Ο διαφαινόμενος ρόλος stem κυττάρων και μικροπεριβάλλοντος, στο δέρμα και τα κακοήθη νεοπλάσματα του δέρματος.

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ Κατεύθυνση: ΜΟΡΙΑΚΗ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗ Ο διαφαινόμενος ρόλος stem κυττάρων και μικροπεριβάλλοντος, στο δέρμα και τα κακοήθη νεοπλάσματα του δέρματος. Διπλωματική Εργασία ΚΑΜΠΙΛΑΥΚΟΣ ΠΑΝΑΓΙΩΤΗΣ Ιατρός Μάρτιος 2010 Επιβλέπουσα Καθηγήτρια: Γεωργία Σωτηροπούλου-Μπονίκου

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Γεωργία Σωτηροπούλου-Μπονίκου Αναπληρώτρια καθηγήτρια Ιατρικής σχολής Παν. Πατρών Χαράλαμπος Καλόφωνος Καθηγητής Ιατρικής σχολής Παν. Πατρών Κυριακή Αρώνη Αναπληρώτρια καθηγήτρια Ιατρικής σχολής Παν. Αθηνών 2

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ σελ. 7 ΕΙΣΑΓΩΓΗ σελ. 8 Κεφάλαιο 1 ΤΟ ΔΕΡΜΑ σελ. 10 ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΕΜΒΡΥΟΛΟΓΙΑΣ Η επιδερμίδα. Το χόριο. Η τριχοσμηγματογόνος συσκευή. ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΑΝΑΤΟΜΙΑΣ σελ. 14 Επιδερμίδα. Κύτταρα της επιδερμίδας. Εξαρτήματα επιδερμίδας. Χόριο. Αγγεία και νεύρα του δέρματος. Κεφάλαιο 2 ΤΑ STEM (ΒΛΑΣΤΙΚΑ) ΚΥΤΤΑΡΑ σελ. 31 ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ STEM ΚΥΤΤΑΡΩΝ Εκλεκτικός διαχωρισμός των αλυσίδων DNA. Πως γίνεται η αυτο-ανανέωση των stem κυττάρων; Η φωλεά των stem κυττάρων. STEMNESS σελ. 47 Μεταγραφικοί παράγοντες των εμβρυικών stem κυττάρων. Μηχανισμός δράσης των μεταγραφικών παραγόντων Oct4, Sox2 και Nanog. και το αυτορυθμιστικό κύκλωμα. Ρύθμιση των αναπτυξιακών μεταγραφικών παραγόντων. ΈΛΕΓΧΟΣ-ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΠΟΛΥΔΥΜΙΑΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣ σελ. 52 Μεταγραφικοί παράγοντες-σηματοδοτικά μονοπάτια. Ρυθμιστικά RNAs στη πολυδυναμία και στη πρώιμη ανάπτυξη. Επιγενετική. 3

4 Επιγενετική ρύθμιση και δίκτυα πολυδυναμίας. Η μεταβαλλόμενη κατάσταση της πολυδυναμίας. Επιγενετική και δέσμευση για συγκεκριμένη κυτταρική διαφοροποίηση. ΕΠΑΝΑΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΜΟΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕΣΩ ΣΥΓΚΕΚΡΙΜΕΝΩΝ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ σελ. 65 ΑΙΧΜΑΛΩΤΙΖΟΝΤΑΣ ΤΗΝ ΠΟΛΥΔΥΝΑΜΙΑ σελ. 69 Η αυτοεπαγόμενη σηματοδότηση Erk αποσταθεροποιεί την αυτο-ανανέωση. Μοριακοί μηχανισμοί του επαναπρογραμματισμού. Κεφάλαιο 3 ΣΥΣΤΗΜΙΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ STEM ΚΥΤΤΑΡΩΝ Συστημική - Ολιστική προσέγγιση. Αναλύοντας την πολυπλοκότητα των stem κυττάρων. Ρυθμιστικά δίκτυα stem κυττάρων. Η τοπογραφία του stem κυττάρου. Στοχαστικότητα και stem κύτταρα. σελ. 76 Κεφάλαιο 4 ΟΜΟΙΟΣΤΑΣΗ ΤΟΥ ΔΕΡΜΑΤΟΣ: ΜΙΑ ΠΡΑΞΗ ΙΣΟΡΡΟΠΙΑΣ ΤΩΝ STEM ΚΥΤΤΑΡΩΝ σελ. 83 Η ΟΜΟΙΟΣΤΑΣΗ ΤΟΥ ΔΕΡΜΑΤΟΣ ΣΤΟΝ ΕΝΗΛΙΚΑ σελ. 84 Σήματα που ρυθμίζουν την διαφοροποίηση του δέρματος. Aσύμμετρη κυτταρική διαίρεση στο δέρμα. Τα πολλαπλά είδη stem κυττάρων διασφαλίζουν την ομοιόσταση του δέρματος Οι μάχες της περιοχής bulge. Δημιουργία και ομοιόσταση των σμηγματογόνων αδένων. Σηματοδότηση στην ανάπτυξη και ομοιόσταση του δέρματος. H ρύθμιση της μετάβασης από τη βασική στην ακανθωτή στιβάδα της επιδερμίδας. Ομοιόσταση του μελανοκυττάρου και ρύθμιση από τα κερατινοκύτταρα. 4

5 Κεφάλαιο 5 ΚΑΡΚΙΝΙΚΑ STEM ΚΥΤΤΑΡΑ (CSCs) σελ. 107 Αναγνώριση και απομόνωση των καρκινικών stem κυττάρων. Προέλευση των καρκινικών stem κυττάρων. Αντίσταση των CSCs στις θεραπευτικές παρεμβάσεις. ΜΕΤΑΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ STEM ΚΥΤΤΑΡΩΝ σελ. 115 Μεταστατική ανεπάρκεια. Οργανο-ειδική μετάσταση. Ο ρόλος του άξονα SDF-1/CXCR4. ΚΑΡΚΙΝΙΚΑ STEM ΚΥΤΤΑΡΑ ΚΑΙ ΕΞΕΙΔΙΚΕΥΜΕΝΟ σελ. 121 ΜΙΚΡΟΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ (ΦΩΛΕΑ) Η ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΣΤΑΣΗΣ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΑΠΟ ΤΗ ΦΩΛΕΑ σελ. 123 Η μεταστατική φωλεά: προσαρμόζοντας το ξένο έδαφοs. Η προ-μεταστατική φωλεά. Έναρξη της προ-μεταστατικής φωλεάς. Προ-μεταστική φωλεά : στόχος για την μετάσταση του όγκου. Η εξωκυττάρια ουσία στη προ-μεταστατική φωλεά. Η μετάσταση είναι ένα πρώιμο γεγονός. Η ανάπτυξη του μεταστατικού όγκου. ΜΕΤΑΝΑΣΤΕΥΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΟΓΚΟΥ ΚΑΙ ΤΟΥ ΜΥΕΛΟΥ ΤΩΝ σελ. 134 ΟΣΤΩΝ ΑΠΟ ΦΩΛΕΑ ΣΕ ΦΩΛΕΑ. Ο ρόλος των μεσεγχυματικών stem κυττάρων (MSCs). ΕΠΙΘΗΛΙΟ-ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΗ ΜΕΤΑΒΑΣΗ (EMT). σελ. 139 ΛΑΝΘΑΝΟΥΣΑ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ (DORMANCY) ΤΩΝ ΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ σελ. 143 Κεφάλαιο 6 ΚΑΡΚΙΝΙΚΑ STEM ΚΥΤΤΑΡΑ ΚΑΙ ΚΑΚΟΗΘΗ ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΑ ΤΟΥ ΔΕΡΜΑΤΟΣ Έκφραση δεικτών των φυσιολογικών stem κυττάρων σε όγκους του δέρματος. Αναπτυξιακά μεταγραφικά μονοπάτια και όγκοι του δέρματος Έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων SOX9 και OCT4 σε όγκους του δέρματος. Έκφραση χαρακτηριστικών μεταγραφικών παραγόντων των stem κυττάρων σε καρκίνους στον άνθρωπο. Καρκινικά stem κύτταρα και κακόηθες μελάνωμα. Ο ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα Nodal. σελ

6 Αναπτυξιακά σηματοδοτικά μονοπάτια στο μελάνωμα. Κεφάλαιο 7 EΠΙΛΟΓΟΣ σελ. 168 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ σελ

7 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η Ιατρική του μέλλοντος αναμένεται να έχει εντελώς διαφορετική μορφή. Στην εποχή μας, χαρακτηρίζεται από την περιστασιακή αντίδραση στο εκάστοτε πρόβλημα, με αποτέλεσμα να μην λαμβάνονται υπόψη τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά κάθε ασθενή και η θεραπεία να μην προσαρμόζεται στις ανάγκες του. Η ιατρική του μέλλοντος, αναμένεται να είναι προβλεπτική, εξατομικευμένη, προληπτική και συμμετοχική - predictive, preventive, personalized, and participatory (4Ρ) [1]. Η ακριβής γνώση της παθογένειας της νόσου, σε συνδυασμό με την κατανόηση των μηχανισμών ομοιόστασης του οργανισμού, αποτελούν απαραίτητες προϋποθέσεις για την Εξατομικευμένη Ιατρική. Η στοχευμένη αντιμετώπιση της νόσου θα αναβαθμίσει τις παρεχόμενες υπηρεσίες υγείας και θα μειώσει στο ελάχιστο τις παρενέργειες της φαρμακευτικής αγωγής. Η ακριβής διάγνωση και η αποτελεσματική πρόληψη αποτελούν επίσης στόχους της Ιατρικής των 4P, όπως χαρακτηριστικά ονομάζεται. Στο πλαίσιο αυτό, τα stem (βλαστικά) κύτταρα έχουν πλέον εισέλθει δυναμικά στο πεδίο ενδιαφέροντος της επιστημονικής και ερευνητικής κοινότητας. Συνεχώς δημοσιεύονται νέες μελέτες, ενώ είναι εμφανές, ότι η δυναμική διαντίδραση με το μικροπεριβάλλον καθορίζει σε μεγάλο βαθμό τη συμπεριφορά τους. Η αποκρυπτογράφηση των «μυστικών» τους, θα δώσει ώθηση στην Αναγεννητική Ιατρική [2]. Θα επιτρέψει δηλαδή την ανάπτυξη καινοτόμων θεραπειών με στόχο την αποκατάσταση της φυσιολογικής λειτουργικότητας του ανθρώπινου σώματος μέσω της αντικατάστασης ή αποκατάστασης κυττάρων που έχουν υποστεί βλάβη. Επίσης, η θεωρία των καρκινικών stem κυττάρων επιτρέπει την καλύτερη κατανόηση της καρκινογένεσης και δημιουργεί νέα δεδομένα στη πρόληψη και αντιμετώπιση του καρκίνου. Η συστημική προσέγγιση γεφυρώνει το χάσμα ανάμεσα στα μόρια και τη φυσιολογία, και αποτελεί ένα νέο κλάδο της βιολογίας, τη Συστημική Βιολογία (Systems Biology) [3]. Η ανάπτυξη ισχυρών υπολογιστικών και μαθηματικών μέσων, σε συνδυασμό με τη συστημική προσέγγιση και αποκρυπτογράφηση του τρόπου λειτουργίας των Δυναμικών Παθοβιολογικών Δικτύων που αφορούν τα stem κύτταρα και το μικροπεριβάλλον, θα οδηγήσουν σε νέες θεραπευτικές στρατηγικές. Η εξατομικευμένη αντικαρκινική θεραπεία περιλαμβάνει την αναγνώριση και στοχοποίηση ειδικά των καρκινικών stem κυττάρων. Το ολοκληρωμένο (integrated) profile των μοριακών αποτυπωμάτων των καρκινικών stem κυττάρων που θα προκύψει, μπορεί να χρησιμεύσει σαν πιο ακριβής δείκτης για την διάγνωση και πρόγνωση του καρκίνου, στα πλαίσια της Ιατρικής του μέλλοντος των 4P. 7

8 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα stem κύτταρα αποτελούν ένα υποσύνολο κυττάρων με τις εξής χαρακτηριστικές ιδιότητες: την ικανότητα για αυτο-ανανέωση και την δυναμική για διαφοροποίηση προς πολλαπλούς κυτταρικούς τύπους (πολυδυναμία) [4]. Είναι σπάνια κύτταρα, εντούτοις ο ρόλος τους στην ομοιόσταση του οργανισμού είναι πολύ σημαντικός. Η διαντίδραση με το μικροπεριβάλλον (φωλεά) ρυθμίζει σε μεγάλο βαθμό τη συμπεριφορά τους [5]. Πράγματι, στοιχεία του μικροπεριβάλλοντος, είτε με φυσική επαφή, είτε με έκκριση διάφορων μορίων, είναι σε διαρκή διαντίδραση επαφή και διαντίδραση με τα stem κύτταρα και πολύ πιθανόν με τους άμεσους απογόνους τους (θυγατρικά κύτταρα). Οι έρευνες των Takahashi και συν. [6, 7] αποτέλεσαν σταθμό στην κατανόηση της φυσιολογίας των stem κυττάρων. Από τα αποτελέσματα των ερευνητών, διαπιστώθηκε ότι αρκεί ένας μικρός μόνο αριθμός μεταγραφικών παραγόντων, ώστε σωματικά κύτταρα υψηλής διαφοροποίησης να αποκτήσουν χαρακτηριστικά stem κυττάρων. Με δεδομένο ότι τα stem κύτταρα έχουν, ή αναμένεται μελλοντικά, να έχουν πολλές εφαρμογές στην κλινική πράξη, η γνώση αυτή μπορεί να αξιοποιηθεί στην Αναγεννητική Ιατρική. Μετά από έρευνες, διαπιστώθηκε ότι οι μεταγραφικοί παράγοντες που ελέγχουν το stemness των κυττάρων, συμμετέχουν σε ρυθμιστικά δίκτυα, για την ανάλυση των οποίων είναι χρήσιμες οι τεχνικές που εφαρμόζονται στα πλαίσια της Συστημικής Βιολογία [8]. Στη ρύθμιση του stemness και των μεταγραφικών παραγόντων, είναι πολύ σημαντικός ο ρόλος των επιγενετικών τροποποιήσεων. Διαπιστώθηκε επίσης, ότι τα επίπεδα αυτών των μεταγραφικών παραγόντων είναι μεταβαλλόμενα και όχι σταθερά [9]. Το γεγονός αυτό, σε συνδυασμό με επιγενετικούς μηχανισμούς, υποχρεώνει το stem κύτταρο σε μια κατάσταση δυναμικής ισορροπίας μεταξύ διατήρησης της πολυδυναμίας και δέσμευσης για περαιτέρω διαφοροποίηση. Η θεωρία των καρκινικών stem κυττάρων [10, 11] παρουσιάζει ιδιαίτερο ερευνητικό ενδιαφέρον και πιθανές μελλοντικές κλινικές εφαρμογές. Το μοντέλο της καρκινογένεσης αναθεωρείται και διαμορφώνεται ως εξής: Ο καρκίνος αποτελεί συστημική νόσο (cancer: a systems biology disease) και αναπτύσσεται από ένα μικρό υποσύνολο κυττάρων με ιδιότητες αυτο-ανανέωσης, ανάλογες αυτών των φυσιολογικών stem κυττάρων των οργάνων. Τα καρκινικά stem κύτταρα δηλαδή, είναι ένας μικρός υποπληθυσμός καρκινικών κυττάρων με χαρακτηριστικά stem κυττάρων (αυτο-ανανέωση, πολυδυναμία). Αυτά τα κύτταρα εγκαινιάζουν και συντηρούν τον όγκο, ενώ είναι υπεύθυνα και για τις μεταστάσεις του 8

9 πρωτογενούς όγκου. Υπόκεινται σε ρυθμιστικό έλεγχο από το μικροπεριβάλλον της πρωτογενούς και της μεταστατικής εστίας [12], ενώ μεγάλο ενδιαφέρον έχει και η θεωρία της προ-μεταστατικής εστίας με συμμετοχή κυττάρων του μυελού των οστών [13]. Τα νεοπλάσματα του δέρματος αποτελούν τους πιο συχνούς όγκους στον άνθρωπο. Με δεδομένο ότι το δέρμα είναι ιστός εύκολα προσπελάσιμος για έρευνα, τα stem κύτταρα στο καλυπτήριο σύστημα έχουν μελετηθεί διεξοδικά [14-17]. Τα αποτελέσματα των ερευνών έχουν δώσει αρκετές απαντήσεις, δημιουργούνται όμως συνεχώς νέα ερωτήματα στον αέναο κύκλο της επιστημονικής γνώσης και κατάρτισης. Η παρούσα μελέτη αποτελεί βιβλιογραφική ανασκόπηση. Επικεντρώνεται στην διεξοδική ανάλυση των stem κυττάρων του δέρματος, με έμφαση στο ρυθμιστικό ρόλο του μικροπεριβάλλοντος. Επίσης, αναλύεται ο διαφαινόμενος ρόλος τους στη καρκινογένεση και τα κακοήθη νεοπλάσματα του δέρματος. 9

10 ΤΟ ΔΕΡΜΑ Το δέρμα αποτελεί το μεγαλύτερο όργανο του ανθρώπινου σώματος καθώς αποτελεί το 16% περίπου του συνολικού σωματικού βάρους και στον ενήλικα η ελεύθερη επιφάνειά του παρουσιάζει έκταση 1,2-2,3 m 2. Kαλύπτει ολόκληρη την εξωτερική επιφάνειά του και είναι το κύριο επίπεδο αλληλεπίδρασης με τον περιβάλλοντα κόσμο. Είναι ένα διαρκώς μεταβαλλόμενο όργανο που περιέχει πολλά εξειδικευμένα κύτταρα και δομές. Το δέρμα λειτουργεί ως προστατευτικό φράγμα που διασυνδέεται με ενίοτε εχθρικό περιβάλλον. Λειτουργεί δηλαδή εν είδει φραγμού που εμποδίζει την έκθεση των εσωτερικών ιστών σε τραυματισμό, την υπεριώδη ακτινοβολία, τις ακραίες θερμοκρασίες, σε τοξίνες και βακτήρια. Συγκεντρώνει επίσης αισθητηριακές πληροφορίες από το περιβάλλον, και παίζει ενεργό ρόλο στο ανοσοποιητικό σύστημα και στην ανοσολογική επαγρύπνηση προστατεύοντας μας από διάφορες ασθένειες. Άλλες σημαντικές λειτουργίες που επιτελεί το δέρμα είναι η ρύθμιση της θερμοκρασίας και ο έλεγχος της απώλειας υγρών συμβάλλοντας με αυτόν τον τρόπο στην διατήρηση της ομοιόστασης του οργανισμού. ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΕΜΒΡΥΟΛΟΓΙΑΣ Το δέρμα έχει διπλή προέλευση, καθώς η επιπολής στιβάδα του, η επιδερμίδα, αναπτύσσεται από το επιπολής εξώδερμα και η εν τω βάθει στιβάδα του, το χόριο, αναπτύσσεται από το υποκείμενο μεσέγχυμα. Το καλυπτήριο σύστημα δημιουργείται κατά τη διάρκεια της πρώτης εμβρυικής περιόδου. Πιο συγκεκριμένα κατά τη διάρκεια της τέταρτης εβδομάδας της εμβρυολογικής ανάπτυξης, το εξώδερμα με πάχος ενός κυττάρου και το υποκείμενο μεσόδερμα αρχίζουν να πολλαπλασιάζονται και να διαφοροποιούνται. Οι εξειδικευμένες δομές που σχηματίζονται από το δέρμα, συμπεριλαμβανομένων των δοντιών, τα μαλλιά, τριχοθυλάκια, νύχια, σμηγματογόνοι αδένες, ιδρωτοποιοί αδένες, αποκρινείς αδένες καθώς και οι μαστικοί αδένες αρχίζουν να εμφανίζονται κατά την περίοδο αυτή της ανάπτυξης. Δόντια, μαλλιά και τριχοθυλάκια σχηματίζονται από την επιδερμίδα και το χόριο σε συνεργασία, ενώ τα νύχια σχηματίζονται από την επιδερμίδα μόνο. Τριχοθυλάκια, σμηγματογόνοι αδένες, ιδρωτοποιοί αδένες, αποκρινείς αδένες και οι μαστικοί αδένες θεωρούνται εξαρτήματα του δέρματος (appendages) [18]. 10

11 Η επιδερμίδα Αρχικά το έμβρυο καλύπτεται από μονοκύτταρη στιβάδα εξωδερμικών κυττάρων (4 η εβδομάδα). Στην αρχή του δεύτερου μήνα αυτό το επιθήλιο διαιρείται και στην επιφάνειά του προστίθεται στιβάδα αποπλατυσμένων κυττάρων, το περιδέρμιο ή επιτρίχιο. Με περαιτέρω πολλαπλασιασμό των κυττάρων της βασικής στιβάδας σχηματίζεται τρίτη διάμεση στιβάδα. Στο τέλος του τέταρτου μήνα η επιδερμίδα αποκτά την τελική της μορφή, οπότε μπορούν να διακριθούν οι εξής στιβάδες : (α) η βασική στιβάδα, η οποία είναι υπεύθυνη για την παραγωγή νέων κυττάρων και είναι γνωστή ως βλαστική στιβάδα. Αυτή η στιβάδα αργότερα σχηματίζει ακρολοφίες και αύλακες οι οποίες υποσημαίνονται στην επιφάνεια του δέρματος στα δακτυλικά αποτυπώματα, (β) η παχιά ακανθωτή στιβάδα, η οποία αποτελείται από ευμεγέθη πολυεδρικά κύτταρα που περιέχουν λεπτά τονοϊνίδια, (γ) η κοκκιώδης στιβάδα, τα κύτταρα της οποίας έχουν μικρά κοκκία κερατοϋαλίνης και (δ) η κεράτινη στιβάδα, η οποία σχηματίζει τη σκληρή λεπιώδη επιφάνεια της επιδερμίδας. Αυτή η στιβάδα αποτελείται από συμπαγείς συσσωρεύσεις νεκρών κυττάρων, τα οποία είναι γεμάτα με κερατίνη. Τα κύτταρα του περιδερμίου συνήθως αποπίπτουν κατά τη διάρκεια του δεύτερου ημίσεως της ενδομήτριας ζωής και μπορούν να ανευρεθούν στο αμνιακό υγρό. Κατά τη διάρκεια των τριών πρώτων μηνών της ανάπτυξης εισβάλλουν στην επιδερμίδα κύτταρα που προέρχονται από την νευρική ακρολοφία. Αυτά τα κύτταρα συνθέτουν την χρωστική μελανίνη, η οποία μπορεί να μεταφερθεί σε άλλα κύτταρα της επιδερμίδας διαμέσου δενδριτικών αποφύσεων. Τα εν λόγω κύτταρα λέγονται μελανοκύτταρα και μετά τη γέννηση προκαλούν χρωματισμό του δέρματος. Οι επιδερμικές ακρολοφίες, οι οποίες παράγουν χαρακτηριστικά σχέδια στην επιφάνεια των θηλών των δακτύλων των παλαμών και των πελμάτων, είναι γενετικά καθορισμένες και αποτελούν αντικείμενο πολλών μελετών στην ιατρική γενετική και σε εγκληματολογικούς ελέγχους (δερματογλυφικά). 11

12 Εικόνα 1 Ανάπτυξη του καλυπτήριου συστήματος. Το χόριο Το χόριο προέρχεται από το μεσέγχυμα. Κατά τη διάρκεια του τρίτου και τέταρτου μήνα της ανάπτυξης αυτός ο ιστός σχηματίζει πολλούς ακανόνιστους σχηματισμούς, τις θηλές του χορίου, οι οποίες εισχωρούν στην υπερκείμενη επιδερμίδα. Αυτές οι θηλές περιέχουν συνήθως ένα μικρό τριχοειδές αγγείο ή κάποιο αισθητικό σωμάτιο. Η βαθύτερη στιβάδα του χορίου, που ονομάζεται υποδόριος ιστός, περιέχει μεγάλες ποσότητες λιπώδους ιστού. Κατά τη γέννηση το δέρμα καλύπτεται από λευκωπό επίχρισμα, το τυρώδες σμήγμα, το οποίο σχηματίζεται από έκκριμα των σμηγματογόνων αδένων καθώς και από εκφυλισμένα κύτταρα της επιδερμίδας και τρίχες. Το τυρώδες σμήγμα προστατεύει το δέρμα του εμβρύου ώστε να μην διαβρέχεται από το αμνιακό υγρό. 12

13 Η τριχοσμηγματογόνος συσκευή Οι τρίχες και οι σμηγματογόνοι αδένες σχηματίζονται ταυτόχρονα κατά τη διάρκεια σχηματισμού της τριχοσμηγματογόνου συσκευής. Οι ιδρωτοποιοί αδένες και τα νύχια αναπτύσσονται ανεξάρτητα. Όλες αυτές οι δομές προέρχονται από την βασική στιβάδα της επιδερμίδας και επομένως η προέλευσή τους είναι από το εξώδερμα. Εικόνα 2 Ανάπτυξη της τριχοσμηγματογόνου συσκευής και των ιδρωτοποιών αδένων. Οι τρίχες εμφανίζονται ως συμπαγείς παχύνσεις της επιδερμίδας, οι οποίες καταδύονται στο υποκείμενο χόριο κατά τη διάρκεια του τρίτου και τέταρτου μήνα. Στα τελικά άκρα τους οι βολβοί των τριχών κοιλαίνονται. Αυτές οι κοιλάνσεις, οι θηλές των τριχών, γεμίζουν γρήγορα με μεσέγχυμα στο οποίο αναπτύσσονται αγγεία και νευρικές απολήξεις. Σύντομα τα κύτταρα στο κέντρο του βολβού της τρίχας γίνονται ατρακτοειδή και κερατινοποιούνται σχηματίζοντας το στέλεχος της τρίχας, ενώ τα περιφερικά κύτταρα γίνονται κυβοειδή σχηματίζοντας τον επιθηλιακό θύλακο της τρίχας. Ο ινώδης θύλακος της τρίχας σχηματίζεται από το περιβάλλον μεσέγχυμα. Σε αυτόν το θύλακο προσφύεται συνήθως ένας μικρός λείος μυς, ο οποίος επίσης προέρχεται από το μεσέγχυμα. Αυτός ο μυς ονομάζεται ανελκτήρας μυς της τρίχας. Συνεχής πολλαπλασιασμός των επιθηλιακών κυττάρων στη βάση του στελέχους ωθεί την τρίχα προς τα άνω και στο 13

14 τέλος του τρίτου μήνα εμφανίζονται οι πρώτες τρίχες στην επιφάνεια του δέρματος, στην περιοχή των οφρύων και του άνω χείλους. Αυτές οι τρίχες, το χνούδι (lanugo), αποπίπτουν περίπου την περίοδο του τοκετού και αργότερα αντικαθίστανται από αδρότερες τρίχες που σχηματίζονται από νέα τριχοθυλάκια. Ο επιθηλιακός θύλακος της τρίχας παρουσιάζει συνήθως μια μικρή εκβλάστηση, την καταβολή του σμηγματογόνου αδένα, η οποία εισχωρεί στο περιβάλλον μεσόδερμα. Τα κύτταρα στο κέντρο αυτών των εκβλαστήσεων εκφυλίζονται και σχηματίζουν με αυτό τον τρόπο λιπαρή ουσία, η οποία εκκρίνεται μέσα στο θύλακο της τρίχας, από όπου φθάνει στο δέρμα. Εικόνα 3 Η διαδικασία μορφογένεσης της τριχοσμηγματογόνου συσκευής πραγματοποιείται αργά κατά την εμβρυική ανάπτυξη [17]. ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΑΝΑΤΟΜΙΑΣ Το δέρμα αποτελείται από δύο στιβάδες, την εξωτερική που καλείται επιδερμίδα και την εσωτερική που ονομάζεται χόριο. Τα εξαρτήματα της επιδερμίδας είναι η τριχοσμηγματογόνος συσκευή, οι αποκρινείς και ιδρωτοποιοί αδένες καθώς και οι όνυχες. Η τροχοσμηγματογόνος συσκευή σχηματίζεται από τρίχες, τον ανελκτήρα μύ και τον σμηγματογόνο αδένα. 14

15 Εικόνα 4 Aνατομία του δέρματος. Το οριστικό πολυεπίπεδο δέρμα είναι παρόν κατά τη γέννηση, αλλά το δέρμα είναι ένα δυναμικό όργανο που υφίσταται συνεχείς αλλαγές σε ολόκληρη τη ζωή, καθώς εξωτερικά στρώματα αποπίπτουν και αντικαθίστανται από κύτταρα εσωτερικών στιβάδων. Το δέρμα ποικίλλει επίσης σε πάχος αναλόγως την ανατομική θέση, το φύλο και την ηλικία του ατόμου. Το δέρμα είναι πιο παχύ στις παλάμες και τα πέλματα των ποδιών (~ 1,5 mm σε πάχος), ενώ το λεπτότερο δέρμα βρίσκεται στα βλέφαρα και στην postauricular περιοχή (~ 0,05 χιλιοστά πάχος). Το δέρμα του άνδρα είναι χαρακτηριστικά παχύτερο από το δέρμα των γυναικών σε όλες τις ανατομικές περιοχές. Τα παιδιά έχουν σχετικά λεπτό δέρμα, που πυκνώνει σταδιακά μέχρι την τέταρτη ή πέμπτη δεκαετία της ζωής όταν αρχίζει να γίνεται πιο λεπτό. Αυτή η αραίωση οφείλεται κατά κύριο λόγο σε αλλαγές στο χόριο, με απώλεια της ελαστικότητας ινών, των επιθηλιακών εξαρτημάτων και στρώματος [19]. Επιδερμίδα Η επιδερμίδα δεν περιέχει αιμοφόρα αγγεία και εξαρτάται πλήρως από το υποκείμενο χόριο για την παράδοση θρεπτικών ουσιών και την απομάκρυνση των τοξικών ουσιών μέσω της διάχυσης στην χοριοεπιδερμική συμβολή. Αποτελείται κυρίως από πολύστιβο πλακώδες 15

