ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ-ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΔΗΜΟΚΡΑΤΙΑ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ-ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ- ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ-ΕΜΒΡΥΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Ι. ΒΑΡΑΚΗΣ Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα Σπουδών στις Βασικές Ιατρικές Επιστήμες ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Μελέτη της έκφρασης των υποδοχέων των νευροτροφινών σε αδενώματα υπόφυσης στον άνθρωπο ΧΟΝΔΡΟΓΙΑΝΝΗ ΧΡΙΣΤΙΝΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΟΣ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ Τριμελής Επιτροπή: Μάρθα Ασημακοπούλου Ελένη Παπαδάκη Βασιλική Ζολώτα ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΔΗΜΟΚΡΑΤΙΑ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Πάτρα, Οκτώβριος 2006

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Συντμήσεις 5 Περίληψη..6 Εισαγωγή...8 Υπόφυση Αδενώματα υπόφυσης 16 Οι νευροτροφίνες 21 Ιστορικά στοιχεία των νευροτροφινών (ΝΤs)...21 Ορισμός και δομή των νευροτροφινών 22 Οι υποδοχείς των νευροτροφινών...23 Σύνθεση και Έκκριση των νευροτροφινών...24 Υποδοχείς TrkA,B,C...26 Υποδοχέας p Σηματοδοτικά μονοπάτια των νευροτροφινών-ενεργοποίηση των υποδοχέων Trks.29 Έκφραση και εντόπιση των νευροτροφινών στην υπόφυση και σε αδενώματα υπόφυσης 32 Σκοπός.34 Υλικά-Πειραματική μέθοδος 35 Αποτελέσματα...39 Φωτογραφίες μικροσκοπίου...42 Συζήτηση...50 Βιβλιογραφία

3 ΛΙΓΑ ΛΟΓΙΑ ΠΡΙΝ ΤΗΝ ΕΡΓΑΣΙΑ Έχουμε συνηθίσει να βλέπουμε τις ευχαριστίες στο τέλος της κάθε εργασίας. Προσωπική μου άποψη είναι πως θα πρέπει να αναφέρεσαι στην αρχή στα άτομα που θέλεις να ευχαριστήσεις, γιατί με την εμπιστοσύνη τους, την προσφορά τους, την βοήθεια τους και την υποστήριξη τους σε κάνουν κάθε φορά να πετυχαίνεις τους στόχους σου, να εκπληρώνεις τις φιλοδοξίες σου, να αγγίζεις ή ακόμα και να πραγματοποιείς τα όνειρα σου. Πολλά είναι τα άτομα που θέλω να ευχαριστήσω, ξεκινώντας από την επιτροπή η οποία με επέλεξε και εισήχθηκα στο μεταπτυχιακό πρόγραμμα. Στη επιτροπή αυτή ήταν και ο κ. Ι. Βαράκης, κοσμήτορας του Ιατρικού Τμήματος. Ο κ. Ι. Βαράκης στήριξε από την αρχή την απόφασή μου να επιλέξω και να ακολουθήσω την κατεύθυνση της Μοριακής Ανατομικής, στην οποία είναι και επικεφαλής αλλά επίσης με ενθάρρυνε να ασχοληθώ με το θέμα που είχα επιλέξει και είναι μεγάλη μου τιμή. Στο πρώτο εξάμηνο των σπουδών μου γνώρισα την κ. Μ. Ασημακοπούλου η οποία μόνο από μια απορία μου κατά την διάρκεια ενός μαθήματος, ενδιαφέρθηκε για εμένα και συγκέντρωσε πληροφορίες για το θέμα που με κέντριζε και επιθυμούσα να ασχοληθώ πειραματικά, δηλαδή το θέμα της διπλωματικής μου εργασίας. Ήταν απόλυτα σύμφωνη στο να μελετήσω τα αδενώματα υπόφυσης και κατά την διάρκεια της συνεργασίας ήταν απολύτως φιλική, διαθέτοντας μεγάλη κατάρτιση και έχοντας μεγάλη μεταδοτικότητα των γνώσεων της. Καταλυτικές παρουσίες ήταν οι Αναπληρώτριες Καθηγήτριες στο Εργαστήριο Ανατομικής, η κ. Γ. Σωτηροπούλου Μπονίκου και η κ. Ε. Παπαδάκη, οι οποίες οποτεδήποτε χρειαζόμουν διευκρίνιση ή πληροφόρηση για κάποιο θέμα που προέκυπτε, ήταν πρόθυμες να συμβάλλουν στην επίλυσή του με την εμπειρία τους και τις γνώσεις τους. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την κ. Β. Ζολώτα, Επίκουρη Καθηγήτρια του Παθολογικού Εργαστηρίου του Π.Γ.Ν. Πατρών, η οποία κατόπιν συνεννοήσεως με την κ. Ασημακοπούλου μου επέτρεψε να συλλέξω το υλικό μου από βιοψίες που έγιναν στο νοσοκομείο καθώς επίσης με προμήθευσε με τα κατάλληλα αντισώματα που χρειάστηκα για να κάνω την ταυτοποίηση των περιστατικών μου. Επίσης, οφείλω να ευχαριστήσω τον κ. Γεώργιο Γκατζούνη, Επίκουρο Καθηγητή της Νευροχειρουργικής Κλινικής του Π.Γ.Ν. Πατρών, ο οποίος μας έδωσε τις κλινικές πληροφορίες των ασθενών

4 Επίσης, θέλω να ευχαριστήσω ιδιαίτερα την Ι. Καραγεώργου και τον Ε. Κανέτση με τους οποίους μοιραζόμουν τον εργαστηριακό χώρο γιατί στα πρόσωπά τους βρήκα όχι μόνο δύο καλούς συνεργάτες αλλά κυρίως δύο πολύτιμους φίλους, καθώς και την συμφοιτήτρια μου Δ. Ζιαβρά για την πολύτιμη βοήθειά της στην εύρεση φωτογραφικού υλικού και την άψογη συνεργασία που είχαμε όποτε αναλαμβάναμε κοινή εργασία. Τέλος, θέλω να ευχαριστήσω τους γονείς μου που χωρίς την δική τους βοήθεια, οικονομική και ψυχολογική, όχι μόνο δεν θα κατάφερνα να ολοκληρώσω ποτέ το Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα αλλά δεν θα σκεφτόμουν καν να το ξεκινήσω. Τους αφιερώνω ότι έχω κάνει γιατί το καταφέραμε μαζί

5 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ NTs Neurotrophins NGF Nerve Growth Factor BDNF Brain-Derived Neurotrophin Factor Trk Tropomyosine-related kinase p75 pan-neurotrophin receptor CD31 platelet endothelial cell adhesion molecule VEGFR3 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 3 Κ.Ν.Σ. Κεντρικό Νευρικό Σύστημα C.N.S Central Neurous System Π.Ν.Σ. Περιφερικό Νευρικό Σύστημα P.N.S Peripheral Nervous System N.F.P.A Non Functional Pituitary Adenomas F.P.A. Functional Pituitary Adenomas PRL Prolactin GH Growth Hormone ACTH Adrenocorticotropic Hormone TSH Thyroid Stimulating Hormone TNFs Tumor Necrosis Factors LRM Leucine Rich Motif CRD Cystein Rich Domain ERK Extracellular Regulated Kinase PI3K Phosphatidylinositol-3-OH kinase PLc-γ1 Phospholipase C MCV Microvessel Count TGFa Tumor Growth Factor a BFGF Basic Fibroblastic Growth Factor AFGF Acidic Fibroblast Growth Factor EGF Epidermal Growth Factor LYVE-1 Lympatic Vessel Endothelial HA receptor-1 Prox-1 Homeobox Transcription Factor - 5 -

6 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Οι νευροτροφίνες (ΝΤs), Nerve Growth Factor (NGF), Brain-Derived Neurotrophin Factor (BDNF), NΤ-3, ΝΤ-4, ΝΤ-5 και ΝΤ-6 ανήκουν σε μια οικογένεια πολυπεπτιδικών αυξητικών παραγόντων οι οποίοι απαιτούνται για την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος στα σπονδυλωτά. Εμπλέκονται στην επιβίωση, στη διαφοροποίηση, στην ωρίμανση των νευρώνων, στη συναπτική πλαστικότητα, στη μάθηση, στη μνήμη, καθώς επίσης και στην έκφραση και ενεργότητα σημαντικών πρωτεϊνών, όπως ιοντικών καναλιών και νευροδιαβιβαστικών υποδοχέων. Οι λειτουργίες αυτές επιτελούνται μέσω της δέσμευσής τους σε δύο είδη μεμβρανικών υποδοχέων, της οικογένειας κινάσης-τυροσίνης TrkA, TrkB και TrkC (tropomyosinerelated kinase) και του pan-neurotrophin (με ικανότητα δέσμευσης με όλες τις νευροτροφίνες) υποδοχέα p75 NTR που είναι μέλος των υποδοχέων Tumor Necrosis Factors (TNFs). Οι νευροτροφίνες εκφράζονται σε κύτταρα του Κ.Ν.Σ. και Π.Ν.Σ. αλλά και σε ιστούς-όργανα εκτός νευρικού συστήματος, όπως είναι η υπόφυση. Σκοπός της εργασίας ήταν να μελετήσουμε την έκφραση των υποδοχέων των νευροτροφινών με σύγχρονες μεθόδους ανοσοϊστοχημείας σε αδενώματα της υπόφυσης και να συσχετίσουμε την έκφρασή τους με τα κλινοκοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών. Όλα τα αδενώματα της μελέτης που συμπεριλήφθησαν στη μελέτη (10ανδρών και 8 γυναικών) εμφάνισαν ανοσοϊστοχημική χρώση για τον υποδοχέα TrkA και συγκεκριμένα έντονη χρώση (+3) τα 9/18 (50%) των περιστατικών, μέτρια χρώση (+2) τα 8/18 (45%) των περιστατικών και ασθενή χρώση (+1) 1/18 (5%) των περιστατικών. Ο υποδοχέας TrkB εμφάνισε θετικότητα στο 83% (15/18) των περιπτώσεων. Τα 6/15 (40%) περιστατικά παρουσίασαν έντονη χρώση (+3), τα 4/15 (27%) περιστατικά μέτρια χρώση (+2) και τα 5/15 (33%) περιστατικά ασθενή χρώση (+1). Ανοσοϊστοχημική χρώση για τον υποδοχέα TrkB παρατηρήθηκε επίσης στα αγγεία 4/15 (27%) των αδενωμάτων. Τα 11/18 (61%) των αδενωμάτων παρουσίασαν ανοσοθετικότητα για τον TrkC και συγκεκριμένα τα 3/11 (27%) περιστατικά εμφάνισαν μέτρια χρώση (+2) και 8/11 (73%) περιστατικά ασθενή (+1). Χρώση για τον υποδοχέα TrkC εντοπίστηκε σε αγγεία σε 4/11 περιστατικά (36%). Τέλος έκφραση για τον p75 υποδοχέα δεν παρατηρήθηκε σε κανένα αδένωμα. Με δεδομένο ότι οι υποδοχείς TrkB και TrkC εκφράζονται στα αγγεία των αδενωμάτων, μελετήθηκε η έκφραση των υποδοχέων των νευροτροφινών σε σχέση με την αγγειογένεση, ένας μηχανισμός που αφορά άμεσα την πρόγνωση και - 6 -

