Κιτ SPOT-Light HER2 CISH

Transcript

1 Κιτ SPOT-Light HER2 CISH Κατ. # τεστ µε τη χρήση επικαλυµµάτων 24 mm x 30 mm Προοριζόµενη χρήση Για διαγνωστική χρήση in vitro Το κιτ SPOT-Light HER2 CISH προορίζεται για τον ποσοτικό προσδιορισµό της ενίσχυσης του γονιδίου HER2 σε επεξεργασµένα µε φορµαλίνη, εγκλεισµένα σε παραφίνη (FFPE) τµήµατα ιστού καρκινώµατος µαστού µε τη χρήση χρωµογόνου in situ υβριδισµού (CISH) και µικροσκοπίου φωτεινού πεδίου (brightfield). Αυτό το τεστ πρέπει να πραγµατοποιηθεί σε εργαστήριο ιστοπαθολογίας. Το κιτ SPOT-Light HER2 CISH ενδείκνυται ως βοηθητικό µέσο για την αξιολόγηση ασθενών για τους οποίους έχει ληφθεί υπόψη η θεραπεία µε Herceptin (trastuzumab). Τα αποτελέσµατα του προσδιορισµού προορίζονται για χρήση ως επικουρικά στοιχεία για τις κλινικο-παθολογικές πληροφορίες που χρησιµοποιούνται επί του παρόντος ως µέρος της διαχείρισης των ασθενών µε καρκίνο του µαστού. Θα πρέπει να γίνει ερµηνεία των αποτελεσµάτων του τεστ µε βάση το κλινικό ιστορικό του ασθενούς, από πιστοποιηµένο παθολόγο. Περίληψη και εξήγηση Το ανθρώπινο γονίδιο HER2, ή c-erbb-2 και το ισοδύναµο γονίδιο ποντικιού neu, έχουν αναγνωριστεί ως πρωτοογκογενή (1-3) έχοντας κοινή οµολογία µε το στενά σχετιζόµενο ογκογενές v-erbb. (1) Το γονίδιο HER2 βρίσκεται στο χρωµόσωµα 17 (17q ) και κωδικοποιεί µια πρωτεΐνη υποδοχέα µεµβράνης 185 kda. Η πρωτεΐνη του HER2 έχει δραστηριότητα κινάσης τυροσίνης και έχει κοινή οµολογία, αλλά ξεχωρίζει, από τον παράγοντα επιδερµικής ανάπτυξης (γνωστό ως EGFr, HER1, ή c-erbb-1). (2) Η ενίσχυση του γονιδίου HER2 ή η υπερέκφραση της πρωτεΐνης του HER2 έχει αναγνωριστεί σε ποσοστό 18 30% των ανθρώπινων καρκίνων µαστού. (8-9) Η αναγνώριση της κατάστασης της ενίσχυσης του γονιδίου HER2 είναι σηµαντική για τον καθορισµό της πρόγνωσης των ασθενών που έχουν διαγνωστεί µε διηθητικό καρκίνο του µαστού, όπως και για την επιλογή ασθενών κατάλληλων για θεραπεία µε trastuzumab (Herceptin, F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Ελβετία και Genentech, Inc., Νότιο Σαν Φρανσίσκο, Καλιφόρνια). (4-6) Το Trastuzumab είναι ένα µονόκλωνο αντίσωµα συγκεκριµένο για την πρωτεΐνη του HER2. Το Trastuzumab έχει επιδείξει ότι είναι αποτελεσµατική θεραπεία µόνο σε ασθενείς των οποίων οι όγκοι επιδεικνύουν ενίσχυση του γονιδίου HER2 ή και υπερέκφραση της πρωτεΐνης του HER2. (7,11) Σε πρώιµο στάδιο του καρκίνου του µαστού, µια βραχύχρονη σύνοδος του trastuzumab χορηγούµενου ταυτόχρονα µε docetaxel ή vinorelbine έχει δείξει ότι είναι αποτελεσµατική σε γυναίκες µε καρκίνο του µαστού που έχουν ενισχυµένο γονίδιο HER2/neu. (12) Άλλες µελέτες έχουν επίσης επιδείξει ότι η κατάσταση του HER2 προκαθορίζει την ευαισθησία ή την αντίσταση σε συγκεκριµένες συνόδους χηµειοθεραπείας. (13) Συνεπώς, οι ακριβείς, συνεπείς και ξεκάθαρες µέθοδοι για την αξιολόγηση της κατάστασης του γονιδίου HER2 και της πρωτεΐνης του HER2 καθίστανται όλο και πιο σηµαντικές. PI Αναθ. 0.0 Σελίδα 1 από 27

2 Αρχές της διαδικασίας Η τεχνική CISH χρησιµοποιεί µήλες DNA µε επισήµανση digoxigenin που είναι συγκεκριµένες για τη θέση του γονιδίου HER2 στο χρωµόσωµα 17q , για τον υβριδισµό των συµπληρωµατικών νουκλεϊκών οξέων που είναι παρόντα στο είδος του καρκίνου του µαστού. Η επισηµασµένη µήλη του HER2 παρασκευάζεται µε τη χρήση τεχνολογίας µήλης αφαίρεσης «Subtraction Probe Technology (SPT )», µια κατοχυρωµένη τεχνολογία που δηµιουργεί συγκεκριµένες µήλες µειώνοντας σηµαντικά τις επαναλαµβανόµενες ακολουθίες (π.χ. στοιχεία Alu και LINE) που βρίσκονται στα ανθρώπινα νουκλεϊκά οξέα. Η µήλη έχει επιδείξει ότι περιέχει το γονίδιο HER2 κατά PCR και ότι προσδένεται σε σηµαντικό βαθµό στη θέση γονιδίου HER2 στο χρωµόσωµα 17q µέσω µετάφασης FISH σε φυσιολογικά λεµφοκύτταρα. Επακόλουθα, οι µήλες SPT της Invitrogen είναι ειδικές εκ παρασκευής και δεν απαιτούν επαναληπτική φραγή ακολουθίας, όπως απαιτείται από τις παραδοσιακές κυτταρογενετικές µήλες DNA. Η τεχνική CISH επιτρέπει την αξιολόγηση των γενετικών ανωµαλιών µε τη χρήση µικροσκοπίου φωτεινού πεδίου (brightfield) και χρωµογόνου εντοπισµού. Τα αποτελέσµατα χρώσης του CISH µπορούν να απεικονιστούν καθαρά µε τυπικό µικροσκόπιο φωτεινού πεδίου και ξηρό φακό 40X. Η κατάσταση ενίσχυσης του γονιδίου HER2 µπορεί να απεικονιστεί εντός του περιεχοµένου της µορφολογίας του περιβάλλοντος ιστού. Μετά την αποπαραφινοποίηση, γίνεται προεπεξεργασία των δειγµάτων µε βήµα θερµικής ανάκτησης, ακολουθούµενο από πέψη ενζύµου. Γίνεται τότε αποξήρανση των δειγµάτων και στέγνωµά τους στο αέρα πριν την προσθήκη της µήλης HER2. Μετά την προσθήκη της µήλης και του επικαλύµµατος στο δείγµα, ο συνδυασµός µετουσιώνεται και υβριδοποιείται για περισσότερες από 10 ώρες ή κατά τη διάρκεια της νύχτας. Κατόπιν πραγµατοποιείται έκπλυση του δείγµατος για την αφαίρεση της µη υβριδοποιηµένης µήλης και εντοπίζεται (ανιχνεύεται) το σήµα µε χρωµογόνο τρόπο, µέσω επακόλουθης προσθήκης αντισώµατος στο digoxigenin και σύζευξη πολυµερούς υπεροξειδάσης χρένου (horseradish) (HRP). Το χρώµα εµφανίζεται µέσω αντίδρασης του δεσµευµένου HRP µε το χρωµογόνο DAB και το υπόστρωµα Η 2 Ο 2. Τέλος, το δείγµα αποχρωµατίζεται (αφαίρεση χρώσης) µε αιµατοξυλίνη Mayer's για τον καθορισµό της µορφολογίας του ιστού και επικαλύπτεται. Το σήµα του γονιδίου HER2 αναγνωρίζεται µέσω µιας απλής κουκίδας σκούρου καφέ χρώµατος όταν είναι παρόν σε µικρό αριθµό αντιγράφων, ή ως καφέ συστοιχίες όταν το σήµα αντιπροσωπεύει πολλά αντίγραφα. Οι περιοχές των κυττάρων του όγκου µπορούν να αναγνωριστούν εύκολα κάτω από το αντικείµενο χαµηλής ισχύος ενός µικροσκοπίου φωτεινού πεδίου (brightfield) και τα αντίγραφα του γονιδίου HER2 µπορούν να αναγνωριστούν µε τη χρήση αντικειµένου 40Χ. Με τη χρήση µικροσκοπίου brightfield µε αντικείµενο 40Χ, εντοπίζονται τα κύτταρα του όγκου και ποσοτικοποιούνται τα αντίγραφα του γονιδίου HER2. Το DAB σχηµατίζει έγχρωµο προϊόν καθίζησης και έτσι τα αποτελέσµατα µπορούν να αρχειοθετηθούν και εξεταστούν σε µετέπειτα ηµεροµηνία. Παρεχόµενα υλικά Το κιτ SPOT-Light HER2 CISH περιέχει όλα τα αντιδραστήρια που απαιτούνται για την πραγµατοποίηση της διαδικασίας CISH σε επεξεργασµένους µε φορµαλίνη, εγκλεισµένους σε παραφίνη ιστούς. Τα υλικά που αναφέρονται παρακάτω αρκούν για 20 συνολικά τεστ και έως 2 δοκιµές µε τα δύο πλακίδια µάρτυρα (ελέγχου), µε τη χρήση επικαλυµµένων δειγµάτων ιστού µε διαστάσεις 24 mm x 30 mm. Μπορούν να πραγµατοποιηθούν περισσότερα τεστ εάν χρησιµοποιηθούν µικρότερα επικαλύµµατα. Το κιτ SPOT-Light HER2 CISH αποστέλλεται σε ψυχρά επιθέµατα. Τα ψυχρά επιθέµατα πρέπει να διατηρούνται ψυχρά µετά την παραλαβή της αποστολής για να διασφαλιστεί ότι το πακέτο δεν έχει εκτεθεί σε υψηλές θερµοκρασίες. Ωστόσο, ορισµένα τµήµατα µπορεί να παραµείνουν µη κατεψυγµένα και αυτό δεν θα επηρεάσει την απόδοση του κιτ. Παρακαλούµε ανατρέξτε στην ενότητα Αποθήκευση αντιδραστηρίου για άµεση αποθήκευση µετά την παραλαβή των εν λόγω τµηµάτων. Αντιδραστήριο A. ιάλυµα θερµικής προεπεξεργασίας 1 L, περιέχει ρυθµιστικό διάλυµα Tris-EDTA (έτοιµο για χρήση) Αντιδραστήριο B. Αντιδραστήριο ενζυµατικής προεπεξεργασίας 5 ml, περιέχει διάλυµα πεψίνης µε αζίδιο του νατρίου 0,05% και απορρυπαντικό (έτοιµο για χρήση) ΠΡΟΣΟΧΗ: Βλαβερό Αντιδραστήριο C. Μήλη HER2 0,4 ml επισηµασµένη µε digoxigenin SPOT-Light HER2 µήλη σε διάλυµα υβριδισµού που περιέχει formamide (φορµαµίδη) (έτοιµο για χρήση) ΠΡΟΣΟΧΗ: Βλαβερό Αντιδραστήριο D. Ρυθµιστικό διάλυµα SSC 500 ml, περιέχει ορό κιτρικού νατρίου (SSC) (έτοιµο για χρήση) PI Αναθ. 0.0 Σελίδα 2 από 27

