ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΑΣ «Διαφορική ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 και του ιού HIV-1 από μεταγραφικούς καταστολείς σε παρθενικά και μνημονικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα» ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΝΑΓΟΥΛΙΑΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ 2014

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΑΣ «Διαφορική ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 και του ιού HIV-1 από μεταγραφικούς καταστολείς σε παρθενικά και μνημονικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα» ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΝΑΓΟΥΛΙΑΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ 2014 H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: Ηράκλειτος ΙΙ. Επένδυση στην κοινωνία της γνώσης μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου. 2

3 Αφιερωμένο στην ανηψιά μου 3

4 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγήτρια Μουζάκη Αθανασία (Επιβλέπουσα Καθηγήτρια-Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) Καθηγητής Γώγος Χαράλαμπος (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) Καθηγητής Μοσχονάς Νικόλαος (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγήτρια Μουζάκη Αθανασία (Επιβλέπουσα Καθηγήτρια-Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) Καθηγητής Γώγος Χαράλαμπος (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) Καθηγητής Μοσχονάς Νικόλαος (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) Ερευνητής Α' Θάνος Δημήτριος ( Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Επιστημών Ακαδημίας Αθηνών) Αναπληρωτής Καθηγητής Μαραγκός Μάρκος (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) Ερευνήτρια Β' Πανουτσακοπούλου Βίλη ( Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Επιστημών Ακαδημίας Αθηνών) Επίκουρος Καθηγητής Πάνος Γεώργιος (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 4

5 Ευχαριστίες.. Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Αιματολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών στα πλαίσια του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών στις Εφαρμογές των Βασικών Ιατρικών Επιστημών και στην κατεύθυνση της Παθοβιοχημείας, υπό την επίβλεψη της Καθηγήτριας Αθανασίας Μουζάκη. Κλείνοντας 10 χρόνια στο εργαστήριο Αιματολογίας δεν έχω να ευχαριστήσω απλά συνεργάτες παρά μόνο φίλους και δικούς μου ανθρώπους. Θεωρώ τον εαυτό μου πολύ τυχερό που πριν αρκετά χρόνια χτύπησα την πόρτα του γραφείου της κυρίας Μουζάκη ζητώντας της να εκπονήσω την διπλωματική μου εργασία στο εργαστήριό της και με δέχτηκε με χαρά. Έτσι το πρώτο και μεγάλο ευχαριστώ θέλω να το εκφράσω στην Καθηγήτρια Αθανασία Μουζάκη για την μεγάλη τιμή και ευκαιρία που μου έδωσε να είμαι τόσα χρόνια μέλος του εργαστηρίου της. Την ευχαριστώ θερμά για την εμπιστοσύνη που μου δείχνει και που μου εμφύτευσε τόσο την τεχνική αλλά και την κριτική και θεωρητική γνώση. Ότι έχω καταφέρει μέχρι σήμερα οφείλεται στον μεγαλύτερο βαθμό στην ίδια. Μα πάνω από όλα την ευχαριστώ για την στήριξη της σαν άνθρωπος, στήριξη η οποία είναι σημαντική και ανεκτίμητη. Ένα μόνο ευχαριστώ είναι πολύ λίγο μπροστά σε αυτά που μου έχει προσφέρει. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον φίλο Τάσο Γεωργακόπουλο, που τόσα χρόνια η συνεργασία μας ήταν άψογη. Τον ευχαριστώ για την πολύτιμη βοήθειά του τόσο για την εκπαίδευσή μου τα πρώτα χρόνια που ήρθα στο εργαστήριο αλλά και για τις χρήσιμες παρεμβάσεις του, την συνεργασία και την κατανόησή του σε όλη μου αυτή την προσπάθεια. Τον ευχαριστώ όμως πάνω από όλα σαν φίλο για την στήριξή του σε όλες τις δυσκολίες που αντιμετώπισα. Στον εργαστηριακό χώρο αυτό είχα την τύχη και την τιμή να συνεργαστώ με ανθρώπους οι οποίοι εκτός από το επιστημονικό κομμάτι με βοήθησαν σημαντικά και ψυχολογικά. Έχω την χαρά να τους αποκαλώ φίλους. Έτσι θέλω να εκφράσω ένα μεγάλο ευχαριστώ στην υποψήφια διδάκτορα Παναγιώτα Σπαντιδέα, την μεταπτυχιακή φοιτήτρια Ιωάννα Αγγελετοπούλου, την μεταπτυχιακή φοιτήτρια Ρούλα Αναστασοπούλου, την υποψήφια διδάκτορα Παναγιώτα Σακελλαράκη, τον 5

6 υποψήφιο διδάκτορα Φώτη Καραγιάννη, την υποψήφια διδάκτορα Μαρία Ρόδη και την μεταπτυχιακή φοιτήτρια Μαριάνθη Κοσμά. Η συνεργασία μας όλα αυτά τα χρόνια ήταν άψογη. Θέλω να ευχαριστήσω επίσης και τα νεότερα μέλη του εργαστηρίου. Ένα μεγάλο ευχαριστώ θα ήθελα επίσης να εκφράσω και στο μέλος της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής Ερευνητή Α' Δημήτριο Θάνο για την φιλοξενία του στο εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας του Ιδρύματος Ιατροβιολογικών Ερευνών Ακαδημίας Αθηνών όπου πραγματοποιήθηκε σημαντικό κομμάτι της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Θέλω να τον ευχαριστήσω για την πολύτιμη βοήθειά του τόσο στο τεχνικό όσο και στο θεωρητικό κομμάτι. Πολύτιμη ήταν και η βοήθεια των μελών του εργαστηρίου του κυρίου Θάνου και για αυτό οφείλω να τους ευχαριστήσω, και ιδιαίτερα τον Μάριο Αγγελόπουλο και την Εύα Μαντούβαλου. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω και τα υπόλοιπα μέλη της συμβουλευτικής και εξεταστικής μου επιτροπής που μου έκαναν την τιμή να συμμετέχουν σε αυτή. Έτσι ευχαριστώ τον Καθηγητή κ. Χαράλαμπο Γώγο, τον Καθηγητή κ. Νικόλαο Μοσχονά, τον επίκουρο Καθηγητή κ. Γεώργιο Πάνο, τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Μάρκο Μαραγκό και την Ερευνήτρια Β' του Ιδρύματος Ιατροβιολογικών Ερευνών Ακαδημίας Αθηνών κα. Βίλη Πανουτσακοπούλου. Τέλος οφείλω ένα τεράστιο ευχαριστώ σε ανθρώπους που βρίσκονται έξω από τον επιστημονικό χώρο και με ενθάρρυναν σε όλη αυτή την προσπάθεια, δίνοντάς μου δύναμη. Ένα τεράστιο ευχαριστώ, λοιπόν, στην Κατερίνα, τον Παναγιώτη, τον Βαγγέλη, τον μικρό μου Αναστάση και στους φίλους μου. Όσον αφορά την οικογένεια μου ένα μόνο ευχαριστώ είναι πολύ λίγο. Ευχαριστώ τους γονείς μου και την αδερφή μου για ότι έχουν κάνει και συνεχίζουν και κάνουν για μένα. Χωρίς αυτούς δεν θα είχα φτάσει εδώ σήμερα. Τελευταίο αφήνω το πλασματάκι στο οποίο αφιερώνω και την παρούσα διδακτορική διατριβή που με τον ερχομό της μου έδωσε νέα ώθηση και δύναμη, την αγαπημένη μου ανηψιά. Σας ευχαριστώ όλους πάρα πολύ, Γιάννης 6

7 ΣΥΝΤΟΜΕΥΣΕΙΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Μέρος 1 ο T ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ (T cells) Βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα (CD4+) Παρθενικά (naïve) Th λεμφοκύτταρα Μνημονικά (memory) Τh λεμφοκύτταρα ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ CD4 T ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΕΣ Ιντερλευκίνες Ιντερλευκίνη-2 (IL-2) Κυκλοσπορίνη Α και ο ρόλος της στην μεταγραφή του γονιδίου της IL Μέρος 2 ο HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS TYPE-1 (HIV-1) Μοριακοί μηχανισμοί που ελέγχουν την έκφραση του HIV Μέρος 3 ο ΤΟ ΟΓΚΟΓΟΝΙΔΙΟ ΕΤS ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΥΤΤΑΡΑ Απομόνωση υποπληθυσμών Τ λεμφοκυττάρων Κυτταρομετρία ροής (FACS) Καλλιέργειες κυττάρων Δημιουργία κλώνων CD4+CD45RO+CD25- μνημονικών Τ κυττάρων RT-PCR ΚΑΙ Real-time PCR Απομόνωση RNA από τα κύτταρα Κατασκευή cdna και RT-PCR Real-time PCR

8 3. ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ Απομόνωση πρωτεϊνών από κύτταρα Ανοσοαποτύπωση κατά Western EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) ΔΙΑΜΟΛΥΝΣΕΙΣ ΣΤΗΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΣΕΙΡΑ JURKAT Πλασμίδια Διαμολύνσεις CAT-assays ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ IMMUNO-DNA FISH (Fluorescence in situ hybridization) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Έκφραση του ets-2 mrna σε υποπληθυσμούς κυττάρων περιφερικού αίματος Ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 στα στοιχεία ARRE-2 και RATS Έκφραση του παράγοντα Ets-2 σε υποπληθυσμούς CD4+ T λεμφοκυττάρων- Ο ρόλος της κυκλοσπορίνης Α (CsA) Η έκφραση του παράγοντα ets-2 στην κυτταρική σειρά Jurkat Υπερέκφραση και αποσιώπηση του Ets-2 στην Jurkat κυτταρική σειρά. Ο ρόλος του στην έκφραση της IL Δοσοεξαρτώμενη καταστολή της έκφρασης της IL-2 και του HIV1-LTR μέσω της πρόσδεσης του Ets-2 στην ARRE-2 και RATS αλληλουχία αντίστοιχα Ο παράγοντας Ets-2 είναι γενικός καταστολέας της έκφρασης της IL Ο παράγοντας Ets-2 καταστέλλει την έκφραση του IL-2 mrna μέσω της πρόσδεσής του στο ARRE-2 στοιχείο του υποκινητή της IL Ο παράγοντας Ets-2 καταστέλλει την έκφραση του HIV-1 μέσω της πρόσδεσής του στο RATS στοιχείο της LTR αλληλουχίας ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ

9 SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ

10 ΣΥΝΤΟΜΕΥΣΕΙΣ 10

11 ab Αντίσωμα AP-1 Activator protein 1 APC Antigen-presenting cell ARRE-1,2 Antigen Receptor Response Element 1,2 CaN Calcineurin CAT Chloramphenicol acetyltransferase CCR4,5,6,7 C-C chemokine receptor type 4,5,6,7 CD14+ Mονοκύτταρα CD19+ B λεμφοκύτταρα CD3+ T λεμφοκύτταρα CD4+ T βοηθητικά λεμφοκύτταρα, μακροφάγα, μονοκύτταρα, δενδριτικά κύτταρα CD4+CD25+ Ρυθμιστικά Τ λεμφοκύτταρα CD4+CD45RA+ Παρθενικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα CD4+CD45RO+ Μνημονικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα CD8+ T κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα ChIP Chromatin immunoprecipitation CLP Common lymphoid progenitor cells CM Culture medium CMP Common myeloid progenitors CMV Cytomegalovirus CpN Cyclophilin CREB camp response element binding protein CsA Cyclosporin A CSF Colony-stimulating factor CTLA-4 Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4 CXCR3 Chemokine (C-X-C motif) receptor 3 DMSO Dimethylsulfoxide EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay FACS Fluorescence-activated cell sorting FISH Fluorescence In Situ Hybridization FoxP3 forkhead box P3 11

12 HAART Ηighly Αctive Αntiretroviral Τherapy HDAC Histone deacetylases HIV Human Immunodeficiency virus HLA Human Leukocyte Antigen HRP Ηorseradish peroxidase ICAM-1 Intercellular Adhesion Molecule 1 IFN-γ Ιντερφερόνη γάμμα IL-2 Ιντερλευκίνη-2 LB Lurria Broth LFA-1 Lymphocyte function-associated antigen 1 LTRs Long terminal repeats MALT Mucosa-associated lymphoid tissue MHC Major Histocompatibility Complex NFAT Nuclear factor of activated T-cells NF-IL-6 Nuclear Factor-Interleukin-6 NF-κΒ Nuclear factor kappa-light-chainenhancer of activated B cells ΝΚ Natural killer cells NMR Nuclear Magnetic Regulation NRE Negative Response Element Oct-1 Octamer-binding protein 1 P/I PMA/Ionomicyn PBMCs Peripheral Blood Mononucleated Cells PBS Phosphate Buffered Saline PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate polii RNA polymerase II PRRE Purine Rich Respond Element PUd Distal purine-rich box RATS Repressor Activator Target Sequence RIPA buffer Radioimmunoprecipitation assay buffer SDS Sodium Dodecyl Sulfate SEM Standar error of mean 12

13 SSC TAR TBS TCFs TCR Th TNFs Saline-sodium citrate buffer Trans-activation Response Element Tris-buffered saline Ternary Complex Factors T Cell Receptor T βοηθητικά λεμφοκύτταρα Tumor Necrosis Factors 13

14 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 14

15 1. ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ [1,2] Το ανοσοποιητικό σύστημα είναι από τα πιο πολύπλοκα συστήματα του ανθρώπινου οργανισμού. Η φυσιολογική λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος έγκειται στην άμυνα του οργανισμού ενάντια στους παθογόνους παράγοντες. Οι περιπτώσεις αυτοάνοσων νοσημάτων και αλλεργιών οφείλονται στην ενεργοποίηση του συστήματος αυτού έναντι συστατικών του ίδιου του οργανισμού καθώς και ενάντια σε μη παθογόνους εξωτερικούς παράγοντες. Η ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος, φυσιολογικά, συμβαίνει σε περιπτώσεις όπου ο οργανισμός εκτίθεται σε ξένα σώματα όπως είναι τα μικρόβια και τα μακρομόρια, όπως πρωτεΐνες και πολυσακχαρίτες. Η άμυνα ενάντια στα μικρόβια επιτυγχάνεται αρχικά μέσω της έμφυτης ανοσίας (innate immunity) και αργότερα μέσω της προσαρμοζόμενης ανοσίας (adaptive immunity). Βασικά συστατικά της έμφυτης ανοσίας, που αποτελεί την πρώτη γραμμή άμυνας του οργανισμού, είναι: 1) φυσικά και χημικά εμπόδια που αποτρέπουν την είσοδο του μολυσματικού παράγοντα στον οργανισμό, όπως το επιθήλιο και οι αντιμικροβιακές ουσίες που εκκρίνονται από αυτό, 2) τα φαγοκυτταρικά κύτταρα, όπως ουδετερόφιλα και μακροφάγα, καθώς και τα κύτταρα φυσικοί δολοφόνοι (Natural killers-νκ cells), που επιτίθενται στους μολυσματικούς παράγοντες που εισέρχονται, τελικά στον οργανισμό (χωρίς να παρουσιάζουν κάποια ειδικότητα ως προς το είδος του αντιγόνου) 3) πρωτεΐνες του αίματος, εδώ περιλαμβάνονται τα μέλη του συμπλόκου του συμπληρώματος και άλλοι παράγοντες που συμμετέχουν στο σχηματισμό της φλεγμονής, 4) πρωτεΐνες που καλούνται κυτταροκίνες, οι οποίες ρυθμίζουν και συντονίζουν πολλές δραστηριότητες των κυττάρων που συμμετέχουν στην έμφυτη και στην προσαρμοζόμενη ανοσία. Οι μηχανισμοί της έμφυτης ανοσίας είναι ειδικοί για κοινές δομές μεταξύ μικροοργανισμών και άλλων παθογόνων παραγόντων καθώς στην έμφυτη ανοσία δεν υπάρχει εξειδίκευση στην αναγνώριση μεταξύ των διαφόρων αντιγόνων (Εικόνα 1). Σε αντίθεση με την έμφυτη ανοσία, υπάρχουν και άλλα είδη ανοσοαπόκρισης που διεγείρονται από την έκθεση του οργανισμού σε παθογόνους παράγοντες αυξάνοντας παράλληλα την αποτελεσματικότητα της απόκρισης σε κάθε έκθεση του οργανισμού στο ίδιο αντιγόνο. Αυτού του είδους οι ανοσοαποκρίσεις αποτελούν την 15

16 προσαρμοζόμενη ανοσία. Τα βασικά χαρακτηριστικά αυτής είναι, η ικανότητα διάκρισης και εξειδίκευσης σε κάθε αντιγόνο καθώς και η ικανότητα να «θυμάται» και να ανταποκρίνεται έντονα σε επαναλαμβανόμενες μολύνσεις από τον ίδιο παθογόνο παράγοντα. Άλλο χαρακτηριστικό της προσαρμοζόμενης ανοσίας είναι η ικανότητα αντίδρασης με μεγάλο αριθμό παθογόνων αλλά και μη παθογόνων παραγόντων. Η προσαρμοζόμενη ανοσία χαρακτηρίζεται συχνά και ως ειδική ανοσία καθώς παρουσιάζει την ιδιότητα της πλήρους διάκρισης μεταξύ μορίων και μικροβίων ακόμα και όταν αυτά παρουσιάζουν πολλές ομοιότητες μεταξύ τους. Τα «όργανα δράσης» αυτού του είδους ανοσίας, είναι τα λεμφοκύτταρα (T και Β λεμφοκύτταρα) (Εικόνα 1). Εικόνα 1: Η έμφυτη ανοσία λειτουργεί ως πρώτη γραμμή άμυνας ενάντια στη μόλυνση. Περιλαμβάνει διαλυτούς παράγοντες, όπως οι πρωτεΐνες του συμπληρώματος, τα κοκκιοκύτταρα (βασεόφιλα, ηωσινόφιλα και ουδετερόφιλα), τα μαστοκύτταρα, τα μακροφάγα, τα δενδριτικά κύτταρα και τα ΝΚ κύτταρα. Στην προσαρμοζόμενη ανοσία παρουσιάζεται καθυστέρηση στην ενεργοποίησή της και χαρακτηρίζεται από την μεγάλη διακριτική ικανότητα αναγνώρισης των αντιγόνων και την μνήμη. Σε αυτή συμμετέχουν τα αντισώματα, τα Β κύτταρα καθώς και τα βοηθητικά (CD4+) και κυτταροτοξικά (CD8+) T λεμφοκύτταρα. Τα ΝΚ καθώς και τα γδ Τ κύτταρα είναι λεμφοκύτταρα τα οποία διαμεσολαβούν στην σύνδεση μεταξύ έμφυτης και προσαρμοζόμενης ανοσίας [3]. 16

17 Το ανοσοποιητικό σύστημα των σπονδυλωτών αποτελείται από μια σειρά οργάνων, ιστών και κυττάρων που εμφανίζονται σε διάφορες περιοχές του σώματος. Όλα τα κύτταρα τα οποία σχετίζονται με το ανοσοποιητικό σύστημα προέρχονται από πολυδύναμα πρόδρομα κύτταρα (stem cells), που διαφοροποιούνται μέσω δύο κύριων κλάδων διαφοροποίησης (Εικόνα 2) : Του λεμφοκυτταρικού κλάδου, από τον οποίο προέρχονται τα λεμφοκύτταρα και, Του μυελωματικού κλάδου από όπου παράγονται τα φαγοκύτταρα και τα λοιπά κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Εικόνα 2: Από τα πολυδύναμα πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα (stem cells) προέρχονται οι δύο κλάδοι διαφοροποίησης των αιμοποιητικών κυττάρων, του λεμφοκυτταρικού κλάδου (CLP) από τον οποίο προέρχονται τα Τ και Β λεμφοκύτταρα, και του μυελωματικού κλάδου (CMP) από τον οποίο προέρχονται τα ερυθροκύτταρα, τα μεγακαρυοκύτταρα και αιμοπετάλια, τα κοκκιοκύτταρα (βασεόφιλα, ηωσινόφιλα και ουδετερόφιλα) και τα μακροφάγα (biochemninja.files.wordpress.com). Τα κύτταρα που εμπλέκονται στην ανοσολογική απόκριση είναι οργανωμένα σε ιστούς και όργανα ώστε να ασκούν τις λειτουργίες τους αποτελεσματικότερα. Αυτό το σύνολο ιστών και οργάνων αναφέρεται ως λεμφικό σύστημα ενώ διακρίνεται σε πρωτογενείς και δευτερογενείς λεμφικούς ιστούς και όργανα (Εικόνα 3). 17

18 Στα πρωτογενή λεμφικά όργανα ανήκουν τα όργανα τα οποία σχετίζονται με την ανάπτυξη των λεμφοκυττάρων. Εδώ ανήκει ο δίλοβος θύμος αδένας, στον οποίο τα αρχέγονα κύτταρα του λεμφοκυτταρικού κλάδου πολλαπλασιάζονται και διαφοροποιούνται σε λειτουργικά T λεμφοκύτταρα, ενώ τα Β λεμφοκύτταρα διαφοροποιούνται στο ήπαρ του εμβρύου. Αργότερα, κατά την ανάπτυξη του εμβρύου, αλλά και μετά την γέννησή του, η διαφοροποίηση και ωρίμανση των Β- λεμφοκυττάρων γίνεται στον μυελό των οστών. Σε αυτά τα λεμφικά όργανα τα λεμφοκύτταρα αποκτούν τους ειδικούς αντιγονικούς τους υποδοχείς που θα τα κάνουν ικανά να ανταπεξέλθουν σε ένα μεγάλο αριθμό αντιγόνων κατά την διάρκεια της ζωής του ατόμου. Επίσης σε αυτά τα όργανα τα λεμφοκύτταρα υφίστανται διαδικασίες επιλογής ώστε να αποκτήσουν ανοχή στα αυτοαντιγόνα, δηλαδή στα διάφορα συστατικά (πρωτεΐνες κ.α) του ίδιου του οργανισμού. Στα δευτερογενή λεμφικά όργανα ανήκουν ο σπλήνας, ο οποίος είναι υπεύθυνος για τα αντιγόνα που μεταφέρονται με την ροή του αίματος, τα λεμφογάγγλια, που προστατεύουν τον οργανισμό από αντιγόνα τα οποία μεταφέρονται από το δέρμα ή από εσωτερικές επιφάνειες, και τέλος ιστοί που σχετίζονται με βλεννογόνες επιφάνειες (MALT, Mucosa Associated Lymphoid Tissue). Στους τελευταίους ανήκουν οι αμυγδαλές και οι πλάκες του Payer στον ειλεό. Τα λεμφοκύτταρα μεταναστεύουν από τα πρωτογενή λεμφικά όργανα στα δευτερογενή, τα οποία παρέχουν το κατάλληλο περιβάλλον για την αλληλεπίδραση των λεμφοκυττάρων με διάφορα αντιγόνα και άλλα κύτταρα. Έτσι τα λεμφοκύτταρα μπορούν και έρχονται σε επαφή με τα διάφορα αντιγόνα με αποτέλεσμα να ενεργοποιούνται και να εκκρίνουν αντισώματα στην κυκλοφορία (Β κύτταρα). Στην παρούσα διδακτορική διατριβή θα αναφερθούμε σε γεγονότα που σχετίζονται με τα Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα και συγκεκριμένα με μοριακούς μηχανισμούς που πραγματοποιούνται στα κύτταρα αυτά κατά την φάση ενεργοποίησής τους με φυσικούς ή τεχνητούς τρόπους. Στο πρώτο μέρος της εργασίας αυτής θα αναφερθούμε εκτενέστερα στα Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα και στους δύο πιο σημαντικούς υποπληθυσμούς τους, τα παρθενικά και τα μνημονικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα καθώς και στην ιντερλευκίνη-2, μία κυτταροκίνη που εκκρίνεται χαρακτηριστικά από τα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα, όταν αυτά ενεργοποιηθούν [4]. Στο δεύτερο μέρος θα αναφερθούμε στον ιό HIV-1 και στον τρόπο δράσης του στα Τ λεμφοκύτταρα ενώ στο τρίτο μέρος θα ασχοληθούμε με τον 18

19 μεταγραφικό παράγοντα Ets-2 και στον τρόπο δράσης του στην μεταγραφική δραστηριότητα του HIV-1 και του γονιδίου της IL-2. Εικόνα 3: Πρωτογενείς και δευτερογενείς λεμφικοί ιστοί. Στους πρώτους ανήκουν ο θύμος αδένας και ο μυελός των οστών. Στους δευτερογενείς λεμφικούς ιστούς ανήκουν μεταξύ άλλων ο σπλήνας, οι λεμφαδένες, οι αμυγδαλές και οι πλάκες του Payer. ( 19

20 Μέρος 1 ο 20

21 1.1 T ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ (T cells) [1,2,5] Όπως αναφέραμε και πιο πάνω, τα Β και T λεμφοκύτταρα προέρχονται από τον λεμφοκυτταρικό κλάδο διαφοροποίησης και είναι τα κύρια όργανα δράσης της προσαρμοζόμενης ανοσίας. Γενικά, τα λεμφοκύτταρα είναι τα κύτταρα τα οποία αναγνωρίζουν ειδικά τα αντιγόνα και ανταποκρίνονται ενάντια σε αυτά και για αυτό το λόγο αποτελούν τους διαμεσολαβητές της χυμικής και της κυτταρικής ανοσίας. Ως χυμική ανοσία αναφέρεται η παραγωγή αντισωμάτων που κυκλοφορούν στο αίμα και είναι ικανά να αναγνωρίζουν έναν παθογόνο παράγοντα ο οποίος εισβάλλει στο σώμα. Ο τύπος αυτός ανοσίας σχετίζεται με την δραστηριότητα των Β λεμφοκυττάρων. Η κυτταρική ανοσία, από την άλλη, επιτυγχάνεται με το σχηματισμό μεγάλου αριθμού εξειδικευμένων κυττάρων, και συγκεκριμένα Τ λεμφοκυττάρων, που ευαισθητοποιούνται ειδικά προς τον ξένο παράγοντα. Αναγνωρίζουμε δύο τύπους λεμφοκυττάρων οι οποίοι διαφέρουν ως προς τον τρόπο που αναγνωρίζουν τα αντιγόνα καθώς και ως προς την λειτουργία τους. Συνοπτικά, έχουμε τα Β λεμφοκύτταρα, τα οποία αναγνωρίζουν μεμβρανικά και εξωκυτταρικά αντιγόνα και διαφοροποιούνται σε πλασματοκύτταρα λειτουργώντας σαν διαμεσολαβητές της χυμικής ανοσίας και τα Τ λεμφοκύτταρα που αναγνωρίζουν τα ενδοκυτταρικά αντιγόνα των μικροβίων και ο ρόλος τους είναι η καταστροφή των μικροβίων ή και ολόκληρων των μολυσμένων κυττάρων. Οι αντιγονικοί υποδοχείς τους είναι μεμβρανικά μόρια που μοιάζουν δομικά με τα αντισώματα που παράγονται από τα Β λεμφοκύτταρα. Τα Τ λεμφοκύτταρα παρουσιάζουν μια ειδικότητα καθώς αναγνωρίζουν μόνο πεπτίδια τα οποία βρίσκονται προσκολλημένα σε πρωτεΐνεςξενιστές οι οποίες κωδικοποιούνται από γονίδια του κύριου συμπλόκου ιστοσυμβατότητας (MHC) και είναι τοποθετημένες στις επιφάνειες των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων (APC). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τα Τ λεμφοκύτταρα να αναγνωρίζουν και να ανταποκρίνονται σε αντιγόνα τα οποία σχετίζονται με την κυτταρική επιφάνεια και όχι με διαλυτά αντιγόνα. Στα APC κύτταρα ανήκουν τα μακροφάγα, τα δενδριτικά κύτταρα και τα Β λεμφοκύτταρα. Έχουν αναγνωριστεί δύο κύριες κατηγορίες T λεμφοκυττάρων, τα T βοηθητικά ή CD4+ λεμφοκύτταρα (T helper cells) και τα T κυτταροτοξικά ή CD8+ λεμφοκύτταρα (T cytotoxic cells). Ο ρόλος των κυτταροτοξικών κυττάρων είναι η θανάτωση 21

22 μολυσμένων κυττάρων που παράγουν αντιγόνα. Από την άλλη, τα βοηθητικά T λεμφοκύτταρα, σε απόκριση στην αντιγονική διέγερση, εκκρίνουν κυτταροκίνες, ο ρόλος των οποίων είναι η διέγερση του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των T κυττάρων καθώς και άλλων κυττάρων που συμμετέχουν στην διαδικασία της ανοσοαπόκρισης, όπως των Β λεμφοκυττάρων, των μακροφάγων και άλλων λευκοκυττάρων. Μία άλλη σημαντική κατηγορία Τ λεμφοκυττάρων αποτελούν και τα ρυθμιστικά Τ λεμφοκύτταρα (Τregs). Τα κύτταρα αυτά παίζουν σημαντικό ρόλο στην διατήρηση της ομοιόστασης και την αναστολή της ανοσοαπόκρισης, όποτε αυτή απαιτείται, ώστε να αποφεύγονται παθολογικές καταστάσεις όπως η ανάπτυξη αυτοάνοσων νοσημάτων [6]. Τα κύτταρα αυτά εκφράζουν στην επιφάνειά τους τον υποδοχέα CD25, έναν τύπου άλφα αλυσίδας υποδοχέα της IL-2 [7]. Σε αυτά τα κύτταρα, σημαντικό ρόλο για την ανάπτυξη και την λειτουργία τους παίζει ο μεταγραφικός παράγοντας FoxP3 (forkhead box P3), που χρησιμοποιείται και ως δείκτης για τον προσδιορισμό και διαχωρισμό του υποπληθυσμού αυτού Τ λεμφοκυττάρων από τους υπόλοιπους λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς [8] Βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα (CD4+) Τα CD4+ βοηθητικά T λεμφοκύτταρα (T H ) διακρίνονται σε δύο κατηγορίες ανάλογα με τον τύπο των κυτταροκινών που εκκρίνουν [9]. Τα Th1 λεμφοκύτταρα εκκρίνουν, κυρίως, τις κυτταροκίνες ιντερφερόνη-γ (IFNγ) αλλά και τον παράγοντα νέκρωσης όγκων β (Tumor necrosis factor-tnf-β), την ιντερλευκίνη-2 (IL-2) και την λυμφοτοξίνη. Τα κύτταρα αυτά επάγουν τις προφλεγμονώδεις αντιδράσεις (επαγωγή φλεγμονής) της ανοσολογικής απόκρισης και συμμετέχουν στις καθυστερημένου τύπου αντιδράσεις υπερευαισθησίας και στην επαγωγή της παραγωγής από τα Β κύτταρα ΙgG αντισωμάτων. Τα Th2 λεμφοκύτταρα εκκρίνουν κυρίως τις κυτταροκίνες IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 καθώς και την IL-13, και επάγουν τις αντιφλεγμονώδεις ανοσολογικές αντιδράσεις (καταστολή φλεγμονής). Τα Th2 κύτταρα έχει δειχθεί ότι είναι απαραίτητα για την παραγωγή από τα Β κύτταρα των IgG, IgA και κυρίως των IgE αντισωμάτων [10]. Οι δύο αυτές κατηγορίες των βοηθητικών T λεμφοκυττάρων παρουσιάζουν μία ανταγωνιστική δράση καθώς οι κυτταροκίνες που εκκρίνει η μία κατηγορία των Th 22

23 κυττάρων δρουν ανασταλτικά στην έκκριση των κυτταροκινών της άλλης κατηγορίας κυττάρων. Μέχρι σήμερα μεγάλο εύρος Th υποπληθυσμών έχει αναφερθεί, ο διαχωρισμός των οποίων γίνεται με βάση τους εξωκυτταρικούς παράγοντες στους οποίους αποκρίνονται και τους μεταγραφικούς παράγοντες την έκφραση των οποίων επάγουν (Εικόνα 4). Εικόνα 4: Τ H υποπληθυσμοί και οι κυτταροκίνες από τις οποίες επάγονται Παρθενικά (naïve) Th λεμφοκύτταρα Τα παρθενικά (naïve) Th λεμφοκύτταρα είναι λεμφοκύτταρα τα οποία έχουν περάσει την διαδικασία ωρίμανσης στο θύμο αδένα, εξέρχονται από αυτόν στην κυκλοφορία αλλά δεν έχουν ενεργοποιηθεί καθώς δεν έχουν «συναντήσει» κάποιο αντιγόνο. Όταν τα παρθενικά T λεμφοκύτταρα ενεργοποιηθούν από κάποιο αντιγόνο τότε διαφοροποιούνται σε λειτουργικά T βοηθητικά λεμφοκύτταρα [11]. Το είδος αυτό των κυττάρων φέρει συγκεκριμένους δείκτες επιφανείας καθώς και διαφορετικό πρότυπο επανακυκλοφορίας από αυτό των ενεργοποιημένων κυττάρων. Τα κύτταρα αυτά εκφράζουν L-selectin (CD62L), τον CC υποδοχέα 7 των 23

