Γενετική χαρτογράφηση. /genetics

Transcript

1 Γενετική χαρτογράφηση /genetics 1

2 2

3 3

4 ΦΥΣΙΚΟΙ ΧΑΡΤΕΣ Καθορίζουν τις πραγματικές θέσεις δεικτών του γονιδιώματος Ο κάθε ερευνητής στο παρελθόν κλωνοποιούσε και ταχτοποιούσε την υπό μελέτη αλληλουχία. Υπήρχαν αλληλεπικαλύψεις αλλά δεν υπήρχε τρόπος διαπίστωσης => μεγάλο κόστος σε χρήματα και εργατοώρες 4

5 ΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΧΑΡΤΕΣ Καθορίζουν τη σχετική θέση των δεικτών στα χρωμοσώματα ή τις πραγματικές αποστάσεις εξετάζεται ο τρόπος μεταβίβασης τους από γενιά σε γενιά. Προσφέρονται ιδιαίτερα για την αναγνώριση γονιδίων που σχετίζονται με σταθερό τρόπο με νοσήματα, όπως η δρεπανοκυτταρική αναιμία και κυστική ίνωση. Ο πρώτος χάρτης του T.H. Morgan Στόχος η δημιουργία γενετικών χαρτών μεγάλου πληροφοριακού δυναμικού [1 δείκτης ανά 2-5 cm (1cM=1000kb)] Από χρήση RFLPs σε 5 SSRs και!!!!! SNPs

6 Ο ανασυνδυασμός μεταξύ δυο γενετικών τόπων χρησιμοποιείται ως αδρή μέτρηση της μεταξύ τους απόστασης 6

7 D = Disease N = Normal A, a = δείκτης Στην συγκεκριμένη οικογένεια Α και D του πατέρα πάνε μαζί = 7 Καθορισμός φάσης

8 Προβληματισμοί πάνω στη χαρτογράφηση Που εντοπίζεται το υπεύθυνο γονίδιο για την Χ ασθένεια; Αν δεν ξέρω το γονίδιο, υπάρχει κάποιο άλλο γονίδιο (ή DNA δείκτης) που να δείχνει /σχετίζεται με την Χ ασθένεια Πόσο σημαντικό ρόλο παίζει η φυσική απόσταση του υπεύθυνου γονιδίου για την Χ ασθένεια με τον δείκτη που χρησιμοποιώ; 8

9 Χαρτογράφηση Gene mapping Φυσική χαρτογράφηση: τοποθέτηση σε χρωμοσωμική περιοχή μπάντα π.χ. Xp21 7q21 Xp21.3 Γενετική χαρτογράφηση: τοποθετεί γονίδια το ένα σε σχέση με το άλλο πάνω σε χρωμόσωμα 9

10 Αν ήταν ανεξάρτητα γονίδια Πειράματα γενετικής σύνδεσης (Morgan) Κόκκινα μάτια Μεγάλα φτερά

11 Αν ήταν συνδεδεμένα γονίδια Το ότι εμφανίζονται γονικοί φαινότυποι πιο συχνά, αλλά και ανασυνδιασμένοι με μικρότερη συχνότητα => 11 διασκελισμός μεταξύ ομόλογων χρωμοσωμάτων

12 Χρωμόσωμα 1 του Donahue

13 Η μεγάλη ετεροχρωματική περιοχή αμέσως κάτω από το κεντρομερίδιο του χρωμοσώματος 1 είναι ποικιλόμορφο χαρακτηριστικό Ονομάζεται ετερομορφισμός Η κληρονόμηση αυτού του ετεροχρωματισμού ακολουθούσε την κληρονόμηση της ομάδας αίματος Duffy (ερυθροκυτταρικό αντιγόνο) => Το γονίδιο για της ομάδας αίματος Duffy βρίσκεται στο χρωμόσωμα 1 13

