Κωνσταντίνος Σφλώμος Καθηγητής Τ.Ε.Ι. Αθήνας. Εργαστηριακές Ασκήσεις ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ

Transcript

1 Κωνσταντίνος Σφλώμος Καθηγητής Τ.Ε.Ι. Αθήνας Εργαστηριακές Ασκήσεις ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Αθήνα

2 Το εξώφυλλο φιλοτεχνήθηκε στο Εργαστήριο Διαφημιστικής Φωτογραφίας του ΤΕΙ Αθήνας με την ευχάριστη συνεργασία του κ. Γιώργου Βρεττάκου Νοέμβριος 2009 ISBN:

3 3

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Οι Ασκήσεις που περιλαμβάνονται στο βιβλίο του Εργαστηρίου της Χημείας Τροφίμων, διεξάγονται κατά το Γ εξάμηνο σπουδών στο Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων (ΤΤΤ) του Τεχνολογικού Εκπαιδευτικού Ιδρύματος της Αθήνας (ΤΕΙ-Α). Επιλέχθηκαν με βάση: Το περίγραμμα του μαθήματος της Χημείας Τροφίμων, όπως περιλαμβάνεται στο νέο Πρόγραμμα Σπουδών του ΤΤΤ. Τις εκπαιδευτικές ανάγκες των μελλοντικών πτυχιούχων του Τμήματος. Τις δυνατότητες και την υποδομή/εξοπλισμό του Εργαστηρίου Χημείας Τροφίμων του ΤΤΤ/ΤΕΙ-Α. Την κοινή πρακτική και αντίληψη περί ειδικής κατάρτισης εξάσκησης των φοιτητών Τεχνολογίας Τροφίμων σε θέματα που αφορούν τις βασικές κατηγορίες των χημικών ουσιών που απασχολούν και εξετάζονται κατά κανόνα σε ένα Εργαστήριο Τροφίμων. Με τις Ασκήσεις και τα αντίστοιχα Πειράματα καταβάλλεται κάθε δυνατή προσπάθεια εξοικείωσης των φοιτητών, τόσο στις κλασικές χημικές μεθόδους όσο και σε ορισμένες σύγχρονες τεχνικές και θέματα, που σχετίζονται με τη Χημεία των Τροφίμων και τη διατροφή του ανθρώπου. Τα πειράματα κατηγοριοποιούνται σε επτά Ενότητες. Στην Ενότητα Α αναφέρονται οι βασικές αρχές και οι κανόνες που διέπουν τη λειτουργία ενός Εργαστηρίου Χημείας Τροφίμων. Οι επόμενες τέσσερις Ενότητες περιλαμβάνουν πειράματα τα οποία αναφέρονται στις κυριότερες τάξεις των οργανικών ουσιών, που βρίσκονται στα τρόφιμα, δηλαδή : τους Υδατάνθρακες, τις Πρωτεΐνες, τα Λιπίδια και τις Βιταμίνες. Οι δύο τελευταίες Ενότητες 4

5 αναφέρονται στην εξέταση ορισμένων συστατικών της τροφικής μας αλυσίδας τα οποία είτε χαρακτηρίζονται ανεπιθύμητα και μπορεί να υποβαθμίζουν την ποιότητα των τροφίμων είτε αναφέρονται σε γενικά πειράματα/τεστ, όπου η συμμετοχή του Τεχνολόγου Τροφίμων θεωρείται απαραίτητη. Η κάθε Ενότητα ολοκληρώνεται με την παρουσίαση μερικών συνοπτικών διαγραμμάτων ( Η Ενότητα με μια ματιά ). Αυτά στοχεύουν αφενός στη γρήγορη επανάληψη των κυριότερων σημείων/θεμάτων της Ενότητας και αφετέρου στην υποστήριξη της ηλεκτρονικής παρουσίασης από τους διδάσκοντες. Η παρεμβολή μερικών ανεκδότων έγινε προκειμένου να μη παραμείνουν κενά στις σελίδες μεταξύ διαδοχικών Ασκήσεων και σε μια προσπάθεια να προστεθεί λίγο χιούμορ στην εκπαιδευτική διαδικασία. Τα ανέκδοτα αυτά επικολλήθηκαν όπως ακριβώς κυκλοφορούν στο Διαδίκτυο, χωρίς καμία επεξεργασία. Ευχαριστώ τους άγνωστους (σε εμένα) δημιουργούς τους αλλά και όσους γνωστούς και φίλους ιδιαιτέρως δε την Άννα, την Αρχοντούλα και τη Μίνα φροντίζουν για την ενημέρωση της χιουμοριστικής μου βιβλιογραφίας. Ελπίζω τις παραμονές των εξετάσεων η μελέτη των αγαπητών μας φοιτητών να μην επικεντρωθεί σε αυτά. Θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους όσους συνέβαλαν διαχρονικά και διατμηματικά (διιδρυματικά) στη προσπάθεια της συγγραφής και της έκδοσης του βιβλίου αυτού. Από το Εργαστήριο Χημείας Τροφίμων του ΤΤΤ/ΤΕΙ-Α, τη Δρ. Δήμητρα Χούχουλα, που έχει και την ευθύνη λειτουργίας του αντίστοιχου Εργαστηρίου, για την ανάγνωση των κειμένων και τις αξιόλογες παρατηρήσεις. Την κα Ελένη Κορώνη για την επίλυση ζητημάτων που αντιμετωπίστηκαν κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων. Τον κ. Γεώργιο Χατζηανδρέου, τελειόφοιτο του ΤΤΤ/ΤΕΙ-Α ο 5

6 οποίος στο πλαίσιο της πρακτικής του άσκησης βοήθησε στη μορφοποίηση των ασκήσεων και τη μετατροπή τους σε εκπαιδευτικό βοήθημα. Από το ΤΤΤ του ΤΕΙ Λάρισας (παράρτημα Καρδίτσας), τη Δρ. Όλγα Γκορτζή, τον Δρ. Σταύρο Λαλά και τον τελειόφοιτο του ιδίου Τμήματος κ. Βασίλη Αθανασιάδη για την επεξεργασία των κειμένων της αρχικής μορφής των Σημειώσεων του Εργαστηρίου και για τις αξιόλογες βελτιωτικές υποδείξεις. Σημαντική ήταν, τέλος, η συνεισφορά και οι προτάσεις της Δρ. Ανθιμίας Μπατρίνου και της Δρ. Ειρήνης Στρατή (επιστημονικοί συνεργάτες του ΤΤΤ/ΤΕΙ-Α) στα βιοτεχνολογικά αντικείμενα και στην ενότητα των Βιταμινών αντίστοιχα. Η παρούσα (αυτό)έκδοση δε θα ήταν εφικτή εάν δεν υπήρχαν οι ειδικές συμβουλές του αγαπητού κ. Κώστα Ωνάση, η ευχάριστη συνεργασία με τις κ ες Φωτεινή Ντάβρη και Λία.. των εκδόσεων λύχνος και η πολυπαραγοντική συμμετοχή της κ ας Μαρίας Γκούμα, πτυχιούχου MSc του ΤΤΤ/ΤΕΙ-Α. Όλους τους παραπάνω, θερμά ευχαριστώ. Η φύση της ύλης του Βιβλίου και η «χημική προσέγγιση» των Ασκήσεων καθιστά τα λάθη αναπόφευκτα. Κατά συνέπειαν, οι σχετικές υποδείξεις θα γίνουν δεκτές με ευγνωμοσύνη. Αθήνα, Οκτώβριος 2009 Κωνσταντίνος Σφλώμος Καθηγητής ΤΤΤ/ΤΕΙ-Α 6

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Ενότητα Α: ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΚΑΙ ΠΡΑΚΤΙΚΕΣ ΓΙΑ ΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ... 4 Α 1 : Φύση και περιεχόμενο εργαστηριακών ασκήσεων... 4 Α 2 : Ορθή εργαστηριακή πρακτική και ασφάλεια... 6 Α 3 : Τετράδιο Εργαστηρίου... 9 Ενότητα Β: ΥΔΑΤΑΝΘΡΑΚΕΣ Πείραμα Β 1 : Αναγωγικές ιδιότητες σακχάρων Πείραμα Β 2 : Χημική υδρόλυση σακχάρων Πείραμα Β 3 : Προσδιορισμός ακατέργαστων ινών Πείραμα Β 4 : Μη ενζυμική αμαύρωση Ι: Καραμελοποίηση Ενότητα Γ: ΑΜΙΝΟΞΕΑ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Πείραμα Γ 1 : Ανίχνευση (ποιοτική ανάλυση) πρωτεϊνών Πείραμα Γ 2 : Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών με ογκομέτρηση Πείραμα Γ 3 : Μη ενζυμική αμαύρωση ΙΙ: Αντίδραση Maillard Πείραμα Γ 4 : Ζελατινοποίηση και υδρόλυση πρωτεϊνών Ενότητα Δ: ΛΙΠΙΔΙΑ Πείραμα Δ 1 : Γαλακτώματα Πείραμα Δ 2 : Προσδιορισμός λιπιδίων Πείραμα Δ 3 : Σαπωνοποίηση λιπών και ελαίων Πείραμα Δ 4 : Ενζυμική υδρόλυση λιπιδίων Ενότητα Ε: ΒΙΤΑΜΙΝΕΣ Πείραμα E 1 : Επίδραση θερμικής επεξεργασίας στο ασκορβικό οξύ φυλλωδών λαχανικών Ενότητα ΣΤ: ΑΝΕΠΙΘΥΜΗΤΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Πείραμα ΣΤ 1 : Οξειδωτικό τάγγισμα

8 Πείραμα ΣΤ 2 : Ενζυμική αμαύρωση τροφίμων Πείραμα ΣΤ 3 : Προσδιορισμός αλλεργιογόνων ουσιών με τη μέθοδο ELISA Πείραμα ΣΤ 4 : Χρωματομετρικές μέθοδοι προσδιορισμού ανεπιθύμητων ιόντων στο πόσιμο νερό Ενότητα Ζ: ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ Πείραμα Ζ 1 : Ταχύς προσδιορισμός σκληρότητας και υπολειμμάτων απολύμανσης νερού Πείραμα Ζ 2 : Θερμιδικό περιεχόμενο τροφών Πείραμα Ζ 3 :Μετρήσεις επιπέδων αλκοόλης στον ανθρώπινο οργανισμόαλκοολόμετρο Βιβλιογραφία αναφοράς και προτάσεις για περαιτέρω μελέτη

9 Ενότητα A ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΚΑΙ ΠΡΑΚΤΙΚΕΣ ΓΙΑ T ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Α.1 ΦΥΣΗ ΚΑΙ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΩΝ ΑΣΚΗΣΕΩΝ Οι βασικές κατηγορίες χημικών ουσιών που απασχολούν κατά κανόνα τη Χημεία Τροφίμων περιλαμβάνουν: Τους υδατάνθρακες (σάκχαρα) Τα αμινοξέα και τις πρωτεΐνες Τα λιπίδια Τα πρόσθετα (χρωστικές, συντηρητικά, αρωματικές ύλες) Τις βιταμίνες και τα ανόργανα άλατα Το νερό Ανεπιθύμητες ουσίες (τοξίνες, υπολείμματα διαφόρων χειρισμών, επεξεργασιών κτλ). Αντιπροσωπευτικές ουσίες και τρόφιμα από τις παραπάνω κατηγορίες περιγράφονται σε ανάλογες ενότητες του Βιβλίου του. Σε ξεχωριστή ενότητα περιλαμβάνονται επίσης, γενικές πειραματικές ασκήσεις που αφορούν: Ταχείες μεθόδους προσδιορισμού της ποιοτικής κατάστασης τροφίμων (ειδικότερα του νερού) σχετικά με τα υπολείμματα γεωργικών χειρισμών (φυτοφαρμάκων κτλ.). Το ενεργειακό περιεχόμενο των τροφίμων. Τον έλεγχο των επιπέδων αλκοόλης στον εκπνεόμενο αέρα, μετά την 9

10 κατανάλωση αλκοολούχων ποτών. Δεδομένου ότι οι ακολουθούμενες εργαστηριακές μέθοδοι και πρακτικές που προτείνονται για την παιδαγωγική και υποδειγματική μελέτη των παραπάνω χημικών ενώσεων αγγίζουν συχνά, τα όρια της Χημικής Ανάλυσης ή της Οργανικής Χημείας και Βιοχημείας, ακόμα και της Βιοτεχνολογίας, κατεβλήθη προσπάθεια να αποφευχθούν ανάλογες επικαλύψεις με τα αντίστοιχα ή άλλα Εργαστήρια (Τεχνολογικών μαθημάτων) του Τμήματος. Ωστόσο, θα πρέπει να διασαφηνιστεί ότι στο εργαστήριο Χημείας Τροφίμων, η φύση των Ασκήσεων έχει χαρακτήρα άλλοτε "αναλυτικό" (ανίχνευση/προσδιορισμός συνθηκών και προϊόντων επεξεργασίας τροφίμων) και άλλοτε "μελέτης της πορείας των αντιδράσεων". Στο δεύτερο αυτό χαρακτήρα, δηλαδή της μελέτης των αντιδράσεων των συστατικών και των λειτουργικών ιδιοτήτων των τροφίμων, αποδίδεται ιδιαίτερη σημασία και κατά συνέπεια- αντιστοιχούν περισσότερες Ασκήσεις. Στο πρώτο εργαστήριο, γίνεται μια σύντομη περιγραφή (επανάληψη) των παραπάνω κατηγοριών των χημικών ουσιών των τροφίμων, που θα εξεταστούν κατά τη διάρκεια του αντιστοίχου εξαμήνου σπουδών. Ανάλογη αναφορά γίνεται και για τη χρήση των εργαστηριακών σκευών (προχοΐδες, ογκομετρικοί κύλινδροι, φιάλες, θερμαντικοί μανδύες, αναδευτήρες, λύχνοι κτλ) και βασικών οργάνων (ζυγός, πυριαντήριο, πεχάμετρο κτλ), που χρησιμοποιούνται ως γνωστόν σε κάθε χημικό εργαστήριο, άρα και αυτό των τροφίμων. Αναφέρονται, ακόμα, οι βασικοί κανόνες ασφάλειας οι οποίοι θα πρέπει να ακολουθούνται απ όλους όσους ασκούνται και εργάζονται σ ένα Εργαστήριο Χημείας Τροφίμων. Τέλος, περιγράφεται ο τρόπος παρουσίασης του Τετραδίου Εργαστηρίου, το οποίο οφείλουν να παραδίδουν οι φοιτητές που παρακολουθούν το Εργαστήριο, μετά από κάθε Άσκηση. 10

11 Α.2 ΟΡΘΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΚΑΙ ΑΣΦΑΛΕΙΑ Τόσον ο χώρος των τροφίμων όσον και των χημικών αναλύσεων και αντιδράσεων είναι στενά συνδεδεμένοι με την υγιεινή και την καθαριότητα. Η καθαριότητα δεν αφορά μόνο το ανθρώπινο δυναμικό, αλλά και όλο τον εργαστηριακό εξοπλισμό (σκεύη όργανα), συμπεριλαμβανομένου και του πάγκου εργασίας. Τα διάφορα υάλινα σκεύη, όπως οι προχοΐδες, οι ογκομετρικές φιάλες, οι ογκομετρικοί κύλινδροι, οι κωνικές και σφαιρικές φιάλες, τα ποτήρια ζέσεως, τα σιφώνια κτλ, πρέπει να καθαρίζονται αμέσως μετά το τέλος κάθε άσκησης ή πριν από την επόμενη χρησιμοποίηση τους σε διαφορετικό χημικό περιβάλλον, με απεσταγμένο νερό, απορρυπαντικό ή σε εξαιρετικές περιπτώσεις χρωμοθειικό οξύ. Για τα περισσότερα πειράματα του συγκεκριμένου εργαστηρίου, το ξέπλυμα με κοινό νερό (βρύσης) είναι αρκετό. Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων ο φοιτητής πρέπει να επιδεικνύει προσοχή και συγκέντρωση στην εργασία, προς αποφυγήν σφαλμάτων. Τα τελευταία, πολλές φορές εγκυμονούν κινδύνους, όχι μόνο για τον ίδιο, αλλά και για τους συμφοιτητές του. Ιδιαίτερη προσοχή επιβάλλεται κατά τη χρήση εύφλεκτων διαλυτών, επικίνδυνων ουσιών (να διαβάζονται οι αντίστοιχες επισημάνσεις στις ετικέτες των φιαλών / δοχείων) και διαβρωτικών υγρών (ισχυρά οξέα και βάσεις), καθώς επίσης και κατά την εργασία με γυμνή φλόγα (λύχνος) ή άλλα θερμαντικά στοιχεία (θερμαντική πλάκα, φούρνος κτλ). Οι βασικές εργασίες (μετάγγιση, αντίδραση κτλ) με εύφλεκτες, διαβρωτικές και γενικά επικίνδυνες ουσίες, γίνονται κατά κανόνα στον απαγωγό. Για την προστασία των ασκουμένων και όλων των εργαζομένων επιβάλλεται η χρήση εργαστηριακού επενδύτη (ποδιάς). Στις περιπτώσεις μάλιστα εργασίας με διαβρωτικές και γενικά επικίνδυνες ουσίες, καθώς επίσης και όταν 11

12 ανυψώνονται οι θερμοκρασίες (λύχνοι, θερμαντικά στοιχεία κτλ), θα πρέπει να γίνεται χρήση προστατευτικών γυαλιών. Εάν ωστόσο συμβεί κάποιο ατύχημα (όπως η επίσταξη διαβρωτικής ουσίας στο δέρμα, το πρόσωπο ή ακόμα και στο στόμα, π.χ. κατά την αναρρόφηση υγρών με σιφώνιο), αυτό θα πρέπει να αναφέρεται αμέσως στον Υπεύθυνο του Εργαστηρίου και να λαμβάνονται τα κατάλληλα μέτρα για την άμεση αντιμετώπιση του ατυχήματος. Στις συχνά παρατηρούμενες περιπτώσεις επίσταξης διαβρωτικών ουσιών επιβάλλεται η άμεση απομάκρυνση τους με έκπλυση με άφθονο νερό. Εφόσον πρόκειται για ισχυρά οξέα (όπως θειικό, νιτρικό, υδροχλωρικό κτλ), μετά την έκπλυσή του με νερό, ακολουθεί εξουδετέρωση του οξέος με διάλυμα Na 3. Ισχυρά αλκαλικά αντιδραστήρια (υδροξείδιο του νατρίου, υδροξείδιο του αμμωνίου κτλ), εξουδετερώνονται με διάλυμα 3. Σημειώνεται ότι για την πλήρωση των σιφωνίων με επικίνδυνα υγρά πρέπει να χρησιμοποιείται η ειδική φούσκα (άπιον ή πουάρ) και ποτέ αναρρόφηση με το στόμα. Είναι δε προφανές ότι δεν επιτρέπονται φαγητά, ποτά και κάπνισμα εντός του Εργαστηρίου. Μετά το τέλος της κάθε άσκησης ο/η κάθε ασκούμενος/η πρέπει να πλένει πολύ καλά τα χέρια του/της. Προκειμένου να αποφεύγεται η επιμόλυνση των αντιδραστηρίων, τα διάφορα σκεύη δειγματοληψίας (σιφώνια, σπάτουλες κτλ) δεν πρέπει να εισάγονται εντός των δοχείων / φιαλών των αντιδραστηρίων. Οι αναγκαίες ποσότητες για την κάθε αντίδραση λαμβάνονται ανάλογα, είτε με μετάγγιση σε ποτήρια ζέσεως (για περιπτώσεις υγρών), είτε με μεταφορά σε κάψες ή φύλλα λείου χαρτιού. Το περίσσευμα των αντιδραστηρίων δεν επιστρέφεται στα δοχεία / φιάλες αποθήκευσης. Για την απόρριψη επικινδύνων ουσιών (υγρών στερεών), χρησιμοποιούνται τα ειδικά δοχεία συλλογής ανακυκλούμενων και 12

13 τοξικών υπολειμμάτων/διαλυτών, που βρίσκονται στον απαγωγό του Εργαστηρίου. Σημαντικός θεωρείται ο προγραμματισμός των πειραμάτων, πριν από την αρχή της κάθε άσκησης, καθώς και η λεπτομερής καταγραφή των συνθηκών πειράματος και των παρατηρούμενων φαινομένων / μεταβολών / αποτελεσμάτων στο τετράδιο εργαστηρίου, σύμφωνα με το Υπόδειγμα που ακολουθεί. Οι ασκούμενοι οφείλουν, τέλος, να γνωρίζουν τις βασικές αρχές της θεωρίας, επί της οποίας στηρίζεται το κάθε πείραμα και να συνεργάζονται εποικοδομητικά με τους συμφοιτητές τους. Το προσωπικό του Εργαστηρίου είναι στη διάθεση τους για κάθε σχετική διευκρίνιση ή υπόδειξη. Α.3 ΤΕΤΡΑΔΙΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ Οι ασκήσεις παρουσιάζονται για έλεγχο και βαθμολογία στο Τετράδιο Εργαστηρίου. Τα αποτελέσματα, που λαμβάνονται κατά τη διάρκεια των πειραμάτων, καταγράφονται αρχικά σε ειδική σελίδα στο τέλος του Τετραδίου. Στη συνέχεια, όταν αναπτύσσεται η άσκηση, σύμφωνα με το υπόδειγμα που ακολουθεί αυτά μεταφέρονται στο αντίστοιχο τμήμα (Αποτελέσματα). Ανάλογες σημειώσεις κρατούνται και για όσα κρίνεται σκόπιμο να παρουσιαστούν στο τμήμα των σχολίων (πιθανόν αποκλίσεις από αναμενόμενα φαινόμενα, προβλήματα που αντιμετωπίζονται κτλ). Τα αποτελέσματα των πειραμάτων δε σημειώνονται σε πρόχειρο φύλλο χαρτιού, γιατί εύκολα μπορούν να χαθούν. Εάν κατά την παρουσίαση των ασκήσεων στο Τετράδιο Εργαστηρίου γίνουν λάθη, διαγράφεται το αντίστοιχο τμήμα, λέξη, αριθμός κτλ. Ο υπεύθυνος του Εργαστηρίου, ελέγχει τα τετράδια μετά από κάθε Εργαστήριο και προτείνει τις σχετικές διορθώσεις / βελτιώσεις, βαθμολογώντας συγχρόνως και την 13

14 αντίστοιχη άσκηση. Η παρουσίαση των ασκήσεων ακολουθεί, κατά κανόνα, το παρακάτω υπόδειγμα: Τίτλος άσκησης, ημερομηνία. Σκοπός. Αναφέρεται περιληπτικά ο σκοπός (στόχος) για τον οποίο γίνεται το πείραμα. Πορεία εργασίας. Παρουσιάζονται συνοπτικά τα βήματα εργασίας χωρίς όμως να αντιγράφεται το φυλλάδιο του Εργαστηρίου. Προτείνεται να γίνεται χρήση ανάλογου διαγράμματος ροής (flow chart). Γράφονται οι αντιδράσεις στις οποίες στηρίζεται το κάθε πείραμα (όπου αυτό ισχύει) και σημειώνονται πιθανές αλλαγές στην προτεινόμενη από το φυλλάδιο μεθοδολογία της άσκησης. Τονίζονται οι "ειδικές" συνθήκες που ενδέχεται να συνοδεύουν τη συγκεκριμένη άσκηση, όπως π.χ. εργασία με επικίνδυνες ουσίες. Αποτελέσματα. Τα πειραματικά δεδομένα και αποτελέσματα παρουσιάζοντα κατά κανόνα υπό μορφή πινάκων ή / και γραφικών παραστάσεων. Προτείνεται προετοιμασία των αντιστοίχων πινάκων (π.χ. στο πρόχειρο τμήμα του Τετραδίου Εργαστηρίου) πριν από κάθε εργαστήριο προφανώς, για λόγους εξοικονόμησης χρόνου και περιορισμού λαθών. Δίνονται όπου χρειάζεται αντίστοιχες επεξηγήσεις για τους πίνακες ή γραφικές παραστάσεις (π.χ. αρίθμηση, τίτλοι, μονάδες μέτρησης κτλ). Για την παρουσία των αριθμητικών αποτελεσμάτων, ακολουθούνται όσα κατά κανόνα ισχύουν για την επεξεργασία πειραματικών δεδομένων, όπως π.χ. μέσος όρος, τυπική απόκλιση κτλ. Σχόλια. Ουσιαστικά παρουσιάζονται με περιληπτική έκφραση τα 14

15 πειραματικά αποτελέσματα, ενώ δηλώνεται / επεξηγείται η ταύτισή τους με τα αναμενόμενα από τη θεωρία, υπό τύπον συμπεράσματος. Αναφέρονται τέλος πιθανά προβλήματα και ο τρόπος αντιμετώπισής τους στο εργαστήριο. Δίνονται οι αντίστοιχες ερμηνείες, και όπου είναι δυνατόν οι σχετικές βιβλιογραφικές πηγές. Για παράδειγμα, έστω ότι παρατηρείται απόκλιση από την αναμενόμενη διαπερατότητα από τους υδρατμούς κάποιας μεμβράνης συσκευασίας τροφίμου. Δίνεται η εξήγηση (π.χ. μπορεί να οφείλεται στην επίδραση ορισμένων λιπαρών οξέων που υπάρχουν στο τρόφιμο) και η σχετική βιβλιογραφική αναφορά (π.χ. Park et al., Fatty acid concentration effect on tensile strength, elongation, and water vapor permeability of laminated edible films. J. Food Sci. 59:916). Σημειώνεται τέλος ότι οι σελίδες του Τετραδίου Εργαστηρίου αριθμούνται διαδοχικά και δημιουργείται στην αρχή του τετραδίου ο Πίνακας Περιεχομένων Ασκήσεων, που διεξάγονται στο Εργαστήριο της Χημείας Τροφίμων. 15

16 Ενότητα Β ΥΔΑΤΑΝΘΡΑΚΕΣ Οι υδατάνθρακες αποτελούν, όπως οι πρωτεΐνες και τα λιπίδια, μια από τις βασικές κατηγορίες των συστατικών της τροφής. Χωρίζονται σε τρεις κύριες ομάδες: τους μονοσακχαρίτες, τους ολιγοσακχαρίτες, και τους πολυσακχαρίτες. Οι μονοσακχαρίτες είναι απλά σάκχαρα που δεν μπορούν να υδρολυθούν περαιτέρω σε απλούστερες ενώσεις, ενώ οι ολιγοσακχαρίτες δίνουν κατά την υδρόλυση τους, δύο έως δέκα μονοσακχαρίτες. Οι αναγωγικές ιδιότητες των σακχάρων εξαρτώνται από την παρουσία σ αυτά ελεύθερης καρβονυλικής ομάδας. Τα ανάγοντα σάκχαρα συμμετέχουν εξάλλου στις αντιδράσεις Maillard. Οι πολυσακχαρίτες, κατά την υδρόλυση τους, αποδίδουν πολλά απλούστερα σάκχαρα. Το άμυλο είναι ένας πολυσακχαρίτης ο οποίος παρουσιάζει σημαντικό ενδιαφέρον για τη Χημεία Τροφίμων, και όχι μόνον. Η ιδιότητα του αμύλου να δεσμεύει μεγάλες ποσότητες μορίων ύδατος, το καθιστά πολύ χρήσιμο πολυσακχαρίτη (πηκτωματοποιητής). Τα άμυλα που χρησιμοποιούνται στο εμπόριο προέρχονται κυρίως από δημητριακά, βολβούς, καρπούς δέντρων κτλ. Κάθε άμυλο, ανάλογα με την προέλευση του, παρουσιάζει και τα δικά του χαρακτηριστικά. Από χημική άποψη οι αμυλόκοκκοι αποτελούνται από δύο επιμέρους ουσίες-πολυμερή της γλυκόζης: 16

17 Α) την αμυλόζη, που βρίσκεται σε ποσοστό ~ 20% στο κέντρο των αμυλόκοκκων και είναι γραμμικό πολυμερές μονάδων D-γλυκόζης (ανάλογα με το είδος του αμύλου) συνδεδεμένων με α (1 4) γλυκοζιτικούς δεσμούς, σε γραμμική διάταξη: Μη ανάγον άκρο...- Ανάγον άκρο α (1 4) γλυκοζιτικοί δεσμοί αμυλόζης. Β) την αμυλοπηκτίνη, που βρίσκεται σε ποσοστό ~ 80% στο εξωτερικό τμήμα των αμυλόκοκκων. Η αμυλοπηκτίνη αποτελείται και αυτή από περίπου μονάδες D-γλυκόζης (ανάλογα με το είδος του αμύλου) οι οποίες εκτός από τη γραμμική τους σύνδεση με α (1 4) γλυκοζιτικούς δεσμούς, δημιουργούν και πλευρικές αλυσίδες (διακλαδώσεις) μονάδων γλυκόζης, που συνδέονται με τον κύριο κορμό του μορίου με α (1 6) γλυκοζιτικούς δεσμούς. Το ποσοστό των μονάδων γλυκόζης που είναι συνδεδεμένες με α (1 6) δεσμούς είναι περίπου 5%. 17

18 α (1 6) διακλαδώσεις αμυλοπηκτίνης. Εκτός του αμύλου, άλλοι πολυσακχαρίτες που παρουσιάζουν χαρακτηριστικό ενδιαφέρον για τη Χημεία και την Τεχνολογία Τροφίμων, αλλά και τη Διατροφή του ανθρώπου, είναι: Οι δεξτρίνες, προϊόντα μερικής υδρόλυσης του αμύλου Το γλυκογόνο, πολυσακχαρίτης ζωικής προέλευσης, ανάλογος της αμυλοπηκτίνης, με πυκνότερες όμως διακλαδώσεις και άρα μεγαλύτερο Μ.Β. Αποτελεί τη βασική αποταμιευτική ουσία με την οποία εξασφαλίζεται η ισορροπία της γλυκόζης στον οργανισμό (αίμα). Η κυτταρίνη, που είναι γραμμικό πολυμερές μονάδων D-γλυκόζης συνδεδεμένων μεταξύ τους με β (1 4) γλυκοζιτικούς δεσμούς. Βρίσκεται μαζί με τη λιγνίνη και τις ξυλάνες στα κυτταρικά τοιχώματα των φυτών. 18

19 Τμήμα του μορίου κυτταρίνης με τις β (1 4) ενωμένες μονάδες D-γλυκόζης. Οι πηκτινικές ύλες, φυτικής προέλευσης ενώσεις, που η συγγένεια τους με τους υδατάνθρακες συνίσταται, κυρίως, στη χημική τους σύσταση. Αποτελούνται από γραμμικά πολυμερή του D-γαλακτουρονικού οξέος, ενωμένου με α (1 4) γλυκοζιτικούς δεσμούς, ενώ μέρος των καρβοξυλομάδων του έχει μετατραπεί σε μεθυλεστέρα. Με τις ουσίες αυτές δημιουργούνται πηκτές (ζελέδες), κατά τη θέρμανση χυμών φρούτων και λαχανικών με ζάχαρη (και οξέα) Το πολυγαλακτουρονικό οξύ της πηκτίνης. 19

20 ΠΕΙΡΑΜΑ Β1 ΑΝΑΓΩΓΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΣΑΚΧΑΡΩΝ Σκοπός Ανίχνευση αναγόντων σακχάρων στα τρόφιμα. Από τη Θεωρία στην Πράξη Όπως όλες οι αλδεϋδες και οι κετόνες (καρβονυλικές ενώσεις), έτσι και οι αλδόζες (π.χ. γλυκόζη) και οι κετόζες (π.χ. φρουκτόζη) είναι ισχυρά αναγωγικά σώματα. Η χαρακτηριστική αυτή ικανότητα των σακχάρων, τους έδωσε την ονομασία "ανάγοντα" σάκχαρα και απετέλεσε τη βάση για σειρά αντιδράσεων ανίχνευσης τους. Υπενθυμίζεται ωστόσο ότι οι καρβονυλικές ομάδες, μπορούν και να αναχθούν (σε αναγωγικό, προφανώς, περιβάλλον) και έτσι, από τους διάφορους π.χ. μονοσακχαρίτες να προκύψουν πολυαλκοόλες. Όσον αφορά την οξείδωση, ανάλογα με τη φύση των οξειδωτικών μέσων, τις συνθήκες οξείδωσης αλλά και τη φύση του μορίου των μονοσακχαριτών, οι τελευταίοι δίνουν διάφορα προϊόντα. Οι ομάδες οι οποίες είναι ευπρόσβλητες από οξειδωτικά μέσα είναι στις μεν αλδόζες η αλδεϋδική, η ακραία πρωτοταγής αλκοολική και η γειτονική προς το καρβονύλιο δευτεροταγής αλκοολική ομάδα, ενώ στις κετόζες οι δύο ακραίες πρωτοταγείς αλκοολικές ομάδες. Κατά την επίδραση ήπιων οξειδωτικών μέσων, ο ανθρακικός σκελετός των σακχάρων διατηρείται αναλλοίωτος. Όταν όμως επικρατούν ισχυρές 20

21 οξειδωτικές συνθήκες, ο ανθρακικός σκελετός διασπάται και σχηματίζονται οξέα, με μικρότερο αριθμό ατόμων άνθρακα. Στην περίπτωση διατήρησης της ανθρακικής αλυσίδας, τα κυριότερα προϊόντα οξείδωσης των σακχάρων είναι: Αλδονικά ή ονικά οξέα (π.χ. γλυκονικό, μαννονικό κτλ), όπου η αλδεϋδομάδα οξειδώνεται προς καρβοξύλιο. Ουρονικά οξέα (π.χ. γλυκουρονικό, γαλακτουρονικό κτλ), όπου η ακραία (πρωτοταγής) αλκοολική ομάδα των αλδοζών οξειδώνεται και αυτή προς καρβοξύλιο, αφού βέβαια προστατευθεί προηγουμένως η πλέον ευοξείδωτη αλδεϋδομάδα τους. Σακχαρικά ή αρικά οξέα ή αλδαρικά, δικαρβονικά οξέα τα οποία σχηματίζονται με την ταυτόχρονη οξείδωση της αλδεϋδικής και της πρωτοταγούς ακοολικής ομάδας προς καρβοξύλια. Οζόνες, υδροξυ-1,2- κετοαλδεϋδες οι οποίες προέρχονται είτε από αλδόζες, με οξείδωση της γειτονικής προς το (αλδεϋδικό) καρβονύλιο δευτεροταγούς αλκοολομάδας, είτε από κετόζες, με οξείδωση της γειτονικής προς το (κετονικό) καρβονύλιο πρωτοταγούς αλκοολικής ομάδας. Αξίζει να σημειωθεί ότι στις κετόζες, η καρβονυλική ομάδα δεν οξειδώνεται τόσο εύκολα όσο η αντίστοιχη των αλδοζών. Για παράδειγμα, ήπια οξειδωτικά μέσα όπως το σύστημα βρώμιο / νερό δεν μπορούν να οξειδώσουν τη φρουκτόζη. Επιπλέον, όταν πράγματι η οξείδωση λάβει χώρα, το προϊόν της αντίδρασης περιέχει λιγότερα άτομα άνθρακα από τη μητρική ένωση. Έχουμε δηλαδή διάσπαση του ανθρακικού σκελετού (αποικοδόμηση). Για να μελετήσουμε στο Εργαστήριο ιδιότητες των δισακχαριτών, ολιγοσακχαριτών και πολυσακχαριτών, χρειάζεται να θυμηθούμε ότι: 21

22 Οι μονοσακχαρίτες έχουν την τάση να σχηματίζουν κυκλικές ημιακετάλες. Αυτές προκύπτουν από την αντίδραση της καρβονυλικής ομάδας (αναφερομένης συχνά και ως αναγωγικής ομάδας) μετά ακραία υδροξύλια της (ανοικτής) ανθρακικής αλυσίδας (Σχήμα Β.1.1.) Σχήμα Β.1.1. Κυκλοποίηση μονοσακχαρίτη (πυρανόζης) Το Σχήμα Β.1.2. δείχνει τις διάφορες ενώσεις που προκύπτουν από την κυκλοποίηση της D-γλυκόζης και της D-φρουκτόζης, όπου σχηματίζονται παράγωγα του πυρανίου (πυρανόζες) ή του φουρανίου (φουρανόζες). Φουράνιο Πυράνιο 22

23 D-γλυκόζη D-αλδοπυρανόζη D-φρουκτόζη D-κετοφουρανόζη D-κετοπυρανόζη 2 Σχήμα Β.1.2. Σχηματισμός πυρανοζών και φουρανοζών από D-γλυκόζη και D-φρουκτόζη Ο παραπάνω σχηματισμός δακτυλίων, συνεπάγεται τη δημιουργία ενός νέου ασύμμετρου, του άνθρακα δηλαδή της ημιακετάλης. Αυτό εξηγεί και την ύπαρξη των δύο οπτικών ισομερών των μονοσακχαριτών, δηλαδή των α- και β-ανωμερών. Το Σχήμα Β.1.3. απεικονίζει τους κατά aworth τύπους των αντιστοίχων ισομερών της γλυκόζης και της φρουκτόζης. Οι απεικονίσεις αυτές 23

24 (κατά aworth) διευκολύνουν την εξήγηση του φαινομένου του σχηματισμού αναγόντων ή μη αναγόντων δισακχαριτών κτλ, που αναφέρεται στην επόμενη υπόμνηση α-l-γλυκοπυρανόζη α-l-γλυκοπυρανόζη β-l-γλυκοπυρανόζη α-d-γλυκοπυρανόζη β-d-γλυκοπυρανόζη α-d- φρουκτοφουρανόζη α-d-γλυκοφουρανόζη β-d-γλυκοφουρανόζη α-d-φρουκτοφουρανόζη Σχήμα Β.1.3. α- και β- ισομερή (ανωμερή) της γλυκόζης και φρουκτόζης (απεικόνιση aworth) Για το σχηματισμό δισακχαριτών (και κατ επέκταση πολυσακχαριτών), η αναγωγική ομάδα ενός μονοσακχαρίτη αντιδρά με ένα από τα υδροξύλια κάποιου άλλου μονοσακχαρίτη, όχι κατ ανάγκην διαφορετικού, σχηματίζοντας έτσι έναν (ή περισσότερους) γλυκοζιτικούς δεσμούς. Εάν το υδροξύλιο του 24

25 δεύτερου μονοσακχαρίτη, που συμμετέχει στον γλυκοζιτικό δεσμό, τυχαίνει να είναι και αυτό ακεταλικό, δηλ. αναγωγικό, τότε προφανώς εξαφανίζονται οι αναγωγικές ιδιότητες του δισακχαρίτη, αφού πια δεν υπάρχει στο μόριο του αναγωγική ομάδα. Το Σχήμα Β.1.4. απεικονίζει ορισμένους δισακχαρίτες. Από τη δομή τους εξηγείται και γιατί η σακχαρόζη (καλαμοσάκχαρο) και η τρεαλόζη δεν ανάγουν το φελίγγειο υγρό (αλκαλικό διάλυμα u ++ ). Η χαρακτηριστική αυτή ιδιότητα των δισακχαριτών χρησιμοποιείται στο Εργαστήριο, για τη διάκριση τους από άλλους δισακχαρίτες ή από τους μονοσακχαρίτες, οι οποίοι εφόσον περιέχουν αναγωγική ομάδα, μπορούν και ανάγουν το φελίγγειο υγρό. 2 2 Μαλτόζη α-d-γλυκοπυρανοζυλ-(1-4)-α-d-γλυκοπυρανόζη 2 2 Κελλοβιόζη β-d-γλυκοπυρανοζυλ-(1-4)-α-d-γλυκοπυρανόζη 25

26 2 2 β-d-γαλακτοπυρανοζυλ-(1-4)-α-d-γλυκοπυρανόζη Λακτόζη 2 2 Ισομαλτόζη 2 Σακχαρόζη(Σουκρόζη) 2 α-d-γλυκοπυρανοζυλ-(1-6)-β-d-γλυκοπυρανόζη 2 2 Τρεαλόζη β-d-φρουκτοφουρανοζυλ-(2-1)-α-d-γλυκοπυρανοζίτης 2 α-d-γλυκοπυρανοζυλ-(1-1)-a-d-γλυκοπυρανοζίτης Σχήμα Β.1.4. Μερικοί ανάγοντες και μη ανάγοντες δισακχαρίτες Από τους τρισακχαρίτες και μετά (τετρασακχαρίτες, έως πολυσακχαρίτες), δεδομένου ότι και το δεύτερο ακεταλικό υδροξύλιο (αυτό του μετά τον πρώτο ακραίο μονοσακχαρίτη) συμμετέχει σε νέο γλυκοζιτικό δεσμό, φαινόμενο το οποίο επαναλαμβάνεται όσο προστίθενται και νέα μόρια μονοσακχαριτών, οι αναγωγικές ιδιότητες εξασθενούν συνεχώς. Έτσι, το άμυλο, για παράδειγμα, δεν ανάγει το φελλίγειο υγρό παρά μόνον όταν προκληθεί τουλάχιστον μερική 26

27 υδρόλυση των μακρομορίων προς δεξτρίνες (ή, ακόμη καλύτερα, προς γλυκόζη) όπου δημιουργείται σημαντικό ποσοστό των αναγωγικών ομάδων, δηλαδή ακεταλικών υδροξυλίων. Μεθοδολογία Οι αναγωγικές ικανότητες των σακχάρων μπορούν να προσδιοριστούν από την ικανότητα τους να ανάγουν αλκαλικά διαλύματα ιόντων δισθενούς χαλκού (κυανά) προς οξείδιο του χαλκού (ερυθρό) σύμφωνα με την αντίδραση: 2u ανάγον σάκχαρο u2 οξειδωμένη μορφή σακχάρου Το πλέον γνωστό αντιδραστήριο για τον έλεγχο αυτό είναι το διάλυμα Fehling. Αυτό αποτελείται από διάλυμα u 2 S 4, Na και τρυγικού καλιονατρίου. Το υδροξείδιο του νατρίου προστίθεται για δύο λόγους: Α) Μετατρέπει τις αλδόζες και κετόζες σε ενόλες, οι οποίες ως ευοξείδωτες πλέον ουσίες, διευκολύνουν τη διάσπαση των μορίων των μονοσακχαριτών, στις θέσεις των διπλών δεσμών (βλ. αντίδραση). Β) Μετατρέπει τα ανηγμένα u +, που προκύπτουν από την οξείδωση του σακχάρου, σε u, και στη συνέχεια με θέρμανση (αφυδάτωση) στο χαρακτηριστικό κόκκινο ίζημα u 2. Το τρυγικό καλιονάτριο προστίθεται για να παρεμποδίσει το σχηματισμό ιζήματος u() 2, που ευνοείται από τη συνύπαρξη στο διάλυμα u ++ και. Το τρυγικό καλιονάτριο όμως σχηματίζει με το χαλκό ευδιάλυτο σύμπλοκο, το οποίο διίσταται ελαφρά και παρέχει προοδευτικά τα απαιτούμενα για την οξείδωση ιόντα u

