In vivo μελέτη της αντιοξειδωτικής δράσης των στύλων του Crocus sativus.

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΔΙΑΤΡΙΒΗ για την απόκτηση ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ In vivo μελέτη της αντιοξειδωτικής δράσης των στύλων του Crocus sativus. Δημακοπούλου Ανδριάνα Βιολόγος Πάτρα 2008

2 Τριμελής Επιτροπή Λάμαρη Φωτεινή, Λέκτορας του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών (επιβλέπουσα). Κορδοπάτης Παύλος, Καθηγητής του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Γεωργακόπουλος Κώστας, Επίκουρος Καθηγητής του Τμήματος Οφθαλμολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών. 2

3 Στη μνήμη του αδερφού μου Δημήτρη. 3

4 Ευχαριστίες Η ερευνητική αυτή εργασία πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, στην κατεύθυνση Φαρμακοχημεία - Φυσικά Προϊόντα: Σχεδιασμός, Σύνθεση και Ανάλυση Βιοδραστικών ενώσεων. Εκπονήθηκε στο εργαστήριο Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, υπό την επίβλεψη της Λέκτορος κ. Λάμαρη Φωτεινής. Για την πραγματοποίηση αυτής της ερευνητικής εργασίας συνέβαλαν σημαντικά ορισμένοι άνθρωποι, τους οποίους νιώθω την ανάγκη να ευχαριστήσω. Ιδιαίτερες ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω στην επιβλέπουσά μου κ. Λάμαρη Φωτεινή, η οποία μου εμπιστεύθηκε το θέμα της διατριβής και είχε ουσιαστική επίβλεψη και συμβολή σε όλα τα στάδια της ερευνητικής μου εργασίας, καθώς και για τις πολύτιμες συμβουλές της κατά την συγγραφή της παρούσας διατριβής. Παρά το μεγάλο φόρτο εργασίας ήταν πάντα πρόθυμη να συζητήσει μαζί μου τις δυσκολίες που αντιμετώπιζα, να προτείνει λύσεις και να με ενθαρρύνει να συνεχίσω την προσπάθεια. Κυρίως όμως θα ήθελα να την ευχαριστήσω γιατί εκτός από καθηγήτριά μου υπήρξε και ένα άτομο το οποίο με στήριξε σε μία πολύ δύσκολη περίοδο της ζωής μου. Υπήρξε ένα άτομο στο οποίο μπορούσα να μιλήσω ανά πάσα στιγμή και για οποιοδήποτε πρόβλημα και αν αντιμετώπιζα. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Επίκουρο Καθηγητή της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών κ.γεωργακόπουλο Κώστα, καθώς και τον ειδικευόμενο οφθαλμίατρο κ. Δρίμτζια Βαγγέλη για τη συνεργασία τους και την ουσιαστική συμβολή τους στην πραγματοποίηση της ερευνητικής αυτής εργασίας. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω την Επίκουρη Καθηγήτρια του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών κ. Μαργαρίτη Μαριγούλα για τη δυνατότητα που μου έδωσε να πραγματοποιήσω ένα μέρος των πειραμάτων μου στο εργαστήριο Φυσιολογίας Ανθρώπου και Ζωικών Οργανισμών του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, για τις πολύτιμες συμβουλές της ιδιαίτερα στο πεδίο της 4

5 φυσιολογίας του εγκεφάλου και για την συνεχή καθοδήγησή της από τα φοιτητικά μου χρόνια. Ιδιαίτερες ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω στις υποψήφιες Διδάκτορες του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, κ. Παπανδρέου Μάγδα και κ. Λιναρδάκη Ζαχαρούλα, για την συνεργασία τους και τη βοήθειά τους, και ιδιαίτερα την κ. Παπανδρέου Μάγδα για την πολύτιμη βοήθεια και τις συμβουλές της στη διαχείριση των πειραματόζωων. Θα ήθελα να ευχαριστήσω όλα τα μέλη του Εργαστηρίου Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων του Τμήματος Φαρμακευτικής, και ιδιαίτερα τον Καθηγητή κ. Κορδοπάτη Παύλο και την Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Μαγκαφά Βασιλική, για την αρμονική συνεργασία τους σε όλη τη διάρκεια της ερευνητικής μου εργασίας. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω την υποψήφια Διδάκτορα του Τμήματος Φαρμακευτικής κ. Χρυσάνθη Δήμητρα για τη συνεργασία της και τη βοήθεια που μου προσέφερε όποτε και αν τη χρειάστηκα, καθώς και τον προπτυχιακό φοιτητή του Τμήματος Φαρμακευτικής κ. Βαρεμένο Γιάννη για την πολύτιμη βοήθειά του στη διεξαγωγή μεγάλου μέρους των πειραμάτων του τελευταίου έτους της ερευνητικής μου εργασίας. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς μου για την διαρκή και πολύπλευρη στήριξή τους καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών μου και κυρίως για την ενθάρρυνσή τους να συνεχίσω τις σπουδές μου μετά την απώλεια του αδερφού μου. 5

6 Π Ε Ρ Ι Ε Χ Ο Μ Ε Ν Α I. ΕΙΣΑΓΩΓΗ I.1 Οξειδωτικό στρες Γενικά περί οξειδωτικού στρες Ελεύθερες ρίζες Αντιοξειδωτική άμυνα του οργανισμού Υπεροξείδωση λιπιδίων I.2 Εισαγωγή στη λειτουργία του εγκεφάλου Δομή και λειτουργία του εγκεφάλου Δομή και λειτουργία του εγκεφαλικού φλοιού, της παρεγκεφαλίδας και του μεσεγκεφάλου Οξειδωτικό στρες και γήρανση του εγκεφάλου Οξειδωτικό στρες και νευροεκφυλιστικές ασθένειες..40 I.3 Οφθαλμός Οφθαλμός δομή και λειτουργία Συγκριτική παρουσίαση οφθαλμού ανθρώπου και επίμυος Φακός δομή και λειτουργία...46 I.4 Καταρράκτης Γενικά περί καταρράκτη Καταρράκτης και οξειδωτικό στρες Καταρράκτης και διατροφή. 55 Ι.5. Οξειδωτικό στρες και καροτενοειδή.58 I.6 Σεληνιώδες νάτριο Σελήνιο (Se) και σεληνιώδες νάτριο (Νa 2 SeO 3 ) Σεληνιώδες νάτριο και καταρράκτης.64 6

7 I.7 Crocus sativus Γένος Crocus Crocus sativus Στύλοι του Crocus sativus Χημική σύσταση των στιγμάτων του Crocus sativus Μελέτες για βιολογική δράση των συστατικών του Crocus sativus.76 ΙΙ. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ..80 III. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΙΙΙ.1 Φυτικό υλικό ΙΙΙ.2 Εκχύλιση C.sativus. 82 III.3 Πειραματόζωα ΙΙΙ.4 Κατεργασία των δειγμάτων...85 ΙΙΙ. 5 Αναλυτικές Μέθοδοι ΙΙΙ.5.1 Μέθοδοι προσδιορισμού της αντιοξειδωτικής ικανότητας...86 ΙΙΙ.5.2 Μέθοδος προσδιορισμού της υπεροξείδωσης λιπιδίων. 89 ΙΙΙ.5.3 Μέθοδος προσδιορισμού των καρβονυλομάδων των πρωτεϊνών.. 93 ΙΙΙ.5.4 Μέθοδος προσδιορισμού του γλουταθείου ΙΙΙ.5.5 Μέθοδος Bradford για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης των δειγμάτων..98 ΙΙΙ.5.6 Ανάλυση των πρωτεϊνών του φακού με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου IV. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ IV.1 Ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων IV.1.1 Ικανότητα αναγωγής του σιδηρι-κατιόντος (μέθοδος FRAP) IV.1.2 Μέθοδος προσδιορισμού του ασκορβικού οξέος (μέθοδος FRASC) IV.1.3 Μέθοδος προσδιορισμού της υπεροξείδωσης λιπιδίων IV.1.4 Μέθοδος προσδιορισμού καρβονυλομάδων πρωτεϊνών IV.1.5 Μέθοδος προσδιορισμού γλουταθείου

8 IV.1.6 Μέθοδος Bradford για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης των δειγμάτων IV.1.7 Ανάλυση των πρωτεϊνών του φακού με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου IV. 2 Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στους επίμυες IV.2.1 Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στο σωματικό βάρος των πειραματόζωων..124 IV.2.2 Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στο βάρος των φακών των πειραματόζωων..125 IV.2.3 Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στην αντιοξειδωτική ικανότητα των ιστών..126 IV.2.4 Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στην υπεροξείδωση λιπιδίων των ιστών IV.2.5 Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στη συγκέντρωση της πρωτεΐνης των ιστών IV.2.6 Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στην ανάλυση των πρωτεϊνών του φακού με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου ΙV.3 Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C. sativus στο πειραματικό μοντέλο IV.3.1 Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στο σωματικό βάρος των πειραματόζωων IV.3.2 Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στο βάρος των φακών των πειραματόζωων IV.3.3 Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στην αντιοξειδωτική ικανότητα των ιστών. 135 IV.3.4 Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στην υπεροξείδωση λιπιδίων των ιστών. 137 IV.3.5 Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στη συγκέντρωση της πρωτεΐνης των ιστών.139 IV.3.6 Ανάλυση των πρωτεϊνών του φακού με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου V. ΣΥΖΗΤΗΣΗ- ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ VI. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 160 8

