«Έρευνα στη Γυναικεία Αναπαραγωγή»

Transcript

1 Μεταπτυχιακό πρόγραμμα σπουδών Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Αθήνας «Έρευνα στη Γυναικεία Αναπαραγωγή» Δέσποινα Τζανακάκη Βιολόγος Κλινική Εμβρυολόγος Τμήμα Εξωσωματικής Γονιμοποίησης - Β Μαιευτική & Γυναικολογική Κλινική Πανεπιστήμιο Αθήνας - Αρεταίειο Νοσοκομείο

2 Ενότητες Α) Σπερματογένεση και δομή ώριμου σπερματοζωαρίου Β) ιερεύνηση σπέρματος σπερμοδιάγραμμα Γ) ιερεύνηση σπέρματος πρόσθετες εξετάσεις ) ιαγνωστική ενεργοποίηση σπέρματος Ε) Κρυοσυντήρηση σπέρματος

3 Σπερματογένεση Η σπερματογένεση είναι μια δυναμική διεργασία πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης των γεννητικών κυττάρων, από το στάδιο του σπερματογονίου έως το στάδιο του ώριμου σπερματοζωαρίου. Ο πληθυσμός των γεννητικών κυττάρων αυξάνει, με συνεχείς μιτωτικές διαιρέσεις, πριν από την είσοδο των σπερματογονίων στη διαδικασία της διαφοροποίησης. Πρόγονος των σπερματογονίων είναι το βλαστικό γεννητικό κύτταρο.

4 Σπερματογένεση

5 Σπερματογένεση

6 Τομή ορχικού σωληναρίου 1. Basal lamina (membrane) (not recognizable) 2. Myofibroblast 3. Fibrocyte 4. Sertoli's cell 5. Spermatogonia 6. Various stages of the germ cells during spermatogenesis 7. Spermatozoon 8. Lumen

7 ομές σπερματοζωαρίου

8 Οδηγίες συλλογής δείγματος σπέρματος για σπερμοδιάγραμμα Αποχή από σεξουαλικές επαφές από 2 έως 7 ημέρες. Συλλογή ολόκληρης της ποσότητας του δείγματος σε αποστειρωμένο δοχείο (π.χ. δοχείο συλλογής ούρων). Παράδοση του δείγματος στο εργαστήριο σε λιγότερο από 1 ώρα απότηστιγμήτηςσυλλογής(διατήρηση δείγματος σε θερμοκρασία ~ 37 C) ή συλλογή του δείγματος σε χώρο κοντά στο εργαστήριο. Όταν δεν είναι δυνατή η συλλογή δείγματος με αυνανισμό, χρησιμοποιούνται μόνο ειδικά προφυλακτικά (μη τοξικά για τα σπ/ρια).

9 Παρατηρήσεις Για αρχική εκτίμηση σπέρματος, απαιτούνται δύο σπερμοδιαγράμματα. Χρονικό διάστημα μεταξύ αυτών από 7 ημέρες έως 3 εβδομάδες. Αν τα αποτελέσματα των δύο εξετάσεων διαφέρουν σημαντικά, πρέπει να γίνει κι άλλο σπερμοδιάγραμμα (τα αποτελέσματα ανάλυσης σπέρματος ενός άνδρα μπορεί να παρουσιάζουν σημαντικές διακυμάνσεις).

10 Βασικός εξοπλισμός και αναλώσιμα εργαστηρίου ανδρολογίας Αποστειρωμένα δοχεία συλλογής σπέρματος. Πιπέτες. οκιμαστικά σωληνάρια. Αντικειμενοφόρες πλάκες (slides) και καλυπτρίδες. Makler counting chamber (ή άλληαντικειμενοφόρος για προσδιορισμό συγκέντρωσης σπ/ρίων). Γάντια. Φυγόκεντρος (ως 3000 g). Μικροσκόπιο (ως 100x αντικειμενικός φακός).

