonzalez, M.C., Saccharification of carbohydrates in microalgal biomass by physical, chemical and enzymatic pretreatments as a previous step for bioethanol production. Chemical Engineering Journal 262, Hill, J., Nelson, E., Tilman, D., Polasky, S., Tiffany, D., Environmental, economic, and energetic costs and benefits of biodiesel and ethanol biofuels. Proceedings of the National Academy of sciences 103,

278 Βιβλιογραφία Ho, S.H., Huang, S.W., Chen, C.Y., Hasunuma, T., Kondo, A., Chang, J.S., 2013a. Bioethanol production using carbohydraterich microalgae biomass as feedstock. Bioresource Technology 135, Ho, S.H., Li, P.J., Liu, C.C., Chang, J.S., 2013b. Bioprocess development on microalgaebased CO 2 fixation and bioethanol production using Scenedesmus obliquus CNWN. Bioresource technology 145, Ho, S.H., Huang, S.W., Chen, C.Y., Hasunuma, T., Kondo, A., Chang, J.S., 2013c. Bioethanol production using carbohydraterich microalgae biomass as feedstock. Bioresource Technology 135, Hodaifa, G., Martinez Ma, E., Sanchez, S., Use of industrial wastewater from oliveoil extraction for biomass production of Scenedesmus obliquus. Bioresource Technology 99, Hoffmann, J.P., Wastewater treatment with suspended and nonsuspended algae. Journal of Phycology 34, Houser, J.B., Venable, M.E., Sakamachi, Y., Hambourger, M.S., Herrin, J., Tuberty, S.R., Wastewater remediation using algae grown on a substrate for biomass and biofuel production. Journal of Environmental Protection 5, 897. Howard, R., Abotsi, E., Van Rensburg, E.J., Howard, S., Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. African Journal of Biotechnology 2, Hu, B., Min, M., Zhou, W., Du, Z., Mohr, M., Chen, P., Zhu, J., Cheng, Y., Liu, Y., Ruan, R., Enhanced mixotrophic growth of microalga Chlorella sp. on pretreated swine manure for simultaneous biofuel feedstock production and nutrient removal. Bioresource Technology 126, Huang, C., Zong, M.h., Wu, H., Liu, Q.p., Microbial oil production from rice straw hydrolysate by Trichosporon fermentans. Bioresource Technology 100, Huang, G., Chen, F., Wei, D., Zhang, X., Chen, G., Biodiesel production by microalgal biotechnology. Appl. Energy 87, Huang, H., Yuan, X., Zeng, G., Wang, J., Li, H., Zhou, C., Pei, X., You, Q., Chen, L., Thermochemical liquefaction characteristics of microalgae in sub and supercritical ethanol. Fuel Processing Technology 92, Hulatt, C.J., Thomas, D.N., Dissolved organic matter (DOM) in microalgal photobioreactors: A potential loss in solar energy conversion? Bioresource Technology 101, Hwang, J.H., Church, J., Lee, S.J., Park, J., Lee, W.H., Use of microalgae for advanced wastewater treatment and sustainable bioenergy generation. Environmental Engineering Science 33, Iconomou, L., Psarianos, C., Koutinas, A., Ethanol fermentation promoted by delignified cellulosic material. Journal of fermentation and bioengineering 79, Jackson, D., Jackson, B., Removal of phosphates in wastewater by the periphyton communities of rotating discs. Int. Ver. Theor. Angrew. Limnol. Verh. 18, Jarvis, B., Federal initiative fuels ethanol industry. Environmental Digest 3, 25. Ji, M.K., Yun, H.S., Park, Y.T., Kabra, A.N., Oh, I.H., Choi, J., Mixotrophic cultivation of a microalga Scenedesmus obliquus in municipal wastewater supplemented with food wastewater and flue gas CO 2 for biomass production. Journal of environmental management 159,

279 256 Βιβλιογραφία Jiang, J.Q., Graham, N.J.D., Harward, C., Comparison of polyferric sulphate with other coagulants for the removal of algae and algaederived organic matter. Water Science and Technology 27, John, R.P., Anisha, G., Nampoothiri, K.M., Pandey, A., Micro and macroalgal biomass: a renewable source for bioethanol. Bioresource technology 102, Johnson, M.B., Microalgal biodiesel production through a novel attached culture system and conversion parameters. Virginia Polytechnic Institute and State University Citeseer, Blacksburg. Johnson, M.B., Wen, Z., Development of an attached microalgal growth system for biofuel production. Applied Microbiology and Biotechnology 85, Josephine, A., Niveditha, C., Radhika, A., Shali, A.B., Kumar, T.S., Dharani, G., Kirubagaran, R., Analytical evaluation of different carbon sources and growth stimulators on the biomass and lipid production of Chlorella vulgaris Implications for biofuels. Biomass Bioenergy 75, Karatay, S.E., Erdoğan, M., Dönmez, S., Dönmez, G., Experimental investigations on bioethanol production from halophilic microalgal biomass. Ecological Engineering 95, Kasavi, C., Finore, I., Lama, L., Nicolaus, B., Oliver, S.G., Oner, E.T., Kirdar, B., Evaluation of industrial Saccharomyces cerevisiae strains for ethanol production from biomass. Biomass Bioenergy 45, Kesaano, M., Sims, R.C., Algal biofilm based technology for wastewater treatment. Algal Research 5, Khemka, A., Saraf, M., Phycoremediation of dairy wastewater coupled with biomass production using Leptolyngbya sp. Journal of Environmental Science and Water Resources 4. Khin, T., Annachhatre, A.P., Novel microbial nitrogen removal processes. Biotechnol. Adv. 22, Kim, J., Im, C.S., Utilization of Wastewater for Microalgal Cultivation. U.S. Patent No.13/ USA. Kim, M., Park, J., Park, C., Kim, S., Jeune, K., Chang, M., Acreman, J., Enhanced production of Scenedesmus spp.(green microalgae) using a new medium containing fermented swine wastewater. Bioresource technology 98, Kirk, T.K., Farrell, R.L., Enzymatic" combustion": the microbial degradation of lignin. Annual Reviews in Microbiology 41, Klass, D.L., Energy and Synthetic Fuels from Biomass and Wastes. John Wiley and Sons. Klausmeler, C.A., Litchman, E., Daufreshna, T., Levin, S.A., Optimal nitrogentophosphorus stoichiometry of phytoplankton. Nature 429, Klindworth, A., Pruesse, E., Schweer, T., Peplies, J., Quast, C., Horn, M., Glöckner, F.O., Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and nextgeneration sequencingbased diversity studies. Nucleic acids research, gks808. Knothe, G., Dependence of biodiesel fuel properties on the structure of fatty acid alkyl esters. Fuel Processing Technology 86, Knothe, G., Designer Biodiesel: Optimizing Fatty Ester Composition to Improve Fuel Properties. Energy & Fuels 22, Koller, M., Salerno, A., Tuffner, P., Koinigg, M., Böchzelt, H., Schober, S., Pieber, S., Schnitzer, H., Mittelbach, M., Braunegg, G., Characteristics and potential

280 Βιβλιογραφία of micro algal cultivation strategies: a review. Journal of Cleaner Production 37, Komárek, J., Review of the cyanobacterial genera implying planktic species after recent taxonomic revisions according to polyphasic methods: state as of Hydrobiologia 764, Komolafe, O., Velasquez Orta, S.B., MonjeRamirez, I., Noguez, I.Y., Harvey, A.P., Orta Ledesma, M.T., Biodiesel production from indigenous microalgae grown in wastewater. Bioresource Technology 154, Kong, Q.x., Li, L., Martinez, B., Chen, P., Ruan, R., Culture of microalgae Chlamydomonas reinhardtii in wastewater for biomass feedstock production. Springer, pp Kopsahelis, N., Agouridis, N., Bekatorou, A., Kanellaki, M., Comparative study of spent grains and delignified spent grains as yeast supports for alcohol production from molasses. Bioresource Technology 98, Kopsahelis, N., Bosnea, L., Bekatorou, A., Tzia, C., Kanellaki, M., Alcohol production from sterilized and nonsterilized molasses by Saccharomyces cerevisiae immobilized on brewer's spent grains in two types of continuous bioreactor systems. Biomass Bioenergy 45, Kothari, R., Kumar, V., Tyagi, V.V., Assessment of waste treatment and energy recovery from dairy industrial waste by anaerobic digestion. IIOAB, Special issue on Environmental Management for Sustainable development 2, 16. Kothari, R., Pathak, V.V., Kumar, V., Singh, D.P., Experimental study for growth potential of unicellular alga Chlorella pyrenoidosa on dairy waste water: An integrated approach for treatment and biofuel production. Bioresource Technology 116, Kothari, R., Prasad, R., Kumar, V., Singh, D.P., Production of biodiesel from microalgae Chlamydomonas polypyrenoideum grown on dairy industry wastewater. Bioresource Technology 144, Krienitz, L., Huss, V.A.R., Hummer, C., Picoplanktonic Choricystis species (Chlorococcales, Chlorophyta) and problems surrounding the morphologically similar 'Nannochlorislike algae'. Phycologia 35, Krienitz, L., Wirth, M., The high content of polyunsaturated fatty acids in Nannochloropsis limnetica (Eustigmatophyceae) and its implication for food web interactions, freshwater aquaculture and biotechnology. Limnologica 36, Kruse, O., Hankamer, B., Microalgal hydrogen production. Current opinion in biotechnology 21, Kumar, P., Barrett, D.M., Delwiche, M.J., Stroeve, P., Methods for pretreatment of lignocellulosic biomass for efficient hydrolysis and biofuel production. Industrial and Engineering Chemistry Research 48, Lakaniemi, A.M., Intihar, V.M., Tuovinen, O.H., Puhakka, J.A., Growth of Chlorella vulgaris and associated bacteria in photobioreactors. Microb. Biotechnol. 5, Lam, M.K., Lee, K.T., Microalgae biofuels: A critical review of issues, problems and the way forward. Biotechnol. Adv. 30, Laplace, J.M., Delgenes, J.P., Moletta, R., Navarro, J.M., Combined alcoholic fermentation of Dxylose and Dglucose by four selected microbial strains: Process considerations in relation to ethanol tolerance. Biotechnology Letters 13,