9 Συντμήσεις BSA Bovine Albumin Serum αλβουμίνη ορού βοοειδούς CAT Catalase καταλάση DNA Deoxyribonucleic acid Δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ DNPH 2,4-dinitro-phenylhydrazine 2,4-δινιτρο-φαινυλυδραζίνη GP x glutathione peroxidase υπεροξειδάση του γλουταθείου GSH glutathione γλουταθείο GSSH oxidized glutathione οξειδωμένη μορφή γλουταθείου LDL low density lipoproteins λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας MDA malondialdehyde μηλονική διαλδεΰδη MPTP 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin 1-μεθυλ-4-φαινυλ- 1,2,3,6-τετραϋδροπυριδίνη PBS Buffer Phosphate ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών PUFAs poly-unsaturated fatty acids πολυακόρεστα λιπαρά οξέα ROS Reactive Oxygen Species Ενεργές μορφές οξυγόνου SOD Superoxide Dismutase δισμουτάση του σουπεροξειδίου STZ Streptozotocin στρεπτοζοτοκίνη TBA Thiobarbituric Acid θειοβαρβιτουρικό οξύ TBARS Thiobarbituric Acid Reactive Substances ενεργές μορφές θειοβαρβιτουρικού οξέος TCA Trichloroacetic Acid τριχλωροοξικό οξύ TEAM Triethanolamine τριαιθανολαμίνη TPTZ 2,4,6-tripyridyl-s-triazine 2,4,6-τριπυριδιλο-s-τριαζίνη 9

10 Απόδοση αγγλικών όρων ascorbic acid ασκορβικό οξύ (βιταμίνη C) carbonyl catalase crocin glutathione glutathione peroxidase glutathione reductase glutathione S-transferase kaempferol lipid peroxidation lutein malondialdehyde picrocrocin quercetin safranal selenium sodium selenite superoxide dismoutase thiobarbituric acid trichloroacetic acid zeaxanthin καρβονύλιο καταλάση κροκίνη γλουταθείο υπεροξειδάση του γλουταθείου αναγωγάση του γλουταθείου S-τρανσφεράση του γλουταθείου καιμπφερόλη λιπιδική υπεροξείδωση λουτεΐνη μηλονική διαλδεΰδη πικροκροκίνη κερσετίνη σαφρανάλη σελήνιο σεληνιώδες νάτριο δισμουτάση του σουπεροξειδίου θειο-βαρβιτουρικό οξύ τριχλωρο-οξικό οξύ ζεαξανθίνη 10

11 I.1. ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟ ΣΤΡΕΣ 1.1 Γενικά περί οξειδωτικού στρες Οξειδωτικό στρες (oxidative stress) έχει οριστεί η διαταραχή στην ισορροπία ανάμεσα στην παραγωγή ελευθέρων ριζών (κυρίως ενεργών μορφών οξυγόνου, ROS) και στην αντιοξειδωτική άμυνα του οργανισμού. Έχει δειχθεί ποικιλοτρόπως ότι ταυτίζεται με μειωμένα επίπεδα αντιοξειδωτικών ουσιών, χαμηλά επίπεδα ενζύμων τα οποία αποτελούν μέρος του αντιοξειδωτικού αμυντικού συστήματος, και αυξημένα επίπεδα οξειδωτικών προϊόντων. Το οξειδωτικό στρες μπορεί να οδηγήσει σε τραυματισμό των ιστών και σε άλλες παθολογικές καταστάσεις (Εικόνα 1). Οξειδωτική Ισορροπία Προ-οξειδωτικά: Κυτταρική λειτουργία Κάπνισμα Ακτινοβολίες Μόλυνση Αντιοξειδωτικά: Διατροφή Βιταμίνες Συμπληρώματα Ένζυμα Ενεργοποίηση κυτταρικής καταστροφής Οξειδωτικό στρες Απενεργοποίηση Επιδιορθωτικών Μηχανισμών κυττάρου κυττάρου Κυτταρική βλάβη Εικόνα 1: Οξειδωτική ισορροπία μεταξύ προ-οξειδωτικών και αντιοξειδωτικών. Σε φυσιολογικές καταστάσεις, η παραγωγή των οξειδωτικών εξισορροπείται από τους μηχανισμούς άμυνας του οργανισμού. Σε κάποιες περιπτώσεις, όμως, η παραγωγή των οξειδωτικών υπερκαλύπτει την λειτουργία των αμυντικών μηχανισμών του οργανισμού (η ισορροπία μετατοπίζεται προς τα προ-οξειδωτικά), καταλήγοντας σε οξειδωτικό στρες, κυτταρική βλάβη και διάφορες παθολογικές καταστάσεις. 11

12 Οι ελεύθερες ρίζες είναι πολύ δραστικά, ασταθή μόρια, τα οποία φέρουν ένα ασύζευκτο ηλεκτρόνιο και είναι δυνατόν να βρίσκονται σε οξειδωμένη ή ανηγμένη μορφή. Η πλειοψηφία των ελευθέρων ριζών που προκαλούν βλάβη στα βιολογικά συστήματα είναι ενεργές μορφές οξυγόνου (ROS- reactive oxygen species). Οι ROS αποτελούν τα κύρια παραπροϊόντα του αερόβιου μεταβολισμού στα κύτταρα. Η παραγωγή τους πραγματοποιείται στα μιτοχόνδρια κατά τη μεταφορά ηλεκτρονίων στο Ο 2 κατά την οξειδωτική φωσφορυλίωση. Παραγωγή των ROS πραγματοποιείται και σε φλεγμονώδεις καταστάσεις. Άλλες πηγές ενεργών μορφών οξυγόνου είναι τα μακροφάγα και τα ουδετερόφιλα, τα οποία περιέχουν ένζυμα όπως το σύμπλοκο της NADPH οξειδάσης (NADPH oxidase). Η NADPH οξειδάση παράγει ρίζες σουπεροξειδίου και υπεροξείδιο του υδρογόνου. Επιπλέον, ROS παράγονται και ως αποτέλεσμα του μεταβολισμού ξένων ουσιών, τοξινών, φαρμάκων, από το κυτόχρωμα Ρ450, καθώς και λόγω της έκθεσης σε περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως η υπεριώδης ακτινοβολία (UV) και η περίσσεια αλάτων σιδήρου. Τέλος, ROS παράγονται και σαν αποτέλεσμα του ατομικού τρόπου ζωής (π.χ. κάπνισμα), καθώς και των διατροφικών συνηθειών (Εικόνα 2). Εικόνα 2: Πηγές σχηματισμού των ελευθέρων ριζών. Οι ελεύθερες ρίζες παράγονται στα μιτοχόνδρια κατά τη μεταφορά ηλεκτρονίων στο Ο 2 κατά την οξειδωτική φωσφορυλίωση, στις φλεγμονώδεις καταστάσεις, αλλά και λόγω της έκθεσης σε περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως η υπεριώδης ακτινοβολία (UV) και η ιονίζουσα ακτινοβολία, η ρύπανση της ατμόσφαιρας και το κάπνισμα. ( 12

13 Οι ROS που παράγονται στα βιολογικά συστήματα είναι ικανές να προκαλέσουν εκτεταμένη καταστροφή σε αυτά, στοχεύοντας τα λιπίδια, τις πρωτεΐνες και το DNA. Αυτές οι αντιδράσεις μεταξύ των κυτταρικών συστατικών και των ελευθέρων ριζών οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων, υπεροξείδωση λιπιδίων, οξείδωση των πρωτεϊνών, δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων (μείωση της παροχής ενέργειας στο κύτταρο), καταστροφή της κυτταρικής μεμβράνης, ενεργοποίηση ή αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, και τελικά σε κυτταρικό θάνατο (απόπτωση, η οποία καταλήγει σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο) (Εικόνα 3). Οι ελεύθερες ρίζες εμπλέκονται στη διαδικασία της γήρανσης. Σύμφωνα με τη θεωρία αυτή (Harman, 1956) η γήρανση μπορεί να θεωρηθεί ως μία προοδευτική, αναπόφευκτη διαδικασία η οποία σχετίζεται με τη συγκέντρωση ελευθέρων ριζών λόγω μιας ανισορροπίας στο σχηματισμό οξειδωτικών και αντιοξειδωτικών ουσιών (Εικόνα 3). Τα μιτοχόνδρια έχουν έναν κρίσιμο ρόλο στη διαδικασία της γήρανσης αφού αποτελούν όχι μόνο τους ενδοκυτταρικούς παραγωγείς ελευθέρων ριζών, αλλά και στόχο των ROS. Σε μεγάλες συγκεντρώσεις, οι ελεύθερες ρίζες εμπλέκονται σε διάφορες ασθένειες, όπως η υπέρταση, ο καρκίνος, ο διαβήτης (ινσουλινο-εξαρτώμενος και ινσουλινοανεξάρτητος), διάφορες αυτοάνοσες καταστάσεις (όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα και η αγκυλωτική σπονδυλίτιδα), κάποιες ασθένειες του αναπνευστικού συστήματος, ορισμένες οφθαλμικές παθήσεις και διαταραχές της όρασης, συμπεριλαμβανομένου του καταρράκτη και της βλάβης του αμφιβληστροειδούς που οδηγεί σε ηλικιακή εκφύλιση της ωχράς κηλίδας, διάφορες νευροεκφυλιστικές ασθένειες (όπως η νόσος του Alzheimer και του Parkinson), η σχιζοφρένεια και το AIDS (Εικόνα 3). 13