11 Κανόνες ασφαλείας για το βιολόγο Όλαταδείγματασπέρματοςπρέπει να αντιμετωπίζονται ως πιθανώς μολυσματικά (HIV, ηπατίτιδα Β κλπ.) και να λαμβάνονται από το προσωπικό οι απαραίτητες προφυλάξεις (γάντια, μάσκες, ένδυση εργαστηρίου κλπ). Προσωπικό εργαστηρίου εμβολιασμένο για ηπατίτιδα Β. Αναλώσιμα υλικά (γάντια, δοχεία συλλογής σπέρματος, πιπέτες κλπ) πρέπει να απορρίπτονται σύμφωνα με τους κανόνες για επικίνδυνα εργαστηριακά απορρίμματα. Χρήση αντιστηπτικών σαπουνιών, συχνό πλύσιμο χεριών. Καθαρισμός των πάγκων εργασίας με αντισηπτικό καθημερινά. Στο εργαστήριο ανδρολογίας απαγορεύονται: κατανάλωση φαγητού / ποτού, κάπνισμα, εφαρμογή καλλυντικών προϊόντων, αποθήκευση φαγητού, κλπ.

12 ΣΠΕΡΜΟ ΙΑΓΡΑΜΜΑ Μακροσκοπική εξέταση Ρευστοποίηση Εμφάνιση Όγκος Ιξώδες ph Μικροσκοπική διερεύνηση Συγκέντρωση σπερματοζωαρίων Κινητικότητα Μορφολογία Παρουσία άλλων κυτταρικών στοιχείων Συγκολλήσεις

13 ΜΑΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ Ρευστοποίηση δείγματος Φυσιολογικά εντός 60 λεπτών σε θερμοκρασία δωματίου (συνήθως σε 15 ). Παρουσία ζελατινοειδών σωματίων, χωρίς κλινικό ενδιαφέρον. Καλή ανάδευση δείγματος (όχι βίαιες κινήσεις). Σε περίπτωση αδυναμίας ρευστοποίησης, μηχανική ανάμειξη δείγματος ή χρήση ενζύμων ή ανάμειξη δείγματος με καλλιεργητικό υλικό και ανάδευση. Καταγραφή του χρόνου ή της αδυναμίας ρευστοποίησης.

14 Εμφάνιση δείγματος Εξέταση μετά τη ρευστοποίηση ή μέσα σε 1 ώρα από την εκσπερμάτιση. Φυσιολογικό δείγμα: ομοιογενής εμφάνιση, χρώμα ώχρας γκρι. Πιθανώς λιγότερο αδιαφανές αν συγκέντρωση σπερματοζωαρίων πολύ μικρή. Κοκκινο-καφέ απόχρωση πιθανή παρουσία ερυθροκυττάρων. Κιτρινωπή απόχρωση πιθανός ίκτερος ή ένδειξη λήψης βιταμινών από τον εξεταζόμενο.

15 Όγκος δείγματος Μετράται με βαθμονομημένες πιπέτες. Αποφεύγεται η χρήση πλαστικών συριγγών (μπορεί να επηρεάσουν την κινητικότητα των σπερματοζωαρίων). Αποφεύγεται η χρήση υποδερμικών βελόνων (ασφάλεια). χ χ

16 Ιξώδες δείγματος Έλεγχος ιξώδους: Το δείγμα αναρροφάται σε πιπέτα όγκου 5 ml, αφήνεται με τη βοήθεια της βαρύτητας να πέσει σε σταγόνες από την πιπέτα και παρατηρείται το μήκος του νήματος που σχηματίζεται. Φυσιολογικό δείγμα μικρές διακριτές σταγόνες, όχι νήμα μήκους > 2 cm. Υψηλό ιξώδες πιθανός συσχετισμός με κινητικότητα / συγκέντρωση σπ/ρίων ή παρουσία αντισωμάτων.

17 ph δείγματος Μέτρηση ph εντός 60. Σταγόνα δείγματος σε ph stick. Μετά από 30 sec, σύγκριση χρώματος stick με τα χρωματικά πρότυπα της συσκευασίας. Αν ph < 7 σε δείγμα με αζωοσπερμία πιθανή απόφραξη σπερματοφόρων αγωγών ή συγγενή αμφοτερόπλευρη έλλειψη σπερματοφόρων πόρων.

18 ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΡΙΩΝ

19 ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΡΙΩΝ Μέρος του δείγματος, τοποθετείται σε δοκιμαστικό σωλήνα και βυθίζεται σε υδατόλουτρο 50-60º C, γιαναακινητοποιηθούν τα σπ/ρια. Τοποθετείται μία σταγόνα καλά αναμεμειγμένου δείγματος σπέρματος (~ 5 μl) στο κέντρο της αντικειμενοφόρου Makler. Καλυπτρίδα με πλέγμα εμβαδού 1 mm², υποδιαιρεμένο σε 100 τετράγωνα, 0.1 x 0.1 mm το καθένα.

