ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

Transcript

1 Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών Τμήμα Βιοτεχνολογίας ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Αθήνα 2014

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΑΣΚΗΣΗ 1 Η : ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΔΙΑΛΥΜΑΤΩΝ ΓΕΝΙΚΑ ΕΚΤΕΛΕΣΗ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ ΑΣΚΗΣΗ 2 Η : ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΟΙ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΙ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΓΕΝΙΚΑ ΕΚΤΕΛΕΣΗ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ ΑΣΚΗΣΗ 3 Η : ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΓΕΝΙΚΑ ΕΚΤΕΛΕΣΗ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ ΑΣΚΗΣΗ 4 Η : ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΟΛΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΚΑΤΑ BRADFORD ΓΕΝΙΚΑ ΕΚΤΕΛΕΣΗ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ ΑΣΚΗΣΗ 5 Η : ΦΥΓΟΚΕΝΤΡΗΣΗ ΓΕΝΙΚΑ ΕΚΤΕΛΕΣΗ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ ΑΣΚΗΣΗ 6 Η : ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡHΣΗ ΓΕΝΙΚΑ ΕΚΤΕΛΕΣΗ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ

3 ΑΣΚΗΣΗ 1 η ΑΣΚΗΣΗ 1 η : Παρασκευή Διαλυμάτων Γενικά Η πραγματοποίηση των πειραμάτων στο εργαστήριο βιοχημείας απαιτεί τις περισσότερες φορές την μελέτη των βιομορίων μακριά από το φυσικό τους σύστημα, μέσα σε ένα τεχνητό περιβάλλον το οποίο δημιουργείται συνήθως σε διαλύματα μέσα σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα (in vitro). Γίνεται λοιπόν φανερό, ότι η όσο το δυνατό ακριβέστερη μελέτη των χαρακτηριστικών των βιομορίων, απαιτεί την δημιουργία του κατάλληλου περιβάλλοντος, του οποίου οι φυσικοχημικές ιδιότητες θα είναι οι βέλτιστες για την λειτουργία τους. Στους σημαντικότερους παράγοντες περιλαμβάνονται η ιονική δύναμη, η τιμή ph, η παρουσία κατάλληλων συγκεντρώσεων από συνενζυμικούς παράγοντες, μέταλλα κ.τ.λ.. Συνεπώς, η εργασία στο εργαστήριο βιοχημείας απαιτεί καλές γνώσεις σχετικά με την παρασκευή διαλυμάτων. Οι βασικές αρχές που διέπουν την παρασκευή διαλυμάτων αποτελούν το αντικείμενο της πρώτης εργαστηριακής άσκησης. Γενικοί ορισμοί: Μοριακότητα (Molarity, Μ) ορίζεται ως ο αριθμός των γραμμομορίων (mol) της διαλυμένης ουσίας σε ένα λίτρο διαλύματος. Μοριακότητα (Μ) = (αριθμός γραμμομορίων της διαλυμένης ουσίας) / (όγκος διαλύματος σε λίτρα) Γραμμομόριο (mol) = (μάζα ουσίας σε gr) / (μοριακό βάρος της ουσίας Μ.Β.) Άρα Μ = (γραμμάρια διαλυμένης ουσίας) / Μ.Β. x (όγκος διαλύματος σε λίτρα) (Eξίσωση 1) Κανονικότητα (Normality, N) ορίζεται ως ο αριθμός των γραμμοϊσοδύναμων της διαλυμένης ουσίας σε ένα λίτρο διαλύματος. Κανονικότητα (Ν) = (αριθμός γραμμοϊσοδύναμων διαλυμένης ουσίας) / (όγκος διαλύματος σε λίτρα) (Eξίσωση 2) Ως γραμμοϊσοδύναμο ορίζεται η ποσότητα σε γραμμάρια της διαλυμένης ουσίας ίση με το αριθμό του χημικού ισοδυνάμου της. Το χημικό ισοδύναμο ορίζεται ως το πηλίκο του μοριακού βάρους της ουσίας δια του αριθμού των υδρογόνων που μπορεί να ελευθερώσει ή να δεσμεύσει το οξύ ή η βάση αντίστοιχα. Στην περίπτωση αλάτων, το χημικό ισοδύναμο ορίζεται ως το πηλίκο του μοριακού βάρους της ουσίας δια του αριθμού των υδρογόνων που απελευθερώθηκαν ή έλαβαν μέρος στην αντίδραση σύνθεσης του, ενώ στην περίπτωση οξειδο-αναγωγικών ενώσεων - 1 -

4 ΑΣΚΗΣΗ 1 η υπολογίζεται ο αριθμός των ηλεκτρονίων που χάνει ή κερδίζει η ένωση κατά τη διάρκεια της αντίδρασης οξειδοαναγωγής. Αραίωση Η αραίωση διαλυμάτων αποτελεί μια από τις καθημερινές εργασίες στο εργαστήριο βιοχημείας, καθώς τις περισσότερες φορές τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται στις εργαστηριακές δοκιμές (διαλύματα εργασίας) παρασκευάζονται με την αραίωση και την ανάμιξη πυκνών διαλυμάτων των επιμέρους ουσιών (μητρικά διαλύματα). Κατά κανόνα οι αραιώσεις διαλυμάτων πραγματοποιούνται είτε με την προσθήκη νερού, είτε αναμειγνύοντας το μητρικό διάλυμα με ένα άλλο διάλυμα. Ανεξάρτητα με τον τρόπο αραίωσης, η αρχική ποσότητα της διαλυμένης ουσίας παραμένει σταθερή ενώ αυξάνεται ο τελικός όγκος του διαλύματος. Όπως είναι γνωστό η συγκέντρωση (C) της διαλυμένης ουσίας σε ένα διάλυμα δίνεται από τη σχέση: C = M / V (Εξίσωση 3) Όπου, Μ η μάζα της διαλυμένης ουσίας και V o όγκος του διαλύματος. Καθώς κατά την αραίωση η μάζα της διαλυμένης ουσίας παραμένει σταθερή, η συγκέντρωση της στο τελικό διάλυμα μετά την αραίωση υπολογίζεται από τη σχέση: V 1 x C 1 = V 2 x C 2 (Εξίσωση 4) Όπου V1, C1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού διαλύματος και V2, C2, ο τελικός νέος όγκος και η τελική συγκέντρωση στο διάλυμα μετά την αραίωση. Κατά την εφαρμογή του τύπου 4, ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δίνεται στη χρησιμοποίηση ίδιων μονάδων όγκου και συγκέντρωσης και στα δύο σκέλη της εξίσωσης. Διαλύματα οξέων και άλλων υγρών αντιδραστηρίων Πολλά οξέα και αντιδραστήρια, παρέχονται στη μορφή διαλυμάτων για τα οποία η συσκευασία αναφέρει το μοριακό βάρος της ουσίας (ΜΒ), την πυκνότητα του διαλύματος (d) και την επί τοις εκατό περιεκτικότητα του αντιδραστηρίου (% w/w). Στις περιπτώσεις αυτές, για την παρασκευή διαλύματος του αντιδραστηρίου συγκεκριμένης μοριακότητας και κανονικότητας πρέπει πρώτα να υπολογιστεί η μοριακότητα και η κανονικότητα του μητρικού διαλύματος που διατίθεται στο εμπόριο: Ο τρόπος υπολογισμού δίνεται παρακάτω με τη βοήθεια ενός παραδείγματος: Για το υδροχλωρικό οξύ (HCl) γνωρίζουμε ότι διατίθεται στο εμπόριο υπό τη μορφή διαλύματος περιεκτικότητας 37% (w/w) και πυκνότητας d=1.19 Κg/lt. Επίσης, το ΜΒ του HCl είναι

5 ΑΣΚΗΣΗ 1 η Από τον ορισμό της πυκνότητας προκύπτει ότι: d = Μ / V => B = V x d (Εξίσωση 5) Συνεπώς ένα λίτρο διαλύματος HCl έχει μάζα 1000 x 1.19 = 1190 gr Επειδή η περιεκτικότητα του διαλύματος είναι 37%, η καθαρή μάζα του HCl σε ένα λίτρο διαλύματος είναι: m HCl = 1190 x 37% = gr Η Μοριακότητα του διαλύματος υπολογίζεται με βάση τον τύπο 1: Μ HCl = 440 / ( x 1 lt) = mol / lt Και η Κανονικότητα δίνεται από τον τύπο 2: Ν HCl = (440 x 1) / ( x 1lt) = N Γνωρίζοντας την κανονικότητα και τη μοριακότητα του μητρικού διαλύματος HCl, μπορούμε να παρασκευάζουμε οποιοδήποτε διάλυμα του οξέος εφαρμόζοντας την μέθοδο της αραίωσης (Εξίσωση 4). Ιονική δύναμη διαλυμάτων ηλεκτρολυτών Η ιονική δύναμη ενός διαλύματος ισούται με το ημιάθροισμα των συγκεντρώσεων όλων των ιόντων που βρίσκονται στο διάλυμα πολλαπλασιασμένες επί το τετράγωνο του σθένους του αντίστοιχου ιόντος. 2 Ιονική δύναμη = ½ Σ i c i z i (Εξίσωση 6) Η ιονική δύναμη δίνει ένα μέτρο του ηλεκτρικού πεδίου του διαλύματος. Στις περιπτώσεις ασθενών ηλεκτρολυτών θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη και ο βαθμός διάστασης. Ρυθμιστικά διαλύματα Ο ρόλος των ρυθμιστικών διαλυμάτων στην πραγματοποίηση βιοχημικών δοκιμών είναι ουσιώδης, καθώς δημιουργούν και διατηρούν την βέλτιστη τιμή του ph για την λειτουργία των υπό μελέτη βιομορίων. Όπως είναι γνωστό, ρυθμιστικά διαλύματα είναι τα διαλύματα που έχουν την ιδιότητα να διατηρούν το ph τους σταθερό κατά την προσθήκη μικρών ποσοτήτων οξέων ή βάσεων. Η ιδιότητα αυτή των ρυθμιστικών διαλυμάτων είναι καθοριστικής σημασίας για την in vitro μελέτη των βιομορίων, καθώς η πραγματοποίηση των βιοχημικών διεργασιών απαιτεί περιβάλλον καθορισμένου και σταθερού ph. Τα ρυθμιστικά διαλύματα είναι μίγματα ασθενών οξέων με τα αντίστοιχα άλατα τους (π.χ. μίγμα οξικού οξέος με οξικό νάτριο) ή ασθενών βάσεων με τα αντίστοιχα άλατα τους. Η τιμή ph ενός ρυθμιστικού διαλύματος οξέος με το αντίστοιχο άλας, δίνεται από την εξίσωση των Henderson-Hasselbalch, η γενική μορφή της οποίας είναι: - 3 -