14 Μεταβολισμός των ROS Φυσιολογικός μεταβολισμός Φλεγμονή Αποτοξίνωση Καταστροφή ιστών + Fe 2+ / Cu 2+ O 2.- +H 2 O 2 OH.- - Αντιοξειδωτικά- Σαρωτές ελευθέρων ριζών: Μακροφάγα Ουδετερόφιλα Ένζυμα GPx SOD CAT Μιτοχόνδρια Υπεροξειδιοσώματα (οξειδάσες, καταλάσες) Μεμβράνη/Κυτόπλασμα (οξειδάση του NADPH) Ενδοπλασματικό δίκτυο (κυτόχρωμα P 450 ) Θετική επίδραση Ρύθμιση μεταγωγής σήματος/ μεταγραφής + Αρνητική επίδραση Υπεροξείδωση λιπιδίων, σταυροσύνδεσμοι, οξείδωση πρωτεϊνών, μεταλλάξεις - Βιταμίνες (A,C,E) Ορμόνες (μελατονίνη) Συμπαράγοντες (συνένζυμο Q) Μεταγωγή σήματος, ανοσοαπόκριση Οξειδωτικό στρες, γήρανση, παθήσεις Εικόνα 3: Επιπτώσεις των ROS στα κύτταρα και στους ιστούς. Οι ελεύθερες ρίζες έχουν διττό ρόλο. Συμμετέχουν σε φυσιολογικές διαδικασίες όπως η μεταγωγή σήματος και η ανοσοαπόκριση, αλλά η υπέρμετρη παρουσία τους στον οργανισμό συνδέεται με τη γήρανση και άλλες παθήσεις. (Πηγή: Gabi, Cellscience Reviews, Vol.1, No.2, 2004). 14

15 1.2 Ελεύθερες ρίζες Στα βιολογικά συστήματα υπάρχουν οι εξής κατηγορίες ελευθέρων ριζών: α) Ενεργές μορφές οξυγόνου (Reactive Oxygen Species, ROS) Οι ROS προέρχονται από το μοριακό οξυγόνο (O 2 ) με διαδοχικές αντιδράσεις. αναγωγής, και είναι: το ανιόν του σουπεροξειδίου (O - 2 ), το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ) και η ρίζα του υδροξυλίου (OH. ). Το ανιόν του σουπεροξειδίου, μία πολύ καταστροφική ένωση, σχηματίζεται από τη μεταφορά ενός ηλεκτρονίου στο μοριακό οξυγόνο (O 2 ), ενώ η μεταφορά δύο ηλεκτρονίων οδηγεί στο σχηματισμό του υπεροξειδίου (Ο 2-2 ). Η πρωτονίωση του ανιόντος του υπεροξειδίου δίνει μία υδρουπεροξυλο-ρίζα (ΗΟ. 2 ), η οποία αντιδρά αυθόρμητα με ένα άλλο ανιόν του σουπεροξειδίου για να σχηματίσει το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ).. Το O - 2 μπορεί να εκκαθαριστεί από τη δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD), ένα ένζυμο που βρίσκεται σε όλους τους αερόβιους οργανισμούς, και το οποίο καταλύει τη μετατροπή δύο τέτοιων ριζών σε H 2 O 2 και O 2. Το σχηματιζόμενο H 2 O 2 εκκαθαρίζεται από την καταλάση (CAT), μία αιμοπρωτεΐνη, η οποία καταλύει τη μετατροπή δύο μορίων H 2 O 2 σε νερό και μοριακό οξυγόνο.. Το O - 2 παράγεται όχι μόνο στα μιτοχόνδρια των κυττάρων κατά τη διάρκεια του αερόβιου μεταβολισμού, αλλά και στα φαγοκύτταρα, κατά την οξείδωση συγκεκριμένων βιομορίων και ως αποτέλεσμα των φωτοχημικών αντιδράσεων. Το. - O 2 είναι λιγότερο δραστικό από το ΟΗ.. Ωστόσο, η σχετική σταθερότητά του επιτρέπει τη γρήγορη μεταφορά του από το σημείο παραγωγής του σε άλλες περιοχές, διαμέσου των κυτταρικών μεμβρανών. Η ΟΗ. έχει μικρό χρόνο ημιζωής και δρα στο σημείο παραγωγής της ή σε κοντινή από αυτό απόσταση. Αποτελεί τη δραστικότερη ενεργή μορφή οξυγόνου που σχηματίζεται in vivo. Σχηματίζεται από το H 2 O 2 παρουσία ενός ιόντος μετάλλου, όπως Fe +2 ή Cu +1. Η ΟΗ. απαντάται στη φλεγμονώδη απόκριση αλλά και σε πολλά ενζυμικά συστήματα συμπεριλαμβανομένης της οξειδάσης της ξανθίνης, του κυτοχρώματος P 450, της οξειδάσης του NADPH και κάποιων φωτοχημικών αντιδράσεων. 15

16 β) Ενεργές μορφές αζώτου (Reactive Nitrogen Species, RNS) Το NO. (ρίζα του οξειδίου του αζώτου) στα θηλαστικά από την οξείδωση της L- αργινίνης που καταλύεται από την συνθετάση του οξειδίου του αζώτου (NOS). Αποτελεί ένα σημαντικό βιολογικό μηνυματοφόρο μόριο. Διαχέεται αρκετά εύκολα, μέσω των βιολογικών μεμβρανών, και παίζει ένα αξιόλογο ρόλο στη φυσιολογία του ΚΝΣ. Παράγεται σε μεγάλα ποσά σε παθολογικές καταστάσεις και προέρχεται από την ενεργοποίηση της μικρογλοίας ή από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Όταν το οξείδιο του αζώτου χάνει ένα ηλεκτρόνιο παράγεται το ΝΟ + (nitrosonium cation), ενώ όταν προσλαμβάνει ένα ηλεκτρόνιο παράγεται το NO - (nitroxyl anion). - Το ανιόν του ONO 2 (peroxynitrate anion) παράγεται από την αντίδραση του NO. - με το ανιόν του σουπεροξειδίου. Είναι λιποδιαλυτό. Το ONO 2 αποτελεί την πιο δραστική ενεργή μορφή αζώτου, προκαλεί βλάβες σε πολλά βιομόρια και εμπλέκεται στην παθογένεση πολλών ασθενειών. Με πρωτονίωση σχηματίζει το ONO 2 H (peroxynitrous acid), το οποίο σχηματίζει ΟΗ. και ΝΟ 2. Η ρίζα του υπεροξυνιτρικού ανιόντος (ΟΝΟ. 2, peroxynitrate radical) παράγεται από την αντίδραση του NO. με το μοριακό οξυγόνο. γ) Αλογονωμένες ενεργές μορφές (Reactive Halogonated Species, RHS) Το HOCl (υποχλωριώδες οξύ) σχηματίζεται από το Η 2 Ο 2 με τη δράση του ενζύμου της μυελο-υπεροξειδάσης (myeloperoxidase). Είναι λιποδιαλυτό και έχει παρόμοια δραστικότητα με το ONO - 2. Οξειδώνει πρωτεΐνες αντιδρώντας με αμινομάδες, θειόλες και τη μεθειονίνη. Σχηματίζει ελεύθερες ρίζες σε αντίδραση τύπου Fenton με το Fe 2+, ενώ στην αντίδρασή του με το ανιόν του σουπεροξειδίου σχηματίζει ΟΗ.. Τα NOCl (nitrosyl chloride) και ClNO 2 (nitryl chloride) παράγονται στα βιολογικά συστήματα και δρουν σαν κυτταροτοξικοί παράγοντες. 16

17 δ) Ενεργές μορφές θείου (Reactive Sulfur Species, RSS) Οι θειούχες ρίζες (thiyl radicals, RS. ) αν και είναι λιγότερο δραστικές από τη ΟΗ. είναι αρκετά δραστικές και συμμετέχουν σε αρκετές κυτταρικές λειτουργίες, καθώς εντοπίζονται σε μεγάλες συγκεντρώσεις στους ζωντανούς οργανισμούς. ε) Οργανικές ελεύθερες ρίζες Το ROOH (organic hydroperoxide) σχηματίζεται από την αντίδραση ελευθέρων ριζών με κυτταρικά συστατικά όπως τα λιπίδια και τα νουκλεοτίδια. Οι άλκοξυ- (RO. ) και υπέροξυ- (ROO. ) ρίζες σχηματίζονται παρουσία του οξυγόνου με προσθήκη ελευθέρων ριζών σε διπλούς δεσμούς ή με αφαίρεση υδρογόνου. Συμμετέχουν στις αντιδράσεις λιπιδικής υπεροξείδωσης. 17