14 Η οικογένεια του Donahue ομάδα αίματος Duffy a ή b 14

15 Ο δεύτερος νόμος του Mendel 2ος νόμος του Mendel ή νόμος της ανεξάρτητης μεταβίβασης των γονιδίων: Τα ετερόζυγα άτομα της F1 γενιάς ως προς δύο ιδιότητες διαχωρίζουν κατά τη διάρκεια της μείωσης τα αλληλόμορφα της μιας ιδιότητας ανεξάρτητα από τα αλληλόμορφα της άλλης ιδιότητας έτσι κάθε άτομο παράγει γαμέτες με όλους τους δυνατούς συνδυασμούς των γονιδίων του. Ο νόμος ισχύει για γονίδια μη συνδεδεμένα δηλαδή για γονίδια που βρίσκονται σε διαφορετικά ζεύγη ομολόγων χρωμοσωμάτων 15

16 Ανάλυση σύνδεσης Ο Donahue απέδειξε ότι ο ετεροχρωματισμός του χρωμοσώματος 1 και η ομάδα αίματος κατά Duffy είναι συνδεδεμένα Άρα το γονίδιο για την ομάδα αίματος κατά Duffy είναι στο χρωμόσωμα 1 Παλιά οι μόνες συνδέσεις που μπορούσαν να κάνουν ήταν για τα γονίδια που βρίσκονταν στο χρωμόσωμα Υ 16

17 17

18 18

19 19

20 20 Δοκιμασία x 2 Παράδοση 9

21 Οι παρατηρούμενοι και οι αναμενόμενοι αριθμοί συγκρίνονται με τη δοκιμασία χ 2, ώστε να προσδιοριστεί η πιθανότητα να είναι τυχαία η διαφορά τους χ 2 =Σd 2 /e, d 2 =(o-e) 2 Αναμενόμε νοι (e, expected) Παρατηρούμ ενοι (o, observed) f(ccss) f(ccss) f(ccss) d d 2 d 2 /e f(cccs) ,61 χ 2 =Σd 2 /e= 7207,31 21 βαθμοί ελευθερίας συνήθως n-1. Eδώ n=3

22 Η διαφορά που παρατηρούμε οφείλεται σε τύχη 22

23 23

24 24

25 25

26 1. Αμιγές θηλυκό άτομο D. melanogaster με μαύρο σώμα και ατροφικά φτερά (bbvgvg) διασταυρώνεται με αρσενικό φυσικού τύπου (b+b+vg+vg+). Στην F1 γενιά προκύπτουν άτομα φυσικού τύπου στα οποία γίνεται διασταύρωση ελέγχου. Στην F2 γενιά προκύπτουν οι απόγονοι: 965 [b + vg + ] 185 [b + vg] 206 [bvg + ] 944 [bvg] Να εξηγηθούν τα αποτελέσματα. Λύση Εάν τα γονίδια b και vg βρίσκονταν σε διαφορετικά χρωμοσώματα και κληρονομούνταν ανεξάρτητα, τότε η αναλογία θα ήταν 1:1:1:1. Τώρα όμως η αναλογία είναι 9:9:2:2 το οποίο σημαίνει ότι τα γονίδια είναι συνδεδεμένα στο ίδιο χρωμόσωμα. Ρ : bvg/bvg x b + vg + /b + vg + F1 : b + vg + /bvg x bvg/bvg F2 : Χωρίς επιχιασμό b + vg + /bvg και bvg/bvg σε ίσες Με επιχιασμό b + vg/bvg και bvg + /bvg σε ίσες αναλογίες οι κυρίαρχοι φαινότυποι και χαμηλότερες οι ανασυνδιασμένοι φαινότυποι. ΕΦΗ ΜΙΧΟΠΟΥΛΟΥ -ΤΥΠΑΣ ασκήσεις 1 και 4

