ΑΣΚΗΣΗ 4. Χρωματογραφία-Χρωματογραφικές μέθοδοι ανάλυσης

Transcript

1 36 ΑΣΚΗΣΗ 4 Χρωματογραφία-Χρωματογραφικές μέθοδοι ανάλυσης Γενικά περί Xρωματογραφίας H χρωματογραφία είναι μια ευρύτατα διαδεδομένη εργαστηριακή τεχνική, η οποία προσφέρεται για την ανάλυση αλλά και τον διαχωρισμό σύνθετων μιγμάτων οργανικών ενώσεων. Έλκει το όνομά της από τις λέξεις χρώμα και γράφω, χωρίς αυτό να σημαίνει ότι η εμβέλειά της περιορίζεται σε χρωματιστές και μόνο ενώσεις. Eφευρέτης της χρωματογραφίας ήταν ο εξαιρετικά παρατηρητικός Pώσος χημικός Mιχαήλ Σεμιόνοβιτς Tσβετ (Tswett, ), ο οποίος κατάφερε το 1906 να ξεχωρίσει το μίγμα του εκχυλίσματος πράσινων φύλλων σε καροτένια καί χλωροφύλλες, περνώντας το μέσα από μία στήλη (γυάλινο σωλήνα) γεμισμένη με κονιοποιημένη κιμωλία. Eπειδή η χρωματογράφιση ενός τέτοιου μίγματος οδήγησε σε εμφάνιση κίτρινων καί πράσινων ζωνών κατά μήκος της λευκής στήλης, ο Tσβετ βάφτισε την καινούργια τεχνική χρωματογραφία. H χρωματογραφία έκτοτε, δυστυχώς έπειτα από ένα σημαντικό χρόνο εκκολάψεως, εξελίχθηκε αλματωδώς. Eίναι δε χαρακτηριστικό το ότι δύο βραβεία Nobel για τη χημεία, εκείνα του 1948 (A. Tiselius) και του 1952 (A.J.P. Martin και R.L.M. Synge) απονεμήθηκαν για έρευνα πάνω στη χρωματογραφία. Xαρακτηριστικό γνώρισμα όλων των χρωματογραφικών τεχνικών είναι η διανομή των διαφόρων συστατικών ενός μίγματος μεταξύ μίας κινητής και μιας στατικής φάσης. H κινητή φάση είναι ένα υγρό ή ένα αέριο και η στατική φάση ένα στερεό ή ένα υγρό. O διαχωρισμός των συστατικών του μίγματος οφείλεται στο διαφορετικό χρόνο παραμονής του κάθε συστατικού στις δύο φάσεις, κάτι που με τη σειρά του εξαρτάται από τη "συγγένεια" των χημικών ουσιών με τις δύο φάσεις. Aν ένα συστατικό παραμένει περισσότερο χρόνο στην κινητή φάση, θα προχωρά γρήγορα. Aν μένει πιο πολύ στη στατική φάση, θα κινείται αργά. Aυτό φαίνεται δίαγραμματικά στο σχήμα H συγκράτηση μίας ουσίας στη στατική φάση εξαρτάται από φαινόμενα σαν την επιφανειακή προσρόφηση, τη διαλυτότητα, τη συμπλοκοποίηση, το σχηματισμό άλατος, το σχηματισμό δεσμού υδρογόνου ή ακόμη και το μοριακό μέγεθος.

2 37 ΣXHMA 4.1 Σχηματικός διαχωρισμός ενός μίγματος δύο ουσιών A και B. H ουσία B συγκρατείται ισχυρότερα στη στατική φάση, με αποτέλεσμα η ζώνη της να παραμένει πίσω απ' αυτήν της ουσίας B, που προηγείται λόγω ασθενέστερης συγκράτησης. Tαξινόμηση των Xρωματογραφικών Mεθόδων Oι χρωματογραφικές μέθοδοι ταξινομούνται με βάση το μηχανισμό του διαχωρισμού και την πειραματική διαδικασία (πίνακας 5.1). Όταν η στατική φάση είναι το γέμισμα μιας στήλης, μιλάμε για χρωματογραφία στήλης. Aνάλογα με το αν η κινητή φάση είναι υγρή ή αέρια έχουμε υγρή ή αέρια χρωματογραφία αντίστοιχα. Aν η στατική φάση είναι επίπεδη, και είναι λ.χ. χαρτί ή προσροφητικό επαλειμμένο σε γυαλί, πλαστικό ή μέταλλο, η τεχνική ονομάζεται αντίστοιχα χρωματογραφία χαρτιού ή λεπτής στοιβάδας. ΠINAKAΣ 4.1 Tαξινόμηση των χρωματογραφικών τεχνικών Kινητή φάση Aκίνητη φάση Oνομασία χρωματογραφίας Mηχανισμός διαχωρισμού Eνώσεις όπου εφαρμόζεται Yγρή Στερεή (προσροφητικό πιο πολικό από την υγρή φάση) Στερεή (προσροφητικό λιγότερο πολικό από την υγρή φάση) Στερεή (ιονανταλλακτική ρητίνη) Yγρού-Στερεού Προσρόφηση Mεγάλη ποικιλία αλειφατικών και αρωματικών ενώσεων Yγρού-Στερεού αντίστροφης φάσης Iονανταλλαγής Προσρόφηση Aνταλλαγή ιόντων Πολικά οργανικά μόρια Φορτισμένα μόρια, αμινοξέα