20 Εφαρμόζεται αμέσως η καλυπτρίδα. Χρησιμοποιείται αντικειμενικός φακός x20, στο μικροσκόπιο.

21 Μετρώνται τα σπερματοζωάρια σε 10 τετράγωνα του Makler. Ο αριθμόςαυτός= εκατομμύρια σπ/ρίων / ml (συγκέντρωση σπ/ρίων). Σε περιπτώσεις ολιγοζωοσπερμίας, μετρώνται τα σπ/ρια στα 100 τετράγωνα του Makler. Ο αριθμός που προκύπτει = συγκέντρωση σπ/ρίων σε εκατοντάδες χιλιάδες.

22 ΜΕΤΡΗΣΗ ΑΡΙΘΜΟΥ ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΡΙΩΝ ΣΕ ΑΙΜΟΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΟ

23 ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΚΙΝΗΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΡΙΩΝ Μία σταγόνα σπέρματος σε απλή αντικειμενοφόρο ή Makler. Μετρώνται συνολικά 100 σπ/ρια, σε τουλάχιστον 5 οπτικά πεδία. (Η μέτρηση επαναλαμβάνεται σε 2 εκατοντάδες σπ/ρίων και υπολογίζεται ο μέσος όρος). Κάθε σπ/ριο που μετράται, κατατάσσεται σε μία από τις εξής κατηγορίες: Α : Ταχεία προωθητική κίνηση ( 5 μήκη κεφαλής σπ/ρίου / sec). Β : Βραδεία προωθητική κίνηση Γ : Νωθρή επιτόπια κίνηση : Ακινησία Έκφραση των τεσσάρων κατηγοριών κινητικότητας σε ποσοστά %.

24 Tally counter Α Β Γ

25 Οι μετρήσεις των ποσοστών κινητικότητας σπ/ρίων πραγματοποιούνται αμέσως μετά τη ρευστοποίηση του δείγματος και επαναλαμβάνονται 3 και 24 ώρες μετά. ΩΡΑ % ΚΙΝΗΤΑ % ΤΑΧΕΙΑ ΠΡΟΩΘΗΤΙΚΗ ΚΙΝΗΣΗ Παράδειγμα ΕΚ ΤΩΝ ΚΙΝΗΤΩΝ % ΒΡΑΔΕΙΑ ΠΡΟΩΘΗΤΙΚΗ ΚΙΝΗΣΗ % ΝΩΘΡΗ ΕΠΙΤΟΠΙΑ ΚΙΝΗΣΗ % ΑΚΙΝΗΤΑ 1 η η η Φ.Τ.: >50% με ταχεία και βραδεία προωθητική κίνηση ή >25% με προωθητική κίνηση την 1η ώρα.

26

27 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΡΙΩΝ

28 ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΗ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΡΙΟΥ ΚΑΤΑ ΑΥΣΤΗΡΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ KRUGER Μήκος κεφαλής μm Πλάτος κεφαλής μm Σχήμα ομαλό ωοειδές Ακρόσωμα σε επιφάνεια 40-70% της κεφαλής Αυχένας 6-10 μm Ουρά ~ 45 μm

29 Φυσιολογικό σπερματοζωάριο

30 Κεφαλής (Μακροκέφαλα, μικροκέφαλα, στρογγυλές, επιμήκεις, πολλαπλές κεφαλές κλπ). Αυχένα (Παρουσία κυτταροπλαστικών υπολειμμάτων, έλλειψη μέσου τμήματος, παχύς ή λεπτός αυχένας κλπ). Ουράς (Πολλαπλές, γωνιώδεις, βραχείες, σπειροειδείς, σπασμένες ουρές κλπ).