27 4. Δίνονται οι αποστάσεις 5 γονιδίων στο ίδιο χρωμόσωμα. Να βρεθεί η διάταξή τους. b-c : 27 b-vg : 18.5 b-d : 17,5 b-pr : 6 c-pr : 21 c-d : 44,5 c-vg : 8,5 d-vg : 36 d-pr : 23,5 pr-vg : 12,5 Λύση Παρατηρώ ότι η μεγαλύτερη απόσταση είναι αυτή των c-d, άρα αυτά θα είναι τα δύο ακραία γονίδια. Η αμέσως μικρότερη είναι αυτή των d-vg, άρα το vg βρίσκεται μετά το c ακριβώς. Η αμέσως μικρότερη είναι αυτή των b-c, άρα το b βρίσκεται πριν το d ακριβώς Η αμέσως μικρότερη είναι αυτή των d-pr, άρα το pr βρίσκεται μετά το vg ακριβώς Η αμέσως μικρότερη είναι αυτή των c-pr, και ακολουθούν οι b- vg, b-d, pr-vg και b-pr. Άρα, η διάταξη των γονιδίων είναι c (8,5) vg (12,5) pr (6) b (17,5) d

28 Γενετική Ανάλυση Κανονική - Αντίστροφη 28

29 29

30 Ακολουθώντας την κληρονόμηση του τόπου δείκτη προβλέπεται η κληρονόμηση της ασθένειας Η πιθανότητα λάθους = συνάρτηση της μεταξύ τους απόστασης Δυο γενετικοί τόποι είναι συνδεδεμένοι αν εμφανίζονται μαζί σε γενεαλογικά δένδρα πιο συχνά από ό,τι κατά τύχη 30

31 Απόσταση δυο γενετικών τόπων Η απόσταση μετράται σε centimorgans (cm) Περιοχές που απέχουν 1 cm δείχνουν ανασυνδυασμό 1% Όχι γραμμική σχέση γιατί οι περιοχές διαφέρουν σε δυνατότητα ανασυνδυασμού Ένα χρωμόσωμα 150 cm Ανθρώπινο γονιδίωμα 3300 cm (αντιστοιχία σε 3x10 9 bp) => 1cM= bp = 1000 kb 31

32 Τύποι πολυμορφικών/γενετικών δεικτών 32

33 Γενετικοί/Πολυμορφικοί δείκτες Γενετικοί δείκτες = απλά κληρονομούμενοι χαρακτήρες Όχι οι ίδιοι ενδιαφέρον Βοηθούν σε ανίχνευση τρόπου κληρονόμησης ειδικής χρωμοσωμικής περιοχής σε οικογένειες Προϋποθέσεις 1. Εύκολη μελέτη 2. Εύληπτο υλικό 3. Κληρονόμηση κατά Mendel 4. Να είναι πολυμορφικοί 5. Καλή ποιότητα γενεαλογικού δένδρου (3 γενιές) 33

34 Γενετική Επιδημιολογία Καθορισμός πιθανών γενετικών δεικτών προδιάθεσης για συνήθεις ασθένειες Κατανόηση παθογενετικών μηχανισμών Ανάπτυξη νέων θεραπειών 34

35 Γενετική χαρτογράφηση 1. Ανάλυση Σύνδεσης Βαθμολογία LOD 2. Ανάλυση Σύνδεσης για πολυγονιδιακές (πολύπλοκες) Ανθρώπινες ασθένειες 3. Ανάλυση ζεύγους αδερφών 35

36 Χαρτογράφηση των γονιδίων του ανθρώπου Με ανάλυση ανασυνδιασμού Με τη μέθοδο της τιμής LOD Υψηλής πυκνότητας Γενετικοί χάρτες Φυσική χαρτογράφηση 36

37 Ανάλυση Σύνδεσης (linkage analysis) Συγκρίνει την ειδική γενετική σχέση ανάμεσα σε γενετικούς τόπους (όχι αλληλόμορφα ή φαινότυπους), οι οποίοι συγκληρονομούνται σε άτομα οικογένειας που εμφανίζουν ασθένεια Πχ δείκτης G8 και Huntington Πχ Διαβήτης ( IDDM) και HLA DQ INS 37

38 1. Βαθμολογία LOD (Logarithm of the Odds Στατιστική παράμετρος για την αξιολόγηση αποτελεσμάτων ανάλυσης σύνδεσης Βαθμολογία LOD συγκρίνει πιθανότητα απόκτησης αποτελεσμάτων ελέγχου αν οι δυο γενετικοί τόποι είναι πραγματικά συνδεδεμένοι με την πιθανότητα παρατήρησης ίδιων αποτελεσμάτων από τύχη Απόσταση = ποσοστό ανασυνδυασμού = θ Αν μια στις 7 μειώσεις δίνει ανασυνδυασμό => θ = 1/7 = 0.14=14 cm Gelehrteer, Αρχές 38 Ιατρικής Γενετικής σελ