18 1.3 Αντιοξειδωτική άμυνα του οργανισμού Ο οργανισμός μας έχει αναπτύξει διάφορα ενδογενή συστήματα ως άμυνα έναντι των ελευθέρων ριζών. Τα συστήματα αυτά περιλαμβάνουν ενδογενή ένζυμα (καταλάση CAT, αναγωγάση του γλουταθείου, δισμουτάση του σουπεροξειδίου SOD, υπεροξειδάση του γλουταθείου GP x, αναγωγάση της μεθειονίνης MsrA), ενδογενείς παράγοντες (γλουταθείο, ουρικό οξύ, χολερυθρίνη, συνένζυμο Q) και διατροφικούς παράγοντες ή εξωγενείς (β-καροτένια και άλλα καροτενοειδή, βιταμίνη C, βιταμίνη Ε και σελήνιο) (Εικόνα 4). Καταστροφή ιστών HOCl.- NADP NADPH Cl- GSH reductase Η 2 Ο + O.SO 2 Φυσιολογικός μεταβολισμός Καταστροφή ιστών SH ομάδες O 2- + O H + SOD H 2 O 2 CAT GSH Se GPx GSSH Fe 2+ O 2.- Η 2 Ο Φυσιολογικός μεταβολισμός OH. PUFAs RO. ROO. Λιπιδικά υπεροξείδια β-καροτένιο Καταστροφή πρωτεϊνών, DNA, υδατανθράκων ρίζα β- καροτενίου Δεΰδροασκορβικό οξύ Ασκορβικό οξύ Καταστροφή ιστών Εικόνα 4: Μηχανισμοί δράσης των αντιοξειδωτικών ενζύμων έναντι των ελευθέρων ριζών. Τα αντιοξειδωτικά ένζυμα παίζουν σημαντικό ρόλο στον περιορισμό των προκαλούμενων από ελεύθερες ρίζες βλαβών των βιολογικών μακρομορίων. Η υπεροξειδάση του γλουταθείου (GPx) είναι μία σεληνο-πρωτεΐνη που ανάγει το Η 2 Ο 2 σε νερό, προσφέροντας έτσι προστασία έναντι των ενδογενών ελευθέρων ριζών. Η οξειδωμένη μορφή του γλουταθείου (GSSG) ανάγεται προς την ανηγμένη (GSH) του μορφή από την αναγωγάση του γλουταθείου (GSH reductase), ένα NADPH- 18

19 εξαρτώμενο ένζυμο. Η καταλάση (CAT), είναι μία αιμοπρωτεΐνη, η οποία καταλύει τη μετατροπή δύο μορίων του H 2 O 2 σε νερό και μοριακό οξυγόνο. H δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD), είναι ένα ένζυμο που βρίσκεται σε όλους τους αερόβιους οργανισμούς, και καταλύει τη μετατροπή δύο ανιόντων του σουπεροξειδίου (O. 2 ) σε H 2 O 2 και O 2. [Πηγή: Bahorun et al., Internet Journal of Medical Update 2006 Jul-Dec; 1(2)]. Τα ενδογενή αντιοξειδωτικά ανήκουν στην πρώτη γραμμή άμυνας έναντι των ελευθέρων ριζών. Παίζουν σημαντικό ρόλο στον περιορισμό των προκαλούμενων από ενεργές μορφές οξυγόνου βλαβών των βιολογικών μακρομορίων. Εντούτοις, δεν είναι πάντα αποτελεσματικά καθώς ορισμένες ενώσεις που δημιουργούνται από την αλληλεπίδραση των ενεργών μορφών οξυγόνου με τα μακρομόρια είναι αρκετά ενεργές. Επομένως, είναι απαραίτητο να απομακρυνθούν τα δευτερογενή αυτά προϊόντα, ώστε να παρεμποδιστεί η περαιτέρω ενδοκυτταρική καταστροφή, η αποικοδόμηση των κυτταρικών συστατικών και τελικά ο κυτταρικός θάνατος. Αυτή η δεύτερη γραμμή άμυνας του οργανισμού έναντι των ελευθέρων ριζών παρέχεται από ένζυμα όπως η υπεροξειδάση του γλουταθείου, η S-τρανσφεράση του γλουταθείου και η αλδεϋδική αφυδρογονάση (Masella et al., 2005).Οι μεταβολίτες οι οποίοι παράγονται από αυτά τα μόρια είναι λιγότερο επιβλαβείς και απομακρύνονται από το κύτταρο μέσω αντλιών, όπως ο συζευγμένος με γλουταθείο S-μεταφορέας. 19

20 Κύρια αντιοξειδωτικά μόρια στον οργανισμό Ασκορβικό οξύ Το ασκορβικό οξύ (Εικόνα 5) είναι το κυριότερο υδατοδιαλυτό εξωκυτταρικό αντιοξειδωτικό που ο ανθρώπινος οργανισμός αδυνατεί να συνθέσει de novo. Είναι ιδανικό χάρη στην υδατοδιαλυτότητα, σταθερότητα και κινητικότητά του και στο γεγονός ότι μπορεί να μεταφερθεί, να επαναπορροφηθεί και να ανακυκλωθεί. Η βιταμίνη C (ασκορβικό οξύ) είναι ένα σημαντικό και απαραίτητο θρεπτικό συστατικό για τον ανθρώπο. Δρα ως ηλεκτρονιοδότης και είναι αναντικατάστατο σε πολλές ενζυμικές αντιδράσεις. Η οξειδωμένη μορφή του ονομάζεται δεΰδροασκορβικό οξύ (Εικόνα 6). Εικόνα 5: Ασκορβικό οξύ. Εικόνα 6: Δεΰδροασκορβικό οξύ. Η έλλειψη ασκορβικού οξέος στον οργανισμό έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση της ασθένειας σκορβούτο. Το ασκορβικό οξύ, ως αναγωγικό μέσο, συμμετέχει στην αντίδραση της υδροξυλίωσης της προλυλοϋδροξυλάσης, κατά την μετατροπή των καταλοίπων προλίνης του κολλαγόνου σε υδροξυπρολίνη, διατηρώντας τη σε ενεργή μορφή μέσω της διατήρησης των ατόμων σιδήρου της στην ανηγμένη δισθενή τους μορφή. Το κολλαγόνο που συντίθεται απουσία ασκορβικού οξέος δεν έχει τη δυνατότητα σχηματισμού κανονικών ινών, με αποτέλεσμα τις κακώσεις του δέρματος και τη δημιουργία εύθραυστων αιμοφόρων αγγείων, τα οποία είναι τα βασικά συμπτώματα του σκορβούτου. 20

21 Στον οφθαλμό βρίσκεται στα δάκρυα, στο υδατοειδές υγρό, στο επιθήλιο του κερατοειδούς, στο υαλώδες σώμα και στον κρυσταλλοειδή φακό. Το ασκορβικό οξύ εκκρίνεται στο υδατοειδές υγρό από το επιθήλιο του άνω και κάτω ταρσού του βλεφάρου. Παίζει ζωτικό ρόλο στον αμυντικό μηχανισμό του οφθαλμού προστατεύοντας τους ιστούς από τη φωτοοξειδωτική βλάβη, ενώ έχει και αντιφλεγμονώδη δράση. Τα δάκρυα περιέχουν σημαντικά επίπεδα ασκορβικού οξέος. Είναι πολύ πιθανόν ότι το ενδοκυττάριο ασκορβικό οξύ δρα ως απόθεμα για να διατηρεί ικανοποιητικά επίπεδα σε εξωκυττάρια υγρά, όπως στα δάκρυα. Ουρικό οξύ Το ουρικό οξύ (Εικόνα 7) είναι επίσης, ένα πολύ σημαντικό ενδογενές αντιοξειδωτικό. Είναι μια ευρέως διαδεδομένη, εκλεκτική, αντιοξειδωτική ένωση, ιδιαίτερα ικανή να αντιδράσει με διάφορες υδροξυλικές ρίζες, ανιόντα υπεροξειδίου, ατομικό οξυγόνο και οξυγονωμένα ενδιάμεσα αίμης με τον Fe σε υψηλή οξειδωτική κατάσταση (+4 και +5), ενώ μετατρέπεται σε αδρανή προϊόντα. Το ουρικό ως αντιοξειδωτικό είναι περίπου το ίδιο δραστικό με το ασκορβικό οξύ. Εικόνα 7: Ουρικό οξύ. Θεωρείται ως ένα μεταβολικά αδρανές τελικό προϊόν του μεταβολισμού των πουρινών στον άνθρωπο, και όπως και στην περίπτωση της χολερυθρίνης, αποδεικνύεται ότι μερικά τελικά προϊόντα αποικοδόμησης των μεταβολικών πορειών δρουν ως προστατευτικοί παράγοντες. Στα περισσότερα θηλαστικά, εκτός των 21