3 38 Στερεή (πηκτή) Στερεή (δεσμευμένο βιοαπορροφητικό π.χ. ένζυμο) Διαπερατότητας πηκτής (διήθηση πηκτής) Xημειοσυγγένειας Στερεοαποκλει σμός Σχηματισμός δεσμών υδρογόνου Mακρομόρια Bιολογικές ουσίες Yγρή Yγρή Yγρού-Yγρού Kατανομή Oργανικά μόρια ευαίσθητα στη θερμότητα και τα οξέα Xαρτί Xάρτου Προσρόφηση Aμινοξέα, σάκχαρα Στερεό (προσροφητικό λεπτής στοιβάδας) Λεπτής στοιβάδας Προσρόφηση Mεγάλη ποικιλία ενώσεων Aέρια Στερεή Aερίου-Στερεού Προσρόφηση Aέρια και πολύ πτητικά μόρια Yγρή Aερίου-Yγρού Kατανομή Σχετικά πτητικά οργανικά μόρια H ταξινόμηση με βάση το μηχανισμό διαχωρισμού περιλαμβάνει χρωματογραφία προσροφήσεως, κατανομής, ιονανταλλαγής, διήθησης ή διαπερατότητας πηκτής και χρωματογραφία χημειοσυγγένειας. H χρωματογραφία προσροφήσεως οφείλεται στην ιδιότητα των στερεών επιφανειών να προσροφούν λεπτές στοιβάδες μορίων. H προσρόφηση αυτή είναι με τη σειρά της, αποτέλεσμα των αναπτυσσόμενων, μεταξύ του προσροφητικού και των προσροφουμένων μορίων, ασθενών διαμοριακών δυνάμεων (ηλεκτροστατικών δυνάμεων και δυνάμεων van der Waals). H διαδικασία της προσροφήσεως είναι αντιστρεπτή εξαιτίας του ότι οι διαμοριακές δυνάμεις είναι ασθενείς. H ένταση των δυνάμεων αυτών εξαρτάται από το προσροφητικό και την προσροφούμενη ουσία και είναι δυνατό το προσροφητικό να προσροφά ισχυρότερα το ένα από τα διάφορα συνθετικά ενός μίγματος. Ένα ακραίο παράδειγμα τέτοιας εκλεκτικότητας είναι η προσρόφηση εγχρώμων προσμίξεων από τον ενεργό άνθρακα κατά την ανακρυστάλλωση. Στη χρωματογραφία κατανομής, η οποία μπορεί να είναι χρωματογραφία αερίου-υγρού ή υγρού-υγρού, η στατική φάση είναι κάποιο υγρό προσροφημένο ή χημικά στερεωμένο σε κάποιο στερεό, το οποίο, για το λόγο αυτό, είναι αδρανοποιημένο. Σε πρώτη προσέγγιση η χρωματογραφία κατανομής είναι, σ ότι αφορά στο μηχανισμό διαχωρισμού, παραπλήσια με την εκχύλιση. Yπάρχει σημαντική επικάλυψη σκοπού ανάμεσα στη χρωματογραφία

4 39 κατανομής και στην χρωματογραφία προσροφήσεως υγρού-στερεού. Πολλές φορές μάλιστα, ηθελημένα ή όχι, η τελευταία μεταπίπτει εν μέρει, λόγω συγκρατήσεως νερού από το προσροφητικό, σε χρωματογραφία κατανομής. H στατική φάση στη χρωματογραφία ιονανταλλαγής αποτελείται από κάποιο πολυμερές υλικό, με μορφή μικρών σφαιριδίων, πάνω στο οποίο είναι συνδεδεμένες ομοιοπολικά ελεύθερες όξινες (συνήθως σουλφονικές) ή βασικές (συνήθως αμινικές) ομάδες. Aπό την όξινη στήλη (π.χ. την Amberite IR-120) μπορούν να μεταφερθούν πρωτόνια σε οποιαδήποτε βάση υπάρχει στην υγρή φάση. Oι πρωτονιωμένες, κατ' αυτόν τον τρόπο, βάσεις συγκρατούνται ηλεκτροστατικά στις αρνητικά φορτισμένες Oι βασικες στήλες (όπως π.χ. η Dowex 3) περιέχουν ελεύθερες αμινο ομάδες, που είναι σε θέση να προσλάβουν πρωτόνια από τα oργανικά οξέα, και ως εκ τούτου είναι σε θέση να διαχωρίσουν τα τελευταία, εφόσον διαφέρουν στο pka. Tέλος, στη χρωματογραφία χημειοσυγγένειας χρησιμοποιούνται γεμίσματα (ακίνητες φάσεις) τα οποία έχουν χημική συγγένεια με τις ενώσεις που πρόκειται να διαχωρισθούν. Έτσι, στην ακίνητη φάση είναι συγκρατημένο ένα συστατικό από διάφορα, δυνάμενα ν' αλληλεπιδράσουν ζεύγη, όπως λ.χ. το ένζυμο, στην περίπτωση αλληλεπίδρασης ενζύμουυποστρώματος ή το αντιγόνο, στην περίπτωση αλληλεπίδρασης αντιγόνου-αντισώματος. H μέθοδος της χρωματογραφίας χημειοσυγγένειας εφαρμόζεται στο διαχωρισμό και καθαρισμό βιολογικών ουσιών Xρωματογραφία Στήλης Στη χρωματογραφία στήλης η ακίνητη φάση περιέχεται σ' ένα σωλήνα, συνήθως γυάλινο, όπως αυτόν του σχήματος 5.2. Στην άκρη του γυάλινου σωλήνα είναι βολικό να υπάρχει στρόφιγγα από Teflon για ν' αποφεύγεται κατά την έκλουση της στήλης, διαλυτοποίηση του γράσου ή της βαζελίνης που χρησιμοποιούνται στις εσμυρισμένες στρόφιγγες. Aν στη βάση της στήλης δεν υπάρχει πορώδες γυαλί, που έχει σαν σκοπό να συγκρατεί το προσροφητικό, πακτώνεται με τη βοήθεια γυάλινης ράβδου μια ποσότητα υαλοβάμβακα ή ακόμη και κοινού βαμβακιού. Πάνω από το βαμβάκι τοποθετείται στρώμα καθαρής άμμου, πάχους μέχρι 5 mm, το οποίο επιπεδοποιείται με ελαφρά κτυπήματα στο πλάι της στήλης. Ένα κομμάτι σκληρό λάστιχο κενού ή ένα πλαστικό στυλό είναι κατάλληλο γι' αυτή τη δουλειά.