24 χημειοκινών (CCR7) και την αlβ2 ιντεργκρίνη LFA-1 (leukocyte function antigen- 1). Τα μόρια αυτά παίζουν σημαντικό ρόλο στην μετακίνηση, προσκόλληση και εξαγγείωση των κυττάρων αυτών στα ενδοθηλιακά φλεβίδια των περιφερειακών λεμφικών ιστών και οργάνων. Τα περισσότερα ανθρώπινα παρθενικά T λεμφοκύτταρα εκφράζουν μία ισομορφή ενός επιφανειακού μορίου 200kD το οποίο ονομάζεται CD45, που περιέχει ένα τμήμα που κωδικοποιείται από ένα εξώνιο που έχει χαρακτηριστεί με το γράμμα Α. Επειδή αυτά τα κύτταρα μπορούν να αναγνωριστούν αφού αντιδρούν με αντισώματα ειδικά για αυτό το τμήμα που κωδικοποιείται από το εξώνιο Α καλούνται CD45RA (RA-restricted A) κύτταρα [12,13] Μνημονικά (memory) Τh λεμφοκύτταρα Τα μνημονικά (memory) T λεμφοκύτταρα είναι ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα τα οποία έχουν αναγνωρίσει ένα αντιγόνο, έχουν ενεργοποιηθεί και παραμένουν στον οργανισμό και μετά το πέρας της μόλυνσης. Όταν ο οργανισμός συναντήσει το ίδιο αντιγόνο τότε τα μνημονικά κύτταρα δρουν πιο γρήγορα εναντίον του, από ότι τα παρθενικά T λεμφοκύτταρα [14]. Όσον αφορά τους υποδοχείς τους, σε σύγκριση με τα παρθενικά T λεμφοκύτταρα, τα μνημονικά, εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα μορίων τα οποία σχετίζονται με την προσκόλληση, όπως ιντεγκρίνες και το μόριο CD44, τα οποία προωθούν την μετανάστευση των μνημονικών λεμφοκυττάρων προς την περιοχή που έχει εμφανιστεί κάποια μόλυνση. Δύο κατηγορίες CD4 μνημονικών λεμφοκυττάρων έχουν αναγνωριστεί στον άνθρωπο. Τα κεντρικά μνημονικά λεμφοκύτταρα (central memory cells) τα οποία εκφράζουν CCR7 και CD62L, και παραμένουν στα λεμφικά όργανα ενώ εκφράζουν IL-2 μετά από την ενεργοποίησή τους. Κάποια από αυτά έχει δειχθεί ότι μεταναστεύουν στην περιοχή της φλεγμονής με βάση την έκφραση των υποδοχέων των χημειοκινών όπως CCR4, CCR6, και CXCR3. Η άλλη κατηγορία χαρακτηρίζεται ως δραστικά μνημονικά κύτταρα (effector memory cells) (CCR7-) και εκκρίνουν IFN-γ και IL-4 μετά την ενεργοποίησή τους [14, 15]. Σε αντίθεση με τα παρθενικά Th λεμφοκύτταρα, τα μνημονικά Th λεμφοκύτταρα εκφράζουν μία ισομορφή του CD45 μορίου 180kD αφού το mrna του εξωνίου Α έχει υποστεί διαφορετική ωρίμανση. Αυτά καλούνται CD45RO κύτταρα. 24

25 1.2 ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ CD4 T ΚΥΤΤΑΡΩΝ [1,2,16,17] Η ενεργοποίηση των παρθενικών Τ λεμφοκυττάρων αποτελεί το πιο κρίσιμο βήμα για την ανάπτυξη της ανοσίας. Για την επιτυχή ενεργοποίηση αυτών απαιτείται ένα σύνολο αλληλεπιδράσεων μεταξύ του TCR υποδοχέα (T cell receptor), συνυποδοχέων και άλλων επιφανειακών μορίων του Τ λεμφοκυττάρου με τους αντίστοιχους προσδέτες του αντιγονοπαρουσιαστικού κυττάρου APC. Η αλληλεπίδραση TCR-αντιγόνου με το MHC αποτελεί το πρώτο βήμα Εικόνα 5: Απαραίτητα επιφανειακά μόρια για την ενεργοποίηση του Τ λεμφοκυττάρου. αντιγονοαναγνώρισης και μέσω αυτής της αλληλεπίδρασης ξεκινάει μία σειρά ενδοκυτταρικών μηχανισμών μεταγωγής σήματος (Εικόνα 5). Οι συνυποδοχείς, όπως CD4 και CD8, του Τ κυττάρου βοηθούν στην μεταγωγή σήματος μέσω του TCR υποδοχέα. Άλλα επιφανειακά μόρια όπως το CD28 και το CTLA-4 ξεκινούν μία σειρά άλλων ενδοκυτταρικών σημάτων που ενισχύουν ή τροποποιούν τα σήματα που προέρχονται από τον TCR υποδοχέα [16]. Ο TCR υποδοχέας δεν δρα μόνος του για την μεταγωγή σήματος μέσα στο κύτταρο αλλά αλληλεπιδρά με ένα σύμπλοκο διαμεμβρανικών πρωτεϊνών, γνωστό ως CD3 που ενισχύει την μεταγωγή σήματος που προέρχεται από το σύμπλοκο πεπτιδίου- MHC. Αυτοί οι μηχανισμοί που αναφέραμε επάγουν το Τ κύτταρο να πολλαπλασιαστεί και να διαφοροποιηθεί σε δραστικό (effector) T κύτταρο. Με την προσκόλλησή του στο αντιγονοπαρουσιαστικό κύτταρο, το Τ κύτταρο αυξάνει την δύναμη της πρόσδεσής του μέσω της ενεργοποίησης της LFA-1 πρωτεΐνης. Η ενεργοποιημένη αυτή, πια, πρωτεΐνη, συνδέεται ισχυρά στον αντίστοιχο προσδέτη της στο αντιγονοπαρουσιαστικό κύτταρο, ο οποίος είναι η ICAM-1 (intracellular adhesion molecule 1). Αυτή η ενισχυμένη σύναψη Τ αντιγονοπαρουσιαστικού κυττάρου βοηθάει το πρώτο να παραμείνει προσδεδεμένο έως ότου ενεργοποιηθεί. Η ενεργοποίηση του Τ κυττάρου ελέγχεται από αρνητική ανατροφοδότηση. Κατά την διάρκεια της διαδικασίας ενεργοποίησης το Τ κύτταρο εκφράζει ένα άλλο μόριο επιφανείας το CTLA-4, ο ρόλος του οποίου είναι να και 25

26 αναστείλει την ενδοκυτταρική μεταγωγή σήματος. Το μόριο αυτό μοιάζει δομικά με το CD28 αλλά προσδένεται στην B7 πρωτεΐνη του αντιγονοπαρουσιαστικού κυττάρου με μεγαλύτερη συγγένεια από ότι το CD28. Με αυτό τον τρόπο ελέγχεται η διαδικασία της ενεργοποίησης. Τα περισσότερα δραστικά Τ κύτταρα που έχουν διαφοροποιηθεί κατά την διάρκεια μιας ανοσοαπόκρισης, πρέπει να εξαλειφθούν μετά το πέρας αυτής. Καθώς τα επίπεδα του αντιγόνου και η ένταση της απόκρισης μειώνεται, λόγω της έλλειψης των αντιγονικών ερεθισμάτων και της μείωσης της έκκρισης κυτταροκινών, που είναι απαραίτητες για την επιβίωσή τους, τα Τ κύτταρα οδηγούνται σε απόπτωση. Τα μόνο που συνεχίζουν να υπάρχουν είναι τα μνημονικά Τ κύτταρα [16,17,18]. Εικόνα 6: Η αναγνώριση του συμπλόκου MHC-πεπτιδίου από έναν ΤCR υποδοχέα Τ κυττάρου και η πρόσδεση του επιφανειακού μορίου B7-1 (CD80) ή B7-2 (CD86) στον CD28 υποδοχέα οδηγεί στην ενεργοποίηση του Τ κυττάρου, στην έκκριση κυτταροκινών, στον πολλαπλασιασμό και την διαφοροποίησή του. Μετά την ενεργοποίηση του Τ κυττάρου και την έκφραση του CTLA-4, η σύνδεση του δεύτερου με τον TCR οδηγεί στην παύση της διαδικασίας ενεργοποίησης του Τ κυττάρου [17]. 26

27 1.3 ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΕΣ [1,2] Οι κυτταροκίνες (cytokines) είναι μικρού μοριακού βάρους διαλυτές πρωτεΐνες ή γλυκοπρωτεΐνες που εκκρίνονται από μεγάλη ποικιλία κυττάρων και μπορούν να αλλάξουν την συμπεριφορά του ίδιου του κυττάρου που τις εκκρίνει, καθώς και άλλων κυττάρων. Η ουσιαστική λειτουργία των κυτταροκινών είναι ο συντονισμός τις λειτουργίας πολλών διαφορετικών κυττάρων που συμμετέχουν στην ανοσολογική αντίδραση. Εμπλέκονται στην επικοινωνία μεταξύ των κυττάρων κατά την διάρκεια της ανοσοαπόκρισης. Κάποιες από τις πιο κοινές κυτταροκίνες είναι οι ιντερλευκίνες, οι ιντερφερόνες, οι παράγοντες νέκρωσης των όγκων (TNF), οι αυξητικοί παράγοντες (GF), οι παράγοντες διέγερσης αποικιών (CSF) και οι χημειοκίνες. Τα μονοκύτταρα/φαγοκύτταρα και τα T λεμφοκύτταρα, ειδικότερα τα βοηθητικά T λεμφοκύτταρα, αποτελούν τις κύριες κατηγορίες κυττάρων που εκκρίνουν κυτταροκίνες. Ο τρόπος δράσης των κυτταροκινών διακρίνεται σε αυτοκρινή (autocrine) κατά τον οποίο οι κυτταροκίνες προσδένονται σε υποδοχείς του ίδιου του κυττάρου που τις εκκρίνει, σε παρακρινή (paracrine) όπου προσδένονται σε υποδοχείς κυττάρωνστόχων που βρίσκονται κοντά στο κύτταρο το οποίο τις εκκρίνει και τέλος σε ενδοκρινή (endocrine) στον οποίο οι κυτταροκίνες προσδένονται σε υποδοχείς κυττάρων τα οποία βρίσκονται μακριά από το κύτταρο το οποίο τις εκκρίνει. Οι κυτταροκίνες προσδένονται σε ειδικούς υποδοχείς οι οποίοι βρίσκονται προσδεδεμένοι στην επιφάνεια των κυττάρων. Στην πιο απλή μορφή του ένας τέτοιος υποδοχέας σχηματίζει ένα ομοδιμερές όταν ενωθεί με μια κυτταροκίνη. Οι κυτταροπλασματικές περιοχές των υπομονάδων από τις οποίες αποτελούνται αυτοί οι υποδοχείς αλληλεπιδρούν, στην συνέχεια, με μία ομάδα μορίων που ονομάζονται Jak κινάσες. Ο ενεργοποιημένος υποδοχέας με την σειρά του φωσφορυλιώνει την Jak κινάση με αποτέλεσμα την ενεργοποίησή της με τέτοιο τρόπο που έχει σαν αποτέλεσμα την μεταβίβαση του μηνύματος που φέρει η κυτταροκίνη στο εσωτερικό του κυττάρου. Με αυτό τον τρόπο οι κινάσες συμβάλλουν στην σύνδεση του σήματος που φέρουν οι κυτταροκίνες με την μεταμεταφραστική τροποποίηση (φωσφορυλίωση) μιας σειράς μορίων-πρωτεϊνών του κυττάρου που συμβάλλουν στην μεταφορά του σήματος της κυτταροκίνης στον πυρήνα. Η διαδικασία αυτή είναι 27

28 γνωστή ως μεταγωγή σήματος (Eικόνα 7). Τέτοιες πρωτεΐνες μπορούν να δρουν απ ευθείας στο DNA του κυττάρου, κάτι που μπορεί να οδηγήσει σε μία σειρά αλλαγών στην συμπεριφορά του (πολλαπλασιασμός, διαφοροποίηση, κυτταρική απόπτωση κ.α) [20]. Η έκκριση και δράση των κυτταροκινών ελέγχεται από διάφορους ρυθμιστικούς παράγοντες που δρουν είτε στο επίπεδο του DNA είτε στο επίπεδο της πρωτεΐνης. Εικόνα 7: Ενεργοποίηση του Jak-STAT μονοπατιού που προκαλείται από την πρόσδεση μιας κυτταροκίνης στον αντίστοιχο υποδοχέα της στο κύτταρο. Με την πρόσδεση της κυτταροκίνης στον υποδοχέα της επάγεται διμερισμός ή πολυμερισμός των πολυπεπτιδίων του υποδοχέα, στην επιφάνεια του κυττάρου, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των ενδοκυτταρικών οδών σηματοδότησης που ξεκινούν με την φωσφορυλίωση τόσο της JAK όσο και της STAT πρωτεΐνης [20]. Γενικά οι κυτταροκίνες διακρίνονται σε προφλεγμονώδεις και αντιφλεγμονώδεις (Εικόνα 8). Αν και σε κάθε κυτταροκίνη αποδίδεται συγκεκριμένη δράση, είναι δύσκολο να γίνει διαχωρισμός της λειτουργίας μιας επιμέρους κυταροκίνης από τις υπόλοιπες. Το τελικό αποτέλεσμα δράσης της κάθε κυτταροκίνης εξαρτάται από τις υπόλοιπες κυτταροκίνες και τους μεσολαβητές, από 28

29 την έκφραση και συγγένεια ειδικών για την κυτταροκίνη υποδοχέων σε κύτταραστόχους και την συνολική κατάσταση ενεργοποίησης του κυττάρου-στόχου. Ένα διαδεδομένο σύστημα ταξινόμησης των κυτταροκινών βασίζεται στην λειτουργία τους. Έτσι αναγνωρίζονται οι ανοσορυθμιστικές κυτταροκίνες (IFN-γ, IL-2, IL-4, IL- 5, IL-7, IL-9 έως IL-18), οι κυτταροκίνες που ρυθμίζουν τη φλεγμονή (TNF-a, IL-6, IL-1, IL1ra, IL-4, IL-10, IL-13) και οι κυτταροκίνες με δράση αυξητικών παραγόντων (GM-CSF, G-CSF, M-CSFIL-3, PDGF, EGF, FGF, TGF) [19]. Εικόνα 8: Χάρτης κυτταροκινών και τα κύτταρα τα οποία τις εκκρίνουν (SA.Biosciences) 29

30 1.3.1 Ιντερλευκίνες [1,2] Όπως έχουμε είδη αναφέρει μία κατηγορία κυτταροκινών είναι οι ιντερλευκίνες. Οι ιντερλευκίνες συμβάλλουν στην επικοινωνία μεταξύ των λευκοκυττάρων. Μέχρι σήμερα έχουν αναγνωριστεί 18 ιντερλευκίνες από τις οποίες οι IL-1, IL-2, IL-4, IL-6 και IL-10 συμμετέχουν στην ρύθμιση της ανοσολογικής απάντησης Ιντερλευκίνη-2 (IL-2) Όπως αναφέρθηκε και πιο πάνω τα Τ βοηθητικά (CD4+) λεμφοκύτταρα παίζουν σημαντικό ρόλο στο ανοσοποιητικό σύστημα των θηλαστικών. Η ενεργοποίησή τους Εικόνα 9: Σε εν ηρεμία κατάσταση η IL-2 εκκρίνεται κυρίως από τα CD4+ T κύτταρα τα οποία έχουν ενεργοποιηθεί από ένα δενδριτικό κύτταρο που φέρει στην επιφάνειά του το σύμπλεγμα αντιγόνου/αυτοαντιγόνου-mhc II, στα δευτερογενή λεμφικά όργανα [25]. μέσω ισχυρής σύνδεσης του ΤCR υποδοχέα με το σύμπλοκο αντιγόνου-mhc II του APC, οδηγεί σε μία σειρά ενδοκυτταρικών μοριακών γεγονότων. Σε αυτά τα γεγονότα περιλαμβάνεται η ενεργοποίηση συγκεκριμένων μεταγραφικών παραγόντων όπως ο NF-κB, ο AP-1 και ο NFAT (nuclear factor of activated T cells) και η μετακίνησή τους από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα [21-23]. Το αποτέλεσμα αυτής της ενεργοποίησης είναι η ρύθμιση της έκφρασης μιας σειράς κυτταροκινών και άλλων γονιδίων όπως οι IL-2 (Εικόνα 9), IL-3, IL-4, TNF-α, IFN-γ και πολλά άλλα. Μεταξύ αυτών των κυτταροκινών μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζει η ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της ιντερλευκίνης 2 (IL-2), καθώς η IL-2 επάγει τα περιφερειακά Th0 λεμφοκύτταρα να εισέλθουν στην S φάση του κυτταρικού κύκλου με τελικό αποτέλεσμα την διαίρεσή τους [24]. Η σωστή ισορροπία στην λειτουργία των διαφόρων παραγόντων που συμμετέχουν στον έλεγχο της ρύθμισης της έκφρασης της IL-2 αποτελεί σημαντικό παράγοντα για την σωστή λειτουργία των Τ κυττάρων. Έλλειψη ισορροπίας στην λειτουργία αυτών των παραγόντων μπορεί να 30

31 οδηγήσει σε μη φυσιολογική έκφραση του γονιδίου της IL-2. Για παράδειγμα, η συνεχόμενη έκφραση της IL-2 από αδρανή Τ κύτταρα χωρίς εξωτερικό ερέθισμα ενεργοποίησης ή η μη έκφρασή της από ενεργοποιημένα κύτταρα, μπορεί να οδηγήσουν σε ανάπτυξη αυτοανοσίας ή στην απώλεια ανοσοαπόκρισης αντίστοιχα [25]. Η καταστολή ή ενεργοποίηση της έκφρασης του γονιδίου της IL-2 ελέγχεται από την πρόσδεση διαφόρων μεταγραφικών παραγόντων (ΑΡ-1, NF-kβ, Oct-1, NFAT) σε μία μικρή περιοχή του υποκινητή 300 περίπου βάσεων που βρίσκεται πριν από το σημείο έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου (Εικόνα 10) [21]. Κομβικό ρόλο στην μεταγωγή σήματος από την επιφάνεια του κυττάρου στον πυρήνα παίζει η ενδοκυτταρική αύξηση ιόντων Ca+ που οδηγεί σε αύξηση της ενεργότητας της φωσφατάσης καλσινευρίνης [26]. Η καλσινευρίνη με την σειρά της αποφωσφορυλιώνει κατάλοιπα σερίνης/θρεονίνης μεταγραφικών παραγόντων που σχετίζονται με την ενεργοποίηση του γονιδίου της IL-2 όπως ο NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells). Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα την μετακίνηση του NFAT από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα και την μεταγραφή του γονιδίου της IL-2 (Δείτε παρακάτω). Μέχρι σήμερα πολλές μελέτες έχουν γίνει και αναφέρονται στην ενεργοποίηση της έκφρασης της IL-2 ενώ λίγα γνωρίζουμε σχετικά με την καταστολή της έκφρασής της στο μεταγραφικό επίπεδο. Μέχρι τώρα αναγνωρίζουμε ότι αρνητική ρύθμιση της έκφρασης της IL-2 εμφανίζεται σε δύο στάδια. Το πρώτο είναι όταν τα Τ κύτταρα είναι αδρανή, πριν την έναρξη σηματοδότησης μέσω του TCR υποδοχέα, και το δεύτερο που πραγματοποιείται μετά την πρόσδεση του αντιγόνου στον TCR υποδοχέα, όπου πραγματοποιείται αναστολή της ενεργοποίησης ώστε να παύσει η έκφραση του γονιδίου της IL-2 και να σταματήσει η διαδικασία ενεργοποίησης του Τ κυττάρου [27,28]. Όλοι οι αρνητικοί ρυθμιστές της έκφρασης της IL-2, με κάποιες εξαιρέσεις όπως NFATp και NFAT4, δρουν με έμμεσο τρόπο στον υποκινητή της IL- 2. Για παράδειγμα ο μεταγραφικός παράγοντας FOXj1 καταστέλλει την έκφραση του NF-κΒ γεγονός που οδηγεί στην καταστολή της έκφρασης του IL-2 mrna [29]. Μελέτη που έγινε στον υποκινητή της IL-2 στο σύστημα ωοκυττάρων του βατράχου Xenopus με πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από ex vivo απομονωμένα T λεμφοκύτταρα ανέδειξαν πολλά στοιχεία που σχετίζονται με την καταστολή της έκφρασης του γονιδίου της IL-2 [30]. Τα πειράματα αυτά έδειξαν ότι η έκφραση του γονιδίου της IL-2 καταστέλλεται από πρωτεϊνικά εκχυλίσματα τα οποία έχουν απομονωθεί από εν ηρεμία παρθενικά CD4CD45RA κύτταρα (που έχουν 31

32 απομονωθεί από ολικό αίμα ή από αίμα από ομφάλιο λώρο), αλλά όχι από πρωτεϊνικά εκχυλίσματα που έχουν απομονωθεί από μνημονικά CD4CD45RO κύτταρα. Τα ίδια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν όταν στο σύστημα των ωοκυττάρων εισήγαγαν μόνο την PU-d αλληλουχία του υποκινητή. Η περιοχή που καλείται distal Purine-Rich Response Element (PU-d) ή Antigen Receptor Response Element (ARRE-2) (περιοχή -292 με -273bp) χρειάζεται για να επιτευχθεί η κατασταλτική δραστηριότητα στην έκφραση του γονιδίου της IL-2. Σε αυτή την περιοχή προσδένεται επίσης και ο NFAT. Μετά από ενεργοποίηση των παρθενικών Τ κυττάρων αυτή η κατασταλτική δραστηριότητα εξαφανίζεται και ένας ενεργοποιητής συντίθεται de novo. Μια σειρά πειραμάτων EMSA, µε αντισώματα έναντι διαφόρων µεταγραφικών παραγόντων, έδειξαν ότι το σύµπλοκο του ενεργοποιητή (εκτός του NFAT) περιέχει τους µεταγραφικούς παράγοντες FRA-2/JUN-D/NFAT ενώ αντίθετα κανένας από αυτούς τους παράγοντες δεν συμμετέχει στο σύµπλοκο του καταστολέα [30-32]. Όλα αυτά τα γεγονότα οδήγησαν στην υπόθεση ότι στα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα υπάρχει ένας ή περισσότεροι καταστολείς οι οποίοι προσδένονται στον υποκινητή της IL-2 και η κατασταλτική του/τους δράση εξαφανίζεται μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων αυτών. Εικόνα 10: Σχηματική αναπαράσταση των θέσεων δέσµευσης µεταγραφικών παραγόντων στον υποκινητή του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2. Pu-bp, Pu-bd: proximal and distal Purine Box, UPS : Upstream Promoter Site, TRE: TPA Response Element, TCEp TCEd: proximal, distal T Cell response Element, US1, US2/3: Upstream Site 1,2/3, ARRE-1/2: Antigen Receptor Response Element 1,2, Oct- 1/2: Octamer-1/2, CD28RE: CD28 Response Element, NF-AT: Nuclear Factor of Activated T cells [21]. 32

33 1.3.3 Κυκλοσπορίνη Α και ο ρόλος της στην μεταγραφή του γονιδίου της IL-2 Η κυκλοσπορίνη Α (CsA) είναι ένας µεταβολίτης των µυκήτων και χορηγείται σε µεταµοσχευμένους ασθενείς κυρίως λόγω της ικανότητας του φαρµάκου να αποτρέπει την απόρριψη µη συµβατών αλλογράφων του HLA (human leukocyte antigen) [33]. Η ανοσοκατασταλτική δράση της κυκλοσπορίνης Α πραγματοποιείται µέσω της αναστολής της έκκρισης των κυτταροκινών από τα Τ λεμφοκύτταρα. Έτσι είναι γνωστό ότι η CsA προκαλεί την καταστολή της έκφρασης της ιντερλευκίνης -2 και συγκεκριμένα στο επίπεδο της µεταγραφής [34]. Συγκεκριμένα η κυκλοσπορίνη (CsA) όταν βρεθεί στο κυτταρόπλασµα του κυττάρου προσδένεται στην κυκλοφιλίνη (CpN) σχηματίζοντας ένα σύµπλοκο. Το σύµπλοκο αυτό προσδένεται και αναστέλλει την δράση του ενζύµου καλσινευρίνης (CaN). Έτσι η CaN δεν μπορεί να αποφωσφορυλιώσει την κυτταροπλασµατική µορφή του παράγοντα NFAT (NFATc), με αποτέλεσµα να µην είναι δυνατή η µεταφορά του στον πυρήνα και η σύνδεσή του µε την πυρηνική µορφή του παράγοντα NFAT (NFATn). Το σύµπλοκο NFATc- NFATn, φυσιολογικά, προσδένεται στον υποκινητή του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 και επάγει την µεταγραφή του (Εικόνα 11). Με αυτό τον τρόπο επάγεται η αναστολή της έκφρασης της IL-2 από τα κύτταρα παρά την ύπαρξη εξωκυτταρικών σημάτων ενεργοποίησης [34,35]. Εικόνα 11: Σχηματική αναπαράσταση της δράσης της κυκλοσπορίνης Α στην έκφραση του γονιδίου της ΙL-2 ( 33

34 Μέρος 2 ο 34

35 2. HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS TYPE-1 (HIV-1) Ο HIV είναι ο ιός ο οποίος είναι υπεύθυνος για την ασθένεια του AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome). Έχουν αναγνωριστεί δύο τύποι του ιού (HIV type 1 and 2) οι οποίοι διαφέρουν μεταξύ τους ως προς την δομή του γονιδιώματος καθώς και στην αντιγονικότητα. Ο HIV τύπου 1 εμφανίζεται με μεγαλύτερη συχνότητα από αυτόν του τύπου 2 [36]. Όσον αφορά την δομή του, είναι ένας τυπικός δίκλωνος RNA ιός (ρετροϊός) με διάμετρο nm. Αποτελείται από μία πρωτεϊνική κάψουλα που στο εσωτερικό φέρει το γονιδίωμα (9,2 kb) του ιού, που συνίσταται από 9 γονίδια (Εικόνα 12). Τα πιο χαρακτηριστικά γονίδια του ιού είναι το γονίδιο gag (κωδικοποιεί μια κεντρική πρωτεΐνη του νουκλεοκαψιδίου), το γονίδιο pol, που κωδικοποιεί την αντίστροφη μεταγραφάση, την ιντεργκράση και τα ένζυμα (viral protease enzymes) που είναι απαραίτητα για την αντιγραφή του γονιδιώματος του ιού. Σημαντικό είναι και το γονίδιο env που κωδικοποιεί τις γλυκοπρωτεΐνες του φακέλου gp120 και gp40, που απαιτούνται για την μόλυνση των κυττάρων. Το ιικό γονιδίωμα περιλαμβάνει ακόμα 6 ρυθμιστικά γονίδια (tat, rev, vif, nef, vpr, vpu) των οποίων τα προϊόντα ρυθμίζουν την αναπαραγωγή του ιού με διάφορους τρόπους. Στα άκρα του γονιδιώματος υπάρχουν επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες LTRs (Long Terminal Repeats) που απαιτούνται για την εισαγωγή του ιικού γονιδιώματος στο γονιδίωμα του ξενιστή. Οι περιοχές αυτές ρυθμίζουν επίσης την έκφραση των γονιδίων του ιού, καθώς αποτελούν θέσεις πρόσδεσης πολλών μεταγραφικών παραγόντων τόσο του ιού όσο και του ξενιστή, ενώ παίζουνε ρόλο και στον πολλαπλασιασμό του [1]. Αυτό που αξίζει να αναφερθεί σχετικά µε την LTR αλληλουχία του ιού, είναι ότι έχουν αποµονωθεί από Μ στελέχη του ιού (αποτελεί το πιο εξαπλωμένο είδος του ιού [37]), LTR περιοχές που παρουσιάζουν ποικιλία στην νουκλεοτιδική τους αλληλουχία. Αυτή η ποικιλότητα στην LTR αλληλουχία µπορεί να είναι αποτέλεσµα προσαρµογής σε διαφορετικό κυτταρικό υπόβαθρο για την βελτιστοποίηση της µεταγραφής του ιού HIV. Οι περισσότερες από αυτές τις µεταλλάξεις στην LTR αλληλουχία εμφανίζονται σε συντηρημένες περιοχές πρόσδεσης για κυτταρικούς ή ιικούς µεταγραφικούς παράγοντες. Είναι ενδιαφέρον ότι παρόλες τις µεταλλάξεις και τις αλλαγές στις αλληλουχίες πρόσδεσης στην LTR, όλη αυτή η ποικιλία των 35

36 µεταλλαγµένων LTR είναι ικανή να επάγει, παρόλα αυτά, την µεταγραφική διαδικασία του ιού σε συγκεκριμένους τύπους κυττάρων-ξενιστών κάτι που αναδεικνύει την µεγάλη ελαστικότητα και προσαρμοστικότητα της κυτταρικής µεταγραφικής µηχανής [38-42]. Εικόνα 12: Το γονιδίωμα του ιού HIV-1. LTR (Long terminal repeats): αλληλουχίες απαραίτητες για την εισαγωγή του ιικού γονιδιώματος στο γονιδίωμα του ξενιστή, Gag: κωδικοποιεί πρωτεΐνες του νουκλεοκαψιδίου, Pol: κωδικοποιεί την αντίστροφη μεταγραφάση, την πρωτεάση, την νουκλεάση και την ιντεργκράση, Vif: κωδικοποιεί πρωτεΐνες απαραίτητες για την ενίσχυση της μολυσματικότητας των ιικών σωματιδίων, Vpr: κωδικοποιεί πρωτεΐνες που προάγουν την εισαγωγή του ιικού DNA στον πυρήνα του κυττάρου ξενιστή, Tat: κωδικοποιεί πρωτεΐνες απαραίτητες για την επιμήκυνση των ιικών μεταγράφων, Rev: πρωτεΐνες που προάγουν την έξοδο από τον πυρήνα ατελώς συνδεδεμένων ή μη συνδεδεμένων RNAs, Vpu: κωδικοποιεί πρωτεΐνες που καταστέλλουν την έκφραση του CD4 υποδοχέα και προάγουν την απελευθέρωση του ιού, Nef: κωδικοποιεί πρωτεΐνες που καταστέλλουν την έκφραση του CD4 υποδοχέα και προάγουν την απελευθέρωση του ιού από το κύτταρο-ξενιστή/ καταστέλλουν την έκφραση του MHCI στην επιφάνεια του κυττάρου-ξενιστή ( Κύτταρα-στόχοι για τον ιό είναι αυτά τα οποία φέρουν τον υποδοχέα CD4 (T λεμφοκύτταρα, μακροφάγα και δενδριτικά κύτταρα) καθώς και έναν ή και τους δύο συνυποδοχείς CXCR4 και CCR5. Η πορεία της ασθένειας σχετίζεται με την μείωση των CD4+ κυττάρων σε συνδυασμό με την αύξηση του φορτίου του ιού στον οργανισμό [43,44]. Η μόλυνση των κυττάρων από τον ιό (Εικόνα 13) ξεκινά με την πρόσδεση της γλυκοπρωτεΐνης του φακέλου (env-gp41/gp120), η οποία προσδένεται ταυτόχρονα στον CD4 υποδοχέα και σε έναν συνυποδοχέα της οικογένειας των χημειοκινών (CXCR4 και CCR5). Η σύνδεση της γλυκοπρωτεΐνης gp120 στον υποδοχέα CD4 προκαλεί αλλαγή στην διαμόρφωσή της που επάγει την gp120 να συνδεθεί και με τον συνυποδοχέα των χημειοκινών. Αυτό προκαλεί με την σειρά του την αλλαγή της διαμόρφωσης της γλυκοπρωτεΐνης gp41 η οποία εκβάλλει μία υδρόφοβη περιοχή (fusion peptide) η οποία εισέρχεται στην κυτταρική μεμβράνη του κυττάρου-στόχου και τελικά οδηγεί στην σύντηξη των μεμβρανών του κυττάρου και του ιού [45,46]. Από εκεί και πέρα ξεκινά ο κύκλος του ιού ενδοκυτταρικά. Με την είσοδο του ιικού 36

