COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS

Transcript

1 COBAS TaqMan HBV Test For Use With The High Pure System ΓΙΑ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ. COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS 48 Tests P/N: High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 Tests P/N: ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Το COBAS TaqMan HBV Test, Για Χρήση με το High Pure System (HPS) είναι μια in vitro εξέταση ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος για την ποσοτικοποίηση του DNA του Ιού της Ηπατίτιδας Β (HBV) σε ανθρώπινο ορό ή πλάσμα, χρησιμοποιώντας το High Pure System Viral Nucleic Acid Kit για χειροκίνητη προετοιμασία δείγματος και τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή για αυτόματη ενίσχυση και ανίχνευση. Το COBAS TaqMan HBV Test δεν προορίζεται για χρήση ως τεστ ελέγχου (screening test) σε αίμα ή προϊόντα αίματος για την παρουσία HBV ή ως διαγνωστική εξέταση για την επιβεβαίωση της παρουσίας μόλυνσης HBV. ΣΥΝΟΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ O Ιός της Ηπατίτιδας Β (HBV) είναι ένας από τους διάφορους ιούς που είναι γνωστό ότι προκαλούν ιογενή ηπατίτιδα. Πάνω από δύο δισεκατομμύρια άνθρωποι έχουν μολυνθεί με HBV παγκοσμίως και πάνω από 350 εκατομμύρια από αυτούς είναι χρόνιοι φορείς της μόλυνσης 1. Οι χρόνιοι φορείς αντιμετωπίζουν υψηλότερο κίνδυνο μακροχρόνιων επιπλοκών μόλυνσης, συμπεριλαμβανομένων της χρόνιας ηπατίτιδας, της κίρρωσης και του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος 2,3,4. Οι ορολογικοί δείκτες χρησιμοποιούνται ευρέως ως διαγνωστικοί και/ή προγνωστικοί δείκτες οξείας ή χρόνιας μόλυνσης HBV. Ο πιο κοινός δείκτης της μόλυνσης HBV είναι η παρουσία του αντιγόνου επιφανείας (HBsAg) του HBV. Αν και οι φορείς ενδέχεται να αποβάλουν το HBsAg και να αναπτύξουν αντίσωμα σε αυτό, φαίνεται ότι υπάρχει ακόμη κίνδυνος για σοβαρές επιπλοκές του ήπατος αργότερα στη ζωή τους 5,6. Το αντιγόνο e του HBV (HBeAg) χρησιμοποιείται γενικά ως δευτερεύων δείκτης για να υποδείξει ενεργό αναδιπλασιασμό του HBV που σχετίζεται με την προοδευτική ηπατική νόσο. Η αποτυχία κάθαρσης του HBeAg φαίνεται ότι αυξάνει τον κίνδυνο ηπατικής νόσου τελικού σταδίου 7,8. Οι παραλλαγές στελεχών του HBV μπορούν είτε να παράγουν HBeAg μη ανιχνεύσιμο στον ορό ή το στέλεχος μπορεί να χάσει την ιδιότητά του να παράγει HBeAg ακόμη και υπό την παρουσία ενεργούς μόλυνσης 9. Συνεπώς, η χρήση του δείκτη αυτού για την παρακολούθηση της εξέλιξης της νόσου ενδέχεται να είναι περιορισμένης χρησιμότητας 10. Η ικανότητα ανίχνευσης του HBV DNA στον ορό έχει αναφερθεί ότι έχει προγνωστική αξία για την έκβαση των οξέων και χρόνιων λοιμώξεων HBV 11,12,13,14. Η μεθοδολογία μπορεί να επιτρέψει την ανίχνευση του HBV DNA μετά την κάθαρση του HBsAg 15 ή την ανίχνευση του HBV χωρίς ορολογικούς δείκτες 16. Ωστόσο, ακόμη δεν έχει εδραιωθεί μια σχέση μεταξύ των ορολογικών δεικτών και των επιπέδων HBV DNA. Η αποτελεσματικότητα της αντιικής θεραπείας που χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία ασθενών με HBV μπορεί να αξιολογηθεί επίσης με τη βοήθεια των ορολογικών δεικτών ή της μέτρησης της λειτουργίας του ενζύμου του ήπατος. Ωστόσο, η πιο άμεση και αξιόπιστη μέτρηση του αναδιπλασιασμού του ιού θεωρείται η ποσοτικοποίηση του ιικού DNA του HBV στον ορό ή το πλάσμα 13,17,18,19. Μια ραγδαία και διαρκής πτώση των επιπέδων HBV DNA των ασθενών που υποβάλλονται σε θεραπεία με άλφα-ιντερφερόνη, Λαμιβουδίνη ή Γκανσικλοβίρη έχει αποδειχτεί ότι αποτελεί προγνωστικό παράγοντα για ευνοϊκή έκβαση της θεραπείας 10,20,21,22,23,24. Η παρακολούθηση των επιπέδων HBV DNA μπορεί να αποτελέσει πρόβλεψη της ανάπτυξης αντίστασης στη Λαμιβουδίνη 25. Για το λόγο αυτόν, μια ποσοτική εξέταση για τη μέτρηση του HBV DNA αποτελεί πολύτιμο εργαλείο που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με άλλους ορολογικούς δείκτες για την αντιμετώπιση της μόλυνσης HBV. ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Το COBAS TaqMan HBV Test βασίζεται σε δύο κύριες διαδικασίες: (1) χειροκίνητη προετοιμασία δείγματος για τη λήψη HBV DNA, (2) αυτοματοποιημένη ενίσχυση PCR του DNA στόχου με τη χρήση ειδικών για το HBV συμπληρωματικών εκκινητών και ανίχνευση διασπώμενων διπλά επισημασμένων με φθορίζουσα χρωστική ολιγονουκλεοτιδίων ιχνηθετών ανίχνευσης που επιτρέπουν την ποσοτικοποίηση του ενισχυμένου προϊόντος (κλώνος (amplicon)) του HBV στόχου και του DNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV, που υποβάλλεται σε επεξεργασία, ενίσχυση και ανίχνευση παράλληλα με το δείγμα. Το αντιδραστήριο Κυρίου Μίγματος περιέχει ζεύγη εκκινητών και ιχνηθέτες ειδικούς για HBV DNA και το DNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV. Το Κύριο Μίγμα έχει αναπτυχθεί για τη διασφάλιση της ισοδύναμης ποσοτικοποίησης όλων των γονότυπων από Α έως G του HΒV. Η ανίχνευση του ενισχυμένου DNA εκτελείται με τη χρήση ολιγονουκλεοτιδικών διπλά επισημασμένων ιχνηθετών, ειδικών για το στόχο και για το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης, που επιτρέπουν τον ανεξάρτητο εντοπισμό του κλώνου (amplicon) του HΒV και του κλώνου (amplicon) του Προτύπου Ποσοτικοποίησης του HΒV. Η ποσοτικοποίηση του ιικού DNA του HBV εκτελείται με τη χρήση του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV. Το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HBV είναι ένα μη μολυσματικό γραμμικοποιημένο πλασμίδιο που περιέχει τις ίδιες ακριβώς περιοχές δέσμευσης εκκινητή με το HBV DNA στόχο και μια μοναδική περιοχή δέσμευσης ιχνηθέτη που επιτρέπει το διαχωρισμό του κλώνου (amplicon) του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV από τον κλώνο (amplicon) στόχο του HBV. Το Πρότυπο Η ενότητα «Πληροφορίες Αναθεώρησης Εγγράφου» βρίσκεται στο τέλος του παρόντος εγγράφου EL 1

