Εργαστηριακή άσκηση 4: Ανοσοδιάχυση. Εργαστήριο Ανοσολογίας Εαρινό εξάμηνο 2019 Υπεύθυνες Διδάσκουσες: Βογιατζάκη Χρυσάνθη, Τσουμάνη Μαρία

Transcript

1 Εργαστηριακή άσκηση 4: Ανοσοδιάχυση Εργαστήριο Ανοσολογίας Εαρινό εξάμηνο 2019 Υπεύθυνες Διδάσκουσες: Βογιατζάκη Χρυσάνθη, Τσουμάνη Μαρία

2 Αντιδράσεις κατακρήμνισης σε υγρό διάλυμα Καμπύλη Heidelberger-Kendall: Γραφική αναπαράσταση της αντίδρασης κατακρήμνισης συμπλέγματος Ag-Ab Υπάρχει πάντα η ιδανική αναλογία στις συγκεντρώσεις αντισώματος/αντιγόνου όπου σχηματίζονται μεγάλα συσσωματώματα που εύκολα δίνουν ίζημα. Για μια δεδομένη συγκέντρωση αντισώματος σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις αντιγόνου όταν η αντίδραση αυτή πραγματοποιείται σε διάλυμα έχουμε την καμπύλη Heidelberger-Kendall. Ετσι στη ζώνη ισοδυναμίας και στη γειτνίαση αυτής θα έχουμε τα πιο έντονα ιζήματα. Πριν τη ζώνη ισοδυναμίας, την ζώνη όπου το αντίσωμα είναι σε πλεόνασμα θα έχουμε την παρουσία μικρού έως ελάχιστου ιζήματος όπως και στη ζώνη όπου πλεονάζει το αντιγόνο. Και στις δύο αυτές περιπτώσεις υπάρχουν στο υπερκείμενο διαλυτά σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος τα οποία δεν δίνουν ίζημα εκτός της ζώνης ισοδυναμίας.

3 Αντιδράσεις κατακρήμνισης σε πήκτωμα Κατά τις ιζηματινοαντιδράσεις σε πηκτή (γέλη-gel) όπως άγαρ, αγαρόζη, το αντιγόνο και το αντίσωμα τοποθετούνται μέσα σε ημίρευστο υλικό και καθώς το ένα διαχέεται προς το άλλο, στο σημείο όπου θα συναντηθούν σε άριστη αναλογία, σχηματίζεται θολερή γραμμή (γραμμή καθίζησης) που οφείλεται στο σχηματισμό αδιάλυτων συμπλεγμάτων αντιγόνουαντισώματος.

4

5 Ανοσοδιάχυση Ορισμός: Mέθοδος προσδιορισμού της συγκέντρωσης ενός αντιγόνου καθώς επίσης και της εύρεσης της χημικής συγγένειας του αντιγόνου με κάποιο αντίσωμα. Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στο γεγονός ότι, όταν ένα αντίσωμα συνδεθεί με το αντίστοιχό του αντιγόνο, σχηματίζεται ίζημα η ποσότητα του οποίου εξαρτάται από το μέγεθος των συμπλόκων που δημιουργούνται και από τις σχετικές συγκεντρώσεις αντισώματος/αντιγόνου. Ανοσοδιάχυση Μονή ακτινωτή ανοσοδιάχυση (Radial Immunodiffusion;RID) Μέθοδος Mancini-Ποσοτική μέθοδος Διπλή ανοσοδιάχυση (Double Immunidiffusion;DID) Μέθοδος Ouchterlony-Ποιοτική ή ημιποσοτική μέθοδος Πλεονεκτήματα: Χαμηλό κόστος, δεν απαιτούν ειδικό εξοπλισμό Μειονεκτήματα: Έχει μικρή ευαισθησία συγκρινόμενη με άλλες μεθόδους. Χρονοβόρα διαδικασία (μεγάλος χρόνος επώασης)

6 Μονή ακτινωτή ανοσοδιάχυση (RID) Μέθοδος Mancini H ακτινωτή ή κυκλοτερής ανοσοδιάχυση (Radial ImmunoDiffution - RID) είναι μία ποσοτική μέθοδος προσδιορισμού της συγκέντρωσης διαφόρων αντιγόνων. Πρόκειται για μία τεχνική διάχυσης, κατά την οποία ένα διάλυμα που περιέχει το αντιγόνο τοποθετείται σε wells ή σε επιφάνεια πηκτής ή άγαρ που εμποτίζεται ομοιόμορφα με αντίσωμα. Η διάμετρος του δακτυλίου που καθιζάνει γύρω από το well ως αποτέλεσμα της αντίδρασης αντιγόνου-αντισώματος αντιστοιχεί στην ποσότητα αντιγόνου στο διάλυμα Το δείγμα μπορεί να είναι ορός, ΕΝΥ, ούρα ή οποιοδήποτε άλλο υγρό του σώματος