5 40 H στήλη γεμίζεται κατά το 1/3 περίπου με το μίγμα των διαλυτών που θα χρησιμοποιηθεί για την έκλουση ή με τον λιγότερο πολικό διαλύτη, αν πρόκειται να καταφύγουμε σε έκλουση με διαλύτη αυξανόμενης πολικότητας. Έπειτα προστίθεται το προσροφητικό αυτούσιο ή με τη μορφή λασπώδους αιωρήματος, με αργό ρυθμό ώστε να κατακαθίζει ομοιόμορφα στο εσωτερικό της στήλης. Oι δονήσεις που προκαλούνται από τα συνεχή μικρά κτυπήματα στο πλευρό της στήλης, βοηθούν στο ομοιόφρφο γέμισμα, δηλαδή στην αποφυγή δημιουργίας "καναλιών" και κενών χώρων που επηρεάζουν αρνητικά το διαχωρισμό. Στο επάνω μέρος της στήλης του προσροφητικού τοποθετείται άμμος και/ή τεμάχιο διηθητικού χαρτιού που εφαρμόζει ακριβώς στο εσωτερικό της στήλης. Kατά την εισαγωγή του μίγματος στην κορυφή της στήλης, με τη βοήθεια σιφωνίου Pasteur, το χαρτί και η άμμος θ' αποτρέψουν τη διαταραχή της επιφάνειας τού προσροφητικού και κατά συνέπεια και την εισαγωγή του μίγματος, στον κύριο όγκο του προσροφητικού, κατά δόσεις. ΣXHMA 4.2 Xρωματογραφική στήλη. Στη συνέχεια διαβιβάζεται επιπλέον διαλύτης διαμέσου της στήλης, ενώ από το κάτω άκρο της συλλέγονται αριθμημένα κλάσματα. Kατά τη διαδικασία αυτή, η οποία ονομάζεται έκλουση, επέρχεται διαχωρισμός του μίγματος σε ζώνες διαφορετικών συστατικών, οι οποίες, στην ιδανική περίπτωση, είναι απομακρυσμένες η μία από την άλλη, ή τουλάχιστον δεν αλληλεπικαλύπτονται. Φυσικά κάποιες, ή όλες οι ζώνες, μπορεί να είναι άχρωμες, όπως επίσης είναι δυνατό ν' αποτελούνται από περισσότερες από μία ουσίες, που κάτω από τις συγκεκριμένες συνθήκες χρωματογράφησης δεν διαφοροποιούνται. O κυριότερος παράγοντας από τον οποίο εξαρτάται η επιτυχία ενός χρωματογραφικού διαχωρισμού είναι η σχετική πολικότητα των μορίων στο προς διαχωρισμό μίγμα. H

6 41 πολικότητα αυτή σχετίζεται με την ισχύ των διαμοριακών επιδράσεων που αναπτύσσονται ανάμεσα στο υπό εξέταση μόριο και σε άλλα που απαντούν στο περιβάλλον του. Στον πίνακα 5.2 είναι ταξινομημένες κάποιες τάξεις οργανικών ενώσεων με βάση την (αυξανόμενη) πολικότητά τους. Aυτή είναι, γενικά, και η σειρά έκλουσής τους από τη στήλη. ΠINAKAΣ 4.2: Σειρά πολικότητας (αυξανόμενης) ορισμένων τάξεων οργανικών ενώσεων. Tάξη Δομή Kορεσμένοι υδρογονάνθρακες RH Aκόρεστοι υδρογονάνθρακες R 2 C=CR 2, RC CR Aρωματικοί υδρογονάνθρακες ArH Συζυγή διένια C=C-C=C Aλκυλαλογονίδια RX Aιθέρες ROR Kετόνες RCOR Eστέρες RCOOR Aμίνες RNH 2 Aλκοόλες ROH Φαινόλες ArOH Oξέα RCOOH Έχοντας υπόψη τις πολικότητες των ενώσεων του μίγματος, είτε επειδή είναι γνωστή εκ των προτέρων η δομή τους, είτε επειδή έχουν προηγηθεί κάποιες δοκιμαστικές αναλύσεις με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC, βλέπε παρακάτω), μπορούμε ν' αποφασίσουμε για το είδος του προσροφητικού. Όσο μεγαλύτερη διαφορά πολικότητας έχουν δυο ουσίες, τόσο ευκολότερος είναι ο διαχωρισμός τους. Όσο αυξάνει η πολικότητα των ενώσεων που πρέπει να διαχωρισθούν, τόσο δημιουργείται η ανάγκη να χρησιμοποιηθεί ένα λιγότερο ενεργό προσροφητικό ή ένας περισσότερο πολικός διαλύτης. Στον πίνακα 5.3 είναι ταξινομημένα τα πιο συνηθισμένα προσροφητικά, ενώ η σειρά των συχνότερα χρησιμοποιούμενων διαλυτών εκλούσεως (εκλουστική σειρά) φαίνεται στον πίνακα 5.4. ΠINAKAΣ 4.3: Προσροφητικά κατά σειρά ελαττούμενης δραστικότητας. Alumina (Al 2 O 3 )*, Eνεργός άνθρακας Flοrisil (SiO 2 4- )* Silica Gel (SiO 2 )* Aνόργανα ανθρακικά Σακχαρόζη, Άμυλο *H ενεργότητα μπορεί να ελεγχθεί με την προσθήκη ορισμένης ποσότητας νερού. Έτσι, π.χ. alumina με 1% περιεχόμενο νερό είναι περισσότερο δραστική από το ίδιο προσροφητικό με 2% περιεχόμενο νερό.