2 Ποσοτικοποίησης HBV ενσωματώνεται σε κάθε μεμονωμένο δείγμα και ορό ελέγχου σε ένα γνωστό αριθμό αντιγράφων και μεταφέρεται κατά την προετοιμασία δείγματος, την ενίσχυση PCR και την ανίχνευση μαζί με το HBV στόχο. Ο COBAS TaqMan 48 Αναλυτής υπολογίζει τον τίτλο HBV DNA στο δείγμα εξέτασης συγκρίνοντας το σήμα HBV με το σήμα Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV για κάθε δείγμα και ορό ελέγχου. Το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HΒV αντισταθμίζει τα αποτελέσματα της αναστολής και ελέγχει τις διαδικασίες προετοιμασίας και ενίσχυσης έτσι ώστε να επιτραπεί ο ακριβής ποσοτικός προσδιορισμός του HΒV DNA σε κάθε δείγμα. Προετοιμασία Δείγματος Το COBAS TaqMan HBV Test υποβάλλει σε επεξεργασία τα δείγματα πλάσματος και ορού και απομονώνει το HBV DNA μέσω γενικής χειροκίνητης προετοιμασίας δείγματος με βάση το νουκλεϊκό οξύ που δεσμεύεται σε ίνες υάλου. Πραγματοποιείται λύση των σωματιδίων του ιού HBV μέσω επώασης σε υψηλή θερμοκρασία με πρωτεάση και χαοτροπικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης/δέσμευσης που απελευθερώνει τα νουκλεϊκά οξέα και προστατεύει το απελευθερωμένο HBV DNA από DNases σε πλάσμα και ορό. Σε κάθε δείγμα εισάγεται ένας γνωστός αριθμός μορίων DNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV με το αντιδραστήριο λύσης. Στη συνέχεια, προστίθεται ισοπροπανόλη στο μίγμα λύσης, το οποίο υποβάλλεται σε φυγοκέντριση μέσω στήλης με ένθετο φίλτρο ινών υάλου. Κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρισης, το HBV DNA και το DNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV δεσμεύονται στην επιφάνεια του φίλτρου ινών υάλου. Οι μη δεσμευμένες ουσίες, όπως άλατα, πρωτεΐνες και άλλες κυτταρικά υπολείμματα, απομακρύνονται με τη φυγοκέντριση. Τα νουκλεϊκά οξέα που απορροφώνται, πλένονται και εκλούονται με υδατικό διάλυμα. Τα αναλώσιμα υλικά επιτρέπουν την παράλληλη επεξεργασία 12 δειγμάτων ή πολλαπλασίων τους. Το επεξεργασμένο δείγμα, που περιέχει HBV DNA και DNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV, προστίθεται στο μίγμα ενίσχυσης/ανίχνευσης. Το HBV DNA -στόχος και το DNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV ενισχύονται στη συνέχεια και ανιχνεύονται στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή με χρήση των αντιδραστηρίων ενίσχυσης και ανίχνευσης που παρέχονται στο Κιτ Εξέτασης. Ενίσχυση PCR Επιλογή Στόχου Η επιλογή της αλληλουχίας DNA-στόχου για το HBV εξαρτάται από τον εντοπισμό των περιοχών εντός του γονιδιώματος HBV που επιδεικνύουν μέγιστο βαθμό διατήρησης αλληλουχίας μεταξύ όλων των γονότυπων. Αντίστοιχα, η ορθή επιλογή εκκινητών και ιχνηθέτη είναι αποφασιστικής σημασίας για τη δυνατότητα της εξέτασης να ανιχνεύσει όλους τους κλινικά σχετικούς γονοτύπους του HBV. Μια περιοχή του εν μέρει μονόκλωνου κυκλικού γονιδιώματος DNA του HBV έχει επιδείξει μέγιστη διατήρηση αλληλουχιών DNA μεταξύ των γονότυπων. Το COBAS TaqMan HBV Test χρησιμοποιεί εκκινητές ενίσχυσης PCR που καθορίζουν μια αλληλουχία εντός της προπυρηνικής/πυρηνικής περιοχή υψηλής διατήρησης του γονιδιώματος HBV. Ενίσχυση Στόχου Τα επεξεργασμένα δείγματα προστίθενται στο μίγμα ενίσχυσης σε σωληνάρια ενίσχυσης (K-tubes) στα οποία πραγματοποιείται ενίσχυση PCR. Ο Θερμοκυκλοποιητής του COBAS TaqMan 48 Αναλυτή θερμαίνει το μίγμα αντίδρασης για την αποδιάταξη του δίκλωνου DNA και την έκθεση των αλληλουχιών στόχου ειδικών για τον εκκινητή στο γονιδίωμα του κυκλικού DNA HBV και του DNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV. Καθώς το μίγμα ψύχεται, οι εκκινητές υβριδίζονται στο DNA-στόχο. Η θερμοσταθερή Ζ05 DNA Πολυμεράση Thermus specie (Ζ05) με την παρουσία Mn 2+ και πλεονάσματος τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοζιτών (dntps), στους οποίους περιλαμβάνονται η δεοξυαδενοσίνη, η δεοξυγουανοσίνη, η δεοξυκυτιδίνη και η δεοξυουριδίνη (αντί της θυμιδίνης), επεκτείνει τους υβριδισμένους εκκινητές κατά μήκος των προτύπου-στόχου για να δημιουργηθεί ένα μόριο δίκλωνου DNA, που ονομάζεται κλώνος (amplicon). Ο COBAS TaqMan 48 Αναλυτής επαναλαμβάνει αυτόματα τη διαδικασία αυτή για έναν καθορισμένο αριθμό κύκλων, καθένας από τους οποίους έχει ως αποτέλεσμα το διπλασιασμό των DNA κλώνων (amplicon). Ο απαιτούμενος αριθμός κύκλων προγραμματίζεται εκ των προτέρων στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. Η ενίσχυση πραγματοποιείται μόνο στη μεταξύ των εκκινητών περιοχή του γονιδιώματος HBV. Δεν ενισχύεται ολόκληρο το γονιδίωμα HBV. Επιλεκτική Ενίσχυση Η επιλεκτική ενίσχυση του νουκλεϊκού οξέος-στόχου από το δείγμα επιτυγχάνεται στο COBAS TaqMan HBV Test με τη χρήση του ενζύμου AmpErase (ουρακίλη-n-γλυκοζυλάση) και της τριφωσφορικής δεοξυουριδίνης (dutp). Το ένζυμο AmpErase αναγνωρίζει και καταλύει τη διάσπαση των κλώνων του DNA που περιέχουν δεοξυουριδίνη 26, αλλά όχι του DNA που περιέχει δεοξυθυμιδίνη. Η δεοξυουριδίνη δεν υπάρχει στο φυσικό DNA, αλλά υπάρχει πάντοτε στον κλώνο (amplicon) λόγω της χρήσης τριφωσφορικής δεοξυουριδίνης ως ενός από τα dntps του αντιδραστηρίου Κύριου Μίγματος. Για το λόγο αυτόν, μόνο ο κλώνος (amplicon) περιέχει δεοξυουριδίνη. Η δεοξυουριδίνη καθιστά το μολυσματικό κλώνο (amplicon) ευαίσθητο στη διάσπαση από το ένζυμο AmpErase πριν από την ενίσχυση του DNA στόχου. Επίσης, κάθε μη ειδικό προϊόν που σχηματίζεται από την αρχική ενεργοποίηση του Κύριου Μίγματος με μαγγάνιο καταστρέφεται από το ένζυμο AmpErase και έτσι βελτιώνεται η ευαισθησία και η ειδικότητα. To ένζυμο AmpErase, που περιλαμβάνεται στο αντιδραστήριο Κύριου Μίγματος, καταλύει τη σχάση του DNA που περιέχει δεοξυουριδίνη στα ιζήματα δεοξυουριδίνης ανοίγοντας την αλυσίδα της δεοξυριβόζης στη θέση C1. Όταν θερμαίνεται στο πρώτο βήμα της θερμοκυκλοποίησης, η αλυσίδα DNA του κλώνου (amplicon) διασπάται στη θέση της δεοξυουριδίνης, καθιστώντας το DNA μη ενισχύσιμο. Το ένζυμο AmpErase είναι αδρανές σε θερμοκρασίες πάνω από τους 55 C, δηλαδή, σε όλα τα βήματα της θερμοκυκλοποίησης, και για το λόγο αυτό δεν καταστρέφει τον κλώνο (amplicon)-στόχο που σχηματίζεται κατά την ενίσχυση EL 2

3 Ανίχνευση των Προϊόντων PCR με COBAS TaqMan Test Το COBAS TaqMan HBV Test χρησιμοποιεί τεχνολογία PCR σε πραγματικό χρόνο 27,28. Η χρήση ιχνηθετών με διπλή φθορίζουσα επισήμανση επιτρέπει την ανίχνευση της συσσώρευσης προϊόντων PCR σε πραγματικό χρόνο παρακολουθώντας την ένταση εκπομπής των φθοριζουσών χρωστικών αναφορέα που απελευθερώνονται κατά τη διαδικασία της ενίσχυσης. Οι ιχνηθέτες αποτελούνται από ολιγονουκλεοτίδια ειδικά για το HBV και το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HBV, επισημασμένα με χρωστική αναφορέα και χρωστική παρεμποδιστή. Στο COBAS TaqMan HBV Test, οι ιχνηθέτες του HBV και του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV είναι επισημασμένοι με διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές αναφορέα. Όταν οι διπλά επισημασμένοι με φθορίζουσα χρωστική ιχνηθέτες είναι ανέπαφοι, η δράση της φθορίζουσας χρωστικής αναφορέα καταστέλλεται λόγω της εγγύτητας της χρωστικής παρεμποδιστή, εξαιτίας των επιδράσεων της μεταφοράς ενέργειας τύπου Förster. Κατά τη διάρκεια της PCR, ο ιχνηθέτης υβριδίζεται σε αλληλουχία-στόχο και διασπάται λόγω της 5' 3' δραστικότητας της νουκλεάσης της θερμοσταθερής Z05 DNA πολυμεράσης. Μόλις απελευθερωθούν και αποχωριστούν οι χρωστικές αναφορέα και παρεμποδιστή, δεν πραγματοποιείται πλέον παρεμπόδιση και ενισχύεται η φθορίζουσα δραστηριότητα της χρωστικής αναφορέα. Η ενίσχυση του HBV DNA και του DNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV μετράται ανεξάρτητα σε διαφορετικά μήκη κύματος. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται για έναν καθορισμένο αριθμό κύκλων και κάθε κύκλος αυξάνει αποτελεσματικά την ένταση εκπομπής των μεμονωμένων χρωστικών αναφορέα, επιτρέποντας τον ανεξάρτητο εντοπισμό του HBV DNAκαι του DNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV. Η ένταση των σημάτων σχετίζεται με την ποσότητα των υλικών εκκίνησης κατά την έναρξη της PCR. Θεμελιώδεις αρχές της Ποσοτικοποίησης του COBAS TaqMan HBV Test Το COBAS TaqMan HBV Test παρέχει με ακρίβεια ποσοτικά αποτελέσματα σε ένα σημαντικά μεγάλο δυναμικό εύρος καθώς η παρακολούθηση του κλώνου (amplicon) εκτελείται κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης της ενίσχυσης. Όσο υψηλότερη είναι η συγκέντρωση τίτλου HBV ενός δείγματος, τόσο συντομότερα αυξάνεται ο φθορισμός της χρωστικής αναφορέα του ιχνηθέτη HBV πάνω από το αρχικό επίπεδο φθορισμού (βλέπε Σχήμα 1). Καθώς η ποσότητα του DNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης (QS) HBV παραμένει σταθερή σε όλα τα δείγματα, ο φθορισμός της χρωστικής αναφορέα του ιχνηθέτη QS HBV πρέπει να εμφανίζεται στον ίδιο κύκλο για όλα τα δείγματα (βλέπε Σχήμα 2). Σε περιπτώσεις όπου η ενίσχυση και η ανίχνευση του QS επηρεάζεται από αναστολή ή από χαμηλή ανάκτηση δείγματος, η εμφάνιση του φθορισμού θα καθυστερήσει, επιτρέποντας έτσι την ανάλογη προσαρμογή του υπολογισμένου τίτλου του HBV DNA στόχου. Η εμφάνιση του συγκεκριμένου σήματος φθορισμού αναφέρεται ως κρίσιμη τιμή κατωφλίου (Ct). Η τιμή Ct ορίζεται ως ο κλασματικός αριθμός κύκλου όπου η φθορίζουσα χρωστική αναφορέα υπερβαίνει μία προκαθορισμένη τιμή κατωφλίου (Καθορισμένο Επίπεδο Φθορισμού) και θέτει σε εκκίνηση την εκθετική φάση ανάπτυξης του σήματος αυτού (δείτε Σχήμα 3). Μια υψηλότερη τιμή Ct υποδεικνύει τίτλο χαμηλότερης συγκέντρωσης του αρχικού HBV DNA στόχου. Η διπλάσια αύξηση της συγκέντρωσης τίτλου συσχετίζεται με μείωση 1 Ct για το HBV DNA στόχο, ενώ η δεκαπλάσια αύξηση της συγκέντρωσης τίτλου συσχετίζεται με μείωση 3,3 Ct. Το Σχήμα 1 απεικονίζει τις καμπύλες ανάπτυξης στόχου για μια σειρά αραιώσεων ενός ιού εύρους 5-log 10. Καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση του ιού, οι καμπύλες ανάπτυξης μετατοπίζονται σε προηγούμενους κύκλους. Επομένως, η πιο αριστερή καμπύλη ανάπτυξης αντιστοιχεί στο υψηλότερο επίπεδο ιικού τίτλου, ενώ η πιο δεξιά καμπύλη ανάπτυξης αντιστοιχεί στο χαμηλότερο επίπεδο ιικού τίτλου. 9,00 Σχήμα 1 8,00 μ μ μ μ 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00-1, μ EL 3

