Κλασική εργαστηριακή προσέγγιση πλασματοκυτταρικών δυσκρασιών

Transcript

1 Κλασική εργαστηριακή προσέγγιση πλασματοκυτταρικών δυσκρασιών Μαρία Μπανταδάκη Επιμ. Α Βιοπαθολόγος Εργαστήριο Ανοσολογίας-Ιστοσυμβατότητας Γ.Ν.Θ. "Παπαγεωργίου"

2 Πλασματοκυτταρικές δυσκρασίες/παραπρωτεϊναιμίες Οι πλασματοκυτταρικές δυσκρασίες αφορούν παθολογικές καταστάσεις που προκύπτουν από υπέρμετρη αύξηση των πλασματοκυττάρων του μυελού των οστών και διαταραχή της ισόρροπης σύνθεσης των ελαφρών και βαριών αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών, με αποτέλεσμα αυξημένη έκκριση μονοκλωνικής ανοσοσφαιρίνης, αντίστοιχης της κλωνικής υπερπλασίας.

3 Πλασματοκυτταρικές δυσκρασίες/παραπρωτεϊναιμίες Η μονοκλωνική ανοσοσφαιρίνη που αναπαράγεται συνεχώς είναι ομοιογενής (πλήρες μόριο ή ελαφρές αλύσεις ή τμήματα βαριών) και αναφέρεται ως Μονοκλωνική Πρωτεΐνη (ΜΠ) ή Παραπρωτεΐνη. Η ανίχνευσή της όμως δεν σημαίνει απαραίτητα και κακοήθη νόσο. Ο βαθμός της βλάβης, τα συμπτώματα και τα ευρήματα που εμφανίζονται, χαρακτηρίζουν ένα ευρύ φάσμα νοσημάτων με διαφορετική κλινική βαρύτητα.

4 Διαγνωστικά κριτήρια GMUS, Ασυμπτωματικού και Συμπτωματικού Μυελώματος

5 Κλασική Διαγνωστική Εργαστηριακή προσέγγιση διαγνωστική πλασματοκυτταρικών δυσκρασιών προσέγγιση πλασματοκυτταρικών δυσκρασιών - Ιστορικό - Κλινική εξέταση - Αιματολογικός έλεγχος (αναιμία, ΤΚΕ) - Βιοχημικός έλεγχος (Ca++ ορού/ούρων, ουρία, κρεατινίνη, ολικά λεύκωματα, β2-μικροσφαιρίνη) - Ανοσολογικός έλεγχος πρωτεϊνών ορού-ούρων - Απεικονιστικός έλεγχος οστών - Εξέταση μυελού οστών (μυελόγραμμα, οστεομυελική βιοψία)

6 Κλασική Εργαστηριακή διαγνωστική προσέγγιση πλασματοκυτταρικών δυσκρασιών Αιματολογικός έλεγχος Παρατηρείται αναιμία, ορθόχρωμη ή υπόχρωμη Συγκόλληση ερυθροκυττάρων σε rouleaux (και υπεργαμμασφαιριναιμία) προκαλούν αύξηση της ΤΚΕ Βιοχημικός έλεγχος Αύξηση της ουρίας και της κρεατινίνης (βλάβη νεφρού) Αύξηση ασβεστίου, (εκτεταμένες οι οστεολύσεις χωρίς παράλληλη αύξηση αλκαλικής φωσφατάσης) Αύξηση ολικών λευκωμάτων του ορού Αύξηση της CRP Αύξηση της β2-μικροσφαιρίνης, που αποτελεί κριτήριο διάγνωσης, πρόγνωσης και παρακολούθησης της νόσου