37 γονιδιώματος στο κύτταρο ενεργοποιούνται τα ένζυμα του νουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου και ξεκινά ο πολλαπλασιασμός του ιικού γονιδιώματος. Το πρώτο βήμα είναι η αντίστροφη μεταγραφή του ιικού γονιδιώματος από δίκλωνο RNA σε δίκλωνο DNA. Η διαδικασία αυτή συμβαίνει στο κυτταρόπλασμα. Στη συνέχεια το δίκλωνο ιικό DNA εισέρχεται στον πυρήνα του κυττάρου. Μαζί με το δίκλωνο DNA στον πυρήνα εισέρχεται και η ιντεργκράση η οποία καταλύει την ενσωμάτωση του ιικού γονιδιώματος στο γονιδίωμα του κυττάρου ξενιστή. Σε αυτή την φάση το ενσωματωμένο DNA του HIV καλείται προϊός. Ο προϊός μπορεί να παραμείνει μεταγραφικά ανενεργός για μεγάλο χρονικό διάστημα [1,2,47].. Εικόνα 13: Στάδια εισαγωγής του HIV-1 στο κύτταρο ξενιστή. Α. Μόρια απαραίτητα για την αναγνώριση (CD4) και προσκόλληση (gp120, gp41) του ιού στο κύτταρο ξενιστή [46]. B. Σχηματική αναπαράσταση του κύκλου ζωής του ιού HIV Προσκόλληση του ιού στο κύτταρο ξενιστή, 2. Σύντηξη της ιικής και κυτταρικής μεμβράνης και είσοδος των ιικών συστατικών στο κύτταρο, 3. Αποκάλυψη του ιικού γενώματος, 4. Έναρξη αντίστροφης μεταγραφής, 5. Εισαγωγή του ιικού DNA στον πυρήνα, 6. Ενσωμάτωση του ιικού DNA στο γονιδίωμα του κυττάρου ξενιστή, 7. Μεταγραφή του ιικού γονιδιώματος, 8. Έξοδος του ιικού mrna από τον πυρήνα, 9. Μετάφραση του ιικού mrna, 10. Σχηματισμός ιικών σωματιδίων, 11. Εκβλάστηση του ιοσώματος, 12. Απελευθέρωσή του από το κύτταρο ξενιστή και 13. ωρίμανσή του [47]. 37

38 2.1 Μοριακοί μηχανισμοί που ελέγχουν την έκφραση του HIV-1 Αισιοδοξία για την καταπολέμηση του HIV έφερε η εισαγωγή της αντιρετροϊκής θεραπείας υψηλής δραστικότητας-haart (highly active antiretroviral therapy) στα τέλη της δεκαετίας του 90'. Σκοπός της θεραπείας αυτής είναι η μείωση του ιικού φορτίου στους ασθενείς, η διατήρηση της φυσιολογικής λειτουργίας του ανοσοποιητικού συστήματος και η αποτροπή εμφάνισης ευκαιριακών λοιμώξεων που συχνά οδηγούν στον θάνατο [48]. Η θεραπεία αυτή περιλαμβάνει συνήθως 3 φάρμακα, 2 αναστολείς της αντίστροφης μεταγραφάσης (NRTIs-Nucleotide reversetranscriptase inhibitors) σε συνδυασμό με έναν αναστολέα πρωτεασών/αναστολέα ιντεγκρασών/αναστολέα μη νουκλεοσιδικής αντίστροφης μεταγραφάσης (PI/INSTI/NNRTI- Protease inhibitor/integrase strand transfer inhibitors/nonnucleoside reverse-transcriptase inhibitors) [49]. Παρά τις αρχικές ελπίδες ότι η λήψη της HAART θεραπείας θα μπορούσε να είναι ο τρόπος θεραπείας της νόσου, μετέπειτα μελέτες έδειξαν ότι η θεραπεία αυτή δεν μπορούσε να εξαλείψει τον ιό HIV-1 από το πλάσμα των ασθενών και το ιικό φορτίο μπορεί να ανιχνευτεί στους ασθενείς ακόμα και μετά από 7 χρόνια θεραπείας [50,51]. Η ανίχνευση του ιικού φορτίου οφείλεται στην ύπαρξη κυττάρων στον οργανισμό του ασθενή τα οποία λειτουργούν ως αποθήκες και ανατροφοδοτούν τον οργανισμό με νέα ιοσωμάτια [52]. Μέχρι σήμερα 3 είδη κυττάρων έχουν αναγνωριστεί ως τέτοιου είδους αποθήκες, τα εν ηρεμία Τ λεμφοκύτταρα, τα μακροφάγα και τα δενδριτικά κύτταρα. Όσον αφορά τα Τ λεμφοκύτταρα παρόλο που ιός μολύνει τόσο τα μνημονικά όσο και τα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα, τα εν ηρεμία παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα, που όπως αναφέραμε εκφράζουν το δείκτη CD45RA, δεν είναι τόσο δεκτικά στην έκφραση και πολλαπλασιασμό του ιού όσο τα μνημονικά CD45RO Τ λεμφοκύτταρα (Εικόνα 15) [53,54]. Η έκφραση του ιού συνδέεται σημαντικά με την ενεργοποίηση και πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων τα οποία έχουν μολυνθεί [55]. Η ρύθμιση της µεταγραφής των γονιδίων του HIV-1 ελέγχεται όπως έχουµε ήδη αναφέρει από την LTR περιοχή. Η 5 LTR αλληλουχία δρα για την επαγωγή της µεταγραφής του προϊικού γονιδιώµατος ενώ η 3 LTR απαιτείται για την πολυαδενυλίωση των µετάγραφων που προκύπτουν [56]. Η 5 LTR αλληλουχία χωρίζεται σε λειτουργικές περιοχές. Αυτές είναι η περιοχή TAR (transactivation response element), η βασική περιοχή (core region), η περιοχή του ενισχυτή (enhancer region) και η περιοχή των ρυθμιστικών στοιχείων (modulatory region) (Εικόνα 14). 38

39 Στην ΤΑR περιοχή προσδένεται ο ιικός trans-ενεργοποιητής tat ενώ η βασική περιοχή περιλαμβάνει τον εκκινητή (initiator-inr), την TATA αλληλουχία (TATA box promoter sequence) και τρεις περιοχές πρόσδεσης του µεταγραφικού παράγοντα Sp1. Στην περιοχή του ενισχυτή προσδένονται ο NF-κΒ και ο NFAT ενώ η ρυθµιστική περιοχή φέρει θέσεις για την πρόσδεση µιας σειράς κυτταρικών µεταγραφικών παραγόντων όπως του NF-IL-6 (Nuclear Factor-Interleukin-6), του µεταγραφικου παράγοντα CREB (camp response element binding protein), µεταγραφικών παραγόντων της οικογένειας ets και πυρηνικών υποδοχέων ορµονών [57-59]. Η έναρξη της µεταγραφικής δραστηριότητας των γονιδίων του HIV σχετίζονται µε την φυσιολογική ενεργοποίηση των T λεµφοκυττάρων από κάποιο αντιγόνο ή από κυτταροκίνες. Η συνάντηση του µολυσµένου Τ λεµφοκυττάρου µε κάποιο αντιγόνο προκαλεί την έξοδο του ιού από την φάση καταστολής και την έναρξη της παραγωγής των ιοειδών. Εικόνα 14: Διαγραμματική απεικόνιση της 5 -LTR αλληλουχίας του ιού HIV-1. Ο ιικός υποκινητής (LTR), διαχωρίζεται στις περιοχές U3, R, και U5. H περιοχή U3 διαχωρίζεται με την σειρά της σε τρείς χαρακτηριστικές περιοχές την ρυθμιστική περιοχή (Modulatory region), την περιοχή του ενισχυτή (Enhancer region) και την βασική περιοχή (Core region). Στην εικόνα παρουσιάζονται και περιοχές πρόσδεσης συγκεκριμένων μεταγραφικών παραγόντων ( Η LTR αλληλουχία του HIV-1 εμπεριέχει πολλές περιοχές πρόσδεσης διαφόρων μεταγραφικών παραγόντων του κυττάρου ξενιστή [60]. Αναφέραμε ήδη ότι η περιοχή του ενισχυτή του HIV-1-LTR περιέχει δύο γειτονικές περιοχές πρόσδεσης του NF-κB (-109 με -79) που παίζουν σημαντικό ρόλο στην επαγωγή της έκφρασης του ιικού γονιδιώματος [61]. Πολλές μελέτες προτείνουν ότι ο HIV-1 χρησιμοποιεί αυτές τις συντηρημένες περιοχές πρόσδεσης του NF-κB για να ενισχύσει τον πολλαπλασιασμό του μέσα στο κύτταρο ξενιστή [62]. Ένα τυπικό NF-κB ετεροδιμερές αποτελείται από μία p50 και μια p65/rela πρωτεΐνη και μπορεί και προσδένεται σε αυτή την περιοχή 39

40 του ενισχυτή [63]. Από την άλλη ένα ομοδιμερές που σχηματίζεται μόνο από την p50 και αλληλεπιδρά με την αποακετυλάση (HDAC1), και όπως έχει δειχθεί σε πειράματα που έγιναν σε Τ κυτταρικές σειρές παρουσιάζει, σε αντίθεση με το ετεροδιμερές, κατασταλτική δράση στην έκφραση του ιού και συμβάλλει έτσι στο να παραμένει ο ιός σε λανθάνουσα φάση [64]. Στην LTR αλληλουχία εκτός από περιοχές πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων που επάγουν την έκφραση του ιού, όπως ο NFAT και NFkΒ, έχουν αναγνωριστεί και περιοχές στις οποίες προσδένονται άλλες πρωτεΐνες του κυττάρου ξενιστή που οδηγούν στην καταστολή της έκφρασης αυτού. Κάποιοι από αυτούς τους μεταγραφικούς παράγοντες οι οποίοι καταστέλλουν την έκφραση του ιού που έχουν αναγνωριστεί είναι ο CBF-1 [65], STAT5 [66], MBP-1 [67], FOXP3 [68] και πιο πρόσφατα ο ZBRK1 [69]. Η απόκριση του ιού HIV-1 στην ενεργοποίηση του κυττάρου μοιάζει αρκετά με αυτή του γονιδίου της IL-2. Στην Τ λευχαιμική σειρά Jurkat αυτή η απόκριση ελέγχεται από την πρόσδεση του μεταγραφικού παράγοντα NFAT στην περιοχή του LTR του HIV-1 που καλείται PRRE (Purine Rich Respond Element) [70]. Η περιοχή αυτή, που εκτείνεται από το -279 έως -250, περιλαμβάνεται στην NRE (Negative Response Element) αλληλουχία της LTR αλληλουχίας του HIV-1 που εκτείνεται από το -340 έως το -185bp από το σημείο έναρξης της μεταγραφής [71]. Έλλειµµα της PRRE περιοχής από τον LTR έχει ως αποτέλεσµα την αύξηση της µεταγραφής του HIV-1 στην Jurkat κυτταρική σειρά [72], ενώ ένθεση ενός αντιγράφου του PRRE στο πλαίσιο ενός υβριδικού υποκινητή είχε ως αποτέλεσμα την μείωση του ρυθµού μεταγραφής δείχνοντας έτσι ότι το στοιχείο PRRE έχει κατασταλτικό ρόλο στην έκφραση του ιού [55,73]. Η PRRE αλληλουχία του HIV-1-LTR παρουσιάζει μία ομολογία με την περιοχή ARRE-2 του υποκινητή της IL-2, στην οποία αναφερθήκαμε παραπάνω [73]. Αυτή η κοινή περιοχή του υποκινητή της IL-2 και του HIV-1-LTR, αργότερα ονομάστηκε RATS (Repressor Activator Target Sequence) [74]. Τα πειράματα τα οποία αναφέραμε πιο πάνω τα οποία πραγματοποιήθηκαν στα ωοκύτταρα βατράχου Xenopus, αυτή την φορά πραγματοποιήθηκαν με την προσθήκη του πλασμιδίου PUCBENN-CAT, το οποίο φέρει το γονίδιο της ακετυολοτρανσφερασης της χλωραμφενικόλης-cat κάτω από τον έλεγχο της LTR αλληλουχίας του HIV-1 [74]. Όπως και στην περίπτωση της IL-2, όταν στα ωοκύτταρα έγινε έγχυση πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων που προέρχονταν από παρθενικά CD45RA Τ λεμφοκύτταρα (από ολικό αίμα ή αίμα από ομφάλιο λώρο), 40

41 παρατηρήθηκε καταστολή της ενεργότητας της έκφρασης του ιού. Η αναστολή αυτή αποκαταστάθηκε μετά την έγχυση πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων που προέρχονταν από ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα. Τα ίδια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν όταν χρησιμοποιήθηκε η RATS αλληλουχία. Τα δεδομένα αυτά κατά αναλογία με τα δεδομένα που αναφέραμε για το γονίδιο της IL-2, μας οδήγησε στην υπόθεση ότι ένας ή περισσότεροι μόρια-καταστολείς της έκφρασης του HIV-1-LTR εκφράζονται στα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα και η έκφρασή του/τους μειώνεται μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων αυτών. Σύμφωνα με τα παραπάνω ο παράγοντας ή οι παράγοντες αυτοί καταστέλλουν την έκφραση τόσο του γονιδίου της IL-2 όσο και του ιού HIV-1-LTR μέσω της πρόσδεσής του/τους στην κοινή αυτή αλληλουχία τους (ARRE-2 για την IL-2, RATS για τον HIV-1-LTR). Ο καταστολέας/λείς, λοιπόν, της έκφρασης της IL-2 και του HIV-1 θα πρέπει να ικανοποιεί τα παρακάτω βασικά στοιχεία: 1. Ο καταστολέας/λείς να είναι παρόν στα παρθενικά T λεμφοκύτταρα και να εξαφανίζεται ή να αλλάζει την λειτουργία του στα μνημονικά T λεμφοκύτταρα. 2. Ο καταστολέας/λείς να δρα κατασταλτικά στην έκφραση του γονιδίου της IL-2 και του HIV-1 μέσω της πρόσδεσής του/ς στην ARRE-2 αλληλουχία του υποκινητή της IL-2 και της RATS αλληλουχίας του HIV1- LTR. Μία έρευνα σε βάση δεδομένων, αποτέλεσμα DNA μικροσυστοιχειών (Πίνακας 1), μας οδήγησε σε έναν μεταγραφικό παράγοντα ο οποίος ικανοποιεί τα στοιχεία τα όποια αναφέραμε. Αυτός ο παράγοντας είναι το προϊόν του ογκογονιδίου ets-2 [75], στο οποίο θα αναφερθούμε στο 3 0 μέρος. Εικόνα 15: Διαφορά στην απελευθέρωση νέων ιοσωμάτων σε παρθενικά CD45RA και μνημονικά CD45RO Τ λεμφοκύτταρα. Τα βελάκια δείχνουν τα ιοειδή τα οποία παρατηρούνται μόνο στα μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα [53]. 41

42 DESCRIPTION (FROM UNIGENE) BINDING SITE NFAT4 (=NFATx=NFATc3) IL-2 PRRE ID2 Inhibitor Of DNA Binding 2 inhibits other BHLH TFs MAZ Myc Associated Zinc Finger Protein GGGAGGG I52969 Programmed Cell Death 2 Unknown Binding Site Myocyte-Specific Enhancer Factor Human Mef2 KCTAWAAATAGM Glucocorticoid Receptor, Alpha Splice Form GRE ELEMENT Evi Zinc Finger Protein ACAAGATAA Interferon-Stimulated Transcription Factor 3 GGGAAACCGAAAC Ets-2 GGGAAG, GGAGGAA ZFP161 Zinc Finger Protein 161 RNRNRCGCGCW MAF 96% Similar To Mouse MAF2 CTCATTTTCCCTTGGTTTCAGCAACTTTAACT Zinc Finger Protein, Subfamily 1A, 1 (Ikaros) NNNTGGGAATRCC Far Upstream Element Binding Protein 3 TTGTTTTTCATGCCGTGGAATAACACAAAATAAAA AATCCCGAGGGAATATAC Host Cell Factor C1 (HCF). ATGCAAAT Transcriptional Repressor Mad4 MYC SITE REPRESSOR Mad1=MAD=MAX-Binding Protein MYC SITE REPRESSOR Signal Transducer Activator Of Transcription 1 ANTTCCGGGAANTGNSN BHLHB2 (Dec-1) Unknown Binding Site Zinc Finger Protein ZNF131 With POZ Domain Unknown Binding Site Histone Acetyltransferase Associated With MOZ TGT/CGGT Bcl-6 Zinc Finger Protein (ZFP51) GAAAATTCCTAGAAAGCATA Madh1 Mad MYC SITE REPRESSOR Egrα, TGF β Early Inducible Protein Unknown Binding Site Cyclin D Binding Myb-Like TF 1 CCCG(G/T)ATGT Mybl1. 100% Similarity F Human A-Myb YAACNGHH Πίνακας 1: Αρνητικοί ρυθμιστές-μεταγραφικοί παράγοντες της ενεργοποίησης των T λεμφοκυττάρων [75]. 42

43 Μέρος 3 ο 43

44 3. ΤΟ ΟΓΚΟΓΟΝΙΔΙΟ ΕΤS-2 H Εts-2 πρωτεΐνη αποτελεί μέλος της οικογένειας των μεταγραφικών παραγόντων ETS, (E26 transformation-specific family) η οποία αποτελείται από 27 γονίδια στον άνθρωπο [76]. Τα μέλη της οικογένειας αυτής των μεταγραφικών παραγόντων φέρουν την χαρακτηριστική περιοχή πρόσδεσης στο DNA έλικα-θηλιάέλικα (winged helix-turn-helix) η οποία αλληλεπιδρά με περιοχές του υποκινητή διαφόρων γονιδίων τα οποία φέρουν την αλληλουχία GGAA/T (Εικόνα 16) [77-79]. Tα μέλη της οικογένειας φέρουν δύο χαρακτηριστικές περιοχές, την ETS περιοχή και την pointed περιοχή. NMR (Nuclear Magnetic Regulation- φασματοσκοπία µαγνητικού συντονισµού) ανάλυση της δοµής της ets περιοχής έδειξε ότι περιλαμβάνει τρεις α-έλικες (α1-α3) και 4 stranded β-θηλιές (β1-β4), διατεταγμένες µε την σειρά α1-β1-β2- α2-α3-β3-β4, σχηματίζοντας µία winged έλικα-θηλιά-έλικα (whth) [80,81]. Η τρίτη α-έλικα είναι υπεύθυνη για την σύνδεση της πρωτεΐνης µε την µεγάλη αύλακα του DNA. Οι ets περιοχές καθώς και οι αµινοξικές ακολουθίες που περιβάλλουν αυτές τις περιοχές επηρεάζουν τον βαθµό πρόσδεσης των πρωτεϊνών και η αλλαγή ενός µόνο αµινοξέος στην ets περιοχή µπορεί να προκαλέσει αλλαγή στην συγγένεια πρόσδεσης της πρωτεΐνης στο DNA [82]. Το πρώτο µέλος της οικογένειας γονιδίων ets (E26 transformation-specific) το οποίο βρέθηκε ήταν το γονίδιο v-ets, το οποίο αναγνωρίστηκε ως ογκογονίδιο σύντηξης gag-myb-ets στον ρετροϊό που προσβάλει τα πτηνά, Ε26. Ο ρετροϊός αυτός επάγει την εκδήλωση ερυθροβλαστικής και µυελοβλαστικής λευχαιμίας στα κοτόπουλα [83]. Στην συνέχεια αναγνωρίστηκαν και αποµονώθηκαν οµόλογα γονίδια της οικογένειας από το Caenorhabditis elegans ή τη Drosophila melanogaster µέχρι τον άνθρωπο. Μέχρι σήµερα περί τα 30 µέλη της οικογένειας έχουν αναγνωριστεί στα θηλαστικά. Τα μέλη της ets οικογένειας συμμετέχουν στην μεταγραφική ρύθμιση διαφόρων γονιδίων και παίζουν σημαντικό ρόλο σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες όπως η μίτωση, αύξηση, διαφοροποίηση, απόπτωση και ρύθμιση της ανοσίας [84,85]. Μπορούν και λειτουργούν ως ενεργοποιητές αλλά και ως καταστολείς της ρύθμισης πολλών γονιδίων. 44

45 Εικόνα 16: Μοντέλο δομής των μελών της ομάδας ETS. Με Η αναγράφονται οι έλικες στην pointed περιοχή (μπλε) και στην ETS περιοχή (κόκκινο) ενώ με β αναγράφονται οι θηλιές [60]. Η πρωτεΐνη Ets-2 ανήκει στην πρώτη από τις δύο κύριες ομάδες που έχουν αναγνωριστεί στην οικογένεια, στην επονομαζόμενη ομάδα ETS. Η άλλη ομάδα καλείται TCF (ternary complex factors group) [77]. Ο παράγοντας Εts-2 πρωτοεκφράζεται κατά την εµβρυϊκή ανάπτυξη στο στάδιο του σχηµατισµού του τροφεκτοδέρµατος (trophectoderm) [86] και εκφράζεται ευρέως σε όλους τους ιστούς των ενηλίκων. Το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη Ets-2 βρίσκεται στο χρωμόσωμα 21 στην θέση 21q22.3. Όπως και τα υπόλοιπα μέλη της οικογένειας, ο Ets-2 δρα και σαν ενεργοποιητής και σαν καταστολέας της έκφρασης γονιδίων-στόχων. Το γονίδιο ets-2 αποτελείται από 10 εξώνια τα οποία οδηγούν στην σύνθεση 3 ειδών µεταγράφων RNA που διαφέρουν µεταξύ τους ως προς το µήκος του 3 άκρου [87]. Παρόλο που τα επίπεδα της πρωτεΐνης Ets-2 παραµένουν σταθερά καθ όλη την διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, πειράµατα έδειξαν ότι τα επίπεδα της φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης αλλάζουν ανάλογα µε την φάση του κυτταρικού κύκλου καθώς και µετά από την ενεργοποίηση των κυττάρων µε µιτογόνα. Έτσι πρότειναν ένα µοντέλο σύµφωνα µε το οποίο η ρύθμιση της ενεργότητας του παράγοντα Εts-2 σχετίζεται µε την µεταγραφική ρύθµιση γονιδίων τα οποία ενεργοποιούνται κατά την έναρξη της G1 φάσης του κυτταρικού κύκλου [88]. H δραστικότητα της Εts-2 πρωτεΐνης εξαρτάται από φωσφορυλίωσή της σε κατάλοιπα θρεονίνης (θρεονίνη 38 και 72) µέσω του Raf/MAPK µονοπατιού [89] και του μονοπατιού φωσφατιδιλοϊνοσιτόλης 3-κινάσης/Akt [90]. Στο ανοσοποιητικό σύστημα η Ets-2 πρωτεΐνη εκφράζεται κατά τα πρώτα στάδια ανάπτυξης των λεμφοκυττάρων και συγκεκριμένα κατά την ανάπτυξη των CD4+ και CD8+ Τ λεμφοκυττάρων [91]. Έχει δειχθεί επίσης ότι η έκφρασή της παίζει 45

46 σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό και στην επιβίωση των θυμοκυττάρων ποντικών μετά από μεταγωγή σήματος απόπτωσης [92]. Ο Ets-2 αλληλεπιδρά με μέλη της ίδιας άλλα και διαφορετικών οικογενειών. Για παράδειγμα αλληλεπιδρά με τον Ets-1 και την πρωτεΐνη Stat5, και αυτό το σύμπλοκο παίζει σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, σε απόκριση της έκφρασης της IL-2 από τα Τ λεμφοκύτταρα [93]. Παρόλο που ο ρόλος της πρωτεΐνης Ets-2 έχει θεωρηθεί ότι είναι επαγωγικός στην γονιδιακή έκφραση, ο ρόλος της σαν καταστολέας έχει αναφερθεί σε πολλές μελέτες. Έτσι στην κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού MCF-7, υπερέκφραση της πρωτεΐνης Ets-2, εξωγενώς, οδηγεί σε καταστολή της ενδογενούς έκφρασης του γονιδίου BRCA1, καθώς έχει αναγνωριστεί περιοχή πρόσδεσης της πρωτεΐνης αυτής στον υποκινητή του γονιδίου [94]. Η Ets-2 πρωτεΐνη έχει δειχθεί να παίζει και κατασταλτικό ρόλο στην ανάπτυξη καρκινικών όγκων. Συγκεκριμένα έχει αναφερθεί ότι αυξημένη ενεργότητα στην έκφραση του γονιδίου ets-2 σε μοντέλο ποντικών για το σύνδρομο Down, επάγει την αναστολή ανάπτυξης όγκων στον εντερικό σωλήνα [95]. Παρόλα αυτά ο ρόλος της πρωτεΐνης Ets-2 στην ρύθμιση του γονιδίου της IL-2 και του ιού HIV-1 δεν έχει αποσαφηνιστεί. Σημαντικό στοιχείο για την διερεύνηση του ρόλου της πρωτεΐνης αυτής στην ρύθμιση των δύο αυτών στοιχείων παίζει και το γεγονός ότι έχει αναγνωριστεί το μοτίβο GGAA, που αποτελεί περιοχή αναγνώρισης και πρόσδεσης της πρωτεΐνης αυτής, τόσο στον υποκινητή της IL-2 (ARRE-2 (PU-d) και ARRE-1 (PU-p) [21,74] όσο και στην LTR αλληλουχία του ιού HIV-1 (Εικόνα 17) [74]. Με βάση τα δεδομένα αυτά στην παρούσα διδακτορική διατριβή, σκοπός μας είναι να αποσαφηνίσουμε την δράση του παράγοντα Ets-2 στην καταστολή της έκφρασης τόσο του γονιδίου της IL-2 όσο και του ιού HIV-1. HIV 1 RATS -279 AGGCCAATGAAGGAGAGAACAACAGCTTGT -250 IL-2 ARRE -292 AAGAAAGGAGGAAAAACT-GT -273 Εικόνα 17: Κοινή αλληλουχία του υποκινητή της IL-2 (ARRE) και της LTR αλληλουχίας του HIV-1 (RATS). Με κόκκινο η περιοχή αναγνώρισης και πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα Ets-2 [74]. 46

47 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 47

48 1. ΚΥΤΤΑΡΑ Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν ηπαρινισμένο ολικό αίμα από υγιείς εθελοντές αιμοδότες, το οποίο συλλέχθηκε από το Κέντρο Αιμοδοσίας του Περιφερειακού Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών και ηπαρινισμένο ολικό αίμα από ομφάλιο λώρο υγιών νεογνών, πηγή πλούσια σε παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα, το οποίο συλλέχθηκε στο 409 Γενικό Νοσοκομείο Πατρών. Για την κατασκευή κλώνων CD4CD45RO Τ λεμφοκυττάρων χρησιμοποιήθηκαν ml ολικού αίματος από ατελείς λήψεις υγειών αιμοδοτών (Κέντρο Αιμοδοσίας Περιφερειακού Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών). Οι κυτταρικές σειρές τις οποίες χρησιμοποιήσαμε είναι: η IM9 και RPMI1788 (EBV-transformed B lymphoblastoid cells), HS-Sultan και Raji (Burkitt s lymphoma), U266 (plasmacytoma) (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, UK), Jurkat (T-cell acute lymphoblastic leukemia), THP-1 (acute monocytic leukemia), U937 (histiocytic lymphoma) (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA), και MM που προέρχονται από κύτταρα πολλαπλού μυελώματος από ασθενή με ΜΜ IgG/ τύπου και IIIA σταδίου, τα οποία διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια για 9 μήνες χωρίς την προσθήκη άλλων εξωγενών αυξητικών παραγόντων. 1.1 Απομόνωση υποπληθυσμών Τ λεμφοκυττάρων Τα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος απομονώθηκαν με την βοήθεια φυγοκέντρησης βαθμίδωσης Φικόλης (LSM-Lymphocyte separation medium). Η απομόνωση των Τ λεμφοκυττάρων από τα μονοπύρηνα κύτταρα έγινε με τη χρήση nylon wool (Combed, Scrubbed Nylon Wool) σε σύριγγα των 20ml. Ο διαχωρισμός των υποπληθυσμών των Τ λεμφοκυττάρων έγινε με τη χρήση ανοσομαγνητικών σφαιριδίων (Dynabeads, Dynal Biotech) με 3 σφαιρίδια ανά κύτταρο για θετική επιλογή και 2 σφαιρίδια ανά κύτταρο για αρνητική επιλογή ή με την χρήση sorting FACSvantage (Becton Dickinson). Συγκεκριμένα, τα CD3+ T κύτταρα, τα CD19+ B κύτταρα και τα CD14+ μονοκύτταρα απομονώθηκαν, από μονοκύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) με την χρήση ειδικού kit ανοσομαγνητικών σφαιριδίων (Dynabeads, Invitrogen, Biotech ASA, Oslo, Norway) σε συγκέντρωση 10 6 κύτταρα/ml με 3 beads/κύτταρο και με τελικό προϊόν μη δεσμευμένα με σφαιρίδια Τ, 48

49 Β λεμφοκύτταρα και μονοκύτταρα. Τα CD4+, CD8+, CD4+CD45RA+, CD4+CD45RO+ απομονώθηκαν με τον ίδιο τρόπο από τα απομονωμένα CD3+ κύτταρα. Επίσης από τα απομονωμένα CD4+ Τ κύτταρα απομονώσαμε τα CD25+, με 3 beads/κύτταρο, και τα διατηρήσαμε σε τριζόλη (Trizole-Gibco BR) στους C για απομόνωση, στην συνέχεια, ολικού RNA. 1.2 Κυτταρομετρία ροής (FACS) Η κυτταρομετρία ροής αποτελεί μια αυτοματοποιημένη μέθοδο ανάλυσης των φυσικών και χημικών ιδιοτήτων κυττάρων που βρίσκονται σε εναιώρημα συνεχόμενης ροής. Η ανάλυση αυτή γίνεται με βάση τον σκεδασμό που εμφανίζουν τα κύτταρα σε συνδυασμό με τον φθορισμό που προκύπτει από τη σήμανση με κατάλληλες φθορίζουσες ουσίες. Η ανάπτυξή της μας έδωσε τη δυνατότητα της πολυπαραμετρικής ανάλυσης των μοριακών, λειτουργικών και βιοχημικών δεδομένων των κυττάρων. Μετά την απομόνωσή τους οι κυτταρικοί πληθυσμοί φαινοτυπήθηκαν με την χρήση κυτταρομετρίας ροής στον αναλυτή Coulter EPICS-XL-MCL. Για την μέτρηση της καθαρότητας το μηχάνημα μέτρησε τουλάχιστον γεγονότα ανά δείγμα. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για την FACS ανάλυση ήταν: mouse anti-human μονοκλωνικά αντισώματα (mab) CD3-PE-Cy5 (Beckman Coulter, France), CD19-FITC (BC), CD14-FITC (BD Biosciences/Pharmingen, San Diego, CA, USA), CD4-FITC (BC), CD8-FITC (BC), CD45RA-PE (BD), CD45RO-PE (BD) και CD25-PE-Cy5 (BC). Για καθένα από τα φθοροχρώµατα που χρησιμοποιούμε, για να ορίσουµε τον αρνητικό φθορισµό, χρησιµοποιούµε και τους αντίστοιχους ισοτυπικούς µάρτυρες (IgG-1-FITC, IgG-1- PE, IgG-1-PE-Cy5-BD) (Εικόνα 18). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με την χρήση του προγράμματος FlowJo V7.5 (Tree Star Inc., Ashland, OR, USA). Οι πληθυσμοί που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματά μας είχαν καθαρότητα >90%. Στις εικόνες 18 και 19 παρουσιάζονται χαρακτηριστικά στικτογράµµατα και ιστογράµµατα κατανοµής πληθυσµών µε βάση τον πρόσθιο και πλάγιο σκεδασµό για τους ισοτυπικούς μάρτυρες (Εικόνα 18) και τα CD4+ κύτταρα (Εικόνα 19). 49