16 επιθήλιο που αποτελείται κυρίως από κερατινοκύτταρα σε προοδευτικά στάδια διαφοροποίησης από το βαθύτερο στα πιο επιφανειακά στρώματα. Από το χόριο προς την εξωτερική επιφάνεια, η επιδερμίδα αποτελείται από πέντε στοιβάδες κυττάρων (κερατινοκυττάρων) που παράγουν κερατίνη και έχουν την ακόλουθη διάταξη: 1. Η βασική στιβάδα (ή βλαστική στιβάδα) η οποία αποτελείται από ένα μόνο στοίχο βασίφιλων κυλινδρικών ή κυβοειδών κυττάρων, τα οποία στηρίζονται στον βασικό υμένα στη χοριοεπιδερμική συμβολή, που διαχωρίζει το χόριο από την επιδερμίδα. Δεσμοσώματα που απαντούν σε μεγάλους αριθμούς συνδέουν τις πλάγιες και τις κορυφαίες επιφάνειες των κυττάρων αυτής της στιβάδας. Ημιδεσμοσώματα που βρίσκονται στη βασική κυτταρική μεμβράνη βοηθούν στην πρόσφυση αυτών των κυττάρων στο βασικό υμένα. Η βασική στιβάδα χαρακτηρίζεται από έντονη μιτωτική δραστηριότητα και είναι υπεύθυνη σε συνδυασμό, με το αρχικό τμήμα της επόμενης στιβάδας, για την συνεχή ανανέωση των επιδερμικών κυττάρων. Η ανθρώπινη επιδερμίδα ανανεώνεται κάθε μέρες περίπου, ανάλογα την περιοχή του σώματος, την ηλικία και άλλους παράγοντες. 2. Η ακανθωτή στιβάδα αποτελείται από κυβοειδή, πολυγωνικά ή μόλις αποπλατυσμένα κύτταρα με ένα κεντρικά τοποθετημένο πυρήνα και κυτταρόπλασμα με αποφυάδες γεμάτες από δέσμες ινιδίων. Αυτές οι δέσμες συγκλίνουν σε πολλές μικρές κυτταρικές προεκτάσεις, οι οποίες καταλήγουν σε δεσμοσώματα που εντοπίζονται στα άκρα αυτών των ακανθωτών προσεκβολών. Σε περιοχές που υπόκεινται σε συνεχή τριβή και πίεση (όπως π.χ. στα πέλματα), η ακανθωτή στιβάδα της επιδερμίδας είναι παχύτερη και περιέχει πιο άφθονα τονοϊνίδια και δεσμοσώματα. Όλες οι μιτώσεις περιορίζονται σε αυτό που χαρακτηρίζεται ως μαλπιγιανή στιβάδα και αποτελείται τόσο από τη βασική όσο και από την ακανθωτή στιβάδα. 3. Η κοκκιώδης στιβάδα χαρακτηρίζεται από 3-5 στίχους αποπλατυσμένων πολυγωνικών κυττάρων, τα οποία περιέχουν ένα κεντρικά τοποθετημένο πυρήνα και κυτταρόπλασμα γεμάτο από αδρά βασίφιλα κοκκία, τα οποία ονομάζονται κοκκία κερατοϋαλίνης. Μια άλλη χαρακτηριστική δομή που βρίσκεται σ αυτά τα κύτταρα της κοκκιώδους στιβάδας της επιδερμίδας κατά την εξέτασή τους με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, είναι τα πεταλιώδη κοκκία. Αυτά τα κοκκία συγχωνεύονται με την κυτταρική μεμβράνη και αποβάλλουν το περιεχόμενο τους στα μεσοκυττάρια διαστήματα της κοκκιώδους στιβάδας, όπου παραμένουν με την μορφή ελύτρων που περιέχουν λιπίδια. Αυτό το υλικό που αποβάλλεται λειτουργεί ως φραγμός στη 16

17 διείσδυση ξένων ουσιών και προσφέρει στο δέρμα ένα πολύ σημαντικό στεγανοποιητικό αποτέλεσμα. 4. Η διαυγής στιβάδα, περισσότερο φανερή στο παχύ δέρμα, είναι ημιδιαφανής και αποτελείται από ένα λεπτό στρώμα εξαιρετικά αποπλατυσμένων ηωσινόφιλων κυττάρων. Μεταξύ των παρακείμενων κυττάρων εξακολουθούν να υπάρχουν ευδιάκριτα δεσμοσώματα. 5. Η κεράτινη στιβάδα αποτελείται από στίχους αποπλατυσμένων απύρηνων και κερατινοποιημένων κυττάρων, των οποίων το κυτταρόπλασμα γεμίζει από μία διπλοθλαστική νηματοειδή σκληροπρωτεΐνη, την κερατίνη. Η κερατίνη περιέχει τουλάχιστον 6 διαφορετικά πολυπεπτίδια με μοριακό βάρος κυμαινόμενο από Μετά την κερατινοποίηση, τα κύτταρα αποτελούνται μόνο από ινώδεις και άμορφες πρωτεΐνες και παχιές κυτταρικές μεμβράνες και ονομάζονται κερατινοποιημένα κύτταρα. Για την εξαφάνιση των κυτταροπλασματικών οργανιδίων παίζουν ρόλο λυσοσωματικά υδρολυτικά ένζυμα. Από την επιφάνεια της κερατίνης στιβάδας αποπίπτουν (αποφολιδώνονται) συνεχώς κύτταρα Εικόνα 5 Δομή επιδερμίδας. Φωτομικρογραφία από τομή παχέος δέρματος. 17

18 Κύτταρα της επιδερμίδας Εκτός από τα κερατινοκύτταρα στην επιδερμίδα παρατηρούνται και άλλα είδη κυττάρων: τα μελανοκύτταρα, τα κύτταρα Langerhans και τα κύτταρα Merkel όπως φαίνεται και στην εικόνα. Εικόνα 6 Κύτταρα της επιδερμίδας και οι βασικές λειτουργίες που επιτελεί το καθένα. Μελανοκύτταρα Τα μελανοκύτταρα εντοπίζονται κάτω ή μεταξύ των κυττάρων της βασικής στιβάδας της επιδερμίδας καθώς επίσης και στα τριχοθυλάκια. Η βασική τους λειτουργία είναι η παραγωγή μιας καστανής χρωστικής, της ευμελανίνης η οποία προστατεύει το δέρμα από τη βλαπτική επίδραση της υπεριώδους ακτινοβολίας. Το χρώμα του δέρματος οφείλεται σε αρκετούς παράγοντες, αλλά οι πιο σημαντικοί από αυτούς είναι η περιεκτικότητα του δέρματος σε μελανίνη και καρωτίνη, ο αριθμός των αιμοφόρων αγγείων του χορίου καθώς και το χρώμα του αίματος που κυλάει μέσα σε αυτά. Η χρωστική που υπάρχει στις κόκκινες τρίχες λέγεται φαιομελανίνη και στη δομή της περιέχει κυστεΐνη. Τα μελανοκύτταρα προέρχονται από κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας. Αποτελούνται από στρογγυλεμένα κυτταρικά σώματα, από τα οποία εκφύονται μακριές, ανώμαλες αποφυάδες διακλαδιζόμενες μεταξύ των κυττάρων της βασικής και της ακανθωτής στιβάδας της επιδερμίδας. Οι κορυφές αυτών των αποφυάδων καταλήγουν σε εγκολπώσεις των κυττάρων των δύο στιβάδων στις οποίες βρίσκονται. Στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο το μελανινοκύτταρο 18

19 φαίνεται αραιοχρωματικό, περιέχει πολυάριθμα μικρά μιτοχόνδρια, μια καλά αναπτυγμένη συσκευή Golgi και βραχείες δεξαμενές αδρού ενδοπλασματικού δικτύου. Στο κύτταρο βρίσκονται και ενδιάμεσα ινίδια με διάμετρο 10 nm περίπου. Τα μελανοκύτταρα δεν προσκολλώνται στα κερατινοκύτταρα με δεσμοσώματα, υπάρχουν όμως ημιδεσμοσώματα, με τα οποία προσδένονται τα μελανοκύτταρα στο βασικό υμένα. Η σύνθεση της μελανίνης γίνεται στο εσωτερικό των μελανινοκυττάρων και η τυροσινάση παίζει σημαντικό ρόλο σε αυτή τη διεργασία. Υπό την επίδραση της τυροσινάσης, η τυροσίνη μετατρέπεται σε 3,4-διϋδροξυφαινυλανίνη (dopa) και στη συνέχεια σε dopa-κινόνη, η οποία διαμέσου μια σειράς μεταμορφώσεων μετατρέπεται σε μελανίνη. Η τυροσινάση σχηματίζεται στα ριβοσωμάτια, μεταφέρεται στον αυλό του αδρού ενδοπλασματικού δικτύου των μελανινοκυττάρων και αθροίζεται σε κυστίδια, τα οποία σχηματίζονται στη συσκευή του Golgi. Στη διεργασία σχηματισμού των ωρίμων κοκκίων της μελανίνης μπορούν να διακριθούν 4 στάδια: Στάδιο 1: Ένα κυστίδιο περιβαλλόμενο από μεμβράνη, αρχίζει να παρουσιάζει δραστηριότητα τυροσινάσης και σχηματισμό λεπτόκοκκου υλικού. Στην περιφέρεια του κυστιδίου ηλεκτρονικά πυκνές ζώνες παρουσιάζουν μια κανονική διάταξη μορίων τυροσινάσης πάνω σε μία πρωτεϊνική θεμέλια ουσία Στάδιο 2: Το κυστίδιο (μελανόσωμα) είναι πιο ωοειδές σε σχήμα και παρουσιάζει στο εσωτερικό του παράλληλα ινίδια με περιοδικότητα περίπου 10 nm ή εγκάρσιες γραμμώσεις της ίδιας περίπου περιοδικότητας. Στην πρωτεϊνική θεμέλια ουσία εναποτίζεται μελανίνη. Στάδιο 3: Λόγω του αυξημένου σχηματισμού μελανίνης η εσωτερική περιοδικότητα της λεπτής υφής είναι λιγότερο φανερή. Στάδιο 4: Το ώριμο κοκκίο μελανίνης είναι ορατό στο φωτομικροσκόπιο και το κυστίδιο είναι εντελώς γεμάτο από μελανίνη. Με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο δεν διακρίνονται πλέον λεπτομέρειες στο εσωτερικό του. Το ώριμο κοκκίο είναι ελλειψοειδές σε σχήμα με μήκος 1μm και πάχος 0,4 μm. Από τη στιγμή που θα σχηματιστούν τα κοκκία της μελανίνης, αρχίζουν να μεταναστεύουν στις κυτταρικές αποφυάδες των μελανινοκυττάρων και μεταφέρονται στα κύτταρα της βασικής και της ακανθωτής στιβάδας της επιδερμίδας. 19

20 Εικόνα 7 Η έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία προκαλεί τη παραγωγή μελανίνη. Τα μελανοσώματα καθώς ωριμάζουν μεταταφέρονται στα κερατινοκύτταρα της επιδερμίδας όπου και αποθηκεύονται. Ενώ τα μελανοκύτταρα συνθέτουν μελανίνη, τα επιθηλιακά κύτταρα χρησιμεύουν ως αποθήκες της χρωστικής και περιέχουν περισσότερη μελανίνη απ ότι τα μελανοκύτταρα. Μέσα στα κερατινοκύτταρα, τα κοκκία της μελανίνης συγχωνεύονται με τα λυσοσωμάτια, γεγονός που αποτελεί την αιτία της εξαφάνισης της μελανίνης στα επιθηλιακά κύτταρα των ανωτέρων στοιβάδων της επιδερμίδας. Σ αυτή την αλληλεπίδραση μεταξύ κερατινοκυττάρων και μελανινοκυττάρων η οποία έχει σαν αποτέλεσμα το χρωματισμό του δέρματος, σημαντικοί παράγοντες είναι η ταχύτητα σχηματισμού των κοκκίων της μελανίνης στα μελανοκύτταρα, η μεταφορά τους στα κερατινοκύτταρα και η τελική διάθεση των κοκκίων από τα κερατινοκύτταρα. Τα μελανοκύτταρα μπορούν εύκολα να γίνουν ορατά με επώαση τμημάτων επιδερμίδας σε dopa. Αυτή η ουσία μετατρέπεται σε καστανές εναποθέσεις μελανίνης στα μελανοκύτταρα, μια αντίδραση που καταλύεται από το ένζυμο τυροσινάση. Στον άνθρωπο η μελάγχρωση (μαύρισμα) του δέρματος, μετά από έκθεση στις υπεριώδεις ακτίνες του ηλιακού φωτός αποτελεί διαδικασία που συντελείται σε δύο στάδια. Κατ αρχήν συμβαίνει μια φυσικοχημική αντίδραση, η οποία μαυρίζει την προϋπάρχουσα μελανίνη και την απελευθερώνει γρήγορα στα κερατινοκύτταρα. Σ ένα δεύτερο στάδιο, ο ρυθμός της σύνθεσης μελανίνης στα μελανοκύτταρα επιταχύνεται με αποτέλεσμα την αύξηση της ποσότητας αυτής της χρωστικής. 20

21 Κύτταρα του Langerhans Αυτά τα αστεροειδή κύτταρα απαντούν κυρίως στην ακανθωτή στιβάδα της επιδερμίδας. Στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο παρουσιάζουν ένα οδοντωτό πυρήνα, διαυγές κυτταρόπλασμα χωρίς τονοϊνίδια ενώ δεν έχουν επίσης δεσμοσώματα στην κυτταρική μεμβράνη. Στο κυτταρόπλασμά τους περιέχουν χαρακτηριστικά έγκλειστα με σχήμα ραβδίου ή ρακέτας ( κοκκία του Birbeck). Υπάρχουν κύτταρα Langerhans ανά τετραγωνικό χιλιοστόμετρο δερματικής επιφάνειας. Αυτά τα κύτταρα θεωρούνται υπεύθυνα για την προώθηση και παρουσίαση δερματικών αντιγόνων στα λεμφοκύτταρα που υπάρχουν στην επιδερμίδα. Τα κύτταρα του Langerhans έχει αποδειχθεί ότι προέρχονται από προγονικά κύτταρα εντοπιζόμενα στο μυελό των οστών. Κύτταρα του Merkel Τα κύτταρα του Merkel γενικά απαντούν στο παχύ δέρμα των παλαμών και των πελμάτων και μοιάζουν κάπως με τα επιθηλιακά κύτταρα της επιδερμίδας, αλλά έχουν μικρά πυκνά κοκκία στο κυτταρόπλασμά τους. Στη βάση των κυττάρων του Merkel υπάρχουν ελεύθερες νευρικές απολήξεις, οι οποίες σχηματίζουν ένα αποπλατυσμένο τελικό δίσκο. Τα κύτταρα του Merkel μπορεί να χρησιμεύουν ως αισθητικοί υποδοχείς μηχανικών ερεθισμάτων. Νύχια Τα νύχια είναι αποπλατυσμένα μορφώματα στη ραχιαία επιφάνεια των τελικών φαλάγγων. Το αρχικό τμήμα του νυχιού κατασκηνώνει στην αύλακα του νυχιού και αποτελεί τη ρίζα του νυχιού. Το επιθήλιο της πτυχής του δέρματος που σκεπάζει τη ρίζα του νυχιού αποτελείται από τις συνηθισμένες στοιβάδες κυττάρων. Η κερατίνη στιβάδα αυτής της επιδερμίδας σχηματίζει το επωνύχιο. Η ονυχική πλάκα επικάθεται σε ένα επιδερμικό στρώμα που λέγεται κοίτη του νυχιού. Σε αυτήν την κοίτη υπάρχουν μόνο η βασική και η ακανθωτή στιβάδα. Η ονυχική πλάκα αντιστοιχεί στην κερατίνη στιβάδα του δέρματος. Το επιθήλιο της κοίτης του νυχιού προέρχεται από τη μήτρα του νυχιού. Το κεντρικό άκρο της μήτρας εντοπίζεται βαθιά στη ρίζα του νυχιού, ενώ το περιφερικό άκρο της εκτείνεται ως το εξωτερικό άκρο του μηνίσκου, ο οποίος είναι μια λευκή, αδιαφανής, ημισέληνος στο αρχικό τμήμα του νυχιού. Τα κύτταρα της μήτρας διαιρούνται, μεταναστεύουν περιφερικά και τελικά κερατινοποιούνται σχηματίζοντας το αρχικό τμήμα της ονυχικής πλάκας. Η ονυχική πλάκα κατόπιν διολισθαίνει προς τα εμπρός πάνω στη κοίτη του νυχιού, η οποία δεν συμμετέχει στο σχηματισμό της 21

22 πλάκας. Το περιφερικό άκρο της πλάκας απελευθερώνεται από τη κοίτη του νυχιού και αποτρίβεται ή κόπτεται. Η σχεδόν διαφανής ονυχική πλάκα και το λεπτό επιθήλιο της κοίτης του νυχιού προσφέρει ένα χρήσιμο όργανο παρατήρησης για τον υπολογισμό της ποσότητας του οξυγόνου στο αίμα καθώς επιτρέπει τη θεώρηση του χρώματος του αίματος στα αγγεία του δέρματος. Εξαρτήματα του δέρματος Εικόνα 8 Εξαρτήματα του δέρματος, η τριχοσμηγματογόνος μονάδα και ιδρωτοποιός αδένας. Το τριχοθυλάκιο Οι τρίχες είναι επιμήκεις κερατινοποιημένες δομές προερχόμενες από εγκολπώσεις του επιθηλίου της επιδερμίδας. Το χρώμα τους, το μέγεθος τους και η κατανομή τους ποικίλλουν ανάλογα με τη φυλή, την ηλικία, το φύλο και τη περιοχή του σώματος. Οι τρίχες υπάρχουν σε όλο το σώμα εκτός από τις παλάμες, τα πέλματα, τα χείλη, τη βάλανο του πέους, την κλειτορίδα και τα μικρά χείλη του αιδοίου. Το δέρμα του προσώπου έχει περίπου 600 τρίχες/εκ2 ενώ το δέρμα του υπόλοιπου σώματος φέρει περίπου 60/εκ 2. Οι τρίχες μεγαλώνουν ασυνεχώς παρουσιάζοντας περιόδους αύξησης ακολουθούμενες από περιόδους ανάπαυσης. Αυτή η αύξηση δεν επιτελείται συγχρόνως σε όλες τις περιοχές του σώματος ή ακόμα και στην ίδια περιοχή, αλλά έχει την τάση να ακολουθεί μωσαϊκό πρότυπο. Η διάρκεια της αύξησης και οι περίοδοι της ανάπαυσης επίσης ποικίλλουν ανάλογα με τη 22

23 περιοχή του σώματος. Μ αυτόν τον τρόπο, στο τριχωτό της κεφαλής, οι περίοδοι της αύξησης μπορεί να κρατήσουν μερικά χρόνια, ενώ οι περίοδοι της ανάπαυσης κατά μέσο όρο 3 μήνες. Σε ορισμένες περιοχές του σώματος, όπως το τριχωτό της κεφαλής, το πρόσωπο και το εφήβαιο, η αύξηση των τριχών επηρεάζεται έντονα όχι μόνο από τις γεννητικές ορμόνεςιδιαίτερα τα ανδρογόνα- αλλά επίσης και από ορμόνες των επινεφριδίων και του θυρεοειδούς. Κάθε τρίχα εκφύεται από μια επιδερμική εγκόλπωση, το τριχοθυλάκιο, το οποίο κατά τη διάρκεια της αυξητικής περιόδου του παρουσιάζει μια τελική διόγκωση που λέγεται βολβός της τρίχας. Στη βάση αυτού του βολβού παρατηρείται η δερματική θηλή. Η δερματική θηλή περιέχει ένα δίκτυ τριχοειδών, το οποίο έχει ζωτική σημασία για τη διατήρηση του τριχοθυλακίου. Η διακοπή της ροής του αίματος ή η απώλεια της ζωτικότητας της δερματικής θηλής, έχουν σαν αποτέλεσμα το θάνατο του τριχοθυλακίου. Τα επιδερμικά κύτταρα που καλύπτουν τη δερματική θηλή σχηματίζουν τη ρίζα της τρίχας, η οποία παράγει το στέλεχος που αποτελεί τη συνέχειά της και προβάλλει από το δέρμα. Κατά τη διάρκεια των αυξητικών περιόδων, τα επιθηλιακά κύτταρα που αποτελούν το βολβό της τρίχας είναι ισοδύναμα με τα κύτταρα της βασικής στιβάδας της επιδερμίδας. Αυτά τα κύτταρα διαιρούνται συνεχώς και διαφοροποιούνται στους εξής τύπους κυττάρων : 1. Σε ορισμένους τύπους παχέων τριχών, τα κύτταρα της κεντρικής περιοχής της ρίζας, στην κορυφή της δερματικής θηλής, παράγουν μεγάλα, κενοτοπιώδη και μετρίως κερατινοποιημένα κύτταρα, τα οποία σχηματίζουν το μυελό της τρίχας 2. Τα κύτταρα που βρίσκονται γύρω από την κεντρική περιοχή της ρίζας, πολλαπλασιάζονται και διαφοροποιούνται προς εντόνως κερατινοποιημένα, συμπαγώς διατεταγμένα ατρακτοειδή κύτταρα, τα οποία σχηματίζουν το φλοιό της τρίχας. 3. Περισσότερο περιφερικά βρίσκονται τα κύτταρα, που παράγουν το επιτρίχιο, μια στιβάδα κυττάρων, τα οποία μέχρι το μέσο του βολβού είναι κυβοειδή, στη συνέχεια γίνονται υψηλά και κυλινδρικά και σε ακόμη υψηλότερο επόπεδο αλλάζουν από οριζόντια σε κατακόρυφα, όπου και σχηματίζουν μια στιβάδα αποπλατυσμένων κυττάρων με έντονη κερατινοποίηση, τα οποία διατάσσονται όπως τα κεραμίδια της στέγης, καλύπτοντας το φλοιό. Αυτά τα κύτταρα του επιτριχίου αποτελούν την τελευταία διαφοροποιούμενη κυτταρική σειρά του τριχοθυλακίου. 4. Τελικά, τα πιο περιφερικά κύτταρα παράγουν το εσωτερικό έλυτρο της ρίζας, το οποίο περιβάλλει τελείως το αρχικό τμήμα του στελέχους της τρίχας. Το 23

24 εσωτερικό έλυτρο είναι μια παροδική δομή, της οποίας τα κύτταρα εκφυλίζονται και εξαφανίζονται πάνω από το επίπεδο των σμηγματογόνων αδένων. Το εξωτερικό έλυτρο της τρίχας αποτελεί συνέχεια των επιδερμικών κυττάρων και κοντά στην επιφάνεια παρουσιάζει όλες τις στιβάδες της επιδερμίδας. Κοντά στη δερματική θηλή είναι λεπτότερο και αποτελείται από κύτταρα, τα οποία αντιστοιχούν στη βασική στιβάδα της επιδερμίδας. Εικόνα 9 Δομή του τριχοθυλακίου. Ανάμεσα στο τριχοθυλάκιο και στο χόριο μεσολαβεί μια υαλοειδής στιβάδα χωρίς κύτταρα, ο υαλοειδής υμένας, ο οποίος αντιπροσωπεύει μια πάχυνση του βασικού υμένα. Το χόριο που περιβάλλει το τριχοθυλάκιο είναι πυκνότερο και σχηματίζει ένα ειδικό έλυτρο από συνδετικό ιστό. Σ αυτό το ινώδες έλυτρο προσφύονται δέσμες λείων μυϊκών κυττάρων, οι ανελκτήρες μύες των τριχών διαμέσου των οποίων το έλυτρο συνδέεται με τη θηλώδη στιβάδα του χορίου. Οι ανελκτήρες μύες παρουσιάζουν πλάγια πορεία και η συστολή τους έχει σαν αποτέλεσμα την ανόρθωση του στελέχους της τρίχας σε περισσότερο κατακόρυφη θέση. Η συστολή των ανελκτήρων μυών των τριχών προκαλεί επίσης μια υποχώρηση του δέρματος στο σημείο που αυτοί οι μύες προσφύονται στο δέρμα. Αυτό το γεγονός προκαλεί το κοινώς λεγόμενο «χήνειο δέρμα». 24

25 Μέσα στον θύλακα κάθε τρίχα διανύει ένα κύκλο ζωής που αποτελείται από τρία στάδια. Τα στάδια αυτά είναι : Αναγενές στάδιο Καταγενές στάδιο Τελογενές στάδιο Στο αναγενές στάδιο η τρίχα γεννιέται από την θηλή του χορίου. Είναι το δυναμικότερο στάδιο της τρίχας. Στο στάδιο αυτό η τρίχα σχηματίζεται και αναπτύσσεται. Διαρκεί 2 έως 6 έτη. Στο καταγενές στάδιο η τρίχα προετοιμάζεται για την πτώση της. Διαρκεί 2-3 εβδομάδες. Στο τελογενές στάδιο η τρίχα ολοκληρώνει το κύκλο της και πέφτει. Το στάδιο αυτό διαρκεί 4-6 μήνες. Σε φυσιολογικές συνθήκες το 85 % των τριχών βρίσκονται στο αναγενές στάδιο, το 1 % στο καταγενές και το % στο τελογενές. Το χρώμα των τριχών οφείλεται στη δραστηριότητα των μελανινοκυττάρων που εντοπίζονται μεταξύ της θηλής και των επιθηλιακών κυττάρων της ρίζας της τρίχας και τα οποία παράγουν τη χρωστική που υπάρχει στα κύτταρα του μυελού και του φλοιού του στελέχους της τρίχας. Αυτά τα μελανοκύτταρα παράγουν και μεταφέρουν μελανίνη στα επιθηλιακά κύτταρα με ένα μηχανισμό όμοιο με εκείνο που περιγράφηκε για την επιδερμίδα. Αν και η διαδικασία της κερατινοποίησης στην επιδερμίδα και στη τρίχα φαίνεται πως είναι η ίδια, υπάρχουν διαφορές στα εξής σημεία: 1. Η επιδερμίδα παράγει σχετικώς μαλακά, κερατινοποιημένα ανώτερα στρώματα νεκρών κυττάρων, τα οποία προσφύονται χαλαρά στο δέρμα και αποφολιδώνονται συνέχεια. Στην τρίχα συμβαίνει το αντίθετο με την παραγωγή μιας σκληρής και συμπαγούς κερατινοποιημένης δομής. 2. Ενώ στην επιδερμίδα η κερατινοποίηση είναι συνεχής και καλύπτει ολόκληρα την επιφάνειά της, στην τρίχα η κερατινοποίηση είναι διακοπτόμενη και συμβαίνει μόνο στη ρίζα της τρίχας. Η θηλή της τρίχας, ασκεί επαγωγική δράση πάνω στα επιθηλιακά κύτταρα που την καλύπτουν. Αυτή η δράση προάγει τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των επιθηλιακών αυτών κυττάρων. Έτσι, βλάβη των θηλών, έχει σαν αποτέλεσμα την απώλεια των τριχών. 3. Σε αντίθεση με ό,τι συμβαίνει στην επιδερμίδα, όπου όλα τα κύτταρα διαφοροποιούνται προς την ίδια κατεύθυνση παράγοντας την τελική κερατινοποιημένη στιβάδα, στη ρίζα της τρίχας, τα κύτταρα διαφοροποιούνται σε διάφορους κυτταρικούς τύπους, οι οποίοι διαφέρουν μεταξύ τους από 25