281 258 Βιβλιογραφία Lau, P.S., Tam, N.F.Y., Wong, Y.S., Effect of algal density on nutrient removal from primary settled wastewater. Elsevier, pp Lee, C.S., Lee, S.A., Ko, S.R., Oh, H.M., Ahn, C.Y., Effects of photoperiod on nutrient removal, biomass production, and algalbacterial population dynamics in labscale photobioreactors treating municipal wastewater. Water Research 68, Lee, S.H., Ahn, C.Y., Jo, B.H., Lee, S.A., Park, J.Y., An, K.G., Oh, H.M., Increased microalgae growth and nutrient removal using balanced N:P ratio in Wastewater. Journal of Microbiology and Biotechnology 23, Lee, S.K., Chou, H., Ham, T.S., Lee, T.S., Keasling, J.D., Metabolic engineering of microorganisms for biofuels production: from bugs to synthetic biology to fuels. Current opinion in biotechnology 19, Leite, G.B., Hallenbeck, P.C., Engineered Cyanobacteria: Research and Application in Bioenergy. Bioenergy Research: Advances and Applications, pp Levine, R.B., CostanzaRobinson, M.S., Spatafora, G.A., Neochloris oleoabundans grown on anaerobically digested dairy manure for concomitant nutrient removal and biodiesel feedstock production. Biomass Bioenergy 35, Li, Q., Du, W., Liu, D., 2008a. Perspectives of microbial oils for biodiesel production. Applied microbiology and biotechnology 80, Li, T., Zheng, Y., Yu, L., Chen, S., Mixotrophic cultivation of a Chlorella sorokiniana strain for enhanced biomass and lipid production. Biomass Bioenergy 66, Li, Y., Horsman, M., Wu, N., Lan, C.Q., Dubois Calero, N., 2008b. Biofuels from microalgae. Biotechnology progress 24, Liang, K., Zhang, Q., Gu, M., Cong, W., 2013a. Effect of phosphorus on lipid accumulation in freshwater microalga Chlorella sp. Journal of applied phycology 25, Liang, S., Liu, X., Chen, F., Chen, Z., Current microalgal health food R & D activities in China. Asian Pacific Phycology in the 21st Century: Prospects and Challenges. Springer, pp Liang, Y., Sarkany, N., Cui, Y., Biomass and lipid productivities of Chlorella vulgaris under autotrophic, heterotrophic and mixotrophic growth conditions. Biotechnology letters 31, Liang, Z., Liu, Y., Ge, F., Xu, Y., Tao, N., Peng, F., Wong, M., 2013b. Efficiency assessment and ph effect in removing nitrogen and phosphorus by algaebacteria combined system of Chlorella vulgaris and Bacillus licheniformis. Chemosphere 92, Lin, Y., Zhang, W., Li, C., Sakakibara, K., Tanaka, S., Kong, H., Factors affecting ethanol fermentation using Saccharomyces cerevisiae BY4742. Biomass Bioenergy 47, Lincoln, E., Wilkie, A., French, B., Cyanobacterial process for renovating dairy wastewater. Biomass Bioenergy 10, Liu, T., Wang, J., Hu, Q., Cheng, P., Ji, B., Liu, J., Chen, Y., Zhang, W., Chen, X., Chen, L., Gao, L., Ji, C., Wang, H., Attached cultivation technology of microalgae for efficient biomass feedstock production. Bioresource Technology 127, Losel, D., Function of lipids: Specialized roles in fungi and algae. Microbial lipids. Academic,

282 Βιβλιογραφία Lund, J.W.G., Kipling, C., Le Cren, E.D., The inverted microscope method of estimating algal numbers and the statistical basis of estimations by counting. Hydrobiologia 11, Luo, L., He, H., Yang, C., Wen, S., Zeng, G., Wu, M., Zhou, Z., Lou, W., Nutrient removal and lipid production by Coelastrella sp. in anaerobically and aerobically treated swine wastewater. Bioresource technology 216, Ma, X., Zhou, W., Fu, Z., Cheng, Y., Min, M., Liu, Y., Zhang, Y., Chen, P., Ruan, R., Effect of wastewaterborne bacteria on algal growth and nutrients removal in wastewaterbased algae cultivation system. Bioresource Technology 167, 813. Mahadevaswamy, M., Venkataraman, L., Bioconversion of poultry droppings for biogas and algal production. Agricultural Wastes 18, Maiorella, B., Wilke, C.R., Blanch, H., Alcohol production and recovery. Bioenergy. Springer, pp Maity, J.P., Hou, C.P., Majumder, D., Bundschuh, J., Kulp, T.R., Chen, C.Y., Chuang, L.T., Nathan Chen, C.N., Jean, J.S., Yang, T.C., Chen, C.C., The production of biofuel and bioelectricity associated with wastewater treatment by green algae. Energy 78, Makri, A., Bellou, S., Birkou, M., Papatrehas, K., Dolapsakis, N.P., Bokas, D., Papanikolaou, S., Aggelis, G., Lipid synthesized by micro algae grown in laboratory and industrial scale bioreactors. Engineering in Life Sciences 11, Malburg Jr, L., Tamblyn Lee, J., Forsberg, C., Degradation of cellulose and hemicelluloses by rumen microorganisms. Weinheim, Germany: VCH, pp Malcata, F.X., Microalgae and biofuels: a promising partnership? Trends in biotechnology 29, Mallick, N., Biotechnological potential of immobilized algae for wastewater N, P and metal removal: a review. biometals 15, Mara, D., Horan, N.J., Handbook of water and wastewater microbiology. Academic press. Mardikis, M., Nikolaou, A., Djouras, N., Panoutsou, C., Agricultural biomass in Greece: Current and future trends. Biomass and Agriculture: sustainability, markets and policies, Markou, G., Angelidaki, I., Nerantzis, E., Georgakakis, D., Bioethanol production by carbohydrateenriched biomass of Arthrospira (Spirulina) platensis. Energies 6, Markou, G., Chatzipavlidis, I., Georgakakis, D., Cultivation of Arthrospira (Spirulina) platensis in oliveoil mill wastewater treated with sodium hypochlorite. Bioresource Technology 112, Markou, G., Georgakakis, D., Cultivation of filamentous cyanobacteria (bluegreen algae) in agroindustrial wastes and wastewaters: A review. Appl. Energy 88, Markou, G., Vandamme, D., Muylaert, K., Microalgal and cyanobacterial cultivation: The supply of nutrients. Water Research 65, Martıńez, M.E., Sánchez, S., Jiménez, J.M., El Yousfi, F., Muñoz, L., Nitrogen and phosphorus removal from urban wastewater by the microalga Scenedesmus obliquus. Bioresource Technology 73,

283 Βιβλιογραφία Mata, L., Gaspar, H., Santos, R., 2012a. Carbon/nutrient balance in relation to biomass production and halogenated compound content in the red alga Asparagopsis taxiformis (bonnemaisoniaceae) Journal of phycology 48, Mata, T.M., Martins, A.A., Caetano, N.S., Microalgae for biodiesel production and other applications: A review. Renewable Sustainable Energy Rev 14, Mata, T.M., Melo, A.C., Simões, M., Caetano, N.S., 2012b. Parametric study of a brewery effluent treatment by microalgae Scenedesmus obliquus. Bioresource Technology 107, Medeiros, D.L., Sales, E.A., Kiperstok, A., Energy production from microalgae biomass: carbon footprint and energy balance. Journal of Cleaner Production 96, Medipally, S.R., Yusoff, F.M., Banerjee, S., Shariff, M., Microalgae as sustainable renewable energy feedstock for biofuel production. BioMed Research International Mehdikhani, P., Bari, M.R., Hovsepyan, H., Screening of Saccharomyces cerevisiae for high tolerance of ethanol concentration and temperature. African Journal of Microbiology Research 5, Meier, R., Biological cycles in the transformation of solar energy into useful fuels. Solar energy research 23, Meng, X., Yang, J., Xu, X., Zhang, L., Nie, Q., Xian, M., Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renewable energy 34, 15. Mesplé, F., Casellas, C., Troussellier, M., Bontoux, J., Modelling orthophosphate evolution in a high rate algal pond. Ecological modelling 89, Metcalf, E., Inc., wastewater engineering, treatment and reuse. New York: McGrawHill. Michailides, M., Panagopoulos, P., Akratos, C.S., Tekerlekopoulou, A.G., Vayenas, D.V., A full scale system for aerobic biological treatment of olive mill wastewater. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86, Middlebrooks, E.J., Porcella, D.B., Gearheart, R.A., Marshall, G.R., Reynolds, J.H., Grenney, W.J., Techniques for algae removal from wastewater stabilization ponds. Journal (Water Pollution Control Federation), Miller, G.L., Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical chemistry 31, Miranda, J., Passarinho, P.C., Gouveia, L., 2012a. Bioethanol production from Scenedesmus obliquus sugars: the influence of photobioreactors and culture conditions on biomass production. Applied microbiology and biotechnology 96, Miranda, J.R., Passarinho, P.C., Gouveia, L., 2012b. Pretreatment optimization of Scenedesmus obliquus microalga for bioethanol production. Bioresource Technology 104, Mittelbach, M., Remschmidt, C., Biodiesel: the comprehensive handbook. Martin Mittelbach. Mizuno, C.S., Schrader, K.K., Rimando, A.M., Algicidal activity of stilbene analogues. Journal of agricultural and food chemistry 56, Molina, E., Fernandez, J., Acien, F.G., Chisti, Y., Tubular photobioreactor design for algal cultures. Elsevier, pp

284 Βιβλιογραφία Molina Grima, E., Belarbi, E.H., Acién Fernández, F.G., Robles Medina, A., Chisti, Y., Recovery of microalgal biomass and metabolites: Process options and economics. Biotechnol. Adv. 20, Monlau, F., Sambusiti, C., Barakat, A., Quéméneur, M., Trably, E., Steyer, J.P., Carrère, H., Do furanic and phenolic compounds of lignocellulosic and algae biomass hydrolyzate inhibit anaerobic mixed cultures? A comprehensive review. Biotechnol. Adv. 32, MoralesSánchez, D., TinocoValencia, R., Kyndt, J., Martinez, A., Heterotrophic growth of Neochloris oleoabundans using glucose as a carbon source. Biotechnology for Biofuels 6. Morse, G.K., Brett, S.W., Guy, J.A., Lester, J.N., Review: Phosphorus removal and recovery technologies. Sci. Total Environ. 212, Mosse, K., Patti, A., Christen, E., Cavagnaro, T., Review: winery wastewater quality and treatment options in Australia. Australian Journal of Grape and Wine Research 17, Moutin, T., Gal, J., El Halouani, H., Picot, B., Bontoux, J., Decrease of phosphate concentration in a high rate pond by precipitation of calcium phosphate: theoretical and experimental results. Water Research 26, Mujtaba, G., Choi, W., Lee, C.G., Lee, K., Lipid production by Chlorella vulgaris after a shift from nutrientrich to nitrogen starvation conditions. Bioresource technology 123, Mulbry, W., Kondrad, S., Buyer, J., 2008a. Treatment of dairy and swine manure effluents using freshwater algae: Fatty acid content and composition of algal biomass at different manure loading rates. Journal of Applied Phycology 20, Mulbry, W., Kondrad, S., Pizarro, C., KebedeWesthead, E., 2008b. Treatment of dairy manure effluent using freshwater algae: Algal productivity and recovery of manure nutrients using pilotscale algal turf scrubbers. Bioresource Technology 99, Mulbry, W., Westhead, E.K., Pizarro, C., Sikora, L., Recycling of manure nutrients: use of algal biomass from dairy manure treatment as a slow release fertilizer. Bioresource technology 96, Muñoz, R., Guieysse, B., Algalbacterial processes for the treatment of hazardous contaminants: A review. Water Research 40, Mur, R., Skulberg, O.M., Utkilen, H., Cyanobacteria in the environment Naik, S.N., Goud, V.V., Rout, P.K., Dalai, A.K., Production of first and second generation biofuels: a comprehensive review. Renewable Sustainable Energy Rev 14, Najafpour, G., Younesi, H., Syahidah Ku Ismail, K., Ethanol fermentation in an immobilized cell reactor using Saccharomyces cerevisiae. Bioresource Technology 92, Nascimento, I.A., Cabanelas, I.T.D., dos Santos, J.N., Nascimento, M.A., Sousa, L., Sansone, G., Biodiesel yields and fuel quality as criteria for algalfeedstock selection: Effects of CO 2 supplementation and nutrient levels in cultures. Algal Research 8, Nations, U., Kyoto protocol to the united nations framework convention on climate change. Nautiyal, S., Rao, K., Kaechele, H., Raju, K., Schaldach, R., Knowledge Systems of Societies for Adaptation and Mitigation of Impacts of Climate 261