7 Square of the ring diameter Αξιολόγηση αποτελεσμάτων Για το τελικό σημείο της διάχυσης ισχύει ότι η συγκέντρωση του αντιγόνου είναι ανάλογη προς το εμβαδόν του κύκλου του ιζήματος. To εμβαδόν του ιζήματος ισούνται με E = πρ 2 όπου ρ η ακτίνα του δακτυλίου σε mm. Η μέτρηση της διαμέτρου μπορεί να γίνει με ειδικό χάρακα. Με την βοήθεια μιας έτοιμης καμπύλης ή με καμπύλη που ετοιμάζει ο ίδιος ο εργαστηριακός γίνεται ο ποσοτικός προσδιορισμός του αντιγόνου. Mεταξύ της διαμέτρου του δακτυλίου καθίζησης και της συγκέντρωσης του αντιγόνου υπάρχει γραμμική σχέση (μέθοδος τελικού σημείου). F, G: άγνωστα δείγματα Antigen concentration

8 Μέτρηση της διαμέτρου του κύκλου του ιζήματος Η μέτρηση των διαμέτρων των δίσκων καθίζησης μπορεί να γίνει είτε με ειδικούς χάρακες είτε με ειδικές αυτόματες συσκευές

9 Εφαρμογή της τεχνικής της ακτινωτής ανοσοδιάχυσης στο Εργαστήριο Ανοσολογίας Θέση Συγκέντρωση 1. Πρότυπο 2,25 mg/l 2. Πρότυπο 13,5 mg/l 3. Πρότυπο 22,5 mg/l 7. Ορός 1? 9. Ορός 2? 10. Ορός 2 με αραίωση 1/2? Εργ. Ανοσολογίας Τμημα ΒΙΕ 2018

10 Διπλή ανοσοδιάχυση-μέθοδος Ouchterlony Η διπλή ανοσοδιάχυση (Double Immunodiffusion) είναι μία ποιοτική μέθοδος που ελέγχει την ειδικότητα ενός Αg ή ενός Ab. Σύμφωνα με την μέθοδο αυτή διαλύματα Αg και Ab τοποθετούνται σε αντικριστά wells, σε οριζόντιο άγαρ με πάχος 1,5 mm. Η διάχυση γίνεται ακτινωτά και η καθίζηση αναπτύσσεται μεταξύ των αντικριστών wells. Eπειδή το ίζημα που σχηματίζεται είναι διαλυτό σε περίσσεια αντιγόνου, η γραμμή ιζήματος («ζώνη ιζηματίνης») παρατηρείται μόνο στη ζώνη ισοδυναμίας και η σχετική της θέση εξαρτάται από την συγκέντρωση των αντιδρώντων στο agar. Η τοπική συγκέντρωση των Ag και Αb κατά την διάχυση τους μέσα στην αγαρόζη εξαρτάται όχι μόνο από την απόλυτη συγκέντρωση τους στο well, αλλά επίσης από το μοριακό τους βάρος και από το ρυθμό με τον οποίο μπορεί να διαχέονται μέσα στην αγαρόζη. Η απόσταση μεταξύ Ag-Ab είναι καθοριστικός παράγοντας για τον χρόνο που απαιτείται για να γίνει η καθίζηση. Η απόσταση δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 6mm. Αν τα wells έχουν όλα το ίδιο μέγεθος η απόσταση δεν πρέπει να είναι μεγαλύτερη του διπλάσιου της διαμέτρου αυτών. Διπλή ανοσοδιάχυση Ι: χρησιμοποιούμε ένα αντιγόνο- ένα αντίσωμα Διπλή ανοσοδιάχυση ΙΙ: χρησιμοποιούμε δύο διαφορετικά αντιγόνα για κάθε ένα αντίσωμα

11 Διπλή ανοσοδιάχυση Ι Στην διπλή ανοσοδιάχυση Ι σχηματίζουμε πάνω στο άγαρ δύο πηγαδάκια ένα για το αντιγόνο και ένα για το αντίσωμα. Τα Ag και Αb διαχέονται στο γύρω τους χώρο. Αν υπάρχει χημική συγγένεια μεταξύ Ag και Ab θα σχηματισθεί κάπου ανάμεσα τους μία ζώνη ιζηματίνης. Αυτή μπορεί να είναι απλή, διπλή ή πολλαπλή ανάλογα με το αν το αντιγόνο ή το αντίσωμα αποτελείται από περισσότερα από ένα μόρια. Με την διπλή ανοσοδιάχυση Ι μελετάμε την ύπαρξη χημικής συγγένειας μεταξύ ενός αντιγόνου και ενός αντισώματος.