26 μικροσκοπική, ιστοχημική και λειτουργική άποψη. Η μιτωτική δραστηριότητα στα τριχοθυλάκια βρίσκεται υπό την επίδραση των ανδρογόνων. Σμηγματογόνοι αδένες Οι σμηγματογόνοι αδένες κατασκηνώνουν στο χόριο του μεγαλύτερου μέρους της επιφάνειας του σώματος. Υπάρχουν περίπου 100 από αυτούς τους αδένες ανά τετραγωνικό εκατοστό στο μεγαλύτερο τμήμα της επιφάνειας του σώματος, αλλά η πυκνότητα αυξάνει σε /cm 2 στο πρόσωπο, το μέτωπο και το τριχωτό της κεφαλής. Στο παχύ δέρμα των παλαμών και των πελμάτων δεν υπάρχουν σμηγματογόνοι αδένες. Είναι κυψελοειδείς αδένες, οι οποίοι συνήθως αποτελούνται από μερικές αδενοκυψέλες, που καταλήγουν σ ένα βραχύ πόρο. Αυτός ο πόρος συνήθως εκβάλλει στο ανώτερο τμήμα του τριχοθυλακίου. Οι αδενοκυψέλες αποτελούνται από μία βασική στιβάδα αδιαφοροποίητων αποπλατυσμένων επιθηλιακών κυττάρων, τα οποία στηρίζονται στο βασικό υμένα. Οι πυρήνες τους σταδιακά συρρικνώνονται και τα κύτταρα γεμίζουν με σταγονίδια λίπους για να ραγούν στη συνέχεια. Το προϊόν αυτής της διεργασίας είναι το σμήγμα, το έκκριμα το σμηγματογόνου αδένα, το οποίο μεταφέρεται σταδιακά προς την επιφάνεια του δέρματος. Ο σμηγματογόνος αδένας αποτελεί παράδειγμα ολοκρινούς αδένα, γιατί το προϊόν της έκκρισης απελευθερώνεται μαζί με υπολείμματα νεκρών κυττάρων. Το σμήγμα αποτελείται από ένα σύνθετο μείγμα λιπιδίων, το οποίο περιέχει τριγλυκερίδια, κηρούς, σκουαλένιο, χοληστερόλη και εστέρες της. Οι σμηγματογόνοι αδένες αρχίζουν να λειτουργούν κατά την ήβη. Ο κύριος ρυθμιστικός παράγοντας της εκκριτικής δραστηριότητας του σμηγματογόνου αδένα είναι η τεστοστερόνη, ενώ στις γυναίκες είναι ένας συνδυασμός ωοθηκικών και επινεφρικών ανδρογόνων. Οι λειτουργίες του σμήγματος στον άνθρωπο είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Πιθανόν έχει ασθενείς αντιβακτηριδιακές και αντιμυκητιασικές ιδιότητες. Το σμήγμα δεν συμμετέχει στην πρόληψη απώλειας νερού. Ιδρωτοποιοί αδένες Οι ιδρωτοποιοί αδένες έχουν ευρεία κατανομή στο δέρμα. Ορισμένες περιοχές όπως η βάλανος του πέους, στερούνται ιδρωτοποιών αδένων. Οι μεροκρινείς ιδρωτοποιοί αδένες είναι απλοί πολυέλικτοι σωληνώδεις αδένες, των οποίων οι πόροι καταλήγουν στην επιφάνεια του δέρματος. Οι πόροι τους δεν διακλαδίζονται και είναι λεπτότεροι σε διάμετρο από το κεντρικό τμήμα. Το εκκριτικό τμήμα του αδένα κατασκηνώνει στο χόριο, έχει πάχος περίπου 0,4 χιλ. και περιβάλλεται από μυοεπιθηλιακά κύτταρα. Η συστολή αυτών των 26

27 κυττάρων θεωρείται ότι βοηθάει στην αποβολή του εκκρίματος. Το εκκριτικό τμήμα των αδένων περιβάλλεται από ένα αρκετά παχύ βασικό υμένα. Στο τμήμα αυτό περιγράφονται 2 τύποι κυττάρων, τα βαθυχρωματικά και τα διαυγή κύτταρα. Οι εκφορητικοί πόροι επενδύονται από πολύστιβο κυβοειδές επιθήλιο. Το υγρό που εκκρίνεται από τους ιδρωτοποιούς αδένες δεν είναι ιξώδες και περιέχει ελάχιστες πρωτείνες. Εκτός από τους μεροκρινείς ιδρωτοποιούς αδένες υπάρχει και ένας άλλος τύπος ο αποκρινής αδένας ο οποίος απαντά στη μασχαλιαία περιοχή, στην άλω του μαστού και στη περινεϊκή χώρα. Οι αποκρινείς αδένες είναι πολύ μεγαλύτεροι (με διάμετρο 3,5 χιλ) από ότι οι μεροκρινείς αδένες. Κατασκηνώνουν στον υποδόριο ιστό και οι πόροι τους εκβάλλουν σε τριχοθυλάκια. Αυτοί οι αδένες παράγουν ένα ιξώδες έκκριμα, το οποίο αρχικά είναι άοσμο, αλλά αποκτά τη χαρακτηριστική οσμή του με μικροβιακή ζύμωση. Οι αποκρινείς αδένες νευρώνονται από από αδρενεργικές νευρικές απολήξεις, ενώ οι μεροκρινείς αδένες από χολινεργικές ίνες. Χόριο Η βασική λειτουργία του είναι να διατηρήσει και να υποστηρίξει την επιδερμίδα. Το χόριο είναι μια πιο σύνθετη δομή και αποτελείται από 2 στρώματα με μάλλον ασαφή όρια: η επιπολής θηλώδης στιβάδα και η εν τω βάθει δικτυωτή στιβάδα. Η θηλώδης στιβάδα είναι πιο λεπτή και αποτελείται από χαλαρό συνδετικό ιστό. Εκτός από τις ινοβλάστες υπάρχουν και άλλα κύτταρα του συνδετικού ιστού, με περισσότερο άφθονα τα mast κύτταρα και τα μακροφάγα. Η θηλώδης στιβάδα ονομάζεται έτσι γιατί αποτελεί το μέγιστο μέρος των θηλών του χορίου. Από αυτή τη στιβάδα ειδικές κολλαγόνες ίνες αγκυροβολούν στο βασικό υμένα της επιδερμίδας και εξαπλώνονται μέσα στο χόριο. Αυτές οι ίνες θεωρείται πως έχουν μια ειδική λειτουργία, να καθηλώνουν την επιδερμίδα στο χόριο και λέγονται ινίδια αγκυροβολίας. Είναι επίσης γνωστό ότι το υποκείμενο χόριο βρίσκεται σε συνεχή διαντίδραση και επικοινωνία με τα κύτταρα της βαστικής στιβάδας της επιδερμίδας συμβάλλοντας στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού τους και της μετακίνησής τους προς ανώτερες στιβάδες [14-17]. 27

28 Εικόνα 10 Διαντίδραση επιδερμίδας χορίου. Η δικτυωτή στιβάδα αποτελείται από ένα παχύτερο στρώμα του συνδετικού ιστού (κυρίως κολλαγόνο τύπου Ι και έχει περισσότερες ίνες και λιγότερα κύτταρα από ό,τι η θηλώδης στιβάδα. Το χόριο έχει ένα πλούσιο δίκτυο αιμοφόρων και ελαστικών ινών. Σε αρκετές περιοχές του δέρματος, το αίμα μπορεί να περάσει κατευθείαν από τις αρτηρίες στις φλέβες διαμέσου των αρτηριοφλεβικών αναστομώσεων. Αυτές οι αναστομώσεις παίζουν ένα πολύ σημαντικό ρόλο στη θερμορρύθμιση και στη ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης, δεδομένου ότι τα αγγεία του χορίου μπορούν να χωρέσουν περίπου το 4,5% του όγκου του αίματος. Ένα πυκνό τριχοειδικό δίκτυο στη θηλώδη στιβάδα περιβάλλει τις επιδερμικές καταδύσεις και χρησιμεύει στη ρύθμιση της θερμοκρασίας του εσωτερικού μέρους του σώματος και στην τροφοδοσία της υπερκείμενης επιδερμίδας, η οποία στερείται αγγείων. Εκτός από αυτά τα στοιχεία, το χόριο περιέχει επίσης ορισμένα εξαρτήματα του δέρματος. Τα τριχοθυλάκια, τους σμηγματογόνους αδένες και τους ιδρωτοποιούς αδένες. Στο χόριο υπάρχει ένα πλούσιο δίκτυο νεύρων. Οι φυγόκεντρες νευρικές ίνες του δέρματος είναι μεταγαγγλιακές ίνες των συμπαθητικών γαγγλίων της παρασπονδυλικής αλυσίδας. Παρασυμπαθητική νεύρωση δεν υπάρχει. Οι κεντρομόλες νευρικές αποφυάδες σχηματίζουν ένα επιφανειακό χοριακό δίκτυο με ελεύθερες νευρικές απολήξεις, ένα δίκτυ γύρω από τα τριχοθυλάκια και τη νεύρωση των περιβαλλόμενων από κάψα αισθητικών οργάνων (σωμάτια του Meissner και του Pacini). Η ινοβλάστη είναι ο βασικός τύπος κυττάρου στο χόριο. Αυτά τα κύτταρα παράγουν και εκκρίνουν προκολλαγόνο και ελαστικές ίνες. Το προκολλαγόνο τελικά διασπάται από πρωτεολυτικά ένζυμα σε κολλαγόνο το οποίο συσσωρεύεται και συνδέεται σφιχτά 28

29 σχηματίζοντας δίκτυο. Έτσι που παρέχει αντοχή σε εφελκυσμό και αντοχή σε διάτμηση και άλλες μηχανικές δυνάμεις. Το κολλαγόνο αποτελεί το 70% του βάρους του χορίου, κυρίως τύπου Ι (το 85% του συνολικού κολλαγόνου) και τύπου III (15% του συνολικού κολλαγόνου). Ελαστικές ίνες αποτελούν λιγότερο από το 1% του βάρους του χορίου, αλλά παίζουν σημαντικό ρόλο στην αντίσταση σε παραμορφωτικές δυνάμεις καθώς και την επιστροφή του δέρματος στη μορφή που έχει σε κατάσταση ηρεμίας. Εικόνα 11 Συνδετικός ιστός στο χόριο. Αγγεία και νεύρα του δέρματος Οι αρτηρίες που τροφοδοτούν το δέρμα σχηματίζουν δύο πλέγματα, ένα μεταξύ της θηλώδους και της δικτυωτής στιβάδας και ένα μεταξύ του χορίου και του υποδόριου ιστού. Από αυτά τα πλέγματα εκφύονται λεπτοί κλάδοι, οι οποίοι αγγειώνουν τις θηλές του χορίου. Κάθε θηλή του χορίου έχει μόνο ένα ανιόντα αρτηριακό και ένα φλεβικό κατιόντα κλάδο. Οι φλέβες διατάσσονται σε τρία πλέγματα. Δύο από αυτά βρίσκονται στο ίδιο επίπεδο με τα αρτηριακά πλέγματα, ενώ το τρίτο εντοπίζεται στο μέσο του χορίου. Αρτηριοφλεβικές αναστομώσεις με σπειροειδή απαντούν συχνά στο δέρμα. Τα λεμφικά αγγεία αρχίζουν σαν τυφλοί σάκκοι στις θηλές του χορίου και συγκλείνουν για να σχηματίσουν δύο πλέγματα όμοια με εκείνα πουν περιγράφηκαν για τις αρτηρίες. 29

30 Εικόνα 12 Τα αγγειακά πλέγματα του δέρματος. Οι αρτηριοφλεβικές αναστομώσεις παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στη θερμορρύθμιση. Μια από τις πιο σημαντικές λειτουργίες του δέρματος είναι να δέχεται ερεθίσματα από το περιβάλλον διαμέσου της άφθονης αισθητικής νεύρωσης του. Εκτός από τις ελεύθερες νευρικές απολήξεις στην επιδερμίδα και τους αδένες του δέρματος, υποδοχείς υπάρχουν στο χόριο και στον υποδόριο ιστό, εντοπιζόμενοι συνηθέστερα στις θηλές του χορίου. Τα τριχοθυλάκια διαθέτουν πλούσιο δίκτυο νευρικών απολήξεων, οι οποίες χρησιμεύουν για την πρόσληψη απτικών ερεθισμάτων από το περιβάλλον. Εικόνα 13 Διάφοροι τύποι αισθητικών νευρικών απολήξεων στο δέρμα. 30

31 ΤΑ STEM ΚΥΤΤΑΡΑ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ STEM ΚΥΤΤΑΡΩΝ Τα stem κύτταρα (βλαστοκύτταρα) χαρακτηρίζονται από 2 βασικές ιδιότητες : από ικανότητα απεριόριστης αυτο-ανανέωσης (self-renewal) και την δυναμική για διαφοροποίηση προς διαφορετικούς τύπους κυττάρων-πολυδυναμία (pluripotency) [3]. Αυτές οι μοναδικές ιδιότητες των stem κυττάρων τα καθιστούν ικανά να δημιουργούν λειτουργικούς ιστούς κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη και να εξασφαλίζουν, μετέπειτα, την ομοιόσταση των ιστών. Αναγνωρίζονται 2 βασικές κατηγορίες stem κυττάρων, τα εμβρυϊκά stem κύτταρα (embryonic stem cells) και τα σωματικά stem κύτταρα (adult somatic or adult tissue specific stem cells). Εικόνα 14 Τα σωματικά stem κύτταρα βρίσκονται στους ιστούς του σώματος και συνιστούν σημαντικούς παράγοντες της φυσιολογίας και παθολογίας [20]. 31

32 Τα stem κύτταρα έχουν ποικίλα επίπεδα δυναμικότητας : μόνο το γονιμοποιημένο ωάριο (ζυγωτό) και οι απόγονοι των 2 πρώτων διαιρέσεων είναι totipotent (παντοδύναμα), είναι ικανά δηλαδή να σχηματίσουν το έμβρυο καθώς και εξωεμβρυικούς ιστούς (τροφοβλάστη). Μετά από 4 περίπου μέρες, αυτά τα totipotent κύτταρα αρχίζουν να διαφοροποιούνται σχηματίζοντας την βλαστοκύστη και μια ομάδα κυττάρων που ονομάζεται εσωτερική μάζα κυττάρων ICM (Inner Cell Mass) από όπου και αναπτύσσεται το έμβρυο. Τα ICM κύτταρα, θεωρούνται ότι είναι pluripotent (πολυδύναμα), ικανά δηλαδή να διαφοροποιηθούν προς όλα σχεδόν τα κύτταρα τα οποία προέρχονται από τις τρεις βλαστικές στοιβάδες, όχι όμως και να σχηματίσουν έμβρυο καθώς δεν είναι ικανά να σχηματίσουν τον πλακούντα και τους υποστηρικτικούς του ιστούς. Τα εμβρυϊκά stem κύτταρα προέρχονται από την ICM. Εικόνα 15 Η εσωτερική μάζα κυττάρων στο επίπεδο της βλαστοκύστης. Οι περισσότεροι ενήλικοι ιστοί έχουν multipotent (πολυδύναμα) stem κύτταρα, τα οποία είναι ικανά να παράγουν ένα περιορισμένο εύρος διαφοροποιημένων κυτταρικών σειρών ανάλογα με την τοποθεσία τους και συμβάλλουν με αυτό τον τρόπο στην διατήρηση της ομοιόστασης. Για παράδειγμα, τα stem κύτταρα του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) έχουν το δυναμικό να διαφοροποιηθούν και να παράγουν τελικά τρεις κυτταρικές σειρές: νευρώνες, ολιγοδενδροκύτταρα και αστροκύτταρα. Επίσης υπάρχουν και unipotent (μονοδύναμα) stem κύτταρα, δηλαδή κύτταρα ικανά να διαφοροποιηθούν προς μία μόνο κυτταρική σειρά. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν τα stem κύτταρα της βασικής στιβάδας της επιδερμίδας, που δίνουν γένεση στα κερατινοποιούμενα πλακώδη κύτταρα, καθώς και ορισμένα ηπατοκύτταρα που έχουν την ικανότητα της αναγέννησης μακροπρόθεσμα [4] (εικόνα 16). 32

33 Εικόνα 16 Τα πολυδύναμα (pluripotent) εμβρυϊκά stem κύτταρα έχουν προέλευση την εσωτερική μάζα κυττάρων ICM της βλαστοκύστης. Έχουν το δυναμικό να σχηματίσουν όλους τους ιστούς, εκτός από τον πλακούντα. Μόνο τα stem κύτταρα στο επίπεδο του μοριδίου είναι ολοδύναμα (totipotent) και μπορούν να δημιουργήσουν όλους τους ιστούς και τον πλακούντα [21]. Οι βασικές ιδιότητες των stem κυττάρων, η αυτο-ανανέωση και η πολυδυναμία, αναγνωρίστηκαν πρώτη φορά στον μυελό των οστών. Περιγράφηκαν πειραματικά το 1961 από τους Till and McCulloch [22], σαν κύτταρα τα οποία σχηματίζουν αποικίες στο σπλήνα [colony forming units - spleen (CFU-S)]. Όλοι οι ιστοί εμφανίζονται να έχουν stem κύτταρα, ακόμα και το ΚΝΣ και η καρδιά, αν και στους δύο αυτούς ιστούς η ενεργοποίησή τους μετά από τραυματισμό είναι πολύ μικρή και καθυστερημένη. Τα stem κύτταρα είναι εξαιρετικά σπάνια κύτταρα. Όταν παράγονται συνεχώς νέα κύτταρα για να αντικαταστήσουν κύτταρα που έχουν υποστεί βλάβη ή έχουν αποφολιδωθεί, τότε συνήθως δημιουργείται μια μονόδρομη ροή κυττάρων με τα stem κύτταρα να βρίσκονται στην αρχή αυτού του «καταρράκτη». Για παράδειγμα στην επιδερμίδα, τα stem κύτταρα βρίσκονται στη βασική στιβάδα, στο ένα άκρο της κλίμακας κυττάρων που σχηματίζεται, με τα νέα κύτταρα που σχηματίζονται να προωθούνται και τελικά να αποπίπτουν προς τα εξωτερικά στρώματα της επιδερμίδας. Παρομοίως, στο κόλον τα stem κύτταρα βρίσκονται στην βάση των επιθηλιακών κρυπτών. Τα stem κύτταρα αποτελούν ένα πολύ μικρό ποσοστό του συνολικού κυτταρικού πληθυσμού. Στο λεπτό 33

34 έντερο, υπάρχουν περίπου έως 10 stem κύτταρα στην βάση των κρυπτών, ενώ η κρύπτη αποτελείται από 300 περίπου κύτταρα [4]. Στον σκελετικό μυ, τα stem κύτταρα αποτελούν το 5% όλων των κυττάρων, ενώ στο μυελό των οστών το πολυδύναμο αιμοποιητικό stem κύτταρο είναι πολύ πιο σπάνιο με μια συχνότητα της τάξης 1 προς περίπου μεταξύ όλων των κυττάρων του μυελού. Μια παγιωμένη αντίληψη έως πρόσφατα ήταν ότι τα stem κύτταρα ανανεώνονται με βραδύ ρυθμό αλλά είναι ισχυρά κλωνογόνα (clonogenic). Αυτή η ιδιότητα μοιάζει να είναι η ενδεδειγμένη, καθότι ο περιορισμός των κυτταρικών διαιρέσεων στα stem κύτταρα, περιορίζει συγχρόνως και τα λάθη στη σύνθεση του DNA. Πράγματι σε πολλούς ιστούς, παρατηρούμε ότι τα stem κύτταρα διαιρούνται λιγότερο συχνά από τα TACs (Transit- Amplifying Cells, βλέπε πιο κάτω). Στο λεπτό έντερο του ποντικού για παράδειγμα, τα stem κύτταρα τα οποία εντοπίζονται ελάχιστα πιο ψηλά από την κρύπτη, ανανεώνονται όντως λιγότερο συχνά από τα TACs που βρίσκονται πιο κοντά στον εντερικό αυλό [23]. Επίσης σε τριχοθυλάκια ποντικού, το στέλεχος της τρίχας και τα περιβάλλοντα έλυτρα προέρχονται από TACs, τα οποία παράγονται από stem κύτταρα της περιοχής bulge που βρίσκονται στον βολβό της τρίχας. Αυτά τα stem κύτταρα της περιοχής bulge διαιρούνται λιγότερα συχνά και είναι πιο κλωνογόνα από τα TACs [4]. Αντίθετα όμως, στο αιμοποιητικό σύστημα, stem κύτταρα με ικανότητα ανανέωσης του κυτταρικού πληθυσμού μακροπρόθεσμα, ενδέχεται να είναι το ίδιο ενεργά όσο αφορά το κυτταρικό κύκλο όπως και οι πιο διαφοροποιημένοι απόγονοί τους [24]. Ένα απλό ιεραρχικό μοντέλο που χαρακτηρίζει τα stem κύτταρα απεικονίζεται στην εικόνα 17, και είναι πολύ πιθανό οι συνεχώς ανανεωνόμενοι κυτταρικοί πληθυσμοί του γαστρεντερικού σωλήνα και του αιμοποιητικού συστήματος να το ακολουθούν. Όταν εξετάζονται in vitro, οι κλώνοι κυττάρων που προκύπτουν από καλλιέργειες αδιαφοροποίητων stem κυττάρων, θεωρείται ότι αντιπροσωπεύουν αποικίες stem κυττάρων, και καλούνται holoclones, περιγράφηκαν δε για πρώτη φορά σε ανθρώπινα κύτταρα της επιδερμίδας [4]. Οι άλλοι τύποι αποικιών, meroclones and paraclones, θεωρείται ότι αντιστοιχούν σε πρώιμα και όψιμα TACs, με ελαττωμένη αντίστοιχα ικανότητα πολλαπλασιασμού. Με βάση την ιδιότητα πολλών stem κυττάρων να πολλαπλασιάζονται με βραδύτερο ρυθμό από τα υπόλοιπα κύτταρα, αναπτύχθηκε μια τεχνική ταυτοποίησής τους, που βασίζεται στην αναγνώριση κυττάρων που κατακρατούν μια χρωστική όπως tritiated thymidine or bromodeoxyuridine (BrdU) στην οποία εκτίθενται όλα τα κύτταρα. Έτσι, τα stem κύτταρα αναγνωρίζονται ως κύτταρα που κατακρατούν την χρωστική (LRCs, Label- Retaining Cells), καθότι στα ταχύτερα πολλαπλασιαζόμενα TACs η χρωστική αραιώνεται περισσότερο με τους διαδοχικούς κυτταρικούς κύκλους καθώς περνά στα θυγατρικά κύτταρα. 34

35 Προφανώς αυτή η τεχνική πρέπει να αξιολογηθεί περαιτέρω καθώς έχουν πλέον αναγνωρισθεί και πληθυσμοί stem κυττάρων που δεν διαιρούνται με βραδύ ρυθμό. Εικόνα 17 Στα πιο πολλά αναγεννώμενα συστήματα, παρατηρείται μια ιεραρχία, σύμφωνα με την οποία λίγα αυτο ανανεωνόμενα stem κύτταρα δίνουν γένεση σε ένα περιορισμένο αριθμό δεσμευμένων απογόνων που καλούνται επίσης και TACs (Transit Amplifying Cells). Τα TACs τελικά δίνουν γένεση σε τελικώς διαφοροποιημένα κύτταρα που δεν μπορούν να πολλαπλασιασθούν. In vitro, τα stem κύτταρα, τα πρώιμα TACs και τα όψιμα TACs θεωρείται ότι παράγουν holoclones, meroclones και paraclones αντίστοιχα [4]. Εκλεκτικός διαχωρισμός των αλυσίδων DNA Κάποια stem κύτταρα φαίνεται ότι έχουν επινοήσει μια στρατηγική για να διασφαλίσουν την γενωμική τους ακεραιότητα, η οποία προσφέρει και μια πιθανή εξήγηση για την κατακράτηση της χρωστικής όπως αναφέρθηκε προηγούμενα. Σύμφωνα λοιπόν με την αποκαλούμενη και υπόθεση της «αθάνατης αλυσίδας DNA» (the immortal strand hypothesis) από τον John Cairns [25], τα νεοσχηματιζόμενα stem κύτταρα καθορίζουν μία από τις δύο αλυσίδες DNA σε κάθε χρωμόσωμα ως κλώνο-εκμαγείο, και έτσι σε κάθε γύρο διπλασιασμού του DNA όπου και οι δύο αλυσίδες αντιγράφονται, μόνο ο κλώνος-εκμαγείο και το αντίγραφό του καταλήγουν στο θυγατρικό κύτταρο που παραμένει αδιαφοροποίητο stem κύτταρο. Με αυτόν τον τρόπο, τα τυχόν λάθη στο διπλασιασμό του DNA κληρονομούνται άμεσα μέσα σε μια γενιά στα θυγατρικά TACs τα οποία σύντομα χάνονται από τον οργανισμό. Αυτός ο μηχανισμός παράγει LRCs μετά από χρήση κατάλληλης 35

36 χρωστικής που συνδέεται στο DNA στην φάση δημιουργίας των stem κυττάρων. Η επαλήθευση της θεωρίας προϋποθέτει ότι τα LRCs θα παρατηρούνται και σε περαιτέρω κύκλους πολλαπλασιασμού και αντιγραφής του DNA, καθώς ο κλώνος-εκμαγείο θα διαχωρίζεται από την αδελφή χρωματίδα και θα παραδίδεται μόνο στο θυγατρικό κύτταρο που προορίζεται για stem κύτταρο. Αυτό έχει αποδειχθεί στο λεπτό έντερο και στο μαστό [4- εντός]. Η παρουσία των LRCs στην αυτο-ανανέωση των stem κυττάρων οφείλεται στον τυχαίο διαχωρισμό των αδελφών χρωματίδων, αυτό όμως δεν είναι συμβατό με την θεωρία της «αθάνατης αλυσίδας DNA», η οποία προβλέπει την απώλεια του δείκτη (χρωστική) για το νεοσυντιθέμενο DNA μετά από δύο κύκλους πολλαπλασιασμού όπως φαίνεται και στην εικόνα 18. Μία εναλλακτική επιγενετική εξήγηση του φαινομένου περιλαμβάνει την υπόθεση της «σιωπηλής» αδελφής χρωματίδας. Σύμφωνα με αυτήν, το θυγατρικό κύτταρο το οποίο παραμένει stem κύτταρο, διατηρεί την χρωματίδα με τα ενεργά γονίδια που σχετίζονται με τον φαινότυπο πολυδυναμίας, με παράλληλη απώλεια αυτών των ιδιοτήτων στο άλλο θυγατρικό κύτταρο που κληρονομεί τις «σιωπηλές» αδελφές χρωματίδες [4]. Με την υπόθεση της «αθάνατης αλυσίδας DNA» δεν συμφωνούν όλες οι έρευνες, καθότι έχει αποδειχθεί για παράδειγμα ότι τα αιμοποιητικά stem κύτταρα (HSCs) δεν διατηρούν την πιο παλιά αλυσίδα DNA κατά την διαίρεσή τους [24]. Εικόνα 18 Η υπόθεση της «αθάνατης αλυσίδας DNA». Η γενωμική σταθερότητα των stem κυττάρων είναι δυνατό να διατηρηθεί εάν οι νεοσυντιθέμενες αλυσίδες του DNA προωθούνται στα θυγατρικά κύτταρα TACs, ενώ τα stem κύτταρα διατηρούν τον αθάνατο κλώνο εκμαγείο [4]. 36

37 Πως γίνεται η αυτο-ανανέωση των stem κυττάρων; Τα stem κύτταρα έχουν την ιδιότητα να διαιρούνται ασύμμετρα (αλλά και συμμετρικά), δηλαδή να δίνουν γένεση σε ένα θυγατρικό πανομοιότυπο με το αρχικό κύτταρο και σε ένα πιο δεσμευμένο, για συγκεκριμένη διαφοροποίηση, προγονικό κύτταρο. Τα stem κύτταρα εξ ορισμού χαρακτηρίζονται από την ικανότητα να δίνουν γένεση σε νέα stem κύτταρα (αυτoανανέωση) αλλά και σε κύτταρα που υφίστανται περαιτέρω διαφοροποίηση. Με την ιδιότητά τους να διαιρούνται ασύμμετρα επιτυγχάνουν και τις δύο διαδικασίες σε ένα βήμα. Δίνουν δηλαδή γένεση σε ένα θυγατρικό πανομοιότυπο με το αρχικό κύτταρο και σε ένα πιο δεσμευμένο, για συγκεκριμένη διαφοροποίηση, προγονικό κύτταρο. Το κύτταρο αυτό ονομάζεται Τransit Αmplyfying Cell ή TAC. Tα Τransit Αmplyfying κύτταρα τελικά καθίστανται ανίκανα για πολλαπλασιασμό και μετατρέπονται σε τελικώς διαφοροποιημένα (terminally differentiated TD) κύτταρα. Εξίσου αποτελεσματικά, ο αριθμός των stem κυττάρων μπορεί να διατηρηθεί σταθερός και με συμμετρικές διαιρέσεις μόνο, εάν κάθε φορά που ένα stem κύτταρο δίνει γένεση σε δύο θυγατρικά TAC, ένα άλλο stem κύτταρο διαιρείται επίσης συμμετρικά αλλά δίνει γένεση σε δύο θυγατρικά stem κύτταρα (εικόνα 19). Εικόνα 19 Η διατήρηση μιας σταθερής δεξαμενής stem κυττάρων επιτυγχάνεται με έναν από τους δύο τύπους κυτταρικής διαίρεσης κατά την ομοιόσταση του ιστού: σε μια ασύμμετρη διαίρεση, ένα θυγατρικό κύτταρο παραμένει stem κύτταρο ενώ το άλλο δεσμεύεται για συγκεκριμένη κυτταρική διαφοροποίηση. Αντίθετα, η συμμετρική διαίρεση έχει ως αποτέλεσμα δύο θυγατρικά κύτταρα με την ίδια μοίρα, επομένως από ένα stem κύτταρο μπορούν να προκύψουν δύο πανομοιότυπα stem κύτταρα (συμμετρική αυτό ανανέωση) ή δύο διαφοροποιημένα κύτταρα (συμμετρική διαφοροποίηση) [14]. 37