7 Εργαστηριακή διαγνωστική προσέγγιση πλασματοκυτταρικών δυσκρασιών Απεικονιστικός έλεγχος οστών Απλή ακτινoγραφία: Οστεολυτικές βλάβες μονήρεις ή πολλαπλές στα οστά (συχνότερα του κορμού και σπανιότερα στα άκρα). Στο 20 % των ασθενών με ΠΜ η οστική βλάβη εμφανίζεται ως διάχυτη οστεοπόρωση και επειδή αφορά άτομα μεγάλης ηλικίας, υπάρχει διαφοροδιαγνωστικό πρόβλημα. Μαγνητική τομογραφία : Εμφανίζει τις αλλοιώσεις πολύ νωρίτερα από την απλή ακτινογραφία και αυτό έχει ιδιαίτερη σημασία για την απόφαση πρώϊμης θεραπείας.

8 Εργαστηριακή διαγνωστική προσέγγιση πλασματοκυτταρικών δυσκρασιών Εξέταση Μυελού των οστών Kυτταρομορφολογική μελέτη (μυελόγραμμα) με την οποία εκτιμάται αρχικά η κλωνική επέκταση των πλασματοκυττάρων στο μυελό. Ο αριθμός τους ποικίλει από > 5%, που θεωρείται ως διαγνωστικός ουδός, μέχρι την πλήρη διήθηση του μυελού. Ανοσοφαινοτυπικός έλεγχος του μυελού που επιτρέπει τη διάκριση των κλωνικών από τα φυσιολογικά πλασματοκύτταρα και βοηθά στη διαφοροδιάγνωση MGUS και Ασυμτωματικού μυελώματος από το ΠΜ και τη μετεξέλιξή τους. Κυτταρογενετική ανάλυση (καρυότυπος) αποκαλύπτει χρωμοσωματικές ανωμαλίες, χρήσιμες στη διάγνωση, πρόγνωση, παρακολούθηση της νόσου.

9 Κλασική εργαστηριακή ανοσολογική προσέγγιση πλασματοκυτταρικών δυσκρασιών Ανίχνευση και ταυτοποίηση παραπρωτεϊνης (τύπος-ποσοτική εκτίμηση) Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ορού Ανοσοκαθήλωση πρωτεϊνών ορού Ποσοτικός προσδιορισμός Ανοσοσφαιρινών ορού Ηλεκτροφόρηση και Ανοσοκαθήλωση δείγματος ούρων (24h) Πολύ σημαντικές για τη διάγνωση, την παρακολούθηση και την εκτίμηση της σοβαρότητας κινδύνου της ΜΓ από τη συνήθως καλοήθη MGUS στο κακόηθες ΠΜ, την αμυλοείδωση-l κ.α.

10 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ορού Απλή τεχνική διαχωρισμού των πρωτεϊνών του ορού (6 βασικά κλάσματα, low resolution) με ευρεία χρήση στην κλινική πρακτική. Ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών του ορού μέσα σε ηλεκτρικό πεδίο βασίζεται στις ιδιότητες τους: Φορτίο Μοριακό βάρος Μέγεθος και σχήμα του μορίου Ένταση ηλεκτρικού πεδίου ph ρυθμιστικού διαλύματος

11 Hλεκτροφόρηση Πρωτεϊνών Ορού (σε πηκτή αγαρόζης) Αυτοματοποιημένα συστήματα Μετά τον διαχωρισμό, η απεικόνησή τους επιτυγχάνεται με τη χρήση χρωστικής ουσίας που βάφει όλες τις πρωτεΐνες με τον ίδιο τρόπο. Ακολουθεί η σάρωση των ηλεκτροφορητικών ζωνών από ένα πυκνόμετρο, που παρέχει τη δυνατότητα προσδιορισμού της συγκέντρωσης κάθε κλάσματος μέσω της έκφρασης της ποσοστιαίας αναλογίας των κλασμάτων (και της ποσοτικής εκτίμησης όταν είναι γνωστή η ολική πρωτεΐνη του ορού (ΤΡ g/dl).