285 262 Βιβλιογραφία Change: Prologue. Knowledge Systems of Societies for Adaptation and Mitigation of Impacts of Climate Change. Springer, pp. 16. Nguyen, M.T., Choi, S.P., Lee, J., Lee, J.H., Sim, S.J., Hydrothermal acid pretreatment of Chlamydomonas reinhardtii biomass for ethanol production. Journal of Microbiology and Biotechnology 19, Niaounakis, M., Halvadakis, C.P., Olivemill waste management: literature review and patent survey. Dardanos. Nicolella, C., Van Loosdrecht, M., Heijnen, J., Wastewater treatment with particulate biofilm reactors. Journal of biotechnology 80, 133. Nurdogan, Y., Oswald, W.J., Enhanced nutrient removal in highrate ponds. Water science and technology 31, Olguín, E.J., Dual purpose microalgaebacteriabased systems that treat wastewater and produce biodiesel and chemical products within a Biorefinery. Biotechnol. Adv. 30, Olofsson, K., Palmqvist, B., Lidén, G., Improving simultaneous saccharification and cofermentation of pretreated wheat straw using both enzyme and substrate feeding. Biotechnology for biofuels 3, 1. Orchard, B., Denis, J., Cousins, J., Developments in biofuel processing technologies. World Pumps 2007, Oswald, W., Gotaas, H., Golueke, C., Kellen, W., Gloyna, E., Hermann, E., Algae in waste treatment [with discussion]. Sewage and Industrial Wastes 29, Oswald, W.J., Golueke, C.G., Biological transformation of solar energy. Advances in applied microbiology 2, Palmqvist, E., Almeida, J.S., Hahn Hägerdal, B., Influence of furfural on anaerobic glycolytic kinetics of Saccharomyces cerevisiae in batch culture. Biotechnol. Bioeng. 62, Palmqvist, E., HahnHägerdal, B., Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. II: inhibitors and mechanisms of inhibition. Bioresource Technology 74, Papanikolaou, S., Aggelis, G., Biotechnological valorization of biodiesel derived glycerol waste through production of single cell oil and citric acid by Yarrowia lipolytica. Lipid technology 21, Paraskeva, P., Diamadopoulos, E., Technologies for olive mill wastewater (OMW) treatment: a review. J. Chem. Technol. Biotechnol. 81, PardoCárdenas, Y., HerreraOrozco, I., GonzálezDelgado, Á.D., Kafarov, V., Environmental assessment of microalgae biodiesel production in Colombia: Comparison of three oil extraction systems. CT&FCiencia, Tecnología y Futuro 5, Pasqualino, J.C., Montane, D., Salvado, J., Synergic effects of biodiesel in the biodegradability of fossilderived fuels. Biomass Bioenergy 30, Perego, C., From biomass to advanced biofuel: the greendiesel case. Centre for Renewable Energy and Environmnental Research, Bologna. PerezGarcia, O., Escalante, F.M.E., debashan, L.E., Bashan, Y., Heterotrophic cultures of microalgae: Metabolism and potential products. Water Research 45, PérezMartínez, C., SánchezCastillo, P., JiménezPérez, M.V., Utilization of immobilized benthic algal species for N and P removal. Journal of applied phycology 22, Philippopoulos, C.D., Papadakis, M.T., Current trends in whey processing and utilization in Greece. International journal of dairy technology 54, 1419.

286 Βιβλιογραφία Pintado, M., Macedo, A., Malcata, F., Review: technology, chemistry and microbiology of whey cheeses. Pinto, G., Pollio, A., Previtera, L., Stanzione, M., Temussi, F., Removal of low molecular weight phenols from olive oil mill wastewater using microalgae. Biotechnology Letters 25, Pires, J., AlvimFerraz, M., Martins, F., Simões, M., Wastewater treatment to enhance the economic viability of microalgae culture. Environmental Science and Pollution Research 20, Pittman, J.K., Dean, A.P., Osundeko, O., The potential of sustainable algal biofuel production using wastewater resources. Bioresource Technology 102, Plessas, S., Bekatorou, A., Koutinas, A.A., Soupioni, M., Banat, I.M., Marchant, R., Use of Saccharomyces cerevisiae cells immobilized on orange peel as biocatalyst for alcoholic fermentation. Bioresource Technology 98, Posadas, E., GarcíaEncina, P.A., Soltau, A., Domínguez, A., Díaz, I., Muñoz, R., Carbon and nutrient removal from centrates and domestic wastewater using algal bacterial biofilm bioreactors. Bioresource technology 139, Posten, C., Schaub, G., Microalgae and terrestrial biomass as source for fuelsa process view. Journal of biotechnology 142, Pouliot, Y., Buelna, G., Racine, C., De la Noüe, J., Culture of cyanobacteria for tertiary wastewater treatment and biomass production. Biological wastes 29, Preiss, M.R., Kowalski, S.P., Algae and Biodiesel: Patenting energized as green goes commercial. Journal of Commercial Biotechnology 16, Pulz, O., Photobioreactors: production systems for phototrophic microorganisms. Appl Microbiol Biotechnol 57, Qin, L., Shu, Q., Wang, Z., Shang, C., Zhu, S., Xu, J., Li, R., Zhu, L., Yuan, Z., Cultivation of Chlorella vulgaris in dairy wastewater pretreated by UV irradiation and sodium hypochlorite. Applied Biochemistry and Biotechnology 172, Rajeshwari, K.V., Balakrishnan, M., Kansal, A., Lata, K., Kishore, V.V.N., Stateoftheart of anaerobic digestion technology for industrial wastewater treatment. Renewable Sustainable Energy Rev 4, Ratledge, C., Single cell oil. Enzyme and Microbial Technology 4, Raven, J., Functions of lipids: lipids of the photosynthetic apparatus. Microbial lipids 2, Rawat, I., Ranjith Kumar, R., Mutanda, T., Bux, F., Dual role of microalgae: Phycoremediation of domestic wastewater and biomass production for sustainable biofuels production. Appl. Energy 88, Razon, L.F., Tan, R.R., Net energy analysis of the production of biodiesel and biogas from the microalgae: Haematococcus pluvialis and Nannochloropsis. Appl. Energy 88, Razzak, S.A., Hossain, M.M., Lucky, R.A., Bassi, A.S., de Lasa, H., Integrated CO 2 capture, wastewater treatment and biofuel production by microalgae culturing A review. Renewable Sustainable Energy Rev 27, Renewable Fuels Association (RFA), Ethanol Industry Outlook: Climate of Opportunity Resurreccion, E.P., Colosi, L.M., White, M.A., Clarens, A.F., Comparison of algae cultivation methods for bioenergy production using a combined life cycle 263

287 Βιβλιογραφία assessment and life cycle costing approach. Bioresource Technology 126, Richmond, A., ChengWu, Z., Optimization of a flat plate glass reactor for mass production of Nannochloropsis sp. outdoors. Elsevier, pp Rispoli, G., Producing premium biofules in EuropeEni's perspective. Geneva. Rittmann, B.E., Opportunities for renewable bioenergy using microorganisms. Biotechnol. Bioeng. 100, Rodolfi, L., Zittelli, G.C., Bassi, N., Padovani, G., Biondi, N., Bonini, G., Tredici, M.R., Microalgae for oil: Strain selection, induction of lipid synthesis and outdoor mass cultivation in a lowcost photobioreactor. Biotechnol. Bioeng. 102, Rodrigues, A., Oliveira, J.S., Treatment of wastewaters from the tomato concentrate industry in high rate algal ponds. Water Science and Technology 19, Rós, P., Da, C., Silva, C.S., SilvaStenico, M.E., Fiore, M.F., Castro, H.F.D., Assessment of chemical and physicochemical properties of cyanobacterial lipids for biodiesel production. Marine drugs 11, Roychoudhury, P., Kaushik, B., Krishnamurthy, G., Venkataraman, G., Effect of bluegreen algae and azolla application on the aggregation status of the soil. Current Science. Ruggieri, L., Cadena, E., MartínezBlanco, J., Gasol, C.M., Rieradevall, J., Gabarrell, X., Gea, T., Sort, X., Sánchez, A., Recovery of organic wastes in the Spanish wine industry. Technical, economic and environmental analyses of the composting process. Journal of Cleaner Production 17, Russell, N., Functions of lipids: structural roles and membrane functions. Microbial lipids 2, RWE, P., RWE S algae project in BergheimNiederaussem Ryan, C., Green, T.B., Hartley, A., Browning, B., Garvin, C., Cultivation Clean Energy: The Promise of Algae Biofuels. Sabater, S., Guasch, H., Romaní, A., Muñoz, I., The effect of biological factors on the efficiency of river biofilms in improving water quality. Hydrobiologia 469, Safonova, E., Kvitko, K., Iankevitch, M., Surgko, L., Afti, I., Reisser, W., Biotreatment of Industrial Wastewater by Selected Algal Bacterial Consortia. Engineering in life sciences 4, Saha, B.C., Iten, L.B., Cotta, M.A., Wu, Y.V., Dilute acid pretreatment, enzymatic saccharification, and fermentation of rice hulls to ethanol. Biotechnology Progress 21, Sahoo, D., Elangbam, G., Devi, S.S., Using algae for carbon dioxide capture and biofuel production to combat climate change. Phykos 42, SanchezSilva, L., LópezGonzález, D., GarciaMinguillan, A., Valverde, J., Pyrolysis, combustion and gasification characteristics of Nannochloropsis gaditana microalgae. Bioresource technology 130, Sánchez, S., Martínez, M.E., Espejo, M.T., Pacheco, R., Espinola, F., Hodaifa, G., Mixotrophic culture of Chlorella pyrenoidosa with olivemill wastewater as the nutrient medium. Journal of Applied Phycology 13, Sánchez Villasclaras, S., Martínez Sancho, M.E., Espejo Caballero, M.T., Delgado Pérez, A., Production of microalgae from olive mill wastewater. International Biodeterioration & Biodegradation 38,

288 Βιβλιογραφία Sarris, D., Giannakis, M., Philippoussis, A., Komaitis, M., Koutinas, A.A., Papanikolaou, S., Conversions of olive mill wastewater based media by Saccharomyces cerevisiae through sterile and non sterile bioprocesses. J. Chem. Technol. Biotechnol. 88, Sarris, D., Kotseridis, Y., Linga, M., Galiotou Panayotou, M., Papanikolaou, S., Enhanced ethanol production, volatile compound biosynthesis and fungicide removal during growth of a newly isolated Saccharomyces cerevisiae strain on enriched pasteurized grape musts. Engineering in Life Sciences 9, Sarris, D., Matsakas, L., Aggelis, G., Koutinas, A.A., Papanikolaou, S., Aerated vs nonaerated conversions of molasses and olive mill wastewaters blends into bioethanol by Saccharomyces cerevisiae under nonaseptic conditions. Industrial Crops and Products 56, Sawyer, C., Carty, M., PL,'PARKIN, GF" Chemistry for environmental Engineering. Mc GrawHill International Editions, Civil Engineering Series. Sayadi, S., Allouche, N., Jaoua, M., Aloui, F., Detrimental effects of high molecularmass polyphenols on olive mill wastewater biotreatment. Process Biochemistry 35, Schenk, P.M., ThomasHall, S.R., Stephens, E., Marx, U.C., Mussgnug, J.H., Posten, C., Kruse, O., Hankamer, B., Second generation biofuels: highefficiency microalgae for biodiesel production. Bioenergy research 1, SchlarbRidley, B., Algal research in the UK. BBSRC. Schmidt, M., Synthetic biology: industrial and environmental applications. John Wiley & Sons. Schneider, R.C., Lobo, E.A., Souza, M.P., Gressler, P.D., Bjerk, T.R., Corbellini, V.A., Potential production of biofuel from microalgae biomass produced in wastewater. INTECH Open Access Publisher. Sedlak, M., Ho, N.W., Production of ethanol from cellulosic biomass hydrolysates using genetically engineered Saccharomyces yeast capable of cofermenting glucose and xylose. Proceedings of the TwentyFifth Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals Held May 4 7, 2003, in Breckenridge, CO. Springer, pp Segneanu, A.E., Cziple, F., Vlazan, P., Sfirloaga, P., Grozescu, I., Gherman, V.D., Biomass extraction methods. Biomass Now Sustainable Growth and Use. Intech. Sharma, K.K., Schuhmann, H., Schenk, P.M., High lipid induction in microalgae for biodiesel production. Energies 5, Sheehan, J., Dunahay, T., Benemann, J., Roessler, P., A Look Back at the U.S. Department of Energy's Aquatic Species ProgramBiodiesel from Algae NREL ReportNREL/TP Shi, J., SharmaShivappa, R.R., Chinn, M., Howell, N., Effect of microbial pretreatment on enzymatic hydrolysis and fermentation of cotton stalks for ethanol production. Biomass Bioenergy 33, Shi, S., Valle Rodríguez, J.O., Siewers, V., Nielsen, J., Prospects for microbial biodiesel production. Biotechnology journal 6, Shimako, A.H., TirutaBarna, L., Pigné, Y., Benetto, E., Navarrete Gutiérrez, T., Guiraud, P., Ahmadi, A., Environmental assessment of bioenergy production from microalgae based systems. Journal of Cleaner Production 139,