38 Ένας άλλος πιθανός μηχανισμός αυτό-ανανέωσης είναι να γίνεται συνδυασμός συμμετρικών και ασύμμετρων διαιρέσεων. Εικόνα 20 Μηχανισμοί διατήρησης τους αριθμού των stem κυττάρων. (Α) Όλα τα stem κύτταρα μπορούν να διαιρεθούν ασύμμετρα. (Β) Ίσοι αριθμοί συμμετρικών διαιρέσεων παράγουν είτε stem κύτταρα είτε TACs. (C) Συνδυασμός συμμετρικών και ασύμμετρων διαιρέσεων. (D) Εξίσου ενδογενή και εξωγενή σήματα καθορίζουν την πορεία του κυττάρου. Stem κύτταρα, κίτρινα TACs, μπλε [4]. Η συμμετρική διαίρεση των stem κυττάρων παρέχει ένα μηχανισμό να αυξηθεί ο πληθυσμός των stem κυττάρων μετά από απώλειά τους. Μπορεί όμως δυνητικά να προκαλέσει και μια μη ελεγχόμενη κλιμάκωση του αριθμού των stem κυττάρων, όπως διαπιστώθηκε με την διαταραχή της ασύμμετρης διαίρεσης των νευροβλαστών στην Drosophila melanogaster, όταν τέτοια κύτταρα μεταμοσχεύτηκαν σε ενήλικους ξενιστές [26]. Εναλλακτικά η έλλειψη των κατάλληλων σημάτων δύναται να οδηγήσει σε εξάλειψη των stem κυττάρων (εικόνα 21), όπως διαπιστώνεται σε ποντίκια με έλλειψη του Tcf-4 και επομένως είναι ανίκανα να σχηματίσουν β-catenin Tcf-4, συμπλέγματα τα οποία είναι απαραίτητα για την Wnt σηματοδότηση στο λεπτό έντερο [4-εντός]. 38

39 Εικόνα 21 Πιθανές συνέπειες ασύμμετρης και συμμετρικής διαίρεσης stem κυττάρων. Stem κύτταρα, κίτρινα TACs, μπλε [4]. Δύο βασικοί μηχανισμοί φαίνεται να διέπουν την ασύμμετρη κυτταρική διαίρεση: (α) η ασύμμετρη κατανομή ενδοκυτταρικών στοιχείων που καθορίζουν την μοίρα του κυττάρου και (β) ασύμμετρος προσανατολισμός και επαφή των θυγατρικών κυττάρων με στοιχεία της φωλεάς ή αλλιώς με εξωγενή σήματα [4]. Στη συνέχεια θα γίνει περιγραφή της δομής της φωλεάς και της ρυθμιστικής δράσης που ασκεί στη λειτουργία του stem κυττάρου, ενώ θα αναφερθούν και τα γνωστά παραδείγματα φωλεών που έχουν μελετηθεί στις γονάδες της Drosophila Melanogaster, σε σχέση με την αναφερθείσα ασύμμετρη κατανομή αυτών των ενδοκυτταρικών στοιχείων με αναπτυξιακό δυναμικό. Τα εξωγενή σήματα που διέπουν την ασύμμετρη διαίρεση είναι πιθανό να προέρχονται από την φωλεά (niche) των stem κυττάρων. Όλα τα stem κύτταρα πιστεύεται ότι εδρεύουν σε ένα εξειδικευμένο μικροπεριβάλλον, γνωστό ως φωλεά. Η φωλεά είναι απαραίτητη για την συντήρηση της ταυτότητας του stem κυττάρου και την αυτο-ανανεωτική του ικανότητα. Είναι επίσης γνωστό ότι τα κύτταρα της φωλεάς, ρυθμίζουν την συμπεριφορά των stem κυττάρων μέσω άμεσης φυσικής επαφής αλλά και παρακρινούς σηματοδότησης [5]. Ειδικές συνδέσεις «αγκιστρώνουν» τα stem κύτταρα με τα κύτταρα της φωλεάς, ενώ ο προσανατολισμός των στοιχείων του κεντροσώματος μέσω αυτής της «αγκίστρωσης» μπορεί να καθορίσει την κατεύθυνση της μιτωτικής ατράκτου. Καθορίζει δηλαδή την εντόπιση και τον προσανατολισμό των θυγατρικών κυττάρων, και επομένως και την πρόσβασή τους στα εξωγενή σήματα της φωλεάς. Στην εικόνα 22(II) παρατηρούμε ότι ο κακός προσανατολισμός των κεντροσωμάτων στα αρσενικά γεννητικά κύτταρα είναι χαρακτηριστικό της γήρανσης σε όρχεις της drosophila, οδηγώντας σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου και μια βαθμιαία μείωση της σπερματογένεσης [27]. Παρομοίως, στην επιδερμίδα [εικόνα 22(III)], ένας 39

40 κάθετος άξονας κυτταρικής διαίρεσης στη βασική μεμβράνη συμβάλει στην διατήρηση του σωστού αριθμού stem κυττάρων στην βασική στιβάδα. Στα επόμενα κεφάλαια της παρούσης μελέτης θα γίνει εκτενής αναφορά στο σημαντικό ρόλο που διαδραματίζει η φωλεά και γενικότερα το μικροπεριβάλλον στη ρύθμιση της συμπεριφοράς του φυσιολογικού stem κυττάρου αλλά και του καρκινικού stem κυττάρου. Εικόνα 22 (Ι και II) Στην Drosophila, ο σωστός προσανατολισμός στην φωλεά είναι πολύ σημαντικός για την αυτo ανανέωση, αντίθετα ο κακός προσανατολισμός μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα υπέρμετρη αύξηση του αριθμού των stem κυττάρων ή την διακοπή του κυτταρικού κύκλου. (ΙΙΙ) Στο στρωματοποιημένο επιθήλιο του δέρματος, ένας κυτταρικός άξονας κάθετος στη βασική μεμβράνη μπορεί να διατηρήσει τον σωστό αριθμό stem κυττάρων στην βασική μεμβράνη. Stem κύτταρα, κίτρινα TACs, μπλε [4]. Η φωλεά των stem κυττάρων Τα σωματικά stem κύτταρα υπάρχουν σε όλους τους ιστούς καθώς είναι απαραίτητα για τη ομοιόστασή τους και την ανταπόκρισή τους μετά από βλάβη. Στο πολύ απαιτητικό αυτό έργο, συνεπικουρούνται από το μικροπεριβάλλον που τα περιβάλλει, το οποίο παρέχει προστασία αλλά συγχρόνως εμφανίζει και πολύ σημαντική ρυθμιστική δράση. Αυτό το μικροπεριβάλλον καλείται φωλεά και είναι η συνισταμένη όλων των παραγόντων, κυτταρικών και μοριακών, που διαντιδρούν και ρυθμίζουν το stem κύτταρο [5]. Σε ορισμένα συστήματα μάλιστα, όπως το καλυπτήριο, η φωλεά φαίνεται να ρυθμίζει και το stem κύτταρο αλλά και τους άμεσους απογόνους του (θυγατρικά κύτταρα). Η αντίληψη αυτή στηρίζεται σε in vivo πειράματα τα οποίαν έδειξαν ότι η διάκριση μεταξύ του stem κυττάρου και των απογόνων του είναι πολύ δύσκολη αν όχι αδύνατη [28]. Τα φυσιολογικά stem κύτταρα χρειάζονται μια συγκεκριμένη φωλεά ή μικροπεριβάλλον προκειμένω να αναπτυχθούν και να επιβιώσουν (εικόνα 23). Η φωλεά των stem κυττάρων 40

41 είναι ένας ανατομικά προσδιορισμένος χώρος που έχει αναγνωρισθεί σε πολλούς ιστούς, και εξυπηρετεί στο να ρυθμίζει τον αριθμό των stem κυττάρων και την λειτουργία τους, όπως επίσης και να προσαρμόζει τα stem κύτταρα σε συνθήκες πίεσης ή αλλαγών. Τα κύτταρα της φωλεάς και το μικροπεριβάλλον που δημιουργούν, επιτρέπει στη φωλεά να διατηρήσει τη δεξαμενή των stem κυττάρων και να αποτρέπει την διαφοροποίησή τους. Συγχρόνως κατευθύνει την ανάπτυξη του ιστού και την ανανέωσή του μέσω πιο διαφοροποιημένων θυγατρικών προγονικών κυττάρων. Στους ιστούς που η φωλεά είναι καλά προσδιορισμένη, το stem κύτταρο περιβάλλεται από διαφοροποιημένα κύτταρα, τα οποία είναι χρήσιμα στο να παρέχουν στέγη κατά κάποιο τρόπο και να αλληλεπιδρούν μαζί του [5, 29]. Εικόνα 23 Η φωλεά είναι μια σύνθετη και δυναμική δομή στην οποία μεταδίδονται και λαμβάνονται διάφορα σήματα μεταξύ των κυττάρων. Απεικονίζεται μια υποθετική δομή φωλεάς, όπου συμπεριλαμβάνονται γνωστά στοιχεία από φωλεές θηλαστικών και μη θηλαστικών που έχουν μελετηθεί ερευνητικά: το stem κύτταρο, κύτταρα του στρώματος, διαλυτοί παράγοντες, εξωκυττάρια ουσία, αγγειακό δίκτυο, νευρωνικές συνδέσεις καθώς και διάφορα είδη κυτταρικών συνδέσεων. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι παρότι ορισμένες συνιστώσες της φωλεάς παραμένουν σταθερές, εντούτοις όλες οι φωλεές δεν είναι όμοιες και δεν περιλαμβάνουν όλα τα παραπάνω στοιχεία. Αντίθετα, οι φωλεές είναι πιθανό να ενσωματώνουν ορισμένα από τα στοιχεία αυτά, προσαρμοσμένα στις ανάγκες κάθε ιστού και τις ιδιαίτερες λειτουργίες του [30]. 41

42 Η αναγνώριση και περιγραφή των φωλεών είναι ιδιαίτερα δύσκολη. Περιπλέκεται από το γεγονός ότι τα stem κύτταρα είναι εξαιρετικά σπάνια και σε πολλές περιπτώσεις δεν υπάρχουν οι κατάλληλοι δείκτες για την πειραματική ταυτοποίησή τους. Παρόλα αυτά έχει γίνει μεγάλη πρόοδος στην αναγνώριση των φωλεών και ειδικά σε ιστούς θηλαστικών. Στον πίνακα 2 που ακολουθεί απεικονίζονται γνωστά παραδείγματα φωλεών stem κυττάρων σε διάφορους ιστούς, καθώς επίσης τα σηματοδοτικά μονοπάτια και τα μόρια κυτταρικών συνάψεων που συμμετέχουν [30]. Στο κεφάλαιο της ομοιόστασης του δέρματος θα περιγραφεί με λεπτομέρεια η δομή και η λειτουργία της φωλεάς στο καλυπτήριο σύστημα. Πίνακας 2 Γνωστά παραδείγματα φωλεών stem κυττάρων [30]. Η ρυθμιστική δράση της φωλεάς επί των σωματικών stem κυττάρων πραγματοποιείται κυρίως σε δύο επίπεδα: τις διαντιδράσεις μέσω της φυσικής επαφής του stem κυττάρου με το μικροπεριβάλλον του και τους εκκρινόμενους παράγοντες όπως φαίνεται στην εικόνα 24. Η ρύθμιση του stem κυττάρου είναι δηλαδή διττή. Οι φυσικές διαντιδράσεις με τη φωλεά του περιλαμβάνουν τη συμμετοχή των κυτταρικές συνάψεων, του Notch σηματοδοτικού μονοπατιού, της βασικής μεμβράνης και των πρωτεϊνών της εξωκυττάριας ουσίας. Οι εκκρινόμενοι παράγοντες συχνά επηρεάζουν την λειτουργία των stem κυττάρων μέσω ρύθμισης της μεταγραφής, ενώ προέρχονται από διάφορα κύτταρα, πλησίον ή πιο 42

43 απομακρυσμένα από τα stem κύτταρα. Μερικά από τα πιο σημαντικά μόρια είναι τα Wnt, BMP, Hedgehog, αυξητικοί παράγοντες και η προσταγλαδίνη E2 (PGE2). Εικόνα 24 Φωλεά των stem κυττάρων. Απεικονίζονται τα στοιχεία του τοπικού μικροπεριβάλλοντος που συμμετέχουν στη ρύθμιση των stem κυττάρων. Αυτά περιλαμβάνουν την αρχιτεκτονική της φωλεάς και τους περιορισμούς που αυτή θέτει, την φυσική επαφή της κυτταρικής μεμβράνης των stem κυττάρων με άλλες επιφάνειες ή κυτταρικές μεμβράνες, σηματοδοτικές διαντιδράσεις με τα υπόλοιπα κύτταρα που απαρτίζουν τη φωλεά, παρακρινή και ενδοκρινή σήματα από τοπικές ή απομακρυσμένες πηγές, μεταβολικά παράγωγα και νευρωνική δραστηριότητα [29]. Μια επισκόπηση των σηματοδοτικών μονοπατιών που έχουν ταυτοποιηθεί σε ορισμένα συστήματα stem κυττάρων αποκαλύπτει ότι είναι ιδιαίτερα συντηρημένα, η ενεργοποίησή τους όμως μπορεί να έχει διαφορετικά αποτελέσματα σε διαφορετικούς ιστούς. Ένα παράδειγμα όπως φαίνεται και στην εικόνα 25 είναι η σηματοδότηση Wnt. Έτσι, ενώ το εν λόγω μονοπάτι εμπλέκεται σε πολλά συστήματα stem κυττάρων, φαίνεται να χρησιμοποιείται για διαφορετικούς σκοπούς σε καθένα από αυτά [30] (εικόνα 25α και 25β). Εικόνα 25α 43

44 Εικόνα 25β Η σηματοδότηση Wnt μπορεί να προωθήσει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, όπως για παράδειγμα την (a) αυτο ανανέωση των αιμοποιητικών stem κυττάρων ή τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων TACs (δεν απεικονίζεται). Σε ορισμένους ιστούς ωστόσο, η σηματοδότηση Wnt κατευθύνει την διαφοροποίηση προς συγκεκριμένες κυτταρικές σειρές όπως συμβαίνει (β) στα προγονικά κύτταρα των τριχοθυλακίων, αντί να επάγει την αυτο ανανέωση των πολυδύναμων κυττάρρων του τριχοθυλακίου. ANG1, angiopoietin 1; BMP4, bone morphogenetic protein 4; EphR, ephrin receptor; GSK3, glycogen synthase kinase 3 ; LEF, lymphoid enhancer factor; OPN, osteopontin; TCF, T cell factor; TIE2, angiopoietin 1 receptor [30]. Εκτός από τους εκκρινόμενους πρωτεϊνικούς παράγοντες, μικρά μόρια και ιόντα μπορούν να λειτουργήσουν ως σήματα στις φωλεές. Στον μυελό των οστών, οι υψηλές συγκεντρώσεις Ca ++ φαίνεται να διευκολύνουν τον προσανατολισμό των αιμοποητικών stem κυττάρων ΗSCs παραπλεύρως των οστεοβλαστών στο ενδόστεο [31]. Παρομοίως, το υποξικό περιβάλλον σε φωλεές HSCs στα οστά, μπορεί να έχει σημαντική δράση στον περιορισμό της έκθεσης των HSCs στις αντιδραστικές ρίζες οξυγόνου το οποίο με τη σειρά του φαίνεται να επάγει οξειδωτικό stress που οδηγεί στη δυσλειτουργία τους. Η ακριβής τοπογραφική οργάνωση και η συγκεκριμένη αρχιτεκτονική των stem κυττάρων σε μια φωλεά, σε συνάρτηση πάντα με τα περιβάλλοντα κύτταρα, διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της δεξαμενής των stem κυττάρων. Η πολωμένη προσκόλληση των stem κυττάρων στα υποστηρικτικά κύτταρα της φωλεάς ή στην εξωκυττάρια ουσία ή η ασύμμετρη 44

45 κατανομή ενδοκυτταρικά, παραγόντων με αναπτυξιακό δυναμικό, συμβάλλει στον προασανατολισμό της διαίρεσης των stem κυττάρων και στον καθορισμό της κυτταρικής «μοίρας». Αυτό το φαινόμενο έχει μελετηθεί καλύτερα στους γαμέτες της Drosophila Melanogaster. Είναι γνωστό ότι σε νευροβλάστες της Drosophila, ένα διατηρημένο σύμπλεγμα πολικότητας (Par complex) μιας μη τυπικής πρωτεϊνικής κινάσης C (apkc), του Par6 και του Bazooka (Par3 σε άλλα είδη), εξυπηρετεί στο να προσανατολίσει την μιτωτική άτρακτο κατά τον βασικο-κορυφαίο άξονα [32]. Είναι γνωστό επίσης, ότι παράγοντες που καθορίζουν την περαιτέρω πορεία του κυττάρου κατανέμονται ασύμμετρα στα θυγατρικά κύτταρα που προορίζονται για διαφοροποίηση. Τέτοια παραδείγματα περιλαμβάνουν την κατανομή των αναστολέων της αυτο-ανανέωσης, όπως ο Brat και ο Mei-P26, στα θυγατρικά κύτταρα που προορίζονται να γίνουν TACs (Transit-Amplyfing Cells) στo ΚΝΣ και στις ωοθήκες αντίστοιχα της Drosophila [4-εντός], καθώς και την παρόμοια κατανομή του Numb, ενός αναστολέα του Notch o οποίος έχει διατηρημένο ρόλο στον έλεγχο της κυτταρικής διαφοροποίησης σε μια ποικιλία κυτταρικών τύπων [33] (εικόνα 26). Εικόνα 26 Ασύμμετρη κατανομή των πρωτεϊνών αpkc και Brat/Pros συμβάλλουν στη ρύθμιση του πολλαπλασιαμού/διαφοροποίησης των θυγατρικών κυττάρων μετά από διαίρεση νευροβλαστών σε προνύμφες της D. Melanogaster. Κατά τη νευρογένεση στη Drosophila, η νευροβλάστη NB (stem κύτταρο) διαιρείται και δημιουργείται μια νέα νευροβλάστη NB και ένα θυγατρικό κύτταρο GMC, δεσμευμένο για τελική διαφοροποίηση. Σε wild type κατάσταση (πάνω σειρά) κατά την κυτταρική διαίρεση της νευροβλάστης, το θυγατρικό NB κύτταρο με δυναμικό πολλαπλασιασμού κληρονομεί την πρωτεΐνη apkc,ενώ το θυγατρικό GMC κύτταρο που διαφοροποιείται περαιτέρω κληρονομεί την πρωτεΐνη Brat/Pros. H τελευταία, μπορεί να καταστείλει την έκφραση των γονιδίων του κυτταρικού κύκλου και του dmyc στο GMC θυγατρικό κύτταρο και επομένως να επάγει τη διαφοροποίηση [34]. 45

46 Η διασύνδεση μεταξύ αυτών των δύο ενδογενών μηχανισμών γίνεται πιο ευκρινής [33] στο ΚΝΣ της Drosophila. Το μόριο Αurora A φωσφορυλιώνει τον Par6, μια ρυθμιστική υπομονάδα για την κινάση apkc η οποία ενεργοποιείται και φωσφορυλιώνει το μόριο Lgl (Lethal giant larvae), έναν αναστολέα της apkc. Η φωσφορυλιωμένη μορφή του Lgl απελευθερώνεται από την apkc, επιτρέποντας έτσι στο Baz να συνδεθεί με το σύμπλεγμα. Αυτό προκαλεί μια αλλαγή στην εξειδίκευση του υποστρώματος της apkc, με αποτέλεσμα να φωσφορυλιώνει το Numb, προκαλώντας την απελευθέρωσή του από την μία πλευρά της μεμβράνης και την ασύμμετρη διανομή του. Με αυτόν τον τρόπο η πολικότητα του κυττάρου (Par σύμπλεγμα) συνδέεται με την διατήρηση της ταυτότητάς του και την διαφοροποίησή του. 46

47 STEMNESS To προφίλ γονιδιακής έκφρασης των πολυδύναμων εμβρυϊκών stem κυττάρων, είναι το αποτέλεσμα αυστηρής ρύθμισης που περιλαμβάνει ειδικούς μεταγραφικούς παράγοντες, ένζυμα τροποποίησης χρωματίνης, ρυθμιστικά RNA μόρια καθώς και σηματοδοτικά μονοπάτια (εικόνα 27). Εικόνα 271 Το διάγραμμα δείχνει υποθετικές συνδέσεις μεταξύ σηματοδοτικών μονοπατιών, μεταγραφικών παραγόντων (μπλε μπάλες), ρυθμιστών χρωματίνης (πράσινες μπάλες) και των γονιδίων στόχων (κόκκινα κουτάκια) οι οποίες σχηματίζουν ένα ρυθμιστικό μεταγραφικό κύκλωμα. Μερικά γονίδια παράγουν mirnas, τα οποία δρουν σε μετα μεταγραφικό επίπεδο [35]. Μεταγραφικοί παράγοντες των εμβρυϊκών stem κυττάρων Οι έρευνες έδειξαν ότι οι homeοdomain μεταγραφικοί παράγοντες Oct4 και Nanog είναι βασικοί ρυθμιστές της αρχικής ανάπτυξης και ταυτότητας των εμβρυικών stem κυττάρων [36, 37]. Αυτοί οι μεταγραφικοί παράγοντες εκφράζονται και στα πολυδύναμα εμβρυϊκά stem κύτταρα αλλά και στην εσωτερική μάζα κυττάρων ICM της βλαστοκύστης, από όπου και προέρχονται αυτά τα stem κύτταρα. Ανωμαλίες στην έκφραση των Oct4 και Nanog προκαλούν απώλεια της πολυδυναμίας και λανθασμένη διαφοροποίηση προς τροφοβλάστη 47

48 και εξωεμβρυϊκό ενδόδερμα αντίστοιχα [36, 38]. Ωστόσο, πρόσφατα στοιχεία υποδεικνύουν, ότι ο ρόλος του Nanog είναι πιο πιθανόν η σταθεροποίση της πολυδυναμίας των εμβρυϊκών stem κυττάρων [38]. Ο Oct4 μπορεί να σχηματίσει ετεροδιμερή με τον HMGbox μεταγραφικό παράγοντα Sox2 στα εμβρυικά stem κύτταρα και ο Sox2 συμβάλλει στη πολυδυναμία, τουλάχιστον εν μέρει, ρυθμίζοντας τα επίπεδα του Oct4 [39]. O Οct4 αποσιωπάται ταχέως και ολοκληρωτικά κατά τα πρώτα στάδια της κυτταρικής διαφοροποίησης. Οι ρόλοι-κλειδιά των Oct4, Nanog και Sox2 κατά την πρώιμη ανάπτυξη και το μοναδικό προφίλ έκφρασής τους, καθιστούν πιθανό ότι αυτοί αποτελούν τους βασικούς ρυθμιστές και τον πυρήνα του ρυθμιστικού μεταγραφικού κυκλώματος που χαρακτηρίζει το stemness των εμβρυϊκών stem κυττάρων. Η αναγνώριση των γονιδίων που συνδέονται οι μεταγραφικοί παράγοντες Oct4, Nanog και Sox2 μέσω genome-wide location analysis οδήγησε στις εξής διαπιστώσεις : (α) οι τρεις αυτοί μεταγραφικοί παράγοντες συνδέονται μαζί στους δικούς τους υποκινητές σχηματίζοντας ένα διασυνδεμένο αυτορυθμιστικό βρόγχο (β) οι τρεις παράγοντες συχνά συνδέονται από κοινού στα γονίδια στόχους και (γ) οι Oct4, Nanog και Sox2 στοχεύουν σε δύο ομάδες γονιδίων, η μια ομάδα ενεργά εκφράζεται ενώ η άλλη όχι παραμένοντας όμως σε μια δυναμική ισορροπία για μεταγενέστερη έκφραση κατά την κυτταρική διαφοροποίηση [35] (εικόνα 28). 48

49 Εικόνα 28 Μοντέλο του πυρήνα του ρυθμιστικού κυκλώματος ενός εμβρυικού stem κυττάρου. Οι μεταγραφικοί παράγοντες Oct4, Sox2 και Nanog (μπλε) συνδέονται με γονίδια που εκφράζουν ενεργά, μεταξύ άλλων, μεταγραφικούς παράγοντες και μόρια σηματοδότησης απαραίτητα για τη διατήρηση της πολυδυναμίας. Οι τρεις αυτοί ρυθμιστές συνδέονται με γονίδια ανενεργά, που κωδικοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες, που εάν εκφράζονταν θα προωθούσαν πιο διαφοροποιημένες κυτταρικές καταστάσεις. Σε αυτή τη δεύτερη ομάδα γονιδίων, η RNA πολυμεράση ΙΙ αρχίζει την μεταγραφή αλλά δεν παράγει ολοκληρωμένα μετάγραφα λόγω της ανασταλτικής δράσης των Polycomb πρωτεινών. Οι Polycomb πρωτείνες αποτρέπουν την RNA πολυμεράση από το να δημιουργήσει μια ολοκληρωμένη μεταγραφική μηχανή (που αντιπροσωπεύεται με αστεράκια στην ουρά του ενζύμου). Επίσης απεικονίζεται ο διασυνδεμένος αυτορυθμιστικός βρόγχος όπου οι Oct4,Sox2 και Nanog συνδέονται σε καθέναν από τους τρεις υποκινητές τους [35]. 49

50 Μηχανισμός δράσης των μεταγραφικών παραγόντων Oct4, Sox2 και Nanog και το αυτορυθμιστικό κύκλωμα Οι Oct4, Nanog και Sox2 συνδέονται στον δικό τους υποκινητή αλλά και στους υποκινητές των γονιδίων που κωδικοποιούν τους άλλους δύο μεταγραφικούς παράγοντες. Αυτό το αυτορυθμιστικό κύκλωμα εισηγείται ότι οι τρεις αυτοί μεταγραφικοί παράγοντες δρουν συλλογικά για την ρύθμιση της έκφρασής τους. Η αυτορρύθμιση πιστεύεται ότι ενισχύει την σταθερότητα της γονιδιακής έκφρασης, η οποία με τη σειρά της συμβάλλει στη διατήρηση του stemness [35]. Λειτουργικές μελέτες επιβεβαίωσαν ότι οι Oct4 και Sox2 καταλαμβάνουν από κοινού και ενεργοποιούν τα γονίδια Oct4 και Nanog [40, 41]. Ο διασυνδεδεμένος αυτορυθμιστικός βρόγχος δίνει μια εξήγηση για ποιο λόγο φαίνεται να ενεργοποιείται απότομα το ρυθμιστικό μεταγραφικό κύκλωμα των ips κυττάρων (βλέπε πιο κάτω), όταν ο Oct4, ο Sox2 και οι άλλοι δύο μεταγραφικοί παράγοντες υπερεκφράζονται στους ινοβλάστες [6, 42]. Όταν αυτοί οι παράγοντες εξωγενώς υπερεκφράζονται, είναι πιθανό ότι συμβάλλουν άμεσα στην ενεργοποίηση των ενδογενών γονιδίων Oct4, Nanog και Sox2, τα προιόντα των οποίων με τη σειρά τους συμβάλλουν στη διατήρηση της γονιδιακής τους έκφρασης. Ο Oct4, Nanog και Sox2 συνδέονται από κοινού σε μια πληθώρα γονιδίων και συχνά σε επικαλυπτόμενα σημεία στο γονιδίωμα. Το γεγονός αυτό πιθανόν υποδηλώνει ότι οι τρεις αυτοί παράγοντες δεν δρουν ανεξάρτητα, αλλά με συντονισμένη δράση ώστε να διατηρήσουν το μεταγραφικό προφίλ που απαιτείται για το stemness. Με τεχνικές ανοσοκαθίζησης έχουν απομονωθεί μεγάλα πρωτεϊνικά σύμπλοκα που περιέχουν τους Oct4 και Nanog σε εμβρυικά stem κύτταρα, στοιχείο που υποστηρίζει την παραπάνω υπόθεση [35-εντός]. Ρύθμιση των αναπτυξιακών μεταγραφικών παραγόντων Οι βασικοί ρυθμιστές της πολυδυναμίας συνδέονται με τους υποκινητές ενεργών γονιδίων, που κωδικοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες, σηματοδοτικά μόρια και ένζυμα τροποποίησης χρωματίνης τα οποία προωθούν την αυτο-ανανέωση των εμβρυικών stem κυττάρων [35]. Ωστόσο, αυτά τα μεταγραφικά ενεργά γονίδια δεν είναι παρά τα μισά από τα γονίδια στόχους των Oct4, Nanog και Sox2. Αυτοί οι παράγοντες συνδέονται επίσης και με τους υποκινητές γονιδίων μιας μεγάλης ομάδας μεταγραφικών παραγόντων, που δεν 50