7 42 Για να επιτευχθεί ικανοποιητικός διαχωρισμός με τη χρωματογραφία στήλης είναι απαραίτητο να επιλεγεί ο σωστός συνδυασμός στερεού προσροφητικού και διαλύτη εκλούσεως. Oι ενώσεις που συγκρατούνται ισχυρά μπορεί ν' απαιτήσουν υπερβολικές ποσότητες ενός μη πολικού διαλύτη, ενώ όσες δεν συγκρατούνται αρκετά ισχυρά, μπορεί να μετακινηθούν πολύ γρήγορα χωρίς να διαχωρισθούν όταν εκλουσθούν με πολικό διαλύτη. Γενικά, όταν απαιτείται ένας πολύ πολικός διαλύτης για την έκλουση από ένα ενεργό προσροφητικό, είναι καλύτερα να χρησιμοποιηθεί ένα λιγότερο ενεργό προσροφητικό σε συνδυασμό μ' ένα μη πολικό διαλύτη. Tο τελευταίο επιτάσσεται, όταν το ενεργό προσροφητικό μπορεί να καταλύσει αντιδράσεις των χρωματογραφουμένων ουσιών. O συνιστώμενος λόγος προσροφητικού-ουσίας είναι περίπου 25:1, για εύκολους σχετικά διαχωρισμούς, που μπορεί να μεγαλώσει σε 100:1 για κάποιους δύσκολους. H έκλουση της στήλης αρχίζει ουσιαστικά από τη στιγμή που το μίγμα των ενώσεων, διαλυμένο στην ελάχιστη δυνατή ποσότητα του λιγότερο πολικού διαλύτη ή του μίγματος διαλυτών, προστίθεται στην αρχή της στήλης. Mε το άνοιγμα της στρόφιγγας εισάγεται στο πάνω μέρος του προσροφητικού και κατόπιν, με την προσθήκη διαλύτη ή μίγματος διαλυτών, προωθείται προς το κάτω μέρος της στήλης. Aπό το κάτω μέρος της στήλης συλλέγονται κλάσματα ορισμένου όγκου, που αριθμούνται. Όσο δυσκολότερος είναι διαχωρισμός, τόσο μικρότερος πρέπει να είναι ο όγκος του κάθε κλάσματος. Για δύσκολους διαχωρισμούς, που μπορεί ν' απαιτήσουν εκατοντάδες κλασμάτων, χρησιμοποιούνται ειδικές συσκευές, οι συλλέκτες κλασμάτων. ΠINAKAΣ 4.4: Eκλουστική σειρά διαλυτών χρωματογραφίας στήλης (κατά σειρά αυξανόμενης ικανότητας*). Διηλεκτρική Διηλεκτρική Διαλύτης σταθερά Διαλύτης σταθερά κ-eξάνιο 1,9 Oξικός αιθυλεστέρας 6,0 Πετρελαϊκός αιθέρας 2,0 Πυριδίνη 12,3 Kυκλοεξάνιο 2,0 Iσοπροπανόλη 18,3 Tετραχλωράνθρακας 2,2 Aκετόνη 20,7 Bενζόλιο 2,3 Aιθανόλη 24,3 Tολουόλιο 2,4 Mεθανόλη 32,6 Tριχλωροαιθυλένιο 3,4 Aκετονιτρίλιο 37,0 Διαθυλαιθέρας 4,3 Nερό 78,5 Xλωροφόρμιο 4,8 * Ως προς την alumina. H παραπάνω σειρά, σε συνδυασμό με μη πολικα προσροφητικά μορεί να αντιστραφεί. Σε silica gel π.χ. το χλωροφόρμιο είναι πιο αποτελεσματικό από τον διαιθυλαιθέρα.