39 39

40 2. Ανάλυση Σύνδεσης με χρήση πολλών δεικτών (multi locus) για Ανθρώπινες ασθένειες Έρευνα πολλών οικογενειών με νόσο Απαραίτητο να υπάρχει υποψήφιο γονίδιο Μελέτη σειράς δεικτών κοντά στο υποψήφιο γονίδιο 40

41 Φυσική χαρτογράφηση 1. In situ υβριδοποίηση 2. Υβρίδια σωματικών κυττάρων 3. Φαινόμενο δόσης 4. Χρωμοσωμικές ανωμαλίες και απώλεια ετεροζυγωτίας 5. Αδρανοποίηση του Χ και μετατοπίσεις Χ-αυτοσωμικών χρωμοσωμάτων 41

42 In situ υβριδοποίηση Η πιο άμεση μέθοδος Μοριακός υβριδισμός μιας κλωνοποιημένης αλληλουχίας DNA με μεταφασικά χρωμοσώματα Ορατό σήμα ραδιενέργεια Φθορισμός με διαφορετικά χρώματα (FISH) Ο ανιχνευτής πρέπει να είναι αρκετά μεγάλο τμήμα DNA 42

43 43

44 44

45 45

46 Ενδεικτικό παράδειγμα των αποτελεσμάτων ενός πειράματος με φθορίζοντα υβριδισμό in situ (FISH) στο οποίο ανιχνευτές DNA σημασμένοι με φθορίζουσες ενώσεις υβριδοποιήθηκαν με ανθρώπινα μεταφασικά χρωμοσώματα. 46

47 Χρωμοσωμικές Ελλείψεις στο Χ Αφορούν περισσότερα από ένα γονίδια Άτομο με 4 μη φυσιολογικά φυλοσύνδετα χαρακτηριστικά βοήθησε στη χαρτογράφηση DMD 47

48 48

49 Γονίδιο για DMD Το μεγαλύτερο ανθρώπινο γονίδιο 79 εξόνια 2.3 x 10 6 bp 1% του χρωμοσώματος Χ Πρωτεΐνη = δυστροφίνη 427 kda πρωτεΐνη κυτταροσκελετού Εμπλέκεται στο συσταλτό σύστημα μυϊκών κυττάρων 49

50 50

51 Πολυγονιδιακές Γενετικές Ασθένειες

52 ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΑΣΘΕΝΕΙΑΣ ΚΑΙ ΑΝΙΣΟΡΡΟΠΙΑ ΣΥΝΔΕΣΗΣ Ασθένειες που συμβαίνουν πιο συχνά σε άτομα που έχουν συγκεκριμένους γονότυπους για κάποιους δείκτες HLA-DR locus: DR3, DR4 και ινσουλινοεξαρτώμενο σακχαρώδη διαβήτη Χειλεοσχιστεία και TGFa (transforming growth factor alpha) 52

53 Υπάρχουν 57 αλληλόμορφα για το Α και 111 για το Β και 34 για το C. Με τυχαίο ανασυνδυασμό η συχνότητα του απλότυπου Α1Β8 θα έπρεπε να ήταν 2.3%. Είναι όμως 9.3% Ανισορροπία σύνδεσης προκαλείται από oδράση επιλογής oπαρέκκλιση oχρωμοσωμική σύνδεση oμη τυχαίες διασταυρώσεις oεπιστατική αρμοστικότητα (διαφορετική από επιστατική αλληλεπίδραση γονιδίων) 53

54 Πώς είναι συνδεδεμένα τα γονίδια στα γονεϊκά χρωμόσωματα? Πως Έχει γίνει κάποιος ανασυνδιασμός στα παιδιά? 54