3 Αντιδραστήριο E1. Κονία PBS 3 πακέτα, κάθε ένα επαρκεί για 1 L διαλύµατος PBS Αντιδραστήριο E2. Tween 20 (50%) 2 ml, Tween 20 σε διάλυµα 50% Αντιδραστήριο F. CAS-Block TM 3 ml, περιέχει ρυθµιστικό διάλυµα, σταθεροποιητή και αζίδιο του νατρίου 0,1% (έτοιµο για χρήση) ΠΡΟΣΟΧΗ: Βλαβερό Αντιδραστήριο G. Αντίσωµα ποντικού αντί-digoxigenin 3 ml, περιέχει BSA, ρυθµιστικό διάλυµα και αζίδιο του νατρίου 0,1% (έτοιµο για χρήση) ΠΡΟΣΟΧΗ: Βλαβερό Αντιδραστήριο H. Πολυµερές σύζευγµα κατσίκας αντί-ποντικιού HRP 3 ml, περιέχει σταθεροποιητή, ρυθµιστικό διάλυµα, θειική γενταµυκίνη 0,005% και 0,1% του Proclin 300. (Έτοιµο για χρήση) Αντιδραστήριο I1. Ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος DAB (20x) 1 ml, συµπύκνωµα που περιέχει ρυθµιστικό διάλυµα Αντιδραστήριο I2. ιάλυµα DAB, (20x) 1 ml, συµπύκνωµα που περιέχει µεθανόλη 85% w/v ΠΡΟΣΟΧΗ: Εύφλεκτο και τοξικό Αντιδραστήριο I3. Υπεροξείδιο υδρογόνου (20x) 1 ml, 0,6% H 2 O 2 Αντιδραστήριο J. Αιµατοξυλίνη Mayer's 100 ml (έτοιµο για χρήση) Αντιδραστήριο K. ιάλυµα προσαρµογής Histomount TM 4 ml (έτοιµο για χρήση) ΠΡΟΣΟΧΗ: Εξαιρετικά εύφλεκτο και βλαβερό Πλακίδιο µάρτυρα (ελέγχου) L. Πλακίδια κυττάρων µάρτυρα (ελέγχου) για τη διαδικασία 2 πλακίδια, κάθε ένα µε 2 επεξεργασµένες µε φορµαλίνη, εγκλεισµένες σε παραφίνη (FFPE) γραµµές κυττάρων, τοποθετηµένες η µία δίπλα στην άλλη: Α) HER2 µη ενισχυµένες (MCF-7) και Β) HER2 ενισχυµένες (SK-OV-3) [Συνιστώνται µη ενισχυµένες κυτταρικές γραµµές µε µετρήσιµα αποτελέσµατα για µέγιστο έλεγχο προσδιορισµού.] ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ / ΥΛΙΚΑ & ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΟΣ, ΑΛΛΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΟΣ Βοηθητικά αντιδραστήρια / υλικά Αρ. κατηγ. Invitrogen 1. Πλακίδια SuperFrost Plus Ή Κολλητικό πλακιδίων Histogrip TM Θετικός µάρτυρας (έλεγχος) ιστού: Τµήµα ιστού FFPE καρκινώµατος µαστού (πορογενές, σωληνοειδές, λοβιακό ή µεικτού τύπου) µε ενίσχυση γονιδίου HER2 που είχε επιβεβαιωθεί µε CISH ή FISH 3. Αρνητικός µάρτυρας (έλεγχος) ιστού: Τµήµα ιστού FFPE καρκινώµατος µαστού (πορογενές, σωληνοειδές, λοβιακό ή µεικτού τύπου) µε µη ενίσχυση γονιδίου HER2 που είχε επιβεβαιωθεί µε CISH ή FISH 4. Απιονισµένο ή αποσταγµένο νερό (dh 2 O) 5. Ξυλένιο 6. Αιθανόλη 70%, 85%, 95% και 100% (EtOH) 7. Επικαλύµµατα, κόλλα ελαστικού, βελόνη 18G ½" και σύριγγα 5 ml Ή 8. Επικαλύµµατα UnderCover TM (18 x 18 mm) Επικαλύµµατα UnderCover TM (22 x 22 mm) PI Αναθ. 0.0 Σελίδα 3 από 27

4 10. 30% υπεροξείδιο υδρογόνου (H 2 O 2 ) 11. Μεθανόλη 100% Εξοπλισµός 1. Χρονόµετρο 2. Πιπέτα (20 µl, 1000 µl) 3. Ακροφύσια πιπέτας 4. Θήκη πλακιδίων 5. Θερµαντική πλάκα, αλουµινόχαρτο και ποτήρι ζέσης 1 λίτρου 6. Θερµαντής πλακιδίων 7. Επωαστής 37 C 8. Θερµικός ανακυκλωτής PCR µε µπλοκ πλακιδίων, Ή Μπλοκ θέρµανσης µε ψηφιακό θερµόµετρο και επωαστή 37 C (± 1 C) και κουτί υγρασίας πλακιδίων 9. Λουτρό νερού (ικανό να διατηρήσει κλίµακα θερµοκρασίας C µε βαθµονοµηµένο θερµόµετρο) 10. Φιάλη πλακιδίων και φιάλες σήµανσης 11. Μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου (brightfield) µε αντικείµενα 20Χ και 40Χ Προφυλάξεις Για διαγνωστική χρήση in vitro. Για εκπαιδευµένους επαγγελµατίες χρήστες. Μην χρησιµοποιείτε το κιτ µετά την ηµεροµηνία λήξης που αναφέρεται στην ετικέτα. Εάν το προϊόν έχει αποθηκευτεί κάτω από οποιεσδήποτε άλλες συνθήκες εκτός από αυτές που καθορίζονται στη συσκευασία, τότε αυτές οι συνθήκες αποθήκευσης θα πρέπει να επιβεβαιωθούν από το χρήστη. Μην τρώτε, πίνετε, ή καπνίζετε, ή φοράτε καλλυντικά σε χώρους χειρισµού των υλικών του κιτ. Πρέπει να τηρείτε τις γενικά καλές εργαστηριακές πρακτικές. Καµία διαθέσιµη µέθοδος τεστ δεν µπορεί να προσφέρει πλήρη διασφάλιση εξάλειψης ενδεχοµένων βιολογικών κινδύνων. Χειρίζεστε όλα τα υλικά σε επίπεδο βιολογικής ασφαλείας 2, όπως συνιστάται για οποιαδήποτε ενδεχοµένως µολυσµατικά υλικά στο εγχειρίδιο Κέντρων Ελέγχου Ασθενειών / Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας. «Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories», 4 η έκδοση, Απρίλιος Μην αναρροφάτε αντιδραστήρια µε το στόµα και αποφύγετε την επαφή µε το δέρµα και τις βλεννογόνες µεµβράνες µε δείγµατα και αντιδραστήρια. Εάν τα αντιδραστήρια έρθουν σ' επαφή µε το δέρµα ή τις βλεννογόνες µεµβράνες, ξεπλύνετε τις επηρεαζόµενες περιοχές µε άφθονη ποσότητα νερού. Τα αντιδραστήρια Β, F, & G περιέχουν αζίδιο νατρίου 0,1%, το αντιδραστήριο Η περιέχει θειική γενταµυκίνη 0,005% και Proclin 0,1%, το αντιδραστήριο Ι2 περιέχει µεθανόλη w/v 85% και το αντιδραστήριο Ι3 περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,6%. Σε συγκεντρώσεις προϊόντος, αυτά τα αντιδραστήρια δε απαιτούν επισήµανση κινδύνου. Παρακαλούµε ανατρέξτε στο συγκεκριµένο φύλλο δεδοµένων ασφαλείας προϊόντος (MSDS) για περαιτέρω πληροφορίες. Το αντιδραστήριο Β περιέχει πεψίνη και αυτό το ένζυµο µπορεί να προκαλέσει αλλεργικές αντιδράσεις σε επαφή του µε το δέρµα. Χρησιµοποιήστε λουτρό νερού βαθµονοµηµένης θερµοκρασίας, µπλοκ θέρµανσης και φούρνο υβριδοποίησης για βέλτιστα αποτελέσµατα. Ορισµένα από τα αντιδραστήρια σ' αυτό το κιτ περιέχουν αζίδιο νατρίου ως συντηρητικό. Το αζίδιο νατρίου µπορεί να αντιδράσει µε το µόλυβδο και το χαλκό σε υδραυλικούς σωλήνες και να σχηµατίσει εκρηκτικά αζίδια µετάλλων, ειδικά εάν έχει συσσωρευτεί. Κατά την απόρριψη των αντιδραστηρίων µε αζίδιο νατρίου, ξεπλύνετε µε άφθονη ποσότητα νερού για ν' αποφύγετε τη συσσώρευση χηµικά επικίνδυνων ουσιών στις σωληνώσεις της αποχέτευσης. Ορισµένα από τα αντιδραστήρια σ' αυτό το κιτ περιέχουν Proclin, αζίδιο νατρίου, ή υπεροξείδιο υδρογόνου. Αυτά τα αντιδραστήρια είναι ταξινοµηµένα ως επιβλαβή, καθώς είναι ερεθιστικά στο δέρµα και τις βλεννογόνους µεµβράνες. Αυτές οι ουσίες διατίθενται σε διαλυµένη (αραιωµένη) µορφή ως συστατικά του παρόντος κιτ, κάτι που µπορεί συνεπώς να µειώσει σηµαντικά τους κινδύνους έκθεσης, αλλά όχι πλήρως. Αποφύγετε την επαφή µε τα µάτια, το δέρµα και τα ρούχα. Παρακαλούµε ανατρέξτε στο συγκεκριµένο για κάθε συστατικό φύλλο δεδοµένων ασφαλείας προϊόντος (MSDS) για περαιτέρω πληροφορίες. Η 3,3 -τετραχλωριούχα διαµινοβενζιδίνη (DAB) µπορεί να είναι επιβλαβής εάν καταποθεί, εισπνευσθεί, ή απορροφηθεί από το δέρµα και µπορεί να προκαλέσει ερεθισµό στα µάτια, στο δέρµα, στις βλεννογόνες µεµβράνες και στην άνω αναπνευστική οδό. Η DAB είναι πιθανώς καρκινογενής. Συµβουλευτείτε τους οµοσπονδιακούς, πολιτειακούς ή/και τοπικούς κανονισµούς για τις συστάσεις απόρριψης. PI Αναθ. 0.0 Σελίδα 4 από 27

5 Αποφύγετε την εξάτµιση του αντιδραστηρίου Ι2. Η µεθανόλη εξατµίζεται εύκολα. Λάβετε µέτρα για την αποφυγή της εξάτµισης, όπως µέσω αεροστεγούς κλεισίµατος του περιέκτη και κλεισίµατος του καλύµµατος αµέσως µετά τη χρήση. Η εξάτµιση της µεθανόλης µπορεί να προκαλέσει καθίζηση του DAB, κάτι που µπορεί να επηρεάσει τα αποτελέσµατα χρώσης. Αποφύγετε την εξάτµιση κατά τον υβριδισµό διασφαλίζοντας ότι τα πλακίδια είναι κατάλληλα σφραγισµένα και ότι υπάρχει επαρκής υγρασία στο θάλαµο υβριδισµού. Η ενζυµική προεπεξεργασία µπορεί να ποικίλει ανάλογα µε τη στερέωση και το πάχος του ιστού. Για τα περισσότερα τµήµατα ιστών (4 5 µm) που είναι στερεωµένα µε ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα φορµαλίνης 10%, ο χρόνος των 5 λεπτών από την ενζυµική προεπεξεργασία είναι ο βέλτιστος. Για ιστούς µε άγνωστη στερέωση, πρέπει να πραγµατοποιηθεί ενζυµική τιτλοποίηση (π.χ. 2 λεπτά, 5 λεπτά & 10 λεπτά) µε βέλτιστο χρόνο πέψης ρυθµισµένο βάσει των αρχικών αποτελεσµάτων. Αντιδραστήριο C η επισηµασµένη µήλη HER2 περιέχει formamide (φορµαµίδη) που είναι επιβλαβής. R21 Βλαβερό σε περίπτωση επαφής µε το δέρµα R22 Βλαβερό εάν καταποθεί R61 Μπορεί να προκαλέσει βλάβη σε έµβρυο S24 Αποφεύγετε την επαφή µε το δέρµα S36 Φοράτε κατάλληλο προστατευτικό ρουχισµό S37 Φοράτε προστατευτικά γάντια S39 Φοράτε προστατευτικά γυαλιά Αντιδραστήριο Ι2 το διάλυµα DAB περιέχει µεθανόλη που είναι εύφλεκτη και τοξική. Παρακαλούµε ανατρέξτε στο φύλλο δεδοµένων ασφαλείας προϊόντος (MSDS) για περαιτέρω πληροφορίες. R10 Εύφλεκτο R23/24/25 Τοξικό σε περίπτωση εισπνοής, επαφής µε το δέρµα, ή κατάποσης S45 Σε περίπτωση ατυχήµατος ή εάν δεν νιώθετε καλά, αναζητήστε αµέσως ιατρική βοήθεια S36 Φοράτε κατάλληλο προστατευτικό ρουχισµό S37 Φοράτε προστατευτικά γάντια Αντιδραστήριο K το διάλυµα προσαρµογής ιστού Histomount περιέχει τολουόλιο, που είναι εξαιρετικά εύφλεκτο και βλαβερό κατά την εισπνοή. Ανατρέξτε στο φύλλο δεδοµένων ασφαλείας προϊόντος (MSDS) για περαιτέρω πληροφορίες. R11 Εξαιρετικά εύφλεκτο R20 Βλαβερό εάν εισπνευστεί S2 ιατηρείτε το µακριά από µέρη όπου µπορεί να το φτάσουν τα παιδιά S16 ιατηρείτε το µακριά από πηγές ανάφλεξης - Απαγορεύεται το κάπνισµα S25 Αποφεύγετε την επαφή µε τα µάτια S29 Μην το αδειάζετε σε αποχετεύσεις S33 Λάβετε προστατευτικά µέτρα κατά ηλεκτροστατικών εκφορτίσεων Όλα τα αντιδραστήρια που καθορίζονται ως «έτοιµα για χρήση», έχουν αραιωθεί στο βέλτιστο βαθµό. Περαιτέρω αραίωση µπορεί να επηρεάσει αρνητικά τα αποτελέσµατα του προσδιορισµού. Οι χρόνοι επώασης, τα αντιδραστήρια και οι θερµοκρασίες έχουν βελτιστοποιηθεί. Η χρήση διαφορετικών χρόνων επώασης, ή διαφορετικών αντιδραστηρίων ή θερµοκρασιών µπορεί να επηρεάσει αρνητικά τα αποτελέσµατα του προσδιορισµού. εν συνιστάται η χρήση διαφορετικών στερεωτικών ιστών ή πάχους ιστών, κάτι που µπορεί να επηρεάσει αρνητικά τα αποτελέσµατα του προσδιορισµού. Συµβουλευτείτε τους τοπικούς κανονισµούς για την απόρριψη των ενδεχοµένως τοξικών συστατικών. Ελαχιστοποιήστε τη µικροβιακή µόλυνση για να αποφύγετε το µη συγκεκριµένο χρωµατισµό. Να προσέχετε πολύ κατά το χειρισµό των αντιδραστηρίων. Φοράτε γάντια µίας χρήσης, ποδιά εργαστηρίου και γυαλιά ασφαλείας κατά το χειρισµό πιθανών καρκινογόνων ουσιών. Αποθήκευση αντιδραστηρίου Το κιτ SPOT-Light HER2 CISH πρέπει να αποθηκεύεται σε θερµοκρασία 2 8 C. Αποθηκεύετε το αντιδραστήριο J σε θερµοκρασία δωµατίου (15 30 C). Σηµείωση: Το αντιδραστήριο Β µπορεί να επηρεαστεί αρνητικά εάν εκτεθεί σε υψηλή θερµοκρασία. Αποθηκεύετε αυτό το αντιδραστήριο σε θερµοκρασία 2 8 C αµέσως µετά τη χρήση. Μην αποθηκεύετε αυτό το αντιδραστήριο σε θερµοκρασία δωµατίου. Αποθηκεύετε το ρυθµιστικό διάλυµα PBS Tween 20 σε θερµοκρασία δωµατίου (15 30 C) για έως 1 εβδοµάδα. Μη χρησιµοποιείτε το σετ µετά την ηµεροµηνία λήξης που αναγράφεται στην ετικέτα. Εάν το προϊόν έχει αποθηκευτεί κάτω απ' οποιεσδήποτε άλλες συνθήκες εκτός από αυτές που καθορίζονται PI Αναθ. 0.0 Σελίδα 5 από 27