7 την ανταπόκριση στην αντίστοιχη θεραπεία των όγκων. Μελετήθηκε η έκφραση του CD31(platelet endothelial cell adhesion molecule) και του VEGFR3 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 3). Ο παράγοντας VEGFR3 συμβάλλει επίσης και στην ανάπτυξη λεμφαγγείων στο στρώμα του όγκου επάγοντας την ανάπτυξή του. Η εκτίμηση της ανοσοεντόπισης για τον CD31 και τον VEGFR3 για κάθε νεόπλασμα έγινε κατόπιν επιλογής τριών αγγειοβριθέστερων περιοχών, την καταμέτρηση των αγγείων σε κάθε περιοχή και τον υπολογισμό του μέσου όρου (MCV Microvessel Count). Για τον παράγοντα VEGFR3 το 89% των περιστατικών ήταν θετικά εμφανίζοντας ένα εύρος MCV της τάξης των 2 έως 32,67, ενώ για τον παράγοντα CD31 το 100% των αδενωμάτων ήταν θετικά με MCV της τάξης των 4,67 έως 53,67. Δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση του MCV με την έκφραση των υποδοχέων των νευροτροφινών. Οι υποδοχείς των νευροτροφινών ενώ εκφράζονται στη φυσιολογική υπόφυση συμμετέχοντας στην ανάπτυξη και στην επιβίωση των κυττάρων, δεν «σιωπούν» στα αδενώματά της. Το ερώτημα που γεννάται είναι αν δρουν ως παράγοντες διατήρησης της καλοήθειας ή αν συμβάλλουν στην ογκογένεση και στην μετέπειτα εξέλιξη των νεοπλασμάτων της υπόφυσης. Περαιτέρω μελέτες απαιτούνται για την διερεύνηση του ρόλου των νευροτροφινών μέσω των υποδοχέων τους στα αδενώματα υπόφυσης, στον άνθρωπο

8 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΥΠΟΦΥΣΗ Η υπόφυση έχει βάρος περίπου 0,5 gr με φυσιολογικές διαστάσεις στον άνθρωπο περίπου 10x13x6 mm (Εικόνα 1). Εντοπίζεται μέσα σε κοιλότητα του σφηνοειδούς οστού, το τουρκικό εφίππιο, το οποίο είναι ένα σημαντικό ακτινολογικό οδηγό σημείο. (1) Εικόνα 1 : Φωτογραφίες φυσιολογικής υπόφυσης μετά από νεκροψία (14) Κατά την εμβρυογένεση, η υπόφυση αναπτύσσεται από το στοματικό εξώδερμα και από νευρικό ιστό. Το στοματικό στοιχείο προέρχεται από ένα θύλακο του εξωδέρματος της οροφής του αρχέγονου στόματος του εμβρύου, αναπτύσσεται κεφαλικά σχηματίζοντας μια δομή που ονομάζεται θύλακος του Rathke. Στη συνέχεια με μια σύσφιγξη στη βάση αυτού του θυλάκου τον χωρίζει από την στοματική κοιλότητα. Ταυτόχρονα, το πρόσθιο τοίχωμά του παχαίνει, περιορίζοντας τον αυλό του θυλάκου του Rathke σε μια μικρή σχισμή. Το νευρικό στοιχείο προέρχεται από μια προς τα κάτω προβολή του εδάφους του διεγκεφάλου και αναπτύσσεται ουραία ως ένας μίσχος χωρίς να αποκολλάται από τον εγκέφαλο (Εικόνα 2)

9 Εικόνα 2 : Ανάπτυξη της αδενοϋπόφυσης και της νευροϋπόφυσης από το εξώδερμα της οροφής της αρχέγονης στοματικής κοιλότητας και του εδάφους του διεγκεφάλου (1). Λόγω της διπλής εμβρυολογικής της προέλευσης, η υπόφυση αποτελείται στην πραγματικότητα από δύο αδένες, την νευροϋπόφυση και την αδενοϋπόφυση. Οι δύο αδένες είναι ενωμένοι ανατομικά αλλά έχουν διαφορετικές λειτουργίες. Η νευροϋπόφυση που αναπτύσσεται από νευρικό ιστό, αποτελείται από μια μεγαλύτερη μοίρα, τη νευρική μοίρα (pars nevrosa) και μια μικρότερη, τη χοάνη (ingundibulum) ή νευρικό μίσχο. Ο νευρικός μίσχος αποτελείται από το στέλεχος και τη μέση εξοχή. Η αδενοϋπόφυση που προέρχεται από το εξώδερμα του αρχέγονου στόματος υποδιαιρείται σε τρεις μοίρες, την περιφερική μοίρα (pars distalis) ή πρόσθιο λοβό, την χοανική μοίρα (pars tuberalis) ή χοανοειδή δακτύλιο, που είναι μια κρανιακή μοίρα και περιβάλλει το νευρικό μίσχο και τη διάμεση μοίρα (pars intermedia) (Εικόνα 3)

10 Εικόνα 3 : Τομή υπόφυσης με τρίχρωμη χρώση Mallory που φαίνεται η νευρική, η διάμεση και η περιφερική μοίρα. Τα ερυθροκύτταρα έχουν χρωματισθεί κίτρινα και δείχνουν την κατανομή των αγγείων (1). Η αιμάτωση της υπόφυσης εξασφαλίζεται από 2 ομάδες αιμοφόρων αγγείων που προέρχονται από την έσω καρωτίδα. Συγκεκριμένα εκ των άνω, η δεξιά και αριστερά άνω υποφυσιακές αρτηρίες χορηγούν αίμα στην μέση εξοχή (median eminence) και το νευρικό μίσχο. Εκ των κάτω, η δεξιά και αριστερά κάτω υποφυσιακές αρτηρίες παρέχουν αίμα κυρίως στη νευροϋπόφυση και σε μικρό βαθμό στο μίσχο. Η υπόφυση συνδέεται με τον υποθάλαμο στη βάση του εγκεφάλου, με τον οποίο έχει μεγάλης σημασία ανατομικές και λειτουργικές σχέσεις (Εικόνα 4). Σε αυτό το υποθαλαμοϋποφυσιακό σύστημα υπάρχουν 3 γνωστές θέσεις παραγωγής ορμονών από τις οποίες εκλύονται 3 ομάδες ορμονών: 1. Πεπτίδια που παράγονται από αθροίσεις (πυρήνες) εκκριτικών νευρώνων στον υποθάλαμο : τον υπεροπτικό και τον παρακοιλιακό πυρήνα, τα οποία μεταφέρονται και συσσωρεύονται στις απολήξεις των νευραξόνων, οι οποίες εντοπίζονται στην νευροϋπόφυση

11 2. Πεπτίδια που παράγονται από νευρώνες του έσω ραχιαίου, έσω κοιλιακού και του χοανικού πυρήνα του υποθαλάμου για να μεταφερθούν στην αδενοϋπόφυση μέσω του πρώτου τμήματος του πυλαίου συστήματος της υπόφυσης. 3. Πρωτεΐνες και γλυκοπρωτεΐνες που παράγονται στην περιφερική μοίρα, απελευθερώνονται σε αιμοφόρα τριχοειδή του δεύτερου τμήματος του πυλαίου συστήματος της υπόφυσης και καταλήγουν στη γενική κυκλοφορία. Εικόνα 4 : Το υποθαλαμοϋποφυσιακό σύστημα (1). Η Περιφερική μοίρα περιλαμβάνει το 75% της μάζας της υπόφυσης. Με συνήθεις χρωστικές αναγνωρίζονται 3 τύποι κυττάρων : τα χρωμόφοβα και τα χρωμόφιλα που υποδιαιρούνται σε βασεόφιλα και οξεόφιλα, ανάλογα με τη χημική τους συγγένεια για τις βασικές και όξινες χρωστικές αντίστοιχα (Εικόνα 5)

12 Εικόνα 5: Η τρίχρωμη χρώση Gomori επιτρέπει την αναγνώριση των κυττάρων της περιφερικής μοίρας (1). Τα βασεόφιλα και τα οξεόφιλα κύτταρα έχουν συγκεκριμένη εντόπιση στην υπόφυση (Εικόνα 6). Εικόνα 6 : Κατανομή βασεόφιλων και οξεόφιλων κυττάρων στην περιφερική μοίρα της υπόφυσης. (58)