55 Απλότυπος Ομάδα πολυμορφικών συνδεδεμένων αλληλόμορφων που κληρονομούνται μαζί Οξεία λευχαιμία Ανταλλαγή υλικού μεταξύ δυο μητρικών χρωμοσωμάτων Απλοταυτόσημη 55 Ταυτόσημη Ιστοσυμβατότητα

56 Ανισορροπία σύνδεσης Linkage Disequillibrium Η προτίμηση κατάληψης ανεξάρτητων γενετικών τόπων από συγκεκριμένα αλληλόμορφα Έστω Α1, Α2 και Β1, Β2 Ανισορροπία Σύνδεσης υφίσταται όταν είναι στατιστικά συχνότερη η εμφάνιση των γονοτύπων Α1Β1 και Α2Β2 σε σχέση με τους Α1Β2 και Α2Β1 56

57 Ανισορροπία σύνδεσης Επιλεκτική ύπαρξη ενός γονιδίου υπεύθυνου για μια ασθένεια συνδεμένου με συγκεκριμένα αλληλόμορφα κάποιων δεικτών Πιθανόν να προέρχεται από κάποιον πρόγονο Μετά από n γενιές μόνο το κλάσμα (1-r) n των χρωμοσωμάτων θα έχει τον αρχικό συνδυασμό, όπου r = πιθανότητα ανασυνδυασμού Αν r μικρό τότε η ανισορροπία θα παραμείνει για πολλές γενιές 57

58 Συχνότητες αλληλόμορφων στο γενικό πληθυσμό Πιθανότητα να βρίσκονται έτσι συνδεδεμένα στο γενικό πληθυσμό 58

59 Β Β Β Β Β Β Β β β β Α Α Α Α Α Α Α α α 21 9 α 59

60 ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ ΑΝΙΣΟΡΡΟΠΙΑΣ ΣΥΝΔΕΣΗΣ HLA Μείζον Σύμπλεγμα Ιστοσυμβατότητας Ανοσολογικές διαταραχές Αυτοάνοσα νοσήματα Κληρονομική αιμοχρωμάτωση Διαβήτης Μεταμοσχεύσεις 60

61 ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ ΑΝΙΣΟΡΡΟΠΙΑΣ ΣΥΝΔΕΣΗΣ Αγκυλοποιητική σπονδυλίτιδα και HLA-Β27 Πιθανόν κάποιο προϊόν HLA συνδυάζεται με Ag και προκαλεί αναποτελεσματική ανοσολογική απόκριση => χρόνια λοίμωξη Πιθανόν κάποια στιγμή στρέφεται εναντίον ξενιστή Πιθανόν άλλο γονίδιο υπεύθυνο για νόσο αλλά σε στενή σύνδεση με HLA 61

62

63 Διαφοροποιήσεις DNA (πολυμορφισμοί) Ασθένειες (φαινότυποι) 63

64 Γενετικές ασθένειες Σπάνιες, απλές, μονογονιδιακές Συχνές, πολύπλοκες, πολυγονιδιακές 64 46

65 Μονογονιδιακές Γενετικές Ασθένειες Υποπτευόμενη γονιδιακή βάση (~1900) Γνωστή γονιδιακή βάση (~4800) Άγνωστη γονιδιακή βάση (~1900)

66 ΠΟΛΥΠΑΡΑΓΟΝΤΙΚΗ ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΟΤΗΤΑ και ΠΟΣΟΤΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Κεφ 5, i Genetics

67 Ασυνεχής κατανομή του χρώματος κελύφους στο σαλιγκάρι Cepaea nemoralus από έναν πληθυσμό στην Αγγλία.

68 Κατανομή βάρους γέννησης νεογνών (αρσενικών και θηλυκών) που γεννήθηκαν από έφηβες στο Portland, Oregon, το 1992.

