ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΑΘΑΝΑΣΙΑ ΜΟΥΖΑΚΗ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΑΘΑΝΑΣΙΑ ΜΟΥΖΑΚΗ «Ταυτοποίηση μεταγραφικών παραγόντων που ρυθμίζουν την έκφραση κυτταροκινών σε αναπτυσσόμενα Τ κύτταρα» ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΚΑΡΑΓΙΑΝΝΗΣ ΦΩΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ 2016

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγήτρια Μουζάκη Αθανασία (Επιβλέπουσα Καθηγήτρια-Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) Αναπληρωτής Καθηγητής Παπαχρήστου Διονύσιος (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) Ερευνήτρια Β' Πανουτσακοπούλου Βίλη ( Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Επιστημών Ακαδημίας Αθηνών) ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγήτρια Μουζάκη Αθανασία (Επιβλέπουσα Καθηγήτρια-Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) Αναπληρωτής Καθηγητής Παπαχρήστου Διονύσιος (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) Ερευνήτρια Β' Πανουτσακοπούλου Βίλη (Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Επιστημών Ακαδημίας Αθηνών) Καθηγητής Παπαθανασόπουλος Παναγιώτης (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) Καθηγητής Θυφρονίτης Γιώργος (Τμήμα Βιολογικών Εφαρμογών και Τεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων) Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Σύρρου Μαρίκα (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων) Λέκτορας Ροσμαράκη Ελευθερία (Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών)

3 Θα ήθελα να ευχαριστήσω την καθηγήτρια κ. Μουζάκη Αθανασία, που μου έδωσε την δυνατότητα να εκπονήσω τη διδακτορική μου διατριβή, στο εργαστήριο της Αιματολογίας, καθώς και για τις πολύτιμες συμβουλές και παρατηρήσεις της, που συνέβαλλαν στην ολοκλήρωση της και στη συγγραφή αυτού του κειμένου. Η καθοδήγηση της ήταν καθοριστική και συνέβαλλε σε μεγάλο βαθμό στη βελτίωση μου σε ερευνητικό επίπεδο, αλλά και στη καλύτερη κατανόηση της λειτουργίας του ανθρώπινου ανοσοποιητικού συστήματος. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω θερμά, τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Παπαχρήστου Διονύσιο για τη βοήθεια που μου παρείχε σε ένα σημαντικό πειραματικό κομμάτι της διατριβής μου, αλλά και την ερευνήτρια κ. Πανουτσακοπούλου Βίλη για τη συμμετοχή τους στη τριμελή μου συμβουλευτική επιτροπή και για τις πολύτιμες συμβουλές τους. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω και τα υπόλοιπα μέλη της εξεταστικής επιτροπής, τον καθηγητή κ. Παπαθανασόπουλο Παναγιώτη, τον καθηγητή κ. Θυφρονίτη Γιώργο, την αναπληρώτρια καθηγήτρια κ. Σύρρου Μαρίκα και τη λέκτορα κ. Ροσμαράκη Ελευθερία, που μου έκαναν τη τιμή να συμμετέχουν σε αυτή. Ένα μεγάλο ευχαριστώ και στον Γεωργακόπουλο Τάσο, ο οποίος με βοήθησε με τις γνώσεις και την εμπειρία του σε οτιδήποτε χρειάστηκα. Ιδιαίτερη μνεία πρέπει να γίνει και στα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου με τα οποία συνεργάστηκα άψογα και συνέβαλαν στη δημιουργία ενός φιλικού κλίματος που έκανε τον χρόνο να περνάει ευχάριστα. Έτσι θα ήθελα να ευχαριστήσω, τον Παναγούλια Ιωάννη, την Αγγελετοπούλου Ιωάννα, την Αναστασοπούλου Ρούλα, την Πάππου Έφη, τη Σπαντιδέα Παναγιώτα και τη Ρόδη Μαρία. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω και τους ερευνητές των υπόλοιπων εργαστηρίων του τμήματος της Ιατρικής, με τους οποίους συνεργάστηκα κατά τη διάρκεια της διδακτορικής μου διατριβής. ΚΑΡΑΓΙΑΝΝΗΣ ΦΩΤΗΣ

4 Πίνακας περιεχομένων ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 5 SUMMARY... 8 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το ανθρώπινο ανοσοποιητικό σύστημα Ανάπτυξη των Τ λεμφοκυττάρων στον θύμο αδένα Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα (Th cells CD4+) Παρθενικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα (naïve Th cells CD4+CD45RA+) Διαφοροποιημένοι Τ βοηθητικοί κυτταρικοί υποπληθυσμοί λεμφοκυττάρων (Th effector lineages) Μεταγραφική ρύθμιση και διαφοροποίηση των παρθενικών Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων Th1 Διαφοροποίηση Th2 Διαφοροποίηση Th17 Διαφοροποίηση Treg Διαφοροποίηση Μνημονικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα (memory Th cells CD4+CD45RO+) Ενεργοποίηση των παρθενικών Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων Ιντερλευκίνη 2 (IL-2) Μεταγραφικός παράγοντας ETS Οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων NFAT Μεταγραφικός παράγοντας FoxP Αυτοάνοσα νοσήματα Σκλήρυνση κατά πλάκας ΣΚΟΠΟΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Κύτταρα - Ιστοί Καλλιέργειες κυττάρων... 50

5 Απομόνωση υποπληθυσμών Τ λεμφοκυττάρων Κυτταρομετρία ροής Μαγνητικός διαχωρισμός κυττάρων RT-PCR και Real-time PCR Απομόνωση RNA από τα κύτταρα Κατασκευή cdna και RT-PCR Real-time PCR Ανοσοφθορισμός Immuno-DNA FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) Ανοσοϊστοχημεία Western blot Ανοσοκατακρήμνιση πρωτεϊνών ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μεταγραφική ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της IL-2 στην κυτταρική σειρά Jurkat Έκφραση και κυτταρικός εντοπισμός του Ets Πρόσδεση του Ets-2 στον υποκινητή του γονιδίου της IL Αλληλεπίδραση του Ets-2 με τον NFAT Έκφραση και εντοπισμός των Ets-2, FoxP3 και NFAT σε λεμφικά όργανα Μελέτη του επιπέδου ενεργοποίησης και της έκφρασης IL-2 T κυτταρικών υποπληθυσμών ασθενών με Σκλήρυνση κατά πλάκας σε σύγκριση με υγιείς δότες.. 81 Μεταγραφική ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της IL-2 σε απομονωμένα παρθενικά και μνημονικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα φυσιολογικών δοτών και ασθενών με σκλήρυνση κατά πλάκας Έκφραση και κυτταρικός εντοπισμός του Ets-2 σε υποπληθυσμούς CD4+ Τ λεμφοκυττάρων φυσιολογικών δοτών Έκφραση και κυτταρικός εντοπισμός του Ets-2 σε υποπληθυσμούς CD4+ Τ λεμφοκυττάρων ασθενών με σκλήρυνση κατά πλάκας Πρόσδεση του Ets-2 στον υποκινητή του γονιδίου της IL-2, σε φυσιολογικούς δότες Πρόσδεση του Ets-2 στον υποκινητή του γονιδίου της IL-2, σε ασθενείς με σκλήρυνση κατά πλάκας... 92

6 Έκφραση και κυτταρικός εντοπισμός του FoxP3 σε ρυθμιστικά Τ λεμφοκύτταρα φυσιολογικών δοτών και ασθενών με σκλήρυνση κατά πλάκας Πρόσδεση του Ets-2 στον υποκινητή του γονιδίου ets-2 και αυτορρύθμιση της έκφρασης του ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 5

8 Η ενεργοποίηση και διαφοροποίηση των παρθενικών Τ βοηθητικών (Th) λεμφοκυττάρων σε διακριτούς λειτουργικούς υποπληθυσμούς είναι κρίσιμη για τη σωστή άμυνα και ανοσορύθμιση του οργανισμού. Οι υποπληθυσμοί αυτοί θεωρούνται ως διαφορετικές γενιές κυττάρων και καθορίζονται από την έκφραση συγκεκριμένων κυτταροκινών και μεταγραφικών παραγόντων. Όταν τα παρθενικά Th κύτταρα λάβουν το ερέθισμα για να ενεργοποιηθούν, μέσω του TCR υποδοχέα τους, διαφοροποιούνται σε διαιρούμενα Th0 προγονικά κύτταρα, πριν από τη περαιτέρω διαφοροποίηση τους σε κάποιον από τους υποπληθυσμούς Th κυττάρων τελεστών. Η πρώτη κυτταροκίνη που παράγεται κατά τη διαδικασία αυτή είναι η IL-2, η οποία είναι υπεύθυνη για τον πολλαπλασιασμό και τη κλωνική επέκταση των T κυττάρων. Σκοπός της διατριβής αυτής είναι η μελέτη της ρύθμισης της έκφρασης της IL- 2 στα Th λεμφοκύτταρα, μέσω της πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων στον υποκινητή του γονιδίου της. Πιο συγκεκριμένα θα διερευνηθεί ο ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα Ets-2 στη ρύθμιση της έκφρασης της IL-2 σε Th λεμφοκύτταρα, σε αντιπαραβολή με τους γνωστούς μεταγραφικούς παράγοντες NFAT και Foxp3, οι οποίοι έχουν την ίδια βάση πρόσδεσης στον υποκινητή της IL-2, καθώς και η συσχέτιση του με τη παθογένεση του αυτοάνοσου νοσήματος σκλήρυνση κατά πλάκας. Δείξαμε ότι ο Ets-2 παρουσιάζει διαφορετικό μοτίβο έκφρασης τόσο ανάμεσα στα διαφορετικά επίπεδα ενεργοποίησης στους Th υποπληθυσμούς και στα ανθρώπινα λεμφοειδή όργανα, όσο και με τους NFAT και Foxp3. Στα παρθενικά Th κύτταρα υγιών δοτών, τα επίπεδα έκφρασης του mrna και της πρωτεΐνης Ets-2 καθώς και η ικανότητα πρόσδεσης στο ARRE-2 στοιχείο μειώνονται μετά την διέγερση των κυττάρων, ακολουθούμενα από αντίστροφη έκφραση της IL-2. Η ικανότητα πρόσδεσης του Ets-2 στην ARRE-2 αλληλουχία του υποκινητή της IL-2 είναι πιο ισχυρή στα παρθενικά Th κύτταρα συγκρινόμενη με τα ενεργοποιημένα ή μνημονικά Th κύτταρα. Αντίθετα στους ασθενείς με σκλήρυνση κατά πλάκας τα επίπεδα έκφρασης του Ets-2 ήταν χαμηλά και στα παρθενικά και στα μνημονικά Τ βοηθητικά κύτταρα αλλά φαίνεται ότι αυξάνεται στα Τ ρυθμιστικά. Από την άλλη τα κύτταρα αυτά, παρουσίαζουν σημαντικά αυξημένη έκφραση IL-2 σε σχέση με τα αντίστοιχα υγιών δοτών. Δείχθηκε επίσης ότι ο Ets-2 δεν προσδένεται στην ARRE-2 αλληλουχία του υποκινητή του γονιδίου της IL-2 στα κύτταρα των ασθενών. Παράλληλα, ο 6

9 μεταγραφικός παράγοντας Foxp3 εμφανίζεται μειωμένος στα Τ ρυθμιστικά κύτταρα των ασθενών σε σχέση με αυτά των υγιών δοτών. Επομένως προτείνουμε ότι η έκφραση του Ets-2 και η πρόσδεση του στο ARRE-2 στοιχείο του υποκινητή του γονιδίου της IL-2 αποτελεί μέρος μιας αυστηρά ρυθμιζόμενης διαδικασίας που έχει σαν τελικό αποτέλεσμα την μετάβαση των παρθενικών Th λεμφοκυττάρων σε Th0 κύτταρα μετά από αντιγονική διέγερσή τους. Η χαμηλή έκφραση και δυσλειτουργία των μεταγραφικών παραγόντων Ets-2 και FoxP3, στα Th κύτταρα ασθενών με MS, ίσως είναι η κύρια αιτία για την αύξηση των παθολογικών Th κλώνων στους ασθενείς αυτούς. 7

10 SUMMARY 8

11 The activation and differentiation of naive T helper (Th) cells into distinct functional subpopulations is crucial for the effective defence and immune-regulation of the organism. These subpopulations are considered different cell lineages and are defined by the expression of specific cytokines and transcription factors. When naïve Th cells are activated, through their TCR receptor, they are differentiated into dividing pre-th0 proliferating precursors, before their differentiation to one of the Th effector subpopulations. The first cytokine that is produced during this process is IL-2, which is responsible for the proliferation and clonal expansion of T lymphocytes. The purpose of this thesis is to study the regulation of IL-2 expression in naive Th cells, through the binding of transcription factors onto the promoter of the IL-2 gene. In particular, we will examine the role of the transcription factor Ets-2 in the regulation of IL-2 expression in naive Th cells, in contrast with the well-studied transcription factors NFAT and Foxp3, which have the same binding site on the promoter of the IL- 2 gene, and also the correlation of Ets-2 with the pathogenesis of the autoimmune disease, Multiple Sclerosis. We have shown a different expression pattern of Ets-2 between Th cells with different levels of activation and human lymphoid organs and with the factors NFAT and Foxp3. In naïve Th cells of healthy donors, mrna and protein expression levels and binding ability to the ARRE-2 element of the IL-2 gene promoter, are reduced after the activation of the cells, followed by an increase in the IL-2 expression. The binding ability of Ets-2 to the ARRE-2 element of the IL-2 gene promoter is stronger in naïve Th cells compared to activated naïve and memory Th cells. On the other hand, in cells obtained from patients with Multiple Sclerosis, the expression levels of Ets-2 were low both in naïve and memory Th cells. In contrast, these cells show an increased expression of IL-2 compared to those from healthy donors. It was also shown that Ets-2 doesn t bind onto the ARRE-2 element of the IL- 2 gene promoter in patients cells. This silencing activity disappears in activated or memory Th cells. At the same time expression of Foxp3 is reduced in T regulatory cells of patients compared to those of healthy donors. Therefore we suggest that Ets-2 expression and protein binding to the ARRE-2 element of the IL-2 promoter are part of a strictly regulated process that results in a physiological transition of naive Th cells to Th0 cells upon antigenic stimulation. Lowlevel synthesis and dysfunction of Ets-2 and FoxP3 in Th cells of MS patients are 9

12 probably responsible for the increase in pathological Th cell clones. 10

13 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 11

14 Το ανθρώπινο ανοσοποιητικό σύστημα Η επιτυχής άμυνα απέναντι σε μικροβιακές μολύνσεις είναι ζωτικής σημασίας για όλους τους ζωντανούς οργανισμούς. Για το λόγο αυτό, όλες οι μορφές ζωής έχουν αναπτύξει στρατηγικές, σχεδιασμένες για την καλύτερη αντιμετώπιση της εισβολής μικροοργανισμών στο ξενιστή. Τα φυτά, οι μύκητες και άλλοι κατώτεροι πολυκύτταροι μικροοργανισμοί βασίζονται σε ένα σύνολο αποκρίσεων που ονομάζονται, συνολικά, έμφυτη ανοσία (innate immunity). Η εξέλιξη των σπονδυλωτών συνοδεύτηκε και από την εμφάνιση ενός πιο ειδικού τύπου ανοσολογικής άμυνας, της επίκτητης ανοσίας (adaptive immunity). Σαν αποτέλεσμα της εξέλιξης αυτής το ανοσοποιητικό σύστημα των θηλαστικών, συμπεριλαμβανομένου και του ανθρώπινου, αποτελείται και από τους δύο αυτούς τύπους άμυνας [1]. Με τον όρο έμφυτη ανοσία, περιγράφονται καταρχήν οι φυσικοί και χημικοί φραγμοί που εμποδίζουν την είσοδο μικροοργανισμών στους ιστούς του ξενιστή. Το κύριο κομμάτι όμως της έμφυτης ανοσίας, αποτελούν τα συστατικά του ανοσοποιητικού συστήματος (ουδετερόφιλα, μονοκύτταρα, μακροφάγα, πρωτεΐνες του συμπληρώματος και κυτταροκίνες) τα οποία παρέχουν άμεση αντίδραση. Από την άλλη, η επίκτητη ανοσία χαρακτηρίζεται από δύο τύπους λεμφοκυττάρων, τα Τ και Β κύτταρα, τα οποία εκφράζουν ένα μεγάλο αριθμό αντιγονικών υποδοχέων. Μέσω των υποδοχέων αυτών, οι επίκτητες ανοσοαποκρίσεις δημιουργούν μηχανισμούς εξειδικευμένους για την αντιμετώπιση διαφόρων τύπων λοιμώξεων. Ενώ λοιπόν η έμφυτη ανοσία δρα άμεσα και γενικευμένα, η επίκτητη ανοσία είναι ειδική αλλά συνήθως χρειάζεται λίγο περισσότερο χρόνο για να δράσει [2, 3]. Για να μπορέσει το ανοσοποιητικό σύστημα να δράσει αποτελεσματικά έναντι κάποιας λοίμωξης, θα πρέπει να εκπληρώσει τέσσερις κύριους στόχους. Πρώτος στόχος είναι η ανοσολογική αναγνώριση: η παρουσία της λοίμωξης πρέπει να ανιχνευθεί. Σε αυτό συμβάλλουν τόσο τα λευκοκύτταρα της φυσικής ανοσίας, όσο και τα λεμφοκύτταρα της επίκτητης ανοσίας. Ο δεύτερος στόχος είναι ο έλεγχος, ο περιορισμός και αν είναι δυνατόν, η εξάλειψη της λοίμωξης. Σε αυτό το σημείο, αναλαμβάνουν δράση οι ανοσολογικοί τελεστές (immune effectors), όπως το σύστημα του συμπληρώματος, τα αντισώματα, τα λεμφοκύτταρα με κυτταροτοξική δράση, καθώς και τα υπόλοιπα λευκοκύτταρα. Παράλληλα όμως, θα πρέπει οι 12

15 ανοσοαποκρίσεις αυτές να βρίσκονται υπό έλεγχο, έτσι ώστε να μην δημιουργήσουν πρόβλημα στον ίδιο τον οργανισμό. Η ανοσολογική ρύθμιση λοιπόν, ή αλλιώς η ικανότητα του ανοσοποιητικού συστήματος να αυτορυθμίζεται, είναι ο τρίτος στόχος και αρκετά σημαντικός, αφού αδυναμία εκπλήρωσης του μπορεί να προκαλέσει καταστάσεις όπως αλλεργίες και αυτοάνοσα νοσήματα. Τέλος, η ανοσολογική μνήμη, κύριο χαρακτηριστικό της επίκτητης ανοσίας, προστατεύει τον οργανισμό από λοιμώξεις που έχει ήδη αντιμετωπίσει στο παρελθόν, με το να τις αντιμετωπίζει πιο γρήγορα και πιο αποτελεσματικά [4]. ΕΙΚΟΝΑ 1: Οι κυριότεροι μηχανισμοί της έμφυτης και της επίκτητης ανοσίας, σε συνάρτηση με τον χρόνο μετά τη μόλυνση ( Τόσο οι έμφυτες όσο και οι επίκτητες ανοσοαποκρίσεις του οργανισμού, εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από τη λειτουργία των λευκοκυττάρων. Τα κύτταρα αυτά προέρχονται από τον μυελό των οστών και πολλά από αυτά παραμένουν εκεί ούτως ώστε να αναπτυχθούν και να ωριμάσουν. Στη συνέχεια μεταναστεύουν σε περιφερικούς ιστούς και παραμένουν εκεί ή μπαίνουν στη κυκλοφορία του αίματος και στο λεμφικό σύστημα. Όλα τα κυτταρικά συστατικά του αίματος, 13

16 συμπεριλαμβανομένων των ερυθροκυττάρων, των αιμοπεταλίων και των λευκοκυττάρων, προέρχονται από τα ίδια προγονικά κύτταρα, τα πολυδύναμα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (hematopoietic stem cells) του μυελού των οστών. Τα κύτταρα αυτά, όταν ωριμάζουν, διαφοροποιούνται σε δύο κυτταρικές σειρές, τη λεμφοειδή και τη μυελοειδή [4]. ΕΙΚΟΝΑ 2: Διαφοροποίηση των πολυδύναμων αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων του ανθρώπου ( Όπως φαίνεται και στην εικόνα 2, ο κοινός λεμφοειδής πρόγονος διαφοροποιείται προς τη λεμφοειδή σειρά των λευκοκυττάρων και αποτελείται από τα κύτταρα φυσικούς δολοφόνους (NK cells), και από τα Τ και Β λεμφοκύτταρα. Αντίστοιχα, ο κοινός μυελοειδής πρόγονος διαφοροποιείται προς τη μυελοειδή σειρά, η οποία αποτελείται από τα υπόλοιπα λευκοκύτταρα, τα ερυθροκύτταρα και τα μεγακαρυοκύτταρα, από τα οποία προέρχονται τα αιμοπετάλια και τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στη πήξη του αίματος. 14

17 Τα κύτταρα τα οποία απαρτίζουν τη μυελοειδή σειρά είναι τα μονοκύτταρα, τα δενδριτικά κύτταρα και τα πολυμορφοπύρηνα ή κοκκιοκύτταρα, τα οποία χωρίζονται στα ουδετερόφιλα, τα βασεόφιλα και τα ηωσινόφιλα. Τα δενδριτικά κύτταρα στην ανώριμη τους φάση είναι φαγοκύτταρα, τα οποία εισέρχονται σε ιστούς όπου και ωριμάζουν μετά από τη συνάντηση τους με κάποιο παθογόνο. Τα κύτταρα αυτά ονομάζονται και αντιγονοπαρουσιαστικά αφού με τη παρουσίαση συγκεκριμένου αντιγόνου στην επιφάνεια τους συμβάλλουν στην ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων. Τα μονοκύτταρα εισέρχονται και αυτά σε ιστούς, όπου και ωριμάζουν σε φαγοκυτταρικά μακροφάγα. Όσον αφορά στη λεμφοειδή σειρά, τα κύτταρα φυσικοί δολοφόνοι αντιδρούν παρουσία μόλυνσης αλλά όχι ειδικά έναντι συγκεκριμένων αντιγόνων και επομένως θεωρούνται ότι είναι μέρος της έμφυτης ανοσίας. Τα κύτταρα αυτά είναι μεγάλου μεγέθους με διακριτά κυτταροτοξικά κοκκία και έχουν τη δυνατότητα να αναγνωρίζουν και να καταστρέφουν μη φυσιολογικά κύτταρα, όπως καρκινικά κύτταρα και κύτταρα μολυσμένα από ιούς. Τα Τ και Β λεμφοκύτταρα ξεχωρίζουν από τα υπόλοιπα λευκοκύτταρα λόγω της έκφρασης ειδικών αντιγονικών υποδοχέων στην κυτταρική τους επιφάνεια, ενώ διαφέρουν μεταξύ τους στο σημείο ωρίμανσης τους στον οργανισμό. Τα μεν Τ κύτταρα ωριμάζουν στο θύμο αδένα ενώ τα Β κύτταρα στον μυελό των οστών. Όταν ένα αντιγόνο δεσμευτεί σε έναν αντιγονικό υποδοχέα στην επιφάνεια ενός Β κυττάρου, το λεμφοκύτταρο αυτό πολλαπλασιάζεται και διαφοροποιείται σε πλασματοκύτταρο, το οποίο αποτελεί το κύτταρο τελεστή των Β λεμφοκυττάρων και το οποίο παράγει αντισώματα, τις διαλυτές μορφές των Β-κυτταρικών υποδοχέων με την ίδια αντιγονική ειδικότητα. Επομένως το αντιγόνο, το οποίο ενεργοποιεί ένα συγκεκριμένο Β λεμφοκύτταρο, μετατρέπεται σε στόχο των αντισωμάτων που παράγονται από τους απογόνους του συγκεκριμένου κυττάρου. Όταν ένα Τ λεμφοκύτταρο ενεργοποιείται, μετά από τη πρώτη του συνάντηση με αντιγόνο, τότε πολλαπλασιάζεται και διαφοροποιείται σε έναν από πολλούς τύπους με διαφορετικές λειτουργίες. Οι λειτουργίες των Τ κυττάρων χωρίζονται σε τρεις τύπους, τη θανάτωση, την ενεργοποίηση και τη ρύθμιση. Πιο συγκεκριμένα, τα Τ κυτταροτοξικά κύτταρα σκοτώνουν άλλα κύτταρα μολυσμένα με ιούς ή άλλα ενδοκυττάρια παθογόνα, τα Τ βοηθητικά κύτταρα προσφέρουν τα απαραίτητα βοηθητικά σήματα για την ενεργοποίηση των Β κυττάρων, τη διαφοροποίηση τους και 15

18 τη παραγωγή αντισωμάτων. Κάποια από τα Τ βοηθητικά κύτταρα, έχουν επίσης την ικανότητα να ενεργοποιούν και τα μακροφάγα έτσι ώστε να γίνουν πιο αποδοτικά στη θανάτωση των φαγοκυτταρωμένων παθογόνων. Τέλος τα Τ ρυθμιστικά κύτταρα καταστέλλουν τη δράση των υπόλοιπων λεμφοκυττάρων και βοηθάνε στη ρύθμιση των ανοσολογικών αποκρίσεων. Κατά τη διάρκεια μίας ανοσοαπόκρισης, μερικά από τα ενεργοποιημένα Β και Τ λεμφοκύτταρα, διαφοροποιούνται σε μνημονικά κύτταρα, τα κύτταρα δηλαδή τα οποία είναι υπεύθυνα για την μακράς διάρκειας ανοσοαπόκριση, η οποία ακολουθεί την έκθεση σε ασθένεια ή εμβολιασμό. Τα μνημονικά κύτταρα, μετά από μία δεύτερη έκθεση στο ειδικό τους αντιγόνο, διαφοροποιούνται σε κύτταρα τελεστές [4, 5]. Για να βελτιστοποιηθούν, οι απαραίτητες για την ενεργοποίηση συγκεκριμένων ανοσοαποκρίσεων, κυτταρικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των λεμφοκυττάρων και των βοηθητικών κυττάρων, τα κύτταρα αυτά εδράζονται σε καλά ορισμένους ιστούς και όργανα, τα οποία αποτελούν και σημεία μεταφοράς και συγκέντρωσης ξένων αντιγόνων. Οι ιστοί και τα όργανα αυτά, στο σύνολο τους, αποτελούν το λεμφικό σύστημα και διακρίνονται σε πρωτογενή (κεντρικά), όπου τα λεμφοκύτταρα ωριμάζουν και γίνονται ικανά να αποκρίνονται σε αντιγόνα και σε δευτερογενή (περιφερικά), όπου τα λεμφοκύτταρα αντιδρούν σε ξένα αντιγόνα, ενεργοποιούνται και είναι ικανά να ξεκινήσουν επίκτητες ανοσοαποκρίσεις κατά των μικροοργανισμών [5, 6]. ΕΙΚΟΝΑ 3: Κατανομή των πρωτογενών και δευτερογενών λεμφοειδών οργάνων στο ανθρώπινο σώμα ( 16