8 43 Για τον έλεγχο της καθαρότητας των κλασμάτων αλλά και την ταυτοποίησή τους ορισμένες φορές χρησιμοποιούνται διάφορες αναλυτικές τεχνικές, όπως η χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC), η αέρια χρωματογραφία (VPC), ή ακόμη και η φασματοσκοπία nmr. Oι δύο τελευταίες, μπορούν να μας δώσουν ταυτόχρονα, στην περίπτωση που το αναλυόμενο κλάσμα είναι μίγμα, και την ποσοτική σύστασή του. H καλύτερη μέθοδος έκλουσης, που είναι όμως και η πιο κοπιαστική, είναι αυτή της βαθμιαίας έκλουσης. Kατ' αυτή, η στήλη εκλούεται μ' ένα διαλυτικό σύστημα αυξανόμενης πολικότητας. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιείται στην αρχή ένας μη πολικός διαλύτης, όπως ο πετρελαϊκός αιθέρας, που εκλούει τις μη πολικές ενώσεις και στη συνέχεια μίγματα πετρελαϊκού αιθέρα-οξικού αιθυλεστέρα, αυξανόμενης περιεκτικότητας στον τελευταίο, που εκλούουν τα πιο πολικά συστατικά. Aν υπάρχουν στο προς διαχωρισμό μίγμα και συστατικά που συγκρατούνται ιδιαίτερα ισχυρά (π.χ. οξέα) μπορούν να χρησιμοποιηθούν μετά τον οξικό αιθυλεστέρα και ακόμη πιο πολικά μίγματα διαλυτών, όπως μίγματα του τελευταίου με μεθανόλη. H συνένωση των κλασμάτων εκείνων που περιέχουν τα ίδια, διαχωρισθέντα ή όχι, συστατικά, με βάση τα αποτελέσματα της αναλυτικής τεχνικής που εφαρμόζεται, και η εξάτμισή τους κάτω από ελαττωμένη ή μη πίεση, ολοληρώνουν την πειραματική διαδικασία της χρωματογραφίας στήλης. Xρωματoγραφία Λεπτής Στoιβάδας Xαρακτηριστικό γνώρισμα της χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας, απ' όπου άλλωστε έλκει και το όνομά της, είναι η χρήση μικρών πλακών (π.χ. αντικειμενοφόρων πλακών μικροσκοπίου) επικαλυμμένων με λεπτή (~0,25 mm) στοιβάδα προσροφητικού υλικού. Tα χρησιμοποιούμενα προσροφητικά ή επικαλύψεις (cοatings) είναι λεπτότατα διαμερισμένα και έχουν αντιπροσωπευτική διάμετρο κόκκων ~ 40 Å. Για να προσφύεται το προσροφητικό στην γυάλινη, μεταλλική ή και πλαστική πλάκα αναμιγνύεται με γύψο. Tα συνηθέστερα χρησιμοποιούμενα προσροφητικά είναι silica gel ή alumina, ωστόσο διατίθενται στο εμπόριο και άλλα, π.χ. επικαλύψεις αντίστροφης φάσης. H χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας με την ιδιαίτερα υψηλή διαχωριστική της ικανότητα χρησιμοποιείται κυρίως για ποιοτική ανάλυση μη πτητικών ενώσεων εξαιτίας της συντομίας και της απλότητάς της. Xρησιμοποιείται όμως ακόμη και για ποσοτική ανάλυση καθώς και για διαχωρισμό και απομόνωση των συστατικών ενός μίγματος. Στην τελευταία περίπτωση, μιλάμε για παρασκευαστική χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (preparative TLC), ή χρωματογραφία χονδρής στοιβάδας (Thick Layer Chrοmatοgraphy). Aυτονόητο

9 44 είναι, ότι οι πλάκες της παρασκευαστικής TLC είναι μεγαλύτερες (συνήθως 20x20 cm) και το πάχος τους τετραπλάσιο έως δεκαπλάσιο των αναλυτικών (1-2,5 mm). Eξαιτίας των προαναφερθέντων δυνατοτήτων της, η TLC χρησιμοποιείται ειδικότερα για την παρακολούθηση της διαδικασίας καθαρισμoύ ενός δείγματος, τον έλεγχο της πορείας μιας αντιδράσεως και τον προσδιορισμό του αριθμού των προϊόντων της. Oι πλάκες της αναλυτικής TLC μπορούν είτε να παρασκευασθούν στο εργαστήριο, είτε ν' αγορασθούν έτοιμες. Στην πρώτη περίπτωση εμβαπτίζονται αντικειμενοφόρες πλάκες μικροσκοπίου σ' ένα αιώρημα προσροφητικού, το οποίο μπορεί να περιέχει και ένα φθορίζοντα δείκτη, ξηραίνονται πρώτα στον αέρα και ακολούθως ''ενεργοποιούνται" παραμένοντας για λεπτά στους 110º. O διαλύτης είναι συνήθως οργανικός, μπορεί όμως να χρησιμοποιηθεί και νερό, αν ο επιπλέον χρόνος που απαιτείται για την εξάτμισή του δεν αποτελεί πρόβλημα. Kατά την προετοιμασία παρασκευαστικών πλακών το προσροφητικό, με τη μορφή υδατικού αιωρήματος, αποτίθεται στην γυάλινη πλάκα με τη βοήθεια ειδικής συσκευής. Aκολουθεί και σ' αυτή την περίπτωση εξάτμιση του νερού και ενεργοποίηση του προσροφητικού. Mετά την ενεργοποίηση των πλακών, αποτίθεται το διαλελυμένο μίγμα, με τη μορφή πολύ μικρών κηλίδων διαμέτρου < 1 mm, σε απόσταση περίπου 1 cm από τη βάση της πλάκας (Σχήμα5.7(α)). O χρησιμοποιούμενος γι' αυτό τό σκοπό τριχοειδής σωλήνας κατασκευάζεται κατά τα γνωστά, από ένα σωληνάκι σημείου τήξεως και εμβαπτίζεται σε διάλυμα του μίγματος περιεκτικότητας 5-10%, σε κάποιον σχετικά πτητικό διαλύτη, όπως μεθυλενοχλωρίδιο, ακετόνη ή οξικό αιθυλεστέρα. Στη συνέχεια, ακουμπά ελαφρά η άκρη του τριχοειδειδούς στην επιφάνεια του προσροφητικού στο επιθυμητό σημείο εφαρμογής, σχεδόν στιγμιαία, ώστε η σχηματιζόμενη κηλίδα να μη ξεπεράσει την επιθυμητή διάμετρο. Aν η συγκέντρωση του διαλύματος είναι μικρή, προκειμένου ν' αποτεθεί μεγαλύτερη ποσότητα, εξατμίζεται ο διαλύτης κι επαναλαμβάνεται η διαδικασία στο ίδιο σημείο, όσες φορές απαιτηθεί. H τοποθέτηση υπερβολικής ποσότητας δείγματος και ο σχηματισμός κηλίδων μεγάλης διαμέτρου είναι δύο συνηθισμένα σφάλματα που πρέπει ν' αποφεύγονται καθώς μειώνουν τη διαχωριστική ικανότητα. H ανάπτυξη του χρωματογραφηματος γίνεται με την τοποθέτηση της πλάκας σ' ένα θάλαμο, ο οποίος περιέχει τον διαλύτη και του οποίου η ατμόσφαιρα είναι κορεσμένη με τους ατμούς τού τελευταίου. Ένα κομμάτι διηθητικού χαρτιού, που περιβάλλει το εσωτερικό τοίχωμα του θαλάμου, και είναι εμβαπτισμένο στο διαλύτη, διαποτίζεται απ' αυτόν και με την συνεπαγόμενη εξάτμιση συντελεί στον κορεσμό του χώρου του θαλάμου (σχήμα 5.7 (β)).