69 Πολυπαραγοντική Κληρονομικότητα Γενετική προδιάθεση : αθροιστικό αποτέλεσμα ποικιλομορφίας σε πολλαπλούς γενετικούς τόπους Πολυγονιδιακά Χαρακτηριστικά: πολλά γονίδια - το καθένα επίδραση στο φαινότυπο Ποσοτικά Κανονική καμπύλη κατανομής -Gauss Πολυπαραγοντικά Χαρακτηριστικά: αλληλεπίδραση πολλαπλών περιβαλλοντικών παραγόντων με πολλά γονίδια

70 Πολυγονιδιακά Χαρακτηριστικά Συνήθως ποσοτικά και εμφανίζουν συνεχή κατανομή στον πληθυσμό Όταν δυο χαρακτηριστικά επηρεάζονται από τα ίδια ή από συνδεδεμένα γονίδια, τότε παρουσιάζεται γενετική συσχέτιση.

71 Συνεχή ή ποσοτικά χαρακτηριστικά Ένας γονότυπος παρουσιάζει φάσμα φαινοτυπικών αντιδράσεων Οι φαινότυποι ακολουθούν κανονική καμπύλη κατανομής Gauss

72 Συνεχή ή ποσοτικά χαρακτηριστικά Μέγεθος ποικιλομορφίας Τρόπος κατανομής 1. Παραγωγικότητα φυτών και ζώων 2. Δείκτης νοημοσύνης 3. Μαθησιακές δυσκολίες 4. Βάρος κατά τη γέννηση

73 Συνεχή ή ποσοτικά χαρακτηριστικά Περιβάλλον; Πόσα γονίδια εμπλέκονται; Συνεισφέρουν όλα τα γονίδια στον ίδιο βαθμό; Αποτέλεσμα αθροιστικό ή συνεργειστικό; Επιλογή πώς αλλάζει το χαρακτηριστικό; Πώς διασταυρώσεις για επιλογή καλύτερου φαινότυπου;

74 Πολλά γονίδια που συνεισφέρουν στο γονότυπο Έστω Α,α Β,β επηρεάζουν συστολική πίεση αίματος Έστω για κάθε Α,α, Β,β p=q=0.5 Α,Β +10 μονάδες στην πίεση α, β 0 μονάδα στην πίεση

75 2 16 1/16 4/16 6/16 4/16 1/16 Αύξηση

76 Περιβαλλοντικές επιδράσεις τροποποιούν επιπρόσθετα την καμπύλη κατανομής

77 Η πολυγονιδιακή υπόθεση για τη ποσοτική κληρονομικότητα Επειδή η κληρονομικότητα των ποσοτικών χαρακτηριστικών δεν μπορεί να αποδοθεί σε ένα μοναδικό γενετικό τόπο, η απλούστερη εναλλακτική εξήγηση είναι ότι αυτά ελέγχονται από πολλά γονίδια animation

78 Τρεις γενετικοί τόποι από δυο αλληλόμορφα ο καθένας

79 Τρία αλληλόμορφα σε ένα γενετικό τόπο

80

81 Μονογονιδιακές versus Πολυπαραγοντικές ασθένειες Μονογονιδιακές Μεγάλες οικογένειες Ένα γονίδιο/ ασθένεια/ οικογένεια Γονίδια με μεγάλη διεισδυτικότητα Μη προσβεβλημένοι ασθενείς παρέχουν πληροφορίες για την ασθένεια Πολυπαραγοντικές Μικρές οικογένειες/ Μεγάλος πληθυσμός Πολλά γονίδια για κάθε ασθένεια/συνδυασμοί γονιδίων Γονίδια με μικρή διεισδυτικότητα Μη προσβεβλημένοι ασθενείς μεταφέρουν αλληλόμορφα γενετικής προδιάθεσης

82 Η πολυγονιδιακή υπόθεση για τη ποσοτική κληρονομικότητα Πόση ποικιλομορφία οφείλεται στα γονίδια και πόση εξαρτάται από το περιβάλλον??? V P =V G +V E Variance Phenotypic = Variance Genetic + Variance Environmental πίσω

83 Ποσοτική γενετική ανάλυση

84 Ομόζυγα Black Mexican sweet corn Tom Thumb popcorn

85 Διακύμανση Περιβαλλοντικές παράμετροι Πολύ μεγαλύτερη Διακύμανση Ίδιες Περιβαλλοντικές παράμετροι

86 Πολυγονιδιακά Συστήματα και Συγγένεια