4 Το Σχήμα 2 απεικονίζει τις καμπύλες ανάπτυξης του Προτύπου Ποσοτικοποίησης για δείγματα από μια σειρά αραιώσεων ιού εύρους 5-log 10. Η ποσότητα του Προτύπου Ποσοτικοποίησης που προστίθεται σε κάθε δείγμα είναι σταθερή για κάθε αντίδραση. Η τιμή Ct του Προτύπου Ποσοτικοποίησης είναι η ίδια ανεξάρτητα από τον ιικό τίτλο. Σχήμα 2 35,00 30,00 μ μ μ μ 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00-5, μ Το Σχήμα 3 παρέχει ένα παράδειγμα ομαλοποίησης των τιμών φθορισμού σε κάθε κύκλο για κάθε καμπύλη ανάπτυξης. Ο κλασματικός αριθμός κύκλου (Ct) υπολογίζεται όταν το σήμα φθορισμού τέμνει το Καθορισμένο Επίπεδο Φθορισμού. Σχήμα 3 1 0,9 μ μ μ μ 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 μ μ μ Ct = 27,1 0,1 0-0, μ Ποσοτικοποίηση του HBV DNA Το COBAS TaqMan HBV Test ποσοτικοποιεί το ιικό HBV DNA χρησιμοποιώντας μια δεύτερη αλληλουχία στόχου (Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HBV), η οποία προστίθεται σε κάθε δείγμα εξέτασης σε γνωστή συγκέντρωση. Το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HBV είναι ένα μη μολυσματικό γραμμικοποιημένο DNA πλασμίδιο που περιέχει τμήματα αλληλουχιών HBV με περιοχές δέσμευσης εκκινητή ίδιες ακριβώς με αυτές της αλληλουχίας στόχου HBV. Το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HBV δημιουργεί, επίσης, ένα προϊόν ενίσχυσης με ίδιο μήκος και σύνθεση βάσεων όπως το HBV DNA στόχος. Η περιοχή δέσμευσης του ιχνηθέτη ανίχνευσης του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV έχει τροποποιηθεί για τη διαφοροποίηση του κλώνου (amplicon) του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV από τον κλώνο (amplicon)-στόχο του HBV EL 4

5 Κατά τη διάρκεια της φάσης υβριδισμού της PCR στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, τα δείγματα εκτίθενται σε φως, διεγείρονται από φιλτραρισμένο φως και τα δεδομένα εκπομπής φθορισμού φιλτραρισμένα συλλέγονται για κάθε δείγμα. Στη συνέχεια, οι τιμές από κάθε δείγμα διορθώνονται για ενδεχόμενες διακυμάνσεις του οργάνου. Αυτές οι τιμές φθορισμού αποστέλλονται από το όργανο στο λογισμικό AMPLILINK και αποθηκεύονται στη βάση δεδομένων. Διενεργούνται προκαταρκτικοί έλεγχοι για να διαπιστωθεί αν τα δεδομένα του HBV DNA και του DNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV αντιπροσωπεύουν έγκυρα σετ και δημιουργούνται ενδείξεις, όταν τα δεδομένα είναι εκτός των προκαθορισμένων ορίων. Μετά την επιτυχή ολοκλήρωση όλων των Προκαταρκτικών Ελέγχων, οι τιμές φθορισμού υποβάλλονται σε επεξεργασία για την παραγωγή τιμών Ct για το HBV DNA και το DNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV. Οι ειδικές για την παρτίδα σταθερές βαθμονόμησης, που παρέχονται με το COBAS TaqMan HBV Test, χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό της τιμής τίτλου για τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου με βάση τις τιμές Ct του HBV DNA και του DNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV. Το COBAS TaqMan HBV Test προτυποποιείται έναντι του Διεθνούς Προτύπου HBV του ΠΟΥ για Εξέταση NAT (εξέταση ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος) 97/ και τα αποτελέσματα τίτλου εκφράζονται σε Διεθνείς Μονάδες (IU/mL). ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 Εξετάσεις Κιτ Απομόνωσης ιικού Νουκλεϊνικού Οξέος με Σύστημα High Pure (P/N: ) LYS 2 x 25 ml (Ρυθμιστικό Διάλυμα Λύσης/Δέσμευσης) Tris 50% (w/w) Υδροχλωρική γουανιδίνη < 1% Ουρία 19% (w/w) Triton X-100 Xn 50% (w/w) Υδροχλωρική γουανιδίνη + Επιβλαβές CAR (RNA, λυοφιλοποιημένο) PK (Πρωτεϊνάση Κ, λυοφιλοποιημένη) 64% (w/w) Πρωτεϊνάση Κ, λυοφιλοποιημένη Xn 64% (w/w) Πρωτεϊνάση Κ, λυοφιλοποιημένη + 2 x 2 mg 2 x 100 mg Επιβλαβές IRB (Ρυθμιστικό Διάλυμα Αφαίρεσης Αναστολέα) Tris 65% Υδροχλωρική γουανιδίνη (προσθέστε 20 ml Αιθανόλη) Xn 65% (w/w) Υδροχλωρική γουανιδίνη + 1 x 33 ml Επιβλαβές WASH (Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης) Tris NaCl (προσθέστε 80 ml Αιθανόλη) ELB (Ρυθμιστικό Διάλυμα Έκπλυσης) 1 x 20 ml 1 x 30 ml EL 5

6 RS (Σετ Υποδοχής του High Pure System Viral Nucleic Acid) Υποδοχή Λύσης Υποδοχή Σωληναρίων Φίλτρου με προσαρτημένη Υποδοχή Απορριμμάτων Υποδοχή Έκπλυσης Υποδοχή Καλύμματος 4 x το καθένα WR 8 x το καθένα (Υποδοχή Απορριμμάτων του High Pure System Viral Nucleic Acid) COBAS TaqMan HBV Test 48 Εξετάσεις HBV HPS (P/N: ) Αντιδραστήρια Προετοιμασίας Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου HBV QS 2 x 1,0 ml (Πρότυπο Ποσοτικοποίησης COBAS TaqMan HBV) Ρυθμιστικό διάλυμα Tris-HCl EDTA < 0,001% γραμμικοποιημένο, δίκλωνο DNA πλασμίδιο που περιέχει ένα ένθετο Το ένθετο του DNA περιέχει αλληλουχίες δέσμευσης εκκινητή HBV και μια μοναδική περιοχή δέσμευσης ιχνηθετών. Χρωστική ύλη αμαράνθης < 0,005% Poly ra RNA (συνθετικό) 0,05% Αζίδιο του νατρίου HBV H(+)C 2 x 1,0 ml [HBV Ορός ελέγχου (+) Υψηλής Συγκέντρωσης] < 0,001% γραμμικοποιημένο, δίκλωνο DNA πλασμίδιο που περιέχει αλληλουχίες ΗBV. Αρνητικό Ανθρώπινο Πλάσμα, μη αντιδρών σε εγκεκριμένες από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) των ΗΠΑ εξετάσεις ανίχνευσης αντισωμάτων HCV, αντισωμάτων HIV-1/2, HIV p24 αντιγόνου και HBsAg. Τα HIV-1 RNA, HCV RNA και HBV DNA δεν ανιχνεύτηκαν με μεθόδους PCR. 0,1% συντηρητικό ProClin 300 Xi μίγμα (3:1) 6-Χλωρο-2-μεθυλο-2H-ισοθειαζολ-3-όνης και 2-μεθυλο-2H-ισοθειαζολ-3-όνης + Ερεθιστικό R36/38: Ερεθίζει τα μάτια και το δέρμα. R43: Μπορεί να προκαλέσει ευαισθητοποίηση σε επαφή µε το δέρµα. HBV L(+)C 2 x 1,0 ml [HΒV Ορός ελέγχου (+) Χαμηλής Συγκέντρωσης] < 0,001% γραμμικοποιημένο, δίκλωνο DNA πλασμίδιο που περιέχει αλληλουχίες ΗBV. Αρνητικό Ανθρώπινο Πλάσμα, μη αντιδρών σε εγκεκριμένες από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) των ΗΠΑ εξετάσεις ανίχνευσης αντισωμάτων HCV, αντισωμάτων HIV-1/2, HIV p24 αντιγόνου και HBsAg. Τα HIV-1 RNA, HCV RNA και HBV DNA δεν ανιχνεύτηκαν με μεθόδους PCR. 0,1% συντηρητικό ProClin 300 Xi μίγμα (3:1) 6-Χλωρο-2-μεθυλο-2H-ισοθειαζολ-3-όνης και 2-μεθυλο-2H-ισοθειαζολ-3-όνης + Ερεθιστικό R36/38: Ερεθίζει τα μάτια και το δέρμα. R43: Μπορεί να προκαλέσει ευαισθητοποίηση σε επαφή µε το δέρµα EL 6