51 εκφράζονται στα εμβρυικά stem κύτταρα, αλλά η έκφραση των οποίων σχετίζεται στενά με την κυτταρική διαφοροποίηση προς συγκεκριμένες σειρές (Εικόνα 28). Η σίγαση αυτών των μεταγραφικών ρυθμιστών είναι επίσης ένα σημαντικό σημείο ελέγχου και διατήρησης του stemness. Για παράδειγμα, ο MyoD, είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας ικανός να επάγει την έκφραση του κατάλληλου γονιδιακού προγράμματος για μύες, σε μια ποικιλία κυττάρων [43]. Επομένως οι Oct4, Nanog και Sox2 συμβάλλουν στην διατήρηση του stemness και της αδιαφοροποίητης κατάστασης των εμβρυικών stem κυττάρων, μέσω της κατασταλτικής δράσης σε συγκεκριμένους μεταγραφικούς ρυθμιστές που επάγουν την κυτταρική διαφοροποίηση. Τα περισσότερα από τα γονίδια, που αποτελούν στόχο και των οποίων καταστέλλεται η έκφρασή μέσω των Oct4, Nanog και Sox2, είναι συγχρόνως και στόχοι από την Polycomb οικογένεια πρωτεϊνών (PcG). Αυτές οι πρωτείνες είναι επιγενετικοί ρυθμιστές που καταστέλουν την μεταγραφή μέσω αποσιώπησης της χρωματίνης και σχηματίζουν σύμπλοκα (PRCs). Αυτά τα σύμπλοκα είναι διατηρημένα από την drosophila έως στον άνθρωπο [44]. Πρόσφατες έρευνες αποκάλυψαν ότι τα ανενεργά γονίδια, λόγω της δράσης των Oct4, Nanog και Sox2, υπόκεινται σε μια ασυνήθιστη μεταγραφική ρύθμιση [35-εντός]. Πιο συγκεκριμένα, σε αυτά τα γονίδια γίνεται έναρξη της μεταγραφής χωρίς όμως λειτουργικό αποτέλεσμα. Η μεταγραφική μηχανή έναρξης συναρμολογείται στους υποκινητές των γονιδίων που κωδικοποιούν αναπτυξιακούς ρυθμιστές. Στα σημεία αυτά υπάρχουν τροποποιήσεις ιστονών που επιτρέπουν την έναρξη της μεταγραφής, όπως η μεθυλίωση H3K4. Η RNA πολυμεράση όμως, δεν είναι ικανή να ολοκληρώσει την μεταγραφή πιθανόν λόγω της κατασταλτικής δράσης των πρωτεινών PcG. Φαίνεται δηλαδή, ότι αυτά τα ανενεργά γονίδια που κωδικοποιούν αναπτυξιακούς ρυθμιστές, έχουν υποστεί επιγενετικές τροποποιήσεις με αντίθετη δράση και βρίσκονται σε μια λεπτή ισορροπία, υπερισχύουν όμως αυτές οι τροποποιήσεις που καταστέλλουν την μεταγραφή τους [35]. Η παρουσία της RNA πολυμεράσης στους υποδοχείς αυτών των γονιδίων, μπορεί να εξηγήσει γιατί βρίσκονται σε μια ευαίσθητη ισορροπία για μεταγραφική ενεργοποίηση κατά την κυτταρική διαφοροποίηση. Οι πρωτείνες του συμπλέγματος Polycomb, καθώς και σχετιζόμενες πρωτείνες, πιθανώς εμποδίζουν την λειτουργία της RNA πολυμεράση σε μόρια ρυθμιστές της ανάπτυξης και διαφοροποίησης των πολυδύναμων stem κυττάρων, σε κυτταρικές σειρές όπου αυτά δεν εκφράζονται. Στα γονίδια που είναι ενεργοποιημένα σε ένα συγκεκριμένο κυτταρικό τύπο, οι PcG πρωτείνες και τα νουκλεοσώματα με H3K27 μεθυλίωση έχουν χαθεί, επιτρέποντας έτσι στη μεταγραφική μηχανή να ολοκληρώσει την 51

52 μεταγραφή τους [45, 46]. Οι ακριβείς μηχανισμοί που οδηγούν σε εκλεκτική ενεργοποίηση γονιδίων ρυθμιστικών παραγόντων δεν είναι ακριβώς γνωστή, αλλά σχεδόν σίγουρα περιλαμβάνουν H3K27 απομεθυλίωση από ένζυμα όπως οι JMJ απομεθυλοτρανσφεράσες [35]. Στη συνέχεια θα γίνει εκτενής αναφορά στον επιγενετικό έλεγχο και ρύθμιση της πολυδυναμίας. ΈΛΕΓΧΟΣ-ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΟΥ STEMNESS ΚΑΙ ΤΗΣ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣ Μεταγραφικοί παράγοντες-σηματοδοτικά μονοπάτια Τα πολυδύναμα εμβρυϊκά stem κύτταρα μπορούν να διατηρηθούν σε αδιαφοροποίητη κατάσταση σε καλλιέργεια, βρίσκονται όμως συνεχώς σε μια ευαίσθητη ισορροπία για κυτταρική διαφοροποίηση. Έχουν αναγνωρισθεί εξωκυττάρια σήματα τα οποία συμβάλλουν στη διατήρηση της πολυδυναμίας ή διεγείρουν το κύτταρο για διαφοροποίηση. Ένα τέτοιο σήμα είναι το μόριο LIF που μπορεί να βοηθήσει τα εμβρυϊκά stem κύτταρα του ποντικού να παραμείνουν αδιαφοροποίητα, αλλά δεν είναι απαραίτητο για την πολυδυναμία in vivo [47]. Άλλοι διαλυτοί παράγοντες όπως ο Wnt, activin/nodal και ο bfgf έχει επίσης δειχθεί ότι συμβάλλουν στην διατήρηση της πολυδυναμίας, τουλάχιστον κάτω υπό ορισμένες συνθήκες καλλιέργειας [48]. Επιπρόσθετα, ανθρώπινα εμβρυϊκά stem κύτταρα καθώς και ανθρώπινοι ινοβλάστες πάνω στους οποίους γίνεται η καλλιέργεια, έχει αναφερθεί ότι στέλνουν αμφίδρομα παρακρινή σήματα FGF και IGF αντίστοιχα, απαραίτητα για να διατηρηθεί η πολυδυναμία [49]. Όλα αυτά αποτελούν ενδείξεις ότι διάφορα σήματα δημιουργούν ένα μικροπεριβάλλον in vitro και πιθανώς in vivo το οποίο συμβάλλει στη συντήρηση του stemness. Τα σηματοδοτικά μονοπάτια διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο επίσης στην προώθηση συγκεκριμένης κυτταρικής διαφοροποίησης. Για παράδειγμα, η ενεργοποίηση των μονοπατιών Notch και BMP4 διεγείρει τη διαφοροποίηση των εμβρυϊκών stem κυττάρων. Το 52

53 Notch μονοπάτι έχει αποδειχθεί ότι διεγείρει την διαφοροποίηση προς τη νευρική σειρά των εμβρυϊκών stem κυττάρων τόσο του ανθρώπου όσο και του ποντικού. Ο BMP4, υπό ορισμένες συνθήκες, μπορεί να αποτρέψει την διαφοροποίηση προς τη νευρική σειρά και επάγει την διαφοροποίηση προς άλλες κυτταρικές σειρές [37]. Όταν προκύπτει δέσμευση προς συγκεκριμένη κυτταρική διαφοροποίηση, ο OCT4 ταχέως απενεργοποιείται και οι κατάλληλοι ρυθμιστικοί παράγοντες της ανάπτυξης αποδεσμεύονται από την κατασταλτική δράση των Polycomb πρωτεινών και ενεργοποιούνται. Η έκτοπη έκφραση του OCT4 προκαλεί εκτεταμένη και γρήγορη επέκταση κυττάρων σχετικά αδιαφοροποίητων, δυσπλασία ειδικά στο έντερο, και υψηλή θνησιμότητα [50]. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι υπάρχει υψηλή εξελικτική πίεση όσον αφορά την αποσιώπηση αυτών των παραγόντων κατά την κυτταρική διαφοροποίηση στη διάρκεια της εμβρυογένεσης [50].μ Πράγματι, η απάλειψη του γονιδίου OCT4 στα stem κύτταρα ενήλικων ποντικών, δεν είχε καμία λειτουργική παρενέργεια [51], γεγονός που συμφωνεί με την διαπίστωση ότι ο συγκεκριμένος μεταγραφικός παράγοντας δεν παίζει κανένα ρόλο στην αυτο-ανανέωση των σωματικών stem κυττάρων ή στην ομοιόσταση των ιστών. Το ρετινοϊκό οξύ, ένας καλός επαγωγέας της κυτταρικής διαφοροποίησης έχει δειχθεί ότι συμβάλλει στην αποσιώπηση του OCT4. Επίσης, και άλλοι μεταγραφικοί παράγοντες που επάγονται κατά την κυτταρική διαφοροποίηση χρειάζονται για την καταστολή του OCT4, μεταξύ των οποίων ο ARP-1, COUP-TF1, και ο GCNF (αναφέρεται και ως Nr6a1) [35]. Ρυθμιστικά RNAs στη πολυδυναμία και στη πρώιμη ανάπτυξη Έρευνες υποστηρίζουν ότι micrornas (mirnas) διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην γονιδιακή ρύθμιση στα εμβρυικά stem κύτταρα αλλά λίγα είναι γνωστά για το πώς ελέγχουν την ανάπτυξη-διαφοροποίησή τους [35]. Εμβρυικά stem κύτταρα με ελλείψεις σε ένζυμα επεξεργασίας mirnas εμφανίζουν ελαττώματα στην κυτταρική διαφοροποίηση όπως επίσης και στην μορφογένεση [35]. Παρόλα αυτά πολλές πτυχές της δράσης των mirnas παραμένουν ακόμα άγνωστες. 53

54 Επιγενετική Επιγενετική είναι η μελέτη των αναστρέψιμων κληρονομήσιμων αλλαγών στη λειτουργία των γονιδίων, που εμφανίζονται χωρίς κάποια αλλαγή στην αλληλουχία του πυρηνικού DNA. Είναι η διαδικασία της επίδρασης στη δράση ενός γονίδιου χωρίς να αλλάζει το ίδιο το DNA του γονιδίου [52]. Το επιγένωμα είναι η γενική επιγενετική κατάσταση ενός κυττάρου. Δεδομένου ότι ένα έμβρυο μπορεί να παραγάγει ένα πλήθος κυττάρων με διαφορετικές τύχες κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, θα μπορούσε να ειπωθεί ότι ένα γονιδίωμα δίνει γένεση σε πολλά επιγενώματα. Οι επιγενετικοί μηχανισμοί επιτρέπουν στα κύτταρα να χρησιμοποιούν από τη γενετική πληροφορία μόνο αυτή που πρέπει. Αν και κάθε κύτταρό διαθέτει ολόκληρη τη γενετική πληροφορία για τη δημιουργία του οργανισμού, δεν χρησιμοποιεί παρά μόνο ένα μέρος της. Οι επιγενετικές διαμορφώσεις είναι αναστρέψιμες και δυνητικά κληρονομούνται μέσω των μειωτικών και μιτωτικών διαδικασιών. Επιγενετικοί μηχανισμοί [9]: Είναι οι εξής: α) η επιλεκτική μεθυλίωση των νησίδων CpG (κυτοσίνη φωσφο-γουανίνη) του DNA, η προσθήκη δηλαδή μιας ομάδας μεθυλίου σε μια από τις 4 βάσεις του DNA. Κατά κανόνα, η μεθυλίωση αποτελεί έναν τρόπο άρσης της έκφρασης ενός γονιδίου. Με άλλα λόγια, τα προϊόντα τα οποία κωδικοποιεί ένα γονίδιο παύουν να παράγονται όταν αυτό μεθυλιωθεί. Αντιθέτως τα γονίδια τα οποία δεν είναι μεθυλιωμένα παραμένουν ενεργά. Η μεθυλιωμένη κυτοσίνη αντιστοιχεί συνήθως σε μια κλειστή μορφή χρωματίνης και στην αποσιώπηση γονιδίων. Το προφίλ μεθυλίωσης μεταφέρεται κατά τη κυτταρική διαίρεση και αλλάζει κατά τη διάρκεια της ζωής. Οι δίδυμοι λοιπόν έχουν διαφορετικά σημαδεμένο DNA και όσο προχωράνε σε ηλικία τόσο μεγαλύτερη διαφοροποίηση θα έχουν. Είναι το λεγόμενο epigenetic drift που παρατηρείται με την ηλικία. β) η μεθυλίωση ακετυλίωση αποακετυλίωση των ιστονών και οι ομοιοπολικές συνδέσεις στα άκρα τους, που οδηγούν σε αναδιαμόρφωση της δομής της χρωματίνης και αντίστοιχη γονιδιακή σίγαση ή έκφραση. Οι πιο καλά μελετημένες τροποποιήσεις είναι η τριμεθυλίωση των καταλοίπων Lys9 και Lys27 της ιστόνης H3 (αναφέρονται ως H3K9me3 και H3K27me3) που προκαλεί γονιδιακή σίγαση, καθώς και οι τροποποιήσεις H3K4me3 και H3K9 ακετυλίωση (H3K3ac) που σχετίζονται με ενεργά γονίδια. 54

55 γ) οι μετα-μεταγραφικές και μεταγραφικές παρεμβάσεις από τα RNA αναστολής: η παρεμβολή του RNA ή RNAi όπως αποκαλείται, είναι το φαινόμενο που προκαλεί τη μεταμεταγραφική σίγαση ενός γονιδίου μετά από ενδογενή παραγωγή ή από εισαγωγή στο κύτταρο ενός μικρομοριακού παρεμβατικού RNA με αλληλουχία συμπληρωματική με αυτή του γονιδίου. Η γονιδιακή σίγαση μέσω της οδού του RNAi ενεργοποιείται από την ύπαρξη ενός δίκλωνου μορίου RNA. Το ένζυμο Dicer, το οποίο ανήκει στην οικογένεια των RNAσών ΙΙΙ, κόβει το δίκλωνο RNA σε τμήματα μήκους 22 περίπου νουκλεοτιδίων, τα αποκαλούμενα μικρά παρεμβατικά RNAs(siRNAs). Tα sirnas ξετυλίγονται και η μία από τις δύο έλικες ενσωματώνεται σε ένα σύμπλεγμα μορίων που συνιστούν τη νουκλεάση RISC RNA σύμπλοκο που επάγει τη γονιδιακή σίγαση. Η έλικα του δίκλωνου RNA που ενσωματώνεται στο RISC υβριδίζεται με το συμπληρωματικό RNA-στόχο ενεγοποιώντας τη νουκλεάση μέσα στο σύμπλοκο RISC, η οποία κατακερματίζει τον στόχο. Το RISC έχει τη δυνατότητα να ανακυκλωθεί και να αποικοδομήσει πολλά mrna-στόχους.συνεπώς από μια αλληλουχία που έχει εισαχθεί σε ένα κύτταρο σε περιορισμένη ποσότητα, καθίσταται δυνατή η σίγαση ενός σχετικά μεγάλου αριθμού μορίων mrna. Εκτός λοιπόν από τους μεταγραφικούς παράγοντες και τα σηματοδοτικά μονοπάτια, οι επιγενετικές τροποποιήσεις και η οργάνωση της χρωματίνης διαδραματίζουν επίσης καταλυτικό ρόλο στην ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης κατά την διάρκεια της αυτοανανέωσης και της διαφοροποίησης των stem κυττάρων [9]. Έτσι, ο έλεγχος της γονιδιακής έκφρασης μέσω της οικογένεια των Polycomb group πρωτεϊνών που καταστέλουν την μεταγραφή με αποσιώπηση της χρωματίνης με την επιγενετική τροποποίηση H3K27me3, είναι απαραίτητος προκειμένου να διατηρηθεί η πολυδυναμία των εμβρυϊκών stem κυττάρων κατά των εμβρυογένεση [53, 54]. Οι μελέτες με τεχνικές ανοσοκαθίζησης της χρωματίνης, οδήγησαν σε μια ενδιαφέρουσα αντίληψη όσο αφορά τον έλεγχο της πολυδυναμίας: τα γονίδια που είναι υπό καταστολή στα εμβρυϊκά stem κύτταρα αλλά είναι απαραίτητη η ενεργοποίησή τους σε μεταγενέστερο στάδιο για την διαφοροποίηση, είχαν τμήματα με τα επιγενετικά σημάδια H3K4me3 και H3K27me3 που έχουν αντίθετη δράση. Το αποτέλεσμα είναι να βρίσκονται σε μια κατάσταση ισορροπίας (bivalent domain) όσον αφορά την πολυδυναμία ή τη περαιτέρω διαφοροποίηση [55]. Φαίνεται με άλλα λόγια ότι με βάση τα επιγενετικά σημάδια H3K4me3 και H3K27me3 55

56 είναι δυνατό να γίνει μια κατηγοριοποίηση των γονιδίων ως εξής: ενεργά γονίδια (H3K4me3), γονίδια σε κατάσταση ισορροπίας (bivalent domain) και συχρόνως ετοιμότητας (H3K4me3 και H3K27me3) και γονίδια υπό καταστολή (H3K27me3) [56]. Ωστόσο, σχεδόν το ένα τρίτο των γονιδίων στα εμβρυϊκά stem κύτταρα δεν έχουν τα επιγενετικά σημάδια H3K4me3 ή H3K27me3 αλλά είναι κυρίως σε σίγαση. Επομένως, σε αυτά τα γονίδια φαίνεται να έχει γίνει άλλου είδους επιγενετική τροποποίηση και πιο συγκεκριμένα μεθυλίωση του DNA που λειτουργεί σαν συμπληρωματικός μηχανισμός ελέγχου [9]. Μέχρι σήμερα ο πλέον πρώιμος επιγενετικός παράγοντας που έχει περιγραφεί να συμμετέχει στον καθορισμό της διαφοροποίησης προς συγκεκριμένη κυτταρική σειρά, είναι ο CARM1 ο οποίος συμμετέχει στις μεθυλιώσεις H3R2, H3R17 και H3R26. Αυτοί οι επιγενετικοί δείκτες, γενικώς συνδέονται με ενεργό γονιδιακή έκφραση. Τα βλαστομερίδια με υψηλότερα ενδογενή επίπεδα CARM1, και ειδικότερα αυτά στα οποία είχε εισαχθεί mrna του CARM1 προκειμένου να γίνει υπερέκφραση, εμφανίζουν μία τάση να εντοπίζονται στην εσωτερική μάζα κυττάρων ICM [57]. Επομένως, οι επιγενετικοί παράγοντες όχι μόνο διαμορφώνουν ευνοϊκό ή μη περιβάλλον για τη διαφοροποίηση του κυττάρου, αλλά πιθανόν να προδιαθέτουν το κύτταρο προς συγκεκριμένη κυτταρική σειρά. Καθοριστικό ρόλο επίσης στην επιλογή μεταξύ αυτών των πλέον πρώιμων κυτταρικών σειρών στη διάρκεια της ανάπτυξης, της τροφοβλάστης και της εμβρυϊκής κυτταρικής σειράς, φαίνεται να διαδραματίζει ο μεταγραφικός παράγοντας ELF5. Ο περιορισμός του δυναμικού για διαφοροποίηση επιτυγχάνεται με την επιγενετική ρύθμιση του παράγοντα ELF5, ο οποίος μεθυλιώνεται και αποσιωπάται στην εμβρυϊκή κυτταρική σειρά, αλλά είναι υπομεθυλιωμένος και ενεργός στην κυτταρική σειρά της τροφοβλάστης. Σχηματίζοντας μια καμπύλη θετικής ανάδρασης με τα γονίδια Cdx2 και Eomes στα κύτταρα της τροφοβλάστης, το μόριο Elf5 ενισχύει την δέσμευση για διαφοροποίηση προς την κυτταρική σειρά της τροφοβλάστης. Αντίθετα, αυτό το μονοπάτι διαφοροποίησης εγκαταλείπεται στη κυτταρική σειρά που προορίζεται να δημιουργήσει το έμβρυο, μέσω της επιγενετικής αποσιώπησης του ELF5 [58]. Ένας από τους βασικούς στόχους της σύγχρονης βιολογίας είναι η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών με τους οποίους τα πολυδύναμα προγονικά κύτταρα ελέγχουν την ανάπτυξη των ιστών και την ομοιόσταση. Πολύ σημαντικός όπως αναφέρθηκε, είναι ο ρόλος που διαδραματίζει η Polycomb οικογένεια πρωτεϊνών (PcG) των καταστολέων της μεταγραφής μέσω αποσιώπησης της χρωματίνης [59, 60]. Οι πρωτεΐνες αυτές σχηματίζουν συμπλέγματα αναδόμησης της χρωματίνης που αναφέρονται ως RPC1 και RPC2. 56

57 Αποτελούμενο από τα μόρια Ezh2, Eed και Suz12 το σύμπλεγμα RPC2 επιστρατεύεται στη χρωματίνη όπου το ένζυμο μεθυλοτρανσφεράση EZH2 καταλύει την τρι-μεθυλίωση της ιστόνης H3 σε κατάλοιπα λυσίνης lys27 (H3K27me3). Αυτή η επιγενετική τροποποίηση με τη σειρά της παρέχει μια πλατφόρμα για την επιστράτευση του RPC1, το οποίο ενισχύει την καταστολή είτε μέσω συμπίεσης της δομής της χρωματίνης είτε διαντιδρώντας με τον μηχανισμό μεταγραφής της χρωματίνης [61]. Χωρίς την δράση του EZH2 δεν είναι εφικτή ούτε η επιστράτευση του συμπλέγματος πρωτεϊνών RPC2, ούτε η καταστολή της μεταγραφής της χρωματίνης από τις Polycomb πρωτεΐνες [61]. Μια μελέτη στην οποία χρησιμοποιήθηκε επιδερμίδα επίμυος στα πειραματικά μοντέλα, έδειξε ότι το μόριο EZH2 είναι βασικός συντελεστής για την καταστολή της έκφρασης της χρωματίνης στα κύτταρα της βασικής στιβάδας, ενώ επίσης ότι η έκφρασή του ελαττώνεται με την ηλικία και την δέσμευση για κυτταρική διαφοροποίηση in vivo και in vitro [59]. Έδειξε επίσης ότι η λεπτή ισορροπία στον χώρο μεταξύ των PcG πρωτεϊνών που καταστέλλουν τη μεταγραφή στα αδιαφοροποίητα κύτταρα και των μεταγραφικών ενεργοποιητών όπως το μόριο AP1 στα διαφοροποιημένα κύτταρα, καθορίζει σε κάποιο βαθμό την διαφοροποίηση της επιδερμίδας κατά την ανάπτυξη του δέρματος. Το επιγενετικό σημάδι H3K27me3 αποτρέπει τη σύνδεση του μεταγραφικού παράγοντα AP1 σε γονίδια-στόχους που σχετίζονται με διαφοροποίηση στα κύτταρα της βασικής στιβάδας, ενώ κατά την τελική διαφοροποίηση αυτά τα όψιμα γονίδια διαφοροποίησης χάνουν την συγκεκριμένη επιγενετική τροποποίηση, συνδέονται με το AP1 και γίνονται ενεργά όπως φαίνεται και στην εικόνα 29. Εικόνα 29 Η αντιδιαμετρική έκφραση των PcG πρωτεϊνών και του παράγοντα AP1 διασφαλίζει το πρόγραμμα διαφοροποίησης της επιδερμίδας στο χρόνο και στο χώρο. Στα κύτταρα της βασικής στιβάδας, η παρουσία της επιγενετικής τροποποίησης H3K27me3 αποτρέπει την σύνδεση του AP1 καθώς και την ενεργοποίηση των όψιμων γονιδίων διαφοροποίησης. Αντίθετα, η απώλεια αυτής της επιγενετικής τροποποίησης επιτρέπει την σύνδεση του AP1 και την ενεργοποίηση των γονιδίων [59]. 57

58 Επιγενετική ρύθμιση και δίκτυα πολυδυναμίας Στην εικόνα 30 απεικονίζεται η διασύνδεση μεταξύ των μεταγραφικών παραγόντων πολυδυναμίας και των επιγενετικών τροποποίησεων. Στη πραγματικότητα, είναι πιθανό αυτή η δυναμική ισορροπία ανάμεσα στα δύο ρυθμιστικά δίκτυα να αποτελεί και τη βάση του stemness. Έτσι, αρκετοί επιγενετικοί τροποποιητές που επιφέρουν αποσιώπηση γονιδίων, διασυνδέονται με τους μεταγραφικούς παράγοντες OCT4, NANOG, SOX2 και/ή SALL4 [9]. Ανάμεσά τους περιλαμβάνονται γονίδια που κωδικοποιούν συνιστώσες του συμπλέγματος πρωτεϊνών PRC και αρκετά άλλα όπως φαίνεται και στην εικόνα. Εικόνα 30 Διαντίδραση μεταξύ των παραγόντων πολυδυναμίας και επιγενετικών τροποποιητών. Οι επιγενετικοί τροποποιητές οι οποίοι συνδέονται και ρυθμίζονται από τους μεταγραφικούς παράγοντες της πολυδυναμίας όπως ο OCT4, NANOG, SOX2 και SALL4. Αντιστρόφως, μερικά από αυτά τα μόρια είναι γνωστό ότι με τη σειρά τους και αυτά ρυθμίζουν την δράση των παραγόντων πολυδυναμίας. Τα μόρια JMJD1A, και ειδικότερα το JMJD2C, είναι απαραίτητα προκειμένου να αντιστραφεί η τριμεθυλίωση σε κατάλοιπα λυσίνης Lys9 της ιστόνης H3 (H3K9me3) στον γενετικό τόπο του NANOG με την οποία το γονίδιο είναι ενεργό. Σε φάση διαφοροποίησης, τα OCT4 και NANOG αποσιωπούνται γρήγορα με τις επιγενετικές τροποποιήσεις H3K9me2 και H3K9me3. To NANOG αποσιωπάται επίσης με την επιγενετική τροποποίηση H3K27me3 που διαμεσολαβείται από το σύμπλεγμα πρωτεϊνών PRC και την συνιστώσα EZH2. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες και είναι τονισμένα με μαύρα γράμματα συνδέονται και με τους 4 μεταγραφικούς παράγοντες [9]. 58

59 Ο μεταγραφικός παράγοντας SALL4 φαίνεται να έχει έναν μοναδικό ρόλο σε αυτή τη διαντίδραση καθώς συνδέεται μαζί με τα μόρια PRC1 και PRC2 στo επιγενετικό σημάδι H3K27me3 σε ορισμένους γενετικούς τόπους αλλά δεν χρειάζεται αυτά τα περιοριστικά συμπλέγματα για τη σύνδεσή του σε άλλα σημεία. Αν και η σημασία αυτής της παρατήρησης δεν είναι ξεκάθαρη, δείχνει όμως μια απευθείας διασύνδεση μεταξύ των παραγόντων πολυδυναμίας και των επιγενετικών τροποποιητών προκειμένου να διατηρηθεί η πολυδυναμία. Είναι αξιοσημείωτο ότι μια βασική λειτουργία των γονιδίων-στόχων των παραγόντων OCT4, NANOG, SOX2 και SALL4 τα οποία και κωδικοποιούν επιγενετικούς τροποποιητές, είναι η ρύθμιση της έκφρασης των ίδιων των παραγόντων πολυδυναμίας με αποτέλεσμα να δημιουργείται ένα αυτορυθμιστικό κύκλωμα μεταγραφικού ελέγχου. Για παράδειγμα, το γονίδιο JMJD2C και η πρωτεΐνη που κωδικοποιεί είναι απαραίτητο για την αντιστροφή της επιγενετικής τροποποίησης H3K9me3 στον γενετικό τόπο NANOG με αποτέλεσμα το γονίδιο να είναι ενεργό. Αντίθετα, κατά την διαφοροποίηση, το μόριο OCT4 γρήγορα αποσιωπάται με τα επιγενετικά σημάδια H3K9me2 και H3K9me3 που διαμεσολαβούνται από το σύμπλεγμα G9A-EHMT1 και την επακόλουθο de novo DNMT3A- και DNMT3Bεξαρτώμενη μεθυλίωση του DNA. Επομένως, τα μειωμένα επίπεδα της JMJD2C λόγω των χαμηλών επιπέδων του μεταγραφικού παράγοντα OCT4 οδηγούν σε καταστολή της έκφρασης του NANOG μέσω των επιγενετικών τροποποίησεων H3K9me2, H3K9me3, H3K27me3 και την μεθυλίωση του DNA. Είναι προφανές, ότι μια διατάραξη της λεπτής αυτής ισορροπίας θα έχει σαν αποτέλεσμα την καταστολή αυτών των γονιδίων και επομένως την διαφοροποίηση [9]. Ένα τόσο περίτεχνα ρυθμιζόμενο σύστημα παρέχει μια λογική εξήγηση για την ασταθή φύση της κατάστασης πολυδυναμίας και της ροπής των εμβρυϊκών stem κυττάρων για διαφοροποίηση in vitro. O μηχανισμός θετικής ανάδρασης αρκετών επιγενετικών καταστολέων όπως OCT4, NANOG, SOX2 και SALL4 μπορεί επίσης να εξηγήσει γιατί τα πολυδύναμα κύτταρα δεν διατηρούνται στη κατάσταση αυτή in vivo με αποτέλεσμα ένα επιπλέον επίπεδο ελέγχου για την αποτροπή του μη ελεγχόμενου κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της τερατογένεσης. Αυτή η άποψη υποστηρίζεται από πρόσφατες μελέτες των ενδογενών πρωτεϊνικών συμπλεγμάτων που διαπλέκονται με τα μόρια OCT4 και NANOG, στις οποίες έγινε ταυτοποίηση πρωτεϊνών από τα πρωτεϊνικά συμπλέγματα καταστολής της έκφρασης NuRD (nucleosome remodelling and histone deacetylation), SIN3A (a transcriptional regulator) και PMl (promyelocytic leukaemia) [62]. Αυτά τα 59