28 Σε περίπτωση θετικής αντίδρασης, δηλαδή παρουσίας αναγόντων σακχάρων, εμφανίζεται ίζημα άλλοτε πράσινο, άλλοτε κίτρινο/πορτοκαλί και άλλοτε ερυθρωπό, ανάλογα με την ποσότητα και το είδος των αναγόντων σακχάρων. Η έκταση της αλλαγής του χρώματος, από το αρχικό μπλε έως το τελικό κόκκινο, αποτελεί ένδειξη της έκτασης που λαμβάνει η αναγωγική αντίδραση και, κατά συνέπεια, δίνει ένα μέτρο της αναγωγικής δύναμης του σακχάρου. Η κυριότερη δυσκολία με την αντίδραση αυτή είναι ότι δεν εξελίσσεται στοιχειομετρικά. Η σχέση αναγωγικού προς οξειδωτικό εξαρτάται τόσο από τις συνθήκες της αντίδρασης, όσο και από τη δομή των σακχάρων. Ωστόσο, είναι δυνατόν οι συνθήκες της αντίδρασης να τυποποιηθούν, και με τη χρήση των αντίστοιχων Πινάκων αναφοράς, να πάρουμε ακόμη και ποσοτικά (επαναλήψιμα), αποτελέσματα (π.χ. ογκομετρική μέθοδος Lane Eynon). Κατά τη διάρκεια του πειράματος λαμβάνουν χώρα οι εξής αντιδράσεις: 2 2 Na 2 Na Na οξείδ Na Na + Na 2 28

29 και u e - u + 2u u 2u θέρμ. u Εργαστηριακός εξοπλισμός Αντιδραστήρια Σάκχαρα (γλυκόζη, φρουκτόζη, μαλτόζη, τρεαλόζη, καλαμοσάκχαρο, άμυλο) Πορεία εργασίας Θειικός χαλκός (κρυσταλλικός) Υδροξείδιο του νατρίου Τρυγικό καλιονάτριο 1) Παρασκευή διαλύματος Fehling A: 3,5 g κρυσταλλικού θειικού χαλκού διαλύονται σε 50 ml νερού. Το διάλυμα μπορεί να διατηρηθεί επί μακρόν. 2) Παρασκευή διαλύματος Fehling B: 17,3 g τρυγικού καλιονατρίου και 5,0 g Na, διαλύονται σε 50 ml νερού. Το διάλυμα μπορεί να διατηρηθεί για μεγάλο χρονικό διάστημα, εφόσον φυλάσσεται σε πωματισμένη φιάλη. 3) Σε δοκιμαστικό σωλήνα αναμειγνύονται 3 ml από το διάλυμα Fehling Α και 3mL από το διάλυμα Fehling Β. Προστίθενται 50 mg σακχάρου και θερμαίνονται σε υδατόλουτρο που βράζει, επί 5 10 min. 4) Ψύξη και παρατήρηση χρώματος. 5) Κατάταξη των σακχάρων σε ανάγοντα και μη ανάγοντα. 6) Ερμηνεία αποτελεσμάτων - εκτίμηση αναγωγικού δυναμικού σακχάρων. 29

30 ΠΕΙΡΑΜΑ Β 2 ΧΗΜΙΚΗ ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΣΑΚΧΑΡΩΝ Σκοπός Η μελέτη της συμπεριφοράς όξινων τροφίμων κατά τη θέρμανση τους. Από τη Θεωρία στην Πράξη Κατά τη διάρκεια του μαγειρέματος ή γενικά των επεξεργασιών που υφίστανται τα τρόφιμα, ορισμένα σάκχαρα (πολυσακχαρίτες) υδρολύονται. Το φαινόμενο αυτό είναι εντονότερο σε τροφές οι οποίες περιέχουν αρκετή ποσότητα οξέων (όξινα τρόφιμα). Οι πηκτικές ουσίες των φρούτων ή λαχανικών, όταν υδρολύονται, έχουν ως αποτέλεσμα αφενός το μαλάκωμα του φρούτου / λαχανικού και αφετέρου την αύξηση του ιξώδους (πήξιμο) του χυμού τους, καθώς τα πηκτινικά οξέα διασπείρονται στη μάζα του υγρού. Άλλοι πολυσακχαρίτες που εμφανίζουν έστω και σε περιορισμένο βαθμό, την υδρόλυση αυτή κατά το μαγείρεμα, είναι τα άμυλα. Ορισμένες φορές ο βαθμός της υδρόλυσης του αμύλου ενδέχεται να είναι τόσο μεγάλος, ώστε να μειώσει σημαντικά την πηκτωματογόνο δράση του. Για το λόγο αυτό, όταν για παράδειγμα στα διάφορα γλυκά προσθέτουμε χυμό λεμονιού και το μίγμα πήζει, δεν πρέπει να ακολουθήσει παρατεταμένος βρασμός του σκευάσματος, μετά την προσθήκη του αμύλου, γιατί διαφορετικά το ιξώδες μειώνεται εκ νέου. Άλλη περίπτωση όπου έχουμε υδρόλυση του αμύλου (ουσιαστικά δεξτρινοποίηση, δηλ. μερική διάσπαση προς δεξτρίνες) είναι και κατά το 30

31 σχηματισμό της κόρας του ψωμιού στο ψήσιμο. Ωστόσο, οι αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα στην περίπτωση αυτή είναι περισσότερο πολύπλοκες από τη χημική υδρόλυση του αμύλου, (βλ. και αντιδράσεις αμαύρωσης ή καφετιάσματος). Μια εξίσου σημαντική εφαρμογή της χημικής υδρόλυσης των πολυσακχαριτών με οξέα είναι και αυτή που γίνεται όταν το άμυλο υδρολύεται σε D-γλυκόζη. Έτσι, από φτηνές πρώτες ύλες (π.χ. καλαμποκάλευρο) μπορούμε να πάρουμε γλυκαντικές ύλες, υποκατάστατα δηλαδή του καλαμοσακχάρου. Η χημική υδρόλυση του αμύλου όμως, για πολλούς λόγους, τείνει σήμερα να αντικατασταθεί από την ενζυμική υδρόλυση (βλ. αντίστοιχο πείραμα). Μεθοδολογία Πρέπει κατ αρχήν να σημειωθεί ότι η υδρόλυση των γλυκοζιτών (ακεταλικών παραγώγων των σακχάρων) και κατ επέκταση των πολυσακχαριτών των τροφίμων επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες, όπως: το pη, τη θερμοκρασία, τη στερεοϊσομέρεια (α- ή β-ανωμερή μορφή), το μέγεθος του δακτυλίου του μονοσακχαρίτη κτλ. Οι γλυκοζιτικοί δεσμοί διασπώνται ευκολότερα σε όξινο περιβάλλον παρά σε αλκαλικό, στο οποίο εμφανίζουν σχετική σταθερότητα. Ο μηχανισμός της χημικής υδρόλυσης ενός γλυκοζίτη, παρουσία οξέος, θεωρείται ότι ακολουθεί την εξής πορεία: 31

32 R + R + (Β 2 ) R Στο εργαστήριο (όπως και τη βιομηχανία) τα οξέα, που χρησιμοποιούνται για την κατάλυση της υδρόλυσης των σακχάρων είναι είτε το θειικό είτε το υδροχλωρικό. Το τρόφιμο στο οποίο μελετάται η χημική υδρόλυση είναι είτε κάποιο γλυκό του κουταλιού, είτε μαρμελάδα. Η άσκηση περιλαμβάνει δύο στάδια: Α) Προσδιορίζεται κατ αρχήν το ποσό των αναγόντων σακχάρων, που υπάρχουν στο προς εξέταση τρόφιμο. Ο προσδιορισμός γίνεται με βάση τις οξειδωτικές ιδιότητες του φελίγγειου υγρού. Υπολογίζεται δηλαδή ο όγκος του σακχαρούχου διαλύματος του τροφίμου, ο οποίος απαιτείται για την αναγωγή ενός γνωστού όγκου φελίγγειου διαλύματος (μίγμα Fehling Α και Fehling Β) με τη βοήθεια του κυανού του μεθυλενίου ως δείκτη. Ο αέρας εκδιώκεται από την αντίδραση με τη διατήρηση του μίγματος σε βρασμό. Β) Κατόπιν, τα μη ανάγοντα σάκχαρα (σακχαρόζη κτλ) υδρολύονται προς ανάγοντα σάκχαρα με τη βοήθεια αραιού υδροχλωρικού οξέος και θερμότητας (βρασμός του μίγματος). Ακολουθεί προσδιορισμός του συνόλου των αναγόντων πλέον σακχάρων (αρχικών και εκείνων που προήλθαν από την 32

33 υδρόλυση), σύμφωνα με την παραπάνω μέθοδο (αναγωγή διαλύματος φελίγγειου υγρού, αφού προηγουμένως το υδρολυθέν μίγμα ψυχθεί και εξουδετερωθεί με διάλυμα Na. Η κατανάλωση σακχαρούχου διαλύματος στη δεύτερη περίπτωση, του προσδιορισμού δηλαδή των ολικών σακχάρων, είναι μεγαλύτερη αυτής που παρατηρείται κατά τον προσδιορισμό των αρχικά υπαρχόντων αναγόντων σακχάρων. Η αυξημένη αυτή κατανάλωση σακχαρούχου διαλύματος αποδεικνύει την πραγματοποίηση της χημικής υδρόλυσης των σακχάρων. Δίνει επίσης την δυνατότητα του προσδιορισμού των μη αναγόντων σακχάρων που υπάρχουν στο τρόφιμο (διαφορά μεταξύ ολικών σακχάρων και αναγόντων σακχάρων). Εργαστηριακός εξοπλισμός Αντιδραστήρια Μαρμελάδα ή γλυκό κουταλιού Διάλυμα Fehling A Διάλυμα Fehling Β Αραιό l Υδατικό διάλυμα Na (10%) Κυανούν του μεθυλενίου (1% υδατικό διάλυμα), το οποίο διηθείται προτού χρησιμοποιηθεί. Φαινολοφθαλεΐνη Πορεία εργασίας Τα διάφορα στάδια της άσκησης στηρίζονται στις αντιδράσεις του προηγουμένου πειράματος και επίσης στην αντίδραση υδρόλυσης (Β 2 ) και της εξουδετέρωσης της περίσσειας του υδροχλωρικού οξέος, που χρησιμοποιήθηκε για την υδρόλυση, με Na. 1) Προετοιμασία δείγματος τροφίμου: 33

34 Ποσότητα W = 4 5 g του τροφίμου ζυγίζεται ακριβώς και μεταφέρεται σε ποτήρι ζέσεως στο οποίο προστίθενται περί τα 100 ml ζεστού νερού. Ακολουθεί ανάδευση έως ότου διαλυθούν όλες οι υδατοδιαλυτές ουσίες. Το μίγμα διηθείται σε ογκομετρική φιάλη των 250 ml και αραιώνεται με νερό μέχρι του τελικού αυτού όγκου. Το σακχαρούχο αυτό διάλυμα χρησιμοποιείται για τους παρακάτω προσδιορισμούς. 2) Χημική υδρόλυση σακχάρων: 100 ml από το παραπάνω παρασκευασθέν σακχαρούχο διάλυμα, μεταφέρονται σε κωνική φιάλη, στην οποία προστίθενται 5 10 ml πυκνού l. Το μίγμα αφήνεται να βράσει επί 8 10 min. Στη συνέχεια ψύχεται, εξουδετερώνεται με 10% Na και δείκτη φαινολοφθαλεΐνη και αραιώνεται σε ογκομετρική φιάλη μέχρι τελικού όγκου 250 ml. 3) Προσδιορισμός αναγόντων σακχάρων: Μέρος του αρχικού σακχαρούχου διαλύματος μεταφέρεται σε προχοΐδα. 5 ml διαλύματος Fehling Α και 5 ml διαλύματος Fehling Β μεταγγίζονται σε κωνική φιάλη. Προστίθενται 4 σταγόνες κυανούν του μεθυλενίου 1%. Το διάλυμα θερμαίνεται μέχρι βρασμού και, ενώ βράζει, προστίθεται το σακχαρούχο διάλυμα από την προχοΐδα μέχρις ότου εξαφανιστεί ο κυανός χρωματισμός. Σημειώνεται ο κατά προσέγγιση όγκος του καταναλωθέντος σακχαρούχου διαλύματος. Έστω x ml ο όγκος αυτός. Η ογκομέτρηση επαναλαμβάνεται με τη λήψη άλλων 10 ml (συνολικά) φελίγγειου μίγματος (Α + Β), ως εξής: Στο υπό βρασμό διατηρούμενο φελίγγειο μίγμα προστίθενται μονομιάς, από την προχοΐδα, (x 1) ml σακχαρούχου διαλύματος. Μετά την προσθήκη 4 σταγόνων κυανούν του μεθυλενίου και πάντοτε υπό βρασμό του μίγματος, 34

35 συνεχίζεται η προσθήκη του σακχαρούχου διαλύματος κατά ποσότητες 0,25 ml μέχρι του τελικού σημείου της αντίδρασης (εξαφάνιση κυανού χρώματος). Έστω Τ αν ml, ο τελικός αυτός όγκος. 4) Προσδιορισμός ολικών σακχάρων: Το υδρολυθέν και εξουδετερωθέν σακχαρούχο διάλυμα, που προέκυψε με τις κατεργασίες του 2 ου σταδίου της Πορείας εργασίας, φέρεται και αυτό σε προχοΐδα. Ακολουθεί η ίδια πορεία εργασίας, όπως ακριβώς περιγράφηκε και κατά το προηγούμενο στάδιο 3, για τον προσδιορισμό των αναγόντων σακχάρων. Έστω ότι αυτή τη φορά ο τελικός όγκος του καταναλωθέντος σακχαρούχου διαλύματος είναι Τ ολ ml. 5) Υπολογισμοί: Η συγκέντρωση των σακχάρων υπολογίζεται με τη χρήση των ακόλουθων συντελεστών μετατροπής: 1 ml συνολικού διαλύματος Fehling (A + Β) με τους κατάλληλους υπολογισμούς (τιτλοδοτήσεις), υπολογίζεται ότι ισοδυναμεί με: 4,95 mg γλυκόζης ή 5,25mg φρουκτόζης ή 7,68mg μαλτόζης ή 4,75mg σακχαρόζης Τα ανάγοντα σάκχαρα υπολογίζονται, ως ισοδύναμα σε γλυκόζη, από τον τύπο: % ανάγοντα 49,5 σάκχαρα Τ αν 250 W 10 35

36 Τα ολικά σάκχαρα υπολογίζονται, ως ισοδύναμα σε γλυκόζη, από τον τύπο: % ολικά σάκχαρα 49, ,5 Τ W 10 ολ Τέλος, τα μη ανάγοντα σάκχαρα υπολογίζονται εκ διαφοράς (ολικά ανάγοντα σάκχαρα). 36

37 ΠΕΙΡΑΜΑ Β 3 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΚΑΤΕΡΓΑΣΤΩΝ ΙΝΩΝ Σκοπός Υπολογισμός της περιεκτικότητας των τροφίμων σε ακατέργαστες ίνες (κυτταρίνη). Από τη Θεωρία στην Πράξη Οι ακατέργαστες ίνες ονομάζονται συχνά και διαιτητικές ίνες δεδομένου, ότι παρόλο που δεν πέπτονται (ο άνθρωπος και τα περισσότερα ζώα δεν διαθέτουν ένζυμα ικανά να διασπάσουν τους β- 1,4 δεσμούς των μορίων της D-γλυκόζης, που αποτελούν το μόριο της κυτταρίνης) και κατά συνέπεια στερούνται θρεπτικής αξίας, η παρουσία τους στα τρόφιμα θεωρείται, από διατροφική (διαιτητική) άποψη, ως εξαιρετικής σημασίας. Διεγείρουν, για παράδειγμα, την εντερική περισταλτική λειτουργία, βοηθώντας έτσι στη γρήγορη απομάκρυνση των άχρηστων συστατικών από τον οργανισμό, μερικά από τα οποία ενδέχεται εάν παραμείνουν επί μακρόν σε επαφή με τα εντερικά τοιχώματα να προξενήσουν βλάβες στον οργανισμό (π.χ. χολικά οξέα καρκίνος παχέος εντέρου). Η προάσπιση αυτή της υγείας μας, που επιτυγχάνεται με τις ακατέργαστες ίνες, είναι και αποτέλεσμα της αύξησης του όγκου των περιττωμάτων και κατά συνέπεια της ελάττωσης των συγκεντρώσεων των πιθανών τοξικών ουσιών. Εάν αυτές υπάρχουν στα τρόφιμα (π.χ. υπολείμματα γεωργικών φαρμάκων) μπορούν να προξενήσουν ανάλογες βλάβες στον 37

38 οργανισμό του ανθρώπου. Ελαττώνοντας όμως τη συγκέντρωση των δραστικών αυτών ενώσεων, περιορίζεται και η δυνατότητα αντίδρασης τους με τα υγιή κύτταρα του τελευταίου τμήματος του πεπτικού συστήματος, όπως επίσης παρεμποδίζεται και η ενδεχόμενη μεταφορά τους προς άλλα "ευαίσθητα σ αυτές" όργανα του σώματος. Τέλος, οι ακατέργαστες ίνες βοηθούν και στην αντιμετώπιση της δυσκοιλιότητας. Αξίζει να αναφερθεί ότι σύμφωνα με νεότερες αντιλήψεις, η προστατευτική δράση των ακατέργαστων ινών στηρίζεται στο γεγονός ότι ορισμένα συστατικά τους διασπώνται και ζυμώνονται με τη βοήθεια της βακτηριακής χλωρίδας του παχέος εντέρου, δημιουργώντας έτσι υψηλές συγκεντρώσεις κατώτερων λιπαρών οξέων, όπως οξικό, προπιονικό, βουτυρικό. Τα οξέα αυτά, έχει αποδειχθεί ότι "συνεργάζονται" για την καταστροφή των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου, με μια διαδικασία ανάλογη της απόπτωσης. Ολοκληρώνοντας την αναφορά στις ευεργετικές δράσεις των ακατέργαστων ινών στον οργανισμό, σημειώνεται ότι στην βιβλιογραφία έχει πολλές φορές σημειωθεί ότι η αυξημένη παρουσία τους στο διαιτολόγιο, μειώνει τις πιθανότητες καρδιαγγειακών παθήσεων, πιθανόν λόγω της ελάττωσης των επιπέδων των διαφόρων λιπιδίων στο αίμα. Δεν έχει όμως αποδειχθεί ακόμη ποιο ή ποια από τα επιμέρους συστατικά των ακατέργαστων ινών έχουν την ευεργετική αυτή επίδραση. Ωστόσο, υποστηρίζεται ότι αυτή οφείλεται, κυρίως, στο διαλυτό κλάσμα (π.χ. τα κόμμεα, τις πηκτίνες και λιγότερο τις ημικυτταρίνες), παρά στο αδιάλυτο (π.χ. κυτταρίνη). Μετά τις παραπάνω αναφορές είναι προφανής η σημασία του υπολογισμού του περιεχομένου των τροφίμων σε ακατέργαστες ίνες. Αυτές, όπως ήδη αναφέρθηκε, αποτελούνται κυρίως από κυτταρίνη και ημικυτταρίνες (ξυλάνες, μαννάνες, γλυκομαννάνες, γαλακτάνες, αραβινογαλακτάνες), αλλά και λιγνίνη 38

39 (μη σακχαροειδές πολυμερές του ξυλώδους ιστού των φυτών που προκύπτει από τη συμπύκνωση αρωματικών αλδεϋδών, όπως βανιλλίνης και p- υδροξυβενζαλδεΰδης), πηκτίνες, κόμμεα (gums) κτλ. Από τα παραπάνω συστατικά των ακατέργαστων ινών άλλα είναι σχετικά εύκολα υδατοδιαλυτά και άλλα παραμένουν αδιάλυτα. Παραδοσιακά, για την αναλυτική χημεία, αδιάλυτα θεωρούνται τα συστατικά που παραμένουν μετά την κατεργασία του απολιπασμένου δείγματος του τροφίμου στην αρχή αραιό οξύ (υπό βρασμό) και στη συνέχεια με αραιό άλκαλι (πάλι υπό βρασμό). Η κατεργασία διαλυτοποιεί και απομακρύνει πολλά από τα επιμέρους συστατικά εκτός από την κυτταρίνη, αρκετές ημικυτταρίνες και τη λιγνίνη, στα οποία και αναφέρεται τελικά το αδιάλυτο μέρος των ακατέργαστων ινών. Αντί της χημικής επεξεργασίας των τροφίμων προς απομάκρυνση των ευδιάλυτων συστατικών των ακατέργαστων ινών, χρησιμοποιούνται επίσης διάφορα ένζυμα (π.χ. αμυλάσες). Μεθοδολογία Για τον προσδιορισμό του αδιάλυτου κλάσματος των ακατέργαστων ινών, απ όσα τρόφιμα περιέχουν πλέον του 10% λίπος, απομακρύνονται κατ αρχήν τα λιπίδια, π.χ. με πετρελαϊκό αιθέρα. Ακολουθεί κατεργασία με αραιό διάλυμα οξέος, οπότε διασπώνται και απομακρύνονται με διήθηση οι υδατάνθρακες και πρωτεΐνες που υδρολύονται ευκολότερα. Τα αδιάλυτα συστατικά, τα οποία αποτελούνται, κυρίως, από το υπό προσδιορισμό κλάσμα των ακατέργαστων ινών (κυτταρίνη, μερικές ημικυτταρίνες και λιγνίνη, εφόσον φυσικά υπάρχουν στο τρόφιμο) και μικρά ποσά ανόργανης ύλης, ξηραίνονται και ζυγίζονται. Έστω ότι το βάρος τους είναι W 1 g. 39

40 Ακολουθεί καύση των οργανικών συστατικών του παραπάνω υπολείμματος (δηλ. των ακατέργαστων ινών) και νέα ζύγιση με την οποία υπολογίζονται τα άκαυστα ανόργανα συστατικά (τέφρα). Έστω W 2 g το βάρος της τέφρας. Ο υπολογισμός της % περιεκτικότητας του τροφίμου σε αδιάλυτες διαιτητικές ίνες (NDF = Nonsoluble Dietary Fibre) γίνεται από τον τύπο: W W W 1 2 % NDF 100 όπου W = βάρος του δείγματος (τροφίμου) Σε πολλές εργαστηριακές μεθόδους, το προϊόν της υδρόλυσης (με αραιό διάλυμα οξέος) των πρωτεϊνών και υδατανθράκων, κατεργάζεται με θερμό διάλυμα αλκάλεος, οπότε σαπωνοποιούνται τα τυχόν παραμένοντα (αδιάλυτα στον πετρελαϊκό αιθέρα) λιπίδια. Αυτή η κατεργασία συντελεί ακόμα στην περαιτέρω διαλυτοποίηση των περιεχομένων ανόργανων υλών, μέρος των οποίων έχει ήδη διαλυτοποιηθεί κατά την κατεργασία με οξέα. Εργαστηριακός εξοπλισμός Αντιδραστήρια σφαιρικές ή κωνικές φιάλες 100 ml ψυκτήρες υάλινοι ηθμοί κωνικές φιάλες διήθησης υπό ελαττωμένη πίεση νιφάδες καλαμποκιού ή άλλου δημητριακού π. ΗΝ 3 και 3 (80%) Πεχαμετρικός χάρτης αιθυλική αλκοόλη και αιθέρας 40

41 Πορεία εργασίας 1) Ο υάλινος ηθμός που θα χρησιμοποιηθεί κατά το πείραμα ξηραίνεται (100º) και ζυγίζεται. 2) Ποσότητα (0,8 1,2 g) δείγματος λεπτοαλεσμένου τροφίμου ζυγίζεται επακριβώς και μεταφέρεται σε σφαιρική (ή κωνική) φιάλη των 100 ml. Εάν το περιεχόμενο στο τρόφιμο λίπος υπερβαίνει κατά κανόνα το 10%, εκχυλίζεται με 3 x 25 ml πετρελαϊκού αιθέρα, και το απολιπανθέν δείγμα ξηραίνεται στον αέρα. 3) Στο δείγμα προστίθενται 60 ml μίγματος πυκνού νιτρικού οξέος και οξικού οξέος σε αναλογία 1/9, ν/ν. Το μίγμα θερμαίνεται, υπό ήπιο βρασμό, με κάθετο ψυκτήρα επί 1 ώρα. 4) Το περιεχόμενο της φιάλης διηθείται μέσω του προζυγισμένου υάλινου ηθμού και εκπλένεται με θερμό νερό μέχρις ότου απομακρυνθούν τα οξέα (ουδέτερη αντίδραση). Στη συνέχεια, προκειμένου να επιταχυνθεί η ξήρανση, το υπόλειμμα εκπλένεται με λίγη αλκοόλη και αιθέρα. 5) Ο ηθμός, μετά του υπολείμματος που παραμένει από τις παραπάνω κατεργασίες, ξηραίνεται και ζυγίζεται. 6) Δεδομένου ότι αφενός μεν η περιεκτικότητα του υπολείμματος σε ανόργανα συστατικά είναι σχετικά μικρή και αφετέρου ο προσδιορισμός των ανόργανων υλών (τέφρας) διδάσκεται σε άλλη άσκηση, η αναφερόμενη στη μεθοδολογία καύση (συνήθως) παραλείπεται. Τα αποτελέσματα εκφράζονται κατά συνέπεια ως % περιεκτικότητα του τροφίμου σε αδιάλυτα συστατικά, τα οποία προφανώς περιέχουν: κυτταρίνη (κυρίως), ορισμένες ημικυτταρίνες, ενδεχομένως λιγνίνη και μικρότερες ποσότητες ανόργανων υλών. 41

42 ΠΕΙΡΑΜΑ Β 4 ΜΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΜΑΥΡΩΣΗ (Ι) ΚΑΡΑΜΕΛΟΠΟΙΗΣΗ Σκοπός Η μελέτη της συμπεριφοράς των σακχάρων κατά τη θερμική τους επεξεργασία (απουσία αμινοξέων πρωτεϊνών). Από τη Θεωρία στην Πράξη Κατά τις διάφορες επεξεργασίες ή την αποθήκευση τους στα τρόφιμα υφίστανται μεταξύ των άλλων και ορισμένες μεταβολές στο χρώμα τους, το οποίο τείνει προς σκουρόχρωμες αποχρώσεις, του καφέ ή ακόμα και του μαύρου. Για το λόγο αυτό, οι συγκεκριμένες αντιδράσεις ονομάζονται αντιδράσεις αμαύρωσης ή καφετιάσματος (browning reactions). Αυτές, ανάλογα εάν λαμβάνουν χώρα χωρίς ή με τη δράση ενζύμων, χωρίζονται σε αντιδράσεις μη ενζυμικής αμαύρωσης και αντιδράσεις ενζυμικής αμαύρωσης. Εκτός από το χρώμα, μεταβάλλονται συγχρόνως και άλλα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των υφιστάμενων αμαύρωση τροφίμων (γεύση, οσμή), τα οποία άλλοτε είναι επιθυμητά (από τις βιομηχανίες τροφίμων και τους καταναλωτές) και άλλοτε ανεπιθύμητα. Οι αντιδράσεις μη ενζυμικής αμαύρωσης, χωρίζονται σε τρεις επιμέρους κατηγορίες: 42

43 καραμελοποίηση αντιδράσεις Maillard οξείδωση ασκορβικού οξέος Οι δύο τελευταίες κατηγορίες, καθώς και οι αντιδράσεις ενζυμικής αμαύρωσης, θα εξεταστούν κατά τη διεξαγωγή άλλων πειραμάτων (βλ. επόμενες ενότητες). Στο πείραμα αυτό μελετάται η καραμελοποίηση, μαζί με τις συνθήκες που την ευνοούν ή την παρεμποδίζουν, ως σχετιζόμενη άμεσα με τους υδατάνθρακες. Υπενθυμίζεται καταρχήν ότι όταν τα σάκχαρα θερμαίνονται (αυτούσια ή σε πυκνά διαλύματα) σε υψηλότερες των 100º θερμοκρασίες, τότε λαμβάνουν χώρα πολύπλοκες αντιδράσεις οι οποίες καταλήγουν σε πλήθος ουσιών με χαρακτηριστικό άρωμα και καφέ χρώμα, όπως αυτά της καραμέλας ή του τοστ. Το σύνολο των φυσικοχημικών αυτών μεταβολών ονομάζεται καραμελοποίηση. Το πρώτο στάδιο της θερμικής αυτής διάσπασης (αποικοδόμησης) των σακχάρων είναι η αντιστρεπτή ισομερίωση των αλδοζών προς κετόζες, μέσω των 1,2 - cis - ενοδιολών: 2 Η αντίδραση χρειάζεται συνδυασμένη καταλυτική δράση οξέος και βάσης για να επιτευχθεί αφενός η πρωτονίωση της καρβονυλικής ομάδας και αφετέρου η αποπρωτονίωση της ασθενώς όξινης υδροξυλομάδας. Ωστόσο, σε υψηλές θερμοκρασίες και πολύ μικρές συγκεντρώσεις οξέων, στο σύστημα αυτό τα 43

44 ανιόντα των οργανικών οξέων, (π.χ. μηλικού οξέος) και τα υδροξύλια του νερού, συμπεριφέρονται ως βάσεις. Σε ουδέτερο ή όξινο περιβάλλον η ενοδιόλη αφυδατώνεται εύκολα με σειρά αντιδράσεων, που παρουσιάζεται στο Σχήμα Β.4.1. Το εμφανιζόμενο στο σχήμα αυτό ως τελικό προϊόν, η υδροξυμεθυλοφουρφουράλη (MF), δεν είναι βέβαια και το μοναδικό προϊόν της σειράς αυτής των αντιδράσεων. Η χαρακτηριστική οσμή της "καμένης ζάχαρης" οφείλεται για παράδειγμα στην ακρολεΐνη (προπενάλη, 2 =) και τη γλυοξάλη (αιθανοδιάλη, ). 44

45 Υδροξυμεθυλοφουρφουράλη 2 2 (MF) Σχήμα Β.4.1. Σχηματισμός της υδροξυμεθυλοφουρφουράλης με αφυδάτωση ενοδιόλης εξόζης 45

46 Η MF μπορεί να εντοπισθεί ευκολότερα σε τρόφιμα που περιέχουν υδατάνθρακες και βέβαια θερμαίνονται κατά την παρασκευή τους (γλυκά του κουταλιού, μέλι που έχει νοθευτεί με ιμβερτοσάκχαρο διάφορα άλλα σακχαρούχα υλικά κτλ). Οι καφέ χρωστικές που χαρακτηρίζουν τη καραμέλα και άλλα τρόφιμα, προέρχονται από ορισμένες αντιδράσεις πολυμερισμού, οι οποίες όμως δεν έχουν αποσαφηνισθεί. Στις αντιδράσεις αυτές συμμετέχει οπωσδήποτε η MF καθώς και οι πρόδρομες ενώσεις της. Οι προκύπτουσες χρωστικές έχουν μεγάλο μοριακό βάρος και κατά συνέπεια δεν μπορούν να απορροφηθούν από το έντερο. Η "καμένη" ζάχαρη αποτελεί μια παραδοσιακή και προσφιλή συνταγή για καφέ χρώσεις και ανάλογες γεύσεις, που μπορεί να παρασκευαστεί γρήγορα, ακόμα και στο σπίτι. Ωστόσο, στη βιομηχανία τροφίμων, προτιμώνται καραμελοχρώματα, που παρασκευάζονται με βάση τις αντιδράσεις Maillard (βλ. επόμενη Ενότητα). Κατά την διεργασία της καραμελοποίησης, η παρατεταμένη θέρμανση σε υψηλές θερμοκρασίες, οδηγεί στο σχηματισμό προϊόντων πυρόλυσης που παρουσιάζουν ανεπιθύμητα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά (πικρή γεύση, δυσάρεστη οσμή, πολύ σκοτεινό μαύρο χρώμα). Είναι επομένως προφανής η αναγκαιότητα ελέγχου των συνθηκών καραμελοποίησης. Στο Εργαστήριο, πραγματοποιούνται δύο επιμέρους πειραματικές ασκήσεις. Κατά την Α, μελετάται η αντίδραση της καραμελοποίησης ως προς τη φύση (δομή) των αντιδρώντων σακχάρων και την καταλυτική δράση ορισμένων ιμβερτοσάκχαρο ή ανάστροφο σάκχαρο: ισομοριακό μίγμα D-γλυκόζης και D-φρουκτόζης που παρασκευάζεται για εμπορική χρήση (σιρόπι), συνήθως, με όξινη υδρόλυση της σακχαρόζης σε υψηλές θερμοκρασίες. 46

47 ουσιών, ενώ στη Β, εξετάζεται η επίδραση της θερμοκρασίας στις ιδιότητες της παρασκευαζόμενης καραμέλας. Εργαστηριακός εξοπλισμός Αντιδραστήρια κάψες πορσελάνης θερμόμετρα ποτήρια ζέσεως 500 ml ζάχαρη(σακχαρόζη) γλυκόζη (κρυσταλλική) όξινο τρυγικό κάλιο αραιό διάλυμα Na (10%) Πορεία εργασίας Άσκηση Α: Φύση αντιδρώντων καταλύτες 1) Γλυκόζη (5 g x 3 δείγματα) και σακχαρόζη (5 g x 3 δείγματα) ζυγίζονται σε έξι διαφορετικές κάψες. 2) Στις δύο από τις κάψες που περιέχουν την κρυσταλλική γλυκόζη προστίθεται μικρή ποσότητα ύδατος ούτως ώστε να διαβραχεί όλη η γλυκόζη. Το ίδιο επαναλαμβάνεται και στις δύο από τις τρεις κάψες που περιέχουν τη ζάχαρη. Αφήνεται δηλαδή μία κάψα με γλυκόζη και μία με ζάχαρη χωρίς να διαβραχούν με νερό. 3) Στις κάψες της γλυκόζης προστίθενται επίσης, στην μεν πρώτη 0,5 g όξινου τρυγικού καλίου, στη δε δεύτερη 0,5 ml αραιού διαλύματος Na. Όξινο τρυγικό κάλιο (0,5 g) προστίθεται επίσης και στη μία από τις δύο κάψες με την εφυγρανθείσα ζάχαρη. Σύμφωνα με τα παραπάνω έχουν προκύψει τα εξής μίγματα: 47

48 Α) γλυκόζη + νερό + οξύ Β) γλυκόζη + διάλυμα βάσης Γ) γλυκόζη και νερό Δ) σακχαρόζη + διάλυμα βάσης Ε) σακχαρόζη + νερό + οξύ ΣΤ) σακχαρόζη + νερό 4) Όλες οι κάψες τοποθετούνται συγχρόνως στην ίδια θερμαντική εστία. Ακολουθεί βαθμιαία αύξηση της θερμοκρασίας, υπό συνεχή ανάδευση με υάλινη ράβδο ή σπάτουλα (απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή κατά την αύξηση της θερμοκρασίας), μέχρις εμφανίσεως καφέ / μαύρων χρωμάτων και οσμής "καμένης" ζάχαρης. Η ζάχαρη τήκεται στους 185º περίπου ενώ στους 210º το τήγμα πυρολύεται και αφρίζει (απώλεια ύδατος). 5) Καταγράφεται το χρονικό διάστημα που απαιτείται για να εμφανιστεί καφέ χρωματισμός του ιδίου βάθους χρώματος στις διάφορες κάψες, καθώς επίσης και η θερμοκρασία κατά την οποία πρωτοεμφανίζεται καφέτιασμα στην κάθε κάψα. 6) Ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Άσκηση Β: Επίδραση θερμοκρασίας 1) 100 g ζάχαρης φέρονται σε ποτήρι ζέσεως των 500 ml στο οποίο προστίθενται 40 ml Η 2 Ο και 0,5 g όξινου τρυγικού καλίου. Το μίγμα θερμαίνεται μέχρι βρασμού σε θερμαντική εστία και στη συνέχεια διατηρείται σε αυτή (περίπου) τη θερμοκρασία. 2) Σε τακτά χρονικά διαστήματα, σημειώνονται οι αλλαγές που εμφανίζονται στο σιρόπι, καταγράφονται οι αντίστοιχες θερμοκρασίες, και λαμβάνονται δείγματα από αυτό (με σπάτουλα ή κουτάλι), τα οποία ρίπτονται 48

49 σε δοχείο που περιέχει κρύο νερό. 3) Εξετάζονται τα δείγματα της καραμέλας, που έχουν ληφθεί στις διάφορες θερμοκρασίες του σιροπιού και προτείνεται η βέλτιστη θερμοκρασία καραμελοποίησης (για συγκεκριμένες χρήσεις). 49

50 Η Ενότητα με μια ματιά ΥΔΑΤΑΝΘΡΑΚΕΣ Μονοσακχαρίτες: γλυκόζη, φρουκτόζη, Ολιγοσακχαρίτες: σακχαρόζη, λακτόζη, κελλοβιόζη, (ισο)μαλτόζη, τρεαλόζη, δεξτρίνες Πολυσακχαρίτες: αμυλόζη, αμυλοπηκτίνη, γλυκογόνο, κυτταρίνη, πηκτινικές ύλες α- (1,4) γλυκοζιτικοί δεσμοί αμυλόζης α-(1,6) διακλαδώσεις αμυλοπηκτίνης Τμήμα του μορίου κυτταρίνης με τις β (1 4) ενωμένες μονάδες D-γλυκόζης. Το πολυγαλακτουρονικό οξύ της πηκτίνης. 1.Αναγωγικές ιδιότητες σακχάρων Οξείδωση: Αλδονικά Ουρονικά Σακχαρικά (δικαρβονικά) Οζόνες Κυκλοποίηση μονοσακχαρίτη (πυρανόζης) 50

51 Φουράνιο Πυράνιο Σχηματισμός πυρανοζών και φουρανοζών από D-γλυκόζη και D-φρουκτόζη 51

52 2. Χημική υδρόλυση σακχάρων Μηχανισμός χημικής υδρόλυσης γλυκοζίτη παρουσία οξέος 3.Προσδιορισμός ακατέργαστων ινών Κυτταρίνη- φυτικές ίνες Δεν πέπτονται από τον οργανισμό του ανθρώπου - στερούνται θρεπτικής αξίας. Συνεισφέρουν στην ικανότητα κορεσμού τροφών Διέγερση εντερικής λειτουργίας- καταπολέμηση δυσκοιλιότητας και αποφυγή A Αποικοδόμηση και σύνθεση κατώτερων λιπαρών οξέων - μείωση καρδιαγγειακών νοσημάτων. Ημικυτταρίνες Πηκτίνες Κόμμεα 4. Μη ενζυμική αμαύρωση (Ι) - Καραμελοποίηση Καραμελοποίηση Αντίδραση Maillard Οξείδωση ασκορβικού οξέος Σχηματισμός της υδροξυμεθυλοφουρφουράλης με αφυδάτωση ενοδιόλης εξόζης 52

53 Ενότητα Γ ΑΜΙΝΟΞΕΑ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Οι πρωτεΐνες είναι η δεύτερη βασική κατηγορία των συστατικών των ζώντων οργανισμών (άρα και των τροφίμων), που θα εξετάσουμε. Οι πρωτεΐνες αποτελούν, ως γνωστόν, πολυμερή των αμινοξέων, η πλειοψηφία των οποίων είναι του τύπου 2 NR, δηλαδή α-αμινοξέα. Ξεχωρίζουν λοιπόν από τους υδατάνθρακες και τα λιπίδια, ως προς το ότι, μόνο οι ενώσεις της κατηγορίας αυτής περιέχουν άζωτο. Η διαφορά αυτή άλλωστε, αποτελεί και τη βάση για πολλές μεθόδους προσδιορισμού των πρωτεϊνών στα τρόφιμα. Το μοριακό βάρος των πρωτεϊνών κυμαίνεται από περίπου μέχρι μερικά εκατομμύρια. Η δομή των μορίων τους είναι ιδιαίτερα πολύπλοκη. Ωστόσο, ορισμένα χαρακτηριστικά της δομής τους γίνονται εύκολα αντιληπτά. Για παράδειγμα, τα αμινοξέα ενώνονται μεταξύ τους μόνο με πεπτιδικούς δεσμούς ( N ), η δε ποικιλία των διαφόρων αμινοξέων είναι και αριθμητικά περιορισμένη, αλλά και ουσιαστικά κοινή σε όλες τις πρωτεΐνες. Επιπλέον, οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες των πρωτεϊνών ουδέποτε διακλαδίζονται. Τα μακρομόρια των πρωτεϊνών χαρακτηρίζονται από πολλές ιδιότητες, από τις οποίες τελικά εξαρτάται και η συμπεριφορά τους στα τρόφιμα, όπου ευρίσκονται. Ορισμένες είναι επιφανειοδραστικές και εμφανίζουν αφριστικές ή γαλακτωματοποιητικές ικανότητες, άλλες δεσμεύουν μόρια του νερού και υπό ορισμένες συνθήκες σχηματίζουν πηκτές, άλλες εμφανίζουν ενζυμική δράση, ενώ άλλες παρουσιάζουν ενδιαφέρον στην τεχνολογία τροφίμων λόγω της ικανότητας τους να κροκιδώνονται (θρόμβωση μετουσίωση των πρωτεϊνών). 53