19 Από τα όργανα που διακρίνονται στην εικόνα 3, στα πρωτογενή λεμφικά όργανα περιλαμβάνονται ο μυελός των οστών, από όπου προέρχονται όλα τα λεμφοκύτταρα και ο θύμος αδένας, όπου ωριμάζουν τα Τ λεμφοκύτταρα, ενώ στα δευτερογενή λεμφικά όργανα περιλαμβάνονται όλα τα υπόλοιπα, δηλαδή οι λεμφαδένες, ο σπλήνας, οι ιστοί που σχετίζονται με βλεννογόνες επιφάνειες και οι πλάκες του Peyer [4]. Ο ανθρώπινος μυελός των οστών αποτελεί τον ιστό εκείνο που βρίσκεται στο κέντρο και τις επιφύσεις των οστών και είναι το όργανο στο οποίο παράγονται όλα τα κύτταρα του αίματος. Θεωρείται όργανο αιμοποίησης και είναι το σημείο παραγωγής και ωρίμανσης των Β λεμφοκυττάρων. Στον μυελό εντοπίζονται αντιγονοειδικά πλασματοκύτταρα, τα οποία παράγουν αντισώματα, επιτρέποντας έτσι τη συμμετοχή του οργάνου σε χυμικές ανοσοαποκρίσεις. Αν και ο μυελός δεν περιέχει διακριτά οργανωμένες περιοχές Τ και Β λεμφοκυττάρων, αποτελεί φωλεά για τη λειτουργία, μετανάστευση και επιλεκτική διατήρηση κυττάρων τόσο της έμφυτης όσο και της επίκτητης ανοσίας [7]. Σε αντίθεση με τα Β, τα Τ λεμφοκύτταρα, στα οποία και θα επικεντρωθούμε στη διατριβή αυτή, δημιουργούνται στον θύμο αδένα και όχι στον μυελό των οστών. Ωστόσο η παραγωγή τους εξαρτάται από την παραγωγή των λεμφοειδών προγονικών κυττάρων του μυελού τα οποία και μεταναστεύουν μέσω της κυκλοφορίας του αίματος στο θύμο αδένα [8]. Ο θύμος αδένας είναι ένα δίλοβο όργανο και εντοπίζεται στον θώρακα, επάνω από την καρδιά. Κάθε λοβός διαιρείται σε λοβία που διαχωρίζονται από δοκίδες συνδετικού ιστού και τα οποία αποτελούνται από έναν εξωτερικό φλοιό και έναν εσωτερικό μυελό (εικόνα 4). Ο φλοιός είναι πλούσιος σε κύτταρα και περιέχει την πλειονότητα των σχετικά ανώριμων θυμοκυττάρων που πολλαπλασιάζονται, ενώ ο μυελός περιέχει πιο ώριμα κύτταρα που βρίσκονται στα τελευταία στάδια διαφοροποίησης, γεγονός που συνεπάγεται την ύπαρξη διαβάθμισης διαφοροποίησης από τον φλοιό προς τον μυελό. Διάσπαρτα μέσα στο θύμο αδένα, βρίσκονται διάφορα επιθηλιακά κύτταρα καθώς και κάποια μακροφάγα και δενδριτικά κύτταρα. Στον μυελό, βρίσκονται επίσης και κάποιες δομές που ονομάζονται σωμάτια Hassal και φαίνεται ότι περιέχουν εκφυλιζόμενα επιθηλιακά κύτταρα, πλούσια σε υψηλού μοριακού βάρους κυτταροκερατίνες [9]. 17

20 ΕΙΚΟΝΑ 4: Φωτογραφία τομής ανθρώπινου θύμου αδένα από έμβρυο, μετά από χρώση με αιματοξυλίνη. Ο φλοιός είναι βαμμένος πιο σκούρος σε αντίθεση με τον ανοιχτόχρωμο μυελό. (experimental data) Όπως θα δούμε και με περισσότερες λεπτομέρειες στη συνέχεια, τα πιο ανώριμα T λεμφοκύτταρα, εισέρχονται στο φλοιό του θύμου διαμέσου των αιμοφόρων αγγείων. Η ωρίμανση τους ξεκινάει στο φλοιό και στη συνέχεια μεταναστεύουν στον μυελό, με συνέπεια αυτός να περιέχει κυρίως ώριμα Τ λεμφοκύτταρα. Μόνο τα ώριμα αυτά κύτταρα φεύγουν από το θύμο αδένα και εισέρχονται στη κυκλοφορία του αίματος και στους περιφερικούς λεμφικούς ιστούς. Οι λεμφαδένες είναι καλά οργανωμένες δομές, που βρίσκονται στα σημεία σύγκλισης των αγγείων του λεμφικού συστήματος. Τα αγγεία αυτά διοχετεύουν υγρό από τους ιστούς, μεταφέροντας έτσι αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και αντιγόνα από μολυσμένους ιστούς στους λεμφαδένες, όπου και εγκλωβίζονται. Στους λεμφαδένες, τα Β λεμφοκύτταρα βρίσκονται σε θυλάκια, ενώ τα Τ λεμφοκύτταρα βρίσκονται διάσπαρτα σε γειτονικές περιθυλακιακές περιοχές, γνωστές και ως Τ-κυτταρικές ζώνες. Μερικά από τα θυλάκια των Β κυττάρων περιέχουν βλαστικά κέντρα, όπου τα Β λεμφοκύτταρα πολλαπλασιάζονται μετά από έκθεση τους σε συγκεκριμένα αντιγόνα. Ο σπλήνας είναι υπεύθυνος για τα αντιγόνα που μεταφέρονται με το αίμα, και οι ασθενείς στους οποίους έχει γίνει σπληνεκτομή είναι πολύ πιο ευαίσθητοι σε παθογόνους μικροοργανισμούς που φθάνουν στο αίμα. Ο σπλήνας βρίσκεται στο άνω αριστερό τεταρτημόριο της κοιλιάς, πίσω από το στομάχι και κοντά στο διάφραγμα. Αποτελείται από δύο κύριους τύπους σπληνικού ιστού, τον λευκό και τον ερυθρό πολφό. Ο λευκός πολφός αποτελείται από λεμφικό ιστό, δηλαδή από Τ και Β λεμφοκύτταρα, ενώ ο ερυθρός πολφός αποτελείται από φλεβώδεις κόλπους και κυτταρικές χορδές που περιέχουν εδραία μακροφάγα, ερυθρά αιμοσφαίρια, αιμοπετάλια, κοκκιοκύτταρα, λεμφοκύτταρα και πολλά πλασματοκύτταρα [4]. 18

21 Ανάπτυξη των Τ λεμφοκυττάρων στον θύμο αδένα Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, ο θύμος αδένας είναι ένα όργανο το οποίο λειτουργεί υποστηρικτικά ως προς την ανάπτυξη των Τ λεμφοκυττάρων. Το θυμικό παρέγχυμα αποτελείται από θυμοκύτταρα, καθώς και από διάφορα στρωματικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των θυμικών επιθηλιακών κυττάρων [10]. Τα θυμοκύτταρα διαιρούνται σε τέσσερεις κατηγορίες, ανάλογα με την έκφραση των υποδοχέων CD4 και CD8 [11]. Τα πιο ανώριμα αιμοποιητικά κύτταρα που εισέρχονται στον θύμο αδένα, αναγνωρίζονται ως πρώιμα προγονικά κύτταρα της Τ λεμφοειδούς σειράς (early T-lineage progenitors). Τα κύτταρα αυτά δεν εκφράζουν κανέναν από τους υποδοχείς CD4 και CD8, επομένως ανήκουν στην κατηγορία των CD4/CD8 double-negative (DN) θυμοκυττάρων [10]. Τα DN κύτταρα εδράζονται στην εξωτερική περιοχή του φλοιού του θύμου αδένα [11]. Κατά το στάδιο αυτό, τα θυμοκύτταρα περνούν από τις αναπτυξιακές φάσεις DN1(CD44+CD25-), DN2(CD44+CD25+) και DN3(CD44-CD25+), κατά τις οποίες συμβαίνουν οι ανακατατάξεις στους γενετικούς τόπους TCRγ,δ και β [10]. Κατά το DN στάδιο, διαφοροποιούνται 2 διακριτές γενιές Τ λεμφοκυττάρων, τα οποία εκφράζουν είτε τον TCRαβ είτε τον TCRγδ. Η συγκρότηση επιτυχημένα αναδιαταγμένων TCRβ και αμετάβλητων pre-tcrα, μαζί με αλυσίδες CD3, οδηγεί στη δέσμευση των κυττάρων στη TCRαβ γενιά και στη περαιτέρω διαφοροποίηση τους μετά το DN3 στάδιο, συμπεριλαμβανομένων και το πολλαπλασιασμό τους, την αναδιάταξη του TCRα-VJ, τη μείωση της έκφρασης του CD25 και την έκφραση των υποδοχέων CD4 και CD8. Το DN2 στάδιο χωρίζεται σε 2 επιπλέον στάδια, τα DN2mt (myeloid-t) και DN2t (T-lineage determined), ενώ η διαβάθμιση μεταξύ τους ονομάζεται DN2- determination step. Η διαβάθμιση αυτή, θεωρείται ότι είναι το πρώτο κρίσιμο σημείο στην ανάπτυξη των Τ λεμφοκυττάρων, αφού καθορίζει τη δέσμευση στη Τ λεμφοειδή γενιά ή όχι. Τα στάδια αυτά επηρεάζονται από περιβαλλοντικά σήματα μέσα στον θύμο αδένα, με πιο χαρακτηριστικό παράδειγμα τη ρύθμιση σηματοδοτικών μονοπατιών από την ιντερλευκίνη-7 [12]. 19

22 Τα αναπτυξιακά αυτά βήματα των DN θυμοκυττάρων, σχετίζονται με τη δυναμική μετεγκατάσταση τους μέσα στο θυμικό παρέγχυμα. Τα Τ λεμφοειδή προγονικά κύτταρα στο θύμο αδένα ποντικών, εδράζονται στο σημείο σύνδεσης του μυελού με τον φλοιό. Τα θυμοκύτταρα μεταναστεύουν προς την περιοχή της κάψουλας του θύμου (capsular region), κατά τη διαφοροποίηση τους προς DN2 και DN3 θυμοκύτταρα. Τα περισσότερα από τα DN3 θυμοκύτταρα, βρίσκονται στο φλοιό κοντά στην εξωτερική κάψουλα (subcapsular region), όπου διαφοροποιούνται περαιτέρω προς το pre-dn4 ή DN4 στάδιο, όπου εμφανίζουν χαμηλή έκφραση των CD4, CD8, CD25 και CD44 και θεωρούνται ότι βρίσκονται στο πρόδρομο στάδιο για να γίνουν CD4/CD8 διπλά θετικά θυμοκύτταρα (DP) [10]. Τα DP κύτταρα εκφράζουν ενδιάμεσα επίπεδα TCRαβ στην επιφάνεια τους και υπόκεινται σε μία διαδικασία επιλογής η οποία οδηγεί στην επαγωγή της απόπτωσης σε περισσότερα από το 90% των νέο-παραγόμενων θυμοκυττάρων. Οι πολύπλοκοι μηχανισμοί που ρυθμίζουν αυτή τη διαδικασία και εγγυούνται την παραγωγή του ιδανικού ρεπερτορίου (repertoire) των Τ κυττάρων, αποτελούν το δεύτερο κρίσιμο σημείο της ανάπτυξης των θυμοκυττάρων. Τα DP θυμοκύτταρα που εκφράζουν τον TCRαβ στην επιφάνεια τους, εδράζονται στο φλοιό. Τα κύτταρα αυτά μετακινούνται ενεργά μέσα στο μικροπεριβάλλον του φλοιού, επιζητώντας την αλληλεπίδραση του TCR με μόρια του MHC που σχετίζονται με αυτό-αντιγόνα. Τα DP θυμοκύτταρα, τα οποία αλληλεπιδρούν μέσω των TCR τους με σύμπλοκα αυτό-αντιγόνων/mhc, επιλέγονται για επιβίωση ή θάνατο ανάλογα με ισχύ σύνδεσης (avidity) της αλληλεπίδρασης αυτής. Τα DP θυμοκύτταρα τα οποία λαμβάνουν TCR σήματα χαμηλής ισχύς, επάγονται για την επιβίωση τους και τη διαφοροποίηση τους σε ώριμα θυμοκύτταρα, μέσω της διαδικασίας που ονομάζεται θετική επιλογή (positive selection). Αντίθετα, τα DP θυμοκύτταρα που λαμβάνουν ισχυρά σήματα οδηγούνται στο θάνατο, μέσω της αρνητικής επιλογής (negative selection or clonal deletion). Κατά τη θετική επιλογή, η διαφορετική κινητική της αλληλεπίδρασης TCR/αντιγόνου, καθορίζει τη γενιά προς την οποία θα διαφοροποιηθεί το θυμοκύτταρο, δηλαδή είτε ως CD4+CD8- είτε ως CD4-CD8+ SP θυμοκύτταρο. Τα θετικώς επιλεγμένα θυμοκύτταρα μεταναστεύουν στο μυελό του θύμου όπου συνεχίζουν την αλληλεπίδραση με αυτό-αντιγόνα τα οποία εκθέτονται από το μικροπεριβάλλον του μυελού. Τα επιθηλιακά κύτταρα του μυελού εκφράζουν ένα 20

23 μεγάλο αριθμό γονιδίων τα οποία αντιπροσωπεύουν περιφερικούς ιστούς, συμβάλλοντας έτσι στη καθιέρωση της αυτό-ανοχής (self-tolerance) στο μυελό του θύμου αδένα. Επομένως, μετά από όλη αυτή τη διαδικασία τα Τ λεμφοκύτταρα είτε ως Τ βοηθητικά (CD4+) είτε ως Τ κυτταροτοξικά (CD8+), αποχωρούν από τον θύμο αδένα και εισέρχονται στη περιφερική κυκλοφορία [11]. ΕΙΚΟΝΑ 5: Διαγραμματική απεικόνιση των σταδίων διαφοροποίησης των θυμοκυττάρων [11]. 21

24 Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα (Th cells CD4+) Παρθενικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα (naïve Th cells CD4+CD45RA+) Τα Τ βοηθητικά κύτταρα (CD4+CD8-), τα οποία μέσα από τις συνδυασμένες διαδικασίες της θετικής και αρνητικής επιλογής στο θύμο αδένα, εξέρχονται από το θύμο αδένα σχηματίζουν τον πληθυσμό των παρθενικών Τ κυττάρων τα οποία κυκλοφορούν στα όρια των περιφερικών λεμφικών ιστών [13]. Τα παρθενικά T κύτταρα χαρακτηρίζονται από την έκφραση των επιφανειακών δεικτών CD45RA, CD27, CD28, CD62L, CCR7, CD31 και του υποδοχέα της IL-7. Ο επιφανειακός δείκτης CD45RA εκφράζεται μόνο από τα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα και αποτελεί μία από τις ισομορφές του δείκτη CD45, που εμφανίζεται στα περισσότερα λευκοκύτταρα. Ο δείκτης αυτός χρησιμεύει κυρίως για το διαχωρισμό των παρθενικών από τα μνημονικά Τ κύτταρα. Η κυκλοφορία τους, μεταξύ των αιμοποιητικών και των λεμφικών ιστών, ρυθμίζεται από τα επιφανειακά μόρια CD62L και CCR7. Ο αριθμός των παρθενικών Τ λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα παραμένει σχετικά σταθερός καθ όλη τη διάρκεια της ενήλικης ζωής παρά τη διαρκή ενεργοποίηση τους με ξένα αντιγόνα και τη δραματική μείωση, με τη πάροδο του χρόνου, των εξερχόμενων κυττάρων από το θύμο αδένα [14]. Διαφοροποιημένοι Τ βοηθητικοί κυτταρικοί υποπληθυσμοί λεμφοκυττάρων (Th effector lineages) Όπως αναφέρθηκε και στην αρχή της εισαγωγής, τα Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα (Th κύτταρα CD4+), αποτελούν ένα μεγάλο μέρος του πληθυσμού των Τ λεμφοκυττάρων και παίζουν κύριο ρόλο στις επίκτητες ανοσοαποκρίσεις. Αυτό το επιτυγχάνουν μέσω της ικανότητας τους να βοηθούν στην παραγωγή αντισωμάτων από τα Β λεμφοκύτταρα, στην ενεργοποίηση και στρατολόγηση των κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων, των μακροφάγων, των πολυμορφοπύρηνων κυττάρων και των 22

25 υπολοίπων κυττάρων τελεστών στις εστίες μόλυνσης και φλεγμονής καθώς και διαμέσου της παραγωγής κυτταροκινών από τα ίδια τα Th κύτταρα, οι οποίες ενορχηστρώνουν τις ανοσοαποκρίσεις του οργανισμού [15, 16]. Η διαφοροποίηση των Τh κυττάρων σε διακριτούς λειτουργικούς υποπληθυσμούς είναι κρίσιμη για τη σωστή άμυνα και ανοσορύθμιση του οργανισμού. Οι υποπληθυσμοί αυτοί καθορίζονται από εξωτερικά και εσωτερικά ερεθίσματα και διατηρούν σταθερούς φαινοτύπους, οι οποίοι ενισχύονται από επιγενετικές τροποποιήσεις. Κατά συνέπεια, οι υποπληθυσμοί αυτοί θεωρούνται ως διαφορετικές γενιές κυττάρων και καθορίζονται από την έκφραση συγκεκριμένων κυτταροκινών και μεταγραφικών παραγόντων [17]. Τα συμβατικά παρθενικά Τ βοηθητικά κύτταρα, μπορούν να διαφοροποιηθούν σε 4 (και ίσως περισσότερους) διακριτούς υποπληθυσμούς, οι οποίοι διακρίνονται από τα σήματα που δέχονται κατά την αρχική τους αλληλεπίδραση με κάποιο αντιγόνο. Οι 4 αυτοί υποπληθυσμοί είναι οι Th1, Th2, Th17 και τα Tregs. Η διαφοροποίηση των Th κυττάρων από παρθενικά CD4+ κύτταρα ρυθμίζεται από τις κυτταροκίνες του περιβάλλοντος των κυττάρων και την επακόλουθη ενεργοποίηση συγκεκριμένων μεταγραφικών παραγόντων. Για κάθε υποπληθυσμό Th κυττάρων, ένα διακριτό σετ κυτταροκινών ρυθμίζει τη διαφοροποίηση τους: IL-12/IFNγ για τα Th1, IL-4/(IL-2, IL- 7, TSLP) για τα Th2, TGFb/(IL-6, IL-21, IL-23) για τα Th17 και TGFβ/IL-2 για τα Tregs. Οι μεταγραφικοί παράγοντες που ρυθμίζουν τη διαφοροποίηση των Th κυττάρων είναι και αυτοί γνωστοί: T-bet/Stat4 για τα Th1, GATA3/Stat5 για τα Th2, RORγt/Stat3 για τα Th17 και FoxP3/Stat5 για τα Tregs [15, 16]. Νεότερες μελέτες αναγνώρισαν και νέους υποπληθυσμούς Th κυττάρων, εκτός από τους κλασσικούς που αναφέρθηκαν προηγουμένως. Σε αυτούς συμπεριλαμβάνονται τα Tfh (follicular helper T cells), τα Tr1 (regulatory type 1 cells), τα Th3, τα Th9 και τα Th22 κύτταρα [17, 18]. Από τους παραπάνω υποπληθυσμούς βοηθητικών κυττάρων, οι πιο ευρέως μελετημένοι είναι οι Th1 και Th2. Τα Th1 κύτταρα παράγουν κυρίως IFNγ, ενώ κάποια TNF-α. Η IFNγ επάγει τα μακροφάγα και άλλα κύτταρα της έμφυτης ανοσίας και αυξάνει την ικανότητα τους να σκοτώνουν ενδοκυττάρια παθογόνα. Επιπροσθέτως, υποστηρίζουν τις λειτουργίες των CD8+ Τ κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων και ρυθμίζουν την έκφραση άλλων διαμεσολαβητών ανοσοποιητικών και μη κυττάρων. Από την άλλη, τα Th2 κύτταρα αν και έχουν αναγνωριστεί, κυρίως για την παραγωγή 23

26 IL-4, εκκρίνουν επίσης και τις IL-5, IL-6 και IL-13. Οι Th2 αποκρίσεις είναι απαραίτητες για την αντιμετώπιση εξωκυττάριων παθογόνων, όπως τα παράσιτα, ενώ επίσης βοηθούν στη δράση των B λεμφοκυττάρων, ρυθμίζοντας την ενεργοποίηση τους και την αλλαγή τάξης αντισωμάτων [19]. Μεταγραφική ρύθμιση και διαφοροποίηση των παρθενικών Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων Η δέσμευση προς μία γενιά (lineage) Τ βοηθητικών κυττάρων χαρακτηρίζεται τόσο από την ύπαρξη συγκεκριμένων lineage-associated μεταγραφικών παραγόντων όσο και από αλλαγές στην ισορροπία τους. Επομένως, οι παράγοντες αυτοί μπορούν να ρυθμίζουν τα μοτίβα έκφρασης συγκεκριμένων υποδοχέων αυξητικών παραγόντων, επιτρέποντας έτσι σε εξωγενείς αυξητικούς παράγοντες να καθοδηγούν την επιβίωση, διατήρηση και πολλαπλασιασμό συγκεκριμένων κυτταρικών τύπων [20]. Εκτός όμως από τους μεταγραφικούς παράγοντες, σημαντικό ρόλο στη γονιδιακή ρύθμιση παίζουν και τα ρυθμιστικά στοιχεία των ίδιων των γονιδίων. Τα στοιχεία αυτά αποτελούν σημεία πρόσδεσης του DNA, μικρού αριθμού και τοποθετημένα ομαδικά σε μικρό χώρο. Στα σημεία αυτά προσδένονται μεταγραφικοί παράγοντες, συνήθως με τη μορφή συμπλόκου και επάγουν την έκφραση ενός γονιδίου. Επιπλέον, μεταγραφικοί παράγοντες που δεσμεύονται σε διαφορετικά ρυθμιστικά στοιχεία του ίδιου γονιδίου, μπορούν να αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και ανάλογα με τον τύπο της αλληλεπίδρασης να προκαλούν διαφορετικά αποτελέσματα. Η πρόσδεση των μεταγραφικών παραγόντων στα ρυθμιστικά στοιχεία ενός γονιδίου επηρεάζεται από μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις του γονιδίου και από διάφορες πρωτεΐνες, οι οποίες έχουν τη δυνατότητα να απομονώσουν, να απενεργοποιήσουν ή να αποδομήσουν τους μεταγραφικούς παράγοντες, αλλάζοντας έτσι τη διαθεσιμότητα των παραγόντων αυτών και τη δυνατότητα πρόσδεσης τους στο DNA [21]. Γνωρίζοντας λοιπόν τον σημαντικό ρόλο της μεταγραφικής ρύθμισης στην έκφραση γονιδίων και στην ανάπτυξη των Τ λεμφοκυττάρων και αφού κύριο αντικείμενο μελέτης της διατριβής αυτής είναι τα Τ βοηθητικά κύτταρα, θα επικεντρωθούμε στη διασαφήνιση του ρόλου των μεταγραφικών παραγόντων, στην 24

27 ανάπτυξη και διαφοροποίηση των Τ βοηθητικών κυττάρων προς διακριτούς υποπληθυσμούς μετά την έξοδο τους από το θύμο αδένα. Η ενεργοποίηση και διαφοροποίηση των παρθενικών Τ κυττάρων, εξαρτάται σε πολύ μεγάλο βαθμό και από το κυτταροκινικό περιβάλλον στο οποίο βρίσκονται, αφού κάθε κυτταροκίνη ενεργοποιεί διαφορετικό σηματοδοτικό μονοπάτι μέσα στο κύτταρο με τελικό αποτέλεσμα την ενεργοποίηση διαφορετικής ομάδας μεταγραφικών παραγόντων και την έκφραση διαφορετικών γονιδίων κάθε φορά. Μετά το πρώτο στάδιο της διαφοροποίησης των παρθενικών κυττάρων, ανάλογα με το ερέθισμα που θα λάβει το κύτταρο, ενεργοποιείται και διαφορετικό μέλος της οικογένειας των STAT μεταγραφικών παραγόντων, τα οποία εκφράζονται και σε διαφορετικό υποπληθυσμό Τ βοηθητικών κυττάρων. Πιο συγκεκριμένα, οι STAT1 και STAT4 ενεργοποιούνται στα Th1 κύτταρα, ο STAT6 στα Th2 και Th9, ο STAT3 στα Th17 και Tfh και ο STAT5 στα itregs. Εκτός όμως από την STAT οικογένεια, κάθε Th κυτταρικός υποπληθυσμός χαρακτηρίζεται και από άλλους κυρίαρχους ρυθμιστές (master regulators) μεταγραφικούς παράγοντες που ρυθμίζουν την κατεύθυνση της διαφοροποίησης των κυττάρων, όπως φαίνεται και στη παρακάτω εικόνα. 25

28 ΕΙΚΟΝΑ 6: Th κυτταρικοί υποπληθυσμοί και η πλαστικότητα τους [22]. Για να γίνουμε πιο συγκεκριμένοι, θα περιγράψουμε πιο αναλυτικά, τι συμβαίνει σε καθένα από τους τέσσερις πιο σημαντικούς Τ βοηθητικούς κυτταρικούς υποπληθυσμούς. Τh1 Διαφοροποίηση Ο σημαντικότερος μεταγραφικός παράγοντας των Th1 λεμφοκυττάρων, η διαφοροποίηση των οποίων επάγεται από τις κυτταροκίνες IL-12 και IFNγ, είναι ο T- bet, ο οποίος χαρακτηρίζεται όχι μόνο από την ικανότητα να επάγει την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων αλλά και να καταστέλλει την ανάπτυξη των άλλων κυτταρικών υποπληθυσμών. Η ίδια η έκφραση του T-bet, επάγεται από τον Stat1 και όχι από τον Stat4. Η έκφραση του Stat1, επάγεται από την κυτταροκίνη IFNγ. Ο T-bet εμποδίζει την ανάπτυξη των Th2 λεμφοκυττάρων, καταστέλλοντας την έκφραση του γονιδίου της IL-4, με συνέπεια την εξασθένηση της δράσης του Gata3. Η 26

29 διαφοροποίηση προς τον Th17 υποπληθυσμό, εμποδίζεται από την αλληλεπίδραση μεταξύ του T-bet και του υποκινητή του γονιδίου Rorc, το οποίο κωδικοποιεί τον RORγτ, το βασικό μεταγραφικό παράγοντα των Th17 κυττάρων. Σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση των Th1 κυττάρων παίζει και ο επαγόμενος από την IL-12, Stat4. Ο παράγοντας αυτός επάγει την έκφραση της IFNγ, δημιουργώντας έτσι έναν θετικό βρόγχο ρύθμισης (positive feedback loop) για τη περαιτέρω έκφραση του T-bet. Παρ όλα αυτά οι δύο μεταγραφικοί αυτοί παράγοντες δεν δρουν γραμμικά κατά τη Th1 διαφοροποίηση αλλά αποτελούν κομμάτια διαφορετικών σηματοδοτικών μονοπατιών, τα οποία όμως πρέπει να δράσουν συντονισμένα για τη πλήρη Th1 διαφοροποίηση. Ο T-bet, εκτός από ενεργοποιητής φαίνεται ότι έχει και το ρόλο του καταστολέα, αφού μέσα από την επαγωγή του Bcl-6 καταστέλλει την έκφραση της IFNγ σε μεταγενέστερα στάδια της Th1 διαφοροποίησης, δρώντας έτσι προστατευτικά ως προς την εμφάνιση ανοσοπαθολογικών καταστάσεων. Άλλοι σημαντικοί μεταγραφικοί παράγοντες είναι οι Runx1, Runx3, Eomesodermin και Hlx, ο καθένας επηρεάζοντας και διαφορετικό κομμάτι της διαφοροποίησης των παρθενικών Τh κυττάρων προς Th1 λεμφοκύτταρα [18, 22-24]. Τh2 Διαφοροποίηση Όπως είπαμε και προηγουμένως, ο Stat6 είναι από τους πιο σημαντικούς μεταγραφικούς παράγοντες για τη διαφοροποίηση προς τον Th2 κυτταρικό υποπληθυσμό. Ο Stat6 επάγεται από την IL-4 και με τη σειρά του ρυθμίζει θετικά την έκφραση του Gata3, ο οποίος είναι και ο κύριος μεταγραφικός παράγοντας των Th2 κυττάρων. Οι μηχανισμοί δράσης του Gata3 είναι τρεις και περιλαμβάνουν την επαγωγή της παραγωγής Th2 κυτταροκινών, τον επιλεκτικό πολλαπλασιασμό Th2 κυττάρων μέσω της στρατολόγησης του Gfi-1 και τέλος την καταστολή της Th1 διαφοροποίησης μέσω της αλληλεπίδρασης με τον T-bet και του Stat4. Εκτός από τον Stat6, ρόλο στη Th2 διαφοροποίηση φαίνεται ότι παίζουν και οι Stat3 και Stat5 δρώντας είτε θετικά είτε αρνητικά. Άλλοι μεταγραφικοί παράγοντες που επιδρούν στη Th2 διαφοροποίηση είναι οι JUNB και c-maf, οι οποίοι επάγουν την 27