6 ΑΣΚΗΣΗ 1 η ph = pk a + log([βάση]/[οξύ]) (Εξίσωση 7) Όπου, pk είναι ο αρνητικός δεκαδικός λογάριθμος της σταθεράς διάστασης της του οξέος ή της βάσης, και [βάση], [οξύ] είναι η συγκέντρωση της ουσίας που παίζει το ρόλο βάσης ή οξέος, αντίστοιχα. Στην περίπτωση του ρυθμιστικού διαλύματος οξικού οξέος/οξικού νατρίου έχουμε: Σε αυτό το ρυθμιστικό διάλυμα, το οξικό οξύ έχει το ρόλο του ασθενούς οξέως, ενώ το οξικό ανιόν έχει το ρόλο της βάσης. Από τη σχέση 7 προκύπτει ότι το ph του ρυθμιστικού διαλύματος είναι συνάρτηση του λόγου των συγκεντρώσεων [βάση], [οξύ] και όχι των αριθμητικών τους τιμών. Συνεπώς, το ph παραμένει σταθερό ακόμα και μετά την αραίωση του ρυθμιστικού διαλύματος. Στην περίπτωση όπου [βάση] = [οξύ], από την εξίσωση 7 προκύπτει ότι : ph = pk a Σε αυτή την περιοχή τιμών ph, το ρυθμιστικό διάλυμα έχει την μεγαλύτερη ρυθμιστική ικανότητα. Στη συνήθη εργαστηριακή πρακτική, τα ρυθμιστικά διαλύματα θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε περιοχές ph που βρίσκονται μέχρι μία μονάδα από την τιμή pka (ph = pka ± 1). Εκτέλεση της άσκησης Απαιτούμενα Υλικά Αντιδραστήρια Στερεό ΝαΟΗ Ένυδρο στερεό οξικό νάτριο (CH 3COONa.3H 2O) Πυκνό οξικό οξύ (CH 3COOΗ) Στερεό NaCl Εξοπλισμός Πιπέτες γυάλινες Ποτήρι ζέσεως Μαγνητικός αναδευτήρας Ηλεκτρονικός ζυγός ακριβείας - 4 -

7 ΑΣΚΗΣΗ 1 η Πειραματική διαδικασία Α) Παρασκευή διαλυμάτων 10 mm και 10 μμ NaCl 1) Παρασκευάστε 100 ml διαλύματος 10 mm ΝaCl (MB NaCl=58.44) Για την παρασκευή 100 ml 10 mm NaCl απαιτούνται: mol NaCl = M x V = 0.01 M x 0.1 lt = mol NaCl Συνεπώς, η ποσότητα στερεού NaCl που θα πρέπει να ζυγίσουμε είναι: mnacl = molnacl x MB NaCl = x = gr NaCl Άρα, για την παρασκευή 100 ml διαλύματος 10 mm NaCl: Ζυγίζουμε gr NaCl Διαλύουμε την ποσότητα του NaCl σε 90 ml απιονισμένο νερό με τη βοήθεια μαγνητικού αναδευτήρα. Συμπληρώνουμε με απιονισμένο νερό μέχρι τελικό όγκο 100 ml. 2) Παρασκευάστε 100 ml διαλύματος 10 μμ ΝaCl (MB NaCl=58.44) Αντίστοιχα με το παραπάνω διάλυμα, μπορούμε να υπολογίσουμε ότι για την παρασκευή 100 ml διαλύματος 10 μμ NaCl χρειάζεται να ζυγίσουμε gr NaCl. Οι ηλεκτρονικοί ζυγοί ακριβείας που συνήθως είναι διαθέσιμοι στο εργαστήριο Βιοχημείας έχουν ακρίβεια μέχρι τέταρτο δεκαδικό του γραμμαρίου (0.0001). Συνεπώς δεν διαθέτουν την απαιτούμενη ακρίβεια για τη ζύγιση της παραπάνω ποσότητας. Στις περιπτώσεις αυτές τα διαλύματα παρασκευάζονται με την αραίωση πυκνότερων μητρικών διαλυμάτων. Στη συγκεκριμένη περίπτωση ως μητρικό διάλυμα θα χρησιμοποιηθεί το διάλυμα 10 mm NaCl που παρασκευάστηκε προηγουμένως. Από τον τύπο της αραίωσης (εξίσωση 4) προκύπτει: V 1 x C 1 = V 2 x C 2 V 1 = (0.1 lt x 10-5 M) / 10-2 M = 10-4 lt = 0.1 ml Άρα, για την παρασκευή 100 ml διαλύματος 10 μm NaCl: Αναμιγνύουμε 0.1 ml μητρικού διαλύματος 10 mm NaCl και 90 ml απιονισμένου νερού. Συμπληρώνουμε με απιονισμένο νερό μέχρι τελικό όγκο 100 ml. Β) Παρασκευή διαλύματος 1M οξικού οξέος (CH 3COOΗ) 1) Παρασκευάστε 100 ml διαλύματος 1Μ οξικού οξέος Από τη συσκευασία του οξικού οξέος γνωρίζουμε ότι: ΜΒ CH3COOH=60.05 και d CH3COOH=1.053 gr/cm 3 Για την παρασκευή 100 ml 1 M CH 3COOΗ απαιτούνται: mol CH3COOΗ = M x V = 1 M x 0.1 lt = 0.1 mol CH 3COOΗ - 5 -

8 ΑΣΚΗΣΗ 1 η Συνεπώς, ο όγκος του πυκνού CH 3COOΗ που θα χρησιμοποιηθεί δίνεται από την σχέση: V CH3COOΗ = (mol CH3COOΗ x MB CH3COOΗ) / d CH3COOΗ = (0.1 mol x 60.05) / = 5.7 ml Άρα, για την παρασκευή 100 ml διαλύματος 1 Μ CH 3COOΗ: Αναμιγνύουμε 5.7 ml πυκνού CH 3COOΗ με 90 ml απιονισμένο νερό. Συμπληρώνουμε με απιονισμένο νερό μέχρι τελικό όγκο 100 ml. Γ) Παρασκευή ρυθμιστικού διαλύματος οξικού οξέος 1) Παρασκευάστε 100 ml ρυθμιστικού διαλύματος οξικού οξέος 0.2 Μ ph 5 Δίνονται: MB CH3COONa.3H2O = 136, K CH3COOΗ = 1.74x10-5. Με την εφαρμογή της εξίσωσης των Henderson-Hasselbalch (εξίσωση 7) μπορούμε να υπολογίσουμε την αναλογία συγκεντρώσεων [βάση]/[οξύ] ή ([CH 3COO - ]/[CH 3COOH]) (βλέπε σελ. 4). ph = pk a + log([ch 3COO - ]/[CH 3COOH]) Η τελική συγκέντρωση του αδιάστατου CH 3COOH και των ανιόντων CH 3COO - θα πρέπει να είναι 0.2 Μ. Συνεπώς, αν [CH 3COO - ] = x, τότε [CH 3COOΗ] = 0.2-x και 4.5 = log[x/(0.2-x)] x = Άρα: [CH 3COO - ] = Μ και [CH 3COOH] = Μ Για την παρασκευή 100 ml διαλύματος απαιτούνται: 0.1 lt x M = mol CH 3COO lt x M = mol CH 3COOH Όπως είναι γνωστό η συγκέντρωση του CH 3COO - προέρχεται σχεδόν εξ ολοκλήρου από τη διάσταση του CH 3COONa. Άρα: m CH3COONa = mol CH3COONa x MB CH3COONa = 1.7 gr Αντίστοιχα, η συγκέντρωση του CH 3COOH προέρχεται σχεδόν εξ ολοκλήρου από το αδιάστατο οξικό οξύ. Άρα V CH3COOΗ = (mol CH3COOΗ x MB CH3COOΗ) / d CH3COOΗ = ( x 60.05)/1.053 = 0.42 ml Άρα, για την παρασκευή 100 ml ρυθμιστικού διαλύματος οξικού οξέος 0.2Μ ph 5.0: Ζυγίζουμε 1.7 gr CH 3COONa.3H 2O. Διαλύουμε την ποσότητα σε 90 ml απιονισμένο νερό με τη βοήθεια μαγνητικού αναδευτήρα. Προσθέτουμε 0.42 ml πυκνό οξικό οξύ. Συμπληρώνουμε με απιονισμένο νερό μέχρι τελικό όγκο 100 ml