22 πρωτευόντων, το ουρικό οξύ οξειδώνεται περαιτέρω προς το σχηματισμό αλλαντοΐνης. Προφανώς, κατά την πορεία εξέλιξης των ανώτερων θηλαστικών χάθηκε το ένζυμο που καταλύει την αντίδραση οξείδωσης του ουρικού οξέος. Το ουρικό οξύ μπορεί, επίσης, να δράσει ως επιπλέον υπόστρωμα για το ένζυμο κυκλοξυγενάση, ικανό να οξειδωθεί. Αποτρέπει την απενεργοποίηση των ενδοθηλιακών ενζύμων κατά τη διάρκεια του οξειδωτικού στρες, υποστηρίζοντας, έτσι, την ιδιαίτερη σχέση ανάμεσα στο σχηματισμό του ουρικού οξέος και στην ανάγκη για ένα ισχυρό βιολογικά αντιοξειδωτικό. Στον οφθαλμό βρίσκεται στα δάκρυα, στο υδατοειδές υγρό και στο υαλώδες σώμα. Γλουταθείο Το γλουταθείο είναι η κύρια μη-πρωτεϊνική θειόλη που εμπλέκεται στην αντιοξειδωτική κυτταρική άμυνα. Είναι ένα τριπεπτίδιο γ-γλουταμινικό κυστεΐνη γλυκίνη (γ-glu-cys-gly). Η ενεργός μορφή του γλουταθείου οφείλεται στη θειόλη (- SH) της κυστεΐνης. Είναι ένα ευρέως διαδεδομένο μόριο που παράγεται σε όλα τα όργανα, κυρίως στο ήπαρ, στον σπλήνα, στους νεφρούς και στους φακούς και είναι παρόν ουσιαστικά σε όλους τους ιστούς των θηλαστικών και σε όλους τους κυτταρικούς τύπους σε συγκεντρώσεις της τάξης των mm (Pastore et al., 2003). Η σύνθεση του γλουταθείου στα κύτταρα από τα αμινοξέα που το αποτελούν είναι μία διαδικασία διαδοχικών ενζυμικών αντιδράσεων, η οποία απαιτεί κατανάλωση ATP και καταλύεται από την γ-γλουταμυλοκυστική συνθετάση (GCS) και την συνθετάση του γλουταθείου (GS) (Pastore et al., 2003; Ganea et al., 2006). Οι παράγοντες που ρυθμίζουν τη σύνθεση του γλουταθείου είναι η ενεργότητα της GCS, τα αποθέματα κυστεΐνης του οργανισμού και η αναδραστική αναστολή (feedback inhibition) της σύνθεσης του γλουταθείου. Το γλουταθείο στο κύτταρο υπάρχει στην ανηγμένη (GSH) και οξειδωμένη (GSSG) του μορφή (Εικόνα 8) ή δεσμευμένο σε πρωτεΐνες (π.χ. αιμοσφαιρίνη συνδεμένη με γλουταθείο που αποτελεί κλινικό δείκτη στο αίμα για το οξειδωτικό στρες) (Pastore et al., 2003). Αποτελεί τον κύριο μη ενζυμικό ρυθμιστή της ενδοκυτταρικής οξειδοαναγωγικής κατάστασης και συμμετέχει σε αντιδράσεις οξειδοαναγωγής, μέσω της αντιστρέψιμης οξείδωσης της ενεργής του θειόλης. 22

23 Εικόνα 8: Η ανηγμένη (GSH) και η οξειδωμένη (GSSG) μορφή του γλουταθείου. Υπό φυσιολογικές κυτταρικές συνθήκες, η μεγαλύτερη αναλογία του γλουταθείου βρίσκεται στην ανηγμένη του μορφή και κατανέμεται στον πυρήνα, στο ενδοπλασματικό δίκτυο και στα μιτοχόνδρια. Επίσης, η ανηγμένη μορφή μπορεί να βρίσκεται, όπως προαναφέρθηκε, δεσμευμένη σε πρωτεΐνες και να δρα ως συνένζυμο διαφόρων ενζύμων τα οποία εμπλέκονται στην άμυνα του οργανισμού. Με αυτό τον τρόπο, το γλουταθείο μπορεί να εκκαθαρίζει ελεύθερες ρίζες ή να δρα ως υπόστρωμα των ενζύμων υπεροξειδάση του γλουταθείου, αναγωγάση του γλουταθείου (glutathione reductase, GR) και S-τρανσφεράση του γλουταθείου, κατά τη διάρκεια της αποτοξίνωσης του υπεροξειδίου του υδρογόνου, των λιπιδικών υδροϋπεροξειδίων και άλλων ηλεκτρονιόφιλων ενώσεων. Εκτός όμως από τη δράση του ως σαρωτή ελευθέρων ριζών, το γλουταθείο συμμετέχει σε πλήθος κυτταρικών λειτουργιών όπως η ρύθμιση της σύνθεσης πρωτεϊνών και DNA, η μεταγωγή σήματος, η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, η πρωτεόλυση, η ανασοαπόκριση, καθώς και η συμμετοχή του σε διάφορα μεταβολικά μονοπάτια (Wu et al., 2004). 23

24 Εικόνα 9: Ο κύκλος του γλουταθείου. Η υπεροξειδάση του γλουταθείου, μία σεληνο-πρωτεΐνη, ανάγει το Η 2 Ο 2 προς το σχηματισμό νερού και παράλληλα οξειδώνει το γλουταθείο σε GSSG. Η οξειδωμένη μορφή (GSSG) του γλουταθείου ανάγεται από την αναγωγάση του γλουταθείου (glutathione reductase, GR), ένα NADPH- εξαρτώμενο ένζυμο. H αναγωγάση του γλουταθείου είναι σημαντική όχι μόνο για τη διατήρηση των φυσιολογικών επιπέδων του ενδοκυτταρικού γλουταθείου, αλλά και για τη διατήρηση των σουλφυδρυλομάδων πολλών πρωτεϊνών στην ανηγμένη τους μορφή, μια απαίτηση για την κανονική τους λειτουργία (Ganea et al., 2006). Η προσθετική ομάδα FAD (φλαβινο-αδενινο-δινουκλεοτίδιο) βρίσκεται στο ενεργό κέντρο του ενζύμου της αναγωγάσης του γλουταθείου και παίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της ενεργότητας του ενζύμου (Katakura et al., 2004; Ganea et al., 2006) (lpi.oregonstate.edu) Οι υπεροξειδάσες του γλουταθείου αποτελούν μία ομάδα ενζύμων τα οποία είναι ικανά να ανάγουν μία πληθώρα οργανικών και ανόργανων υδροϋπεροξειδίων προς τις αντίστοιχες υδροξυ-ενώσεις, χρησιμοποιώντας το ανηγμένο γλουταθείο ή άλλα αντίστοιχα αναγωγικά μόρια. Υπάρχουν πολλές ιστο-ειδικές υπεροξειδάσες του γλουταθείου, οι οποίες εμφανίζουν ιστο-ειδική δράση. Όλες οι μορφές είναι σεληνο- 24

25 πρωτεΐνες και η βασική τους λειτουργία είναι να αντιμετωπίζουν καταστάσεις οξειδωτικού στρες. Κατά τη διάρκεια του καταλυτικού κύκλου το σελήνιο (Se) οξειδώνεται από το υδροϋπεροξείδιο προς σεληνικό οξύ. Στη συνέχεια το ενδιάμεσο αυτό ανάγεται από τον δότη ηλεκτρονίων. Στην περίπτωση του ανηγμένου γλουταθείου σχηματίζεται ένα σεληνο-δισουλφίδιο, το οποίο διασπάται από ένα δεύτερο μόριο GSH και αναγεννάται η ενεργός μορφή του ενζύμου (Ursini et al., 1995; Masella et al., 2005). Οι S-τρανσφεράσες του γλουταθείου χωρίζονται σε τρεις ενζυμικές οικογένειες: την κυτταροπλασματική, τη μιτοχονδριακή και τη μικροσωματική. Τα ένζυμα αυτά αποτοξινώνουν ηλεκτρονιόφιλα ξενοβιοτικά, όπως χημικά καρκινογόνα, περιβαλλοντικούς παράγοντες μόλυνσης και αντι-ογκογόνους παράγοντες (Hayes et al., 2005; Masella et al., 2005). Επιπλέον, προστατεύουν από ενεργές ενώσεις, οι οποίες παράγονται in vivo σε κατάσταση οξειδωτικού στρες, απενεργοποιώντας ενδογενείς ακόρεστες αλδεΰδες, κινόνες, εποξείδια και υδροϋπεροξείδια. Οι τρανσφεράσες αυτές ασκούν την προστατευτική τους δράση μέσω της ικανότητάς τους να καταλύουν τη σύζευξη του ανηγμένου γλουταθείου με τελικά προϊόντα οξείδωσης. Συνεπώς, τόσο η υπεροξειδάση του γλουταθείου, όσο και η S- τρανσφεράση του γλουταθείου με τη δράση τους μειώνουν τα ενδοκυτταρικά επίπεδα του ανηγμένου γλουταθείου. Το ανηγμένο γλουταθείο υπάρχει σε μια ασυνήθιστα υψηλή συγκέντρωση στον κρυσταλλοειδή φακό, όπου λειτουργεί ως αντιοξειδωτικό ζωτικής σημασίας για τη διατήρηση της διαφάνειας του φακού (Ganea et al., 2006). Το γλουταθείο αποτοξινώνει σημαντικά βλαβερά οξειδωτικά, όπως το υπεροξείδιο του υδρογόνου και το δεϋδροασκορβικό οξύ. Πρόσφατες μελέτες έχουν υποδείξει μια σημαντική λειτουργία του ως σαρωτή υδροξυλικών ριζών στα επιθηλιακά κύτταρα του φακού ανεξάρτητα από την ικανότητα του κυττάρου να αποτοξινώνει το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Wu et al., 2004). Το γλουταθείο δεν προστατεύει μόνο τις κυτταρικές μεμβράνες από οξειδωτική βλάβη, αλλά επίσης, βοηθά στη διατήρηση των σουλφυδρυλομάδων πολλών πρωτεϊνών στην ανηγμένη τους μορφή, μια απαίτηση για την κανονική τους λειτουργία (Ganea et al., 2006). 25