30 έκφραση των IL4, IL5 και IL13, οι IRF4, NOTCH και NFATc2, οι οποίοι επάγουν την έκφραση της IL4, ενώ τέλος ο SATB1 ρυθμίζει τη Th2 διαφοροποίηση επιστρατέυοντας τη πρόσδεση του μεταγραφικού παράγοντα Ikaros στα γονίδια του T- bet και της IFNγ, καταστέλλοντας έτσι την έκφραση τους [18, 22, 25]. Τh17 Διαφοροποίηση Στα πρώτα στάδια της Th17 διαφοροποίησης, ο Stat3 επάγει τη διαδικασία αυτή ρυθμίζοντας την έκφραση σημαντικών γονιδίων όπως αυτών των μεταγραφικών παραγόντων RORα και RORγτ. Εκτός από αυτά τα δύο γόνιδια, ο Stat3 ρυθμίζει και την έκφραση άλλων μεταγραφικών παραγόντων, όπως οι IRF4, Runx1, Bcl-6 και Stat1. Ο κύριος μεταγραφικός παράγοντας των Th17 κυττάρων είναι ο RORγτ και έχει δειχθεί ότι είναι απαραίτητος και επαρκής για τη παραγωγή των κυττάρων αυτών. Εκτός όμως από τους ενεργοποιητές της Th17 διαφοροποίησης, υπάρχουν και μεταγραφικοί παράγοντες που τη καταστέλλουν όπως οι T-bet, FOXP3, Ets-1 και άλλοι. Σημαντικός παράγοντας και για την καταστολή της διαφοροποίησης προς τον Th17 κυτταρικό υποπληθυσμό είναι και η IL2, η οποία αντίθετα επάγει τη διαφοροποίηση προς τους Th1, Th2 και Τh9 υποπληθυσμούς. Οι μηχανισμοί της κατασταλτικής αυτής δράσης είναι η επαγωγή των Stat3, Stat5 και T-bet και η καταστολή των γονιδίων που εκφράζουν τους IL6Rα και gp130 [22, 24, 26]. Treg Διαφοροποίηση Στα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα, ο TGF-β επάγει την έκφραση του FOXP3, ο οποίος είναι και ο κύριος μεταγραφικός παράγοντας υπευθυνος για την ανάπτυξη και τη λετουργία των itreg και ntreg κυττάρων. Ο, επαγόμενος από την IL2, Stat5 παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση των διαφοροποιημένων Treg κυττάρων μέσω της πρόσδεσης του στο γονίδιο του FOXP3 και την επαγωγή της έκφρασης του. Με τη σειρά του ο FOXP3, ρυθμίζει την έκφραση ενός μεγάλου αριθμού Treg ειδικών γονιδίων. Η ρύθμιση αυτή, επιτυγχάνεται κυρίως με τη συνεργατική δράση του FOXP3 με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες, όπως οι EOS, IRF4, SATB1, LEF1 και Gata-1. 28

31 Άλλοι μεταγραφικοί παράγοντες, οι οποίοι είναι σημαντικοί για τη λειτουργία των Treg κυττάρων, είναι οι FOXO1, FOXO3, NFAT, SMAD3, c-rel και BACH2. Έχει δειχθεί επίσης ότι ο μεταγραφικός παράγοντας Ets-1, αλληλεπιδρά με το γονίδιο του FOXP3 και είναι απαραίτητος για την ανάπτυξη των ntregs. Τέλος, ο μεταγραφικός παράγοντας NFAT, επίσης ρυθμίζει την ανάπτυξη των Treg κυττάρων είτε μέσω της φυσικής αλληλεπίδρασης του με τον FOXP3 είτε μέσω της πρόσδεσης του στον υποκινητή του γονιδίου του [22, 24, 27]. Μνημονικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα (memory Th cells CD4+CD45RO+) Όταν τα παρθενικά Τ κύτταρα ενεργοποιηθούν από κάποιο αντιγονοπαρουσιαστικό κύτταρο, με τους μηχανισμούς που θα περιγραφούν αναλυτικά στη συνέχεια, αρχίζουν να διαιρούνται και να διαφοροποιούνται σε κύτταρα τελεστές. Το 90% των κυττάρων αυτών ζουν για ένα διάστημα 1-2 εβδομάδων και ύστερα πεθαίνουν. Τα εναπομείναντα κύτταρα, ονομάζονται μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα και βρίσκονται σε μία αδρανή κατάσταση αλλά με την ικανότητα της αυτό-ανανέωσης και της επιβίωσης για μεγάλο χρονικό διάστημα. Τα μνημονικά κύτταρα είναι αρκετά ετερογενή και χωρίζονται σε δύο κατηγορίες τουλάχιστον. Τα μνημονικά κύτταρα τελεστές, τα οποία εκφράζουν υποδοχείς που διαμεσολαβούν στη μετανάστευση τους σε μη λεμφικά σημεία φλεγμονής και τα κεντρικά μνημονικά κύτταρα, τα οποία εκφράζουν τους δείκτες CD62L και CCR7 που βοηθούν στη μετανάστευση τους στα περιφερικά λεμφικά όργανα. Σε αντίθεση με τα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα και οι δύο κατηγορίες μνημονικών λεμφοκυττάρων εκφράζουν την CD45RO ισομορφή του επιφανειακού δείκτη CD45 [28]. 29

32 Ενεργοποίηση των παρθενικών Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων Το αρχικό βήμα για τη διαφοροποίηση των παρθενικών Τ κυττάρων είναι η αντιγονική διέγερση τους, μέσω της αλληλεπίδρασης του TCR αντιγονικού υποδοχέα και των συνυποδοχέων του με το σύμπλοκο αντιγόνου-mhc II στην επιφάνεια αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων, κυρίως των δενδριτικών κυττάρων [18]. Μέσω της αλληλεπίδρασης αυτής τα Τ βοηθητικά κύτταρα ενεργοποιούνται. Η κυτταρική ενεργοποίηση είναι ένας γενικός όρος, ο οποίος εμπεριέχει σηματοδοτικά γεγονότα που οδηγούν σε θετικές κυτταρικές αποκρίσεις. Σε αυτές ανήκουν η κυτταρική επιβίωση και ο πολλαπλασιασμός, οι κυτταροσκελετικές αναδιατάξεις, αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση και αυξημένη μεταβολική ενεργότητα [29]. Η TCR ενεργοποίηση είναι ο πρώτος καθοριστικός παράγοντας για τη διαφοροποίηση των παρθενικών Τ βοηθητικών κυττάρων, αν και δεν έχει διευκρινιστεί τελείως ο τρόπος. Ισχυρό σήμα προτρέπει τα κύτταρα να διαφοροποιηθούν προς τους Th1, Th17 και Tfh υποπληθυσμούς, ενώ ασθενές σήμα ευνοεί τη διαφοροποίηση προς Th2 και επαγώμενα Tregs [22]. Ένα από τα κυριότερα χαρακτηριστικά της TCR σηματοδότησης που οδηγεί στην ενεργοποίηση των παρθενικών Τ βοηθητικών κυττάρων, είναι η παραγωγή της ιντερλευκίνης 2 (IL-2). Η κυτταροκίνη αυτή είναι υπεύθυνη για τον πολλαπλασιασμό και τη κλωνική επέκταση των T κυττάρων, λειτουργίες τις οποίες ρυθμίζει αυτοκρινώς μέσω της δέσμευσης της στον επιφανειακό υποδοχέα της [30]. Ο μηχανισμός ρύθμισης της IL-2 σε αυτό το στάδιο, φαίνεται ότι είναι πολύ σημαντικός αφού καθορίζει τη μετάβαση των Τ βοηθητικών κυττάρων από τη παρθενική τους κατάσταση στη φάση των πρόδρομων Th0 κυττάρων, των ανώριμων Th0 τελεστών(th0 effectors) και στη συνέχεια στα τελικά στάδια Th διαφοροποίησης που περιεγράφηκαν νωρίτερα. Οι μηχανισμοί ρύθμισης και δράσης της IL-2, θα αναλυθούν διεξοδικά στη συνέχεια, αφού αποτελούν και κύριο στόχο μελέτης της παρούσας διατριβής. 30

33 Ιντερλευκίνη 2 (IL-2) Η ιντερλευκίνη 2 (IL-2) είναι μία πλειοτροπική κυτταροκίνη, η οποία παράγεται μετά από αντιγονική ενεργοποίηση και παίζει σημαντικό ρόλο στις ανοσοαποκρίσεις. Οι κυτταροκίνες είναι μικρές πρωτεΐνες (περίπου 25 kda), οι οποίες εκκρίνονται από διάφορα κύτταρα σε απόκριση σημάτων ενεργοποίησης και δρουν επάγοντας αποκρίσεις μέσω της δέσμευσης τους σε ειδικούς υποδοχείς. Η δράση τους μπορεί να είναι αυτοκρινής, ρυθμίζοντας τη λειτουργία του ίδιου του κύτταρου που εκκρίνει τη κυτταροκίνη, παρακρινής, ρυθμίζοντας τη λειτουργία γειτονικών κυττάρων και ενδοκρινής, ρυθμίζοντας τη λειτουργία μακρινών κυττάρων, φθάνοντας σε αυτά μέσω της κυκλοφορίας του αίματος [4, 31]. Υπάρχουν δύο κύριες δομικές οικογένειες κυτταροκινών. Η οικογένεια των αιματοποιητίνων (hematopoietin family), στην οποία ανήκουν αυξητικές ορμόνες και πολλές ιντερλευκίνες, ανάμεσα τους η ιντερλευκίνη 2 και η οικογένεια των TNF, η οποία περιλαμβάνει τον TNF-α και πολλές κυτταροκίνες που δεσμεύονται στη κυτταρική μεμβράνη. Όλες οι κυτταροκίνες έχουν τοπική και συστημική δράση και συμμετέχουν τόσο στην έμφυτη όσο και στην επίκτητη ανοσία [4]. ΕΙΚΟΝΑ 7: Σχηματική απεικόνιση των κυτταροκινών που εκκρίνουν τα κύτταρα του αιμοποιητικού συστήματος και οι στόχοι, στους οποίους αυτές δρουν ( 31

34 Η IL-2 ανακαλύφθηκε το 1976, ως η δραστικότητα αυξητικού παράγοντα Τ κυττάρων σε υπερκείμενα ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων [32]. Εκτός από τη δράση της αυτή, η IL-2 επάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων φυσικών δολοφόνων (NK cells) και αυξάνει την κυτταροτοξική τους δράση, όπως επίσης και των ενεργοποιημένων από λεμφοκίνες κυττάρων δολοφόνων. Επάγει την παραγωγή αντισωμάτων και τον πολλαπλασιασμό των B λεμφοκυττάρων και είναι απαραίτητη για τον επαγόμενο από ενεργοποίηση κυτταρικό θάνατο (AICD), ο οποίος είναι σημαντικός για την ομοιόσταση και την εξάλειψη πιθανών επιζήμιων για τον οργανισμό αυτό-δραστικών κυττάρων. Η IL-2 επίσης επάγει την ανάπτυξη των CD4+FoxP3+ ρυθμιστικών Τ λεμφοκυττάρων, τα οποία έχουν κατασταλτική δράση και ρυθμίζουν την ανοχή. Πιο πρόσφατα βρέθηκε ότι η IL-2 έχει ρόλο και στην επαγωγή της διαφοροποίησης των παρθενικών Τ λεμφοκυττάρων, προς έναν από τους υποπληθυσμούς τελεστών κυττάρων Th1 ή Th2, ενώ φαίνεται να καταστέλλει τη διαφοροποίηση τους προς τους υποπληθυσμούς Th17 και Tfh. Όπως φαίνεται, η IL-2 έχει ένα ευρύ φάσμα δράσης στο ανοσοποιητικό σύστημα, όχι μόνο επάγοντας τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των T λεμφοκυττάρων αλλά και περιορίζοντας πιθανές επικίνδυνες αυτοάνοσες αντιδράσεις [31]. ΕΙΚΟΝΑ 8: Έκφραση και δράση της IL-2 από παρθενικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα, μετά από την ενεργοποίηση τους από αντιγόνο [33]. 32

35 Η IL-2 είναι μία πρωτεΐνη, μοριακού βάρους 15 kda, που αποτελείται από 4 α- έλικες. Παράγεται κυρίως από τα CD4+ T βοηθητικά λεμφοκύτταρα, μετά από αντιγονική ενεργοποίηση τους και σε μικρότερο βαθμό από τα CD8+, τα NK, τα NKT, τα ενεργοποιημένα δενδριτικά κύτταρα και τα ιστιοκύτταρα. Στα Τ βοηθητικά κύτταρα, η επαγωγή της μεταγραφής της IL-2 απαιτεί δύο σήματα, διαμεσολαβούμενα από τα ιόντα ασβεστίου και τη πρωτεϊνική κινάση C. H μεταγραφή της IL-2 ρυθμίζεται, θετικά ή αρνητικά, από ένα μεγάλο αριθμό μεταγραφικών παραγόντων στους οποίους συμπεριλαμβάνονται μέλη της οικογένειας των NFAT μεταγραφικών παραγόντων, ο AP-1, o NF-κB, ο OCT-1 και άλλοι [31, 32, 34, 35]. Λεπτομέρειες για κάποιους από τους παράγοντες αυτούς και τον μηχανισμό δράσης τους, θα δούμε στη συνέχεια. Οι δράσεις και ο κύριος ρόλος της IL-2 στην ανάπτυξη, τον πολλαπλασιασμό και τη ρύθμιση των T λεμφοκυττάρων, την καθιστά ένα πολύ σημαντικό και καθοριστικό παράγοντα σε ένα μεγάλο αριθμό οξειών και χρόνιων παθολογικών καταστάσεων, συμπεριλαμβανομένων των λευχαιμιών, των φλεγμονωδών νόσων, των ιϊκών μολύνσεων και των αυτοανόσων νοσημάτων, στα οποία ανωμαλίες στη ρύθμιση της μεταγραφής του γονιδίου της IL-2 οδηγούν σε μη φυσιολογική έκφραση της [36]. Η έκφραση της IL-2, όπως και πολλών άλλων κυτταροκινών, ρυθμίζεται σε πολλά επίπεδα. Οι περισσότερες μελέτες όμως έχουν επικεντρωθεί στη ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της IL-2 σε μεταγραφικό επίπεδο, όπως θα κάνουμε και εμείς στη παρούσα διατριβή, καθώς η ρύθμιση αυτή αποτελεί το σημαντικό τελικό αποτέλεσμα της σηματοδότησης μέσω του TCR υποδοχέα και του συνυποδοχέα του, του CD28. Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, η σηματοδότηση αυτή καταλήγει στην ενεργοποίηση κάποιων μεταγραφικών παραγόντων, οι οποίοι ρυθμίζουν την έκφραση της IL-2, μέσω της πρόσδεσης τους στον υποκινητή του γονιδίου της. Τα πιο σημαντικά σημεία ρύθμισης του γονιδίου της IL-2 στα Τ κύτταρα, βρίσκονται σε μία περιοχή περίπου 300 βάσεων, η οποία βρίσκεται upstream από το σημείο έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου και η οποία περιέχει θέσεις δέσμευσης για όλους τους μεταγραφικούς παράγοντες που παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης της IL-2, συμπεριλαμβανομένων των NFAT, FoxP3, AP-1, Oct και NF-κB [37]. Οι περισσότεροι από τους μεταγραφικούς παράγοντες αυτούς επάγουν την έκφραση της IL-2. Υπάρχουν όμως και αρκετοί καταστολείς της έκφρασης της IL-2, οι οποίοι μέχρι σήμερα, διαχωρίζονται σε δύο κατηγορίες. Στη πρώτη βρίσκονται αυτοί που ρυθμίζουν τη διατήρηση της αδρανούς κατάστασης των T κυττάρων, πριν την 33

36 έναρξη της σηματοδότησης του TCR υποδοχέα και στη δεύτερη αυτοί που η μεταγραφή τους επάγεται σαν αποτέλεσμα της TCR σηματοδότησης και εμπλέκονται στην αναστολή μέσω ανάδρασης της σηματοδότησης αυτής [30]. Το πώς δρουν οι καταστολείς αυτοί στον υποκινητή της IL-2 στα Τ βοηθητικά κύτταρα, είναι αντικείμενο έρευνας του εργαστηρίου μας. Προηγούμενες μελέτες μας ανέδειξαν αρκετά στοιχεία που σχετίζονται με τον μηχανισμό ρύθμισης της IL-2, με τη χρήση του συστήματος ωοκυττάρων του βατράχου Xenopus και πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων από ex vivo απομονωμένα Τ λεμφοκύτταρα. Πιο συγκεκριμένα, τα πειράματα στη μελέτη αυτή έδειξαν ότι η έκφραση του γονιδίου της IL-2 καταστέλλεται από πρωτεϊνικά εκχυλίσματα απομονωμένα από εν ηρεμία παρθενικά βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα αλλά όχι από πρωτεϊνικά εκχυλίσματα απομονωμένα από μνημονικά βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα. Τα αποτελέσματα αυτά έδειξαν ότι η κατασταλτική δραστηριότητα του γονιδίου της IL-2 επιτυγχάνεται μέσω μιας περιοχής του υποκινητή του γονιδίου της IL-2 που καλείται distal Purine-Rich Response Element (PU-d) ή Antigen Receptor Response Element (ARRE-2) (περιοχή από -292 έως -273), η οποία αποτελεί και σημείο πρόσδεσης του NFAT. ΕΙΚΟΝΑ 9: Σχηματική αναπαράσταση των θέσεων δέσμευσης μεταγραφικών παραγόντων στον υποκινητή του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 [33]. Μετά την ενεργοποίηση των παρθενικών Τ κυττάρων, η κατασταλτική αυτή δραστηριότητα εξαφανίζεται και αντικαθίσταται από ένα νεοσυντιθέμενο ενεργοποιητή. Μία σειρά πειραμάτων με EMSA, με αντισώματα έναντι διαφόρων μεταγραφικών παραγόντων, έδειξαν ότι το σύμπλοκο του ενεργοποιητή περιέχει τους μεταγραφικούς παράγοντες FRA-2/JUN-D, ενώ αντίθετα κανένας από αυτούς τους παράγοντες δεν συμμετείχε στο σύμπλοκο του καταστολέα [38-40]. Όλα αυτά τα 34

37 δεδομένα οδηγούν στην υπόθεση ότι στα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα υπάρχει ένας ή περισσότεροι καταστολείς οι οποίοι προσδένονται στον υποκινητή της IL-2 και η κατασταλτική τους δράση εξαφανίζεται μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων αυτών. Μεταγραφικός παράγοντας ETS-2 Σε προηγούμενη μελέτη μας, μέσω αναζήτησης σε διαθέσιμες βάσεις δεδομένων γονιδιακής έκφρασης για πρωτεΐνες με ικανότητα δέσμευσης στο DNA που να πληρούν τα πρότυπα που περιεγράφηκαν στην προηγούμενη ενότητα, αναγνωρίστηκε ως πιθανός καταστολέας της έκφρασης της IL-2 στα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα, ο μεταγραφικός παράγοντας Ets-2 [41]. Ο Ets-2 ανήκει στην οικογένεια των Ets (E-26 Transformation-Specific) μεταγραφικών παραγόντων, οι οποίοι έχουν την ικανότητα πρόσδεσης στο DNA. Η οικογένεια αυτή αριθμεί 28 μέλη, αναγνωρισμένα μέχρι στιγμής στο ανθρώπινο γονιδίωμα [42]. Οι παράγοντες αυτοί έχουν σαν κοινό γνώρισμα μία αλληλουχία 85 αμινοξέων, η οποία δρα σαν περιοχή πρόσδεσης στο DNA (Ets περιοχή) και διαμεσολαβεί στη πρόσδεση του μεταγραφικού παράγοντα σε πλούσιες σε πουρίνη αλληλουχίες DNA με μία κεντρική συναινετική αλληλουχία (consensus sequence) GGAA-T [43, 44]. Τα μέλη της οικογένειας των Ets μεταγραφικών παραγόντων έχουν βρεθεί ότι ρυθμίζουν την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων, τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο σε έναν μεγάλο αριθμό σημαντικών κυτταρικών λειτουργιών, όπως ο πολλαπλασιασμός, η απόπτωση, η διαφοροποίηση, η ανάπτυξη κυττάρων της λεμφοειδούς σειράς, η αγγειογένεση και η μετανάστευση [45]. Οι Ets μεταγραφικοί παράγοντες έχουν ταξινομηθεί σε 4 κύριες κατηγορίες ανάλογα με τα πρότυπα πρόσδεσης τους στο DNA [46]. Οι περισσότεροι από αυτούς έχουν την Ets περιοχή στο καρβοξυτελικό τους άκρο, με κάποιες εξαιρέσεις να την έχουν στο αμινοτελικό τους άκρο. Εκτός από την Ets περιοχή, κάποιοι παράγοντες έχουν άλλη μία καλά διατηρημένη περιοχή, τη PNT, στο αμινοτελικό τους άκρο, η οποία δημιουργεί μία δομή έλικα-θηλιά-έλικα και είναι υπεύθυνη για αλληλεπιδράσεις με άλλες πρωτεΐνες. 35

38 NMR αναλύσεις της δομής της Ets περιοχής έχουν αποκαλύψει την ύπαρξη τριών α-ελίκων (α1-α3) και 4-stranded β-θηλιών (β1-β4) διατεταγμένες με τη σειρά α1- β1-β2-α2-α3-β3-β4, σχηματίζοντας μία winged τοπολογία έλικας-θηλιάς-έλικας. Η τρίτη α-έλικα είναι υπεύθυνη για την επαφή με τη μεγάλη αύλακα του DNA. Η Ets περιοχή και οι γύρω από αυτή αμινοξικές αλληλουχίες, επηρεάζουν την ικανότητα δέσμευσης στο DNA του κάθε Ets παράγοντα. Ακόμα και η αλλαγή ενός μόνο αμινοξέος από την Ets περιοχή, μπορεί να αλλάξει δραματικά την ικανότητα αυτή [44]. ΕΙΚΟΝΑ 10: Μοντέλο της δομής των Ets και PNT περιοχών των Ets μεταγραφικών παραγόντων, όπου διακρίνονται οι έλικες (H) και οι θηλιές (β) και η διάταξη τους σε κάθε περιοχή [47]. O Ets-2 (v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 2) μεταγραφικός παράγοντας, ανήκει στη πρώτη από τις τέσσερις κατηγορίες της Ets οικογένειας των μεταγραφικών παραγόντων, μαζί με τον Ets-1, με τον οποίο παρουσιάζουν μεγάλη ομοιότητα αφού το 84% της αλληλουχίας των Ets περιοχών τους και το 55% της συνολικής πολυπεπτιδικής τους αλληλουχίας είναι το ίδιο [42]. Ο Ets-2 είναι ένα καλά συντηρημένο πρωτο-ογκογονίδιο, το οποίο φαίνεται να έχει σημαντικό ρόλο στη παθογένεια διαφόρων καρκίνων, στην ανάπτυξη των οστών και στις ανοσολογικές αποκρίσεις [48]. Η πρωτεΐνη Ets-2 αποτελείται από 469 αμινοξέα. Το γονίδιο ETS-2 κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη μεγέθους περίπου 58 kda και βρίσκεται στη θέση q22.3 του μεγάλου άκρου του χρωμοσώματος 21. Ο Ets-2, είναι από τα μέλη αυτά της Ets οικογένειας που περιέχουν και την Ets περιοχή αλλά και τη PNT περιοχή. Οι περιοχές αυτές όπως 36

39 αναφέραμε και προηγουμένως είναι υπεύθυνες για τη πρόσδεση στο DNA και για τη μεταγραφική ενεργότητα, αντίστοιχα. Έχει δειχθεί επίσης, ότι ο Ets-2 αποτελεί στόχο της οικογένειας των MAPK κινασών και πιο συγκεκριμένα στη θέση Threonine-72, η οποία είναι και το μοναδικό σημείο λειτουργικής φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης και βρίσκεται κοντά στη PNT περιοχή [49]. ΕΙΚΟΝΑ 11: Σχηματική αναπαράσταση της πρωτείνης Ets-2. Διακρίνονται οι περιοχές Ets και PNT καθώς και το σημείο φωσφορυλίωσης της πρωτείνης, Τ72 [50]. Η φωσφορυλίωση του Ets-2 στο σημείο Τ-72, έχει δειχθεί ότι γίνεται άμεσα από τη κινάση ERK2, μέσω του Ras σηματοδοτικού μονοπατιού και η διαδικασία αυτή φαίνεται να είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα Ets- 2. Πειράματα με διαγονιδιακά ποντίκια που φέρανε μία μετάλλαξη στο σημείο T-72, έδειξαν σημαντική καταστολή της ανάπτυξης των θυμοκυττάρων, υποδηλώνοντας σημαντικό ρόλο του Ets-2 στην ανάπτυξη και επιβίωση των θυμοκυττάρων [51]. H φωσφορυλίωση σημείων του Ets-2, εκτός από την ενεργοποίηση του μορίου φαίνεται να ρυθμίζει και την αποικοδόμηση του. Πιο συγκεκριμένα, πρόσφατη μελέτη έχει δείξει ότι ο Ets-2 αποτελεί υπόστρωμα φωσφορυλίωσης του συμπλόκου CDK10/cyclin M σε δύο γειτονικές σερίνες, στις θέσεις 220 και 225 και ότι η φωσφορυλίωση αυτή οδηγεί στην αποικοδόμηση του Ets-2 μέσω του πρωτεασώματος ρυθμίζοντας έτσι τα πρωτεϊνικά επίπεδα του παράγοντα στο κύτταρο. Η ρύθμιση αυτή, του Ets-2, φαίνεται να έχει μεγάλη σημασία σε φυσιολογικές και μη καταστάσεις, όπως η ανάπτυξη, ο καρκίνος και η αντίσταση στο φάρμακο tamoxifen [52]. Ο Ets-2, όπως και πολλά άλλα μέλη της Ets οικογένειας των μεταγραφικών παραγόντων, ρυθμίζει την έκφραση πολλών γονιδίων στόχων είτε θετικά είτε αρνητικά. Μελέτες που έχουν γίνει μέχρι τώρα, έχουν δείξει ότι υπερέκφραση του Ets-2, επάγει την απόπτωση σε μοντέλα ποντικών με σύνδρομο Down, ενώ παράλληλα μειώνει την ανάπτυξη όγκων σε μοντέλα ποντικών αλλά και σε ανθρώπους ασθενείς με σύνδρομο 37