9 ΑΣΚΗΣΗ 2 η ΑΣΚΗΣΗ 2 η : Χρωματογραφικοί Διαχωρισμοί Πρωτεϊνών Γενικά Η χρήση χρωματογραφικών μεθόδων για τον διαχωρισμό βιολογικών μιγμάτων στα επιμέρους συστατικά τους ανάγεται στις αρχές του 20ου αιώνα όταν ο ρώσος βοτανολόγος Mikhail Tswett χρησιμοποίησε στερεούς προσροφητές για το διαχωρισμό στα συστατικά του διαλύματος φυτικών χρωστικών. Η νέα μέθοδος ονομάστηκε χρωματογραφία (Chromatography) πιθανότατα εξαιτίας των έγχρωμων ζωνών που σχηματίζονταν κατά τον διαχωρισμό των συστατικών του μίγματος κατά την κίνηση του διάμεσω του προσροφητή. Στις μέρες μας οι σύγχρονες μέθοδοι διαχωρισμού βιολογικών μιγμάτων στηρίζονται σε πολύ μεγάλο βαθμό στις χρωματογραφικές διαδικασίες. Παρά την ύπαρξη μεγάλου αριθμού παραλλαγών, όλα τα συστήματα χρωματογραφίας αποτελούνται από τη στατική και την κινητή φάση. Η κινητή φάση αποτελείται από το βιολογικό μίγμα (πρωτεϊνών ή μεταβολιτών), το οποίο είναι διαλυμένο σε κάποιο υγρό ή αέριο μέσο. Το διάλυμα που προκύπτει διοχετεύεται διαμέσω ενός πορώδους υδρόφιλου πολυμερούς (φορέας), στο οποίο φέρεται ακινητοποιημένο κάποιο μικρό μόριο, πήκτωμα ή στερεό, το οποίο αποτελεί τη στατική φάση. Το σύμπλοκο φορέα και στατικής φάσης ονομάζεται προσροφητής. Ο διαχωρισμός των συστατικών της κινητής φάσης επιτυγχάνεται μέσω της αλληλεπίδρασης των μεμονωμένων μορίων που την αποτελούν με την στατική φάση. Η αλληλεπίδραση αυτή έχει ως αποτέλεσμα την κίνηση των μορίων της κινητής φάσης με διαφορετική ταχύτητα διαμέσω του προσροφητή, η οποία εξαρτάται από τις φυσικοχημικές ιδιότητες τους. Συνεπώς εάν το βιολογικό μίγμα ξεκινήσει την κίνηση του διαμέσω του προσροφητή υπό την μορφή στενής ζώνης, οι διαφορικές δυνάμεις συγκράτησης που επιδρούν σε κάθε συστατικό κατά την διάρκεια της κίνησης του, έχουν ως αποτέλεσμα το διαχωρισμό τους σε διακριτές ζώνες (Σχήμα 1). Ο διαχωρισμός των χρωματογραφικών συστημάτων γίνεται με βάση διάφορα χαρακτηριστικά της στατικής και της κινητής φάσης. α) Χρωματογραφία στήλης Ο προσροφητής βρίσκεται πακτωμένος σε μορφή στήλης (Σχήμα 1). β) Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας Η στατική φάση επικάθεται σε κατάλληλο στερεό επίπεδο υπόβαθρο, συνήθως πλαστικό, μεταλλικό ή γυάλινο πλακίδιο

10 ΑΣΚΗΣΗ 2 η Σχήμα 1: Σχηματική αναπαράσταση ενός τυπικού συστήματος χρωματογραφίας στήλης. γ) Χρωματογραφία χάρτου Η στατική φάση σχηματίζεται από ένα φύλλο κυτταρίνης το οποίο εμβαπτίζεται σε κατάλληλο διαλύτη. Επιπλέον, τα χρωματογραφικά συστήματα μπορούν να διαχωριστούν ανάλογα με τη φύση της κινητής και στατικής φάσης. Για παράδειγμα, στην αέρια-υγρή χρωματογραφία η κινητή και στατική φάση βρίσκονται σε αέρια και υγρή μορφή, αντίστοιχα. Τέλος τα χρωματογραφικά συστήματα διαχωρίζονται ανάλογα με τη φύση των κυρίαρχων αλληλεπιδράσεων μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης. Η αλληλεπίδραση μεταξύ στατικής και κινητής φάσης μπορεί να έχει είτε τη μορφή προσρόφησης των μορίων της κινητής φάσης στη στατική, είτε τη μορφή διαφορικής κατανομής των μορίων που επιθυμούμε να διαχωρίσουμε μεταξύ κινητής και στατικής φάσης. Σύμφωνα με αυτό το διαχωρισμό τα κυριότερα είδη χρωματογραφίας είναι τα ακόλουθα: - 8 -

11 ΑΣΚΗΣΗ 2 η Α) Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής Ο διαχωρισμός των βιομορίων (πχ. Πρωτεΐνες) κατά τη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής (Ion Exchange Chromatography) γίνεται με βάση το φορτίο τους και βασίζεται στην ανάπτυξη ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των φορτίων της επιφάνειας των πρωτεϊνών και φορτισμένων χημικών ομάδων, οι οποίες βρίσκονται ακινητοποιημένες πάνω σε ένα αδρανές πολυμερές υλικό υπό τη μορφή σφαιριδίων (ιοντοανταλλάκτης). Ανάλογα με το πρόσημο του φορτίου που φέρουν, οι ιοντοανταλλάκτες διακρίνονται σε: α) ανιοντοανταλλάκτες, οι οποίοι φέρουν θετικό φορτίο, και β) κατιοντοανταλλάκτες, οι οποίοι φέρουν αρνητικό φορτίο. Οι συνηθέστερα χρησιμοποιούμενοι ιοντανταλλάκτες αναφέρονται στον Πίνακα 1. Πίνακας 1: Οι συνηθέστερα χρησιμοποιούμενοι τύποι ιοντοανταλλακτών Ονομασία Τύπος Ιονιζόμενη ομάδα Χαρακτηριστικά Dowex 1 Ισχυρά βασική ρητίνη Χ-CH2N + (CH3)3 Ανιοντοανταλλάκτης πολυστηρενίου Dowex 50 Ισχυρά όξινη ρητίνη πολυστηρενίου Χ-SO3 - Κατιονοανταλλάκτης DEAE-Cellulose Διαιθυλαμινοαιθυλ- Βασικό πολυμερές Ανιονοανταλλάκτης. Χρησιμοποιείται για το ομάδα κυτταρίνης διαχωρισμό όξινων και ουδέτερων πρωτεϊνών -CH2CH2N + (C2H5)2 CM-Cellulose Κατιονοανταλλάκτης Όξινο πολυμερές Μεθυλοκαρβόξυλ-ομάδα Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό βασικών κυτταρίνης -CH2COO - και ουδέτερων πρωτεϊνών P-cellulose Όξινο πολυμερές Φωσφορική ομάδα κυτταρίνης -OPO3H2 Διβασικός κατιονοανταλλάκτης DEAE-Sephadex Διαιθυλαμινοαιθυλ- Ανιονοανταλλάκτης. Βασικό πολυμερές ομάδα Συνδυασμός χρωματογραφίας δεξτράνης -CH2CH2N + (C2H5)2 ιοντοανταλλαγής και μοριακού ηθμού CM-Sephadex Κατιονοανταλλάκτης. Όξινο πολυμερές Μεθυλοκαρβόξυλ-ομάδα Συνδυασμός χρωματογραφίας δεξτράνης -CH2COO - ιοντοανταλλαγής και μοριακού ηθμού Bio-Gel CM 100 Κατιονοανταλλάκτης. Όξινο πήκτωμα Μεθυλοκαρβόξυλ-ομάδα Συνδυασμός χρωματογραφίας πολυακρυλαμίδης -CH2COO - ιοντοανταλλαγής και μοριακού ηθμού - 9 -

12 ΑΣΚΗΣΗ 2 η Κατά τη διαδικασία της χρωματογραφίας ιοντοανταλλαγής, ιόντα που βρίσκονται δεσμευμένα στο ιοντοανταλλάκτη αντικαθίστανται κατά αντιστρέψιμο τρόπο από τα φορτισμένα βιομόρια που βρίσκονται στην κινητή φάση της χρωματογραφίας. Στην περίπτωση ανιονοανταλλάκτη η διαδικασία αναπαριστάται από την αντίδραση: R + H - + B - R + B - + A - Όπου, R + H - ο ανιονοανταλλάκτης και B - το ανιόν που βρίσκεται στην κινητή φάση. Όταν ένα βιολογικό δείγμα που αποτελείται από φορτισμένα μακρομόρια περάσει μέσα από ένα ανιονοανταλλάκτη τα αρνητικά φορτισμένα πολυανιόντα δεσμεύονται στον προσροφητή αφήνοντας τα πολυκατιόντα να περάσουν από τη στήλη. Αντίθετα, ο κατιονοανταλλάκτης δεσμεύει τα πολυκατιόντα αφήνοντας τα αρνητικά φορτισμένα μόρια να περάσουν από τη στήλη (Σχήμα 2). Η ισχύς της ηλεκτροστατικής αλληλεπίδρασης ενός φορτισμένου βιομορίου σε ένα ιοντοαναλλάκτη εξαρτάται από το είδος και τη συγκέντρωση των υπολοίπων ιόντων στο διάλυμα, εξαιτίας του Σχήμα 2: Σχηματική αναπαράσταση ενός τυπικού συστήματος χρωματογραφίας ιοντοανταλλαγής με τη χρήση κατιοντοανταλλάκτη