7 CTM ( ) C 4 x 1,0 ml [COBAS TaqMan Αρνητικός Ορός Ελέγχου (Ανθρώπινο Πλάσμα)] Αρνητικό Ανθρώπινο Πλάσμα, μη αντιδρών σε εγκεκριμένες από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) των ΗΠΑ εξετάσεις ανίχνευσης αντισωμάτων HCV, αντισωμάτων HIV-1/2, HIV p24 αντιγόνου και HBsAg. Τα HIV-1 RNA, HCV RNA και HBV DNA δεν ανιχνεύτηκαν με μεθόδους PCR. 0,1% συντηρητικό ProClin 300 Xi μίγμα (3:1) 6-Χλωρο-2-μεθυλο-2H-ισοθειαζολ-3-όνης και 2-μεθυλο-2H-ισοθειαζολ-3-όνης + Ερεθιστικό R36/38: Ερεθίζει τα μάτια και το δέρμα. R43: Μπορεί να προκαλέσει ευαισθητοποίηση σε επαφή µε το δέρµα. Αντιδραστήρια Ενίσχυσης και Ανίχνευσης HBV MMX 2 x 24 Εξετάσεις (COBAS TaqMan HBV Κύριο Μίγμα) 2 x 1,4 ml Ρυθμιστικό διάλυμα Tricine Υδροξείδιο του Καλίου Οξικό Κάλιο Γλυκερόλη < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,001% Νοηματικοί και αντινοηματικοί εκκινητές στην Προ-Πυρηνική/Πυρηνική περιοχή του HBV < 0,001% ιχνηθέτες ολιγονουκλεοτιδίων με φθορίζουσα επισήμανση ειδικοί για HBV και το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HBV < 0,001% Ολιγονουκλεοτιδικό Aptamer < 0,05% Z05 DNA Πολυμεράση (μικροβιακό) < 0,1% Ένζυμο AmpErase (ουρακίλη-n-γλυκοζυλάση) (μικροβιακό) 0,09% Αζίδιο του νατρίου CTM Mn 2+ 2 x 24 Εξετάσεις (COBAS TaqMan Διάλυμα Μαγγανίου) 2 x 1,0 ml < 1,2% Οξικό μαγγάνιο Παγόμορφο οξικό οξύ 0,09% Αζίδιο του νατρίου ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ A. ΓΙΑ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ. Β. Η παρούσα εξέταση προορίζεται για χρήση με ανθρώπινο πλάσμα που έχει συλλεχτεί σε αντιπηκτικό EDTA και ανθρώπινο ορό. Γ. Μην αναρροφάτε με πιπέτα από το στόμα. Δ. Μην τρώτε, πίνετε ή καπνίζετε στους χώρους εργασίας των εργαστηρίων. Φοράτε προστατευτικά γάντια μιας χρήσης, ποδιές εργαστηρίου και προστατευτικά γυαλιά όταν χειρίζεστε δείγματα και κιτ αντιδραστηρίων. Πλένετε καλά τα χέρια σας μετά το χειρισμό δειγμάτων και αντιδραστηρίων της εξέτασης. E. Αποφεύγετε τη μόλυνση των αντιδραστηρίων από μικρόβια και ριβονουκλεάση όταν αφαιρείτε τα κλάσματα δείγματος από τις φιάλες αντιδραστηρίων. ΣΤ. Συνιστάται η χρήση αποστειρωμένων πιπετών μιας χρήσης με ακροφύσια ελεύθερα από DNase. Ζ. Μη συγκεντρώνετε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες ή από διαφορετικές φιάλες της ίδιας παρτίδας. H. Μην συνδυάζετε αντιδραστήρια από διαφορετικά κιτ. Θ. Η απόρριψη των αχρησιμοποίητων αντιδραστηρίων, των απορριμμάτων και των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς. Ι. Μη χρησιμοποιείτε ένα κιτ μετά την ημερομηνία λήξης του. ΙΑ. Διατίθενται Δελτία Δεδομένων Ασφάλειας (SDS), κατόπιν αιτήματος από τα γραφεία της Roche στην περιοχή σας. ΙΒ. Τα δείγματα και οι οροί ελέγχου πρέπει να αντιμετωπίζονται ως μολυσματικά και ο χειρισμός τους να γίνεται με ασφαλείς εργαστηριακές διαδικασίες, όπως αυτές που περιγράφονται στην τεκμηρίωση Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 30 και στο έγγραφο CLSI M29-A3 31. Καθαρίζετε καλά και απολυμαίνετε όλες τις επιφάνειες εργασίας με φρέσκο διάλυμα 0,5% υποχλωριώδους νατρίου σε απιονισμένο ή απεσταγμένο νερό EL 7

8 ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα οικιακά υγρά λευκαντικά του εμπορίου περιέχουν κατά κανόνα υποχλωριώδες νάτριο σε συγκέντρωση 5,25%. Η αραίωση οικιακού λευκαντικού σε αναλογία 1:10 παράγει διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 0,5%. ΙΓ. ΠΡΟΣΟΧΗ: Τα CTM ( ) C, HBV L(+)C και HBV H(+)C περιέχουν Ανθρώπινο Πλάσμα που προέρχεται από ανθρώπινο αίμα. Το υλικό προέλευσης έχει ελεγχθεί με επιτρεπόμενες από τον FDA των ΗΠΑ εξετάσεις και έχει βρεθεί ότι δεν αντιδρά στην παρουσία Αντιγόνου Επιφανείας Ηπατίτιδας Β (HΒsAg), αντισωμάτων HIV-1/2 και HCV, και HIV p24 Αντιγόνου. Η εξέταση του αρνητικού ανθρώπινου πλάσματος με τις μεθόδους PCR δεν έδειξε ανιχνεύσιμο HIV-1 RNA, HCV RNA ή HBV DNA. Καμία γνωστή μέθοδος εξέτασης δεν διασφαλίζει απόλυτα ότι τα προϊόντα που προέρχονται από ανθρώπινο αίμα δεν μεταδίδουν μολυσματικούς παράγοντες. Για το λόγο αυτό, όλα τα υλικά ανθρώπινης προέλευσης πρέπει να θεωρούνται δυνάμει μολυσματικά. Τα CTM ( ) C, HBV L(+)C και HBV H(+)C πρέπει να αντιμετωπίζονται ως μολυσματικά και ο χειρισμός τους να γίνεται με ασφαλείς εργαστηριακές πρακτικές, όπως αυτές που περιγράφονται στην τεκμηρίωση Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 30 και στο έγγραφο CLSI M29-A3 31. Καθαρίζετε καλά και απολυμαίνετε όλες τις επιφάνειες εργασίας με φρέσκο διάλυμα 0,5% υποχλωριώδους νατρίου σε απιονισμένο ή απεσταγμένο νερό. ΙΔ. Τα HBV MMX, HBV QS και CTM Mn 2+ περιέχουν αζίδιο του νατρίου. Το αζίδιο του νατρίου μπορεί να αντιδράσει με το μόλυβδο και το χαλκό των σωληνώσεων και να δημιουργήσει υψηλής εκρηκτικότητας αζίδια μετάλλου. Όταν απορρίπτετε διαλύματα που περιέχουν αζίδιο του νατρίου στους νεροχύτες των εργαστηρίων, ρίχνετε άφθονη ποσότητα νερού για να αποφύγετε το σχηματισμό αζιδίου. ΙΕ. Φοράτε προστατευτικά γυαλιά, ποδιές εργαστηρίου και γάντια μίας χρήσης όταν χειρίζεστε οποιοδήποτε αντιδραστήριο. Αποφύγετε την επαφή των υλικών αυτών με το δέρμα, τα μάτια ή τους βλεννογόνους. Σε περίπτωση τυχαίας επαφής, ξεπλύνετε αμέσως με άφθονη ποσότητα νερού. Εάν δεν υπάρξει άμεση αντιμετώπιση, μπορεί να προκληθούν εγκαύματα. Εάν πέσουν σταγόνες από τα αντιδραστήρια, αραιώστε με νερό πριν τις σκουπίσετε. ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΚΑΙ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ Αντιδραστήρια Προετοιμασίας Δείγματος A. Αποθηκεύστε τα Αντιδραστήρια του High Pure System Viral Nucleic Acid στους C κατά την παραλαβή τους. B. Αποθηκεύστε το Ρυθμιστικό Διάλυμα Έκπλυσης (ELB) και το Ρυθμιστικό Διάλυμα Λύσης/Δέσμευσης (LYS) στους C. Αφού ανοιχτούν, αποθηκεύστε τα ELB και LYS στους C. Μετά το άνοιγμα, τα ELB και LYS πρέπει να χρησιμοποιηθούν εντός 30 ημερών ή ως την ημερομηνία λήξης, ημερομηνία που θα επέλθει πρώτη. Γ. Μετά την προσθήκη του Ρυθμιστικού Διαλύματος Έκπλυσης (ELB) για ανασύσταση του Φορέα RNA και της Πρωτεϊνάσης K, αποθηκεύστε τον ανασυσταμένο Φορέα RNA (CAR) και την ανασυσταμένη Πρωτεϊνάση Κ (PK) που δεν έχουν χρησιμοποιηθεί στους -15 έως -25 C. Μετά την ανασύσταση, ο Φορέας RNA και η Πρωτεϊνάση Κ πρέπει να χρησιμοποιηθούν εντός 30 ημερών ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την περίπτωση. Δ. Μετά την προσθήκη αιθανόλης, αποθηκεύστε το Ρυθμιστικό Διάλυμα Αφαίρεσης Αναστολέα (IRB) και το Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης (WASH) στους C. Αυτά τα Διαλύματα Εργασίας παραμένουν σταθερά για 30 ημέρες ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την περίπτωση. E. Το Διάλυμα Εργασίας Λύσης/Δέσμευσης [Ρυθμιστικό διάλυμα Λύσης/Δέσμευσης με Φορέα RNA, Πρωτεϊνάση K και HBV QS] πρέπει να χρησιμοποιείται αμέσως μετά την ακόλουθη προετοιμασία. Κάθε πλεόνασμα πρέπει να απορρίπτεται. Αντιδραστήρια Ενίσχυσης και Ανίχνευσης A. Μην καταψύχετε τα αντιδραστήρια ή τους ορούς ελέγχου. B. Αποθηκεύστε τα HBV MMX, CTM ( ) C, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS και CTM Mn 2+ στους 2-8 C. Τα αντιδραστήρια αυτά, αν δεν ανοιχτούν, παραμένουν σταθερά μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μετά το άνοιγμα, για τη αφαίρεση ενός κλάσματος δείγματος για παρτίδα μεγέθους 12 δειγμάτων, αποθηκεύστε τα υπολειπόμενα HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS και CTM Mn 2+ στους 2-8 C. Μετά το άνοιγμα, τα HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS και CTM Mn 2+ παραμένουν σταθερά στους 2-8 C για 30 ημέρες ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την περίπτωση. Μετά το άνοιγμα, η ποσότητα του CTM ( ) C που δεν έχει χρησιμοποιηθεί πρέπει να απορρίπτεται. Γ. Το Κύριο Μίγμα Εργασίας (που προετοιμάζεται με την προσθήκη CTM Mn 2+ στο HBV MMX) πρέπει να αποθηκεύεται στους 2-8 C σε σκοτεινό μέρος. Τα δείγματα και οι οροί ελέγχου που έχουν προετοιμαστεί πρέπει να προστίθενται εντός 2 ωρών από την προετοιμασία του Κύριου Μίγματος Εργασίας. Δ. Τα επεξεργασμένα δείγματα και οροί ελέγχου παραμένουν σταθερά έως και 3 ώρες στους C, 24 ώρες στους 2-8 C ή κατεψυγμένα στους -20 C έως και 1 εβδομάδα. E. Η ενίσχυση πρέπει να ξεκινήσει μέσα σε 3 ώρες από τη στιγμή που τα επεξεργασμένα δείγματα και οι οροί ελέγχου προστέθηκαν στο Κύριο Μίγμα Εργασίας EL 8