54 Οι ιδιότητες και τα λειτουργικά αυτά χαρακτηριστικά των πρωτεϊνών εξαρτώνται βέβαια από τη σύσταση τους, δηλαδή από τα διάφορα αμινοξέα, τα οποία τις απαρτίζουν, και ειδικότερα, τη συγκεκριμένη αλληλουχία των αμινοξέων που είναι μοναδική για κάθε πρωτεΐνη. Εάν ακόμα και ένα αμινοξύ μιας πρωτεΐνης είναι διαφορετικό απ' αυτό που "ορίζει" η φύση, τότε είναι πολύ πιθανόν, η πρωτεΐνη, να μην εμφανίζει βιολογική δράση. Μια τυπική αλληλουχία αμινοξέων πρωτεΐνης, στην προκειμένη περίπτωση της α 5 -καζεΐνης του αγελαδινού γάλακτος, φαίνεται στο Σχήμα Γ.1. Η αλληλουχία μπορεί να φαίνεται τυχαία, όμως στην πραγματικότητα είναι απόλυτα ελεγχόμενη και αναπαραγόμενη σε κάθε μόριο της πρωτεΐνης, που παράγεται στον οργανισμό της αγελάδας. Σχήμα Γ.1 Αλληλουχία αμινοξέων της α-καζεΐνης αγελαδινού γάλακτος. Κάθε αμινοξύ παρουσιάζεται με τον αντίστοιχο κωδικό του, όπως επεξηγείται στον Πίν. Γ.2. Η αναλογία των διαφόρων αμινοξέων στις πρωτεΐνες των τροφίμων που καταναλώνουμε είναι ένας από τους σημαντικότερους διατροφικούς παράγοντες. Ωστόσο, η ολική ποσότητα των αμινοξέων, που περιέχονται στην τροφή μας, είναι εξίσου σημαντική με την "ποιότητα" τους. Στον Πίνακα Γ.1 54

55 παρουσιάζεται, ενδεικτικά, το πρωτεϊνικό περιεχόμενο (μέσος όρος) μερικών τροφίμων. Όλα τα αμινοξέα, εκτός της προλίνης και της υδροξυπρολίνης (βλ. Πίνακα Γ.2), που εμφανίζονται στις πρωτεΐνες έχουν τον ίδιο γενικό τύπο: 2 N + N 3 ή - R R Το κεντρικό άτομο που φέρει την πλευρική αλυσίδα (R) η οποία και χαρακτηρίζει το κάθε αμινοξύ καθώς και το καρβοξύλιο και την αμινομάδα ονομάζεται "α-άτομο άνθρακα". Εκτός από την περίπτωση της γλυκίνης όπου R=, οι τέσσερεις διαφορετικοί υποκατάστατες του, δημιουργούν κέντρο ασυμμετρίας. Αυτό συνεπάγεται ότι τα αμινοξέα, όπως και τα σάκχαρα, είναι οπτικώς ενεργά. Όλα τα αμινοξέα που ευρίσκονται στις πρωτεΐνες ανήκουν στη L-μορφή, όπως δηλαδή παρουσιάστηκε στον παραπάνω γενικό τύπο (ο τύπος αυτός παρουσιάζει, επίσης, και τον αμφολυτικό χαρακτήρα των αμινοξέων). D-Αμινοξέα υπάρχουν μεν στη φύση, όχι όμως και στις πρωτεΐνες. Βρίσκονται για παράδειγμα στα βακτήρια, ως συστατικά της κυτταρικής μεμβράνης, σε ορισμένα αντιβιοτικά κτλ. Για τη Χημεία Τροφίμων τα ελεύθερα αμινοξέα δεν παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Ωστόσο, έχουν σημασία από τεχνολογική άποψη, δεδομένου ότι συμμετέχουν είτε αυτούσια είτε ως προϊόντα διαφόρων αντιδράσεων στην ανάπτυξη του αρώματος και άλλων οργανοληπτικών χαρακτηριστικών των τροφίμων (όπως π.χ. οι αντιδράσεις Maillard). 55

56 Τρόφιμο Ολική Πρωτεΐνη (%) Τρόφιμο Ολική Πρωτεΐνη (%) Ψωμί άσπρο 8.4 Τόνος (κονσέρβα) 27.5 Ψωμί ολικής αλέσεως 9.2 Πατάτες (φρέσκες) 1.7 Ρύζι 2.6 Πατάτες τσιπς 5.6 Ζυμαρικά 3.6 Φακές (ξηρές) 24.3 Νιφάδες καλαμποκιού 7.9 Καλαμπόκι (κονσέρβα) 2.9 Γάλα αγελαδινό πλήρες 3.2 Λάχανο (ωμό) 1.7 Γάλα ανθρώπινο 1.3 Μανιτάρια (ωμά) 1.8 Τυριά Μήλα (ωμά) 0.4 Γιαούρτι (πλήρες) 5.7 Μπανάνες 1.2 Παγωτό 3.6 Σταφύλια (χωρίς κουκούτσι) Αυγό (ολόκληρο) 12.5 Αμύγδαλα 21.1 Κρέας μοσχαρίσιο (ωμό, άνευ λίπους) Κρέας αρνίσιο (ωμό, άνευ λίπους) Κοτόπουλο (ωμό, άνευ λίπους) 20.3 Φιστίκια (αράπικα / καβουρδισμένα) Μαρμελάδα Σοκολάτα απλή 4.7 Κιμάς μοσχαρίσιος (ωμός) 15.2 Σοκολάτα γάλακτος 8.4 Λουκάνικα χοιρινά (ωμά) 10.6 Μπύρα μαύρη (bitter) 0.3 Μπακαλιάρος (φιλέτο ωμό) 17.4 Μπύρα ξανθιά (lager) 0.2 Πίνακας Γ.1 Πρωτεϊνικό περιεχόμενο μερικών τροφίμων / ποτών Πηγή: Β. olland, A. A. Welch, I.D. Unwm, D.. Buss, A. A. Paul and D. A. T. Southgate "Me ance and Widdowson's the omposition of Foods", The Royal Society of hemistry, ambridge, 1991 Για το λόγο αυτό ορισμένα από τα συνηθέστερα ευρισκόμενα στις πρωτεΐνες L-αμινοξέα παρουσιάζονται στον ακόλουθο Πίνακα Γ.2. 56

57 Ονομασία Συμβολισμός / Κωδικός Ομάδα R: από R 2 N Ασπαργινικό asp / D - 2 Γλουταμινικό glu / E Τυροσίνη tyr / Y Κυστεΐνη cys / - 2 S Ασπαργίνη asn / N - 2 N 2 Γλουταμίνη gln / Q N 2 Σερίνη ser / S - 2 Θρεονίνη* thr / T -() 3 Ιστιδίνη his / 2 N N Λυσίνη* lys / K N 2 Θρυπτοφάνη* try / W 2 N Γλυκίνη* gly / G - Αλανίνη ala / A - 3 Φαινυλαλανίνη* phen / F Βαλίνη* val / V -( 3 ) 2 Λευκίνη* leu / L - 2 ( 3 ) 2 Ισολευκίνη* ile / L -( 3 ) 2 3 Μεθειονίνη* met / M S- 3 Προλίνη pro / P + 2 N * απαραίτητα αμινοξέα Πίνακας Γ.2 Μερικά αμινοξέα πρωτεϊνών (σειρά L) 57

58 ΠΕΙΡΑΜΑ Γ 1 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ (ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ) ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Σκοπός Η διεξαγωγή ορισμένων χρωστικών αντιδράσεων, χαρακτηριστικών των πρωτεϊνών. Από τη Θεωρία στην Πράξη Οι πρωτεΐνες είναι στερεά σώματα κυρίως άμορφα, αν και ορισμένες ευρίσκονται σε κρυσταλλική μορφή. Δεν τήκονται, μηδέ αποστάζονται. Στο νερό, άλλες πρωτεΐνες διαλύονται εύκολα (αλβουμίνες), άλλες είναι δυσδιάλυτες, τουλάχιστον στο ισοηλεκτρικό τους σημείο, όπου διαλυτοποιούνται μόνον κατόπιν προσθήκης αλάτων (γλοβουλίνες), ενώ τέλος άλλες είναι εντελώς αδιάλυτες (κεράτινες). Τα διαλύματα των πρωτεϊνών είναι κολλοειδή, συνήθως άχρωμα, και στρέφουν το επίπεδο του πολωμένου φωτός αριστερά. Οι πρωτεΐνες καθιζάνονται από τα διαλύματα τους. Η καθίζηση αυτή (ονομάζεται και θρόμβωση) των πρωτεϊνών μπορεί να είναι αντιστρεπτή ή μη αντιστρεπτή. Κατά την αντιστρεπτή μεταβολή, οι πρωτεΐνες καθιζάνουν είτε με την προσθήκη ουδετέρων αλάτων (Nal, MgS 4 κτλ) στο ισοηλεκτρικό τους σημείο (εξαλάτωση) είτε με προσθήκη αλκοόλης ή ακετόνης. Μετά την απομάκρυνση όμως του μέσου που προκαλεί τη θρόμβωση, οι πρωτεΐνες επανέρχονται στην αρχική τους κατάσταση (διάλυμα). Κατά τη μη αντιστρεπτή 58

59 μεταβολή, οι πρωτεΐνες παραμένουν οριστικά αδιάλυτες, δεδομένου ότι το φαινόμενο συνοδεύεται από ριζικότερες αλλαγές στο μόριο των πρωτεϊνών. Η μη αντιστρεπτή αυτή καθίζηση ονομάζεται μετουσίωση και επιτυγχάνεται με θέρμανση ή προσθήκη ηλεκτρολυτών (οξέων όπως π.χ. τριχλωροξικού οξέος, αλάτων βαρέων μετάλλων κτλ). Οι αντιδράσεις καθίζησης των πρωτεϊνών χρησιμοποιούνται μαζί με τις χρωστικές για την ανίχνευση των πρωτεϊνών. Όσον αφορά τις χρωστικές αντιδράσεις των πρωτεϊνών, σημειώνεται ότι αυτές οφείλονται στην παρουσία στο μόριο τους ορισμένου αμινοξέος ή ορισμένης χαρακτηριστικής ομάδας. Οι χρωστικές αντιδράσεις, εκτός από την ποιοτική ανάλυση των πρωτεϊνών, χρησιμοποιούνται μερικές φορές και για τον ποσοτικό προσδιορισμό τους. Δεδομένου ότι τα τεστ χρώσης (ανίχνευσης) των πρωτεϊνών στηρίζονται σε αντιδράσεις που χαρακτηρίζουν συγκεκριμένες δομές ομάδες, οι οποίες ευρίσκονται μέσα στο μόριο τους, δεν χαρακτηρίζουν δηλαδή τα πρωτεϊνικά μόρια στο σύνολο τους, είναι προφανές ότι ένα μοναδικό θετικό τεστ δε μπορεί να αποτελεί αδιαμφισβήτητη απόδειξη της παρουσίας πρωτεΐνης. Κατά συνέπεια, προκειμένου να αποδειχθεί η παρουσία πρωτεΐνης, είναι λογικό να πραγματοποιούνται περισσότερα του ενός χρωστικά τεστ. Τα τεστ αυτά πρέπει να επιλέγονται έτσι, που να αντιστοιχούν σε διάφορες χαρακτηριστικές ομάδες των πρωτεϊνών. Μεθοδολογία Για την ανίχνευση των πρωτεϊνών στο Εργαστήριο, πραγματοποιούνται δύο σειρές ελέγχων. Η πρώτη αφορά τη θρόμβωση των πρωτεϊνών και μελετά συγχρόνως την επίδραση ορισμένων παραγόντων (pη, θερμοκρασία, σύσταση θρομβωτικών μέσων) σε αυτή. 59

60 Η δεύτερη σειρά των ανιχνευτικών τεστ περιλαμβάνει τρεις χαρακτηριστικές χρωστικές αντιδράσεις και συγκεκριμένα: Α) Το τεστ διουρίας: Το τεστ αυτό είναι χαρακτηριστικό των ενώσεων που περιέχουν δύο ή περισσότερους πεπτιδικούς δεσμούς. Συνεπώς τα διπεπτίδια (δηλαδή η συνένωση δύο αμινοξέων με έναν πεπτιδικό δεσμό) δε δίνουν τη χαρακτηριστική αυτή αντίδραση. Κατά την αντίδραση των τριπεπτιδίων και γενικά των πολυπεπτιδίων με ισχυρά αλκαλικό διάλυμα θειικού χαλκού σχηματίζεται το σύμπλοκο της διουρίας που έχει τη δομή: R N +2 u N R N N R R Ο σχηματισμός του συμπλόκου αυτού χρωματίζει το διάλυμα κόκκινο ιώδες, με όλες τις αποχρώσεις του (από ροζ μέχρι έντονο μωβ), αναλόγως της περιεκτικότητας του διαλύματος σε πεπτιδικούς δεσμούς, δηλαδή πρωτεΐνες. Η ευαισθησία αυτή του τεστ και η συσχέτιση του χρώματος με την περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη, οδηγεί πολλές φορές στην χρησιμοποίηση του για τον ποσοτικό προσδιορισμό των πρωτεϊνών, με τη βοήθεια βέβαια καμπύλης αναφοράς και φασματοφωτομέτρου (απορρόφηση στα 550 nm). Το τεστ αυτό 60

61 πήρε το όνομά του από τη διουρία 2 NNN 2, η οποία προφανώς δίνει την ίδια αντίδραση. Ωστόσο, επειδή η διουρία δεν απαντάται κανονικά στα τρόφιμα, θετικό αποτέλεσμα της αντίδρασης, υποδηλώνει και την ύπαρξη πρωτεΐνης. Το τεστ χρησιμοποιείται επίσης για την αναγνώριση του τερματισμού της υδρόλυσης των πρωτεϊνών, οπότε καθίσταται προφανώς αρνητικό. Β) Ξανθοπρωτεϊνική αντίδραση: Το τεστ αυτό είναι χαρακτηριστικό των πρωτεϊνικών μορίων, που περιέχουν αμινοξέα με βενζολικό πυρήνα. Όπως γνωρίζουμε (βλ. και Πίνακα Γ.2) τέτοια αμινοξέα είναι η τυροσίνη, η θρυπτοφάνη, και η φαινυλανίνη. Κατά την αντίδραση τους με πυκνό νιτρικό οξύ επέρχεται νίτρωση των αρωματικών πυρήνων και σχηματίζονται ανάλογα πικρικού οξέος (κίτρινο χρώμα). Για παράδειγμα, με τη φαινυλαλανίνη έχουμε: N N 3 3+ N 2 2 N 2 N 2 Όταν επιδράσει πυκνό νιτρικό οξύ στις πρωτεΐνες, αυτές καθιζάνουν και στη συνέχεια αναδιαλύονται δίνοντας στο διάλυμα έναν κίτρινο χρωματισμό, ο οποίος με αλκάλια ή αμμωνία (εξουδετέρωση) μετατρέπεται σε πορτοκαλί. Στη 61

62 δημιουργία ανάλογων ενώσεων οφείλεται και το κίτρινο πορτοκαλί χρώμα, που σχηματίζεται κατά την επαφή νιτρικού οξέος με το δέρμα (τυροσίνη της πρωτεΐνης του δέρματος). Γ) Τεστ νινυδρίνης: Το τεστ αυτό είναι χαρακτηριστικό των ενώσεων που περιέχουν αμινομάδες. Δεν αποτελεί δηλαδή ειδική για τις πρωτεΐνες αντίδραση. Είναι γενική αντίδραση, περιλαμβάνοντας βέβαια τις πρωτεΐνες, αλλά και τα υδρολυτικά τους προϊόντα (πεπτίδια, αμινοξέα κτλ), ακόμα και αμμωνία, τα αμμωνιακά άλατα κτλ. Κατά την αντίδραση των αμινοξέων με νινυδρίνη (υδρίτης του 1, 2, 3 - τρικετο-υδρινδενίου) και θέρμανση του μίγματος μέχρι βρασμού, εμφανίζεται έγχρωμη (μπλε) ένωση, ενώ συγχρόνως σχηματίζεται αλδεϋδη και εκλύεται διοξείδιο του άνθρακα. Από τον κανόνα εξαιρούνται οι αντίστοιχες ενώσεις, που προκύπτουν από την αντίδραση της προλίνης και της υδροξυπρολίνης. Τα αμινοξέα αυτά δίνουν κίτρινα προϊόντα. 2 + R N 2 N + R

63 Εργαστηριακός εξοπλισμός Αντιδραστήρια Α) Τεστ θρομβώσεως αυγά (ασπράδι) 0,1Μ διάλυμα Nal κρεατοσκευάσματα (αλλαντικά) 0,1Μ διάλυμα al ,0Μ διάλυμα σακχαρόζης l 3 (10%) 0,01Μ l απεσταγμένο Η 2 Ο 0,1Μ l Β) Χρωστικές αντιδράσεις διάφορα τρόφιμα (π.χ. αυγό, γάλα, ψωμί, αλεύρι, ζάχαρη, λίπος) διάλυμα Na (2Μ) αραιό διάλυμα us 4 (1%) πυκνό N 3 διάλυμα νινυδρίνης (υδρίτης του 1,2,3 τρικετο υδρινδενίου) δοκιμαστικοί σωλήνες Πορεία εργασίας Α) Τεστ θρομβώσεως 1) Το ασπράδι ενός αυγού (αφού "κτυπηθεί" ελαφρά) αραιώνεται με τριπλάσιο όγκο αποσταγμένου νερού. Το μίγμα αναδεύεται αργά αλλά έντονα και στη συνέχεια διηθείται. 2) Ποσότητες των 10 ml από το διήθημα (αλβουμίνη) φέρονται σε 9 διαφορετικούς δοκιμαστικούς σωλήνες. Σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα προστίθενται εναλλάξ, 5 ml από το καθένα από τα παραπάνω αντιδραστήρια, που έχουν επισημανθεί με αστερίσκο στο τμήμα "Εργαστηριακός εξοπλισμός 63

64 Αντιδραστήρια". 3) Μετράται το pη του δοκιμαστικού σωλήνα όπου έχει προστεθεί το αποσταγμένο νερό, και επίσης αυτών που περιέχουν το 0,01Μ l και το 0,1Μ l. 4) Όλοι οι δοκιμαστικοί σωλήνες τοποθετούνται σε δοχείο με νερό, το δοχείο θερμαίνεται βαθμιαία, και σημειώνεται η θερμοκρασία κατά την οποία εμφανίζεται χαρακτηριστική γυαλάδα (οπάλιου λίθου). Β) Χρωστικές αντιδράσεις 1) Μικρές ποσότητες από τα υπό εξέταση τρόφιμα πολτοποιούνται και αναμιγνύονται καλά με λίγα ml ύδατος. Στη συνέχεια τα μίγματα αραιώνονται, πάλι με νερό, και δημιουργούνται έτσι τα αντίστοιχα αιωρήματα. Ποσότητες περίπου 5 ml από το παραπάνω αιώρημα κάθε τροφίμου φέρονται σε δοκιμαστικούς σωλήνες, προς πραγματοποίηση των 3 χρωστικών τεστ. Για κάθε χρωστικό τεστ εκτελείται και λευκός (τυφλός) προσδιορισμός για σύγκριση χρώματος. 2) Τεστ διουρίας: Στους δοκιμαστικούς σωλήνες που περιέχουν το υπό εξέταση αιώρημα, προστίθενται 2 ml διαλύματος, 2Μ ΝaΟΗ και 2 3 σταγόνες 1% διαλύματος usο 4. Διαβαθμίσεις του ιώδους χρώματος (ροζ μωβ), υποδηλώνουν την ύπαρξη ενώσεων με 2 ή περισσότερους πεπτιδικούς δεσμούς. 3) Ξανθοπρωτεϊνική αντίδραση: Στους δοκιμαστικούς σωλήνες που περιέχουν το υπό εξέταση αιώρημα, προστίθενται περίπου 2 ml π. ΗΝ 3. Σε περίπτωση ύπαρξης αμινοξέος με βενζολικό πυρήνα (θρυπτοφάνη, τυροσίνη, φαινυλαλανίνη), εμφανίζεται αμέσως κίτρινο χρώμα. Ακολουθεί εξουδετέρωση του όξινου διαλύματος με πυκνό διάλυμα Na, οπότε ο χρωματισμός 64

65 μεταβάλλεται από κίτρινο σε πορτοκαλί. 4) Τεστ νινυδρίνης: Στους δοκιμαστικούς σωλήνες που περιέχουν το υπό εξέταση αιώρημα, προστίθενται περίπου 2 ml νινυδρίνης. Το μίγμα θερμαίνεται μέχρι βρασμού σε υδατόλουτρο. Μετά την ψύξη και εφόσον το τρόφιμο περιέχει τουλάχιστον μια ελεύθερη αμινομάδα και μια ελεύθερη καρβοξυλομάδα, εμφανίζεται κυανός (λιλά) χρωματισμός, εκτός από την περίπτωση ύπαρξης προλίνης ή υδροξυπρολίνης, οι οποίες δίνουν κίτρινα προϊόντα. 65

66 ΠΕΙΡΑΜΑ Γ 2 ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕ ΟΓΚΟΜΕΤΡΗΣΗ Σκοπός Υπολογισμός πρωτεϊνικού περιεχομένου διαφόρων τροφίμων. Από τη Θεωρία στην Πράξη Παρόλο που για τον ποσοτικό προσδιορισμό των πρωτεϊνών στα τρόφιμα ακολουθείται κατά κανόνα η μέθοδος Kjeldahl (στηρίζεται στη μετατροπή οργανικού αζώτου σε αμμωνία), συχνά και μόνο για ορισμένες τροφές, όπως για παράδειγμα το γάλα, είναι δυνατόν να εφαρμόσουμε μία απλούστερη μέθοδο. Με τη μέθοδο αυτή μπορούμε να υπολογίσουμε γρήγορα και χωρίς την ανάγκη ειδικών συσκευών (Kjeldahl) την περιεκτικότητα του τροφίμου σε πρωτεΐνες, με ογκομέτρηση με φορμαλδεΰδη (φορμόλη). Γνωρίζουμε ότι οι πρωτεΐνες, παρόλο που μπορεί να συμπεριφερθούν ως οξέα, δεν εμφανίζουν ισχυρά όξινο χαρακτήρα ώστε να γίνει υπολογισμός τους με απευθείας ογκομέτρηση με ισχυρή βάση (άλκαλι). Ωστόσο, εάν προηγουμένως προστεθεί φορμαλδεΰδη (φορμόλη) τότε, καθώς γνωρίζουμε από την Οργανική Χημεία, προκύπτουν οι λεγόμενες βάσεις του Schiff, οι οποίες χρησιμοποιούνται κατά κανόνα για την προστασία της αμινικής ομάδας. Η φορμαλδεΰδη αντιδρά με τις αμινομάδες των πρωτεϊνών τις οποίες και δεσμεύει 66

67 με το σχηματισμό μεθυλενο-αμινο-ομάδων (βλ. αντίδραση στη μεθοδολογία του πειράματος). Με τον τρόπο αυτό, η καρβοξυλομάδα "αποδεσμεύεται" και εξουδετερώνεται ευκολότερα με π.χ. καυστικό νάτριο. Μεθοδολογία Δεδομένου ότι οι συγκεντρώσεις των ιόντων υδρογόνου και γενικά η αμφολυτική συμπεριφορά των αμινοξέων είναι ιδιαίτερα κρίσιμοι παράγοντες για την εξέλιξη των αντιδράσεων που λαμβάνουν χώρα κατά τον προσδιορισμό, καταβάλλεται κάθε δυνατή προσπάθεια για τη χρήση ουδέτερων αντιδραστηρίων. Έτσι, τόσο το τρόφιμο (στην προκειμένη περίπτωση το γάλα), όσον και η φορμόλη (40% διάλυμα φορμαλδεΰδης) εξουδετερώνονται προηγουμένως με 0,1Μ Na και δείκτη φαινολοφθαλεΐνη. Πρόνοια λαμβάνεται επίσης και για την απομάκρυνση διαφόρων παρεμποδιστικών ουσιών. Στην περίπτωση του γάλατος, τα διαλυμένα άλατα του ασβεστίου που θα παρεμπόδιζαν την αντίδραση, απομακρύνονται με την προσθήκη κορεσμένου διαλύματος οξαλικού καλίου ή αμμωνίου. Με τον τρόπο αυτό, τα ιόντα του a ++ καταβυθίζονται ως οξαλικό ασβέστιο. Σύμφωνα με τα παραπάνω οι κύριες αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα κατά τον συγκεκριμένο προσδιορισμό (γάλα) είναι οι εξής: 67

68 K K a ++ + a + 2K + R R N 2 + N Ουδέτερο όξινη (βάση του Schiff) R R N 2 + Na Na N Το πρωτεϊνικό περιεχόμενο του γάλατος υπολογίζεται από τον τύπο: % πρωτεΐνη = συντελεστής αλδεΰδης x 0,17 όπου ο συντελεστής αλδεΰδης ισούται με τον αριθμό των ml του 0,1Μ διαλύματος Na, που απαιτούνται ανά 100 ml γάλατος, προκειμένου να εξουδετερώσουν την οξύτητα, που προέκυψε από την αντίδραση με τη φορμαλδεΰδη. Εργαστηριακός Εξοπλισμός Αντιδραστήρια προχοΐδες σιφώνια κωνικές φιάλες κορεσμένο διάλυμα οξαλικού καλίου φαινολοφθαλεΐνη διάλυμα φορμαλδεΰδης 40% (φορμόλη) 0,1Μ ΝaΟΗ Πορεία εργασίας 1) 10,0 ml από το προς εξέταση δείγμα του γάλατος φέρονται με σιφώνιο σε κωνική φιάλη, στην οποία προστίθεται 1,0 ml φαινολοφθαλεΐνης και 0,4 ml κορεσμένου διαλύματος οξαλικού καλίου. Το οξαλικό κάλιο αφήνεται να 68

69 δράσει για 2 3 min και, στη συνέχεια, το μίγμα εξουδετερώνεται με τη βοήθεια 0,1Μ Na, (που έχει τοποθετηθεί σε προχοΐδα), μέχρις ελαφρού (ροζ) χρωματισμού του δείκτη. 2) Το διάλυμα της φορμαλδεΰδης (40%) εξουδετερώνεται, επίσης με 0,1Μ ΝaΟ και δείκτη φαινολοφθαλεΐνη. 2 ml του ουδέτερου αυτού διαλύματος προστίθενται στην κωνική φιάλη που περιέχει το μίγμα του γάλατος κτλ, που προέκυψε κατά την προηγούμενη κατεργασία. 3) Το συνολικό περιεχόμενο της κωνικής φιάλης ογκομετρείται μέχρις ότου ληφθεί ανάλογος χρωματισμός με αυτόν που προέκυψε κατά την εξουδετέρωση του 1 ου σταδίου (γάλατος). Σημειώνονται τα ml του 0,1Μ διαλύματος Na, που καταναλώθηκαν κατά τη β ογκομέτρηση μόνον. 4) Υπολογίζεται η % περιεκτικότητα του γάλατος σε πρωτεΐνες. 69

70 ΠΕΙΡΑΜΑ Γ 3 ΜΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΜΑΥΡΩΣΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΙΙ: ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ MAILLARD Σκοπός Η εξέταση του μη ενζυμικού μαυρίσματος (ή καφετιάσματος) των τροφίμων, που προκύπτει από την αντίδραση καρβονυλικών ενώσεων των τροφίμων (π.χ. σάκχαρα) με αμινομάδες (π.χ. αμινοξέα πρωτεΐνες), καθώς και των παραγόντων που επηρεάζουν τις σχετικές αντιδράσεις. Από τη Θεωρία στην Πράξη Καθώς αναφέρθηκε στην προηγούμενη ενότητα εκτός από το μαύρισμα των τροφίμων που δημιουργείται κατά την καραμελοποίηση των σακχάρων, υπάρχει και η περίπτωση του μη ενζυμικού μαυρίσματος που οφείλεται σε σειρά αντιδράσεων οι οποίες λαμβάνουν χώρα μεταξύ των αμινο-ενώσεων και των αναγόντων σακχάρων. Καθώς είναι φυσικό, πολλά τρόφιμα που περιέχουν και τις δύο κατηγορίες ενώσεων, υφίστανται τα αποτελέσματα των αντιδράσεων αυτών (αντιδράσεις Maillard), ιδιαίτερα όταν επεξεργάζονται θερμικά. Τα αποτελέσματα των αντιδράσεων Maillard είναι άλλοτε επιθυμητά και άλλοτε ανεπιθύμητα. Επιβάλλεται, κατά συνέπεια, η προσεκτική μελέτη, όλων των παραγόντων που τις επηρεάζουν. Σχετικά χαμηλό ποσοστό υγρασίας του μίγματος, για παράδειγμα, αυξάνει τη συγκέντρωση των αντιδρώντων και 70

71 ευνοεί την αντίδραση Maillard. Έτσι, δημιουργείται το χαρακτηριστικό και επιθυμητό χρώμα και άρωμα της κόρας του ψωμιού, και διαφόρων ειδών ζαχαροπλαστικής (κέικς κτλ), του καβουρδισμένου καφέ ή ξηρών καρπών, αλλά και των ψημένων και γενικά μαγειρεμένων (τηγανιτών κτλ) φαγητών (π.χ. ψητό κρέας). Ωστόσο, το καφέτιασμα, που παρατηρείται μερικές φορές κατά την παραγωγή σκόνης γάλατος και αυγού ή αφυδατωμένων λαχανικών, καθώς και το μαύρισμα των τσιπς πατάτας είναι ανεπιθύμητα και καταβάλλεται προσπάθεια (κατά την παραγωγή τους) για παρεμπόδιση της αντίδρασης Maillard. Οι αμινομάδες που συμμετέχουν συνήθως στην αντίδραση Maillard είναι αυτές τις λυσίνης και της ιστιδίνης, αν και η α-αμινομάδα οποιουδήποτε ελεύθερου αμινοξέος μπορεί εξίσου να λάβει μέρος. Από το Σχήμα Γ.3.1 φαίνεται ότι κατά την αντίδραση Maillard, όπως και κατά την καραμελοποίηση, σχηματίζεται υδροξυμεθυλοφουρφουράλη (MF). Σχηματίζονται όμως και οι ονομαζόμενες ενώσεις Amadori (N-υποκατεστημένες 1-αμινο-1-διοξυ-2- κετόζες), από τις οποίες προκύπτουν στη συνέχεια διάφορες δικαρβονυλικές ενώσεις. 71

72 RN 2 N R N R 2 N R Ένωση Amadori RN 2 2 N R MF δεσοξυοζόνη 2 2,3-ενοδιόλη RN Σχήμα Γ.3.1. Σχηματισμός MF και δικαρβονυλίων κατά την αντίδραση Maillard. Από την κυκλοποίηση των δικαρβονυλικών αυτών ενώσεων προκύπτουν πολλές ενώσεις στις οποίες οφείλεται το χαρακτηριστικό άρωμα πολλών ειδών 72

73 ζαχαροπλαστικής και μαγειρεμένων τροφίμων. Ακόμη, οι δικαρβονυλικές αυτές ενώσεις διασπώμενες, δίνουν αρωματικές ενώσεις, όπως για παράδειγμα το διακετύλιο (Σχήμα Γ.3.2). Ωστόσο, η σημαντικότερη αντίδραση που παρέχουν κατά τη μη ενζυμική αμαύρωση οι α-δικαρβονυλικές ενώσεις είναι αυτή που πραγματοποείται με τα α-αμινοξέα, σε υψηλές θερμοκρασίες, και είναι γνωστή ως αποικοδόμηση Strecker. Αποτέλεσμα αυτής της αποικοδόμησης είναι η δημιουργία τόσο ορισμένων αλδεϋδών (π.χ. ισοβουτυλική αλδεΰδη ή μεθυλοπροπανάλη), όσο και διαφόρων παραγώγων της πυραζίνης, που προκύπτει από το διμερισμό των ενδιάμεσα σχηματιζόμενων αμινο-καρβονυλικών ενώσεων (π.χ. 3-αμινο-2-βουτανόνη). Και τα δύο αυτά προϊόντα (αλδεΰδες και πυραζίνες) συμμετέχουν σε μεγάλο ποσοστό στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των φαγητών, γλυκισμάτων φούρνου κτλ. Ωστόσο, μερικά από τα ενδιάμεσα ή τα τελικά προϊόντα της αποικοδόμησης Strecker, ιδιαίτερα αυτά που οδηγούν στο σχηματισμό των σκουρόχρωμων και οσμηρών μελανοϊδινών (αζωτούχα προϊόντα πολυμερισμού και συμπύκνωσης των παραπάνω ενώσεων, περιέχοντα στο μόριό τους δακτυλίους πυραζίνης και ιμιδαζολίου), είναι γενικά ανεπιθύμητα, όχι τόσο από οργανοληπτική, όσο από υγιεινή / τοξικολογική άποψη (ερευνάται η μεταλλαξιγόνος δράση τους, καθώς και η συμμετοχή τους στο σχηματισμό νιτροζαμινών). 73

74 3 + 2 N 3 3 _ 2 3 N N _ 2 3 N N 3 + 1/2 2 3 N 3 N 2 3 Σχήμα Γ.3.2. _ N N 3 Η αποικοδόμηση Strecker μεταξύ διακετυλίου και βαλίνης Στο σημείο αυτό πρέπει να τονιστεί ότι η αντίδραση Maillard, από διατροφική άποψη, παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Ήδη αναφέρθηκε ο σχηματισμός, από διάφορα ενδιάμεσα προϊόντα των επιμέρους αντιδράσεων που λαμβάνουν χώρα, μεταλλαξιγόνων (ή μεταλλαξιογόνων δηλ. ενώσεων που προκαλούν μεταλλάξεις στα κύτταρα)) και, συνεπώς, πιθανά καρκινογόνων ουσιών. Παλαιότερα γινόταν χρήση, για παράδειγμα, μιας μεθόδου επιτάχυνσης του καφετιάσματος των προϊόντων που χρησιμοποιούνταν στην παρασκευή αντίστοιχων χρωμάτων για τα τρόφιμα. Ως "επιταχυντής" προσθέτονταν στα 74

75 υπόλοιπα αντιδρώντα σώματα (σάκχαρα) αμμωνία (αμινο-ένωση). Μετά την υποψία για καρκινογόνα προϊόντα όμως, η μέθοδος αποσύρθηκε. Ένα άλλο διατροφικό πρόβλημα, που προκύπτει από τις αντιδράσεις Maillard είναι αυτό το οποίο σχετίζεται με τη μείωση της θρεπτικής αξίας των τροφίμων, που υφίστανται την αντίδραση. Όταν ένα αμινοξύ ή τμήμα μιας πρωτεΐνης αντιδρά σύμφωνα με την αντίδραση Maillard, είναι προφανές ότι το αμινοξύ αυτό, από διατροφική άποψη, "χάνεται". Η απώλεια αυτή γίνεται ιδιαίτερα κρίσιμη, όταν το ή τα αμινοξέα που απομακρύνονται έτσι από τις τροφές μας, ανήκουν στα απαραίτητα αμινοξέα. Ένα από αυτά και μάλιστα πολύ δραστικό κατά τις αντιδράσεις με τα ανάγοντα σάκχαρα των τροφίμων, λόγω της ακραίας ελεύθερης αμινομάδας, είναι η λυσίνη. Εύκολα όμως αντιδρούν και άλλα αμινοξέα, ιδιαίτερα δε όσα εμφανίζουν βασικό χαρακτήρα, όπως η αργινίνη, η ιστιδίνη και η θρυπτοφάνη. Τα βασικά αμινοξέα είναι περισσότερο "ευπρόσβλητα" από τα υπόλοιπα, λόγω της παρουσίας του περισσότερου βασικού ατόμου του αζώτου, στην πλευρική αλυσίδα. Πρέπει ωστόσο να σημειωθεί ότι δεν χρειάζεται να εντοπίσουμε τους καφέ / μαύρους χρωματισμούς των μελανοϊδινών για να θεωρήσουμε ότι υπάρχει μείωση της θρεπτικής αξίας των τροφίμων. Όπως παρουσιάστηκε προηγουμένως (βλ. και Σχήματα Γ.3.1 και Γ.3.2), ήδη από τα πρώτα βήματα της αντίδρασης Maillard και της αποικοδόμησης Strecker, έχουμε "δέσμευση" των αντίστοιχων αμινομάδων (αμινοξέων). Η εξέλιξη της αντίδρασης Maillard και ο σχηματισμός των ανάλογων προϊόντων είναι μια διεργασία μάλλον φυσική και σχετικά εύκολη, εφόσον βέβαια συνυπάρχουν οι απαραίτητες ουσίες. Ωστόσο, η έκταση που αυτή θα λάβει χώρα και, ακόμα περισσότερο, ο έλεγχος ή η πλήρης αναστολή της, 75

76 απαιτούν την προσεκτική παρέμβαση του τεχνολόγου τροφίμων, με τη βοήθεια πάντοτε των διαφόρων "παρεμποδιστικών" παραγόντων. Ο έλεγχος της αμαύρωσης Maillard, σύμφωνα με τα παραπάνω επιβάλλεται για τρεις, κυρίως, λόγους: οργανοληπτικό (παρεμπόδιση της εμφάνισης ανεπιθύμητων χρωμάτων και οσμών / γεύσεων) διατροφικό (μη δέσμευση απαραίτητων αμινοξέων τοξικολογικό (αποφυγή δημιουργίας πιθανών μεταλαξιγόνων ουσιών) Την αντίδραση Maillard επηρεάζουν: η θερμοκρασία: μείωση της θερμοκρασίας προκαλεί αναστολή το ποσοστό ύδατος / υγρασίας: στα υγρά τρόφιμα, η μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε νερό (αραίωση) ελαττώνει τη συγκέντρωση των αντιδρώντων σωμάτων, άρα και την ταχύτητα της αντίδρασης. Στα στερεά όμως τρόφιμα, εάν λείπει παντελώς το νερό, τότε δεν υπάρχει περίπτωση διαλυτοποίησης / επαφής των μορίων των αντιδρώντων σωμάτων, άρα και έναρξης της αντίδρασης. Εάν όμως υπάρχει σχετική υγρασία τότε, για να παρεμποδιστεί η αντίδραση Maillard, η υγρασία του τροφίμου ή καλύτερα η ενεργότητα του ύδατος (α w ), θα πρέπει να βρίσκεται έξω από 2 κρίσιμα όρια. Υψηλότερη (από το ανώτερο όριο) υγρασία ελαττώνει τη συγκέντρωση των αντιδρώντων ενώ χαμηλότερη (από το κατώτερο όριο) δυσχεραίνει την απαιτούμενη επαφή των αντιδρώντων μορίων (διαλυτοποίηση). Γενικά η ταχύτητα της αντίδρασης Maillard είναι μεγαλύτερη όταν α w 0,8. το p: μείωση του p (δηλαδή προσθήκη οξέων, π.χ. κιτρικού οξέος) οδηγεί σε πρωτονίωση των ελεύθερων αμινομάδων, που κανονικά θα συμμετείχαν στην αντίδραση και κατ αυτόν τον τρόπο, παρεμποδίζεται η 76

77 πυρηνόφιλη αντίδραση. Προφανώς, η προσθήκη βάσεων ευνοεί την αντίδραση. η διαθεσιμότητα των αντιδρώντων: Η αντίδραση Maillard μπορεί προφανώς να περιοριστεί ή και να ανασταλεί, εφόσον δεσμεύεται ή απομακρύνεται μία από τις αντιδρούσες ουσίες, συνήθως δε, το σάκχαρο. Η παρεμπόδιση αυτή μπορεί να γίνει είτε ενζυμικά (καταστροφή της δραστικής ομάδας του σακχάρου) είτε χημικά (δέσμευση καρβονυλομάδας σακχάρου). Κατά την παρασκευή, π.χ. σκόνης αυγών, πριν από την ξήρανσή τους, προστίθεται οξειδάση γλυκόζης. Το ένζυμο οξειδώνει τη γλυκόζη προς γλυκονικό οξύ το οποίο, βέβαια, δεν αντιδρά με τα αμινοξέα κατά το πρότυπο Maillard. Επίσης, το μαύρισμα στα ψάρια μπορεί να περιοριστεί με την προσθήκη Lactobacillus pentoaceticum, βακτηρίου με οξειδωτική δράση προς τη ριβόζη (οξειδάση ριβόζης). Η περισσότερο κοινή όμως μέθοδος παρεμπόδισης της αντίδρασης Maillard είναι αυτή που γίνεται κυρίως με χημικά μέσα και ειδικότερα τα όξινα θειώδη άλατα, το διοξείδιο του θείου ή τα μεταδιθειώδη άλατα, τα οποία όμως μετατρέπονται σε όξινα θειώδη, σύμφωνα με την αντίδραση: Na 2 S NaS 3 Ωστόσο, αρκετά συχνά, ανάλογα με τα τρόφιμα χρησιμοποιούνται επίσης ως χημικοί παρεμποδιστές και άλατα του ασβεστίου. Τα τελευταία σχηματίζουν σύμπλοκα με τα αμινοξέα, δρουν δηλαδή στη δεύτερη κατηγορία των αντιδρώντων σωμάτων και όχι στα σάκχαρα. Η παρεμπόδιση της αντίδρασης Maillard που πραγματοποιείται με την προσθήκη όξινων θειωδών αλάτων, εξηγείται με την αντίδρασή τους με την καρβονυλομάδα των σακχάρων και κατά συνέπεια, τη δέσμευση 77

78 απομάκρυνση των τελευταίων από το περιβάλλον της αντίδρασης (Σχήμα Γ.3.3). S 3 Na + NaS Σχήμα Γ.3.3. Πιθανός μηχανισμός παρεμπόδισης του μη ενζυμικού καφετιάσματος γλυκόζης με όξινα θειώδη άλατα. Μεθοδολογία Για τη μελέτη της αντίδρασης Maillard στο εργαστήριο, πραγματοποιούνται δύο σειρές πειραμάτων. Α) Κατά την πρώτη σειρά πειραμάτων παρασκευάζονται διάφορα συστήματα αμινοξέων / γλυκόζης, αμινοξέων / φρουκτόζης και αξιολογείται το παραγόμενο άρωμα και το χρώμα των θερμαινόμενων διαλυμάτων. Οι αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα έχουν ήδη περιγραφεί προηγουμένως. Β) Κατά τη δεύτερη σειρά πειραμάτων μελετάται (με τη βοήθεια κυρίως του αναπτυσσόμενου χρώματος) η επίδραση που έχουν στην εξέλιξη της αντίδρασης: i) το όξινο ή αλκαλικό περιβάλλον της αντίδρασης: σε 3 σωλήνες που περιέχουν ίσον όγκο του πρότυπου συστήματος γλυκόζης / γλυκίνης 78