60 πειραματικά αποτελέσματα υπογραμμίζουν τον κατασταλτικό ρόλο των μορίων-κλειδί για την πολυδυναμία. Η μεταβαλλόμενη κατάσταση της πολυδυναμίας Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό της διαντίδρασης των μεταγραφικών παραγόντων και των επιγενετικών τροποποιητών, που αποτελεί και τη βάση της πολυδυναμίας και της κυτταρικής διαφοροποίησης, είναι η πλαστικότητα της. Έτσι, στα πρώτα στάδια της ανάπτυξης του εμβρύου σε επίμυες, όπως φαίνεται και στην εικόνα 31, δεν φαίνεται να υπάρχει σαφής προσδιορισμός της μοίρας του κυττάρου, όπως αυτή αντικατοπτρίζεται από την κατανομή των μεταγραφικών παραγόντων. Ο OCT4 συγκεκριμένα, παρατηρείται σε όλα τα κύτταρα μέχρι το στάδιο της βλαστοκύστης και σταδιακά εξαφανίζεται από τα κύτταρα της τροφοβλάστης αργότερα. Τα επίπεδα του NANOG στο μορίδιο είναι ανεξάρτητα από τη θέση του κυττάρου, ενώ η έκφραση ενός καθοριστικού παράγοντα για τον σχηματισμό της τροφοβλάστης, του CDX2 φαίνεται να περιορίζεται στα πιο εξωτερικά κύτταρα της και πιθανόν να σχετίζεται με την ικανότητα αυτού του παράγοντα να συμβάλλει στην ασύμμετρη κυτταρική διαίρεση στο στάδιο των 8 κυττάρων [9]. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι οι αποφάσεις για την πρώιμη διαφοροποίηση των κυττάρων, δεν είναι το αποτέλεσμα ενός ή λίγων παραγόντων που είναι μοναδικοί για κάθε κύτταρο, αλλά αφορούν τη λεπτή ισορροπία μεταξύ παραγόντων με αντίθετη δράση. 60

61 Εικόνα 31 Στοχαστικότητα της γονιδιακής έκφρασης, του αναπτυξιακού δυναμικού και της δέσμευσης για διαφοροποίηση προς συγκεκριμένη κυτταρική σειρά. Η στοχαστικότητα της γονιδιακής έκφρασης και οι διαντιδράσεις μεταξύ μεταγραφικών παραγόντων που καθορίζουν την διαφοροποίηση του κυττάρου και έχουν αντίθετη δράση, σταδιακά καθορίζουν την διφοροποίηση των πρώτων κυττάρων. Αυτοί οι μεταγραφικοί παράγοντες περιλαμβάνουν τα μόρια OCT4, NANOG, SOX2, SALL4, STELLA, CDX2, EOMES και ELF5. Η διεργασία αυτή ελέγχεται από επιγενετικές τροποποιήσεις που διαμορφώνουν ευνοϊκό ή μη περιβάλλον ή μπορεί επίσης να προδιαθέτουν το κύτταρο για δέσμευση προς συγκεκριμένη διαφοροποίηση. Είναι πολύ πιθανό η έκφραση για κάθε έναν από τους μεταγραφικούς παράγοντες, να παρουσιάζει διακυμάνσεις μεταξύ ενός ελάχιστου και μέγιστου ορίου και έτσι να διαμορφώνονται οι συνθήκες για ανάπτυξη, πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση στα επιμέρους βλαστομερίδια. Η έκφραση αυτών των παραγόντων παραμένει ένα «μωσαϊκό» μέχρι το στάδιο της βλαστοκύστης, όταν και έχουν σχηματιστεί πλέον οι κυτταρικές σειρές της εσωτερικής μάζας κυττάρων ICM, της επιβλάστης και των αντίστοιχων εμβρυϊκών stem κυττάρων, της τροφοβλάστης και των αντίστοιχων stem κυττάρων. Η de novo μεθυλίωση του DNA αρχίζει χρονικά μεταξύ του μοριδίου και του σταδίου της βλαστοκύστης. Ο καθορισμός της κυτταρικής διαφοροποίησης σε αυτά τα πρώιμα στάδια συμπίπτει με τη μεθυλίωση του ELF5 στη ICM, η οποία δημιουργεί έναν επιγενετικό φραγμό μεταξύ των κυτταρικών σειρών του αναπτυσσόμενου εμβρύου και της τροφοβλάστης. Η μεθυλίωση του παράγοντα Stella πραγματοποιείται στο ίδιο περίπου χρονικό παράθυρο και πιθανόν να έχει παρόμοια λειτουργία ώστε να σχηματιστεί η επιβλάστη μετά την εμφύτευση [9]. 61

62 Η μεταβλητότητα της γονιδιακής έκφρασης είναι χαρακτηριστικό γνώρισμα των εμβρυϊκών stem κυττάρων. Ένα ιδαίτερο χαρακτηριστικό τους είναι η εναλλαγή των διαφορετικών επιγενετικών καταστάσεων, που συνδέονται με ετερογενή έκφραση διάφορων γονιδίων σχετικών με την κυτταρική ανάπτυξη [62]. Η διατήρηση αυτής της μεταβλητότητας φαίνεται να είναι πολύ σημαντική για την φυσιολογία των εμβρυικών stem κυττάρων, ενώ στο αναπτυσσόμενο έμβρυο τα κύτταρα γρήγορα μεταπίπτουν σε πιο σταθερές καταστάσεις που πιθανό να είναι πιο ευνοϊκές ενεργειακά, περιορίζοντας όμως το δυναμικό τους για διαφοροποίηση και αυτο-ανανέωση. Η συνεχώς αυξανόμενη λίστα των παραγόντων που εμφανίζουν ετερογένεια στην έκφρασή τους, περιλαμβάνει τα μόρια NANOG, PECAM1, SSEA1, REX1 και STELLA [9]. Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν αυτές τις πρωτεΐνες πιθανώς να συνδέεται με το δυναμικό τους (stemness), το οποίο πειραματικά μπορεί να αξιολογηθεί με την ικανότητά τους να συμμετέχουν στον σχηματισμό χιμαιρικών οργανισμών. Για παράδειγμα τα REX1-αρνητικά και OCT4-θετικά (REX1-/OCT4+) κύτταρα εμφανίζουν μικρή ικανότητα στο σχηματισμό χίμαιρας συγκριτικά με REX1+/OCT4+ εμβρυικά stem κύτταρα. Παρόμοια αποτελέσματα δημοσιεύτηκαν και από μελέτες με πληθυσμούς STELLA-/OCT4+ και STELLA+/OCT4+ εμβρυϊκών stem κυττάρων [63]. Η διακύμανση μεταξύ ενεργούς και μη μορφής του μεταγραφικού παράγοντα STELLA, σχετίζεται με επιγενετικές διαφορές στον γενετικό του τόπο, με τα κύτταρα που εκφράζουν το μόριο να εμφανίζουν έντονα τα θετικά επιγενετικά σημάδια H3K9ac και H3K4me3. Ωστόσο έχει ενδιαφέρον ότι η αναλογία των υποπληθυσμών των εμβρυικών stem κυττάρων που εκφράζουν και αυτών που δεν εκφράζουν τον μεταγραφικό παράγοντα STELLA είναι μεταβαλλόμενος, με αποτέλεσμα ο πληθυσμός των stem κυττάρων ως σύνολο να παρουσιάζει παρόμοιες αναλογίες μεταξύ των STELLA-θετικών και των STELLA-αρνητικών κυττάρων [9]. Είναι εμφανές, ότι μια συνεχής διάταξη και απο-διάταξη επιγενετικών τροποποιήσεων πιθανό να συμβάλλει στη μεταβλητότητα της κατάστασης πολυδυναμίας. Η εξαναγκασμένη συνεχής έκφραση του Nanog είναι επαρκής για να αποτρέψει την διαφοροποίηση των εμβρυικών stem κυττάρων και να διατηρήσει την ικανότητα της αυτόανανέωσης ακόμα και με την παρουσία ενεργούς σηματοδότησης FGF/Erk [64]. Στην πραγματικότητα τα επίπεδα έκφρασης του Nanog ποικίλλουν μεταξύ των εμβρυϊκών stem κυττάρων, όπως φαίνεται στην εικόνα 32. Επιπλέον, εμβρυϊκά stem κύτταρα στα οποία έγινε απάλειψη και των δύο αλληλόμορφων γονιδίων του Nanog, συνέχισαν να παραμένουν πολυδύναμα και σε αδιαφοροποίητη κατάσταση [38]. Παράλληλα, άλλα γονίδια που 62

63 σχετίζονται με το stemness καθώς και γονίδια στόχοι του Nanog, συνέχιζαν να εκφράζονται παρά την απουσία του. Αυτά τα δεδομένα, θέτουν υπό αμφισβήτηση την διαμορφωθείσα άποψη ότι οι τρεις μεταγραφικοί παράγοντες Nanog, Oct4 και Sox2 λειτουργούν από κοινού για να συντηρήσουν το stemness του κυττάρου. Παρόλα αυτά, γεγονός παραμένει ότι τα κύτταρα με έλλειψη του Nanog εμφανίζουν μια αυξημένη τάση-ροπή προς διαφοροποίηση [37, 38]. Φαίνεται δηλαδή ότι ο συγκεκριμένος μεταγραφικός παράγοντας διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στο να αναστέλλει τις συνέπειες της Erk σηματοδότησης όσον αφορά την διατήρηση της πολυδυναμίας των εμβρυικών stem κυττάρων. Έρευνες με τεχνικές απάλειψης γονιδίων και σύντηξης κυττάρων, έδειξαν ότι ο Nanog δρα στο να εδραιώνει de novo την κατάσταση πολυδυναμίας [37], καθώς και στα κύτταρα της γαμετικής σειράς [38]. Επομένως, στις καλλιέργειες εμβρυικών stem κυττάρων, o Nanog μπορεί να αντιστρέψει την δράση του Erk μονοπατιού ή άλλων μορίων που επάγουν την διαφοροποίηση, και να επαναρυθμίσει το κύτταρο σε αδιαφοροποίητη κατάσταση. Στο έμβρυο, η έκφραση του Nanog είναι επίσης δυναμική καθότι ελαττώνεται την στιγμή της εμφύτευσης και αυξάνει ξανά αργότερα. Η δημιουργία ενός αλληλόμορφου με το γονίδιο GFP (green fluorescent protein), οδήγησε στο συμπέρασμα ότι η ρύθμιση των επιπέδων του Nanog γίνεται στο επίπεδο της μεταγραφής (transcription) και είναι πλήρως αντιστρέψιμη διαδικασία. Ο μηχανισμός δεν είναι ακριβώς γνωστός. Πιθανόν οι διακυμάνσεις των επιπέδων του μεταγραφικού παράγοντα να είναι τυχαίες-στοχαστικές, όπως φαίνεται να είναι και η αρχική έκφραση του Nanog στο έμβρυο [38, 64]. Ανεξαρτήτως του υποκείμενου μηχανισμού ρύθμισης, αυτή η διακύμανση προσδίδει μια λειτουργική ετερογένεια στην δυνατότητα αυτό-ανανέωσης μεταξύ μεμονωμένων εμβρυικών stem κυττάρων. Ο Nanog, όπως αναφέρθηκε, δεν είναι το μόνο γονίδιο πολυδυναμίας που εμφανίζει ποικιλία στα επίπεδα έκφρασής του. Επομένως η αντίληψη ότι οι καλλιέργειες εμβρυϊκών stem κυττάρων είναι ομοιογενείς, δεν ανταποκρίνεται στην πραγματικότητα. 63

64 Εικόνα 32 Μία μεταβλητή συμμαχία (coalition). Ο μεταγραφικός παράγοντας Nanog διασφαλίζει την αυτο ανανέωση των εμβρυικών stem κυττάρων, ενώ οι διακυμάνσεις των επιπέδων έκφρασής του από κύτταρο σε κύτταρο, δημιουργούν την πιθανότητα για διαφοροποίηση. Τα εμβρυικά stem κύτταρα είναι ετερογενή. Ανοσοϊστοχημεία δείχνει υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης Nanog σε Oct4 θετικά αδιαφοροποίητα εμβρυικά stem κύτταρα [64]. Επιγενετική και δέσμευση για συγκεκριμένη κυτταρική διαφοροποίηση Η ανάπτυξη είναι σε γενικές γραμμές μια γραμμική διαδικασία, που περιλαμβάνει μια σειρά από εξελικτικά στάδια διαφοροποίησης, ξεκινώντας από το στάδιο της πολυδυναμίας με τελική κατάληξη την δέσμευση και τελική διαφοροποίηση προς συγκεκριμένη κυτταρική σειρά. Επομένως, το έμβρυο ως σύνολο κινείται κατά μήκος μιας αναπτυξιακής κλίμακας και πάντα προς τα εμπρός, αν και ορισμένα κύτταρα μεμονωμένα πιθανόν να αποκλίνουν από αυτή την πορεία. Ο περιορισμός στο αναπτυξιακό δυναμικό των κυττάρων και η συνοδός ελάττωση της πλαστικότητας τους, συνδέεται άμεσα με τη συσσώρευση επιγενετικών τροποποιήσεων, με αποτέλεσμα την δημιουργία κυτταρικής μνήμης και την σταθεροποίηση της πορείας του κυττάρου προς συγκεκριμένη κατεύθυνση [9]. Το ερώτημα, πότε ακριβώς λαμβάνει χώρα η πλέον πρώιμη απόφαση για την περαιτέρω πορεία του κυττάρου, που 64

65 καθορίζει την διαφοροποίηση του βλαστομεριδίου προς τροφοβλάστη ή εσωτερική μάζα κυττάρων ICM, έχει μελετηθεί με μεγάλη λεπτομέρεια. Η πλέον διαδεδομένη αντίληψη θεωρεί ότι αυτή η διαδικασία πραγματοποιείται μετά τον τρίτο κυτταρικό κύκλο, και ίσως πιο νωρίς ακόμα μεταξύ των σταδίων 4 και 8 κυττάρων [65]. Εικόνα 33 Κυτταρικό δυναμικό κατά την ανάπτυξη και τον επαναπρογραμματισμό. Η σταδιακή απώλεια του δυναμικού για διαφοροποίηση κατά την ανάπτυξη, μπορεί να παρομοιαστεί με την ροή ενός ποταμού και οι επιγενετικές τροποποιήσεις με καταρράκτες. Οι διακριτές καταστάσεις ολοδυναμίας, πολυδυναμίας και ολιγοδυναμίας μπορούν να παρομοιαστούν με τα ενεργειακά πλατό ακριβώς πριν τους καταρράκτες. Ο πρώτος κύριος καταρράκτης συναντάται στο στάδιο της βλαστοκύστης. Τα κύτταρα της τροφοβλάστης φθάνουν στον καταρράκτη πρώτα, καθώς δεσμεύονται προς συγκεκριμένη κυτταρική διαφοροποίηση νωρίτερα από τα κύτταρα της εσωτερικής μάζας κυττάρων ICM. Τα πολυδύναμα stem κύτταρα της τροφοβλάστης διατηρούν πλήρη πολυδυναμία μέχρι την εμβρυϊκή μέρα E8.5, παραμένοντας έτσι σε πολυδύναμη κατάσταση περισσότερο από τα κύτταρα της εμβρυϊκής σειράς. Από την επιβλάστη προέρχονται τα επιβλαστικά stem κύτταρα (episcs). Αυτά βρίσκονται σε χαμηλότερο ενεργειακό πλατό από τα εμβρυϊκά stem κύτταρα λόγω του χαμηλότερου δυναμικού τους για σχηματισμό χίμαιρας. Από τη στιγμή που φθάσουν στο πλατό αυτό, είναι εφικτή η μόνιμη (για παράδειγμα NANOG σε καλλιέργειες stem κυττάρων) ή προσωρινή (στοχαστικά τυχαιοποιημένα εκφραζόμενα γονίδια) απουσία ορισμένων παραγόντων που είναι απαραίτητοι για την εγκατάσταση του πλατό αρχικά. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι απαιτείται μια ορισμένη «ενέργεια ενεργοποίησης» προκειμένου να υπερκεραστούν οι καταρράκτες σε μια μονόδρομη κατεύθυνση και να δημιουργηθούν καταστάσεις αυξημένου δυναμικού. Αυτή η «ενέργεια ενεργοποίησης» πιθανόν να αντιπροσωπεύει την ανάγκη για επιγενετικές τροποποιήσεις. Μια τέτοια παρέμβαση έχει σημαντικές εφαρμογές σε στρατηγικές επαναπρογραμματισμού, καθώς φαίνεται ότι απαιτείται η βραχυπρόθεσμη υπερέκφραση η 65

66 ενεργοποίηση επιπρόσθετων παραγόντων, προκειμένου τα ips κύτταρα να φθάσουν σε μια κατάσταση παρόμοια με τα εμβρυϊκά stem κύτταρα [9]. ΕΠΑΝΑΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΜΟΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕΣΩ ΣΥΓΚΕΚΡΙΜΕΝΩΝ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ Οι Takahashi and Yamanaka, σε μια σημαντική ανακάλυψή τους στα πλαίσια πρωτοποριακών ερευνών, έφεραν νέα στοιχεία στο φως σχετικά με την ικανότητα επαναπρογραμματισμού σωματικών κυττάρων [6, 7]. Αρχικά, σε ινοβλάστες ποντικού και αργότερα σε ενήλικες ινοβλάστες ανθρώπου, κατάφεραν να επαναπρογραμματίσουν σωματικά κύτταρα σε πολυδύναμα κύτταρα ips (induced Pluripotent Stem cells), μόνο με την εισαγωγή μέσω ιών-φορέων στα εξεταζόμενα κύτταρα, των εξής τεσσάρων μεταγραφικών παραγόντων : Oct4, Sox2, c-myc και Klf4 (εικόνα 34). Εικόνα 34 Σχηματική απεικόνιση των πειραμάτων των Takahashi and Yamanaka σε ανθρώπινους ινοβλάστες [7]. Τα ips κύτταρα του ποντικού δεν διαχωρίζονται από τα αντίστοιχα εμβρυϊκά stem κύτταρα σε πολλά επίπεδα, και πιο συγκεκριμένα στη μορφολογία, στον πολλαπλασιασμό, στη γονιδιακή έκφραση και στο σχηματισμό τερατώματος μετά από μεταμόσχευσή τους σε ανοσοκατασταλμένα ζώα. Το τεράτωμα είναι ένα όγκος που αποτελείται από κύτταρα και των τριών βλαστικών στιβάδων και παρέχει την δυνατότητα να εκτιμηθεί η ικανότητα των υπό μελέτη κυττάρων να εκφράσουν την συνδυασμένη δυναμική της αυτο-ανανέωσης και εξέλιξης. Επιπλέον, τα κύτταρα αυτά όταν μεταμοσχεύτηκαν σε βλαστοκύστεις, έδωσαν γένεση σε χιμαιρικά ζώα [6, 7, 66]. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι μπορούν να παραχθούν πολυδύναμα κύτταρα με επαναπρογραμματισμό σωματικών κυττάρων με τον συνδυασμό ενός μικρού αριθμού παραγόντων. Σε μεταγενέστερη έρευνα χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινοι ινοβλάστες, στους οποίους έγινε εισαγωγή μέσω ιών-φορέων των ίδιων τεσσάρων μεταγραφικών παραγόντων και το αποτέλεσμα ήταν εξίσου θεαματικό [7]. Τα παραχθέντα ips κύτταρα είναι παρόμοια με τα 66

67 ανθρώπινα εμβρυικά stem κύτταρα σε πολλές παραμέτρους, όπως η μορφολογία, ο πολλαπλασιασμός, η εξάρτηση από το υλικό καλλιέργειας, οι δείκτες επιφανείας, η γονιδιακή έκφραση, η δραστηριότητα των υποκινητών, η δραστηριότητα των τελομερασών, η in vitro διαφοροποίηση και ο σχηματισμός τερατώματος. Παρόλα αυτά, δεν πρόκειται για πανομοιότυπα κύτταρα, καθώς αναλύσεις με DNA μικροσυστοιχίες ανίχνευσαν διαφορές μεταξύ των δύο πολυδύναμων κυτταρικών σειρών. Επομένως απαιτούνται περαιτέρω έρευνες για να προσδιορισθεί εάν αυτά τα ανθρώπινα ips κύτταρα μπορούν να αντικαταστήσουν τα ανθρώπινα εμβρυικά stem κύτταρα σε ιατρικές εφαρμογές. Οι ρετροιοί που χρησιμοποιήθηκαν ως φορείς βρίσκονταν σε πλήρη καταστολή, γεγονός που υποδεικνύει ότι αυτά τα ips κύτταρα είχαν υποστεί πλήρη επαναπρογραμματισμό χωρίς να εξαρτώνται από την συνεχή διαγονιδιακή έκφραση των συγκεκριμένων παραγόντων από τους ιούς για την αυτο-ανανέωσή τους. Στο πείραμα με τους ινοβλάστες ποντικιών [6], η επιλογή των κυττάρων έγινε με την ενεργοποίηση ενός γονιδίου στόχου του μεταγραφικού παράγοντα Oct4, το Fbx15 (εικόνα 35). Τα κύτταρα λοιπόν, στα οποία ενεργοποιήθηκε το εν λόγω γονίδιο, βρίσκονταν σε μια ενδιάμεση, ημιτελή κατάσταση πολυδυναμίας, όπου υπήρχε εξάρτηση από την συνεχή διαγονιδιακή έκφραση των 4 παραγόντων από τους ιούς. Επιπλέον ήταν ικανά να σχηματίσουν τερατώματα, όχι όμως και χίμαιρες, ενώ τα ενδογενή γονίδια Oct4 και Nanog είχαν ελάχιστη ή μηδαμινή έκφραση και οι αντίστοιχοι υποκινητές ήταν υπερ-μεθυλιωμένοι. Όταν χρησιμοποιήθηκε ως πιο αυστηρό κριτήριο επιλογής πολυδυναμίας, η ενεργοποίηση των ενδογενών γονιδίων Oct4 και Nanog, τα κύτταρα Oct4-iPS ή Nanog-iPS, σε αντίθεση με τα Fbx15-iPS, είχαν υποστεί πλήρη επαναπρογραμματισμό σε πολυδύναμη κυτταρική κατάσταση, ανάλογη των εμβρυικών stem κυττάρων σύμφωνα με βιοχημικά και βιολογικά κριτήρια [6, 7, 66]. 67

68 Εικόνα 35 Επαναπρογραμματισμός σωματικών κυττάρων σε πολυδύναμα κύτταρα. (A) Η μεταφορά των τεσσάρων μεταγραφικών παραγόντων Oct4, Sox, c Myc και Klf4 σε ινοβλάστες προκαλεί την μετατροπή τους σε μερικώς επαναπρογραμματισμένα κύτταρα που εκφράζουν το Fbx15 ή σε πλήρως επαναπρογραμματισμένα κύτταρα που εκφράζουν τους Oct4 και Nanog. H διαδικασία περιλαμβάνει μια σειρά από τυχαιοποιημένα στοχαστικά γεγονότα. (Β) Σχήματα επιλογής. Η μεταφορά των τεσσάρων μεταγραφικών παραγόντων πραγματοποιείται σε κύτταρα που φέρουν ως δείκτες γονίδια αντοχής σε αντιβιοτικά, συνδεδεμένα με τους γενετικούς τόπους των ενδογενών γονιδίων Fbx15, Oct4 και Nanog. Έτσι επιλέγονται τα κύτταρα στα οποία ενεργοποιούνται τα συγκεκριμένα γονίδια και εμφανίζουν αντοχή στα αντιβιοτικά σε συνθήκες καλλιέργειας [35]. Η έκφραση των παραγόντων επαναπρογραμματισμού, φαίνεται ότι θέτει σε εφαρμογή μια σειρά στοχαστικών-τυχαίων γεγονότων τα οποία έχουν ως αποτέλεσμα την παραγωγή ενός μικρού μόνο κλάσματος από ips κύτταρα [54]. Δηλαδή η έκτοπη έκφραση των παραγόντων Oct4, Nanog, Sox2 και Klf4 προκαλεί μια σειρά από τυχαιοποιημένες επιγενετικές αλλαγές, όπως τροποποιήσεις ιστονών και αλλαγές στη μεθυλίωση του DNA, που καταλήγουν σε μια πολυδύναμη κατάσταση ορισμένων μόνο κυττάρων από το σύνολο των αρχικών ινοβλαστών. Η συχνότητα πλήρους επαναπρογραμματισμού ήταν της τάξης του 0,5% των αρχικών ινοβλαστών του ποντικού που χρησιμοποιήθηκαν και μεταμορφώθηκαν σε ips κύτταρα μετά από 3-4 εβδομάδες [67]. Ένα θέμα προς διερεύνηση [6], είναι εάν τα κύτταρα Fbx15-iPS με τον ημιτελή επαναπρογραμματισμό, είναι σταθερές ενδιάμεσες καταστάσεις στην πορεία προς πλήρη επαναπρογραμματισμό (εικόνα 35) ή αντιπροσωπεύουν έναν γενετικά ομοιογενή πληθυσμό κυττάρων που βρίσκονται σε διαφορετικά στάδια στοχαστικού επαναπρογραμματισμού (εικόνα 36). 68

69 Εικόνα 36 Ο επαναπρογραμματισμός περιλαμβάνει διαδοχική ενεργοποίηση δεικτών πολυδυναμίας καθώς και μια σειρά στοχαστικών επιγενετικών γεγονότων. (Α) Κινητική των δεικτών πολυδυναμίας. Κύτταρα θετικά για αλκαλική φωσφατάση (AP) και SSEA1 ανιχνεύονται ήδη από την 3 και 9 μέρα αντίστοιχα, από την στιγμή της μεταφοράς των μεταγραφικών παραγόντων με ιούς φορείς, ενώ η GFP η οποία εκφράζεται από τους ενδογενείς γενετικούς τόπους Oct4 ή Nano, εμφανίζεται για πρώτη φορά μετά από 2 εβδομάδες. Επομένως οι μεταφερόμενοι μεταγραφικοί παράγοντες πρέπει να εκφράζονται για περίπου 2 εβδομάδες προκειμένου να ξεκινήσει η διαδικασία επαναπρογραμματισμού. (Β) Έγινε μεταγωγή των τεσσάρων παραγόντων σε Oct4 GFP ή Nanog GFP ινοβλάστες. Οι αποικίες που εμφάνιζαν μεταμορφωμένο φαινότυπο ήταν GFP αρνητικές και κλωνοποιήθηκαν λίγες ημέρες αργότερα (ημέρα 6). Η συνέχιση της καλλιέργειας αυτών των αποικιών, οδήγησε στην εμφάνιση ορισμένων υποκλώνων που ενεργοποίησαν την GFP σε διαφορετικούς χρόνους. Επειδή αυτοί οι υποκλώνοι προέρχονται από τα ίδια αρχικά κύτταρα στα οποία μεταφέρθηκαν οι μεταγραφικοί παράγοντες, συμπεραίνουμε ότι στοχαστικά γεγονότα πρέπει παίζουν σημαντικό ρόλο για την ολοκλήρωση του επαναπρογραμματισμού [35]. ΑΙΧΜΑΛΩΤΙΖΟΝΤΑΣ ΤΗΝ ΠΟΛΥΔΥΝΑΜΙΑ 69