13 Τα ενδοκρινικά κύτταρα στην περιφερική μοίρα είναι οργανωμένα σε χορδές που είναι δικτυωτές ίνες ινοβλαστών (Εικόνα 7). Εικόνα 7: Τα κύρια στοιχεία της περιφερικής μοίρας είναι οι χορδές επιθηλιακών κυττάρων, μεταξύ των οποίων διατρέχουν τριχοειδή αγγεία, όπως φαίνεται στην παρούσα εικόνα της τρίχρωμης χρώσης Gomori (1). Έχουν χρησιμοποιηθεί πολλές χρώσεις στην προσπάθεια να διαχωριστούν οι 3 τύποι των ορμονοεκκριτικών κυττάρων με τους υποτύπους τους, με μικρή επιτυχία. Ανοσοϊστοχημικές μέθοδοι και η εξέταση με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο είναι προς το παρόν οι μόνες αξιόπιστες τεχνικές για την διάκριση των κυτταρικών αυτών τύπων ώστε να προκύψει ο συγκεντρωτικός (Πίνακας Ι). Η Χοανική μοίρα ή Χοανοειδής δακτύλιος περιβάλλει δακτυλοειδώς την χοάνη της νευροϋπόφυσης. Κυρίως τα κύτταρα της εκκρίνουν γοναδοτροπίνες : θυλακιοτρόπο ορμόνη FSH ωχρινοτρόπο ορμόνη LH Η Διάμεση μοίρα αποτελείται κυρίως από βασεόφιλα κύτταρα (ασθενώς χρωματισμένα) με άγνωστη λειτουργία

14 Πίνακας Ι : Διακρίνονται οι τύποι κυττάρων με την χημική συγγένεια με την χρωστική, η παραγόμενη ορμόνη και η φυσιολογική της λειτουργία, η ύπαρξη εκκριτικών κοκκίων και οι υποθαλαμικές εκλυτικές και ανασταλτικές ορμόνες (1). Η Νευροϋπόφυση αποτελείται από την νευρική μοίρα και τον νευρικό μίσχο Η νευρική μοίρα δεν περιέχει καθόλου εκκριτικά κύτταρα αλλά αποτελείται από αμύελους νευράξονες εκκριτικών υποθαλαμικών νευρώνων. Το 25% του όγκου της συνιστάται από ειδικό τύπο έντονα διακλαδισμένων νευρογλοιακών κυττάρων που ονομάζονται υποφυσιοκύτταρα (Εικόνα 8)

15 Εικόνα 8:Τρίχρωμη χρώση Mallory, με το μεγαλύτερο μέρος να καλύπτεται από νευράξονες και είναι ορατοί οι πυρήνες των υποφυσιοκυττάρων, τα σωμάτια του Herring (δομές με νευροεκκριτικά κοκκία) καθώς και τα ερυθροκύτταρα (1). Οι ορμόνες που παράγονται στη νευροϋπόφυση είναι: α) η αντιδιουριτική ορμόνη (ADH) η οποία αυξάνει την διαπερατότητα των αθροιστικών σωληναρίων του νεφρού στο νερό και προάγει την συστολή των λείων μυών των αγγείων. β) η ωκυτοκίνη, η οποία διεγείρει τη συστολή των λείων μυϊκών ινών της μήτρας καθώς και τη συστολή των μυοεπιθηλιακών κυττάρων του μαζικού αδένα (1)

16 ΑΔΕΝΩΜΑΤΑ ΥΠΟΦΥΣΗΣ Τα αδενώματα της υπόφυσης είναι καλοήθη νεοπλάσματα επιθηλιακής προέλευσης που προέρχονται από τον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης. Αποτελούν το 10% των ενδοκρανιακών νεοπλασμάτων και σε νεκροψίες ανευρίσκονται σε ποσοστό 15%. Μαζί με τα μηνιγγιώματα και τα νευρινώματα αποτελούν τους συχνότερους όγκους της βάσης του κρανίου. Διακρίνονται επιμέρους βάσει του μεγέθους τους και της επέκτασής τους σε παρακείμενους ιστούς (Hardy s classification) καθώς και της εκκριτικής τους δραστηριότητας σε λειτουργικά και μη λειτουργικά αδενώματα (2,3). Η νευροαπεικονιστική κατάταξη αδενωμάτων (Hardy s classification) διαχωρίζει τα αδενώματα σε 4 τύπους. Τύπος 1-2 : Μακροαδενώματα ( > 1cm ) (Εικόνα 9) με ή χωρίς εξωυποφυσιακή επέκταση. Μικροαδενώματα ( < 1 cm ) (Εικόνα 10) Τύπος 3 : Όγκοι τοπικά διηθητικοί, με στοιχεία καταστροφής του πέριξ οστού και επέκταση του όγκου στο σφηνοειδή και συραγγώδη κόλπο. Τύπος 4 : Με επέκταση και σε άλλα σημεία του ΚΝΣ με ή χωρίς την παρουσία απομακρυσμένων μεταστάσεων. Εικόνα 9 : Δεξιά απεικόνιση με MRI ενός μακροαδενώματος. Αριστερά σχηματική απεικόνιση του και εντόπισή του σε σχέση με το οπτικό χίασμα (2,3)

17 Εικόνα 10 : Δεξιά απεικόνιση με MRI ενός μικροαδενώματος. Αριστερά σχηματική απεικόνιση του και εντόπισή του σε σχέση με τον μίσχο της υπόφυσης (2,3). Τα αδενώματα της υπόφυσης κατατάσσονται και βάσει των εκκρίσεών τους σε λειτουργικά και μη αδενώματα. Μη λειτουργικά-non Functioning Pituitary Adenomas (NFPA), αποτελούν το 30-40% των περιπτώσεων και ονομάστηκαν έτσι διότι τα κύτταρά τους παράγουν ορμόνες. Δυστυχώς διαγιγνώσκονται αργά, όταν έχουν γίνει μακροαδενώματα της τάξεως των 10 mm και άνω (2,3). Συμπτώματα (Εικόνα 11-15) προκαλούν κυρίως μέσω της επέκτασής τους σε παρακείμενα ζωτικά όργανα. Εικόνα 11: Ημιανοψία (κροταφική) από συμπίεση αντίστοιχων νευρικών ινών οπτικού χιάσματος λόγω αδενώματος (2,3)

18 Εικόνα 12: Συμπίεση κρανιακών νεύρων και κροταφικού λοβού (2,3). Εικόνα 13: Κεφαλαλγία από συμπίεση σκληράς μήνιγγας με διάταση κοιλιών (2,3). Εικόνα 14: Ανάπτυξη υδροκέφαλου από συμπίεση υδραγωγού Sylvius (2,3). Εικόνα 15: Εκροή ΕΝΥ και επέκταση όγκου στο σφηνοειδή κόλπο (2,3)

19 Είναι δυνατόν να συμπιέζουν το μίσχο της υπόφυσης και να προκαλούν μερική ή ολική υποφυσιακή ανεπάρκεια, καθώς και / ή υπερπρολακτιναιμία (stalk effect). Τα Λειτουργικά αδενώματα Functioning Pituitary Adenomas (FPA) εκκρίνουν ορμόνες και εμφανίζουν ποικίλο μέγεθος από λίγα mm (μικροαδενώματα) έως μερικά cm (μακροαδενώματα) με όλα τα προηγούμενα συμπιεστικά φαινόμενα αλλά και χαρακτηριστικά κλινικά σύνδρομα λόγω υπερπαραγωγής συγκεκριμένων υποφυσιακών ορμονών. Συγκεκριμένα αναφέρεται παρακάτω η υπερέκκριση ορμονών και το κλινικό σύνδρομο που εμφανίζεται : PRL:προλακτίνωμα γαλακτόρροια, συνήθως >100ng/ml GH:μεγαλακρία, κυρίως μακροαδενώματα με τάση επέκτασης στoυς σηραγγώδεις κόλπους ACTH:σύνδρομο Cushing s ή Nelson sσύνδρομο υπερκορτιζολαιμία Μεταστάσεις στην υπόφυση, είναι δυνατόν να εμφανιστούν οφειλόμενες σε καρκινώματα : Πνευμόνων Μαστού Νεφρών. Η διάγνωση των αδενωμάτων της υπόφυσης μπορεί να πραγματοποιηθεί με τις εξής εφαρμογές: Μαγνητική τομογραφία (MRI) Αξονική τομογραφία 2 ή 3 διαστάσεων (CT) Αγγειογραφία (MRA) Κλασσική αγγειογραφία Η θεραπεία των νεοπλασμάτων επιτυγχάνεται με: Χειρουργική επέμβαση διασφηνοειδικά Ορμονική αποκατάσταση Ακτινοθεραπεία

20 Οι Θεωρίες της ογκογένεσης (4) για τα αδενώματα της υπόφυσης περιλαμβάνουν: i. Ρόλος του υποθάλαμου: Υπάρχει ανικανότητα απάντησης της υπόφυσης στην έκκριση των υποθαλαμικών ορμονών. ii. Χρωμοσωμική αστάθεια: Εμφανίζονται διαταραχές του κυτταρικού κύκλου και μεταλλάξεις διαφόρων γονιδίων. iii. Διαταραχές στο γενετικό υλικό σωματικών κυττάρων μη υποφυσιακών: Εντοπίζονται μεθυλιώσεις στο γενετικό υλικό σωματικών κυττάρων μη υποφυσιακών

21 ΟΙ ΝΕΥΡΟΤΡΟΦΙΝΕΣ ΙΣΤΟΡΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΤΩΝ ΝΕΥΡΟΤΡΟΦΙΝΩΝ (ΝΤs) Το 1953 η Levi-Montalcini και ο Hamburger δημιούργησαν ένα πειραματικό μοντέλο. Εμφύτευσαν μόσχευμα σαρκώματος μυός στην σπονδυλική στήλη αναπτυσσόμενης όρνιθας in novo. Με το πείραμα αυτό ανακάλυψαν ένα διαλυτό παράγοντα που προκαλούσε υπερτροφία και ανάπτυξη ινών συμπαθητικών νευρώνων. Ο παράγοντας αυτός ονομάστηκε Nerve Growth Factor (NGF) και το αποτέλεσμα το οποίο είχαν φαίνεται στην Εικόνα 16 (5,6). Εικόνα 16 : Η ύπαρξη του NGF στην αριστερή εικόνα προκαλεί υπερτροφία και ανάπτυξη ινών συμπαθητικών νευρώνων (6). Το 1982 ο Barde YA κατάφερε να απομονώσει έναν παράγοντα επιβίωσης από εγκέφαλο γουρουνιού τον οποίον ονόμασε Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) (5). Το 1994 Gotz R. και το 1998 Lai KO προσδιόρισαν τέσσερα επιπρόσθετα μέλη της οικογένειας των νευροτροφινών και συγκεκριμένα τις νευροτροφίνες ΝΤ-3, ΝΤ-4/5, ΝΤ-6 και ΝΤ-7. Θα πρέπει να αναφέρουμε ότι οι δύο τελευταίες εντοπίζονται μόνο σε ψάρια και όχι σε θηλαστικά όπως οι άλλες ΝΤs (5)