79 προστίθεται στο μεν α l 1N, στο β Na 1N και στο γ απεσταγμένο νερό. Τα διαλύματα θερμαίνονται συγχρόνως σε υδατόλουτρο και παρατηρούνται οι μεταβολές (χρώμα, ένταση χρώματος) ii) το ποσοστό ύδατος (συγκέντρωση αντιδρώντων) και η ύπαρξη παρεμποδιστών (NaS 3 ): σε 3 δοκιμαστικούς σωλήνες φέρονται ίσες ποσότητες από πρότυπο σύστημα γλυκόζης / γλυκίνης. Στον α προστίθεται επιπλέον ίσος όγκος ύδατος, στο β διάλυμα NaS 3, ενώ ο γ παραμένει ως έχει. Ακολουθεί θέρμανση των 3 διαλυμάτων για ίσο χρονικό διάστημα (και στην ίδια θερμοκρασία σε υδατόλουτρο) και καταγραφή των αποτελεσμάτων (χρώμα-ένταση) iii) η φύση-δομή των σακχάρων (ανάγον / μη ανάγον σάκχαρο): κατά το πείραμα αυτό τηγανίζονται 3 ομάδες δειγμάτων από πατάτες, οι οποίες έχουν προηγουμένως ζεματισθεί σε ζεστό νερό, για αδρανοποίηση του ενζύμου φαινολάση. Η φαινολάση, όπως θα εξηγηθεί στην περίπτωση του ενζυμικού μαυρίσματος (βλ. αντίστοιχο πείραμα), είναι και αυτή υπεύθυνη για το καφέτιασμα της πατάτας που παρατηρείται κατά την αποφλοίωση ή τον τεμαχισμό της. Μετά το ζεμάτισμα οι πατάτες παραμένουν για 1 h εμβαπτισμένες σε: νερό (α ομάδα δειγμάτων) διάλυμα γλυκόζης (β ομάδα δειγμάτων) διάλυμα σακχαρόζης (γ ομάδα δειγμάτων) Ακολουθεί τηγάνισμα σε λάδι, κάτω από τις ίδιες πάντοτε συνθήκες και εξέταση των διαφορών στο χρώμα / ένταση χρώματος κάθε ομάδας. 79

80 Εργαστηριακός εξοπλισμός Αντιδραστήρια δοκιμαστικοί σωλήνες γλυκόζη φρουκτόζη σακχαρόζη (ζάχαρη) γλυκίνη ασπαραγινικό οξύ καζεΐνη λυσίνη λευκίνη μεθειονίνη τυροσίνη φαινυλανανίνη l 1N Na 1N NaS 3 (διάλυμα 10% β/ο) πατάτες ελαιόλαδο ή σπορέλαιο (για το τηγάνισμα) Πορεία εργασίας Άσκηση Α (αξιολόγηση χρώματος-αρώματος διαφόρων προτύπων συστημάτων): 1) Σε 8 δοκιμαστικούς σωλήνες φέρονται από 50 mg γλυκόζης. Σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα προστίθενται 50 mg από το καθένα από τα παραπάνω 8 αμινοξέα, καθώς επίσης και από 0,5 ml απεσταγμένο νερό. Τα μίγματα αναμιγνύονται πολύ καλά. Η ίδια διαδικασία επαναλαμβάνεται και με τη φρουκτόζη (επίσης 50 mg). 2) Σημειώνεται η οσμή και το χρώμα κάθε μίγματος και αφού οι δοκιμαστικοί σωλήνες καλυφθούν (στο στόμιό τους) με τεμάχιο φύλλου αλουμινίου, τοποθετούνται σε υδατόλουτρο (100º), επί 45 min. Για καλύτερα αποτελέσματα, μπορούμε να θερμάνουμε τους δοκιμαστικούς σωλήνες σε λουτρό σιλικόνης ή παραφίνης. Αυτό προτείνεται γιατί ορισμένα συστήματα 80

81 σακχάρου / αμινοξέος (π.χ. γλυκόζη / γλυκίνη ή γλυκόζη / τυροσίνη), προκειμένου να δώσουν έντονα τα χαρακτηριστικά αποτελέσματα της αντίδρασης Maillard, απαιτούν υψηλότερες των 100º θερμοκρασίες (120º 150º). Ωστόσο, στην περίπτωση χρησιμοποίησης λουτρού παραφίνης ή σιλικόνης, η θερμοκρασία πρέπει να ελέγχεται συνεχώς και οπωσδήποτε να μην υπερβαίνει τους 160º (επικίνδυνοι ατμοί-κίνδυνος ανάφλεξης). 3) Μετά την ομοιόμορφη θέρμανση όλων των δοκιμαστικών σωλήνων, αυτοί ψύχονται σε ψυχρό υδατόλουτρο και καταγράφεται (σε Πίνακα) το άρωμα και το χρώμα κάθε μίγματος. Για το άρωμα δηλώνεται εάν υπάρχει ευχάριστη ή δυσάρεστη οσμή και σημειώνεται η περίπτωση κατά την οποία το προϊόν της αντίδρασης Maillard θυμίζει το χαρακτηριστικό άρωμα κάποιου τροφίμου (π.χ. σοκολάτας, πατάτας, ποπκόρν κτλ). Όσον αφορά το χρώμα, το κάθε προϊόν (σύστημα σάκχαρο / αμινοξύ) χαρακτηρίζεται με έναν βαθμό της κλίμακας 0 3, όπου 0 = κανένας χρωματισμός, 1 = ανοικτό κίτρινο, 2 = βαθύ κίτρινο, 3 = καφέ. Η βαθμολογία του χρώματος του κάθε μίγματος καταγράφεται και αυτή στον ίδιο Πίνακα (3 στήλες: μίγμα-άρωμα-χρώμα). Άσκηση Β (παράγοντες που επηρεάζουν την αντίδραση Maillard) 1) Παρασκευάζονται 50 ml διαλύματος 1Μ γλυκόζης (ΜΒ=180) και 50 ml 1Μ γλυκίνης (ΜΒ=75). Τα δύο διαλύματα ενώνονται σε ένα και αποτελούν το πρότυπο σύστημα για τη διερεύνηση των επιταχυντών και των παρεμποδιστών της αντίδρασης Maillard. 2) 3 ml από το παραπάνω διάλυμα του συστήματος γλυκόζη / γλυκίνη φέρονται σε 5 δοκιμαστικούς σωλήνες και ακολούθως προστίθενται: στον α δοκ. σωλ. 0,5 ml l 1N στον β δοκ. σωλ. 0,5 ml Na 1N 81

82 ο γ δοκ. σωλ. παραμένει χωρίς άλλη προσθήκη στον δ δοκ. σωλ. 3 ml 2 στον ε δοκ. σωλ. 3 ml διαλύματος 10% NaS 3 Οι 5 δοκιμαστικοί σωλήνες με το περιεχόμενό τους παραμένουν σε υδατόλουτρο που βράζει, επί 60 min (καλυμμένοι με φύλλο αλουμινίου). 3) Οι παρατηρούμενες αλλαγές στο χρώμα και την έντασή του, καθώς και ο χρόνος που αυτές γίνονται αντιληπτές (από την έναρξη της θέρμανσης), καταγράφονται σε Πίνακα, όπως στην προηγούμενη Άσκηση Α, και αιτιολογούνται. 4) Πατάτα κόβεται σε τεμάχια 3 διαφορετικών σχημάτων (στρογγυλές, τριγωνικές, τετράγωνες). Τα τεμάχια της πατάτας εμβαπτίζονται σε νερό, που βράζει για 1 λεπτό. 5) Στη συνέχεια, επί 60 min και στη θερμοκρασία περιβάλλοντος η α ομάδα εμβαπτίζεται σε Η 2 Ο η β ομάδα εμβαπτίζεται σε 3% διάλυμα γλυκόζης η γ ομάδα εμβαπτίζεται σε 3% διάλυμα ζάχαρης 6) Όλες οι ομάδες της πατάτας τηγανίζονται συγχρόνως σε σπορέλαιο ή ελαιόλαδο. 7) Παρατηρούνται οι μεταβολές στο χρώμα κάθε ομάδας και οι διαβαθμίσεις του χρώματος καταγράφονται σε Πίνακα (όπως προηγουμένως). Αιτιολογούνται τα αποτελέσματα. 82

83 ΠΕΙΡΑΜΑ Γ 4 ΖΕΛΑΤΙΝΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Σκοπός Με το πείραμα αυτό εξετάζονται, αφενός η διεργασία της ζελατινοποίησης των πρωτεϊνών καθώς και των παραγόντων που την επηρεάζουν, και αφετέρου η ενζυμική υδρόλυση των πρωτεϊνών. Από τη Θεωρία στην Πράξη Ζελατινοποίηση είναι ως γνωστόν η διαδικασία μετατροπής μιας ουσίας και συνήθως πολυσακχαρίτη ή πρωτεΐνης, σε ένα κολλοειδές σύστημα που ονομάζεται πηκτή (ζελέ gel). Κατ αυτή, μόρια υγρών (π.χ. νερού) εγκλωβίζονται μεταξύ των μακρομορίων των πηκτωματογόνων ουσιών. Υπενθυμίζεται ότι από τους υδατάνθρακες, οι διάφορες πηκτίνες και το άμυλο χρησιμοποιούνται κατά κόρον στην τεχνολογία τροφίμων για παρασκευή πηκτών. Ωστόσο, ακόμη μεγαλύτερη εφαρμογή βρίσκουν οι πηκτές οι οποίες παρασκευάζονται από διάφορες πρωτεΐνες και συνήθως τη ζελατίνη, πρωτεΐνη που παράγεται από το κολλαγόνο. Το τελευταίο, βρίσκεται κυρίως στους συνδετικούς ιστούς (δέρμα οστά χόνδροι) των ζώων. Όλες σχεδόν, οι παραπάνω πηκτωματογόνες ουσίες χρησιμοποιούνται επίσης και ως γαλακτωματοποιητές ή και σταθεροποιητές των γαλακτωμάτων (π.χ. παγωτά). Στην παρούσα Ενότητα (Πείραμα Γ 4 ) θα εξετάσουμε, προφανώς, τις πηκτές των πρωτεϊνών (ζελατίνης). 83

84 Το ιξώδες ενός λύματος * πρωτεΐνης, και συγκεκριμένα της ζελατίνης, επηρεάζεται από διάφορους παράγοντες όπως είναι το μέγεθος και το σχήμα των μορίων (μοριακή δομή), η θερμοκρασία, ο βαθμός ενυδάτωσης της πρωτεΐνης, η συγκέντρωση και το p. Κατά κανόνα, όταν οι συγκεντρώσεις των ιόντων υδρογόνου ή υδροξυλίου (δηλαδή το p) απομακρύνονται από το ισοηλεκτρικό σημείο της πρωτεΐνης, οι ιονισμένες ομάδες της (αμινομάδες ή καρβοξυλομάδες) εμφανίζουν μεγαλύτερη τάση δημιουργίας δεσμών υδρογόνου με το νερό. Κατά συνέπεια, η προσρόφηση νερού (ενυδάτωση της πρωτεΐνης) αυξάνεται όσο το p απομακρύνεται από το ισοηλεκτρικό σημείο, στο οποίο, προφανώς, το ιξώδες παρουσιάζει την ελάχιστη τιμή (αυξάνεται ο όγκος των ενυδατωμένων πλέον μορίων). Η αύξηση αυτή που παρατηρείται στην ενυδάτωση και στο ιξώδες της πρωτεΐνης, με την απομάκρυνση του p από το ισοηλεκτρικό σημείο, φθάνει σε ορισμένα μέγιστα. Πέραν αυτών των τιμών του p, το ιξώδες μειώνεται, λόγω του ότι αρχίζει πλέον η διεργασία της χημικής υδρόλυσης που πραγματοποιείται, ως γνωστόν, σε όξινο ή αλκαλικό περιβάλλον. Όταν λύμα ζελατίνης ψυχθεί κάτω των 35º, το ιξώδες επίσης αυξάνει μέχρι το λύμα να μετατραπεί σε πηκτή. Για να σχηματιστεί όμως η πηκτή, η συγκέντρωση της ζελατίνης πρέπει να είναι 1 1,5%. Η προκύπτουσα πηκτή βρίσκεται σε "ημιστερεή" μορφή και εάν θερμανθεί ή ανακινηθεί σχετικά βίαια επαναρευστοποιείται. Οι εξαιρετικές πηκτωματογόνες ιδιότητες της ζελατίνης οφείλονται στη χαρακτηριστική σύσταση των αμινοξέων που την απαρτίζουν: γλυκίνη ή αλανίνη, βασικά ή όξινα αμινοξέα, και προλίνη ή υδροξυπρολίνη. * λύμα (sol): κολλοειδές αιώρημα στερεού σε υγρό. 84

85 Όσον αφορά τη συνεκτικότητα και τη σκληρότητα (ακαμψία) των παρασκευαζόμενων πηκτών, αυτές, κατά κανόνα αυξάνονται, όσον αυξάνεται η συγκέντρωση της ζελατίνης. Στην περίπτωση αυτή, οι ενδομοριακές-ελκτικές δυνάμεις καθίστανται ισχυρότερες, αφού οι πιθανότητες επαφής των πρωτεϊνικών μορίων είναι αυξημένες. Η συνεκτικότητα των πηκτών επηρεάζεται ακόμα και από το p ή την παρουσία ορισμένων ουσιών (π.χ. υδατανθράκων). Ο βαθμός επίδρασής τους ποικίλει ανάλογα με τη φύση του μορίου της πρωτεΐνης, το ισοηλεκτρικό της σημείο (ιδιαίτερα για το p, όπως εξηγήθηκε και προηγουμένως για το α στάδιο της διεργασίας της ζελατινοποίησης δηλ. την ενυδάτωση), τους δεσμούς υδρογόνου και γενικά κάθε παράγοντα που εμπλέκεται στις ενδομοριακές και διαμοριακές δυνάμεις (ελκτικές και απωθητικές) που αναπτύσσονται κατά το σχηματισμό των πηκτών. Έτσι, οι μηχανισμοί με τους οποίους όλες αυτές οι ουσίες / παράγοντες επιδρούν στη συνεκτικότητα της πηκτής είναι αρκετά πολύπλοκοι. Η ερμηνεία τους δε, καθίσταται πολυπλοκότερη εάν αναλογιστούμε ότι ακόμα και για τον ίδιο το σχηματισμό των πηκτών υφίστανται τρεις θεωρίες (απορρόφηση διαλύτη, θεωρία χωροπλέγματος, προσανατολισμός σωματιδίων). Έτσι, κάθε παράγοντας υπεισέρχεται στο σχηματισμό της πηκτής, με διαφορετικό κάθε φορά συντελεστή βαρύτητας, ανάλογα με την προτεινόμενη θεωρία. Από τεχνολογική (πρακτική) άποψη ιδιαίτερη σημασία έχει η μελέτη της συμπεριφοράς της πηκτής με προσθήκη ζάχαρης. Η ζάχαρη, όταν προστεθεί σε ζελατίνη, και σε αντίθεση με ότι συμβαίνει κατά την παρασκευή πηκτών αμύλου (όπου δρα ανταγωνιστικά), καθιστά την πηκτή πιο συνεκτική. Η δράση αυτή εξηγείται εν μέρει τουλάχιστον από τη συνέργεια που παρουσιάζει ο δισακχαρίτης αυτός για τη σταθεροποίηση της πηκτής, μέσω των σχηματιζόμενων δεσμών υδρογόνου. Η υδρόφιλη συμπεριφορά των 85

86 υδατανθράκων, λόγω της πληθώρας των υδροξυλομάδων, είναι άλλωστε δεδομένη. Οι υδροξυλομάδες σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου με τα μόρια του νερού και αυτό οδηγεί σε αύξηση της ενυδάτωσης. Από τη μελέτη των πρωτεϊνών, είναι γνωστό ότι αυτές, εκτός της χημικής υδρόλυσης (με οξέα ή βάσεις), υφίστανται και ενζυμική υδρόλυση. Με τη βοήθεια των πρωτεολυτικών ενζύμων (ενδοπεπτιδάσες ή πρωτεάσες και εξωπεπτιδάσες) διασπώνται σε πεπτίδια ή αμινοξέα, σύμφωνα με την αντίδραση: Η παπαΐνη, που βρίσκεται και παραλαμβάνεται από τα φύλλα και τους καρπούς του τροπικού φυτού παπάγια, αποτελεί μία από τις συνηθέστερα χρησιμοποιούμενες πρωτεάσες. Πρωτεολυτικά ένζυμα υπάρχουν προφανώς και σε άλλα φυτικά προϊόντα (ανανά, σύκα, ακτινίδια κτλ). Για το λόγο αυτό πρέπει να λαμβάνεται ιδιαίτερη μέριμνα κατά την παρασκευή πηκτής με φρούτα (φρουτοζελέ), όπου τα ένζυμα ορισμένων φρούτων (π.χ. η ακτινιδίνη των ακτινιδίων ή η βρωμελίνη του ανανά) ανταγωνίζονται την πηκτωματογόνο δράση της ζελατίνης, υδρολύοντας την πρωτεΐνη και καταστρέφοντας έτσι την πηκτή, όπως θα διαπιστώσουμε και κατά την εργαστηριακή άσκηση. Μεθοδολογία Για τη μελέτη του φαινομένου της ζελατινοποίησης, των παραγόντων που το επηρεάζουν, καθώς και της ενζυμικής υδρόλυσης των πρωτεϊνών, πραγματοποιούνται οι εξής χειρισμοί: 86

87 Α) Μελέτη της επίδρασης της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης: Παρασκευάζονται διαλύματα διαφορετικής περιεκτικότητας σε ζελατίνη. Εκτιμάται, έμμεσα το ιξώδες κάθε διαλύματος, μέσω της μέτρησης του χρόνου που απαιτείται για την εκροή συγκεκριμένης ποσότητας αυτού από σιφώνιο των 5 ml. Στη συνέχεια παρασκευάζονται οι πηκτές και προσδιορίζονται: ο χρόνος πήξης, δηλαδή το χρονικό διάστημα που απαιτείται για στερεοποίηση ρευστού διαλύματος θερμοκρασίας 60º, όταν αυτό μεταφερθεί σε ψυχρό περιβάλλον (10º) η συνεκτικότητα κάθε πηκτής, που μετριέται έμμεσα, μέσω του χρόνου που απαιτείται για να μετακινηθεί συγκεκριμένη μάζα πηκτής όταν αυτή εξαναγκάζεται σε (κατακόρυφη) ροή. Κανονικά η συνεκτικότητα ή ειδικότερα η σκληρότητα (ακαμψία) της πηκτής μετριέται μέσω ειδικού οργάνου που ονομάζεται διαπερατόμετρο (penetrometer). Η αρχή λειτουργίας των οργάνων αυτών, που χαρακτηρίζονται ειδικότερα ως ζελατινόμετρα (gelometer) βασίζεται στη μέτρηση της αντίστασης που παρουσιάζεται κατά τη διείσδυση (αγγλικά: penetration) ενός ανεστραμμένου κώνου στην πηκτή. Ωστόσο, στο Εργαστήριο, εάν δεν διατίθεται το κατάλληλο όργανο η εκτίμηση της σκληρότητας συνεκτικότητας της πηκτής μπορεί να γίνει είτε με μέτρηση της πίεσης (βάρους ανεστραμμένου δοκιμαστικού σωλήνα στον οποίο προστίθεται σιγά σιγά άμμος και ο οποίος τοποθετείται κατακόρυφα πάνω στην πηκτή, είτε με τον προηγουμένως περιγραφέντα έμμεσο τρόπο (κατακόρυφη εξαναγκασμένη ροή). Β) Μελέτη της επίδρασης του p: Παρασκευάζονται διαλύματα 1,5% ζελατίνης με p από 1 έως 12, με τη χρήση αραιού l ή Na. Προσδιορίζονται τα παραπάνω χαρακτηριστικά διαλυμάτων / πηκτών, όπως προηγουμένως. 87

88 Γ) Επίδραση ζάχαρης και πρωτεολυτικών ενζύμων: Παρασκευάζονται 5 διαλύματα 1,5% ζελατίνης. Στα 3 από αυτά προστίθεται ζάχαρη σε διαφορετικές για κάθε διάλυμα συγκεντρώσεις. Στο δ προστίθεται διάλυμα παπαΐνης και στο ε ίσος όγκος νερού (μάρτυρας). Τα διαλύματα παραμένουν στους 50º (υδατόλουτρο) επί 30 min για την αντίστοιχη υδρολυτική δράση της παπαΐνης, η οποία επιβεβαιώνεται και με το τεστ διουρίας. Μετριούνται βέβαια και όλες οι σχετικές μεταβλητές, όπως και προηγουμένως. Δ) Οι παραπάνω επιδράσεις / μεταβολές παριστάνονται γραφικά ως εξής: Μεταβολή του ιξώδους και του χρόνου πήξης των διαλυμάτων, καθώς και της σκληρότητας και της συνεκτικότητας των πηκτών, ως προς τη συγκέντρωση της ζελατίνης. Μεταβολή του ιξώδους και του χρόνου πήξης των διαλυμάτων, καθώς και της σκληρότητας και της συνεκτικότητας των πηκτών, ως προς το p. Μεταβολή του ιξώδους και του χρόνου πήξης των διαλυμάτων, καθώς και της σκληρότητας και της συνεκτικότητας των πηκτών, ως προς τη συγκέντρωση της ζάχαρης και επίσης την προσθήκη ενζύμου. Εργαστηριακός εξοπλισμός Αντιδραστήρια δοκιμαστικοί σωλήνες τρυβλία petri ποτήρια ζέσεως των 50, 250, 1000 ml σιφώνια των 5 ml p μετρο διαπερατόμετρο (penetrometer) χρονόμετρο ζελατίνη 6Μ l 2M Na ζάχαρη πρωτεολυτικό ένζυμο (παπαΐνη ή φισίνη) διαλύματα Fehling A και Fehling B κρέας (βοδινό ή μοσχαρίσιο) 88

89 Πορεία εργασίας 1) Παρασκευή διαλυμάτων: α) Για τη μελέτη της επίδρασης της συγκέντρωσης ζελατίνης: 60 g ζελατίνης προστίθενται σε ψυχρό απιονισμένο ύδωρ και το μίγμα (διασπορά) παραμένει προς ενυδάτωση επί 1 ώρα. Στη συνέχεια και υπό ανάδευση, προστίθεται θερμό (~ 60º) απιονισμένο ύδωρ, μέχρι τελικού όγκου 1000 ml. Δημιουργείται έτσι ένα λύμα (κολλοειδές αιώρημα) ζελατίνης περιεκτικότητας 6%. Από αυτό παρασκευάζονται 250 ml αραιώσεων, κάθε μία από τις οποίες περιέχει 6, 3, 1,5 και 0,5% ζελατίνης. β) Για τη μελέτη της επίδρασης του p: Παρασκευάζονται όπως παραπάνω 1000 ml λύματος ζελατίνης περιεκτικότητας 1,8%, το οποίο διαιρείται σε 5 ίσα μέρη των 200 ml. Σε καθένα από τα επιμέρους λύματα, με τη βοήθεια αραιού l ή Na, γίνεται ρύθμιση του p σε 1, 5, 6, 7 και 12 αντιστοίχως. Στη συνέχεια, κάθε λύμα, ενώ είναι ακόμα θερμό, αραιώνεται μέχρι τελικού όγκου 250 ml, δηλαδή τελικής συγκέντρωσης ζελατίνης περίπου 1,5%. γ) Για τη μελέτη της επίδρασης της ζάχαρης και των πρωτεολυτικών ενζύμων: Σε 3 ποτήρια ζέσεως των 250 (με χαραγή) φέρονται 4,3, 8,6 και 17,2 g ζάχαρης καθώς και από 50 ml ψυχρού ύδατος στο καθένα. Σε άλλα δύο ίδια ποτήρια προστίθενται μόνο 50 ml ψυχρού ύδατος. Στη συνέχεια, σε καθένα από τα παραπάνω 5 ποτήρια, προστίθενται 3,75 g ζελατίνης. Στο ένα από τα δύο ποτήρια στα οποία εμπεριέχεται μόνο ψυχρό ύδωρ, προστίθενται 0,2 g πρωτεολυτικού ενζύμου. Όλα τα λύματα αναδεύονται περιοδικά επί 1 ώρα. Ακολούθως στο καθένα, προστίθεται θερμό απιονισμένο νερό (~ 60º) μέχρι τελικού όγκου 250 ml και έτσι η 89

90 τελική περιεκτικότητα ζελατίνης είναι 1,5%. Η θερμοκρασία διατηρείται στους 60º σε υδατόλουτρο επί 30 επιπλέον min για τη δράση της παπαΐνης. δ) Παρασκευή διαλύματος παπαΐνης: Τελική συγκέντρωση της τάξης του 0,1% του ενζύμου είναι αρκετή για την αντίστοιχη επίδραση. Για το σκοπό αυτό παρασκευάζεται υδατικό διάλυμα παπαΐνης 1%, από το οποίο προστίθεται η ανάλογη ποσότητα στο προς υδρόλυση παρασκεύασμα. Η παπαΐνη αναμιγνύεται αρχικά με λίγες σταγόνες κρύου νερού και αφού ενυδατωθεί, δημιουργείται το αντίστοιχο λύμα (αιώρημα) με την προσθήκη του απαιτούμενου όγκου ύδατος σε ογκομετρική φιάλη. Το αιώρημα της παπαΐνης παραμένει χωρίς ανάδευση για 2 ώρες, πριν τη χρήση του. Ωστόσο, σύμφωνα με το προηγούμενο βήμα, η παπαΐνη μπορεί να προστεθεί και αυτούσια στο προς υδρόλυση παρασκεύασμα. 2) Ποσότητα περίπου 50 ml των παραπάνω λυμάτων και ενώ αυτά είναι ακόμη ζεστά, μεταφέρεται σε ποτήρια ζέσεως. Τα ποτήρια με το περιεχόμενό τους τοποθετούνται στο ψυγείο, μέχρις ότου δημιουργηθούν πηκτές. Μετά τη δημιουργία των πηκτών (κατά προτίμηση την επόμενη ημέρα), εξετάζεται η σκληρότητα τους (ακαμψία) με διαπερατόμετρο (penetrometer) ή με εφαρμογή πίεσης με ανεστραμμένο δοκιμαστικό σωλήνα. Εξετάζεται επίσης και η διαύγειά τους. 3) 10 ml από τα παραπάνω λύματα (θερμοκρασίας 60º) φέρονται σε δοκιμαστικούς σωλήνες, οι οποίοι τοποθετούνται σε υδατόλουτρο θερμοκρασίας 10º. Προσδιορίζεται για το κάθε παρασκεύασμα ο χρόνος πήξης, ως το χρονικό διάστημα που μεσολαβεί μέχρις ότου το περιεχόμενο κάθε δοκιμαστικού σωλήνα, αδυνατεί να ρεύσει ελεύθερα από αυτόν. Όταν σχηματιστούν πηκτές, ο κάθε δοκιμαστικός σωλήνας απομακρύνεται από το 90

91 υδατόλουτρο και αναστρέφεται πάνω σε χαρτοπετσέτα, σε θερμοκρασία δωματίου. Το χρονικό διάστημα που απαιτείται έως ότου το περιεχόμενο κάθε δοκιμαστικού σωλήνα αγγίξει τη χαρτοπετσέτα, λαμβάνεται ως ένδειξη του μέτρου της συνεκτικότητας της πηκτής. 4) Ποσότητα 10 ml από τα παραπάνω θερμά λύματα (~ 60º) φέρεται σε σιφώνια των 5 ml και μετριέται (με χρονόμετρο) ο χρόνος που απαιτείται για την έξοδο όλου του περιεχομένου (ένδειξη ιξώδους). Οι μετρήσεις επαναλαμβάνονται 2 3 φορές. 5) Δημιουργούνται τα ακόλουθα γραφήματα: α) Συγκέντρωση ιξώδες Συγκέντρωση χρόνος πήξης Συγκέντρωση συνεκτικότητα Συγκέντρωση σκληρότητα β) p ιξώδες p χρόνος πήξης p συνεκτικότητα p σκληρότητα γ) Συγκέντρωση ζάχαρης ιξώδες Συγκέντρωση ζάχαρης χρόνος πήξης Συγκέντρωση ζάχαρης συνεκτικότητα Συγκέντρωση ζάχαρης σκληρότητα 6) Εξετάζεται ο χρωματισμός στο τεστ διουρίας, για την επίδραση της παπαΐνης και εξάγονται τα αντίστοιχα συμπεράσματα. 91

92 Ενότητα Δ ΛΙΠΙΔΙΑ Ο όρος "λιπίδιο" αναφέρεται σε μια ομάδα οργανικών ουσιών η οποία προσδιορίζεται ακόμη ασαφέστερα απ ότι οι υδατάνθρακες. Γενικά, στα λιπίδια περιλαμβάνονται ετερογενείς ενώσεις, που βρίσκονται σε ζωικούς και φυτικούς οργανισμούς και οι οποίες είναι αδιάλυτες στο νερό και διαλυτές σε μη πολικούς (οργανικούς) διαλύτες. Στην ομάδα των λιπιδίων ανήκουν τα λίπη και τα έλαια (δεν υφίσταται ουσιαστικός διαχωρισμός, εκτός του ότι σε θερμοκρασία περιβάλλοντος τα μεν λίπη είναι στερεά τα δε έλαια υγρά), που ευρίσκονται στις διάφορες τροφές, καθώς και τα ονομαζόμενα φωσφολιπίδια τα οποία υπάρχουν στις κυτταρικές μεμβράνες. Τα βρώσιμα έλαια και λίπη, αποτελούνται σχεδόν εξ ολοκλήρου από λιπίδια. Περιέχουν δηλαδή και άλλες ουσίες (βιταμίνες κτλ), αλλά σε μικρά μόνο ποσοστά. Από την άλλη, όλα σχεδόν τα τρόφιμα περιλαμβάνουν στη σύστασή τους λιπίδια, σε μικρό ή μεγαλύτερο ποσοστό (Πίνακας Δ.1.). Σημειώνεται ότι στις βιβλιογραφικές αναφορές της % περιεκτικότητας των τροφίμων σε "λίπος", περιλαμβάνονται όλα τα λιπίδια (αναφέρονται και ως ολικό λίπος). Στην ουσία πρόκειται για την περιεκτικότητα σε τριγλυκερίδια (λίπη έλαια), εκτός από την περίπτωση των τροφίμων που περιέχουν στη σύστασή τους κρόκο αυγού, ο οποίος και περιέχει ποσοτικά σημαντικά ποσοστά φωσφολιπιδίων. 92

93 Τρόφιμο % Ολικό λίπος Τρόφιμο % Ολικό λίπος Αλεύρι ολικής αλέσεως 2,2 Λουκάνικο-χοιρινό (ψημένο) 24,6 Ψωμί (λευκό) 1,9 Μοσχάρι-φιλέτο (ψημένο) 21,1 Γάλα-αποβουτυρωμένο (αγελαδινό) 0,1 Μοσχάρι-κιμάς (ωμό) 20,5 Γάλα-πλήρες (αγελαδινό) 3,9 Αρνί-παϊδάκι (ψημένο) 29,0 Γάλα ανθρώπινο 4,1 Κοτόπουλο (ψημένο 5,4 Τυριά (συνήθως) Γαλοπούλα-στήθος (ψημένο) 1,4 Παγωτό 9,8 Βακαλάος (ωμός) 0,7 Αυγό-κρόκος 30,5 Βακαλάος (τηγανισμένος, με κουρκούτι) 10,3 Αυγό-ασπράδι ίχνη Σκουμπρί (καπνιστό) 30,9 Βούτυρο 81,7 Σολωμός (καπνιστός) 4,5 Μαργαρίνη 81,6 Ταραμοσαλάτα 46,4 Λαρδί (μαγειρικό λίπος) 99,0 Φιστίκια-αράπικα (καβουρδισμένα) 49,8 Φυτικά έλαια 99,9 Σοκολάτα υγείας 29,2 Μπέικον (τηγανισμένο) 42,2 Σοκολάτα γάλακτος 30,3 Πίνακας Δ.1. Περιεκτικότητα σε λίπος, μερικών τροφίμων (τιμές ενδεικτικές). Τα λιπίδια, που βρίσκονται στις τροφές, έχουν ένα κοινό χαρακτηριστικό της σύστασής τους: είναι εστέρες ανώτερων λιπαρών οξέων. Ωστόσο, υπάρχουν και διάφορα άλλα λιπίδια, των οποίων τα μόρια δεν έχουν αυτό το κοινό χαρακτηριστικό στη δομή τους. Τέτοια είναι τα στεροειδή και τα τερπένια (με εξαίρεση τη χοληστερόλη και τους εστέρες της με λιπαρά οξέα). Οι ουσίες αυτές όμως εμφανίζουν μεγαλύτερο ενδιαφέρον για τη Χημεία Τροφίμων με δράσεις, οι οποίες ταυτίζονται με αυτές που χαρακτηρίζουν τις βιταμίνες, τις χρωστικές ή τις αρωματικές ενώσεις. Τα λιπίδια, εκτός από το ότι ευρίσκονται σε όλες σχεδόν τις φυσικές τροφές του ανθρώπου, έστω και σε μικρές 93

94 ποσότητες, προστίθενται ακόμη στα τρόφιμα, αρκετά συχνά, κατά τις διάφορες επεξεργασίες ή παρασκευές φαγητών. Χρησιμοποιούνται, για παράδειγμα, ως ενισχυτές των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών των τροφίμων (γεύση, άρωμα κτλ), ως μέσα μεταφοράς θερμότητας (τηγάνισμα κτλ), για την παρασκευή γαλακτωμάτων (μαγιονέζα κτλ) και βέβαια για την αύξηση της ικανότητας κορεσμού των τροφών μας. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, τα λιπίδια τα οποία αφορούν την Ενότητα αυτή, αλλά και την Τεχνολογία Τροφίμων γενικότερα, έχουν από άποψη δομής ένα κοινό χαρακτηριστικό: είναι εστέρες μονοκαρβονικών (ή μονοκαρβοξυλικών) οξέων. Από τα οξέα των λιπιδίων, άλλα είναι κορεσμένα, και άλλα ακόρεστα μονοκαρβονικά. Το γεγονός δε ότι τα κορεσμένα μονοκαρβονικά οξέα απαντούν κυρίως στα λίπη, τους έδωσε αρχικά την ονομασία λιπαρά οξέα (άλειφαρ = λίπος). Ωστόσο, σήμερα, στον όρο "λιπαρά" οξέα, περιλαμβάνονται και ακόρεστα μονοκαρβονικά οξέα, επειδή και αυτά απαντούν συχνά σε λίπη (και έλαια). Ισχύει δηλαδή η γενικότερη ορολογία και διάκριση: "κορεσμένα λιπαρά οξέα ακόρεστα λιπαρά οξέα". Τα λιπαρά οξέα που απαντούν στα τρόφιμα, περιέχουν άρτιο αριθμό ατόμων άνθρακα, ενωμένων μεταξύ τους χωρίς διακλαδώσεις (ευθύγραμμη αλυσίδα ), όπως π.χ. το δωδεκανοϊκό (ή λαυρικό οξύ): Οι διπλοί δεσμοί στα ακόρεστα λιπαρά οξέα είναι cis. Το σύστημα το οποίο χρησιμοποιείται συχνά στη βιβλιογραφία για τον προσδιορισμό των θέσεων των διπλών δεσμών δηλώνει τον αριθμό του ενός, από τους δύο που συμμετέχουν στο διπλό δεσμό (του πρώτου). Για τη σύντομη περιγραφή της δομής, στην αρχή δηλώνεται ο συνολικός αριθμός ατόμων, μετά παρεμβάλλεται άνω και 94

95 κάτω τελεία (:) και στη συνέχεια δηλώνεται ο αριθμός των διπλών δεσμών. Ακολουθεί το χαρακτηριστικό των διπλών δεσμών γράμμα Δ και στη συνέχεια ο προσδιορισμός των διπλών δεσμών. Έτσι, για παράδειγμα, το α-λινολενικό οξύ: 3 2 = 2 = 2 = ( 2 ) 7 το οποίο ονομάζεται (συστηματικά) cis-9, 12, 15-δεκα-οκτα-τριενοϊκό οξύ, παριστάνεται και ως "18:3 Δ9,12,15" (υπενθυμίζεται ότι η αρίθμηση αρχίζει από την καρβοξυλομάδα). Μερικά από τα συχνότερα ευρισκόμενα στα τρόφιμα λιπαρά οξέα είναι αυτά που παρουσιάζονται στον Πίνακα Δ.2. Συστηματική ονομασία Εμπειρική ονομασία "Δομή" Κορεσμένα η-βουτανοϊκό (η-βουτανικό) βουτυρικό 4:0 η-εξανοϊκό καπρονικό 6:0 η-οκτανοϊκό καπρυλικό 8:0 η-δεκανοϊκό καπρινικό 10:0 η-δωδεκανοϊκό λαυρικό 12:0 η-δεκατετρανοϊκό μυριστικό 14:0 η-δεκαεξανοϊκό παλμιτικό 16:0 η-δεκαοκτανοϊκό στεατικό 18:0 η-εικοσανοϊκό αραχιδικό 20:0 Ακόρεστα cis-9-δεκαεξενοϊκό παλμιτελαϊκό 16:1Δ9 cis-9-δεκαοκτενοϊκό ελαϊκό 18:1Δ9 cis,cis-9,12-δεκαοκταδιενοϊκό λινελαϊκό 18:2Δ9,12 cis-9,12,15-δεκαοκτατριενοϊκό α-λινολενικό 18:3Δ9,12,15 cis-5,8,11,14-εικοσιτετρανοϊκό αραχιδονικό 20:4Δ5,8,11,14 Πίνακας Δ.2. Μερικά λιπαρά οξέα τροφίμων Τα λιπαρά οξέα συνδέονται με τα υδροξύλια της γλυκερίνης (γλυκερόλης ή προπανο-1,2,3-τριόλης) και σχηματίζουν τους αντίστοιχους εστέρες, οι οποίοι 95

96 ονομάζονται τριγλυκερίδια (απλά = το ίδιο οξύ και στα τρία υδροξύλια, ή μικτά = περισσότερα του ενός οξέα). Από χημική άποψη, δύο βασικές κατηγορίες αντιδράσεων που υφίστανται τα λιπίδια, ενδιαφέρουν ιδιαίτερα τον Τεχνολόγο Τροφίμων. Η πρώτη είναι η υδρόλυση (λιπόλυση) και η δεύτερη η οξείδωση. Και οι δύο κατηγορίες αντιδράσεων οδηγούν, ανάλογα με την περίπτωση (σύσταση τροφίμου, φυσικοχημικό περιβάλλον), σε διάφορες υποβαθμίσεις του τροφίμου που είναι γνωστές με τον όρο τάγγισμα. Έχουμε συνεπώς το υδρολυτικό τάγγισμα και το οξειδωτικό τάγγισμα. Η υδρόλυση των εστερικών δεσμών που παρατηρείται στα λιπίδια ονομάζεται και λιπόλυση. Πραγματοποιείται είτε ενζυμικά είτε με την επίδραση θερμοκρασίας και υγρασίας. Πραγματοποιείται ακόμη και κατά την παρατεταμένη θέρμανση λιπών και ελαίων με αλκάλια. Στην περίπτωση αυτή η υδρόλυση των λιπιδίων, ονομάζεται σαπωνοποίηση. Τα προϊόντα που προκύπτουν, είναι ελεύθερα λιπαρά οξέα (και στην περίπτωση της σαπωνοποίησης τα άλατά τους με άλκαλι) και γλυκερίνη, σε διάφορες αναλογίες. Οι αναλογίες των προϊόντων διαφέρουν ανάλογα με το είδος των τριγλυκεριδίων, το ένζυμο κτλ. Για παράδειγμα, η παγκρεατική λιπάση καταλύει 1,1 -εστερικούς δεσμούς των τριγλυκεριδίων. Έτσι στο εργαστήριο (όπως άλλωστε συμβαίνει και στο λεπτό έντερο), μετά τη σχετική υδρόλυση εντοπίζονται δύο λιπαρά οξέα, που προέρχονται από τις εξωτερικές θέσεις του τριγλυκεριδίου, και επίσης ένα 2-μονογλυκερίδιο. 96

97 2 R R R 2 + R 1 + R 3 2 R 3 2 Ο σχηματισμός ελεύθερων λιπαρών οξέων κατά τη λιπόλυση είναι ουσιαστικά η πηγή των ανεπιθύμητων ταγγισμένων γεύσεων και αρωμάτων, που παρατηρείται στο φρέσκο γάλα. Από την άλλη μεριά όμως, οι χαρακτηριστικές και επιθυμητές γεύσεις ορισμένων τυριών που παράγονται με τη βοήθεια ενζύμων, έχουν και αυτές την ίδια προέλευση (υδρολυτικό τάγγισμα). Ελεγχόμενη και επιλεκτική λιπόλυση χρησιμοποιείται επίσης κατά την παρασκευή και άλλων τροφίμων, όπως του γιαουρτιού και του ψωμιού. Σε αντίθεση με τα ζωικά λίπη, όπου δεν παρατηρούνται συνήθως ελεύθερα λιπαρά οξέα (εάν βέβαια αδρανοποιηθούν και τα αντίστοιχα ένζυμα, με τις αναπτυσσόμενες, κατά την επεξεργασία παραλαβής τους από τους ζωικούς ιστούς, θερμοκρασίες), τα φυτικά έλαια, ακόμη και μέχρι τη συγκομιδή των καρπών / σπόρων, είναι δυνατόν να έχουν υποστεί σημαντική υδρόλυση. Εμφανίζονται δηλαδή αρκετά ελεύθερα λιπαρά οξέα τα οποία επιβάλλεται να εξουδετερωθούν με αλκάλια. Το φαινόμενο της λιπόλυσης παρατηρείται όμως και κατά τη διάρκεια του τηγανίσματος των τροφών, όπου συνυπάρχουν τόσο οι υψηλές θερμοκρασίες όσο και το νερό, που περιέχεται στα τρόφιμα που τηγανίζονται. Ο σχηματισμός των ελεύθερων λιπαρών οξέων κατά το τηγάνισμα, εκτός από τη μείωση του 97