289 Βιβλιογραφία Shin, D.Y., Cho, H.U., Utomo, J.C., Choi, Y.N., Xu, X., Park, J.M., Biodiesel production from Scenedesmus bijuga grown in anaerobically digested food wastewater effluent. Bioresource Technology 184, Silaban, A., Bai, R., GutierrezWing, M.T., Negulescu, I.I., Rusch, K.A., Effect of organic carbon, C: N ratio and light on the growth and lipid productivity of microalgae/cyanobacteria coculture. Engineering in Life Sciences 14, Singh, A., Nigam, P.S., Murphy, J.D., 2011a. Renewable fuels from algae: an answer to debatable land based fuels. Bioresource Technology 102, Singh, J., Thakur, I.S., Evaluation of cyanobacterial endolith Leptolyngbya sp. ISTCY101, for integrated wastewater treatment and biodiesel production: A toxicological perspective. Algal Research 11, Singh, J., Tripathi, R., Thakur, I.S., Characterization of endolithic cyanobacterial strain, Leptolyngbya sp. ISTCY101, for prospective recycling of CO 2 and biodiesel production. Bioresource Technology 166, Singh, M., Reynolds, D.L., Das, K.C., 2011b. Microalgal system for treatment of effluent from poultry litter anaerobic digestion. Bioresource Technology 102, Siqueira, P.F., Karp, S.G., Carvalho, J.C., Sturm, W., RodríguezLeón, J.A., Tholozan, J.L., Singhania, R.R., Pandey, A., Soccol, C.R., Production of bioethanol from soybean molasses by Saccharomyces cerevisiae at laboratory, pilot and industrial scales. Bioresource Technology 99, Siso, M.G., The biotechnological utilization of cheese whey: a review. Bioresource Technology 57, 111. Slade, R., Bauen, A., Microalgae cultivation for biofuels: cost, energy balance, environmental impacts and future prospects. Biomass Bioenergy 53, Smith, C., Higson, A., Research Needs in Ecosystem Services to Support Algal Biofuels, Bioenergy and Commodity Chemicals Production in the UK. In: NNFCC (Ed.), Heslington, UK. Sobczuk, T.M., Chisti, Y., Potential fuel oils from the microalga Choricystis minor. J. Chem. Technol. Biotechnol. 85, Soletto, D., Binaghi, L., Lodi, A., Carvalho, J.C.M., Converti, A., Batch and fedbatch cultivations of Spirulina platensis using ammonium sulphate and urea as nitrogen sources. Elsevier, pp Soratana, K., Landis, A.E., Evaluating industrial symbiosis and algae cultivation from a life cycle perspective. Bioresource Technology 102, Spoehr, H.A., Milner, H.W., The chemical composition of Chlorella; effect of environmental conditions. Plant Physiology 24, Spolaore, P., JoannisCassan, C., Duran, E., Isambert, A., Commercial applications of microalgae. Journal of bioscience and bioengineering 101, Su, Y., Mennerich, A., Urban, B., Municipal wastewater treatment and biomass accumulation with a wastewaterborn and settleable algalbacterial culture. Water Research 45, Subashchandrabose, S.R., Ramakrishnan, B., Megharaj, M., Venkateswarlu, K., Naidu, R., Consortia of cyanobacteria/microalgae and bacteria: Biotechnological potential. Biotechnol. Adv. 29, Sukačová, K., Trtílek, M., Rataj, T., Phosphorus removal using a microalgal biofilm in a new biofilm photobioreactor for tertiary wastewater treatment. Water Research 71,

290 Βιβλιογραφία Sultana, M.Y., Mourti, C., Tatoulis, T., Akratos, C.S., Tekerlekopoulou, A.G., Vayenas, D.V., Effect of hydraulic retention time, temperature, and organic load on a horizontal subsurface flow constructed wetland treating cheese whey wastewater. J. Chem. Technol. Biotechnol. 91, Sun, F., Chen, H., Enhanced enzymatic hydrolysis of wheat straw by aqueous glycerol pretreatment. Bioresource Technology 99, Sun, Y., Cheng, J.J., Dilute acid pretreatment of rye straw and bermudagrass for ethanol production. Bioresource Technology 96, Suutari, M., Rintamäki, A., Laakso, S., Membrane phospholipids in temperature adaptation of Candida utilis: alterations in fatty acid chain length and unsaturation. Journal of lipid research 38, Syassen, O., The development potential of diesel engines with Biodiesel as fuel. Proceedings of the Second European Motor Biofuels Forum Graz, Austria. Takagi, M., Yoshida, T., Effect of salt concentration on intracellular accumulation of lipids and triacylglyceride in marine microalgae Dunaliella cells. Journal of bioscience and bioengineering 101, Takahashi, F., Ortega, E., Assessing the sustainability of Brazilian oleaginous crops possible raw material to produce biodiesel. Energy Policy 38, Tang, H., Abunasser, N., Garcia, M.E.D., Chen, M., Ng, K.Y.S., Salley, S.O., Potential of microalgae oil from Dunaliella tertiolecta as a feedstock for biodiesel. Elsevier, pp Taşkan, E., Performance of mixed algae for treatment of slaughterhouse wastewater and microbial community analysis. Environmental Science and Pollution Research 23, Tatoulis, T.I., Tekerlekopoulou, A.G., Akratos, C.S., Pavlou, S., Vayenas, D.V., Aerobic biological treatment of second cheese whey in suspended and attached growth reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 90, Teixeira, M.R., Rosa, M.J., Comparing dissolved air flotation and conventional sedimentation to remove cyanobacterial cells of Microcystis aeruginosa: part I: the key operating conditions. Separation and Purification Technology 52, Thajuddin, N., Subramanian, G., Cyanobacterial biodiversity and potential applications in biotechnology. TomasPejo, E., Oliva, J., Ballesteros, M., Realistic approach for fullscale bioethanol production from lignocellulose: a review. Travieso, L., Benítez, F., Sánchez, E., Borja, R., León, M., Raposo, F., Rincón, B., Assessment of a microalgae pond for post treatment of the effluent from an anaerobic fixed bed reactor treating distillery wastewater. Environmental technology 29, Travieso, L., Benitez, F., Sanchez, E., Borja, R., Colmenarejo, M.F., Production of biomass (algaebacteria) by using a mixture of settled swine and sewage as substrate. Journal of Environmental Science and Health Part A Toxic/Hazardous Substances and Environmental Engineering 41, Tricolici, O., Bumbac, C., Postolache, C., Microalgaebacteria system for biological wastewater treatment. J. Environ. Prot. Ecol. 15, Tziotzios, G., Michailakis, S., Vayenas, D., Aerobic biological treatment of olive mill wastewater by olive pulp bacteria. International Biodeterioration & Biodegradation 60,

291 Βιβλιογραφία Ueno, Y., Kurano, N., Miyachi, S., Ethanol production by dark fermentation in the marine green alga, Chlorococcum littorale. Journal of Fermentation and Bioengineering 86, Ugwu, C.U., Aoyagi, H., Uchiyama, H., Photobioreactors for mass cultivation of algae. Elsevier, pp Ummalyma, S.B., Sukumaran, R.K., Cultivation of microalgae in dairy effluent for oil production and removal of organic pollution load. Bioresource Technology. UNEEN14214, Automotive fuels Fatty acid methyl esters (FAME) for diesel engines Requirements and test methods. Great Britain: BSI British Standards Institution, London. Valigore, J.M., Gostomski, P.A., Wareham, D.G., O'Sullivan, A.D., Effects of hydraulic and solids retention times on productivity and settleability of microbial (microalgalbacterial) biomass grown on primary treated wastewater as a biofuel feedstock. Water Research 46, Vamvakaki, A.N., Kandarakis, I., Kaminarides, S., Komaitis, M., Papanikolaou, S., Cheese whey as a renewable substrate for microbial lipid and biomass production by Zygomycetes. Engineering in Life Sciences 10, Van Den Hende, S., Vervaeren, H., Desmet, S., Boon, N., 2011a. Bioflocculation of microalgae and bacteria combined with flue gas to improve sewage treatment. New biotechnology 29, Van Den Hende, S., Vervaeren, H., Saveyn, H., Maes, G., Boon, N., 2011b. Microalgal bacterial floc properties are improved by a balanced inorganic/organic carbon ratio. Biotechnol. Bioeng. 108, Van Haandel, A.C., Lettinga, G., Anaerobic sewage treatment: a practical guide for regions with a hot climate. John Wiley & Sons. van Iersel, S., Gamba, L., Rossi, A., Alberici, S., Dehue, B., Van de Staaij, J., Flammini, A., Algaebased biofuels: a review of challenges and opportunities for developing countries. Italy: Food and agriculture Organization of the Unites Nations. Van Kasteren, J., Nisworo, A., A process model to estimate the cost of industrial scale biodiesel production from waste cooking oil by supercritical transesterification. Resources, Conservation and Recycling 50, Van Wagenen, J., Pape, M.L., Angelidaki, I., Characterization of nutrient removal and microalgal biomass production on an industrial wastestream by application of the decelerationstat technique. Water Research 75, Varnam, A., Evans, M., Environmental microbiology. CRC Press, London. Vidal, G., Carvalho, A., Mendez, R., Lema, J., Influence of the content in fats and proteins on the anaerobic biodegradability of dairy wastewaters. Bioresource Technology 74, Von Blottnitz, H., Curran, M.A., A review of assessments conducted on bioethanol as a transportation fuel from a net energy, greenhouse gas, and environmental life cycle perspective. Journal of cleaner production 15, Walker, T.L., Purton, S., Becker, D.K., Collet, C., Microalgae as bioreactors. Plant cell reports 24, Wang, J., Yang, H., Wang, F., Mixotrophic cultivation of microalgae for biodiesel production: Status and prospects. Applied Biochemistry and Biotechnology 172,