22 ΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΔΟΜΗ ΤΩΝ ΝΕΥΡΟΤΡΟΦΙΝΩΝ Οι νευροτροφίνες είναι μια μικρή οικογένεια διμερών εκκριτικών πρωτεϊνών που επηρεάζουν σημαντικά όλες τις βιολογικές λειτουργίες των νευρικών κυττάρων των σπονδυλοζώων. Η κύρια δομική μορφή τους (Εικόνα 17) αποτελείται από 2 ζεύγη από διαπλέκουσες, δίκλωνες β-δομές συνδεόμενες με 3 δισουλφιδικούς δεσμούς και από 3 ελάσσονες β-αλυσίδες που οδηγούν σε βρόγχους. Εικόνα 17 : Δομή ΝΤs όπου διακρίνονται τα 2 ζεύγη από δίκλωνες β-δομές (A, B, C, D) που συνδέονται με 3 δισουλφιδικούς δεσμούς και οι 3 ελάσσονες β-αλυσίδες (πράσινα βέλη) που οδηγούν σε θηλειές (Loop 1, 2, 4) (5). Oι νευροτροφίνες εμπλέκονται σε έναν μεγάλο αριθμό λειτουργιών, όπως : Επιβίωση, διαφοροποίηση και κυτταρικό θάνατο Συναπτική πλαστικότητα Μάθηση και μνήμη Ανάπτυξη και σχηματική διαμόρφωση αξόνων και δενδριτών Έκφραση και ενεργότητα λειτουργικών καναλιών (ιοντικών καθώς και νευροδιαβιβαστικών υποδοχέων) Έλεγχος της ανάπτυξης αισθητικών νευρώνων Νευρικό γήρας Κατάθλιψη και άλλες ψυχικές διαταραχές Μεταβολισμός

23 ΟΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΩΝ ΝΕΥΤΡΟΦΙΝΩΝ Όλες οι παραπάνω λειτουργίες των ΝΤs επιτελούνται μέσω της δέσμευσης τους σε δύο είδη μεμβρανικών υποδοχέων, της οικογένειας κινάσης-τυροσίνης που είναι οι υποδοχείς TrkA, TrkB και TrkC (tropomyosine-related kinase ή Trks) και του υποδοχέα p75 NTR που είναι μέλος της οικογένειας Tumor Necrosis Factors (TNFs). Η δέσμευση νευροτροφινών-υποδοχέων γίνεται με συγκεκριμένο τρόπο (Εικόνα 18, Πίνακας ΙΙ). Ο NGF με τον TrkA και με χαμηλότερη συγγένεια με τον p75, o BDNF με τον TrkB και με λιγότερη συγγένεια με τον p75, ο ΝΤ-3 με τον TrkC, λιγότερο με τον TrkA,TrkΒ και p75, η ΝΤ-4 και η ΝΤ-5 με τον TrkB, ενώ τέλος για τη ΝΤ-6 δεν γνωρίζουμε τον υποδοχέα της (7). Εικόνα 18 : Σχηματική αναπαράσταση των υποδοχέων Trks και ο τρόπος σύνδεσής τους με τις νευροτροφίνες. Επίσης διακρίνονται και οι πρωτεϊνικές περιοχές των υποδοχέων (7)

24 Νευροτροφίνες NGF Υποδοχείς TrkA p75 με χαμηλή συγγένεια * BDNF TrkB, * NT - 3 TrkC, * NT 4/5 TrkB, * Πίνακας ΙΙ: Η ικανότητα δέσμευσης των νευροτροφινών με τους υποδοχείς τους (* p75 = pan neurotrophin receptor, ικανότητα δέσμευσης όλων των ΝΤs αλλά με χαμηλή συγγένεια) ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗ ΤΩΝ ΝΕΥΡΟΤΡΟΦΙΝΩΝ Οι νευροτροφίνες παράγονται αρχικά ως προ νευροτροφίνες και αποτελούνται περίπου από αμινοξέα. Με κονβερτάσες και συγκεκριμένα με τις PC1/3, PC2 και PC4 αποκολλάται η προ- περιοχή και επιτυγχάνεται η ωρίμανσή τους. Στην Εικόνα 19 φαίνονται τα μόρια των BDNF, NGF, NT3 και NT4/5 με την προ-περιοχή τους καθώς και τα σημεία όπου επιδρούν οι κονβερτάσες και αποκόπτουν την περιοχή αυτή (6,7). Εικόνα 16: Απεικόνιση των νευροτροφινών με την προ-περιοχή (6)

25 Τελικώς εκκρίνονται οι ΝΤs στον εξωκυττάριο χώρο ως ομοδιμερείς πρωτεΐνες (Εικόνα 20) ακολουθώντας 2 διαφορετικές οδούς έκκρισης : η κύρια οδός (constitutive pathway), η οποία συμβαίνει πάντα στο κύτταρο. η ρυθμιζόμενη οδός (regulated pathway), η οποία ελέγχεται και πραγματοποιείται ανάλογα με την ενδοκυττάρια συγκέντρωση ιόντων ασβεστίων Ca +2 (7). Εικόνα 20 : Οι 2 οδοί έκκρισης των νευροτροφινών στον εξωκυττάριο χώρο με συγκεκριμένο παράδειγμα για τον BDNF (6)

26 ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ TrkΑ, Β, C Γενικά πρόκειται για διαμεμβρανικούς πρωτεϊνικούς υποδοχείς με δράση κινάσης-τυροσίνης (8). Έχουν την ιδιότητα να εμφανίζουν κοινή δομή (ενδοκυτταρικά & εξωκυτταρικά). Συγκεκριμένα η δομή (Εικόνα 21) τους αποτελείται από τα ακόλουθα τρία τμήματα : εξωκυττάριο τμήμα, με δύο μοτίβα πλούσια σε λευκίνη (LRM) μεταξύ δύο κυστεϊνικών τμημάτων. Ακολουθούν δύο τμήματα τύπου ανοσοσφαιρίνης (C2) διαμεμβρανικό τμήμα ενδοκυττάριο τμήμα, με ένα τμήμα κινάσης-τυροσίνης που ακολουθείται από ένα κοντό COOH άκρο. Οι υποδοχείς Trks περιέχουν συγκεκριμένες δομές κλειδιά με μεγάλη λειτουργική σπουδαιότητα και αυτές είναι: - η περιοχή που προσομοιάζει με τις ανοσοσφαιρίνες (Ig-like C2 ), και είναι η θέση σύνδεσης των NTs με τους υποδοχείς. - η περιοχή LRM (Leucine Rich Motif, δηλαδή περιοχή πλούσια σε λευκίνη), η οποία εμφανίζει υψηλή συγγένεια και ειδικότητα πρόσδεσης. - και τέλος η Tyrosine kinase domain, περιοχή κινάσης-τυροσίνης χάρη της οποίας διαχωρίζονται οι Trks από τους υπόλοιπους υποδοχείς τύπου τυροσίνηςκινάσης. Εικόνα 21: Δομή Trks και οι περιοχές κλειδιά (8)

27 ΥΠΟΔΟΧΕΑΣ p75 NTR ή Nerve Growth Factor Receptor (NGFR) Ο πρωτεϊνικός υποδοχέας p75 είναι ένα από τα 25 μέλη της υπερ-οικογένειας των υποδοχέων Tumor Necrosis Factors (TNFs), ο οποίος έχει την ικανότητα να συνδέεται με όλες τις νευροτροφίνες (9). Συγκεκριμένα η δομή του p75 αποτελείται από τις ακόλουθες περιοχές που χωρίζονται σε εξωκυττάρια, διαμεμβρανική και εξωκυττάρια περιοχή (10) (Εικόνα 22). Το εξωκυττάριο τμήμα του p75 υποδοχέα περιέχει το αμινο-τελικό άκρο (Νterminal tail). Ακολουθούν τέσσερις περιοχές πλούσιες σε κυστεΐνη (Cystein-Rich Domaims, CRDs, δηλαδή περιοχές πλούσιες σε κυστεΐνη ) και εκεί συνδέονται οι NTs. Τέλος υπάρχουν πολυ Ν θέσεις γλυκοζυλίωσης και μια πολυ Ο θέση που έχει την μορφή μίσχου (stalk). Στη συνέχεια ακολουθεί το διαμεμβρανικό τμήμα. Η ενδοκυττάρια περιοχή περιέχει μια θέση παλμιτολίωσης της κυστεΐνης 279, δύο δυνητικές θέσεις πρόσδεσης παραγόντων που σχετίζονται με τους υποδοχείς της οικογένειας TNFRs και ονομάζονται TNFR-associated factors (TRAFs). Ακολουθεί μια περιοχή «θανάτου» τύπου ΙΙ (Type II death domain) το οποίο είναι ένα σφαιρικό πρωτεϊνικό μόριο που εμπλέκεται στην μετάδοση αποπτωτικών σημάτων. Εν συνεχεία, εντοπίζεται ένα δυνητικό τμήμα ενεργής G πρωτεΐνης και ακολουθεί το καρβοξυλικό C- άκρο που ονομάζεται PDZ μοτίβο (PDZ protein binding motif) (9,10)