12 Tριχοειδική Hλεκτροφόρηση (Capillary Electrophoresis) τριχοειδές τετηγμένου πυριτίου Η μετακίνηση των πρωτεϊνών γίνεται με την ηλεκτροοσμωτική ροή (EOF), που είναι η συνολική ροή (+) φορτισμένων ιόντων του ρυθμιστικού διαλύματος προς την κάθοδο (-).

13 Φυσιολογικό Hλεκτροφόρημα Πρωτεϊνών Ορού Alb a1 a2 β1 β2 γ

14 Αξιολόγηση των μεταβολών των ηλεκτροφορητικών πρωτεϊνικών ζωνών Oι μεταβολές των πρωτεϊνών στις διάφορες ζώνες και η σχετική ποσότητά τους, δίνουν σημαντικές πληροφορίες και αποτελούν τον πρωταρχικό στόχο για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, σε σχέση με διάφορα νοσήματα.

15 Μονοκλωνική γαμμαπάθεια Η παρουσία μιας στενής ζώνης στο γράφημα σαν οξυκόρυφο έπαρμα υποδηλώνει την σύνθεση μιας ομοιογενούς ανοσοσφαιρίνης η οποία προέρχεται από τον κακοήθη πολλαπλασιασμό πλασματοκυττάρων που προέρχονται από ένα μόνο πλασματοκυτταρικό κλώνο. (Πολαπλούν Μυέλωμα, Μακροσφαιριναιμία Waldenstrom κ.α.). Οι οροί που παρουσιάζουν αυτή την εικόνα εξετάζονται περαιτέρω με ανοσοκαθήλωση για την τυποποίηση της ανοσοσφαιρίνης που υπερπαράγεται και με ανοσοκαθήλωση ούρων για πρωτεΐνη Bence Jones.

16 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών του ορού Ανίχνευση μονοκλωνικής πρωτεΐνης φυσιολογική Αξιολόγηση σε σύγκριση με φυσιολογικό ηλεκτροφότημα, για παρουσία παραπρωτεΐνης

17 Ποσοτική εκτίμηση μονοκλωνικής παραπρωτεΐνης (από το ηλεκτροφόρημα) φυσιολογική Μετά την ανίχνευση παραπρωτεϊνικής ζώνης, ακολουθεί η ποσοτική εκτίμηση της παραπρωτεΐνης με πυκνόμετρηση (densitometry), μετά από ορισμό του μονοκλωνικού κλάσματος και σάρωση στο πυκνόμετρο με γνωστή την ΤΡ=mg/dl. (πχ. από τον ορισμό του κλάσματος στο διάγραμμα προκύπτει ΜΠ και 1,36 g/dl)

18 Ποσοτική μέτρηση των ανοσοσφαιρινών του ορού Μέτρηση των IgG, IgA, IgM ανοσοσφαιρινών με νεφελομετρία. Δεν καθορίζεται επακριβώς η ποσότητα της παραπρωτεΐνης (πχ. MΠ IgG) γιατί μετρά μαζί και τις φυσιολογικά παραγόμενες ανοσοσφαιρίνες (πχ. IgG). Επιτρέπει την εκτίμηση, για το εάν υπάρχει ανοσοκαταστολή στην παραγωγή ανοσοσφαιρινών άλλων τάξεων, που έχει σχέση με τη βαρύτητα της νόσου. Νεφελομετρία (Η μέτρηση του συνόλου των ελαφρών κ και λ αλυσίδων, πλέον δεν συνιστάται)

19 Διαχείρηση δειγμάτων με διακριτή μονοκλωνική ζώνη ή ασαφείς ζώνες " Διακριτή μονοκλωνική ζώνη στη β περιοχή ". Διακριτή "μονοκλωνική ζώνη στη γ περιοχή". Παράλληλα σημειώνεται "καταστολή των φυσιολογικών γ σφαιρινών ". "Ολιγοκλωνικές ζώνες μόλις διακρινόμενες" σε επικείμενο πολυκλωνικό φόντο. Εμφανίζει "αυξημένη κεντρική πυκνότητα στις γ σφαιρίνες ". Παρατηρείται "ασάφεια για παρουσία πολύ λεπτής ζώνης ".