292 269 Βιβλιογραφία Wang, L., Min, M., Li, Y., Chen, P., Chen, Y., Liu, Y., Wang, Y., Ruan, R., Cultivation of green algae Chlorella sp. in different wastewaters from municipal wastewater treatment plant. Applied biochemistry and biotechnology 162, Wang, M., Wang, J., Tan, J.X., 2011a. Lignocellulosic Bioethanol: Status and Prospects. Energy Sources, Part A: Recovery, Utilization, and Environmental Effects 33, Wang, X., Liu, X., Wang, G., 2011b. Two stage Hydrolysis of Invasive Algal Feedstock for Ethanol Fermentation. Journal of Integrative Plant Biology 53, Wen, S., Liu, H., He, H., Luo, L., Li, X., Zeng, G., Zhou, Z., Lou, W., Yang, C., Treatment of anaerobically digested swine wastewater by Rhodobacter blasticus and Rhodobacter capsulatus. Bioresource Technology 222, Wiley, P.E., Brenneman, K.J., Jacobson, A.E., Improved algal harvesting using suspended air flotation. Water Environment Research 81, Wilkie, A.C., Mulbry, W.W., Recovery of dairy manure nutrients by benthic freshwater algae. Bioresource Technology 84, Witsch, H.v., Physiologischer Zustand und Wachstumsintensität bei Chlorella. Archiv für Mikrobiologie 14, Woertz, I., Feffer, A., Lundquist, T., Nelson, Y., Algae grown on dairy and municipal wastewater for simultaneous nutrient removal and lipid production for biofuel feedstock. Journal of Environmental Engineering 135, Wogan, D.M., Da Silva, A.K., Webber, M.E., Stautberg, E., Algae: pond powered biofuels. p. 23. Wu, L.F., Chen, P.C., Huang, A.P., Lee, C.M., The feasibility of biodiesel production by microalgae using industrial wastewater. Bioresource Technology 113, Wu, Y., Hu, Z., Yang, L., Graham, B., Kerr, P.G., The removal of nutrients from nonpoint source wastewater by a hybrid bioreactor. Bioresource Technology 102, Xu, H., Miao, X., Wu, Q., High quality biodiesel production from a microalga Chlorella protothecoides by heterotrophic growth in fermenters. Journal of biotechnology 126, Xu, X.Q., Beardall, J., Effect of salinity on fatty acid composition of a green microalga from an antarctic hypersaline lake. Phytochemistry 45, Yang, B., Wyman, C.E., BSA treatment to enhance enzymatic hydrolysis of cellulose in lignin containing substrates. Biotechnol. Bioeng. 94, Yang, C., Jia, L., Chen, C., Liu, G., Fang, W., Biooil from hydroliquefaction of Dunaliella salina over Ni/REHY catalyst. Bioresource Technology 102, Zamalloa, C., Boon, N., Verstraete, W., Decentralized twostage sewage treatment by chemical biological flocculation combined with microalgae biofilm for nutrient immobilization in a roof installed parallel plate reactor. Bioresource technology 130, Zhang, G., French, W.T., Hernandez, R., Alley, E., Paraschivescu, M., Effects of furfural and acetic acid on growth and lipid production from glucose and xylose by Rhodotorula glutinis. Biomass Bioenergy 35, Zhang, Q., Feldman, M., Peterson, C., Diesel engine durability when fueled with methyl ester of winter rapeseed oil. Paper, American Society of Agricultural Engineers.

293 Βιβλιογραφία Zhang, Q., Hu, G., Effect of nitrogen to phosphorus ratios on cell proliferation in marine micro algae. Chinese Journal of Oceanology and Limnology 29, Zheng, Y., Twostage heterotrophic and phototrophic culture technology for microalgal biofuel production. Washington State University. Zheng, Y., Pan, Z., Zhang, R., Overview of biomass pretreatment for cellulosic ethanol production. International journal of agricultural and biological engineering 2, Zhou, Q., Zhang, P., Zhang, G., Biomass and carotenoid production in photosynthetic bacteria wastewater treatment: Effects of light intensity. Bioresource Technology 171, Zhu, L., Hiltunen, E., Antila, E., Zhong, J., Yuan, Z., Wang, Z., Microalgal biofuels: flexible bioenergies for sustainable development. Renewable Sustainable Energy Rev 30, Zhu, L., Ketola, T., Microalgae production as a biofuel feedstock: risks and challenges. International Journal of Sustainable Development & World Ecology 19, Zhu, L., Wang, Z., Shu, Q., Takala, J., Hiltunen, E., Feng, P., Yuan, Z., Nutrient removal and biodiesel production by integration of freshwater algae cultivation with piggery wastewater treatment. Water Research 47, Ηλεκτρονικές πηγές ated_allrounders.html

294 Παράρτημα 8. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Διαλυτό Χημικά Απαιτούμενο Οξυγόνο (dcod) Το COD παριστά την ποσότητα του οξυγόνου που καταναλώνεται για τη χημική οξείδωση των οργανικών ενώσεων, οι οποίες περιέχονται τόσο στα υγρά απόβλητα όσο και στα φυσικά νερά. Η οξείδωση γίνεται με διχρωμικό κάλιο σε όξινο περιβάλλον και τα αποτελέσματα εκφράζονται σε mg Ο 2 /L. Η αντίδραση οξείδωσης του οργανικού υλικού από τα διχρωμικά ιόντα περιγράφεται από την εξίσωση: C a H b O c + ccr 2 O cH + 2Cr 3+ + nco 2 + (a/2+4c)h 2 O όπου c=2/3n+a/6b/3. Αντιδραστήρια Διάλυμα Χώνευσης με υπεροξείδιο του διχρωμικού καλίου (K 2 Cr 2 O 7 ) Σε φιάλη των 1000 ml προσθέτουμε: 500 ml απιονισμένο νερό gr Κ 2 Cr 2 O 7 (που έχει υποστεί ξήρανση στους 150 ο C για 2h). 167 ml H 2 SO gr HgSO 4 (ανάδευση με θέρμανση). Αραίωση με απιονισμένο νερό μέχρι όγκου 1000 ml (ανάδευση με θέρμανση). Διατηρείται στο ψυγείο σε σκοτεινή φιάλη Καταλύτης, πυκνό 96%, H 2 SO 4 με Ag. Σε πυκνό H 2 SO 4 προστίθεται Ag 2 SO 4 σε αναλογία 5.5 gr Ag 2 SO 4 / kg H 2 SO 4. Αφήνεται να διαλυθεί με ανάδευση. Μέθοδος Ο προσδιορισμός του χημικά απαιτούμενου οξυγόνου πραγματοποιείται με την εξής διαδικασία: Σε δύο φιαλίδια προσθέτονται από 2 ml διαλύματος σε κατάλληλη αραίωση και απιονισμένο νερό (τυφλό δείγμα). Σε όλα τα φιαλίδια προσθέτονται 1.2 ml διάλυμα χώνευσης και 2.8 ml καταλύτη. 271

295 Παράρτημα Ακολουθεί ισχυρή ανάδευση (Vortex). Τα φιαλίδια τοποθετούνται στον χωνευτή του COD (150 ο C) για 2 h. Βγάζουμε τα φιαλίδια και ανοίγουμε τα καπάκια (αποσυμπίεση) και τα ξανακλείνουμε, περιμένοντας 10 min να κρυώσουν. Ακολουθεί ισχυρή ανάδευση (Vortex). Μετρούνται οι απορροφήσεις στο φωτόμετρο COD. Ο υπολογισμός των συγκεντρώσεων γίνεται από την παρακάτω εξίσωση: dcod (mg/l) = [Ο.Α. δείγμα] (x) Αραίωση Ο.Α.: οπτική απορρόφηση των δειγμάτων που δείχνει το φωτόμετρο COD Προσδιορισμός πολυσακχαριτών Η μέθοδος περιλαμβάνει γυάλινους δοκιμαστικούς σωλήνες με: i. 1ml δείγμα, ii. 1ml φαινόλη 5% w/v, σε λιγότερο από 30sec, προστίθεται στη συνέχεια iii. 5ml πυκνό H 2 SO 4 (9598%, v/v) iv. Ακολουθεί ανάδευση με vortex και παραμονή 10 min σε ηρεμία. v. Επανάληψη ανάδευσης και παραμονή σε ηρεμία για 20 min. vi. Μέτρηση οπτικής απορρόφησης (Abs) και υπολογισμός συγκέντρωσης (mg/l) Κατασκευή Πρότυπης καμπύλης Για την κατασκευή της καμπύλης βαθμονόμησης του αμύλου παρασκευάζονται 6 πρότυπα διαλύματα διαφορετικής συγκέντρωσης αμύλου. Πρότυπο Διάλυμα 1 συγκέντρωσης 0.12 g starch/l Σε ζυγό ακριβείας ζυγίζεται ποσότητα g αμύλου. Η ποσότητα αυτή μεταφέρεται σε ποτήρι ζέσεως των 100 ml και διαλύεται σε απιονισμένο νερό μέχρι τα 100 ml. Πρότυπο Διάλυμα 2 συγκέντρωσης g starch/l 1 ml από το Διάλυμα 1 αραιώνεται σε 9 ml απιονισμένο νερό. Σύμφωνα με το νόμο της αραίωσης: C 1 * V 1 = C 2 * V 2 0,12g/L * 0.001L = C 2 * 0.01L C 2 = g starch/l Πρότυπο Διάλυμα 3 συγκέντρωσης g starch/l 2 ml από το Διάλυμα 1 αραιώνεται σε 8 ml απιονισμένο νερό. Πρότυπο Διάλυμα 4 συγκέντρωσης g starch/l 272

296 Concentration(g/L) Παράρτημα 4 ml από το Διάλυμα 1 αραιώνεται σε 6ml απιονισμένο νερό. Πρότυπο Διάλυμα 5 συγκέντρωσης g starch/l 6 ml από το Διάλυμα 1 αραιώνεται σε 4 ml απιονισμένο νερό. Πρότυπο Διάλυμα 6 συγκέντρωσης g starch/l 8 ml από το Διάλυμα 1 αραιώνεται σε 2 ml απιονισμένο νερό. Χρησιμοποιούμε ζεστό νερό (6070 ο C). Τα διαλύματα αναδεύονται για 1 ώρα περίπου. Στη συνέχεια κατασκευάζεται η πρότυπη καμπύλη. 0,12 0,10 Equation y = a + b*x Adj. RSquare 0,99966 Value Standard Error B Intercept 0 B Slope 0, ,13938E4 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Abs(490nm) Κατασκευή πρότυπης καμπύλης αναγόντων σακχάρων Ο προσδιορισμός των αναγόντων σακχάρων (γλυκόζη) πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο 3.5 dinitrosalicylic acid, DNS (Miller, 1959). Παρασκευή διαλύματος DNS 1. Ζύγιση 1.6g NaOH και διάλυσή του σε 20ml απιονισμένο νερό 2. Ζύγιση 1g DNS (3.5 dinitrosalicylic acid) 3. Ζύγιση 40.3g τρυγικό κάλιονάτριο (sodium tatrate terahydrate) Σε ποτήρι ζέσεως όγκου 100ml προστέθηκαν κατά σειρά τα εξής: 1. 50ml νερό 2. 20ml διαλύματος NaOH 3. Τοποθέτηση διαλύματος σε θερμαινόμενο αναδευτήρα σε χαμηλή θερμοκρασία (40 o C) 4. Προσθήκη με αργό ρυθμό DNS και τρυγικό κάλιονάτριο 5. Ογκομέτρηση μέχρι τα 100 ml 273