9 ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Αντιδραστήρια Προετοιμασίας Δείγματος A. High Pure System Viral Nucleic Acid Kit Κιτ Απομόνωσης ιικού Νουκλεϊνικού Οξέος με Σύστημα High Pure (P/N: ) LYS (Ρυθμιστικό Διάλυμα Λύσης/Δέσμευσης) CAR (Φορέας RNA) PK (Πρωτεϊνάση K) IRB (Ρυθμιστικό Διάλυμα Αφαίρεσης Αναστολέα) WASH (Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης) ELB (Ρυθμιστικό Διάλυμα Έκπλυσης) RS (Σετ Υποδοχής του High Pure System Viral Nucleic Acid) WR (Υποδοχή Απορριμμάτων του High Pure System Viral Nucleic Acid) Αντιδραστήρια Ενίσχυσης και Ανίχνευσης B. COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS (P/N: ) HBV QS (Πρότυπο Ποσοτικοποίησης COBAS TaqMan HBV) HBV H(+)C [HBV Ορός ελέγχου (+) Υψηλής Συγκέντρωσης] HBV L(+)C [HΒV Ορός ελέγχου (+) Χαμηλής Συγκέντρωσης] CTM ( ) C [COBAS TaqMan Αρνητικός Ορός Ελέγχου (Ανθρώπινο Πλάσμα)] HBV MMX (COBAS TaqMan HBV Κύριο Μίγμα) CTM Mn 2+ (COBAS TaqMan Διάλυμα Μαγγανίου) EL 9

10 ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Όργανο και Λογισμικό COBAS TaqMan 48 Αναλυτής Λογισμικό AMPLILINK Σταθμός δεδομένων για το λογισμικό AMPLILINK Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS TaqMan 48 αναλυτή, για χρήση με το AMPLILINK λογισμικό, έκδοση σειράς 3.2 και 3.3 Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK Λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.2, για χρήση με το COBAS AmpliPrep Όργανο, τον COBAS TaqMan Αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή ή Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.3, για χρήση με το COBAS AmpliPrep όργανο, τον COBAS TaqMan αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR αναλυτή και το cobas p 630 όργανο Αρχείο Ορισμού Εξέτασης (TDF). Για το όνομα και την έκδοση του TDF ανατρέξτε στην Καρτέλα Στοιχείων Προϊόντος που παρέχεται μαζί με το κιτ. Πωματιστής K-tube (P/N: ) Εργαλείο πωματισμού K-tray (P/N: ) K-carrier COBAS TaqMan 48 Αναλυτή (P/N: ) K-tray carrier (P/N: ) Συγκρατητής K-carrier (P/N: ) Μεταφορέας K-carrier (P/N: ) Υλικά μίας χρήσης Κιβώτιο των 12 x 96 K-tube (P/N: ) Κιβώτιο των 24 K-tray (P/N: ) Απαιτήσεις Φυγόκεντρου Επιτραπέζια φυγόκεντρος Sigma 4-15C ή αντίστοιχη φυγόκεντρος μικροπλάκας με απόδοση φυγόκεντρου δύναμης 4600 x g Πτυσσόμενος ρότορας φυγόκεντρου Sigma P/N: (περιλαμβάνει 2 κάδους P/N: και 2 συγκρατητές πλάκας P/N: 17978) ή αντίστοιχο ΑΛΛΑ ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Ισοπροπανόλη (> 99%) πληροί τις προδιαγραφές ACS ή ανώτερες Αιθανόλη (96-100%) πληροί τις προδιαγραφές ACS ή ανώτερες Ρυθμιζόμενες Συσκευές Πιπέτας*: (χωρητικότητα 250 µl και 1000 µl) με ακροφύσια φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης ελεύθερα από Dnase Βοήθημα πιπέτας: Drummond (P/N: ) ή αντίστοιχο Υδατόλουτρο που έχει ρυθμιστεί στους 50 C (± 2 C) Μονάδα Ξηρής Θερμότητας που έχει ρυθμιστεί στους 70 C (± 2 C) Αποστειρωμένες ορολογικές πιπέτες μιας χρήσης: 5, 10 και 25 ml Αποστειρωμένα κωνικά σωληνάρια πολυπροπυλενίου, 15 ml και 50 ml: Corning (P/N: και P/N: ) ή αντίστοιχο Αποστειρωμένα σωληνάρια μικροφυγόκεντρου 2,0 ml: Sarstedt (P/N: ) ή αντίστοιχο Αναδευτήρας τύπου Vortex Υποδοχές σωληναρίων Γάντια μιας χρήσης, χωρίς πούδρα Βαθμονομημένα Θερμόμετρα για Υδατόλουτρο και Μονάδα Ξηρής Θερμότητας * Οι συσκευές πιπέτας πρέπει να διαθέτουν ακρίβεια 3% του δηλούμενου όγκου. Τα ελεύθερα από Dnase ακροφύσια, με φραγή αερολυμάτων ή θετική μετατόπιση πρέπει να χρησιμοποιούνται όπου προδιαγράφεται, για να αποφεύγεται η διασταυρούμενη μόλυνση των δειγμάτων και των κλώνων (amplicon) EL 10

11 ΣΥΛΛΟΓΗ, ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όλα τα δείγματα και οι οροί ελέγχου πρέπει να θεωρούνται μολυσματικά και ο χειρισμός τους πρέπει να γίνεται ανάλογα. A. Συλλογή Δειγμάτων Το COBAS TaqMan HBV Test, προορίζεται αποκλειστικά για χρήση με δείγματα ορού ή πλάσματος. Το αίμα πρέπει να συλλέγεται σε Σωληνάρια Διαχωρισμού Ορού BD SST ή σε σωληνάρια με τη χρήση αντιπηκτικού EDTA (μωβ πώμα). Αποθηκεύετε το ολικό αίμα στους 2-25 C για διάστημα 1 ημέρας το μέγιστο. Με τη χρήση πλάσματος EDTA ή ορού προκύπτουν σχεδόν ισοδύναμα αποτελέσματα εξέτασης. Στο Σχήμα 4 απεικονίζεται η επίδραση του τύπου δείγματος στα αποτελέσματα HBV DNA από τα δείγματα ασθενών. Σχήμα 4 Σύγκριση Τύπων Δείγματος Πλάσματος EDTA και Ορού 12,00 10,00 Δ μ μ μ (Log HBV DNA IU/mL, n=2) 10 8,00 6,00 4,00 2,00 y = 1,0139x - 0,0703 R 2 = 0,9984 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Δ μ μ (Log 10 HBV DNA IU/mL, n = 2) Διαχωρίστε τον ορό ή το πλάσμα από το ολικό αίμα εντός 1 ημέρας από τη συλλογή, με φυγοκέντριση στα x g για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μεταφέρετε τον ορό ή το πλάσμα σε ένα αποστειρωμένο σωληνάριο πολυπροπυλενίου. Το Σχήµα 5 παρουσιάζει στοιχεία από τις µελέτες συλλογής αυτών των δειγµάτων. Σχήμα 5 Σταθερότητα HBV σε Ολικό Αίμα με Αντιπηκτικό EDTA ή στα Σωληνάρια Διαχωρισμού Ορού Πριν Από το Διαχωρισμό σε Πλάσμα ή Ορό 4,5 HBV DNA μ Log HBV DNA (UI/mL n=2) 10 4,0 3,5 3,0 2,5 < C C C C C < C C C C C 2,0 μ -1 μ -2 μ -3 μ -4 μ Δ μ EL 11