40 Down [48, 53]. Από την άλλη, υπερέκφραση του Ets-2 οδηγεί στη καταστολή του γονιδίου BRCA1 στη καρκινική σειρά MCF-7 [54]. Εκτός από τον ρόλο που μπορεί να παίζει ο Ets-2 σε παθολογικές καταστάσεις, όπως ο καρκίνος, φαίνεται ότι παίζει ρόλο και στην ανάπτυξη του ανθρώπινου ανοσοποιητικού συστήματος. Έχει δειχθεί ότι εκφράζεται διαρκώς καθ όλη τη διάρκεια της ζωής των θυμοκυττάρων και επηρεάζει την ωρίμανση, τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση τους, μέσω της ρύθμισης του c-myc [55, 56]. Επίσης, έχει βρεθεί ότι στα Th2 κύτταρα, μαζί με τον Ets-1, ρυθμίζουν την ενεργοποίηση της μεταγραφής της IL-5 [57]. Τέλος, φαίνεται ότι ρυθμίζει την έκφραση της κινάσης Syk, η οποία εκφράζεται στα Τ κύτταρα και λειτουργεί σαν σηματοδοτικός διαμεσολαβητής του TCR υποδοχέα. Μη φυσιολογική ρύθμιση της έκφρασης της Syk, από τον Ets-2, φαίνεται ότι μπορεί να οδηγήσει στη πρόκληση αυτοάνοσων νοσημάτων, όπως τον Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο [58]. Όπως φαίνεται και από όσα αναφέραμε παραπάνω, ο μεταγραφικός παράγοντας Ets-2, διαδραματίζει σημαντικό ρόλο, στη φυσιολογική λειτουργία του ανθρώπινου ανοσοποιητικού συστήματος, μέσω της ρύθμισης της έκφρασης αρκετών γονιδίων στόχων του. Μέχρι στιγμής, δεν έχουν αποσαφηνιστεί τελείως όλοι οι ρόλοι που αυτός διαδραματίζει, ούτε οι μηχανισμοί με τους οποίους δρα, αφήνοντας πεδίο δράσης για πολλές μελέτες, όπως η παρούσα διατριβή, να μελετήσουν και να αποκαλύψουν και άλλα στοιχεία για τον μεταγραφικό παράγοντα Ets-2. Οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων NFAT Οι NFAT πρωτεΐνες ανακαλύφθηκαν πρώτη φορά ως επαγόμενοι πυρηνικοί παράγοντες, με ικανότητα πρόσδεσης στην ARRE-2 περιοχή του υποκινητή της ιντερλευκίνης-2 σε ανθρώπινα Τ λεμφοκύτταρα. Το μεγάλο ενδιαφέρον για αυτές προκλήθηκε από το γεγονός ότι η επαγωγή τους καταστελλόταν από την κυκλοσπορίνη Α (CsA), ένα φάρμακο που χρησιμοποιούταν ευρέως στις μεταμοσχεύσεις έναντι των άνοσο-απορρίψεων οργάνων και ιστών [59]. 38

41 Μεταγενέστερες μελέτες έδειξαν ότι οι NFAT παράγοντες, δεν εκφράζονται μόνο στα Τ κύτταρα και στα υπόλοιπα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος αλλά και σε κύτταρα άλλων ιστών, όπως τα επιθηλιακά. Οι μελέτες αυτές κατέδειξαν επίσης το σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο που παίζουν οι παράγοντες αυτοί και σε λειτουργίες άλλες εκτός από την ενεργοποίηση και τη διαφοροποίηση των Τ κυττάρων. Πιο συγκεκριμένα φαίνεται ότι οι NFAT παράγοντες ρυθμίζουν τη λειτουργία κυττάρων όπως τα δενδριτικά κύτταρα, τα Β λεμφοκύτταρα και τα μεγακαρυοκύτταρα, ενώ παίζουν ρόλο και σε ένα μεγάλο αριθμό λειτουργιών, σημαντικών για την ανάπτυξη του οργανισμού, όπως ο καθορισμός της κυτταρικής διαφοροποίησης, η εμβρυική ανάπτυξη και η οργανογένεση (κυρίως στο καρδιακό, το αιμοποιητικό, το σκελετικό και το νευρικό σύστημα). Επιπλέον, μη φυσιολογική ρύθμιση της NFAT σηματοδότησης μπορεί να οδηγήσει σε κακοήθειες και ανάπτυξη καρκίνων [59, 60]. Στον άνθρωπο, η NFAT οικογένεια των μεταγραφικών παραγόντων, αποτελείται από πέντε διαφορετικά γονιδιακά προϊόντα: τους NFAT1 (NFATc2 ή NFATp), NFAT2 (NFATc1 ή NFATc), NFAT3 (NFATc4), NFAT4 (NFATc3 ή NFATx) και NFAT5 (TonEBP ή OREBP). Όλα τα μέλη της οικογένειας αυτής, έχουν μία καλά συντηρημένη περιοχή πρόσδεσης του DNA, η οποία είναι συγγενής με την περιοχή πρόσδεσης στο DNA των μεταγραφικών παραγόντων της οικογένειας REL. Η περιοχή αυτή (RHR REL homology region) είναι και το κοινό χαρακτηριστικό όλων των NFAT πρωτεϊνών που τους προσδίδει τη κοινή ιδιότητα πρόσδεσης στο DNA [61]. Οι NFAT μεταγραφικοί παράγοντες περιέχουν επίσης μία αμινοτελική περιοχή ενεργοποίησης (TAD), μία ρυθμιστική περιοχή (NHR) και μία καρβοξυτελική περιοχή. Η ρυθμιστική περιοχή NHR, η οποία είναι μέτρια συντηρημένη, περιέχει πολλές περιοχές πλούσιες σε σερίνη (SRRs) που φωσφορυλιώνονται από τις κινάσες CK1, GSK3 και DYRK. Η περιοχή αυτή περιέχει επίσης θέσεις πρόσδεσης για την καλσινευρίνη και τη CK1, οι οποίες ρυθμίζουν την ενεργότητα των NFAT πρωτεϊνών [59]. 39

42 ΕΙΚΟΝΑ 12: Απεικόνιση της γενικής δομής των NFAT μεταγραφικών παραγόντων. Φαίνονται η NHR ρυθμιστική περιοχή (η οποία περιέχει τη TAD περιοχή ενεργοποίησης και τα σημεία πρόσδεσης της καλσινευρίνης και της κινάσης CK1), η RHR περιοχή πρόσδεσης στο DNA και η καρβοξυτελική περιοχή [62]. Όλοι οι NFAT μεταγραφικοί παράγοντες, εκτός από τον NFAT5, ενεργοποιούνται από την εισροή στο κύτταρο ιόντων ασβεστίου (Ca 2+ ), είτε μέσω του PLC-γ μονοπατιού είτε μέσω των αποθηκών ασβεστίου των ίδιων των κυττάρων. Οι ασβέστιο-εξαρτώμενες NFAT ισομορφές, βρίσκονται σε μία υπερφωσφορυλιωμένη μορφή στο κυτταρόπλασμα και με την αύξηση των ιόντων ασβεστίου, αποφωσφορυλιώνονται από την καλσινευρίνη και μετακινούνται στον πυρήνα των κυττάρων. Με την είσοδο τους στο πυρήνα, οι NFAT μεταγραφικοί παράγοντες ενεργοποιούν την έκφραση διαφόρων γονιδίων στόχων. Ο NFAT5, ο οποίος είναι και το αρχαιότερο μέλος της NFAT οικογένειας, ενεργοποιείται μετά από απόκριση στο οσμωτικό στρες [59, 60]. Οι NFAT μεταγραφικοί παράγοντες θεωρούνται σημαντικοί για τις ανθρώπινες ανοσοαποκρίσεις, γιατί μέσω της ικανότητας να προσδένονται στο DNA, ρυθμίζουν την έκφραση πολλών κυτταροκινών καθώς και των υποδοχέων τους. Μία διαδικασία η οποία καθορίζει τις τύχες των παρθενικών Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων, δηλαδή τη διαφοροποίηση τους σε κύτταρα τελεστές και επομένως τη λειτουργία τους [63]. Μία από τις πιο σημαντικές κυτταροκίνες, την έκφραση της οποίας ρυθμίζουν οι NFAT μεταγραφικοί παράγοντες, είναι η IL-2. Όπως είπαμε και προηγουμένως οι NFAT πρωτεΐνες ρυθμίζουν την έκφραση της IL-2, μέσω της πρόσδεσης τους στον υποκινητή του γονιδίου της. Από όλες τις NFAT ισομορφές, οι NFAT1 και NFAT2 40

43 εκφράζονται κυρίως σε λεμφοκύτταρα που παράγουν IL-2, ενώ ο NFAT4 εκφράζεται κυρίως στο θύμο αδένα. Μελέτες έδειξαν ότι η καταστολή της έκφρασης είτε του NFAT1 είτε του NFAT2 δεν επηρεάζει την έκφραση της IL-2, η αποσιώπηση όμως και των δύο ισομορφών καταστέλλει ισχυρά την έκφραση της IL-2, αποδεικνύοντας έτσι ότι οι NFAT μεταγραφικοί παράγοντες είναι σημαντικοί επαγωγείς της έκφρασης της IL-2 στα Τ λεμφοκύτταρα [64]. Μεταγραφικός παράγοντας FoxP3 Ο μεταγραφικός παράγοντας FoxP3 είναι μέλος της οικογένειας των winged helix/forkhead μεταγραφικών παραγόντων και ανακαλύφθηκε επειδή οι μεταλλάξεις του προκαλούσαν την έναρξη θανατηφόρων αυτοανόσων νοσημάτων, τα οποία τώρα αναγνωρίζονται με το γενικό όνομα σύνδρομο IPEX (Immunodysregulation, polyendocrinopathy, and enteropathy, X-linked), τόσο στα ποντίκια όσο και στους ανθρώπους. Ανεξάρτητες μελέτες από πολλά διαφορετικά εργαστήρια, έχουν αποδείξει τον καθοριστικό ρόλο που παίζει ο FoxP3 στη διατήρηση και τη λειτουργία των T ρυθμιστικών κυττάρων (Τreg). Επιπροσθέτως, έχει δειχθεί ότι o FoxP3 είναι κατεσταλμένος σε ένα μεγάλο αριθμό καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων κύτταρα του στήθους, του προστάτη, των ωοθηκών, του παγκρέατος, του θυρεοειδούς αδένα καθώς και Τ λευχαιμικών κυττάρων. Η καταστολή αυτή επιτρέπει την κυτταρική αύξηση και πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων καθώς ο FoxP3 καταστέλλει την έκφραση ογκογονιδίων και επάγει την έκφραση άλλων ογκοκατασταλτικών γονιδίων [65]. Το γονίδιο FoxP3 είναι καλά συντηρημένο σε όλα τα θηλαστικά. Βρίσκεται στο βραχύ άκρο του Χ χρωμοσώματος και αποτελείται από 11 εξόνια, τα οποία κωδικοποιούν μία πρωτεΐνη 431 αμινοξέων. Ξεκινώντας από το αμινοτελικό άκρο, ο FoxP3 περιέχει μία περιοχή πλούσια σε προλίνες, υπεύθυνη για τη καταστολή της έκφρασης γονιδίων στόχων, ένα δάκτυλο ψευδαργύρου, ένα δομικό μοτίβο φερμουάρ λευκίνης που επιτρέπει στο μόριο να ομο- ή ετερο-διμερίζεται και τέλος τη συντηρημένη forkhead περιοχή πρόσδεσης στο DNA (FKH) με δύο σημεία που 41

44 στοχεύουν τον εντοπισμό του FoxP3 στο πυρήνα στα καρβοξυ- και αμινοτελικά του άκρα [66]. ΕΙΚΟΝΑ 13: Απεικόνιση της δομής και των περιοχών που απαρτίζουν το γονίδιο και τη πρωτεΐνη FoxP3, καθώς και των κύριων λειτουργιών που αυτές επιτελούν [66]. Ο FoxP3 είναι μέρος ενός μεγάλου μοριακού συμπλόκου μεγέθους περίπου 600 kda, το οποίο αποτελείται επίσης από αποακετυλάσες ιστονών, ακετυλοτρανσφεράσες ιστονών και άλλους μεταγραφικούς παράγοντες όπως ο Runx1. Αλληλεπιδρά με αρκετούς μεταγραφικούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένου του NFAT καταστέλλοντας την έκφραση της IL-2 και άλλων προφλεγμονοδών κυτταροκινών μειώνοντας έτσι την τελεστική δράση των T βοηθητικών κυττάρων [66]. Η μεγαλύτερη έκφραση του FoxP3 παρατηρείται σε έναν υποπληθυσμό των T βοηθητικών κυττάρων, τα οποία ονομάζονται CD4+CD25+ T ρυθμιστικά κύτταρα. Παρόλα αυτά μερικά CD8+ T κύτταρα εκφράζουν επίσης FoxP3 και έχουν την ικανότητα να λειτουργούν σαν Τ ρυθμιστικά κύτταρα. Έχει παρατηρηθεί επίσης και μικρή έκφραση FoxP3 σε διπλά αρνητικά θυμοκύτταρα στον άνθρωπο. Φαίνεται ότι η έκφραση του FoxP3 είναι απαραίτητη για Τ κύτταρα να αποκτήσουν τη κατασταλτική τους δράση [67]. Τα Τ ρυθμιστικά κύτταρα παίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ανοσολογικής ανοχής, της πρόληψης αυτοάνοσων νοσημάτων και του περιορισμού φλεγμονοδών καταστάσεων. Ένα αποκλειστικό και σημαντικό χαρακτηριστικό των κυττάρων αυτών είναι η ευελιξία που διαθέτουν στο να μπορούν να καταστέλλουν ένα μεγάλο αριθμό κυτταρικών πληθυσμών, όπως τα CD4+ και CD8+ T κύτταρα, τα Β κύτταρα, τα δενδριτικά κύτταρα και τους οστεοκλάστες, σε μία σειρά φλεγμονοδών καταστάσεων αλλά και σε διαφορετικούς ιστούς μέσα στον οργανισμό. Στη λειτουργία αυτή των T ρυθμιστικών κυττάρων, φαίνεται ότι εμπλέκονται μία σειρά από 42

45 μηχανισμούς, οι οποίοι δεν έχουν μελετηθεί ακόμα καλά. Αυτό που έχει όμως αποδειχτεί είναι ο σημαντικός ρόλος που παίζει ο μεταγραφικός παράγοντας FoxP3 στη διατήρηση της σταθερότητας των κυττάρων αυτών και στη ρυθμιστική τους δράση, τόσο σημαντική για τη φυσιολογική λειτουργία του ανθρώπινου οργανισμού και στην αποφυγή παθολογικών καταστάσεων όπως τα αυτοάνοσα νοσήματα [68]. Αυτοάνοσα νοσήματα Σκλήρυνση κατά πλάκας Τα αυτοάνοσα νοσήματα προκαλούνται από την επίθεση των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος στους ιστούς τους οποίους υπό φυσιολογικές συνθήκες προστατεύουν. Τα νοσήματα αυτά χωρίζονται σε συστημικά ή ιστο-ειδικά και προκαλούνται από τη διατάραξη της ισορροπίας του ανοσοποιητικού συστήματος. Το ανθρώπινο ανοσοποιητικό σύστημα σχεδιάστηκε να αναγνωρίζει και να αντιδρά σε ένα μεγάλο αριθμό ξένων παθογόνων, ενώ παράλληλα παραμένει αδρανές απέναντι στα κύτταρα και τους ιστούς του ίδιου του οργανισμού (αυτό-αντιγόνα). Η ικανότητα αυτή ονομάζεται ανοσολογική ανοχή [69]. Αποτυχία στην εφαρμογή της ανοσολογικής ανοχής από το ανοσοποιητικό σύστημα, οδηγεί στη πρόκληση αυτοανοσίας. Οι λόγοι που μπορούν να οδηγήσουν σε αυτό το φαινόμενο είναι εγγενείς ανωμαλίες των λεμφοκυττάρων ή διαταραχές στη φύση του αντιγόνου και στην παρουσίαση των αυτό-αντιγόνων. Τα αυτοάνοσα νοσήματα συνήθως είναι ετερογενή και πολυπαραγοντικά και επομένως υπήρξε δύσκολο μέχρι σήμερα να κατανοηθούν πλήρως οι μηχανισμοί που προκαλούν αυτοανοσία. Αυτό που γνωρίζουμε είναι το αποτέλεσμα της αυτοανοσίας, το οποίο μπορεί να είναι η παραγωγή αντισωμάτων κατά των αυτό-αντιγόνων ή η ενεργοποίηση Τ λεμφοκυττάρων που αντιδρούν με αυτά [5]. 43

46 ΕΙΚΟΝΑ 14: Σχηματική απεικόνιση της παραγωγής αντισωμάτων έναντι αυτό-αντιγόνων κατά τη διάρκεια αυτοανοσίας[70]. Ένα από τα πιο γνωστά αυτοάνοσα νοσήματα και με το οποίο θα ασχοληθούμε στη διατριβή αυτή, είναι η σκλήρυνση κατά πλάκας (Multiple Sclerosis MS). Η σκλήρυνση κατά πλάκας είναι ένα χρόνιο αυτοάνοσο φλεγμονώδες νόσημα απομυελίνωσης του κεντρικού νευρικού συστήματος, το οποίο προκαλεί αυτοάνοσες αντιδράσεις με αποτέλεσμα τον τραυματισμό ιστών και τη κλινική ανικανότητα. Οι μηχανισμοί παθογένειας της νόσου αυτής, όπως και για πολλά άλλα αυτοάνοσα νοσήματα, δεν έχουν αναγνωριστεί πλήρως. Φαίνεται όμως ότι η αρχή και η εξάπλωση σκλήρυνσης κατά πλάκας οφείλεται σε γενετικούς, μολυσματικούς, ανοσολογικούς ή και περιβαλλοντικούς παράγοντες [71]. Η πορεία της νόσου μπορεί να ακολουθήσει τέσσερα διακριτά κλινικά μοτίβα. Το πρώτο είναι η υποτροπιάζουσα διαλείπουσα σκλήρυνση κατά πλάκας (Relapsing Remitting MS / RRMS) και αποτελεί το 80-90% των αρχικών περιστατικών σκλήρυνσης κατά πλάκας. Χαρακτηρίζεται από οξείες επιθέσεις νευρολογικών βλαβών, οι οποίες στις περισσότερες περιπτώσεις ακολουθούνται από σχεδόν ολική ανάκτηση λειτουργίας. Το δεύτερο είναι η δευτερογενής προοδευτική σκλήρυνση κατά πλάκας (Secondary Progressive MS / SPMS). Ξεκινάει όπως και η RRMS, αλλά από ένα σημείο και μετά χαρακτηρίζεται από μία σταθερή επιδείνωση της λειτουργίας και όχι από οξείες επιθέσεις. Περίπου το 80% των RRMS ασθενών ακολουθούν αυτή τη 44

47 κλινική πορεία, ενώ αποτελεί τον τύπο του νοσήματος με το μεγαλύτερο ποσοστό νευρολογικών βλαβών. Το τρίτο μοτίβο είναι η κύρια προοδευτική σκλήρυνση κατά πλάκας (Primary Progressive MS / PRMS). Αποτελεί το 10% των αρχικών περιστατικών και χαρακτηρίζεται από μία σταδιακή μείωση της λειτουργίας και από μη εμφάνιση οξειών επιθέσεων. Τέλος, η προοδευτική υποτροπιάζουσα σκλήρυνση κατά πλάκας (Progressive Relapsing MS / PRMS), ξεκινάει σταδιακά, ενώ οι ασθενείς υπόκεινται σε σποραδικές οξείς επιθέσεις [72]. H σκλήρυνση κατά πλάκας, είναι ουσιαστικά ένα χρόνιο αυτοάνοσο νόσημα του κεντρικού νευρικού συστήματος και χαρακτηρίζεται από επαναλαμβανόμενα επεισόδια απομυελίνωσης και αξονικών αλλοιώσεων. Τα κύρια παθολογικά γνωρίσματα της νόσου αυτής είναι η διαρροή του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, η καταστροφή ελύτρων μυελίνης, η βλάβη και ο κυτταρικός θάνατος των ολιγοδενδροκυττάρων, ο τραυματισμός και η απώλεια των αξόνων, η δημιουργία νευρογλοιακών ουλών και η παρουσία φλεγμονοδών διηθήσεων. Οι διηθήσεις αυτές αποτελούνται από αυτοαντιδρώντα Τ κύτταρα, μακροφάγα, αστροκύτταρα, ιστιοκύτταρα και άλλα, τα οποία έχουν την ικανότητα να προκαλούν φλεγμονώδεις αντιδράσεις με αποτέλεσμα τον τοπικό τραυματισμό ιστών [73]. Όπως είπαμε και προηγουμένως, η παθογένεια του νοσήματος αυτού παραμένει ακόμα άγνωστη. Ένας από τους προτεινόμενους μηχανισμούς παθογένεσης της σκλήρυνσης κατά πλάκας φαίνεται να είναι και η μη φυσιολογική λειτουργία των ανοσορυθμιστικών μηχανισμών του οργανισμού. Κυρίαρχο ρόλο σε αυτούς παίζουν τα Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα και η IL-2, τα οποία όπως θα δούμε και στη συνέχεια, αποτελούν τα αντικείμενα μελέτης της συγκεκριμένης διατριβής. 45

48 ΕΙΚΟΝΑ 15: Ένας από τους προτεινόμενους μηχανισμούς παθογένεσης της σκλήρυνσης κατά πλάκας, που εμπλέκει τα Τ λεμφοκύτταρα και τους ανοσορυθμιστικούς μηχανισμούς του οργανισμού [72]. 46

49 ΣΚΟΠΟΣ 47

50 Τα Τ λεμφοκύτταρα και πιο συγκεκριμένα τα Τ βοηθητικά κύτταρα (CD4), όπως περιγράφηκε και στην εισαγωγή, αποτελούν σημαντικά συστατικά του ανθρώπινου ανοσοποιητικού συστήματος, αφού ανωμαλίες στην ενεργοποίηση και λειτουργία τους μπορεί να οδηγήσουν σε αυτοάνοσα νοσήματα ή στην αδυναμία του οργανισμού να αντιμετωπίσει με επιτυχία μολυσματικούς παράγοντες και παθογόνες καταστάσεις [74]. Η ενεργοποίηση των CD4+ Τ βοηθητικών, προκαλεί μία αλυσίδα γεγονότων στο εσωτερικό των κυττάρων, ανάμεσα στα οποία είναι και η ενεργοποίηση, η πυρηνική μετατόπιση και η λειτουργία συγκεκριμένων μεταγραφικών παραγόντων. Το αποτέλεσμα της ενεργοποίησης αυτής είναι η ρύθμιση της έκφρασης διαφόρων κυτταροκινών, μεταξύ των οποίων είναι η IL-2 [75]. Η σωστή ισορροπία της λειτουργίας των διαφόρων παραγόντων που εμπλέκονται στη μεταγραφική ρύθμιση της IL-2, είναι μεγάλης σημασίας για τα Τ κύτταρα, αφού χωρίς τη σωστή ρύθμιση, το γονίδιο της IL-2 θα μπορεί να εκφράζεται μη φυσιολογικά ακόμα και σε κύτταρα που βρίσκονται σε ηρεμία οδηγώντας έτσι σε αυτοάνοσα νοσήματα ή σε απώλεια της ανοσολογικής απόκρισης [4]. Σκοπός της διατριβής αυτής είναι η μελέτη της ρύθμισης της έκφρασης της IL- 2 σε Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα, από μεταγραφικούς παράγοντες που προσδένονται στην ARRE-2 αλληλουχία του υποκινητή του γονιδίου. Οι υπό εξέταση παράγοντες είναι οι NFAT, FoxP3 και Ets-2. Μεγαλύτερη έμφαση θα δοθεί στον μεταγραφικό καταστολέα Ets-2, αφού οι ιδιότητες έκφρασης και λειτουργίας του παραμένουν ακόμα άγνωστες σε σχέση με τους άλλους δύο μεταγραφικούς παράγοντες. Η μελέτη αυτή εκτείνεται σε απομονωμένα Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα, τόσο από φυσιολογικούς δότες όσο και από ασθενείς με το αυτοάνοσο νόσημα, σκλήρυνση κατά πλάκας, με σκοπό να διερευνηθεί ο ρόλος του Ets-2 και των άλλων μεταγραφικών παραγόντων στην παθογένεση του νοσήματος αυτού. 48

51 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 49

52 Κύτταρα - Ιστοί Στη παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε ηπαρινισμένο ολικό αίμα από υγιείς εθελοντές δότες και ασθενείς με σκλήρυνση κατά πλάκας, το οποίο συλλέχθηκε από το Περιφερειακό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Πατρών. Επίσης, χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά Jurkat (T-cell acute lymphoblastic leukemia), η οποία προήλθε από απομονωμένα κύτταρα περιφερικού αίματος ενός 14χρονου αγοριού με Τ κυτταρική λευχαιμία και παρουσιάζει όλα τα χαρακτηριστικά ενός παρθενικού Τ λεμφοκυττάρου, όπως η έκφραση IL-2 μετά από ενεργοποίηση [76]. Στη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν και τομές ιστών μονιμοποιημένων και εγκλεισμένων σε παραφίνη. Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν τομές από θύμο αδένα φυσιολογικών εμβρύων κατά την εμβρυϊκή ηλικία των 25 εβδομάδων και τομές από ιστό αμυγδαλής φυσιολογικών ενηλίκων ατόμων, από το αρχείο του Εργαστηρίου Παθολογίας του Γενικού Νοσοκομείου Πατρών O Άγιος Ανδρέας. Καλλιέργειες κυττάρων Τόσο οι κυτταρικοί υποπληθυσμοί που απομονώθηκαν από ολικό αίμα όσο και κύτταρα κυτταρικής σειράς, καλλιεργήθηκαν και διατηρήθηκαν σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό (CM) με βέλτιστη συγκέντρωση 1 χ 10 6 κύτταρα/ml. Το καλλιεργητικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε ήταν RPMI 1640 περιείχε ορό εμβρύου βοός σε περιεκτικότητα 10% και πενικιλίνη/στρεπτομυκίνη σε περιεκτικότητα 1%. Η ανάπτυξη των κυττάρων έγινε σε επωαστικό θάλαμο με σταθερή θερμοκρασία 37 0 C και σταθερή τροφοδότηση με αέριο διοξείδιο του άνθρακα (CO2) σε ποσοστό 5% Σε περιπτώσεις που τα κύτταρα έπρεπε να ενεργοποιηθούν οι καλλιέργειες των κυττάρων έγιναν παρουσία εστέρα φορβόλης (PMA) 10ng/ml και ιονομυκίνης 1-2μM για όσο χρονικό διάστημα απαιτούνταν στο αντίστοιχο πείραμα. 50

53 Απομόνωση υποπληθυσμών Τ λεμφοκυττάρων Από ολικό περιφερικό αίμα, απομονώνουμε τα μονοπύρηνα κύτταρα (λεμφοκύτταρα και μονοκύτταρα) με τη βοήθεια ηλεκτροφόρησης βαθμίδωσης φικόλης. Πιο συγκεκριμένα, μεταφέρουμε το ηπαρινισμένο αίμα (συνήθως αραιωμένο με καλλιεργητικό μέσο RPMI 1640 σε αναλογία 1:1) σε σωληνάρια falcon, τα οποία περιέχουν ήδη φικόλη. Η αναλογία φικόλης/αραιωμένου αίματος είναι 1:2. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 30 λεπτά στις 1800 rpm κατά την οποία έχουμε το διαχωρισμό του ολικού αίματος σε τρεις φάσεις. Το πλάσμα του αίματος, τα μονοπύρηνα κύτταρα και τα πολυμορφοπύρηνα μαζί με τα ερυθροκύτταρα (εικόνα 16). ΕΙΚΟΝΑ 16: Σχηματική απεικόνιση της απομόνωσης μονοπύρηνων κυττάρων από περιφερικό ολικό αίμα με ηλεκτροφόρηση βαθμίδωσης φικόλης. Μετά την απομόνωση των μονοπύρηνων κυττάρων, μπορούμε να προχωρήσουμε στην απομόνωση συγκεκριμένων Τ κυτταρικών υποπληθυσμών με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής ή με τη χρήση ανοσομαγνητικών σφαιριδίων, τεχνικές οι οποίες αναλύονται διεξοδικά στη συνέχεια. 51