6 στη συσκευασία, τότε αυτές οι συνθήκες αποθήκευσης θα πρέπει να επιβεβαιωθούν από το χρήστη. εν υπάρχουν ορατές ενδείξεις που να καθορίζουν την αστάθεια αυτού του προϊόντος. Συνεπώς, είναι σηµαντικό να αξιολογείται τα πλακίδια µάρτυρα (ελέγχου). Παρακαλούµε επικοινωνήστε µε το τµήµα τεχνικής υποστήριξης εάν υποψιάζεστε οποιοδήποτε πρόβληµα µ' αυτό το κιτ. PI Αναθ. 0.0 Σελίδα 6 από 27

7 Οδηγίες χρήσης A. Προετοιµασία δείγµατος Τµήµατα ιστού εγκλεισµένα σε παραφίνη: Ιστοί επεξεργασµένοι σε ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα φορµαλίνης για 6 48 ώρες πριν από την έγκλιση σε παραφίνη, είναι κατάλληλοι για χρήση. Στερεωτικά διαφορετικά από το ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα φορµαλίνης 10% δεν έχουν βελτιστοποιηθεί για αυτό το πρωτόκολλο και δεν είναι κατάλληλα για χρήση. Τα τµήµατα ιστών (πάχος 4 5 µm) πρέπει να προσαρτώνται σε πλακίδια µικροσκοπίου επεξεργασµένα µε HistoGrip ή Superfrost Plus. Οποτεδήποτε είναι δυνατόν, χρησιµοποιήστε τµήµατα τυποποιηµένου πάχους για να διασφαλίσετε οµοιόµορφη χρώση αντιδραστηρίων CISH εντοπισµού και αντιδραστηρίων αντίστροφης χρώσης. 28 Στεγνώστε τα πλακίδια στον αέρα, ή στεγνώστε τα σε θερµοκρασία 37 C, κατόπιν θερµάνετε τα για 2 4 ώρες σε θερµοκρασία 60 C. Οι κατάλληλα στερεωµένοι και εγκλεισµένοι ιστοί θα διατηρηθούν για αόριστο διάστηµα πριν την τοµή σε τµήµατα και την προσάρτηση στα πλακίδια, εάν έχουν αποθηκευτεί σε δροσερό και ξηρό µέρος (15 30 C). 26,27 Τα τµήµατα ιστών πάχους 2 3 µm µπορεί να παράγουν λανθασµένα αποτελέσµατα χαµηλού αριθµού αντιγράφων γονιδίων. B. Τυπική διαδικασία CISH για τµήµατα ιστών FFPE ιαδικαστικές σηµειώσεις Όλα τα αντιδραστήρια εκτός από το αντιδραστήριο C (µήλη HER2) πρέπει να εξισορροπούνται σε θερµοκρασία δωµατίου (15 30 C) πριν τη χρήση. Μπορείτε να χρησιµοποιήσετε τη µήλη HER2 ψυχρή και χωρίς να την εξισορροπήσετε µε τη θερµοκρασία δωµατίου. Κάθε επώαση πρέπει να πραγµατοποιηθεί σε θερµοκρασία δωµατίου (15 30 C), εκτός εάν καθορίζεται διαφορετικά. Είναι σηµαντικό να µην επέλθει αφυδάτωση του τµήµατος του ιστού καθ' όλη τη διάρκεια της διαδικασίας, εκτός και αν καθορίζεται διαφορετικά. Καθ' όλη τη διάρκεια της διαδικασίας, απαιτούνται αρκετές εκπλύσεις. Για κάθε έκπλυση, πρέπει να χρησιµοποιείτε φρέσκο διάλυµα. Τα πλακίδια µάρτυρα (ελέγχου) πρέπει να τυγχάνουν επεξεργασίας µαζί µε κάθε επεξεργασία των πλακιδίων τεστ του ασθενούς και πρέπει να αντιµετωπίζονται µε τον ίδιο τρόπο µε τα δείγµατα τεστ για όλα τα βήµατα. Εκτός κι αν καθορίζεται διαφορετικά, όλα τα βήµατα πρέπει να πραγµατοποιούνται σε θερµοκρασία δωµατίου (15 30 C). Αυτή η διαδικασία απαιτεί περισσότερες από οχτώ ώρες για την ολοκλήρωσή της: παρακάτω περιγράφεται βολικός διαχωρισµός της διαδικασίας, µε έναρξη την 1η ηµέρα µε αποπαραφινοποίηση έως την µετουσίωση και τον υβριδισµό (κατά τη νύχτα) και συνέχεια την 2η ηµέρα µε την περιορισµένη έκπλυση έως την εξέταση σε µικροσκόπιο φωτεινού πεδίου (brightfield). Τα αντιδραστήρια Invitrogen που παρέχονται µε το κιτ είναι αναγκαία για τη διαδικασία CISH. Η χρήση άλλων αντιδραστηρίων µπορεί να έχει σαν αποτέλεσµα υψηλό σήµα υπόβαθρου, ή µείωση ή απώλεια του σήµατος CISH. Η αντικατάσταση οποιωνδήποτε εκ των αντιδραστηρίων που παρέχονται ως συστατικά του κιτ µπορεί να ακυρώσει τα αποτελέσµατα του προσδιορισµού. ιαδικασία 1ης ηµέρας 1. Προετοιµασία αντιδραστηρίου Ξυλένιο (2 περιέκτες πλακιδίων), 100% EtOH (3 περιέκτες πλακιδίων) PI Αναθ. 0.0 Σελίδα 7 από 27

8 o Σκεπάστε σφικτά και αποθηκεύστε για διάστηµα έως 1 εβδοµάδας σε θερµοκρασία δωµατίου (15 30 C) ή έως την ολοκλήρωση της επεξεργασίας 100 πλακιδίων. Σειρά αιθυλικής αλκοόλης (EtOH) o Προετοιµάστε ξεχωριστούς περιέκτες αιθανόλης (EtOH) 70%, 85%, 95% και 100%. o Σκεπάστε σφικτά και αποθηκεύστε για διάστηµα έως 1 εβδοµάδας σε θερµοκρασία δωµατίου (15 30 C) ή έως την ολοκλήρωση της επεξεργασίας 100 πλακιδίων. Επισηµάνετε κατάλληλα κάθε αντιδραστήριο έκπλυσης και σηµειώστε τη σειρά χρήσης στη διαδικασία, διατηρώντας την εν λόγω σειρά. 2. Αποπαραφινοποίηση Σηµείωση: Προετοιµάστε επαρκή ποσότητα αντιδραστηρίων για κάθε περιέκτη πλακιδίων που απαιτείται για τον αριθµό των πλακιδίων στη δοκιµή. Κάθε έκπλυση απαιτεί ξεχωριστό όγκο αντιδραστηρίων. Εάν δεν µπορείτε να προχωρήσετε αµέσως στο επόµενο βήµα, αφήστε τα πλακίδια να στεγνώσουν µετά την εµβάπτιση σε 100% EtOH τρεις φορές αντί για έκπλυση πλακιδίων σε dh2o τρεις φορές. α) Εµβυθίστε σε ξυλένιο 2 φορές, 5 λεπτά το καθένα β) Μουσκέψτε µε 100% EtOH 3 φορές, 3 λεπτά το καθένα γ) Εκπλύνετε σε dh2o 3 φορές, 2 λεπτά το καθένα Η πλήρης αποπαραφινοποίηση είναι αναγκαία για βέλτιστα αποτελέσµατα που µπορούν να αναπαραχθούν. 3. Θερµική προεπεξεργασία Σηµείωση: Tα πλακίδια πρέπει να βραστούν ή θερµανθούν σε θερµοκρασία 98 C για 15 λεπτά. σε διάλυµα θερµικής προκατεργασίας (Αντιδραστήριο Α). Τα πλακίδια δεν πρέπει να υπερθερµαίνονται και πρέπει να βεβαιωθείτε ότι η θερµοκρασία παραµένει στους 98 C έως 100 C. Σας συνιστούµε να χρησιµοποιήσετε την πλάκα θέρµανσης γι' αυτό το βήµα. (Για πρωτόκολλα που απαιτούν τη χρήση βραστήρα υπό πίεση, µε όργανο ένδειξης πίεσης ή φούρνο µικροκυµάτων µε όργανο ένδειξης θερµοκρασίας, παρακαλούµε επικοινωνήστε µε το τµήµα τεχνικής υποστήριξης στη διεύθυνση techsupport@invitrogen.com). To διάλυµα θερµικής προεπεξεργασίας (αντιδραστήριο Α) µπορεί να χρησιµοποιηθεί έως και δύο φορές πριν την απόρριψη. α) Τοποθετήστε τα πλακίδια στη θήκη πλακιδίων. β) Προθερµάνετε το διάλυµα θερµικής προεπεξεργασίας (αντιδραστήριο A) σε βραστήρα εργαστηρίου σε πλάκα έως ότου βράζει σταθερά και η θερµοκρασία είναι 98 C. Για την αποτροπή εξάτµισης του ρυθµιστικού διαλύµατος, θα πρέπει να καλύψετε τη φιάλη µε γυάλινο καπάκι ή αλουµινόχαρτο. γ) Τοποθετήστε τα πλακίδια στο διάλυµα βρασµού, καλύψτε το βραστήρα, αρχίστε τη χρονοµέτρηση όταν η θερµοκρασία φτάσει στους 98 C ή όταν εµφανιστούν φυσαλίδες βρασµού και πάλι και βράστε για 15 λεπτά. Βεβαιωθείτε ότι η θερµοκρασία παραµένει από 98 C έως 100 o C. δ) Μεταφέρετε αµέσως τα πλακίδια σε dh2o σε θερµοκρασία δωµατίου (15 30 C). ε) Εκπλύνετε τρεις φορές σε dh2o, για 2 λεπτά το καθένα. 4. Πέψη ενζύµων Σηµείωση: Για τους περισσότερους ιστούς µαστού, 5 λεπτά πέψης ενζύµου σε θερµοκρασία δωµατίου (15 30 C) θα παράγει βέλτιστα αποτελέσµατα CISH. Ο χρόνος πέψης πρέπει να ρυθµιστεί βάσει των αρχικών αποτελεσµάτων µε χρόνο πέψης 5 λεπτών. Μπορεί να απαιτείται διαφορετικός χρόνος επώασης, ανάλογα µε το πάχος του ιστού και τη µέθοδο στερέωσης. Μια µελέτη πέψης ενζύµου καθόρισε ότι ο χρόνος πέψης ενζύµου µπορεί να κυµαίνεται από 2 20 λεπτά και θα παράγει κατάλληλο σήµα CISH για την αξιολόγηση του HER2 ένα σετ αρχειοθετηµένων ιστών µαστού. Σε µια µελέτη συνταύτισης για την υποστήριξη της χρήσης της CISH έναντι της FISH, στην οποία χρησιµοποιήθηκαν κλινικά δείγµατα ιστών καρκίνου µαστού που είχαν υποστεί επεξεργασία εντός 12 µηνών από την ηµεροµηνία της µελέτης, ο χρόνος πέψης ενζύµων των 5 λεπτών απέδωσε βέλτιστα σήµατα CISH για την αξιολόγηση του γονιδίου HER2. (28) α) Εξισορροπήστε το αντιδραστήριο ενζυµικής προεπεξεργασίας (αντιδραστήριο B) σε θερµοκρασία δωµατίου (15 30 C). β) Προσθέστε αρκετό αντιδραστήριο Β για να καλύψετε το τµήµα του ιστού και επωάστε για 5 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (15 30 C). γ) Εκπλύνετε σε dh2o τρεις φορές για 2 λεπτά το καθένα. PI Αναθ. 0.0 Σελίδα 8 από 27