13 ΑΣΚΗΣΗ 2 η ανταγωνισμού μεταξύ των ιόντων για την κατάλληψη των θέσεων του ιοντοανταλλάκτη. Επιπλέον, η ισχύς της αλληλεπίδρασης των πολυιόντων εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το ph του διαλύματος καθώς η τιμή του καθορίζει το πρόσημο και την απόλυτη τιμή του τελικού φορτίου του. Για το λόγο αυτό, στην περίπτωση διαχωρισμού πρωτεϊνών είναι απαραίτητη η γνώση του ισοηλεκτρικού σημείου της πρωτεΐνης που επιθυμούμε να απομονώσουμε έτσι ώστε να γνωρίζουμε το φορτίο της σε συγκεκριμένες τιμές ph. Από τα παραπάνω γίνεται φανερό ότι οι τιμές της ιοντικής ισχύος και του ph θα πρέπει να επιλέγονται τέτοιες ώστε η πρωτεΐνη στόχος να δεσμεύεται στο κατά περίπτωση ιοντοανταλλάκτη. Η έκλουση της πρωτεΐνης από τη στήλη, μπορεί να γίνει με την διοχέτευση στη στήλη ενός ρυθμιστικού διαλύματος με ιοντική ισχύ και ph τέτοιο που να μειώνεται η ισχύς της αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης στόχου. Φυσικά είναι δυνατό η πρωτεΐνη στόχος να εκλούεται μαζί με άλλες πρωτεΐνες σε συγκεκριμένες συνθήκες ph και ιοντικής ισχύος. Για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα η χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής χρησιμοποιείται συνήθως σε συνδυασμό με άλλες χρωματογραφικές μεθόδους (συγγενείας ή μοριακού ηθμού). Β) Χρωματογραφία συγγένειας Ένα από τα ιδιαιτέρα χαρακτηριστικά των πρωτεϊνών είναι η ικανότητα τους να δεσμεύουν εκλεκτικά συγκεκριμένα μόρια. Η ιδιότητα αυτή χρησιμοποιείται για την απομόνωση πρωτεϊνών στόχων από σύνθετα βιολογικά δείγματα με τη μέθοδο της χρωματογραφίας συγγένειας (Affinity Chromatography). Με βάση την τεχνική αυτή, ένα μόριο το οποίο αναφέρεται ως δεσμευτής (Ligand), το οποίο έχει την ιδιότητα να δεσμεύεται εκλεκτικά από την πρωτεΐνη στόχο, ακινητοποιείται ομοιοπολικά σε ένα αδρανές πορώδες πολυμερές το οποίο έχει τη μορφή σφαιριδίων. Όταν ένα βιολογικό δείγμα περάσει διαμέσω της στήλης του προσροφητή συγγένειας, η πρωτεΐνη στόχος δεσμεύεται στον ακινητοποιημένο δεσμευτή ενώ τα υπόλοιπα συστατικά του δείγματος απομακρύνονται από τη στήλη με τη ροή του ρυθμιστικού διαλύματος (Σχήμα 3). Τέλος, η πρωτεΐνη στόχος εκλούεται από τη στήλη με την αλλαγή του ρυθμιστικού διαλύματος έτσι ώστε να ασθενήσουν οι δυνάμεις αλληλεπίδρασης μεταξύ της πρωτεΐνης στόχου και του δεσμευτή. Η έκλουση συνήθως επιτυγχάνεται με κατάλληλη ρύθμιση του ph και της ιοντικής ισχύος του διαλύματος έκλουσης. Εναλλακτικά, η πρωτεΐνη στόχος μπορεί να απομακρυνθεί από το δεσμευτή με την προσθήκη ενός μορίου το οποίο αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη στόχο με τρόπο που να μειώνει την συγγένεια της με το δεσμευτή ή ακόμα και με τη προσθήκη περίσσειας του ίδιου του δεσμευτή τα μόρια του οποίου θα αντικαταστήσουν τα μόρια του ακινητοποιημένου δεσμευτή στη θέση αλληλεπίδρασης με την πρωτεΐνη. Το μεγαλύτερο πλεονέκτημα της τεχνικής είναι ο πολύ μεγάλος βαθμός εξειδίκευσης που παρουσιάζει σε σύγκριση με τις άλλες χρωματογραφικές

14 ΑΣΚΗΣΗ 2 η Σχήμα 3: Σχηματική αναπαράσταση ενός τυπικού συστήματος χρωματογραφίας συγγενείας όπου η έκλουση της πρωτεΐνης στόχου επιτυγχάνεται με την προσθήκη στο διάλυμα έκλουσης περίσσειας μορίων δεσμευτή. μεθόδους. Αυτό οφείλεται στο ότι η μέθοδος διαχωρισμού βασίζεται σε μοναδικές βιοχημικές ιδιότητες της πρωτεΐνης στόχου και όχι σε γενικά φυσικοχημικά χαρακτηριστικά της. Γ) Χρωματογραφία μοριακού ηθμού Στη χρωματογραφία μοριακού ηθμού (Molecular Sieve Chromatography, Gel Filtration Chromatography, Size Exclusion Chromatography) ο διαχωρισμός ενός μείγματος πρωτεϊνών στα συστατικά του γίνεται με βάση το μέγεθος και το σχήμα των επιμέρους πρωτεϊνών. Η στατική φάση αποτελείται από σφαιρίδια ενός υδρόφιλου πορώδους και αδρανούς πολυμερούς. Οι πόροι των σφαιριδίων καλύπτουν ένα σχετικά μικρό εύρος μοριακών μεγεθών, το οποίο αποτελεί σημαντικό κατασκευαστικό χαρακτηριστικό του χρωματογραφικού υλικού. Κατά την κίνηση του

15 ΑΣΚΗΣΗ 2 η Σχήμα 4: Σχηματική αναπαράσταση ενός τυπικού συστήματος χρωματογραφίας μοριακού ηθμού όπου η έκλουση των πρωτεϊνών γίνεται κατά σειρά μεγέθους. Οι μεγαλύτερες πρωτεΐνες συλλέγονται στα πρώτα κλάσματα που συλλέγονται από τη στήλη ενώ οι μικρότερες πρωτεΐνες συλλέγονται στα μετέπειτα κλάσματα. βιολογικού δείγματος δια μέσω της στήλης που περιέχει τα παραπάνω σφαιρίδια, οι πρωτεΐνες που έχουν μέγεθος μεγαλύτερο από το μέγιστο μέγεθος πόρων των σφαιριδίων θα αποκλειστούν από το εσωτερικό των σφαιριδίων και θα κινηθούν μόνο στον ελεύθερο χώρο μεταξύ των σφαιριδίων. Συνεπώς, οι μεγαλύτερες πρωτεΐνες θα κινηθούν γρηγορότερα διαμέσω της στήλης από τις μικρότερες οι οποίες έχουν την ικανότητα να κινηθούν και στο χώρο του εσωτερικού των σφαιριδίων. Η μοριακή μάζα του μικρότερου μορίου το οποίο δεν έχει την ικανότητα να εισέλθει στο εσωτερικό των σφαιριδίων καλείται όριο αποκλεισμού (exclusion limit). Το μέγεθος αυτό είναι σε κάποιο βαθμό και συνάρτηση του σχήματος της πρωτεΐνης, καθώς επιμήκη μόρια, τα οποία διαθέτουν μεγαλύτερη ακτίνα ενυδάτωσης, είναι λιγότερο πιθανό να εισέλθουν στο εσωτερικών των πόρων σε σχέση με σφαιρικά πολυπεπτίδια της ίδιας μοριακής μάζας. Η συμπεριφορά ενός πολυπεπτιδίου το οποίο κινείται διαμέσω της στήλης είναι δυνατό να περιγραφεί ποσοτικά. Αν V x είναι ο όγκος ο οποίος καταλαμβάνεται από τα σφαιρίδια του

16 ΑΣΚΗΣΗ 2 η χρωματογραφικού υλικού και V o ο ελεύθερος όγκος της στήλης μεταξύ των σφαιριδίων, τότε ο συνολικό όγκος της στήλης (V t) δίνεται από τον τύπο: V t = V x + V o Συνήθως ισχύει ότι V o = 35% V t Ο όγκος ρυθμιστικού διαλύματος με τον οποίο εκλούεται από τη στήλη μία πρωτείνη καλείται (όγκος έκλουσης, V e). Ο ελεύθερος όγκος (V o) της στήλης υπολογίζεται εύκολα ως ο όγκος του ρυθμιστικού διαλύματος στον οποίο εκλούονται οι πρωτεΐνες με μοριακή μάζα μεγαλύτερη από το όριο αποκλεισμού του χρωματογραφικού υλικού. Συνεπώς, η συμπεριφορά μιας πρωτείνης είναι δυνατό να αποδοθεί από το σχετικό όγκο έκλουσης V e/v o, ο οποίος δεν εξαρτάται από το χρωματογραφικό υλικό που χρησιμοποιείται. Από τα παραπάνω γίνεται φανερό, ότι για τις πρωτεΐνες η μοριακή μάζα των οποίων είναι μικρότερη από το όριο αποκλεισμού, ισχύει ο γενικός κανόνας ότι η έκλουση τους από τη στήλη θα γίνει κατά σειρά μεγέθους, με τις μεγαλύτερες να εκλούονται νωρίτερα από τις μικρότερες. Ο διαχωρισμός αυτός επιτυγχάνεται καθώς το μέγεθος των πόρων των σφαιριδίων ποικίλλει μέσα σε συγκεκριμένα όρια. Συνεπώς, τα μικρότερα μόρια έχουν τη δυνατότητα να κινηθούν σε μεγαλύτερο όγκο στο εσωτερικό των σφαιριδίων από τα μεγαλύτερα, με συνέπεια να καθυστερούν να εξέλθουν από τη στήλη και να εμφανίζουν μεγαλύτερο σχετικό όγκο έκλουσης σε σχέση με τα μεγαλύτερα (Σχήμα 4). Εκτός από την εφαρμογή της μεθόδου στον διαχωρισμό μιγμάτων πρωτεϊνών στα συστατικά τους, η χρωματογραφία μοριακού ηθμού βρίσκει εφαρμογή στον προσδιορισμό της μοριακής μάζας πρωτεϊνών. Ο προσδιορισμός στηρίζεται στην ύπαρξη γραμμικής σχέσης μεταξύ του σχετικού όγκου έκλουσης της πρωτεΐνης στόχου και του λογαρίθμου της μοριακής μάζας της. Για το σκοπό αυτό κατασκευάζεται πρότυπη καμπύλη αναφοράς με τον υπολογισμό του σχετικού όγκου έκλουσης πολυπεπτιδίων γνωστής μοριακής μάζας, για συγκεκριμένο κάθε φορά χρωματογραφικό υλικό. Τα πλέον συνηθισμένα υλικά που χρησιμοποιούνται για την κατασκευή των σφαιριδίων είναι η δεξτράνη (dextran, μεγάλης μοριακής μάζας πολυμερές της γλυκόζης που παράγεται από το βακτήριο Leuconostoc mesenteroides), η αγαρόζη (agarose, φυσικό γραμμικό πολυμερές D- γαλακτόζης και 3,6-ανυδρο-L-γαλακτόζης) και το πολυακρυλαμίδιο (polyacrylamide, τεχνητό πολυμερές ακρυλαμιδίου και N,N-μεθυλενο-δις-ακρυλαμιδίου). Κάθε χρωματογραφικό υλικό που διατίθεται στο εμπόριο χαρακτηρίζεται από το μέγεθος των πόρων των σφαιριδίων, μέγεθος που καθορίζει και το εύρος διαχωρισμού που επιτυγχάνει. Το πορώδες κάθε υλικού αποτελεί κατασκευαστικό χαρακτηριστικό. Για τα σφαιρίδια δεξτράνης καθορίζεται από τη μοριακή μάζα και την εισαγωγή ομάδων γλυκερινικού αιθέρα, που συνδέουν υδροξύλια γειτονικών αλυσίδων