28 Εικόνα 22: Δομή του υποδοχέα των νευροτροφινών p75 (10). Η παραπάνω δομή του p75 που περιγράψαμε είναι η πλήρης με άρτιο το μήκος του υποδοχέα (full length p75, FL-p75). Υπάρχει όμως και μία ισομορφή του υποδοχέα που χαρακτηρίζεται ως «κοντή» ισομορφή (sort p75) (Εικόνα 23). Ο λόγος είναι ότι σε αυτήν απουσιάζουν από το εξωκυττάριο τμήμα οι τέσσερις περιοχές πλούσιες σε κυστεΐνη (CDRs) στις οποίες προσδένονται οι νευροτροφίνες και σημαντικό ρόλο διαδραματίζει η πολυ Ο θέση που ευθύνεται για αυτό. Κατά συνέπεια ακολουθεί σήμα απόπτωσης του κυττάρου. Αν λοιπόν στο κύτταρο υπάρχει ο υποδοχέας s-p75 το κύτταρο επιβιώνει (11). Εικόνα 23 : Οι δύο ισομορφές του υποδοχέα p75. Αριστερά είναι ο FL-p75, με τις 4τέσσερις περιοχές πλούσιες σε κυστεΐνη με κόκκινο, τον μίσχο ή πολυ Ο θέση με κίτρινο, το διαμεμβρανικό τμήμα με γκρι. Ακολουθεί το ενδοκυττάριο τμήμα με τις TRAFs θέσεις πρόσδεσης με μπλε, την περιοχή «θανάτου» τύπου ΙΙ με πράσινο και τέλος το C- τελικό άκρο ή PDZ. Δεξιά η s-p75 ισομορφή στην οποία απουσιάζουν οι CRDs (9). Η σύνδεση της ΝΤ σε κάθε μια ισομορφή έχει διαφορετικό αποτέλεσμα (Εικόνα 24). Όπως μπορούμε να διακρίνουμε ο υποδοχέας p75 ενεργοποιεί σηματοδοτικά μονοπάτια που ρυθμίζουν τόσο τον κυτταρικό θάνατο (κόκκινο μονοπάτι) όσο και την επιβίωση (πράσινο). Συγκεκριμένα στην FL-p75 ισομορφή ενεργοποιούνται οι κασπάσες 3, 6 και 9 μέσω του μονοπατιού Rac JNK Bax - Cyto-c

29 Εικόνα 24 : Οι δύο ισομορφές του p75 με τα σηματοδοτικά μονοπάτια που ενεργοποιούν (11) ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΑ ΜΟΝΟΠΑΤΙΑ ΤΩΝ ΝΕΥΡΟΤΡΟΦΙΝΩΝ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ Trks Όπως έχουμε ήδη αναφέρει οι υποδοχείς Trks έχουν δράση κινάσης-τυροσίνης και ακολουθούν το γενικό σχήμα ενεργοποίησης αυτού του τύπου υποδοχέων. Αρχικά, πραγματοποιείται σύνδεση του μορίου της νευροτροφίνης στον υποδοχέα της, ακολουθεί διμερισμός αυτού, φωσφορυλιώνονται οι τυροσίνες του και εν συνεχεία φωσφορυλιώνονται και ενεργοποιούνται τα σηματοδοτικά μόρια που προσδένονται στον Trk υποδοχέα (12). Μετά την ενεργοποίηση των σηματοδοτικών πρωτεϊνών ακολουθούν τρεις διαφορετικοί οδοί μεταγωγής σήματος (Εικόνα 25 & 26) με διαφορετικά ενδιάμεσα μόρια - κλειδιά και διαφορετική έκβαση για το κύτταρο. Αυτοί οι οδοί μεταγωγής σήματος περιλαμβάνουν το μονοπάτι Ras/ERK (extracellular regulated kinase), της φωσφατιδυλινοσιτόλ-3-οη κινάσης (ΡΙ3Κ)/Akt κινάσης και της φωσφολιπάσης C-γ1 (PLC-γ1) (12)

30 Εικόνα 25 : Διακρίνονται οι τρεις διαφορετικές οδοί μεταγωγής σήματος που ενεργοποιούνται μετά την σύνδεση της νευροτροφίνης με τον υποδοχέα της και αποφέρουν διαφορετικό αποτέλεσμα για το κύτταρο (13)

31 Εικόνα 26: Ολοκληρωμένη εικόνα όπου διακρίνονται όλα τα εμπλεκόμενα μόρια στις τρεις οδούς μεταγωγής σήματος (13). Όπως μπορούμε να διακρίνουμε από την Εικόνα 26, οι σηματοδοτικές οδοί των Trk υποδοχέων ρυθμίζουν την επιβίωση και την ανάπτυξη των κυττάρων.το μόριο της ΝΤ προσδένεται στον υποδοχέα Trk τον οποίον διεγείρει και φωσφορυλιώνει και ακολουθεί η ίδια διαδικασία για μια σειρά σηματοδοτικών πρωτεϊνών που βρίσκονται προσκολλημένες στον υποδοχέα. Σε αυτές τις πρωτεΐνες περιλαμβάνονται η Shc που ενεργοποιεί την Ras μέσω των Grb-2 και SOS, η FRS-2, raps, SH2-B και η CHK, η οποία πρωτοστατεί στην ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ και της PLC-γ1. Οι Shc και FRS-2 φωσφορυλιώνουν την Τυροσίνη 490 (Tyr490) του TrkA, ενώ η PLC-γ1 και η CHK φωσφορυλιώνουν την Tyr785. Η ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ επίσης ρυθμίζεται μέσω των Raf, Rap, SHP-2 και PKCδ. Οι οδοί των ΜΕΚ και ΜΑΡΚ ελέγχουν την ανάπτυξη και την επιβίωση. Ο υποδοχέας ενεργοποιεί την PI-3K μέσω της Ras και της Gad-1/IRS-1/IRS-2 οικογένειας πρωτεϊνών. Η ενεργοποίηση της ΡΙ-3Κ διεγείρει τις PDK1 και PDK2, οι οποίες με τη σειρά τους ενεργοποιούν την Akt. Οι στόχοι της αντι-αποπτωτικής ενεργότητας των ΡΙ-3Κ/Akt περιλαμβάνουν τις πρωτεΐνες BAD, Forkhead, GSK-3, Bcl-2, IAP και p53 που εμπλέκονται στον κυτταρικό θάνατο (13). Θα πρέπει να αναφέρουμε ότι στην Εικόνα 25 παρατηρούμε σύνδεση του p75 και του Trk. Αυτή η λειτουργική διασυνομιλία μεταξύ τους, φαίνεται να είναι μια διαδικασία κλειδί στον καθορισμό του τρόπου που διαθέτει το νευρικό σύστημα

32 προκειμένου να αναπτυχθεί ή ακόμα και να αποκαταστήσει μια βλάβη του κατά τη διάρκεια μιας φλεγμονής μέσω των υποδοχέων αυτών (13). ΈΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΤΩΝ ΝΕΥΡΟΤΡΟΦΙΝΩΝ ΣΤΗΝ ΥΠΟΦΥΣΗ ΚΑΙ ΣΕ ΑΔΕΝΩΜΑΤΑ ΥΠΟΦΥΣΗΣ Κατά κύριο λόγο οι νευροτροφίνες εκφράζονται σε κύτταρα του Νευρικού Συστήματος, είτε του Κεντρικού είτε του Περιφερικού. Ωστόσο, έχει εντοπισθεί η έκφρασή τους και σε ιστούς και όργανα, εκτός του Νευρικού Συστήματος (10). KNΣ: (ευρεία έκφραση) Στους περισσότερους πυρήνες του εγκεφάλου, θάλαμο, αμυγδαλή ΠΝΣ: Αισθητικά και Συμπαθητικά γάγγλια Άλλοι ιστοί και όργανα: Ήπαρ, Μύες, Πνεύμονες, Υπόφυση Όπως είναι γνωστό, η πρόσθια μοίρα της υπόφυσης αποτελείται από πέντε διαφορετικούς τύπους κυττάρων οι οποίοι διαχωρίζονται ανάλογα με τις ορμόνες που παράγουν και εκκρίνουν (Πίνακας Ι). Τα κύτταρα αυτά λειτουργούν και επηρεάζονται υπό την πολυδύναμη δράση συγκεκριμένων παραγόντων, λαμβάνοντας, αποκωδικοποιώντας και μεταφέροντας σε περιφερικά ενδοκρινή όργανα, σήματα που προέρχονται από τον εγκέφαλο, διαδραματίζοντας έτσι σημαντικό και μοναδικό ρόλο στις ενδοκρινείς ενδο-αντιδράσεις (43). Τέτοιοι παράγοντες είναι οι υποθαλαμικές ορμόνες, οι νευροδιαβιβαστές, οι ορμόνες που εκκρίνονται από περιφερικούς αδένεςστόχους αλλά και οι αυξητικοί παράγοντες. Στους αυξητικούς παράγοντες συγκαταλέγονται και οι νευροτροφίνες. Έχει εντοπισθεί ένα εκτεταμένο ενδουποφυσιακό δίκτυο αυξητικών παραγόντων που στοχεύει στον έλεγχο των κυττάρων της υπόφυσης κατά τον πολλαπλασιασμό τους και τη μετανάστευσή τους. Στο παρελθόν πραγματοποιήθηκαν έρευνες στις οποίες εντοπίστηκε η έκφραση των νευροτροφινών στα διάφορα είδη εκκριτικών κυττάρων της υπόφυσης και ο ρόλος που διαδραματίζουν τόσο σε φυσιολογικές καταστάσεις όσο και στα αδενώματά της. Μελέτες απέδειξαν την έκφραση νευροτροφινών σε σωματοτρόπα (GH), σε θυρεοειδοτρόπα (TSH) (44), σε γαλακτοτρόπα (PRL) καθώς και σε γοναδοτρόπα (LH) κύτταρα της πρόσθιας μοίρας της υπόφυσης (45). Επίσης μετρήθηκε το mrna των νευροτροφινών στα κύτταρα της υπόφυσης (46)