9 5. Αφυδάτωση σε βαθµονοµηµένη σειρά αιθανόλης: α) 70% EtOH 2 λεπτά β) 85% EtOH 2 λεπτά γ) 95 % EtOH 2 λεπτά δ) 100% EtOH 2 λεπτά ε) 100% EtOH 2 λεπτά 6. Στεγνώστε σε αέρα τα πλακίδια για 20 λεπτά ή έως είναι πλήρως στεγνά. Επισηµάνετε τα πλακίδια µε µολύβι, εάν είναι αναγκαίο. 7. Μετουσίωση και υβριδισµός Σηµείωση: Χρησιµοποιήστε θερµικό ανακυκλωτή PCR µε πλευρικό µπλοκ ή µπλοκ θέρµανσης µε ψηφιακή ένδειξη θερµοκρασία και θάλαµο υγρασίας πλακιδίων µε επωαστή 37 C, ή παρόµοιο εξοπλισµό. Βεβαιωθείτε ότι η υγρασία στους θαλάµους διατηρείται επαρκώς. Υβριδισµός για βραχύτερα χρονικά διαστήµατα µπορεί να έχει σαν αποτέλεσµα ασθενέστερο σήµα. Η µετουσίωση της µήλης σε θερµοκρασία χαµηλότερη από τη συνιστώµενη από το πρωτόκολλο µπορεί να επιφέρει ασθενές ή ανύπαρκτο σήµα CISH. Η αλλαγή των χρόνων επώασης µπορεί να έχει σαν αποτέλεσµα είτε ασθενές σήµα, είτε παραµόρφωση (χρώση) από το υπόβαθρο. α) Προσθέστε 15 µl µήλης HER2 (αντιδραστήριο C) στο κέντρου του επικαλύµµατος 22 x 22 mm. Ανάλογα µε το µέγεθος του ιστού, µπορεί να απαιτείται περισσότερη ή λιγότερη µήλη. Χρησιµοποιήστε τον ακόλουθο όγκο µήλης βάσει του µεγέθους του επικαλύµµατος: 18 mm x 18 mm 10 µl 22 mm x 22 mm 15 µl 24 mm x 30 mm 20 µl β) Τοποθετήστε το κάλυµµα, µε τη µήλη προς τα κάτω, στην κατάλληλη περιοχή του δείγµατος ιστού στο πλακίδιο. Μπορείτε να χρησιµοποιήσετε τα επικαλύµµατα CISH UnderCover Slips αντί για τυπικά επικαλύµµατα. Όταν χρησιµοποιείτε τα επικαλύµµατα CISH UnderCover Slips, ξεκολλήστε το χαρτί και τοποθετήστε την πλευρά µε το εκτεθειµένο επικάλυµµα (απ' όπου έχει µόλις αφαιρεθεί το χαρτί) στην κατάλληλη θέση του πλακιδίου για να καλύψετε το δείγµα ιστού. Πρέπει να πιέσετε τις άκρες της ταινίας για να σφραγίσετε το επικάλυµµα ώστε να αποτρέψετε εξάτµιση. ΜΗΝ ΠΙΕΖΕΤΕ ΠΡΟΣ ΤΑ ΚΑΤΩ ΣΤΟ ΚΕΝΤΡΟ ΤΟΥ ΕΠΙΚΑΛΥΜΜΑΤΟΣ. γ) Όταν χρησιµοποιείτε τυπικό επικάλυµµα, το επικάλυµµα πρέπει να σφραγιστεί για την αποτροπή εξάτµισης κατά την επώαση. Η σφράγιση µπορεί να επιτευχθεί µε τη χρήση σύριγγας των 5 ml και βελόνας των 18G ½". Πληρώστε τη σύριγγα µε ελαστική κόλλα και επαλείψτε ένα λεπτό στρώµα στις άκρες του επικαλύµµατος, επικαλύπτοντας ελαφρά το πλακίδιο. δ) Αφήστε την κόλλα ελαστικού να στεγνώσει (~10 λεπτά) για την αποτροπή τυχόν ολίσθησης του καλύµµατος από το πλακίδιο. ε) Μπορείτε να πραγµατοποιήσετε µετουσίωση και υβριδισµό µε θερµικό ανακυκλωτή PCR µε πλευρικό µπλοκ ή µπλοκ θέρµανσης µε ψηφιακή ένδειξη θερµοκρασίας µαζί µε θάλαµο υγρασίας πλακιδίων µε επωαστή 37 C. 1) Εάν χρησιµοποιείτε θερµικό ανακυκλωτή PCR µε πλευρικό µπλοκ: Μετουσιώστε στους 95ºC (± 1ºC) για 5 λεπτά και προχωρήστε σε επώαση κατά τη νύχτα (10 18 ώρες) στους 37ºC (± 1ºC). 2) Εάν χρησιµοποιείτε θερµικό ανακυκλωτή και θάλαµο υγρασίας µε επωαστή στους 37 C: Μετουσιώστε στους 95ºC (± 1ºC) για 5 λεπτά και προχωρήστε σε επώαση κατά τη νύχτα (10 18 ώρες) στους 37ºC (± 1 C) σε θάλαµο υγρασίας. ιαδικασία 2ης ηµέρας 8. Προετοιµασία αντιδραστηρίου PBS (Ορός ρυθµισµένος µε φωσφορικό άλας) o Προσθέστε ένα πακέτο κονίας PBS (Αντιδραστήριο Ε1) σε 1 L dh 2 O. Αναµείξτε. Ρυθµιστικό διάλυµα PBS/Tween 20 (0,01% Tween) o Προσθέστε 10 σταγόνες 50% Tween 20 (Αντιδραστήριο Ε2) σε 1 L PBS (από το παραπάνω βήµα). Αναµείξτε. o Αποθηκεύετε σε θερµοκρασία δωµατίου (15 30 C) για έως 1 εβδοµάδα. ιάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB) o Παρασκευάστε αυτό το διάλυµα αµέσως πριν τη χρήση του. o Προσθέστε 1 σταγόνα από κάθε αντιδραστήριο (I1, I2, I3) σε 1 ml dh 2 O. Αναµείξτε καλά. PI Αναθ. 0.0 Σελίδα 9 από 27

10 3% H 2 O 2 σε απόλυτη µεθανόλη o Προσθέστε 1 µέρος 30% H 2 O 2 σε 9 µέρη µεθανόλης. o Σκεπάστε σφικτά και αποθηκεύστε για διάστηµα έως 1 εβδοµάδας σε θερµοκρασία δωµατίου (15 30 C) ή έως την ολοκλήρωση της επεξεργασίας 100 πλακιδίων. Ξυλένιο (2 θήκες πλακιδίων) o Σκεπάστε σφικτά και αποθηκεύστε για διάστηµα έως 1 εβδοµάδας σε θερµοκρασία δωµατίου (15 30 C) ή έως την ολοκλήρωση της επεξεργασίας 100 πλακιδίων. 9. Περιορισµένη έκπλυση Σηµείωση: Η χρήση θερµοκρασιών άνω των συνιστώµενων σύµφωνα µε τη διαδικασία, µπορεί να παράγει µείωση ή πλήρη απώλεια του σήµατος CISH. Εκπλύσεις σε πολύ χαµηλή θερµοκρασία µπορεί να έχουν σαν αποτέλεσµα υψηλό υπόβαθρο. Πρέπει να χρησιµοποιηθεί βαθµονοµηµένο θερµόµετρο για να διασφαλιστεί ότι έχει επιτευχθεί και διατηρείται η ακριβής θερµοκρασία του λουτρού νερού. α) Ανοίξτε το λουτρό νερού των 70ºC (±1 C) και αφήστε το να έλθει σε κανονική θερµοκρασία. β) Προετοιµάστε δύο φιάλες Coplin που περιέχουν ρυθµιστικό διάλυµα SSC (αντιδραστήριο D), ένα σε θερµοκρασία δωµατίου και το άλλο θερµασµένο στους 70 C. γ) Αποκολλήστε την ελαστική κόλλα του επικαλύµµατος UnderCover Slip. Μην αφήνετε να ξηρανθεί (αφυδατωθεί) το τµήµα του ιστού. δ) Για την αφαίρεση του καλύµµατος χωρίς να σχιστεί ο ιστός: Προ-µουσκέψτε τα πλακίδια σε θερµοκρασία δωµατίου SSC για ~2 3 λεπτά, έως ότου να µπορεί να αποκολληθούν εύκολα τα επικαλύµµατα. Κατόπιν, προχωρήστε µε το επόµενο βήµα. ε) Ξεπλύνετε για λίγο τα πλακίδια στη φιάλη που περιέχει SSC σε θερµοκρασία δωµατίου (15 30 C), κατόπιν εµβυθίστε τα πλακίδια για 5 λεπτά στη φιάλη Coplin που περιέχει το διάλυµα SSC στο λουτρό νερού 70ºC (±1 C). στ) Εκπλύνετε σε dh2o για 3 φορές, για 2 λεπτά το καθένα. 10. Ανοσοεντοπισµός α) Εµβυθίστε τα πλακίδια σε 3% H2O2 σε 100% µεθανόλη για 10 λεπτά. β) Εκπλύνετε σε PBS/Tween 20 (0,01%) 3 φορές, για 2 λεπτά το καθένα. γ) Προσθέστε CAS-Block TM (αντιδραστήριο F): 2 3 σταγόνες / πλακίδιο ή αρκετή ποσότητα για να καλύψετε τον ιστό και επωάστε για 10 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (15 30 C). δ) Απορροφήστε το αντιδραστήριο F µε πανάκι εργαστηρίου. Μην ξεπλένετε. ε) Προσθέστε αντίσωµα ποντικιού αντί-digoxigenin (αντιδραστήριο G): 2 3 σταγόνες / πλακίδιο ή αρκετή ποσότητα για να καλύψετε τον ιστό και επωάστε για 30 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (15 30 C). στ) Εκπλύνετε σε PBS/Tween 20 (0,01%) 3 φορές, για 2 λεπτά το καθένα. ζ) Προσθέστε σύζευγµα κατσίκας αντι-ποντικιού HRP (αντιδραστήριο Η): 2 3 σταγόνες / πλακίδιο ή αρκετή ποσότητα για να καλύψετε τον ιστό και επωάστε για 30 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (15 30 C) σε θάλαµο υγρασίας. η) Εκπλύνετε σε PBS/Tween 20 (0,01%) 3 φορές, για 2 λεπτά το καθένα. θ) Κατά την έκπλυση, παρασκευάστε διάλυµα υποστρώµατος - χρωµογόνου: προσθέστε µία σταγόνα από κάθε αντιδραστήριο (αντιδραστήρια I1, I2, I3) σε 1 ml dh 2 O. ι) Προσθέστε διάλυµα υποστρώµατος - χρωµογόνου (DAB): 2 3 σταγόνες / πλακίδιο ή αρκετή ποσότητα για να καλύψετε τον ιστό και επωάστε για 30 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (15 30 C) σε θάλαµο υγρασίας. ια) Τοποθετήστε τα πλακίδια στη θήκη πλακιδίων. ιβ) Εκπλύνετε µε τρεχούµενο νερό για 2 λεπτά. 11. Αντιχρωµατισµός και προσάρτηση Σηµείωση: Αντιχρωµατίστε για µικρή χρονική διάρκεια για 3 5 δευτερόλεπτα και εξετάστε τον ιστό στο µικροσκόπιο χωρίς την επικάλυψη. Αντιχρωµατίστε για επιπλέον 3 5 δευτερόλεπτα εάν επιθυµείτε ισχυρότερο πυρηνικό χρωµατισµό. Ο χρόνος αντιχρωµατισµού εξαρτάται από τους ιστούς που χρησιµοποιούνται. εν συνιστάται ο αντιχρωµατισµός στο σκοτάδι, καθώς αυτό µπορεί να συγκαλύψει τα θετικά σήµατα χρωµατισµού. α) Αντιχρωµατίστε τον ιστό µε αιµατοξυλίνη (αντιδραστήριο J): 3 5 δευτερόλεπτα. β) Εκπλύνετε µε τρεχούµενο νερό για 2 λεπτά. γ) Αφυδατώστε σε βαθµονοµηµένη σειρά EtOH για 2 λεπτά σε κάθε βαθµό. (70%, 85%, 95%, 100%, 100%, αποθηκευµένα από την 1η ηµέρα και χρησιµοποιούνται στην ίδια σειρά.) PI Αναθ. 0.0 Σελίδα 10 από 27