20 Παραπρωτεΐνη που συν-μεταναστεύει με μια φυσιολογική ζώνη πρωτεΐνης Όταν μια παραπρωτεϊνη συν-μεταναστεύει με μια φυσιολογική ζώνη πρωτεΐνης (π.χ. β-σφαιρίνες), είναι δύσκολο ή αδύνατο να γίνει διάκριση μεταξύ τους και να υπολογησθεί ποσοτικά, γιαυτό συνιστάται: IFE για προσδιορισμό της παραπρωτεϊνης (π.χ. IgA, λ) Παρακολούθηση του συνολικού επίπεδου IgA (κάθε 3-6 μήνες) Εκτίμηση του συνολικού ποσοστού των β-σφαιρινών που μπορεί να δείξει σημαντική αλλαγή στην υποκείμενη ζώνη. Νεότερες μέθοδοι FLC και HLC (ελεύθερες ελαφρές και βαριές αλυσίδες)

21 Ανοσοκαθήλωση Πρωτεϊνών Ορού (Immunofixation electrophoresis, IFE) Τυποποίηση της μονοκλωνικής ζώνης Ανοσοκαθήλωση (πηκτή αγαρόζης) Ανοσοκαθήλωση (παθολογικού δείγματος)

22 Ανοσοκαθήλωση Πρωτεϊνών Ορού Τυποποίηση μονοκλωνικής πρωτεΐνης ολόκληρου μορίου

23 Tριχοειδική Ανοσοκαθήλωση Ορού (Capillary Zone Electrophoresis, CZE) Το δείγμα ηλεκτροφορείται και καταγράφεται το διάγραμμα. Ακολουθεί σε στερεά φάση επώαση του δείγματος με αντιορούς σε μικροσφαιρίδια για βαριές (γ, α, μ) και ελαφρές αλυσίδες (κ, λ). Η μονοκλωνική ανοσοσφαιρίνη συνδέται στα σφαιρίδια του αντίστοιχου αντιορού τα οποία παραμένουν στη στερεά φάση, ενώ το υπερκείμενο ηλεκτροφορείται εκ νέου. Η σύγκριση των δύο διαγραμμάτων πριν και μετά την επώαση παρουσιάζει, ανοσοαφαίρεση στην βαριά και την ελαφρά αλυσίδα της ανοσοφαιρίνης στην οποία ανήκει η μονοκλωνική ζώνη.

24 Αναφορά αποτελέσματος δείγματος (με μονοκλωνική παραπρωτεϊνική ζώνη ολόκληρου μορίου ανοσοσφαιρίνης) SPE: Παρατηρείται παρουσία έντονης μονοκλωνικής παραπρωτεϊνικής ζώνης στις γ- σφαιρίνες που αντιπροσωπεύει το 2,9 g/dl των γ-σφαιρινών. IFE: Η τυποποίηση με ανοσοκαθήλωση έδειξε παραπρωτεΐνη τύπου IgG, κ.

25 Τυποποίηση μονοκλωνικής παραπρωτεΐνης ελαφρών αλύσεων Ο κλασικός τρόπος ανίχνευσης παραπρωτεΐνης στον ορό γίνεται με SPE που δείχνει παρουσία οξυκόρυφου επάρματος και IFE που καθορίζει τον τύπο ολόκληρου του μορίου της μονοκλωνικής ανοσοσφαιρίνης (π.χ. IgG,κ ). Η IFE όμως μπορεί να ανιχνεύσει και μόνο μονοκλωνικές ελαφρές αλυσίδες (π.χ. λάμδα αλυσίδες) στην περίπτωση αυτή ακολουθεί περαιτέρω έλεγχος επιβεβαίωσης. normal