70 Η αυτοεπαγόμενη σηματοδότηση Erk αποσταθεροποιεί την αυτο-ανανέωση Οι μεταγραφικοί παράγοντες Oct4 και Sox2 προκαλούν την έξοδο από την κατάσταση πολυδυναμίας με το να κατευθύνουν την έκφραση του FGF4. Πρόκειται για ένα αυτοεπαγόμενο διεγερτικό σήμα, που προωθεί τα εμβρυϊκά stem κύτταρα προς κυτταρική διαφοροποίηση [64] (εικόνα 38). Αξιοσημείωτο είναι ότι το σήμα FGF4/Erk δεν δεσμεύει την διαφοροποίηση προς συγκεκριμένη κυτταρική σειρά, αλλά καθιστά τα stem κύτταρα πιο ευαίσθητα σε περαιτέρω σήματα διαφοροποίησης (εικόνα 37). Κατά συνέπεια τα πολυδύναμα κύτταρα με έλλειψη του παράγοντα FGF4 ή με ανεπάρκεια στο μονοπάτι Erk, εμφανίζουν μια γενικότερη αδυναμία στο να ανταποκριθούν σε σήματα διαφοροποίησης. Εικόνα 37 Στο μοντέλο αυτό, τα ρυθμιστικά μεταγραφικά δίκτυα που σχετίζονται με συγκεκριμένη κυτταρική διαφοροποίηση το καθένα παραμένουν κάτω από την ουδό ενεργοποίησής τους, λόγω της μεταξύ τους ανταγωνιστικής δράσης και της κατασταλτικής δράσης των τριών μεταγραφικών παραγόντων Oct4, Sox2 και Nanog. Αποσταθεροποίηση από αυτή τη δυναμική ισορροπία προκύπτει όταν η μείωση των επιπέδων της Nanog πρωτείνης συμπίπτει με αυξημένη ενεργοποίηση του Erk. Η φωσφορυλιωμένη μορφή του Erk μπορεί να ενεργοποιήσει σηματοδοτικά μονοπάτια που επάγουν την διαφοροποίηση. Προκαλεί επίσης αυξημένος εύρος διακυμάνσεων των ρυθμιστικών δικτύων και ευνοεί έτσι την δέσμευση προς συγκεκριμένο πρόγραμμα διαφοροποίησης. Παρόλα αυτά, εάν τα επίπεδα του Nanog αυξηθούν πριν πραγματοποιηθεί αυτή η δέσμευση, τότε εξουδετερώνεται η δράση του Erk και το κύτταρο επιστρέφει στην αρχική κατάσταση δυναμικής ισορροπίας και πολυδυναμίας. Φωτογραφία των J. Silva and A. Smith [64]. Η διατήρηση της αδιαφοροποίητης κατάστασης απαιτεί να υπερκεραστεί το αναπτυξιακό δυναμικό που προκύπτει από τον FGF4 ως αποτέλεσμα της δράσης των Oct4 και Sox2. Πράγματι, στις καλλιέργειες πολυδύναμων κυττάρων έχουν αναπτυχθεί διάφορες μέθοδοι για 70

71 την διατήρηση του stemness των κυττάρων. Μία στρατηγική είναι η εξωγενής ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα Stat3 από το μόριο LIF (leukemia inhibitory factor) και παράλληλα η επαγωγή πρωτεινών που αναστέλλουν την διαφοροποίηση μέσω των πρωτεινών BMPs (bone morphogenetic proteins) [64]. Μία άλλη προσέγγιση περιλαμβάνει την φαρμακολογική αναστολή του άξονα FGF4/Erk που επιτρέπει την αυτο-ανανέωση χωρίς την συμμετοχή του Stat3. H χρήση αυτών των αναστολέων ενέχει τον κίνδυνο να επηρεαστεί η ανάπτυξη και η βιωσιμότητα του πολυδύναμου κυττάρου. Αυτή η παρενέργεια μπορεί να ξεπεραστεί με την εκλεκτική αναστολή του μορίου GSK3(glycogen synthase kinase-3), που προκαλεί την σταθεροποίηση της ενδοκυτταρικής β-κατενίνης, πιθανώς με ενεργοποίηση του κανονικού μονοπατιού Wnt ή άλλες διαντιδράσεις [64]. Πράγματι, το μονοπάτι Wnt ενισχύει την καταστολή της νευρικής διαφοροποίησης και μπορεί να συμβάλλει στην αυτο-ανανέωση. Παρόλα αυτά το συγκεκριμένο μονοπάτι έχει μικρή μόνο επίδραση στην αύξηση και βιωσιμότητα του εμβρυϊκού stem κυττάρου και δεν αναπαράγει ακριβώς τα ίδια αποτελέσματα με την αναστολή GSK3. Ένας τρίτος τρόπος είναι η αναστροφή του φαινομένου και της δράσης του FGF4 με την συνεχή έκφραση του Nanog. Εικόνα 38 Διατήρηση της πολυδυναμίας. Η αυτοεπαγόμενη σηματοδότηση FGF/Erk υποχρεώνει τα εμβρυικά stem κύτταρα για δέσμευση προς διαφοροποίηση και πρέπει να εξουδετερωθεί για να να μην διαταραχθεί η αυτο ανανέωση. (Α) Οι Oct4 και Sox2 κατευθύνουν την έκφραση του Fgf4 και υποχρεώνουν τα εμβρυϊκά stem κύτταρα για διαφοροποίηση. Η αυξημένη δραστηριότητα του Erk έχει σαν αποτέλεσμα τα πολυδύναμα κύτταρα να γίνονται πιο ευαίσθητα σε παράγοντες κυτταρικής δέσμευσης και διαφοροποίησης. (Β) Η αυτο ανανέωση των πολυδύναμων stem κυττάρων απαιτεί να υπερκεραστεί η σηματοδότηση FGF4/Erk. Η δράση του FGF4 μπορεί να (1) μπλοκαριστεί από φαρμακευτικούς εκλεκτικούς αναστολείς του υποδοχέα FGF4 (FGFR) και του Mek, (2) να αντιστραφεί 71

72 από την συνεχή έκφραση του Nanog ή (3) να εξουδετερωθεί από την κυτταροκίνη LIF (leukemia inhibitory factor) και το μορφογόνο BMP4 [64]. Μοριακοί μηχανισμοί του επαναπρογραμματισμού Η απώλεια των περισσότερων κλωνοποιημένων εμβρύων μετά την εμφύτευση έχει συνδεθεί με την λανθασμένη ενεργοποίηση των σιωπηλών ενδογενών γονιδίων της πολυδυναμίας OCT4, Nanog και SOX2 [68, 69]. Παρομοίως η διατήρηση της πολυδυναμίας στα ips κύτταρα μετά την μεταγωγή των τεσσάρων μεταγραφικών παραγόντων, έχει δειχθεί ότι εξαρτάται από την ενεργοποίηση αυτών των ενδογενών γονιδίων. Επομένως κάθε προτεινόμενος μοριακός μηχανισμός για τη περιγραφή του φαινομένου του επαναπρογραμματισμού, οφείλει να εξηγήσει γιατί αυτή η διαδικασία που ξεκινάει από την έκτοπη έκφραση των OCT4, SOX2 και άλλων παραγόντων είναι σταδιακή και χρειάζονται αρκετές εβδομάδες για να ολοκληρωθεί. Επίσης γιατί ένα μικρό μόνο κλάσμα των αρχικών ινοβλαστών τελικά αναπρογραμματίζεται σε ips κύτταρα. Φαίνεται λοιπόν, ότι η όλη διαδικασία είναι το αποτέλεσμα τυχαίων-στοχαστικών γεγονότων που πραγματοποιούνται στα επαγόμενα κύτταρα και τα οποία είναι απαραίτητα για την ολοκλήρωση του επαναπρογραμματισμού. Έτσι εξηγείται και η χαμηλή αποτελεσματικότητα της όλης διαδικασίας καθώς και η μεγάλη χρονική διάρκεια που απαιτείται. Επιπλέον γενετικές διαφορές μεταξύ των επαγόμενων κυττάρων (εν προκειμένων των ινοβλαστών), είναι ένας ακόμη παράγοντας μεταβλητότητας που επηρεάζει την συχνότητα εμφάνισης των ips κυττάρων. Για παράδειγμα, είναι πιθανό, επειδή τα επαγόμενα κύτταρα φέρουν ποικίλλο αριθμό ιών-φορέων μεταξύ τους, μόνο τα λίγα κύτταρα, εκείνα που φέρουν το απαιτούμενο υψηλό αριθμό ιών-φορέων και εκφράζουν επομένως τους μεταγραφικούς παράγοντες στα απαιτούμενα υψηλά επίπεδα, να επιλέγονται για επιγενετικό επαναπρογραμματισμό. Εναλλακτικά, είναι πιθανό ο επαναπρογραμματισμός να χρειάζεται την ενεργοποίηση κάποιων άλλων μη γνωστών γονιδίων, μέσω μετάλλαξης, η οποία προκαλείται από την χρήση των ιών-φορέων. Τέλος, μία άλλη εκδοχή είναι ότι ορισμένα μόνο κύτταρα όπως τα πολύ σπάνια σωματικά stem κύτταρα είναι ευαίσθητα για επαναπρογραμματισμό [64]. Επιπλέον, κάθε μοντέλο ερμηνείας της εν λόγω διαδικασίας, οφείλει να λάβει σοβαρά υπόψη τα εξής δεδομένα [64]: 1) Η διαδικασία του επαναπρογραμματισμού περιλαμβάνει 72

73 ενδιάμεσες κυτταρικές καταστάσεις. Για παράδειγμα, κλώνοι με ανθεκτικότητα σε φάρμακα εμφανίζονται σε καλλιέργεια κυττάρων με γονίδιο νεομυκίνης στους γενετικούς τόπους OCT4 και Nanog 3-6 μέρες μετά την είσοδο των ιών-φορέων [42, 52, 70], ενώ ο δείκτης GFP στους ίδιους γενετικούς τόπους είναι ανιχνεύσιμος μετά από εβδομάδες [71]. Εικόνα 39). Αυτή η ανακολουθία, όσο αφορά το χρόνο εμφάνισης της αντίστασης στη νεομυκίνη και την ανίχνευση της πρωτείνης, πιθανό να εξηγείται από ότι αρχικά υπάρχει μια μικρή μόνο έκφραση των συγκεκριμένων γενετικών τόπων. Είναι αρκετή όμως, να μετατρέψει τα μερικώς επαναπρογραμματισμένα κύτταρα σε ανθεκτικά στη νεομυκίνη, αλλά κάτω από το επίπεδο που απαιτείται για να γίνει ορατός ο δείκτης GFP και να διατηρηθεί η πολυδυναμία. 2) Η κατάσταση της πολυδυναμίας είναι επικρατής στο υβρίδιο που δημιουργείται από τη σύντηξη ενός σωματικού και ενός πολυδύναμου κυττάρου. 3) Πολλαπλοί κύκλοι διπλασιασμού του DNA και κυτταρικών διαιρέσεων απαιτούνται για να ολοκληρωθεί η διαδικασία του επαναπρογραμματισμού 4) Η de novo μεθυλίωση και απομεθυλίωση του DNA είναι πιθανό να είναι σημαντική για την διαδικασία του επαναπρογραμμτισμού και την διατήρηση της πολυδυναμίας 5) Τα ογκογονίδια c-myc και Klf4, αν και μη απαραίτητα για την ολοκλήρωση του επαναπρογραμματισμού, φαίνεται ότι επιταχύνουν την διαδικασία και βελτιώνουν την αποτελεσματικότητά της 6) Οι πρωτείνες Polycomb και οι τροποποιήσεις των ιστονών, διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην καταστολή των ρυθμιστών της ανάπτυξης των εμβρυϊκών stem κυττάρων και χρειάζεται να εκφραστούν ξανά κατά τη διάρκεια του επαναπρογραμματισμού. Η παρατήρηση ότι η πολυδυναμία είναι η επικρατούσα κατάσταση στα υβρίδια που σχηματίζονται, συμφωνεί με την άποψη ότι οι μεταγραφικοί παράγοντες ενός εμβρυικού stem κυττάρου, όταν είναι παρόντες, θα προκαλέσουν μια κατάσταση πολυδυναμίας μέσω της καταστολής γονιδίων που επάγουν την διαφοροποίηση. OCT4, Nanog και ο SOX2 προάγουν την κατάσταση πολυδυναμίας, εν μέρει τουλάχιστον, συνδεόμενοι και καταστέλλοντας την έκφραση διάφορων ρυθμιστικών παραγόντων της ανάπτυξης και καταστέλλοντας πιο διαφοροποιημένες καταστάσεις. Επίσης, αυτοί οι παράγοντες της πολυδυναμίας φαίνεται να συμμετέχουν, άμεσα ή έμμεσα, στη στρατολόγηση των πρωτεινών Polycomb, οι οποίες διαχέονται και συνδέονται σε μεγάλο βαθμό με αναπτυξιακά γονίδια στα εμβρυικά stem κύτταρα, καταστέλλοντας την έκφρασή τους. Οι αλλαγές στην χρωματίνη που παρατηρούνται κατά τη διάρκεια του επαναπρογραμματισμού, φαίνεται να συμβαίνουν προοδευτικά σε μια μεγάλη χρονική περίοδο, και δεν προκύπτουν ομοιογενώς σε όλα τα κύτταρα στα οποία μεταφέρονται οι μεταγραφικοί παράγοντες της πολυδυναμίας. Πολλαπλοί κύκλοι διπλασιασμού του DNA 73

74 καθώς και κυτταρικές διαιρέσεις χρειάζονται για την ολοκλήρωση του επαναπρογραμματισμού, πιθανόν επειδή η καταστολή μέσω της δομής ετεροχρωματίνης που παρατηρείται στον υποκινητή του OCT4 πρέπει να αντιστραφεί.. Επίσης, ο διασυνδεόμενος αυτορυθμιστικός βρόγχος που δημιουργείται από τους παράγοντες OCT4, Nanog και SOX2 πρέπει να εδραιωθεί (Εικόνα 39C). Στα σωματικά κύτταρα, το γονίδιο OCT4 είναι υπερμεθυλιωμένο και καταλαμβάνεται από νουκλεοσώματα με τη μεθυλιωμένη ιστόνη H3K9 [71]. Στα ips κύτταρα φαίνεται ότι η μεθυλίωση στους υποκινητές των παραγόντων της πολυδυναμίας καθώς και των ιστονών H3K9 σε αυτούς τους υποδοχείς έχει χαθεί [72] (Εικόνα 39Β). Η έκτοπη έκφραση των παραγόντων OCT4 και SOX2 μπορεί να οδηγήσει στην ενεργοποίηση των ενδογενών γονιδιακών τόπων, όταν κατά τη διάρκεια του διαπλασιασμού, ένα ή περισσότερα αλλήλια του OCT4 υποκινητή αποτυγχάνει να μεθυλιωθεί σε CpG και οργανώνονται σε νουκλεοσώματα χωρίς κατασταλτικές τροποποιήσεις. Παρόμοια γεγονότα μπορούν να οδηγούν σε ενεργοποίηση γονιδίων άλλων ενδογενών παραγόντων της πολυδυναμίας, και όταν τα επίπεδα των ενδογενών πρωτεϊνών OCT4, Nanog και SOX2 είναι πλέον κατάλληλα για την δημιουργία του αυτορυθμιστικού βρόγχου, τότε οι ενδογενείς παράγοντες μπορούν πλέον να συντηρήσουν την ενεργοποιημένη κατάσταση των δικών τους γονιδίων. 74

75 Εικόνα 39 Μοντέλο διαδοχικών σταδίων στον επαναπρογραμματισμό σωματικών κυττάρων. Α) Διαδοχικές αλλαγές στομ φαινότυπο και ενεργοποίηση των Oct4, Nanog και Sox2. Οι ινοβλάστες δεν εκφράζουν Oct4 ή Nanog. Μετά την εισαγωγή των μεταγραφικών παραγόντων Oct4, Sox2, c Myc και Klf4 οι ινοβλάστες αποκτούν διαφορετικό φαινότυπο. Τα ενδογενή γονίδια Oct4 ή Nanog εκφράζονται πλέον σε χαμηλά επίπεδα, που είναι αρκετά ώστε τα κύτταρα που φέρουν το γονίδιο ανθεκτικότητας στο αντιβιοτικό νεομυκίνη συνδεμένο με κάποιον από τους δύο γενετικούς τόπους, να εμφανίζουν αντοχή στο αντιβιοτικό. Τα χαμηλά επίπεδα έκφρασης δεν επιτρέπουν όμως την ανίχνευση της πρωτεΐνης GFP. Β)Διαδοχικές αλλαγές ιστονών και τροποποιήσεις του DNA. Στους ινοβλάστες οι υποκινητές των μεταγραφικών παραγόντων Oct4, Nanog και Sox2 είναι μεθυλιωμένοι, ενώ επίσης είναι τριμεθυλιωμένη η ιστόνη H3 στο κατάλοιπο λυσίνης K9 (H3K9me3). Στη διάρκεια του επαναπρογραμματισμού, τα επιγενετικά σημάδια H3K9me3 που σχετίζονται με καταστολή της έκφρασης μπορεί να αντικατασταθούν σταδιακά από τις επιγενετικές τροποποιήσεις H3K4me3 που σχετίζονται με ενεργό γονιδιακή έκφραση ενώ συχρόνως οι νησίδες CpG (κυτοσίνη φωσφογουανίνη) σταδιακά απο μεθυλιώνονται. Αυτή η παροδική επιγενετική κατάσταση πιθανόν να επιτρέπει ένα επίπεδο έκφρασης που να είναι αρκετό για την εμφάνιση αντοχής στο αντιβιοτικό, όχι όμως και για την ανίχνευση του δείκτη GFP. Επιπρόσθετες επιγενετικές τροποποιήσεις αλλάζουν την διαμόρφωση των ιστονών και τη μεθυλίωση του DNA έτσι ώστε να επιτρέπεται η πλήρης έκφραση αυτών των γονιδίων και να καθίσταται δυνατή η ανίχνευση της πρωτεΐνης GFP. C) Moριακό κύκλωμα κατά τον αναπρογραμματισμό. Οι μεταγραφικοί παράγοντες που εισάγονται στο κύτταρο μπορούν να διαντιδράσουν με τα ενδογενή γονίδια της πολυδυναμίας τα οποία 75

76 κωδικοποιούν τους παράγοντες Oct4, Nanog και Sox2 μπορούν σταδιακά να ενεργοποιήσουν τον ενδογενή αυτο ρυθμιστικό μηχανισμό που διατηρεί φυσιολογική τη γονιδιακή έκφραση. Στη διάρκεια του επαναπρογραμματισμού ενεργοποιούνται οι de novo μεθυλοτρανσφεράσες Dnmt3a και Dnmt3b, οι οποίες με τη σειρά τους μεθυλιώνουν και προκαλούν σίγαση στους εν λόγω μεταγραφικούς παράγοντες. Η κατάσταση πολυδυναμίας ρυθμίζεται από την αυτο ρυθμιζόμενη έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων Oct4, Nanog και Sox2 [64]. Ενώ υπάρχουν αρκετές γνώσεις για τον ρόλο των OCT4 και SOX2 στον έλεγχο του μεταγραφικού κυκλώματος στα εμβρυϊκά stem κύτταρα και το πώς συμβάλλουν στην πολυδυναμία, δεν συμβαίνει το ίδιο και για τους μεταγραφικούς παράγοντες c-myc και Klf4. Μία πιθανότητα είναι ότι αυτοί οι μεταγραφικοί παράγοντες συμβάλλουν από κοινού στην μετατροπή του κυττάρου σε μια καρκινική κατάσταση, αποδίδοντας στους ινοβλάστες τις ιδιότητες ενός πολυδύναμου stem κυττάρου [7]. Ένα άλλο μοντέλο προτείνει ότι ο παράγοντας c-myc τροποποιεί την χρωματίνη διευκολύνοντας έτσι την πρόσβαση των παραγόντων επαναπρογραμματισμού στα αρμόδια γονίδια επιταχύνοντας την όλη διαδικασία [7]. Όταν εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα, η πρωτείνη c-myc συνδέεται με ένα μεγάλο αριθμό γονιδίων και μπορεί να προκαλέσει τροποποιήσεις ιστονών που διευκολύνουν την πρόσβαση στους μεταγραφικούς παράγοντες [73, 74]. Αυτή η υπόθεση συμφωνεί με την παρατήρηση ότι ο επαναπρογραμματισμός μπορεί να ολοκληρωθεί παρά την απουσία των παραγόντων c- Myc και Klf4, αλλά με πολύ μικρότερη αποδοτικότητα. Η συμμετοχή του Klf4 στον επαναπρογραμματισμό, μπορεί να περιλαμβάνει την ρύθμιση των ειδικών για τα εμβρυικά stem κύτταρα γονιδίων, και να είναι έτσι ανεξάρτητη από την ογκογόνο δυναμική του. Οι παράγοντες OCT4 και SOX2 συνδέονται σε αλληλεπικαλυπτόμενα σημεία του υποκινητή Lefty-1, ενός ειδικού για εμβρυικά stem κύτταρα γονιδίου, αλλά δεν είναι αρκετά για την πλήρη ενεργοποίηση της μεταγραφής του στα σωματικά κύτταρα [75]. Η προσθήκη του Klf4 προκαλεί την μεταγραφή του Lefty1 στα σωματικά κύτταρα, υποθέτοντας ότι ο Klf4 μπορεί να βοηθήσει τους παράγοντες OCT4 και Sox2 στην έναρξη της έκφρασης σημαντικών γονιδίων πολυδυναμίας στα σωματικά κύτταρα. Επομένως, φαίνεται ότι ο επαναπροπρογραμματισμός των σωματικών κυττάρων είναι δυνατόν να πραγματοποιηθεί χωρίς τους παράγοντες c-myc και Klf4, αλλά με μικρότερη αποτελεσματικότητα [35, 42]. Η παραδοχή αυτή είναι σύμφωνη με την παρατήρηση ότι τα ογκογονίδια αυτά δεν είναι απαραίτητα για τον αναπρογραμματισμό και ότι μπορεί απλώς να 76

77 διευκολύνουν τις επιγενετικές τροποποιήσεις και την ενεργοποίηση των απαραίτητων ενδογενών γονιδίων όπως το OCT4 και Sox2, τα οποία με τη σειρά τους δημιουργούν τον αυτορυθμιστικό βρόγχο που συντηρεί την κατάσταση πολυδυναμίας (Εικόνα 39C). Επειδή όμως η υπερέκφραση του OCT4 μπορεί να υπερκεράσει την ανάγκη για τον Sox2, είναι πιθανόν ότι μόνο ο Oct4 είναι ο μοναδικός απαραίτητος μεταγραφικός παράγοντας για τον επαναπρογραμματισμό, και ότι οι υπόλοιποι μεταγραφικοί παράγοντες ή σηματοδοτικά μόρια χρησιμεύουν στο να διευκολύνουν την ενεργοποίηση του κυκλώματος πολυδυναμίας. ΣΥΣΤΗΜΙΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ STEM ΚΥΤΤΑΡΩΝ Συστημική Ολιστική προσέγγιση Ένα σύστημα είναι μια ομάδα επί μέρους στοιχείων (υποσυνόλων) τα οποία στο σύνολό τους διαντιδρώντα και αλληλοεξαρτώμενα διαμορφώνουν μια πολυπλοκότερη ενιαία οντότητα. Από την διαντίδραση των επί μέρους υποσυνόλων προκύπτουν νέες ιδιότητες και λειτουργίες που συνιστούν ιδιότητες κλειδιά του συστήματος. Οι νέες αυτές ιδιότητες και λειτουργίες αποκαλούνται αναδυόμενες ιδιότητες (emergent properties). Δεδομένου ότι οι αναδυόμενες ιδιότητες είναι το αποτέλεσμα διαντιδράσεων μεταξύ των επί μέρους υποσυνόλων δεν μπορούν να αποδοθούν σε οποιοδήποτε από αυτά τα υποσύνολα μεμονωμένα, και ως εκ τούτου το σύστημα λέμε ότι είναι ενιαίο και αδιαίρετο (irreducible) [3]. Η λειτουργία και οι ιδιότητες ενός συστήματος είναι αδύνατον να κατανοηθούν στο σύνολό τους από την μελέτη, μεμονωμένα, οποιουδήποτε από τα επί μέρους στοιχεία του. Η κατανόηση των συστημάτων και κυρίως των αναδυομένων ιδιοτήτων τους είναι δυνατή μόνο μέσω της μελέτης του συστήματος ως συνόλου. Η έρευνα με τα stem κύτταρα έχει φέρει στο φως μεγάλες ποσότητες δεδομένων και καινούργιων στοιχείων. Μία πρόκληση για την ερευνητική κοινότητα που ασχολείται με το θέμα αυτό, είναι η απαρτίωση όλων αυτών των δεδομένων σε μια ολοκληρωμένη εικόνα για την φύση, τη λειτουργία και τις ιδιότητες των stem κυττάρων [8]. Αρκετές ερευνητικές ομάδες κινούνται προς αυτή τη κατεύθυνση εφαρμόζοντας τεχνικές συστημικής προσέγγισης 77

78 προκειμένου να γίνει κατανοητή η ρύθμιση της μοίρας του stem κυττάρου, προς ποια κατεύθυνση δηλαδή θα διαφοροποιηθεί. Σε αυτό το πλαίσιο, αντί η έρευνα να εστιάζεται στον ρόλο επιμέρους γονιδίων, πρωτεϊνών ή μονοπατιών, ο στόχος της συστημικής βιολογίας είναι η μελέτη ενός οργανισμού, ως ένα απαρτιωμένο δίκτυο γονιδίων, πρωτεϊνών και βιοχημικών αντιδράσεων που δημιουργούν ζωή. Εν προκειμένω, γίνεται χρήση πειραματικών τεχνικών υψηλής απόδοσης σε συνδυασμό με θεωρητικές μαθηματικές προσεγγίσεις καθώς το μόνο μέσον, που μπορεί να προσφέρει ένα μετρήσιμο πλαίσιο για την απαρτίωση πολυάριθμων διαδικασιών, που επισυμβαίνουν σε πολλά επίπεδα στον χώρο και στον χρόνο, είναι η μοντελοποίηση με μαθηματικά. Τα προβλήματα στην συστημική βιολογία απαιτούν την ανάπτυξη τεχνολογιών μέτρησης και υπολογιστικών εργαλείων, με δι-επιστημονική συμμετοχή [8]. Αναλύοντας την πολυπλοκότητα των stem κυττάρων Η μοριακή βιολογία έχει πλέον εισέλθει στην εποχή των τεχνικών υψηλής απόδοσης. Επομένως είναι πλέον ρουτίνα η χρήση αυτών των τεχνικών στις μελέτες με stem κύτταρα. Αυτές οι τεχνικές περιλαμβάνουν: μικροσυστοιχίες για την μελέτη της έκφρασης γονιδίων σε όλο το γονιδίωμα, ανοσοκαθίζηση υψηλής ανάλυσης χρωματίνης ChIP (highthroughput chromatin immunoprecipitation) όπως το ChIP-on-chip, ChIP-seq (ChIP-sequencing) και ChIP-PET (ChIP-pairedendditag) για την επεξεργασία και ανάλυση των διαντιδράσεων πρωτεϊνών-dna, και φασματομετρία μάζας του πρωτεώματος για την επεξεργασία της δομής των πρωτεϊνών στα διάφορα μοριακά σύμπλοκα καθώς και τις μετα-μεταφραστικές τροποποποιήσεις. Η ανάλυση του πρωτεώματος εμφανίζει αυξημένες τεχνικές δυσκολίες. Μερικές από τις τεχνικές που έχουν αναπτυχθεί αναφέρονται στην εικόνα 40. Ένα συγκριτικό πλεονέκτημα της μελέτης των πρωτεομικών δικτύων, σε σχέση με τα γενωμικά δίκτυα και τη μελέτη των m-rnas, είναι το γεγονός ότι οι πρωτεΐνες μπορούν να ανιχνευθούν σε δείγμα αίματος και άλλα βιολογικά σωματικά υγρά. Αντίθετα, τα αντίστοιχα m-rnas των πρωτεϊνών είναι πιο δύσκολα ανιχνεύσιμα λόγω του μικρότερου χρόνου αποδόμησης και απομάκρυνσής τους από τον οργανισμό. 78

79 Εικόνα 40 Στρατηγικές Συστημικής προσέγγισης για την μελέτη των καρκινικών stem κυττάρων. Μεταξύ αυτών είναι: itraq (Isobaric tagging for relative and absolute quantitation), Glyco peptide capture, SPRI (Antibody microarrays using surface plasmon resonance imagining), DEAL (DNAencoded antibody libraries), ανάλυση δυναμικών παθαβιολογικών δικτύων [76]. Ρυθμιστικά δίκτυα stem κυττάρων. Τα Βιολογικά Δίκτυα περιλαμβάνουν πολλές οντότητες που διαντιδρούν, και περιλαμβάνουν: γονίδια, πρωτεϊνες και μικρά μόρια. Για την δημιουργία ενός βιολογικού ρυθμιστικού δικτύου είναι απαραίτητες δύο ομάδες δεδομένων: η μοριακή συνιστώσα (όπως τα γονίδια, πρωτεΐνες ή mirnas) και οι διαντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα. Στη βιβλιογραφία υπάρχουν αρκετά δεδομένα για το πώς οι πειραματικές τεχνικές υψηλής ανάλυσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη μελέτη των ρυθμιστικών δικτύων. Για παράδειγμα, ο Wang και συν. [77] δημιούργησαν ένα υψηλής ποιότητας δίκτυο διαντιδράσεων πρωτεϊνών-πρωτεϊνών για την πολυδυναμία σε εμβρυϊκά stem κύτταρα ποντικών το οποίο έχει ως πυρήνα τον μεταγραφικό παράγοντα των stem κυττάρων NANOG 79