11 δ) Εµβυθίστε σε ξυλένιο: 2 φορές, 2 λεπτά το καθένα. Αυτό το διάλυµα ξυλενίου πρέπει να είναι διαφορετικό απ' αυτό που χρησιµοποιήσατε την 1η ηµέρα. Μπορεί να επαναχρησιµοποιηθεί σ' αυτό το βήµα για την 1η εβδοµάδα, ή έως 100 πλακίδια. ε) Κάλυµµα, µε τη χρήση διαλύµατος προσάρτησης Histomount (Αντιδραστήριο Κ). στ) Αποθηκεύετε τα πλακίδια σε θερµοκρασία δωµατίου (15 30 C) για µελλοντική ανάλυση των αποτελεσµάτων. Περιορισµοί διαδικασίας Το κιτ SPOT-Light HER2 CISH δεν µπορεί να ανιχνεύσει το αναφερόµενο ποσοστό 5% (10) των καρκίνων του µαστού που είναι θετικοί σύµφωνα µε ανοσοιστοχηµεία (IHC) αλλά αρνητικοί για ενίσχυση γονιδίου HER2. Η CISH είναι µία διαδικασία πολλαπλών βηµάτων που απαιτεί εξειδικευµένη εκπαίδευση στην επιλογή των κατάλληλων αντιδραστηρίων, την επιλογή ιστών, τη στερέωση, επεξεργασία, προετοιµασία του πλακιδίου CISH και την ερµηνεία των αποτελεσµάτων χρώσης. Η χρώση ιστών εξαρτάται από το χειρισµό και την επεξεργασία του δείγµατος ιστού πριν τη χρώση. Τυχόν υπερβάλλων ή µη ολοκληρωµένος αντιχρωµατισµός µπορεί να διακυβεύσει την ερµηνεία των αποτελεσµάτων. Οποιαδήποτε απόκλιση από τις συνιστώµενες διαδικασίες της δοκιµής µπορεί να ακυρώσει τα αναµενόµενα αποτελέσµατα. Θα πρέπει να εφαρµόσετε τους κατάλληλους ελέγχους και τεκµηριώσεις. Οι χρήστες οι οποίοι αποκλίνουν από τις συνιστώµενες διαδικασίες τεστ, θα πρέπει να αποδεχτούν την ευθύνη για την ερµηνεία των αποτελεσµάτων των δειγµάτων σύµφωνα µε τις συγκεκριµένες περιστάσεις. Το κιτ SPOT-Light HER2 CISH έχει βελτιστοποιηθεί µόνο για την αναγνώριση και ποσοτικοποίηση του γονιδίου HER2/neu στον πυρήνα µεσόφασης σε επεξεργασµένα µε φορµαλίνη, εγκλεισµένα σε παραφίνη δείγµατα ιστών ανθρώπινου καρκίνου του µαστού. Άλλοι τύποι δειγµάτων ή στερεωτικών δεν έχουν επαληθευτεί. Η κλινική ερµηνεία οποιωνδήποτε αποτελεσµάτων του τεστ πρέπει να αξιολογηθεί σύµφωνα µε το ιατρικό ιστορικό του ασθενούς και άλλα αποτελέσµατα εργαστηριακών διαγνωστικών τεστ. PI Αναθ. 0.0 Σελίδα 11 από 27

12 Έλεγχος ποιότητας Θετικοί και αρνητικοί µάρτυρες (έλεγχοι) σε ένα πλακίδιο Πλακίδιο µάρτυρα (ελέγχου) L. A B Εικόνα 1. Το πλακίδιο µάρτυρα (ελέγχου) περιέχει σειρά µη ενισχυµένων κυττάρων Α (MCF-7) και σειρά ενισχυµένων κυττάρων Β (SK-OV-3). Σηµείωση: οι γραµµές κυττάρων δεν απεικονίζονται σε κλίµακα, αλλά είναι µικρότερες απ ότι καθορίζεται στο διάγραµµα. Το σήµα CISH θα πρέπει να είναι καφέ, ευδιάκριτο και εύκολο στην αξιολόγησή του. Τα συµπεριλαµβανόµενα πλακίδια µαρτύρων (Πλακίδιο L) περιέχουν δύο τµήµατα τοµών 4 µm κοµµένα από τα µπλοκ κυττάρων FFPE, προπαρασκευασµένα από δύο διαφορετικές γραµµές κυττάρων. Θα πρέπει να χρησιµοποιείτε αυτά τα πλακίδια ως διαδικαστικούς µάρτυρες. Η γραµµή κυττάρων Α (MCF-7) είναι µη ενισχυµένη και έχει 5 σήµατα ή κουκίδες ανά πυρήνα. Η γραµµή κυττάρων Β (SK-OV-3) είναι ενισχυµένη και εµφανίζεται ως µικρές προς µεγάλες συστοιχίες DAB στον πυρήνα. Το πλακίδιο γραµµής κυττάρων µάρτυρα (ελέγχου) πρέπει να τυγχάνει επεξεργασίας µαζί µε κάθε επεξεργασία των πλακιδίων τεστ του ασθενούς και πρέπει να αντιµετωπίζεται µε τον ίδιο τρόπο όπως τα τµήµατα ιστών. Εάν το πλακίδιο µάρτυρα (Πλακίδιο L) είναι αρνητικό για αµφότερες τις γραµµές κυττάρων Α και Β, αυτό αποτελεί ένδειξη ότι έλαβε χώρα σφάλµα κατά τη διαδικασία CISH. Η γραµµή κυττάρων θετικού µάρτυρα (Β), γνωστή για την επίδειξη ενίσχυσης HER2, θα πρέπει να εξεταστεί πρώτη για να διαβεβαιωθεί ότι τα αντιδραστήρια λειτουργούν κατάλληλα. Η παρουσία συστοιχιών γονιδίων, ή >5 ανεξάρτητων σηµάτων ή κουκίδων εντός του πυρήνα ενός κυττάρου, αποτελεί ένδειξη αναµενόµενης θετικής αντιδραστικότητας. Εάν ο θετικός µάρτυρας δεν επιδείξει την παρουσία συστοιχιών ή >5 σηµάτων ανά πυρήνα σε πλειοψηφία (>50%) κυττάρων καρκινώµατος, τα αποτελέσµατα που λαµβάνονται για τα δείγµατα του ασθενούς θα πρέπει να θεωρηθούν άκυρα. Η γραµµή κυττάρων αρνητικού ή φυσιολογικού µάρτυρα (ελέγχου) (Α), γνωστή για την επίδειξη µη ενίσχυσης HER2, θα πρέπει να περιέχει 5 κουκίδες στον πυρήνα κάθε κυττάρου. Εάν λάβει χώρα µη συγκεκριµένη χρώση στον πυρήνα κανονικού µάρτυρα (Α), τα αποτελέσµατα που λαµβάνονται για τα δείγµατα του ασθενούς πρέπει να θεωρηθούν άκυρα. Εάν λάβει χώρα µη συγκεκριµένη χρώση, επιδεικνύει συνήθως εµφάνιση διάχυσης χρώσης. Κατά περιστάσεις µπορεί να παρατηρηθούν σποραδικές χρώσεις εκτός του πυρήνα σε τµήµατα του ιστού που έχουν τύχει υπερβολικής επεξεργασίας µε φορµαλίνη. Τα αποτελέσµατα σ' αυτές τις περιπτώσεις πρέπει να ερµηνευτούν µε προσοχή. Μη συγκεκριµένες χρώσεις δεν θα πρέπει να συγχέονται µε τα θετικά σήµατα CISH. Ένας θετικός µάρτυρας ιστού που αποτελείται από ιστό καρκίνου µαστού γνωστό για την επίδειξη ενίσχυσης HER2, εάν χρησιµοποιείται, θα πρέπει να επιδεικνύει την παρουσία συστοιχιών γονιδίων >5 ανεξάρτητων σηµάτων ή κουκίδων ανά πυρήνα σε πλειοψηφία (>50%) κυττάρων καρκινώµατος, κάτι που αποτελεί ένδειξη αναµενόµενης θετικής αντιδραστικότητας. Εάν ο θετικός µάρτυρας ιστού δεν επιδείξει την παρουσία συστοιχιών ή >5 σηµάτων ανά πυρήνα σε ποσοστό >50% των κυττάρων καρκινώµατος, τα αποτελέσµατα που λαµβάνονται για τα δείγµατα του ασθενούς θα πρέπει να θεωρηθούν άκυρα. Ένας αρνητικός µάρτυρας ιστού που αποτελείται από ιστό καρκίνου µαστού γνωστό για την επίδειξη µη ενίσχυσης HER2, εάν χρησιµοποιείται, θα πρέπει να περιέχει <5 σήµατα ανά πυρήνα σε πλειοψηφία κυττάρων καρκινώµατος (>50%). Γενικά, η παρουσία περισσότερων από δύο σηµάτων ή κουκίδων στον πυρήνα του ισοδύναµου φυσιολογικού ιστού (φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα ή στρωµατικά κύτταρα στον όγκο) του θετικού µάρτυρα ιστού επιβεβαιώνει ότι η µήλη και τα αντιδραστήρια ανοσοεντοπισµού δεν αλληλο-αντιδρούν µε τα κυτταρικά ή ιστικά συστατικά. Εάν λάβει χώρα µη συγκεκριµένος χρωµατισµός στον πυρήνα του ισοδύναµου του θετικού µάρτυρα ιστού, τότε τα αποτελέσµατα που λήφθηκαν για τα δείγµατα του ασθενούς θα πρέπει να θεωρούνται άκυρα. Αποκλείσεις στην επεξεργασία ιστού και τις τεχνικές διαδικασίες στο εργαστήριο του χρήστη, πρέπει να επαληθεύονται µια και µπορεί να παράγουν σηµαντική διαφοροποίηση αποτελεσµάτων, καθιστώντας αναγκαία τη συχνή απόδοση των εσωτερικών διαδικασιών ελέγχων του εργαστηρίου, επιπλέον των ακόλουθων διαδικασιών. Ερµηνεία Αξιολόγηση επάρκειας πλακιδίων Οι κουκίδες HER2 CISH (σήµατα) πρέπει να είναι µικρές αλλά ξεκάθαρα ευδιάκριτες µε τη χρήση αντικειµένου 20X 40X. Οι κουκίδες θα εµφανιστούν καφέ έναντι του αντιχρωµατισµού. PI Αναθ. 0.0 Σελίδα 12 από 27