98 σημείου καπνισμού ή καπνού (smoking point) του ελαίου και την υποβάθμιση της ποιότητας του τηγανισμένου τροφίμου (υδρολυτικό τάγγισμα), αυξάνει την πιθανότητα οξειδωτικών αντιδράσεων. Αυτές είναι γενικά ευκολότερες στα ελεύθερα οξέα παρά στους εστέρες τους με γλυκερίνη (περαιτέρω υποβάθμιση της ποιότητας). Η λιπόλυση που πραγματοποιείται με τη χρήση ορισμένων ενζύμων (ενζυμική λιπόλυση), όπως π.χ. της παγκρεατικής λιπάσης, χρησιμοποιείται στο εργαστήριο τόσο για τον προσδιορισμό των θέσεων των λιπαρών οξέων στους εστέρες τους με τη γλυκερίνη (γλυκερίδια), όσο και κατά τα ενδιάμεσα στάδια της σύνθεσης ορισμένων λιπιδίων. Η δεύτερη τώρα αιτία υποβάθμισης των λιπιδίων, δηλαδή η οξείδωση, είναι ακόμη πιο κρίσιμη από την υδρόλυση. Αυτή, εκτός των προβλημάτων που αναφέρθηκαν στη λιπόλυση (ανεπιθύμητες γεύσεις / οσμές, αυξημένες οξύτητες, ελάττωση της διατηρησιμότητας του τροφίμου), οδηγεί πολλές φορές στη μείωση της θρεπτικής αξίας του τροφίμου και στο σχηματισμό τοξικών προϊόντων. Οι περιπτώσεις των επιθυμητών οξειδωτικών αντιδράσεων των λιπιδίων είναι ουσιαστικά πολύ λίγες (π.χ. άρωμα ορισμένων τυπικών τυριών ή τηγανιτών τροφίμων). Η οξείδωση των λιπιδίων των τροφίμων, άρα και το οξειδωτικό τάγγισμα λαμβάνει χώρα με την αντίδραση των ακόρεστων λιπαρών οξέων με το μοριακό οξυγόνο. Πρόκειται ουσιαστικά δηλαδή για μια "αυτοξείδωση", η οποία δεν εξαρτάται από την παρουσία υγρασίας στο τρόφιμο, γίνεται δε είτε με ενζυμικούς είτε με μη ενζυμικούς μηχανισμούς. Είναι, λοιπόν, προφανές γιατί το οξειδωτικό τάγγισμα, που μπορεί να επηρεάσει ακόμα και αγνά (καθαρά) και εξευγενισμένα έλαια, έχει ιδιαίτερη σημασία για την χημεία και την τεχνολογία των τροφίμων. 98

99 Η αλληλουχία των αντιδράσεων οξείδωσης των λιπιδίων, μελετάται και παρουσιάζεται με τη βοήθεια των αντίστοιχων αντιδράσεων των ελεύθερων λιπαρών οξέων. Η αντιστοιχία των μηχανισμών μεταξύ των δύο κατηγοριών (οξέα-εστέρες) είναι γενικά αποδεκτή. Η αλληλουχία, λοιπόν, αυτή των αντιδράσεων παριστάνεται με τα τρία διαφορετικά στάδια: της έναρξης, της προαγωγής και του τερματισμού (Σχήμα Δ.1.). Στο στάδιο της έναρξης, δημιουργούνται λίγες αλλά δραστικότατες ελεύθερες ρίζες, οι οποίες προέρχονται από τα μόρια των λιπαρών οξέων με την παρουσία μονήρων ηλεκτρονίων (R ). Ο σχηματισμός των λίγων αυτών αλλά απόλυτα απαραίτητων αρχικών ελεύθερων ριζών αποδίδεται στην καταλυτική δράση ορισμένων ουσιών (διάσπαση υδροϋπεροξειδίων, μέταλλα, φωτεινή ενέργεια, χλωροφύλλη, μυογλοβίνη κτλ). Στο στάδιο της προαγωγής, το ατμοσφαιρικό (μοριακό) οξυγόνο αντιδρά με τις ελεύθερες ρίζες. Παράγονται έτσι υπεροξειδικές ελεύθερες ρίζες (R ). Είναι και αυτές πολύ δραστικές και αντιδρούν περαιτέρω με άλλα ακόρεστα λιπαρά οξέα, δημιουργώντας υδροϋπεροξείδια (R) και νέες ελεύθερες ρίζες του τύπου R. Οι τελευταίες επαναλαμβάνουν τον αρχικό τους ρόλο και διατηρούν την όλη διαδικασία (αλυσιδωτή αντίδραση). Όμως, τα υδροϋπεροξείδια μπορούν ακόμα να διασπαστούν και να δώσουν και άλλες ελεύθερες ρίζες, τις αλκοξειδικές (R ), οι οποίες συμπεριφέρονται κατά βάση όπως και οι υπεροξειδικές R. Αποτέλεσμα όλων αυτών των αντιδράσεων είναι να αυξάνεται συνεχώς το πλήθος των ελευθέρων ριζών στο λίπος, το οποίο απορροφά συγχρόνως σημαντικές ποσότητες οξυγόνου από τον αέρα. Με την πάροδο του χρόνου, η συγκέντρωση των ελευθέρων ριζών φθάνει σ ένα σημείο, απ όπου αυτές αρχίζουν να αντιδρούν μεταξύ τους, οπότε σχηματίζουν σταθερά, τελικά 99

100 προϊόντα. Αυτά ορίζουν και το στάδιο του τερματισμού της αυτοοξείδωσης των ακόρεστων λιπαρών οξέων / λιπιδίων. Έναρξη X R R X.+ R R. 2 Προαγωγή R R R R R R R Τερματισμός R.,R.,R. RR,RR,RR Σχήμα Δ.1. Συνοπτική παρουσίαση αντιδράσεων αυτοξείδωσης ακόρεστων λιπαρών οξέων. Η χαρακτηριστική οσμή του ταγγισμένου λίπους οφείλεται κατά κανόνα στις αλδεΰδες, που σχηματίζονται από τη διάσπαση της ανθρακικής αλυσίδας σε ένα από τα δύο τμήματα του μορίου των αλκοξειδικών ριζών, όπως παρουσιάζεται, ενδεικτικά, στο Σχήμα Δ.2. R 1 R 2.. R 3. R 2 R 3 R 3. R 3 R 1 αλδεύδες R 1 R δευτεροταγείς αλκοόλες 2 R 1 κετόνες R 2 Σχήμα Δ.2. Σχηματισμός αλδεϋδών, κετονών και αλκοολών από αλκοξειδικές ρίζες. 100

101 Οι αντιδράσεις της οξείδωσης των λιπιδίων εμφανίζονται, προφανώς κατά την παρατεταμένη θέρμανση των λιπών / ελαίων στον ατμοσφαιρικό αέρα και μάλιστα εντονότερα και με περισσότερα προϊόντα. Μερικά από τα εμφανιζόμενα τότε προϊόντα οφείλονται στη συνένωση και κατ επέκταση στον πολυμερισμό πολλών από τα ενδιάμεσα δραστικά μόρια που σχηματίζονται σύμφωνα με τους μηχανισμούς των αντιδράσεων αυτοξείδωσης. Μερικές από τις δυνατότητες σχηματισμού διμερών ή πολυμερών προϊόντων, παρουσιάζονται στο Σχήμα Δ.3. R. + R. R R R. + R. R R R R 2 R. + R. + R 1. + R 2 R 3 R2 R 3 R 1 R 3 R 4 R 1 R 2 R 3 R 4 R 3 R 4 Σχήμα Δ.3. Συνενώσεις και πολυμερισμοί από ενδιάμεσα προϊόντα οξείδωσης λιπών (τα διένια προκύπτουν από τη διάσπαση των αλκοξειδικών ριζών). 101

102 Ιδιαίτερης σημασίας θεωρούνται, από τοξικολογικής τουλάχιστον άποψης, οι αντιδράσεις κυκλοποίησης, όπως παρουσιάζει η τελευταία αντίδραση (Diels- Alder) του Σχήματος Δ.3. Ωστόσο, όλες οι αντιδράσεις πολυμερισμού ελαίων που τηγανίζονται, σχηματίζουν ενώσεις μεγάλου μοριακού βάρους, οι οποίες αυξάνουν το ιξώδες και δημιουργούν άφρισμα. Στην πράξη, ορισμένες φορές έχουν βρεθεί τηγανισμένα λάδια που περιέχουν προϊόντα πολυμερισμού σε ποσοστό που ξεπερνά το 30% Με τον μηχανισμό της "αλυσιδωτής" αντίδρασης αυτοξείδωσης των λιπιδίων εξηγείται ακόμη και γιατί μία ποσότητα ελαίου, που χρησιμοποιείται για μαζικό τηγάνισμα τροφίμων (πατάτες, ψάρια, κεφτέδες, κροκέτες κτλ), είναι προτιμότερο να απορρίπτεται (όταν έχει φτάσει τα οριακά επίπεδα χρήσης), παρά να συμπληρώνεται με φρέσκο λάδι. Ανάλογα ανεπιθύμητα και πιθανόν τοξικά (καρκινογόνα) προϊόντα προκύπτουν και κατά την οξείδωση (ιδιαίτερα με το τηγάνισμα) και άλλων λιπιδίων, εκτός των εστέρων ακόρεστων λιπαρών οξέων με γλυκερίνη. Ενώσεις της χοληστερόλης, (οξείδια) για παράδειγμα, έχουν και αυτές εντοπιστεί σε τηγανισμένα προϊόντα (π.χ. τηγανιτές πατάτες) και είναι ύποπτα για ύπαρξη διαφόρων καρδιαγγειακών παθήσεων. Ο σχηματισμός όμως αυτών των επικίνδυνων και ανεπιθύμητων ενώσεων περιορίζεται και γενικά το οξειδωτικό τάγγισμα αναστέλλεται, με την προσθήκη των αντιοξειδωτικών ουσιών, όπως θα εξηγηθεί στο αντίστοιχο Πείραμα ΣΤ

103 ΠΕΙΡΑΜΑ Δ 1 ΓΑΛΑΚΤΩΜΑΤΑ Σκοπός Η μελέτη των τύπων των γαλακτωμάτων και των ιδιοτήτων τους. Από τη Θεωρία στην Πράξη Το λάδι, όταν προστίθεται στο νερό, σχηματίζει μια ξεχωριστή στιβάδα πάνω από αυτή του νερού, δηλαδή την υδατική στιβάδα. Αποδεικνύεται έτσι ότι το λάδι και το νερό δε διαλύονται το ένα στο άλλο και είναι μη αναμίξιμα. Εάν ωστόσο, λάδι και νερό αναταραχθούν μαζί με βίαιες κινήσεις, τα δύο υγρά διαχέονται το ένα εντός του άλλου και σχηματίζεται ένα γαλάκτωμα. Το γαλάκτωμα όμως αυτό είναι ασταθές και κατά την παραμονή του σε ηρεμία, διαχωρίζεται ξανά στις αρχικές δύο στιβάδες (νερού-λαδιού). Τα γαλακτώματα ανήκουν στα κολλοειδή συστήματα. Υπενθυμίζεται ότι υπάρχουν διάφοροι τύποι κολλοειδών συστημάτων, όπως συνοψίζονται και στον Πίνακα Δ.1.1. Διεσπαρμένη φάση Συνεχής φάση Ονομασία κολλοειδούς Παραδείγματα στερεό υγρό λύμα (sol) άμυλο και πρωτεΐνες σε νερό υγρό υγρό γαλάκτωμα (emulsion) γάλα, μαγιονέζα αέριο υγρό αφρός (foam) χτυπημένο ασπράδι αυγού αέριο στερεό στερεός αφρός (solid foam) παγωτό, ψωμί πηκτή (gel) ζελέ, μαρμελάδα υγρό στερεό στερεό γαλάκτωμα βούτυρο, Πίνακας Δ.1.1. Τύποι κολλοειδών συστημάτων μαργαρίνη 103

104 Υπάρχουν δύο τύποι γαλακτωμάτων: α) ο τύπος λάδι σε νερό (Λ/Ν), όπως το γάλα, η μαγιονέζα, η μουστάρδα, η κρέμα γάλακτος και οι κρέμες σαλατών, β) ο τύπος νερό σε λάδι (Ν/Λ), όπως το βούτυρο γάλακτος (φρέσκο) και η μαργαρίνη. Ο β αυτός τύπος των γαλακτωμάτων (Ν/Λ), δεδομένου ότι περιλαμβάνει τρόφιμα στα οποία η συνεχής φάση είναι συνήθως στερεή, ονομάζονται και στερεά γαλακτώματα. Η σταθερότητα ενός γαλακτώματος αυξάνεται με την παρουσία ουσιών, των οποίων τα μόρια διαθέτουν τόσο πολικά όσο και μη πολικά τμήματα. Τέτοια είναι π.χ. τα μόρια των φωσφολιπιδίων. Στο σχήμα Δ.1.1 παρουσιάζεται πώς, αυτές οι ενώσεις (γαλακτωματοποιητές) μπορούν να "προσανατολίσουν" τα μόριά τους μεταξύ των δύο φάσεων και να δημιουργήσουν έτσι ένα διαχωριστικό "φράγμα". Το φράγμα αυτό εμποδίζει τη συνένωση των σταγονιδίων που σχηματίζουν το γαλάκτωμα. Σχήμα Δ.1.1. Σχηματική αναπαράσταση της διάταξης μιας σταγόνας λαδιού σε γαλάκτωμα του τύπου Λ/Ν. 104

105 Ένα τρόφιμο με πολύ καλές γαλακτωματοποιητικές ιδιότητες είναι ο κρόκος του αυγού. Τα φωσφολιπίδια που τον αποτελούν (το 28% περίπου των συνολικών του λιπιδίων) είναι, κυρίως, λεκιθίνες. Σημειώνεται ότι, εκτός από τους γαλακτωματοποιητές, η τεχνολογία τροφίμων χρησιμοποιεί και τους σταθεροποιητές των γαλακτωμάτων. Οι δύο κατηγορίες αυτές των πρόσθετων ουσιών δρουν συνεργιστικά. Οι σταθεροποιητές, παρόλο που δεν είναι από μόνα τους γαλακτωματοποιητικά μόρια, ενισχύουν τη σταθερότητα των γαλακτωμάτων μέσω της αύξησης του ιξώδους της υδατικής φάσης και της, κατ επέκταση, ελάττωσης της κινητικότητας των διεσπαρμένων σταγονιδίων, άρα και της πιθανότητας σύγκρουσης συνένωσης μεταξύ τους. Οι σταθεροποιητές ανήκουν είτε στις πρωτεΐνες (π.χ. ζελατίνη) είτε στους πολυσακχαρίτες, όπως είναι τα κόμμεα, τα αλγινικά άλατα, οι καραγεννάνες κτλ. Ανάλογες με τους σταθεροποιητές ενώσεις, τόσο ως προς τη χημική σύσταση όσο και ως προς τη δράση, είναι και τα πηκτωματογόνα. Μόνο που για να δράσουν (δημιουργία πηκτής) απαιτούνται ποσότητες μεγαλύτερες απ αυτές που προστίθενται για τη σταθεροποίηση των γαλακτωμάτων. Κατά την ανάμιξη ενός συστήματος "λάδι νερό", ο τύπος του γαλακτώματος που θα προκύψει (Λ/Ν ή Ν/Λ) εξαρτάται από πολλούς παράγοντες, όπως τη σύσταση της ελαιώδους και της υδατικής στιβάδας, τη δομή του γαλακτωματοποιητή και τις σχετικές αναλογίες των υφιστάμενων φάσεων. Εάν, για παράδειγμα, η πολική ομάδα ενός γαλακτωματοποιητή παρουσιάζει εντονότερες ικανότητες προσρόφησης απ ό,τι η μη πολική του ομάδα, η προσρόφηση του γαλακτωματοποιητή από το νερό είναι εντονότερη από αυτή που παρατηρείται με το λάδι. Είναι γνωστό όμως ότι το μέγεθος της προσρόφησης σε μια υγρή επιφάνεια εξαρτάται από το εμβαδόν της επιφανείας 105

106 αυτής που είναι διαθέσιμο. Άρα, διευκολύνεται και η αυξημένη προσρόφηση του γαλακτωματοποιητή από το νερό, αφού η ενδιάμεση φάση "λάδι νερό" προτείνει την κυρτή επιφάνεια (μεγαλύτερο εμβαδόν) προς την υδατική στιβάδα. Δημιουργείται έτσι ένα γαλάκτωμα του τύπου Λ/Ν. Οι σχετικές αναλογίες του ελαίου και του νερού, βοηθούν επίσης στην πρόγνωση του τύπου του γαλακτώματος, που πρόκειται να σχηματιστεί με μία ανατάραξη των 2 φάσεων. Εάν υπάρχει περισσότερο λάδι απ ό,τι νερό, το δεύτερο τείνει να μετατραπεί σε διάσπαρτα σταγονίδια. Παράγεται συνεπώς ένα γαλάκτωμα του τύπου Ν/Λ. Αντίθετα, όταν υπάρξει περισσότερο νερό σε σχέση με το λάδι, ευνοείται ο σχηματισμός γαλακτώματος Λ/Ν. Μεθοδολογία Κατ αρχήν, για τον προσδιορισμό του τύπου του γαλακτώματος γίνεται χρήση των χαρακτηριστικών χρωστικών ουσιών κυανούν του μεθυλενίου, που είναι υδατοδιαλυτή χρωστική (χρώματος μπλε), και Sudan III, που είναι λιποδιαλυτή χρωστική (χρώματος κόκκινου). Κατά την επαφή του γαλακτώματος με ισόποσο μίγμα των δύο χρωστικών, προκύπτει ο χρωματισμός, που αντιστοιχεί στην χρωστική εκείνη η οποία διαλύεται στη συνεχή φάση ενός γαλακτώματος. Υπενθυμίζεται ότι η συνεχής φάση ενός γαλακτώματος αποτελεί κατά κάποιον τρόπο το διαλύτη της διεσπαρμένης φάσης. Κατά συνέπεια, κόκκινος χρωματισμός υποδηλώνει τον τύπο Ν/Λ, ενώ μπλε χρωματισμός σημαίνει γαλάκτωμα του τύπου Λ/Ν. Σχετική με την παραπάνω μέθοδο προσδιορισμού του τύπου του γαλακτώματος (με χρήση χρωστικών), είναι και η μέθοδος της αραίωσης των 106

107 γαλακτωμάτων. Και πάλι επειδή η συνεχής φάση ενός γαλακτώματος παίζει το ρόλο του διαλύτη, η σχετική αραίωση του γαλακτώματος καθίσταται εφικτή, μόνον όταν το μέσο αραίωσης (λάδι ή νερό) είτε είναι το ίδιο είτε είναι άλλη ουσία πλήρως αναμίξιμη με τη συνεχή φάση. Η συμπεριφορά αυτή των γαλακτωμάτων χρησιμοποιείται επίσης και κατά τις διαδικασίες αραίωσής τους. Έτσι η μαγιονέζα αραιώνεται π.χ. με το ξύδι (υδατική φάση) ενώ δεν είναι δυνατόν να αραιωθεί με λάδι. Αντίθετα η μαργαρίνη μπορεί να αραιωθεί μόνον με λάδι. Για τη μελέτη της ικανότητας, που έχουν τα διάφορα βρώσιμα λίπη να προσροφούν νερό και να σχηματίζουν έτσι γαλακτώματα, χρησιμοποιούνται διάφορα προϊόντα τα οποία, με τη βοήθεια ηλεκτρικού αναμίκτη (μίξερ), αναμιγνύονται με νερό. Το νερό προσροφάται από το κάθε λίπος σε διαφορετικές ποσότητες. Ως τελικό σημείο της προσθήκης και άρα του υπολογισμού της ποσότητας νερού που προσροφάται από το λίπος, λαμβάνεται το σημείο κατά το οποίο οι δύο φάσεις (λιπαρή υδατική) αρχίζουν να ξεχωρίζουν. Η ιδιότητα αυτή των λιπών εξαρτάται και από τη δομή των τριγλυκεριδίων που τα απαρτίζουν. Τέλος, για τη μελέτη της δράσης των γαλακτωματοποιητών και των σταθεροποιητών γαλακτωμάτων, δημιουργούνται διάφορα γαλακτώματα στα οποία προστίθενται οι αντίστοιχες ουσίες. Εξετάζεται η δράση των συστατικών του αυγού, ως του πλέον "παραδοσιακού" γαλακτωματοποιητή και της ζελατίνης, ως σταθεροποιητή και υπολογίζεται η ικανότητά τους, ανάλογα με το χρόνο που απαιτείται για το διαχωρισμό των 2 φάσεων, αφότου το μίγμα παραμείνει σε ηρεμία. 107

108 Εργαστηριακός εξοπλισμός Αντιδραστήρια ηλεκτρικός αναμίκτης (μίξερ) προχοΐδες δοκιμαστικοί σωλήνες ύαλοι ωρολογίου ποτήρια ζέσεως (100 ml και 250 ml) κυανό του μεθυλενίου (σκόνη) Sudan III (σκόνη) μαγειρικό λίπος (λαρδί) βούτυρο (νωπό) μαργαρίνη μαλακή μαργαρίνη ελαιόλαδο ή σπορέλαιο μαγιονέζα μουστάρδα αυγό (κρόκος και ασπράδι) ζελατίνη (1% υδατικό διάλυμα) Πορεία εργασίας α) Προσδιορισμός του τύπου γαλακτώματος 1) Με τη βοήθεια χρωστικών ουσιών i) Μίγμα ίσων ποσοτήτων κυανούν του μεθυλενίου και Sudan III κονιοποιείται σε μικρή κάψα ή γουδί. ii) Σε υάλους ωρολογίου φέρεται ποσότητα 2 3 g μαγιονέζας, μουστάρδας, νωπού βουτύρου και μαργαρίνης. iii) Μικρή ποσότητα του μίγματος των χρωστικών φέρεται σε επαφή με το γαλάκτωμα (με τη βοήθεια σπάτουλας) στην άκρη ή / και στην επιφάνειά του, χωρίς να αναμιχθεί με αυτό. Παρατηρούνται οι χρώσεις και προσδιορίζεται ο τύπος του γαλακτώματος. 2) Με αραίωση i) Ποσότητα περίπου 5 g από το καθένα από τα παραπάνω 108

109 γαλακτώματα (μαγιονέζα, μουστάρδα, νωπό βούτυρο, μαργαρίνη) φέρεται σε 8 διαφορετικά ποτήρια ζέσεως των 100 ml. Δημιουργούνται έτσι 2 σειρές δειγμάτων από τα 4 γαλακτώματα. ii) Στην πρώτη σειρά των δειγμάτων προσθέτουμε σε κάθε ποτήρι ζέσεως από 8 10 ml νερού, ενώ στη δεύτερη σειρά των δειγμάτων από 8 10 ml ελαιολάδου ή σπορέλαιου. iii) Με υάλινη ράβδο ανακατεύουμε το περιεχόμενο κάθε δείγματος και παρατηρούμε τα αποτελέσματα. iv) Συγκρίνουμε τα αποτελέσματα με την προηγούμενη μέθοδο (χρωστικών ουσιών) και εξάγουμε συμπεράσματα για τη δυνατότητα αραίωσης των διαφόρων γαλακτωμάτων σε σχέση με τον τύπο στον οποίο ανήκουν (Λ/Ν ή Ν/Λ). β) Υπολογισμός προσροφούμενου ύδατος-γαλακτωματοποιητικής ικανότητας λιπιδίων 1) Ποσότητα 50 g από καθένα από τα λιπίδια: μαγειρικό λίπος, νωπό βούτυρο, μαργαρίνη, μαλακή μαργαρίνη και ελαιόλαδο, φέρεται σε ποτήρι ζέσεως των 250 ml. 2) Με μικρό ηλεκτρικό αναδευτήρα (μίξερ) και σε χαμηλή ταχύτητα, αναδεύεται το κάθε δείγμα, ενώ συγχρόνως προστίθεται σε αυτό νερό με σταθερή ροή (περίπου 10 ml / min) από προχοΐδα. 3) Η προσθήκη του νερού σταματά στο σημείο όπου παρατηρείται διαχωρισμός των 2 φάσεων του γαλακτώματος και τότε σημειώνεται ο όγκος του νερού που προσροφήθηκε από 50 g του κάθε λιπιδίου. 4) Τα αποτελέσματα παριστάνονται γραφικά και εξάγονται συμπεράσματα για τη γαλακτωματοποιητική ικανότητα των λιπιδίων. 109

110 γ) Δράση γαλακτωματοποιητών και σταθεροποιητών 1) Σε κάθε έναν από 4 δοκιμαστικούς σωλήνες προστίθεται 5 ml ελαιολάδου και ακολούθως: στον α δοκιμαστικό σωλήνα 5 ml νερού στο β δοκιμαστικό σωλήνα 5 ml κρόκου αυγού (υδατική αραίωση 1:1, β/β) στο γ δοκιμαστικό σωλήνα 5 ml ασπραδιού αυγού (υδατική αραίωση 1:1, β/β) στο δ δοκιμαστικό σωλήνα 5 ml διαλύματος ζελατίνης (1%) 2) Ο κάθε δοκιμαστικός σωλήνας, αφού πωματιστεί, ανακινείται έντονα επί 1 2 min με το χέρι και στη συνέχεια αφήνεται σε ηρεμία σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (χρονική στιγμή t 0 ). 3) Σημειώνονται τα χρονικά διαστήματα που μεσολαβούν από t 0 μέχρι της στιγμής όπου αρχίζει ο διαχωρισμός των 2 φάσεων (t 1 ) και μέχρις ότου αυτός ολοκληρωθεί (t 2 ), όπου βέβαια παρατηρείται το ανάλογο φαινόμενο. 4) Τα αποτελέσματα παριστάνονται γραφικά με ραβδόγραμμα των 2 χρόνων (t 1 και t 2 ) σε έναν άξονα και εξάγονται συμπεράσματα για τη δράση των γαλακτωματοποιητών και των σταθεροποιητών των γαλακτωμάτων. 110

111 ΠΕΙΡΑΜΑ Δ 2 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ Σκοπός Υπολογισμός της περιεκτικότητα των τροφίμων σε λιπαρές ύλες. Από τη Θεωρία στην Πράξη Κατά κανόνα, όταν για ένα τρόφιμο αναφέρεται η σε λίπος περιεκτικότητά του (βιβλιογραφία, στη συσκευασία κτλ), αυτή αφορά το σύνολο των λιπιδίων, των διαλυτών δηλαδή συστατικών σε μη-πολικούς οργανικούς διαλύτες και όχι μόνο τα τριγλυκερίδια (λίπη έλαια). Βέβαια, για την πλειοψηφία των τροφίμων, όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως τα τριγλυκερίδια συνιστούν περίπου το 99% των λιπιδίων και μόνο ένα μικρό ποσοστό από αυτά ανήκει σε άλλες κατηγορίες ενώσεων όπως τα φωσφολιπίδια, τα σφιγγολιπίδια, τα στεροειδή, τα τερπένια, τις λιποδιαλυτές βιταμίνες (A, D, E, K) και τους κηρούς. Έτσι, λαμβάνοντας υπόψη και την ευκολία με την οποία μπορεί να προσδιοριστεί το συνολικό ποσό των λιπιδίων, σε αντίθεση με τον κατ αποκλειστικότητα προσδιορισμό των λιπών / ελαίων μόνο, οι όροι λίπος και λιπίδια χρησιμοποιούνται αδιακρίτως, τουλάχιστον όσον αναφορά την ανάλυση των τροφίμων και το διατροφικό της περιεχόμενο. Η επισήμανση της διάκρισης έχει πρακτική σημασία μόνο για τρόφιμα που περιέχουν κρόκο αυγού και βέβαια για τον ίδιο τον κρόκο του αυγού, αφού σ αυτόν, από το 33% των συνολικών λιπιδίων που περιέχει, το 28% είναι 111

112 φωσφολιπίδια και το 5% χοληστερόλη (κυρίως) μαζί με κάποιες άλλες υποκατηγορίες λιπιδίων. Βέβαια, υπάρχουν και τριγλυκερίδια (περίπου 67%). Για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας των τροφίμων σε λίπος χρησιμοποιούνται πολλές και διάφορες μέθοδοι. Αυτές κατατάσσονται σε τρεις κατηγορίες: βαρομετρικές μέθοδοι εκχύλισης με διαλύτες ογκομετρικές μέθοδοι ενόργανες μέθοδοι Δεδομένου ότι οι δύο τελευταίες κατηγορίες εξετάζονται σε άλλα Εργαστήρια (λιπών ελαίων ή ενόργανης ανάλυσης), στο Εργαστήριο Χημείας Τροφίμων θα αναπτυχθεί μια "παραδοσιακή" μέθοδος εκχύλισης (Soxhlet), η οποία ανήκει στις βαρομετρικές μεθόδους. Κατά τις μεθόδους αυτές το λίπος εκχυλίζεται από τα τρόφιμα, με ελάχιστη έκθεσή του σε φως και θερμότητα (ήπιες συνθήκες), με τη βοήθεια του κατάλληλου διαλύτη. Στη συνέχεια ο διαλύτης απομακρύνεται και παραμένει το λίπος, το οποίο και ζυγίζεται. Ο βαθμός απόδοσης της μεθόδου αυτής εξαρτάται από πολλούς παράγοντες. Σ αυτούς συγκαταλέγονται: το ποσό του "ελεύθερου" λίπους το οποίο υπάρχει στο τρόφιμο, δεδομένου ότι μπορεί να υπάρχει και λίπος ενωμένο με άλλα συστατικά του τροφίμου, όπως οι πρωτεΐνες και οι υδατάνθρακες, η πολικότητα του διαλύτη που χρησιμοποιείται για την εκχύλιση, η μέθοδος που εφαρμόζεται για την αποδέσμευση των ενωμένων λιπιδίων. Οι διαλύτες οι οποίοι χρησιμοποιούνται για την εκχύλιση του λίπους δεν αναμιγνύονται προφανώς με το νερό. Σ αυτούς, δηλαδή τους μη πολικούς οργανικούς διαλύτες περιλαμβάνονται ο διαιθυλαιθέρας, ο πετρελαϊκός αιθέρας, 112

113 το διχλωρομεθάνιο, καθώς και μίγματα χλωροφορμίου μεθανόλης. Στο σημείο αυτό σημειώνεται ότι λόγω της επικινδυνότητας των χλωριωμένων υδρογονανθράκων (χλωροφόρμιο, διχλωρομεθάνιο κτλ) η χρήση αυτών, καλό είναι να αποφεύγεται. Όπου δε, δεν υπάρχει ανάλογος αντικαταστάτης τους, οι διάφορες διεργασίες (εκχύλιση, εξάτμιση κτλ) θα πρέπει να εκτελούνται με μεγάλη προσοχή και οπωσδήποτε στον απαγωγό. Μεθοδολογία Η μέθοδος Soxhlet είναι ίσως η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδος υπολογισμού της σε λίπος περιεκτικότητας ενός τροφίμου. Βασίζεται στη συνεχή και επί 1 περίπου ώρα εκχύλιση του λίπους από το τρόφιμο με μη πολικό διαλύτη, όπως π.χ. πετρελαϊκό αιθέρα (Σχήμα Δ.2.1). Σύμφωνα με αυτή, ορισμένη ποσότητα του τροφίμου τοποθετείται μέσα σε πορώδη θήκη (χοάνη), που έχει το σχήμα μεγάλου δοκιμαστικού σωλήνα. Ο διαλύτης φέρεται μέσα σε στενή σφαιρική φιάλη απόσταξης, η οποία έχει προηγουμένως ζυγιστεί. Στη συνέχεια θερμαίνεται ο διαλύτης. Αυτός, εξατμιζόμενος συμπυκνώνεται και συλλέγεται σε υποδοχέα ο οποίος περιέχει και τη θήκη του πορώδους υλικού με το τρόφιμο. Ο διαλύτης αναμιγνύεται με το τρόφιμο, διαλύει το λίπος του και όταν φθάσει σε ορισμένο ύψος (όγκο), μεταγγίζεται αυτόματα (με σιφωνισμό) στην αρχική σφαιρική αποστακτική φιάλη όπου είχε πρωτοποθετηθεί. Η διεργασία αυτή επαναλαμβάνεται συνεχώς για 1 περίπου ώρα, οπότε εκτιμάται ότι έχει εκχυλιστεί όλη η ποσότητα του περιεχόμενου στο τρόφιμο λίπους, και έχει μεταφερθεί σε διάλυμα στην αποστακτική φιάλη. Απομάκρυνση του διαλύτη έχει ως αποτέλεσμα την παραμονή υπολείμματος στη φιάλη, το οποίο αποτελείται από το λίπος που υπήρχε αρχικά στο τρόφιμο. Η φιάλη ζυγίζεται 113

114 ξανά και η αύξηση του βάρους της αντιστοιχεί προφανώς στο περιεχόμενο λίπος. αποστακτήρας Ηθμός με προς εκχύλιση ουσία Θερμαντικό στοιχείο Διαλύτης και εκχύλισμα Σχήμα Δ.2.1. Προσδιορισμός λιπαρών υλών με τη μέθοδο Soxhlet. Σε μερικά τρόφιμα, όπως για παράδειγμα τα κρεατοσκευάσματα και τα τυριά, όπου μέρος του λίπους μπορεί να βρίσκεται ενωμένο με άλλες ουσίες (συνήθως πρωτεΐνες), το τρόφιμο πρέπει πρώτα να κατεργάζεται με υδροχλωρικό οξύ. Η διαδικασία αυτή επιβάλλεται για να απελευθερωθεί όλο το υπάρχον λίπος του τροφίμου, προτού ξεκινήσει η εκχύλιση-παραλαβή του με 114

115 τον οποιοδήποτε διαλύτη. Επειδή βέβαια η κατεργασία γίνεται σε υδατικό διάλυμα, το λίπος παραμένει αδιάλυτο ενώ με τη διήθηση που ακολουθεί, απομακρύνεται το οξύ το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την αποδέσμευση των λιπιδίων από τις ενώσεις με τις οποίες ήταν ενωμένο. Η μέθοδος Soxhlet, καθώς και οι διάφορες παραλλαγές της, είναι γενικά αποδεκτή και παρουσιάζει μεγάλη ακρίβεια και επαναληψιμότητα των μετρήσεων. Είναι όμως αρκετά χρονοβόρα και θα πρέπει να λαμβάνεται ιδιαίτερη πρόνοια για τη χρησιμοποίηση επικίνδυνων και κυρίως εύφλεκτων διαλυτών. Εργαστηριακός εξοπλισμός-αντιδραστήρια συσκευή Soxhlet (αποστακτική σφαιρική φιάλη, εκχυλιστήρας) χοάνη εκχύλισης (πορώδης ελεύθερη λιπαρών) ποτήρια ζέσεως (250 ml και 100 ml) κωνική φιάλη (250 ml) υδατόλουτρο κάθετος ψυκτήρας φούρνος τρόφιμο (δημητριακά, κρεατοσκεύασμα, τυρί κ.λπ.) πετρελαϊκός αιθέρας (40º 60º) πυκνό υδροχλωρικό οξύ υαλοβάμβακας Πορεία εργασίας α) Φυτικά τρόφιμα (δημητριακά, ξηροί καρποί κτλ) 1) Συναρμολογείται η συσκευή Soxhlet (εκχυλιστήρας, ψυκτήρας και αποστακτική φιάλη η οποία έχει προηγουμένως ξηρανθεί και ζυγιστεί). 115

116 2) Ζυγίζεται με ακρίβεια ποσότητα 2 3 g του τροφίμου στη χοάνη Soxhlet και καλύπτεται, με σύγχρονη ελαφρά συμπίεση, με λίγο υαλοβάμβακα. Η χοάνη Soxhlet τοποθετείται μέσα στον εκχυλιστήρα στον οποίο προστίθεται πετρελαϊκός αιθέρας μέχρις ότου δημιουργηθεί σιφωνισμός. 3) Αφού δημιουργηθεί σιφωνισμός, συνεχίζεται η προσθήκη και νέας ποσότητας πετρελαϊκού αιθέρα έως ότου το δοχείο του εκχυλιστήρα γεμίσει κατά 50% (μέχρι περίπου τη μέση). Επιβεβαιώνεται η καλή επαφή των συνδέσμων (εσμιρυσμένων) και αρχίζει η θέρμανση της φιάλης με ηλεκτρικό θερμαντικό μανδύα ή κατά προτίμηση με υδατόλουτρο. Η θερμοκρασία (και στις δύο περιπτώσεις θέρμανσης) ρυθμίζεται έτσι ώστε ο διαλύτης να βράζει ήπια. Η παροχή θερμότητας συνεχίζεται μέχρις ότου δημιουργηθούν τουλάχιστον 10 σιφωνισμοί. 4) Ο διαλύτης απομακρύνεται με απόσταξη και συλλέγεται για να επαναχρησιμοποιηθεί. Μετά την απομάκρυνση και των ελαχίστων ποσοτήτων του διαλύτη με εντονότερη θέρμανση (προσοχή: θα έχει πρώτα αποσταχθεί / απομακρυνθεί όλος ο διαλύτης και μόνον ίχνη αυτού ενδέχεται να έχουν εγκλωβιστεί στη μάζα του ρευστού λίπους) η φιάλη ψύχεται και ζυγίζεται. Η διαφορά βάρους από την αρχική ζύγιση εκφράζει το περιεχόμενο στο λίπος τρόφιμο. 5) Οι λιπαρές ύλες υπολογίζονται ως η % περιεκτικότητα του τροφίμου σε λίπος, από τον τύπο: % λίπος W W W 2 1 αρχ. 100 όπου W 1 = βάρος (σε g) της κενής αποστακτικής φιάλης W 2 = βάρος φιάλης + βάρος λίπους (σε g) 116

117 W 3 = βάρος δείγματος τροφίμου (σε g) β) Προϊόντα κρέατος Στα τρόφιμα αυτής της κατηγορίας (αλλαντικά κτλ) αλλά και σε ορισμένα άλλα που περιέχουν π.χ. ξηρούς καρπούς ή τυριά, μέρος του λίπους μπορεί να βρίσκεται ενωμένο με πρωτεΐνες. Στις περιπτώσεις αυτές η πορεία της εργασίας έχει ως εξής: 1) Ζυγίζονται με ακρίβεια περίπου 5 g του τροφίμου και το δείγμα φέρεται σε ποτήρι ζέσεως των 250 ml. Σ αυτό προστίθενται 65 ml ύδατος και 35 ml πυκνού υδροχλωρικού οξέος. Η όλη διεργασία γίνεται στον απαγωγό, στον οποίο και παραμένει το δείγμα επί 15 min, μετά την προσθήκη του υδροχλωρικού οξέος. 2) Το μίγμα διηθείται στη συνέχεια μέσω θερμού, πτυχωτού, διαβρεγμένου με νερό, χάρτινου ηθμού. Το μέγεθος του ηθμού πρέπει να είναι τέτοιο, που να χωράει στο εσωτερικό της χοάνης Soxhlet. Το ευρισκόμενο στο ποτήρι ζέσεως μίγμα μεταφέρεται (στο σύνολό του) στο διηθητικό χωνί με τη βοήθεια και λίγου ζεστού νερού. Ακολουθεί έκπλυση του περιεχομένου του ηθμού (με ζεστό νερό) μέχρις ότου εξαφανισθεί η οξύτητα από τα εκπλύματα (κανονικά τα εκπλύματα ελέγχονται με διάλυμα 0,1 Μ νιτρικού αργύρου). 3) Ο ηθμός με το περιεχόμενό του μεταφέρονται στην πορώδη εκχυλιστική χοάνη Soxhlet και το σύνολο αυτό τοποθετείται σε ποτήρι ζέσεως των 100 ml, το οποίο εισάγεται σε φούρνο θερμοκρασίας 100º, για 6 8 ώρες. Ξηραίνεται επίσης και το ποτήρι ζέσεως των 250 ml που χρησιμοποιήθηκε για την κατεργασία με το υδροχλωρικό οξύ (βήμα 1, παραπάνω). Μια κωνική φιάλη των 250 ml, με μερικά τεμαχίδια πορσελάνης ή άλλο υλικό 117

118 που εξασφαλίζει ήπιο βρασμό, ξηραίνεται και αυτή στον ίδιο φούρνο (100º) επί 1 ώρα και στη συνέχεια ψύχεται και ζυγίζεται. 4) Η εκχυλιστική χοάνη, μετά την ξήρανση και ψύξη της, φέρεται στη συσκευή Soxhlet. Τα δύο ποτήρια ζέσεως (100 και 250 ml), αφού ψυχθούν και αυτά, εκπλένονται με 150 ml πετρελαϊκό αιθέρα. Όλα τα εκπλύματα μεταγγίζονται στον υποδοχέα της εκχυλιστικής χοάνης Soxhlet. Ακολουθεί προσθήκη της απαραίτητης ποσότητας του διαλύτη και κατεργασία όπως προηγουμένως (γενικός τρόπος). 118

119 ΠΕΙΡΑΜΑ Δ 3 ΣΑΠΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΛΙΠΩΝ ΚΑΙ ΕΛΑΙΩΝ Σκοπός Η μελέτη της υδρολυτικής διάσπασης λιπών και ελαίων, με χημικά μέσα και η μετατροπή τους σε σάπωνες. Από τη Θεωρία στην Πράξη Μία από τις πιο σημαντικές αντιδράσεις που υφίστανται τα λιπίδια είναι η υδρόλυση (λιπόλυση). Η αντίδραση μπορεί να γίνει είτε με χημικά μέσα (π.χ. καυστικό νάτριο) είτε ενζυμικά. Κατά τη λιπόλυση με αλκάλια παράγεται γλυκερίνη καθώς και τα άλατα των οξέων που απαρτίζουν το λιπίδιο, δηλαδή τον εστέρα της γλυκερόλης. Τα άλατα αυτά ονομάζονται σάπωνες και η υδρολυτική διάσπαση σαπωνοποίηση. Υπενθυμίζεται ότι οι σάπωνες με ασβέστιο και μαγνήσιο είναι δυσδιάλυτοι στο νερό, σε αντίθεση με αυτούς που περιέχουν Na + ή Κ +. Για το λόγο αυτό άλλωστε, οι σάπωνες δεν δρουν ικανοποιητικά με σκληρό νερό. Μετά το τέλος της αντίδρασης της σαπωνοποίησης και προκειμένου να διαχωριστούν οι σάπωνες από το υπόλοιπο μίγμα, προστίθεται σ αυτό χλωριούχο νάτριο. Οι σάπωνες καθίστανται έτσι περισσότερο δυσδιάλυτοι και ειδικώς (σχετικό ειδικό βάρος) ελαφρότεροι, οπότε και επιπλέουν. Η διεργασία αυτή καλείται εξαλάτωση. Στη συνέχεια ψύχονται, στερεοποιούνται και έτσι διαχωρίζονται από τα υπόλοιπα συστατικά του μίγματος. Σημειώνεται ότι η 119