26 Μονοκλωνικές ελεύθερες ελαφρές αλυσίδες Ο έλεγχος αυτός γίνεται με χρήση επιπλέον αντιορών για IgD και IgE καθώς και FLC-κ και FLC-λ Αν δεν ανιχνευθεί παραπρωτεΐνη IgD ή IgE και και ένας εκ των δύο αντιορών FLC-κ ή FLC-λ εμφανίσει μονοκλωνική ζώνη τότε τίθεται η διάγνωση Πολλαπλού Μυελώματος ελεύθερων ελαφρών αλυσίδων

27 Αναφορά αποτελέσματος δείγματος (με μονοκλωνική παραπρωτεϊνική ζώνη ελεύθερων ελαφρών αλύσεων) SPE: Παρατηρείται μικρό οξυκόρυφo έπαρμα στην περιοχή των β-σφαιρινών. Πιθανή παρουσία μονοκλωνική παραπρωτεϊνικής ζώνης. Ακολουθεί ανοσοκαθήλωση. IFE: Παρουσία παραπρωτεΐνης τύπου λ, ελεύθερων ελαφρών αλύσεων. Ο έλεγχος για IgD και αντι- IgE παραπρωτεΐνη ήταν αρνητικός.

28 Πρωτεΐνες Ούρων Το ποσό του λευκώματος που περνά από το αγγειώδες σπείραμα είναι 36 g/24ώρο Επαναρροφάται όλο από τα κύτταρα των εσπειραμένων σωληναρίων και τελικά με τα ούρα απεκκρίνονται 150 mg/24ώρο Το λεύκωμα φυσιολογικών ούρων είναι: - Αλβουμίνη κυρίως<(5 mg / dl) - Σφαιρίνες σε πολύ μικρή ποσότητα, μη σημαντική (α1 και α2), ίχνη για β και γ που σχεδόν δεν ανιχνεύονται

29 Ηλεκτροφόρηση Πρωτεϊνών Ούρων Ηλεκτροφόρηση ούρων 1 φυσιολογικό (αλβουμίνη<mg /dl, ελάχιστες σφαιρίνες) 2a σπειραματική πρωτεϊνουρία Alb Tsf 2b σωληναριακή πρωτεϊνουρία (πολλαπλές ζώνες α1, α2, β) 2c πρωτεϊνουρία από υπερφόρτωση (Bence Jones) Πρωτεΐνη Bence Jones Ούρα 24ώρου, γιατί το ποσό απέκκρισης των πρωτεϊνών κατά τη διάρκεια της ημέρας μεταβάλεται και γιατί αντανακλούν καλύτερα τη νεφρική λειτουργία Υπερπαραγωγή ελεύθερων ελαφρών μονοκλωνικών αλυσίδων, αδυναμία απορρόφησή τους από τα εσπειραμένα σωληνάρια και απέκκριση στα ούρα (Bence Jones πρωτεΐνη).

30 Ηλεκτροφόρηση Πρωτεϊνών Ούρων Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών Ούρων Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών Ούρων Φυσιολογικά, ανιχνεύεται κυρίως λευκωματίνη, α1 και α2 σε πολύ μικρές ποσότητες, ενώ β και γ μπορεί να υπάρχουν ίχνη ή να είναι απούσες

31 Ανοσοκαθήλωση Ούρων-Πρωτεΐνη Bence Jones Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών Ούρων Ανιχνεύεται μονοκλωνικό κλάσμα τύπου λ ελεύθερων ελαφρών αλυσίδων (Bence Jones πρωτεΐνη λ ελεύθερων ελαφρών αλυσίδων)

32 1 (1,6 mg/dl )