33 Ελάχιστα είναι γνωστά για τον ακριβή ρόλο της κάθε νευτροφίνης στο κάθε τύπο εκκριτικών κυττάρων της υπόφυσης. Η πλέον μελετημένη νευροτροφίνη είναι ο παράγοντας NGF και ο υποδοχέας της TrkA. Ο NGF εκφράζεται στα γαλακτοτρόπα κύτταρα και έχει βρεθεί πως διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των κυττάρων αυτών (47). Συγκεκριμένα, σε πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε ποντίκια αλλά και σε κυτταροκαλλιέργειες (PC12 κύτταρα), ο NGF προκαλεί έκκριση της ορμόνης προλακτίνης PRL. Σε καλλιέργειες παρατηρήθηκε διπλασιασμός του πλήθους των γαλακτοτρόπων κυττάρων μετά από χορήγηση NGF (47). Επίσης, σε διαγονιδιακά ποντίκια αναπτύχθηκε υπερπλασία σε γαλακτοτρόπα κύτταρα εξαιτίας υπερέκφρασης του NGF (48). Επιπλέον, ο παράγοντας NGF επιδρά στον υποθαλαμικό-υποφυσιακό άξονα και αυξάνει την έκκριση ACTH ορμόνης, με αποτέλεσμα να προκαλείται παραγωγή γλυκοκορτικοειδών (49). Αυτός είναι ένας μηχανισμός που πιθανόν να εμπλέκει τον NGF ως μεσολαβούντα παράγοντα στην απόκριση του οργανισμού στην φλεγμονή (50,51,52). Αρκετοί από τους αυξητικούς παράγοντες που εκφράζονται στην υπόφυση, έχουν μελετηθεί ότι εμπλέκονται και στην διαδικασία ογκογένεσης στην υπόφυση διαθέτοντας την ικανότητα τροποποίησης των κυττάρων σε καρκινικά. Σε αυτούς τους παράγοντες συγκαταλέγονται και οι νευροτροφίνες (53,54). Ο εντοπισμός των ΝTs δεν αλλάζει στα αδενώματα της υπόφυσης, δηλαδή εξακολουθεί η παραγωγή τους από τα ίδια κύτταρα όπως και στην φυσιολογική. Η αλλαγή που παρατηρείται είναι στην έκφραση των NTs που αυξάνεται στα νεοπλάσματα. Τα πλέον συνηθισμένα και καλώς μελετημένα είναι τα προλακτινώματα. Έχει βρεθεί ότι επιδρώντας ο NGF στα γαλακτοτρόπα κύτταρα, τα οποία αναπαράγονται υπέρ του δέοντος σε παθολογικές καταστάσεις, προκαλεί την επιπλέον αύξηση του αριθμού τους και τη μεταλλαγή τους σε καρκινικά (48). Επιπροσθέτως, η υπερέκφραση και άλλων αυξητικών παραγόντων, όπως του TGFa και τη διακοπή της παραγωγής του TGFβ1, οδηγούν στην ανάπτυξη προλακτινώματος (24,55) και μάλιστα έχει βρεθεί ότι υπάρχει μια διασυνομιλία μεταξύ του TGFa και του NGF (26,27). Κατά συνέπεια όταν υπερκεφράζεται ο πρώτος παράγοντας, επηρεάζεται και ο δεύτερος ο οποίος φαίνεται να εμπλέκεται στην δημιουργία νεοπλασμάτων (56)

34 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Σκοπός της παρούσης μελέτης ήταν η διερεύνηση της έκφρασης και της κατανομής των υποδοχέων των ΝΤs (p75 και Trks) σε αδενώματα υπόφυσης στον άνθρωπο και η συσχέτιση των υποδοχέων των νευροτροφινών με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών. Στην πορεία της μελέτης παρατηρήθηκε έκφραση των ΝΤs και σε αγγεία, γεγονός πολύ ενδιαφέρον και αξιοσημείωτο. Έτσι, διερευνήθηκε επίσης η έκφραση των υποδοχέων των νευροτροφινών σε σχέση με την αγγειογένεση των αδενωμάτων που συμπεριελήφθησαν στη μελέτη

35 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ Μελετήθηκαν 18 αδενώματα υπόφυσης, 10 ανδρών και 8 γυναικών (Πίνακας ΙΙΙ) από βιοψίες που έγιναν στο Π.Γ.Ν. Πατρών και τα οποία φυλάσσονταν στο Παθολογοανατομικό Εργαστήριο του Νοσοκομείου. Μετά από μονιμοποιήση σε διάλυμα 10% φορμόλης, ακολούθησε με κατάλληλη επεξεργασία εμποτισμός τους σε παραφίνη. Με μικροτόμο κόπηκαν τομές της τάξεως των 4μm και οι τομές επιστρώθηκαν σε αντικειμενοφόρες πλάκες SuperFrost και Polysine. Προκειμένου να διατηρηθούν οι τομές, φυλάχθηκαν στους 4 0 C. Τα διαλύματα τα οποία χρησιμοποιήθηκαν είναι τα εξής: Ξυλόλη Αλκοόλες 100%, 96%, 80%, 70% Η 2 Ο 2 3% Κιτρικό Na ph 6 TBS 1x ph 7,6 TBS/BSA/γάλα ChemMate DAKO Envision, DAKO Cytomation, Cat No: K-5007 NovoLinkTM Polymer Detection System, NovoCastra LabTM Vector Laboratories DAB 3,3 διαμινοβενζιδίνη Αιματοξυλίνη Entellan Χρησιμοποιήθηκαν πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των υποδοχέων: Santa Cruz Biotechnology Trk-A TrkB TrkC anti-rabbit polyclonal IgG Neomarkers Fremont Μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι του υποδοχέα p75 anti-mouse monoclonal IgG

36 Η ταυτοποίηση των αδενωμάτων ανάλογα με τον τύπο των εκκριτικών κυττάρων που προέρχονται, έγινε με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι των ορμονών PRL και GH. Biogenex anti-human Prolactin (hprl) anti-human Growth Hormone (hgh) anti-mouse monoclonal IgG Η ταυτοποίηση των αγγείων έγινε με τη χρήση των εξής αντισωμάτων: Zymed Rabbit anti-vegfr3 Dako Cytomation monoclonal mouse anti-human CD31 Α. Τεχνική Ανοσοϊστοχημείας για την ταυτοποίηση των υποδοχέων των νευροτροφινών Το σύστημα ενίσχυσης-ανίχνευσης Dako EnVision TM που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη αυξάνει σημαντικά την αναλογία σήματος προς αντίσωμα. Στην συγκεκριμένη τεχνική το δευτερεύον αντίσωμα είναι συνδεδεμένο σε σύμπλεγμα από μεγαλομόρια δεξτράνης, που φέρει μεγάλο αριθμό μορίων ενζύμου, άρα σε ένα μόριο πρωτεύοντος αντισώματος, αντιστοιχούν πολλά μόρια υπεροξειδάσης, με αποτέλεσμα ισχυρότατη αντίδραση παραγωγής έγχρωμου προϊόντος. Με την τεχνική αυτή αυξάνεται η ευαισθησία της μεθόδου, ελαχιστοποιούνται τα μη-ειδικά σημεία χρώσης και μειώνεται ο συνολικός αριθμός των βημάτων της κλασσικής τεχνικής. Τα βήματα της τεχνικής ήταν τα εξής: 1. Αποπαραφίνωση τομών με δ/ματα ξυλόλης 2. Ενυδάτωση με κατιούσα σειρά αλκοολών 3. Κατανάλωση ενδογενούς υπεροξειδάσης με διάλυμα (δ/μα) Η 2 Ο 2 3% 4. Ανάκτηση αντιγονικών θέσεων με microwave με δ/μα Κιτρικού Na ph 6 (5 min 1000Watt) 5. Ενδιάμεσες πλύσεις με δ/μα ΤΒS ph 7,6 6. Επώαση over night (Ο/Ν) με αντισώματα αραιωμένα με δ/μα TBS/BSA/γάλα (Αραίωση αντισωμάτων Trks 1:200, p75 1:500) 7. Εφαρμογή του δ/ματος EnVision για 45 min (δρα ως δεύτερο αντίσωμα) 8. Επώαση με χρωμογόνο DAB για 10 min

37 9. Πλύσεις με νερό 10. Εμβάπτιση τομών σε αιματοξυλίνη 11. Αφυδάτωση με ανιούσα σειρά δ/μάτων αλκοολών και ξυλόλής 12. Κάλυψη τομών με κόλλα Entellan. Α. Τεχνική Ανοσοϊστοχημείας α) για την ταυτοποίηση των αδενωμάτων ανάλογα με τον εκκριτικό τύπο κυττάρων, β) για την ταυτοποίηση των αγγείων Χρησιμοποιήθηκε το NovoLinkTM Polymer Detection System, NovoCastra LabTM Αναλυτικά : 1. Αποπαραφίνωση τομών με δ/ματα ξυλόλης 2. Ενυδάτωση με κατιούσα σειρά αλκοολών 3. Κατανάλωση ενδογενούς υπεροξειδάσης με διάλυμα (δ/μα) Η 2 Ο 2 3% 4. Ανάκτηση αντιγονικών θέσεων με microwave με δ/μα Κιτρικού Na ph 6 (2min 800 Watt και 7min 300 Watt) 5. Ενδιάμεσες πλύσεις με δ/μα ΤΒS ph 7,6 6. Επώαση αντισωμάτων anti-prl, anti-gh για 1/2h RT. Τα αντισώματα δεν χρειάστηκαν περαιτέρω αραίωση. Τα αντισώματα anti-vegfr3 (1:100), anti-cd31 (1:20) επωάσθηκαν για 1h σε θερμοκρασία δωματίου 7. Εφαρμογή του δ/ματος EnVision για 45 min (δρα ως δεύτερο αντίσωμα) 8. Επώαση με χρωμογόνο DAB για 10 min 9. Πλύσεις με νερό 10. Εμβάπτιση τομών σε αιματοξυλίνη 11. Αφυδάτωση με ανιούσα σειρά δ/μάτων αλκοολών και ξυλόλής 12. Κάλυψη τομών με κόλλα Entellan.. Η αξιολόγηση της ανοσοϊστοχημικής χρώσης έγινε με την χρήση φωτονικού μικροσκοπίου

38 Αξιολογήθηκε το ποσοστό (%) των θετικών κυττάρων για τους υποδοχείς αλλά και η ένταση της χρώσης. Η βαθμολόγηση της έντασης της χρώσης έγινε ως εξής: 0=αρνητικό, 1+=ασθενής χρώση, 2+=μέτρια χρώση, 3+=έντονη χρώση. Για την ταυτοποίηση των αγγείων επιλέξαμε τις 3 αγγειοβριθρέστερες περιοχές με μεγέθυνση 10x και μετρήσαμε τα αγγεία με μεγέθυνση 40x ώστε να υπολογιστεί ο μέσος όρος τους (MCV, Μικροαγγειακή πυκνότητα)(15,16,17)