120 υδρόλυση των λιπών και ελαίων είναι εφικτή και σε όξινο περιβάλλον (κυρίως με αρωματικά σουλφοξέα). Μεθοδολογία Ορισμένη ποσότητα λίπους θερμαίνεται υπό συνεχή ανάδευση με διάλυμα καυστικού νατρίου. Δημιουργείται γαλάκτωμα το οποίο με περαιτέρω θέρμανση (και ανάδευση) σχηματίζει σάπωνα, σύμφωνα με την αντίδραση: R 2 R + 3Na 3RNa + 2 R 2 2 λίπος σάπωνες γλυκερίνη Εάν στο μίγμα προστεθεί άλμη, ο σάπωνας εξαλατώνεται και μπορεί να παραληφθεί με διήθηση (ίζημα). Εργαστηριακός εξοπλισμός Αντιδραστήρια κάψες ποτήρια ζέσεως (250 και 500 ml) λίπος ή έλαιο υδατικό διάλυμα Na (1:1 w/w) κορεσμένο υδατικό διάλυμα Nal (σε 1l νερού διαλύονται 356 g Nal) απεσταγμένο νερό, για την παρασκευή των διαλυμάτων αραιώσεων Πορεία εργασίας 1) Σε μεγάλη κάψα φέρεται ποσότητα περίπου 10 g λίπους, το οποίο θερμαίνεται μέχρις ότου τακεί. 120

121 2) Στο θερμό (όχι καυτό) λίπος, προστίθεται αργά, προσεκτικά και με συνεχή ανάδευση 5 ml διαλύματος Na. Όταν σχηματιστεί γαλάκτωμα, αυτό θερμαίνεται ήπια υπό συνεχή ανάδευση μέχρις ότου το γαλάκτωμα μετατραπεί σε λευκή, ελαφρά θολή μάζα. 3) Το προϊόν (σάπωνας) μεταφέρεται σε ποτήρι ζέσεως των 500 ml και προστίθενται σ αυτό 100 ml καυτού απεσταγμένου νερού. Η θέρμανση συνεχίζεται καθώς και η ήπια ανάδευση, μέχρις ότου παραχθεί μια ομοιογενής μάζα (πάστα). 4) Στην πάστα αυτή προστίθενται 200 ml θερμού κορεσμένου διαλύματος Nal και το μίγμα αναδεύεται συνεχώς. Σχηματίζεται τότε προοδευτικά ίζημα το οποίο όμως επιπλέει στην άλμη. 5) Το μίγμα διηθείται από πτυχωτό ηθμό και το ίζημα εκπλένεται με απεσταγμένο νερό (μέχρις ότου απομακρυνθεί η περίσσεια του χλωριούχου νατρίου), ξηραίνεται και παραλαμβάνεται ο σάπωνας. 121

122 ΠΕΙΡΑΜΑ Δ 4 ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΛΙΠΙΔΙΩΝ Σκοπός Η μελέτη της δράσης των ενζύμων στα λίπη και τα έλαια (υδρολυτικό τάγγισμα). Από τη Θεωρία στην Πράξη Εκτός από τη δράση των χημικών μέσων στα λίπη και τα έλαια η οποία οδηγεί στην υδρολυτική τους διάσταση, τα λιπίδια έχουν επίσης τη δυνατότητα να υδρολυθούν και ενζυμικά. Προκύπτουν προφανώς ανάλογα προϊόντα, με τη διαφορά ότι σε αντιδιαστολή με την υδρόλυση π.χ. με καυστικό νάτριο τα παραγόμενα λιπαρά οξέα ευρίσκονται σε ελεύθερη μορφή. Η ενζυμική υδρόλυση είναι η κατ εξοχήν παρατηρούμενη λιπόλυση που λαμβάνει χώρα στη φύση, τόσο στους ζωικούς και φυτικούς ιστούς (π.χ. λεπτό έντερο, ελαιούχοι σπόροι φυτών) όσο και στα διάφορα τρόφιμα (π.χ. γάλα και γαλακτοκομικά προϊόντα). Όπως αναφέρθηκε και στην εισαγωγή της Ενότητας Δ, τα προϊόντα της ενζυμικής υδρόλυσης είναι άλλοτε ανεπιθύμητα (υδρολυτική τάγγιση) και άλλοτε επιθυμητά (ελεγχόμενη λιπόλυση για παρασκευή γιαουρτιού). Οι παράγοντες που επηρεάζουν την ενζυμική υδρόλυση είναι βασικά τα λιπολυτικά ένζυμα καταλύτες (λιπάσες), η υγρασία και η θερμοκρασία. Τα μεν λιπολυτικά ένζυμα μπορούν εύκολα να αδρανοποιηθούν με θέρμανση, η δε 122

123 θερμοκρασία και υγρασία αποκλείονται, όταν η λιπαρή ύλη ή το τρόφιμο που την περιέχει, παραμένουν σε σχετικά ψυχρό και ξηρό περιβάλλον. Με αυτούς τους τρόπους παρεμποδίζεται και το υδρολυτικό τάγγισμα. Ανάλογες παρεμβάσεις είναι ιδιαίτερα κρίσιμες κατά την παρασκευή του γάλακτος ή των γαλακτοκομικών προϊόντων δεδομένου ότι το βουτυρικό οξύ που ελευθερώνεται κατά το υδρολυτικό τάγγισμα έχει εξαιρετικά δυσάρεστη και έντονη οσμή (και γεύση). Μεθοδολογία Οι εστερικοί δεσμοί που υπάρχουν στα λιπίδια ενός γαλακτώματος το οποίο σχηματίζεται κατά την ανάμιξη σπορέλαιου με νερό, διασπώνται με τη δράση της λιπάσης: παγκρεατίνη. Το διάλυμα στο οποίο δρα το ένζυμο μετατρέπεται από ελαφρά αλκαλικό, που είχε καταστεί πριν την υδρόλυση, σε ελαφρά όξινο. Αποδεικνύεται έτσι ο σχηματισμός ελεύθερων λιπαρών οξέων σύμφωνα με την αντίδραση: 2 ΟR 1 R R 3 λιπάση R 1 + R 2 + R 3 2 Μέρος του ενζύμου αδρανοποιείται με βρασμό και δοκιμάζεται ξανά στο αρχικό προς υδρόλυση, γαλάκτωμα. Παραμονή του p στα αρχικά επίπεδα αποδεικνύει την καταλυτική δράση αλλά και την ευαισθησία της λιπάσης στη θερμοκρασία. Εργαστηριακός εξοπλισμός Αντιδραστήρια 123

124 θερμοστατούμενο υδατόλουτρο (40º) δοκιμαστικοί σωλήνες πεχαμετρικός χάρτης διάλυμα φαινολοφθαλεΐνης (δείκτης) σπορέλαιο γαλακτωματοποιητής (π.χ. χολικά άλατα) αραιό διάλυμα 3 αραιό διάλυμα Na 2 3 παγκρεατίνη (1% διάλυμα) Πορεία εργασίας 1) Σε δοκιμαστικό σωλήνα, δημιουργείται γαλάκτωμα του τύπου Λ/Ν, με ανακίνηση 5 ml σπορέλαιου, 5 ml νερού και μικρής ποσότητας χολικών αλάτων. 2) Το γαλάκτωμα καθίσταται ελαφρά αλκαλικό με τη βοήθεια είτε διαλύματος 3 είτε διαλύματος Na 2 3 και δείκτη φαινολοφθαλεΐνη (ελαφρά ροζ χρωματισμός). Στη συνέχεια, χωρίζεται σε 2 ίσες ποσότητες σε δοκιμαστικούς σωλήνες. Οι 2 δοκιμαστικοί σωλήνες τοποθετούνται σε υδατόλουτρο θερμοκρασίας 40º. 3) Ελαφρά αλκαλικό καθίσταται (με πεχαμετρικό χάρτη) και διάλυμα της παγκρεατίνης (6 ml), το μισό από το οποίο φέρεται σε δοκιμαστικό σωλήνα που τοποθετείται σε υδατόλουτρο που βράζει, για 15 min. 4) Τα 3 ml του μη θερμανθέντος διαλύματος της παγκρεατίνης φέρονται στον ένα δοκιμαστικό σωλήνα με το γαλάκτωμα (υδατόλουτρο, 40º). Το ίδιο πραγματοποιείται και με τα 3 ml του θερμανθέντος διαλύματος του ενζύμου. Οι δύο σωλήνες παραμένουν στο θερμοστατούμενο υδατόλουτρο επί 1 ώρα. 5) Σε τακτά χρονικά διαστήματα, με τη βοήθεια πεχαμετρικού χάρτη, μετριέται το p του περιεχομένου των δοκιμαστικών σωλήνων και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται σε γράφημα. 124

125 Ενότητα Ε ΒΙΤΑΜΙΝΕΣ Οι βιταμίνες είναι οργανικές ενώσεις οι οποίες περιέχονται στις τροφές σε αρκετά μικρές ποσότητες. Ο ανθρώπινος οργανισμός δεν μπορεί να συνθέσει τις βιταμίνες και συνεπώς, αυτές πρέπει να προσλαμβάνονται με τη διατροφή μας. Όπως και τα ιχνοστοιχεία, είναι υπεύθυνες για τη φυσιολογική ανάπτυξη, συντήρηση και λειτουργία του οργανισμού. Για το λόγο αυτό, η προστασία των βιταμινών κατά τη συντήρηση και κατεργασία των τροφίμων αποκτά ιδιαίτερη σημασία. Η απώλεια των βιταμινών μπορεί να οφείλεται είτε σε χημικές αντιδράσεις, οι οποίες τις μετατρέπουν σε ανενεργά συστατικά ή, στην περίπτωση των υδατοδιαλυτών βιταμινών, σε απομάκρυνσή τους κατά το μαγείρεμα. Δίαιτες, πτωχές σε βιταμίνες μπορεί να οδηγήσουν σε υποβιταμίνωση ή ακόμα και σε αβιταμίνωση. Η υποβιταμίνωση ορίζεται ως η ύπαρξη μίας ή περισσοτέρων βιταμινών στον οργανισμό σε συγκεντρώσεις όμως αρκετά χαμηλότερες των απαιτούμενων. Η αβιταμίνωση είναι ουσιαστικά ασθένεια του οργανισμού και αναφέρεται σε ιδιαίτερα χαμηλές συγκεντρώσεις ή απουσία βιταμίνης βιταμινών από τον οργανισμό, που μπορεί να τον οδηγήσουν ακόμα και στο θάνατο. Ωστόσο, η πρόσληψη βιταμινών, ιδιαίτερα των λιποδιαλυτών, πρέπει και αυτή να ακολουθεί τον κανόνα του μέτρου. Όπως θα αναφερθεί στην αναλυτική παρουσίαση των επιμέρους βιταμινών, υπάρχουν βιταμίνες οι οποίες σε υψηλές συγκεντρώσεις εμφανίζουν σοβαρές τοξικές δράσεις στον οργανισμό. Θα πρέπει λοιπόν ο τελευταίος, να προστατεύεται από 125

126 υπερβολικές συγκεντρώσεις βιταμινών, δηλαδή από τις οριζόμενες ως υπερβιταμινώσεις. Οι βιταμίνες χωρίζονται σε διάφορες κατηγορίες, όχι ανάλογα με τη χημική δομή τους αλλά σύμφωνα με τη βιολογική και τη χημική τους δραστικότητα. Κατά συνέπεια, μία βιταμίνη μπορεί να περιλαμβάνει περισσότερες χημικές ενώσεις οι οποίες, όμως, εμφανίζουν παρόμοια βιολογική δράση. Όλες αυτές οι ενώσεις περιλαμβάνονται σε μια κατηγορία ή ομάδα, η οποία χαρακτηρίζεται συνήθως με ένα γράμμα του λατινικού αλφάβητου. Έτσι για παράδειγμα, ως βιταμίνη Α ορίζεται η ομάδα των ενώσεων: ρετινόλη, ρετινάλη, καθώς και τα καροτενοειδή. Οι βιταμίνες παρουσιάζουν διαφορετικές βιοχημικές συμπεριφορές και δράσεις. Μπορούν να δράσουν π.χ. ως αντιοξειδωτικά (βιταμίνες Α, και Ε), μπορεί να έχουν ορμονική δράση (βιταμίνη D), ακόμα και να ρυθμίσουν την ανάπτυξη κυττάρων και ιστών (βιταμίνη Α). Οι περισσότερες βιταμίνες, κυρίως δε αυτές του συμπλέγματος Β, εμφανίζουν ενζυμικές δράσεις (συνένζυμα) και λειτουργούν ως καταλύτες σε πληθώρα μεταβολικών αντιδράσεων. Δεδομένου ότι η παρουσία των βιταμινών στα τρόφιμα παρουσιάζει εποχιακές αλλά και γεωγραφικές/χωροταξικές διακυμάνσεις, που συνεπάγονται αυξομείωση συγκεντρώσεων των βιταμινών στο καθημερινό «τυπικό» διαιτολόγιο, τα τελευταία χρόνια, πολλοί επιστημονικοί φορείς και οργανώσεις υποστηρίζουν ότι: η περιστασιακή ή κατά περίπτωση χορήγηση βιταμινούχων σκευασμάτων είναι μάλλον αναγκαία. Πράγματι, οι βιταμίνες, αποτελούν μία από τις δημοφιλέστερες κατηγορίες των συμπληρωμάτων διατροφής. Ανάλογα με τη διαλυτότητά τους στο νερό ή στα λιπίδια, οι βιταμίνες χωρίζονται σε δύο κύριες κατηγορίες: α) τις λιποδιαλυτές βιταμίνες και β) τις υδατοδιαλυτές βιταμίνες. Στις λιποδιαλυτές βιταμίνες ανήκουν οι: βιταμίνη Α 126

127 (ρετινόλη), βιταμίνη D (καλσιφερόλη), βιταμίνη E (τοκοφερόλη) και βιταμίνη Κ (φυλλοκινόνη). Στις υδατοδιαλυτές βιταμίνες ανήκουν: οι βιταμίνες του συμπλέγματος Β και η βιταμίνη (ασκορβικό οξύ). Το σύμπλεγμα Β, περιλαμβάνει τις εξής βιταμίνες: B1 ή θειαμίνη, B2 ή ριβοφλαβίνη, B3 ή νιασίνη ή νικοτινικό οξύ, B5 ή παντοθενικό οξύ, B6 ή πυριδοξίνη, B7 ή βιοτίνη, B9 ή φολικό οξύ, B12 ή κοβαλαμίνη. 127

128 ΠΕΙΡΑΜΑ Ε 1 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΘΕΡΜΙΚΗΣ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ ΣΤΟ ΑΣΚΟΡΒΙΚΟ ΟΞΥ ΦΥΛΛΩΔΩΝ ΛΑΧΑΝΙΚΩΝ Σκοπός Ο προσδιορισμός του ασκορβικού οξέος (βιταμίνη ) σε πράσινα φυλλώδη λαχανικά μετά την επίδραση θερμικής επεξεργασίας υπό διαφορετικές συνθήκες, η σύγκριση των διαφορετικών διεργασιών και η εξαγωγή συμπερασμάτων ως προς το ποσοστό απώλειας της βιταμίνης μετά τη θερμική επεξεργασία. Από τη Θεωρία στην Πράξη Η φυσική μορφή της βιταμίνης είναι το L ασκορβικό οξύ (L ισομερές), ενώ το D ισομερές της έχει μικρότερη βιολογική δραστικότητα έναντι του L ισομερούς. Στα τρόφιμα προστίθεται πέραν της βιταμινικής του δράσης και ως αντιοξειδωτικό. Το L ισομερές είναι λευκή, κρυσταλλική ουσία με ελαφρά όξινη γεύση και ευδιάλυτη στο νερό. Έχει ισχυρές αναγωγικές ιδιότητες. Παρόλο που είναι χημικά σταθερό σε στερεή κατάσταση, τα διαλύματά του οξειδώνονται σχετικά εύκολα σε αλκαλικό περιβάλλον και υπό την επίδραση της θέρμανσης, του φωτός, του οξυγόνου και των μετάλλων. Τα υδατικά διαλύματα του ασκορβικού οξέος παρουσιάζουν σχετική σταθερότητα σε όξινο περιβάλλον. 128

129 Στην πορεία της οξείδωσης του ασκορβικού οξέος, το ασκορβικό οξύ μετατρέπεται αρχικά προς L δεϋδροασκορβικό οξύ (αντιστρεπτό στάδιο), το οποίο στη συνέχεια οξειδώνεται μη αντιστρεπτά προς δικετογουλονικό οξύ με μηδενική βιταμινική δράση. Το τελευταίο αποκαρβοξυλιώνεται, δίνοντας φουρφουράλη και 2. Σε επόμενα στάδια η φουρφουράλη δίνει μέσω αντιδράσεων συμπύκνωσης και πολυμερισμού ανάλογων της αντίδρασης Maillard σκουρόχρωμα τελικά προϊόντα. L-ασκορβικό οξύ DA L-δεϋροασκορβικό οξύ Η οξείδωση του ασκορβικού οξέος αποτελεί σημαντικό πρόβλημα, αφενός λόγω της απώλειας της αντιοξειδωτικής του δράσης και αφετέρου λόγω της παραγωγής σκουρόχρωμων, ανεπιθύμητων τελικών προϊόντων κατά την παρασκευή των χυμών. Η ταχύτητα οξείδωσης του ασκορβικού οξέος εξαρτάται από τη μερική πίεση του οξυγόνου, τη θερμοκρασία, το p και την παρουσία ιόντων βαρέων μετάλλων. 129

130 Μεθοδολογία Η απώλεια της βιταμίνης από τα λαχανικά συμβαίνει σε όλες τις θερμικές επεξεργασίες τους, όπως κατά τον βρασμό, το τηγάνισμα, το ζεμάτισμα, το μαγείρεμα με ατμό, με μικροκύματα και με χύτρα ταχύτητας. Στα βρασμένα λαχανικά η απώλεια της βιταμίνης κυμαίνεται από 28 έως 63%. Προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση της θερμικής επεξεργασίας στο περιεχόμενο ασκορβικό οξύ των φυλλωδών λαχανικών πραγματοποιούνται οι εξής χειρισμοί: Χειρισμός Α: Εμβάπτιση για 5min σε ζέον ύδωρ Χειρισμός Β: Εμβάπτιση για 5min σε ζέον διάλυμα κιτρικού οξέος 0,5% (w/v) Χειρισμός Γ: Εμβάπτιση για 5min σε ζέον διάλυμα 0,5% (w/v) ΝαΗ 3. Για τον ογκομετρικό προσδιορισμό της βιταμίνης χρησιμοποιείται μια από τις παλαιότερες μεθόδους που βασίζεται στις ισχυρές αναγωγικές ιδιότητες του ασκορβικού οξέος. Η ογκομέτρηση γίνεται με διάλυμα της χρωστικής ουσίας 2,6-διχλωροφαινυλινδοφαινόλης (αντιδραστήριο Tillman s). Η ένωση αυτή είναι έντονα κυανή σε ουδέτερο ή αλκαλικό περιβάλλον ενώ σε όξινο διάλυμα δίνει ρόδινη χροιά. Χρησιμοποιείται διάλυμα μεταφωσφορικού οξικού οξέος για να μειωθεί η οξείδωση του ασκορβικού οξέος, για την απενεργοποίηση των ενζύμων και τη μείωση της επίδρασης των ιόντων σιδήρου. Ο προσδιορισμός της βιταμίνης πραγματοποιείται στο ζωμό της θερμικής επεξεργασίας και στα εκχυλίσματα του επεξεργασμένου φυτικού ιστού προκειμένου να εξαχθούν συμπεράσματα για την ποσότητα του ασκορβικού οξέος που ανακτάται σε κάθε χειρισμό από τους παραπάνω, να συγκριθούν τα 130

131 αποτελέσματα των τριών διεργασιών και να σχολιασθούν σε σχέση με βιβλιογραφικά δεδομένα. Εργαστηριακός εξοπλισμός Ποτήρια ζέσεως (250 ml) Αναλυτικός ζυγός Κωνικές φιάλες 250 ml Ογκομετρικές φιάλες 100, 250 και 1000 ml Σιφώνια 2,5 & 10 ml Αντιδραστήρια Ύφασμα για φιλτράρισμα Χωνιά διήθησης Αποχυμωτής ή ηλεκτρικός αναμίκτης (μίξερ) Προχοΐδες Θερμαντική πλάκα Διάλυμα 2,6-διχλωροφαινυλινδοφαινόλης 0,03% w/v. Αποθηκεύεται σε σκουρόχρωμη γυάλινη φιάλη και φυλάσσεται στο ψυγείο αναλλοίωτο για 7 ημέρες. Μίγμα μεταφωσφορικού οξικού οξέος (3% w/v και 8% w/v). Μπορεί να παραμείνει αναλλοίωτο στο ψυγείο για 7 ημέρες. Πρότυπο διάλυμα ασκορβικού οξέος 0,1% w/v. Φυλάσσεται στο ψυγείο. Διάλυμα κιτρικού οξέος 0,5% w/v. Διάλυμα ΝαΗ 3 0,5% w/v. 131

132 Πορεία εργασίας 1) Τιτλοδότηση διαλύματος 2,6-διχλωροφαινυλινδοφαινόλης: Σε κωνική φιάλη των 250 ml μεταφέρονται 2 ml πρότυπου διαλύματος ασκορβικού οξέος, προστίθενται 25 ml μίγματος μεταφωσφορικού-οξικού οξέος και 25 ml νερού. Το διάλυμα της κωνικής φιάλης τιτλοδοτείται άμεσα με το διάλυμα 2,6- διχλωροφαινυλινδοφαινόλης. Το μπλε χρώμα αποχρωματίζεται όταν προστίθεται στο διάλυμα του ασκορβικού οξέος. Το τελικό σημείο της ογκομέτρησης διαπιστώνεται από τη ρόδινη χροιά του διαλύματος που παραμένει για 15 sec μετά από έντονη ανάδευση. Υπολογίζεται η ποσότητα του ασκορβικού οξέος (mg) που είναι ισοδύναμη με 1 ml διαλύματος 2,6- διχλωροφαινυλινδοφαινόλης. 2) Ζυγίζονται 10,00 g πράσινου φυλλώδους λαχανικού (σπανάκι, μπρόκολο, κουνουπίδι, κ.α.) και το δείγμα επεξεργάζεται ως εξής: Σε 3 ποτήρια ζέσεως των 250 ml που περιέχουν αντίστοιχα ίσους όγκους i) απιονισμένου ζέοντος νερού ii) ζέοντος διαλύματος κιτρικού οξέος 0,5 % w/v και iii) ζέοντος διαλύματος Na 3 0,5 % w/v εμβαπτίζονται για 5 min τα προζυγισμένα λαχανικά. Δίνεται προσοχή έτσι ώστε τα δείγματα των λαχανικών να είναι πλήρως βυθισμένα και εάν κριθεί απαραίτητο, συμπληρώνεται ο όγκος με απιονισμένο νερό. Μετά την πάροδο των 5 min διηθείται το περιεχόμενο των 3 ποτηριών ζέσεως σε ισάριθμες ογκομετρικές φιάλες των 250 ml, εκπλένεται το χωνί διήθησης με λίγο νερό και συμπληρώνεται κάθε ογκομετρική φιάλη στον όγκο με μίγμα μεταφωσφορικού οξικού οξέος. Το στερεό υπόλειμμα του δείγματος μεταφέρεται ποσοτικά με διαδοχικές εκπλύσεις με μίγμα μεταφωσφορικού οξικού οξέος και 132

133 αλέθεται σε ηλεκτρικό αναμίκτη πριν μεταφερθεί σε ογκομετρική φιάλη των 250 ml όπου συμπληρώνεται στον όγκο με μίγμα μεταφωσφορικού οξικού οξέος. Από τις ογκομετρικές φιάλες που περιέχουν το διήθημα και το διάλυμα του στερεού υπολείμματος της κάθε επεξεργασίας λαμβάνονται 50,0 ml και τιτλοδοτούνται με το διάλυμα της 2,6 διχλωροφαινυλινδοφαινόλης. Από την κατανάλωση, υπολογίζεται η ποσότητα του ασκορβικού οξέος i) στο διήθημα της κάθε επεξεργασίας και ii) στο επεξεργασμένο δείγμα και από το άθροισμά τους το ασκορβικό οξύ που έχει ανακτηθεί μετά από κάθε επεξεργασία, εκφρασμένο σε mg/100g φυτικού ιστού. Επίσης σχολιάζεται το ποσοστό απώλειας της βιταμίνης μετά από κάθε θερμική επεξεργασία και συγκρίνεται με βιβλιογραφικά δεδομένα. 133

134 Ενότητα ΣΤ ΑΝΕΠΙΘΥΜΗΤΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Κατά τις διάφορες διεργασίες ή επεξεργασίες που υφίστανται τα τρόφιμα είτε κατά το στάδιο της πρωτογενούς παραγωγής (καλλιέργειες) είτε κατά το στάδιο της μεταποίησης (παρασκευή αποθήκευση τροφίμων) ή ακόμα όταν αυτά παρασκευάζονται για ατομική ή μαζική κατανάλωση (μαγειρείο, εστιατόριο κτλ) σχηματίζονται ή παραμένουν ως υπολείμματα των διαφόρων χειρισμών, ορισμένες ουσίες οι οποίες μπορεί να έχουν δυσμενείς επιπτώσεις στην ποιότητα και την υγιεινή κατάσταση του τροφίμου. Οι ουσίες αυτές χαρακτηρίζονται ως ανεπιθύμητες, πολλές από τις οποίες είναι μάλιστα επικίνδυνες ή ακόμα και τοξικές. Στο σημείο αυτό, κρίνεται σκόπιμο να τονιστεί η διαφορά που υφίσταται μεταξύ της τοξικότητας (toxicity) μιας ουσίας και τις επικινδυνότητας ή του ενδεχόμενου κινδύνου (hazard), που προκύπτει από τη χρήση της. Ως τοξικότητα ορίζεται η εγγενής ικανότητα της ουσίας να προξενεί βλάβες στον οργανισμό, όταν δοκιμάζεται (ελέγχεται) μόνη της (αυτούσια), ενώ η επικινδυνότητα αναφέρεται στη δυνατότητα, που έχει μία ουσία να προξενεί βλάβες στον οργανισμό, υπό ορισμένες όμως προϋποθέσεις έκθεσής του σ αυτήν. Κάθε ουσία δηλαδή μπορεί να είναι τοξική σε κάποια δόση, αλλά σε φυσιολογικές δόσεις, δεν είναι επικίνδυνες όλες οι ουσίες. Αυτό επιβάλει τη συστηματική εξέταση της σχέσης: κίνδυνος / όφελος, που ισχύει για την παραγωγή και κατανάλωση των τροφίμων. Ιδιαίτερη προσοχή απαιτείται από 134

135 όσους εμπλέκονται στις κανονιστικές και νομοθετικές ρυθμίσεις και την πολιτική που υπαγορεύεται από τη χρήση ανάλογων ουσιών και οπωσδήποτε, όλους όσους έχουν αναλάβει το ιδιαίτερα κρίσιμο έργο της πληροφόρησης. Η παραπληροφόρηση σχετικά με λίστες καρκινογόνων ουσιών στις οποίες περιλαμβάνονται πολλά από τα φυσικά συστατικά των τροφίμων και εμφανίζονται στα έντυπα και ηλεκτρονικά μέσα ενημέρωσης (ακόμα και στο Internet) ή η διαφημιστική παραπλάνηση σχετικά με τα συμπληρώματα διατροφής, που λαμβάνονται ανεξέλεγκτα και σε υπερβολικές δόσεις (καφεΐνη, ταυρίνη, βιταμίνες Α και D) από ορισμένα άτομα, έχουν σίγουρα αρνητικές συνέπειες. Το έργο της Τοξικολογίας Τροφίμων είναι ιδιαίτερα δύσκολο δεδομένου ότι όλες οι μεταβολές που συνοδεύουν την είσοδο των επικινδύνων ή τοξικών ουσιών στον οργανισμό (εκτός των περιπτώσεων χημικών δηλητηριάσεων) είναι κατά κανόνα αργές και τα αποτελέσματα τους δεν εκδηλώνονται άμεσα και μονοσήμαντα. Στην περίπτωση δε των αντιδράσεων με το γενετικό υλικό είναι συνήθως μη αναστρέψιμες (καρκινογένεση). Πολλές έρευνες που εμπίπτουν στο χώρο της Τοξικολογίας Τροφίμων αφορούν την ταυτοποίηση της σχέσης δομής δραστικότητας αλλά και τους μηχανισμούς δράσης γεωργικών φαρμάκων (που εμφανίζονται στην τροφική αλυσίδα ως υπολείμματα), συντηρητικών (νιτρωδοενώσεις), τεχνητών χρωστικών και ορμονών, μονομερών υλικών συσκευασίας και μεταλλαξιογόνων, τα οποία προκύπτουν από επεξεργασίες που επιδέχονται τα τρόφιμα (θερμική προϊόντα Maillard και πολυαρωματικοί υδρογονάνθρακες, ακτινοβόληση ραδιολυτικά προϊόντα κτλ). Οι έρευνες αυτές αναφέρονται δηλαδή σε χημικές ενώσεις που εμφανίζονται στην τροφική αλυσίδα από εξωτερικές επεμβάσεις σ αυτήν. Ωστόσο ένα εξίσου σημαντικό μέρος της Χημικής Τοξικολογίας Τροφίμων αντιστέκεται στη 135

136 διερεύνηση των επιπτώσεων που έχουν στην Υγεία ορισμένες εγγενείς ουσίες, όπως κορεσμένα λιπίδια, trans λιπαρά οξέα, φυσικές τοξίνες, αλκοόλη κτλ. Η μελέτη του σχηματισμού, του μηχανισμού δράσης ή της ανίχνευσης, της τακτοποίησης και της απομόνωσης όλων αυτών των ανεπιθυμήτων ουσιών δεν είναι πάντοτε εύκολη υπόθεση, τουλάχιστον για τους εκπαιδευτικούς σκοπούς του Εργαστηρίου Χημείας Τροφίμων. Έτσι, εντελώς ενδεικτικά και πάντοτε με οδηγό την απόκτηση τεχνολογικής (και βέβαια εργαστηριακής) εμπειρίας, από τις διάφορες κατηγορίες των ανεπιθύμητων ουσιών που σχηματίζονται ή εντοπίζονται στα τρόφιμα, θα εξεταστούν λεπτομερέστερα μόνο οι αντιδράσεις ενζυμικής αμαύρωσης. Είναι οι αντιδράσεις αυτές, που οδηγούν τις διάφορες φαινολικές ενώσεις των φρούτων και λαχανικών, στις σκοτεινόχρωμες (καστανές) μελανίνες. Πρέπει ωστόσο να τονιστεί ότι μερικές από τις αντιδράσεις / προϊόντα ενζυμικής αμαύρωσης δεν είναι πάντοτε ανεπιθύμητες. Τουναντίον μάλιστα, υπάρχουν προϊόντα και διεργασίες οι οποίες οφείλουν το σχηματισμό τους ή το χαρακτηριστικό τους άρωμα / γεύση σε ανάλογες αντιδράσεις (π.χ. ζύμωση τεΐου, ξήρανση σπερμάτων κακάου κτλ). Επειδή όμως η πλειοψηφία των αντιδράσεων / προϊόντων ενζυμικής αμαύρωσης είναι ανεπιθύμητα και επειδή οι τρόποι παρεμπόδισής τους παρουσιάζουν γενικότερο τεχνολογικό και εκπαιδευτικό (για τη Χημεία Τροφίμων) ενδιαφέρον, για το λόγο αυτό εξετάζονται στην παρούσα Ενότητα. 136

137 ΠΕΙΡΑΜΑ ΣΤ 1 ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟ ΤΑΓΓΙΣΜΑ Σκοπός Η μελέτη των παραγόντων που επηρεάζουν το τάγγισμα των λιπιδίων, καθώς και η μελέτη της δράσης ουσιών που παρεμποδίζουν ή εντείνουν την οξείδωση. Από τη Θεωρία στην Πράξη Στην εισαγωγή της Ενότητας Δ αναπτύχθηκαν οι σχετικές γνώσεις που θεωρούνται απαραίτητες για την κατανόηση των οξειδωτικών αντιδράσεων που υφίστανται τα λίπη και τα έλαια. Αναλύθηκαν επίσης οι μηχανισμοί, μέσω των οποίων παράγονται επιβλαβή για την υγεία του ανθρώπου και ανεπιθύμητα για την ποιότητα των τροφίμων προϊόντα. Όλα όσα δηλαδή δημιουργούν τη μία από τις δύο κατηγορίες ταγγίσματος των λιπιδίων, δηλαδή το οξειδωτικό τάγγισμα (ή τάγγιση). Μεταξύ των παραγόντων οι οποίοι ευνοούν το οξειδωτικό τάγγισμα, αναφέρθηκαν στην εισαγωγή τόσο η θερμοκρασία όσον και η φωτεινή ενέργεια. Η καταλυτική τους δράση εμπλέκεται σε πολλά σημεία των πολύπλοκων μηχανισμών που οδηγούν στα τελικά προϊόντα του ταγγίσματος των λιπιδίων. Είναι οι ίδιοι παράγοντες οι οποίοι θα πρέπει να αποφεύγονται τόσο κατά την επεξεργασία και παραγωγή των ευοξείδωτων λιπιδίων / τροφίμων στη βιομηχανία, όσο και κατά τη χρήση / αποθήκευσή τους από τους καταναλωτές. Ως οξειδωτική βέβαια αντίδραση, το τάγγισμα, ευνοείται από την παρουσία ορισμένων ενώσεων οι οποίες δρουν ως οξειδωτικά, αναγόμενες εύκολα στο 137

138 φυσικοχημικό περιβάλλον της όλης αντίδρασης. Από την άλλη μεριά, η ύπαρξη διαφόρων αντιοξειδωτικών ουσιών οι οποίες οξειδώνονται ευκολότερα από τα συνυπάρχοντα λιπίδια, παρεμποδίζει το οξειδωτικό τάγγισμα, τουλάχιστον σε ικανοποιητικό, για την τεχνολογία τροφίμων βαθμό. Η παρουσία ή προσθήκη τόσο των καταλυτικών όσο και των παρεμποδιστικών αυτών ουσιών έχει μεγάλη σημασία για τη βιομηχανία δεδομένου ότι η ύπαρξη π.χ. ορισμένων ιχνοστοιχείων-μετάλλων στην αλυσίδα παραγωγής / συσκευασίας επιτείνει το τάγγισμα, ενώ πολλές φορές επιβάλλεται (και επιτρέπεται) η χρήση αντιοξειδωτικών, όπως είναι η βουτυλική υδροξυανισόλη (ΒΗΑ) και άλλες ενώσεις που φαίνονται στο Σχήμα ΣΤ βουτυλική υδροξυανισόλη (BA) (δι)-βουτυλικό υδροξυτολουόλιο (BT) 3 2 4' 8' γαλλικός προπυλεστέρας (PG) α-τοκοφερόλη (βιταμίνη Ε) Σχήμα ΣΤ.1.1. Μερικά από τα επιτρεπόμενα αντιοξειδωτικά 138

139 Η δράση των αντιοξειδωτικών ουσιών εντοπίζεται κυρίως στη δέσμευση των ενώσεων (ελευθέρων ριζών) που δημιουργούνται κατά το στάδιο της προαγωγής των αντιδράσεων οξείδωσης των λιπιδίων. Εάν, για παράδειγμα, παραστήσουμε το αντιοξειδωτικό με τον τύπο ΑΗ, αυτό μπορεί να δώσει ένα άτομο υδρογόνου σε μια ελεύθερη ρίζα, π.χ. την R. Έτσι έχουμε: ΑΗ + R R + A Όμως, λόγω της ευνοϊκής δομής του μορίου τους (αρωματικός πυρήνας), οι ελεύθερες ρίζες των αντιοξειδωτικών σταθεροποιούνται λόγω συντονισμού (μεσομέρεια):.. ' ' Η δραστικότητα των ριζών αυτών μειώνεται, κατά συνέπεια, σημαντικά και το κρίσιμο στάδιο της προαγωγής των αντιδράσεων οξείδωσης, τερματίζεται με αντιδράσεις του τύπου: Α + Α Α Α ή Α + R R A Τα αντιοξειδωτικά επιβραδύνουν το στάδιο της προαγωγής της οξείδωσης, σχεδόν ανάλογα με τη συγκέντρωσή τους. Έχει έτσι αποδειχθεί ότι η παρουσία 0,1% ΒΗΑ σε μαγειρικό λίπος, μπορεί να επιμηκύνει τουλάχιστον κατά 1 μήνα 139

140 το χρόνο ανάλωσης των τροφίμων, τα οποία παρασκευάζονται με το λιπίδιο αυτό. Όμως στην πράξη, τουλάχιστον τα τρία συνθετικά αντιοξειδωτικά ΒΗΑ, ΒΗΤ και γαλλικός προπυλεστέρας, προστίθενται στα διάφορα λίπη σε συγκεντρώσεις όχι μεγαλύτερες των 200 ppm. Τον τελευταίο καιρό διερευνάται η τοξικότητα και συγκεκριμένα η πιθανότητα καρκινογένεσης, που συνοδεύει την παρουσία των συνθετικών αυτών ουσιών στον οργανισμό (πειραματόζωων και ανθρώπου). Ωστόσο, η ολοκληρωτική απαγόρευσή τους δεν φαίνεται πιθανή, τουλάχιστον στο άμεσο μέλλον. Γίνονται όμως προσπάθειες για αντικατάστασή τους από φυσικά αντιοξειδωτικά, όπως είναι οι τοκοφερόλες και παράγωγα (ενώσεις) του ασκορβικού οξέος με λιπαρά οξέα. Άλλες δύο βιταμίνες με αντιοξειδωτικές ιδιότητες οι οποίες εξετάζονται σοβαρά και ήδη χρησιμοποιούνται από την Τεχνολογία Τροφίμων έστω και περιορισμένα για ανάλογη δράση είναι το ασκορβικό οξύ και η ρητινόλη (βιταμίνη Α). Η χρησιμοποίησή τους και γενικά η παρουσία τους στα τρόφιμα αποκτά μάλιστα ιδιαίτερη σημασία μετά της αλλεπάλληλες δημοσιεύσεις επιδημιολογικών και άλλων ερευνών, από τις οποίες διαφαίνεται ότι οι "αντιοξειδωτικές βιταμίνες" έχουν ευεργετική δράση στον οργανισμό τον οποίον προασπίζουν από τα καρδιαγγειακά νοσήματα. Τα αποτελέσματα και οι εξηγήσεις που δίνονται από τους ερευνητές για τη δράση τους στον οργανισμό, βρίσκονται σε απόλυτη αρμονία με τα όσα αναφέρθηκαν παραπάνω για την αντιοξειδωτική δράση τους στα τρόφιμα. π.χ. στην ανάπτυξη της αθηροσκλήρωσης, η οποία προξενεί βλάβες στις αρτηρίες του πάσχοντος οργανισμού, εμπλέκεται και η υπεροξείδωση των λιπιδίων, που αποτελούν συστατικά των λιποπρωτεϊνών και βέβαια των τροφίμων. Η δράση των προ-οξειδωτικών ουσιών, σχετίζεται και αυτή με τις αντιδράσεις οξειδωτικής τάγγισης και ιδιαίτερα αυτές που λαμβάνουν χώρα 140

141 κατά το πρώτο στάδιο, της έναρξης. Συγκεκριμένα, τα προ-οξειδωτικά, μπορούν να ευνοήσουν το σχηματισμό των απαραίτητων για την έναρξη των οξειδωτικών αντιδράσεων ελευθέρων ριζών R, σύμφωνα με την αντίδραση, π.χ. ενός κατιόντος μετάλλου με μεταβλητό σθένος, όπως: n + R M n R M ή ακόμα να ευνοήσουν το σχηματισμό μονήρους οξυγόνου ( 1 2 ), το οποίο αντιδρά με τους διπλούς δεσμούς των ακόρεστων λιπαρών οξέων. Ευνοείται κατ επέκταση ο σχηματισμός των απαιτούμενων κατά το επόμενο στάδιο (προαγωγής) υδροϋπεροξειδίων R, σύμφωνα με την αντίδραση: R + 2 R και το μηχανισμό: Στις ουσίες που δρουν σύμφωνα με την α από τις παραπάνω αντιδράσεις ανήκει ο θειικός χαλκός (δισθενής), ενώ σ αυτές που ευνοούν το σχηματισμό μονήρους οξυγόνου συγκαταλέγονται η αίμη, η χλωροφύλλη, αλλά επίσης και ο θειικός χαλκός, που δρα με βάση την αντίδραση: M n + 2 M n e 141