54 Κυτταρομετρία ροής Η κυτταρομετρία ροής είναι μία τεχνική κατά την οποία μπορούμε να μετρήσουμε ταυτόχρονα διάφορα φυσικά χαρακτηριστικά μεμονωμένων σωματιδίων, συνήθως κυττάρων, τα οποία διέρχονται σε νηματική ροή από ένα σταθερό σημείο στο οποίο προσπίπτει μία ακτίνα φωτός. Στα χαρακτηριστικά αυτά, συμπεριλαμβάνονται το σχετικό μέγεθος των σωματιδίων, η σχετική κοκκίωση ή η εσωτερική πολυπλοκότητα και η σχετική ένταση φθορισμού. Οι μετρήσεις αυτές γίνονται μέσω ενός συστήματος που συνδέει το οπτικό με το ηλεκτρικό σήμα και καταγράφει τον τρόπο με τον οποίο το κάθε κύτταρο ή σωματίδιο σκεδάζει το προσπίπτων φως και εκπέμπει φθορισμό. Ένα μηχάνημα κυτταρομετρίας ροής αποτελείται από τρία κύρια συστήματα: Το σύστημα ροής, το οποίο μεταφέρει τα υπό εξέταση σωματίδια με μία ροή να περάσουν μέσα από τη δέσμη φωτός που εκπέμπεται από μία πηγή laser. Το οπτικό σύστημα, που αποτελείται από τα laser τα οποία φωτίζουν τα σωματίδια του δείγματος και από τα οπτικά φίλτρα τα οποία καθοδηγούν τα προκύπτοντα σήματα φωτός στους κατάλληλους ανιχνευτές. Το ηλεκτρονικό σύστημα, το οποίο μετατρέπει τα σήματα φωτός που ανιχνεύθηκαν σε ηλεκτρονικά σήματα για την περαιτέρω επεξεργασία τους στον υπολογιστή. Σε ένα κυτταρομετρητή ροής, τα κύτταρα ενός δείγματος διέρχονται σε νηματική ροή από ένα σταθερό σημείο στο οποίο προσπίπτει μία ακτίνα laser και το οποίο σκεδάζεται. Εάν στο δείγμα υπάρχουν φθορίζονται μόρια τότε αυτά θα φθορίσουν. Το σκεδαζόμενο και το φθορίζων φως συλλέγονται από ειδικούς φακούς και κατευθύνονται στους κατάλληλους ανιχνευτές, οι οποίοι και παράγουν ηλεκτρονικά σήματα ανάλογα με τα οπτικά σήματα που έχουν λάβει. Τα σήματα αυτά αντικατοπτρίζουν χαρακτηριστικά και παραμέτρους από κάθε ένα κύτταρο του δείγματος και τα οποία στη συνέχεια μπορούν να αναλυθούν από ειδικά λογισμικά. Η σκέδαση του φωτός από ένα κύτταρο ανιχνεύεται υπό διάφορες γωνίες ανάλογα με τη διάταξη ειδικών ανιχνευτών. Αν ο ανιχνευτής βρίσκεται μπροστά από το κύτταρο, μετράει το οριζόντιο σκεδαζόμενο φως (Forward-scattered Light FSC), 52

55 το οποίο αντικατοπτρίζει το μέγεθος ή την επιφάνεια του κυττάρου. Αν ο ανιχνευτής είναι κάθετος προς το προσπίπτων φως, τότε μετράει τη κάθετη σκέδαση του φωτός (Side-scattered Light SSC), η οποία αντιστοιχεί στην κοκκίωση του κυττάρου ή την εσωτερική πολυπλοκότητα του. ΕΙΚΟΝΑ 17: Ιδιότητες σκέδασης του φωτός από ένα κύτταρο [77]. Ο φθορισμός, το τρίτο σήμα που συλλέγεται, είναι η ιδιότητα που έχουν ορισμένες ουσίες να εκπέμπουν δευτερεύουσα ακτινοβολία όταν διεγείρονται από μία άλλη πρωτογενή. Η διεγείρουσα και η εκπεμπόμενη ακτινοβολία είναι χαρακτηριστικές για τη κάθε φθορίζουσα ουσία. Οι ουσίες αυτές, συνήθως συζευγμένες σε αντισώματα, χρησιμοποιούνται για τη στόχευση συγκεκριμένων επιτόπων με σκοπό την μέτρηση των βιολογικών και βιοχημικών ιδιοτήτων τους μέσω της κυτταρομετρίας ροής. Η χρήση αυτή βρίσκει εφαρμογή στην αναγνώριση και ποσοτικοποίηση διακριτών κυτταρικών πληθυσμών, εξωκυτταρικών υποδοχέων ή ενδοκυττάριων οργανιδίων, στον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε DNA του κυττάρου, στην μέτρηση ενζυμικής δραστηριότητας και σε άλλες μελέτες. Αυτή τη στιγμή υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός φθοροχρωμάτων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε πειράματα κυτταρομετρίας ροής και ο οποίος ολοένα και αυξάνεται. Κάθε φθορόχρωμα έχει το δικό του φάσμα διέγερσης (η περιοχή των μηκών κύματος φωτός που προκαλούν το φθορισμό του) και ένα φάσμα εκπομπής (η περιοχή του φθορισμού που εκπέμπεται). Όταν χρησιμοποιούνται δύο ή παραπάνω φθοροχρώματα μαζί, τα φάσματα εκπομπής πρέπει να διαφέρουν, έτσι ώστε να μην αλληλοεπικαλύπτονται τα σήματα που λαμβάνουν οι ανιχνευτές. Ορισμένα μηχανήματα κυτταρομετρίας ροής, εκτός από τη μέτρηση χαρακτηριστικών διαφόρων κυτταρικών πληθυσμών έχουν και τη δυνατότητα του διαχωρισμού και της συλλογής τους, έτσι ώστε να χρησιμοποιηθούν αργότερα σε άλλες 53

56 λειτουργικές, βιοχημικές ή μικροσκοπικές αναλύσεις. Αφού οι επιθυμητοί πληθυσμοί έχουν αναγνωριστεί, με βάση το φθορισμό συγκεκριμένων φθοροχρωμάτων, τα κύτταρα των πληθυσμών αυτών φορτίζονται και στη συνέχεια διαχωρίζονται με βάση το φορτίο τους και συλλέγονται. Η διαδικασία χρώσης επιφανειακών δεικτών για την φαινοτύπηση ή τον διαχωρισμό κυτταρικών υποπληθυσμών με κυτταρομετρία ροής, έχει ως εξής: Σε σωληνάρια κυτταρομετρία ροής, τοποθετούνται μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος σε συγκέντρωση 1χ10 6 κύτταρα/100μl ή 1χ10 7 κύτταρα/100 μl, για φαινοτύπηση ή διαχωρισμό αντίστοιχα. Στη συνέχεια προσθέτουμε τον επιθυμητό συνδυασμό μονοκλωνικών αντισωμάτων σε κάθε δείγμα και επωάζουμε για 30 στους 4 0 C, στο σκοτάδι. Μετά το τέλος της επώασης ακολουθεί πλύση των κυττάρων με 1xPBS προκειμένου να απομακρυνθεί η περίσσεια του αντισώματος και επαναιωρούνται στον κατάλληλο όγκο για κάθε χρήση (300μl 1xPBS για φαινοτύπηση ή 1ml FACS buffer για διαχωρισμό). Τα δείγματα αναλύονται ή διαχωρίζονται στον κυτταρομετρητή FACS Aria II. Η διαδικασία χρώσης ενδοκυττάριων πρωτεϊνών στόχων (μεταγραφικοί παράγοντες) Τ κυττάρων ή κυττάρων με κυτταρομετρία ροής, έχει ως εξής: Συνεχίζοντας μετά τη χρώση επιφανειακών δεικτών που περιγράφηκε παραπάνω (εάν είναι αναγκαίο), στα κύτταρα προστίθεται 500μl διάλυμα μονιμοποίησης και πραγματοποιείται επώαση για 30 στους 4 0 C, στο σκοτάδι. Πραγματοποιούνται δύο διαδοχικές πλύσεις με κατάλληλο διάλυμα (Permeabilization buffer). Στα κύτταρα προστίθεται το πρωτογενές αντίσωμα έναντι του ενδοκυττάριου στόχου και πραγματοποιείται επώαση για 30 στους 4 0 C, στο σκοτάδι. Μετά από δύο διαδοχικές πλύσεις με Permeabilization buffer, προστίθεται δευτερογενές φθορίζων αντίσωμα έναντι του πρωτογενούς ενδοκυττάριου στόχου και πραγματοποιείται επώαση για 30 στους 4 0 C, στο σκοτάδι. Μετά το τέλος της επώασης ακολουθεί πλύση των κυττάρων με Permeabilization buffer και με 1xPBS προκειμένου να απομακρυνθεί η περίσσεια του αντισώματος και επαναιωρούνται σε 300μl 1xPBS. Τα δείγματα αναλύονται στον κυτταρομετρητή FACS Aria II. 54

57 Μαγνητικός διαχωρισμός κυττάρων Εκτός από τον διαχωρισμό των κυττάρων με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής, υπάρχει και η μέθοδος διαχωρισμού των κυττάρων με τη χρήση μαγνητικών σφαιριδίων. Τα μαγνητικά αυτά σφαιρίδια είναι συζευγμένα σε αντισώματα ειδικά για συγκεκριμένους επιτόπους, οι οποίοι εκφράζονται στην επιφάνεια κυττάρων συγκεκριμένων πληθυσμών. Αφού λοιπόν τα αντισώματα δεσμευτούν στον επίτοπο στόχο τους, τότε ο επιθυμητός κυτταρικός πληθυσμός απομονώνεται με τη χρήση ενός μαγνήτη. Υπάρχουν δύο τύποι μαγνητικού διαχωρισμού. Η θετική και η αρνητική επιλογή. Στην θετική επιλογή, ο πληθυσμός στόχος απομονώνεται άμεσα από το δείγμα με βάση την έκφραση συγκεκριμένου επιφανειακού επιτόπου. Αντίθετα στην αρνητική επιλογή, χρησιμοποιείται μία συλλογή αντισωμάτων τα οποία δεσμεύονται σε επιτόπους των ανεπιθύμητων κυττάρων, τα οποία και απομακρύνονται αφήνοντας μόνο τον πληθυσμό στόχο. Η αρνητική επιλογή έχει το πλεονέκτημα της μη ενεργοποίησης των κυττάρων που θέλουμε να απομονώσουμε εξαιτίας της δέσμευσης αντισωμάτων στην κυτταρική επιφάνεια [78]. Η διαδικασία απομόνωσης συγκεκριμένων υποπληθυσμών Τ κυττάρων με τη χρήση μαγνητικών σφαιριδίων έχει ως εξής: Στα κύτταρα προστίθεται ειδικό αντίσωμα για τον υποπληθυσμό που πρόκειται να απομονωθεί. Ακολουθεί επώαση κυττάρων-αντισώματος για 10 στους 4 0 C, υπό ανάδευση. Πραγματοποιείται πλύση των μαγνητικών σφαιριδίων με ρυθμιστικό διάλυμα (isolation buffer). Στη συνέχεια ακολουθεί πλύση των κυττάρων προκειμένου να απομακρυνθεί η περίσσεια του αντισώματος. Στο εναιώρημα των κυττάρων προστίθενται τα μαγνητικά σφαιρίδια και θα πραγματοποιείται επώαση για 15 στους 4 0 C, υπό ανάδευση. Στη φάση αυτή τα μαγνητικά σφαιρίδια δεσμεύονται στα κύτταρα στόχους. Με τη χρήση ενός μαγνήτη (μαγνητικό στατό), αφαιρείται το υπερκείμενο, που περιέχει τον αρνητικό πληθυσμό κυττάρων και κρατάμε τον απομονωμένο επιθυμητό πληθυσμό. 55

58 Τέλος, προστίθεται κατάλληλο διάλυμα (release buffer) και πραγματοποιείται επώαση του εναιωρήματος κυττάρων, σφαιριδίων και διαλύματος για 10 στους 4 0 C, υπό ανάδευση. Το διάλυμα αυτό προκαλεί αποδέσμευση των μαγνητικών σφαιριδίων από τα κύτταρα, επιτρέποντας τη συλλογή των απομονωμένου Τ κυτταρικού υποπληθυσμού. ΕΙΚΟΝΑ 18: Μέθοδος απομόνωσης κυτταρικών πληθυσμών με τη χρήση ανοσομαγνητικών σφαιριδίων Dynabeads [78]. 56

59 RT-PCR και Real-time PCR Ο έλεγχος της γονιδιακής έκφρασης συγκεκριμένων γονιδίων έγινε στο επίπεδο του mrna τόσο με την χρήση RT-PCR όσο και με την χρήση Real-time PCR. Η διαδικασία αυτή ξεκινάει με την απομόνωση του RNΑ από τα κύτταρα και την κατασκευή cdna με αντίστροφη μεταγραφή. Απομόνωση RNA από τα κύτταρα Τα κύτταρα, μετά την καλλιέργειά τους παρουσία ή απουσία P/I για συγκεκριμένο αριθμό ωρών, φυγοκεντρούνται στις 2500rpm για 10min στους 4 0 C και ακολουθούν 2 πλύσεις με 1xPBS. Στην συνέχεια το ίζημα των κυττάρων διαλύεται σε τριζόλη, σε ποσότητα 1ml trizol/5-10x10 6 κύτταρα. Η τριζόλη προκαλεί διάρρηξη των μεμβρανών των κυττάρων και εκχύλιση των κυτταροπλασματικών υλικών. Η απομόνωση του RNA από τα υπόλοιπα κυτταροπλασματικά υλικά γίνεται με τη χρήση διαλύματος χλωροφορμίου:ισοαμυλικής αλκοόλης (49:1) και επώασης σε συνθήκες RT. Ακολουθεί φυγοκέντρηση και απομόνωση της υδάτινης φάσης που περιέχει εκχύλισμα με το RNA των κυττάρων. Στην συνέχεια ακολουθεί καθίζηση του RNA με την προσθήκη στην απομονωμένη υδάτινη φάση ισοπροπανόλης σε όγκο 1:1 και επώαση για 20min στους C. Η διαδικασία της απομόνωσης του RNA τελειώνει με φυγοκέντρηση των δειγμάτων και καθαρισμό του ιζήματος με EtOH καθώς και με διάλυσή του σε κατάλληλη ποσότητα depc νερού. Η αποθήκευση των δειγμάτων γίνεται στους C Κατασκευή cdna και RT-PCR Μετά την απομόνωση του RNA προχωρήσαμε στην διαδικασία της κατασκευής cdna. Η κατασκευή του cdna από το ολικό RNA των δειγμάτων, έγινε με χρήση του ενζύμου της αντίστροφης μεταγραφάσης (reverse transcriptase) σύμφωνα με το πρωτόκολλο της Invitrogen (SuperScript II Reverse Transcriptase-Invitrogen). Η 57

60 διαδικασία αυτή περιλαμβάνει την χρήση random εκκινητών, dntps, των κατάλληλων buffer και 5-10ng ολικού RNA. Η γονιδιακή έκφραση των Ets-2 και IL-2 μελετήθηκε με RT-PCR και η έκφραση του mrna της β2-μικρογλοβουλίνης (β2-m), χρησιμοποιήθηκε σαν εσωτερικός μάρτυρας. Η ποσοτικοποίηση της έκφρασης των συγκεκριμένων γονιδίων έγινε μετά την μέτρηση της έντασης των PCR προϊόντων μετά την ηλεκτροφόρησή τους σε πήκτωμα αγαρόζης με το πρόγραμμα ImageJ. Τα επίπεδα της έκφρασης κανονικοποιήθηκαν με βάση τα επίπεδα έκφρασης της β2-m. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: για την έκφραση του Ets-2: 5 - CGCAGCGGCAGGATGAATG-3 και 5 -AGGAACGGAGGTGAGGTGTG-3, που συνθέτουν ένα PCR προϊόν 576 bp, για την IL-2: 5 -TCACCA GGATGCTCACATTTAAGT-3 και 5 GAGGTTTGAGTTCTTCTTCTAGAC-3, που συνθέτουν ένα PCR προϊόν 174 bp και για την β2-m: 5 - CCCCCACTGAAAAAGATGAG-3 και 5 -TCATCCAATCCAAATGCGGC-3, που οδηγούν στην σύνθεση ενός PCR προϊόντος 125 bp. Real-time PCR H Real-time συγκριτική (comparative) PCR πραγματοποιήθηκε με την χρήση του μηχανήματος Mx3000P TM Quantitative PCR System thermal cycler και η ανάλυση έγινε με το πρόγραμμα MxProTM (Stratagene Corp, La Jolla, CA, USA). Η έκφραση της β2-m χρησιμοποιήθηκε σαν μάρτυρας κανονικοποίησης (normalizer) και η συνθήκη CM ως calibrator. Η αλληλουχία των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν είναι ίδια με αυτή που χρησιμοποιήσαμε στην RT-PCR. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο της Kapa Biosystems σε τελικό όγκο κάθε αντίδρασης στα 20μl, με 1μl περίπου cdna, 200 nm από το κάθε ζεύγος εκκινητών, 10μl 2x KAPA SYBR Fast qpcr mix και 0.4μl ROX low (KAPA SYBR FAST qpcr Kit, Kapa Biosystems Inc., Woburn, MA, USA). Οι συνθήκες της αντίδρασης ήταν 95 0 C για 15min και ακολουθούν 40 κύκλοι με 95 0 C για 30sec για την αποδιάταξη του cdna, 58 0 C για 30sec για την επανασύνδεση με τους εκκινητές και 72 0 C για 30sec για την σύνθεση των μεταγράφων. 58

61 Ανοσοφθορισμός Ο ανοσοφθορισμός είναι μία πειραματική τεχνική που χρησιμοποιείται ευρέως, με ερευνητικές και κλινικές εφαρμογές, για την ανίχνευση συγκεκριμένων πρωτεϊνών σε κύτταρα και ιστούς, φρέσκους ή μονιμοποιημένους. Στα πειράματα ανσοφθορισμού χρησιμοποιούνται αντισώματα συζευγμένα με φθοροχρώματα, τα οποία δεσμεύονται (άμεσα ή έμμεσα) στο υπό διερεύνηση αντιγόνο, δίνοντας μας έτσι τη δυνατότητα ανίχνευσης του μέσω ενός μικροσκοπίου φθορισμού. Η ανίχνευση του αντιγόνου γίνεται με δύο τρόπους, όπως είπαμε. Τον άμεσο, όπου το αντίσωμα που προσδένεται στο υπό εξέταση αντιγόνο είναι συζευγμένο με φθορόχρωμα και τον έμμεσο, όπου το πρώτο αντίσωμα αναγνωρίζεται από ένα δεύτερο αντίσωμα, το οποίο είναι συζευγμένο με φθορόχρωμα. ΕΙΚΟΝΑ 19: Σχηματική αναπαράσταση του άμεσου και του έμμεσου ανοσοφθορισμού ( Η μέθοδος του ανοσοφθορισμού μας δίνει τη δυνατότητα, να ανιχνεύσουμε παραπάνω από ένα αντιγόνα στο ίδιο δείγμα, χρησιμοποιώντας αντισώματα με διαφορετικά φθοροχρώματα. Στην περίπτωση όμως που χρησιμοποιούμε τον έμμεσο ανοσοφθορισμό, θα πρέπει να προσέξουμε, τα πρώτα αντισώματα να έχουν παραχθεί από διαφορετικό ζώο ξενιστή, έτσι ώστε να μην έχουμε αντίδραση από τα δεύτερα αντισώματα και πάρουμε ψεύτικο σήμα. Στη παρούσα μελέτη χρησιμοποιήσαμε, κυρίως, την τεχνική του έμμεσου ανοσοφθορισμού, για τον εντοπισμό και τη διαμερισματοποίηση διαφόρων μεταγραφικών παραγόντων σε μονιμοποιημένα κύτταρα. Πιο συγκεκριμένα, κύτταρα Jurkat, παρθενικά και μνημονικά Τ κύτταρα (CD4+CD45RA+CD25- και CD4+CD45RO+CD25-) που καλλιεργήθηκαν σε 59

62 CM±P/I, αφήνονται να προσκολληθούν σε αντικειμενοφόρους πλάκες, επικαλυμμένες με poly-l-lysine, για 30min στους 37 ο C. Τα κύτταρα μονιμοποιούνται με παραφορμαλδεύδη 4% για 10min σε θερμοκρασία δωματίου (RT) και ξεπλένονται 3 φορές με 1xPBS για 5min και στη συνέχεια γίνονται διαπερατά με επώαση σε 0,3% Triton X-100 για 4min, επίσης σε RT. Αφού ξεπλυθούν 2 φορές με 1xPBS για 5min, επωάζονται για 60min σε blocking buffer (10% FBS 3% BSA σε 1xPBS) για το μπλοκάρισμα των μη ειδικών θέσεων δέσμευσης των αντισωμάτων. Στη συνέχεια ακολουθεί επώαση με το πρωτογενές αντίσωμα έναντι των υπό εξέταση μεταγραφικών παραγόντων, αραιωμένο σε blocking buffer για 60min σε RT. Ακολουθούν 3 διαδοχικές πλύσεις με 0,05% Tween-20/1xPBS και επώαση με δευτερογενές φθορίζων αντίσωμα έναντι του πρωτογενούς, αραιωμένο σε blocking buffer για 60min σε RT. Αφού ξεπλύνουμε 3 φορές με 0,05% Tween-20/1xPBS, τα κύτταρα επωάζονται σε διάλυμα DAPI για 10min, για τη χρώση των πυρήνων και ξεπλένονται με 1xPBS και dh2o. Τέλος οι πλάκες επικαλύπτονται με διάλυμα MOWIOL και καλυπτρίδες, και φυλάσσονται στο σκοτάδι στους 4 ο C, μέχρι την ανάλυση τους στο μικροσκόπιο φθορισμού. Η παρατήρηση των δειγμάτων έγινε σε μικροσκόπιο φθορισμού (widefield) NIKON Eclipse TE 2000-U ή σε συνεστιακό (confocal) μικροσκόπιο LEICA TCSSP5 και η ανάλυση τους με το λογισμικό επεξεργασίας εικόνας FIJI. IMMUNO-DNA FISH (FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION) Η Immuno-DNA FISH είναι μία τεχνική συνεντοπισμού πρωτεϊνών και DNA αλληλουχιών με το συνδυασμό ανοσοφθορισμού (immunofluorescence) και FISH (In situ υβριδιποίηση με φθοροχρώματα). Η in situ υβριδοποίηση με φθοροχρώματα (FISH), χρησιμοποιεί ανιχνευτές DNA σημασμένους με μόρια αναφοράς. Τα μόρια αυτά είτε φθορίζουν τα ίδια, είτε ανιχνεύονται από αντισώματα συζευγμένα με φθοροχρώματα και είναι ορατά σε παρατήρηση σε μικροσκόπιο φθορισμού. Η μέθοδος αυτή επιτρέπει τον εντοπισμό της θέσης συγκεκριμένων ακολουθιών DNA στον πυρήνα των κυττάρων. Η υβριδοποίηση εξαρτάται από την ικανότητα του αποδιαταγμένου DNA να επανασυνδέεται με συμπληρωματικές αλυσίδες σε 60

63 περιβάλλον λίγο χαμηλότερα από το σημείο τήξης του. Η τεχνική αυτή αποτελεί τον πιο άμεσο τρόπο εντοπισμού της θέσης γενετικών αλληλουχιών στα κύτταρα. Από την άλλη μεριά, η τεχνική του ανοσοφθορισμού, όπως περιεγράφηκε και νωρίτερα, επιτρέπει την ανίχνευση και τον εντοπισμό της θέσης πρωτεϊνών, είτε αυτές είναι πυρηνικές είτε κυτταροπλασματικές. Η ανίχνευση αυτή γίνεται επίσης με τη χρήση αντισωμάτων συζευγμένων με φθοροχρώματα, τα οποία ανιχνεύουν και δεσμεύονται σε συγκεκριμένους επιτόπους συγκεκριμένων πρωτεϊνών. Η παρατήρηση των αποτελεσμάτων γίνεται και εδώ, όπως και στη τεχνική της FISH, σε μικροσκόπιο φθορισμού. Ο συνδυασμός των δύο αυτών τεχνικών, μας επιτρέπει, στο ίδιο παρασκεύασμα να εντοπίσουμε στο εσωτερικό του κυττάρου ταυτόχρονα μία πρωτεΐνη και μία DNA αλληλουχία (ή και περισσότερες). Εάν η υπό εξέταση πρωτεΐνη είναι μεταγραφικός παράγοντας, δηλαδή έχει την ικανότητα πρόσδεσης στον υποκινητή ενός γονίδιου (DNA αλληλουχία), τότε με αυτή την τεχνική, μας δίνεται η δυνατότητα να παρατηρήσουμε και τον συνεντοπισμό τους στον πυρήνα του κυττάρου. Έτσι κύτταρα Jurkat, παρθενικά και μνημονικά Τ κύτταρα (CD4+CD45RA+CD25- και CD4+CD45RO+CD25-) που καλλιεργήθηκαν σε CM±P/I, αφήνονται να προσκολληθούν σε αντικειμενοφόρους πλάκες, επικαλυμμένες με poly-l-lysine, για 30min στους 37 ο C. Τα κύτταρα μονιμοποιούνται με παραφορμαλδεύδη 4% για 10min σε θερμοκρασία δωματίου (RT) και ξεπλένονται 3 φορές με 1xPBS για 5min και στη συνέχεια γίνονται διαπερατά με επώαση σε 0,3% Triton X-100 για 4min, επίσης σε RT. Αφού ξεπλυθούν 2 φορές με 1xPBS για 5min, επωάζονται για 60min σε blocking buffer (10% FBS 3% BSA σε 1xPBS) για το μπλοκάρισμα των μη ειδικών θέσεων δέσμευσης των αντισωμάτων. Στη συνέχεια ακολουθεί επώαση με το πρωτογενές αντίσωμα έναντι των υπό εξέταση μεταγραφικών παραγόντων, αραιωμένο σε blocking buffer για 60min σε RT. Ακολουθούν 3 διαδοχικές πλύσεις με 0,05% Tween-20/1xPBS και επώαση με δευτερογενές φθορίζων αντίσωμα έναντι του πρωτογενούς, αραιωμένο σε blocking buffer για 60min σε RT. Αφού ξεπλύνουμε 3 φορές με 0,05% Tween-20/1xPBS, τα κύτταρα επαναμονιμοποιούνται με παραφορμαλδεύδη 4% για 10min σε RT και ξεπλένονται 2 φορές με 1xPBS για 5min. Ακολουθεί επώαση με 0,5% Triton X-100 για 4min σε RT, δύο διαδοχικές πλύσεις με 1xPBS για 5min και μία με 2xSSC για 5min. Για την διαδικασία της FISH, αφού αφήσουμε τις πλάκες να στεγνώσουν, αποδιατάσσουμε το 61