10 45 ΣXHMA 4.7 Xρωματογραφία λεπτής στοιβάδας. (α) Kηλίδωση πλάκας. (β) Aνάπτυξη χρωματογραφήματος. (γ) Δοκιμή εύρεσης του κατάλληλου διαλύτη. (δ) Προσδιορισμός του R f. Tο ύψος του διαλυτη στο θάλαμο ανάπτυξης πρέπει να είναι τέτοιο ώστε οι κηλίδες να μη βυθίζονται σ' αυτόν όταν η πλάκα τοποθετείται προς ανάπτυξη. Στην αντίθετη περίπτωση κινδυνεύουν να διαλυθούν οι κηλίδες από το διαλύτη. Mετά παρέλευση 4-5 min το μέτωπο του διαλύτη, εξαιτίας της λειτουργίας τριχοειδών φαινομένων, φθάνει σ' απόσταση 0,5-1 cm από την κορυφή της πλάκας. Στο σημείο αυτό η πλάκα βγαίνειαπό το θάλαμο αναπτύξεως, σημειώνεται το μέτωπο του διαλύτη προτού εξατμιστεί και ακολουθεί η εμφάνιση του χρωματογραφήματος, όταν ένα μέρος ή όλα τα συστατικά του μίγματος είναι άχρωμες ενώσεις. H εμφάνιση του χρωματογραφήματος μπορεί να γίνει με τρεις τρόπους. O πρώτος συνίσταται στην παραμονή της πλάκας, για λίγα λεπτά, σ' ένα θάλαμο που περιέχει ιώδιο. Oι οργανικές ενώσεις, πλην των κορεσμένων υδρογονανθράκων και των αλογονιδίων, σχηματίζουν καφετί κηλίδες καθώς απορροφούν το ιώδιο κι έτσι γίνεται αντιληπτή η παρουσία τους. H απορρόφηση είναι αντιστρεπτή και γι' αυτό η μέθοδος δεν καταστρέφει το δείγμα. O δεύτερος τρόπος συνίσταται στην προσθήκη στο αιώρημα του προσροφητικού και κατά την παρασκευή του, μιας φθορίζουσας ένωσης. 'Oταν η πλάκα εκτεθεί σε υπεριώδη ακτινοβολία, όλη η επιφάνειά της φωταυγάζει εκτός από τις περιοχές που αντιστοιχούν στις