31 Globozoospermia

32 Triple Head Pinheads Macro-head

33 Σπερματίδες

34 Προετοιμασία παρασκευάσματος για έλεγχο μορφολογίας σπερματοζωαρίων Ετοιμάζονται δύο παρασκευάσματα. Η αντικειμενοφόρος πλένεται με 70% αλκοόλη και στεγνώνεται. Μία σταγόνα 5 20 μl σπέρματος τοποθετείται στην αντικειμενοφόρο. Με την άκρη μιας δεύτερης αντικειμενοφόρου, απλώνεται η σταγόνα σε όλη την επιφάνεια της πρώτης αντικειμενοφόρου.

35 Χρώσεις παρασκευασμάτων σπέρματος Παπανικολάου Shorr Αντιδραστήρια: i. Diff-Quik Fixative: 1.8 mg/ triarylmethane in methyl alcohol (εμβάπτιση για 15 sec). i. Solution 1: 1 g/l xanthene in sodium azidereserved buffer (εμβάπτιση για 10 sec). i. Solution 2: 1.25 g/ thiazine dye mixture (0.625 g/l Azure A and g/l methylene blue) in buffer. (εμβάπτιση για 5sec) εμβαπτίσεις σε νερό για ξέπλυμα και τοποθετούμε τις αντικειμενοφόρους κάθετα, να στεγνώσουν στον αέρα.

36 Υπολογισμός μορφολογικών ανωμαλιών Στο μικροσκόπιο χρησιμοποιείται 10x προσοφθάλμιος και 100x αντικειμενικός φακός. Μικρόμετρο προσαρμοσμένο στο μικροσκόπιο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για προσδιορισμούς μεγεθών. 100 σπερματοζωάρια ελέγχονται για μορφολογικές ανωμαλίες (αν υπάρχει δυνατότητα, 2 εκατοντάδες). Υπολογίζεται % ποσοστό μορφολογικών ανωμαλιών.

37 Σπερματοζωάρια μετά από χρώση

38 Παράδειγμα % ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΟΡΦΕΣ % ΑΝΩΜΑΛΕΣ ΜΟΡΦΕΣ % ΑΝΩΜΑΛΙΕΣ ΚΕΦΑΛΗΣ Μακροκέφαλα, μικροκέφαλα, στρογγυλές, επιμήκεις, πολλαπλές % ΑΝΩΜΑΛΙΕΣ ΜΕΣΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ Παρουσία κυτταροπλαστικών υπολειμμάτων, έλλειψη μέσου τμήματος % ΑΝΩΜΑΛΙΕΣ ΟΥΡΑΣ Πολλαπλές, γωνιώδεις, βραχείες, σπειροειδείς ουρές Φ.Τ.: φυσιολογικές μορφές > 14 %

39 Παρουσία άλλων κυτταρικών στοιχείων Επιθηλιακά κύτταρα Κύτταρα προστάτη Κύτταρα σπερματογένεσης * Λευκοκύτταρα ** Ερυθροκύτταρα Round cells (Φ.Τ.: < 5 x 10 6 / ml) * Αυξημένες ανώριμες μορφές σπ/ρίων Πιθανή διαταραχή σπερματογένεσης ** Αυξημένα λευκοκύτταρα (> 1 x 10 6 / ml) Πιθανή φλεγμονή (απαιτούνται μικροβιολογικές εξετάσεις).

40 Πλακώδη επιθηλιακά κύτταρα Λευκοκύτταρα Σπερματίδες

41 Συγκολλήσεις σπερματοζωαρίων Συγκολλήσεις κεφαλής-κεφαλής. Συγκολλήσεις ουράς-ουράς. Μεικτές συγκολλήσεις (ουράς-κεφαλής). Όλες αυτές οι συγκολλήσεις πρέπει να αφορούν κινητά σπερματοζωάρια, για να αξιολογηθούν. Πιθανά ανοσολογικά αίτια υπογονιμότητας Στο σπερμοδιάγραμμα, αναφέρεται ο τύπος των συγκολλήσεων κεφαλή/ουρά κλπ και βαθμολογούνται από (καμία συγκόλληση) έως +++ (όλα τα κινητά σπ/ρια παρουσιάζουν συγκολλήσεις).