50 Εικόνα 18: Στικτόγραµµα κατανοµής πληθυσµών µε βάση τον πρόσθιο και πλάγιο σκεδασµό και ιστογράµµατα ισοτυπικών µαρτύρων. Πάνω για τα CD4CD45RO και κάτω για τα CD4CD45RA. Οι ισοτυπικοί μάρτυρες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν IgG-1-FITC και IgG-1- PE. Εικόνα 19: Στικτογράµµα και ιστογράµµα κατανοµής των CD4 θετικών κυττάρων καθώς και συνέκφρασής τους με τα CD45RO (πάνω) και CD45RA (κάτω). Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για την FACS ανάλυση ήταν CD4- FITC, CD45RA-PE και CD45RO-PE. 1.3 Καλλιέργειες κυττάρων Τόσο οι κυτταρικοί υποπληθυσμοί που απομονώθηκαν από ολικό αίμα όσο και τα κύτταρα που προέρχονται από κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν και διατηρήθηκαν σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό (CM) σε συγκέντρωση 5x10 5-2x10 6 /ml ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο. Το καλλιεργητικό υλικό RPMI 1640 (Gibco BRL, Gaitherburg, MD) ήταν 10% σε ορό εμβρύου βοός (Fetal Bovine Serum, Gibco BRL) και περιείχε επίσης 5x10 5 molar 2-µερκαπτεθανόλη (2-Mercaptoethanol, Sigma-Aldrich)και 10 50

51 IU/ml πενικιλίνης (penicillin, Sigma-Aldrich). Η καλλιέργεια των κυττάρων έγινε παρουσία ή απουσία εστέρα φορβόλης 10ng/ml (PMA, Phorbol Myristate Acetate, Sigma, Buchs, Switzerland) και ιονοµικήνης (ιονοφόρο Ca2+, ionomycin, Sigma) 1-2µΜ, όποτε τα κύτταρα έπρεπε να ενεργοποιηθούν. Στα πειράματα για την δράση της κυκλοσπορίνης Α, προστέθηκε στα κύτταρα μισή ώρα πριν την ενεργοποίησή τους ποσότητα κυκλοσπορίνης A 1µg/ml (Cyclosporin A, Sigma-Aldrich). Τα κύτταρα αυτά αναπτύχθηκαν σε επωαστικό θάλαµο, στους 37 0 C και 5% CO Δημιουργία κλώνων CD4+CD45RO+CD25- μνημονικών Τh κυττάρων Για τα πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης (ChIP) σε CD4+CD45RA+CD25- και CD4+CD45RO+CD25- T λεμφοκύτταρα απαιτούνταν μεγάλος αριθμός κυττάρων. Έτσι χρησιμοποιήθηκε αίμα από ομφάλιο λώρο για την απομόνωση των παρθενικών CD45RA+ Th λεμφοκυττάρων ενώ για τα μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα προχωρήσαμε σε κατασκευή κλώνων αυτών από ml ολικού αίματος. Μετά από την διαδικασία της βαθμίδωσης φικόλης και nylon wool προκύπτει ο καθαρός υποπληθυσμός Τ λεμφοκυττάρων. Αυτός ο υποπληθυσμός καλλιεργήθηκε σε συγκέντρωση 2x10 6 κύτταρα/ml παρουσία μιτογόνων (PMA/ionomicyn). Ακολούθησε κύκλος ενεργοποιήσεων κάθε 6 μέρες ενώ κάθε 3 μέρες αντικαθίσταται το 50%-70% του καλλιεργητικού υλικού (CM) με φρέσκο. Τέλος, αφήσαμε τα κύτταρα για 3-4 μέρες στο καλλιεργητικό μέσο για να φτάσουν σε κατάσταση ηρεμίας. Μετά το πέρας των 3 κύκλων ενεργοποίησης-ανάπτυξης ακολουθεί φυγοκέντρηση με βαθμίδωση φικόλης για την απομάκρυνση των νεκρών κυττάρων. Στην συνέχεια ακολούθησε απομάκρυνση των CD25+ κυττάρων με αρνητική επιλογή με μαγνητικά σφαιρίδια και θετική επιλογή για τα CD4+ T λεμφοκύτταρα. Η καθαρότητα του πληθυσμού επιβεβαιώθηκε με την χρήση κυτταρομετρίας ροής FACS. Η κατάσταση ηρεμίας των CD4+CD25- κυττάρων επιβεβαιώθηκε με PCR για το γονίδιο της ιντερλευκίνης-2 51

52 2. RT-PCR ΚΑΙ Real-time PCR Ο έλεγχος της γονιδιακής έκφρασης συγκεκριμένων γονιδίων έγινε στο επίπεδο του mrna τόσο με την χρήση RT-PCR όσο και με την χρήση Real-time PCR. Η διαδικασία αυτή ξεκινάει με την απομόνωση του RNΑ από τα κύτταρα και την κατασκευή cdna με αντίστροφη μεταγραφή. 2.1 Απομόνωση RNA από τα κύτταρα Τα κύτταρα, μετά την καλλιέργειά τους παρουσία ή απουσία P/I και CsA για συγκεκριμένο αριθμό ωρών, φυγοκεντρούνται στις 2500rpm για 10min στους 4 0 C και ακολουθούν 2 πλύσεις με 1xPBS (Phosphate buffered saline-gibco BRL). Στην συνέχεια το ίζημα των κυττάρων διαλύεται σε τριζόλη (Trizole-Gibco BR), σε ποσότητα 1ml trizole/5-10x10 6 κύτταρα. Η τριζόλη προκαλεί διάρρηξη των μεμβρανών των κυττάρων και εκχύλιση των κυτταροπλασματικών υλικών. Η απομόνωση του RNA από τα υπόλοιπα κυτταροπλασματικά υλικά γίνεται με τη χρήση διαλύματος χλωροφορμίου:ισοαμυλικής αλκοόλης (49:1) και επώασης σε συνθήκες RT. Ακολουθεί φυγοκέντρηση και απομόνωση της υδάτινης φάσης που περιέχει εκχύλισμα με το RNA των κυττάρων. Στην συνέχεια ακολουθεί καθίζηση του RNA με την προσθήκη στην απομονωμένη υδάτινη φάση ισοπροπανόλης σε όγκο 1:1 και επώαση για 20min στους C. Η διαδικασία της απομόνωσης του RNA τελειώνει με φυγοκέντρηση των δειγμάτων και καθαρισμό του ιζήματος με EtOH καθώς και με διάλυσή του σε κατάλληλη ποσότητα depc νερού. Η αποθήκευση των δειγμάτων γίνεται στους C 2.2 Κατασκευή cdna και RT-PCR Μετά την απομόνωση του RNA προχωρήσαμε στην διαδικασία της κατασκευής cdna. Η κατασκευή του cdna από το ολικό RNA των δειγμάτων, έγινε με χρήση του ενζύμου της αντίστροφης μεταγραφάσης (reverse transcriptase) σύμφωνα με το πρωτόκολλο της Invitrogen (SuperScript II Reverse Transcriptase-Invitrogen). Η 52

53 διαδικασία αυτή περιλαμβάνει την χρήση random εκκινητών, dntps, των κατάλληλων buffer και 5-10ng ολικού RNA. Η γονιδιακή έκφραση των ets-2, IL-2 και FoXP3 μελετήθηκε με RT-PCR και η έκφραση του mrna της β2-μικρογλοβουλίνης (β2-m), χρησιμοποιήθηκε σαν εσωτερικός μάρτυρας. Η ποσοτικοποίηση της έκφρασης των συγκεκριμένων γονιδίων έγινε μετά την μέτρηση της έντασης των PCR προϊόντων μετά την ηλεκτροφόρησή τους σε πήκτωμα αγαρόζης με το πρόγραμμα Scion Image. Τα επίπεδα της έκφρασης κανονικοποιήθηκαν με βάση τα επίπεδα έκφρασης της β2-m. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: για την έκφραση του ets-2 mrna: 5 - CGCAGCGGCAGGATGAATG-3 και 5 -AGGAACGGAGGTGAGGTGTG-3, που συνθέτουν ένα PCR προϊόν 576 bp, για το IL-2 mrna: 5 -TCACCA GGATGCTCACATTTAAGT-3 και 5 GAGGTTTGAGTTCTTCTTCTAGAC-3, που συνθέτουν ένα PCR προϊόν 174 bp, για το FoxP3 mrna: 5 - GAGCTGCCTACAGTGCCCCTA-3 και 5 -CATTTGCCAGCAGTGGGTAG-3 που συνθέτουν ένα PCR προϊόν 150 bp και για τo β2-m mrna: 5 - CCCCCACTGAAAAAGATGAG-3 και 5 -TCATCCAATCCAAATGCGGC-3, που οδηγούν στην σύνθεση ενός PCR προϊόντος 125 bp. 2.3 Real-time PCR H Real-time συγκριτική (comparative) PCR πραγματοποιήθηκε με την χρήση του μηχανήματος Mx3000P TM Quantitative PCR System thermal cycler και η ανάλυση έγινε με το πρόγραμμα MxPro TM (Stratagene Corp, La Jolla, CA, USA). Η έκφραση της β2-m χρησιμοποιήθηκε σαν μάρτυρας κανονικοποίησης (normalizer) και η συνθήκη CM ως βάση σύγκρισης (calibrator). Η αλληλουχία των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν είναι ίδια με αυτή που χρησιμοποιήσαμε στην RT-PCR. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο της Kapa Biosystems σε τελικό όγκο κάθε αντίδρασης στα 20μl, με 1μl περίπου cdna, 200 nm από το κάθε ζεύγος εκκινητών, 10μl 2x KAPA SYBR Fast qpcr mix και 0.4μl ROX low (KAPA SYBR FAST qpcr Kit, Kapa Biosystems Inc., Woburn, MA, USA). Οι συνθήκες της αντίδρασης ήταν 95 0 C για 15min και ακολουθούν 40 κύκλοι με 95 0 C για 30sec για την αποδιάταξη του cdna, 58 0 C για 30sec για την επανασύνδεση με τους εκκινητές και 72 0 C για 30sec για την σύνθεση των μεταγράφων. 53

54 3. ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ 3.1 Απομόνωση πρωτεϊνών από κύτταρα Τα κύτταρα (περίπου 10 6 /συνθήκη), μετά την καλλιέργειά τους παρουσία ή απουσία P/I και CsA για συγκεκριμένο αριθμό ωρών, φυγοκεντρούνται στις 2500rpm για 10min στους 4 0 C και ακολουθούν 2 πλύσεις με 1xPBS (Phosphate buffered saline- Gibco BRL). Στο ίζημα των κυττάρων προσθέτουμε 20μl RIPA buffer (50mM tris-hcl PH 7.4, 1% NP-40, 0,5% Na-deoxycholate, 0,1% SDS, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 50mM NaF) το οποίο περιέχει αναστολείς πρωτεασών (5µg/ml Aprotinin, 5µg/ml Leupeptin- Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA). Ακολουθεί επώαση για 20min στον πάγο και στην συνέχεια φυγοκέντρηση για την απομάκρυνση των συστατικών της μεμβράνης του κυττάρου στις 10000rpm για 10min στους 4 0 C. Η συγκέντρωση του υπερκειμένου σε πρωτεΐνες μετρήθηκε με την μέθοδο Bradford (Sigma-Aldrich). Ένας όγκος υπερκειμένου που περιέχει 10 g πρωτεΐνης αραιώθηκε με ίσο όγκο 2xSDS sample buffer και στην συνέχεια τα δείγματα θερμάνθηκαν σε υδατόλουτρο στους C για 2min. Η ανάλυση, στην συνέχεια, των ολικών πρωτεϊνών έγινε με SDS-PAGE και στην συνέχεια ανοσοαποτύπωση κατά Western. 3.2 Ανοσοαποτύπωση κατά Western Με την ανάλυση κατά Western μπορούμε να ανιχνεύσουμε μία συγκεκριμένη πρωτεΐνη σε ένα μείγμα πρωτεϊνών ενώ ταυτόχρονα μπορούμε να πάρουμε κάποια στοιχεία για αυτή την πρωτεΐνη όπως το μέγεθός της και την περιεκτικότητά της στο μείγμα. Η ακρίβεια της μεθόδου εξαρτάται από την χρήση υψηλής ευαισθησίας αντισώματος έναντι της πρωτεΐνης που θέλουμε να ανιχνεύσουμε. Ο διαχωρισμός του μείγματος των πρωτεϊνών γίνεται σε πήκτωμα SDS-polyacrylamide με βάση το μέγεθός τους. Το SDS είναι απορρυπαντικό και προσδίδει στις πρωτεΐνες αρνητικό φορτίο. Τα επίπεδα έκφρασης της Ets-2 πρωτεΐνης καθορίστηκαν με την χρήση του rabbit πολυκλωνικού αντισώματος ets-2 (1:1000) (rabbit polyclonal Ab to human ets- 2- Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA). Σαν δεύτερο αντίσωμα χρησιμοποιήσαμε το HRP-conjucated goat anti-rabbit IgG (1:2500) (Upstate). Οι ίδιες 54

55 μεμβράνες αποϋβριδοποιήθηκαν (καταστροφή του HRP) με την χρήση sodium azide (0,02%) και στην συνέχεια ακολούθησε επώασή τους με το αντίσωμα τουμπουλίνης (1:2000) (mouse Ab to tubulin-upstate, Biotechnology UBI, Lake Placid, NY, USA) και σαν δεύτερο το goat anti-mouse IgG (1:2500)(Upstate). Η αποτύπωση των ανοσοαντιδρώντων ζωνών των πρωτεϊνών έγινε σε x-ray φιλμ με την χρήση ECL LumiGLO kit ανίχνευσης (Upstate). 3.3 EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για την ανίχνευση αλληλεπιδράσεων µεταξύ πρωτεϊνικών παραγόντων µε νουκλεοτιδικές αλληλουχίες. Στηρίζεται στην παρατήρηση ότι τα σύµπλοκα πρωτεϊνών-dna µεταναστεύουν πιο αργά σε µη αποδιατακτικά πηκτώµατα πολυακρυλαµιδίου ή αγαρόζης, σε σύγκριση µε τα ελεύθερα µόρια DNA. Η πειραματική αυτή διαδικασία χρησιμοποιείται για την ποιοτική ανίχνευση ειδικών παραγόντων που δένουν στο DNA (όπως µεταγραφικοί παράγοντες) ώστε να ανιχνευτούν σημαντικές αλληλουχίες πρόσδεσης µέσα σε ρυθµιστικές περιοχές συγκεκριμένων γονιδίων. Πυρηνικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα απομονώθηκαν από CD4+CD45RA+CD25- και CD4+CD45RO+CD25- Τ λεμφοκύτταρα (5x10 6 κύτταρα/σημείο). Όλες οι διαδικασίες για την απομόνωση των εκχυλισμάτων έγιναν στους 4 0 C. Η Ets-2 πρωτεΐνη απομονώθηκε από 5mg πυρηνικών εκχυλισμάτων σύμφωνα με την διαδικασία: 1mg πρωτεϊνικού εκχυλίσματος αραιώθηκε 5 φορές (x5) σε KIB buffer (20 mm HEPES ph 7.6, 100 mm KCL, 0.02 mm EDTA, 0.5 mm 1,4-dithio-DLthreitol) και στην συνέχεια το διάλυμα αυτό διηθήθηκε σε κολώνα με agarose Α/G πρωτεΐνης. Το εκλουόμενο εκχύλισμα επωάστηκε για 1h παρουσία 50μg ets-2 αντισώματος (Santa Cruz) και διηθήθηκε ξανά σε κολώνα με agarose Α/G πρωτεΐνη. Η Ets-2 πρωτεΐνη που προσκολλήθηκε στην κολώνα εκλούστηκε με ImmunoPure Gentle Ag/Ab Elution Buffer (Thermo Scientific, Pierce Biotechnology, Rockford, USA) και το έκλουσμα διανεμήθηκε σε eppendorf όγκου 1,5ml. Για την πειραματική διαδικασία της EMSA οι πρωτεΐνες κατακρημνίστηκαν με 10% w/v PEG8000 και το ίζημα των πρωτεϊνών διαλύθηκε σε KIB buffer. Η συγκέντρωση των πρωτεϊνών υπολογίστηκε με Bradford assay. Οι αλληλουχίες ανιχνευτών που χρησιμοποιήσαμε ήταν: για την AREE-2 αλληλουχία 3 -AAGAAAGGAGGAAAAACTGTTT-5 και 55

56 για την RATS αλληλουχία 3 -AATGAAGGAGAGAACAACAGC-5. Η ραδιενεργή σήμανση των ανιχνευτών έγινε με [γ-32p]atp με την χρήση Τ4 Polynucleotide Kinase η οποία καταλύει τη µεταφορά του γ-atp από το ATP στο 5 άκρο του νουκλεοτιδίου. Το μείγμα που θα ηλεκτροφορήσουμε θα περιέχει το binding buffer, τους ραδιενεργούς ανιχνευτές, 5mg πυρηνικού πρωτεϊνικού εκχυλίσματος και poly (di / dc) και poly (da / dt) (για περιορισμό της μη ειδικής πρόσδεσης-2µg/µl). Τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου 9 %, ακολουθεί ξήρανση του πηκτώματος στους 60 0 C για 2h και αφήνουμε στους C με x-ray φιλμ. Οι µέρες της έκθεσης διαφέρουν ανά περίπτωση (Εικόνα 20). Εικόνα 20: Διαγραμματική απεικόνιση της πειραματικής μεθόδου EMSA. Τα τρία βασικά βήματα της μεθόδου περιλαμβάνουν 1. Διαδικασία πρόσδεσης, 2. Ηλεκτροφόρηση, 3. Ανίχνευση του σημασμένου ανιχνευτή ( 56

57 4. ΔΙΑΜΟΛΥΝΣΕΙΣ ΣΤΗΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΣΕΙΡΑ JURKAT 4.1 Πλασμίδια Η υπερέκφραση του γονιδίου ets-2 έγινε μετά από διαµόλυνση Jurkat κυττάρων. Σαν φορέας υπερέκφρασης χρησιμοποιήθηκε το πλασµίδιο pcdna3. Το ets-2 cdna εισήχθη στις θέσεις περιορισµού HindIII/BamHI του φορέα μετά από κατάλληλη πέψη µε τα αντίστοιχα περιοριστικά ένζυµα. Η ενίσχυση του ανθρώπινου ets-2 cdna έγινε µε PCR, με χρήση Vent πολυμεράσης (New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Germany). Οι εκκινητές ήταν: 5 - CCCAAGCTTGGCAGGATGAATGATTTCGG-3 και 5 - CGGGATCCTCAGTCCTCCGTGTCG-3. Η σύνδεση (ligation) έγινε στους 25 0 C για 1h παρουσία λιγάσης (New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Germany). Η επιλογή των θετικών κλώνων έγινε µετά από µετασχηµατισµό (transformation) βακτηρίων Esherichia coli (στέλεχος DH5) και ανάπτυξή τους σε θρεπτικό µέσο LB (Lurria Broth) παρουσία αµπικιλλίνης. Η ακρίβεια της κλωνοποίησης επιβεβαιώθηκε με αλληλούχιση (Minotech, Crete, Greece). Τα γονίδια-στόχοι που χρησιμοποιήσαμε ήταν: IL-2-CAT (περιλαμβάνει το γονίδιο αναφοράς της ακετυλοτρανσφεράσης της χλωραμφενικόλης-cat κάτω από τον έλεγχο του υποκινητή της IL-2 (-300 έως +1) [96], 4xARRE2-CAT [97] που περιέχει τέσσερα αντίγραφα της περιοχής ARRE-2 του υποκινητή της IL-2 (-292/-264) συνδεδεμένο με ένα ανενεργό ΤΚ υποκινητή (-270/+56), puc-benn-cat [98] που περιέχει ολόκληρη την LTR αλληλουχία του HIV-1 (-450 έως +531), 2xRATS-CAT που περιέχει δύο αντίγραφα της ομόλογης με την ARRE-2 περιοχή της IL-2, RATS αλληλουχία του HIV-1 LTR (-279 έως-250), 2xmutant-RATS-CAT (φέρει σημειακή μετάλλαξη στην RATS περιοχή του HIV-1-LTR) [99] και το πλασμίδιο CMV-CAT, που φέρει τον υποκινητή του κυτταρομεγαλοϊού CMV [100]. Για τα πειράματα knock down της έκφρασης του Ets-2 χρησιμοποιήθηκαν πέντε πλασμίδια με φορέα το πλασμίδιο plko.1-puro που φέρουν πέντε διαφορετικές αλληλουχίες για τον σχηματισμό φουρκέτας στο ets-2 mrna (MISSION shrna-sigma Aldrich) 57

58 4.2 Διαμολύνσεις Την προηγούμενη µέρα πριν την έναρξη της διαµόλυνσης τα κύτταρα Jurkat µεταφέρονται σε CM (RPMI 1640) µε 5% ορό εμβρύου βοός (Fetal Bovine Serum- FBS). Χρησιμοποιήσαμε 10 7 κύτταρα ανά σηµείο σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης. Διαμολύναμε τα κύτταρα με αυξανόμενες συγκεντρώσεις DNA (pcdna3-ets-2 και πλασμιδίων αναφοράς). Η τελική συγκέντρωση του DNA διατηρούνταν πάντα στα 60μg με την προσθήκη φορέα pcdna3. Η διαµόλυνση έγινε µε την µέθοδο DEAEdextran [84] (Promega) σε τελικό όγκο 540µl (40µl DNA, 472µl TBS (tris-buffered saline), 28µl DEAE-dextran). Το DEAE-dextran προκαλεί την αύξηση του ιξώδους του DNA ώστε να σχηματιστεί µία συμπυκνωμένη µάζα DNA. Η συμπύκνωση του DNA κάνει πιο εύκολη την είσοδό του µέσα στα κύτταρα από τις οπές που θα σχηματιστούν από την επώαση παρουσία DMSO. Πριν την προσθήκη του TDM (transfection DNA mix) τα κύτταρα φυγοκεντρούνται στα 1400rpm στους 4 0 C για 10min ώστε να τα απομονώσουνε από το θρεπτικό μέσο. Μετά ακολουθούν πλύσεις µε ρυθμιστικό διάλυµα TBS. Αφού έχουµε αποµονώσει τα κύτταρα τότε προσθέτουµε το TDM (transfection DNA mix) και τα επωάζουµε για 1h στους 37 0 C και σε 5% CO 2 ώστε να ηρεµήσουν από το στρες που τους έχουµε προκαλέσει. Αφού περάσει ο χρόνος επώασης προσθέτουµε 12/% DMSO, τα αφήνουµε για 2min αυστηρά και µετά κάνουµε πλύσεις µε 1xPBS (GibcoBRL). Τέλος επωάζουµε τα κύτταρα σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό RPMI 1640 και τα αφήνουµε να ηρεµήσουν τουλάχιστον για 6h πριν προχωρήσουµε στην ενεργοποίησή τους, εφόσον αυτό απαιτείται. Για την διαμόλυνση των κυττάρων της Jurkat κυτταρικής σειράς χρησιμοποιήσαμε επίσης το kit Lipofectamin 2000 (Lipofectamine Invitrogen). Συνοπτικά, χρησιμοποιήσαμε 2x10 6 κύτταρα/σημείο σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό. Η συνολική συγκέντρωση του DNA ήταν στα 2μg. Σε ένα eppedorf προστέθηκαν 100μl Optim-MEM (Life Technologies) και η ανάλογη ποσότητα του DNA. Στην συνέχεια προσθέτουμε ποσότητα Plus reagent (Lipofectamine 2000-Invitrogen) 1μl/μg DNA. Ακολουθεί ανάδευση και επώαση σε RT συνθήκες για 5min. Ακολουθεί άλλη μία επώαση 30min αφού πρώτα προσθέσαμε 5μl λιποφεκταμίνης. Το διάλυμα αυτό προστίθεται σταγόνα σταγόνα στην καλλιέργεια των κυττάρων. Αφήνουμε O/N έως ότου προχωρήσουμε σε διαδικασία ενεργοποίησης των κυττάρων (Εικόνα 21). 58

59 Εικόνα 21: Διαγραμματική απεικόνιση της δράσης της λιποφεκταμίνης για την διαμόλυνση των Jurkat κυττάρων ( 4.3 CAT-assays Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην χρήση του ενζύμου CAT. Το CAT προέρχεται από την πλήρη ονομασία του βακτηριακού ενζύμου chloramphenicol acetyl transferase το οποίο αδρανοποιεί την chloramphenicol ακετυλιώνοντάς την. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται συνήθως για τον έλεγχο της ενεργότηττας ενός υποκινητή. Το γονίδιο το οποίο κωδικοποιεί το ένζυμο CAT συνδέεται με τον υποκινητή ενός άλλου γονιδίου του οποίου θέλουμε να εξετάσουμε την έκφραση (IL-2-CAT, puc-benn-cat, κτλ). Με τα ανασυνδυασμένα αυτά γονίδια διαμολύνουμε τα κύτταρά μας. Η ποσότητα του CAT ενζύμου που παράγεται, υποδηλώνει την μεταγραφική ενεργότητα του υποκινητή σε σχέση με άλλους υποκινητές που χρησιμοποιούνται ως μάρτυρες (CMV-CAT) (Εικόνα 22). Συνοπτικά η διαδικασία περιλαμβάνει την θραύση των μεμβρανών των κυττάρων με την χρήση υπερήχων (Sonicator- Bioblock Scientific), απομάκρυνση των θραυσμάτων των μεμβρανών με φυγοκέντρηση και επώαση του υπερκειμένου με ραδιενεργό 14 C και ακέτυλο-συνένζυμο Α (Acetyl-CoA) για 4h στους 37 0 C σε υδατόλουτρο. Στη συνέχεια ακολουθεί χρωματογραφία λεπτής στιβάδος, σε TLC πιάτα, των δειγμάτων και έκθεσή τους σε X-ray φιλμ. 59

60 Εικόνα 22: Διαγραμματική απεικόνιση αποτελεσµάτων CAT assay. Στην πρώτη κάθετη σειρά παρουσιάζεται η εικόνα ενός υποκινητή 1, στην 2η ένας δεύτερος υποκινητής 2, στην 3η ένα αρνητικό control και στην 4η ένα θετικό ( 5. ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ Η μέθοδος της ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης (Chromatin Immunoprecipitation-ChIP) χρησιμοποιείται για την επιβεβαίωση της πρόσδεσης μίας συγκεκριμένης πρωτεΐνης σε συγκεκριμένη αλληλουχία του DNA in vivo. Τα βασικά στάδια της μεθόδου περιγράφονται διαγραμματικά στην Εικόνα 23. Πειράματα ChIP πραγματοποιήθηκαν σε κύτταρα της κυτταρικής σειράς Jurkat αλλά και σε απομονωμένα CD4+CD45RA+CD25- και CD4+CD45RO+CD25- Τ λεμφοκύτταρα. Χρησιμοποιήσαμε 5x10 7 κύτταρα ανά συνθήκη, που καλλιεργήθηκαν σε πλήρες καλλιεργητικό (CM) και στην συνέχεια ενεργοποιήθηκαν με PMA/Ionomycin ± CsA. Αναλυτικά οι συνθήκες που πραγματοποιήθηκαν ήταν CM, 6h P/I, CM+CsA και 6h P/I + CsA. Για τα πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης για τον έλεγχο της πρόσδεσης της πρωτεΐνης Ets-2 στην LTR αλληλουχία του HIV-1, τα κύτταρα πρώτα διαμολύνθηκαν (Διαμολύνσεις) με το πλασμίδιο puc- BENN-CAT, και στην συνέχεια είτε παρέμειναν σε CM είτε ενεργοποιήθηκαν για 12h με P/I. 60

61 1. Η πρωτεΐνη της οποίας μελετάμε την ικανότητα πρόσδεσής της σε συγκεκριμένη αλληλουχία του DNA, με την προσθήκη φορμαλδεΰδης παραμένει προσκολλημένη στην περιοχή πρόσδεσης (crosslinked) 2-3. Σπάσιμο των κυττάρων, απομόνωση και θραύση της χρωματίνης σε μικρά κομμάτια (~500bp) με την χρήση υπερήχων Προσθήκη στο μείγμα χρωματίνης, αντισώματος ειδικού για την πρωτεΐνη που μελετάμε. Κατακρήμνιση και απομόνωση του συμπλόκου πρωτεΐνης/χρωματίνης που μας ενδιαφέρει (με μαγνητικά σφαιρίδια ή σφαιρίδια αγαρόζης) Προσθήκη στο διάλυμα πρωτεΐνης / χρωματίνης πρωτεϊνάσης Α, για την πέψη των πρωτεϊνών και PCR με εκκινητές κατάλληλους για την ανίχνευση της περιοχής σύνδεσης της πρωτεΐνης. Εικόνα 23: Διαγραμματική απεικόνιση της μεθόδου της Ανοσοκατακρήμνισης Χρωματίνης ( 61

62 Μετά την καλλιέργεια των κυττάρων προχωρήσαμε στην επαγωγή σχηματισμού ομοιοπολικών δεσμών (crosslinking) μεταξύ των πρωτεϊνών και του DNA με την προσθήκη στην καλλιέργεια φορμαλδεΰδης σε τελικό όγκο στην καλλιέργεια 1,1%. Με την φορμαλδεΰδη οι πρωτεΐνες σχηματίζουν ομοιοπολικούς δεσμούς με την χρωματίνη (περιοχή πρόσδεσής τους) και έτσι ισχυροποιείται η δέσμευσή τους πάνω σε αυτή. Αφού περάσουν 10min προσθέτουμε στην καλλιέργεια γλυκίνη σε τελική συγκέντρωση 0,125mM, ώστε να ανασταλεί η δράση της φορμαλδεΰδης, και αφήνουμε 10min σε RT με ελαφριά ανάδευση. Ακολουθεί φυγοκέντρηση των δειγμάτων σε 2500rpm για 10min στους 4 0 C και 2x πλύσεις με 1xPBS σε falcon των 50ml. Το επόμενο βήμα είναι η θραύση της μεμβράνης των κυττάρων η οποία επιτυγχάνεται με την προσθήκη του Lysis Buffer (5mM HEPES ph 8, 85mM KCl, 0,5% NP-40) η δράση του οποίου στηρίζεται στην ύπαρξη στο διάλυμα κατάλληλων απορρυπαντικών (NP-40) καθώς και αναστολέων πρωτεασών, για την αποφυγή διάσπασης των πρωτεϊνών. Ακολουθεί επώαση για 10min στον πάγο και φυγοκέντρηση 3500rpm για 10min σε παγωμένη φυγόκεντρο. Μετά το πέρας της φυγοκέντρησης και την απομάκρυνση του υπερκειμένου στο ίζημα έχουμε τους πυρήνες των κυττάρων που τους διαρρηγνύουμε με την χρήση του Nuclei Lysis buffer (10m EDTA, 1% SDS, 50mM Tris-HCl ph 8,1) προκαλώντας αύξηση της ωσμωτικής πίεσης στο εσωτερικό τους με την χρήση ανάλογων διαλυμάτων σε συνδυασμό με την χρήση του απορρυπαντικού SDS. Όλες οι διαδικασίες γίνονται σε πάγο. Μετά από φυγοκέντρηση των δειγμάτων έχουμε πια απομονώσει την χρωματίνη και το επόμενο βήμα που ακολουθήσαμε είναι η θραύση αυτής σε μικρότερα κομμάτια (~500bp) με την χρήση υπερήχων, στο διάλυμα Nuclei Lysis buffer. Η διαδικασία αυτή έγινε στο μηχάνημα Sonicator- Bioblock Scientific, σε πάγο, σε 20 κύκλους περίπου ανά δείγμα (amplitude 30%). Κάθε κύκλος διαρκεί 45sec-1min ανά δείγμα (15sec off/15sec on). Για να εξετάσουμε αν όντως η χρωματίνη έσπασε σε μικρά κομμάτια πήραμε ποσότητα χρωματίνης την οποία βράσαμε σε eppedorf 1,5ml με 400mM ΝaCl στους 90 0 C για 10min. Ακολουθεί επώαση στους 37 0 C σε υδατόλουτρο για 45min με RNase A και καθαρισμοί με phenol:clorophorm:isoamilyc alcohol (25:24:1). Το δείγμα στην συνέχεια το ηλεκτροφορούμε σε πήκτωμα αγαρόζης 1%. Χαρακτηριστική εικόνα που λαμβάνουμε μετά από την θραύση της χρωματίνης με την χρήση υπερήχων φαίνεται στην Εικόνα