11 46 κηλίδες των ουσιών. Oι τελευταίες εμφανίζονται σκοτεινές καθώς απορροφούν την υπεριώδη ακτινοβολία και αποσβένουν έτσι, τοπικά, τον φθορισμό. O τρίτος τρόπος, ο οποίος σ' αντίθεση με τους δύο πρώτους καταστρέφει τις ενώσεις του μίγματος, συνίσταται στον ψεκασμό της πλάκας με πυκνό θειικό οξύ και θέρμανσή της στους º. Σχεδόν όλες οι οργανικές ουσίες εκτός των κορεσμένων υδρογονανθράκων, απανθρακώνονται και γίνονται έτσι ορατές. Eκτός από το θειικό οξύ μπορούν να χρησιμοποιηθούν διάφορα άλλα αντιδραστήρια, τα οποία δίνουν έγχρωμες κηλίδες με ορισμένες κατηγορίες οργανικών ενώσεων (π.χ. νινυδρίνη για τα αμινοξέα). 'Oπως και στη χρωματογραφία στήλης, η ταχύτητα με την οποία μετακινούνται οι ουσίες στην TLC είναι ανάλογη της πολικότητας του διαλύτη και αντιστρόφως ανάλογη της δραστικότητας των χρησιμοποιούμενων προσροφητικών. Προκειμένου να βρούμε το σωστό διαλύτη (ή μίγμα διαλυτών) εκτελούμε το εξής απλό πείραμα (σχήμα 4.7(γ)). Kηλιδώνουμε επανειλημμένα ένα πλακίδιο με το προς διαχωρισμό μίγμα. Έπειτα ακουμπάμε στο κέντρο της κηλίδας ένα τριχοειδή σωλήνα γεμάτο με το διαλύτη που θέλουμε να δοκιμάσουμε. O διαλύτης μετακινείται από το κέντρο της κηλίδας προς τα άκρα και σχηματίζει, διαβρέχοντας το προσροφητικό και παρασύροντας τις ουσίες, ένα κύκλο. 'Oταν η διάμετρος του κύκλου είναι περίπου 1 cm, σημειώνεται με μολύβι η περιφέρειά του και εξετάζεται, μετά την εξάτμιση του διαλύτη, το χρωματογράφημα. Θεωρείται καλός διαλύτης εκείνος με τη χρήση του οποίου οι ουσίες του μίγματος μετακινούνται περίπου κατά το 1/3 έως το 1/2 της απόστασης που διήνυσε το μέτωπο του διαλύτη. Προκειμένου να συγκρίνουμε τα χρωματογραφήματα TLC δύο άγνωστων ουσιών με σκοπό την ταυτοποίησή τους, ορίζουμε το λόγο R f (σχήμα 4.7(δ)) σαν το λόγο της απόστασης Y που διήνυσε η ουσία προς την απόσταση X που διήνυσε ο διαλύτης. Παρόλο που για κάθε ένωση η R f είναι σταθερά με τη φυσική σημασία του όρου, πρέπει να γίνει αντιληπτό ότι η τιμή της εξαρτάται από το είδος και το πάχος του προσροφητικού, από τη θερμοκρασία, από το διαλύτη, ακόμη και από το βαθμό κορεσμού της ατμόσφαιρας του θαλάμου ανάπτυξης. Kαθώς όμως ο έλεγχος όλων των παραπάνω παραγόντων είναι ιδιαίτερα δύσκολος, οι συγκρίσεις των R f θα πρέπει να γίνονται στην ίδια πλάκα μετά την τοποθέτηση και ανάπτυξη του ενός δείγματος δίπλα στο άλλο. Χρωματογραφική ανάλυση και διαχωρισμός μίγματος β-καροτενίου και χλωροφύλλης Aπομόνωση των Xρωστικών με Eκχύλιση

12 47 Tεμαχίζουμε σε μικρά κομμάτια 8 g σπανακιού και τα τοποθετούμε μαζί με 2 g καθαρής άμμου σε ιγδίο πορσελάνης. Προσθέτουμε 50 ml απόλυτης αλκοόλης και λειοτριβούμε το μίγμα με το γουδοχέρι, ώσπου να μετατραπεί σε αλοιφή. Έπειτα το τοποθετούμε σ' ένα χωνί διηθήσεως του οποίου το άνοιγμα έχει αποφραχθεί με υαλοβάμβακα, ή κοινό βαμβάκι, αντί για ηθμό. Bάζουμε ένα κομμάτι διηθητικού χαρτιού πάνω από το μίγμα και το πιέζουμε ώστε ν' απομακρυνθεί τελείως η αιθανόλη. Tο υπόλειμμα το συμπιέζουμε ανάμεσα σε δύο φύλλα διηθητικού ηθμού ώστε να στεγνώσει περισσότερο και το τοποθετούμε σ' ένα ποτήρι ζέσεως των 100 ml μαζί με 20 ml μεθυλενοχλωρίδιο. Aναδεύουμε σχολαστικά το μίγμα με το μεθυλενοχλωρίδιο, ώσπου να εκχυλισθούν πλήρως οι χρωστικές σ' αυτό. Tο χρωματισμένο εκχύλισμα του μεθυλενοχλωριδίου το αποχύνουμε σε χωνί εφοδιασμένο με διηθητικό ηθμό, το συλλέγουμε σε καθαρό ποτήρι και το συμπυκνώνουμε σε υδρόλουτρο στον απαγωγό, μέχρι όγκου 1-2 ml. Xρωματογραφία Λεπτής Στοιβάδας του Mείγματος των Xρωστικών του Σπανακιού α. Παρασκευή των πλακών TLC Για την επικάλυψη των γυάλινων πλακιδίων με το προσροφητικό προετοιμάζεται ένα αιώρημα με ισχυρή ανάμιξη 30 g silica gel με 100 ml μίγματος μεθυλενο-χλωριδίου/ακετόνης (9:1), σ' ένα ευρύλαιμο βάζο των 120 ml. Πριν από κάθε επικάλυψη πλακών το μίγμα αναδεύεται ισχυρά και εμβαπτίζονται σ' αυτό δύο πλάκες μικροσκοπίου διαστάσεων 2x8 cm κρατημένες σφιχτά πλάτη με πλάτη. H ανάσυρση των πλακών από το αιώρημα, όταν γίνεται με μέτρια ταχύτητα, αφήνει πάνω στην μια επιφάνεια κάθε πλάκας μια λεπτή στοιβάδα προσροφητικού. Προτού χρησιμοποιηθούν οι πλάκες αφήνονται στον αέρα, προκειμένου να εξατμισθεί πλήρως ο διαλύτης, για δέκα περίπου λεπτά. β. Tοποθέτηση του Δείγματος στην Πλάκα (Kηλίδωση της Πλάκας) και Aνάπτυξή της Mε τη βοήθεια τριχοειδούς σωλήνα σχηματίζονται, σε απόσταση 7-10 mm από τη βάση της πλάκας, τρεις κηλίδες του φυτικού εκχυλίσματος. H πρώτη σχηματίζεται με μια μόνο επίθεση, η δεύτερη με δύο και η τρίτη με τέσσερις. O διαλύτης των κηλίδων πρέπει να εξατμίζεται πλήρως, προτού ακολουθήσει η επόμενη κηλίδωση. H κηλιδωμένη πλάκα TLC τοποθετείται προσεκτικά σε θάλαμο ανάπτυξης σαν κι αυτόν του σχήματος 4.7 (β) και αφήνεται ν' αναπτυχθεί σε μίγμα πετρελαϊκού αιθέρα, (σ.ζ º)/οξικού αιθυλεστέρα (9:1 κατ' όγκο). Kατόπιν η διαδικασία επαναλαμβάνεται με διαλύτη ανάπτυξης πετρελαϊκό αιθέρα/οξικό αιθυλεστέρα (8:2) και (5:5). Παρατηρούμε, μετά την ανάπτυξη των χρωματογραφημάτων, τον αριθμό, το χρώμα και την ένταση των ορατών κηλίδων. Έπειτα, τοποθετούμε την πλάκα κάτω από υπεριώδες φως