12 Διπλή ανοσοδιάχυση ΙΙ Στη διπλή ανοσοδιάχυση ΙΙ συγκρίνουμε την χημική συγγένεια μεταξύ δύο διαφορετικών αντιγόνων ως προς το ίδιο αντίσωμα. Στη διπλή ανοσοδιάχυση ΙΙ σχηματίζουμε πάνω στο agar τρία wells ένα για το αντίσωμα και δύο για τα δύο διαφορετικά αντιγόνα. Αντίδραση ταυτότητας α. Η γραμμή ιζήματος είναι συνεχής. Συμπέρασμα: τα δύο αντιγόνα έχουν κοινούς επιτόπους που αναγνωρίζονται εξίσου από το αντίσωμα Αντίδραση μη ταυτότητας β. Oι γραμμές ιζηματίνης διασταυρώνονται. χωρίς να έχουν καμία αλληλεπίδραση. Συμπέρασμα: τα δύο αντιγόνα έχουν διαφορετικούς επιτόπους. Αντίδραση μερικής ταυτότητας γ. Το ένα από τα δύο αντιγόνα σχηματίζει μία γραμμή ιζήματος που προεξέχει χαρακτηριστικά. Συμπέρασμα: το αντιγόνο που «βλέπει» προς την προεξοχή έχει κάποιους επιπλέον επιτόπους που αναγνωρίζονται από το αντίσωμα Αντίδραση ταυτότητας α Αντίδραση μη ταυτότητας β Αντίδραση μερικής ταυτότητας γ Τα αντιγόνα 1 αναγνωρίζονται από το ίδιο αντίσωμα και κατά συνέπεια έχουν κοινούς αντιγονικούς καθοριστές Τα αντιγόνα 1 και 2 αναγνωρίζονται από 2 διαφορετικά αντισώματα & δεν παρουσιάζουν κοινούς αντιγονικούς καθοριστές Τα αντιγόνα 1 και 2 αναγνωρίζονται από το ίδιο αντίσωμα παρουσιάζοντας κοινούς αλλά και μη κοινούς αντιγονικούς καθοριστές.το αντίσωμα 1 αναγνωρίζει περισσότερους αντιγονικούς καθοριστές στο αντιγόνο 1 από ότι στο αντιγόνο 2

13 Εφαρμογή της διπλής ανοσοδιάχυσης ΙΙ στο εργαστήριο Αg1 Αg2 Αg6 Ab Αg3 Αg5 Αg4 Εργ. Ανοσολογίας Τμημα ΒΙΕ 2018 Αν στο κέντρο ενός τρυβλίου τοποθετήσουμε το αντίσωμα και περιφερειακά 6 αντιγόνα είναι δυνατόν να μελετήσουμε την αντιγονική συσχέτιση μεταξύ των αντιγόνων αυτών.

14 Διεξαγωγή της εργαστηριακής άσκησης Μέτρηση ΙgG με τη μέθοδο της ακτινωτής ανοσοδιάχυσης IgG ανοσοσφαιρίνες αποτελούν το 75% των συνολικών ανοσοσφαιρινών του ορού Μοριακό βάρος:150 kda 2 γ βαριές αλυσίδες και 2 ελαφριές αλυσίδες Υψηλά επίπεδα IgG συσχετίζονται με χρόνια ηπατική βλάβη και μυέλωμα ΙgG Μέση συγκέντρωση (g/l) Εύρος τιμών (g/l) Άνδρες Γυναίκες

15 Αντιδραστήρια RID plates: περιέχουν ειδικά αντισώματα για το IgG σε gel αγαρόζης Calibrators: 3 vials διαφορετικής συγκέντρωσης IgG 7% BSA: χρησιμοποιείται ως αραιωτικό μέσο Control ορός Πιπέτες μεταβλητού όγκου

16 Πειραματική πορεία 1. Αφήνουμε τα RID plates σε θερμοκρασία δωματίου για min. Δεν εκκινούμε την πειραματική διαδικασία αν υπάρχει υγρασία. 2. Αφού γίνει καλή ανάμιξη, τοποθετούμε 5 μl από τα calibrators και τo control μέσα σε πηγαδάκια προσεκτικά για να αποφύγουμε τυχόν υπερχείλιση. 3. Αναμιγνύουμε καλά τον ορό σε vortex για να εξασφαλιστεί η ομοιόμορφη κατανομή της μετρούμενης ουσίας σε όλο τον όγκο του. 4. Αναρροφούμε με την πιπέττα 5 μl ορού και τα τοποθετούμε μέσα στο πηγαδάκι προσεκτικά για να αποφύγουμε τυχόν υπερχείλιση. 5. Ακολουθεί επώαση από 18 έως 48 ώρες. Κατά την διάρκεια της επώασης οι δίσκοι φυλάσσονται σε σκοτεινό θάλαμο σε χώρο του εργαστηρίου όπου εξασφαλίζεται σταθερή θερμοκρασία (γύρω στους 25 ο C) και αποφεύγεται να στεγνώσει το plate. 6. Mετά το τέλος της επώασης μετράμε την διάμετρο κάθε δακτυλίου της ανοσοδιάχυσης που σχηματίστηκε με την βοήθεια χάρακα. 7. Με τη βοήθεια των calibrators, κατασκευάζουμε καμπύλη της διαμέτρου του δακτυλίου στο τετράγωνο (άξονας ψ) και της συγκέντρωσης του αντιγόνου (άξονας χ). 8. Υπολογίζουμε τη συγκέντρωση του υπο εξέταση ορού