12 B. Μεταφορά Δειγμάτων Η μεταφορά του ολικού αίματος, του ορού ή του πλάσματος πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς που αφορούν στη μεταφορά αιτιολογικών παραγόντων 32. Το ολικό αίμα πρέπει να μεταφέρεται στους 2-25 C και να υφίσταται επεξεργασία μέσα σε 1 ημέρα από τη συλλογή. Το πλάσμα ή ο ορός πρέπει να μεταφέρονται σε θερμοκρασία 2-8 C ή κατεψυγμένα σε θερμοκρασία -20 C έως -80 C. Γ. Αποθήκευση Δειγμάτων Τα δείγματα πλάσματος ή ορού μπορούν να αποθηκεύονται σε θερμοκρασία δωματίου έως 3 ημέρες, στους 2-8 C έως 7 ημέρες ή κατεψυγμένα σε θερμοκρασία -20 C έως -80 C τουλάχιστον έξι εβδομάδες. Συνίσταται η αποθήκευση των δειγμάτων σε κλάσματα των µl σε αποστειρωμένα σωληνάρια πολυπροπυλενίου 2,0 ml με βιδωτό πώμα (όπως τα Sarstedt P/N: ). Το Σχήμα 6 παρουσιάζει στοιχεία από τις μελέτες αποθήκευσης αυτών των δειγμάτων. Σχήμα 6 Σταθερότητα HBV σε Πλάσμα EDTA ή Ορό HBV DNA μ Log HBV DNA (UI/mL n=2) 10 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 μ -1 μ -2 μ -3 μ -4 μ Δ μ 0 1 RT 3 RT 5 RT 7 RT C C C C 6-80 C Τα δείγματα ορού και πλάσματος μπορούν να καταψυχθούν και να αποψυχθούν έως και πέντε φορές χωρίς απώλεια του HBV DNA. Στο Σχήμα 7 απεικονίζονται τα δεδομένα από αυτές τις μελέτες ψύξης-απόψυξης. Σχήμα 7 Αποτελέσματα HBV Μετά Από Πέντε Κύκλους Ψύξης-Απόψυξης μ Log HBV DNA (U/mL n=2) 10 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 μ -1 μ -2 μ -3 μ F-T 2 F-T 3 F-T 4 F-T 5 F-T Δ μ EL 12

13 ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για λεπτομερείς οδηγίες λειτουργίας, την εκτύπωση αποτελεσμάτων και την ερμηνεία ενδείξεων, σχολίων και μηνυμάτων σφάλματος, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS TaqMan 48 αναλυτή, για χρήση με το Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, έκδοση σειράς 3.2 και 3.3 και (1) στο Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK Λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.2, για χρήση με το COBAS AmpliPrep Όργανο, τον COBAS TaqMan Αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή και τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή ή (2) στο Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.3, για χρήση με το COBAS AmpliPrep όργανο, τον COBAS TaqMan αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR αναλυτή και το cobas p 630 όργανο. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όλα τα αντιδραστήρια ενίσχυσης και ανίχνευσης πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος πριν από τη χρήση. Απομακρύνετε τα αντιδραστήρια από το χώρο αποθήκευσης θερμοκρασίας 2-8 C τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από τη χρήση. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα δείγματα πλάσματος και ορού πρέπει να περιέλθουν για λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος πριν από τη χρήση. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όπου προδιαγράφεται, χρησιμοποιείτε συσκευές πιπέτας με ακροφύσια φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης. Απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή για την αποφυγή μόλυνσης. Αριθμός Αναλύσεων: Κάθε κιτ περιέχει αντιδραστήρια για τέσσερις αναλύσεις 12 εξετάσεων, οι οποίες μπορούν να εκτελεστούν ξεχωριστά ή ταυτόχρονα. Ένα αντίγραφο από CTM ( ) C, HBV L(+)C και HBV H(+)C πρέπει να συμπεριλαμβάνεται σε κάθε ανάλυση εξέτασης έως και 24 δειγμάτων και ορών ελέγχου (βλέπε ενότητα Ποιοτικός Έλεγχος ). Τα Αντιδραστήρια Ενίσχυσης και Ανίχνευσης συσκευάζονται σε φιάλες διπλής χρήσεως για 24 εξετάσεις. Για την αποτελεσματικότερη χρήση των αντιδραστηρίων, τα δείγματα και οι οροί ελέγχου πρέπει να υφίστανται επεξεργασία σε παρτίδες πολλαπλάσιες του 12. Προετοιμασία Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αν χρησιμοποιείτε κατεψυγμένα δείγματα ορού ή πλάσματος, αφήστε τα δείγματα σε θερμοκρασία δωματίου μέχρι να αποψυχθούν τελείως και στροβιλίστε τα για 5-10 δευτερόλεπτα πριν από τη χρήση. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αφήστε τα αντιδραστήρια να αποκτήσουν θερμοκρασία περιβάλλοντος πριν προχωρήσετε. Προθερμάνετε τη Μονάδα (-δες) Θερμότητας έως τους 70 C (± 2 C) και το υδατόλουτρο έως τους 50 C (± 2 C) πριν την έναρξη των αντιδράσεων καθαρισμού. Α. Προετοιμασία Αντιδραστηρίων ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Προετοιμάστε το Διάλυμα Εργασίας Λύσης/Δέσμευσης μόνο όταν όλα τα δείγματα και οι οροί ελέγχουν έχουν περιέλθει σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για λεπτά. 1. Προετοιμάστε το Ρυθμιστικό Διάλυμα Αφαίρεσης Αναστολέα εγχύοντας με πιπέτα 20 ml αιθανόλη % στο Ρυθμιστικό Διάλυμα Αφαίρεσης Αναστολέα (IRB). Ανακατέψτε αναστρέφοντας 5-10 φορές. Αυτό το ανασυσταμένο Ρυθμιστικό Διάλυμα Αφαίρεσης Αναστολέα επαρκεί για 48 εξετάσεις. 2. Προετοιμάστε το Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης εγχύοντας με πιπέτα 80 ml αιθανόλη % στο Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης (WASH). Ανακατέψτε αναστρέφοντας 5-10 φορές. Αυτό το ανασυσταμένο Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης επαρκεί για 48 εξετάσεις. 3. Προθερμάνετε το Ρυθμιστικό Διάλυμα Έκπλυσης (ELB) στους 70 C (± 2 C) σε σωληνάριο μικροφυγόκεντρου 2,0 ml με βιδωτό πώμα. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν πολλαπλά σωληνάρια. Ο όγκος έκπλυσης ανά δείγμα είναι 75 µl. Προθερμάνετε τον όγκο που αναφέρεται στον παρακάτω πίνακα σύμφωνα με τον αριθμό εξετάσεων. Αριθμός Αντιγράφων Αντιδραστήριο Ρυθμιστικό Διάλυμα Έκπλυσης (ml) 2,0 4,0 4. Διοχετεύστε με πιπέτα τον όγκο ισοπροπανόλης που αναφέρεται στον παρακάτω πίνακα σύμφωνα με τον αριθμό εξετάσεων σε ένα καθαρό και αποστειρωμένο σωληνάριο. Αριθμός Αντιγράφων Αντιδραστήριο Ισοπροπανόλη (ml) 5,0 10, EL 13