63 ~500bp Εικόνα 24: Χαρακτηριστική εικόνα εμφάνισης της χρωματίνης μετά από θραύση της με sonication για 20 κύκλους. Η χρωματίνη επωάστηκε παρουσία 400mM ΝaCl και RNase A και ηλεκτροφορήθηκε σε 1% πήκτωμα αγαρόζης. Η μεγάλη ένταση αντιστοιχεί ~500bp. Μετά την θραύση της χρωματίνης ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 14000rpm για 10min στους 4 0 C, απομόνωση του υπερκειμένου και αποθήκευση στους C μέχρι να την χρησιμοποιήσουμε. Για την ανοσοκατακρήμνιση χρησιμοποιήθηκαν 25μg χρωματίνης για κάθε συνθήκη. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν anti-ets- 2 (sc-351) και anti-polii (sc-9001) (Santa Cruz) ενώ η κατακρήμνιση έγινε με μαγνητικά σφαιρίδια (magnetic beads A/3beads/μl αντισώματος). Το σύμπλεγμα μαγνητικά σφαιρίδια/αντισώματος/dna/πρωτεΐνης επωάστηκε Ο/Ν σε στροφείο και την επόμενη μέρα ακολούθησαν πλύσεις του συμπλέγματος με τα διαλύματα: 2 φορές με Low salt buffer (0,1% SDS, 1,1% Triton X-100, 2mM EDTA ph 8, 20mM Tris- HCl ph 8,1, 150mM NaCl), 2 φορές με high salt buffer (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl ph 8,1, 500mM NaCl), 2 φορές με LiCl buffer (10mM Tris-HCl ph 8, 250mM LiCl, 1% NP-40) και 2 φορές με TE buffer (10 mm Tris-HCl ph 7.5, 1 mm EDTA). Οι πλύσεις έγιναν σε μαγνητικό σταστό. Η απελευθέρωση του συμπλόκου από τα μαγνητικά σφαιρίδια έγινε με την προσθήκη διαλύματος IP elution buffer (1% SDS, 50 mm NaHCO3) και δυνατό vortex για 15min. Ακολούθησε επώαση με RNase A για 45min στους 37 0 C, με πρωτεϊνάση Α στους 55 0 C (για αναστροφή του crosslinking) και καθαρισμός της με phenol:clorophorm:isoamilyc alcohol (25:24:1). Το επόμενο βήμα είναι PCR για την αλληλουχία που περιμένουμε ότι προσδένεται ο παράγοντας που μελετούμε. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήσαμε ήταν: για την ARRE-2 περιοχή του υποκινητή της IL-2 (περιλαμβάνει και την περιοχή πρόσδεσης του παράγοντα ets-2) 5 - CTTGCTGTTGTCCACCAC-3 και 5 -TGGATGTAGGTGAAATCCC-3, που 63

64 οδηγούν στην σύνθεση ενός PCR προϊόντος 201bp, για την TATA/ARRE-1 περιοχή του υποκινητή της IL-2 5 -TCTTTGGGGGTTTAAAGAAATTC-3 και 5 - AGGAGTTGAGGTTACTGTGAG-3 που οδηγούν στην σύνθεση ενός PCR προϊόντος 217bp και για τον υποκινητή της β2-m: 5 - CGCCGATGTACAGACAGCAAA-3 και 5 -TGCTGTCAGCTTCAGGAATG-3, που οδηγούν στην σύνθεση ενός PCR προϊόντος 229bp. Οι συνθήκες του PCR ήταν 95 C για 5 min, 35 κύκλοι με 95 C για 1min, 50 C για 1min και 72 C για 1min. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήσαμε για την LTR αλληλουχία του HIV-1 ήταν οι: 5'- CACCCCCTTAAAGGAG-3' και 5'-GTGGCAGGAGTTGAGGTTAC-3', που οδηγούν στην σύνθεση ενός PCR προϊόντος 536bp. Τα προϊόντα της PCR αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5% παρουσία EtBr (Sigma-Aldrich). 6. IMMUNO-DNA FISH (Fluorescence in situ hybridization) Αποτελεί μία τεχνική συνεντοπισμού πρωτεϊνών και DNA αλληλουχιών με το συνδυασμό ανοσοφθορισμού (immunofluorescence) και FISH (In situ υβριδιποίηση με φθοροχρώματα). Η in situ υβριδοποίηση με φθοροχρώματα (FISH), χρησιμοποιεί ανιχνευτές DNA σημασμένους με μόρια αναφοράς. Τα μόρια αυτά είτε φθορίζουν τα ίδια, είτε ανιχνεύονται από αντισώματα συζευγμένα με φθοροχρώματα και είναι ορατά σε παρατήρηση σε μικροσκόπιο φθορισμού. Η μέθοδος αυτή επιτρέπει τον εντοπισμό της θέσης συγκεκριμένων ακολουθιών DNA στον πυρήνα των κυττάρων. Η υβριδοποίηση εξαρτάται από την ικανότητα του αποδιαταγμένου DNA να επανασυνδέεται με συμπληρωματικές αλυσίδες σε περιβάλλον λίγο χαμηλότερα από το σημείο τήξης του. Η τεχνική αυτή αποτελεί τον πιο άμεσο τρόπο εντοπισμού της θέσης γενετικών αλληλουχιών στα κύτταρα. Από την άλλη μεριά, η τεχνική του ανοσοφθορισμού επιτρέπει την ανίχνευση και τον εντοπισμό της θέσης πρωτεϊνών, είτε αυτές είναι πυρηνικές είτε κυτταροπλασματικές. Η ανίχνευση αυτή γίνεται επίσης με τη χρήση αντισωμάτων συζευγμένων με φθοροχρώματα, τα οποία ανιχνεύουν και δεσμεύονται σε συγκεκριμένους επιτόπους συγκεκριμένων πρωτεϊνών. Η παρατήρηση των αποτελεσμάτων γίνεται και εδώ, όπως και στη τεχνική της FISH, σε μικροσκόπιο φθορισμού. 64

65 Ο συνδυασμός των δύο αυτών τεχνικών, μας επιτρέπει, στο ίδιο παρασκεύασμα να εντοπίσουμε στο εσωτερικό του κυττάρου ταυτόχρονα μία πρωτεΐνη και μία DNA αλληλουχία (ή και περισσότερες). Εάν η υπό εξέταση πρωτεΐνη είναι μεταγραφικός παράγοντας, δηλαδή έχει την ικανότητα πρόσδεσης στον υποκινητή ενός γονίδιου (DNA αλληλουχία), τότε με αυτή την τεχνική, μας δίνεται η δυνατότητα να παρατηρήσουμε και τον συνεντοπισμό τους στον πυρήνα του κυττάρου. Έτσι κύτταρα Jurkat, παρθενικά και μνημονικά Τ κύτταρα (CD4+CD45RA+CD25- και CD4+CD45RO+CD25-) που καλλιεργήθηκαν σε CM±P/I, αφήνονται να προσκολληθούν σε αντικειμενοφόρους πλάκες, επικαλυμμένες με poly-l-lysine, για 30min στους 37 ο C. Τα κύτταρα μονιμοποιούνται με παραφορμαλδεΰδη 4% για 10min σε θερμοκρασία δωματίου (RT) και ξεπλένονται 3 φορές με 1x PBS για 5min και στη συνέχεια γίνονται διαπερατά με επώαση σε απορρυπαντικό 0,5% Triton X-100 για 5min, επίσης σε RT. Αφού ξεπλυθούν 3 φορές με 1xPBS για 5min, επωάζονται για 60min σε blocking buffer (10% FBS 3% BSA σε 1x PBS) για το μπλοκάρισμα των μη ειδικών θέσεων δέσμευσης των αντισωμάτων. Στη συνέχεια ακολουθεί επώαση με το anti-ets-2ab, αραιωμένο σε blocking buffer για 60min σε RT. Ακολουθούν πλύσεις x3 με 0,05% Tween-20/PBS και επώαση με το 2 ο φθορίζων αντίσωμα έναντι του 1 ου, Alexa 488, αραιωμένο σε blocking buffer για 60min σε RT. Tα κύτταρα επαναμονιμοποιούνται με παραφορμαλδεΰδη 4% για 10min σε RT και ξεπλένονται x3 φορές με 1xPBS για 5min. Ακολουθεί επώαση με 0,5% Triton X-100 για 5min σε RT και διαδοχικές πλύσεις, x2 με 1xPBS για 5min, 1x με 2xSSC (saline-sodium citrate-150mm NaCl, 15mM Na 3 C 6 H 5 O 7 ) για 5min και αφυδάτωση των δειγμάτων σε παγωμένες αλκοόλες 70%, 85% και 100% για 2min διαδοχικά. Για την διαδικασία της FISH, αφού αφήσουμε τις πλάκες να στεγνώσουν, αποδιατάσσουμε το DNA των κυττάρων σε διάλυμα 2xSSC/70% formamide για 3min στους 73 ο C. Παράλληλα αποδιατάσσουμε τον DNA probe, ο οποίος έχει κατασκευαστεί με τη μέθοδο του nick translation χρησιμοποιώντας biotin modified dutps, στους 75 ο C για 5min. Τα κύτταρα αφυδατώνονται ξανά σε αλκοόλες 70%, 85% και 100% για 2min διαδοχικά, αυτή την φορά σε RT. Αφού στεγνώσουν, προσθέτουμε τους DNA probes και τα αφήνουμε να υβριδοποιηθούν Ο/Ν στους 42 ο C, σε περιβάλλον με αρκετή υγρασία. Την επόμενη μέρα, τα κύτταρα ξεπλένονται διαδοχικά x3, με 2xSSC/50% formamide, 1xSSC, 0,01% Tween-20/4xSSC για 5min και έπειτα επωάζονται με blocking buffer για 60min σε RT. Στη συνέχεια επωάζουμε για 60min με το αντίσωμα έναντι του DNA 65

66 probe, streptavidine Alexa 568, αραιωμένο σε blocking buffer και ξεπλένουμε x3 με 0,05% Tween-20/1xPBS. Τα κύτταρα επωάζονται σε διάλυμα DAPI για 10min, για τη χρώση των πυρήνων και αφού ξεπλυθούν με 1xPBS και dh 2 O, επικαλύπτονται με διάλυμα MOWIOL και καλυπτρίδες, και φυλάσσονται στο σκοτάδι στους 4 ο C, μέχρι την ανάλυση τους στο μικροσκόπιο φθορισμού. Η ανάλυση και παρατήρηση των δειγμάτων έγινε σε μικροσκόπιο φθορισμού NIKON Eclipse TE 2000-U ή σε συνεστιακό (confocal) μικροσκόπιο LEICA TCSSP5. 66

67 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 67

68 1. Έκφραση του ets-2 mrna σε υποπληθυσμούς κυττάρων περιφερικού αίματος Ένα από τα στοιχεία το οποίο, σύμφωνα με όσα αναφέραμε παραπάνω, πρέπει να ικανοποιεί ο πιθανός καταστολέας είναι η μεγαλύτερη έκφρασή του στα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα σε σχέση με τα μνημονικά και η μείωση της έκφρασής του μετά την ενεργοποίηση των παρθενικών Τ λεμφοκυττάρων. Καθώς το προϊόν του ογκογονιδίου ets-2 είναι ένας πιθανός καταστολέας της έκφρασης της IL-2 και του HIV-1-LTR στα παρθενικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα [75], προχωρήσαμε αρχικά στον καθορισμό των επιπέδων έκφρασής του, σε επίπεδο mrna, με Real-time PCR, σε υποπληθυσμούς κυττάρων περιφερικού αίματος (PBMC) υγιών δοτών, σε συνθήκες ενεργοποίησης ή μη. Για αυτό τον σκοπό ακολούθησε απομόνωση πληθυσμών κυττάρων περιφερικού αίματος καθώς και η απομόνωση υποπληθυσμών Τ λεμφοκυττάρων, τα οποία καλλιεργήθηκαν παρουσία (P/I) ή απουσία (CM) μιτογόνων (Μέθοδοι-Υλικά). Το ets-2 mrna εκφράζεται στα ίδια επίπεδα σε κύτταρα PBMCs είτε μετά την απομόνωσή τους (ex vivo) είτε όταν έχουν απομονωθεί μετά από καλλιέργειά τους σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό Ο/Ν. Η έκφρασή του μειώνεται ελαφρώς μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων με μιτογόνα P/I (Εικόνα 25Α-PBMC). Τα ex vivo απομονωμένα μονοκύτταρα (CD14+) εκφράζουν το ets-2 στα ίδια περίπου επίπεδα με τα ex vivo PBMC αλλά η έκφρασή του αυξάνεται μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων αυτών με P/I (Εικόνα 25Α- CD14). Από την άλλη τα CD19+ B κύτταρα συνθέτουν μικρές ποσότητες του παράγοντα άσχετα με το είδος της καλλιέργειας (ex vivo, CM, P/I) (Εικόνα 25Α- CD19). Στα CD3+ Τ κύτταρα η μεγαλύτερη έκφραση του ets-2 mrna παρατηρήθηκε στο μη ενεργοποιημένο στάδιο των κυττάρων (ex vivo, CM) (Εικόνα 25Α-CD3). Παράλληλη ανάλυση της έκφρασης της IL-2, στους ίδιους πληθυσμούς κυττάρων (Εικόνα 25Β), ανέδειξε μία συσχέτιση στην έκφραση της IL-2 και του ets-2 mrna στα Τ κύτταρα, καθώς αυξημένα επίπεδα IL-2 mrna ανιχνεύθηκαν στην P/I συνθήκη όπου παρουσιάστηκε και η χαμηλότερη έκφραση του ets-2 mrna. Τα αποτελέσματα αυτά αναδεικνύουν μια διαφορική ρύθμιση της έκφρασης του παράγοντα ets-2 σε διαφορετικούς υποπληθυσμούς κυττάρων περιφερικού αίματος. Για την αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης του ets-2 mrna σε διαφορετικούς υποπληθυσμούς Τ λεμφοκυττάρων ακολουθήσαμε την ίδια πειραματική διαδικασία 68

69 αυτή την φορά με ex vivo απομονωμένους υποπληθυσμούς Τ λεμφοκυττάρων (Μέθοδοι-Υλικά). Όπως φαίνεται και στην Εικόνα 25C, όλοι οι υποπληθυσμοί εκφράζουν ets-2 mrna αλλά σε διαφορετικές ποσότητες. Η σημαντικότερη διαφορά παρατηρήθηκε ανάμεσα στα CD4+CD45RA+CD25- παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα και τα CD4+CD45RO+CD25- μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα, με τα πρώτα να εκφράζουν το ets-2 mrna σε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα (Εικόνα 25C- CD4CD45RA, CD4CD45RO). Τα κυτταροτοξικά CD3+CD8+CD25- παρουσίασαν την μικρότερη έκφραση (Εικόνα 25C-CD8), ενώ τα ρυθμιστικά CD4+CD25+ Tregs (Εικόνα 25C-CD25) εκφράζουν το ets-2 mrna στα ίδια περίπου επίπεδα με τα CD3+CD4+CD25- Τ βοηθητικά (Εικόνα 25C-CD4) και τα CD4+CD45RO+CD25- μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα. Οι ίδιοι υποπληθυσμοί αναλύθηκαν και για την έκφραση της IL-2 και όπως αναμενόταν καμία έκφραση δεν παρατηρήθηκε καθώς οι υποπληθυσμοί ήταν ex vivo απομονωμένοι και όχι ενεργοποιημένοι. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η έκφραση του ets-2 mrna δεν είναι ίδια σε όλους τους υποπληθυσμούς των PBMCs και η έκφρασή του δεν μεταβάλλεται το ίδιο σε όλες τις κατηγορίες κυττάρων σε συνθήκες ενεργοποίησης. Η μεγαλύτερη έκφραση του ets-2 mrna στα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα, σε σχέση με τα μνημονικά Τ κύτταρα, και η πτώση της έκφρασής του μετά την ενεργοποίηση των παρθενικών Τ λεμφοκυττάρων με μιτογόνα συμφωνεί με το πρώτο χαρακτηριστικό το οποίο πρέπει να ικανοποιεί ο πιθανός καταστολέας. 69

70 Εικόνα 25: Σύνθεση του ets-2 και IL-2 mrna σε υποπληθυσμούς μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του ets-2 (A, C) και IL-2 (B) mrna ανιχνεύθηκαν με Real-time PCR σε κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) και απομονωμένους πληθυσμούς μονοκυττάρων (CD14), B λεμφοκυττάρων (CD19) και Τ λεμφοκυττάρων (CD3). Τα CD14, CD19, CD3 κύτταρα απομονώθηκαν με την χρήση μαγνητικών σφαιριδίων με αρνητική επιλογή. Το ολικό RNA και η κατασκευή του cdna έγινε αμέσως μετά την απομόνωση των κυττάρων (ex vivo) είτε μετά την καλλιέργεια αυτών σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό απουσία (CM) ή παρουσία μιτογόνων (P/I). Η έκφραση της β2m χρησιμοποιήθηκε ως normalizer και η συνθήκη CM ως calibrator. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (mean ±SEM). C. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του ets-2 mrna ανιχνεύθηκαν με Real-time PCR σε PBMCs, CD3 Τ κύτταρα και υποπληθυσμών αυτών [CD4 Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα, CD8 κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα, ρυθμιστικά CD4+CD25+ T κύτταρα (CD25), μνημονικά CD4+CD45RO+CD25- (CD4CD45RO) και παρθενικά CD4+CD45RA+CD25- (CD4CD45RA) Τh λεμφοκύτταρα]. Τα κύτταρα απομονώθηκαν με αρνητική επιλογή σε CM και η επεξεργασία τους έγινε αμέσως. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (mean ±SEM). 70

71 2. Ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 στα στοιχεία ARRE-2 και RATS Στην συνέχεια θελήσαμε να επιβεβαιώσουμε την δεύτερη συνθήκη που θα πρέπει να ικανοποιεί ο πιθανός καταστολέας, ότι δηλαδή προσδένεται στην ARRE-2 αλληλουχία του υποκινητή της IL-2 και στην RATS αλληλουχία του HIV-1 αντίστοιχα. Για αυτό τον σκοπό ακολουθήσαμε την πειραματική διαδικασία EMSA. Η μέθοδος EMSA χρησιμοποιήθηκε επίσης για να εξετάσουμε και σε ποιό τύπο κυττάρων παρουσιάζει την μεγαλύτερη ικανότητα πρόσδεσης, όταν αυτή υπάρχει, ο παράγοντας Ets-2 στο ΑRRE-2 στοιχείο του υποκινητή. Σε αυτή την πειραματική διαδικασία χρησιμοποιήσαμε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από CD3+ T κύτταρα, CD14+ μονοκύτταρα, CD19+ λεμφοκύτταρα καθώς και από παρθενικά (CD4+CD45RA+ CD25-) και μνημονικά (CD4+CD45RO+CD25-) Τ λεμφοκύτταρα. Σαν ανιχνευτή χρησιμοποιήσαμε ένα ολιγονουκλεοτίδιο που περιέχει την ARRE-2 αλληλουχία του υποκινητή της IL-2. Όπως φαίνεται και στην Εικόνα 26 παρατηρήθηκε ισχυρή ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα Εts-2 όταν χρησιμοποιήθηκαν πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από CD3 και παρθενικά CD4CD45RA Τ κύτταρα, σε αντίθεση με τα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από τα CD14, CD19 και τα μνημονικά CD4CD45RO Τh κύτταρα όπου δεν παρατηρήθηκε ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με παλαιότερα πειράματα EMSA όπου εκχυλίσματα από παρθενικά ή μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα δεν παρουσίασαν καμία ικανότητα πρόσδεσης, όταν σαν ανιχνευτής χρησιμοποιήθηκε η ARRE-2 αλληλουχία με σημειακή μεταλλαγή στην αλληλουχία πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 [32]. Επιπλέον, όταν επαναλάβαμε την διαδικασία EMSA αυτή την φορά με εκχυλίσματα από παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα στα οποία είχε απομακρυνθεί ο παράγοντας Ets-2, παρατηρήσαμε ότι η ικανότητα πρόσδεσης του καταστολέα μειώθηκε σημαντικά (Εικόνα 26- Ets-2 Depletion). Το γεγονός αυτό επιβεβαιώνει προηγούμενες μελέτες που αναφέρουν τον Ets-2 ως έναν παράγοντα ο οποίος είναι παρόν στα PBMCs και προσδένεται στην ARRE-2 αλληλουχία [75]. Competition assays με χρήση μη σημασμένου ARRE-2 ανιχνευτή (σε περίσσεια μέχρι και 50x φορές) έδειξαν κατάργηση της ικανότητας πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 στην ARRE-2 αλληλουχία (Εικόνα 26-ΑRRE-2 competition). 71

72 ARRE-2 competition Εικόνα 26: Ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα Ets- 2 στην ARRE-2 αλληλουχία του υποκινητή του γονιδίου της IL-2 με την χρήση της πειραματικής διαδικασίας EMSA. Πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από CD3, CD14, CD19 καθώς και CD4CD45RA και CD4CD45RO Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα αναλύθηκαν για την ικανότητα πρόσδεσής τους στον ραδιενεργό ανιχνευτή που φέρει την αλληλουχία ARRE-2 του υποκινητή της IL-2. Η εικόνα που παρουσιάζεται είναι χαρακτηριστική 3 ανεξάρτητων πειραμάτων με το ίδιο αποτέλεσμα. Τέλος, για να μελετήσουμε περεταίρω την ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 στην ARRE-2 αλληλουχία αλλά και στην RATS αλληλουχία του HIV1-LTR, απομονώσαμε εκχυλίσματα πλούσια σε σύμπλοκα πρωτεϊνών που περιέχουν τον παράγοντα Ets-2 από εν ηρεμία Τ λεμφοκύτταρα και τα περάσαμε από κολώνες με αντισώματα έναντι της Ets-2 πρωτεΐνης. Μετά την έκλουση, απομονώσαμε ποσότητες οι οποίες περιείχαν διαφορετικές συγκεντρώσεις από την πρωτεΐνη Ets-2. Αυτές χρησιμοποιήθηκαν στην πειραματική μέθοδο EMSA με ανιχνευτές τις αλληλουχίες ARRE-2 και RATS αντίστοιχα (Εικόνα 27). Όπως φαίνεται και στη Εικόνα 27, ο παράγοντας Ets-2 προσδένεται τόσο στην ARRE-2 όσο και στην RATS αλληλουχία με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, αφού όσο πιο πυκνά είναι τα εκχυλίσματα, σε συγκέντρωση της Ets-2 πρωτεΐνης, τόσο αυξάνεται και η ένταση της πρόσδεσης. Έτσι καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η έκφραση του Ets-2 σχετίζεται με την πρόσδεσή του στην ARRE-2 περιοχή του υποκινητή της IL-2 και της ομόλογης RATS αλληλουχίας του HIV1-LTR. Εικόνα 27: Ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 στην ARRE-2 και RATS αλληλουχία. Η πρωτεΐνη Ets-2 απομονώθηκε από ολικά πυρηνικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από εν ηρεμία Τ 72

73 λεμφοκύτταρα, τα οποία πέρασαν μέσα από κολώνα A/G agarose. Τα εκλούσματα (a, f) στην συνέχεια επωάστηκαν για 1h με 50μg αντισώματος Ets-2 και πέρασαν μέσα από κολώνα A/G agarose. Τα προσδεδεμένα εκλούσματα του Ets-2 συλλέχθηκαν ανά 1ml (b-e, g-j). Η πειραματική διαδικασία EMSA πραγματοποιήθηκε με ανιχνευτές που φέρουν της ARRE αλληλουχία του υποκινητή της IL-2 και την RATS αλληλουχία του HIV-1-LTR και διαδοχικές αραιώσεις του εκλούσματος που περιέχει την Ets-2 πρωτεΐνη (a, b-e και f, g-j). 3. Έκφραση του παράγοντα Ets-2 σε υποπληθυσμούς CD4+ T λεμφοκυττάρων- Ο ρόλος της κυκλοσπορίνης Α (CsA) Για να μελετήσουμε περεταίρω την έκφραση του ets-2 mrna σε παρθενικά και Εικόνα 28: FACS ανάλυση για τον καθορισμό της καθαρότητας του υποπληθυσμού CD4CD45RA (πάνω) και CD4CD45RO (κάτω). Στο παρόν στικτόγραμμα παρουσιάζεται η συνέκφραση CD4/CD45RΑ και CD4/CD45RO (Q2) μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα σε συνθήκες ενεργοποίησης και μη ώστε να επιβεβαιώσουμε το πρώτο χαρακτηριστικό που πρέπει να φέρει ο καταστολέας, ότι δηλαδή η έκφρασή του είναι μεγαλύτερη στα παρθενικά σε σχέση με τα μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα και η έκφρασή του μειώνεται μετά την ενεργοποίηση των παρθενικών Τ λεμφοκυττάρων, ακολουθήσαμε πειράματα RT-PCR σε αυτές τις κατηγορίες κυττάρων. Τα CD4+CD45RA+CD25- παρθενικά Th και τα CD4+CD45RA+CD25+ ρυθμιστικά Tregs κύτταρα απομονώθηκαν από CD3+ κύτταρα που προέρχονται από αίμα από ομφάλιο λώρο. Η καθαρότητα των πληθυσμών των κυττάρων εξετάστηκε με FACS (Εικόνα 28) και ακολούθησε καλλιέργεια των κυττάρων και ενεργοποίησή τους με τα μιτογόνα PMA και Ionomicyn για 4 και 12h ±CsA. Η RT-PCR ανάλυση έδειξε ότι το IL-2 mrna εκφράζεται στα κύτταρα μετά την ενεργοποίησή τους με μιτογόνα και η έκφραση αυτή σχετίζεται με την έκφραση του ets-2 mrna (Εικόνα 29Α). Συγκεκριμένα στα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα η έκφραση του ets-2 mrna μειώνεται με το πέρας των ωρών ενεργοποίησης. Έτσι η έκφρασή του από το μέγιστο που παρουσιάζει στην CM συνθήκη, μειώνεται στις 4h στο 50% της αρχικής και φτάνει στις 12h μετά την ενεργοποίηση στο 43% της αρχικής έκφρασης (Εικόνα 29Α-. 73

74 CD4CD45RA). Όταν το μονοπάτι της μεταγραφικής ενεργοποίησης του γονιδίου της IL-2 διακόπηκε με την προσθήκη CsA στην καλλιέργεια παρατηρήθηκε αναστολή στην σύνθεση του IL-2 mrna, όπως αναμέναμε. Από την άλλη όμως παρατηρήθηκε μια σταθεροποίηση στην σύνθεση του ets-2 mrna στα επίπεδα του 80% της αρχικής έκφρασης στις 4h P/I και στο 90% στις 12h P/I (Εικόνα 29Α, +CsA, CD4CD45RA). Τα ρυθμιστικά CD4+CD25+ Tregs εξέφραζαν το ets-2 mrna στο 77% σε σχέση με τα CD4CD45RA CM και εκφράζουν foxp3 και καθόλου ΙL-2 mrna (Εικόνα 29Α, - CsA, CD4CD25). Έκφραση του foxp3 mrna δεν ανιχνεύθηκε στις άλλες συνθήκες καλλιέργειας των παρθενικών Τ λεμφοκυττάρων γεγονός που υποδηλώνει ότι ο Foxp3 δεν ελέγχει την ρύθμιση της έκφρασης της IL-2 στα κύτταρα αυτά. Όσον αφορά τα CD4+CD45RO+CD25- και CD4+CD54RΟ+CD25+ μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα όπως αναφέρθηκε και πιο πριν απομονώθηκαν από αίμα υγιών ενήλικων ατόμων και καλλιεργήθηκαν στις ίδιες συνθήκες που αναφέραμε για τα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα. Η ανάλυση του mrna με RT-PCR ανέδειξε ένα διαφορετικό πρότυπο έκφρασης του ets-2 στα μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα σε σχέση με τα παρθενικά. Συγκεκριμένα το ets-2 mrna ανιχνεύθηκε σε επίπεδο 5 φορές λιγότερο στα μνημονικά Τ κύτταρα (0.23), σε CM συνθήκη, σε σχέση με τα παρθενικά (Εικόνα 29Α- CD4CD45RO). Μετά από μιτογονική ενεργοποίηση των μνημονικών Τ λεμφοκυττάρων η έκφραση του ets-2 mrna αυξήθηκε x2 και x3 φορές στις 4 και 12h αντίστοιχα σε σχέση με την έκφραση του mrna στην συνθήκη CM. Η έκφραση του IL-2 mrna παρέμεινε στα ίδια επίπεδα με τα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα στις αντίστοιχες συνθήκες. Στις καλλιέργειες ενεργοποιημένων μνημονικών κυττάρων παρουσία CsA, η έκφραση του ets-2 mrna αυξήθηκε x2 σε σχέση με την καλλιέργεια των κυττάρων με CsA χωρίς ενεργοποίηση (CM +CsA), ενώ την ίδια στιγμή η IL-2 δεν εκφράζεται (Εικόνα 29A, +CsA, CD4CD45RO). Παρατηρήσαμε λοιπόν ένα διαφορετικό πρότυπο έκφρασης του ets-2 mrna στα ενεργοποιημένα μνημονικά σε σχέση με τα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα. Αξιοσημείωτο είναι ότι τα μνημονικά CD4+CD45RO+CD25+ Tregs εκφράζουν το ets-2 mrna σε χαμηλότερα επίπεδα σε σχέση με τα παρθενικά CD4+CD45RΑ+CD25+ Tregs ενώ η έκφραση του FoxP3 mrna παραμένει σχεδόν ίδια (Εικόνα 29A, CD4CD45ROCD25). Kαι στα μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα όπως και στα παρθενικά δεν ανιχνεύθηκε έκφραση του foxp3 mrna σε καμία από τις καλλιεργητικές συνθήκες, γεγονός που μας οδηγεί στο συμπέρασμα ότι ο foxp3 δεν ελέγχει την ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της IL-2 σε αυτά τα κύτταρα. 74