297 Παράρτημα Πειραματική διαδικασία 1. Σε γυάλινους δοκιμαστικούς σωλήνες μεταφέρουμε 0.5ml δείγματος και 0.5ml αντιδραστηρίου DNS και αναδεύονται. 2. Τα δείγματα μεταφέρονται για 510 min σε υδατόλουτρο στους C. 3. Τα δείγματα ψύχονται αμέσως στους 25 0 C. 4. Προσθέτουμε 5 ml απιονισμένο νερό. 5. Ανάδευση στο vortex. 6. Μέτρηση της οπτικής απορρόφηση (Abs) στο φασματοφωτόμετρο στα 540 nm. Πρότυπη καμπύλη Έχοντας παρασκευάσει το Stock και το Standard διάλυμα, επιλέγεται και η αντίστοιχη περιοχή συγκεντρώσεων για τα πρότυπα διαλύματα. Στη συνέχεια κατασκευάζεται η γραφική παράσταση, έχοντας στον άξονα y τις τιμές των συγκεντρώσεων και στον άξονα x τις αντίστοιχες τιμές των απορροφήσεων. 2,5 Equation y = a + b*x Adj. RSquare 0,99909 Value Standard Error B Intercept 0 B Slope 1, ,01772 y=1,85805x 2,0 Γλυκόζη (g/l) 1,5 1,0 0,5 0,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 Απορρόφηση (540nm) Κατασκευή πρότυπης καμπύλης νιτρικού αζώτου Σε ζυγό ακριβείας ζυγίζεται ποσότητα 2g KNO 3 και τοποθετείται σε κλίβανο στους 105 ο C για 2 ώρες. Μετά τη ξήρανση ζυγίζεται σε ζυγό ακριβείας ποσότητα g ΚΝΟ 3. Η ποσότητα αυτή μεταφέρεται σε φιάλη των 1000ml. Το διάλυμα έχει συγκέντρωση 100μg NO 3 N/ml (Stock nitrate solution). Στη συνέχεια ποσότητα

298 Παράρτημα ml από το Stock nitrate solution αραιώνεται με απιονισμένο νερό έως τα 1000 ml. Το διάλυμα έχει συγκέντρωση 10μg ΝΟ 3 Ν/ml. (Intermediate nitrate solution). Διαδικασία: Για την κατασκευή της καμπύλης βαθμονόμησης του NO 3 N παρασκευάζονται 12 πρότυπα διαλύματα διαφορετικής συγκέντρωσης NO 3 N. Πρότυπο Διάλυμα 1 συγκέντρωσης 0.196mg NO 3 N /L 1 ml Intermediate nitrate solution αραιώνεται σε 50 ml απιονισμένο νερό. Πρότυπο Διάλυμα 2 συγκέντρωσης mg NO3N /L 2 ml Intermediate nitrate solution αραιώνεται σε 50 ml απιονισμένο νερό. Πρότυπο Διάλυμα 3 συγκέντρωσης mg NO 3 N /L 4 ml Intermediate nitrate solution αραιώνεται σε 50 ml απιονισμένο νερό. Πρότυπο Διάλυμα 4 συγκέντρωσης 1.228mg NO 3 N /L 7 ml Intermediate nitrate solution αραιώνεται σε 50 ml απιονισμένο νερό. Πρότυπο Διάλυμα 5 συγκέντρωσης mg NO 3 N /L 10 ml Intermediate nitrate solution αραιώνεται σε 50 ml απιονισμένο νερό. Πρότυπο Διάλυμα 6 συγκέντρωσης mg NO 3 N /L 20 ml Intermediate nitrate solution αραιώνεται σε 50 ml απιονισμένο νερό. Πρότυπο Διάλυμα 7 συγκέντρωσης 3.75mg NO 3 N /L 30 ml Intermediate nitrate solution αραιώνεται σε 50 ml απιονισμένο νερό. Πρότυπο Διάλυμα 8 συγκέντρωσης 4.444mg NO 3 N /L 40 ml Intermediate nitrate solution αραιώνεται σε 50 ml απιονισμένο νερό. Πρότυπο Διάλυμα 9 συγκέντρωσης 5mg NO 3 N /L 50 ml Intermediate nitrate solution αραιώνεται σε 50 ml απιονισμένο νερό. Πρότυπο Διάλυμα 10 συγκέντρωσης mg NO 3 N /L 70 ml Intermediate nitrate solution αραιώνεται σε 50 ml απιονισμένο νερό. Πρότυπο Διάλυμα 11 συγκέντρωσης mg NO 3 N /L 100 ml Intermediate nitrate solution αραιώνεται σε 50 ml απιονισμένο νερό. Πρότυπο Διάλυμα 12 συγκέντρωσης 7.5mg NO 3 N /L 150 ml Intermediate nitrate solution αραιώνεται σε 50 ml απιονισμένο νερό. Ως τυφλό διάλυμα χρησιμοποιείται απιονισμένο νερό. Τα παραπάνω διαλύματα μετρώνται με φασματοφωτομετρική ανάλυση στα 220nm με κυψελίδες χαλαζία (Quartz). Στη συνέχεια κατασκευάζεται η γραφική παράσταση έχοντας στον άξονα y 275

299 NO3N (mg/l) Παράρτημα τις τιμές των συγκεντρώσεων και άξονα x τις αντίστοιχες τιμές απορροφήσεων. Η ζητούμενη καμπύλη βαθμονόμησης είναι της μορφής Y=B*X. με συντελεστή συσχέτισης R 2 να προσεγγίζει τη μονάδα. 3,0 2,5 Y = * X R 2 = ,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Abs (220nm) Κατασκευή πρότυπης καμπύλης νιτρωδών Color reagent: Σε 400 ml απιονισμένο νερό προστίθενται 50ml 85% φωσφορικό οξύ και 5g σουλφαναμίδη. Αφού διαλυθεί η σουλφαναμίδη προστίθενται 0.5g N(1 naphtyl) ethylenediamine dihydrochloride. Το διάλυμα αναδεύεται μέχρι να γίνει διαυγές και στη συνέχεια αραιώνεται μέχρι τα 500ml. Το διάλυμα τοποθετείται σε σκοτεινή φιάλη και διατηρείται στο ψυγείο για ένα μήνα. Stock nitrite solution: Σε ζυγό ακριβείας ζυγίζεται ποσότητα 1.232g ΝaΝΟ 2. Η ποσότητα αυτή μεταφέρεται σε φιάλη των 1000 ml και διαλύεται σε απιονισμένο νερό μέχρι τα 1000 ml. Στο διάλυμα προστίθεται 1ml CHCl 3 για τη συντήρησή του. Το διάλυμα έχει συγκέντρωση 500μg NO 2 N / ml. Intermediate nitrate solution: Ποσότητα 50 ml από το Stock nitrite solution αραιώνεται με απιονισμένο νερό έως τα 250 ml. Το διάλυμα έχει συγκέντρωση 50μg NO 2 N / ml. Το διάλυμα δεν συντηρείται, ετοιμάζεται κάθε φορά που γίνεται καμπύλη βαθμονόμησης. Standard nitrite solution: Ποσότητα 10ml Intermediate nitrate solution αραιώνεται με απιονισμένο νερό έως τα 1000ml. Το διάλυμα έχει συγκέντρωση 0.5μg/ml Διαδικασία Για την παρασκευή της καμπύλης βαθμονόμησης του NO 2 N παρασκευάζονται 6 πρότυπα διαλύματα διαφορετικής συγκέντρωσης NO 2 N. 276

300 Παράρτημα Πρότυπο Διάλυμα 1 συγκέντρωσης 1.667μg NO 2 N /L 0.5 ml Standard nitrite solution αραιώνεται σε 300 ml απιονισμένο νερό. Πρότυπο Διάλυμα 2 συγκέντρωσης 3.333μg NO 2 N /L 2 ml Standard nitrite solution αραιώνεται σε 300 ml απιονισμένο νερό. Πρότυπο Διάλυμα 3 συγκέντρωσης 8.333μg NO 2 N /L 5 ml Standard nitrite solution αραιώνεται σε 300 ml απιονισμένο νερό. Πρότυπο Διάλυμα 4 συγκέντρωσης 10μg NO 2 N /L 6 ml Standard nitrite solution αραιώνεται σε 400 ml απιονισμένο νερό. Πρότυπο Διάλυμα 5 συγκέντρωσης 11,666μg NO 2 N /L 7ml Standard nitrite solution αραιώνεται σε 300 ml απιονισμένο νερό. Πρότυπο Διάλυμα 6 συγκέντρωσης 16,666μg NO 2 N /L 5 ml Standard nitrite solution αραιώνεται σε 200 ml απιονισμένο νερό. Από κάθε διάλυμα μεταφέρεται ποσότητα 50 ml σε νέα φιάλη. Ως τυφλό διάλυμα χρησιμοποιήθηκε απιονισμένο νερό. Σε κάθε διάλυμα των 50 ml προστίθενται 2ml Color reagent. Τα διαλύματα αναδεύονται για 10 λεπτά. Αφού παρασκευαστούν τα παραπάνω διαλύματα ακολουθείται για αυτά μέτρηση στα 543nm. Στη συνέχεια κατασκευάζεται η γραφική παράσταση έχοντας στον άξονα y τις τιμές των συγκεντρώσεων και άξονα x τις αντίστοιχες τιμές απορροφήσεων Equation y = a + b*x Adj. RSquare 0,99904 Value Standard Error B Intercept 0 B Slope 450, , NO 2 (μg/l) ,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030 0,035 0,040 Abs(543nm) 277

301 Παράρτημα Ολικό Kjeldahl Άζωτο (TKN) (mgl 1 ) Το άζωτο που περιέχεται στο υπό εξέταση δείγμα μετατρέπεται σε αμμωνία εφαρμόζοντας χώνευση με οξέα υπό την παρουσία μεταλλικού καταλύτη. Στη συνέχεια, η αμμωνία διαχωρίζεται με απόσταξη και στοιχειομετρείται. 1ο βήμα: Χώνευση Το πρωτεϊνικό άζωτο και η ελεύθερη αμμωνία παρουσία θειικού οξέος (H 2 SO 4 ) και μεταλλικού καταλύτη (Seleniun, Se) κατά τη χώνευση μετατρέπονται σε αμμωνιακό άλας (NH 4 HSO 4 ). Organic N + H 2 SO 4 (NH 4 )ΗSO 4 + H 2 O + CO 4 + παραπροϊόντα 2ο βήμα: Απόσταξη Kατά τη διαδικασία της απόσταξης το αμμωνιακό άλας με την προσθήκη NaOH μετατρέπεται σε αμμωνία (NH 3 ) η οποία διαχωρίζεται με την εφαρμογή απόσταξης και συλλέγεται μετά την απόσταξη σε βορικό οξύ (Boric Acid). (NH 4 )HSO 4 + 2NaOH 2NH 3 + Na 2 SO 4 + 2H 2 O. 3ο βήμα: Στοιχειομετρική ανάλυση Η τελική συγκέντρωση οργανικού αζώτου προσδιορίζεται με τιτλοδότηση με πρότυπο διάλυμα υδροχλωρικού οξέος 0.1Ν στο δείγμα. Η ποσότητα της αμμωνίας και του οργανικού αζώτου (TKN) του αρχικού δείγματος προσδιορίζεται με τη διαδικασία της χώνευσης και της απόσταξης μαζί. Στην περίπτωση που το αρχικό μας δείγμα υποστεί κατάλληλη επεξεργασία για αφαίρεση της αμμωνίας, τότε η διαδικασία της χώνευσης και της απόσταξης θα μας δώσει μόνο την ποσότητα του οργανικού αζώτου που υπάρχει σε αυτό. Διαλύματα Αντιδραστήρια 1. Πυκνό διάλυμα θειικού οξέος H 2 SO 4, 96% (1Μ=2Ν). 2. Ταμπλέτες χώνευσης καταλύτη σεληνίου (Selenium, Se). 3. Πυκνό διάλυμα HCl, 0.1N: διαλύουμε 10 ml διαλύματος κανονικού υδροχλωρίου 1Ν σε υπερκάθαρο μέχρι τελικού όγκου 1000 ml. 4. Δείκτης Tashiro: 0.6 gr methyl red διαλύονται σε 50 ml 95% αιθυλικής αλκοόλης. Έπειτα 0.1 gr methylene blue σε 50 ml απιονισμένου νερού. Τέλος αναμιγνύουμε τα δύο διαλύματα. Το χρώμα είναι πράσινο σε αλκαλική σειρά και γκρίζο προς ροζ (ph 4.9) στο όξινο μέσο στο κόκκινο με μια υπερβολή του οξέος. 5. Διάλυμα δείκτη βορικού οξέος, 4%: διαλύουμε 40 gr βορικού οξέος, H 3 BO 3 σε 700 ml υπερκάθαρο και συμπληρώνουμε μέχρι τελικού όγκου 1000 ml με υπερκάθαρο. 278