64 DNA των κυττάρων σε διάλυμα 2xSSC/70% formamide για 3min στους 73 ο C. Παράλληλα αποδιατάσσουμε τον DNA probe, ο οποίος έχει κατασκευαστεί με τη μέθοδο του nick translation χρησιμοποιώντας biotin ή digoxigenin modified dutps, στους 75 ο C για 5min. Τα κύτταρα αφυδατώνονται σε παγωμένες αλκοόλες 70%, 85% και 100% για 2min διαδοχικά. Αφού στεγνώσουν, προσθέτουμε τους DNA probes και τα αφήνουμε να υβριδοποιηθούν overnight στους 42 ο C, σε περιβάλλον με αρκετή υγρασία. Την επόμενη μέρα, τα κύτταρα ξεπλένονται διαδοχικά, με 2xSSC/50% formamide, 2xSSC και 0,01% Tween-20/2xSSC για 5min και έπειτα επωάζονται με blocking buffer για 60min σε RT. Στη συνέχεια επωάζουμε για 60min με φθορίζων αντίσωμα έναντι του DNA probe, streptavidine Alexa 568 ή Anti-Digoxigenin FITC, αραιωμένο σε blocking buffer και ξεπλένουμε 3 φορές με 0,05% Tween-20/1xPBS. Τα κύτταρα επωάζονται σε διάλυμα DAPI για 10min, για τη χρώση των πυρήνων και αφού ξεπλυθούν με 1xPBS και dh2o, επικαλύπτονται με διάλυμα MOWIOL και καλυπτρίδες, και φυλάσσονται στο σκοτάδι στους 4 ο C, μέχρι την ανάλυση τους στο μικροσκόπιο φθορισμού. Η παρατήρηση των δειγμάτων έγινε σε μικροσκόπιο φθορισμού (widefield) NIKON Eclipse TE 2000-U ή σε συνεστιακό (confocal) μικροσκόπιο LEICA TCSSP5 και η ανάλυση τους με το λογισμικό επεξεργασίας εικόνας FIJI. Ανοσοϊστοχημεία H ανοσοϊστοχημεία είναι μία μέθοδος εντοπισμού, της παρουσίας και της θέσης, διαφόρων πρωτεϊνών σε έναν ιστό. Αν και δεν είναι τόσο ευαίσθητη ποσοτικά, όσο η western ηλεκτροφόρηση, μας επιτρέπει να παρατηρήσουμε διάφορες διεργασίες μέσα στον ίδιο τον ιστό. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιείται πολύ συχνά και για διαγνωστικούς σκοπούς, όπως για παράδειγμα στη πρόγνωση καρκινικών σταδίων. Η ανοσοϊστοχημεία, όπως και ο ανοσοφθορισμός, βασίζεται στη χρήση ειδικών αντισωμάτων έναντι των πρωτεϊνών στόχων. Η οπτικοποίηση της αλληλεπίδρασης αυτής γίνεται είτε με ανίχνευση χρωμογόνου, κατά την οποία ένα ένζυμο συζευγμένο με το αντίσωμα διασπά το υπόστρωμα παράγοντας έτσι ένα χρωματικό ίζημα στο σημείο δέσμευσης της πρωτεΐνης το οποίο ανιχνεύεται με οπτικό μικροσκόπιο, είτε με ανίχνευση φθορισμού όπου το αντίσωμα είναι συζευγμένο με φθορόχρωμα το οποίο φθορίζει και μπορεί να παρατηρηθεί με ένα μικροσκόπιο φθορισμού. 62

65 Η μέθοδος ανοσοϊστοχημείας που έχει χρησιμοποιηθεί σε αυτή τη μελέτη, είναι αυτή της χρώσης σε ιστούς μονιμοποιημένους, σε φορμόλη και εγκλεισμένους σε παραφίνη. Τα βασικά στάδια της τεχνικής αυτής είναι: Η μονιμοποίηση και ο εγκλεισμός του ιστού. Το κόψιμο σε τομές και η τοποθέτηση των τομών σε αντικειμενοφόρους πλάκες. Η αποπαραφινοποίηση και η ενυδάτωση των τομών. Η ανάκτηση των αντιγόνων (Antigen Retrieval). Στάδιο κατά το οποίο τα αντιγόνα αποκαλύπτονται, λόγω της δημιουργίας γεφυρών μεθυλενίου κατά την μονιμοποίηση του ιστού. Η ανοσοϊστοχημική χρώση. Η χρώση των πυρήνων και/ή του κυτταροπλάσματος. Η αφυδάτωση, η διαύγαση και η μονιμοποίηση. Και τέλος η παρατήρηση σε οπτικό μικροσκόπιο. ΕΙΚΟΝΑ 20: Σχηματική αναπαράσταση των σταδίων ανίχνευσης ενός αντιγόνου με τη χρήση της ανοσοϊστοχημείας ( 63

66 Όλοι οι ιστοί που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, μονιμοποιήθηκαν σε φορμόλη 10% και εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Από κάθε ιστό, κόπηκαν τομές μεγέθους 4μm. Στην αρχή κάθε πειράματος, οι τομές αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλη μέσα σε κλίβανο σταθερής θερμοκρασίας 60 ο C και στη συνέχεια ενυδατώθηκαν με την εμβάπτιση τους σε διαλύματα αλκοόλης μειωμένης συγκέντρωσης (αλκοόλη/ξυλόλη 1/1 αλκοόλη 100% - αλκοόλη 96%). Αφού οι τομές ξεπλύθηκαν σε νερό και σε ρυθμιστικό διάλυμα TBS (για 5 min), τοποθετήθηκαν σε διάλυμα κιτρικού οξέος με ph 6 μέσα σε φούρνο μικροκυμάτων για 2 min στα 800W και για 7 min στα 300W, για το στάδιο της ανάκτησης αντιγόνων. Μετά από ένα ξέπλυμα με TBS (5 min), οι τομές τοποθετήθηκαν σε διάλυμα υπεροξειδίου 3%, στο σκοτάδι, για το μπλοκάρισμα της ενδογενούς υποροξειδάσης. Μετά από 3 ξεπλύματα με TBS (5 min), έγινε το μπλοκάρισμα των μη ειδικών θέσεων δέσμευσης των αντισωμάτων με blocking buffer (2% BSA / TBS) για 30 min. Στη συνέχεια ακολουθεί επώαση με το αντίσωμα έναντι των πρωτεϊνών στόχων, αραιωμένο σε blocking buffer, overnight στους 4 ο C. Αφού ξεπλύνουμε τις τομές 3 φορές με TBS (5 min), προχωρούμε στην οπτικοποίηση της δέσμευσης του αντιγόνου στο αντίσωμα με τη χρήση χρωμογόνου. Στη διαδικασία αυτή χρησιμοποιήσαμε το kit ανοσοϊστοχημείας της DAKO, το οποίο περιέχει το δευτερεύων αντίσωμα που προσδένεται στο πρώτο αντίσωμα και είναι συζευγμένο με το ένζυμο της υπεροξειδάσης και με το κατάλληλο υπόστρωμα από το οποίο θα προκύψει το χρωμογόνο. Έπειτα, οι τομές βάφτηκαν με αιματοξυλίνη για τη χρώση των πυρήνων και αφυδατώθηκαν με εμβάπτιση σε διαλύματα αλκοόλης αυξανόμενης συγκέντρωσης (αλκοόλη 80% αλκοόλη 96% - αλκοόλη 100% - αλκοόλη 100%). Τέλος οι τομές, εμβαπτίζονται σε ξυλόλη για διαύγαση και έπειτα επικαλύπτονται με καλυπτρίδες. Η παρατήρηση των τομών έγινε σε οπτικό μικροσκόπιο Nikon Eclipse 80i. Western Blot Με την ανάλυση κατά Western μπορούμε να ανιχνεύσουμε μία συγκεκριμένη πρωτεΐνη σε ένα μείγμα πρωτεϊνών ενώ ταυτόχρονα μπορούμε να πάρουμε κάποια στοιχεία για αυτή την πρωτεΐνη όπως το μέγεθός της και την περιεκτικότητά της στο μείγμα. Η ακρίβεια της μεθόδου εξαρτάται από την χρήση υψηλής ευαισθησίας αντισώματος έναντι της πρωτεΐνης που θέλουμε να ανιχνεύσουμε. Ο διαχωρισμός του 64

67 μείγματος των πρωτεϊνών γίνεται σε gel SDS-polyacrylamide με βάση το μέγεθός τους. Το SDS είναι απορρυπαντικό και προσδίδει στις πρωτεΐνες αρνητικό φορτίο. Η διαδικασία του western blot, χωρίζεται σε τρία στάδια, την απομόνωση ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων, την ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και το ανοσοαποτύπωμα western, τα οποία περιγράφονται αναλυτικά παρακάτω: Απομόνωση ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων Στο ίζημα των κυττάρων προστίθεται διάλυμα λύσης (ripa buffer) Τοποθετούνται τα eppendorf στον πάγο για 15 και ανά 5 πραγματοποιείται ανάδευση σε vortex Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 15, στα 14000g, στους 4oC Το υπερκείμενο μεταφέρεται σε νέο eppendorf Προστίθεται διάλυμα 2Χ Sample buffer και μερκαπτοαιθανόλης Ακολουθεί βρασμός των δειγμάτων στους 95oC για 5 λεπτά Τα δείγματα φυλάσσονται στους -20 o C Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE Αρχικά πραγματοποιείται η παρασκευή του πηκτώματος διαχωρισμού των πρωτεϊνών το οποίο φορτώνεται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης καλύπτοντας περίπου τα 3:4 αυτής (separating gel) Ακολουθεί η παρασκευή του διαλύματος πακεταρίσματος (stucking gel). Στη συνέχεια φορτώνεται πάνω στο πήκτωμα διαχωρισμού το διάλυμα του πηκτώματος πακεταρίσματος, ενώ αμέσως τοποθετείται στη συσκευή το χτενάκι για τη δημιουργία των θέσεων φόρτωσης των δειγμάτων Τα δείγματα που πρόκειται να αναλυθούν βράζονται στους 95 ο C για 5 λεπτά και έπειτα φυγοκεντρούνται στις rpm για 5 λεπτά Όταν πήξει το πήκτωμα, αφαιρείται το χτενάκι και η συσκευή τοποθετείται μέσα στο δοχείο της ηλεκτροφόρησης που περιέχει το running buffer Τα δείγματα φορτώνονται στις θέσεις που έχουν σχηματιστεί στο πήκτωμα πακεταρίσματος. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται αρχικά στα 24mA μέχρι η χρωστική να εισέλθει στο πήκτωμα διαχωρισμού οπότε αυξάνεται η ένταση στα 48mA. 65

68 Ανοσοαπoτύπωμα western Αρχικά τα δείγματα αναλύονται με SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση. Στη συνέχεια πραγματοποιείται η μεταφορά των αναλυμένων δειγμάτων σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, σε ρυθμιστικό διάλυμα (transfer buffer) με 10% μεθανόλη, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου έντασης 300mA, για 2 ώρες Μετά το πέρας της μεταφοράς, η νιτροκυτταρίνη πλένεται με dh2o και βάφεται με τη χρωστική Ponceau S για 15 λεπτά. Η απομάκρυνση της χρωστικής επιτυγχάνεται με χρήση του διαλύματος PBS (1x), 0,1% Tween (PBS Tween) Η κάλυψη των μη ειδικών θέσεων δέσμευσης του αντισώματος στη μεμβράνη πραγματοποιείται με διάλυμα 5% γάλακτος σε PBS (1x), 0,1% Tween (PBS- Tween) (διάλυμα blocking), για 1 ώρα, σε θερμοκρασία δωματίου Ακολουθεί η επώαση της μεμβράνης με το πρώτο αντίσωμα υπό κίνηση, σε θερμοκρασία δωματίου, για 2 ώρες ή Ο/Ν. Το αντίσωμα διαλύεται σε διάλυμα blocking στο οποίο προστίθεται επιπλέον 0,02% NaN3 Η μεμβράνη ξεπλένεται 2 φορές γρήγορα με PBS (1x), 0,1% Tween (PBS- Tween). Ακολουθούν μια 15λεπτη και τρεις 5λεπτες πλύσεις με PBS (1x), 0,1% Tween (PBS-Tween) Ακολουθεί η επώαση της μεμβράνης με το κατάλληλο δεύτερο αντίσωμα, υπό ανάδευση για μια ώρα, σε θερμοκρασία δωματίου Η περίσσεια του δεύτερου αντισώματος απομακρύνεται με 2 γρήγορες πλύσεις, καθώς και μια 15λεπτη και τρεις 5λεπτες με διάλυμα PBS (1x), 0,1% Tween (PBS-Tween) Στο άκρο του το δεύτερο αντίσωμα φέρει την HRP (Horse Radish Peroxidase) που προκαλεί φωταύγεια στο κατάλληλο υπόστρωμα Το σήμα ανιχνεύεται με τη χρήση του αντιδραστηρίου ECL και αποτυπώνεται σε φωτογραφικό φιλμ, σε σκοτεινό δωμάτιο 66

69 Ανοσοκατακρήμνιση πρωτεϊνών Η διαδικασία της ανοσοκατακρήμνισης περιλαμβάνει την προετοιμασία των σφαιριδίων, την πρόσδεση του αντισώματος στα σφαιρίδια και την επώαση του κυτταρικού εκχυλίσματος με τα σφαιρίδια. Προετοιμασία σφαιριδίων Για κάθε αντίδραση χρησιμοποιούμε 100μl διαλύματος 50% σφαιριδίων. Αρχικά το διάλυμα με τα σφαιρίδια τοποθετείται σε μαγνητικό στατό για 5 λεπτά Στη συνέχεια το υπερκείμενο αφαιρείται και τα σφαιρίδια αναδιαλύονται σε 1 ml διαλύματος λύσης, ανακινούνται για 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και τοποθετούνται στο μαγνήτη για 5 λεπτά Ακολουθούν ακόμα 2 πλύσεις των σφαιριδίων με διάλυμα λύσης Τα σφαιρίδια αναδιαλύονται σε διάλυμα λύσης έτσι ώστε ο συνολικός τους όγκος να είναι ίσος με τον αρχικό όγκο των σφαιριδίων που χρησιμοποιήθηκαν Πρόσδεση αντισώματος στα σφαιρίδια Για κάθε αντίδραση ανοσοκατακρήμνισης (100μl διαλύματος 50% σφαιριδίων) χρησιμοποιήθηκαν 5μg αντισώματος Κατάλληλη ποσότητα αντισώματος προστίθεται στο διάλυμα με τα σφαιρίδια. Ακολουθεί επώαση υπό ανακίνηση, για 2 ώρες στους 4 o C Στη συνέχεια πραγματοποιούνται 3 πλύσεις των σφαιριδίων με διάλυμα λύσης, με στόχο να απομακρυνθεί η περίσσεια του αντισώματος που δεν έχει προσδεθεί σε αυτά Για κάθε πλύση, 1 ml διαλύματος λύσης προστίθεται στα σφαιρίδια. Ακολουθεί ανακίνηση για 5 λεπτά, μαγνήτης για 5 λεπτά στους 4 o C και απόρριψη του υπερκειμένου Μετά την ολοκλήρωση της τρίτης πλύσης, τα σφαιρίδια αναδιαλύονται σε διάλυμα λύσης έτσι ώστε ο συνολικός τους όγκος να είναι ίσος με τον αρχικό όγκο των σφαιριδίων που χρησιμοποιήθηκαν (100μl/αντίδραση ανοσοκατακρήμνισης) 67

70 Απομόνωση κυτταρικού εκχυλίσματος Επώαση κυτταρικού εκχυλίσματος με σφαιρίδια Για κάθε αντίδραση ανοσοκατακρήμνισης χρησιμοποιήθηκαν 10 7 κύτταρα. Η διαδικασία προετοιμασίας των κυττάρων και της επώασής τους με τα σφαιρίδια είναι η ακόλουθη: Τα κύτταρα τοποθετούνται σε πάγο. Αφαιρείται το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο και πραγματοποιούνται 2 πλύσεις των κυττάρων με κρύο διάλυμα PBS (1x) Ακολουθεί προσθήκη 1000μl διαλύματος λύσης σε κάθε eppendorf. Τα eppendorf παραμένουν πάνω στον πάγο για 10 λεπτά Το κυτταρικό εκχύλισμα φυγοκεντρείται στις 13000rpm για 10 λεπτά. Από το υπερκείμενο φυλάσσεται ένα τμήμα (50μl) ως δείγμα ολικού κυτταρικού εκχυλίσματος. Σε αυτό προστίθενται 50μl 1xFSB+DTT, βράζεται στους 95oC για 5 λεπτά και φυλάσσεται στους -20 o C Το υπόλοιπο υπερκείμενο τοποθετείται στο eppendorf με τα σφαιρίδια στα οποία είναι προσδεμένο το αντίσωμα. Η επώαση πραγματοποιείται για 3 ώρες στους 4 o C, υπό ανακίνηση Μετά το πέρας των 3 ωρών, τοποθετούνται τα eppendorf στο μαγνήτη για 5 λεπτά. Από το υπερκείμενο φυλάσσεται ένα τμήμα (50μl) ως δείγμα πρωτεϊνών που δεν προσδέθηκαν στα σφαιρίδια. Σε αυτό προστίθενται 50μl 2xFSB+DTT, βράζεται στους 95 o C για 5 λεπτά και φυλάσσεται στους -20 o C. Το υπόλοιπο υπερκείμενο απορρίπτεται Ακολουθούν 3 πλύσεις των σφαιριδίων. Κάθε πλύση πραγματοποιείται με 1 ml διαλύματος λύσης, για 2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου υπό ανακίνηση Στη συνέχεια το δείγμα τοποθετείται στο μαγνήτη για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο απορρίπτεται και επαναλαμβάνεται η ίδια διαδικασία ακόμα 2 φορές Στα σφαιρίδια προστίθενται 50μl διαλύματος 1xFSB+DTT. Το δείγμα βράζεται στους 95 o C για 5 λεπτά και φυλάσσεται στους -20 o C. 68

71 ΑΠΟΤΕΛΕΣ ΜΑΤΑ 69

72 Μεταγραφική ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της IL-2 στην κυτταρική σειρά Jurkat Έκφραση και κυτταρικός εντοπισμός του Ets-2 Η λευχαιμική κυτταρική σειρά Jurkat, αποτελεί ένα σύστημα κυττάρων τα οποία συμπεριφέρονται σαν παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα, με τη δυνατότητα να εκφράζουν IL-2 μετά από ενεργοποίηση με μιτογόνα. Τα κύτταρα αυτά μπορούν επίσης να παραχθούν εύκολα σε μεγάλους αριθμούς, γεγονός που μας διευκολύνει στο στήσιμο ορισμένων τεχνικών αλλά και στη χρησιμοποίηση τους σε τεχνικές οι οποίες απαιτούν αρκετά μεγάλο αριθμό κυττάρων. Για τους λόγους αυτούς επιλέξαμε να μελετήσουμε το πρότυπο έκφρασης και εντοπισμού του μεταγραφικού παράγοντα Ets- 2 και στα συγκεκριμένα κύτταρα. Αρχικά, κύτταρα Jurkat καλλιεργήθηκαν παρουσία (P/I) ή απουσία μιτογόνων (CM) και στη συνέχεια με τη χρήση real-time PCR μετρήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης του mrna της κυτταροκίνης IL-2 και του μεταγραφικού παράγοντα Ets-2. Τα κύτταρα αυτά, κατά τη συνθήκη CM, εμφανίζουν υψηλή έκφραση του Ets-2 σε επίπεδο mrna, η οποία όμως μειώνεται σχεδόν στο μισό όταν τα κύτταρα Jurkat διεγείρονται με μιτογόνα για 6h, ενώ η έκφραση του διατηρείται σε χαμηλά επίπεδα όσο διατηρείται η ενεργοποίηση. Από την άλλη, η IL-2 εκφράζεται μόνο μετά από την ενεργοποίηση. Το πρότυπο αυτό έκφρασης δείχνει μία πρώτη συσχέτιση της έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Ets-2 με την έκφραση της κυτταροκίνης IL-2 στα Τ παρθενικά βοηθητικά κύτταρα. Φαίνεται δηλαδή ότι η ενεργοποίηση με μιτογόνα των κυττάρων Jurkat, προκαλεί την μείωση της έκφρασης του Ets-2, ενώ παράλληλα ξεκινάει η έκφραση της IL-2 σε επίπεδο mrna. 70

73 ΕΙΚΟΝΑ 21: Τα επίπεδα έκφρασης των Ets-2 και IL-2 mrna μετρήθηκαν με την χρήση real-time PCR σε Jurkat κύτταρα, τα οποία καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία μιτογόνων (P/I) για 6h και 12h. Για να επιβεβαιώσουμε ότι η έκφραση του Ets-2, στα κύτταρα Jurkat, μειώνεται μετά από τη διέγερση με μιτογόνα και σε πρωτεϊνικό επίπεδο χρησιμοποιήσαμε τη μέθοδο της Western blot ανάλυσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η πρωτεϊνική έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Ets-2 στα κύτταρα Jurkat, είναι ανάλογη με την έκφραση σε επίπεδο mrna και ακολουθούν το ίδιο πρότυπο, αφού η έκφραση σε πρωτεϊνικό επίπεδο του Ets-2 μειώνεται μετά από τη διέγερση των κυττάρων Jurkat με μιτογόνα. ΕΙΚΟΝΑ 22: Έκφραση του Ets-2 σε πρωτεϊνικό επίπεδο στην Jurkat κυτταρική σειρά. Ανάλυση με Western blot ανάλυση των επιπέδων της Ets-2 πρωτεΐνης στη Jurkat κυτταρική σειρά. Τα Jurkat κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό CM±P/I, για χρονικές περιόδους 6h και 12h. Οι τιμές που αναγράφονται στον πίνακα αντιστοιχούν στο ποσοστό αλλαγής της έκφρασης της Εts-2 πρωτεΐνης, με την έκφραση της Εts-2 πρωτεΐνης στην συνθήκη CM να αποτελεί βάση σύγκρισης. Η εικόνα που παρουσιάζεται είναι χαρακτηριστική τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με το ίδιο αποτέλεσμα. 71

74 Στη συνέχεια, θελήσαμε να παρατηρήσουμε και οπτικά το πρότυπο έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Ets-2 στα κύτταρα Jurkat αλλά και να εξετάσουμε σε ποια σημεία του κυττάρου εντοπίζεται ο Ets-2 και αν παρατηρούνται διαφορές μεταξύ των ενεργοποιημένων και μη κυττάρων Jurkat. Για το λόγο αυτό κύτταρα Jurkat καλλιεργημένα, απουσία και παρουσία μιτογόνων για 6 και 12h, προσκολλήθηκαν σε αντικειμενοφόρους πλάκες και αφού επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα έναντι του Ets-2 και δευτερογενές αντίσωμα Alexa Fluor 488, παρατηρήθηκαν σε συνεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού LEICA TCSSP5. ΕΙΚΟΝΑ 23: Εντοπισμός της πρωτεΐνης Ets-2 σε κύτταρα Jurkat πριν και μετά από διέγερση με μιτογόνα. Κύτταρα Jurkat αφέθηκαν να προσκολληθούν σε αντικειμενοφόρους πλάκες επικαλυμμένες με poly-l-lysine και μονιμοποιήθηκαν με παραφορμαλδεύδη 4%. Μετά από πλύσεις (1xPBS) και επώαση με blocking buffer, ακολουθεί επώαση με anti-ets-2 ab και δεύτερο αντίσωμα anti-mouse Alexa 488 (πράσινο). Η χρώση των πυρήνων έγινε με διάλυμα DAPI (μπλε) για 10min. Η ανάλυση και παρατήρηση των εικόνων έγινε σε μικροσκόπιο confocal LEICA TCSSP5 σε ανάλυση 63x. Η επεξεργασία των εικόνων και ηλεκτρονική μεγέθυνση τους έγινε με το πρόγραμμα FIJI. 72

75 Τα πειράματα ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι, σε συνθήκες CM, ο Ets-2 βρίσκεται κυρίως πυρηνικά, ενώ μετά από την διέγερση των κυττάρων με μιτογόνα (6 και 12h) ο Ets-2 εντοπίζεται και κυτταροπλασματικά. Παρατηρείται επίσης η μείωση στην έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα, όπως έδειξαν και τα πειράματα Western blot ανάλυσης. Πρόσδεση του Ets-2 στον υποκινητή του γονιδίου της IL-2 Βιβλιογραφικά είναι γνωστό ότι η καταστολή της έκφρασης της IL-2, διαμεσολαβείται από μία περιοχή του υποκινητή του γονιδίου της IL-2 που καλείται distal Purine-Rich Response Element (PU-d) ή Antigen Receptor Response Element (ARRE-2) (περιοχή από -292 έως -273). Παλαιότερη μελέτη του εργαστηρίου Ανοσοαιμοτολογίας, έχει δείξει με πειράματα EMSA ότι ο παράγοντας Ets-2 έχει ισχυρή ικανότητα πρόσδεσης στην αλληλουχία ARRE-2 σε παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα, ενώ αντίθετα δεν παρατηρήθηκε καμία ικανότητα πρόσδεσης τoυ μεταγραφικού παράγοντα σε μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα. Αφού μελετήσαμε τη συμπεριφορά του μεταγραφικού παράγοντα Ets-2 (έκφραση, διαμερισματοποίηση, αλληλεπίδραση) στα κύτταρα Jurkat και στους διαφορετικούς υποπληθυσμούς των T λεμφοκυττάρων, θελήσαμε να δούμε εάν όντως ο παράγοντας αυτός προσδένεται στον υποκινητή του γονιδίου της IL-2 και εάν ναι σε ποιους τύπους κυττάρων και με ποιόν τρόπο επηρεάζεται η έκφραση της κυτταροκίνης αυτής. Για το λόγο αυτό κύτταρα Jurkat καλλιεργημένα, απουσία και παρουσία μιτογόνων για 6h, προσκολλήθηκαν σε αντικειμενοφόρους πλάκες και με το συνδυασμό των τεχνικών ανοσοφθορισμού και FISH, μελετήθηκε η ύπαρξη ή όχι συνεντοπισμού μεταξύ του μεταγραφικού παράγοντα Ets-2 και του υποκινητή του γονιδίου της IL-2. Η χρώση της ARRE-2 περιοχή του υποκινητή του γονιδίου της IL- 2 έγινε με ειδικά σχεδιασμένους probe, με ενσωματωμένα μόρια βιοτίνης και με μόρια στρεπταβιδίνης συζευγμένα με το φθορόχρωμα Alexa