42 Φυσιολογικό δείγμα Με συγκολλήσεις

43 ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΙΜΕΣ ΣΠΕΡΜΟ ΙΑΓΡΑΜΜΑΤΟΣ (WHO) Όγκος > 2 ml PH 7,2 8 Συγκέντρωση σπ/ρίων > 20 x 10 6 / ml Συνολικός αριθμός σπ/ρίων > 40 x 10 6 / ml > 50% σπ/ρια με προωθητική κίνηση ή Κινητικότητα >25% σπ/ρια με ταχεία προωθητική κίνηση την 1 η ώρα Μορφολογία > 14% φυσιολογικές μορφές Λευκοκύτταρα < 10 6 / ml

44 ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ ΑΝ ΡΟΛΟΓΙΑΣ Αποκλίσεις σε αποτελέσματα σπερμοδιαγραμμάτων του ίδιου δείγματος, στη συγκέντρωση, κινητικότητα ή/και μορφολογία. ύο τάξεις σφαλμάτων : α) Τυχαία σφάλματα β) Συστηματικά σφάλματα (bias). Στατιστικό σφάλμα (λόγω περιορισμένου αριθμού σπ/ρίων που μετρώνται). Επαναλαμβανόμενες μετρήσεις από τον ίδιο βιολόγο βοηθούν ; Σημαντικός ο ποιοτικός έλεγχος (Internal & External). Καλιμπράρισμα σε πιπέτες και άλλο εξοπλισμό (Makler κλπ). ιερεύνηση «μη αναμενόμενων» αποτελεσμάτων.

45 ΟΡΙΣΜΟΙ ΙΑΤΑΡΑΧΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ Ολιγοζωοσπερμία: Μειωμένος αριθμός σπερματοζωαρίων, κάτω από 20 χ 10 6 /ml ήκάτωαπό40 x 10 6 στο συνολικό όγκο του δείγματος. Ασθενοζωοσπερμία: Ασθενής κινητικότητα σπερματοζωαρίων (από την 1η ώρα των παρατηρήσεων), δηλαδή λιγότερο από 50% των σπερματοζωαρίων με προωθητική κίνηση, εκτός αν περισσότερο από 25% των σπερματοζωαρίων έχουν ταχεία προωθητική κίνηση.

46 ΟΡΙΣΜΟΙ ΙΑΤΑΡΑΧΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ Τερατοζωοσπερμία: Ποσοστό σπερματοζωαρίων με φυσιολογική μορφολογία (αυστηρά κριτήρια Kruger) μικρότερο του 14 %. Ολιγοασθενοτερατοζωοσπερμία: Συνύπαρξη μειωμένου αριθμού, ασθενούς κινητικότητας και αυξημένων μορφολογικών ανωμαλιών των σπερματοζωαρίων.

47 Αζωοσπερμία: εν παρατηρούνται σπερματοζωάρια στο δείγμα (ακόμα και μετά από φυγοκέντριση του δείγματος και επανέλεγχο του ιζήματος). ιακρίνεται σε αποφρακτική και μη αποφρακτική. Αποφρακτική Οφείλεται σε επίκτητη απόφραξη αμφότερων των εκφορητικών σπερματικών οδών (λόγω φλεγμονής ή τραυματισμού), σε συγγενή απλασία ή δυσπλασία τους, σε συγγενή αμφοτερόπλευρη έλλειψη των σπερματικών πόρων. Μη αποφρακτική Έλλειψη παραγωγής σπερματοζωαρίων, η οποία μπορεί να είναι ιδιοπαθής ή να οφείλεται σε χρωμοσωμικές ανωμαλίες, λοιμώξεις (πχ. παρωτίτιδα σε μεγάλη ηλικία) και φλεγμονές, κρυψορχία, τραυματισμούς, ακτινοβολία, χημειοθεραπεία, ενδοκρινικά, μεταβολικά ή περιβαλλοντικά αίτια. Ασπερμία: Απουσία εκσπερμάτισης.

48 ΑΝΤΙΣΠΕΡΜΙΚΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ IgA(μεγαλύτερης κλινικής σημασίας από τα IgG). IgG IgM(σπάνια εντοπίζονται στο σπέρμα). Έλεγχος αντισωμάτων Immunobead test (IBT). Σφαίρες πολυακρυλαμιδίου συνδεδεμένες με ανοσοσφαιρίνες κουνελιού. Τα IgA και IgG μπορούν να ανιχνευθούν ταυτόχρονα με αυτό το τεστ. Mixed antiglobulin reaction test (MAR test). Ανάμειξη σπέρματος με μόρια latex ή ερυθροκύτταρα επικαλυμμένα με ανθρώπινα IgA ή IgG. Τα αποτελέσματα των δύο τεστ δε συμφωνούν πάντα!