302 Παράρτημα 6. Διάλυμα NaOH 8.75Ν, 35%: διαλύουμε 350 gr NaOH σε 1000 ml απιονισμένου νερού. Διαδικασία 1. Μεταφέρουμε 10 ml αδιήθητου δείγματος στις φιάλες χώνευσης. 2. Προσθέτουμε 2 ταμπλέτες χώνευσης σε κάθε φιάλη και στη συνέχεια προσθέτουμε σε κάθε δείγμα 15 ml H 2 SO Στη συνέχεια τοποθετούμε τους σωλήνες Kjeldahl στη συσκευή χώνευσης, κατεβάζουμε το καπάκι και πωματίζουμε τις κενές θέσεις. 4. Το δείγμα βράζει για 60min στους 420 o C (προσοχή: πρέπει πάντα να γίνεται έλεγχος στην αντλία κενού για την επαγωγή των ατμών). 5. Μετά το πέρας του βρασμού τα δείγματα αφήνονται να κρυώσουν για μικρό χρονικό διάστημα (15min) και στη συνέχεια μεταφέρονται στους σωλήνες απόσταξης. 6. Αποστάζουμε αρχικά δείγμα με αποσταγμένο νερό για τον καθαρισμό της στήλης. Ο χρόνος απόσταξης ορίζεται στα 4 min, η απόδοση της συσκευής στο 100% και μηδενικό χρόνο αντίδρασης. Μεταφέρουμε τη φιάλη με το δείγμα στη συσκευή απόσταξης. Το προϊόν της απόσταξης συλλέγεται σε κωνική φιάλη ml που περιέχει 30 ml διαλύματος βορικού οξέος. Κατά την απόσταξη προστίθενται 60 ml H 2 O και 60 ml αντιδραστήριο υδροξειδίου του νατρίου (ΝαΟΗ) για την ανύψωση της τιμής του ph και ακολουθεί απόσταξη. 7. Στη συνέχεια προσθέτουμε 10 σταγόνες δείκτη Tashiro και πραγματοποιούμε τιτλοδότηση με διάλυμα HCl 0.1Ν. 8. Η τιτλοδότηση κάθε δείγματος πρέπει να γίνεται άμεσα μετά την απόσταξη και όχι να περιμένουμε να αποστάξουμε όλα τα δείγματα. Υπολογισμός Ο υπολογισμός των συγκεντρώσεων δίνεται μέσω της εξίσωσης: TKN, (mgl 1 ) = [(AB)*F*Ν/S]*1000 όπου : Α = η ποσότητα HCl οξέος που χρησιμοποιήθηκε κατά την τιτλοδότηση στο δείγμα μας (ml). B = η ποσότητα HCl οξέος που χρησιμοποιήθηκε κατά την τιτλοδότηση στο τυφλό μας (ml). F = ατομικό βάρος Ν (14,007gr). Ν = η κανονικότητα του HCl (0,1Ν). Άρα 1mL = 14,007*κανονικότητα (0.1) = 14*0.1=1,4007 mg Ν. S = η ποσότητα του δείγματος που χρησιμοποιήθηκε (ml). 279

303 Παράρτημα Ολικός Φώσφορος Η συγκέντρωση του ολικού φωσφόρου υπολογίζεται μέσω του προσδιορισμού των ορθοφωσφορικών ιόντων στο δείγμα. Αντιδραστήρια 1. Υδατικό διάλυμα φαινολοφθαλεΐνης: Διαλύουμε 0.5gr phenolphalein disodium salt σε τελικό όγκο 100ml απιονισμένου νερού. 2. Διάλυμα θειικού οξέος, 11Ν: Αραιώνουμε 300ml πυκνού H 2 SO 4 με απιονισμένο νερό, σε τελικό όγκο 1000ml. 3. Κρυσταλλικό potassium persulfate K 2 S 2 O Καυστικό νάτριο, 1Ν: Διαλύουμε 40g NaOH σε 600ml απιονισμένου νερού. Αφήνουμε το διάλυμα να κρυώσει και αραιώνουμε σε τελικό όγκο 1000ml με απιονισμένο νερό. Διαδικασία 1. Σε 50ml δείγματος (φίλτρα 0.45μm) προσθέτουμε μια σταγόνα υδατικού διαλύματος φαινολοφθαλεΐνης. Αν αναπτυχθεί κόκκινο χρώμα προσθέτουμε διάλυμα H 2 SO 4 11N, έως ότου να εξαφανιστεί. 2. Προσθέτουμε στο δείγμα 1ml H 2 SO 4 11N και 0.5g κρυσταλλικό potassium persulfate K 2 S 2 O Βράζουμε τα δείγματα για 3040 λεπτά ή έως ότου ο τελικός τους όγκος είναι ίσος με 10ml. 4. Αφήνουμε τα δείγματα να κρυώσουν και τα αραιώνουμε με απιονισμένο νερό σε τελικό όγκο 30ml. 5. Προσθέτουμε μία σταγόνα υδατικού διαλύματος φαινολοφθαλεΐνης, και διάλυμα ΝαΟΗ 1Ν, έως ότου τα δείγματα αποκτήσουν ένα ανοιχτό ροζ χρώμα. Σε αυτό το στάδιο μπορεί να σχηματιστεί ένα ίζημα σε κάποια δείγματα. Τα δείγματα δεν πρέπει να φιλτράρονται. Το ίζημα επαναδιαλύεται κάτω από τις όξινες συνθήκες της χρωματογραφικής μεθόδου που θα χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό των ορθοφωσφορικών ιόντων που προκύπτουν μετά την χώνευση. Διαδικασία μέτρησης Βλέπε μέθοδο μέτρησης ορθοφωσφορικών ιόντων. 280

304 Παράρτημα Μέθοδος μέτρησης ορθοφωσφορικών ιόντων (PO 4 3 ) Η φασματοφωτομετρική αυτή μέθοδος είναι κατάλληλη για την μέτρηση των ορθοφωσφόρικων ιόντων σε πόσιμο, γλυκό και αλμυρό νερό καθώς και οικιακά και βιομηχανικά απόβλητα. Τα απαραίτητα αντιδραστήρια για να πραγματοποιηθεί η μέθοδος είναι τα παρακάτω: 1) Sulfuric acid 5N: Αραιώνουμε 70ml πυκνού θειικού οξέος με απιονισμένο νερό σε τελικό όγκο 500ml. 2) Antinomy potassium tartate: Διαλύουμε g K(SbO) C 4 H 4 O1/2H 2 O σε 400ml απιονισμένο νερό και στη συνέχεια αραιώνουμε σε τελικό όγκο 500ml. Αποθηκεύουμε το διάλυμα στους 4 ο C σε σκοτεινή φιάλη. 3) Ammonium molybdate: Διαλύουμε 20g (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 4H 2 O σε 500ml απιονισμένο νερό. Αποθηκεύουμε το διάλυμα σε ένα πλαστικό μπουκάλι στους 4 o C. 4) Ascorbic acid: Διαλύουμε 1.76g ασκορβικού οξέος σε 100ml απιονισμένου νερού. Το διάλυμα είναι σταθερό για περίπου μια εβδομάδα αν αποθηκευτεί στους 4 ο C. 5) Combined reagent: Αναμιγνύουμε τα παραπάνω αντιδραστήρια στις ακόλουθες ποσότητες για τελικό όγκο 100ml: 50ml διαλύματος sulfuric acid, 5N 5ml διαλύματος antimony potassium tartate 15ml διαλύματος Ammonium molybdate 30ml διαλύματος Ascorbic acid Αναμιγνύουμε ύστερα από την προσθήκη κάθε διαλύματος. Όλα τα διαλύματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου πριν αναμιχθούν και να ακολουθείται η συγκεκριμένη σειρά ανάμειξής τους. Αν κατά την ανάμειξή τους σχηματιστεί θολερότητα στο συνδυασμένο αντιδραστήριο, το ανακινούμε και το αφήνουμε για μερικά λεπτά μέχρι να εξαφανιστεί η θολερότητα. Το συνδυασμένο αντιδραστήριο είναι ασταθές και για αυτό παρασκευάζεται πριν από κάθε σειρά μετρήσεων. Πρότυπη καμπύλη βαθμονόμησης Πρότυπο διάλυμα ορθοφωσφορικών (Stock Phosphate solution) συγκέντρωσης 50 mg/l: Διαλύουμε σε απιονισμένο νερό g potassium dihydrogen phosphate, 281

305 Παράρτημα KH 2 PO 4, το οποίο έχει ξηρανθεί στους 105 o C για 24h, και αραιώνουμε σε τελικό όγκο 1000ml. Ενδιάμεσο διάλυμα ορθοφωσφορικών (Intermediate Phosphorus solution) συγκέντρωσης 0.5 mg/l: Αραιώνουμε 10ml (5ml) του πρότυπου διαλύματος ορθοφωσφορικών (Stock Phosphate solution) σε τελικό όγκο 1000 ml (500ml) Διάλυμα 1: 1ml Intermediate Phosphorus solution και 49ml απιονισμένο νερό, C=0.01mg/l Διάλυμα 2: 3ml Intermediate Phosphorus solution και 47ml απιονισμένο νερό, C=0.03mg/l Διάλυμα 3: 5ml Intermediate Phosphorus solution και 45ml απιονισμένο νερό, C=0.05mg/l Διάλυμα 4: 10ml Intermediate Phosphorus solution και 40ml απιονισμένο νερό, C=0.1mg/l Διάλυμα 5: 20ml Intermediate Phosphorus solution και 30ml απιονισμένο νερό, C=0.2mg/l Διάλυμα 6: 30ml Intermediate Phosphorus solution και 20ml απιονισμένο νερό, C=0.3mg/l Διάλυμα 7: 40ml Intermediate Phosphorus solution και 10ml απιονισμένο νερό, C=0.4mg/l Διαδικασία 1. Τοποθετούνται 50 ml διηθημένου δείγματος σε κωνική φιάλη των 100ml. 2. Προσθέτονταν 8 ml από το combined reagent σε κάθε δείγμα και ακολουθούσε ανάδευση. 3. Επιτρέπονταν στο χρώμα να αναπτυχθεί μέσα σε χρονικό διάστημα το ελάχιστο 10 λεπτών και το μέγιστο 30 λεπτών. Εφόσον το δείγμα έχει ορθοφωσφορικά ιόντα χρωματίζεται μπλε. Η ένταση του χρώματος είναι ανάλογη της ποσότητας των ορθοφωσφορικών ιόντων που περιέχονται στο δείγμα. 4. Φασματοφωτομετρούνταν το κάθε δείγμα σε μήκος κύματος 880 nm. 282