76 Eικόνα 24: Συνεντοπισμός της πρωτεΐνης Ets-2 και της ARRE2 αλληλουχίας του γονιδίου της IL-2 στην Jurkat κυτταρική σειρά με την χρήση Immuno-DNA FISH Jurkat κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ή μη μιτογόνων και αφέθηκαν να προσκολληθούν σε αντικειμενοφόρους πλάκες επικαλυμμένες με poly-l-lysine και μονιμοποιήθηκαν με παραφορμαλδεύδη 4%. Μετά από πλύσεις (1xPBS) και επώαση με blocking buffer ακολουθεί επώαση με anti-ets-2 ab και δεύτερο αντίσωμα antimouse Alexa 488 (πράσινο). Μετά από αποδιάταξη του DNA των κυττάρων και του DNA ανιχνευτή (κατασκευάστηκε με nick translation με την χρήση biotin modified dutps) ακολουθεί υβριδοποίηση overnight στους 42 ο C και σήμανση του DNA ανιχνευτή με streptavidine Alexa 568 (κόκκινο). Η χρώση των πυρήνων έγινε με διάλυμα DAPI (μπλέ) για 10min. Η ανάλυση και παρατήρηση των εικόνων έγινε σε μικροσκόπιο φθορισμού NIKON ECLIPSE TE 2000-U σε ανάλυση 100x. Όπως φαίνεται και στην παραπάνω εικόνα στη συνθήκη CM ο μεταγραφικός παράγοντας Ets-2 συνεντοπίζεται με τον υποκινητή του γονιδίου της IL-2 (κίτρινα spots), ενώ αντίθετα όταν τα κύτταρα Jurkat διεγείρονται με μιτογόνα ο συνεντοπισμός αυτός σταματάει να υπάρχει, υποδηλώνοντας ότι πλέον ο μεταγραφικός παράγοντας Ets-2 χάνει την ικανότητα πρόσδεσης του στον υποκινητή του γονιδίου της IL-2. Για να δείξουμε ότι η τεχνική αυτή λειτούργησε σωστά, ακολουθήσαμε την ίδια πειραματική διαδικασία, για να δούμε τη συμπεριφορά του μεταγραφικού παράγοντα NFAT2, ο οποίος αποδεδειγμένα ενεργοποιεί την έκφραση της IL-2, μετά από διέγερση με μιτογόνα, μέσω της πρόσδεσης του στον υποκινητή του γονιδίου της IL-2. Μέσω της ίδιας διαδικασίας, παρατηρήσαμε ότι ο NFAT2, εμφανίζει αντίθετη συμπεριφορά ως προς τον Ets-2, αφού συνεντοπίζεται με τον υποκινητή της IL-2 μόνο μετά από τη διέγερση των κυττάρων Jurkat με μιτογόνα, ενώ σε συνθήκη CM βρίσκεται εκτός του πυρήνα των κυττάρων. 74

77 Eικόνα 25: Συνεντοπισμός της πρωτεΐνης NFAT2 και της ARRE2 αλληλουχίας του γονιδίου της IL-2 στην Jurkat κυτταρική σειρά με την χρήση Immuno-DNA FISH Jurkat κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ή μη μιτογόνων και αφέθηκαν να προσκολληθούν σε αντικειμενοφόρους πλάκες επικαλυμμένες με poly-l-lysine και μονιμοποιήθηκαν με παραφορμαλδεύδη 4%. Μετά από πλύσεις (1xPBS) και επώαση με blocking buffer ακολουθεί επώαση με anti-nfat2 ab και δεύτερο αντίσωμα anti-mouse Alexa 488 (πράσινο). Μετά από αποδιάταξη του DNA των κυττάρων και του DNA ανιχνευτή (κατασκευάστηκε με nick translation με την χρήση biotin modified dutps) ακολουθεί υβριδοποίηση overnight στους 42 ο C και σήμανση του DNA ανιχνευτή με streptavidine Alexa 568 (κόκκινο). Η χρώση των πυρήνων έγινε με διάλυμα DAPI (μπλέ) για 10min. Η ανάλυση και παρατήρηση των εικόνων έγινε σε μικροσκόπιο φθορισμού NIKON ECLIPSE TE 2000-U σε ανάλυση 100x. Αλληλεπίδραση του Ets-2 με τον NFAT Με τα προηγούμενα πειράματα επιβεβαιώθηκε η συμμετοχή του Ets-2 στη ρύθμιση της έκφρασης της IL-2 στα κύτταρα Jurkat, μέσω της πρόσδεσης του στην ARRE-2 περιοχή του γονιδίου της. Είναι γνωστό βιβλιογραφικά ότι ο μεταγραφικός παράγοντας NFAT, ο οποίος αποτελεί και τον πρώτο μεταγραφικό παράγοντα ο οποίος ανακαλύφθηκε ότι προσδένεται στην ARRE-2 περιοχή του υποκινητή του γονιδίου της IL-2 σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα, επάγει την έκφραση της IL-2 στα Τ κύτταρα, λειτουργία αντίθετη με αυτή που φαίνεται να επιτελεί ο Ets-2. Για το λόγο αυτό, θελήσαμε να δούμε εάν παρατηρείται κάποια αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο αυτών μεταγραφικών παραγόντων σε ενεργοποιημένα ή μη κύτταρα Jurkat. Κύτταρα Jurkat λοιπόν καλλιεργήθηκαν, παρουσία ή απουσία μιτογόνων, για 6 ώρες και ύστερα μελετήσαμε με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού εάν παρατηρείται 75

78 συνεντοπισμός των μεταγραφικών παραγόντων Ets-2 και NFAT, στα υπο εξέταση κύτταρα. Παρατηρήσαμε ότι δεν υπάρχει καμία αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο αυτών μεταγραφικών παραγόντων ούτε όταν τα Jurkat κύτταρα βρίσκονται σε ηρεμία ούτε όταν βρίσκονται σε ενεργοποιημένη κατάσταση. CM P/I Eικόνα 26: Συνεντοπισμός των μεταγραφικών παραγόντων Ets-2 και NFAT σε Jurkat κύτταρα μετά από καλλιέργεια, παρουσία ή απουσία μιτογόνων για 6 ώρες με την χρήση ανοσοφθορισμού κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ή μη μιτογόνων και αφέθηκαν να προσκολληθούν σε αντικειμενοφόρους πλάκες επικαλυμμένες με poly-l-lysine και μονιμοποιήθηκαν με παραφορμαλδεύδη 4%. Μετά από πλύσεις (1xPBS) και επώαση με blocking buffer ακολουθεί επώαση με rabbit anti-ets-2 ab και mouse anti-nfat2 πρωτογενές αντίσωμα και στη συνέχεια με δευτερογενή αντισώματα anti-rabbit Alexsa 488 (πράσινο) και anti-mouse Alexa 568(κόκκινο). Η χρώση των πυρήνων έγινε με διάλυμα DAPI (μπλέ) για 10min. Η ανάλυση και παρατήρηση των εικόνων έγινε σε μικροσκόπιο φθορισμού NIKON ECLIPSE TE 2000-U σε ανάλυση 100x. Για την επιβεβαίωση του παραπάνω αποτελέσματος, έγιναν και πειράματα ανοσοκατακρήμνισης σε δείγματα απομωνομένης πρωτείνης από Jurkat κύτταρα καλλιεργημένα παρουσία ή απουσία μιτογόνων για 6 ώρες. Και στα πειράματα αυτά φαίνεται ότι οι μεταγραφικοί παραγόντες δεν αλληλεπιδρούν ούτε όταν τα κύτταρα βρίσκονται σε κατάσταση ηρεμίας ούτε όταν είναι ενεργοποιημένα. 76

79 Εικόνα 27: Αλληλεπίδραση των μεταγραφικών παραγόντων Ets-2 και NFAT σε Jurkat κύτταρα μετά από καλλιέργεια, παρουσία ή απουσία μιτογόνων για 6 ώρες μετά από ανοσοκατακρήμνιση και Western blot ανάλυση. Έκφραση και εντοπισμός των Ets-2, FoxP3 και NFAT σε λεμφικά όργανα Στο στάδιο αυτό της διατριβής αυτής μελετήσαμε την έκφραση και τον εντοπισμό του μεταγραφικού παράγοντα Ets-2 σε ανθρώπινους λεμφικούς ιστούς, πρωτογενείς και δευτερογενείς. Σαν πρωτογενής λεμφικός ιστός χρησιμοποιήθηκε ιστός ανθρώπινου εμβρυϊκού θύμου αδένα (25 εβδομάδων κύησης) και σαν δευτερογενής, ιστός αμυγδαλής ενήλικου ανθρώπου (λεμφαδένας). Με τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας και τη χρήση ιστομορφομετρίας, μελετήσαμε, ποσοτικοποιήσαμε και συγκρίναμε τα επίπεδα έκφρασης του υπό εξέταση μεταγραφικού παράγοντα μεταξύ των δύο διαφορετικών ιστών, οι οποίοι αποτελούνται από Τ λεμφοκύτταρα σε διαφορετική κατάσταση ωριμότητας και ενεργοποίησης, αλλά και μεταξύ των διαφορετικών διαμερισμάτων του ίδιου ιστού. Παράλληλα, προσπαθήσαμε να διακρίνουμε και διαφορές στον κυτταρικό εντοπισμό των παραγόντων αυτών. Οι ιστοί που χρησιμοποιήθηκαν, ήταν μονιμοποιημένοι και εγκλεισμένοι σε παραφίνη και κόπηκαν σε διαδοχικές τομές πάχους 4μm. Κάθε τομή, μετά τη 77

80 διαδικασία της ανοσοιστοχημείας και τη χρώση με αντίσωμα έναντι του μεταγραφικού παράγοντα, παρατηρήθηκε και φωτογραφήθηκε σε οπτικό μικροσκόπιο. Η περαιτέρω ανάλυση των εικόνων και η ιστομορφομετρία έγινε με τη χρήση του προγράμματος ανάλυσης εικόνας Photoshop. Από τις αναλύσεις φαίνεται ότι ο Ets-2 εκφράζεται, περίπου, στο 55% των θυμοκυττάρων του μυελού του θύμου αδένα, ενώ στο φλοιό το ποσοστό αυτό πέφτει στο 40%. Όπως παρατηρούμε και στην εικόνα 28, ο εντοπισμός του Ets-2 στα θυμοκύτταρα είναι κυρίως πυρηνικός. Παράλληλα φαίνεται ότι ο Ets-2 εκφράζεται και από τη πλειοψηφία των επιθηλιακών κυττάρων, τόσο στο πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα τους. Από την άλλη, είδαμε ότι ο αριθμός των κυττάρων που εκφράζουν τον Ets-2 στην αμυγδαλή μειώνεται, σε σχέση με τον αντίστοιχο του θύμου, αφού φαίνεται ότι Ets-2 θετικά είναι περίπου το 23% των κυττάρων τόσο στο φλοιό όσο και στο βλαστικό κέντρο (Germinal Center) της αμυγδαλής. Παρατηρούμε επίσης ότι ενώ η πλειοψηφία των κυττάρων εμφανίζει πυρηνικό εντοπισμό του Ets-2, σε ορισμένα κύτταρα ο Ets-2 εκφράζεται και κυτταροπλασματικά. Στη συνέχεια, ακολουθώντας την ίδια διαδικασία, μελετήσαμε την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα FoxP3, ενός γνωστού αναστολέα της έκφρασης της IL- 2. Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση του FoxP3 κυμαίνεται σε χαμηλότερα επίπεδα (11-12%), σε σχέση με τον Ets-2, στα θυμοκύτταρα τόσο του φλοιού όσο και του μυελού του θύμου αδένα και εντοπίζεται κυρίως πυρηνικά. Και αυτός ο μεταγραφικός παράγοντας φαίνεται να εκφράζεται από τα επιθηλιακά κύτταρα του ιστού, όπως και ο Ets-2. Η αντίστοιχη ανάλυση του ιστού της αμυγδαλής ως προς τον FoxP3 έδειξε ακόμα χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης του μεταγραφικού αυτού παράγοντα (7%), τα οποία παραμένουν ίδια τόσο στο φλοιό όσο και στο βλαστικό κέντρο (Germinal Center) της αμυγδαλή, ενώ και ο εντοπισμός του μεταγραφικού αυτού παράγοντα παραμένει πυρηνικός (εικόνα 29). 78

81 ΕΙΚΟΝΑ 28 Έκφραση του Ets-2 σε ιστούς θύμου αδένα ανθρώπινου εμβρύου και αμυγδαλής ενήλικα ανθρώπου. a. Φωτογραφία από μικροσκόπιο, που δείχνει μέρος του εμβρυικού θύμου αδένα (σε ηλικία κυήσεως 25 εβδομάδων). Η άσπρη γραμμή διαχωρίζει τον μυελό (M-Medulla) από τον φλοιό (C-Cortex) του ιστού. a1. Αντιπροσωπευτική τομή μέρους του φλοιού του θύμου αδένα (σημειωμένη περιοχή του a1) βαμμένη με αντίσωμα έναντι του Ets-2. Παρατηρούμε ότι περίπου το 40% των θυμοκυττάρων της περιοχής επιδεικνύουν ισχυρή θετική χρώση ως προς τον Ets-2. a2. Μεγαλύτερη μεγέθυνση της σημειωμένης περιοχής του a1, στην οποία φαίνεται ισχυρή πυρηνική χρώση του Ets-2 (κόκκινα βέλη). b. Φωτογραφία από μικροσκόπιο, που δείχνει μέρος του εμβρυικού θύμου αδένα (σε ηλικία κυήσεως 25 εβδομάδων). Η άσπρη γραμμή διαχωρίζει τον μυελό (M-Medulla) από τον φλοιό (C-Cortex) του ιστού. b1. Αντιπροσωπευτική τομή μέρους του μυελού του θύμου αδένα (σημειωμένη περιοχή του b) βαμμένη με αντίσωμα έναντι του Ets-2. Ο αριθμός των Ets-2 θετικών κυττάρων στο μυελό είναι αυξημένος, σε σχέση με τον φλοιό, αφού όπως φαίνεται το 55% των θυμοκυττάρων επιδεικνύουν ισχυρή χρώση ως προς τον Ets-2. b2. Μεγαλύτερη μεγέθυνση της σημειωμένης περιοχής του b1, στην οποία φαίνεται ισχυρή πυρηνική χρώση του Ets-2 τόσο στα θυμοκύτταρα (κόκκινα βέλη) όσο και στα επιθηλιακά κύτταρα (πράσινα βέλη). c. Φωτογραφία από μικροσκόπιο, που δείχνει μέρος της αμυγδαλής. Η άσπρη γραμμή σηματοδοτεί το germinal center του ιστού. c1. Περίπου 22% των λεμφοκυττάρων του germinal center επιδεικνύουν θετική χρώση ως προς τον Ets-2. c2. Μεγαλύτερη μεγέθυνση της σημειωμένης περιοχής του c1, στην οποία φαίνεται πυρηνική και κυτταροπλασματική χρώση του Ets-2 σε λεμφοκύτταρα (κόκκινα βέλη) και σε επιθηλιακά κύτταρα (πράσινα βέλη). d. Φωτογραφία από μικροσκόπιο, που δείχνει μέρος της αμυγδαλής. Η άσπρη γραμμή σηματοδοτεί το germinal center του ιστού. d1. Περίπου 23% των λεμφοκυττάρων του φλοιού της αμυγδαλής επιδεικνύουν θετική χρώση ως προς τον Ets-2. d2. Μεγαλύτερη μεγέθυνση της σημειωμένης περιοχής του d1, στην οποία φαίνεται ισχυρή πυρηνική και κυτταροπλασματική χρώση του Ets-2 στα λεμφοκύτταρα (κόκκινα βέλη) και στα επιθηλιακά κύτταρα (πράσινα βέλη). 79

82 ΕΙΚΟΝΑ 29: Έκφραση του FoxP3 σε ιστούς θύμου αδένα ανθρώπινου εμβρύου και αμυγδαλής ενήλικα ανθρώπου. a. Φωτογραφία από μικροσκόπιο, που δείχνει μέρος του εμβρυικού θύμου αδένα (σε ηλικία κυήσεως 25 εβδομάδων). Η άσπρη γραμμή διαχωρίζει τον μυελό (M-Medulla) από τον φλοιό (C-Cortex) του ιστού. A1. 11% των θυμοκυττάρων του φλοιού του θύμου επιδεικνύει ασθενή θετική χρώση έναντι του FoxP3. A1. Μεγαλύτερη μεγέθυνση της σημειωμένης περιοχής του a1, στην οποία φαίνεται η ασθενής πυρηνική χρώση του FoxP3 (κόκκινα βέλη). b. Φωτογραφία από μικροσκόπιο, που δείχνει μέρος του εμβρυικού θύμου αδένα (σε ηλικία κυήσεως 25 εβδομάδων). Η άσπρη γραμμή διαχωρίζει τον μυελό (M-Medulla) από τον φλοιό (C-Cortex) του ιστού. B1. Θυμοκύτταρα του μυελού του θύμου αδένα, επιδεικνύουν ασθενή χρώση έναντι του FoxP3 σε επίπεδα παρόμοια με αυτά του φλοιού (11%). B2. Μεγαλύτερη μεγέθυνση της σημειωμένης περιοχής του b1, στην οποία φαίνεται η ασθενής πυρηνική χρώση του FoxP3 (κόκκινα βέλη). c. Φωτογραφία από μικροσκόπιο, που δείχνει μέρος της αμυγδαλής. Η άσπρη γραμμή σηματοδοτεί το germinal center του ιστού. c1. Το germinal center της αμυγδαλής επιδεικνύει ασθενή χρώση έναντι του FoxP3. Τα FoxP3 θετικά κύτταρα αποτελούν περίπου το 8% των συνολικών λεμφοκυττάρων c2. Μερικά θετικά ως προς το FoxP3 λεμφοκύτταρα παρατηρούνται σε μεγαλύτερη μεγέθυνση της σημειωμένης περιοχής του c1(κόκκινα βέλη). d. Φωτογραφία από μικροσκόπιο, που δείχνει μέρος της αμυγδαλής. Η άσπρη γραμμή σηματοδοτεί το germinal center του ιστού. d1. Ασθενής χρώση έναντι FoxP3 σε χαρακτηριστική τομή φλοιού αμυγδαλής. Ο αριθμός των FoxP3 θετικών κυττάρων στο φλοιό είναι συγκρίσιμος με αυτόν που παρατηρήθηκε στο germinal center (7%). d2. Μερικά θετικά ως προς το FoxP3 λεμφοκύτταρα παρατηρούνται σε μεγαλύτερη μεγέθυνση της σημειωμένης περιοχής του d1(κόκκινα βέλη). 80

83 Μελέτη του επιπέδου ενεργοποίησης και της έκφρασης IL-2 T κυτταρικών υποπληθυσμών ασθενών με Σκλήρυνση κατά πλάκας σε σύγκριση με υγιείς δότες Σκοπός της διατριβής αυτής, όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως είναι να μελετήσουμε τον ρόλο του Ets-2 στη ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της IL-2 στα Τ λεμφοκύτταρα και εάν παίζει κάποιο ρόλο και στη παθογένεση παθολογικών καταστάσεων στις οποίες εμπλέκονται τα Τ βοηθητικά κύτταρα και η IL-2. Μία υπόψηφια τέτοια παθολογική κατάσταση είναι το αυτοάνοσο νόσημα, Σκληρυνση κατά πλάκας, το οποίο και περιγράφηκε με λεπτομέρειες στην εισαγωγή. Κυρίαρχος λόγος για την επιλογή του νοσήματος αυτού, εκτός από τη σημαντικότητα της επιδημιολογίας της είναι και η διαφαινόμενη συμμετοχή των Τ βοηθητικών κυττάρων στη παθογένεια της νόσου καθώς και η αυξημένη μη φυσιολογική έκφραση της IL-2 από τους ασθενείς με Σκλήρυνση κατά πλάκας. Για τη συγκεκριμένη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε 7 ασθενείς ( 2 σε υποτροπή και 5 σε ύφεση) και 7 υγιή άτομα ως κοντρόλ. Ξεκινήσαμε μελετώντας το επίπεδο ενεργοποίησης των CD4+ κυττάρων, με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής και τη χρήση των δεικτών ενεργοποίησης CD25 και HLADR. Παρατηρήσαμε μεγάλη διαφορά στο επίπεδο ενεργοποίησης στα Τ κύτταρα τελεστές και στα Τ ρυθμιστικά κύτταρα μεταξύ των ασθενών σε υποτροπή και ύφεση. Πιο συγκεκριμένα το ποσοστό των ενεργοποιημένων κυττάρων τελεστών ήταν μεγαλύτερο στους ασθενείς σε υποτροπή, ενώ αντίθετα το ποσοστό των ενεργοποιημένων Τ ρυθμιστικών ήταν μεγαλύτερο στους ασθενείς σε ύφεση και σε σχεδόν ίδια επίπεδα με αυτά των υγιών δοτών. 81

84 Eικόνα 30: Διαφορές στα επίπεδα ενεργοποίησης των Τ κυττάρων τελεστών και των Τ ρυθμιστικών μεταξύ των ασθενών σε υφεση, σε υποτροπή και των υγιών δοτών. Η ανάλυση έγινε με κυτταρομετρία ροής σε μονοπύρηνα κύτταρα απομονωμένα με τη διαδικασία της βαθμίδωσης φυκόλης από περιφερικό αίμα. Έπειτα προχωρήσαμε στη μελέτη των επιπέδων έκφρασης της Il-2 σε επίπεδο mrna, σε διάφορους απομονωμένους κυτταρικούς υποπληθυσμούς. Από περιφερικό αίμα λοιπόν, απομονώθηκαν με φικόλη τα μονοπύρηνα κύτταρα (λεμφοκύτταρα και μονοκύτταρα), από τα οποία στη συνέχεια απομονώθηκαν καθαροί υποπληθυσμοί των CD4+ T βοηθητικών λεμφοκυττάρων, με τη χρήση FACS sorter. Πιο συγκεκριμένα απομονώθηκαν οι υποπληθυσμοί CD3+CD4+CD25-CD45RA+ Τ παρθενικά βοηθητικά λεμφοκύτταρα, CD3+CD4+CD25-CD45RΟ+ Τ μνημονικά βοηθητικά λεμφοκύτταρα και CD3+CD4+CD25+ Τ ρυθμιστικά λεμφοκύτταρα. Η καθαρότητα των υποπληθυσμών αυτών εξετάστηκε με κυτταρομετρία ροής και όπως φαίνεται στη παρακάτω εικόνα υπερβαίνει το 95% για τα παρθενικά και μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα και το 90% για τα Τ ρυθμιστικά λεμφοκύτταρα. 82

85 ΕΙΚΟΝΑ 31: FACS ανάλυση για τον καθορισμό της καθαρότητας των υποπληθυσμών CD4+CD45RA+ (αριστερά), CD4+CD45RO+ (κέντρο) και CD4+CD25- (δεξιά). Το ποσοστό της καθαρότητας για κάθε πληθυσμό είναι 95,8%, 96,5% και 90,2% αντίστοιχα. Όπως φαίνεται και στη παρακάτω εικόνα, η IL-2 εκφράζεται σε υψηλότερα επίπεδα στα παρθενικά Τ κύτταρα τελεστές αλλά και στα Τ ρυθμιστικά κύτταρα των ασθενών με σκλήρυνση κατά πλάκας σε σχέση με τους υγιείς δότες. Αυτό το αποτέλεσμα ίσως υποδεικνύει δυσλειτουργία στο μηχανισμό καταστολής της έκφρασης του γονιδίου της IL-2 στα κύτταρα αυτά στους ασθενείς. Ένας μηχανισμός, μέρος του οποίου θα προσπαθήσουμε να αποδείξουμε ότι είναι και ο μεταγραφικός παράγοντας Ets-2. Eικόνα 32: Διαφορές στα επίπεδα έκφρασης του mrna της IL-2 μεταξύ διαφόρων απομονωμένων κυτταρικών πληθυσμών ασθενών σε υφεση, σε υποτροπή και υγιών δοτών. Η ανάλυση έγινε με qrt- PCR στους κυτταρικούς πληθυσμούς απομονωμένους με κυτταρομετρία ροής. 83

86 Μεταγραφική ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της IL-2 σε απομονωμένα παρθενικά και μνημονικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα φυσιολογικών δοτών και ασθενών με σκλήρυνση κατά πλάκας Έκφραση και κυτταρικός εντοπισμός του Ets-2 σε υποπληθυσμούς CD4+ T λεμφοκυττάρων φυσιολογικών δοτών Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, ο κύριος σκοπός της διατριβής αυτής είναι καταρχήν η μελέτη της έκφρασης και του εντοπισμού του μεταγραφικού παράγοντα Ets-2 σε ανθρώπινα Τ λεμφοκύτταρα και έπειτα η ανάδειξη του ρόλου του στη ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της IL-2, τόσο σε φυσιολογικές καταστάσεις όσο και σε παθολογικές και πιο συγκεκριμένα στο αυτοάνοσο νόσημα της σκλήρυνσης κατά πλάκας. Πρώτο στάδιο λοιπόν της διατριβής αυτής είναι η μελέτη, ως προς τον μεταγραφικό παράγοντα Ets-2, υποπληθυσμών Τ λεμφοκυττάρων από ενήλικες υγιείς δότες. Αφού απομονώθηκαν οι υποπληθυσμοί που θέλουμε να εξετάσουμε, ακολούθησε καλλιέργεια των κυττάρων παρουσία (P/I) ή όχι (CM) των μιτογόνων PMA και Ionomycin για 6 και 12 ώρες. Μετά το τέλος των καλλιεργειών τα κύτταρα συλλέχθησαν και μετρήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των Ets-2 και IL-2 mrna με realtime PCR, τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης Ets-2 με Western blot ανάλυση καθώς και ο κυτταρικός εντοπισμός του μεταγραφικού αυτού παράγοντα με μικροσκοπία φθορισμού. Η real-time PCR έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης στα κύτταρα σε ηρεμία (CM) είναι μηδενικά, ενώ μετά από τη διέγερση τους με μιτογόνα (P/I) εμφανίζεται έκφραση του mrna της IL-2 τόσο στα βοηθητικά όσο και στα μνημονικά Τ κύτταρα. Τα μεγαλύτερα επίπεδα έκφρασης παρατηρούνται στα βοηθητικά Τ κύτταρα μετά από 6 ώρες ενεργοποίησης, ενώ στις υπόλοιπες κατηγορίες τα επίπεδα έκφρασης παραμένουν 84

87 σχεδόν τα ίδια. Το πρότυπο αυτό της έκφρασης του mrna της IL-2 φαίνεται να σχετίζεται με αυτό της έκφραση του Ets-2 mrna. Πιο συγκεκριμένα στα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα η έκφραση του Ets-2 mrna μειώνεται με τη πάροδο του χρόνου ενεργοποίησης, από το μέγιστο που εμφανίζει στη CM κατάσταση στο 50% στις 6 και στο 43% στις 12 ώρες μετά την ενεργοποίηση. Όσον αφορά στα Τ μνημονικά βοηθητικά κύτταρα η ανάλυση με real-time PCR των επιπέδων mrna ανέδειξε ένα διαφορετικό πρότυπο έκφρασης του Ets-2 mrna. Ο υποπληθυσμός αυτός φαίνεται να παράγει 5 φορές λιγότερο Ets-2 mrna σε συνθήκη CM σε σύγκριση με τα Τ παρθενικά βοηθητικά λεμφοκύτταρα. Μετά από διέγερση με μιτογόνα τα επίπεδα του mrna αυξήθηκαν 2 και 3 φορές στις 6 και 12 ώρες αντίστοιχα σε σχέση με τα επίπεδα σε συνθήκη CM. Εικόνα 33: Τα επίπεδα έκφρασης των IL-2 και Ets-2 mrna μετρήθηκαν με την χρήση real-time PCR σε παρθενικά CD4+CD45RA+ και σε μνημονικά CD4+CD45RO+ κύτταρα, που απομονώθηκαν από ολικό περιφερικό αίμα υγιών ενήλικων εθελοντών. Τα κύτταρα αυτά καλλιεργήθηκαν παρουσία (P/I) ή απουσία (CM) μιτογόνων για 6h και 12h. Η έκφραση της β2-m χρησιμοποιήθηκε σαν μάρτυρας για την ισοφόρτωση των δειγμάτων. Α. Έκφραση του mrna της IL-2 σε παρθενικά και μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα σε διαφορετικές καλλιεργητικές συνθήκες. B. Έκφραση του mrna του Ets-2 σε παρθενικά και μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα σε διαφορετικές καλλιεργητικές συνθήκες. 85