49 ΤΕΣΤ ΒΙΩΣΙΜΟΤΗΤΑΣ ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΡΙΩΝ α) Υπο-ωσμωτικό τεστ ή HOS test Βασίζεται στην ημιπερατότητα της κυτταρικής μεμβράνης του σπ/ρίου. Όταν το ζωντανό σπ/ριο βρεθεί σε υπο-ωσμωτικές συνθήκες, «φουσκώνει», καθώς αυξάνεται, λόγω εισροής νερού, ο κυτταρικός όγκος. Ανάμειξη σπέρματος με υπο-ωσμωτικό διάλυμα. Μικροσκοπικός έλεγχος σπ/ρίων («φούσκωμα» ουράς). Υπολογισμός % ποσοστού σπ/ρίων που αντέδρασαν. Φυσιολογικά, > 60% σπ/ρίων αντιδρούν στο υπο-ωσμωτικό τεστ.

50 ΤΕΣΤ ΒΙΩΣΙΜΟΤΗΤΑΣ ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΡΙΩΝ α) Υπο-ωσμωτικό τεστ ή HOS test Μορφολογικές αλλαγές σπ/ρίων υπό συνθήκες υπο-ωσμωτικού στρες: (a) Καμία αλλαγή (b-g) ιάφορες αλλαγές στην ουρά Οι ριγέ επιφάνειες δείχνουν την περιοχή της ουράς που έχει υποστεί αλλαγή λόγω του υπο-ωσμωτικού στρες.

51 ΤΕΣΤ ΒΙΩΣΙΜΟΤΗΤΑΣ ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΡΙΩΝ β) Τεστ με χρώση εοσίνης Ανάμειξη μιας σταγόνας σπέρματος με μια σταγόνα διαλύματος εοσίνης. Μικροσκοπικός έλεγχος σπ/ρίων μετά από 30 sec. Τα νεκρά σπ/ρια εμφανίζονται κόκκινα, ενώ τα ζωντανά σπ/ρια λευκά. Νεκρό σπ/ριο Ζωντανό σπ/ριο

52 Huhner test (or post-coital test) Αξιολογεί την αλληλεπίδραση τραχηλικής βλέννης σπέρματος (λίγο πριν την ωοθυλακιορρηξία). ε χρησιμοποιείται πλέον συχνά. Αμφίβολη αξιοπιστία (φυσιολογικές τιμές, μη ευρέως αποδεκτές). Πώς γίνεται ; Το ζευγάρι έχει σεξουαλική επαφή λίγο πριν την ωοθυλακιορρηξία (μέτρηση LH/ υπερηχογράφημα κλπ) ώρες αργότερα, δείγμα τραχηλικής βλέννης εξετάζεται κάτω από μικροσκόπιο.

53 Huhner test (or post-coital test) Φυσιολογικό Μη φυσιολογικό

54

55 ΑΛΛΕΣ ΠΡΟΑΙΡΕΤΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Βιοχημικοί δείκτες, για τη βοηθητική λειτουργία αδένων, προστάτη, επιδιδυμίδας κλπ. (π.χ. κιτρικό οξύ, οξική φωσφατάση, φρουκτόζη, προσταγλανδίνες, α-γλυκοσιδάση). CASA (Computer-Aided Sperm Analysis) Τεστ διεισδυτικότητας σπερμ/ρίων σε ωάρια χάμστερ χωρίς διάφανη ζώνη. Περαιτέρω έλεγχος σε ερευνητικό επίπεδο ROSκαι ανδρική υπογονιμότητα Τεστ αντίδρασης ακροσώματος Τεστ πρόσδεσης σπερμ/ρίων στη διάφανη ζώνη

56 ( ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ) ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ Σκοπός: Απομόνωση σπερματοζωαρίων από λευκοκύτταρα, επιθηλιακά κύτταρα, ακίνητα/μορφολογικά ανώμαλα/ανώριμα σπερματοζωάρια, αντισώματα σπερματοζωαρίων, μικροοργανισμούς, τοξικά μόρια. Απόκτηση πληθυσμού σπερματοζωαρίων που είναι :ζωντανά, με προωθητική κίνηση και φυσιολογική μορφολογία. Επιλογή μεθόδου ανάλογα με : Κινητικότητα Συγκέντρωση Παρουσία άλλων κυτταρικών στοιχείων