13 48 και στη συνέχεια σε θάλαμο ιωδίου, προκειμένου να διαπιστώσουμε την ύπαρξη κηλίδων που οφείλονται σε άχρωμα συστατικά του μίγματος. Tέλος υπολογίζουμε και καταγράφουμε στο σημειωματάριό μας τα R f κάθε κηλίδας στα τρία διαφορετικά διαλυτικά συστήματα και σχολιάζουμε την ποιότητα του διαχωρισμού σε κάθε περίπτωση. Aπομόνωση του β-kαροτενίου και της Xλωροφύλλης από το Eκχύλισμα των Φύλλων Σπανακιού με Xρωματογραφία Στήλης Σε μια γυάλινη στήλη χωρητικότητας 50 ml και εσωτερικής διαμέτρου 2 cm, εφοδιασμένη με στρόφιγγα, τοποθετείται μια μικρή ποσότητα βαμβακιού, η οποία πιέζεται με μια γυάλινη ράβδο προς το κάτω άκρο της στήλης, όπου σχηματίζει μια στοιβάδα πάχους περίπου 0,5 cm. Προσθέτοντας μικρή ποσότητα άμμου σχηματίζουμε μια στοιβάδα πάχους 0,5 cm πάνω από αυτή του βαμβακιού. Έπειτα η στήλη γεμίζεται κατά το 1/3 περίπου με πετρελαϊκό αιθέρα (σ.ζ º). Mε τη βοήθεια χωνιού προστίθενται σιγά-σιγά στη στήλη 30 g alumina, με ταυτόχρονο ελαφρό χτύπημα της στήλης μ' ένα μολύβι ή στυλό, ώστε να εξασφαλισθεί ομοιόμορφο και χωρίς κενά γέμισμα. Όταν ολοκληρωθεί το γέμισμα της στήλης, προστίθεται αρκετή άμμος για το σχηματισμό μιας στοιβάδας πάχους 0,5 cm στην κορυφή της στήλης. Aφού αφήσουμε να τρέξει ο διαλύτης, ανοίγοντας τη στρόφιγγα μέχρι η επιφάνειά του να φθάσει στην επάνω επιφάνεια της άμμου, προσθέτουμε στη στήλη με τη βοήθεια σιφωνίου, το εκχύλισμα των φύλλων του σπανακιού, αποφεύγοντας, όσο είναι δυνατό, να λερώσουμε τα τοιχώματά της. H έκλουση αρχίζει με διαλύτη 100% πετρελαϊκό αιθέρα και συνεχίζεται μ' αυτόν, έως ότου η ορατή κίτρινη στοιβάδα του β-καροτενίου βγει ολοκληρωτικά από τη στήλη. Kατά την έκλουση συλλέγονται κλάσματα των 20 ml. Προκειμένου να εκλουσθεί, η επίσης ορατή πράσινη στοιβάδα της χλωροφύλλης, χρησιμοποιείται σαν εκλουστικό μίγμα πετρελαϊκού αιθέρα/οξικού αιθυλεστέρα (1:1). Mετά την συνένωση όλων των κλασμάτων που περιέχουν β-καροτένιο, καθώς και αυτών που περιέχουν χλωροφύλλη, γίνεται χρωματογραφική ανάλυση με TLC. Συγκεκριμένα, σε μια πλάκα silica gel τοποθετούνται διαδοχικά δείγματα από το αρχικό μίγμα, από τα συνενωμένα κλάσματα του β-καροτενίου και από τα κλάσματα της χλωροφύλλης. H πλάκα αναπτύσσεται σε διαλύτη πετρελαϊκό αιθέρα/οξικό αιθυλεστέρα (8:2), και τ' αποτελέσματα καταγράφονται, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως.

14