26 Αμετάκλητη βλάβη επέρχεται στα κύτταρα όταν δεν είναι ικανά να διατηρήσουν το επίπεδο του γλουταθείου, κάτι που συμβαίνει σε παθολογικές καταστάσεις (καταρράκτης, σακχαρώδης διαβήτης), καθώς και σε προχωρημέν ηλικία (Lou, 2003; Ganea et al., 2006). Με την πάροδο της ηλικίας τα επίπεδα του ανηγμένου γλουταθείου στον οργανισμό μειώνονται ενώ αυξάνονται αυτά της οξειδωμένης μορφής του. Συγκεκριμένα, μειώνεται η σύνθεση του γλουταθείου και του NADPH, καθώς μειώνεται η ενεργότητα της γ-γλουταμυλοκυστικής συνθετάσης και της συνθετάσης του γλουταθείου, με αποτέλεσμα τη μείωση της αντιοξειδωτικής δράσης του γλουταθείου. Αντίθετα, αυξάνεται η συγκέντρωση της υπεροξειδάσης του γλουταθείου και της S-τρανσφεράσης του γλουταθείου (Sethna et al.,1983; Rathbun et al., 1993). Στο φακό, η μείωση της συγκέντρωσης του ανηγμένου γλουταθείου, η οποία παρατηρείται όπως προαναφέρθηκε με την πάροδο της ηλικίας, προκαλεί οξείδωση των σουλφυδρυλικών ομάδων των πρωτεϊνών με τελικό αποτέλεσμα την αλλαγή στις συνδέσεις μεταξύ πρωτεϊνών, αλλαγές στη διαλυτότητα και στη διαύγεια του φακού, καθώς και την επαγωγή της προκαλούμενης από τις ελεύθερες ρίζες οξειδωτικής καταστροφής, η οποία ακολουθείται από εκδήλωση καταρράκτη (David et al., 1984; Shearer et al., 1997). Επίσης, τα διαβητικά άτομα λόγω της αυτοοξείδωσης σακχάρων (γλυκόζης, φρουκτόζης) η οποία οδηγεί σε αυξημένο οξειδωτικό στρες, εμφανίζουν καταρράκτη. Συνεπώς, η μέτρηση των συγκεντρώσεων των διαφόρων μορφών του γλουταθείου στα βιολογικά δείγματα είναι σημαντική για την κατανόηση της ομοιόστασης σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις. Η συγκέντρωσή του αποτελεί πολύ ευαίσθητο δείκτη της κυτταρικής λειτουργικότητας και βιωσιμότητας. 26

27 1.4 Υπεροξείδωση λιπιδίων Μηχανισμοί υπεροξείδωσης λιπιδίων Η υπεροξείδωση των λιπιδίων, αποτέλεσμα της οξειδωτικής καταστροφής των κυτταρικών μεμβρανών που σχετίζεται με την ανάπτυξη σοβαρών ασθενειών, επάγεται μέσω τριών μηχανισμών: α) αυτοοξείδωση μέσω της δράσης των ελευθέρων ριζών Η διαδικασία περιλαμβάνει 3 στάδια (Εικόνα 10) (Laguerre et al., 2007). Στο πρώτο στάδιο (initiation) απομακρύνεται ένα άτομο υδρογόνου από μία μεθυλενομάδα (- CH 2 -) ενός μορίου πολυακόρεστου λιπαρού οξέος, μέσω της αντίδρασής του με τη OH., και σχηματίζεται μία ρίζα λιπαρού οξέος (lipid radical) με ένα ασύζευκτο ηλεκτρόνιο. Η παραπάνω αντίδραση μπορεί να ανασταλεί από τις τοκοφερόλες, τη μαννιτόλη και από το μυρμηκικό ιόν. Η παρουσία του διπλού δεσμού στο λιπαρό οξύ εξασθενεί τους δεσμούς C-H παρακείμενου του διπλού δεσμού ατόμου άνθρακα, κάνοντας ευκολότερη την απομάκρυνση του ατόμου υδρογόνου. Στο επόμενο στάδιο, η ρίζα αυτή αντιδρά με το μοριακό οξυγόνο και σχηματίζει υπεροξυ-ρίζες των λιπαρών οξέων (lipid peroxyl radicals). Τα μόρια αυτά μπορούν να αντιδράσουν με πρωτεΐνες, με το DNA ή με άλλα όμοιά τους μόρια. Στη λιπιδική μεμβράνη όπου βρίσκονται, το πιθανότερο είναι να αντιδράσουν με μόρια πολυακόρεστων λιπαρών οξέων, από τα οποία αποσπούν ένα άτομο υδρογόνου σχηματίζοντας ένα λιπιδικό υπεροξείδιο (lipid peroxide). Η παραπάνω αντίδραση καταλύεται παρουσία ιόντων σιδήρου ή χαλκού. 27

28 Το τελευταίο στάδιο του τερματισμού συνήθως πραγματοποιείται με την αντίδραση του λιπιδικού υπεροξειδίου με την α-τοκοφερόλη (α-tocopherol). Με αυτό τον τρόπο ξεκινά η αλυσίδα των αντιδράσεων της υπεροξείδωσης λιπιδίων. Από μία και μόνο εκκίνηση (initiation) μπορούν να σχηματιστούν έως και περισσότερα από 100 μόρια λιπιδικών υπεροξειδίων. Εικόνα 10: Μηχανισμός υπεροξείδωσης λιπιδίων μέσω των ελευθέρων ριζών. ( 28

29 β) φωτο-οξείδωση To οξυγόνο που παράγεται από τις φωτοχημικές αντιδράσεις αντιδρά εξαιρετικά γρήγορα με τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (παρουσία χλωροφύλλης, ριβοφλαβίνης, πορφυρίνης κ.ά.). Οι αντιδράσεις φωτο-οξείδωσης είναι ταχύτερες από τις αντιδράσεις αυτό-οξείδωσης. Οι αντιδράσεις φωτο-οξείδωσης στα πράσινα φυτά αναστέλλονται από τα καροτενοειδή και από τις τοκοφερόλες. γ) ενζυμική υπεροξείδωση Τα ένζυμα λιποξυγενάσες (lipoxygenases, φυτικών ή ζωικών οργανισμών) καταλύουν τις αντιδράσεις ανάμεσα στο O 2 και τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, όπως το αραχιδονικό οξύ. Επίσης, τα ένζυμα κυκλοξυγενάσες (cycloxygenases, φυτικών ή ζωικών οργανισμών) καταλύουν τις αντιδράσεις ανάμεσα στο μοριακό οξυγόνο και τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, τα οποία μετατρέπονται σε βιολογικώς ενεργά μόρια, τα ενδοϋπεροξείδια (endoperoxides). Τα τελευταία αποτελούν ενδιάμεσα μόρια της μετατροπής των λιπαρών οξέων σε προσταγλαδίνες (prostagladins). 29

30 1.4.2 Δευτερογενή προϊόντα υπεροξείδωσης λιπαρών οξέων Μηλονική διαλδεΰδη ( MDA) Η υπεροξείδωση των λιπιδίων, όπως προαναφέρθηκε, είναι αποτέλεσμα της οξειδωτικής καταστροφής των κυτταρικών μεμβρανών και σχετίζεται με την ανάπτυξη σοβαρών ασθενειών. Ο πιο σημαντικός και καλύτερα μελετημένος δείκτης για τον έλεγχο της υπεροξείδωσης των λιπιδίων θεωρείται η μηλονική διαλδεΰδη (MDA) (Εικόνα 11), η οποία αποτελεί το κύριο προϊόν της υπεροξείδωσης των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (Εικόνα 12). Εικόνα 11: Μηλονική διαλδεΰδη (MDA). Εκτός από τελικό προϊόν της λιπιδικής υπεροξείδωσης, αποτελεί και ένα ασταθές παραπροϊόν της ενζυμικής οξυγόνωσης του αραχιδονικού οξέος, καθώς και προϊόν της αντίδρασης της κυκλοξυγενάσης στον μεταβολισμό των προσταγλαδινών. Αποδίδει ένα φθορίζον κόκκινο παράγωγο και παρουσιάζει μέγιστη απορρόφηση στα 267nm. 30

31 Εικόνα 12: Μονοπάτι σχηματισμού της MDA από πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (PUFAs). Έχουν προταθεί διάφορα μονοπάτια σχηματισμού της MDA, αλλά το πιθανότερο είναι να σχηματίζεται από μονοκυκλικά υπεροξείδια τα οποία έχουν σχηματιστεί από λιπαρά οξέα με 3 ή περισσότερους διπλούς δεσμούς, όπως το λινολενικό οξύ (linolenic acid). (Πηγή: Laguerre et al., Progress in Lipid Research 46 (2007) ). Υπό φυσιολογικές συνθήκες, και σε ουδέτερο ph, η MDA βρίσκεται με τη μορφή ενολικού ανιόντος, χαμηλής χημικής δραστικότητας. Ωστόσο, η αλδεΰδη αυτή είναι ιδιαίτερα τοξική και ικανή να αλληλεπιδράσει με το DNA, προκαλώντας μεταλλάξεις (Del Rio et al., 2005). Το κύριο προϊόν της αλληλεπίδρασης αυτής είναι η πυριμιδο- [1,2-α] πουριν-10(3h)-δεοξυριβόζη (M 1 G), η οποία βρίσκεται σε ισορροπία με την ανοιχτή μορφή Ν 2 -οξοπροπενυλ-γουανοσίνη (Εικόνα 13). Η M 1 G είναι ικανή να προκαλέσει πλαισιοτροποποιητικές μεταλλάξεις, καθώς και μεταλλάξεις υποκατάστασης σε βακτηριακά κύτταρα και σε κύτταρα θηλαστικών (Vanderveen et al., 2003). Επίσης, η MDA δημιουργεί σταυροσυνδέσμους μεταξύ DNA και πρωτεϊνών (Voitkun and Zhitkovich, 1999). Οι προαναφερθείσες τοξικές δράσεις της MDA ενδέχεται να οδηγούν σε καρκίνο. Αυξημένα επίπεδα της MDA έχουν παρατηρηθεί σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, του στήθους, του τραχήλου, και του στομάχου (Gonenc et al., 2001; Kolanjiapan et al., 2002; Bakan et al., 2002). 31