14 5. Διοχετεύστε με πιπέτα 0,5 ml Ρυθμιστικό Διάλυμα Έκπλυσης (ELB) στο Φορέα RNA (CAR). Αντικαταστήστε τον αναστολέα, αντιστρέψτε το φιαλίδιο και στη συνέχεια στροβιλίστε το μέχρι να διαλυθεί ολόκληρη η ποσότητα του Φορέα RNA. Ο ανασυσταμένος Φορέας RNA επαρκεί για 24 εξετάσεις. Ο όγκος ανασυσταμένου Φορέα RNA που δεν έχει χρησιμοποιηθεί μπορεί να φυλάσσεται στους -15 έως -25 C έως και 30 ημέρες ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την περίπτωση. 6. Διοχετεύστε με πιπέτα 5,0 ml Ρυθμιστικού Διαλύματος Έκπλυσης (ELB) στην Πρωτεϊνάση Κ (PK). Αντικαταστήστε τον αναστολέα, αντιστρέψτε το φιαλίδιο και στη συνέχεια στροβιλίστε το μέχρι να διαλυθεί ολόκληρη η ποσότητα της Πρωτεϊνάσης Κ. Η ανασυσταμένη Πρωτεϊνάση Κ επαρκεί για 24 εξετάσεις. Ο όγκος ανασυσταμένης Πρωτεϊνάσης Κ που δεν έχει χρησιμοποιηθεί μπορεί να φυλάσσεται στους -15 έως -25 C έως και 30 ημέρες ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την περίπτωση. 7. Προετοιμάστε το Ρυθμιστικό Διάλυμα Λύσης/Δέσμευσης σύμφωνα με τις παρακάτω οδηγίες διοχετεύοντας με πιπέτα τους όγκους που αναφέρονται στον παρακάτω πίνακα ανάλογα με τον αριθμό των δειγμάτων και ορών ελέγχου που πρόκειται να υποστούν επεξεργασία. Αριθμός Αντιγράφων Αντιδραστήρια Ρυθμιστικό Διάλυμα Λύσης/Δέσμευσης (ml) 7,0 14,0 Φορέας RNA (µl) HBV QS (µl) Πρωτεϊνάση Κ (ml) 1,4 2,8 ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ο όγκος HBV QS είναι ειδικός για το COBAS TaqMan HBV Test. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αν πρόκειται να χρησιμοποιηθεί ανασυστασμένος Φορέας RNA ή Πρωτεϊνάση Κ, αποψύξτε τα δείγματα σε θερμοκρασία δωματίου και αντιστρέψτε τα αρκετές φορές πριν από τη χρήση. Προσθέστε τον όγκο του Ρυθμιστικού Διαλύματος Λύσης/Δέσμευσης που υποδεικνύεται σε ένα καθαρό και αποστειρωμένο σωληνάριο 50 ml. Προσθέστε τον όγκο ανασυσταμένου Φορέα RNA που υποδεικνύεται στο σωληνάριο που περιέχει το Ρυθμιστικό Διάλυμα Λύσης/Δέσμευσης. Στροβιλίστε το HBV QS για 3-5 δευτερόλεπτα και προσθέστε τον υποδεικνυόμενο όγκο HBV QS στο σωληνάριο που περιέχει το Ρυθμιστικό Διάλυμα Λύσης/Δέσμευσης και τον ανασυσταμένο Φορέα RNA. Πωματίστε το σωληνάριο και ανακατέψτε αντιστρέφοντας φορές. ΜΗ στροβιλίζετε - θα δημιουργηθούν φυσαλίδες στο διάλυμα. Προσθέστε τον όγκο της ανασυσταμένης Πρωτεϊνάσης Κ που υποδεικνύεται στο σωληνάριο που περιέχει το Ρυθμιστικό Διάλυμα Λύσης/Δέσμευσης. Πωματίστε το σωληνάριο και ανακατέψτε αντιστρέφοντας φορές. ΜΗ στροβιλίζετε - θα δημιουργηθούν φυσαλίδες στο διάλυμα. Αρχίστε τη χορήγηση του Διαλύματος Εργασίας Λύσης/Δέσμευσης αμέσως μετά την προσθήκη και ανάμιξη της Πρωτεϊνάσης Κ με το Ρυθμιστικό Διάλυμα Λύσης/Δέσμευσης. Το Ρυθμιστικό Διάλυμα Λύσης/Δέσμευσης (LYS) που δεν έχει χρησιμοποιηθεί μπορεί να φυλάσσεται στους C έως και 30 ημέρες ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την περίπτωση. Το Διάλυμα Εργασίας Λύσης/Δέσμευσης που δεν έχει χρησιμοποιηθεί πρέπει να απορρίπτεται. B. Προετοιμασία Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για τη διαδικασία αυτή συνιστάται η χρήση των ρυθμιζόμενων συσκευών πιπέτας με ακροφύσια ανθεκτικά στα αερολύματα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Στα βήματα 1, 14, 16, 19 και 22 μπορεί να χρησιμοποιηθεί μια επαναληπτική πιπέτα με κατάλληλο μέγεθος αποστειρωμένων ακροφυσίων τύπου combi-tips. Ωστόσο, θα πρέπει να δοθεί ιδιαίτερη προσοχή για να αποφεύγεται το πιτσίλισμα αντιδραστηρίων και η διασταυρούμενη μόλυνση. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αποφεύγετε τυχόν διαρροή Διαλύματος Εργασίας Λύσης/Δέσμευσης, δείγματος, ορού ελέγχου και ισοπροπανόλης στην περιοχή σφράγισης μεταξύ βυθίσματος και καπακιού στη στεφάνη κάθε βυθίσματος καθόλη τη διάρκεια της διαδικασίας. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Χρησιμοποιείτε γάντια που εφαρμόζουν καλά στα χέρια σας. Αλλάζετε συχνά γάντια και ειδικά μετά το χειρισμό θετικών ορών ελέγχου και το άνοιγμα γεμάτων σωληναρίων Υποδοχέα Λύσης. Μην αγγίζετε ποτέ το εσωτερικό των καπακιών (π.χ. κατά το άνοιγμα ή το κλείσιμο). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Κατά το χειρισμό ορών ελέγχου του κιτ και κλινικών δειγμάτων, φορτώνετε τον Αρνητικό Ορό Ελέγχου πριν προχωρήσετε στους θετικούς ορούς ελέγχου του κιτ. 1. Διοχετεύστε με πιπέτα 625 µl Διαλύματος Εργασίας Λύσης/Δέσμευσης σε κάθε βύθισμα του Υποδοχέα Λύσης (I, διαφανής). Διασφαλίστε ότι δεν υπάρχουν σταγονίδια στην περιοχή σφράγισης μεταξύ βυθίσματος και καπακιού στη στεφάνη κάθε βυθίσματος. Πιέστε απαλά τα καπάκια προς τα κάτω στη θέση κάλυψης. Μην ασφαλίσετε το μηχανισμό κλεισίματος EL 14

15 2. Ανοίγοντας ένα βύθισμα κάθε φορά, διοχετεύστε προσεκτικά με πιπέτα 500 µl δείγματος ή ορού ελέγχου στο κατάλληλο βύθισμα. Διασφαλίστε ότι δεν υπάρχουν σταγονίδια στην περιοχή σφράγισης μεταξύ βυθίσματος και καπακιού στη στεφάνη κάθε βυθίσματος. Μετά την προσθήκη κάθε δείγματος ή ορού ελέγχου, πιέστε το καπάκι προς τα κάτω ξεκινώντας από το μεντεσέ και ασκώντας ελαφρά πίεση προς τα κάτω, συνεχίστε να ασκείτε ελαφρά πίεση κατά μήκος του κέντρου του καπακιού και ασφαλίστε το μηχανισμό κλεισίματος, για να σφραγίσετε καλά το βύθισμα. 3. Μετά την προσθήκη όλων των δειγμάτων και των ορών ελέγχου, αναμίξτε με στροβιλισμό το γεμάτο Υποδοχέα Λύσης για 10 περίπου δευτερόλεπτα. Αποφύγετε τον έντονο στροβιλισμό. Ελέγξτε οπτικά αν έχουν στροβιλιστεί και αναμιχθεί καλά όλα τα βυθίσματα. 4. Τοποθετήστε προσεκτικά τους Υποδοχείς Λύσης σε υδατόλουτρο προθερμασμένο στους 50 C (± 2 C) αποφεύγοντας τυχόν πιτσίλισμα. Επωάστε τον Υποδοχέα Λύσης για 10 λεπτά. Κατά τη διάρκεια της επώασης, ο Υποδοχέας Λύσης θα πρέπει να εμβυθίζεται σε νερό, χωρίς όμως να επιπλέει. Διασφαλίστε ότι η πάνω επιφάνεια του Υποδοχέα Λύσης μεταξύ των βυθισμάτων παραμένει στεγνή κατά την επώαση. Σκουπίστε προσεκτικά με πανί την πάνω και κάτω πλευρά του Υποδοχέα Λύσης μετά την αφαίρεσή του από το υδατόλουτρο. 5. Φυγοκεντρίστε τον Υποδοχέα Λύσης για δευτερόλεπτα στη ρυθμισμένη ταχύτητα 4600 x g στη φυγόκεντρο μικροπλάκας. Η φυγόκεντρος ενδέχεται να μη φτάσει τη ρυθμισμένη ταχύτητα. Βεβαιωθείτε οπτικά ότι δεν έχει προκληθεί κάποια διαρροή ελέγχοντας τη στάθμη υγρού σε κάθε βύθισμα. Εάν παρατηρήσετε διαρροή, μη συνεχίσετε. 6. Ανοίξτε ένα βύθισμα κάθε φορά ασκώντας ελαφρά πίεση στο μεντεσέ με την κουμπωτή ασφάλεια, για να απασφαλίσετε το μηχανισμό κλεισίματος, και ανασηκώστε το καπάκι του βυθίσματος και διοχετεύστε με πιπέτα 250 µl ισοπροπανόλης σε κάθε βύθισμα. Μετά από κάθε προσθήκη, πιέστε το καπάκι προς τα κάτω ξεκινώντας από το μεντεσέ και ασκώντας ελαφρά πίεση προς τα κάτω, συνεχίστε να ασκείτε ελαφρά πίεση κατά μήκος του κέντρου του καπακιού και ασφαλίστε το μηχανισμό κλεισίματος, για να σφραγίσετε καλά το βύθισμα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ο όγκος της ισοπροπανόλης είναι ειδικός για κάθε COBAS TaqMan Test. 7. Βεβαιωθείτε οπτικά ότι όλοι οι Υποδοχείς είναι σφιχτά κλεισμένοι. Αναμίξτε τα δείγματα αναστρέφοντας τον υποδοχέα τρεις φορές και στροβιλίζοντας στη συνέχεια τον υποδοχέα για 10 περίπου δευτερόλεπτα. Αποφύγετε τον έντονο στροβιλισμό. Ελέγξτε οπτικά αν έχουν στροβιλιστεί και αναμιχθεί καλά όλα τα βυθίσματα. 8. Φυγοκεντρίστε τον Υποδοχέα Λύσης για δευτερόλεπτα στη ρυθμισμένη ταχύτητα 4600 x g στη φυγόκεντρο μικροπλάκας. Η φυγόκεντρος ενδέχεται να μη φτάσει τη ρυθμισμένη ταχύτητα. Βεβαιωθείτε οπτικά ότι δεν έχει προκληθεί κάποια διαρροή ελέγχοντας τη στάθμη υγρού σε κάθε βύθισμα. Εάν παρατηρήσετε διαρροή, μη συνεχίσετε. 9. Ανοίξτε ένα βύθισμα κάθε φορά ασκώντας ελαφρά πίεση στο μεντεσέ με την κουμπωτή ασφάλεια, για να απασφαλίσετε το μηχανισμό κλεισίματος, και ανασηκώστε το καπάκι του βυθίσματος και μεταφέρετε 750 µl δείγματος ή μίγματος ορού ελέγχου στα αντίστοιχα βυθίσματα του Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου (ΙΙ, κίτρινος) με προσαρτημένο Υποδοχέα Απορριμμάτων (λευκός). Μετά την προσθήκη κάθε δείγματος ή μίγματος ορού ελέγχου, πιέστε το καπάκι προς τα κάτω ξεκινώντας από το μεντεσέ και ασκώντας ελαφρά πίεση προς τα κάτω, συνεχίστε να ασκείτε ελαφρά πίεση κατά μήκος του κέντρου του καπακιού και ασφαλίστε το μηχανισμό κλεισίματος, για να σφραγίσετε καλά το βύθισμα. 10. Μετά την προσθήκη όλων των δειγμάτων ή των ορών ελέγχου, φυγοκεντρίστε το συγκρότημα Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου για 2 λεπτά στα 4600 x g στη φυγόκεντρο μικροπλάκας. Βεβαιωθείτε οπτικά ότι δεν έχει προκληθεί κάποια διαρροή ελέγχοντας τη στάθμη υγρού σε κάθε βύθισμα. Εάν παρατηρήσετε διαρροή, μη συνεχίσετε. 11. Ανοίξτε ένα βύθισμα κάθε φορά ασκώντας ελαφρά πίεση στο μεντεσέ με την κουμπωτή ασφάλεια, για να απασφαλίσετε το μηχανισμό κλεισίματος, και ανασηκώστε το καπάκι του βυθίσματος και μεταφέρετε το υπόλοιπο δείγμα ή μίγμα ορού ελέγχου στα αντίστοιχα βυθίσματα του Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου. Μετά την προσθήκη κάθε δείγματος ή μίγματος ορού ελέγχου, κλείστε το καπάκι του βυθίσματος ξεκινώντας από το μεντεσέ και ασκώντας ελαφρά πίεση προς τα κάτω, συνεχίστε να ασκείτε ελαφρά πίεση κατά μήκος του κέντρου του καπακιού και ασφαλίστε το μηχανισμό κλεισίματος. Απορρίψτε τον Υποδοχέα Λύσης κατάλληλα. 12. Φυγοκεντρίστε το συγκρότημα Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου για 2 λεπτά στα 4600 x g στη φυγόκεντρο μικροπλάκας. Βεβαιωθείτε οπτικά ότι δεν έχει προκληθεί κάποια διαρροή ελέγχοντας τη στάθμη υγρού σε κάθε βύθισμα. Εάν παρατηρήσετε διαρροή, μη συνεχίσετε. 13. Αφαιρέστε τον Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου από τον Υποδοχέα Απορριμμάτων πατώντας και τους δύο συνδέσμους ασφάλισης στην άνω πλευρά του Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου. Απορρίψτε τον Υποδοχέα Απορριμμάτων. Αντικαταστήστε τον με ένα νέο Υποδοχέα Απορριμμάτων και ασφαλίστε τον Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου στον Υποδοχέα Απορριμμάτων EL 15