17 ΑΣΚΗΣΗ 2 η Πίνακας 2: Υλικά που χρησιμοποιούνται στη χρωματογραφία μοριακού ηθμού Εμπορική ονομασία Τύπος Εύρος Διαχωρισμού (kda) Sephadex G-10 Dextran Sephadex G-25 Dextran 1 5 Sephadex G-50 Dextran 1 30 Sephadex G-75 Dextran 3 70 Sephadex G-100 Dextran Sephadex G-150 Dextran Sephadex G-200 Dextran Bio-Gel P-2 Polyacrylamide Bio-Gel P-6 Polyacrylamide 1 6 Bio-Gel P-10 Polyacrylamide Bio-Gel P-30 Polyacrylamide Bio-Gel P-100 Polyacrylamide Bio-Gel P-300 Polyacrylamide Sepharose 6B Agarose Sepharose 4B Agarose Sepharose 2B Agarose Στην περίπτωση του πολυακρυλαμιδίου, το πορώδες των σφαιριδίων ρυθμίζεται από το βαθμό πολυμερισμού και την περιεκτικότητα σε N,N-μεθυλενο-δις-ακρυλαμίδιο. Η επιλογή του κατάλληλου χρωματογραφικού υλικού αποτελεί καθοριστικό παράγοντα για τον επιτυχή διαχωρισμό και πρέπει να γίνεται με τρόπο ώστε οι μοριακές μάζες των πρωτεϊνών που επιθυμούμε να διαχωρίσουμε να βρίσκονται μέσα στο εύρος διαχωρισμού του υλικού. Στον πίνακα 2 αναφέρονται τα πλέον χρησιμοποιούμενα υλικά στη χρωματογραφία μοριακού ηθμού, καθώς και το αντίστοιχο εύρος διαχωρισμού. Εκτέλεση της άσκησης Απαιτούμενα Υλικά Αντιδραστήρια Βιολογικά υλικά Εναιώρημα σφαιριδίων χρωματογραφικού υλικού Sephadex G-50. Υαλοβάμβακας. Ρυθμιστικό διάλυμα (25 mm HEPES ph 7.0). Μείγμα πρωτεϊνών. Εξοπλισμός Υάλινη στήλη με στένωση στο κάτω άκρο

18 ΑΣΚΗΣΗ 2 η Βάση στήριξης. Στατώ. Σωλήνες eppendorf. Ποτήρι ζέσεως. Γυάλινες πιπέτες. Πειραματική διαδικασία Α) Διαχωρισμός πρωτεϊνών με την μέθοδο της χρωματογραφίας μοριακού ηθμού Το κάτω μέρος της στήλης φράσσεται με ένα μικρό κομμάτι υαλοβάμβακα. Η στήλη τοποθετείται στη βάση στήριξης και προστίθεται το εναιώρημα G-50 με την βοήθεια γυάλινης πιπέτας μέχρι να σχηματιστεί στήλη ύψους 2 cm. Η προσθήκη πρέπει να γίνεται υπό γωνία ώστε να αποφεύγεται ο εγκλωβισμός φυσαλίδων αέρα στο εσωτερικό της στήλης. Η στήλη εξισορροπείται με την προσθήκη 5 όγκων ρυθμιστικού διαλύματος. Ιδιαίτερη προσοχή απαιτείται για την αποφυγή του στεγνώματος της στήλης. Μόλις απομακρυνθεί το ρυθμιστικό διάλυμα από τη στήλη προστίθενται 50 μl δείγματος πρωτεϊνών στην κορυφή της στήλης. Μόλις το δείγμα εισέρθει πλήρως στο εσωτερικό της στήλης, αρχίζει η διαδικασία έκλουσης των πρωτεϊνών με την συνεχή προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος. Ταυτόχρονα με την προσθήκη του ρυθμιστικού διαλύματος, συλλέγονται 5 διαδοχικά κλάσματα έκλουσης των 500 μl από την έξοδο της στήλης, σε σωλήνες eppendorf. Για τον προσδιορισμό του κλάσματος έκλουσης στο οποίο εντοπίζονται οι πρωτεΐνες πραγματοποιείται προσδιορισμός της συγκέντρωσης πρωτεΐνης σε κάθε κλάσμα με τη μέτρηση απορρόφησης στα 280 nm ή τη μέθοδο Bradford (βλέπε Ασκήσεις 3 και 4) και ανάλυση μέρος του κλάσματος με ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτική πηκτή πολυακρυλαμιδίου

19 ΑΣΚΗΣΗ 3 η ΑΣΚΗΣΗ 3 η : Φωτομετρία Γενικά Η τεχνική της φωτομετρίας χρησιμοποιείται ευρύτατα στο εργαστήριο Βιοχημείας για τον ποσοτικό προσδιορισμό ενώσεων βιολογικών μεγαλομορίων. Η ευρύτατη εφαρμογή της μεθόδου οφείλεται κυρίως στην ταχύτητα, την απλότητα και την ακρίβεια που την χαρακτηρίζουν. Η τεχνική στηρίζεται στην ιδιότητα ορισμένων ουσιών που βρίσκονται διαλυμένες σε κατάλληλο διαλύτη, να απορροφούν ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία συγκεκριμένου μήκους κύματος (λ). Τα μήκη κύματος που χρησιμοποιούνται περιλαμβάνουν την περιοχή του ορατού ( nm), του υπεριώδους ( nm) και του εγγύς υπερύθρου ( nm). Η ποσότητα του φωτός που απορροφάται από μία ουσία στα παραπάνω μήκη κύματος, δίνεται από το φάσμα απορρόφησης της ουσίας. Το φάσμα απορρόφησης αποτελεί χαρακτηριστικό κάθε ουσίας και καθορίζεται από την χημική δομή της. Στο σχήμα 1 παρουσιάζεται το φάσμα απορρόφησης της ριβοφλαβίνης. Το συγκεκριμένο φάσμα απορρόφησης παρουσιάζει ένα μέγιστο στην ορατή περιοχή του φάσματος (450 nm) και σε αυτό οφείλεται το κίτρινο χρώμα που λαμβάνουν τα διαλύματα της ριβοφλαβίνης. Τα δύο άλλα μέγιστα που εμφανίζονται στην περιοχή του υπεριώδους (260 και 370 nm) δεν γίνονται αντιληπτά από το ανθρώπινο μάτι. Η ποσοτική φωτομετρική ανάλυση βασίζεται στον συνδυασμό των νόμων των Lambert και Beer. Σύμφωνα με τον πρώτο, το ποσοστό του προσπίπτοντος φωτός που απορροφάται από ένα μέσο, είναι ανεξάρτητο της έντασης του και κάθε διαδοχική μονάδα στοιβάδας του μέσου απορροφά ίσο κλάσμα φωτός με την προηγούμενη και την επόμενη. Στη γενικευμένη του μορφή, ο νόμος του Beer αναφέρει ότι η απορρόφηση του φωτός που διέρχεται από ένα διάλυμα είναι ανάλογη του αριθμού των μορίων της ουσίας που απορροφά το φως. Από τον συνδυασμό των παραπάνω νόμων προκύπτει το ποσοστό του φωτός που Σχήμα 1: Φάσμα απορρόφησης της ριβοφλαβίνης (συγκέντρωση 22 μμ σε 0.1 Μ φωσφορικού νατρίου pη 7,06 και μήκος κυψελίδας 1 cm)

20 ΑΣΚΗΣΗ 3 η απορροφάται από ένα διάλυμα εξαρτάται από την συγκέντρωση της διαλυμένης ουσίας και το μήκος της διαδρομής του φωτός μέσα από το διάλυμα. Η μαθηματική έκφραση του νόμου Lambert και Beer δίνεται από την παρακάτω εξίσωση: log(i o/i) = A = ε c l (εξίσωση 1) Όπου: Ι ο: η ένταση του προσπίπτοντος στο διάλυμα φωτός Ι: η ένταση του εξερχόμενου από το διάλυμα φωτός ε: Συντελεστής μοριακής απόσβεσης της ουσίας. Ο συντελεστής αυτός αποτελεί χαρακτηριστικό μέγεθος για κάθε ουσία για συγκεκριμένο μήκος κύματος. c: Συγκέντρωση της διαλυμένης ουσίας. l: Το μήκος διαδρομής του φωτός για μέσα από το διάλυμα (οπτική διαδρομή). Ο δεκαδικός λογάριθμος το πηλίκου I o/i καλείτε απορρόφηση (Α, Absorbance), ή οπτική πυκνότητα (OD, Optical Density). Από την εξίσωση 1 προκύπτει ότι για δεδομένο μήκος κύματος και σταθερή οπτική διαδρομή, η απορρόφηση είναι συνάρτηση της συγκέντρωσης του διαλύματος. Με αυτό τον τρόπο, μετρώντας την απορρόφηση ενός διαλύματος και γνωρίζοντας το συντελεστή μοριακής απόσβεσης της διαλυμένης ουσίας σε συγκεκριμένο μήκος κύματος, είναι εύκολο να υπολογιστεί η συγκέντρωση της διαλυμένης ουσίας. Στις περιπτώσεις που δεν είναι γνωστός, ο συντελεστής μοριακής απόσβεσης μπορεί να υπολογιστεί με την μέτρηση της απορρόφησης διαλυμάτων γνωστής συγκέντρωσης της ουσίας και την κατασκευή πρότυπης καμπύλης αναφοράς. Η μέτρηση της απορρόφησης γίνεται με τη χρήση εξειδικευμένου οργάνου που ονομάζεται φωτόμετρο. Στο σχήμα 2 παρουσιάζονται τα βασικά μέρη και το διάγραμμα λειτουργίας ενός τυπικού φωτόμετρου. Πηγή φωτός: Ως πηγή φωτός χρησιμοποιούνται μία ή περισσότερες λυχνίες οι οποίες είναι ικανές να εκπέμπουν σταθερή φωτεινή ακτινοβολία σε όλο το εύρος του ηλεκτρομαγνητικού Σχήμα 2: Φάσμα απορρόφησης της ριβοφλαβίνης (συγκέντρωση 22 μμ σε 0.1 Μ φωσφορικού νατρίου pη 7,06 και μήκος κυψελίδας 1 cm)