75 Από τις ίδιες καλλιέργειες παρθενικών και μνημονικών Th κυττάρων απομονώσαμε και ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα ώστε να εξετάσουμε το πρότυπο έκφρασης του παράγοντα Ets-2 στο πρωτεϊνικό επίπεδο σε αυτές τις συνθήκες καλλιέργειας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το πρότυπο έκφρασης σε πρωτεϊνικό επίπεδο ακολουθεί το ίδιο πρότυπο που παρατηρήθηκε στο επίπεδο του mrna (Εικόνα 29Β). Οι αλλαγές που παρατηρήθηκαν σε επίπεδο mrna και ακολουθούνται από αντίστοιχες αλλαγές στο πρωτεϊνικό επίπεδο οδηγούν στο συμπέρασμα ότι ο έλεγχος της έκφρασης του ets-2 στα παρθενικά και μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα συμβαίνει στο επίπεδο της μεταγραφής. Η συσχέτιση της έκφρασης του ets-2 και της IL-2 στα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα μας οδήγησε στο να μελετήσουμε την παράλληλη κινητική έκφρασης των δύο αυτών μορίων ώστε να καθορίσουμε την πορεία έκφρασής τους σε σχέση με τον χρόνο ενεργοποίησης. Έτσι παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα απομονωμένα από αίμα ομφάλιου λώρου καλλιεργήθηκαν παρουσία P/I σε ένα εύρος χρονικού διαστήματος που έφτανε τις 16h (Εικόνα 29C). Η σύνθεση του IL-2 mrna ξεκινάει περίπου στις 4h μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων και φτάνει στην μέγιστη έκφρασή της στις 10h περίπου. Αντίθετα η έκφραση του ets-2 mrna αρχίζει να μειώνεται στις 4h και εξαφανίζεται στις 12h μετά την ενεργοποίηση. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων έκφρασης δείχνουν ότι η μεταγραφική ρύθμιση του ets-2 μετά από μιτογονική διέγερση διαφέρει στα παρθενικά από τα μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα. Το ets-2 mrna συντίθεται σε σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα στα μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα σε σχέση με τα παρθενικά σε CM συνθήκες, γεγονός που ενισχύει την θεωρία της εξαφάνισης του μεταγραφικού καταστολέα στα μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα. Επιπλέον, στα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα η επαγωγή της έκφρασης του IL-2 mrna, συμπίπτει με την σταδιακή μείωση της έκφρασης του ets-2 mrna. Αντίθετα στα μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα, κάτω από τις ίδιες συνθήκες, η έκφραση του ets-2 mrna αυξάνεται. Τέλος, η διακοπή της επαγόμενης από μιτογόνα έκφρασης της IL-2, στα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα, με την κυκλοσπορίνη Α, οδηγεί στην σταθεροποίηση της έκφρασης του ets-2 mrna. Η αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης Ets-2 στα παρθενικά σε σχέση με τα μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα επιβεβαιώθηκε και με ανοσοφθορισμό, όπου χρησιμοποιήθηκε σαν πρώτο αντίσωμα anti-ets-2 και σαν δεύτερο anti-mouse Alexa 488 (Εικόνα 30). Στην Εικόνα 30 μπορούμε να εντοπίσουμε, έκτος από την αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης Ets-2 στα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα και την διασπορά της 75

76 πρωτεΐνης αυτής μέσα στα κύτταρα αυτά. Έτσι και σε αυτή την εικόνα επιβεβαιώνεται η αυξημένη έκφραση της Ets-2 πρωτεΐνης στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα σε σχέση με τα μνημονικά παρατήρηση που επιβεβαιώνει και τα πειράματα Western blot (Εικόνα 29Β- CD4CD45RA-CSA-CM, CD4CD45RO-CsA- CM). Η παρατήρηση αυτή μπορεί να οφείλεται σε μείωση της έκφρασης της πρωτεΐνης αυτής κατά την φάση μετάβασης των κυττάρων από την παρθενική στην ενεργοποιημένη κατάσταση, γεγονός που συμφωνεί με τα αποτελέσματα που θα παρατηρήσουμε παρακάτω. Εικόνα 29: Έκφραση του ets-2 mrna και πρωτεΐνης σε παρθενικά και μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα σε διαφορετικές καλλιεργητικές συνθήκες. A. Τα επίπεδα έκφρασης του ets-2, IL-2 και FoxP3 mrna μετρήθηκαν με την χρήση RT-PCR σε παρθενικά CD4+CD45RA+ και ρυθμιστικά CD4+CD25+ Τh κύτταρα, που απομονώθηκαν από αίμα από ομφάλιο λώρο, και σε μνημονικά CD4+CD45RO+ και ρυθμιστικά CD4+CD45RO+CD25+ Τh κύτταρα που απομονώθηκαν από ολικό αίμα υγιών ενήλικων εθελοντών. Τα κύτταρα αυτά καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία CsA με ταυτόχρονη ενεργοποίηση (ή μη) με μιτογόνα (P/I) για 4h και 12h. Τα ρυθμιστικά Tregs καλλιεργήθηκαν μόνο σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό (CM). Η έκφραση της β2-m χρησιμοποιήθηκε σαν μάρτυρας για την ισοφόρτωση των δειγμάτων. Οι τιμές που αναγράφονται στον πίνακα αντιστοιχούν στο ποσοστό αλλαγής της σύνθεσης του ets-2 mrna (κανονικοποίηση με βάση την έκφραση του β2-m mrna), με την έκφραση του ets-2 mrna στην συνθήκη CD4CD45RA-Csa-P/I να αποτελεί την βάση σύγκρισης. Β. Western blot ανάλυση των επιπέδων της Ets-2 πρωτεΐνης σε CD4CD45RA και CD4CD45RO Th κύτταρα σε συνθήκες CM ή μετά από επώαση για 4h και 12h +P/I ±CsA. Τα πρωτεϊνικά επίπεδα της τουμπουλίνης (tubulin) χρησιμοποιήθηκαν σαν μάρτυρας για την ισοφόρτωση των δειγμάτων. C. Κινητική της έκφρασης των ets-2 και IL-2 mrna σε παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα μετά από μιτογονική διέγερση των κυττάρων. Τα CD4+CD45RA+CD25- παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα απομονώθηκαν με την χρήση sorter και καλλιεργήθηκαν με την προσθήκη μιτογόνων P/I για 2h έως 16h. Η έκφραση της β2-m χρησιμοποιήθηκε σαν μάρτυρας για την ισοφόρτωση των δειγμάτων. Η εικόνα που παρουσιάζεται είναι χαρακτηριστική τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με το ίδιο αποτέλεσμα. 76

77 Εικόνα 30: Εντοπισμός της πρωτεΐνης Ets-2 στα παρθενικά (CD45RA) και μνημονικά (CD45RO) Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα με την χρήση της τεχνικής του ανοσοφθορισμού κύτταρα (CD4+CD45RA+CD25- και CD4+CD45RO+CD25-) αφέθηκαν να προσκολληθούν σε αντικειμενοφόρους πλάκες επικαλυμμένες με poly-l-lysine και μονιμοποιήθηκαν με παραφορμαλδεύδη 4%. Μετά από πλύσεις (1xPBS) και επώαση με blocking buffer, ακολουθεί επώαση με anti-ets-2 ab και δεύτερο αντίσωμα anti-mouse Alexa 488 (πράσινο). Η χρώση των πυρήνων έγινε με διάλυμα DAPI (μπλε) για 10min. Η ανάλυση και παρατήρηση των εικόνων έγινε σε μικροσκόπιο confocal LEICA TCSSP5 σε ανάλυση 63x. 77

78 4. Η έκφραση του παράγοντα ets-2 στην κυτταρική σειρά Jurkat Για την συνέχεια των πειραμάτων μας και ιδιαίτερα για την πραγματοποίηση πειραμάτων διαμολύνσεων ώστε να διευκρινίσουμε τον ρόλο του παράγοντα ets-2 στην έκφραση του γονιδίου της IL-2 και του HIV-1, χρειαζόμασταν ένα σύστημα κυττάρων τα οποία να συμπεριφέρονται όπως τα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα και να μπορούν να απομονωθούν σε μεγάλο αριθμό. Για αυτό το σκοπό χρησιμοποιήσαμε την λευχαιμική κυτταρική σειρά Jurkat. Στην κυτταρική αυτή σειρά ακολουθήσαμε την ίδια πειραματική διαδικασία όπως και στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα. Η συγκεκριμένη κυτταρική σειρά επιλέχθηκε γιατί τα κύτταρα εκφράζουν IL-2 mrna μετά την ενεργοποίησή τους με μιτογόνα ενώ η σύνθεσή της αναστέλλεται με την προσθήκη CsA στην καλλιέργεια [101] (Εικόνα 31). Τα Jurkat κύτταρα επίσης εκφράζουν το ets-2 mrna και την Ets-2 πρωτεΐνη στην CM συνθήκη, όπου μετά από μιτογονική διέγερση των κυττάρων με P/I για 4h η έκφρασή του τόσο σε επίπεδο mrna όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο αρχίζει να μειώνεται (Εικόνα 31Α και Β, - CsA). Όπως και στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα έτσι και στην Jurkat κυτταρική σειρά η προσθήκη CsA στην καλλιέργεια οδηγεί στην σταθεροποίηση της έκφρασης του ets-2 τόσο σε επίπεδο mrna όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης (Εικόνα 31Α και Β, +CsA). Έτσι διαπιστώσαμε ότι και στην κυτταρική σειρά Jurkat υπάρχει αυτή η συσχέτιση της έκφρασης του παράγοντα ets-2 (mrna και πρωτεΐνης) με την έκφραση του IL-2 mrna, δηλαδή μείωση της έκφρασης του Ets-2 μετά από ενεργοποίηση των κυττάρων και ταυτόχρονη αύξηση της έκφρασης της IL-2. Για τον λόγο αυτό η κυτταρική σειρά αυτή θα αποτελέσει χρήσιμο εργαλείο για την συνέχεια των πειραμάτων μας. 78

79 Εικόνα 31: Έκφραση του Ets-2 και της IL-2 στην Jurkat κυτταρική σειρά.a. Τα Jurkat κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό CM±Csa±P/I, για χρονική περίοδο 4h-48h. Τα επίπεδα του ets-2 και IL-2 mrna ανιχνεύθηκαν με την χρήση RT-PCR και η έκφραση της β2-m χρησιμοποιήθηκε σαν μάρτυρας. Οι τιμές που αναγράφονται στον πίνακα αντιστοιχούν στο ποσοστό αλλαγής της σύνθεσης του ets-2 mrna (κανονικοποίηση με βάση την έκφραση του β2-m mrna), με την έκφραση του ets-2 mrna στην συνθήκη CM-Csa-P/I να αποτελεί την βάση σύγκρισης. B. Western blot ανάλυση των επιπέδων της Ets-2 πρωτεΐνης στη Jurkat κυτταρική σειρά. Τα Jurkat κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό CM±Csa±P/I, για χρονική περίοδο 4h-18h. Τα πρωτεϊνικά επίπεδα της τουμπουλίνης (tubulin) χρησιμοποιήθηκαν σαν μάρτυρας για την ισοφόρτωση των δειγμάτων. Οι τιμές που αναγράφονται στον πίνακα αντιστοιχούν στο ποσοστό αλλαγής της έκφρασης της Εts-2 πρωτεΐνης (κανονικοποίηση με βάση την έκφραση της τουμπουλίνης), με την έκφραση της Εts-2 πρωτεΐνης στην συνθήκη CM±CsA να αποτελεί βάση σύγκρισης. Η εικόνα που παρουσιάζεται είναι χαρακτηριστική τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με το ίδιο αποτέλεσμα. 79

80 5. Υπερέκφραση και αποσιώπηση του Ets-2 στην Jurkat κυτταρική σειρά. Ο ρόλος του στην έκφραση της IL-2. Αφού επιβεβαιώσαμε ότι τα κύτταρα της Jurkat κυτταρικής σειράς συμπεριφέρονται όπως τα παρθενικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα, όσον αφορά την έκφραση του παράγοντα Ets-2 και της IL-2, θελήσαμε να μελετήσουμε την άμεση επίδραση που παρουσιάζει ο Ets-2 στην μεταγραφική ενεργότητα του υποκινητή της IL-2. Για αυτό το σκοπό κατασκευάσαμε έναν φορέα υπερέκφρασης του ογκογονιδίου ets-2 (pcdna3-ets-2) με τον οποίο διαμολύναμε τα κύτταρα αυτά. Έτσι τα κύτταρα Jurkat διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο pcdna3-ets-2 ή μόνο με τον φορέα pcdna3, παρέμειναν 6h σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό για να ανακάμψουν και στην συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 6h παρουσία P/I (όπου χρειαζόταν). Μετά από την απομόνωση ολικού mrna και κατασκευή cdna ανιχνεύθηκαν τα επίπεδα σύνθεσης του ενδογενούς IL-2 και του εξωγενούς ets-2 mrna (Εικόνα 32Α). Όπως φαίνεται και στην Εικόνα 32 η έκφραση αυξανομένων ποσοτήτων του ets-2, οδηγεί σε μία σταδιακή μείωση της σύνθεσης του ενδογενούς IL-2 mrna. Η υπερέκφραση της Ets-2 πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε με Western blot ανάλυση (Εικόνα 32Β). Αυτή η σταδιακή μείωση της σύνθεσης του IL-2 mrna συνεχίζεται σε σταθερό ρυθμό όσο αυξάνεται η ποσότητα του ets-2 με την οποία έχουν διαμολυνθεί τα κύτταρα και φτάνει στο 60% πτώσης στην μέγιστη ποσότητα του pcdna3-ets-2 (30μg). Εικόνα 32: Υπερέκφραση του παράγοντα Ets-2 στην Jurkat κυτταρική σειρά. Α. Η εξωγενής σύνθεση του ets-2 και η ενδογενής έκφραση του IL-2 mrna μετρήθηκε με RT-PCR σε κύτταρα Jurkat τα οποία διαμολύνθηκαν με αυξανόμενες ποσότητες του πλασμιδίου pcdna3-ets-2 (0, 10, 20, 30 μg), μέσω του οποίου επιτυγχάνεται η υπερέκφραση του Ets-2. Η ποσότητα του συνολικού DNA ανά δείγμα παρέμενε σταθερή στα 60μg με την προσθήκη σκέτου φορέα pcdna3. H έκφραση της β2-m χρησιμοποιήθηκε σαν μάρτυρας. Οι τιμές που αναγράφονται στον πίνακα αντιστοιχούν στο ποσοστό αλλαγής της σύνθεσης του εξωγενούς ets-2 mrna, με την έκφραση του ets-2 mrna στην συνθήκη διαμόλυνσης με 10μg +P/I να αποτελεί την βάση σύγκρισης. Για την ενδογενή σύνθεση του IL-2 80

81 mrna σαν βάση σύγκρισης χρησιμοποιήθηκε η έκφραση της IL-2 στην συνθήκη CM. H κανονικοποίηση έγινε με βάση την έκφραση του β2-m mrna. Β. Western blot ανάλυση για την επιβεβαίωση της υπερέκφρασης του παράγοντα Ets-2 στα κύτταρα. Τα κύτταρα Jurkat διαμολύνθηκαν με 20μg pcdna3-ets-2 DNA για 6h και ακολούθησε απομόνωση των πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων. Τα πρωτεϊνικά επίπεδα της τουμπουλίνης (tubulin) χρησιμοποιήθηκαν σαν μάρτυρας για την ισοφόρτωση των δειγμάτων. Η εικόνα που παρουσιάζεται είναι χαρακτηριστική τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με το ίδιο αποτέλεσμα. Σε μία αντίθετη προσέγγιση θελήσαμε να απαντήσουμε στο ερώτημα αν η αποσιώπηση του παράγοντα Ets-2 θα μπορούσε να έχει σαν αποτέλεσμα την παροδική έκφραση του IL-2 mrna χωρίς την παρουσία κάποιου μηνύματος ενεργοποίησης. Για αυτό το σκοπό διαμολύναμε κύτταρα Jurkat με τον φορέα plko.1 με 5 κλώνους ets-2 sh-rna ώστε να επιτύχουμε knock down του παράγοντα Ets-2. Τα κύτταρα μετά την διαμόλυνση καλλιεργήθηκαν σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό παρουσία ή απουσία P/I για 6h. Η μείωση των επιπέδων της Ets-2 πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε με ανάλυση Western blot (Εικόνα 33Β). Στην Εικόνα 33Α βλέπουμε ότι η αποσιώπηση του Ets-2 στην CM συνθήκη, οδηγεί σε χαμηλή σύνθεση του IL-2 mrna, γεγονός που επιβεβαιώνει ότι ο παράγοντας Ets-2 δρα σαν καταστολέας της έκφρασης της IL-2 στην Jurkat κυτταρική σειρά, απουσία σημάτων ενεργοποίησης. Αξιοσημείωτο είναι επίσης το γεγονός ότι μικρή μείωση στην έκφραση του IL-2 mrna παρατηρήθηκε και στην συνθήκη όπου έχουμε αποσιώπηση του παράγοντα Ets-2 αλλά και σε ενεργοποιημένα με P/I κύτταρα Jurkat (Εικόνα 33Α-P/I). Αυτό το αποτέλεσμα μας οδηγεί στην υπόθεση ότι ο Ets-2 κάτω από συνθήκες ενεργοποίησης παύει να διαδραματίζει τον ρόλο του καταστολέα της IL-2 και δρα ίσως πια σαν ενεργοποιητής. Εικόνα 33: Knock down του παράγοντα Ets-2 στην Jurkat κυτταρική σειρά. Α. Τα Jurkat κύτταρα διαμολύνθηκαν με τον φορέα plko.1 και ένα μείγμα 5 κλώνων shrna-ets-2 και στην συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό CM±P/I για 6h. Ακολούθησε απομόνωση του RNA, κατασκευή cdna και ανίχνευση των επιπέδων του IL-2 mrna με Real time PCR. Η έκφραση της β2- m χρησιμοποιήθηκε ως normalizer και η συνθήκη CM ως calibrator. Τα αποτελέσματα 81

82 παρουσιάζονται ως μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (mean ±SD) Β. Western blot ανάλυση για την επιβεβαίωση της αποσιώπησης του παράγοντα Ets-2. Τα πρωτεϊνικά επίπεδα της τουμπουλίνης (tubulin) χρησιμοποιήθηκαν σαν μάρτυρας για την ισοφόρτωση των δειγμάτων. Η εικόνα που παρουσιάζεται είναι χαρακτηριστική τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με το ίδιο αποτέλεσμα. 6. Δοσοεξαρτώμενη καταστολή της έκφρασης της IL-2 και του HIV1-LTR μέσω της πρόσδεσης του Ets-2 στην ARRE-2 και RATS αλληλουχία αντίστοιχα Θέλοντας να επιβεβαιώσουμε την κατασταλτική δράση του παράγοντα Ets-2 στην έκφραση της IL-2 και του HIV1-LTR, μέσω της πρόσδεσής του στις αλληλουχίες δέσμευσής του στα στοιχεία αυτά, προχωρήσαμε σε πειράματα συνδιαμολύνσεων. Έτσι συνδυαμολύναμε κύτταρα Jurkat με αυξανόμενες ποσότητες του φορέα υπερέκφρασης pcdna3-ets-2 με τα πλασμίδια αναφοράς που φέρουν i. τον υποκινητή της IL-2 (-300 έως +1) υβριδοποιημένο με το γονίδιο που κωδικοποιεί το ένζυμο CAT (Εικόνα 34Α) ii. το γονίδιο αναφοράς CAT κάτω από τον έλεγχο 4 αντιγράφων της ARRE-2 αλληλουχίας (4xARRE-CAT) (Εικόνα 34Β) iii. τo CAT γονίδιο αναφοράς κάτω από τον έλεγχο 2 αντίγραφων της ARRE-2 αλληλουχίας με σημειακή μετάλλαξη στην αλληλουχία πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 (2xmutantARRE-CAT) (Εικόνα 34C) iv. τo CAT γονίδιο αναφοράς κάτω από τον έλεγχο ολόκληρης της LTR αλληλουχίας του HIV-1 (pucbenn-cat) (Εικόνα 35Α) v. τo CAT γονίδιο αναφοράς κάτω από τον έλεγχο 2 αντιγράφων της RATS αλληλουχίας του HIV1-LTR (2xRATS-CAT) (Εικόνα 35Β) vi. τo CAT γονίδιο αναφοράς κάτω από τον έλεγχο 2 αντιγράφων της RATS αλληλουχίας του HIV1- LTR με σημειακή μετάλλαξη στην αλληλουχία πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 (2xmutantRATS-CAT) (Εικόνα 35C) και vii. ως μάρτυρα το πλασμίδιο αναφοράς CMV-CAT (Εικόνα 34D και 35D). Όσον αφορά την έκφραση της IL-2 όπως μπορούμε να δούμε στην Εικόνα 34 αυξανόμενα επίπεδα έκφρασης του παράγοντα Ets-2 οδηγούν σε σταδιακή μείωση της έκφρασης τόσο του IL-2-CAT όσο και του 4xARRE2-CAT με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Αυτή η μείωση φτάνει στο 40% περίπου της αρχικής έκφρασης (και στα δύο στοιχεία) όταν τα κύτταρα έχουν διαμολυνθεί με την μέγιστη ποσότητα φορέα υπερέκφρασης του παράγοντα Ets-2 (40μg) (Εικόνα 34Α και Β). Δεν παρατηρήθηκαν τα ίδια αποτελέσματα για τα στοιχεία 2xmutantARRE-CAT και CMV-CAT, 82

83 οδηγώντας μας έτσι στο συμπέρασμα ότι υπάρχει μία ειδικότητα ως προς την περιοχή πρόσδεσης της πρωτεΐνης Ets-2. Εικόνα 34: Ο παράγοντας Ets-2 καταστέλλει τη έκφραση της IL-2 μέσω του στοιχείου ARRE-2. Η έκφραση του ενζύμου CAT που ελέγχεται Α. από τον υποκινητή της IL-2, B. 4 αντίγραφα της ARRE-2 αλληλουχίας, C. 2 αντίγραφα της ARRE-2 αλληλουχίας με σημειακή μετάλλαξη στην αλληλουχία πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2, D. τον υποκινητή του CMV ως μάρτυρα. Τα CAT assays πραγματοποιήθηκαν με εκχυλίσματα από κύτταρα Jurkat που έχουν διαμολυνθεί με αυξανόμενες ποσότητες του πλασμιδίου pcdna3-ets-2 (0, 5, 10, 20, 40 μg) και σταθερή ποσότητα από τα πλασμίδια αναφοράς (20μg). Η ποσότητα DNA με την οποία διαμολύνθηκαν τα κύτταρα διατηρήθηκε στα 60μg/ανά δείγμα με την προσθήκη του φορέα pcdna3. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό (CM) πριν την διαμόλυνση. Μετά την διαμόλυνση παρέμειναν για άλλες 6h σε CM για να ανακάμψουν και στην συνέχεια καλλιεργήθηκαν παρουσία P/I για άλλες 6h. Τα αποτελέσματα περιγράφονται ως ποσοστό επί της % (mean ± SEM) της ενεργότητας του ενζύμου CAT από τρία ανεξάρτητα πειράματα, με την μέγιστη ενεργότητα του CAT ενζύμου (100%) να αποτελεί την βάση σύγκρισης σε κάθε πείραμα. 83

84 Την ίδια πειραματική διαδικασία ακολουθήσαμε και για τις αλληλουχίες που σχετίζονται με τον HIV1-LTR (Εικόνα 35Α, Β, C). Και σε αυτή την περίπτωση παρατηρήθηκε ότι αυξανομένης της ποσότητας του pcdνa3-ets-2 με την οποία διαμολύναμε τα κύτταρα, μειώνεται σταδιακά τόσο η έκφραση του pucbenn-cat όσο και του 2xRATS-CAT (Εικόνα 35Α, Β). Αυτό δεν παρατηρήθηκε για το 2xmutantRATS-CAT και CMV-CAT (Εικόνα 35C, D) υποδηλώνοντας και σε αυτή την περίπτωση ειδικότητα ως προς την δέσμευση του παράγοντα Ets-2 στην RATS αλληλουχία του HIV1-LTR καθώς δεν υπήρξε μείωση στην έκφραση όταν χρησιμοποιήσαμε πλασμίδιο αναφοράς με μεταλλαγή στην περιοχή πρόσδεσης του παράγοντα (Εικόνα 35C). Σε μία αντίθετη προσέγγιση συνδιαμολύναμε τα κύτταρα Jurkat, αντί με τον φορέα υπερέκφρασης του Ets-2, με τον φορέα plko.1 με 5 κλώνους ets-2 sh-rna ώστε να επιτύχουμε knock down του παράγοντα Ets-2 και να εξετάσουμε τι επίδραση θα έχει η μειωμένη έκφρασή του στην μεταγραφική ενεργότητα του pucbenn-cat (Εικόνα 36Α) και του 2xRATS-CAΤ (Εικόνα 36Β). Όπως φαίνεται και στην Εικόνα 36 όσο αυξάνεται η ποσότητα των sh-rna κλώνων, τόσο αυξάνεται και η μεταγραφική ενεργότητα των δύο αυτών στοιχείων. Καμία αλλαγή δεν παρατηρήθηκε στην ενεργότητα του 2xmutantRATS-CAT (Εικόνα 36C). Τα παραπάνω αποτελέσματα σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα των πειραμάτων EMSA (Εικόνα 26, 27) συνηγορούν στην άποψη ότι ο παράγοντας Ets-2 καταστέλλει την έκφραση τόσο της IL-2 όσο και του HIV1-LTR μέσω της πρόσδεσής του στην κοινή τους αλληλουχία (ARRE-2 για την IL-2 και RATS για τον HIV-1). 84

85 Εικόνα 35: Ο παράγοντας Ets-2 καταστέλλει την έκφραση του HIV1-LTR μέσω του στοιχείου RATS. Η έκφραση του ενζύμου CAT που ελέγχεται A. Από την LTR αλληλουχία του HIV-1 B. 2 αντίγραφα της RATS αλληλουχίας, C. 2 αντίγραφα της RATS αλληλουχίας με σημειακή μετάλλαξη στην αλληλουχία πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2, D. τον υποκινητή του CMV ως μάρτυρα. Τα CAT assays πραγματοποιήθηκαν με εκχυλίσματα από κύτταρα Jurkat που έχουν διαμολυνθεί με αυξανόμενες ποσότητες του πλασμιδίου pcdna3-ets-2 (0, 5, 10, 20, 40 μg) και σταθερή ποσότητα από τα πλασμίδια αναφοράς (20μg). Η ποσότητα DNA με την οποία διαμολύνθηκαν τα κύτταρα διατηρήθηκε στα 60μg/ανά δείγμα με την προσθήκη του φορέα pcdna3. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό (CM) πριν την διαμόλυνση. Μετά την διαμόλυνση παρέμειναν για άλλες 6h σε CM για να ανακάμψουν και στην συνέχεια καλλιεργήθηκαν παρουσία P/I για άλλες 6h. Τα αποτελέσματα περιγράφονται ως ποσοστό επί της % (mean ± SEM) της ενεργότητας του ενζύμου CAT από τρία ανεξάρτητα πειράματα, με την μέγιστη ενεργότητα του CAT ενζύμου (100%) σε κάθε πείραμα να αποτελεί βάση σύγκρισης. Οι στατιστικά σημαντικές διαφορές αναγράφονται με αστερίσκους (***, P<0.001, **p<0.01, *p<0.1, συγκρινόμενα με 1-way ANOVA). 85

86 Εικόνα 36: Knock down του παράγοντα Ets-2 στην Jurkat κυτταρική σειρά και η δράση του στην έκφραση του HIV1-LTR. Η έκφραση του ενζύμου CAT που ελέγχεται A. Από την LTR αλληλουχία του HIV1 B. 2 αντίγραφα της RATS αλληλουχίας, C. 2 αντίγραφα της RATS αλληλουχίας με σημειακή μετάλλαξη στην αλληλουχία πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2. Τα CAT assays πραγματοποιήθηκαν με εκχυλίσματα από κύτταρα Jurkat που έχουν διαμολυνθεί με αυξανόμενες ποσότητες του πλασμιδίου plko.1 με 5 κλώνους ets-2 sh-rna (0, 0,5, 1μg) και σταθερή ποσότητα από τα πλασμίδια αναφοράς (1μg). Η ποσότητα DNA με την οποία διαμολύνθηκαν τα κύτταρα διατηρήθηκε στα 2μg/ανά δείγμα με την προσθήκη του φορέα plko.1. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό (CM) πριν την διαμόλυνση. Μετά την διαμόλυνση παρέμειναν για άλλες 6h σε CM για να ανακάμψουν και στην συνέχεια καλλιεργήθηκαν παρουσία P/I για άλλες 6h. Τα αποτελέσματα περιγράφονται ως ποσοστό επί της % (mean ± SEM) της ενεργότητας του ενζύμου CAT από τρία ανεξάρτητα πειράματα, με την μέγιστη ενεργότητα του CAT ενζύμου (100%) σε κάθε πείραμα να αποτελεί την βάση σύγκρισης. Οι στατιστικά σημαντικές διαφορές αναγράφονται με αστερίσκους (***, P<0.001, **p<0.01, *p<0.1, συγκρινόμενα με 1-way ANOVA). 86

87 7. Ο παράγοντας Ets-2 είναι γενικός καταστολέας της έκφρασης της IL-2 Για να εξετάσουμε αν η πρωτεΐνη Ets-2 καταστέλλει την έκφραση του IL-2 mrna και σε άλλα κύτταρα εκτός από τα Τ λεμφοκύτταρα, αναζητήσαμε κυτταρικές σειρές οι οποίες εκφράζουν το IL-2 mrna χωρίς την επαγωγή τους με κάποιο μιτογόνο. Έτσι βρήκαμε ότι οι λευχαιμικές κυτταρικές σειρές U266, RPMI 788, Sultan, THP1, IM9, U937, Raji και MM εκφράζουν ενδογενώς τα ets-2 και IL-2 mrna σε διαφορετικά επίπεδα (Εικόνα 37). Από αυτές τις κυτταρικές σειρές τα THP1 εκφράζουν τα υψηλότερα επίπεδα του ets-2 mrna και τα Raji τα υψηλότερα επίπεδα του IL-2 mrna. Εικόνα 37: Έκφραση του ets-2 και του IL-2 mrna σε διάφορες λευχαιμικές κυτταρικές σειρές. Η μέτρηση των επιπέδων του mrna έγινε με RT-PCR. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό CM απουσία μιτογόνων. Η έκφραση της β2-m χρησιμοποιήθηκε σαν μάρτυρας για την ισοφόρτωση των δειγμάτων. Η εικόνα που παρουσιάζεται είναι χαρακτηριστική τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με το ίδιο αποτέλεσμα. Η κυτταρική σειρά Raji, που είναι μία Β λεμφοκυτταρική σειρά, χρησιμοποιήθηκε για να εξετάσουμε αν η υπερέκφραση της Ets-2 πρωτεΐνης μπορεί να οδηγήσει και σε αυτή την κατηγορία κυττάρων, στην μείωση των επιπέδων του IL-2 mrna. Έτσι τα κύτταρα αυτά διαμολύνθηκαν με τον φορέα υπερέκφρασης του Ets-2 και με την χρήση RT-PCR εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασης του IL-2 mrna. Τα επίπεδα της υπερεκφρασμένης Ets-2 πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με ανάλυση Western blot (Εικόνα 38Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν, ότι όπως και στην περίπτωση των Jurkat κυττάρων η υπερέκφραση της Ets-2 πρωτεΐνης στην Raji κυτταρική σειρά οδηγεί σε μείωση της ενδογενούς έκφρασης του IL-2 mrna (Εικόνα 38Α). Το συμπέρασμα της πειραματικής αυτής διαδικασίας είναι ότι ο παράγοντας Ets-2 δρα σαν καταστολέας της έκφρασης της IL-2 και σε κύτταρα πέρα των Τ λεμφοκυττάρων. 87

88 Εικόνα 38: Έκφραση του ets-2 και IL-2 mrna στην Raji κυτταρική σειρά. Α. Η εξωγενής έκφραση του ets-2 mrna και η ενδογενής έκφραση του IL-2 mrna ανιχνεύθηκε με RT-PCR σε κύτταρα Raji τα οποία είχαν διαμολυνθεί με αυξανόμενες ποσότητες του φορέα υπερέκφρασης pcdna3-ets-2 (0, 10, 20, 30 μg). Η ποσότητα DNA με την οποία διαμολύνθηκαν τα κύτταρα διατηρήθηκε στα 60μg/ανά δείγμα με την προσθήκη του φορέα pcdna3. Τα κύτταρα παρέμειναν σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό CM για 6h μετά την διαμόλυνση. Η έκφραση της β2-m χρησιμοποιήθηκε σαν μάρτυρας για την ισοφόρτωση των δειγμάτων. Οι τιμές που αναγράφονται στον πίνακα αντιστοιχούν στο ποσοστό αλλαγής της σύνθεσης του εξωγενούς ets-2 mrna, με την έκφραση του ets-2 mrna στην συνθήκη διαμόλυνσης με 10μg του pcdna3-ets-2 να αποτελεί βάση σύγκρισης. Β. Western blot ανάλυση για την επιβεβαίωση της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης Εts-2 στα κύτταρα Raji. Τα κύτταρα αυτά διαμολύνθηκαν με 20 μg pcdna3-ets-2 DNA ή pcdna3 και μετά από καλλιέργεια σε CM για 6h ακολούθησε απομόνωση ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων. Τα πρωτεϊνικά επίπεδα της τουμπουλίνης (tubulin) χρησιμοποιήθηκαν σαν μάρτυρας για την ισοφόρτωση των δειγμάτων. Η εικόνα που παρουσιάζεται είναι χαρακτηριστική τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με το ίδιο αποτέλεσμα. 8. Ο παράγοντας Ets-2 καταστέλλει την έκφραση του IL-2 mrna μέσω της πρόσδεσής του στο ARRE-2 στοιχείο του υποκινητή της IL-2 Για να αποδείξουμε ότι ο Εts-2 καταστέλλει την έκφραση της IL-2 μέσω της πρόσδεσής του στην ARRE-2 αλληλουχία του υποκινητή της IL-2 πραγματοποιήσαμε πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης (ChIP). Για την πειραματική αυτή διαδικασία απομονώσαμε χρωματίνη από Jurkat κύτταρα (Εικόνα 39Β), CD3+CD4+CD45RA+CD25- παρθενικά Τh κύτταρα (Εικόνα 39C) και CD3+CD4+CD45RO+CD25- μνημονικά Τh κύτταρα (Εικόνα 39D). Τα κύτταρα αυτά καλλιεργήθηκαν σε πλήρες καλλιεργητικό μέσο (CM) παρουσία ή απουσία P/I ή CsA για 6h. Το σύμπλοκο χρωματίνης/πρωτεϊνών κατακρημνίστηκε με την χρήση αντισωμάτων έναντι των πρωτεϊνών Ets-2 και PolII και η συσχέτισή τους με τον 88