142 Μεθοδολογία Για την εποπτική παρακολούθηση της τάγγισης χρησιμοποιείται ως δείκτης καροτένιο. Τα καροτένια (Σχήμα ΣΤ.1.2) είναι πολυακόρεστοι υδρογονάνθρακες και προσομοιάζουν στη δομή με τα λιπαρά οξέα. Αποτελούν, ως γνωστόν, πρόδρομες ενώσεις της βιταμίνης Α, και τη χρωστική ουσία των καρότων από τα οποία και απομονώθηκαν. Η χρωστική των καρότων αποτελείται από μίγμα τριών ενώσεων, τα οποία ονομάζονται α-, β- και γ- καροτένιο. Είναι κρυσταλλικά σώματα, τα α- και β-καροτένια ερυθροπορτοκαλόχρωμα, ενώ το γ-καροτένιο είναι ερυθροϊώδες. Όλα είναι διαλυτά στο χλωροφόρμιο και λιγότερο στον πετρελαϊκό αιθέρα, ενώ δε διαλύονται στην αλκοόλη. Είναι ουσίες οι οποίες οξειδώνονται πάρα πολύ εύκολα και κατά την οξείδωσή τους το χρώμα τους εξαφανίζεται. Κατά συνέπεια, η ταχύτητα αποχρωματισμού (λεύκανσης) τους, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης ταχύτητας της οξειδωτικής τάγγισης των λιπιδίων, εφόσον βέβαια στα τελευταία προστεθεί και ελάχιστη ποσότητα καροτένιου. Το λίπος (χοιρινό-λαρδί) το οποίο πρόκειται να μελετηθεί, αφού τακεί και αναμιχθεί με ελάχιστη ποσότητα καροτένιου, διαλύεται σε λίγο όγκο διαλύτη. Εάν ως διαλύτης χρησιμοποιηθεί το χλωροφόρμιο ή το διχλωρομεθάνιο, λόγω της επικινδυνότητάς τους (χλωριωμένοι υδρογονάνθρακες), η κατανάλωσή τους θα πρέπει να περιορίζεται στα απολύτως απαραίτητα ποσά και η εργασία να εκτελείται σε απαγωγό εστία. Ωστόσο, αραίωση του λίπους μπορεί να επιχειρηθεί και με πετρελαϊκό αιθέρα. Με το διάλυμα διαβρέχονται τέσσερα τεμάχια διηθητικού χάρτη. Το πρώτο από αυτά παραμένει σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, σε σκοτεινό μέρος. Το δεύτερο παραμένει εκτεθειμένο στο ηλιακό φως (άμεσα), το τρίτο στο ψυγείο και το τέταρτο σε επωαστικό κλίβανο, 142

143 στους 60º. Ελέγχεται ο χρωματισμός ή ο αποχρωματισμός κάθε τεμαχίου διηθητικού χάρτη (βάσει του δείκτη καροτένιου) και εξάγονται συμπεράσματα για την επίδραση της θερμοκρασίας και της ηλιακής ακτινοβολίας στο οξειδωτικό τάγγισμα του λίπους. Μπορεί ακόμη να συγκριθεί και η διαφορά της οσμής που παρουσιάζουν τα αποχρωματισμένα τεμάχια χάρτη (ταγγισμένα λίπη), ως προς αυτά που διατηρούν τον αρχικό ή ελαφρά μεταβληθέντα χρωματισμό β-καροτένιο 4' 2' 3' 1' α-καροτένιο γ-καροτένιο Σχήμα ΣΤ.1.2. Δομές καροτενίων α-, β-, γ-. Η κεντρική περιοχή που είναι κοινή σε όλα τα καροτένια, στα α- και γ- έχει καταληφθεί. Τέλος, για τη δοκιμή της δράσης των προβιβαστών και παρεμποδιστών του οξειδωτικού ταγγίσματος ακολουθείται η ίδια αρχική διαδικασία, με το διάλυμα λίπους καροτενίου να προσροφάται, πάλι σε διηθητικό χάρτη. Πάνω σ αυτόν, τοποθετούνται μικρά (κυκλικά) τεμάχια επίσης διηθητικού χάρτη, τα οποία έχουν κορεστεί με διαλύματα των υπό εξέταση προ- και αντι-οξειδωτικών ουσιών. Το όλο σύστημα των διηθητικών χαρτών εισάγεται σε κλίβανο θερμοκρασίας 40º (σε τρυβλία petri) και τέλος, γίνονται οι ανάλογες παρατηρήσεις. 143

144 Εργαστηριακός εξοπλισμός Αντιδραστήρια επωαστικός κλίβανος (40º, 60º) τρυβλία petri διηθητικός χάρτης (δίσκοι διαμέτρου 7 cm και 1 cm) λίπος (χοιρινό, τηγμένο) καροτένιο χλωροφόρμιο (απαγωγός εστία) πετρελαϊκός αιθέρας (40 60º) θειικός χαλκός ΙΙ, us 4 (0,01%) βουτυλική υδροξυανισόλη, ΒΗΑ (0,001%) αιμογλοβίνη (0,5%) φρέσκα κρεμμύδια (πράσινο μέρος) Πορεία εργασίας 1) Προετοιμασία δείγματος λίπους Σε μεγάλη γυάλινη κάψα μεταφέρεται ποσότητα περίπου 50 g τηγμένου χοιρινού λίπους (λαρδί) και προστίθενται σ αυτό 10 mg καροτενίου. Το μίγμα αναμιγνύεται με λίγο χλωροφόρμιο (περίπου 30 ml). Με τη βοήθεια τσιμπίδας, εμβαπτίζονται στο παρασκεύασμα αυτό και αφήνονται να στραγγίσουν, για 20 περίπου δευτερόλεπτα. Οι εμποδισμένοι με το λίπος δίσκοι τοποθετούνται σε τρυβλία petri. 2) Προετοιμασία εκχυλίσματος πράσινων λαχανικών Για την παρασκευή εκχυλισμάτων από λαχανικά που περιέχουν χλωροφύλλη, 30 g από τα εύκαμπτα μακρόστενα φύλλα φρέσκων κρεμμυδιών (ή κάποιο άλλο πράσινο λαχανικό) τεμαχίζονται και μεταφέρονται σε ποτήρι ζέσεως των 250 ml. Προστίθενται 100 ml νερού και το μίγμα θερμαίνεται μέχρι βρασμού επί 2 3 min. Στη συνέχεια, ψύχεται και διηθείται. 3) Μελέτη της επίδρασης της θερμοκρασίας και του ηλιακού φωτός Τέσσερα τρυβλία petri, που περιέχουν τους δίσκους του διηθητικού χάρτη 144

145 εμποτισμένους με το λίπος (και καροτένιο), καλύπτονται με το κάλυμμα του τρυβλίου και τοποθετούνται αντίστοιχα σε: i. σκοτεινό μέρος, σε θερμοκρασία δωματίου ii. φωτεινό μέρος (κατά προτίμηση σε άμεση ηλιακή ακτινοβολία), σε χώρο του Εργαστηρίου iii. ψυγείο iv. επωαστικό κλίβανο 60º Μετά από 2 ώρες παραμονής στους παραπάνω χώρους, εξετάζεται το χρώμα (με δείκτη τη μετατροπή του χρώματος του καροτένιου) και η οσμή των δοκιμίων. Με τη βοήθεια των σχετικών αντιδράσεων δίνονται οι αναγκαίες εξηγήσεις και εξάγονται τα ανάλογα συμπεράσματα. 4) Μελέτη της δράσης προβιβαστών και παρεμποδιστών του οξειδωτικού ταγγίσματος Μικροί δίσκοι (διαμέτρου 1 cm) διηθητικού χάρτη εμβαπτίζονται στα υδατικά διαλύματα: i. us 4 (0,01%) ii. ΒΗΑ (0,001%) iii. αιμογλοβίνης (0,5%) iv. εκχυλίσματος πράσινων λαχανικών, που προέκυψε κατά την παραπάνω προετοιμασία (2). Οι κορεσμένοι με τα παραπάνω τέσσερα διαλύματα μικροί δίσκοι, τοποθετούνται σε τέσσερα διαφορετικά τρυβλία, πάνω από τον εμποτισμένο με το μίγμα λίπους καροτένιου μεγάλο δίσκο διηθητικού χάρτη. Τα τρυβλία petri καλύπτονται με το κάλυμμά τους, αναστρέφονται και τοποθετούνται σε επωαστικό κλίβανο θερμοκρασίας 40º. Μετά από δίωρη παραμονή τους σ 145

146 αυτόν, εξετάζεται η μεταβολή του χρώματος (του καροτένιου) στα σημεία επαφής των μικρών δίσκων των προ-οξειδωτικών και αντιοξειδωτικών, με τον εμποτισμένο με λίπος διηθητικό χάρτη. Ερμηνεύονται τα αποτελέσματα, με τη βοήθεια των αντίστοιχων αντιδράσεων, και εξάγονται τα ανάλογα συμπεράσματα για τη δράση προ- και αντι-οξειδωτικών ουσιών. 146

147 ΠΕΙΡΑΜΑ ΣΤ 2 ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΜΑΥΡΩΣΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Σκοπός Η διερεύνηση των συνθηκών σχηματισμού καστανοχρώμων χρωστικών (μελανινών), που προκύπτουν όταν διάφοροι φυτικοί ιστοί (άχρωμοι) έλθουν σε επαφή με τον αέρα. Από τη Θεωρία στην Πράξη Όλοι μας έχουμε παρατηρήσει ότι όταν μια κομμένη επιφάνεια από ορισμένα φρούτα και λαχανικά ανοικτού χρώματος όπως είναι τα μήλα, οι μπανάνες, οι πατάτες κτλ, έλθει σε επαφή με τον αέρα, τότε αυτή μετατρέπεται γρήγορα σε καστανόχρωμη. Το εν λόγω καφέτιασμα δημιουργείται όταν οι διάφορες πολυφαινολικές ουσίες, οι οποίες περιέχονται συνήθως στο κενοτόπιο των φυτικών κυττάρων, οξειδώνονται με τη βοήθεια του ενζύμου φαινολάση. Η φαινολάση ευρίσκεται στο κυτταρόπλασμα των φυτικών κυττάρων. Όταν, λοιπόν, οι φυτικοί ιστοί τραυματιστούν, όπως για παράδειγμα συμβαίνει κατά το κόψιμο ή το ξεφλούδισμα των φρούτων και των λαχανικών ή ακόμα όταν αυτά κτυπηθούν και δημιουργηθούν μώλωπες, ή τέλος όταν προσβληθούν από μύκητες, το ένζυμο (φαινολάση) έρχεται σε επαφή με τα υποστρώματα (φαινολικές ενώσεις). Η φαινολάση, η οποία αρχικά ονομαζόταν και πολυφαινολοξειδάση ή πολυφαινολική οξειδάση, υπάρχει στους περισσότερους φυτικούς ιστούς. Από 147

148 την άλλη μεριά, η τυροσινάση, ένζυμο με δράση ανάλογη προς αυτή της φαινολάσης, ευρίσκεται στο δέρμα των θηλαστικών. Η φαινολάση είναι ένα "ιδιότροπο" (αλλά όχι και το μοναδικό) ένζυμο το οποίο έχει τη δυνατότητα να καταλύει δύο αρκετά διαφορετικούς τύπους αντιδράσεων. Ο πρώτος από αυτούς, περιλαμβάνει την οξείδωση (πιο συγκεκριμένα την υδροξυλίωση) των μονοφαινολών σε ορθο-διφαινόλες: 1/2 2 R δράση κρεζολάσης R Δεδομένου ότι οι παραπάνω μονοφαινόλες παράγωγα του τολουολίου, ονομάζονται και υδροξυ-τολουόλια ή κρεζόλες (ή και κρεσόλες), η εξειδικευμένη αυτή δράση της φαινολάσης αναφέρεται στη βιβλιογραφία ως δράση κρεζολάσης. Ο δεύτερος τύπος αντιδράσεων που καταλύει το ίδιο ένζυμο (φαινολάση), αφορά την οξείδωση των ο-διφαινολών σε ο-κινόνες. Με το ίδιο σκεπτικό, επειδή το υπόστρωμα για τη συγκεκριμένη δράση της φαινολάσης, είναι παράγωγο του ο-δι-υδροξυ-βενζολίου ή (πυρο)κατεχόλης, η επιμέρους αυτή δράση του ενζύμου ονομάζεται και "δράση κατεχολάσης". 1/2 2 2 R δράση κατεχολάσης R 148

149 Οι ο-κινόνες είναι πολύ δραστικές ενώσεις και πολυμερίζονται εύκολα αφού πρώτα μετατραπούν στις αντίστοιχες υδροξυκινόνες: 2 R R R R Αντιδράσεις σαν κι αυτές με την πρωτεΐνη των ενζύμων τυροσίνη (τα ένζυμα είναι, ως γνωστόν, ουσίες πρωτεϊνικής φύσης) μπορούν να οδηγήσουν σε τροποποίηση του ενζύμου και συνεπώς σε αδρανοποίησή του. Τα καστανά χρώματα που αναπτύσσονται στις κομμένες επιφάνειες φρούτων και λαχανικών μπορεί να θεωρούνται ως ανεπιθύμητα για τον καταναλωτή, ωστόσο δεν έχουν δυσμενείς επιπτώσεις στη γεύση και στη διατροφική αξία των τροφών. Το σημαντικότερο υπόστρωμα για τη δράση της φαινολάσης στα μήλα, τα αχλάδια, και τις πατάτες θεωρείται το χλωρογονικό οξύ: 149

150 Πολύ λίγα είναι όμως γνωστά για τις πραγματικές δομές των πολυμερισμένων κινονών, και γενικά των καστανόχρωμων ενώσεων που σχηματίζονται από τον πολυμερισμό των κινονών. Όσον αφορά τις πατάτες και ειδικότερα τους καστανόχρωμους-μελανούς χρωματισμούς που αναπτύσσονται στις κομμένες επιφάνειές τους, πρέπει να τονιστούν τα εξής: Πολλοί υποστηρίζουν ότι οι λαμβάνουσες χώρα αντιδράσεις οφείλονται όχι μόνο σε ενζυμικό μαύρισμα αλλά και σε μη ενζυμικό (αντιδράσεις υδατανθράκων και πρωτεϊνών). Για τη μη ενζυμική αμαύρωση της πατάτας ισχύουν τα όσα αναπτύχθηκαν στο αντίστοιχο Πείραμα Γ 3. Για την ενζυμική της αμαύρωση, το χλωρογονικό οξύ δεν είναι το μόνο πιθανό υπόστρωμα της φαινολάσης. Υπεύθυνη θεωρείται και η τυροσίνη. Για την περίπτωση της τυροσίνης, που είναι αυτή παράγωγο της κρεζόλης, ο μηχανισμός σχηματισμού των καστανών έως και μαύρων χρωστικών, των μελανινών έχει μελετηθεί, κάπως περισσότερο από αυτόν που οδηγεί στα καστανόχρωμα πολυμερισμένα προϊόντα των κινονών, οι οποίες προκύπτουν από την ανάλογη σειρά αντιδράσεων του χλωρογονικού οξέος. Για το 150

151 σχηματισμό λοιπόν των σκουρόχρωμων χρωστικών ουσιών, των μελανινών, που σχηματίζονται από την τυροσίνη, προτείνεται ο μηχανισμός του Σχήματος ΣΤ.2.1. A ΤΥΡΟΣΙΝΑΣΗ B + Ένζυμο Αρχικά πολύ N αργά,κατόπιν 2 γρήγορα 2 N 2 + Ένζυμο Γρήγορα 2 N 2 Τυροσίνη DPA Κινόνη DPA N + 2 5,6 -Διυδροξυινδόλio Σχετικά αργά +2 N Αλλόχρωμα (ερυθρό) + Γρήγορα Γρήγορα N Λευκοένωση Γρήγορα + N 5,6 κινονο-ινδόλιο + Σχετικά αργά Μελανίνη +2 N 2-καρβόξυ-5,6 διυδρόξυ-ινδόλιο Σχήμα ΣΤ.2.1. Μηχανισμός ενζυμικής αμαύρωσης με υπόστρωμα την τυροσίνη. Η δομή των μελανινών (ή μελανοϊδινών) δεν έχει πλήρως διερευνηθεί. Ωστόσο, οι μελανίνες και παρόμοιες ενζυμικές αντιδράσεις είναι αυτές στις οποίες οφείλεται το χρώμα του δέρματος και των τριχών. Οι αποχρώσεις βέβαια ποικίλουν ανάλογα με την περιεκτικότητά τους τόσο στο μοναδικό υπόστρωμα 151

152 της φαινολάσης που βρίσκεται στους ζωικούς ιστούς, δηλαδή την τυροσίνη, όσο και στο ίδιο το ένζυμο. Κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας των φρούτων και των λαχανικών (στο σπίτι, αλλά και στη βιομηχανία) προσπαθούμε να παρεμποδίσουμε τις δράσεις της φαινολάσης. Για το σκοπό αυτό, τα φρούτα και τα λαχανικά ζεματίζονται αμέσως μετά (ή ακόμα και πριν από) τον τεμαχισμό τους ή οποιαδήποτε άλλη κατεργασία αναμένεται να οδηγήσει στον τραυματισμό των ιστών τους. Η θερμική αυτή επεξεργασία αδρανοποιεί προφανώς το ένζυμο και οι ανεπιθύμητες δράσεις του (μαύρισμα) ελαχιστοποιούνται. Μια κοινή πρακτική που ακολουθείται στο σπίτι και στο εργοστάσιο είναι η εμβάπτιση και η παραμονή των φρούτων ή λαχανικών σε νερό, μέχρι το επόμενο στάδιο της επεξεργασίας τους, το οποίο εμπεριέχει συνήθως θέρμανση. Ένας άλλος τρόπος που χρησιμοποιείται για την παρεμπόδιση της ενζυμικής αμαύρωσης είναι αυτός που γίνεται με εμβάπτιση των πρόσφατα ξεφλουδισμένων ή τεμαχισμένων φρούτων / λαχανικών σε αραιά υδατικά διαλύματα (λουτρά) κιτρικού οξέος κιτρικό οξύ μηλικό οξύ Αυτός ο χειρισμός, εκτός από το ότι περιλαμβάνει τη χρήση ουσιών οι οποίες αποτελούν φυσικά συστατικά των χυμών των φρούτων, έχει και το πλεονέκτημα να κρατά το p σε χαμηλές τιμές, κάτω δηλαδή από το p = 7, που θεωρείται ιδανική τιμή για τη δράση της φαινολάσης. Έτσι, εκτός από την προστασία των 152

153 ευοξείδωτων ουσιών από το οξυγόνο, αναστέλλεται και η δράση του ενζύμου. Αρκετά συχνά μάλιστα, στα λουτρά αυτά των δύο παραπάνω οξέων προστίθεται για περαιτέρω ενίσχυση της αποτελεσματικότητας και ασκορβικό οξύ ή θειώδες (διοξείδιο του θείου). Για τη δράση του ασκορβικού οξέος, εκτός του ότι η ουσία αυτή αποτελεί συγχρόνως και βιταμίνη, υποστηρίζονται τα εξής: Το ασκορβικό οξύ είναι μια πολύ καλή χηλική ένωση αλλά και αντιοξειδωτική. Αντιδρά άμεσα με τις κινόνες και προλαμβάνει την αμαύρωση. Επίσης, εάν υπάρχει σε αρκετή (για τη δράση αυτή) ποσότητα, απορροφά το οξυγόνο το οποίο έχει εγκλωβιστεί σε κλειστά δοχεία, όπως π.χ. τις κονσέρβες. ο διφαινόλη Ο2 ο κινόνη + Η 2 Ο ο κινόνη + ασκορβικό ο διφαινόλη + δεϋδρο-ασκορβικό Παρόλο που η προσθήκη του ασκορβικού οξέος στη βιομηχανία παρασκευής π.χ. αφυδατωμένου πουρέ (σκόνης) πατάτας γίνεται μάλλον για λόγους διασφάλισης της λευκής εμφάνισης των προϊόντων παρά για τη βιολογική του δράση (βιταμίνη ), η προσθήκη αυτή έχει προφανώς και θετικά διατροφικά αποτελέσματα. Τα αποτελέσματα αυτά γίνονται ακόμη πιο εμφανή σε ορισμένες ομάδες καταναλωτών, π.χ. τους ηλικιωμένους, που για διαφόρους λόγους προτιμούν τη χρήση ανάλογων ημι-έτοιμων φαγητών αντί των φρέσκων φρούτων, λαχανικών, κτλ. Το διοξείδιο του θείου, έχει και αυτό μια εξειδικευμένη δράση έναντι της φαινολάσης, παρόλο που ο μηχανισμός της δράσης αυτής δεν είναι απόλυτα γνωστός. Έχει παρατηρηθεί ότι συγκεντρώσεις θειώδους οι οποίες εξασφαλίζουν μια συγκέντρωση S 2 της τάξης των 10 ppm, αναστέλλουν 153

154 πλήρως τη δράση της φαινολάσης. Το θειώδες οξύ έχει ως γνωστόν αναγωγικές ιδιότητες. Επιπρόσθετα όμως έχει και την ικανότητα να διασφαλίζει και την ενεργό παρουσία του ασκορβικού οξέος. Ωστόσο, δεν πρέπει να παραβλεφθεί το γεγονός ότι αποχρωματίζει τις (επιθυμητές) ανθοκυάνες των τροφίμων και επίσης ότι συμβάλλει στη διάβρωση των μεταλλικών κουτιών (κονσερβών). S 2 S metabisulfite (μεταδιθειώδες) S 3 2- pk=7.21 S 3 - pk= S 3 Σχήμα ΣΤ.2.2. Θειώδεις ενώσεις που αποδίδουν S 2 Όσον αφορά τα θεωρούμενα ως επιθυμητά αποτελέσματα της ενζυμικής αμαύρωσης, αυτά αναφέρονται κυρίως σ ένα μόνο προϊόν το τσάι. Τα φύλλα του φυτού από το οποίο παρασκευάζεται το τσάι περιέχουν, σημαντικές ποσότητες πολυφαινολικών ουσιών πάνω από 30% επί ξηρού βάρους. Κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας των φύλλων (ζύμωση), με τη βοήθεια της φαινολάσης, οι πολυφαινολικές ενώσεις οξειδώνονται και πολυμερίζονται προσδίδοντας έτσι στο προϊόν το χαρακτηριστικό χρώμα και γεύση. 154

155 Μεθοδολογία Με βάση τα παραπάνω, για την εκδήλωση ενζυμικού μαυρίσματος σε κομμένα φρούτα και λαχανικά, πρέπει να συνυπάρχουν: φαινολικές ουσίες (υπόστρωμα) οξυγόνο (αέρας) φαινολάση (ένζυμο) Δέσμευση ή αποκλεισμός ενός τουλάχιστον από τους παραπάνω παράγοντες, προκαλεί αναστολή ή οπωσδήποτε περιορισμό των σχετικών αντιδράσεων και συντελεί στη διατήρηση των φυσικών χαρακτηριστικών των τροφίμων, κυρίως δε του χρώματος το οποίο χρησιμοποιείται και ως δείκτης των οποιωνδήποτε μεταβολών. Οι επεμβάσεις οι οποίες εκτελούνται στο Εργαστήριο για τις παρατηρήσεις των ανάλογων φαινομένων, περιλαμβάνουν και τους τρεις παράγοντες. Για το σκοπό αυτό λαμβάνονται δείγματα φρούτων και λαχανικών, κόπτονται σε χαρακτηριστικές φέτες ή πολτοποιούνται (ανάλογα με την πρακτική που προτείνεται στο Εργαστήριο για κάθε Ομάδα εργασίας) και δοκιμάζονται διάφορα φυσικοχημικά μέσα ως εξής: 1) Επέμβαση στο φαινολικό υπόστρωμα Παρόλο που τα φαινολικά υποστρώματα θα μπορούσαν εύκολα να δεσμευθούν με αντίδρασή τους με βορικά άλατα, επειδή η μέθοδος αυτή δεν επιτρέπεται για τα τρόφιμα, δε δοκιμάζεται προφανώς και στο Εργαστήριο. Αντί αυτής μελετάται η επίδραση που έχει στο φαινολικό υπόστρωμα το ασκορβικό οξύ. Για την ακρίβεια, όπως προαναφέρθηκε, το ασκορβικό οξύ δεν δρα στο αρχικό φαινολικό υπόστρωμα, δηλαδή τις διάφορες μονοφαινόλες ή ο- διφαινόλες, αλλά στα προϊόντα που προκύπτουν από την οξείδωση των ο- 155

156 διφαινολών, δηλαδή στις ο-κινόνες. Με τις αναγωγικές του ιδιότητες το ασκορβικό, ανάγει τις ο-κινόνες πίσω σε ο-διφαινόλες και αναστέλλει την εξέλιξη των αντιδράσεων αμαύρωσης. Προς τούτο, τα τεμαχισμένα δείγματα, εμβαπτίζονται σε αραιό διάλυμα ασκορβικού οξέος. Δεδομένου ότι το ασκορβικό οξύ μπορεί να αναστείλει και τη δράση του ενζύμου (σημειώνεται ότι η καταλληλότερη περιοχή δράσης της φαινολάσης είναι μεταξύ 5 7) το p ρυθμίζεται έτσι, ώστε να είναι μόνο ελαφρώς όξινο, δηλαδή περίπου p=6. Κατά συνέπεια, η ενδεχόμενη παρεμπόδιση της αντίδρασης θα οφείλεται στη δράση του ασκορβικού οξέος επί του φαινολικού υποστρώματος. Αυτό θα διαπιστωθεί από τη σύγκριση (και βαθμολογία, σε κλίμακα 0 5) του χρώματος του δείγματος ως προς τους μάρτυρες. Για την παρασκευή των μαρτύρων του πειράματος, ορισμένα τεμάχια από το κάθε προϊόν αφήνονται εκτεθειμένα στον αέρα (οξυγόνο) και μάλιστα σε θερμοκρασία 28 30º (επωαστικός κλίβανος), ενώ ορισμένα άλλα εμβαπτίζονται και παραμένουν μέσα σε απεσταγμένο νερό, σε χαμηλή θερμοκρασία (κατάψυξη). Ο τελικός χρωματισμός των μαρτύρων μετά από 1 ώρα παραμονής τους στον επωαστικό κλίβανο βαθμολογείται με 5, ενώ ο βυθισμένος στο νερό μάρτυρας, που θεωρητικά διατηρεί το αρχικό χρώμα, βαθμολογείται με 0. Το κάθε προϊόν (σε 4 τεμάχια δείγματα) παραμένει εμβαπτισμένο στο διάλυμα του ασκορβικού οξέος επί 2 min. Στη συνέχεια 2 δείγματα τοποθετούνται πάνω σε λευκό διηθητικό χάρτη και εισάγονται στον επωαστικό κλίβανο (28º 30º), ενώ τα άλλα 2 δείγματα εξακολουθούν να παραμένουν καλυμμένα με το προς μελέτη διάλυμα (ασκορβικό οξύ) και τοποθετούνται στην κατάψυξη. Μετά από παραμονή των δειγμάτων στον επωαστικό κλίβανο και 156

157 τον καταψύκτη, επί μία ώρα, αυτά εξάγονται από τους αντίστοιχους χώρους και τα αποτελέσματα συγκρίνονται μεταξύ τους και επίσης ως προς τους μάρτυρες (βαθμολογία). 2) Αποκλεισμός οξυγόνου (αέρα) Ο αποκλεισμός του οξυγόνου μπορεί να επιτευχθεί με την αφαίρεση του αέρα από το δοχείο παραμονής του τροφίμου (δημιουργία κενού). Στο Εργαστήριο δοκιμάζεται μια άλλη μέθοδος η οποία χρησιμοποιείται και αυτή στη βιομηχανία, όπως και στο σπίτι. Σύμφωνα με αυτή, τα φρούτα / λαχανικά παραμένουν βυθισμένα σε διαλύματα άλμης (Nal) ή σιροπιού (ζάχαρης). Κατ αυτόν τον τρόπο το οξυγόνο αποκλείεται από το άμεσο περιβάλλον των κατά τα άλλα επιδεκτικών για ενζυμική αμαύρωση προϊόντων. Τα δείγματα παραμένουν βυθισμένα στα αντίστοιχα διαλύματα σε θερμοκρασία 28 30º επί μία ώρα οπότε, και εξετάζονται για τυχόν μεταβολές στο χρώμα τους. Η ζάχαρη προτιμάται από το χλωριούχο νάτριο, ιδιαίτερα στην επεξεργασία των φρούτων γιατί εισχωρεί στο εσωτερικό του και σχηματίζει προστατευτικό διάλυμα γύρω από τα κύτταρα (ιδιαίτερα τα επιφανειακά) χωρίς όμως να αλλοιώνει δραστικά τους οργανοληπτικούς χαρακτήρες, όπως συμβαίνει με το χλωριούχο νάτριο. Όσον αφορά τη χρήση καθαρού νερού, χωρίς προσθήκη άλλης ουσίας, αυτή ενώ μεν χρησιμοποιείται συχνά στο σπίτι για λόγους ευκολίας, εντούτοις δε δίνει πολύ ικανοποιητικά αποτελέσματα, κυρίως γιατί μετά την εξαγωγή τους από το νερό τα προϊόντα μαυρίζουν αμέσως. Σχετική με τη δράση αυτή του αποκλεισμού του οξυγόνου είναι και η επέμβαση που γίνεται με τη βοήθεια υδατικών διαλυμάτων οξέων όπως κιτρικού, ασκορβικού κτλ. Τα φαινόμενα στις περιπτώσεις αυτές, όπως θα αναπτυχθεί στις ακόλουθες κατεργασίες, είναι αποτέλεσμα συνεργιστικών 157

158 δράσεων (αντίδραση με φαινολικό υπόστρωμα, αποκλεισμός οξυγόνου, αλλά και αδρανοποίηση της φαινολάσης). 3) Αδρανοποίηση φαινολάσης α) με θέρμανση Παρόλο που η θερμική επεξεργασία εγκυμονεί κινδύνους αλλοίωσης της γεύσης και της υφής (μαλάκωμα) των υφιστάμενων αυτή, προς αδρανοποίηση του ενζύμου, φρούτων και λαχανικών, εντούτοις χρησιμοποιείται συχνά στη βιομηχανία, τουλάχιστον για ορισμένα λαχανικά. Κατά την οικιακή επεξεργασία, αποτελεί σχεδόν τον πιο εύκολο τρόπο παρεμπόδισης της ενζυμικής αμαύρωσης (ζεμάτισμα) σε λαχανικά και μερικές φορές σε φρούτα. Ο άλλος τρόπος είναι αυτός που αναφέρθηκε στην περίπτωση του αποκλεισμού του οξυγόνου, δηλαδή με βύθισμα και παραμονή μέχρι το μαγείρεμα των φρούτων / λαχανικών σε υδατικό διάλυμα χλωριούχου νατρίου, ζάχαρης ή ακόμα και καθαρού νερού. Για την επίτευξη της αδρανοποίησης της φαινολάσης, αρκεί εμβάπτιση των τροφίμων σε ζέον ύδωρ επί 1 min. Ακολουθεί παραμονή των δειγμάτων στους 28 30º και στον καταψύκτη, επί μία ώρα και εξέταση σύγκριση των αποτελεσμάτων, σύμφωνα με τα παραπάνω πρότυπα, όπως αναπτύχθηκαν αναλυτικά στην επέμβαση (1) (φαινολικό υπόστρωμα). β) με φυσικοχημικά μέσα i) μείωση του p Υπάρχουν πολλοί τρόποι με τους οποίους, με τη βοήθεια χημικών ενώσεων, μπορούμε να αδρανοποιήσουμε το υπεύθυνο για το μαύρισμα των φρούτων / λαχανικών ένζυμο, δηλαδή τη φαινολάση. Ήδη αναφέρθηκε ότι το κατάλληλο για τη δράση του ενζύμου p κυμαίνεται μεταξύ 5 και 7. Εάν λοιπόν χρησιμοποιήσουμε διάφορα οξέα όπως το κιτρικό, το μηλικό και το φωσφορικό και κατεβάσουμε το p στα επίπεδα του 3, τότε η φαινολάση αδρανοποιείται. 158

159 Επίσης, θετικά αποτελέσματα έχουμε με την προσθήκη και ασκορβικού οξέος στα παραπάνω όξινα (με κιτρικό οξύ κτλ.) διαλύματα. Η αντιοξειδωτική δράση της βιταμίνης βελτιώνει περαιτέρω την παρεμπόδιση του ενζύμου, που οφείλεται στο χαμηλό p του διαλύματος. Έτσι, το ασκορβικό οξύ δρα συνεργιστικά, τόσο με την μετατροπή των ο-κινονών σε ο-διφαινόλες όσον και με την αδρανοποίηση της φαινολάσης. Σύμφωνα με τα παραπάνω, στο Εργαστήριο δοκιμάζεται η κατεργασία κατά τα ήδη περιγραφέντα των φρούτων / λαχανικών με διάλυμα το οποίο περιέχει τόσο κιτρικό όσο και ασκορβικό οξύ και εξάγονται τα ανάλογα συμπεράσματα. Σημειώνεται ότι το p θα πρέπει να ρυθμιστεί μεταξύ 3 και 4. Για το λόγο αυτό ένα διάλυμα 5% κιτρικού και 2% ασκορβικού οξέος θεωρείται ικανοποιητικό, για τις περισσότερες των περιπτώσεων. Για τη διαπίστωση της συνεργιστικής δράσης των δύο ουσιών επαναλαμβάνεται η κατεργασία, αλλά αυτή τη φορά το διάλυμα εμβάπτισης των δειγμάτων περιέχει μόνο κιτρικό οξύ στα ίδια χαμηλά επίπεδα του p (δηλαδή 3 4). Στη βιομηχανία, η συνεργιστική δράση του ασκορβικού οξέος αντικαθίσταται, ορισμένες φορές, από αυτή του θειώδους. Αυτό προστίθεται στα λουτρά παραμονής τα οποία περιέχουν και κιτρικό ή μηλικό οξύ. ii) δέσμευση του ενζύμου Μερικά από τα αποτελεσματικότερα χημικά μέσα που αντιδρούν με τη φαινολάση είναι διάφορες ενώσεις οι οποίες δημιουργούν χημικές ενώσεις με τα ιόντα χαλκού. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, ο χαλκός αποτελεί συστατικό του δραστικού τμήματος της φαινολάσης (συνένζυμο). Κατά συνέπεια, η δημιουργία συμπλόκων ενώσεων με παραδείγματος χάριν διάφορα άλατα οξέων, όπως διαιθυλθειοκαρβαμιδικά, κυανιούχα, θειούχα, ή το EDTA και την υδροξυκινολίνη θα μπορούσε να εμποδίσει κάλλιστα τη δράση της φαινολάσης. 159

160 Ωστόσο, οι ενώσεις αυτές δεν είναι κατάλληλες για τη χρησιμοποίησή τους στα τρόφιμα. Αντ αυτών προτείνονται και πάλι το κιτρικό ή το μηλικό οξύ (σχηματίζουν σύμπλοκα με το χαλκό και έχουν επίσης όλες τις προαναφερθείσες συνεργιστικές δράσεις). Τέλος, το διοξείδιο του θείου, τα θειώδη άλατα και το μεταδιθειώδες νάτριο είναι και αυτά ισχυροί αναστολείς της δράσης της φαινολάσης και χρησιμοποιούνται ευρέως στη βιομηχανία τροφίμων, παρόλα τα μειονεκτήματα που παρουσιάζουν (καταστροφή της θειαμίνης, ανεπιθύμητες οσμές κτλ). Στο Εργαστήριο, για τη μελέτη της χημικής παρεμπόδισης (δέσμευσης) της φαινολάσης χρησιμοποιείται αραιό διάλυμα (0,5%) EDTA, που σχηματίζει σύμπλοκο με το χαλκό. Εργαστηριακός εξοπλισμός Αντιδραστήρια επωαστικός κλίβανος (28 30º) πεχάμετρο ποτήρια ζέσεως (100 ml και 500 ml) ασκορβικό οξύ (υδατικό διάλυμα 1%) ζάχαρη (υδατικό διάλυμα 50%) κιτρικό οξύ (υδατικό διάλυμα 5%) υδατικό διάλυμα 5% κιτρικού οξέος και 2% ασκορβικού οξέος EDTA (υδατικό διάλυμα 0,5%) Μήλα, αχλάδια, πατάτες, μελιτζάνες Πορεία εργασίας 1) Δεδομένου ότι η κατεργασία των τροφίμων θα πρέπει να γίνει αμέσως μετά τον τεμαχισμό τους, παρασκευάζονται πρώτα τα προς εξέταση διαλύματα, σύμφωνα με τις αναγραφόμενες παραπάνω περιεκτικότητες. Στη συνέχεια τεμαχίζονται σε λεπτές φέτες τα φρούτα και τα λαχανικά και: 160

161 i. Δύο τεμάχια από κάθε προϊόν τοποθετούνται σε λευκό διηθητικό χαρτί και άλλα δύο εμβαπτίζονται σε απεσταγμένο νερό, σε ποτήρι ζέσεως των 100 ml. Τα δείγματα αυτά θα αποτελέσουν τους μάρτυρες. ii. Ρυθμίζεται το p των διαλυμάτων κατεργασίας, ως ακολούθως: ασκορβικού οξέος p=5 7 κιτρικού οξέος p=3 4 κιτρικού / ασκορβικού p=3 4 2) Επέμβαση στο φαινολικό υπόστρωμα: 4 τεμάχια από το κάθε προϊόν εμβαπτίζονται στο διάλυμα του ασκορβικού οξέος για 1 min. Στη συνέχεια 2 τεμάχια τοποθετούνται πάνω σε λευκό διηθητικό χάρτη και άλλα 2 σε ποτήρι ζέσεως των 100 ml, που περιέχει το ίδιο διάλυμα του ασκορβικού οξέος. Τα τεμάχια του διηθητικού χάρτη εισάγονται σε επωαστικό κλίβανο (28 30º) και αυτά που είναι καλυμμένα με το διάλυμα του ασκορβικού οξέος στον καταψύκτη. 3) Αποκλεισμός οξυγόνου: 2 τεμάχια από κάθε φρούτο και λαχανικό τοποθετούνται σε ποτήρι ζέσεως των 500 ml και καλύπτονται με το διάλυμα της ζάχαρης, ενώ άλλα 2 καλύπτονται με το διάλυμα της άλμης (σε αντίστοιχο δοχείο). Και τα 2 ποτήρια με τα δείγματα τοποθετούνται στον επωαστικό κλίβανο (28 30º). 4) Αδρανοποίηση φαινολάσης α) με θέρμανση: 4 τεμάχια από κάθε φρούτο και λαχανικό εμβαπτίζονται σε νερό που βράζει για 1 λεπτό. Τα 2 από αυτά τοποθετούνται πάνω σε λευκό διηθητικό χάρτη και στη συνέχεια στον 161

162 επωαστικό κλίβανο. Τα άλλα 2 τοποθετούνται σε ποτήρι ζέσεως των 100 ml με απεσταγμένο νερό και ακολούθως στον καταψύκτη. β) με φυσικοχημικά μέσα: i) μείωση του p: 4 τεμάχια από κάθε φρούτο και λαχανικό εμβαπτίζονται στο διάλυμα του κιτρικού οξέος (p 3) και 4 τεμάχια των ίδιων προϊόντων στο διάλυμα του μίγματος κιτρικού ασκορβικού (επίσης p 3). Μετά την παραμονή τους επί 1 min στα αντίστοιχα διαλύματα χωρίζονται ανά δύο από κάθε προϊόν. Τα 2 πρώτα της τετράδας κάθε προϊόντος τοποθετούνται σε διηθητικό χάρτη, και στη συνέχεια στον κλίβανο, ενώ τα άλλα 2 σε ποτήρια ζέσεως (100 ml) όπου καλύπτονται με τα αντίστοιχα διαλύματα στα οποία είχαν εμβαπτισθεί (κιτρικού και μίγματος κιτρικού ασκορβικού). Τα τελευταία μεταφέρονται στον καταψύκτη. ii) δέσμευση της φαινολάσης (ιόντων χαλκού): 4 τεμάχια από κάθε φρούτο και λαχανικό κατεργάζονται κατά τα γνωστά, όπως δηλαδή και με την επέμβαση στο φαινολικό υπόστρωμα (βήμα 2) με τη διαφορά ότι το διάλυμα κατεργασίας είναι τώρα το EDTA. 5) Μετά από παραμονή μιας ώρας στον καταψύκτη ή στον επωαστικό κλίβανο (28 30º), όλα τα δείγματα εξάγονται και βαθμολογούνται ως προς το χρώμα σε σχέση με τους μάρτυρες, και με μεταξύ τους σύγκριση (καταψύκτης επωαστικός κλίβανος). Τα αποτελέσματα καταγράφονται σε πίνακα για κάθε φρούτο λαχανικό και εξάγονται τα αντίστοιχα συμπεράσματα. Παρατήρηση: Λόγω του μεγάλου αριθμού των δειγμάτων και της πολλαπλότητας των επεμβάσεων θα πρέπει να καταβληθεί κάθε δυνατή 162

163 προσπάθεια για τη διασφάλιση της επισήμανσης των δειγμάτων / χειρισμών και βέβαια, για την εξοικονόμηση χώρου (καταψύκτης επωαστικός κλίβανος). Ανάλογα με τον αριθμό των παρακολουθούντων το Εργαστήριο φοιτητών, κάθε ομάδα εργασίας ενδέχεται να ασχοληθεί με τη μελέτη ενός μόνο προϊόντος. Στην περίπτωση αυτή, τα συνολικά αποτελέσματα θα αναγραφούν στον Πίνακα του Εργαστηρίου και θα μεταφερθούν στο Τετράδιο Εργασίας, όπου η κάθε ομάδα θα υποσημειώσει το προϊόν με το οποίο εργάστηκε. 163

164 ΠΕΙΡΑΜΑ ΣΤ 3 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΛΛΕΡΓΙΟΓΟΝΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ELISA Σκοπός Έλεγχος αλλεργιογόνων ουσιών σε τρόφιμα με την μέθοδο ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Από τη Θεωρία στην Πράξη Αλλεργίες που οφείλονται σε τρόφιμα Υπολογίζεται ότι το 3,5% των ενηλίκων και το 6 8% των παιδιών είναι αλλεργικοί σε τρόφιμα (π.χ. περισσότερο από 10 εκατομμύρια άτομα στις ΗΠΑ έχουν αλλεργία που οφείλεται σε κάποιο τρόφιμο). Έχουν εντοπιστεί πάνω από 160 είδη τροφίμων που περιέχουν πρωτεΐνες οι οποίες προκαλούν αλλεργική αντίδραση, αλλά το 90% όλων των τροφο αλλεργικών αντιδράσεων προκαλούνται από 8 τύπους τροφίμων που είναι οι εξής: Αυγά, γάλα, σόγια, σιτάρι, μαλακόστρακα (γαρίδες κτλ.), ψάρι, ξηρούς καρπούς όπως φιστίκια (κυρίως τύπου αράπικο), καρύδια, φουντούκια, αμύγδαλα, κάσιους, κτλ. 164