13 Εάν δεν υπάρχουν εµφανείς κουκίδες στο δείγµα, τότε πρέπει να επαναληφθεί ο προσδιορισµός. Παρακαλούµε καλέστε το τµήµα τεχνικής υποστήριξης της Invitrogen στον αριθµό (µόνο στις Η.Π.Α.) για να συζητήσετε ενδεχόµενες αιτίες του προβλήµατος. Εµφάνιση σήµατος CISH ανατρέξτε στο Παράρτηµα Α, «Οδηγός ερµηνείας τεστ HER2 CISH» Οι κουκίδες του HER2 CISH θα εµφανιστούν ως: Μια µονή κουκίδα (Εικόνα Ζ). Μια µονή κουκίδα έχει µια οµαλή, στρογυλεµένη γωνία σε φυσιολογικά κύτταρα ή κύτταρα καρκινώµατος. Μια µονή κουκίδα αντιπροσωπεύει ένα µονό αντίγραφο του γονιδίου HER2. Ένα ζεύγος (Εικόνα H). Οι κουκίδες εµφανίζονται ως «ζεύγη» και δεν αντιπροσωπεύουν πραγµατική µικρή συστοιχία. Εάν δύο σήµατα είναι διαχωρισµένα από διάστηµα µικρότερο από τη διάµετρο ενός σήµατος, τότε αυτά τα σήµατα πρέπει να µετρηθούν ως µία µονή κουκίδα. Το ζεύγος είναι το αποτέλεσµα διαχωρισµού χρωµοσωµάτων, µε κάθε σήµα να βρίσκεται στο ζεύγος των αδελφών χρωµατιδίων. 29 Μια µικρή συστοιχία (Εικόνα Ε). Μια µικρή συστοιχία είναι µια µη φυσιολογικά διαµορφωµένη οµάδα σηµάτων που έχει 3 5 φορές µεγαλύτερη διάµετρο από αυτήν της µονής κουκίδας. Μια µονή κουκίδα από το καρκίνωµα ή φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα από το ίδιο πλακίδιο µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως αναφορά. Μια µεγάλη συστοιχία (Εικόνα Α). Μια µεγάλη συστοιχία είναι µια µη φυσιολογικά διαµορφωµένη οµάδα σηµάτων που έχει 5 φορές µεγαλύτερη διάµετρο από αυτήν της µονής κουκίδας. Μια µονή κουκίδα από το καρκίνωµα ή φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα από το ίδιο πλακίδιο θα πρέπει να χρησιµοποιηθούν ως αναφορά. Σήµα µεγέθυνσης 10X 20X 40X 60X ή 100X Σήµα CISH Οι µονές κουκίδες είναι σπάνια ορατές και παραβλέπονται εύκολα. Οι µονές κουκίδες είναι µικρές αλλά διακρίνονται καθαρά. Οι µονές κουκίδες διακρίνονται καθαρά. Μη αναγκαίο. Επιλογή των στοχευόµενων πεδίων για τη µέτρηση του σήµατος HER2 CISH: Με τη χρήση αντικειµενικής µεγέθυνσης 4X 20X, σαρώστε το χρωµατισµένο µε CISH δείγµα για να καθορίσετε τις περιοχές του διηθητικού καρκινώµατος µε τη µεγαλύτερη ιστοπαθολογική αντιπροσώπευση. Αποφύγετε περιοχές νέκρωσης, ή επικαλυπτόµενα σήµατα λόγω επικάλυψης πυρήνων και πυρήνες µε ασθενή ένταση σήµατος. Αποφύγετε στοιχεία ενδοπορικού (intraductal) καρκινώµατος (DCIS) σε διηθητικά καρκινώµατα. Αξιολογήστε την ενδεχόµενη ετερογένεια της κατάστασης του γονιδίου HER2 πριν τη µέτρηση του CISH. Εάν το δείγµα είναι οµογενές, επιλέξτε µια περιοχή ιστού µε ισχυρά σήµατα CISH για τη µέτρηση του σήµατος. Συνεχίστε µε τη µέτρηση του σήµατος. Εάν το δείγµα έχει ενδο-ογκική ετερογένεια της κατάστασης γονιδίου HER2 στο στοιχείο του διηθητικού καρκινώµατος, επιλέξτε περιοχές που αντιπροσωπεύουν την κατάσταση κάθε γονιδίου HER2 για τη µέτρηση του σήµατος. Ένα δείγµα ιστού είναι ετερογενές εάν η κατάσταση του γονιδίου HER2 (ενισχυµένα και µη ενισχυµένα κύτταρα) ποικίλλει σε διαφορετικές περιοχές του ίδιου τµήµατος ενός πρωτεύοντος καρκίνου του µαστού. Πρέπει να γίνει αξιολόγηση των κυττάρων σε κάθε περιοχή ετερογένειας για να καθοριστεί ποια κατάσταση HER2 (ενισχυµένη ή µη ενισχυµένη) κυριαρχεί σε τµήµα µεγαλύτερο από το 50% του τµήµατος του όγκου. Συνεχίστε µε τη µέτρηση της περιοχής όπου η κατάσταση του HER2 είναι κυρίαρχη για τον εν λόγω όγκο. Μέτρηση σήµατος Χρησιµοποιήστε αντικείµενο 40Χ. Μπορεί να χρησιµοποιηθεί µεγαλύτερο αντικείµενο εάν απαιτείται, αλλά δεν είναι αναγκαία εµβύθιση σε έλαιο. Ανατρέξτε στο Παράρτηµα Α, «Οδηγός ερµηνείας τεστ HER2 CISH». Ένα µεµονωµένο γονίδιο HER2 εµφανίζεται ως µια µικρή, µονή, στρογγυλή κουκίδα (Εικόνα Ζ). Μην µετράτε πυρήνες που επικαλύπτονται ή οποιαδήποτε περιοχή στην οποία οι πυρήνες δεν είναι ορατοί. Μετρήστε µόνο το σήµα CISH που βρίσκεται εντός ενός πυρήνα. Εξαιρέστε περιστασιακά σποραδικά σήµατα, τα οποία µπορεί να οφείλονται σε υπολείµµατα διαρροής (πιτσιλίσµατος) του DNA του HER2 από την επεξεργασία των καρκινικών κυττάρων, εκτός του πυρήνα. PI Αναθ. 0.0 Σελίδα 13 από 27

14 Μη ενίσχυση o Καθορίζεται ως 1 5 µονές κουκίδες στην πλειοψηφία (>50%) των καρκινικών κυττάρων στην επιλεγµένη περιοχή του ιστού. o εν είναι αναγκαία η καταµέτρηση των κουκίδων σε 30 κύτταρα. Προαιρετικό: χρησιµοποιήστε το φύλλο εργασίας στο Παράρτηµα Β, «Φύλλο εργασίας βαθµολογίας HER2 CISH» για όλες τις µετρήσεις κυττάρων. Αναφέρετε τα αποτελέσµατα ως το µέσο όρο των συνολικών µετρήσεων 30 κυττάρων, για να λάβετε ξεκάθαρη διάγνωση µη ενίσχυσης. Ενίσχυση o Καθορίζεται ως: o >5 κουκίδες στην πλειοψηφία (>50%) των καρκινικών κυττάρων στην επιλεγµένη περιοχή του ιστού, ή o Μεγάλες συστοιχίες στην πλειοψηφία (>50%) των καρκινικών κυττάρων στην επιλεγµένη περιοχή του ιστού, ή o Μείγµα πολλαπλών κουκίδων και µεγάλων συστοιχιών στην πλειοψηφία (>50%) των καρκινικών κυττάρων στην επιλεγµένη περιοχή του ιστού, ή o Μείγµα πολλαπλών κουκίδων και µικρών συστοιχιών στην πλειοψηφία (>50%) των καρκινικών κυττάρων στην επιλεγµένη περιοχή του ιστού, ή o Μικρές συστοιχίες στην πλειοψηφία (>50%) των καρκινικών κυττάρων στην επιλεγµένη περιοχή του ιστού. o Για οποιαδήποτε από τις παραπάνω περιπτώσεις, δεν είναι αναγκαία η καταµέτρηση των κουκίδων σε 30 κύτταρα. Προαιρετικό: χρησιµοποιήστε το φύλλο εργασίας στο Παράρτηµα Β, «Φύλλο εργασίας βαθµολογίας HER2 CISH» για τις µετρήσεις κυττάρων. Αναφέρετε τα αποτελέσµατα ως το µέσο όρο των συνολικών µετρήσεων 30 κυττάρων, για να λάβετε ξεκάθαρη διάγνωση ενίσχυσης. Για λόγους µέτρησης, µετρήστε µια µικρή συστοιχία ως 5 κουκίδες και µια µεγάλη συστοιχία ως 10 κουκίδες. o Λογική: Η ανάθεση συγκεκριµένου αριθµού κουκίδων σε µικρές ή µεγάλες συστοιχίες, είναι αυθαίρετη για τους σκοπούς ποσοτικοποίησης. Τα κύτταρα έχουν, φυσιολογικά, δύο αντίγραφα του γονιδίου HER2. Κύτταρα που έχουν αναπαράγει το DNA τους αλλά δεν έχουν ακόµα διαιρεθεί, έχουν 4 αντίγραφα του γονιδίου. Συνεπώς, µια µικρή συστοιχία αποτελεί ένδειξη ενίσχυσης και θα έχει ελάχιστο αριθµό 5 αντιγράφων γονιδίων. Μια µεγάλη συστοιχία, µε τουλάχιστον το διπλό µέγεθος από µια µικρή συστοιχία, θα έχει ελάχιστο αριθµό 10 αντιγράφων γονιδίων. Μη ξεκάθαρες περιπτώσεις ενίσχυσης και µη ενίσχυσης Ερµηνεύστε τα δείγµατα που δεν ανήκουν ξεκάθαρα στις κατηγορίες ενίσχυσης ή µη ενίσχυσης µε προσοχή. Αυτά τα δείγµατα παρουσιάζουν 4 6 κουκίδες στην πλειοψηφία (>50%) των καρκινικών κυττάρων στην επιλεγµένη περιοχή του ιστού. Όταν ο µέσος αριθµός των κουκίδων είναι µεταξύ 4 και 6 µετά από τη µέτρηση 30 κυττάρων καρκινώµατος, θα πρέπει να µετρηθούν 30 επιπλέον κύτταρα για σύνολο 60 κυττάρων. Εάν έχετε ακόµα αµφιβολίες, τότε ο προσδιορισµός µπορεί να επαναληφθεί µε πλακίδιο µε φρέσκο δείγµα. Αναφέρετε τα αποτελέσµατα µε τη χρήση του φύλλου εργασίας στο Παράρτηµα B, «Φύλλο εργασίας βαθµολογίας HER2 CISH». 1. Μετρήστε τις κουκίδες σε 30 κύτταρα όγκου στην επιλεγµένη περιοχή του ιστού. Ανατρέξτε στο θέµα υπ' αρ. 4 παρακάτω εάν υπάρχουν µικρές συστοιχίες. 2. Αθροίστε το συνολικό αριθµό των κουκίδων στα 30 κύτταρα και υπολογίστε το µέσο όρο. 3. Καταγράψτε τα αποτελέσµατα βάσει του µέσου όρου των 60 κυττάρων. 4. Εάν παρατηρήσετε µείγµα µονών κουκίδων και µικρών συστοιχιών (λόγω δηµιουργίας συστοιχιών αρκετών µονών κουκίδων), ή παρατηρήσετε µόνο µικρές συστοιχίες: Μετρήστε µία µικρή συστοιχία ως 5 κουκίδες. Μια µονή κουκίδα από το καρκίνωµα ή φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα από το ίδιο πλακίδιο µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως αναφορά για τον καθορισµό του τι αντιπροσωπεύει µια µικρή συστοιχία. 5. Αναφέρετε τα αποτελέσµατα ως το µέσο όρο των συνολικών µετρήσεων 60 κυττάρων, για να λάβετε διάγνωση είτε ενίσχυσης, είτε µη ενίσχυσης σύµφωνα µε την κατευθυντήρια οδηγία της Invitrogen. Αναφορά των αποτελεσµάτων PI Αναθ. 0.0 Σελίδα 14 από 27