89 υποκινητή της IL-2 έγινε με RT-PCR με την χρήση κατάλληλων εκκινητών. Οι περιοχές ανίχνευσης περιγράφονται σχηματικά στην Εικόνα 38Α. Έτσι μελετήσαμε την ικανότητα πρόσδεσης της Ets-2 πρωτεΐνης στις περιοχές ARRE-2 και ARRE-1 (περιοχή TATA box του υποκινητή και αλληλουχίες αναγνώρισης από Ets-2 και NFAT) (Εικόνα 39Β, C, D). Σαν περιοχή μάρτυρα χρησιμοποιήσαμε περιοχή του υποκινητή της β2-m (β2-m TATA box). Σημαντική παρατήρηση στην πειραματική αυτή διαδικασία είναι το εύρημα ότι στα εν ηρεμία Jurkat και παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα ο Ets-2 είναι προσδεδεμένος στην περιοχή της χρωματίνης που εμπεριέχει την ARRE-2 αλληλουχία του υποκινητή της IL-2 (Εικόνα 39Β, C - CM-ARRE-2). Αντίθετα η ενεργοποίηση των κυττάρων με P/I οδήγησε στην αποχώρηση του Ets-2 από την ARRE-2 αλληλουχία και την πρόσδεση της PolII στην IL-2 TATA/ARRE-1 περιοχή, γεγονός που συνάδει με την ενεργοποίηση της IL-2 τόσο στα Jurkat όσο και στα παρθενικά Τ κύτταρα (Εικόνα 39 B, C, -CsA). Η μη ανίχνευση ικανοποιητικής ικανότητας πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 στην ARRE-2 αλληλουχία σε ενεργοποιημένα Jurkat ή παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα συμπίπτει με την μείωση του ets-2 mrna και την αντίστοιχη μείωση της Ets-2 πρωτεΐνης που αναφέρθηκε στα προηγούμενα πειράματα (Εικόνα 29, 31, 32). Αντιθέτως, τα αντίστροφα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στα μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα, όπου η ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 στην ARRE-2 περιοχή ανιχνεύθηκε με μεγαλύτερη ένταση στα ενεργοποιημένα (συνθήκη P/I) σε σχέση με τα εν ηρεμία κύτταρα (CM) (Εικόνα 39D, -CsA). Αυτά τα δεδομένα προτείνουν μια αλλαγή του ρόλου της ARRE-2 περιοχής στα μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα, όπου φαίνεται να συμμετέχει στην ενεργοποίηση της έκφρασης του γονιδίου της IL-2. Επιπλέον η πρόσδεση του Ets-2 στην ARRE-2 περιοχή στα ενεργοποιημένα με μιτογόνα (P/I) μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα συμφωνεί με την μικρή αύξηση του Ets-2 mrna και πρωτεΐνης σε αυτά τα κύτταρα στην συνθήκη P/I που παρατηρήσαμε σε προηγούμενα πειράματα (Εικόνα 29Α, Β- CD45RO-CsA). Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με προγενέστερες μελέτες που έχουν γίνει και αναφέρονται στην ύπαρξη ή απουσία έκφρασης της IL-2 σχετιζόμενη με την ARRE-2 αλληλουχία [30-32 και Εικόνα 26]. Σε αντίθεση με αυτά που παρατηρήθηκαν για το ARRE-2 στοιχείο, η πρόσδεση του Εts-2 στην IL-2 TATA/ARRE-1 περιοχή φαίνεται να είναι αυξημένη στα ενεργοποιημένα παρθενικά και Jurkat κύτταρα (Εικόνα 39B, C, -CsA, Ab-Ets-2). Στα μνημονικά Th κύτταρα η ικανότητα πρόσδεσης του Ets-2 στην IL-2 TATA/ARRE-1 89

90 περιοχή φαίνεται να είναι ισοδύναμη τόσο στην CM όσο και στην P/I συνθήκη (Εικόνα 39D, -CsA, Ab-Ets-2). Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι μετά την καλλιέργεια των κυττάρων παρουσία CsΑ, ο Ets-2 παραμένει σταθερά προσδεδεμένος στην ARRE-2 περιοχή ακόμα και μετά από ενεργοποίηση των κυττάρων με P/I (Εικόνα 39B, C, D, +CsA, Ab-Ets-2). Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με τα προηγούμενα πειράματα στα οποία παρατηρήσαμε σταθεροποίηση της έκφρασης του ets-2 σε επίπεδο mrna και πρωτεΐνης, μετά την καλλιέργεια των κυττάρων παρουσία CsA (Εικόνα 29, 31 +CsA). Επιπλέον η CsA μπλόκαρε την πρόσδεση του Ets-2 στην TATA/ARRE-1 περιοχή. Αφού η P/I-NFAT εξαρτώμενη ενεργοποίηση της έκφρασης της IL-2 μπλοκάρεται παρουσία CsA, οδηγούμαστε στο συμπέρασμα ότι η μειωμένη ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 στην ARRE-2 περιοχή του υποκινητή είναι ένα προαπαιτούμενο γεγονός για την μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου της IL-2. Όταν χρησιμοποιήσαμε αντίσωμα έναντι της ανθρώπινης πολυμεράσης ΙΙ (PolII), τα αποτελέσματα που ελήφθησαν ήταν παρόμοια στα Jurkat και παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα (Εικόνα 39B, C, -CsA, Ab-PolII). Έτσι στην συνθήκη CM η PolII φαίνεται προσδεδεμένη στην ARRE-2 περιοχή ενώ μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων με P/I, πρόσδεση της PolII εμφανίζεται στην TATA/ARRE-1 περιοχή. Η παρουσία της PolII στην ARRE-2 περιοχή σε εν ηρεμία κατάσταση των κυττάρων, μπορεί να αντανακλά την συσχέτιση της πρωτεΐνης αυτής με άλλους παράγοντες που προσδένονται στην περιοχή αυτή και βρίσκονται σε μία κατάσταση «ετοιμότητας» να δράσουν κάτω από το κατάλληλο ερέθισμα. Από την άλλη η μεταφορά της PolII στην TATA/ARRE-1 περιοχή μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων συμφωνεί με την ενεργοποίηση του γονιδίου της IL-2. Αντίθετα στα μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα η PolII προσδένεται το ίδιο ισχυρά στην ARRE-2 περιοχή τόσο στην CM όσο και στη P/I συνθήκη (Εικόνα 39D, -CsA, PolII). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν για τα Jurkat και τα παρθενικά Τh κύτταρα, η μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου της IL-2 προϋποθέτει την πρόσδεση της PolII στην TATA/ARRE-1 περιοχή του υποκινητή. Η αναστολή της μεταγραφικής ενεργοποίησης του γονιδίου της IL-2 με την προσθήκη της CsA, οδήγησε και στην αναστολή πρόσδεσης της PolII στην TATA/ARRE-1 (Εικόνα 39Β, C, D, +CsA, Ab- PolII), επιβεβαιώνοντας έτσι τα παραπάνω συμπεράσματά μας. 90

91 Για να επιβεβαιώσουμε την ειδικότητα της πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 στις περιοχές αυτές χρησιμοποιήσαμε σαν μάρτυρα την περιοχή του υποκινητή της β2-m. Κατακρήμνιση χρωματίνης με την χρήση Ets-2 αντισώματος δεν ανέδειξε καμία ικανότητα πρόσδεσης της πρωτεΐνης αυτής στην περιοχή του υποκινητή της β2-m σε καμία από τις συνθήκες και κατηγορίες κυττάρων που εξετάστηκαν (Εικόνα 39B, C, D, β2-m TATA). Αντίθετα όταν χρησιμοποιήθηκε το PolII αντίσωμα, η περιοχή που περιλαμβάνει το TATA box του υποκινητή της β2-m κατακρημνίστηκε σε όλες τις κατηγορίες κυττάρων και σε όλες τις συνθήκες σε ίσες σχεδόν ποσότητες (Εικόνα 39B, C, D - β2-m TATA), γεγονός που συμφωνεί με τις ιδιότητες έκφρασης του γονιδίου της β2-μικρογλοβουλίνης. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι ο παράγοντας Ets-2 προσδένεται στην ARRE-2 αλληλουχία του υποκινητή της IL-2, στα Jurkat και παρθενικά Τ κύτταρα, όταν το γονίδιο της IL-2 δεν είναι μεταγραφικά ενεργό. Η επαγωγή του γονιδίου της IL-2 σχετίζεται με χαμηλή ικανότητα πρόσδεσης της Ets-2 πρωτεΐνης στην ARRE-2 αλληλουχία, γεγονός που ενισχύει την άποψη ότι ο παράγοντας Ets-2 δρα σαν καταστολέας της έκφρασης της IL-2 στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα μέσω της πρόσδεσής του στην ARRE-2 αλληλουχίας του υποκινητή. 91

92 Εικόνα 39:Πρόσδεση του παράγοντα Ets-2 σε ενδογενείς περιοχές του υποκινητή της ΙL-2 μέσω ανάλυσης ChIP. Α. Σχηματική αναπαράσταση του υποκινητή της IL-2. Αναγράφονται οι περιοχές ARRE-2, ARRE-1, TATA box, το σημείο έναρξης της μεταγραφής (+1) καθώς και άλλες σημαντικές αλληλουχίες του υποκινητή (OCT, TCE d ). Οι θέσεις αναγνώρισης των εκκινητών για τον πολλαπλασιασμό των ανάλογων περιοχών φαίνονται με βέλη. Το ζευγάρι εκκινητών Ρ1-Ρ2 χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της περιοχής που περιλαμβάνει την ARRE-2 αλληλουχία (200bp). Το ζευγάρι εκκινητών Ρ3-Ρ4 χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της περιοχής που περιλαμβάνει την ΤΑΤΑ box και ARRE-1 αλληλουχία (140bp). Για την ChIP ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν, Β. Jurkat κύτταρα, C. CD4+CD45RA+CD25- παρθενικά Th κύτταρα (CD4CD45RA) και D. CD4+CD45RO+CD25- μνημονικά Th κύτταρα (CD4CD45RO). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε CM±P/I±CsA για 6 h. Η ChIP ανάλυση πραγματοποιήθηκε με την χρήση των αντισωμάτων anti-ets-2 και anti-polii. Η crosslinked χρωματίνη από κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε CM, πριν από την διαδικασία της ανοσοκατακρήμνισης, χρησιμοποιήθηκε σαν μάρτυρας σε κάθε διαδικασία πολλαπλασιασμού των περιοχών με PCR, με τους ανάλογους εκκινητές, ώστε να επαληθεύσουμε ότι όλες οι αντιδράσεις εμπεριέχουν την ίδια συγκέντρωση χρωματίνης για την ανοσοκατακρήμνιση (INPUT). Σαν αρνητικό μάρτυρα πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις χωρίς την προσθήκη χρωματίνης (- ch). Σαν εσωτερικό μάρτυρα για την επιβεβαίωση της ακρίβειας της ChIP ανάλυσης (αντισωμάτων και πολλαπλασιασμένων περιοχών), πραγματοποιήθηκε PCR για την ανίχνευση της TATA box περιοχής του υποκινητή της β2-μικρογλοβουλίνης (β2-m TATA). Τα προϊόντα της PCR ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης παρουσία EthBr. Η εικόνα που παρουσιάζεται είναι χαρακτηριστική τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με το ίδιο αποτέλεσμα. 92

93 9. Ο παράγοντας Ets-2 καταστέλλει την έκφραση του HIV-1 μέσω της πρόσδεσής του στο RATS στοιχείο της LTR αλληλουχίας Αφού αποδείξαμε ότι ο παράγοντας Ets-2 καταστέλλει την έκφραση της IL-2 μέσω της πρόσδεσής του στην ARRE-2 αλληλουχία του υποκινητή, θελήσαμε να επιβεβαιώσουμε την κατασταλτική δράση της Ets-2 πρωτεΐνης στην έκφραση του HIV-1-LTR μέσω της δέσμευσής του στην RATS αλληλουχία. Για το σκοπό αυτό ακολουθήσαμε ξανά την πειραματική διαδικασία της ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης αυτή την φορά σε Jurkat κύτταρα τα οποία πρώτα διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο pucbenn-cat (Εικόνα 40). Τα κύτταρα αυτά στην συνέχεια καλλιεργήθηκαν απουσία (CM) ή παρουσία (P/I) μιτογόνων για 6h. Το σύμπλοκο χρωματίνης/πρωτεϊνών κατακρημνίστηκε με την χρήση αντισωμάτων έναντι των πρωτεϊνών Ets-2 και PolII και η συσχέτισή τους με την LTR αλληλουχία του HIV-1 ανιχνεύθηκε με RT-PCR με την χρήση κατάλληλων εκκινητών. Σαν αλληλουχία μάρτυρα χρησιμοποιήσαμε, και σε αυτή την περίπτωση, περιοχή του υποκινητή της β2-m (β2-m TATA box). Η σημαντική παρατήρηση στην πειραματική αυτή διαδικασία ήταν η ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 στην LTR αλληλουχία στα εν ηρεμία Jurkat κύτταρα, η οποία εξαφανίζεται μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων με μιτογόνα (Εικόνα 40- CM-LTR-abEts-2). Η αποχώρηση της πρωτεΐνης Ets-2 από την LTR αλληλουχία, μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων, συνδυάζεται με την ταυτόχρονη ανίχνευση της πρωτεΐνης PolII στην περιοχή αυτή (Εικόνα 40-P/I-LTR-abPolII), που συνάδει με την ενεργοποίηση της περιοχής LTR η οποία λειτουργεί σαν υποκινητής του γονιδιώματος του HIV-1 [102]. Η πρωτεΐνη Ets-2, όπως περιμέναμε, δεν ανιχνεύθηκε στην αλληλουχία του υποκινητή της β2-m. Όπως παρατηρήσαμε και για τον υποκινητή της IL-2 (Εικόνα 39 Β, C, D-ab-PolII-β2-m TATA), όταν χρησιμοποιήσαμε αντίσωμα anti-polii η περιοχή που περιλαμβάνει το TATA box του υποκινητή της β2-m κατακρημνίστηκε σε όλες τις συνθήκες (CM, P/I) σε ίσες σχεδόν ποσότητες (Εικόνα 40-ab-PolII-β2-m TATA). Τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν συμφωνούν με αυτά που αναφέραμε για την ρύθμιση του γονιδίου της IL-2, υποδηλώνοντας έτσι μία κοινή ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της IL-2 και του HIV-1-LTR μέσω της πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 στην κοινή τους αλληλουχία. 93

94 LTR Εικόνα 40: Πρόσδεση του παράγοντα Ets-2 στην LTR (+RATS) περιοχή του HIV-1 μέσω ανάλυσης ChIP. Για την ChIP ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν Jurkat κύτταρα τα οποία διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο pucbenn-cat. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό (CM) πριν την διαμόλυνση. Μετά την διαμόλυνση παρέμειναν για άλλες 6h σε CM για να ανακάμψουν και στην συνέχεια καλλιεργήθηκαν παρουσία P/I για άλλες 6h. Η ChIP ανάλυση πραγματοποιήθηκε με την χρήση των αντισωμάτων anti-ets-2 και anti-polii. Η crosslinked χρωματίνη από κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε CM, πριν από την διαδικασία της ανοσοκατακρήμνισης, χρησιμοποιήθηκε σαν μάρτυρας σε κάθε διαδικασία πολλαπλασιασμού των περιοχών με PCR, με τους ανάλογους εκκινητές, ώστε να επαληθεύσουμε ότι όλες οι αντιδράσεις εμπεριέχουν την ίδια συγκέντρωση χρωματίνης για την ανοσοκατακρήμνιση (INPUT). Σαν αρνητικός μάρτυρας πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις χωρίς την προσθήκη χρωματίνης (-ch). Σαν εσωτερικός μάρτυρας για την επιβεβαίωση της ακρίβειας της ChIP ανάλυσης (αντισωμάτων και πολλαπλασιασμένων περιοχών), πραγματοποιήθηκε PCR για την ανίχνευση της TATA box περιοχής του υποκινητή της β2-μικρογλοβουλίνης (β2-m TATA). Τα προϊόντα της PCR ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης παρουσία EthBr. Η εικόνα που παρουσιάζεται είναι χαρακτηριστική τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με το ίδιο αποτέλεσμα. Η ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 στην LTR αλληλουχία του HIV-1 επιβεβαιώθηκε και in vivo με την χρήση αυτή την φορά της τεχνικής DNA-FISH (Fluorescence in situ hybridization) (Εικόνα 41). Έτσι κύτταρα Jurkat πρώτα διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο pucbenn-cat και στην συνέχεια καλλιεργήθηκαν απουσία (CM) ή παρουσία (P/I) μιτογόνων για 6h. Όπως φαίνεται και στην Εικόνα 41A στην CM συνθήκη ο παράγοντας Ets-2 συνεντοπίζεται με την LTR αλληλουχία του HIV-1-LTR (κίτρινα spots). Αντίθετα μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων (P/I) τόσο ο παράγοντας Ets-2 (πράσινα spots) όσο και η pucbenn αλληλουχία (pucbenn-κόκκινα spots) παρουσιάζονται ελεύθερα στον πυρήνα (DAPI-μπλε). Όταν τα κύτταρα Jurkat διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο 2xmutantRATS (Εικόνα 41Β), που φέρει μία σημειακή μετάλλαξη στην αλληλουχία πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2, τότε καμία ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα δεν παρουσιάστηκε. Αυτό το γεγονός επιβεβαιώνει την ειδικότητα πρόσδεσης της πρωτεΐνης Ets-2 στην RATS αλληλουχία του HIV1-LTR. 94

95 CM A P/I CM B P/I Εικόνα 41: Συνεντοπισμός της πρωτεΐνης Ets-2 και της LTR αλληλουχίας του HIV1-LTR (pucbenn) στην Jurkat κυτταρική σειρά με την χρήση Immuno-DNA FISH Jurkat κύτταρα διαμολύνθηκαν με Α. το πλασμίδιο pucbenn-cat και Β. με το πλασμίδιο 2xmutantRATS-CAT (φέρει 2 αντίγραφα της αλληλουχίας RATS με σημειακή μετάλλαξη στην αλληλουχία πρόσδεσης της πρωτεΐνης Ets-2). Τα διαμολυνσμένα κύτταρα Jurkat αφέθηκαν να προσκολληθούν σε αντικειμενοφόρους πλάκες επικαλυμμένες με poly-l-lysine και μονιμοποιήθηκαν με παραφορμαλδεύδη 4%. Μετά από πλύσεις (1xPBS) και επώαση με blocking buffer ακολουθεί επώαση με anti-ets-2 ab και δεύτερο αντίσωμα anti-mouse Alexa 488 (πράσινο). Μετά από αποδιάταξη του DNA των κυττάρων και του DNA ανιχνευτή (κατασκευάστηκε με nick translation με την χρήση biotin modified dutps) ακολουθεί υβριδοποίηση overnight στους 42 ο C και σήμανση του DNA ανιχνευτή με streptavidine Alexa 568 (κόκκινο). Η χρώση των πυρήνων έγινε με διάλυμα DAPI (μπλέ) για 10min. Η ανάλυση και παρατήρηση των εικόνων έγινε σε μικροσκόπιο φθορισμού NIKON ECLIPSE TE U σε ανάλυση 100x. 95

96 ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 96

97 Ένα κύριο ερώτημα της ανοσολογίας είναι ποιοί είναι αυτοί οι μοριακοί μηχανισμοί οι οποίοι συμμετέχουν στην μετάβαση των Τ κυττάρων από την παρθενική τους κατάσταση στην φάση των πρόδρομων Τh0 κυττάρων, των ανώριμων Th0 τελεστών (Th0 effectors) και στην συνέχεια στις Th γραμμές διαφοροποίησης (Εικόνα 42). Παρόλο που ο ρόλος του NFAT και άλλων μεταγραφικών παραγόντων κατά την επαγωγή των παρθενικών Th κυττάρων έχουν αναφερθεί εκτενώς [21,103], λίγα έχουν γίνει γνωστά σχετικά με το αν υπάρχουν μηχανισμοί και μόρια οι οποίοι συμμετέχουν στον περιορισμό της επαγωγής των παρθενικών κυττάρων μετά το σήμα που λαμβάνουν από κάποιο αντιγόνο, καθώς και ποιοι είναι αυτοί. Τέτοιος κατασταλτικός μηχανισμός ο οποίος ελέγχει την μεταγραφική ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της IL-2 στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα μπορεί να συμμετέχει στις αλλαγές που πραγματοποιούνται σε μοριακό επίπεδο κατά την διαφοροποίηση των κυττάρων. Προηγούμενες μελέτες που έγιναν [30-32, 75] υποδεικνύουν έναν τέτοιο μηχανισμό όπου κεντρικό ρόλο παίζουν τουλάχιστο ένα μόριο που λειτουργεί σαν καταστολέας στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα αλλά εξαφανίζεται ή αλλάζει την λειτουργία του όταν αυτά ενεργοποιηθούν ή στα μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα. Μοντέλα έκφρασης, που καταστέλλουν την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων ή την έκφραση του γονιδίου της IL-2, έχουν ήδη αναφερθεί. Για παράδειγμα, η έκφραση του Foxj1, που ελέγχει την μεταγραφική έκφραση του ΙκΒ, μειώνεται μετά την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων [29]. Το ίδιο μοτίβο έκφρασης έχει δειχθεί και για τους μεταγραφικούς παράγοντες DREAM και Tob [104,105]. Δεν φαίνεται όμως να έχουν σχέση με την μεταβίβαση των κυττάρων από την παρθενική στην μνημονική κατάσταση. Αυτή η μετάβαση από την παρθενική κατάσταση στην ενεργοποιημένη παίζει σημαντικό ρόλο και στην έξοδο από την λανθάνουσα κατάσταση στην οποία βρίσκεται ο ιός HIV-1 στα μολυσμένα κύτταρα. Τα εν ηρεμία παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα αποτελούν από τις κύριες αποθήκες ιικού αποθέματος στον ασθενή [52] καθώς τα κύτταρα αυτά μπορεί να είναι δεκτικά στην μόλυνση από τον ιό αλλά δεν είναι δεκτικά στον πολλαπλασιασμό του [106,107]. Από την άλλη, η ενεργοποίηση των CD4+ κυττάρων αποτελεί κύριο βήμα για την παραγωγή ιοειδών από τα κύτταρα αυτά [108,109]. Και στην περίπτωση του HIV-1 έχουν αναφερθεί μόρια τα οποία καταστέλλουν την έκφρασή του, όπως τα CBF-1 [65], STAT5 [66], MBP-1 [67], FOXP3 [68] και πιο πρόσφατα ο ZBRK1 [69]. Η ύπαρξη πολλών αλληλουχιών αναγνώρισης μεταγραφικών παραγόντων του ξενιστή στην LTR 97

98 αλληλουχία του ιού και συγκεκριμένα παραγόντων που συμμετέχουν και στην ενεργοποίηση ή την καταστολή της ενεργοποίησης των Τ κυττάρων, μπορεί να αποτελεί το κλειδί στην διερεύνηση της λανθάνουσας κατάστασης του ιού στα κύτταρα αυτά. Η φάση της μετάβασης του ιού από την λανθάνουσα κατάσταση στην «ενεργοποιημένη» μπορεί να διαμεσολαβείτε από ένα ή περισσότερους παράγοντες που ενώ διατηρεί/ούν τον ιό σε καταστολή στα εν ηρεμία και παρθενικά Τ κύτταρα εξαφανίζεται ή δρα σαν ενεργοποιητής μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων. Έναν τέτοιο ρόλο, τόσο στην μεταγραφή του γονιδίου της IL-2 όσο και στον ιό του HIV-1 φαίνεται να έχει το προϊόν του ογκογονιδίου Ets-2 καθώς όπως δείχθηκε στο παρελθόν, με χρήση microarrays [75], είναι παρόν στα παρθενικά αλλά όχι στα ενεργοποιημένα Τh κύτταρα ενώ έχει βρεθεί αλληλουχία πρόσδεσής του τόσο στον υποκινητή της IL-2 όσο και στην LTR αλληλουχία του HIV-1 [21, 74]. Το γονίδιο ets-2 εκφράζεται σε μικρότερο βαθμό στα ex vivo ή εν ηρεμία μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα σε σχέση με τα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα (Εικόνα 29Α). Αυτή η διαφορά στα επίπεδα της μεταγραφικής έκφρασης του ets-2 γονιδίου μπορεί να υποδηλώνει ένα διαφορετικό ρόλο ή διαφορετική ανάγκη σε ποσότητα του παράγοντα αυτού ανάμεσα στα παρθενικά και μνημονικά Τh κύτταρα. Πέρα από αυτή την διαφορά η έκφραση του ets-2 ακολουθεί επιπλέον ένα εντελώς διαφορετικό μοντέλο έκφρασης ανάμεσα στα παρθενικά και μνημονικά Τ κύτταρα, καθώς μετά από ενεργοποίηση των κυττάρων η έκφρασή του μειώνεται στα παρθενικά ενώ αυξάνεται στα μνημονικά Th κύτταρα. Παρόλα αυτά όταν τα μνημονικά Th κύτταρα ενεργοποιηθούν η ποσότητα του ets-2 mrna που συντίθεται είναι σημαντικά χαμηλότερη σε σχέση με τα παρθενικά Th κύτταρα. Το ίδιο παρατηρούμε και όταν το μονοπάτι του NFAT, απαραίτητο για την έκφραση της IL- 2, μπλοκάρεται από την CsA. Έτσι τα επίπεδα έκφρασης του ets-2 mrna σε ενεργοποιημένα Th μνημονικά κύτταρα παρουσία CsA είναι χαμηλότερα σε σχέση με τα παρθενικά Th κύτταρα κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Αυτή η παρατήρηση οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η έκφραση του ets-2 mrna στα παρθενικά και μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα είναι ανεξάρτητη από την παρουσία των ενεργοποιητών της μεταγραφής της IL-2. Αντιλαμβανόμαστε έτσι, την ύπαρξη ενός κατασταλτικού μηχανισμού της μεταγραφής στα παρθενικά Th λεμφοκύτταρα που περιλαμβάνει τα επίπεδα έκφρασης του Εts-2 σαν κεντρικό γεγονός στην μετάβαση των Th κυττάρων από την παρθενική στην μνημονική κατάσταση. Η παρατήρηση ότι το ets-2 mrna και τα επίπεδα της Ets-2 πρωτεΐνης μειώνονται σημαντικά στα ενεργοποιημένα με 98

99 μιτογόνα παρθενικά Τh κύτταρα και παραμένουν σε χαμηλά επίπεδα στα εν ηρεμία μνημονικά Τh κύτταρα συμφωνεί με προηγούμενες παρατηρήσεις με πειράματα EMSA όπου ο καταστολέας εξαφανίζεται από το ARRE-2 στοιχείο του υποκινητή της IL-2 σε εκχυλίσματα από ενεργοποιημένα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα ή ότι ο καταστολέας δεν προσδένεται στην ARRE-2 αλληλουχία στα εν ηρεμία μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα [31,32, Εικόνα 26]. Ο συνδυασμός των αποτελεσμάτων από τα πειράματα shrna, ChIP, RT-PCR, EMSA και πειράματα διαμολύνσεων αποδεικνύουν έναν κατασταλτικό ρόλο της Ets- 2 πρωτεΐνης στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα μέσω της πρόσδεσής της στο ARRE-2 στοιχείο του υποκινητή της IL-2, και στον ιό HIV-1 μέσω της πρόσδεσής της στην RATS αλληλουχία του LTR αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα αυτά ενισχύουν την δράση του παράγοντα Ets-2 ως καταστολέα τόσο του γονιδίου της IL-2 στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα όσο και του HIV1-LTR καθώς η ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα αυτού στην ARRE-2 και RATS αλληλουχία μειώνεται σημαντικά μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων. Επιπλέον η υπερέκφραση, εξωγενώς, της Ets-2 πρωτεΐνης στην Jurkat κυτταρική σειρά οδηγεί τόσο στην μείωση της ενδογενούς έκφρασης της IL-2, ή και των εξωγενών πλασμιδίων αναφοράς που φέρουν είτε την ARRE-2 αλληλουχία, είτε την RATS αλληλουχία του HIV1-LTR. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι η ποσότητα της πρωτεΐνης Ets-2 παίζει κρίσιμο ρόλο στην κατασταλτική δράση της. Αντίθετα η αποσιώπηση της ενδογενούς έκφρασης του Ets- 2, με χρήση ets-2 sh-rna κλώνων, σε εν ηρεμία Jurkat κύτταρα οδηγεί στην αύξηση έκφρασης τόσο του ενδογενούς IL-2 mrna όσο και της έκφρασης του εξωγενούς ΗIV1-LTR απουσία μηνυμάτων επαγωγής της έκφρασής τους (Εικόνα 33Α,36). Η μεγάλη διαθεσιµότητα των µορίων του καταστολέα στα παρθενικά Τh λεµφοκύτταρα γεννά και πολλά ερωτήματα σχετικά µε τον ανταγωνισµό πρόσδεσης των µορίων αυτών τόσο στον υποκινητή της ιντερλευκίνης-2 όσο και στην LTR αλληλουχία του HIV-1. Η διαθεσιµότητα του καταστολέα σε µη µολυσµένα παρθενικά Τh λεµφοκύτταρα επαρκεί για την καταστολή των ενδογενών στόχων του κύτταρου µε αποτέλεσµα να απαιτείται µία ισχυρή αντιγονική διέγερση για την ενεργοποίηση των κυττάρων αυτών. Η παρουσία, από την άλλη, του ιού µέσα στο κύτταρο µειώνει, πιθανόν, την διαθεσιµότητα των µορίων του καταστολέα για την κάλυψη των ενδογενών στόχων καθώς κάποια από αυτά θα πρέπει να προσδένονται και στον υποκινητή του ιού. Το γεγονός αυτό ίσως οδηγεί σε ενεργοποίηση των κυττάρων µε λιγότερο ισχυρά αντιγονικά ερεθίσµατα κάτι που µπορεί να εξηγεί και 99