88 Από τα κύτταρα από τις παραπάνω καλλιέργειες, απομονώθηκαν και πρωτεϊνικά εκχυλίσματα για τη μέτρηση των επίπεδων έκφρασης της πρωτεΐνης Ets-2 με Western blot ανάλυση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο Ets-2 παρουσιάζει το ίδιο πρότυπο έκφρασης τόσο σε πρωτεϊνικό επίπεδο όσο και σε επίπεδο mrna. Εικόνα 34: Ανάλυση με Western blot ανάλυση της έκφραση του Ets-2 σε πρωτεϊνικό επίπεδο σε παρθενικά και μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα σε διαφορετικές καλλιεργητικές συνθήκες. Τα παρθενικά CD4+CD45RA+ και μνημονικά CD4+CD45RO+ κύτταρα, που απομονώθηκαν από ολικό περιφερικό αίμα υγιών ενήλικων εθελοντών, καλλιεργήθηκαν σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό CM±P/I, για χρονικές περιόδους 6h και 12h. Τα πρωτεϊνικά επίπεδα της τουμπουλίνης (tubulin) χρησιμοποιήθηκαν σαν μάρτυρας για την ισοφόρτωση των δειγμάτων. Η εικόνα που παρουσιάζεται είναι χαρακτηριστική τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με το ίδιο αποτέλεσμα. Στη συνέχεια, θελήσαμε να δούμε σε ποιο σημείο του κυττάρου, εντοπίζεται ο μεταγραφικός παράγοντας Ets-2 στα απομονωμένα παρθενικά και μνημονικά Τ βοηθητικά κύτταρα τόσο σε συνθήκες CM όσο και μετά από την ενεργοποίηση τους με μιτογόνα και αν παρατηρείται κάποια αλλαγή μεταξύ των διαφορετικών υποπληθυσμών ή συνθηκών. Για το λόγο αυτό απομονωμένα κύτταρα CD4+CD25- CD45RA+ και CD4+CD25-CD45RΟ+, καλλιεργημένα σε συνθήκες CM και P/I, προσκολλήθηκαν σε αντικειμενοφόρους πλάκες και αφού επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα έναντι του Ets-2 και δευτερογενές αντίσωμα Alexa Fluor 488, παρατηρήθηκαν σε συνεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού. Από την παρατήρηση αυτή, επιβεβαιώθηκαν καταρχήν τα αποτελέσματα που πήραμε προηγουμένως με τη Western blot ανάλυση, ότι η έκφραση του Ets-2 σε πρωτεϊνικό επίπεδο είναι αρκετά μεγαλύτερη στα παρθενικά Τ βοηθητικά κύτταρα από ότι στα μνημονικά σε κατάσταση ηρεμίας. Ενώ όταν τα κύτταρα ενεργοποιούνται με μιτογόνα, τα επίπεδα έκφρασης του Ets-2 μειώνονται σημαντικά στα παρθενικά Τ κύτταρα αλλά αυξάνονται σε μικρό βαθμό στα μνημονικά. 86

89 Όσον αφορά στη διαμερισματοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα, παρατηρήσαμε ότι η εντόπιση του είναι κατά κύριο λόγο πυρηνική σε όλα τα κύτταρα, με την υποσημείωση ότι ενώ στα παρθενικά κύτταρα εν ηρεμία ο Ets-2 εντοπίζεται κυρίως πυρηνικά, στα μνημονικά κύτταρα φαίνεται να αλλάζει κάπως το μοτίβο διαμερισματοποίησης του και να εντοπίζεται και κυτταροπλασματικά. Το ίδιο φαίνεται να συμβαίνει και όταν τα κύτταρα ενεργοποιούνται (εικόνα 35). ΕΙΚΟΝΑ 35: Εντοπισμός της πρωτεΐνης Ets-2 σε απομονωμένα παρθενικά (CD45RA) και μνημονικά (CD45RO) Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα, παρουσία(p/i) ή απουσία (CM) μιτογόνων, με τη χρήση ανοσοφθορισμού. Με πράσινο χρώμα, παρατηρείται η έμμεση χρώση με πρωτογενές αντίσωμα έναντι του Ets-2 και φθορίζον δευτερογενές αντίσωμα Alexa Fluor 488 και με μπλε χρώμα, η χρώση των πυρήνων με διάλυμα DAPI. Από την ανάλυση σε συνεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού φαίνεται ότι έκφραση της πρωτείνης Ets-2 στα παρθενικά κύτταρα είναι κατά πολύ μεγαλύτερη από την αντίστοιχη των μνημονικών, ενώ όταν τα κύτταρα ενεργοποίουνται η έκφραση μειώνεται στα παρθενικά κύτταρα και φτάνει στα επίπεδα των μνημονικών κυττάρων. Η ανάλυση και παρατήρηση των εικόνων έγινε σε μικροσκόπιο confocal LEICA TCSSP5 σε ανάλυση 63x. Η επεξεργασία των εικόνων και ηλεκτρονική μεγέθυνση τους έγινε με το πρόγραμμα FIJI 87

90 Έκφραση και κυτταρικός εντοπισμός του Ets-2 σε υποπληθυσμούς CD4+ T λεμφοκυττάρων από ασθενείς με σκλήρυνση κατά πλάκας Με βάση τα παραπάνω, προχωρήσαμε στη μελέτη της έκφρασης και του κυτταρικού εντοπισμού του μεταγραφικού παράγοντα Ets-2 σε απομονωμένους κυτταρικούς πληθυσμούς ασθενών με Σκλήρυνση κατά πλάκας και τη σύγκριση τους με τα αντίστοιχα υγιών δοτών. Από περιφερικό αίμα ασθενών και υγιών δοτών λοιπόν, απομονώθηκαν με φικόλη τα μονοπύρηνα κύτταρα (λεμφοκύτταρα και μονοκύτταρα), από τα οποία στη συνέχεια απομονώθηκαν καθαροί υποπληθυσμοί των CD4+ T βοηθητικών λεμφοκυττάρων, με τη χρήση FACS sorter. Πιο συγκεκριμένα απομονώθηκαν οι υποπληθυσμοί CD4+CD25+ T ρυθμιστικά κύτταρα, CD4+CD25- CD45RA+ Τ παρθενικά βοηθητικά λεμφοκύτταρα και CD4+CD25-CD45RΟ+ Τ μνημονικά βοηθητικά λεμφοκύτταρα. Τα κύτταρα αυτά συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των Ets- 2 και IL-2 mrna με real-time PCR, καθώς και ο κυτταρικός εντοπισμός του μεταγραφικού αυτού παράγοντα με μικροσκοπία φθορισμού. Eικόνα 36: Διαφορές στα επίπεδα έκφρασης του mrna του Ets-2 μεταξύ διαφόρων απομονωμένων κυτταρικών πληθυσμών ασθενών σε υφεση, σε υποτροπή και υγιών δοτών. Η ανάλυση έγινε με qrt- PCR στους κυτταρικούς πληθυσμούς απομονωμένους με κυτταρομετρία ροής. 88

91 Αυτό που παρατηρούμε από την παραπάνω εικόνα είναι ότι η έκφραση του Ets- 2 μειώνεται σε σημαντικό βαθμό στα παρθενικά Τ κύτταρα των ασθενών με Σκλήρυνση κατά πλάκας σε σχέση με τα αντίστοιχα κύτταρα υγιών δοτών. Αντίθετα, παρατηρούμε μία σημαντική αύξηση στην έκφραση του Ets-2 στα Τ ρυθμιστικά κύτταρα των ασθενών σε ύφεση σε σχέση με τους υγιείς δότες και με τους ασθενςί σε υποτροπή. Όπως θα δούμε και παρακάτω σε πειράματα ανοσοφθορισμού, η μείωση αυτή σε επίπεδο mrna μεταφράζεται και σε πρωτεινικό επίπεδο. Συγκρίνοντας επομένως το μοτίβο έκφρασης του Ets-2 στα παρθενικά και μνημονικά κύτταρα ασθενών και υγιών δοτών, η μόνη διαφορά που παρατηρούμε είναι η μεγάλη μείωση της έκφρασης στα παρθενικά κύτταρα των ασθενών σε σχέση με αυτά των υγιών δοτών, ενώ η έκφραση του Ets-2 στα μνημονικά κύτταρα παραμένει στα ίδια επίπεδα στις δύο ομάδες. Όσον αφορά στον κυτταρικό εντοπισμό και εδώ δεν παρατηρούμε κάποια διαφορά αφού ο Ets-2 παραμένει κυρίως πυρηνικός. ΕΙΚΟΝΑ 37: Εντοπισμός της πρωτεΐνης Ets-2 σε απομονωμένα παρθενικά(cd45ra) και μνημονικά(cd45ro) Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα ασθενών και υγιών δοτών με τη χρήση ανοσοφθορισμού. Με πράσινο χρώμα, παρατηρείται η έμμεση χρώση με πρωτογενές αντίσωμα έναντι του Ets-2 και φθορίζον δευτερογενές αντίσωμα Alexa Fluor 488 και με μπλε χρώμα, η χρώση των πυρήνων με διάλυμα DAPI. Πειράματα ανοσοφθορισμού και σε απομονωμένα Τ ρυθμιστικά κύτταρα ασθενών με Σκλήρυνση κατά πλάκας και υγιών δοτών, έδειξαν σημαντική αύξηση της πρωτεϊνικής έκφρασης του Ets-2 στα κύτταρα των ασθενών, με τη διαμερισματοποίηση του να μην αλλάζει και να παραμένει πυρηνική. 89

92 ΕΙΚΟΝΑ 38: Εντοπισμός της πρωτεΐνης Ets-2 σε απομονωμένα CD4+CD25+ Τ ρυθμιστικά λεμφοκύτταρα ασθενών και υγιών δοτών με τη χρήση ανοσοφθορισμού. Με πράσινο χρώμα, παρατηρείται η έμμεση χρώση με πρωτογενές αντίσωμα έναντι του Ets-2 και φθορίζον δευτερογενές αντίσωμα Alexa Fluor 488 και με μπλε χρώμα, η χρώση των πυρήνων με διάλυμα DAPI. Πρόσδεση του Ets-2 στον υποκινητή του γονιδίου της IL-2, σε φυσιολογικούς δότες Αφού μελετήσαμε το πρότυπο έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Ets-2, στα κύτταρα Jurkat, εφαρμόσαμε τις ίδιες πειραματικές διαδικασίες και σε απομονωμένους υποπληθυσμούς Τ λεμφοκυττάρων από ενήλικες υγιείς δότες, έτσι ώστε να έχουμε μία καλύτερη εικόνα ως προς τη συμπεριφορά του Ets-2 στον ανθρώπινο οργανισμό και για επιβεβαίωση των πειραμάτων EMSA, που αναφέρθηκαν προηγουμένως και δείχνουν πρόσδεση του Ets-2 στον υποκινητή του γονιδίου της IL- 2 μόνο στα παρθενικά και όχι στα μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα. Η ανίχνευση του συνεντοπισμού του Ets-2 με την ARRE-2 αλληλουχία του υποκινητή της IL-2 με τη μέθοδο της Immuno-DNA FISH, έγινε σε απομονωμένα παρθενικά και μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα τόσο σε κατάσταση ηρεμίας (εικόνα 39) όσο και μετά από καλλιέργεια παρουσία μιτογόνων για 6 ώρες (εικόνα 40). 90

93 Eικόνα 39: Συνεντοπισμός της πρωτεΐνης Ets-2 και της ARRE2 αλληλουχίας του γονιδίου της IL-2 σε απομονωμένα ανθρώπινα παρθενικά και μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα με την χρήση Immuno-DNA FISH κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ή μη μιτογόνων και αφέθηκαν να προσκολληθούν σε αντικειμενοφόρους πλάκες επικαλυμμένες με poly-l-lysine και μονιμοποιήθηκαν με παραφορμαλδεύδη 4%. Μετά από πλύσεις (1xPBS) και επώαση με blocking buffer ακολουθεί επώαση με anti-ets-2 ab και δεύτερο αντίσωμα anti-mouse Alexa 488 (πράσινο). Μετά από αποδιάταξη του DNA των κυττάρων και του DNA ανιχνευτή (κατασκευάστηκε με nick translation με την χρήση biotin modified dutps) ακολουθεί υβριδοποίηση overnight στους 42 ο C και σήμανση του DNA ανιχνευτή με streptavidine Alexa 568 (κόκκινο). Η χρώση των πυρήνων έγινε με διάλυμα DAPI (μπλέ) για 10min. Η ανάλυση και παρατήρηση των εικόνων έγινε σε μικροσκόπιο φθορισμού NIKON ECLIPSE TE 2000-U σε ανάλυση 100x. Eικόνα 40: Συνεντοπισμός της πρωτεΐνης Ets-2 και της ARRE2 αλληλουχίας του γονιδίου της IL-2 σε απομονωμένα ανθρώπινα παρθενικά και μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα μετά από καλλιέργεια παρουσία μιτογόνων για 6 ώρες με την χρήση Immuno-DNA FISH κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ή μη μιτογόνων και αφέθηκαν να προσκολληθούν σε αντικειμενοφόρους πλάκες επικαλυμμένες με poly-llysine και μονιμοποιήθηκαν με παραφορμαλδεύδη 4%. Μετά από πλύσεις (1xPBS) και επώαση με blocking buffer ακολουθεί επώαση με anti-ets-2 ab και δεύτερο αντίσωμα anti-mouse Alexa 488 (πράσινο). Μετά από αποδιάταξη του DNA των κυττάρων και του DNA ανιχνευτή (κατασκευάστηκε με nick translation με την χρήση biotin modified dutps) ακολουθεί υβριδοποίηση overnight στους 42 ο C και σήμανση του DNA ανιχνευτή με streptavidine Alexa 568 (κόκκινο). Η χρώση των πυρήνων έγινε με διάλυμα DAPI (μπλέ) για 10min. Η ανάλυση και παρατήρηση των εικόνων έγινε σε μικροσκόπιο φθορισμού NIKON ECLIPSE TE 2000-U σε ανάλυση 100x. 91

94 Όπως παρατηρούμε, τα αποτελέσματα στα απομονωμένα ανθρώπινα Τ λεμφοκύτταρα συμφωνούν με τα αντίστοιχα στα Jurkat κύτταρα και δείχνουν ότι σε κατάσταση ηρεμίας στα παρθενικά κύτταρα, ο Ets-2 βρίσκεται προσκολλημένος στην ARRE-2 αλληλουχία του υποκινητή της IL-2, ενώ όταν αυτά ενεργοποιούνται τότε αποδεσμεύεται. Ενώ αντίθετα παρατηρούμε αντίστροφη εικόνα στα μνημονικά κύτταρα αφού ο Ets-2 προσδένεται στην ARRE-2 αλληλουχία μόνο μετά από την ενεργοποίηση των κυττάρων. Πρόσδεση του μεταγραφικού παράγοντα Ets-2 στον υποκινητή του γονιδίου της IL-2, σε ασθενείς με σκλήρυνση κατά πλάκας Αφού μελετήσαμε τα επίπεδα έκφρασης του Ets-2 και παρατηρήσαμε σημαντικά διαφορά στην έκφραση του στα παρθενικά κύτταρα ασθενών με σκλήρυνση κατά πλάκας σε σχέση με αυτά των υγιών δοτών, γεγονός που συνοδεύεται και με αυξημένη έκφραση της κυτταροκίνης IL-2 από τα ίδια κύτταρα, θελήσαμε να δούμε εάν ο Ets-2 παρουσιάζει και λειτουργική μεταβολή στα κύτταρα των ασθενών. Όπως αποδείξαμε και προηγουμένως, η κατασταλτική λειτουργία του Ets-2 ως προς την έκφραση της IL-2, διαμεσολαβείτε από την πρόσδεση του στην ARRE-2 περιοχή του γονιδίου της κυτταροκίνης. Αφού γνωρίζουμε ότι σε υγιείς δότες, ο Ets-2 προσδένεται στον ARRE-2 μόνο στα παρθενικά εν ηρεμία Τ κύτταρα και όχι στα μνημονικά, θελήσαμε να δούμε τι συμβαίνει και στα κύτταρα των ασθενών. Για το λόγο αυτό απομονώσαμε CD4+CD25-CD45RA+ παρθενικά και CD4+CD25-CD45RO+ μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα από το περιφερικό αίμα ασθενών με σκλήρυνση κατά πλάκας με τη χρήση FACS sorter. Η ανίχνευση του συνεντοπισμού του Ets-2 με την ARRE-2 αλληλουχία του υποκινητή της IL-2 έγινε με τη μέθοδο της Immuno-DNA FISH και τα αποτελέσματα φαίνονται στην παρακάτω εικόνα. 92

95 Eικόνα 41: Συνεντοπισμός της πρωτεΐνης Ets-2 και της ARRE2 αλληλουχίας του γονιδίου της IL-2 σε απομονωμένα παρθενικά και μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα, ασθενών με σκλήρυνση κατά πλάκας και υγιών δοτών, με την χρήση Immuno-DNA FISH κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ή μη μιτογόνων και αφέθηκαν να προσκολληθούν σε αντικειμενοφόρους πλάκες επικαλυμμένες με poly-llysine και μονιμοποιήθηκαν με παραφορμαλδεύδη 4%. Μετά από πλύσεις (1xPBS) και επώαση με blocking buffer ακολουθεί επώαση με anti-ets-2 ab και δεύτερο αντίσωμα anti-mouse Alexa 488 (πράσινο). Μετά από αποδιάταξη του DNA των κυττάρων και του DNA ανιχνευτή (κατασκευάστηκε με nick translation με την χρήση biotin modified dutps) ακολουθεί υβριδοποίηση overnight στους 42 ο C και σήμανση του DNA ανιχνευτή με streptavidine Alexa 568 (κόκκινο). Η χρώση των πυρήνων έγινε με διάλυμα DAPI (μπλέ) για 10min. Η ανάλυση και παρατήρηση των εικόνων έγινε σε μικροσκόπιο φθορισμού NIKON ECLIPSE TE 2000-U σε ανάλυση 100x. Παρατηρούμε λοιπόν, ότι ο Ets-2 δεν προσδένεται στην ARRE-2 περιοχή του γονιδίου της IL-2 στα παρθενικά κύτταρα ασθενών σε αντίθεση με τη φυσιολογική του λειτουργία στα παρθενικά κύτταρα υγιών δοτών. Από την άλλη η εικόνα που παρατηρούμε στα μνημονικά κύτταρα των ασθενών παραμένει ίδια με αυτή των υγιών δοτών, αφού ο Ets-2 δεν προσδένεται στον ARRE-2 σε καμία από τις δύο καταστάσεις. Η διαφοροποίηση αυτή, είναι μία σημαντική ένδειξη ότι η αδυναμία πρόσδεσης του Ets-2 στον υποκινητή της IL-2 ίσως ευθύνεται για την αυξημένη έκφραση της IL-2 στους ασθενείς με σκλήρυνση κατά πλάκας και μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στη παθογένεια της νόσου. 93

96 Έκφραση και κυτταρικός εντοπισμός του FoxP3 σε ρυθμιστικά Τ λεμφοκύτταρα φυσιολογικών δοτών και ασθενών με σκλήρυνση κατά πλάκας Στο αρχικό στάδιο της μελέτης για τη σκλήρυνση κατά πλάκας, παρατηρήσαμε αυξημένα επίπεδα έκφρασης της Il-2 όχι μόνο στα παρθενικά Τ βοηθητικά κύτταρα αλλά και στα Τ ρυθμιστικά κύτταρα. Ενώ για τη πρώτη κατηγορία κυττάρων στοχοποιήσαμε τον Ets-2, για τη δεύτερη δεν έχουμε ακόμα κάποια απάντηση. Γνωρίζουμε βιβλιογραφικά, όμως, ότι κύριος υπεύθυνος για τη ρύθμιση της IL-2 στα κύτταρα αυτά είναι ο μεταγραφικός παράγοντας FoxP3, o οποίος και καταστέλλει την έκφραση της σε φυσιολογικές συνθήκες. Για το λόγο αυτό θελήσαμε να δούμε εάν υπάρχουν διαφορές στην έκφραση του παράγοντα αυτού μεταξύ των Τ ρυθμιστικών κυττάρων ασθενών και υγιών δοτών. Όπως και με τον Ets-2, αρχικά απομονώσαμε διάφορους κυτταρικούς υποπληθυσμούς από περιφερικό αίμα ασθενών και υγιών δοτών και αναλύσαμε τα επίπεδα έκφρασης του FoxP3 mrna με qrt-pcr. Eικόνα 42: Διαφορές στα επίπεδα έκφρασης του mrna του FoxP3 μεταξύ διαφόρων απομονωμένων κυτταρικών πληθυσμών ασθενών σε υφεση, σε υποτροπή και υγιών δοτών. Η ανάλυση έγινε με qrt- PCR στους κυτταρικούς πληθυσμούς απομονωμένους με κυτταρομετρία ροής. 94

97 Αυτό που παρατηρήσαμε είναι μειωμένη έκφραση του FoxP3 στα Τ ρυθμιστικά κύτταρα ασθενών σε ύφεση σε σχέση με τα κύτταρα των υγιών δοτών. Με την ίδια λογική συγκρίναμε και τη πρωτεϊνική έκφραση του FoxP3 στα Τ ρυθμιστικά κύτταρα ασθενών και υγιών δοτών, με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού. ΕΙΚΟΝΑ 43: Εντοπισμός της πρωτεΐνης FoxP3 σε απομονωμένα (CD4+CD25+) Τ ρυθμιστικά λεμφοκύτταρα ασθενών και υγιών δοτών με τη χρήση ανοσοφθορισμού. Με πράσινο χρώμα, παρατηρείται η έμμεση χρώση με πρωτογενές αντίσωμα έναντι του FoxP3 και φθορίζον δευτερογενές αντίσωμα Alexa Fluor 488 και με μπλε χρώμα, η χρώση των πυρήνων με διάλυμα DAPI. Όπως φαίνεται και από τις εικόνες ανοσοφθορισμού, η έκφραση του FoxP3 είναι αρκετά μειωμένη στα Τ ρυθμιστικά κύτταρα των ασθενών με σκλήρυνση κατά πλάκας σε σχέση με αυτά των υγιών δοτών. Η μείωση αυτή ίσως να ευθύνεται και για την αυξημένη έκφραση της κυτταροκίνης IL-2 από τα κύτταρα ενώ και ο συνδυασμός της με την αδυναμία καταστολής της έκφρασης της IL-2, από τον Ets-2, στα εν ηρεμία παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα, να προκαλούν την εμφάνιση της νόσου. Για να απαντήσουμε στο ερώτημα όμως της παθογένειας της Σκλήρυνσης κατά πλάκας με σιγουριά, απαιτούνται επιπρόσθετα πειράματα, τα οποία όμως λόγω δυσκολίας τεχνικής και χρονικής, δεν κατέστησαν δυνατά να ενσωματωθούν στη παρούσα διατριβή. 95

98 Πρόσδεση του μεταγραφικού παράγοντα Ets-2 στον υποκινητή του γονιδίου ets-2 και αυτορρύθμιση της έκφρασης του Τελειώνοντας με τη μελέτη για τη φυσιολογική λειτουργία και ρόλο που έχει ο Ets-2 στα Τ κύτταρα, θελήσαμε να μελετήσουμε τον τρόπο ρύθμισης του ίδιου του μεταγραφικού παράγοντα. Μέχρι στιγμής στη βιβλιογραφία, όπως είπαμε και στην εισαγωγή, δεν υπάρχουν πολλές μελέτες που να δείχνουν πως ρυθμίζεται η έκφραση του ίδιου του Ets-2. Η πιο σημαντική μελέτη μέχρι τώρα, αναφέρει τη σχέση του συμπλόκου CDK10/cyclin M με τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης του Ets-2 και τη μετέπειτα πρωτεόλυσης της από το πρωτεάσωμα. Επειδή όμως, η ρύθμιση αυτή αφορά σε μετα-μεταφραστικό επίπεδο, θελήσαμε να μελετήσουμε τι γίνεται σε μεταγραφικό επίπεδο κατά την έκφραση του γονιδίου του Ets-2. Επειδή, όπως προ είπαμε, δεν υπάρχουν πολλά βιβλιογραφικά δεδομένα γύρω από τον μεταγραφικό παράγοντα Ets-2, κοιτάξαμε εάν υπάρχουν θέσεις πρόσδεσης του Ets-2 στον ίδιο του τον υποκινητή. Αφού η έρευνα αυτή αποδείχθηκε επιτυχής, ερευνήσαμε και πειραματικά εάν ο Ets-2 προσδένεται στο σημείο αυτό του υποκινητή του και εάν ναι, υπό ποιες κυτταρικές συνθήκες. Για το λόγο αυτό κύτταρα Jurkat καλλιεργημένα, απουσία και παρουσία μιτογόνων για 6h, προσκολλήθηκαν σε αντικειμενοφόρους πλάκες και με το συνδυασμό των τεχνικών ανοσοφθορισμού και FISH, μελετήθηκε η ύπαρξη ή όχι συνεντοπισμού μεταξύ του μεταγραφικού παράγοντα Ets-2 και του υποκινητή του γονιδίου του. Η χρώση για τον υποκινητή του Ets-2 έγινε με ειδικά σχεδιασμένους probe, με ενσωματωμένα μόρια βιοτίνης και με μόρια στρεπταβιδίνης συζευγμένα με το φθορόχρωμα Alexa 568. Παρατηρήσαμε λοιπόν ότι ο Ets-2 προσδένεται στον υποκινητή του γονιδίου του μόνο όταν τα κύτταρα βρίσκονται σε κατάσταση ενεργοποίησης, κατά την οποία έχει παρατηρηθεί ότι τα επίπεδα έκφρασης του Ets-2 πέφτουν ραγδαία σε σχέση με τα κύτταρα που βρίσκονται σε ηρεμία. Επίσης η λειτουργία αυτή του Ets-2 φαίνεται να είναι η αντίστροφη σε σχέση με τη λειτουργία του κατά τη ρύθμιση της IL-2. Δηλαδή σε κατάσταση ηρεμίας των Jurkat κυττάρων (παρθενικά Τ κύτταρα), ο Ets-2 εκφράζεται σε υψηλά πρωτεινικά επίπεδα, προσδένται στον υποκινητή της IL-2 αλλά 96

99 όχι σε αυτόν του Ets-2, ενώ αντίθετα όταν τα κύτταρα ενεργοποιούνται, τα πρωτεινικά επίπεδα του Ets-2 πέφτουν σημαντικά, σταματάει να προσδένεται στον υποκινητή της IL-2 και προσδένται στον υποκινητή του ίδιου του γονιδίου. Eικόνα 44: Συνεντοπισμός της πρωτεΐνης Ets-2 και του υποκινητή του γονιδίου του Ets-2 στην Jurkat κυτταρική σειρά με την χρήση Immuno-DNA FISH Jurkat κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ή μη μιτογόνων και αφέθηκαν να προσκολληθούν σε αντικειμενοφόρους πλάκες επικαλυμμένες με poly-llysine και μονιμοποιήθηκαν με παραφορμαλδεύδη 4%. Μετά από πλύσεις (1xPBS) και επώαση με blocking buffer ακολουθεί επώαση με anti-ets-2 ab και δεύτερο αντίσωμα anti-mouse Alexa 488 (πράσινο). Μετά από αποδιάταξη του DNA των κυττάρων και του DNA ανιχνευτή (κατασκευάστηκε με nick translation με την χρήση biotin modified dutps) ακολουθεί υβριδοποίηση overnight στους 42 ο C και σήμανση του DNA ανιχνευτή με streptavidine Alexa 568 (κόκκινο). Η χρώση των πυρήνων έγινε με διάλυμα DAPI (μπλέ) για 10min. Η ανάλυση και παρατήρηση των εικόνων έγινε σε μικροσκόπιο φθορισμού NIKON ECLIPSE TE 2000-U σε ανάλυση 100x. 97