21 ΑΣΚΗΣΗ 3 η φάσματος που απαιτείται για την ανάλυση. Για ακτινοβολία στην περιοχή του ορατού και του εγγύς υπέρυθρου ( nm) τα περισσότερα όργανα χρησιμοποιούν λυχνίες βολφραμίου ρυθμιζόμενης σταθερής τάσης. Για μετρήσεις στην περιοχή του υπεριώδους ( nm) χρησιμοποιούνται λυχνίες δευτερίου. Επιλογέας μήκους κύματος (μονοχρωμάτορας): Η φωτομετρία απαιτεί μετρήσεις σε συγκεκριμένο μήκος κύματος. Για το σκοπό αυτό τα φωτόμετρα φέρουν ένα μηχανισμό ο οποίος αποτελείται από ένα ή περισσότερα φίλτρα ή πρίσματα, σκοπός του οποίου είναι ο αποκλεισμός της ακτινοβολίας με μικρότερα και μεγαλύτερα μήκη κύματος από το επιθυμιτό, που παράγονται από τη φωτεινή πηγή. Το μήκος κύματος που χρησιμοποιείται για τη μέτρηση τις περισσότερες φορές ταυτίζεται με το μήκος κύματος στο οποίο η μετρούμενη ουσία παρουσιάζει την μέγιστη απορρόφηση (λ max). Βέβαια, αυτό δεν είναι πάντα απαραίτητο καθώς ο νόμος του Beer ισχύει για όλα τα μήκη κύματος στα οποία η μετρούμενη ουσία παρουσιάζει απορρόφηση. Η επιλογή διαφορετικού μήκους κύματος από το λ max επιβάλλεται στις περιπτώσεις όπου η μέτρηση στο συγκεκριμένο μήκος κύματος παρεμποδίζεται από την ύπαρξη άλλων ουσιών στο δείγμα ή της φωτοδιάσπασης της ουσίας στο συγκεκριμένο μήκος κύματος. Σχισμή (Διάφραγμα, slit): Ο ρόλος της σχισμής είναι η ρύθμιση της έντασης του φωτός (I o) που εκπέμπεται από το μονοχρωμάτορα, έτσι ώστε να μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την μέτρηση. Στα απλά όργανα η σχισμή έχει σταθερό εύρος, ενώ τα πλέον προηγμένα όργανα χρησιμοποιούν μηχανισμό μεταβλητού εύρους. Δοκιμαστικοί σωλήνες ή Κυψελίδες: Το δείγμα προς μέτρηση τοποθετείται σε ειδικούς δοκιμαστικούς σωλήνες ή κυψελίδες των οποίων οι διαστάσεις είναι γνωστές, καθώς το μήκος της οπτικής διαδρομής του φωτός μέσω του δείγματος υπεισέρχεται στο νόμο των Lambert και Beer (εξίσωση 1). Στις περισσότερες κυψελίδες το μήκος της οπτικής διαδρομής είναι 1 cm χωρίς να αποκλείονται μικρότερα ή μεγαλύτερα μήκη. Κατασκευάζονται συνήθως από γυαλί ή πλαστικό, ενώ για μετρήσεις στην περιοχή του υπεριώδους χρησιμοποιούνται ειδικές χαλαζιακές κυψελίδες. Ανιχνευτής φωτός (Φωτοπολλαπλασιαστής): Το εξερχόμενο από το δείγμα φως (Ι) μετριέται από τα φωτόμετρα με τη χρήση φωτοβολταϊκού κυττάρου ή σωλήνα κενού. Στην πρώτη περίπτωση το φως μετριέται από ένα ευαίσθητο ημιαγωγό (π.χ. σελήνιο) που βρίσκεται ανάμεσα σε δύο διάφανα μεταλλικά φύλλα και μία πλάκα σιδήρου. Τα φωτόνια που προσπίπτουν δημιουργούν ροή ηλεκτρονίων από το σελήνιο προς το σίδηρο, δημιουργώντας ρεύμα το οποίο είναι ανάλογο με την ένταση του φωτός που προσπίπτει. Οι σωλήνες κενού περιλαμβάνουν δύο ηλεκτρόδια μεταξύ των οποίων δημιουργείται διαφορά δυναμικού. Τα φωτόνια που προσπίπτουν στην κάθοδο απελευθερώνουν ηλεκτρόνια τα οποία συλλέγονται από την άνοδο δημιουργώντας ρεύμα το οποίο

22 ΑΣΚΗΣΗ 3 η είναι και σε αυτή την περίπτωση ανάλογο της προσπίπτουσας ακτινοβολίας. Το παραγόμενο ρεύμα μετριέται και στις δύο περιπτώσεις από αμπερόμετρο. Εκτέλεση της άσκησης Απαιτούμενα Υλικά Αντιδραστήρια Βιολογικά υλικά Απιονισμένο νερό Διάλυμα γονιδιωματικού DNA του λ βακτηριοφάγου Διάλυμα ολικού RNA από φύλλα του φυτού Arabidopsis thaliana Διάλυμα μονόκλωνων ολιγονουκλεοτιδίων DNA Εξοπλισμός Σωλήνες eppendorf Μηχανικές ρυθμιζόμενες πιπέτες Κυψελίδες χαλαζία Φασματοφωτόμετρο υπεριώδους Πειραματική διαδικασία Α) Προσδιορισµός της συγκέντρωσης και της καθαρότητας λ DNA 10 μλ από το δείγμα γονιδιωματικού DNA του λ βακτηριοφάγου μεταφέρονται σε σωλήνα eppendorf, όπου και αραιώνονται µε dh2o σε αναλογία 1:100. Μετά την αραίωση το δείγμα τοποθετείται σε ειδική κυψελίδα χαλαζία και προσδιορίζεται η οπτική πυκνότητα του δείγματος σε μήκη κύματος 240, 260 και 280 nm. Πριν από κάθε μέτρηση το φωτόμετρο πρέπει να μηδενίζεται στο αντίστοιχο μήκος κύματος με την χρήση απιονισμένου νερού χωρίς δείγμα DNA. Σε υδατικά διαλύματα, χωρίς την παρουσία άλλων προσμίξεων, όπως πρωτεΐνες και πολυσακχαρίδια, η συγκέντρωση του δίκλωνου DNA στο αρχικό δείγμα δίνεται από την εξίσωση: C dsdna (μg/ml) = 50 x OD260 x συντελεστής αραίωσης όπου: ΟD260, η οπτική πυκνότητα του δείγματος στα 260 nm. Για την εκτίμηση της καθαρότητας του δίκλωνου DNA υπολογίζεται ο λόγος OD260/OD280 και ΟD240/OD260. Όταν οι τιμές τους είναι 1,8-2,0 και 0,5, αντίστοιχα, τότε το δείγμα θεωρείται ικανοποιητικής καθαρότητας

23 ΑΣΚΗΣΗ 3 η Β) Προσδιορισµός της συγκέντρωσης και της καθαρότητας ολικού RNA 10 μλ από το δείγµα ολικού RNA από φύλλα του φυτού Arabidopsis thaliana μεταφέρονται σε σωλήνα eppendorf, όπου και αραιώνονται µε dh2o σε αναλογία 1:100. Μετά την αραίωση το δείγμα τοποθετείται σε ειδική κυψελίδα χαλαζία και προσδιορίζεται η οπτική πυκνότητα του δείγματος σε μήκη κύματος 240, 260 και 280 nm. Πριν από κάθε μέτρηση το φωτόμετρο πρέπει να μηδενίζεται στο αντίστοιχο μήκος κύματος με την χρήση απιονισμένου νερού χωρίς δείγμα RNA. Σε υδατικά διαλύματα, χωρίς την παρουσία άλλων προσμίξεων, όπως πρωτεΐνες και πολυσακχαρίδια, η συγκέντρωση του μονόκλωνου RNA στο αρχικό δείγμα δίνεται από την εξίσωση: C ssrna (μg/ml) = 40 x OD260 x συντελεστής αραίωσης όπου: ΟD260, η οπτική πυκνότητα του δείγματος στα 260 nm. Για την εκτίμηση της καθαρότητας του δείγματος RNA υπολογίζεται ο λόγος OD260/OD280 και ΟD240/OD260. Όταν οι τιμές τους είναι 1,8-2,0 και 0,5, αντίστοιχα, τότε το δείγμα θεωρείται ικανοποιητικής καθαρότητας. Β) Προσδιορισμός της συγκέντρωσης και της καθαρότητας ολιγονουκλεοτιδίων DNA 10 μλ από το δείγμα ολιγονουκλεοτιδίων μεταφέρονται σε σωλήνα eppendorf, όπου και αραιώνονται µε dh2o σε αναλογία 1:100. Μετά την αραίωση το δείγμα τοποθετείται σε ειδική κυψελίδα χαλαζία και προσδιορίζεται η οπτική πυκνότητα του δείγματος σε μήκη κύματος 240, 260 και 280 nm. Πριν από κάθε μέτρηση το φωτόμετρο πρέπει να μηδενίζεται στο αντίστοιχο μήκος κύματος με την χρήση απιονισμένου νερού χωρίς δείγμα ολιγονουκλεοτιδίων. Σε υδατικά διαλύματα, χωρίς την παρουσία άλλων προσμίξεων, όπως πρωτεΐνες και πολυσακχαρίδια, η συγκέντρωση μονόκλωνων ολιγονουκλεοτιδίων DNA στο αρχικό δείγμα δίνεται από την εξίσωση: C oligodna (μg/ml) = 30 x OD260 x συντελεστής αραίωσης όπου: ΟD260, η οπτική πυκνότητα του δείγματος στα 260 nm. Για την εκτίμηση της καθαρότητας του δείγματος υπολογίζεται ο λόγος OD260/OD280 και ΟD240/OD260. Όταν οι τιμές τους είναι 1,8-2,0 και 0,5, αντίστοιχα, τότε το δείγμα θεωρείται ικανοποιητικής καθαρότητας