39 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Τα αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα IV. Βρέθηκε έκφραση για τον υποδοχέα TrkA στο 100% των όγκών και συγκεκριμένα με έντονη χρώση (+3) σε 9/18 (50%) των περιπτώσεων, σε 8/18 (45%) των περιπτώσεων με μέτρια χρώση (+2) και 1/18 (5%) των περιπτώσεων με χαμηλή χρώση (+1). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι ο υποδοχέας TrkA εμφάνιζε την μεγαλύτερη και εντονότερη έκφραση σε σχέση με τους άλλους υποδοχείς των νευροτροφινών αλλά δεν εμφάνιζε ανοσοθετικότητα σε αγγεία. Αξίζει να αναφερθεί ότι στο ένα μοναδικό αδένωμα με τύπο κυττάρων αμιγώς PRL(+) ο μόνος υποδοχέας που εκφράστηκε ήταν ο TrkA ενώ οι υπόλοιποι υποδοχείς νευροτροφινών είχαν μηδενική έκφραση. Ο υποδοχέας TrkB εμφάνισε θετικότητα σε 15/18 (83%) των περιπτώσεων. Τα 6/15 (40%) περιστατικά παρουσίασαν έντονη χρώση (+3), τα 4/15 (27%) περιστατικά μέτρια χρώση (+2) και τα 5/15 (33%) περιστατικά ασθενή χρώση (+1). Ανοσοϊστοχημική χρώση παρατηρήθηκε για τον TrkB και σε αγγεία σε 4/15 (27%) περιστατικά και συγκεκριμένα με τύπο αδενωμάτος 1/4 ACTH+, 2/4 GH+ και 1/4 GH-,PRL-. Για τον υποδοχέα TrkC, τα 11/18 (61%) περιστατικά παρουσίασαν ανοσοθετικότητα και συγκεκριμένα 3/11 (27%) από αυτά εμφάνησαν μέτρια χρώση (+2) και 8/11 (73%) περιστατικά ασθενή χρώση (+1). Ανοσοθετικότητα για τον TrkC παρατηρήθηκε στα αγγεία σε 4/11 (36%) περιστατικά και συγκεκριμένα με τύπο αδενώματος 1/4 ACTH+, 1/4 GH+,PRL+, 1/4 GH-,PRL- και 1/4 GH+. Η έκφραση των υποδοχέων Trks εντοπίστηκε ανεξάρτητα από τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών, ωστόσο παρατηρήσαμε στα GH(+) αδενώματα μεγάλη έκφραση του υποδοχέα TrkA. Σε αδενώματα τύπου PRL(+) και ACTH(+) παρατηρείται σχετικώς χαμηλότερο ποσοστό έκφρασης υποδοχέων νευροτροφινών και έντασης της ανοσοθετικότητας Σε κανέναν από τους όγκους που μελετήθηκαν δεν εντοπίστηκε έκφραση του υποδοχέα p75 NTR. Για τον παράγοντα VEGFR3 το 89% των περιστατικών ήταν θετικά εμφανίζοντας ένα εύρος MCV 2 έως 32,67, ενώ για τον παράγοντα CD31 το 100% των αδενωμάτων ήταν θετικά με εύρος MCV 4,67 έως 53,67. Σημειώθηκε μεγαλύτερη έκφραση του παράγοντα VEGFR3 σε μεγαλύτερες ηλικίες ανεξαρτήτως φύλου, καθώς επίσης και στα GH(+) αδενώματα. Tα αδενώματα αυτά, που ήταν 7/18, εμφάνιζαν διήθηση του όγκου

40 Αξιοσημείωτο αποτέλεσμα είχαμε και σε ένα από τα δύο PRL(+) αδενώματα όπου ο παράγοντας VEGFR3 είχε MCV 22,3 και ο παράγοντας CD31 είχε MCV 24,3, δηλαδή πλησίαζαν κατά πολύ τον μέσο όρο του αριθμού των αγγείων. Τύπος κυττάρων Περιστατικά Ποσοστό Ποσοστό ανά Φύλο Άνδρες Γυναίκες ACTH(+) 4/18 22% 25%Α 75% Γ GH(+) 8/18 44% 66,7%Α 33,3%Γ GH(+),PRL(+) 2/18 11% 50%Α 50%Γ GH(-),PRL(-) 1/18 6% 100%Α 0% Γ PRL(+) 2/18 11% 0% Α 100%Γ ACTH(+), GH(+),PRL(+) 1/18 6% 100%Α 0% Γ Πίκανας ΙΙΙ:Κατάταξη περιστατικών ανάλογα με τον τύπο εκκριτικών κυττάρων

41 Α/Α Φύλο Τύπος Ηλικία TrkA TrkB TrkC % + κυττάρων ένταση χρώσης % + κυττάρων ένταση χρώσης % + κυττάρων ένταση χρώσης NGFR % + κυττάρων & ένταση χρώσης VEGFR3 MCV 1 Γ ACTH α α A GH α+ 0 32,67 27,3 3 Α GH+,PRL ,67 4 Γ PRL ,67 24,3 5 Α GH ,3 6 A GH Γ ACTH ,3 8 Γ GH+,PRL α+ 2,3 9,67 9 Α GH ,3 17,67 10 A GH-,PRL α α ,3 11 Γ PRL ,3 10,67 12 A ACTH ,67 13 Α ACTH+,GH+,PRL ,67 14 A GH α ,3 15 Α GH α ,67 16 Γ GH , Γ ACTH ,67 18,67 18 Γ GH ,3 14,67 CD31 1:20 MCV Πίνακας ΙV Ανοσοϊστοχημική έκφραση των υποδοχέων των νευροτροφινών και μικροαγγειακή πυκνότητα σε αδενώματα υπόφυσης. Με (α +) επισημαίνονται οι περιπτώσεις στις οποίες εμφανίστηκε ανοσοθετικότητα στα αγγεία για τους υποδοχείς TrkB και TrkC. Επίσης έχουν σημειωθεί οι υψηλότεροι (κόκκινοι αριθμοί) και οι χαμηλότεροι (μπλε αριθμοί) μέσοι όροι των αριθμών των αιμοφόρων αγγείων και των λεμφαγγείων.

42 Α/Α Φύλο Ηλικία Τύπος Ορμονική Θεραπεία Προ-χειρουργικά επίπεδα ορμονών 4 Γ 51 PRL+, GH+ Bromocriptine Mesylate PRL,Cortisol,ACTH,GH:N/A (Parlodel) 1 ½ χρόνο θεραπεία(διεκόπη από ασθενή) 7 Γ 67 ACTΗ+ ΚΑΜΙΑ PRL:38,3ng/ml ACTH:14,5ng/ml Cortisol,GH:N/A Διήθηση Όγκου Αλλοίωση του τουρκικού εφιππίου. Μέγεθος:2,5x1,5 cm. Επέκταση στο άνω τμήμα του τουρκικού εφιππίου. Συμπίεση οπτικού χιάσματος. Κλινικά Συμπτώματα Οπτική εξασθένιση 10 χρόνια πριν την επέμβαση. 3ετή συμπτώματα κεφαλαλγίας, εμβοής αυτιών και ιλίγγου CT,MRI Προ-χειρουργείου:χειροτέρευση οπτικών πεδίων (αμφίπλευρη προσωρινή ημιανοψία) Κεφαλαλγία Αμφίπλευρη προσωρινή ημιανοψία 8 Γ 59 PRL+, GH+ ΚΑΜΙΑ PRL,Cortisol,ACTH,GH:N/A ΚΑΜΙΑ Κεφαλαλγία Οπτική εξασθένιση Ναυτία (20 ημέρες πριν την επέμβαση) 9 Α 71 GH+ ΚΑΜΙΑ PRL,Cortisol,ACTH,GH:N/A ΚΑΜΙΑ Οπτική εξασθένιση (3 μήνες πριν την επέμβαση) 10 Α 45 PRL-, GH- ΚΑΜΙΑ PRL,Cortisol,ACTH,GH:N/A ΚΑΜΙΑ Τύφλωση δεξιού οφθαλμού (2 μήνες πριν την επέμβαση) Αριστερή προσωρινή ημιανοψία 11 Γ 23 PRL+ Bromocriptine Mesylate (Parlodel) PRL:>200 ng/ml Cortisol,ACTH,GH:N/A Διάμετρος όγκου:2 cm, χωρίς επέκταση στο σφηνοειδές οστό. Μεγέθυνση τουρκικού εφιππίου Κεφαλαλγία Αμηνόρροια 12 Α 34 ACTΗ+ ΚΑΜΙΑ PRL,Cortisol,ACTH,GH:N/A ΚΑΜΙΑ Κεφαλαλγία Οπτική εξασθένιση (1 μήνα πριν την επέμβαση) Δεξιά προσωρινή ημιανοψία