32 Εικόνα 13: Δομή της πυριμιδο-[1,2-α] πουριν-10(3h)-δεοξυριβόζης (M 1 G), του κύριου προϊόντος της αλληλεπίδρασης της MDA με το DNA, η οποία βρίσκεται σε ισορροπία με την ανοιχτή μορφή Ν 2 -οξοπροπενυλ-γουανοσίνη. Η MDA αντιδρά μέσω των καρβονυλομάδων της με πρωτογενείς αμίνες. Τα τελικά προϊόντα αυτών των in vivo αντιδράσεων της MDA με πρωτογενείς αμίνες εμπλέκονται στην αθηρογένεση. Η τοξικότητα της MDA μπορεί να προκαλέσει δυσλειτουργία και του καρδιαγγειακού συστήματος. Επίσης, η MDA παρεμβάλλεται και στις διαμοριακές συνδέσεις μέσω κολλαγόνου, συμβάλλοντας στην ακαμψία του καρδιαγγειακού ιστού. Αυξημένα επίπεδα της MDA έχουν παρατηρηθεί σε ασθενείς με συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια, καθώς και σε άτομα με αθηροσκλήρωση (Polidori et al., 2002; Tamer et al., 2002). Μελέτες σχετικά με την αντίδραση της MDA με αμινοξέα καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι τα τελικά προϊόντα εξαρτώνται από το αμινοξύ. Τα αρωματικά αμινοξέα και η αργινίνη αντιδρούν με την α-αμινομάδα και σχηματίζουν μονοεναμινάλη, ενώ η κυστεΐνη σχηματίζει ένα προϊόν που περιέχει δύο μόρια κυστεΐνης και τρία μόρια MDA (Nair et al., 1981). Οι πρωτεΐνες αντιδρούν ευκολότερα με την MDA σε σχέση με τα ελεύθερα αμινοξέα. Αν και δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί οι λόγοι που συμβαίνει αυτό μάλλον οι πρωτεΐνες προσφέρουν ένα πιο ενεργό περιβάλλον (υπόστρωμα) για τη συμπύκνωση της MDA (Esterbauer et al., 1991). Η MDA συνήθως αντιδρά με την ε- αμινομάδα της λυσίνης των πρωτεϊνών και δημιουργεί ενδομοριακούς και διαμοριακούς συνδέσμους μεταξύ πρωτεϊνών. Επίσης, η MDA αντιδρά με κατάλοιπα 32

33 ιστιδίνης, τυροσίνης, αργινίνης και μεθειονίνης. Τέλος, έχει προταθεί ότι η MDA αντιδρά με διάφορα νουκλεοζίδια, όπως η δεοξυ-γουανοσίνη και η κυτιδίνη. Σχετικές έρευνες αποκαλύπτουν αυξημένα επίπεδα της MDA σε εγκύους στο στάδιο της προ-εκλαμψίας, μία ασθένεια η οποία θεωρείται πολύ πιθανό να σχετίζεται με τα αυξημένα επίπεδα οξειδωτικού στρες (Chirico et al., 1993; Orhan et al., 2001). Επιπλέον, αυξημένα επίπεδα της MDA έχουν παρατηρηθεί σε ασθενείς με νόσο του Alzheimer και σε ασθενείς με μη-ινσουλινοεξαρτώμενο διαβήτη, ασθένειες οι οποίες επίσης σχετίζονται με αυξημένα επίπεδα οξειδωτικού στρες (Delibas et al., 2002; Dierckx et al., 2003). Τέλος, μελέτες που πραγματοποιήθηκαν σε υγιή άτομα νεαρής ηλικίας (21-40 ετών) και ηλικιωμένα (61-85 ετών) απέδειξαν ότι τα επίπεδα της MDA στο πλάσμα ήταν υψηλότερα στα μεγαλύτερης ηλικίας άτομα, σε συνδυασμό με μειωμένη τιμή της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας (FRAP). Το παραπάνω γεγονός ενισχύει την άποψη για στενή σχέση της MDA με το οξειδωτικό στρες (Mutlu-Turkoglu et al., 2003). 4-υδροξυ-2-ενενάλη (HNE) Η 4-υδροξυ-2-ενενάλη σχηματίζεται από τη λιπιδική υπεροξείδωση των λιπαρών οξέων, όπως το αραχιδονικό και το λινολεϊκό οξύ (Van Kuijk et al., 1990). Σε χαμηλές συγκεντρώσεις εντοπίζεται σε υγιείς ιστούς, ενώ σε υψηλότερες συγκεντρώσεις εμπλέκεται στην παθογένεση πολλών ασθενειών όπως η νόσος του Alzheimer, ο καταρράκτης, η αθηροσκλήρωση και ο καρκίνος. Παρουσιάζει ποικίλη βιολογική δραστικότητα επηρεάζοντας την κυτταρική μετανάστευση και τη μεταγωγή σήματος, δρώντας σαν χημειοτακτικός παράγοντας και τροποποιώντας την έκφραση διαφόρων γονιδίων, όπως το c-fos πρωτοογκογονίδιο (Esterbauer et al., 1991). 33

34 Εικόνα 14: Δομή της 4-υδροξυ-2-ενενάλης (HNE). F 2 -ισοπροστάνια (isoprostanes) Τα F 2 -ισοπροστάνια σχηματίζονται in situ από τη λιπιδική υπεροξείδωση των φωσφολιπιδίων που περιέχουν αραχιδονικό οξύ. Αν και μέχρι πρόσφατα θεωρούνταν ότι τα F 2 -ισοπροστάνια σχηματίζονται μόνο μέσω ενός ανεξάρτητου από την κυκλοξυγενάση μηχανισμού, πρόσφατες μελέτες αποδεικνύουν ότι σχηματίζονται και μέσω ενός ενζυμικού μονοπατιού. Τα F 2 -ισοπροστάνια θεωρούνται, σύμφωνα με μελέτες, οι πιο αξιόπιστοι δείκτες για την in vivo μέτρηση του οξειδωτικού στρες στον άνθρωπο (Morrow & Roberts, 1999). Εικόνα 15: Δομή των F 2 -ισοπροστανίων. 34

35 I.2. Εισαγωγή στη λειτουργία του εγκεφάλου 2.1 Δομή και λειτουργία του εγκεφάλου Ο εγκέφαλος αποτελεί μαζί με το νωτιαίο μυελό το κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ). Ο εγκέφαλος του ενηλίκου αποτελείται από τον προμήκη μυελό, τη γέφυρα, την παραγκεφαλίδα, το μεσεγκέφαλο, το διεγκέφαλο (θάλαμο, υποθάλαμο), και τα κεντρικά ημισφαίρια (εγκεφαλικός φλοιός και πυρήνες). Εικόνα 16: Απεικόνιση του εγκεφάλου, όπου διακρίνονται οι περιοχές του φλοιού (cerebral cortex), της παρεγκεφαλίδας (cerebellum) και του μεσεγκεφάλου (midbrain). 2.2 Δομή και λειτουργία του εγκεφαλικού φλοιού, της παρεγκεφαλίδας και του μεσεγκεφάλου. Ο εγκεφαλικός φλοιός (cerebral cortex) αποτελεί το εξωτερικό τμήμα (στρώμα) των κεντρικών ημισφαιρίων. Αποτελείται από τη φαιά ουσία που τη συγκροτούν κυρίως τα σώματα των νευρικών κυττάρων, τα οποία διατάσσονται σε 6 διακριτές στιβάδες, ενώ εσωτερικά βρίσκεται η λευκή ουσία η οποία αποτελείται από τις νευρικές ίνες των κυττάρων του φλοιού που κατευθύνονται προς την περιφέρεια (κινητικές ή φυγόκεντρες), τις νευρικές ίνες που κατευθύνονται από την περιφέρεια προς τα 35

36 κύτταρα του φλοιού (αισθητικές ή κεντρομόλες) και αυτές που συνδέουν το αριστερό με το δεξιό ημισφαίριο. Η εξωτερική επιφάνεια των εγκεφαλικών ημισφαιρίων έχει πολλαπλές αυλακώσεις, τις αύλακες, καθώς και προεξοχές ανάμεσα στις αύλακες, τις έλικες. Με τον τρόπο αυτό αυξάνεται κατά πολύ η επιφάνεια των εγκεφαλικών ημισφαιρίων. Οι βαθύτερες αύλακες χωρίζουν κάθε ημισφαίριο σε τέσσερις λοβούς: το μετωπιαίο, το βρεγματικό, τον ινιακό και τον κροταφικό. Κάθε περιοχή του φλοιού είναι εξειδικευμένη για μία συγκεκριμένη λειτουργία και αποτελεί το κέντρο της λειτουργίας αυτής. Ο μετωπιαίος λοβός εμπλέκεται στο σχεδιασμό και την εκτέλεση των κινήσεων, ενώ ο προμετωπιαίος λοβός είναι σημαντικός για τις πνευματικές λειτουργίες και τον καθορισμό της προσωπικότητας του ατόμου. Στο βρεγματικό λοβό εντοπίζονται τα αισθητικά κέντρα των γενικών αισθήσεων (αφής, πίεσης, πόνου και θερμοκρασίας) και της γεύσης. Στον κροταφικό λοβό εντοπίζεται το κέντρο ακοής και στον ινιακό το κέντρο όρασης. Ο μεσεγκέφαλος (midbrain) βρίσκεται μεταξύ γέφυρας και παρεγκεφαλίδας και αποτελείται από την οροφή (tectum) και το κάλυμμα (tegmentum). Επίσης, περιέχει ένα κεντρικά τοποθετημένο κανάλι, το οποίο συνδέει την τρίτη και την τέταρτη κοιλία του εγκεφάλου. Η οροφή (tectum) σχηματίζει το ραχιαίο ή οπίσθιο τμήμα του μεσεγκεφάλου, το οποίο αποτελείται από έναν αριθμό δομών με κυριότερα τα άνω και κάτω διδύμια. Τα διδύμια εμφανίζονται σαν τέσσερα εξογκώματα στο εγκεφαλικό στέλεχος. Τα άνω διδύμια λαμβάνουν αισθητικές εισόδους από τους οθφαλμούς, μέσω του θαλάμου, και εμπλέκονται στον έλεγχο της κίνησης των οφθαλμών, ενώ τα κάτω διδύμια λαμβάνουν κυρίως αισθητικές εισόδους από το αυτί. Το κάλυμμα (tegmentum) του μεσεγκεφάλου βρίσκεται στο πρόσθιο τμήμα της οροφής και αποτελεί μία πολύπλοκη δομή, η οποία περιέχει πολλούς πυρήνες, ορισμένοι από τους οποίους εμπλέκονται στον έλεγχο των κινήσεων. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η μέλαινα ουσία, η οποία αποτελεί τμήμα του καλύμματος του μεσεγκεφάλου και συμπεριλαμβάνεται στο σύστημα των βασικών 36