24 ΑΣΚΗΣΗ 4 η ΑΣΚΗΣΗ 4 η : Προσδιορισμός Συγκέντρωσης Ολικών Πρωτεινών κατά Bradford Γενικά Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης ολικών πρωτεϊνών σε ένα βιολογικό δείγμα αποτελεί καθημερινό ερώτημα στο βιοχημικό εργαστήριο. Για το σκοπό αυτό έχουν αναπτυχθεί διάφορες μέθοδοι όπως η μέθοδος Lowry, η μέθοδος Beardens, η μέθοδος της διουρίας και η μέθοδος Bradford. Από τις παραπάνω μεθόδους, η μέθοδος κατά Βradford είναι η πλέον χρησιμοποιούμενη, καθώς έχει μια σειρά από πλεονεκτήματα όπως η ευκολία πραγματοποιήσεως και η σχετικά καλή ακρίβεια που παρέχει. Η μέθοδος βασίζεται στην ιδιότητα της χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G-250 να αλλάζει το μήκος κύματος όπου παρουσιάζει τη μέγιστη απορρόφηση όταν αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες σε όξινο περιβάλλον. Συγκεκριμένα η ελεύθερη χρωστική παρουσιάζει μέγιστο απορρόφησης στα 465 nm ενώ μετά την αλληλεπίδραση το μέγιστο απορρόφησης εμφανίζεται στα 595 nm. Οπτικά η αλληλεπίδραση εμφανίζεται ως αλλαγή χρώματος της χρωστικής από καστανό σε γαλάζιο. Η χρωστική Coomassie Brilliant Blue G-250 δεσμεύεται κυρίως στις πλευρικές αλυσίδες : α) Αρωματικών αμινοξέων (Τυροσίνη, Φαινυλαλανίνη, Τρυπροφάνη) β) Βασικών αμινοξέων (Αργινίνη, Λυσίνη, Ιστιδίνη) Η αλληλεπίδραση με την αργινίνη είναι η ισχυρότερη, ενώ λιγότερο ισχυρές είναι οι αλληλεπιδράσεις με την ιστιδίνη, λυσίνη, τυροσίνη, τρυπτοφάνη και φαινυλαλανίνη. Πρακτικά ο προσδιορισμός γίνεται με την μέτρηση της απορρόφησης στα 595 nm με τη χρήση φωτόμετρου, ενώ η ποσοτικοποίηση βασίζεται στην κατασκευή πρότυπης καμπύλης αναφοράς με τη μέτρηση της απορρόφησης διαλυμάτων γνωστής συγκέντρωσης πρωτεΐνης. Η μετρούμενη απορρόφηση ακολουθεί γραμμική σχέση με τη συγκέντρωση πρωτεΐνης για εύρος συγκεντρώσεων mg/ml. Για μέτρηση μεγαλύτερων συγκεντρώσεων τα δείγματα θα πρέπει να αραιώνονται κατάλληλα

25 ΑΣΚΗΣΗ 4 η Εκτέλεση της άσκησης Απαιτούμενα Υλικά Αντιδραστήρια Βιολογικά υλικά Μητρικό διάλυμα χρωστικής Bradford [100 mg χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G- 250, 100 ml πυκνού φωσφορικού οξέος (85% w/w), 100 ml υδατικού διαλύματος μεθανόλης (50% v/v)] Διάλυμα εργασίας Bradford (Αραίωση του μητρικού διαλύματος χρωστικής Bradford με απιονισμένο νερό σε αναλογία 1 προς 4. Το διάλυμα το φτιάχνουμε σε σκοτεινό δοχείο και μπορούμε να το διατηρήσουμε σε θερμοκρασία δωματίου για 24 h. Μητρικό διάλυμα BSA (0.2 mg/ml) Δείγμα πρωτεϊνών Εξοπλισμός Σωλήνες eppendorf Μηχανικές ρυθμιζόμενες πιπέτες Κυψελίδες Parafilm Φασματοφωτόμετρο Πειραματική διαδικασία Α) Κατασκευή πρότυπης καμπύλης αναφοράς Η πρότυπη καμπύλη αναφοράς πρέπει να κατασκευάζεται κάθε φορά που παρασκευάζεται νέο μητρικό διάλυμα χρωστικής Bradford. Για την κατασκευή της πρότυπης καμπύλης αναφοράς, σε 6 κυψελίδες του 1ml προστίθενται 950μl διάλυμα εργασίας Bradford, και μl μητρικού διαλύματος BSA, αντίστοιχα. Τέλος, συμπληρώνεται τελικός όγκος 1 ml με απιονισμένο νερό (Πίνακας 1). Για κάθε αραίωση BSA πραγματοποιούνται 3 επαναλήψεις.. Πίνακας 1: Προετοιμασία δειγμάτων για την κατασκευή της πρότυπης καμπύλης αναφοράς. Χειρισμός Διάλυμα εργασίας Αραίωση mg πρωτεΐνης/ml dh (μl) 2O(μl) BSA BSA τελικού δείγματος Μάρτυρας :5 0, :5 0, :5 0, :5 0, ,

26 ΑΣΚΗΣΗ 4 η Οι κυψελίδες καλύπτονται με ένα μικρό κομμάτι parafilm και αναδεύονται. Τα δείγματα επωάζονται σε θερμοκρασία δωματίου σε σκοτεινό μέρος για min. Το φασματοφωτόμετρο μηδενίζεται με τη βοήθεια του δείγματος μάρτυρα. Για κάθε ένα από δείγματα λαμβάνεται η απορρόφηση στα 595 nm. Η πρότυπη καμπύλη αναφοράς κατασκευάζεται με βάση την απορρόφηση που μετρήθηκε ως προς την συγκέντρωση σε πρωτεΐνη του τελικού δείγματος. Παρακάτω παρουσιάζεται ένα παράδειγμα πρότυπης καμπύλης αναφοράς. Η κλίση της καμπύλης αναφοράς 2,6 αντιστοιχεί στον συντελεστή απόσβεσης ε. Chart Title 0,600 0,500 y = 2,6029x + 0,0123 R 2 = 0,9908 0,400 ABS 0,300 0,200 0,100 0,000 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 C (mg/ml) Β) Μέτρηση της συγκέντρωσης σε πρωτεΐνη των άγνωστων δειγμάτων Για τον προσδιορισμό άγνωστου δείγματος πρωτεΐνης σε κυψελίδα προσθέτουμε 950μl διάλυμα εργασίας Bradford και 50 μl διαλύματος πρωτεΐνης. Το δείγμα πρωτεΐνης θα πρέπει να έχει αραιωθεί κατάλληλα ώστε η ποσότητα πρωτεΐνης στην κυψελίδα να μην υπερβαίνει τα 2-10 μg πρωτεΐνης. Με τον τρόπο αυτό τα δείγματα θα βρίσκονται εντός του εύρους της καμπύλης αναφοράς. Τέλος, για κάθε δείγμα πραγματοποιούνται 2 ανεξάρτητες μετρήσεις. Οι κυψελίδες καλύπτονται με ένα μικρό κομμάτι parafilm και αναδεύονται. Τα δείγματα επωάζονται σε θερμοκρασία δωματίου σε σκοτεινό μέρος για min. Το φασματοφωτόμετρο μηδενίζεται με τη βοήθεια δείγματος μάρτυρα. Για κάθε ένα από δείγματα λαμβάνεται η απορρόφηση στα 595 nm

27 ΑΣΚΗΣΗ 4 η Η συγκέντρωση του δείγματος σε πρωτεΐνη υπολογίζεται με βάση την πρότυπη καμπύλη αναφοράς εφαρμόζοντας τον τύπο ABS = ε x l x c. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι αξιόπιστες θεωρούνται οι μετρήσεις κατά τις οποίες η απορρόφηση κυμαίνεται από 0,100 έως 0,500. Αν η συγκέντρωση πρωτεΐνης είναι μεγαλύτερη αραιώνουμε κατάλληλα το αρχικό μας δείγμα

28 ΑΣΚΗΣΗ 5 η ΑΣΚΗΣΗ 5 η : Φυγοκέντρηση Γενικά Η φυγοκέντρηση είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται στο εργαστήριο Βιοχημείας για το διαχωρισμό μεγαλομορίων, υποκυτταρικών οργανιδίων και κυττάρων με τη βοήθεια της φυγοκέντρου δύναμης. Αν θεωρήσετε ένα δοχείο με εναιώρημα άμμου σε νερό, από την εμπειρία γνωρίζουμε ότι τα σωματίδια της άμμου θα καθιζάνουν στον πυθμένα του δοχείου ωθούμενα από την βαρύτητα (επιτάχυνση της βαρύτητας g=9.81 m s 2 ). Σε ένα διάλυμα μακρομορίων όμως, τα αιωρούμενα μακρομόρια δεν εμφανίζουν αισθητή καθίζηση καθώς εμποδίζονται από τις τυχαίες θερμικές κινήσεις (κίνηση Brown). Η καθίζηση των μεγαλομορίων γίνεται αισθητή μόνο όταν ασκείται πάνω τους επιτάχυνση κατά πολύ μεγαλύτερη από ένα g. Οι επιταχύνσεις αυτές στο εργαστήριο επιτυγχάνονται με τη χρήση της τεχνικής της φυγοκέντρησης όπου η καθίζηση των μεγαλομορίων επιτυγχάνεται μέσω της φυγοκέντρου δύναμης που ασκείται λόγω της περιστροφής του δείγματος με τη χρήση της φυγοκέντρου. Η τεχνική αυτή χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά το 1923 από το Σουηδό βιοχημικό The Svedberg. Η φυγόκεντρος δύναμη που ασκείται σε ένα σωματίδιο με μάζα m το οποίο περιστρέφεται με γωνιακή ταχύτητα ω σε ακτίνα r από τον άξονα περιστροφής, δίνεται από τον τύπο: F φυγκοκέντρησης = mω 2 r (εξίσωση 1) Η τελική δύναμη καθίζησης που ασκείτε στο αντικείμενο ισούται με την F φυγκοκέντρησης μείον την δύναμη της άνωσης που ασκείται στο σωματίδιο από το διάλυμα στο οποίο βρίσκεται. F καθίζησης = mω 2 r V pρω 2 r (εξίσωση 2) Όπου V ρ ο όγκος του σωματιδίου και ρ η πυκνότητα του διαλύματος. Εκτός από τη δύναμη της άνωσης μια επιπλέον δύναμη που αντιτίθεται στην καθίζηση του σωματιδίου είναι η δύναμη της τριβής που ασκείται πάνω του κατά την κίνηση του μέσα στο διάλυμα. Η δύναμη αυτή ισούται με: F τριβής = f(dr/dt) (εξίσωση 3) Όπου, f ο συντελεστής τριβής ο οποίος εξαρτάται από το κινούμενο σωματίδιο (για σφαιρικά σωματίδια ισχύει f = 6πηr m, όπου η το ιξώδες του διαλύματος και r m η ακτίνα του σωματιδίου) και dr/dt ο ρυθμός καθίζησης εκφρασμένος ως αλλαγή της ακτίνας περιστροφής με το χρόνο. Από τα παραπάνω προκύπτει ότι ένα σωματίδιο το οποίο βρίσκεται μέσα σε φυγοκεντρικό πεδίο θα επιταχύνει μέχρι η φυγόκεντρος δύναμη να γίνει ίση με το άθροισμα της άνωσης και της τριβής: F φυγκοκέντρησης = V pρω 2 r + f(dr/dt) (εξίσωση 4)