16 14. Ανοίξτε όλα τα καπάκια του Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου και διοχετεύστε με πιπέτα 400 µl Ρυθμιστικού Διαλύματος Αφαίρεσης Αναστολέα (IRB) στα τοιχώματα κάθε βυθίσματος. Μην αγγίζετε τα τοιχώματα των βυθισμάτων. Μετά την προσθήκη Ρυθμιστικού Διαλύματος Αφαίρεσης Αναστολέα σε όλα τα βυθίσματα, πιέστε το καπάκι προς τα κάτω ξεκινώντας από το μεντεσέ και ασκώντας ελαφρά πίεση προς τα κάτω, συνεχίστε να ασκείτε ελαφρά πίεση κατά μήκος του κέντρου του καπακιού και ασφαλίστε το μηχανισμό κλεισίματος, για να σφραγίσετε καλά τα καπάκια. 15. Φυγοκεντρίστε το συγκρότημα Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου για 2 λεπτά στα 4600 x g στη φυγόκεντρο μικροπλάκας. Βεβαιωθείτε οπτικά ότι δεν έχει προκληθεί κάποια διαρροή ελέγχοντας τη στάθμη υγρού σε κάθε βύθισμα. Εάν παρατηρήσετε διαρροή, μη συνεχίσετε. 16. Ανοίξτε όλα τα καπάκια του Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου και διοχετεύστε με πιπέτα 700 µl Ρυθμιστικού Διαλύματος Πλύσης (WASH) στα τοιχώματα κάθε βυθίσματος. Μην αγγίζετε τα τοιχώματα των βυθισμάτων. Μετά την προσθήκη Ρυθμιστικού Διαλύματος Πλύσης σε όλα τα βυθίσματα, πιέστε το καπάκι προς τα κάτω ξεκινώντας από το μεντεσέ και ασκώντας ελαφρά πίεση προς τα κάτω, συνεχίστε να ασκείτε ελαφρά πίεση κατά μήκος του κέντρου του καπακιού και ασφαλίστε το μηχανισμό κλεισίματος, για να σφραγίσετε καλά τα καπάκια. 17. Φυγοκεντρίστε το συγκρότημα Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου για 2 λεπτά στα 4600 x g στη φυγόκεντρο μικροπλάκας. Βεβαιωθείτε οπτικά ότι δεν έχει προκληθεί κάποια διαρροή ελέγχοντας τη στάθμη υγρού σε κάθε βύθισμα. Εάν παρατηρήσετε διαρροή, μη συνεχίσετε. 18. Αφαιρέστε τον Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου από τον Υποδοχέα Απορριμμάτων πατώντας και τους δύο συνδέσμους ασφάλισης στην άνω πλευρά του Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου. Απορρίψτε τον Υποδοχέα Απορριμμάτων. Αντικαταστήστε τον με ένα νέο Υποδοχέα Απορριμμάτων και ασφαλίστε τον Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου στον Υποδοχέα Απορριμμάτων. 19. Ανοίξτε όλα τα καπάκια του Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου και διοχετεύστε με πιπέτα 700 µl Ρυθμιστικού Διαλύματος Πλύσης στα τοιχώματα κάθε βυθίσματος. Μην αγγίζετε τα τοιχώματα των βυθισμάτων. Μετά την προσθήκη Ρυθμιστικού Διαλύματος Πλύσης σε όλα τα βυθίσματα, πιέστε το καπάκι προς τα κάτω ξεκινώντας από το μεντεσέ και ασκώντας ελαφρά πίεση προς τα κάτω, συνεχίστε να ασκείτε ελαφρά πίεση κατά μήκος του κέντρου του καπακιού και ασφαλίστε το μηχανισμό κλεισίματος, για να σφραγίσετε καλά τα καπάκια. 20. Φυγοκεντρίστε το συγκρότημα Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου για 3 λεπτά στα 4600 x g στη φυγόκεντρο μικροπλάκας. Βεβαιωθείτε οπτικά ότι δεν έχει προκληθεί κάποια διαρροή ελέγχοντας τη στάθμη υγρού σε κάθε βύθισμα. Εάν παρατηρήσετε διαρροή, μη συνεχίσετε. 21. Αφαιρέστε τον Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου από τον Υποδοχέα Απορριμμάτων πατώντας και τους δύο συνδέσμους ασφάλισης στην άνω πλευρά του Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου. Τοποθετήστε τον Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου στον Υποδοχέα Έκλουσης (IIIA, μπλε χρώμα) και ασφαλίστε τον Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου στον Υποδοχέα Έκλουσης. Απορρίψτε τον Υποδοχέα Απορριμμάτων κατάλληλα. 22. Ανοίξτε όλα τα καπάκια του Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου και εκτελέστε έγχυση 75 µl του προθερμασμένου Ρυθμιστικού Διαλύματος Έκλουσης (ELB) στο κέντρο κάθε φίλτρου χωρίς να αγγίξετε το φίλτρο. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μην προσθέτετε Ρυθμιστικό Διάλυμα Έκλουσης με έγχυση στο τοίχωμα του βυθίσματος. Μετά την προσθήκη Ρυθμιστικού Διαλύματος Έκλουσης σε όλα τα βυθίσματα, πιέστε το καπάκι προς τα κάτω ξεκινώντας από το μεντεσέ και ασκώντας ελαφρά πίεση προς τα κάτω, συνεχίστε να ασκείτε ελαφρά πίεση κατά μήκος του κέντρου του καπακιού και ασφαλίστε το μηχανισμό κλεισίματος, για να σφραγίσετε καλά το βύθισμα. 23. Μετά την προσθήκη Ρυθμιστικού Διαλύματος Έκλουσης στο τελευταίο βύθισμα, επωάστε τον Υποδοχέα Έκλουσης σε θερμοκρασία δωματίου για τουλάχιστον 3 λεπτά, πιέστε το καπάκι προς τα κάτω ξεκινώντας από το μεντεσέ και ασκώντας ελαφρά πίεση προς τα κάτω, συνεχίστε να ασκείτε ελαφρά πίεση κατά μήκος του κέντρου του καπακιού και ασφαλίστε το μηχανισμό κλεισίματος, για να σφραγίσετε καλά το βύθισμα. 24. Φυγοκεντρίστε το συγκρότημα Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου για 3 λεπτά στα 4600 x g στη φυγόκεντρο μικροπλάκας. Βεβαιωθείτε οπτικά ότι δεν έχει προκληθεί κάποια διαρροή ελέγχοντας τη στάθμη υγρού σε κάθε βύθισμα. Εάν παρατηρήσετε διαρροή, μη συνεχίσετε. 25. Αφαιρέστε τον Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου από τον Υποδοχέα Έκλουσης πατώντας και τους δύο συνδέσμους ασφάλισης στην άνω πλευρά του Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου. Απορρίψτε τον Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου κατάλληλα. 26. Τοποθετήστε το Κάλυμμα Υποδοχέα (IIIB, μπλε χρώμα) στον Υποδοχέα Έκλουσης (IIIA, μπλε). Πιέστε σταθερά προς τα κάτω και ασφαλίστε τους συνδέσμους στον Υποδοχέα Έκλουσης. Πιέστε το καπάκι προς τα κάτω ξεκινώντας από το μεντεσέ και ασκώντας ελαφρά πίεση προς τα κάτω, συνεχίστε να ασκείτε ελαφρά πίεση κατά μήκος του κέντρου του καπακιού και ασφαλίστε το μηχανισμό κλεισίματος, για να σφραγίσετε καλά όλα τα καπάκια. 27. Τα επεξεργασμένα δείγματα και οροί ελέγχου χρησιμοποιούνται απευθείας για PCR. Χρησιμοποιήστε 50 µl από τα επεξεργασμένα δείγματα και τους ορούς ελέγχου για ενίσχυση. Προσθέστε τα επεξεργασμένα δείγματα και τους ορούς ελέγχου στο Κύριο Μίγμα Εργασίας εντός 3 ωρών από την ολοκλήρωση της προετοιμασίας των δειγμάτων και των ορών έλεγχου. Εάν τα επεξεργασμένα δείγματα και οι οροί ελέγχου δεν μπορούν να EL 16