Βιολογικές Μεμβράνες και Μεταγωγή Σήματος

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ Βιολογικές Μεμβράνες και Μεταγωγή Σήματος Ανάλυση κατά Scatchard Διδάσκουσα: Καθ. Μαρία - Ελένη Ε. Λέκκα

2 Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σε άδειες χρήσης Creative Commons. Για εκπαιδευτικό υλικό, όπως εικόνες, που υπόκειται σε άλλου τύπου άδειας χρήσης, η άδεια χρήσης αναφέρεται ρητώς.

3 ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΠΡΟΣΔΕΤΗ-ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΤA SCATCHARD

4 ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΤA SCATCHARD Χρησιμοποιείται για τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό της αλληλεπίδρασης υποδοχέα-προσδέτη

5 ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΠΡΟΣΔΕΤΗ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΚΑΤA SCATCHARD Χρησιμοποιείται για τον ποσοτικό και ποιοτικό προσδιορισμό των επιφανειακών υποδοχέων ενός αγωνιστή στα κύτταρα Χρησιμοποιούμε ραδιοσημασμένους («θερμούς») προσδέτες (L), πχ μια ορμόνη. Σε συγκεκριμένη ποσότητα υποδοχέων (R) προστίθενται αυξανόμενες ποσότητες ραδιοσημασμένου L. Το κλάσμα του L που συνδέθηκε με τον υποδοχέα R, προσδιορίζεται με το διαχωρισμό του συμπλόκου RL από την ελεύθερη ορμόνη L Κατασκευάζουμε καμπύλη [RL] vs [L] + [R] (ολική ποσότητα ορμόνης που προστέθηκε). Η καμπύλη έχει μορφή υπερβολής και αυξάνει προς ένα μέγιστο, στο οποίο έχουμε κορεσμό των υποδοχέων

6 ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΠΡΟΣΔΕΤΗ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΚΑΤA SCATCHARD Για να ελέγξουμε τiς θέσεις μη ειδικής σύνδεσης (non-specific binding), που αντιστοιχεί σε καμπύλη χωρίς κορεσμό, (πχ οι εικοσανοειδείς ορμόνες προσδένονται μη ειδικά στις βιολογικές μεμβράνες), κάνουμε μια σειρά συμπληρωματικών πειραμάτων. Παρασκευάζουμε σειρά διαλυμάτων αυξανόμενων συγκεντρώσεων ορμόνης, τα οποία περιέχουν σταθερή συγκέντρωση μεγάλης περίσσειας «ψυχρής» (μη ραδιοσημασμένης) Κατεργαζόμαστε τα κύτταρα συγκεκριμένης ποσότητας υποδοχέων (R) με τα μίγματα θερμού/ψυχρού L. Τα ψυχρά μόρια L ανταγωνίζονται με τα θερμά ως προς τις θέσεις ειδικής σύνδεσης στους υποδοχείς, αλλά όχι ως προς τη μη ειδική πρόσδεση. Η πραγματική τιμή της ειδικής πρόσδεσης προκύπτει από την αφαίρεση της μη ειδικής από την ολική πρόσδεση. Από τη γραμμική καμπύλη [RL]/[L] vs [RL]. Προκύπτει μια Κd και Bmax για το σύμπλοκο υποδοχέα-ορμόνης Συγκρίνουμε τις καμπύλες scatchard με αυτές της σύνδεσης ενζύμουυποστρώματος

7

8 ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΣΥΓΓΕΝΕΙΑΣ (ΑFFINITY CHROMATOGRAPHY)

9 ΜΕΛΕΤΗ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ Πειράματα λειτουργικής έκφρασης (functional expression assays) Κύτταρα-στόχοι που δε διαθέτουν υποδοχείς για σεγκεκριμένο προσδέτη Χ διαμολύνονται (transfected) με φορέα έκφρασης cdna που κωδικεύει τον υποδοχέα. Ο σχεδιασμός του φορέα έκφρασης διαχωρίζει τα τροποποιημένα κύτταρα από τα υπόλοιπα. Εφ όσον τα κύτταρα αυτά εκφράζουν τις σηματοδοτικές πρωτεΐνες, μπορεί να μελετηθεί η λειτουργικότητα και τα χαρακτηριστικά του υποδοχέα

10

11 Τέλος Ενότητας

12 Χρηματοδότηση Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στα πλαίσια του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα. Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων» έχει χρηματοδοτήσει μόνο τη αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού. Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους.

13 Σημειώματα

14 Σημείωμα Ιστορικού Εκδόσεων Έργου Το παρόν έργο αποτελεί την έκδοση 1.0. Έχουν προηγηθεί οι κάτωθι εκδόσεις: Έκδοση 1.0 διαθέσιμη εδώ.

15 Σημείωμα Αναφοράς Copyright Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, Διδάσκουσα: Καθ. Μαρία - Ελένη Ε. Λέκκα. «Βιολογικές Μεμβράνες και Μεταγωγή Σήματος. Ανάλυση κατά Scatchard». Έκδοση: 1.0. Ιωάννινα Διαθέσιμο από τη δικτυακή διεύθυνση:

16 Σημείωμα Αδειοδότησης Το παρόν υλικό διατίθεται με τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Αναφορά Δημιουργού - Παρόμοια Διανομή, Διεθνής Έκδοση 4.0 [1] ή μεταγενέστερη. [1]