100 την ευπάθεια που παρουσιάζουν οι ασθενείς σε µολύνσεις που σε υγιή άτοµα δεν προκαλούν έντονες ανοσολογικές αντιδράσεις. Αξιοσημείωτο γεγονός αποτελεί και η παρατήρηση ότι η κατασταλτική δράση της Ets-2 πρωτεΐνης στην έκφραση της IL-2 δεν περιορίζεται μόνο στα Τ κύτταρα καθώς πειράματα υπερέκφρασης στη Β λευχαιμική σειρά (Raji), στην οποία παρατηρείται υψηλή έκφραση του IL-2 mrna, οδηγεί σε μείωση της ενδογενούς έκφρασή της. Όσων αφορά την έκφραση της IL-2 τα πειράματα ChIP ανέδειξαν έναν διαφορετικό ρόλο της πρωτεΐνης Ets-2 ανάμεσα στα παρθενικά (ενεργοποιημένα ή μη) και μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα. Η Ets-2 πρωτεΐνη δεν εκφράζεται απλά λιγότερο στα μνημονικά σε σχέση με τα παρθενικά Τh κύτταρα, αλλά επίσης παρουσιάζει και ένα διαφορετικό πρότυπο συσχέτισης με την ARRE-2 αλληλουχία ανάμεσα στις δύο αυτές κατηγορίες κυττάρων όταν αυτά ενεργοποιούνται. Στα εν ηρεμία μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα η Ets-2 πρωτεΐνη προσδένεται στην ARRE-1 αλληλουχία του υποκινητή της IL-2 και αυτή η ικανότητα πρόσδεσης δεν αλλάζει μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων αυτών. Ταυτόχρονα όμως όταν τα μνημονικά Τh κύτταρα ενεργοποιούνται η Ets-2 πρωτεΐνη ανιχνεύεται προσδεδεμένη και στην ARRE-2 αλληλουχία. Αντίθετα στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα και στην Jurkat κυτταρική σειρά παρατηρείται μία μετακίνηση του παράγοντα Ets-2 από την ARRE-2 στην ARRE-1 αλληλουχία όταν τα κύτταρα ενεργοποιούνται. Το γεγονός αυτό ίσως σημαίνει ότι από αυτό το σημείο και μετά η Ets-2 πρωτεΐνη δρα σαν ενεργοποιητής της μεταγραφής του γονιδίου της IL-2 στα ενεργοποιημένα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα ή ότι χάνει πια το ρόλο της ως καταστολέας. Η υπόθεση αυτή ενισχύεται και από το γεγονός ότι η έκφραση συγκεκριμένων shrna-ets-2 κλώνων στα ενεργοποιημένα Jurkat κύτταρα μειώνουν ελαφρά την έκφραση του IL-2 mrna (Εικόνα 33Α). Αυτή η μετακίνηση, από το ARRE-2 στο ARRE-1 δεν συμβαίνει στα μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα ίσως λόγο της προτίμησης της πρωτεΐνης Ets-2, που υπάρχει, για την πρόσδεσή της στην ARRE-1 αλληλουχία που έχει ήδη συμβεί κατά την πρώτη τους ενεργοποίηση σαν παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα. Φαίνεται ότι αυτή η μετακίνηση της Ets-2 πρωτεΐνης από το ARRE-2 στο ARRE-1 στοιχείο του υποκινητή της IL-2 μετά την ενεργοποίηση των παρθενικών Th λεμφοκυττάρων γίνεται μόνιμη πρόσδεση στα μνημονικά Τh κύτταρα με ισόποση ικανότητα πρόσδεσης σε αυτό το στοιχείο τόσο στα εν ηρεμία όσο και στα ενεργοποιημένα μνημονικά Th κύτταρα. Το γεγονός αυτό μπορεί να αντανακλά σε έναν μηχανισμό 100

101 άμεσης απόκρισης των μνημονικών κυττάρων όταν το ανοσοποιητικό σύστημα το απαιτεί. Η συνέργια της Ets-2 πρωτεΐνης με το ARRE-1 στοιχείο του υποκινητή της IL-2 στα εν ηρεμία μνημονικά Th κύτταρα, η συνεργασία του Ets-2 με την ARRE-2 αλληλουχία στα παρθενικά Τh κύτταρα καθώς και η αλλαγή των επιπέδων έκφρασης του ets-2 mrna αποτελούν σημαντικά γεγονότα για την ματαίωση του ρόλου του παράγοντα Ets-2 ως καταστολέας. Η πρόσδεση του παράγοντα Ets-2 στην ARRE-1 αλληλουχία του υποκινητή της IL-2 στα ενεργοποιημένα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα μπορεί να εξηγεί την μη ανίχνευση πρόσδεσης του παράγοντα στο ARRE-2 στοιχείο σε πυρηνικά εκχυλίσματα από ενεργοποιημένα παρθενικά ή εν ηρεμία μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα [31, 32, Εικόνα 26-CD4CD45RO]. Καταστολή της μεταγραφής της έκφρασης του IL-2 mrna έχει περιγραφεί και στο παρελθόν με καταστολέα το μόριο SATB. Το μόριο αυτό δρα στην καταστολή της έκφρασης της IL-2 μέσω της αλληλεπίδρασής του με την αποακετυλάση HDAC1. Η αποεκετυλάση αυτή απομακρύνεται παρουσία του Τat ενεργοποιητή του HIV-1 με αποτέλεσμα την μεταγραφή του γονιδίου της IL-2 [99]. Η απώλεια της δράσης ως καταστολέα της Ets-2 πρωτεΐνης συμφωνεί με παλαιότερες αναφορές οι οποίες προσδίδουν ένα διττό ρόλο σαν καταστολέα ή/και ενεργοποιητή στην πρωτεΐνη αυτή [94] ή την συνδέουν με την ενεργοποίηση της μεταγραφής του γονιδίου της IL-2 στα μνημονικά Τh κύτταρα [110]. Τα πειράματα shrna, ChIP, EMSA και διαμολύνσεων δείχνουν έναν κατασταλτικό ρόλο για την πρωτεΐνη Ets-2 στην έκφραση του HIV1-LTR in vitro, μέσω της πρόσδεσή της στην RATS αλληλουχία (Εικόνα 43). Σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν για τον προσδιορισμό του ρόλου του παράγοντα Ets-2 στην έκφραση του γονιδίου της IL-2, μέσω της πρόσδεσής του στις ARRE 1/2 αλληλουχίες, αντιλαμβανόμαστε το σημαντικό ρόλο που παίζει η μετάβαση από την εν ηρεμία παρθενική κατάσταση των Τh λεμφοκυττάρων στην ενεργοποιημένη μνημονική κατάσταση, στην ενεργοποίηση της έκφρασης του ιού HIV-1, που συνδυάζεται με την απομάκρυνση του παράγοντα Ets-2 από RATS αλληλουχία. Η μετακίνηση αυτή σχετίζεται και με την διαθεσιμότητα των μορίων Ets-2 στα μνημονικά Τh κύτταρα όπου η πρωτεΐνη Ets-2 ανιχνεύεται σε σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα στον πυρήνα (Εικόνα 30). Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με τα ως σήμερα γνωστά δεδομένα σχετικά με τον ρόλο των μεταγραφικών παραγόντων της οικογένειας ETS στον έλεγχο της 101

102 έκφρασης και διαφοροποίησης διαφόρων γονιδίων στα αιμοποιητικά ή άλλα κύτταρα [84, 85, 111]. Τα μέλη της οικογένειας ETS όπως ο Εts-1 και ο Ets-2 αναγνωρίζουν και προσδένονται σε αλληλουχίες περίπου 20bp οι οποίες περιέχουν το μοτίβο GGAA το οποίο υπάρχει τόσο στις ARRE-1 και ARRE-2 αλληλουχίες του υποκινητή της IL-2 όσο και στην RATS αλληλουχία του HIV1-LTR. Μέλη της οικογένειας όπως τα TEL, YAN και ERF σχετίζονται με την καταστολή της μεταγραφής με διάφορους μηχανισμούς [ ]. Συγκεκριμένα η Ets-2 πρωτεΐνη δρα κατασταλτικά στην έκφραση του γονιδίου BRCA1 [94] και η φωσφορυλίωσή του στην Thr72 είναι πιθανόν υπεύθυνη για την αλλαγή στην λειτουργία της πρωτεΐνης Εts-2 από καταστολέα σε ενεργοποιητή, προσδίδοντας έτσι ένα διττό ρόλο του παράγοντα Ets-2 στην μεταγραφή γονιδίων-στόχων στα κύτταρα της κυτταρικής σειράς MCF-7. Η φωσφορυλίωση στην συγκεκριμένη θέση έχει δειχθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο και στην διαφοροποίηση και επιβίωση των θυμοκυττάρων [115]. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή προτείνουμε ότι ο Ets-2 εκφράζεται αρχικά στα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα και προσδένεται στο GGAA μοτίβο της ARRE-2 και RATS αλληλουχίας μπλοκάροντας έτσι την έκφραση της IL-2 και του HIV-1 αντίστοιχα σε αυτά τα κύτταρα. Καθώς ο ενεργός παράγοντας NFAT δεν είναι παρόν στα μη ενεργοποιημένα κύτταρα, η άμεση πρόσδεση του παράγοντα Ets-2 στο ARRE-2 στοιχείου του υποκινητή της IL-2 αποτελεί ένα φυσικό φραγμό για την πρόσδεση της μεταγραφικής μηχανής, μαζί με άλλα απαραίτητα μόρια, όπως ρυθμιστές τις χρωματίνης και άλλους μεταγραφικούς παράγοντες. H ικανότητα των μελών της οικογένειας ETS να ελέγχουν την έκφραση τέτοιων ποικιλόμορφα ρυθμιζόμενων γονιδίων, τους προσδίδει ένα επιπλέον χαρακτηριστικό, ότι δρουν σαν διαμεσολαβητές αλληλεπιδράσεων μεταξύ διαφορετικών μεταγραφικών παραγόντων. Αυτό το χαρακτηριστικό έχει αναγνωριστεί και στον κατασταλτικό ρόλο της πρωτεΐνης Ets-2 στην έκφραση του γονιδίου BRCA1, στο οποίο αναφερθήκαμε παραπάνω, καθώς για να δράσει, αλληλεπιδρά πρώτα με την πρωτεΐνη Brg1 που αποτελεί συστατικό του συμπλόκου Swi/Snf [94]. Ο ρόλος της δομής της χρωματίνης παίζει επίσης σημαντικό ρόλο καθώς όπως έχει βρεθεί, μετά από ενεργοποίηση των κυττάρων EL4, η περιοχή του DNA στην αλληλουχία -292 με -273 του υποκινητή της IL-2, που περιλαμβάνει και την αλληλουχία πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2, παρουσιάζεται ευπαθής στην δράση της DNase I [116]. Παράλληλα το νουκλεόσωμα που περιλαμβάνει την περιοχή του DNA από -60 μέχρι -210 αναδιαμορφώνεται [117]. Έτσι ένας πιθανός ρόλος της πρωτεΐνης Ets-2 στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα 102

103 είναι να προσελκύει αποακετυλάσες (HDAC) ώστε να επιφέρουν μία τρισδιάστατη αλλαγή στην τοπολογία της χρωματίνης που οδηγεί σε καταστολή της έκφρασης. Η υπόθεση αυτή ενισχύεται και από τον τοποεντοπισμό της πρωτεΐνης αυτής στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα που φαίνεται να είναι αυξημένη σε σχέση με τα μνημονικά όπου η ποσότητα των μορίων της Ets-2 πρωτεΐνης είναι σημαντικά μικρότερη (Εικόνα 30). Επίσης δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την περίπτωση η πρωτεΐνη Ets-2 να συμμετέχει στην διαμόρφωση της δομής της χρωματίνης, πέρα της πιθανής αλληλεπίδρασης με τις HDACs και μέσω της αλληλεπίδρασής της με ακετυλοτρανσφεράσες και μεθυλοτρανσφεράσες των ιστονών ώστε να επιτύχει την κατασταλτική της δράση. Ένας άλλος πιθανός ρόλος της Ets-2 πρωτεΐνης στην καταστολή της μεταγραφής του γονιδίου της IL-2 στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα μπορεί να είναι μέσω της συμμετοχής της στην μεθυλίωση του εγγύς (proximal) υποκινητή της IL-2, που αποτελεί σημαντικό βήμα για την μεταγραφή του [103, 118]. Έχει βρεθεί ότι το DNA στη περιοχή του proximal υποκινητή της IL-2 είναι ιδιαίτερα μεθυλιωμένο τόσο σε ανθρώπινα όσο και σε ποντικίσια Τh παρθενικά λεμφοκύτταρα [117, 118]. Μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων η μεθυλίωση του DNA στην περιοχή αυτή του υποκινητή μειώνεται πιθανώς μέσω ενός ενζυματικού μηχανισμού. Η περιοχή αυτή, από το σημείο αυτό και μετά, παραμένει μη μεθυλιωμένη πιθανόν για να διευκολυνθεί η άμεση έκφραση της IL-2 μετά από ένα δεύτερο σήμα ενεργοποίησης στο κύτταρο [117, 118]. Έτσι στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα η παρουσία της Ets-2 πρωτεΐνης μπορεί να διευκολύνει την λειτουργία των DNA μεθυλασών δρώντας σαν διαμεσολαβητής για την αλληλεπίδρασή τους με άλλες πρωτεΐνες ή κατευθύνοντάς τες άμεσα στις cis περιοχές στόχους. Μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων η μείωση στην έκφραση της Ets-2 πρωτεΐνης επηρεάζει την δράση των DNA μεθυλασών και πιθανόν εν συνεχεία λαμβάνει δράση μία διμεθυλάση. Και η αντίστροφη όμως διαδικασία είναι επίσης πιθανή ότι δηλαδή η μεθυλίωση στην περιοχή αυτή του υποκινητή βοηθά στην πρόσδεση του παράγοντα Ets-2. Μετά από μιτογονική ενεργοποίηση των παρθενικών Τh λεμφοκυττάρων η Ets-2 πρωτεΐνη δεν προσδένεται με την ίδια ειδικότητα στην ARRE-2 αλληλουχία. Αντίθετα εμφανίζεται να προσδένεται πια στην ARRE-1 αλληλουχία του υποκινητή, η οποία είναι σημαντική στην ενεργοποίηση της μεταγραφής του γονιδίου της IL-2 [21]. Η χαμηλότερη έκφραση του ets-2 mrna στα μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα καθιστά πιθανόν αδύνατη την δράση της Ets-2 πρωτεΐνης ως καταστολέα και έτσι δεν 103

104 έχει πια κατασταλτική δράση στην έκφραση της IL-2. Έτσι όποτε απαιτείται έκφραση της IL-2 ξανά, η έκφραση μπορεί να είναι πιο ταχεία αφού δεν θα χρειαστεί να υπερβούν το «εμπόδιο» της Ets-2 πρωτεΐνης. Υπό μία έννοια τα επίπεδα έκφρασης του Ets-2 μπορεί να λειτουργούν ως ένα επιγενετικό κλειδί μνήμης που παίζει ρόλο στην μετάβαση από την παρθενική στην μνημονική κατάσταση των Τh λεμφοκυττάρων. Επίσης δεν θα πρέπει να απορρίψουμε την πιθανότητα η μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις του παράγοντα Ets-2 να είναι υπεύθυνες για την αλλαγή στον τρόπο δράσης του. Μία τέτοια μεταμεταφραστική τροποποίηση είναι η φωσφορυλίωση στην θέση Thr72 όπως έχει ήδη αναφερθεί [115]. Ανάλογο ρόλο μπορεί να έχει ο παράγοντας Ets-2 και στην μεταγραφή του ιού HIV-1. In vitro μελέτες αναφέρουν ότι μεθυλίωση CpG στην LTR αλληλουχία του ιού σχετίζεται με καταστολή της μεταγραφής του ιικού γονιδιώματος [119,120]. Άλλος ένας επιγενετικός μηχανισμός που σχετίζεται με την καταστολή της έκφρασης του ιού αποτελεί και σε αυτή την περίπτωση η τροποποίηση των ιστονών. Η αποακετυλίωση των ιστονών αποτελεί ένα σημαντικό γεγονός για την αποσιώπηση της έκφρασης του ιικού γονιδιώματος στα εν ηρεμία CD4+ κύτταρα. Μπλοκάρισμα της ενεργότηττας της HDAC1 μπορεί να οδηγήσει στην ενεργοποίηση της μεταγραφής του ιού μετά την ενεργοποίηση των T λεμφοκυττάρων in vitro [121,122]. Έτσι και στην περίπτωση της ρύθμισης της έκφρασης του ιού HIV-1 ο παράγοντας Ets-2 μπορεί να παίζει τον ρόλο του διαμεσολαβητή αλληλεπίδρασης διαφόρων παραγόντων με τις DNA μεθυλάσες ή η ίδια η μεθυλίωση να βοηθά στην πρόσδεση του παράγοντα Ets-2 στην RATS αλληλουχία του ιού. Θα πρέπει επίσης να αναφέρουμε ότι οι περιοχές ARRE-1, ARRE-2 και RATS είναι επίσης αλληλουχίες αναγνώρισης και δέσμευσης του NFAT. Η πρόσδεση του παράγοντα Ets-2 στην ARRE-1 περιοχή του υποκινητή της IL-2 στα ενεργοποιημένα παρθενικά και μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα και στην ARRE-2 στα ενεργοποιημένα μνημονικά Τh κύτταρα συνυπάρχει με την ταυτόχρονη πρόσδεση του NFAT σε αυτές τις περιοχές. Έτσι σύμφωνα με τα παραπάνω μία άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο αυτών παραγόντων δεν μπορεί να αποκλειστεί. Επιπλέον ο NFAT αποτελεί έναν παράγοντα ενεργοποίησης της μεταγραφής του ιικού γονιδιώματος ο οποίος προσδένεται στην LTR αλληλουχία του ιού [123,124]. Σε μία διαφορετική προσέγγιση με σχέση με την ρύθμιση της έκφρασης της IL-2, η απομάκρυνση του παράγοντα Ets-2 από την RATS αλληλουχία μπορεί να 104

105 ακολουθείται από την ταυτόχρονη πρόσδεση του NFAT στην περιοχή αυτή με αποτέλεσμα την έναρξη της μεταγραφής του ιικού γονιδιώματος. Συμπερασματικά προτείνουμε ένα μοντέλο σύμφωνα με το οποίο η έκφραση του ets-2 και η πρόσδεση της πρωτεΐνης στην ARRE-2 αλληλουχία του υποκινητή της IL- 2, αποτελεί μέρος μιας αυστηρά ρυθμιζόμενης διαδικασίας που έχει σαν τελικό αποτέλεσμα την μετάβαση των παρθενικών Τh λεμφοκυττάρων σε Th0 κύτταρα μετά από αντιγονική διέγερσή τους (Εικόνα 42). Δυσλειτουργία ενός τέτοιου κατασταλτικού μηχανισμού σε μοριακό επίπεδο θα μπορούσε να οδηγήσει σε μετέπειτα διαταραχές στην πλαστικότητα των Th κυττάρων με αποτέλεσμα εμφάνιση αυτοάνοσων [125] ή άλλων παθολογικών καταστάσεων. Επίσης, η ταυτοποίηση του παράγοντα Ets-2 ως καταστολέα της μεταγραφής του ιού HIV-1 μέσω της πρόσδεσής του στην RATS αλληλουχία του LTR απαντά σε ερωτήματα σχετικά με την λανθάνουσα κατάσταση του ιού. Η μεγαλύτερη ποσότητα του καταστολέα στα παρθενικά Τh κύτταρα μπορεί να εξηγεί τα χαμηλά επίπεδα έκφρασης του ιού στα κύτταρα αυτά. Τα κύτταρα όμως αυτά λειτουργούν σαν «δεξαμενες» αποθέματος του ιού καθώς με αυτό τον τρόπο δεν γίνεται προσβάσιμος από τα αντιρετροϊκά φάρμακα. Τα φάρμακα αυτά δρούνε σε διάφορες φάσεις του πολλαπλασιασμού του ιού, όντας όμως μεταγραφικά ανενεργός ο ιός δεν γίνεται στόχος των φαρμάκων αυτών γεγονός που μπορεί να εξηγεί τη υποκλινική φάση της νόσου και την αντοχή του ιού σε μακροχρόνια θεραπεία. 105

106 Εικόνα 42: Προτεινόμενο μοντέλο του κατασταλτικού ρόλου του παράγοντα Ets-2 ως ένα πρόωρο και σημαντικό γεγονός, που αποτελεί κομμάτι μίας αυστηρά ρυθμιζόμενης διαδικασίας που οδηγεί στην μετάβαση των παρθενικών Τh λεμφοκυττάρων σε Th0 κύτταρα μετά από αντιγονική διέγερση. 106

107 Εικόνα 43: Προτεινόμενο μοντέλο κατασταλτικής δράσης του παράγοντα Ets-2 στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα μέσω της πρόσδεσής του στην RATS αλληλουχία του HIV1-LTR. Στην εικόνα διακρίνονται σημαντικές αλληλουχίες της LTR περιοχής (RATS, NFAT, USF, TCF-1a, NF-κβ, Sp1, TATA). 107

108 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 108

109 Η IL-2 είναι η πρώτη κυτταροκίνη η οποία εκκρίνεται όταν τα παρθενικά Τ βοηθητικά (Th) λεμφοκύτταρα ενεργοποιούνται και διαφοροποιούνται σε λειτουργικά Τh0 λεμφοκύτταρα, από τα οποία θα προέλθουν τα Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα των άλλων γραμμών διαφοροποίησης. Ο ιός HIV-1 είναι μεταγραφικά ενεργός στα ενεργοποιημένα CD4+ T κύτταρα και ανενεργός στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα. Η έκφραση της IL-2 και του HIV-1 εμποδίζεται στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα από την ύπαρξη ενός καταστολέα ο οποίος προσδένεται στην ARRE- 2/NFAT περιοχή του υποκινητή της IL-2 και την RATS (Repressor Activator Target Sequence) αλληλουχία (-279 to -250bp) του HIV-1-LTR αντίστοιχα. Οι δύο αυτές περιοχές παρουσιάζουν νουκλεοτιδική ομολογία στην αλληλουχία τους και εμπεριέχουν το νουκλεοτιδικό μοτίβο AAGGAG, που αποτελεί αλληλουχία πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα Ets-2. Στην παρούσα διατριβή αποδείξαμε ότι ο παράγοντας Ets-2 είναι καταστολέας της έκφρασης της IL-2 και του HIV-1- LTR στα CD4+CD45RA+CD25-FoxP3- παρθενικά Τh κύτταρα, μέσω της πρόσδεσής του στην κοινή τους αλληλουχία. Η κατασταλτική αυτή δράση του παράγοντα Ets-2 παύει να υπάρχει στα μνημονικά Th κύτταρα ή όταν τα παρθενικά Th κύτταρα ενεργοποιηθούν. Αρχικά μετρήσαμε τα επίπεδα σύνθεσης του ets-2 mrna σε υποπληθυσμούς T λεμφοκυττάρων και σε 9 λευχαιμικές κυτταρικές σειρές, πριν και μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων με τα μιτογόνα PMA/Ionomicyn (P/I). To ets-2 mrna ανιχνεύθηκε στα Τ κύτταρα και στις περισσότερες κυτταρικές σειρές όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό (CM), αλλά η σύνθεσή του μειώθηκε σημαντικά μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων (P/I). Στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα τα επίπεδα του ets-2 mrna και της Ets-2 πρωτεΐνης καθώς και η ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 στις ARRE-2 και RATS αλληλουχίες, μειώνονται μετά την ενεργοποίηση των Th κυττάρων. Η μείωση αυτή ακολουθείται από ταυτόχρονη έκφραση της IL-2. Η προσθήκη κυκλοσπορίνης A στην καλλιέργεια των κυττάρων οδήγησε στην σταθεροποίηση της έκφρασης του ets-2 mrna και πρωτεΐνης όταν τα κύτταρα έχουν πρώτα ενεργοποιηθεί. Στην συνέχεια διαμολύναμε τα κύτταρα Jurkat με (i) τα πλασμίδια IL-2-CAT, 4xARRE-CAT (φέρει 4 αντίγραφα της ARRE-2 αλληλουχίας), 2xmutantARRE-CAT (φέρει σημειακή μετάλλαξη στην αλληλουχία πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2) (ii) HIV1-LTR-CAT, 2xRATS-CAT (2 αντίγραφα της RATS αλληλουχίας), 2xmutantRATS-CAT (φέρει σημειακή μετάλλαξη στην αλληλουχία πρόσδεσης του 109

110 παράγοντα Ets-2) και CMV-CAT (control), (iii) pcdna3-ets2 (για την υπερέκφραση της Εts-2 πρωτεΐνης), (iv) ets-2 shrna (για την αποσιώπηση της έκφρασης του Ets-2 στα κύτταρα). Πειράματα συνδυαμολύνσεων στα Jurkat κύτταρα με αυξανόμενες ποσότητες του pcdna3-ets2 οδήγησε σε σταδιακή μείωση της μεταγραφικής ενεργότητας των πλασμιδίων IL-2-CAT, 4xARRE-CAT, HIV1-LTR-CAT και 2xRATS-CAT μετά από μιτογονική διέγερση των κυττάρων με P/I. Καμία αλλαγή δεν παρατηρήθηκε στην μεταγραφική ενεργότητα των πλασμιδίων αναφοράς CMV- CAT, 2xmutantARRE-CAT και 2xmutantRATS-CAT. Αντίθετα, πειράματα συνδυαμολύνσεων με τα πλασμίδια αναφοράς HIV1-LTR-CAT, 2xRATS-CAT και τους κλώνους του ets-2 sh-rna οδήγησε στην αύξηση της μεταγραφικής ενεργότητας και των δύο πλασμιδίων αναφοράς αλλά όχι για τα 2xmutantRATS-CAT και CMV-CAT. Επίσης η διαμόλυνση των Jurkat κυττάρων με τους κλώνους του ets- 2 sh-rna, απουσία σημάτων ενεργοποίησης, οδήγησε και στην έκφραση του ενδογενούς IL-2 mrna. Η παρατήρηση αυτή επιβεβαιώνει την κατασταλτική δράση του παράγοντα Ets-2 στην έκφραση της IL-2 σε μη επαγώγιμες συνθήκες. Τα πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης αποκάλυψαν ότι η ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 στο ARRE-2 στοιχείο του υποκινητή της IL-2, είναι ισχυρότερη στα παρθενικά Τh κύτταρα σε σχέση με τα ενεργοποιημένα ή μνημονικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα. Με την ίδια πειραματική διαδικασία αυτή την φορά σε Jurkat κύτταρα τα οποία είχαν διαμολυνθεί με το πλασμίδιο HIV-1-LTR παρατηρήθηκε ότι η ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 στην RATS αλληλουχία ήταν ισχυρότερη στην CM συνθήκη σε σχέση με το P/I όπου ο παράγοντας Ets-2 εξαφανίζεται από την RATS αλληλουχία. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή προτείνουμε ότι η έκφραση του ets-2 και η πρόσδεση της Ets-2 πρωτεΐνης στο ARRE-2 στοιχείο του υποκινητή της IL-2 αποτελεί μέρος μιας αυστηρά ρυθμιζόμενης διαδικασίας που έχει σαν τελικό αποτέλεσμα την μετάβαση των παρθενικών Τh λεμφοκυττάρων σε Th0 κύτταρα μετά από αντιγονική διέγερσή τους. Δυσλειτουργία ενός τέτοιου κατασταλτικού μηχανισμού σε μοριακό επίπεδο θα μπορούσε να οδηγήσει σε μετέπειτα διαταραχές στην πλαστικότητα των Th κυττάρων με αποτέλεσμα εμφάνιση αυτοάνοσων ή άλλων παθολογικών καταστάσεων. Η μετάβαση των παρθενικών Τh λεμφοκυττάρων στην μνημονική και ενεργοποιημένη κατάσταση των κυττάρων παίζει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση της έκφρασης του HIV-1-LTR στα μολυσμένα κύτταρα. Αυτή η καταστολή του ιικού γονιδιώματος που διαμεσολαβείται μέσω της RATS 110

111 αλληλουχίας μπορεί να ευθύνεται για την χαμηλή μεταγραφική ενεργότητα και πολλαπλασιασμού του ιού HIV-1 στα παρθενικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα και να συμβάλει στην λανθάνουσα κατάσταση του ιού στα κύτταρα αυτά καθώς και στην διατήρηση των ιικών αποθεμάτων παρά την μακράς διαρκείας θεραπεία. H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: Ηράκλειτος ΙΙ. Επένδυση στην κοινωνία της γνώσης μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου. 111

112 SUMMARY 112

113 IL-2 is the first cytokine produced when naive T helper (Th) cells are activated and differentiate into dividing pre-th0 proliferating precursors. The HIV1 virus is transcriptionally active in activated CD4 T-cells, and inactive in naïve CD4 T-cells. IL-2 and HIV-1 expression is blocked in naive Th cells by a transcriptional silencer that binds to the ARRE-2/NFAT element of the IL-2 gene promoter and RATS- Repressor Activator Target Sequence of HIV1-LTR (-279 to -250bp). These two elements share a homologous sequence that encompasses the AAGGAG Εts-2 binding site. Herein we show that Ets-2 is the repressor of IL-2 and HIV-1-LTR expression in CD4+CD45RA+CD25-FoxP3- naive Th cells by binding to this common region. This silencing activity disappears in activated naïve Th cells and memory Th cells. We first measured the levels of ets-2 mrna in activated with PMA/Ionomycin (P/I) or non activated (CM) peripheral blood-derived T-cells and 9 leukemic cell lines. Ets-2 mrna was synthesized in T-cells and in the most cell lines when cultured in plain culture medium (CM), but its synthesis was severely reduced when the cells were stimulated. In naive Th cells, the ets-2 mrna, quantity of Ets-2 protein and its binding activity to ARRE-2 and RATS sequence decrease upon Th cell activation, followed by a reciprocal expression of IL-2. Cyclosporine A stabilizes ets- 2 mrna and protein when the cells are activated. We transfected Jurkat cells with (i) the reporter plasmids IL-2-CAT, 4xARRE- CAT (4 copies of ARRE-2 sequence), 2xmutantARRE-CAT (carries a point mutation in the Ets-2 binding site) (ii) HIV1-LTR-CAT, 2xRATS-CAT (2 copies of RATS sequence), 2xmutantRATS-CAT (carries a point mutation in the Ets-2 binding site) and CMV-CAT (control), (iii) pcdna3-ets2 (for ets-2 overexpression), (iv) ets-2 shrna (to silence ets-2 expression in the cells). Co-transfection experiments in Jurkat cells with increasing amounts of pcdna3-ets2, led to a gradual reduction of IL-2- CAT, 4xARRE-CAT, HIV1-LTR-CAT and 2xRATS-CAT transcriptional activity, upon cell stimulation with P/I, but not of CMV-CAT. No transcriptional response was observed for the 2xmutantARRE-CAT and 2xmutantRATS-CAT reporter genes. Cotransfection experiments with HIV1-LTR-CAT, 2xRATS-CAT and ets-2 shrna led to an increase in both reporter genes activity but not for 2xmutantRATS-CAT and CMV-CAT. Also transfection of the Jurkat cell line with ets-2 shrna clones led to a slight expression of endogenous IL-2 mrna confirming that Ets-2 acts as a repressor of IL-2 expression in these cells in non inductive conditions. Chromatin 113

114 Imunoprecipitation experiments revealed that Ets-2 binding activity to the ARRE-2 element of the native IL-2 promoter is stronger in naive Th cells compared to activated or memory Th cells. In the same way when ChiP experiments performed in transfected with the HIV-1-LTR plasmid Jurkat cells, Ets-2 binding activity to the RATS element was stronger to the CM condition compared to the P/I where the Ets-2 binding activity disappears. In this work we suggest that ets-2 expression and protein binding to the ARRE-2 element of the IL-2 promoter are part of a strictly regulated process that results in a physiological transition of naive Th cells to Th0 cells upon antigenic stimulation. Malfunction of such a repression mechanism at the molecular level could lead to disturbed later events in Th cell plasticity, leading, in term, to autoimmune diseases or other pathological conditions. The transition of naive Th cells to memory and activated Th cells plays a crucial role in the activation of the HIV-1-LTR expression in the infected cells. Thus, our results also confirm the role of Ets-2 as a transcriptional repressor of HIV1. This HIV1-LTR-RATS-mediated repression may account for the low-level transcription and replication of HIV1 in naïve T-cells, and contribute to the viral latency and maintenance of viral reservoirs in patients, despite long-term therapy. This research has been co-financed by the European Union (European Social Fund ESF) and Greek national funds through the Operational Program "Education and Lifelong Learning" of the National Strategic Reference Framework (NSRF) - Research Funding Program: Heracleitus II. Investing in knowledge society through the European Social Fund. 114