33 1

34 2

35 3

36 Περιορισμοί ηλεκτροφορητικών δοκιμασιών Ορού " Διακριτή μονοκλωνική ζώνη στη γ περιοχή ". Αύξηση των α2-σφαιρινών ή παρουσία μονοκλωνικής ζώνης Αύξηση των β2-σφαιρινών ή παρουσία μονοκλωνικής ζώνης "Ασάφεια" για παρουσία πολύ λεπτής ζώνης? "Ολιγοκλωνικές ζώνες μόλις διακρινόμενες "? Ασαφείς ζώνες (<1,0 g/l): "γι αυτές πιθανά η λύση να μη δοθεί ούτε με την IFE" "Αυξημένη κεντρική πυκνότητα στις γ σφαιρίνες ".?

37 Περιορισμοί ηλεκτροφορητικών δοκιμασιών Ούρων Δείγματα από 24ωρη συλλογή Συμπύκνωση (5-30 mg/l, 5-59 mg/l) Εκτέλεση χρονοβόρα Όχι ποσοτική μέτρηση Υποκειμενική εκτίμηση Αποτέλεσμα όχι πάντα ακριβές - Ψευδή μονοκλωνικότητα λόγω συμπύκνωσης - Ασάφεια σε βαριά πρωτεϊνουρία με πολυκλωνικές FLCs (έντονο φόντο-backraound). - Άμεση σχέση με νεφρική λειτουργία (παραγωγή Μ-FLCs χαμηλή, νεφρικά σωληνάρια μεταβολίσουν 30 g/day, ελάχιστη απέκκριση, ανακριβές αποτέλεσμα).

38 Ηλεκτροφόρηση Πρωτεϊνών Ούρων (UPE) Ανίχνευση Μ-πρωτεΐνης ελαφρών αλυσίδων στα ούρα (όχι στον ορό) Στα εργαστήρια που δεν υπάρχει δυνατότητα ποσοτικής μέτρησης των FLCs, θα πρέπει μαζί με τη SPE να πραγματοποιείται και η UPE, παρά τις πρακτικές δυσκολίες της, γιατί είναι ποιο ευαίσθητη από τη SPE ορού για χαμηλά επίπεδα μονοκλωνικών ελεύθερων αλυσίδων (10-20 mg/l), και βελτιώνει τη διαγνωστική προσέγγιση του ΠΜ.

39 Ηλεκτροφόρηση Πρωτεϊνών Ούρων (UPE) Ανίχνευση Μ-πρωτεΐνης ελαφρών αλυσίδων στα ούρα (όχι στον ορό) Όμως η UPE, παρά τις πρακτικές δυσκολίες της θα πρέπει να πραγματοποιείται μαζί με τη SPE, γιατί είναι ποιο ευαίσθητη από αυτήν για χαμηλά επίπεδα μονοκλωνικών ελεύθερων αλυσίδων (10-20 mg/l), και βελτιώνει τη διαγνωστική προσέγγιση του ΠΜ. Ιδιαίτερα όταν δεν υπάρχει δυνατότητα εφαρμογής στο εργαστήριο της ποσοτικής μέτρησης ελεύθερων ελαφρών αλύσεων (FLCs).

40

41 Συμπέρασμα Η τεχνική της ηλεκτροφόρησης (SPE) μόνη της αλλά κυρίως σε συνδυασμό με την ανοσοκαθήλωση (IFE) εξακολουθεί να αποτελεί την κλασική δοκιμασία πρώτης γραμμής στην κλινική πρακτική, για τη διάγνωση πλασματοκυτταρικών δυσκρασιών, γιατί είναι απλή με χαμηλό κόστος και τα αποτελέσματά της όταν αξιολογηθούν σωστά είναι αξιόπιστα. Στις περιπτώσεις όπου αυτό δεν είναι εφικτό η χρήση της SPE, συνδυάζεται με την εφαρμογή νεότερων τεχνικών που έχουν τη δυνατότητα ακριβέστερης και πρώιμης διάγνωσης των πλασματοκυτταρικών δυσκρασιών.