165 Τα αλλεργιογόνα των τροφίμων αποτελούνται από πρωτεϊνικής φύσης ενώσεις οι οποίες εμπεριέχονται σε ορισμένα τρόφιμα και μπορούν να προκαλέσουν ανοσολογικές αντιδράσεις σε αλλεργικά (στη συγκεκριμένη ένωση) άτομα. Ως αλλεργικά χαρακτηρίζονται τα άτομα τα οποία διακρίνονται από αυξημένη ευαισθησία απέναντι σε ορισμένες χημικές ή βιολογικές ουσίες. Έχει διαπιστωθεί ότι ακόμη και ελάχιστες ποσότητες της αλλεργιογόνου πρωτεΐνης σε ένα τρόφιμο μπορούν να προκαλέσουν την αλλεργική αντίδραση και η ποσότητα αυτή διαφέρει από άτομο σε άτομο. Τα τροφο αλλεργιογόνα μόλις ληφθούν, μπορούν να προκαλέσουν μία σειρά από συμπτώματα που κυμαίνονται από ήπια εξανθήματα ως σοβαρά γαστρεντερικά και αναπνευστικά συμπτώματα, συμπεριλαμβανομένης της ναυτίας, του εμετού, του πρησμένου λαιμού, του άσθματος και του αναπνευστικού προβλήματος. Η σοβαρότερη τροφο αλλεργική αντίδραση είναι το αναφυλακτικό σοκ, μία αντίδραση που μπορεί να συμπεριλάβει οποιαδήποτε από τα συμπτώματα που περιγράφονται προηγουμένως, αλλά επίσης περιλαμβάνει μια επικίνδυνη πτώση στην πίεση του αίματος και μερικές φορές καρδιακή αρρυθμία. Το αναφυλακτικό σοκ μπορεί επίσης να οδηγήσει σε θάνατο εάν δεν αντιμετωπιστεί αμέσως. Έλεγχοι των τροφο αλλεργιογόνων Η Ευρωπαϊκή Ένωση (Ε.Ε.) έχει πρόσφατα επιβάλλει την υποχρεωτική επισήμανση των συσκευασμένων τροφίμων με τα περιέχοντα συστατικά με σκοπό την προστασία των ατόμων που είναι αλλεργικά σε τρόφιμα. Ο έλεγχος της παρουσίας αλλεργιογόνων είναι απαραίτητος για να ανιχνευτούν τα πιθανά επικίνδυνα συστατικά και να διασφαλιστεί ότι θα επισημανθούν. Οι βιομηχανίες συνήθως αναγράφουν στην συσκευασία των προϊόντων μία προειδοποιητική δήλωση όπως πχ «μπορεί να περιέχει φιστίκι ή ίχνη από φιστίκι», ακόμη και αν 165

166 οι πιθανότητες να περιέχει την αλλεργιογόνο πρωτεΐνη (π.χ. φιστίκι) είναι ελάχιστες. Μεθοδολογία Η τεχνική της ανοσοπροσροφητικής ανάλυσης στερεάς φάσεως με σύνδεση ενζύμου (ELISA) βασίζεται στη χρήση αντισωμάτων τα οποία παρέχουν εξαιρετική εξειδίκευση ως αντιδραστήρια για τον καθορισμό της ποσότητας μίας πρωτεΐνης ή κάποιου άλλου αντιγόνου. Με την τεχνική αυτή, ένα ένζυμο που αντιδρά με ένα άχρωμο υπόστρωμα και παράγει ένα έγχρωμο προϊόν συνδέεται ομοιοπολικά με ένα ειδικό αντίσωμα που αναγνωρίζει ένα αντιγόνο στόχο. Αν υπάρχει αντιγόνο, τότε το σύμπλοκο αντισώματος-ενζύμου θα δεσμευτεί σε αυτό και το ένζυμο θα καταλύσει την αντίδραση παράγοντας το χρωμοφόρο προϊόν. Επομένως, η παρουσία του χρωμοφόρου προϊόντος καθορίζει την ύπαρξη του αντιγόνου. Μία τέτοια μέτρηση, γρήγορη και ευαίσθητη μπορεί να ανιχνεύσει ποσότητες πρωτεΐνης μικρότερες από ένα νανογραμμάριο (10-9 g). Υπάρχουν διάφοροι τύποι ELISA, οι κυριότεροι από τους οποίους είναι ο έμμεσος τύπος ELISA και η διπλή (sandwich) ELISA. Σημειώνεται ότι ανάλογη μεθοδολογία μπορεί να ακολουθηθεί και για τον προσδιορισμό αφλατοξινών σε τρόφιμα. Η μέθοδος της ELISA SANDWI για αντιγόνα. Η διπλή (sandwich) ELISA επιτρέπει την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση του αντιγόνου. Αντισώματα για ένα συγκεκριμένο αντιγόνο προσκολλώνται στον πυθμένα ενός ειδικού πλακιδίου (ή σε μικροσωλήνες τιτλοδότησης). Μικρές ποσότητες προσροφώνται στην επιφάνεια του πλακιδίου. Τα ελεύθερα αντισώματα απομακρύνονται με πλύση. Στην συνέχεια το δείγμα 166

167 (που περιέχει το αντιγόνο υπό ανίχνευση) προστίθεται στο πλακίδιο και το τυχόν αντιγόνο δεσμεύεται στο αντίσωμα. Οι μη προσδεμένες πρωτεΐνες απομακρύνονται με πλύση. Στη συνέχεια ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για το αντιγόνο προστίθεται στο πλακίδιο. Το δεύτερο αυτό αντίσωμα είναι συνδεδεμένο με ένζυμο (ενζυμοσύνδετο) και δεσμεύεται επίσης στο αντιγόνο. Όσα ενζυμοσύνδετα αντισώματα περισσεύουν (δεν έχουν δεσμευτεί με αντιγόνο) ξεπλένονται και απομακρύνονται. Όταν τοποθετηθεί το κατάλληλο υπόστρωμα του ενζύμου επιτελείται μία ενζυμική αντίδραση που παράγει ένα ορατό σήμα το οποίο δείχνει την ποσότητα αντιγόνου στο δείγμα. Χρησιμοποιούνται ή χρωμογόνα ή φθορισμού υποστρώματα, τα οποία έχουν υψηλότερη ευαισθησία.η ένταση του χρώματος είναι ευθέως ανάλογη της ποσότητας του αντιγόνου. Εργαστηριακός εξοπλισμός Αντιδραστήρια φασματοφωτόμετρο (Neogen) λευκοί μικροσωληνίσκοι (με αντιγόνο) κόκκινοι μικροσωληνίσκοι φυγόκεντρος ή φίλτρα υδατόλουτρο με αναδευτήρα ομογενοποιητής (blender jar) ζυγός ακριβείας πιπέτα (μονή και 12 κάναλη) και tips μικρολεκάνες τοποθέτησης των διαλυμάτων onjugate, Substrate και Red Stop μικροδοχεία και βάση αυτών πλαστικά δοχεία τοποθέτησης του δείγματος ποτήρια ζέσεως απορροφητικό χαρτί χρονόμετρο δοχεία με 0, 2,5, 5, 10 και 25 ppm πρότυπων διαλυμάτων αλλεργιογόνου δοχεία με διάλυμα ενζυμοσύνδετου αντισώματος (onjugate) δοχείο με διάλυμα Substrate 167

168 δοχείο με διάλυμα Red Stop σκόνη Extraction Solution σκόνη προσθετικού εκχύλισης σκόνη Washing Buffer απιονισμένο νερό δείγμα (τρόφιμο) Πορεία εργασίας Τα τεστ τροφο αλλεργιογόνων είναι τα sandwich enzyme-linked immunoassays (S ELISAs) και βασίζονται στην ίδια αρχή. Μία αλλεργιογόνος πρωτεΐνη-στόχος εκχυλίζεται από τα δείγματα με ένα ρυθμιστικό διάλυμα άλατος. Η εκχυλισμένη πρωτεΐνη προστίθεται στο πλακίδιο τιτλοδότησης που έχει προσκολληθεί το αντίσωμα και δεσμεύεται με το αντίσωμα κατά την διάρκεια της επώασης. Η μη δεσμευμένη πρωτεΐνη εκπλένεται και προστίθεται ένα δεύτερο αντίσωμα που είναι συζευγμένο με ένζυμο (ενζυμοσύνδετο, enzyme-labeled conjugate). Το ενζυμοσύνδετο αντίσωμα δεσμεύεται και αυτό με το αντιγόνο (την αλλεργιογόνο πρωτεΐνη). Μετά από μία δεύτερη έκπλυση προστίθεται το υπόστρωμα. Παρατηρείται αλλαγή στο χρώμα λόγω της ύπαρξης του δεσμευμένου ενζυμοσύνδετου αντισώματος. Προστίθεται το αντιδραστήριο «Red Stop» και καταγράφεται το χρώμα του διαλύματος. Το μπλε χρώμα υποδηλώνει μία ισχυρά θετική αντίδραση (ύπαρξη αλλεργιογόνου). Το κόκκινο χρώμα υποδηλώνει ελάχιστο ή καθόλου αλλεργιογόνο-στόχο. Παράλληλα με τα δείγματα που περιέχουν άγνωστη συγκέντρωση αλλεργιογόνου, χρησιμοποιούνται και πρότυπα διαλύματα γνωστής συγκέντρωσης αλλεργιογόνου (controls). Οι οπτικές πυκνότητες μετρώνται σε ένα ειδικό φασματοφωτόμετρο (ELISA reader). Κατασκευάζεται μία πρότυπη καμπύλη με βάση τις οπτικές πυκνότητες των πρότυπων διαλυμάτων από την οποία υπολογίζονται οι συγκεντρώσεις αλλεργιογόνων πρωτεϊνών των δειγμάτων. 168

169 Sandwich ELSA test αντίσωμα αλλεργιογόνο ενζυμοσύνδετο αντίσωμα αντίδραση αντισώματος αλλεργιογόνου Υπόστρωμα αλλεργιογόνου Α. Εκχύλιση αλλεργιογόνου (πρωτεΐνης) Για έλεγχο αλλεργιογόνων σε αμύγδαλα, φιστίκια, αυγά, φουντούκια και σόγια. 1) Προετοιμασία του διαλύματος εκχύλισης (extraction solution) και προθέρμανση στους 60. 2) Ομογενοποίηση του δείγματος. Μεταφορά 5 g δείγματος, ή 5 ml υγρού δείγματος σε συσκευή ομογενοποίησης 250 ml (blender jar). 3) Προσθήκη μίας μεζούρας του προσθετικού εκχύλισης (extraction additive) στον αναμίκτη. 4) Προσθήκη 125 ml του διαλύματος εκχύλισης (που διατηρείται στους 60 ) στο μπλέντερ και ανάδευση στην υψηλή ταχύτητα για 2 min 5) Επώαση για 10 min μέχρι να διαχωριστεί το δείγμα. 6) Αφαίρεση του διαυγούς υπερκείμενου υγρού και χρήση σαν δείγμα για ανίχνευση αλλεργιογόνου. Εναλλακτικά μπορεί να γίνει φυγοκέντρηση στις rpm για 5 min. 169

170 B. Ποσοτικοποίηση αλλεργιογόνου με ELISA Sandwich 1. προσθήκη 150 μl από πρότυπα διαλύματα και δείγματα στους μικροσωλήνες μεταφοράς (transfer wells). 2. μεταφορά 100 μl στους μικροσωλήνες με τα αντισώματα (antibody wells). Επώαση για 10 min. 3. απομάκρυνση των διαλυμάτων από τους μικροσωλήνες αντισωμάτων. 4. πλύση των μικροσωλήνων με διάλυμα έκπλυσης. 5. απομάκρυνση νερού σε απορροφητικό χαρτί. 6. μεταφορά 100 μl του εμζυμοσύνδετου αντισώματος (conjugate) στους μικροσωλήνες αντισώματος. Επώαση για 10 min 7. Επανάληψη βημάτων 3-5 με απομάκρυνση όλων των υγρών, εξονυχιστική έκπλυση των μικροσωλήνων και χτύπημα στο απορροφητικό χαρτί για απομάκρυνση σταγόνων. 8. Μεταφορά 100μL του υποστρώματος στους μικροσωλήνες. Επώαση για 10 min. 9. Μεταφορά 100μL του αντιδραστηρίου RED STP στους μικροσωλήνες. Μέτρηση αποτελεσμάτων σε ELISA Reader. 170

171 Συνολικά, για την εκτέλεση του πειράματος προσδιορισμού αλλεργιογόνων με τη μέθοδο sandwich ELISA, ακολουθούνται τα παρακάτω βήματα: 1. Ζύγιση 5 g από το δείγμα (τρόφιμο). 2. Ομογενοποίηση του δείγματος. 3. Στο ομογενοποιημένο δείγμα γίνεται προσθήκη 125 ml διαλύματος εκχύλισης. 4. Τοποθέτηση εκχυλισμένου δείγματος σε υδατόλουτρο (60 o ) ταυτόχρονη ανάδευση για 15 min. 5. Διήθηση ή φυγοκέντριση του εκχυλισμένου δείγματος (φυγοκέντριση: 5 min στις rpm ή 20 min σε μικρότερη ταχύτητα. 6. Παραμονή των δειγμάτων σε θερμοκρασία δωματίου, αφού γίνει συλλογή του προϊόντος φυγοκέντρισης. 7. Ανακίνηση δειγμάτων. 8. Προσθήκη 150 μl από το κάθε διάλυμα control κατά σειρά συγκέντρωσης 0 ppm, 1 ppm, 2,5 ppm, 5 ppm και 10 ppm αντίστοιχα στις 5 πρώτες θέσεις των κόκκινων μικροσωληνίσκων. 9. Προσθήκη στις υπόλοιπες 7 θέσεις 150 μl από το κάθε διάλυμα από τα 7 δείγματα. 10. Μεταφορά 100 μl από τους κόκκινους μικροσωληνίσκους στις αντίστοιχες θέσεις των λευκών μικροσωληνίσκων. 11. Ελαφρά ανακίνηση. 12. Παραμονή σε ηρεμία για 10 min. 13. Άδειασμα των άσπρων μικροσωληνίσκων. 14. Έκπλυση 5 φορές με το διάλυμα buffer. 15. Μεταφορά 100μL από το διάλυμα onjugate (μπουκαλάκι μπλε χρώματος) σε καθέναν από τους άσπρους μικροσωληνίσκους. 16. Ελαφρά ανακίνηση. 17. Παραμονή σε ηρεμία για 10 min. 18. Άδειασμα των άσπρων μικροσωληνίσκων. 19. Έκπλυση 5 φορές με το διάλυμα buffer. 20. Μεταφορά 100μL από το διάλυμα Substrate (μπουκαλάκι πράσινου χρώματος) σε καθέναν από τους άσπρους μικροσωληνίσκους. 21. Παραμονή σε ηρεμία για 10 min. 22. Μεταφορά 100μL από το διάλυμα Red Stop (μπουκαλάκι κόκκινου χρώματος) σε καθέναν από τους άσπρους μικροσωληνίσκους. 23. Φωτομέτρηση στα 650 nm. 24. Καταγραφή- Αναφορά αποτελέσματος για την ύπαρξη ή μη τροφοαλλεργιογόνου και περιεκτικότητας του τροφίμου σε αυτό. 171

172 ΠΕΙΡΑΜΑ ΣΤ 4 ΧΡΩΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΑΝΕΠΙΘΥΜΗΤΩΝ ΙΟΝΤΩΝ ΣΤΟ ΠΟΣΙΜΟ ΝΕΡΟ Σκοπός Ο προσδιορισμός με χρωματομετρικές μεθόδους των συγκεντρώσεων και χημικών ενώσεων, που όταν οι συγκεντρώσεις τους υπερβαίνουν ορισμένα όρια χαρακτηρίζονται ως ανεπιθύμητες για το πόσιμο και μη νερό (απόβλητα, βιομηχανικά ύδατα, λέβητες, υδατοκαλλιέργειες). Ειδικότερα, τα νιτρώδη άλατα θεωρούνται καρκινογόνα, αφού μπορούν να αντιδράσουν με αμίνες-αμινοξέα και να δώσουν τις γνωστές για την τοξικότητά τους νιτροζαμίνες. Γίνεται έλεγχος των συγκεντρώσεων αμμωνίας, νιτρικών και νιτρωδών ιόντων, οι οποίες αυξάνονται σημαντικά από την υπερβολική χρήση λιπασμάτων. Μεθοδολογία Α) Προσδιορισμός N 3 + Σχηματισμός κίτρινο-πορτοκαλόχρωμου συμπλόκου μεταξύ των N 4 και του αντιδραστηρίου Nessler (B: gi 2, KI, Na). 2 (ΗgI 2.2KI) + 2N 3 2(N 3.gI 2 ) + 2KI 2(N 3.gI 2 ) N 2 g 2 I 3 + N 4 I 172

173 Μέθοδος: 1) 5mL δείγματος στο φιαλίδιο 2) 3 σταγόνες από το αντιδραστήριο Α (τρυγικό καλιονάτριο) και μετά από ανακίνηση, 2 σταγόνες από το αντιδραστήριο Β (Nessler). 3) Μετά 3 min, σύγκριση κλίμακας χρώματος (mg/l N 3 ). Προσοχή: Το αντιδραστήριο Nessler είναι τοξικό - Β) Προσδιορισμός NΟ 3 4) Τα νιτρικά ανάγονται πρώτα σε νιτρώδη τα οποία αντιδρούν με σουλφανιλικό οξύ και σχηματίζουν διαζω-ένωση. Στη συνέχεια το διαζωνιακό άλας αντιδρά με 2,5-διυδροξυ-βενζοϊκό οξύ και σχηματίζει χαρακτηριστικό αζώχρωμα. Αντίδραση: 3 S + N=N + Διαζωνιακό άλας 3 S N=N + + Αζώχρωμα 173

174 Μέθοδος: Προσθήκη: 1) 5mL δείγματος στο φιαλίδιο 2) Προσθήκη 1 κοχλιαρίου (επίπεδη επιφάνεια) αντιδραστηρίου Α (προσοχή-τοξικό-γάντια. Κάλυψη, ανακίνηση για 1 min). - 3) Μετά 10 min σύγκριση χρωματικής κλίμακας (mg/l NΟ 3 ). - Γ) Προσδιορισμός NΟ 2 4) Σχηματισμός ερυθρο-ιώδους αζωένωσης ( σύμπλοκου σε p 2-2.5, μετά από αντίδραση μεταξύ του διαζωτωμένου σουλφανιλικού οξέος, που επιτυγχάνεται με το νιτρώδες οξύ και της ναφθυλαμίνης). 3 S N=N N 2 Μέθοδος: Προσθήκη: 1) 5mL δείγματος στο φιαλίδιο 2) 10 σταγόνες αντιδραστηρίου Α (α-ναφθυλαμίνη, σουλφανιλικό οξύ, οξικό οξύ). 3) Ανακίνηση. 4) Μετά 5 min, σύγκριση χρωματικής κλίμακας (mg/l NΟ2-). 174

175 ΕΝΟΤΗΤΑ Ζ ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ Στην τελευταία αυτή ενότητα του Βιβλίου του Εργαστηρίου της Χημείας των Τροφίμων περιγράφονται τρεις ασκήσεις, οι οποίες δεν εντάσσονται αποκλειστικά σε κάποια από τις προηγούμενες έξι ενότητες. Οι ασκήσεις αυτές αφορούν γρήγορες τεχνικές και μεθόδους που χρησιμοποιούνται σήμερα από τη βιομηχανία τροφίμων ή/και ορισμένους κρατικούς φορείς για τον έλεγχο είτε της ποιότητας του νερού είτε του θερμιδικού περιεχομένου των τροφίμων ή τέλος, για τον έλεγχο των επιπέδων αλκοόλης που ενδέχεται να επιβαρύνουν τον ανθρώπινο οργανισμό. Οι τεχνικές στις οποίες αναφέρονται οι ασκήσεις ενώ είναι επιστημονικά αποδεκτές δε μπορεί να χρησιμοποιηθούν από μόνες τους- για έκφραση ερευνητικών αποτελεσμάτων. Ωστόσο η ευκολία, η απλότητα, η ταχύτητα και η αξιοπιστία των αντιστοίχων πειραμάτων τις έχει καταστήσει (μαζί με άλλες μεθόδους) γενικά αποδεκτές και εφαρμόσιμες στην καθημερινή πρακτική 175

176 ΠΕΙΡΑΜΑ Ζ 1 ΤΑΧΥΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΚΛΗΡΟΤΗΤΑΣ ΚΑΙ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΩΝ ΑΠΟΛΥΜΑΝΣΗΣ ΝΕΡΟΥ Σκοπός Ο προσδιορισμός με χρωματομετρικές μεθόδους των συγκεντρώσεων διαφόρων ανιόντων και χημικών ενώσεων, που όταν οι συγκεντρώσεις τους υπερβαίνουν ορισμένα όρια χαρακτηρίζονται ως ανεπιθύμητες για το πόσιμο και μη νερό (απόβλητα, βιομηχανικά ύδατα, λέβητες, υδατοκαλλιέργειες). Γίνεται έλεγχος της σκληρότητας, κυρίως αλάτων ασβεστίου, καθώς και των συγκεντρώσεων χλωρίου το οποίο αποτελεί το βασικό μέσο απολύμανσης (χλωρίωσης) του νερού. Μεθοδολογία Α)Έλεγχος σκληρότητας Συμπλοκομετρική τιτλοδότηση με το μετά νατρίου άλας του αιθυλενοδιάμινο-τετρα-οξικού οξέος (EDTA). Αλλαγή χρώματος ειδικού δείκτη, που βασίζεται σε τροποποιημένη και σταθεροποιημένη χρωστική ουσία (eriochrome black). Na 2 2 Na N 2 2 N + a Na N N a 2 -Na Η + 176

177 Προστίθενται μικροί κρύσταλλοι EDTA μέχρι αλλαγής χρώματος από ερυθρό σε πράσινο. Τα αποτελέσματα σε ppm a 3 και αυτά μετατρέπονται σε γαλλικούς ή γερμανικούς βαθμούς με βάση την εξίσωση: 10 ppm a 3 (mg/l) =1 γαλλικός βαθμός ( ο f)= 0.56 γερμανικοί βαθμοί ( ο d). Μέθοδος: Προσθήκη: 1) 5 ml δείγματος με τη σύριγγα στην κυψελίδα 2) 3 σταγόνων δείκτη (ερυθρωπό) eriochrome black/τριαιθανολαμίνη 3) μικρών κρυστάλλων EDTA (διαλύματος τιτλοδότησης) στο δείγμα Η 2 Ο και ανακίνηση μέχρι αλλαγής χρώματος από ερυθρό σε πράσινο). Ανάγνωση ποσότητας από τη σύριγγα και πολλαπλασιασμός με το 10 σκληρότητα σε ppm a 3 4) μετατροπή σε γαλλικούς και γερμανικούς βαθμούς σύμφωνα με την παραπάνω εξίσωση Β) Προσδιορισμός ιόντων l - Ο προσδιορισμός στηρίζεται στην αντίδραση μεταξύ του Ν,Ν-διαιθυλο-pφαινυλενοδιαμίνης (DPD) και του ελεύθερου χλωρίου, σε υδατικό διάλυμα p 6,0-6,5. 177

178 5 2 N N 2 + 1/2 l N N 2 l - + N N l Μέθοδος: Για το ελεύθερο διαθέσιμο χλώριο, προσθήκη: 1) 5 ml δείγματος νερού (με τη σύριγγα). 2) 2 σταγόνες Αντιδραστηρίου A 3) 1 σταγόνα Αντιδραστηρίου Β. 4) Ανακίνηση. 5) Μετά 4 min, σύγκριση χρωματικής κλίμακας (mg/l l - ). Για το ολικό διαθέσιμο χλώριο προσθήκη: 1) 2 σταγόνων Αντιδραστηρίου, στο προηγούμενο φιαλίδιο. 2) Ανακίνηση. 3) Μετά 2 min, σύγκριση χρωματικής κλίμακας (mg/l l - ). Για το δεσμευμένο διαθέσιμο χλώριο Το δεσμευμένο χλώριο υπολογίζεται από τη διαφορά μεταξύ του ολικού διαθέσιμου χλωρίου και του ελεύθερου διαθέσιμου χλωρίου. Δηλαδή: (mg/l l - ) ολικού διαθέσιμου χλωρίου - (mg/l l - ) ελεύθερου διαθέσιμου χλωρίου = δεσμευμένο διαθέσιμο χλώριο. 178

179 ΠΕΙΡΑΜΑ Ζ 2 ΘΕΡΜΙΔΙΚΟ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΤΡΟΦΩΝ Σκοπός Ο προσδιορισμός της θερμιδικής αξίας διαφόρων τροφίμων και η κατάταξή τους στην κατηγορία των χαμηλής θερμιδικής αξίας προϊόντων (light). Μεθοδολογία Μπορούν να εφαρμοστούν δύο τρόποι προσδιορισμού της θερμιδικής αξίας των τροφίμων. α) Ο άμεσος προσδιορισμός. Αυτός πραγματοποιείται με το Αδιαβατικό Θερμιδόμετρο Καύσης (Bomb alorimeter). Κατ αυτόν γίνεται πλήρης καύση του δείγματος σε ένα κλειστό σύστημα από το οποίο δεν είναι δυνατή η διαφυγή θερμότητας προς το εξωτερικό περιβάλλον (αδιαβατικό θερμιδόμετρο). Κατά τη διεργασία αυτή η αύξηση της θερμοκρασίας του συστήματος είναι ενδεικτική της ενέργειας που απελευθερώνεται με την καύση του δείγματος του τροφίμου. Το αδιαβατικό θερμιδότερο αποτελείται από την κυρίως οβίδα καύσης και ένα εξωτερικό δοχείο με το μανδύα του. Καταρχάς μετράται η θερμοχωρητικότητα Κ του αδιαβατικού θερμιδομέτρου (σε al/ o ) προσδιοριζόμενη από τη σχέση : Q m Δθ (al/g) g ο β όπου: 179

180 Q β = Θερμότητα Καύσης του βενζοϊκού οξέος (σε 6,32 al/g) m = Βάρος του δείγματος (βενζοϊκού οξέος) (σε g) Δθ= θ 2 -θ 1 =ανύψωση θερμοκρασίας στο εσωτερικό δοχείο που περιέχει την οβίδα ( o ) Στη συνέχεια, το δείγμα με τη μορφή λυοφιλιωμένης κάψουλας, τοποθετείται στο θερμιδόμετρο, γίνεται καύση αυτού και προσδιορίζεται η θερμότητα καύσης (σε al/g) του συγκεκριμένου δείγματος, από τη σχέση: Q τροφ Κ θ m al/ o g o Από τη θερμότητα καύσης προσδιορίζεται και η θερμιδική αξία του δείγματος, η οποία εκφράζεται αρχικά σε al/g λυοφιλιωμένου προϊόντος. Συχνά γίνεται αναγωγή της θερμιδικής αξίας σε al/g νωπού δείγματος ή σε al/100g νωπού δείγματος. Ο δεύτερος τρόπος έκφρασης των αποτελεσμάτων είναι αυτός που αναγράφεται συνήθως στους πίνακες διατροφικής αξίας. β) Ο έμμεσος προσδιορισμός. Αυτός πραγματοποιείται μετά από χημική ανάλυση των επιμέρους συστατικών των τροφίμων. Προσδιορίζονται δηλαδή σύμφωνα με τις κλασικές μεθόδους τα ολικά σάκχαρα, οι πρωτεΐνες και τα λιπίδια (βλ. πρακτικές ασκήσεις των αντιστοίχων ενώσεων/κεφαλαίων) και στη συνέχεια, με τους συντελεστές μετατροπής του Πίνακα Z.2.1. υπολογίζεται η θερμιδική αξία του συγκεκριμένου τροφίμου. Υδατάνθρακες 4 calg Πρωτεΐνες 4 cal/g Λίπη-έλαια 9 cal/g Αλκοόλη 7 cal/g Πίνακας Ζ.2.1Θερμιδικό περιεχόμενο συστατικών τροφίμων - ποτών 180

181 Για την κατάταξη ενός τροφίμου στην κατηγορία των light γίνεται μέτρηση της θερμιδικής αξίας ενός συμβατικού δείγματος του τροφίμου/ποτού και σύγκριση αυτής με τη θερμιδική αξία ενός άλλου δείγματος το οποίο πρέπει να περιέχει λιγότερα λιπαρά ή λιγότερες ή καθόλου μεταβολιζόμενες γλυκαντικές ύλες (π.χ. ασπαρτάμη ή σακχαρίνη αντί σακχαρόζης). 181

182 ΠΕΙΡΑΜΑ Ζ 3 ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΑΛΚΟΟΛΗΣ ΣΤΟ ΑΙΜΑ- ΑΛΚΟΟΛΟΜΕΤΡΟ Σκοπός έλεγχος των συγκεντρώσεων αιθυλικής αλκοόλης στον εκπνεόμενο αέρα και κατ επέκταση στο αίμα, μετά την κατανάλωση αλκοολούχων ποτών. Από τη θεωρία στην πράξη Η αιθανόλη που βρίσκεται σε διαφορετικές συγκεντρώσεις στα διάφορα αλκοολούχα ποτά (μπύρα ~ 5%, κρασί ~ 12%, ουίσκι τζιν μπράντι ούζο κτλ ~ 40-50%), όταν εισέλθει στον οργανισμό, απορροφάται σε διάστημα 1h 3h, από το στομάχι και κατά 80% περίπου από το έντερο. Με το αίμα των αγγείων που περιβάλλουν το στομάχι και το έντερο η αλκοόλη μεταφέρεται σε πολλά όργανα του σώματος (συκώτι, καρδιά, πνεύμονες, εγκέφαλος κτλ) όπου εκδηλώνει τις βιολογικές της δράσεις. Από τους πνεύμονες, διαχέεται και στον εκπνεόμενο αέρα, ακολουθώντας το Νόμο του enry. Κατά συνέπεια, με μετρήσεις του ποσοστού οινοπνεύματος στον εκπνεόμενο αέρα, με συνεκτίμηση: α) του συντελεστή κατανομής του στα διάφορα όργανα (για το αίμα είναι 1:2000), β) του ποσοστού μεταφοράς (εξάτμισης) της αλκοόλης από το αίμα στον εκπνεόμενο αέρα, υπολογίζεται η συγκέντρωση της αιθανόλης στο αίμα. 182

183 Μεθοδολογία Το όργανο το οποίο χρησιμοποιείται στο Εργαστήριο για τις μετρήσεις των επιπέδων αλκοόλης στο αίμα (αλκοολόμετρο), είναι παρόμοιο αυτού που χρησιμοποιεί η Τροχαία για τα αντίστοιχα αλκοτέστ. Ακριβέστερες ωστόσο μετρήσεις και καταγραφή των συγκεντρώσεων αλκοόλης στον οργανισμό, πραγματοποιούνται σε δοκίμια αίματος τα οποία λαμβάνονται από το υπό εξέταση άτομο. Δεδομένου ότι στους χώρους εργασίας και άσκησης δεν επιτρέπεται η κατανάλωση φαγητών και ποτών, η χρήση δε οινοπνευματωδών ποτών ενδέχεται να δημιουργήσει σοβαρά προβλήματα, οι μετρήσεις γίνονται στον εκπνεόμενο αέρα από το εκπαιδευτικό προσωπικό (ΕΠ) του Εργαστηρίου. Επειδή η αιθυλική αλκοόλη αρχίζει να απορροφάται από τον οργανισμό και να εξατμίζεται από τη στιγμή της πρώτης επαφής της πτητικής αυτής ένωσης με το βλεννογόνο του στόματος, η επίδειξη και χρήση του αλκοολομέτρου (άρα και οι αντίστοιχες μετρήσεις και υπολογισμοί) γίνονται αφού το μέλος ΕΠ, που προσφέρεται για ανάλογο πειραματισμό, κρατήσει στο στόμα του (της) διαφορετικά αλκοολούχα ποτά και για διάφορα χρονικά διαστήματα. Οι μετρήσεις ακολουθούν τον νόμο του enry, ο οποίος δηλώνει ότι: η ποσότητα της εξατμιζόμενης από τους πνεύμονες αιθανόλης είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της ουσίας στο αίμα. Θα πρέπει ωστόσο να τονιστεί ότι: η συγκέντρωση του οινοπνεύματος στο αίμα, δεν είναι πάντοτε ευθέως ανάλογη της ποσότητας οινοπνεύματος που έχει καταναλωθεί από το συγκεκριμένο άτομο. Η συγκέντρωση της αλκοόλης εξαρτάται από πολλούς παράγοντες όπως: όγκο αίματος, δηλαδή όγκο βάρος φύλο ανθρώπου, μεταβολικές αντιδράσεις, χρόνο που έχει μεσολαβήσει από την κατανάλωση, παράλληλη πρόσληψη 183

184 άλλων υγρών, σύσταση τροφής, πληρότητα στομάχου κτλ. Ακόμα μεγαλύτερες είναι οι αποκλίσεις των βιολογικών επιδράσεων της αλκοόλης στον οργανισμό. Όμως, για κανονιστικούς λόγους και νομικές αιτιάσεις, οι μετρήσεις με τις παραπάνω προσεγγίσεις θεωρούνται γενικά αποδεκτές και νομικά κατοχυρωμένες. Το αλκοολόμετρο πρέπει να έχει προηγουμένως βαθμονομηθεί. Το όργανο έχει επίσης τη δυνατότητα σύνδεσης με εκτυπωτή, όπου καταγράφονται τα επιμέρους αποτελέσματα των διαφόρων ελέγχων (τεστ). Η αναλογία συγκέντρωσης της αλκοόλης στο αίμα και της συγκέντρωσης της ένωσης αυτής στον εκπνεόμενο αέρα εκτιμάται ότι είναι 2000:1. 1 Δηλαδή εάν ο εκπνεόμενος αέρας εμφανίσει συγκέντρωση αλκοόλης π.χ. 1 mg/l, τότε στο αίμα τη συγκεκριμένη χρονική στιγμή κυκλοφορούν mg αιθανόλης ανά λίτρο αίματος. Το όργανο που χρησιμοποιείται στο Εργαστήριο (όπως και τα περισσότερα όργανα του εμπορίου, τροχαίας αστυνομίας κλπ) έχει ρυθμιστεί έτσι, ώστε να εμφανίζει αυτόματα το ποσοστό συγκέντρωσης αλκοόλης στον εκπνεόμενο αέρα σε mg ανά λίτρο, δηλαδή σε mg/l BrA (από το Breath Alcohol oncentration). Για να υπολογισθεί η συγκέντρωση της αλκοόλης που κυκλοφορεί τη στιγμή του αλκοτέστ στο αίμα, πολλαπλασιάζεται η ένδειξη (mg/l BrA) επί 2000 και το αποτέλεσμα εκφράζεται σε mg/l BA (από το Blood Alcohol oncentration). Από τη συγκέντρωση αλκοόλης στο αίμα και διάφορες άλλες κατ εκτίμηση παραμέτρους μπορεί να υπολογισθεί και η καταναλωθείσα ποσότητα οινοπνεύματος. Αναλόγως της περιεκτικότητας του οινοπνευματώδους ποτού σε 1 Σε ορισμένες χώρες η αναλογία αυτή εκτιμάται ότι είναι λίγο μεγαλύτερη, όπως π.χ. 2100:1 (στις ΗΠΑ) ή αλλού 2300:1. 184

185 αλκοόλη είναι δυνατό να προταθούν γενικές (απαγορευτικές) οδηγίες προς τους καταναλωτές. Αυτές όμως δεν αποτελούν κανόνα και δεν έχουν συστηματική εφαρμογή για όλα τα άτομα. Έτσι το άτομο, για να μην υπερβεί τα οριζόμενα από το Νόμο ποσοστά, θεωρείται λογικό ότι μπορεί να καταναλώσει μέχρι 150 ml κρασιού ή 330 ml μπύρας ή 30 ml ουίσκι κτλ. Ο παρακάτω πίνακας 1, υποδεικνύει τις επιπτώσεις που δημιουργούνται σε έναν μεσαίου βάρους, ύψους κτλ. άνθρωπο, από την κατανάλωση οινοπνεύματος. Συγκέντρωση οινοπνεύματος στον εκπνεόμενο αέρα Κατάσταση ατόμου (mg/l BrA) νηφαλιότητα ευφορία διέγερση σύγχυση ζάλισμα έως αναισθησία κώμα θάνατος Νομικές επιπτώσεις ( Σεπτέμβριος 2009 ) 0,00-0,25 καμία επίπτωση 0,25-0,40 πρόστιμο >0,40 αφαίρεση άδειας Πίνακας Z.4.1. Επιπτώσεις από την κατανάλωση αιθανόλης 185

186 Πορεία εργασίας 1. Προετοιμασία του οργάνου και του ελέγχου: Το αλκοολόμετρο έχει τα ακόλουθα πλήκτρα / ενδείξεις: Ι-0 (Α): Άνοιγμα κλείσιμο οργάνου (Β): Μικρή κουκίδα αριστερά (): Μεγάλη κουκίδα (D): Μικρή κουκίδα δεξιά. Το όργανο που χρησιμοποιείται για τις μετρήσεις πρέπει να είναι σωστά βαθμονομημένο. Ο έλεγχος της σωστής βαθμονόμησης και άρα της ορθής λειτουργίας του αλκοολομέτρου γίνεται (από το προσωπικό του Εργαστηρίου) στην αρχή της πρακτικής άσκησης, με τη βοήθεια της κατάλληλης φιάλης βαθμονόμησης. Τα βήματα που ακολουθούνται είναι τα εξής: Πιέζεται το πλήκτρο [Α] ή 0-Ι στην ημερομηνία / ώρα. Κρατείται πιεσμένο το πλήκτρο () Όταν ακουστεί παρατεταμένος οξύς ήχος, αφήνεται το πλήκτρο (). Η οθόνη θα πρέπει να δείξει 3.2 ή 3.8 GR κτλ. Πιέζεται το πλήκτρο (Β). Όταν ανάψει το πράσινο λαμπάκι (READY) και αφού έχει τοποθετηθεί κατάλληλα το επιστόμιο (βλ. παρακάτω 1ε), πιέζεται και κρατείται το πώμα της φιάλης βαθμονόμησης. Μετά από 5sec, πιέζεται το πλήκτρο (). Στα 7sec απομακρύνεται το χέρι από το πώμα της φιάλης βαθμονόμησης και ελευθερώνεται το πλήκτρο (). Η ένδειξη της οθόνης θα πρέπει να είναι Εφόσον η ένδειξη είναι εκτός της περιοχής αυτής, απαιτείται βαθμονόμηση του οργάνου. Αυτή γίνεται με ειδικό κλειδί (Dongle), σύμφωνα με τις 186

187 οδηγίες και τις προδιαγραφές της κατασκευάστριας εταιρείας του αλκοολομέτρου. Υπεύθυνο για την ορθή βαθμονόμηση (λειτουργία) του οργάνου είναι το προσωπικό του Εργαστηρίου. Στο βαθμονομημένο όργανο, λαμβάνονται οι μετρήσεις ως εξής: α) Πιέζεται (και ελευθερώνεται) το πλήκτρο (Α). Φωτίζονται αυτόματα όλες οι ενδείξεις (ημερομηνία, ώρα, ελεύθερος χώρος μνήμης κτλ) β) Συνδέεται το αλκοολόμετρο με τον εκτυπωτή γ) Επιλέγεται μία από τις 3 λειτουργίες του οργάνου (modes), που εμφανίζονται διαδοχικά στην οθόνη: P: για έλεγχο με χωνάκι, χωρίς εκτύπωση Α: για έλεγχο με επιστόμιο και εκτύπωση PA: για αμφοτέρους τους ελέγχους (P και A), εφόσον η επιλογή της λειτουργίας P έδειξε FAIL. δ) Το αλκοολόμετρο τίθεται (αυτόματα) σε κατάσταση αναμονής και η ένδειξη WAIT παραμένει αναμμένη μέχρι ότου ανάψει η πράσινη λυχνία (READY) ε) Προσαρμογή επιστομίου: Αποφεύγοντας την επαφή του επιστομίου με τα χέρια και κρατώντας το από το άκρο της μεγάλης οπής, το επιστόμιο τοποθετείται στην αντίστοιχη υποδοχή του οργάνου (στο επάνω μέρος αυτού), όπως δείχνει η φωτογραφία. Αφαιρείται προσεκτικά το περιτύλιγμα του επιστομίου. στ) Ενημέρωση του προς έλεγχο ατόμου: Ο ελεγχόμενος οφείλει να πάρει βαθιά αναπνοή και να τοποθετήσει το άκρο του επιστομίου στο στόμα του. Στη συνέχεια, θα πρέπει να εκπνεύσει τον αέρα δυνατά και παρατεταμένα μέχρις ότου ενεργοποιηθεί (αυτόματα) η αντλία αναρρόφησης του 187

188 εκπνεόμενου αέρα και ανάψει πρώτα η ένδειξη FLW και μετά η ένδειξη ANALYZING. 2. Λήψη δείγματος αναπνοής Το άτομο το οποίο υφίσταται τον έλεγχο, ακολουθεί τα βήματα της προηγούμενης παραγράφου 1στ. Το φύσημα σταματά, όταν ενεργοποιηθεί η αντλία αναρρόφησης του εκπνεόμενου αέρα και ακουστεί (ταυτόχρονα) ένας χαρακτηριστικός διπλός συνεχόμενος ήχος. 3. Καταγραφή αποτελεσμάτων ελέγχου Όταν σβήσει η ένδειξη ANALYZING (και ανάψει η ένδειξη WAIT), εμφανίζεται στην οθόνη το ποσοστό της αλκοόλης, σε mg/l BrA. Εφόσον ο εκτυπωτής είναι συνδεδεμένος με το αλκοολόμετρο, οι μετρήσεις καταγράφονται και εκτυπώνονται σε αυτόν. Μετά από ένα προκαθορισμένο χρονικό διάστημα η οθόνη και το όργανο επανέρχονται στην αρχική κατάσταση (ένδειξη READY). Μετά την αλλαγή επιστομίου είναι δυνατόν να ακολουθήσουν νέες μετρήσεις (έλεγχοι). Τέλος, το όργανο τίθεται εκτός λειτουργίας με πίεση του πλήκτρου Ι-0 (Α). 188