29 ΑΣΚΗΣΗ 5 η Πίνακας 1: Ενδεικτικές τιμές του συντελεστή καθίζησης (s 20,w) για διάφορες πρωτεΐνες, ιούς και υποκυτταρικά οργανίδια. Βιολογικά Υλικά Μοριακή μάζα (kda) Συντελεστής καθίζησης, s20,w (S) Ριβονουκλεάση Α 6,7 1,14 Κυτόχρωμα c 12,6 2,00 Αφυδρογονάση του γλουταμινικού ,60 Ευκαρυωτικά Ριβοσώματα 80 Πολυσώματα Βακτηριοφάγος Τ Μικροσώματα Μιτοχόνδρια Από τις παραπάνω εξισώσεις προκύπτει ότι κάθε σωματίδιο που βρίσκεται μέσα σε φυγοκεντρικό πεδίο χαρακτηρίζεται από συγκεκριμένο ρυθμό καθίζησης. Συνεπώς για κάθε σωματίδιο ορίζεται ο συντελεστή καθίζησης (s, sedimentation coefficient) o οποίος εκφράζει την οριακή ταχύτητα που αποκτά το σωματίδιο για δεδομένη γωνιακή ταχύτητα και δίνεται από τη σχέση: s = v / ω 2 r ή με αντικατάσταση: s = M(1-V s ρ) / N f (εξίσωση 5) Όπου, v η ταχύτητα καθίζησης (dr/dt), Ν ο αριθμός του Avogadro, Vs ο μερικός σχετικός όγκος του σωματιδίου (η μεταβολή του όγκου κατά τη διάλυση 1 gr σε άπειρο όγκο διαλύτη). Ο Σχήμα 1: Σχηματική αναπαράσταση τυπικής φυγοκέντρησης με καθίζηση ταχύτητας. Ο ρυθμός καθίζησης για δεδομένη γωνιακή ταχύτητα (ω) εξαρτάται από το συντελεστή καθίζησης (s) κάθε βιολογικού υλικού. Σε τυπικές συνθήκες φυγοκέντρησης, μόρια με μικρό συντελεστή καθίζησης παραμένουν σε αιώρημα

30 ΑΣΚΗΣΗ 5 η συντελεστής καθίζησης ορίζεται σε μονάδες Svedberg (S), ένα S ισούται με sec. Ο συντελεστής καθίζησης για κάθε μεγαλομόριο ή υποκυτταρικό οργανίδιο προσδιορίζεται στους 20 o C και σε διαλύτη με την πυκνότητα και το ιξώδες του νερού (s 20,w) Στον πίνακα 1 αναφέρονται οι συντελεστές καθίζησης για διάφορα υποκυτταρικά οργανίδια και πρωτεΐνες. Στην εργαστηριακή πρακτική, όταν ένα βιολογικό δείγμα βρεθεί μέσα σε ένα φυγοκεντρικό πεδίο, τότε τα διάφορα βιολογικά υλικά που το αποτελούν καθιζάνουν με ταχύτητα που εξαρτάται από το συντελεστή καθίζησης. Συνεπώς, βιολογικά υλικά με μεγαλύτερο συντελεστή καθίζησης κινούνται ταχύτερα από βιολογικά υλικά με μικρότερο συντελεσή με συνέπεια να σχηματίζονται χαρακτηριστικές ζώνες διαχωρισμού (Σχήμα 1). Η τεχνική αυτή ονομάζεται Φυγοκέντρηση με Καθίζηση Ταχύτητας. Αναλυτική Φυγοκέντρηση Η μοριακή μάζα (Μ) ενός μεγαλομορίου η υποκυτταρικού οργανιδίου είναι δυνατό να υπολογιστεί εάν μετρηθεί η συντελεστής καθίζησης (s) και είναι γνωστός ο συντελεστής τριβής του (f). Πράγματι, από την εξίσωση 5 προκύπτει με αντικατάσταση: Μ = s N f / (1-V s ρ) (εξίσωση 6) Ο προσδιορισμός του ρυθμού καθίζησης γίνεται με τη βοήθεια οπτικών διατάξεων. Η τεχνική της αναλυτικής φυγοκέντρησης χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό των μοριακών μαζών σχετικά μεγάλων βιολογικών συμπλόκων. Τα τελευταία χρόνια όμως τείνει να αντικατασταθεί από άλλες μεθόδους όπως η χρωματογραφία μοριακού ηθμού. Φυγοκέντρηση Βαθμίδωσης Πυκνότητας Κατά την τεχνική της Φυγοκέντρησης Βαθμίσωσης Πυκνότητας ο διαχωρισμός ενός βιολογικού δείγματος στα επιμέρους συστατικά τους γίνεται είτε με βάση το συντελεστή καθίζησης και την πυκνότητα τους. Αρχικά το δείγμα αποτίθεται πάνω σε στήλη η οποία περιέχει ένα διάλυμα σακχαρόζης ή γλυκερόλης του οποίου η πυκνότητα μεταβάλλεται γραμμικά ή εκθετικά με το ύψος. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2Α, τα σωματίδια και μεγαλομόρια που αποτελούν το βιολογικό δείγμα κατά τη φυγοκέντρηση ακολουθούν του κανόνες της καθίζησης ταχύτητας. Η αυξανόμενη πυκνότητα διευκολύνει την κλασματοποίηση, έτσι ώστε κάθε στοιβάδα να είναι ελεύθερη από την λιγότερο πυκνή που είναι από επάνω και την πυκνότερη που βρίσκεται από κάτω. Παραλλαγή της μεθόδου αποτελεί η Φυγοκέντρηση Εξισορρόπησης σε Βαθμίδωση Πυκνότητας. Στη μέθοδο αυτή η βαθμίδωση πυκνότητας επιτυγχάνεται με τη χρήση πυκνών αλάτων (πχ. CsCl). Η διαβάθμιση πυκνότητας επιτυγχάνεται κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρηση του διαλύματος σε υψηλές ταχύτητες, ενώ το εύρος πυκνοτήτων που προκύπτει καλύπτει το εύρος πυκνοτήτων των

31 ΑΣΚΗΣΗ 5 η Σχήμα 2: Α) Σχηματική αναπαράσταση τυπικής φυγοκέντρησης σε βαθμίδωση πυκνότητας σακχαρόζης ή γλυκερόλης. Η καθίζηση ακολουθεί γενικά τους κανόνες της φυγοκέντρησης ταχύτητας με τη διαφορά ότι η διαβάθμιση πυκνότητας υποβοηθά το διαχωρισμό. Β) Σχηματική αναπαράσταση τυπικής φυγοκέντρησης εξισορρόπισης σε βαθμίδωσαη πυκνότητας. Η βαθμίδωση πυκνότητας δημιουργείτε κατά τη φυγοκέντρηση σε υψηλές στροφές. Τα συστατικά του βιολογικού δείγματος ισορροπούν στην περιοχή όπου η πυκνότητα του διαλύματος εξισώνεται με τη δική τους. βιολογικών υλικών. Το βιολογικό δείγμα είτε εφαρμόζεται στην κορφή της στήλης είτε απ απευθείας στο εσωτερικό της στήλης και υφίσταται μακροχρόνια φυγοκέντρηση ώστε τα συστατικά του να συσσωρευθούν στην περιοχή όπου η πυκνότητα της βαθμίδωσης είναι ίση με την πυκνότητα τους (Σχήμα 2Β). Στο σημείο αυτό η περαιτέρω καθίζηση σταματά καθώς o συντελεστής (1-V s ρ) γίνεται ίσος με το μηδέν. Η ζώνη που περιέχει τα σωματίδια η μεγαλομόρια που μας ενδιαφέρουν παραλαμβάνεται μετά το τέλος της φυγοκέντρησης. Η μέθοδος αυτή αποκαλείται και ισοπυκνηκή φυγοκέντρηση (isopycnic centrifugation) και χρησιμοποιείται ευρύτατα για την απομόνωση βιολογικών υλικών όπως νουκλεϊνικά οξέα, ιοί και διάφορα υποκυτταρικά οργανίδια όπως ριβοσώματα. Εκτέλεση της άσκησης Απαιτούμενα Υλικά Αντιδραστήρια Βιολογικά υλικά Υγρή καλλιέργεια του βακτηρίου Escherichia coli Υγρή καλλιέργεια του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae Εξοπλισμός Σωλήνες eppendorf Επιτραπέζια φυγόκεντρος