306 Concentration (mg/l) Παράρτημα 0,6 0,5 0,4 Equation y = a + b*x Adj. RSquare 0,99967 Value Standard Error B Intercept 0 B Slope 0, ,00205 y =0,31872 x 0,3 0,2 0,1 0,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 Abs (880 nm) Τεχνολογία εξαγωγής λιπιδίων Η τεχνολογία εξαγωγής των λιπιδίων από τη βιομάζα πρέπει να παρουσιάζει εκλεκτικότητα ως προς τα λιπίδια, ώστε να μην πραγματοποιείται ταυτόχρονη εξαγωγή ανταγωνιστικών παραγόντων, όπως πρωτεΐνες και υδατάνθρακες. Όταν ένα κύτταρο μικροφυκών εκτεθεί σε μη πολικό οργανικό διαλύτη (εξάνιο, χλωροφόρμιο), ο διαλύτης εισχωρεί μέσω της κυτταρικής μεμβράνης, επιδρά με τα ουδέτερα λιπίδια προς σχηματισμό συμπλέγματος [οργανικού διαλύτηλιπιδίων]. Τα ουδέτερα λιπίδια εξάγονται από το κύτταρο και παραμένουν αδιάλυτα στον μη πολικό οργανικό διαλύτη. Ωστόσο, εντοπίζονται και συμπλέγματα στο κυτταρόπλασμα [πρωτεΐνεςουδέτερα λιπίδια]. Πολικοί οργανικοί διαλύτες (ισοπροπανόλη, μεθανόλη) μπορούν να σπάσουν τα συμπλέγματα αυτά. Γι αυτό, χρησιμοποιείται μίγμα πολικού/ μη πολικού διαλύτη (π.χ. μεθανόλη/ χλωροφόρμιο) στην απαιτούμενη αναλογία. Μετά την απομάκρυνση της βιομάζας τα ουδέτερα και τα πολικά λιπίδια αποτελούν μέρος της οργανικής φάσης η οποία υφίσταται εξάτμιση ώστε να παραληφθούν ανεπεξέργαστα και χωρίς υγρασία τα λιπίδια που οδηγούνται σε μετεστεροποίηση. Μετεστεροποίηση Για την εφαρμογή της μεθόδου πραγματοποιούνται τα εξής: 283

307 Παράρτημα 100 mg λιπιδίων μεταφέρονταν σε σφαιρική φιάλη στην οποία είχε προσαρμοστεί κάθετος ψυκτήρας. Σε αυτή προσθέτονταν 10 ml διαλύματος μεθοξειδίου του νατρίου και μερικά θραύσματα πορώδους κεραμικού υλικού προς ομαλοποίηση του βρασμού. Το μίγμα θερμαινόταν σε θερμαινόμενο μανδύα μέχρι ήπιου βρασμού για 20 min. Στη συνέχεια, προσθέτονταν διάλυμα υδροχλωρικής μεθανόλης, μέχρι το ph του μίγματος να γίνει όξινο, όπου η αλλαγή ήταν ορατή λόγω αποχρωματισμού του μίγματος και ο βρασμός συνεχιζόταν για ακόμα 20 min. Μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης προσθέτονταν απιονισμένο νερό και το μίγμα μεταφερόταν σε διαχωριστική χοάνη, όπου πραγματοποιούνταν η εκχύλιση των μεθυλεστέρων με 6 ml εξανίου. Η ανώτερηεξανική φάση (που περιείχε τους εστέρες των λιπαρών οξέων) αφυδατωνόταν με τη βοήθεια Νa 2 SO 4 και παραλαμβανόταν σε γυάλινο φιαλίδιο για να αναλυθεί περαιτέρω σε χρωματογράφο αερίων (GC). Παρασκευή αντιδραστηρίων: Μεθοξείδιο του νατρίου (CH 3 ONa): σε 100 ml μίγματος μεθανόλης/βενζολίου (Sigma), 70/30 (v/v) προσθέτονταν υπό ανάδευση 1 g μεταλλικού νατρίου (Sigma). Η αντίδραση ήταν εξώθερμη. Μετά την πλήρη διάλυση του νατρίου προσθέτονταν φαινολοφθαλεΐνη ως δείκτης ph. Υδροχλωρική μεθανόλη: σε 125 ml μεθανόλης προσθέτονταν 10 ml ακετυλοχλωριδίου (Fluka) (ισχυρά εξώθερμη αντίδραση). Οι αντιδράσεις που λάμβαναν χώρα περιλαμβάνουν τα εξής στάδια: 1 ο Στάδιο: Μετατροπή σε αλκαλικό περιβάλλον (πυρηνόφιλη υποκατάσταση) των γλυκεριδίων (μονο, δι, τρι γλυκεριδίων, πολικών λιπιδίων) σε μεθυλεστέρες λιπαρών οξέων και ταυτόχρονη μετατροπή των ελεύθερων λιπαρών οξέων σε σάπωνες νατρίου. Η δημιουργία trans ισομερών αποτρέπεται σε αλκαλικό περιβάλλον. 2 ο Στάδιο: Σε όξινο περιβάλλον οι σάπωνες μετατρέπονται σε ελεύθερα λιπαρά οξέα τα οποία αντιδρώντας με μεθανόλη μετατρέπονται σε μεθυλεστέρες. Ποσοτικός προσδιορισμός βιομάζας 284

308 Παράρτημα 500 Equation y = a + b*x 0,98061 Adj. RSquare Value Standard Error L Intercept 3, ,40728 L Slope 664, , Βιομάζα (mg/l) ,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 Απορρόφηση (650nm) Καμπύλη αναφοράς για προσδιορισμό νωπής βιομάζας σε μεικτή αυτότροφη καλλιέργεια Προσδιορισμός αιθανόλης 50 Equation y = a + b*x 0,9993 Adj. RSquare Value Standard Error B Intercept 0 B Slope 1, ,01914 Εμβαδόν κορυφής (μriu/min) Συγκέντρωση αιθανόλης (g/l) Καμπύλη αναφοράς αιθανόλης 285

309 Παράρτημα Μικροσκοπική παρατήρηση δειγμάτων Για τη μελέτη της μορφολογίας των μικροοργανισμών κατά τα διάφορα στάδια της ανάπτυξης χρησιμοποιήθηκαν νωπά δείγματα καλλιέργειας, τα κύτταρα των οποίων παρατηρούνταν σε οπτικό μικροσκόπιο Carl Zeiss (GmbH, Göttingen, Germany) με τη χρήση ελαιοκαταδυτικού φακού όπου ήταν απαραίτητο. Λήφθησαν και φωτογραφίες μέσω κάμερας που ήταν συνδεδεμένη με ηλεκτρονικό υπολογιστή. Οι πολυκαλλιέργειες παρατηρήθηκαν με χρήση μικρής ποσότητας υγρού υλικού δείγματος επί αποστειρωμένες αντικειμενοφόρες πλάκες και καλυπτρίδας. Για την ταυτοποίηση της μεικτής αυτότροφης καλλιέργειας που μεταφέρθηκε στο Εργαστήριο Βοτανικής του Τμήματος Βιολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης χρησιμοποιήθηκε ζωντανό και στερεωμένο (με διάλυμα Lugols) υλικό που εξετάστηκε με Nikon ECLIPSE TE2000S ανάστροφου μικροσκοπίου επιφθορισμού (UV, μπλε και πράσινη διέγερση στα 1000x) και σχετικές ταξινομικές κλείδες ταυτοποίησης. Τα τμήματα των μικροοργανισμών (κύτταρα, τριχώματα) μετρήθηκαν με τη μέθοδο ανάστροφου μικροσκοπίου χρησιμοποιώντας θαλάμους καθίζησης 3ml, μετά από κατάλληλη αραίωση. Όπως προβλέπεται υπολογίστηκαν τουλάχιστον 400 άτομα μικροοργανισμών ώστε να προσδιοριστεί η πυκνότητα του πληθυσμού και η κυρίαρχη βιομάζα στη καλλιέργεια. Ο κύριος όγκος κυττάρων/ τριχωμάτων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας γεωμετρική φόρμουλα μετά την μέτρηση των διαστάσεων από 30 άτομα. Η βιομάζα υπολογίστηκε από τον πολλαπλασιασμό της πυκνότητας του πληθυσμού κάθε είδους με τον κύριο όγκο κυττάρων και τριχωμάτων, αντίστοιχα με υποθετική ειδική πυκνότητα κυττάρων το 1g cm 3. Για τη μελέτη της μορφολογίας των ζυμών κατά τα διάφορα στάδια ανάπτυξης, έγιναν επίσης νωπά δείγματα καλλιέργειας, τα κύτταρα της οποίας παρατηρήθηκαν σε οπτικό μικροσκόπιο Carl Zeiss (Gmbh, Göttingen, Germany) (Εικόνα ) σε ολική μεγέθυνση 1000 φορών (=10 100). Έπειτα, ακολούθησε λήψη ψηφιακών φωτογραφιών μέσω κάμερας (Exwave HAD, Sony, Tokyo, Japan) που ήταν συνδεδεμένη με ηλεκτρονικό υπολογιστή. Με αυτό τον τρόπο προσδιορίστηκε η ανάπτυξη των κυττάρων της ζύμης (κύτταρα/ml). 286

310 Παράρτημα Οπτικό μικροσκόπιο Carl Zeiss Μοριακή ταυτοποίηση μικροοργανισμών Συλλέχθηκαν δείγματα από την προσκολλημένη αυτότροφη καλλιέργεια και από τα ανεπεξέργαστα δείγματα των αποβλήτων τυροκομείου και οινοποιείου. Τα δείγματα διηθήθηκαν σε ηθμούς nucleopore 0.2 μm και αποθηκεύτηκαν στους 20 ο C μέχρι την περαιτέρω μοριακή ανάλυση. Το DNA από κάθε ηθμό απομονώθηκε με τη χρήση του MoBio PowerWater Isolation Kit, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και η περιοχή V3V4 του 16S γονιδίου (περίπου 465 ζεύγη βάσεων), ενισχύθηκε σύμφωνα με τους εκκινητές SDBact0341bS17: 5'CCTACGGGNGGCWGCAG3' και SDBact0785aA21: 5'GACTACHVGGGTATCTAATCC3' (Klindworth et al., 2012). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε πυροαλληλούχιση του τμήματος του 16S γονιδίου ακολουθώντας το πρωτόκολλο για την προετοιμασία βιβλιοθηκών της Illumina Miseq και τις οδηγίες του κατασκευαστή στην εταιρία MR. DNA (Shallowater, TX, USA). Έπειτα, πραγματοποιήθηκε επεξεργασία των βάσεων δεδομένων αλληλουχιών που παράχθηκαν με το λογισμικό Mothur , ώστε να απομακρυνθούν οι αλληλουχίες κακής ποιότητας και δημιουργήθηκαν ταξινομικές μονάδες (Operational Taxonomic Units, OTUs) με όριο ομοιότητας 97%. Τέλος, τα OTUs αντιστοιχήθηκαν σε taxa σύμφωνα με τη βάση αλληλουχιών Silva v.128 ( Όλες οι παραπάνω διεργασίες πραγματοποιήθηκαν από την ερευνητική ομάδα της Καθηγήτριας ΜουστάκαΓούνη Μαρίας στο Τμήμα Βιολογίας του ΑΠΘ. 287