37 γαγγλίων. Το ραβδωτό σώμα ανήκει στα βασικά γάγγλια και λαμβάνει μία σημαντική ντοπαμινεργική προβολή από τη μέλαινα ουσία (μελανοραβδωτή οδός). Εκφυλισμός αυτής της οδού έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση της νόσου του Parkinson. Το κάλυμμα περιέχει, επίσης, το τμήμα του δικτυωτού σχηματισμού, ο οποίος αποτελεί μία διάχυτη περιοχή, η οποία εκτείνεται μέχρι τον οπίσθιο εγκέφαλο. Ο δικτυωτός σχηματισμός λαμβάνει αισθητικές πληροφορίες από το σώμα και τις μεταβιβάζει στον εγκεφαλικό φλοιό κυρίως μέσω του θαλάμου. Παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του κύκλου ύπνου-αφύπνισης. Η παρεγκεφαλίδα (cerebellum) είναι μία αρκετά διευρυμένη περιοχή, η οποία βρίσκεται πίσω και κάτω από τον υπόλοιπο εγκέφαλο. Αποτελείται από το σκώληκα στο κέντρο και από τα δύο ημισφαίρια. Όπως στα ημισφαίρια του εγκεφάλου, έτσι και στην παρεγκεφαλίδα, περιφερικά βρίσκεται η φαιά ουσία (φλοιός της παρεγκεφαλίδας), η οποία αποτελείται από τρεις στιβάδες κυττάρων και εδώ σχηματίζει έλικες, ενώ εσωτερικά βρίσκεται η λευκή ουσία και πυρήνες. Η παρεγκεφαλίδα λαμβάνει προβολές από τους οφθαλμούς, το αυτί και από τους σωματαισθητικούς υποδοχείς του σώματος. Οι πληροφορίες στη συνέχεια μεταβιβάζονται σε άλλες περιοχές, οι οποίες εμπλέκονται στον έλεγχο των κινήσεων, και κυρίως στον εγκεφαλικό φλοιό. Επίσης, η παρεγκεφαλίδα λαμβάνει πληροφορίες από τον κινητικό φλοιό. Οι λειτουργίες της παρεγκεφαλίδας οι οποίες δεν είναι συνειδητές και δεν υπάγονται στη θέληση μας είναι: α) η διατήρηση του μυϊκού τόνου, β) ο συντονισμός της συνεργασίας των μυών στις διάφορες κινήσεις και γ) η διατήρηση της ισορροπίας του σώματος. Σε περιπτώσεις βλάβης της παρεγκεφαλίδας εμφανίζεται μυϊκή αδυναμία, μη συντονισμός των μυών για την εκτέλεση των διαφόρων κινήσεων, τρόμος και τάση του ατόμου να πέφτει προς τη μία πλευρά κατά τη στάση ή το βάδισμα (παρεγκεφαλιδική αταξία). 37

38 2.3 Οξειδωτικό στρες και γήρανση του εγκεφάλου Το νευρικό σύστημα είναι ευπρόσβλητο από την τοξική δράση των ελευθέρων ριζών. Ο εγκέφαλος περιέχει μεγάλες ποσότητες πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (PUFAs) τα οποία είναι ευαίσθητα σε υπεροξείδωση, συγκριτικά με άλλους ιστούς χρησιμοποιεί την μεγαλύτερη ποσότητα οξυγόνου για την παραγωγή ενέργειας (υψηλός μεταβολικός ρυθμός) και υστερεί σε αντιοξειδωτικά συστήματα με τις χαμηλής δραστικότητας υπεροξειδάση του γλουταθείου και καταλάση σε σχέση με άλλους ιστούς. Κατά τη διαδικασία της φυσιολογικής γήρανσης, ο εγκέφαλος υπόκειται τόσο σε μορφολογικές όσο και λειτουργικές μεταβολές, οι οποίες επηρεάζουν τα δενδριτικά δίκτυα, τις συνάψεις, την νευροδιαβίβαση, την ανακύκλωση και τον μεταβολισμό μορίων. Οι μεταβολές αυτές αντικατοπτρίζονται σε αλλαγές στην κίνηση, στη σωματαίσθηση, στον ύπνο, στη μνήμη και τη μάθηση. Ανάμεσα στις αλλαγές που λαμβάνουν χώρα κατά τη διαδικασία της γήρανσης περιλαμβάνεται και η ελάττωση στην ευαισθησία του κατεχολαμινεργικού, ντοπαμινεργικού, χολινεργικού και του ενδογενούς συστήματος αναλγησίας. Οι μοριακοί μηχανισμοί οι οποίοι εμπλέκονται σε αυτές τις αλλαγές δεν έχουν ακόμη διευκρινιστεί πλήρως. Ωστόσο, μία θεωρία η οποία κερδίζει συνεχώς έδαφος είναι αυτή η οποία αναφέρεται στην αυξημένη ευαισθησία στις μακροχρόνιες επιπτώσεις του οξειδωτικού στρες, στην μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και στην ύπαρξη φλεγμονών ως τους κύριους παράγοντες που συμβάλλουν στην διαδικασία της γήρανσης. Όντως, η προοδευτική έκπτωση των εγκεφαλικών λειτουργιών, η οποία σχετίζεται με το οξειδωτικό στρες, οφείλεται στην προοδευτικά αυξανόμενη ευαισθησία του εγκεφάλου στις τοξικές επιδράσεις του οξειδωτικού στρες και επιπλέον στη φθορά των φυσιολογικών αντιοξειδωτικών μηχανισμών του εγκεφάλου με την πάροδο των ετών. Η 8-υδροξυ-2 -δεοξυγουανοσίνη (8-OHdG) (Εικόνα 17) είναι ένα νουκλεοτίδιο γουανιδίνης, το οποίο έχει αποκοπεί από την αλυσίδα του DNA με ενδονουκλεάσες, και αποτελεί τον πιο κοινό βιολογικό δείκτη για την μελέτη των μεταβολών του DNA οι οποίες οφείλονται στο οξειδωτικό στρες (Mariani et al., 2005). 38

39 Εικόνα 17: Σχηματισμός της 8-υδρόξυ-δεοξυγουανοσίνης (8-OHdG) από την 2- δεοξυγουανοσίνη (2-dG). ( Η υπεροξείδωση λιπιδίων αποτελεί ένα κύριο χαρακτηριστικό του οξειδωτικού στρες και μπορεί να μετρηθεί με διάφορες μεθόδους, οι οποίες περιλαμβάνουν την ποσοτικοποίηση είτε των πρωτογενών (υδροϋπεροξειδίων), είτε των δευτερογενών (TBARS, ουσίες που αντιδρούν με το θειοβαρβιτουρικό οξύ και F 2 -ισοπροστάνια) προϊόντων της υπεροξείδωσης. Ανάμεσα σε αυτούς τους βιολογικούς δείκτες τα F 2 -ισοπροστάνια θεωρούνται, σύμφωνα με μελέτες, οι πιο αξιόπιστοι δείκτες για την in vivo μέτρηση του οξειδωτικού στρες στον άνθρωπο (Morrow & Roberts, 1999). Εντούτοις, αν και δεν έχει διευκρινιστεί αν ο σχηματισμός των F 2 -ισοπροστανίων αυξάνεται στον ανθρώπινο εγκέφαλο με την αύξηση της ηλικίας, η μηλονική διαλδεΰδη (MDA) και η 4-υδροξυ-2-ενενάλη (HNE), δύο αλδεΰδες δείκτες της υπεροξείδωσης λιπιδίων, έχει αποδειχθεί ότι αυξάνονται κατά την γήρανση στο κυτταρόπλασμα των νευρώνων και των αστροκυττάρων και στους οφθαλμοκινητικούς νευρώνες (Dei et al., 2002; Yoritaka et al., 1996). Πολλές μελέτες καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι παρατηρείται μία αύξηση των οξειδωμένων πρωτεϊνών κατά τη γήρανση του εγκεφάλου. Ειδικότερα έχει δειχθεί δείχνει μία λογαριθμική αύξηση της οξείδωσης των πρωτεϊνών, με μέτρηση των καρβονυλικών ομάδων των πρωτεϊνών στον ανθρώπινο εγκεφαλικό φλοιό, με την 39