Ενα τυπικό πρωτόκολλο για τον καθαρισμό μιας διαλυτής κυτταρικής πρωτείνης περιλαμβάνει

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "Ενα τυπικό πρωτόκολλο για τον καθαρισμό μιας διαλυτής κυτταρικής πρωτείνης περιλαμβάνει"

Ῥούθ Κορομηλάς
7 χρόνια πριν
Προβολές:

2 Ενα τυπικό πρωτόκολλο για τον καθαρισμό μιας διαλυτής κυτταρικής πρωτείνης περιλαμβάνει Διάσπαση της κυτταρικής μεμβράνης με ομοιογενοποίηση Διαφορική φυγοκέντριση ωστε να διαχωρισθεί η πρωτεινική ενεργότητα από υποκυτταρικά σωματίδια και συσσωματωματα πρωτεινών υψηλού μοριακού βάρους Συνδυασμός τεχνικών διαχωρισμού που υπάρχουν σημερα διαθέσιμοι και βασίζονται στο φορτίο πού λαμβάνουν τα πρωτεινικά μόρια ανάλογα με το ρη του διαλύματος ή το μεγεθος του μορίου ή και σε αλλες χαρακτηριστικές ιδιότητες

3 Χρωματογραφία Με τον ορο εννοουνται οι μεθοδοι κατα τις οποίες το προς διαχωρισμό μειγμα κατανέμεται μεταξύ μιας ακίνητης και μιας μετακινουμενης φασης Συμφωνα με τον τυπο της ακίνητης φάσης διακρίνομε Χαρτοχρωματογραφία ( η ακινητη φαση είναι χαρτί) Χρωματογαφια λεπτης στοιβάδας (χρησιμοποιούνται προσροφητικά υλικά οπως σκόνη κυτταρίνης Αργίλιο κ.λπ) Χρωματογραφία Στήλης ( Τό προσροφητικό υλικό στοιβάζεται σε μια γυάλινη στήλη) Αέριος Χρωματογραφία Χρωματογραφία συγγενείας

4 Η χρωματογραφία στηλης σύμφωνα με τον τυπο τού προσροφητικού υλικού μπορεί να διακριθεί Σε ιοντοανταλλακτική Χρωματογραφία Σε χρωματογραφία μοριακής διηθησης Σε χρωματογραφία συγγενείας Η ιοντοανταλλακτική χρωματογραφία μπορεί να διακριθεί σε Α.σε ανιοντοανταλλακτική (με θετικά φορτία) Β σε κατιοντοανταλλακτική (με αρνητικαφορτία) στο ιοντοανταλλάκτη)

10 Μερικα συμπερασματα μπορούν να εξαχθούν από την εξίσωση που περιγραφει την υπερφυγοκεντριση Η ταχυτητα καθιζήσεως ενος σωματιδίου είναι ανάλογος προς την μαζα.μια πρωτεινη 200 Kda κινείται δυο φορες πιό γρηγορα από μια πρωτείνη 100 Kda που εχει το ιδιο σχημα και πυκνότητα Ενα πιο πυκνο σωματίδιο κινείται πιό γρηγορα από ενα λιγώτερο πυκνό Το σχήμα παίζει σημαντικό ρόλο μια και επηρεάζει την αντισταση που δημιουργείται από το ιξωδες.ο συντελεστης τριβής ενός συμπαγους σωματιδίου ειναι μικρότερος από οτι είναι ενός εκτεταμένου Η ταχύτητα καθιζήσεως εξαρταται επίσης από την πυκνοτητα του διαλύματος ρ vp<1 καθιζάνουν vp>1 επιπλεουν vp=1 δεν μετακινούνται v =ταχυτητα κινησεως m=μαζα σωματιδίου ρ=πυκνοτητα διαλύματος ω2r = γωνιακη ταχύτητα f=συντελεστης ιξωδους v=μερικός ειδικός ογκος του σωματιδίου

13 Οι βασικές αρχές που ισχύουν για την τεχνική περίθλασης με ακτίνες Χ είναι Τα ηλεκτρόνια περιθλούν τις ακτίνες Χ. Το πλάτος του κύματος που περιθλάται από ενα ατομο είναι ανάλογο τού αριθμού των ηλεκτρονίων που περιθλούν Τα περιθλώμενα κύματα ανασυνδυάζονται.αυτό σημαίνει οτι μπορούν να επαναισχυροποιούν το ενα το αλλο επάνω στο φιλμ εάν είναι σε φάση είτε να το εξουδετερώνουν αν βρίσκονται εκτός φάσης Ο τρόπος με τον οποίο τα περιθλώμενα κύματα ανασυνδυάζονται εξατάται μόνο από την διευθέτηση των ατόμων

19 Κατα τόν ανοσοελεγχο σταθεράς φάσεως ακολουθούνται τα εξής στάδια Αντίσωμα για την πρωτείνη που μας ενδιαφέρει προσδένεται σε αδρανές υλικό π.χ χλωριούχο πολυβινύλιο Μια σταγόνα από κυτταρικό εκχύλισμα ή ορό προστίθεται στο αδρανές υλικό πού φέρει το αντίσωμα και στην συνέχεια ξεπλένεται για να απομακρυνθεί η μη δεσμευμένη πρωτείνη Προστίθεται κατόπιν αντίσωμα για μιά άλλη θέση της πρωτείνης και ξεπλένεται το δείγμα για να απομακρυνθεί το μη δεσμευμένο δεύτερο αντίσωμα.το δευτερο αντίσωμα είναι ραδιενεργό ή φθορίζον και έτσι μπορεί να ανιχνευθεί το σύμπλεγμα

23 Πολλές μικρές ποσότητες από μια πρωτεινη στο κύτταρο υγρό μπορούν να ανιχνευθούν με μια τεχνική πού ονομαζεται westerm blotting Η τεχνική αυτή περιλαμβάνει τα εξης στάδια Το δείγμα αναλύεται σε πήκτωμα ακρυλαμίδης παρουσία SDS Οι πρωτείνες από το πήκτωμα μεταφέρονται ηλεκτροφορητικα σεπήκτωμα κυτταρίνης Προστίθεται αντίσωμα για την πρωτείνη που μας ενδιαφερει να ανιχνευσουμε Το σύμπλεγμα αντιγόνου αντισώματος ανιχνευεται πλένοντας την λωρίδα νιτροκυτταρίνης με ενα δευτερο αντίσωμα ειδικό για το πρωτο.με την βοήθεια σημανσης που υπάρχει στο δευτερο αντίσωμα ανιχνευεται τό σύμπλεγμα αντιγόνου αντισώματος

Σχετικά έγγραφα

ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ. ΑΝΝΑ-ΜΑΡΙΑ ΨΑΡΡΑ Τμήμα Βιοχημείας κ Βιοτεχνολογίας

ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΑΝΝΑ-ΜΑΡΙΑ ΨΑΡΡΑ Τμήμα Βιοχημείας κ Βιοτεχνολογίας ΑΝΝΑ-ΜΑΡΙΑ ΨΑΡΡΑ 1 ΣΥΣΤΗΜΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ Αντλία Στήλη Υγρό Έκλουσης Συλλέκτης κλασμάτων ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