57 ΣΥΝΗΘΕΙΣ ΜΕΘΟ ΟΙ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ SWIM-UP ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ Για σπέρματα με σχετικά καλή κινητικότητα, ακατάλληλη για σπέρματα με έντονη παρουσία άλλων κυτταρικών στοιχείων ΜΕΘΟ ΟΣ ΚΛΑΣΜΑΤΩΝ ΙΑΒΑΘΜΙΣΜΕΝΗΣ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑΣ (Percoll, Puresperm, Isolate) Βασίζεται στην πυκνότητα και όχι στην κινητικότητα των σπερματοζωαρίων. Κατάλληλη για δείγματα με αντισπερμικά αντισώματα και έντονη παρουσία κυτταρικών στοιχείων.

58 SWIM-UP Επώαση ~ 30 σεεπωαστή υπό κλίση 45 ο Τοποθέτηση καλλιεργητικού πάνω από το σπέρμα Απομάκρυνση υπερκείμενου Φυγοκέντριση Καλλιεργητικό + υπερκείμενο Λήψη ιζήματος και επαναδιάλυση

59 ΚΛΑΣΜΑΤΑ ΙΑΒΑΘΜΙΣΜΕΝΗΣ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑΣ 1 ml 80% +1 ml 40% 40% / 80% +1 ml σπέρμα Ίζημα + καλλιεργητικό Φυγοκέντριση (1300 rpm,20 min) Φυγοκέντριση (1500 rpm,10 min) Λήψη υπερκείμενου/ επαναδιάλυση

60 Παράδειγμα παραμέτρων σπερμοδιαγράματος πριν και μετά την ενεργοποίηση ενός δείγματος ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Όγκος (ml) Συγκέντρωση σπ/ρίων x10 6 /ml Κινητικότητα % Κινητά % Ταχεία προωθητική % Βραδεία προωθητική % Νωθρή επιτόπια % Ακίνητα ΠΡΙΝ ΤΗΝ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕΤΑ ΤΗΝ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ 0,

61

62 Λόγοι: ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ Σε περίπτωση απουσίας του συζύγου την ημέρα της ωοληψίας ή της σπερματέγχυσης. Συγκέντρωση πολλών ολιγοζωοσπερμικών δειγμάτων. ότες (διατήρηση για την περίοδο «καραντίνας»). Σε κίνδυνο απώλειας γονιμότητας του άνδρα πριν από επικείμενη χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία ή χειρουργική επέμβαση. Σε δυσκολία σπερμοληψίας για ψυχολογικούς λόγους. Σε προοδευτική πτώση των παραμέτρων του σπέρματος.

63 ΚΡΥΟΣΗΝΤΗΡΗΣΗ ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΡΙΩΝ Σχετικά αφυδατωμένα Αποφυγή δημιουργίας ενδοκυτταρικών κρυστάλλων Ανθεκτικότητα σε μεγάλους ρυθμούς μείωσης θερμοκρασίας Προσθήκη κρυοπροστατευτικού μέσου (π.χ. γλυκερόλη) Ο βαθμός επιβίωσης εξαρτάται από την ποιότητα του αρχικού δείγματος σπέρματος (> 50%).

64 ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ Σταδιακή προσθήκη κρυοπροστατευτικού μέσου στο δείγμα σπέρματος (συγκεκριμένη αναλογία κρυοπροστατευτικού / σπέρματος ανάλογα με οδηγίες). Καλή ανάμειξη. Μικρή παραμονή σε θερμοκρασία δωματίου (~ 10 ). Τοποθέτηση μείγματος σε αμπούλες ή παγιέτες (straws). Τοποθέτηση αμπουλών / παγιετών κάθετα, ακριβώς πάνω από την επιφάνεια υγρού αζώτου για 30. Εμβάπτιση των αμπουλών/ παγιετών στο υγρό άζωτο (- 196 C) και αποθήκευση.

65 ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗ Cryo-vials Straws Goblets ιατομή «παγιέτας» (straw) με γλυκερόλη ως κρυοπροστατευτικό

66 ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΜΕΝΟΥ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ Canister Tank

67