15 Τα αποτελέσµατα µπορούν να αναφέρονται µε τη χρήση του φύλλου εργασίας στο Παράρτηµα Β, «Φύλλο εργασίας βαθµολογίας HER2 CISH». Η αναφορά κατάστασης του HER2 πρέπει να καταγραφεί σύµφωνα µε την κατευθυντήρια οδηγία της Invitrogen, ειδικά για µη ξεκάθαρες περιπτώσεις ενίσχυσης ή µη ενίσχυσης. Περίληψη ερµηνείας Ενίσχυση Μη ενίσχυση >5 κουκίδες, ή µεγάλες συστοιχίες, ή µείγµα πολλαπλών κουκίδων και µεγάλων συστοιχιών, ή µείγµα πολλαπλών κουκίδων και µικρών συστοιχιών, ή µικρών συστοιχιών του γονιδίου HER2 που είναι παρούσες ανά πυρήνα στην πλειοψηφία (>50%) των κυττάρων του καρκινώµατος στην περιοχή του ιστού που έχει επιλεχθεί για µέτρηση. είτε τις εικόνες Α, Β, Γ, και Ε στο Παράρτηµα Α, «Οδηγός ερµηνείας τεστ CISH του HER2». Μια µεγάλη συστοιχία είναι µια µη φυσιολογικά διαµορφωµένη οµάδα σηµάτων που έχει 5 φορές µεγαλύτερη διάµετρο από αυτήν µιας µονής κουκίδας. Μια µονή κουκίδα από το καρκίνωµα ή φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα από το ίδιο πλακίδιο πρέπει να χρησιµοποιηθεί ως αναφορά. είτε Παράρτηµα Α, Εικόνα Α. Μια µικρή συστοιχία είναι µια µη φυσιολογικά διαµορφωµένη οµάδα σηµάτων που έχει 3 5 φορές µεγαλύτερη διάµετρο από αυτήν µιας µονής κουκίδας. Μια µονή κουκίδα από το καρκίνωµα ή φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα από το ίδιο πλακίδιο πρέπει να χρησιµοποιηθεί ως αναφορά. είτε Παράρτηµα Α, Εικόνα Ε. 1 5 κουκίδες του γονιδίου HER2 που είναι παρόν ανά πυρήνα στην πλειοψηφία (>50%) των κυττάρων του καρκινώµατος στην περιοχή του ιστού που έχει επιλεχθεί για µέτρηση. είτε το Παράρτηµα Α, Εικόνα ΣΤ, Εικόνα Ζ και Εικόνα Η. Μια µονή κουκίδα έχει µια οµαλή, στρογυλεµένη γωνία και παρουσιάζεται σε φυσιολογικά κύτταρα και κύτταρα καρκινώµατος. PI Αναθ. 0.0 Σελίδα 15 από 27

16 Αναµενόµενες τιµές Η επικράτηση του ενισχυµένου γονιδίου HER2 στο γενικό πληθυσµό των γυναικών µε καρκίνο του µαστού είναι 18 30%. (8,9) Όταν γίνεται σύγκριση της ενίσχυσης του γονιδίου HER2 µε υπερέκφραση της πρωτεΐνης του HER2, οι µελέτες έχουν δείξει ότι έως 5% των ασθενών µε καρκίνο του µαστού είναι θετικές για υπερέκφραση της πρωτεΐνης όταν εξετάζονται ανοσοϊστοχηµικά (IHC), αλλά αρνητικές για την ενίσχυση του γονιδίου HER2. (10) Ιδιαίτερα χαρακτηριστικά απόδοσης Κλινική απόδοση Η ασφάλεια και αποτελεσµατικότητα του κιτ SPOT-Light HER2 CISH αξιολογήθηκε σε συγκριτική µελέτη τριών τεστ: του κιτ SPOT-Light HER2 CISH, του PathVysion FISH και του τεστ HercepTest. Η µελέτη συµπεριλάµβανε δύο σετ περιπτώσεων: 226 αλληλοδιάδοχες περιπτώσεις και 60 συµπληρωµατικές περιπτώσεις. Οι αλληλοδιάδοχες περιπτώσεις επιλέχθηκαν από τις αλληλοδιάδοχες περιπτώσεις διηθητικού καρκίνου του µαστού που εξετάστηκαν για τη θεραπεία των ασθενών σε δύο κέντρα της µελέτης (κέντρα Α & Β). Οι συµπληρωµατικές περιπτώσεις ήταν περιπτώσεις που είχαν βαθµολογηθεί µε 2+ µε ανοσοϊστοχηµικό τρόπο (IHC) (µε τη χρήση του αντισώµατος ΑΒ8) κατά τη θεραπεία των ασθενών στο κέντρο Α. A. Αλληλοδιάδοχες περιπτώσεις Ο ακόλουθος πίνακας συνοψίζει την κατανοµή των αποτελεσµάτων CISH και FISH σε σχέση µε τις βαθµολογίες HercepTest. Ένα τεστ θεωρήθηκε έγκυρο όταν το χρωµατισµένο πλακίδιο που προέκυψε ήταν αποδεκτό για αξιολόγηση. Πίνακας 1: Αποτελέσµατα των IHC, FISH και CISH Έκφραση πρωτεΐνης, βαθµολογία HercepTest Σύνολο Περιπτώσεις IHC (N) (%) 1 63,8% 8,6% 9,5% 18,1% 100% Λόγος γονιδίων µε κατάσταση FISH HER2 Αριθµός έγκυρων περιπτώσεων FISH Ενισχυµένο n (%) 3 1 (0,5) 0 (0,0) 5 (2,3) 31 (14,2) 37 Μη ενισχυµένο n (%) (63,8) 19 (8,7) 16 (7,3) 7 (3,2) 181 Αντίγραφα γονιδίων µε κατάσταση CISH HER2 Αριθµός έγκυρων περιπτώσεων CISH Ενισχυµένο n (%) 3 1 (0,5) 0 (0,0) 3 (1,5) 32 (15,5) 36 Μη ενισχυµένο n (%) (63,6) 17 (8,3) 16 (7,8) 6 (2,9) % = N Σύνολο N 100% 2 Αριθµός έγκυρων περιπτώσεων FISH (ή CISH) µε την αντίστοιχη βαθµολογία IHC. 3 % = n Σύνολο περιπτώσεων έγκυρων FISH (ή CISH) 100% Αποτελέσµατα CISH Πίνακας 2: Συµφωνία µεταξύ CISH και IHC Αποτελέσµατα IHC Θετικά (3+) Αρνητικά (<3+) Σύνολο Ενισχυµένα Μη ενισχυµένα Σύνολο Αναφέρθηκαν 20 περιπτώσεις µε αποτελέσµατα τεστ IHC ή CISH που έλειπαν ή ήταν άκυρα και εξαιρέθηκαν από τον πίνακα. Θετική συµφωνία = 32/38 = 84,2% (95% CI: 68,8%, 94,0%) Αρνητική συµφωνία = 164/168 = 97,6% (95% CI: 94,0%, 99,4%) Σύνολο ποσοστιαίας συµφωνίας = (32+164)/206 = 95,1% (95% CI: 91,3%, 97,7%) Τα αποτελέσµατα έδειξαν συµφωνία σε ποσοστό 95,1% (95%CI: 91,3% 97,7%), κάτι που καθορίζει ισχυρή συµφωνία µεταξύ του κιτ SPOT-Light HER2 CISH και του τεστ HerceptTest. PI Αναθ. 0.0 Σελίδα 16 από 27

17 Αποτελέσµατα CISH Πίνακας 3: Συµφωνία µεταξύ CISH και FISH Αποτελέσµατα FISH Ενισχυµένα Μη ενισχυµένα Σύνολο Ενισχυµένα Μη ενισχυµένα Σύνολο Αναφέρθηκαν 21 περιπτώσεις µε αποτελέσµατα τεστ FISH ή CISH που έλειπαν ή ήταν άκυρα και εξαιρέθηκαν από τον πίνακα. Θετική συµφωνία = 34/36 = 94,4% (95% CI: 81,3%, 99,3%) Αρνητική συµφωνία = 169/169 = 100,0% (95% CI: 97,8%, 100,0%) Σύνολο ποσοστιαίας συµφωνίας = (34+169)/205 = 99,0% (95% CI: 96,5%, 99,9%) Τα αποτελέσµατα έδειξαν συµφωνία σε ποσοστό 99,0% (95% CI: 96,5% 99,9%), κάτι που καθορίζει ισχυρή συµφωνία µεταξύ του κιτ SPOT-Light HER2 CISH και του τεστ PathVysion HER2. Συνεπώς, ο λόγος συµφωνίας καθόρισε ότι το τεστ του κιτ SPOT-Light HER2 CISH απέδωσε αποτελέσµατα που ήταν ισοδύναµα µε το τεστ PathVysion HER2. Παρακάτω παρουσιάζεται µια περίληψη 2 ασύµφωνων περιπτώσεων µεταξύ του τεστ µήλης SPOT-Light HER2 και του τεστ µήλης PathVysion HER2. Τα δεδοµένα των CISH και FISH παρουσιάζονται ως µέσος όρος και κλίµακα και η στήλη IHC παρουσιάζει τη βαθµολογία του τεστ HercepTest. Αριθµός περίπτωσης Πίνακας 4: Περιπτώσεις ασυµφωνίας µεταξύ FISH και CISH HER2 CISH (Θετ.)/FISH (Αρν,) CISH FISH IHC Αριθµός περίπτωσης (2, 0,98%) 1 HER2 CISH (Αρν.)/FISH (Θετ.) CISH FISH IHC A ,07 (1,00 10,00) 2,81 (1,67 5,00) 2+ B-008 2,77 (2,00 4,00) 2,65 (1,00 6,00) 2+ 1 % = αριθµός περιπτώσεων ασυµφωνίας δια του συνολικού αριθµού περιπτώσεων µε έγκυρα τεστ FISH και CISH από το αντίστοιχο κέντρο 100% B. Συµπληρωµατικές περιπτώσεις IHC 2+ Παρασχέθηκαν 60 πρόσθετες περιπτώσεις IHC 2+ από το κέντρο µελέτης Α και δοκιµάστηκαν στα κέντρα µελέτης Α και Β. Τα αποτελέσµατα σε κάθε κέντρο µελέτης επέδειξαν ότι το τεστ του κιτ SPOT-Light HER2 CISH απέδωσε αποτελέσµατα που ήταν ισοδύναµα µε το τεστ PathVysion HER2. Ο συσχετισµός των αποτελεσµάτων συνοψίζεται στους Πίνακες 5 και 6. Πίνακας 5: Συµφωνία µεταξύ των τεστ CISH και FISH στο κέντρο µελέτης A σε περιπτώσεις IHC 2+ Αποτελέσµατα CISH Αποτελέσµατα FISH Ενισχυµένα Μη ενισχυµένα Σύνολο Ενισχυµένα Μη ενισχυµένα Σύνολο περιπτώσεις αναφέρθηκαν µε ελλείψεις ή µη εγκυρότητα Θετική συµφωνία = 6/8 = 75,0% (95% CI: 34,9%, 96,8%) Αρνητική συµφωνία = 46/46 = 100,0% (95% CI: 92,3%, 100,0%) Σύνολο ποσοστιαίας συµφωνίας = (6+46)/54 = 96,3% (95% CI: 87,3%, 99,6%) Πίνακας 6: Συµφωνία µεταξύ των τεστ CISH και FISH στο κέντρο µελέτης Β σε περιπτώσεις IHC 2+ Αποτελέσµατα CISH Αποτελέσµατα FISH Ενισχυµένα Μη ενισχυµένα Σύνολο Ενισχυµένα Μη ενισχυµένα Σύνολο περιπτώσεις αναφέρθηκαν µε ελλείψεις ή µη εγκυρότητα Θετική συµφωνία = 7/9 = 77,8% (95% CI: 40,0%, 97,2%) Αρνητική συµφωνία = 45/47 = 95,7% (95% CI: 85,5%, 99,5%) Σύνολο ποσοστιαίας συµφωνίας = (7+45)/56 = 92,9% (95% CI: 82,7%, 98,0%) PI Αναθ. 0.0 Σελίδα 17 από 27