43 Α/Α Φύλο Ηλικία Τύπος Ορμονική Θεραπεία Προ-χειρουργικά επίπεδα Διήθηση Όγκου Κλινικά Συμπτώματα ορμονών 13 Α 60 PRL+, GH+, ACTΗ+ ΚΑΜΙΑ PRL,Cortisol,ACTH,GH:N/A ΚΑΜΙΑ Κεφαλαλγία (10 ημέρες πριν την επέμβαση) 14 Α 46 GH+ ΚΑΜΙΑ PRL:13,3 mg/ml Cortisol,ACTH,GH:N/A 15 Α 70 GH+ ΚΑΜΙΑ PRL:10,4 ng/ml Cortisol:N/A ACTH:7,0 ng/ml GH:0,1 mg/ml 17 Γ 74 ACTΗ+ ΚΑΜΙΑ PRL:38 ng/ml Cortisol:9,9 ng/ml ACTH: N/A GH:0,50 mg/ml Μέγεθος:5,5x5x4,2cm χωρίς οστική αλλοίωση. Συμπίεση οπτικού χιάσματος με αμφίπλευρη σύνδεση στις έσω καρωτίδες. Απόφραξη κοιλότητας τουρκικού εφιππίου. Μέγεθος:3x2,7x3 cm Αλλοίωση του τουρκικού εφιππίου. Μέγεθος:2,2x2,x2,1 cm Απόφραξη κοιλότητας τουρκικού εφιππίου. Συμπίεση οπτικού χιάσματος. Μέγεθος:2,8x2,6x2,6 cm χωρίς οστική αλλοίωση. 6 χρόνια πριν την επέμβαση: Διπλωπία και διάγνωση αδενώματος υπόφυσης μεγέθους 3x3x2,5 cm Τελευταίο έτος:αμφίπλευρη προσωρινή ημιανοψία Αύξηση μεγέθους όγκου Αμφίπλευρη προσωρινή ημιανοψία Οπτική εξασθένιση (4 μήνες πριν την επέμβαση). Αμφίπλευρη προσωρινή ημιανοψία. 18 Γ 50 GH+ ΚΑΜΙΑ PRL:11,49 ng/ml Cortisol:8,57 ng/ml ACTH: N/A GH: N/A Πίνακας V: Κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών με αδενώματα υπόφυσης που συμπεριλήφθησαν στην παρούσα μελέτη. Κεφαλαλγία και ίλιγγος (2 έτη πριν την επέμβαση. Δεξιά προσωρινή ημιανοψία (6 μήνες πριν την επέμβαση)

44 ΦΩΤΟΓΡΑΦΙΕΣ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟΥ Περιστατικό 1:Γυναίκα 36 ετών αδένωμα υπόφυσης ACTH+ TrkA, Μεγέθυνση x20 TrkA, Μεγέθυνση x40 TrkB, Μεγέθυνση x40 TrkC, Μεγέθυνση x40 CD31, Μεγέθυνση x20 CD31, Μεγέθυνση x40

45 Περιστατικό 2:Άνδρας 59 ετών αδένωμα υπόφυσης GH+ TrkB, Μεγέθυνση x40 VEGFR3, Μεγέθυνση x40

46 Περιστατικό 9:Άνδρας 71 ετών αδένωμα υπόφυσης GH+ TrkA, Μεγέθυνση x40 TrkB, Μεγέθυνση x40 TrkC, Μεγέθυνση x40 p75, Μεγέθυνση x40 VEGFR3, Μεγέθυνση x40 CD31, Μεγέθυνση x40

47 Περιστατικό 14:Άνδρας 46 ετών αδένωμα υπόφυσης GH+ TrkA, Μεγέθυνση x40 TrkB, Μεγέθυνση x40 TrkB, αγγείο (+), Μεγέθυνση x40 TrkC, Μεγέθυνση x

48 Περιστατικό 15:Άνδρας 70 ετών αδένωμα υπόφυσης GH+ TrkA, Μεγέθυνση x40 TrkB, Μεγέθυνση x40 TrkB, αγγείο+, Μεγέθυνση x40 TrkC, αγγεία+, Μεγέθυνση x40 p75, Μεγέθυνση x40 VEGFR3, Μεγέθυνση x

49 Περιστατικό 15 (συνέχεια) CD31, Μεγέθυνση x

50 ΣΥΖΗΤΗΣΗ Τα κύτταρα της πρόσθιας υπόφυσης προέρχονται από έναν πολυδύναμο πρόδρομο, του οποίου η φαινοτυπική ανάπτυξη καθορίζεται τόσο από ενδουποφυσιακούς παράγοντες όσο και από υποθαλαμικά και περιφερικά σήματα. Οι αυξητικοί παράγοντες, όπως οι νευροτροφίνες, είναι πολυπεπτίδια που απελευθερώνονται από κύτταρα με σκοπό τη ρύθμιση της ανάπτυξης και τη διαφοροποίηση μέσω ενεργοποιημένων υποδοχέων που υπάρχουν στη μεμβράνη των κυττάρων-στόχων. Η υπερπαραγωγή αυξητικών παραγόντων και η έλλειψη αναστολέων του κυτταρικού πολλαπλασιασμού έχουν ως αποτέλεσμα την κυτταρική ανάπτυξη και την δημιουργία όγκου (19). Όλο και περισσότερο ενισχύεται η απόδειξη ότι η κατάρρευση του σηματοδοτικού δικτύου των υποφυσιακών αυξητικών παραγόντων παίζει σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση της υπόφυσης. Στη βιβλιογραφία ιδιαίτερα αναφέρεται ο ρόλος που διαδραματίζει ο NGF τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθοφυσιολογικές καταστάσεις στην υπόφυση. Ο NGF φαίνεται πως παίζει ένα διπλό ρόλο, α) ως τοπικού διεγέρτη για τη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων της υπόφυσης και κυρίως των γαλακτοτρόπων, και β) ως νευρο-ορμόνη, η οποία εκκρίνεται μαζί με την προλακτίνη στην κυκλοφορία του αίματος. Επίσης, ο NGF χαρακτηρίζεται ως αυτοκρινής παράγοντας διαφοροποίησης των γαλακτοτρόπων κυττάρων της υπόφυσης. Παρεκκλίνοντας από τον έλεγχο ο NGF εμφανίζεται να εμπλέκεται στον μηχανισμό της ανάπτυξης των προλακτινωμάτων (18,19). Οι αυξητικοί παράγοντες, όπως είναι και οι ΝΤs,που εντοπίζονται και εκφράζονται και στην υπόφυση (10) παίζουν ρόλο όχι μόνο στην ανάπτυξή και στην φυσιολογική της λειτουργία αλλά και στην ογκογένεση (25). Μελέτες απέδειξαν ότι μια θεραπεία με οιστρογόνα αυξάνει την έκφραση του TGFa και των ΝΤs στα γαλακτοτρόπα κύτταρα και συμβάλει στην υπερπλασία της υπόφυσης (23). Επιπλέον, η έκφραση του TGFa στα γαλακτοτρόπα κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη προλακτινώματος στις γυναίκες (24). Ωστόσο αν οι ΝΤs και ο TGFa υπερεκφραστούν και στους άλλους τύπους των εκκριτικών κυττάρων της υπόφυσης, θα είναι υπεύθυνοι για τον σχηματισμό όγκου (26,27). Στην παρούσα μελέτη μεγάλη έκφραση του υποδοχέα TrkA, στον οποίο δεσμεύεται η νευροτροφίνη NGF, εντοπιζόταν στα GH(+) αδενώματα. Η παραπάνω παρατήρηση συμβαδίζει με τα ευρήματα μιας πειραματικής μελέτης

51 (28) στην οποία αναφέρεται ότι πράγματι παρατηρείται μεγαλύτερη ανοσοθετικότητα για την νευροτροφίνη NGF και του υποδοχέα αυτής σε GH(+) κύτταρα της πρόσθιας μοίρας της υπόφυσης. Σε κύτταρα τύπου PRL(+) και ACTH(+) παρατηρείται σχετικώς χαμηλότερο ποσοστό έκφρασης υποδοχέων νευροτροφινών και έντασης της ανοσοθετικότητας. Προηγούμενες μελέτες δείχνουν ότι η νευροτροφίνη NGF και η βρωμοκρυπτίνη είναι μια αποτελεσματική θεραπεία σε ένα θεραπευτικό μοντέλο αθυμικού ποντικιού στο οποίο μεταμοσχεύτηκε ένα προλακτίνωμα με ανθεκτικούς τους υποδοχείς D 2 της ντοπανίμης. Ο τύπος του αδενώματος αυτού ονομάζεται «non responder». Με μια μικρή θεραπεία χορήγησης NGF στο ποντίκι παρατηρήθηκε σημαντική αναστολή της ανάπτυξης του όγκου σε αυτό. Σε κλινικές δοκιμές σε περιορισμένο αριθμό ασθενών με «non responder» προλακτίνωματα, μετά από 40 μέρες θεραπεία με έγχυση NGF και βρωμοκρυπτίνης, παρατηρήθηκε μείωση του μεγέθους των αδενωμάτων τους έως και 10 φορές (22). Δεν υπάρχουν προηγούμενες μελέτες που να αποσαφηνίζουν τον ρόλο των υποδοχέων TrkB και TrkC στα αδενώματα της υπόφυσης για να μπορέσουμε να συσχετίσουμε την έκφρασή τους στην παρούσα μελέτη. Ο υποδοχέας p75 δεν εκφράστηκε σε κανένα αδένωμα. Πρόκειται για ένα αναμενόμενο αποτέλεσμα διότι ο p75 εκφράζεται κατά κύριο λόγο σε νευρικά κύτταρα (18), αλλά εξετάστηκε προκειμένου να είναι μια όσο το δυνατό ολοκληρωμένη μελέτη για τους υποδοχείς των νευροτροφινών. Αναφέραμε ότι η ύπαρξη ενός ενδο-υποφυσιακού δικτύου αυξητικών παραγόντων ελέγχει των πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Οι ίδιοι παράγοντες ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων συγκεκριμένων πρωτεϊνών που συμμετέχουν σε αυτοκρινείς και παρακρινείς μηχανισμούς. Τέτοιοι παράγοντες είναι ο EGF (Epidermal Growth Factor), ο TGFa και TGFb1 (Transforming Growth Factor-a και -b1), ο bbfgf (bbasic Growth Factor) αλλά και ο NGF. Η έκφραση όλων των παραπάνω παραγόντων κατευθύνεται από διαφορετικούς υποκινητές και ευθύνονται για ποικίλα σήματα. Για παράδειγμα στην περίπτωση του γονιδίου του TGFa, η έκφρασή του ρυθμίζεται από οιστρογόνα (20) και από ενεργοποιητές της πρωτεϊνικής κινάσης C ή PKC (21) όπου στο σηματοδοτικό της μονοπάτι ενεργοποιούνται και οι νευροτροφίνες ΝΤs, ενώ για να εκφραστεί ο EGF ενεργοποιούνται η τεστοστερόνη και οι θυρεοειδικές ορμόνες (22)