18 Αριθµός περίπτωσης Πίνακας 7: Περιπτώσεις ασυµφωνίας IHC 2+ µεταξύ CISH και FISH HER2 CISH (Θετ.)/FISH (Αρν,) CISH FISH IHC Αριθµός περίπτωσης Κέντρο A (2, 3,70%) 1 HER2 CISH (Αρν.)/FISH (Θετ.) CISH FISH IHC S ,77 (1,00 5,00) 2,48 (0,50 5,00) 2+ S ,67 (1,00 7,00) 2,34 (0,50 8,00) 2+ Κέντρο B (4, 7,14%) 1 S-171 5,20 (2,00 8,00) 1,08 (0,50 2,00) 3+ S-156 5,00 (1,00 9,00) 2,23 (1,00 5,00) 3+ 1 S ,00 (20,00 20,00) 1,25 (0,50 2,00) 0 S-183 4,13 (3,00 6,00) 2,73 (1,00 6,00) 0 % = αριθµός περιπτώσεων ασυµφωνίας δια του συνολικού αριθµού περιπτώσεων µε έγκυρα τεστ FISH και CISH από το αντίστοιχο κέντρο 100% Γ. Περιπτώσεις HercepTest 2+ Όλες οι αλληλοδιάδοχες και συµπληρωµατικές περιπτώσεις υποβλήθηκαν σε δοκιµή µε το τεστ HercepTest. Περιπτώσεις που απέδωσαν βαθµολογίες στο τεστ HercepTest 2+ συνδυάστηκαν και δοκιµάστηκαν σε αµφότερα τα κέντρα της µελέτης. Τα αποτελέσµατα σε κάθε κέντρο µελέτης επέδειξαν ότι το τεστ του κιτ SPOT-Light HER2 CISH απέδωσε αποτελέσµατα που ήταν ισοδύναµα µε το τεστ PathVysion HER2. Ο συσχετισµός των αποτελεσµάτων συνοψίζεται στους Πίνακες 8 και 9. Πίνακας 8: Συµφωνία µεταξύ των τεστ CISH και FISH στο κέντρο µελέτης Α σε περιπτώσεις HercepTest 2+ Αποτελέσµατα CISH Αποτελέσµατα FISH Ενισχυµένα Μη ενισχυµένα Σύνολο Ενισχυµένα Μη ενισχυµένα Σύνολο Αναφέρθηκαν 2 περιπτώσεις µε αποτελέσµατα τεστ FISH ή CISH που έλειπαν ή ήταν άκυρα και εξαιρέθηκαν από τον πίνακα. Θετική συµφωνία = 3/7 = 42,9% (95% CI: 9,9%, 81,6%) Αρνητική συµφωνία = 27/27 = 100,0% (95% CI: 87,2%, 100,0%) Σύνολο ποσοστιαίας συµφωνίας = (3+27)/34 = 88,2% (95% CI: 72,6%, 96,7%) Πίνακας 9: Συµφωνία µεταξύ των τεστ CISH και FISH στο κέντρο µελέτης Β σε περιπτώσεις HercepTest 2+ Αποτελέσµατα CISH Αποτελέσµατα FISH Ενισχυµένα Μη ενισχυµένα Σύνολο Ενισχυµένα Μη ενισχυµένα Σύνολο Αναφέρθηκαν 2 περιπτώσεις µε αποτελέσµατα τεστ FISH ή CISH που έλειπαν ή ήταν άκυρα και εξαιρέθηκαν από τον πίνακα. Θετική συµφωνία = 4/5 = 80,0% (95% CI: 28,4%, 99,5%) Αρνητική συµφωνία = 35/36 = 97,2% (95% CI: 85,5%, 99,9%) Σύνολο ποσοστιαίας συµφωνίας = (4+35)/41 = 95,1% (95% CI: 83,5%, 99,4%) Αριθµός περίπτωσης Πίνακας 10: Περιπτώσεις ασυµφωνίας µεταξύ CISH και FISH στο τεστ HercepTest 2+ HER2 CISH (Θετ.)/FISH (Αρν,) CISH FISH IHC Αριθµός περίπτωσης Κέντρο A (4, 11,76%) 1 HER2 CISH (Αρν.)/FISH (Θετ.) CISH FISH IHC A ,07 (1,00 10,00) 2,81 (1,67 5,00) 2+ B ,77 (1,00 4,00) 2,45 (1,00 5,00) 2+ S ,77 (1,00 5,00) 2,48 (0,50 5,00) 2+ S ,67 (1,00 7,00) 2,34 (0,50 8,00) 2+ Κέντρο B (2, 4,88%) 1 A-023 5,20 (2,00 8,00) 1,49 (0,67 3,50) 2+ B-008 2,77 (2,00 4,00) 2,65 (1,00 6,00) 2+ 1 % = αριθµός περιπτώσεων ασυµφωνίας δια του συνολικού αριθµού περιπτώσεων µε έγκυρα τεστ FISH και CISH από το αντίστοιχο κέντρο 100% PI Αναθ. 0.0 Σελίδα 18 από 27

19 . Περιπτώσεις πολυσωµίας ύο κέντρα της µελέτης αξιολόγησαν τις περιπτώσεις πολυσωµίας βάσει των αντίστοιχων κλινικών τους πρακτικών. Στο κέντρο A, η πολυσωµία του χρωµοσώµατος 17 καθορίστηκε ως η παρουσία 3 CEP17 σηµάτων σε τουλάχιστον 10% των κυττάρων του όγκου, ενώ στην περίπτωση Β τα κριτήρια ήταν η παρουσία 3 CEP17 σηµάτων σε τουλάχιστον 30% των κυττάρων του όγκου. Το ποσοστό των όγκων µε πολυσωµία χρωµοσώµατος 17 ήταν 18,68% στο Κέντρο Α και 7,91% στο κέντρο Β. Το ποσοστό εντοπισµού της πολυσωµίας στο ίδιο σετ όγκων ποίκιλε σηµαντικά µεταξύ των δύο κέντρων της δοκιµής λόγω της διαφοράς στον ορισµό της πολυσωµίας που χρησιµοποιήθηκε σε κάθε κέντρο. Το επίπεδο συµφωνίας που λήφθηκε ανεξάρτητα σε κάθε κέντρο της µελέτης καθόρισε ότι το κιτ SPOT-Light HER2 CISH απέδωσε αποτελέσµατα που ήταν ισοδύναµα µε το τεστ PathVysion HER2. Τα αποτελέσµατα συνοψίζονται στους Πίνακες 11 και 12. Πίνακας 11: Συµφωνία µεταξύ των τεστ CISH και FISH στο κέντρο µελέτης Α σε περιπτώσεις πολυσωµίας Αποτελέσµατα CISH Αποτελέσµατα FISH Ενισχυµένα Μη ενισχυµένα Σύνολο Ενισχυµένα Μη ενισχυµένα Σύνολο Αναφέρθηκαν 3 περιπτώσεις µε αποτελέσµατα τεστ FISH ή CISH που έλειπαν ή ήταν άκυρα και εξαιρέθηκαν από τον πίνακα. Θετική συµφωνία = 12/14 = 85,7% (95% CI: 57,2%, 98,2%) Αρνητική συµφωνία = 34/34 = 100,0% (95% CI: 89,7%, 100,0%) Σύνολο ποσοστιαίας συµφωνίας = (12+34)/48 = 95,8% (95% CI: 85,8%, 99,5%) Πίνακας 12: Συµφωνία µεταξύ των τεστ CISH και FISH στο κέντρο µελέτης Β σε περιπτώσεις πολυσωµίας Αποτελέσµατα CISH Αποτελέσµατα FISH Ενισχυµένα Μη ενισχυµένα Σύνολο Ενισχυµένα Μη ενισχυµένα Σύνολο Αναφέρθηκαν 0 περιπτώσεις µε αποτελέσµατα τεστ FISH ή CISH που έλειπαν ή ήταν άκυρα και εξαιρέθηκαν από τον πίνακα. Θετική συµφωνία = 12/12 = 100,0% (95% CI: 73,5%, 100,0%) Αρνητική συµφωνία = 9/10 = 90,0% (95% CI: 55,5%, 99,8%) Σύνολο ποσοστιαίας συµφωνίας = (12+9)/22 = 95,5% (95% CI: 77,2%, 99,9%) Πίνακας 13: Περιπτώσεις ασυµφωνίας πολυσωµίας µεταξύ CISH και FISH HER2 CISH (Θετ.)/FISH (Αρν,) Αριθµός CISH FISH IHC Αριθµός περίπτωσης περίπτωσης Κέντρο A (2, 4,17%) 1 HER2 CISH (Αρν.)/FISH (Θετ.) CISH FISH IHC A ,07 (1,00 10,00) 2,81 (1,67 5,00) 2+ S ,77 (1,00 5,00) 2,48 (0,50 5,00) 2+ Κέντρο B (1, 4,55%) 1 A-023 5,20 (2,00 1,49 (0,67 3,50) 2+ 8,00) 1 % = αριθµός περιπτώσεων ασυµφωνίας δια του συνολικού αριθµού περιπτώσεων µε έγκυρα τεστ FISH και CISH από το αντίστοιχο κέντρο 100% PI Αναθ. 0.0 Σελίδα 19 από 27

20 Ε. Περίληψη των αποτελεσµάτων σύγκρισης µεταξύ του κιτ SPOT-Light HER2 CISH και του κιτ µήλης DNA PathVysion HER2 Πίνακας 14: Περίληψη του κιτ SPOT-Light HER2 CISH και του κιτ µήλης DNA PathVysion HER2 Τύποι περιπτώσεων Αλληλοδιάδοχες περιπτώσεις Συµπληρωµατικές περιπτώσεις Αµφίσηµες περιπτώσεις Περιπτώσεις πολυσωµίας Κέντρο Α Κέντρο Β Κέντρο Α Κέντρο Β Κέντρο Α Κέντρο Β Αριθµός δειγµάτων % θετική συµφωνία 94,4% 75,0% 77,8% 42,9% 80,0% 85,7% 100,0% % αρνητική συµφωνία 100,0% 100,0% 95,7% 100,0% 97,2% 100,0% 90,0% Συνολικό % συµφωνίας 99,0% 96,3% 92,9% 88,2% 95,1% 95,8% 95,5% Αναλυτική ευαισθησία Η ευαισθησία του κιτ SPOT-Light HER2 CISH δοκιµάστηκε µε τη χρήση τµηµάτων ιστών καρκίνου του µαστού FFPE µε µη ενισχυµένη και ενισχυµένη κατάσταση HER2, όπως και µε γραµµές κυττάρων FFPE που χρησιµοποιήθηκαν στα πλακίδια ελέγχου. Το γονίδιο HER2 εντοπίστηκε (ανιχνεύτηκε) ως µονή κουκίδα στο τµήµα του ιστού και το τµήµα του µπλοκ κυττάρων µε φυσιολογικό γονίδιο HER2. Κάθε ενισχυµένο και µη ενισχυµένο δείγµα επέδειξε ένταση χρωµατισµού 3+ και καλή µορφολογία ιστού. Αποτελεσµατικότητα υβριδισµού Η αποτελεσµατικότητα του υβριδισµού καθιερώθηκε µε δοκιµή (τεστ) 2 δειγµάτων ιστών (1 ενισχυµένο, 1 µη ενισχυµένο, 10 τµήµατα το καθένα) και 4 δειγµάτων γραµµών κυττάρων (2 ενισχυµένες, 2 µη ενισχυµένες). Κάθε δείγµα αναλύθηκε για τον αριθµό των κυττάρων µε σήµατα HER2 από το συνολικό αριθµό των κυττάρων που αναλύθηκαν ( κύτταρα). Η αποτελεσµατικότητα του υβριδισµού καθιερώθηκε σε ποσοστό 94,7 100%. Για χρωµατισµό CISH σε 226 κλινικά δείγµατα από 3 εργαστήρια, το ποσοστό αποτυχίας σε κάθε κέντρο ήταν 8,4% (19), 1,3% (3) και 0,9% (2). (28) Αναλυτική προσδιοριστικότητα Για τον καθορισµό της προσδιοριστικότητας, πραγµατοποιήθηκαν µελέτες µετάφασης σε κυτογενετικά προπαρασκευασµένα πλακίδια, πραγµατοποιήθηκε PCR µε τη χρήση συγκεκριµένου ανά γονίδιο HER2 ζεύγους εκκινητή στο υπόδειγµα της µήλης DNA του HER2 και πραγµατοποιήθηκε ακολουθία DNA για αµφότερα τα άκρα των κλώνων BAC στη µήλη DNA του HER2. Η µήλη SPOT-Light CISH HER2 επέδειξε συγκεκριµένη δέσµευση (πρόσδεση) στη θέση του γονιδίου HER2 στην ταινία του χρωµοσώµατος 17q Η τοπικοποίηση του χρωµοσώµατος καθιερώθηκε µέσω µετάφασης FISH σε φυσιολογικά λεµφοκύτταρα. Η δοκιµή PCR επέδειξε ότι η επιθυµητή ταινία DNA και η ακολουθία DNA επέδειξαν τη σωστή θέση του χρωµοσώµατος και την κάλυψη του γονιδίου HER2. ιαδικαστικοί περιορισµοί Η διαδικασία SPOT-Light HER2 CISH δοκιµάστηκε στα ακραία όρια κάθε µίας από τις ακόλουθες παραµέτρους: πάχος ιστού, προ-επεξεργασία, µετουσίωση, υβριδισµός, περιορισµένη έκπλυση, ανοσοεντοπισµός και αντιχρωµατισµός. εν παρατηρήθηκαν σηµαντικές διαφορές στα αποτελέσµατα της CISH κάτω από τις ακόλουθες συνθήκες: Πίνακας 15: ιαδικαστικοί περιορισµοί Αποδεκτές κλίµακες παραµέτρων προσδιορισµού Πάχος ιστού 4 6 µm Θερµική προεπεξεργασία C λεπτά Πέψη ενζύµων 4-14 λεπτά Μετουσίωση Θερµικός ανακυκλωτής PCR C 2-8 λεπτά Υβριδισµός C ώρες Περιορισµένη έκπλυση C 2 8 λεπτά Ανοσοεντοπισµός Πολυµερές σύζευγµα HRP 25v60 λεπτά Χρωµογόνο DAB λεπτά Αντιχρωµατισµός 3 30 δευτερόλεπτα PI Αναθ. 0.0 Σελίδα 20 από 27