80 (εικόνα 41). Για την επεξεργασία αυτού του δικτύου χρησιμοποίησαν μια ολιστικήσυστημική προσέγγιση του πρωτεώματος, ενώ οι πρωτεΐνες που διαντιδρούν με φυσική επαφή με τον NANOG και τις NANOG-σχετιζόμενες πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν με φασματομετρία μάζας (AP-MS). Έτσι, προσδιόρισαν ένα σύνθετο δίκτυο που περιλαμβάνει μεταγραφικούς παράγοντες ειδικούς για τα stem κύτταρα, πολλοί από τους οποίους ρυθμίζουν την έκφραση άλλων μελών-συνιστωσών του δικτύου. Αυτό υποδεικνύει ότι ο καθορισμός της μοίρας-κατεύθυνσης του stem κυττάρου είναι πολυπαραγοντικό φαινόμενο και περιλαμβάνει συνδυαστικές διαντιδράσεις ανάμεσα σε μεταγραφικούς παράγοντεςκλειδιά και των γονιδίων που τα κωδικοποιούν. Εικόνα 41α Ρυθμιστικά δίκτυα stem κυττάρου. Σχηματική απεικόνιση που δείχνει τις διαντιδράσεις πρωτεϊνών πρωτεϊνών μεταξύ του NANOG και των NANOG σχετιζόμενων πρωτεϊνών [8]. Παρομοίως, αρκετές ομάδες χρησιμοποίησαν ChIP τεχνικές υψηλής απόδοσης για την αναγνώριση των στόχων των μεταγραφικών παραγόντων του πυρήνα των εμβρυϊκών stem κυττάρων, μεταξύ των οποίων οι NANOG [8], OCT4 [8] και SOX2 [8]. Με τον τρόπο αυτό κατασκεύασαν ρυθμιστικά κυκλώματα του πυρήνα των εμβρυϊκών stem κυττάρων, έχοντας ως κεντρικά μόρια αυτούς τους παράγοντες (εικόνα 41b). 80

81 Εικόνα 41b Ρυθμιστικά δίκτυα stem κυττάρου. Σχηματική απεικόνιση του μεταγραφικού ρυθμιστικού κυκλώματος του stem κυττάρου. Τα δεδομένα για την κατασκευή του προέρχονται από ποικίλα πρόσφατα πειράματα με τεχνικές ανοσοκαθίζησης χρωματίνης (ChIP) υψηλής απόδοσης. Οι παράγοντες που είναι κοινοί και στα δύο δίκτυα απεικονίζονται με κόκκινο χρώμα. Αξίζει να σημειωθεί ότι μεταξύ των δύο δικτύων a και b υπάρχει αλληλοεπικάλυψη σε μεγάλο βαθμό καθώς μοιράζονται αρκετά στοιχεία και μάλιστα τα πιο σημαντικά, υποδεικνύοντας ότι οι μεταγραφικοί παράγοντες του πυρήνα του ρυθμιστικού δικτύου των stem κυττάρων ρυθμίζουν ο ένας την έκφραση του άλλου, με ένα συνδυασμένο τρόπο, που περιλαμβάνει διαντιδράσεις πρωτεϊνώνπρωτεϊνών και πρωτεϊνών DNA [8]. Μια διαφορετική προσέγγιση έγινε πρόσφατα από τoν Muller και συν. [8-εντός] οι οποίοι σε αντίθεση με αυτές τις στοχευμένες πειραματικές μελέτες, χρησιμοποίησαν μια καινούργια υπολογιστική προσέγγιση για την δημιουργία ενός εκτεταμένου ρυθμιστικού δικτύου stem κυττάρων το οποίο και ονόμασαν PluriNet. Παρομοίως, ο Ben MacArthur και συν. [8-εντός] κατασκεύασαν μια βάση δεδομένων με τις διαντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα σε επίπεδο μεταγραφής στα stem κύτταρα, η οποία είναι προσβάσιμη μέσω του διαδικτύου. Σε αυτήν γίνεται μια απαρτίωση των δεδομένων από 12 πρόσφατες σχετικές με το θέμα δημοσιεύσεις [8-εντός], οι οποίες κάνουν αναφορά σε πειράματα με τη χρήση τεχνικών υψηλής ανάλυσης για τους 20 μεταγραφικούς παράγοντες που είναι γνωστό ότι διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση της πορείας του stem 81

82 κυττάρου. Έτσι σε αυτή την βάση δεδομένων, υπάρχουν πιθανές διαντιδράσεις μεταγραφικών παραγόντων-γονιδιώματος, που έχουν ταυτοποιηθεί ειδικά για τα εμβρυϊκά stem κύτταρα. Συμπερασματικά, τα δεδομένα μέχρι σήμερα προτείνουν ότι η κατεύθυνση και διαφοροποίηση του εμβρυϊκού stem κυττάρου ελέγχεται από ένα ρυθμιστικό δίκτυο μεταγραφικών παραγόντων του πυρήνα, το οποίο είναι τμήμα ενός ευρύτερου και πολύπλοκου δυναμικού ρυθμιστικού δικτύου που περιλαμβάνει διαντιδράσεις πρωτεϊνώνπρωτεϊνών, επιπλέον μεταγραφικούς παράγοντες, σηματοδοτικά μονοπάτια, mirnas και άλλες επιγενετικές τροποποιήσεις [8]. Η τοπογραφία του stem κυττάρου Εδώ και 50 χρόνια, ο Waddington παρουσίασε τη θεωρία του, γνωστή πλέον και ως επιγενετική τοπογραφία (epigenetic landscape) ως εννοιολογική αναπτυξιακή προσέγγιση [78]. Σύμφωνα με την αντίληψη του Waddington, η ανάπτυξη μπορεί να προσομοιωθεί με μία μπάλα που κυλάει πάνω σε μια κατηφορική πλαγιά, η οποία περιέχει κοιλάδες και λόφους: καθώς η ανάπτυξη συνεχίζεται τα κύτταρα ακολουθούν διαφορετικά μονοπάτια στην κατηφορική πλαγιά και έτσι υιοθετούν διαφορετικές κατευθύνσεις-πορείες. Η μη ελεγχόμενη διαφοροποίηση δεν προκύπτει επειδή οι λόφοι δρουν ως φραγμοί, χωρίζοντας το τοπίο σε διακριτές κοιλάδες (εικόνα 42). Επομένως, σύμφωνα με αυτή τη προσέγγιση, η διαφοροποίηση δεν είναι τελική, αλλά αντιθέτως διάφοροι κυτταρικοί φαινότυποι διατηρούνται λόγω επιγενετικών φραγμών, οι οποίοι όμως είναι δυνατό να υπερκεραστούν μετά από μια επαρκή διαταραχή της ισορροπίας. Με τα λόγια του Waddington, αυτή η «τοπογραφία προσομοιάζει, με εικονικό τρόπο, την περιγραφή των γενικών ιδιοτήτων ενός πολύπλοκου αναπτυξιακού συστήματος στο οποία η πορεία των γεγονότων ελέγχεται από πολλούς διαφορετικούς μηχανισμούς που διαντιδρούν με τέτοιο τρόπο ώστε να επέρχεται ισορροπία μεταξύ τους». 82

83 Εικόνα 42 Waddington's Classical Epigenetic Landscape. To 1957, ο Conrad Waddington παρουσίασε την αντίληψη της επιγενετικής τοπογραφίας προκειμένου να αναπαραστήσει την διαδικασία με την οποία το κύτταρο επιλέγει κατεύθυνση κατά την ανάπτυξη. Αυτή η εικονική αναπαράσταση έχει δυναμικό χαρακτήρα καθότι το κύτταρο (μπάλα) δύναται να ακολουθήσει διαφορετικές κατευθύνσεις που έχουν διαφορετική κατάληξη, δηλαδή διαφοροποίηση [78]. Στοχαστικότητα και stem κύτταρα Η γονιδιακή έκφραση μπορεί να προσομοιωθεί με μια θορυβώδη διαδικασία [8]. Έτσι λόγω της στοχαστικότητας των μοριακών διαδικασιών, όπως η μεταγραφή και η μετάφραση (ενδογενής θόρυβος) καθώς και η επίδραση του περιβάλλοντος σε αυτές τις διαδικασίες (εξωγενής θόρυβος), τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων και πρωτεϊνών μεταβάλλονται συνεχώς. Επειδή λοιπόν ο μοριακός θόρυβος μπορεί να επηρεάσει την κυτταρική συμπεριφορά, τα κύτταρα έχουν υιοθετήσει μια σειρά από εξειδικευμένους μηχανισμούς ώστε να τον ελέγχουν. Για παράδειγμα, χρησιμοποιούν μοριακούς μηχανισμούς όπως το 26S πρωτεόσωμα ώστε να αποδομούνται πρώιμα μετάγραφα και να μειώνεται ο θόρυβος [8- εντός]. Επιπλέον, τα κύτταρα αξιοποιούν επιγενετικούς μηχανισμούς, όπως η οικογένεια των Polycomb group πρωτεϊνών (PcG) που είναι καταστολείς της μεταγραφής μέσω απόσιώπησης της χρωματίνης, περιορίζοντας την μεταγραφική ενεργοποίηση των αναπτυξιακών γονιδίων [79]. Χρησιμοποιούν ακόμα και αυτορυθμιστικά κυκλώματα με μηχανισμούς αρνητικής ανάδρασης προκειμένου να ελεγχθούν τα επίπεδα του θορύβου. 83

84 Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η αναφερθείσα μελέτη του Chambers και συν. [38] όπου και αποδείχθηκε με τεχνικές ανοσοϊστοχημείας και κυτταρομετρίας ότι τα επίπεδα του NANOG στα εμβρυϊκά stem κύτταρα είναι συνεχώς μεταβαλλόμενη με στοχαστικό τρόπο. Το συμπέρασμα φαίνεται να είναι ότι στο χρονικό παράθυρο που τα επίπεδα του NANOG είναι χαμηλά το εμβρυϊκό stem κύτταρο δύναται να χάσει την πολυδυναμία που το χαρακτηρίζει. ΟΜΟΙΟΣΤΑΣΗ ΤΟΥ ΔΕΡΜΑΤΟΣ: ΜΙΑ ΠΡΑΞΗ ΙΣΟΡΡΟΠΙΑΣ ΤΩΝ STEM ΚΥΤΤΑΡΩΝ Ομοιόσταση ονομάζεται η φυσιολογική διαδικασία με την οποία διατηρείται ένας συνεχής σταθερός αριθμός κυττάρων στα αναγεννώμενα όργανα. Τα stem κύτταρα είναι υπεύθυνα για την διατήρηση της ομοιόστασης και αναγέννησης των ιστών. Πιο συγκεκριμένα η ομοιόσταση στο δέρμα πραγματοποιείται χάρη στα stem κύτταρα της επιδερμίδας, τα οποία αντικαθιστούν τα κερατινοκύτταρα που χάνονται είτε λόγω φυσιολογικής κυτταρικής διαφοροποίησης και ανανέωσης της επιδερμίδας, είτε λόγω κυτταρικού θανάτου μετά από ιστική βλάβη. Εικόνα 43 Διαφοροποίηση της επιδερμίδας. Δεξιά απεικονίζονται τα μόρια κλειδιά για κάθε στιβάδα [17]. 84

85 Η ΟΜΟΙΟΣΤΑΣΗ ΤΟΥ ΔΕΡΜΑΤΟΣ ΣΤΟΝ ΕΝΗΛΙΚΑ Όντας ώριμη, η επιδερμίδα υφίσταται ρύθμιση της ομοιόστασης της καθώς τα κύτταρα της βασικής στιβάδας ολοκληρώνουν το πρόγραμμα τους προς τελική διαφοροποίηση και κινούνται προς την επιφάνεια [14]. Η μετάπτωση των κυττάρων από τη βασική στην ακανθωτή στιβάδα αποτελεί κομβικό σημείο στο πρόγραμμα της κυτταρικής διαφοροποίησης. Καθώς τα κύτταρα εισέρχονται στην ακανθωτή στιβάδα, σταματά η έκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν την κερατίνη 5 (γνωστή και ως KRT5) και την KRT14. Αυτές οι πρωτεΐνες των άφθονων ενδιάμεσων ινιδίων χαρακτηρίζουν τα στωματοποιημένα επιθηλιακά κύτταρα τα οποία κατέχουν δυναμικό πολλαπλασιασμού. Σαν φυσικό επακόλουθο, τα κύτταρα της ακανθωτής στιβάδας ενεργοποιούν τα γονίδια των πρωτεϊνών KRT1 και KRT10 ώστε να σχηματιστεί ένα ακόμα πιο ισχυρό δίκτυο ινιδίων που διασυνδέεται με τα δεσμοσώματα. Έτσι, ο αναπτυσσόμενος κυτταροσκελετός ενισχύει τις διακυτταρικές συνδέσεις και παρέχει αντοχή στο μηχανικό stress που αναπτύσσεται στην επιφάνεια του δέρματος. Σήματα που ρυθμίζουν την διαφοροποίηση του δέρματος Ενώ οι μορφογενετικές αλλαγές που σχετίζονται με την κερατινοποίηση είναι καλά μελετημένες, οι μοριακοί μηχανισμοί όμως που ελέγχουν την διαφοροποίηση του δέρματος παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Πειράματα γενετικής σε επίμυες έδειξαν πολλαπλά σηματοδοτικά μονοπάτια που είναι σημαντικά για την σωστή στρωματοποίηση της επιδερμίδας αλλά και για την λειτουργικότητα της. Αυτά τα μονοπάτια περιλαμβάνουν τις πρωτεΐνες Notch, MAPK, NF-kB και τους μεταγραφικούς ρυθμιστές p63 (που συνδέεται με το p53), την οικογένεια AP2 και τις πρωτεΐνες C/EBP, IRF6, GRHl3 και KlF4 [14]. Σημείο-κλειδί στην περαιτέρω πορεία των κυττάρων είναι η μετάπτωση από την βασική στην ακανθωτή στιβάδα, η οποία και ελέγχεται από το μόριο P63 και το κανονικό σηματοδοτικό μονοπάτι Notch. Σε ποντίκια με απουσία του p63, η επιδερμίδα αποτυγχάνει να στρωματοποιηθεί και μόνο λίγα μερικώς διαφοροποιημένα κύτταρα παραμένουν προσκολλημένα στην επιφάνεια του αναπτυσσόμενου εμβρύου. Λειτουργικές μελέτες σε σπονδυλωτά έδειξαν ότι το p63 είναι απαραίτητο για την έναρξη του προγράμματος σχηματισμού και στρωματοποίησης του δέρματος και για την διατήρηση του αναγεννητικού 85

86 δυναμικού των διαφορετικών επιθηλιακών stem κυττάρων [14-εντός]. Το κανονικό μονοπάτι του μεταγραφικού παράγοντα Notch είναι επίσης κρίσιμο κατά τα πρώτα στάδια της δέσμευσης των κυττάρων της βασικής προς την ακανθωτή στιβάδα. Η διαφοροποίηση προς την ακανθωτή στιβάδα αναστέλλεται εντελώς με την απάλειψη της RBPJ, μια πρωτεΐνης που συνδέεται με το DNA και σχηματίζει ετεροδιμερή με τον μεταγρφικό παράγοντα Notch μεταβιβάζοντας το σήμα προς τον πυρήνα. Η διαφοροποίηση αυτή, τροποποιείται επίσης και με την απώλεια του Hes1, που είναι ένα από τα βασικά γονίδια-στόχους του Notch στην επιδερμίδ. Αντίθετα, η υπερβολική σηματοδότηση Notch μετατρέπει τα κύτταρα της βασικής σε κύτταρα της ακανθωτής στιβάδας. Η Notch σηματοδότηση φαίνεται να δρα εν μέρει με τροποποίηση της έκφρασης των πρωτεϊνών C/EBP, οι οποίες δρουν συνδυαστικά με τους μεταγραφικούς παράγοντες της οικογένειας AP2 για να ρυθμίσουν δέσμευση προς τελική κυτταρική διαφοροποίηση. Η συμμετοχή των mirnas παρέχει ένα επιπλέον επίπεδο πολυπλοκότητας σε αυτά τα ρυθμιστικά μεταγραφικά δίκτυα [14-εντός]. Το mir-203 είναι ένα συντηρημένο και άφθονο mirna με σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση δικτύου των μεταγραφικών παραγόντων που υποχρεώνει το stem κύτταρο της βασικής στιβάδας προς τελική διαφοροποίηση. Η πρόωρη έκφραση του mir-203 στα κύτταρα της βασικής στιβάδας προκαλεί την πρόωρη διαφοροποίησή τους και μειώνει το αναπτυξιακό δυναμικό τους. Σε απουσία ή μειωμένα επίπεδα του mir-203 ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός δεν περιορίζεται πλέον στη βασική στιβάδα. Έχει ενδιαφέρον ότι ένας από τους στόχους του mir-203 είναι το mrna p63, η μετάφραση του οποίου αυξάνει στα κύτταρα πάνω από τη βασική στιβάδα όταν το mir-203 απουσιάζει, και καταστέλλεται όταν αυτό εκφράζεται πρόωρα. Αυτές οι μελέτες προτείνουν ότι το mir-203 λειτουργεί εν μέρει εμποδίζοντας την έκφραση βασικών γονιδίων-στόχων στα κύτταρα πάνω από τη βασική στιβάδα και εντείνοντας επίσης την δέσμευση προς διαφοροποίηση. Επιπρόσθετα των mirnas, οι τροποποιήσεις των ιστονών αποτελούν επιγενετικές τροποποιήσεις για κυτταρική διαφοροποίηση στην επιδερμίδα [14]. Στην επιδερμίδα, το μόριο MYC είναι απαραίτητο για την αποκόλληση των stem κυττάρων από την φωλεά τους και για τον επακόλουθο πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση. Το MYC πιθανόν να ρυθμίζει την μετάπτωση από τα αδρανή stem κύτταρα στα πιο δεσμευμένα για συγκεκριμένη διαφοροποίηση κύτταρα TACs, επάγοντας τροποιήσεις ιστονών που τυπικά σχετίζονται με ενεργή μορφή της χρωματίνης. Σε μια άλλη μελέτη, η απομάκρυνση μέσω ενζυμικής δράσης ενός άλλου δείκτη αποσιώπησης της χρωματίνης, της τρι-μεθυλιωμένης lys-27 της ιστόνης H3, σχετίστηκε με μετάπτωση των κυττάρων της βασικής στιβάδας της επιδερμίδας από 86

87 πολλαπλασιασμό σε διαφοροποίηση [14-εντός]. Η υπερέκφραση του συγκεκριμένου ενζύμου που απομεθυλιώνει ιστόνες προκάλεσε την πρόωρη ενεργοποίηση του προγράμματος τελικής διαφοροποίησης σε ανθρώπινα κύτταρα της επιδερμίδας σε καλλιέργειες, ενώ η αναστολή του οδήγησε σε καταστολή της διαφοροποίησης. Aσύμμετρη κυτταρική διαίρεση στο δέρμα Ένα σημαντικό θέμα στην ομοιόσταση του δέρματος, σε μια ασύμμετρη κυτταρική διαίρεση που πραγματοποιείται παράλληλα τοπογραφικά με τη βασική μεμβράνη, είναι το ερώτημα εάν το δεσμευμένο θυγατρικό κύτταρο που προκύπτει είναι TAC (Transit Amplifying Cell) ή τελικώς διαφοροποιημένο. Τα κύτταρα TAC υφίστανται μερικές κυτταρικές διαιρέσεις ακόμα πριν διαφοροποιηθούν. Διάφορες μελέτες οδήγησαν στη διατύπωση δύο διαφορετικών μοντέλων, δύο και τριών βημάτων αντίστοιχα όπως φαίνεται και στην εικόνα 44 [15]. Παρόλα αυτά περαιτέρω έρευνα απαιτείται για την πλήρη διαλεύκανση του θέματος. Εικόνα 44 Μοντέλα δημιουργίας της βασικής στιβάδας που αποτελείται από ένα μόνο στίχο κυττάρων με έντονη μιτωτική δραστηριότητα καθώς και των υπερκείμενων στιβάδων της επιδερμίδας. Η αυτο ανανέωση των stem κυττάρων πραγματοποιείται στη βασική στιβάδα της επιδερμίδας. Οι συμμετρικές διαιρέσεις παράγουν δύο stem κύτταρα και επομένως αυτή η διαδικασία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να αναπληρωθούν οι απώλειες στη βασική στιβάδα. Στο μοντέλο τριών βημάτων, προκύπτει ένα κύτταρο TAC, το οποίο υπολογίζεται ότι διαιρείται 4 με 5 φορές πριν διαφοροποιηθεί σε τελικό στάδιο. Στο μοντέλο δύο βημάτων το stem κύτταρο διαιρείται ασύμμετρα με τρόπο που να κατανέμονται οι παράγοντες που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό στο θυγατρικό κύτταρο που προορίζεται για stem κύτταρο ενώ οι παράγοντες που σχετίζονται με 87

88 διαφοροποίηση στο θυγατρικό κύτταρο που προορίζεται για κύτταρο της ακανθωτής στιβάδας. Ανάλογα με τον προσανατολισμό του άξονα, οι διαιρέσεις μπορούν να πραγματοποιηθούν με τρόπο που το θυγατρικό κύτταρο να αποκολλάται από τη βασική στιβάδα και να μετατρέπεται σε κύτταρο της ακανθωτής στιβάδας, ή διαφορετικά να πραγματοποιείται πλάγια κάτι το οποίο απαιτεί την περαιτέρω απομάκρυνση από τον βασικό υμένα του θυγατρικού κυττάρου που δεσμεύεται για διαφοροποίηση προς κύτταρο της ακανθωτής στπιβάδας. Τα κύτταρα της ακανθωτής στιβάδας εισέρχονται σε πρόγραμμα τελικής διαφοροποίησης καθώς κινούνται προς τα εξωτερικά στρώματα της επιδερμίδας μέχρι την αποβολή τους από την επιφάνεια του δέρματος [17]. Εικόνα 45 Ασύμμετρη διαίρεση stem κυττάρων κατά την διάρκεια της ανάπτυξης και της ομοιόστασης. a) Στα αρχικά στάδια της εμβρυικής ανάπτυξης του δέρματος, οι περισσότερες κυτταρικές διαιρέσεις είναι συμμετρικές και παράλληλες στη βασική μεμβράνη (BM), το οποίο διασφαλίζει την ανάπτυξη της επιφάνειας του αναπτυσσόμενου εμβρύου και διατηρεί το επιθήλιο μονόστοιβο. b) Στη φάση σχηματισμού της επιδερμίδας, το 70% των κυτταρικών διαιρέσεων γίνονται ασύμμετρες, έτσι ώστε η μιτωτική άτρακτος να είναι κάθετη στη βασική μεμβράνη. Αυτό επιτρέπει την ανάπτυξη υπερκείμενων κυττάρων της βασικής στιβάδας τα οποία διαφοροποιούνται τελικώς και σχηματίζουν τον φραγμό του δέρματος. Σε αυτό τον τρόπο ασύμμετρης κυτταρικής διαίρεσης, η διανομή διάφορων μορίων που ρυθμίζουν την περαιτέρω πορεία των κυττάρων γίνεται ασύμμετρα μεταξύ των θυγατρικών κυττάρων. Η βασική στιβάδα διαχωρίζει τις ιντεγρίνες και τους υποδοχείς αυξητικών παραγόντων (GFRs), τα οποία παρέχουν σήματα επιβίωσης και πολλαπλασιασμού στα stem κύτταρα. c) Κατά την ομοιόστασης της επιδερμίδας σε ενήλικα, οι ασύμμετρες κυτταρικές διαιρέσεις πραγματοποιούνται σε παράλληλο επίπεδο με τη βασική μεμβράνη, έτσι ώστε μόνο ένα από τα θυγατρικά κύτταρα να κληρονομεί μόρια που καθορίζουν τη μοίρα του κυττάρου όπως το 88

89 Numb και παραμένει σε κατάσταση stem κυττάρου, ενώ το άλλο θυγατρικό κύτταρο δεσμεύεται για συγκεκριμένη διαφοροποίηση d) Παραδείγματα ασύμμετρων διαιρέσεων και προσανατολισμού της μιτωτικής ατρακτού σε επιθήλιο της στοματικής κοιλότητας και σε τριχοθυλάκιο. Με κόκκινο χρώμα απεικονίζονται οι πυρήνες και με πράσινο οι μικροσωληνίσκοι [14]. Τα πολλαπλά είδη stem κυττάρων διασφαλίζουν την ομοιόσταση του δέρματος Έχουν αναγνωρισθεί πειραματικά τρεις πληθυσμοί stem κυττάρων στο δέρμα, όπως φαίνεται και στην εικόνα 46. Αυτοί είναι: 1. Stem κύτταρα μεταξύ των τριχοθυλακίων της επιδερμίδας (interfollicular epidermal stem cells). 2. Stem κύτταρα των σμηγματογόνων αδένων (sebocyte stem cells). 3. Stem κύτταρα των τριχοθυλακίων στην περιοχή bulge (hair follicle bulge stem cells). Στην εικόνα 46 απεικονίζονται δεξιά οι πιθανοί δείκτες για την ταυτοποίηση των επιμέρους τύπων των stem κυττάρων στο δέρμα. 89

90 Εικόνα 46 Οργάνωση των stem κυττάρων στο δέρμα. 1) Η επιδερμίδα περιέχει ένα πληθυσμό stem κυττάρων στη βασική στιβάδα. Σε πειραματικά μοντέλα όπου υπάρχει ένα μικρός αριθμός stem κυττάρων και ένας μεγάλος αριθμός TACs (κόκκινα) στη βασική στιβάδα, τα stem κύτταρα διαφοροποιούνται με απομάκρυνση από τον βασικό υμένα και κίνηση προς τα πάνω σχηματίζοντας την ακανθωτή, κοκκιώδη και κεράτινη στιβάδα. Πρόσφατα δεδομένα υποστηρίζουν ότι λόγω της ικανότητάς τους να υφίστανται ασύμμετρη κυτταρική διαίρεση, τα περισσότερα, αν όχι όλα τα κύτταρα της βασικής στιβάδας, έχουν την ικανότητα για αυτο ανανέωση και διαφοροποίηση. 2) Ο σμηγματογόνος αδένας περιέχει ένα μικρό αριθμό προγονικών κυττάρων που εκφράζουν τον μεταγραφικό αναστολέα Blimp1 και υπάρχουν κοντά ή ακριβώς στη βάση του αδένα. Αυτά τα προγονικά κύτταρα παράγουν απογόνους που διαφοροποιούνται προς κύτταρα του σμηγματογόνου αδένα. 3) Τα stem κύτταρα του τριχοθυλακίου παρατηρούνται στη περιοχή bulge κάτω από τον σμηγματογόνο αδένα. Χαρακτηρίζονται από χαμηλό ρυθμό ανανέωσης και εκφράζουν τους κυτταροπλασματικούς δείκτες CD34 και VdR, όπως και τους μεταγραφικούς παράγοντες TCF3, SOX9, Lhx2 και NFATC1. Τα κύτταρα της περιοχής bulge σχηματίζουν το εξωτερικό έλυτρο της τρίχας, από όπου πιστεύεται ότι προέρχονται και τα υψηλού δυναμικού για πολλαπλασιασμό κύτταρα του matrix που γειτνιάζουν με τη δερματική θηλή. Μετά από ταχύ πολλαπλασιαμό, τα κύτταρα του matrix διαφοροποιούνται προκειμένου να σχηματιστούν το εσωτερικό έλυτρο της τρίχας και το στέλεχος της τρίχας [15]. 90

91 Οι μάχες της περιοχής bulge Το τριχωτό δέρμα των θηλαστικών μπορεί να χωριστεί σε επιμέρους τριχοσμηγματογόνες μονάδες και την επιδερμίδα μεταξύ των τριχοθυλακίων IFE που τις περιβάλλει. Τα δύο τρίτα της τριχοσμηγματογόνου μονάδας υφίσταται κυκλικές εναλλαγές εκφύλισης (καταγενής φάση), ανάπαυσης (τελογενής φάση) και ανάπτυξης (αναγενής φάση) που στο σύνολό τους ονομάζονται κύκλος της τρίχας. Τα bulge stem κύτταρα βρίσκονται στη βάση ή κοντά στη βάση του μη ανακυκλώμενου τμήματος του τριχοθυλακίου. Είναι υπεύθυνα για την δημιουργία και συντήρηση του ανανεούμενου τμήματος του τριχοθυλακίου κατά την αναγενή φάση του κύκλου της τρίχας. Στη φάση αυτή δηλαδή, τα stem κύτταρα του τριχοθυλακίου τροφοδοτούν τα TACs κύτταρα του matrix τα οποία διαιρούνται ταχέως στον βολβό της τρίχας και μετά μετατρέπονται σε τελικώς διαφοροποιημένα προκειμένου να σχηματιστεί τόσο το στέλεχος της τρίχας όσο και το εσωτερικό έλυτρό της. Εικόνα 47 Διαφορετικές φωλεές stem κυττάρων διασφαλίζουν την ομοιόσταση της επιδερμίδας. a) Στη διάρκεια της τελογενούς φάσης, τα stem κύτταρα της bulge περιοχής επισημαίνονται ειδικά με β γαλακτοσιδάση (LacZ, μπλε). Όταν τα τριχοθυλάκια υφίστανται ανανέωση, όλα τα κύτταρα των νεοσχηματισμένων τριχοθυλακίων είναι σημασμένα, αποδεικνύοντας με αυτό τον τρόπο ότι τα bulge stem κύτταρα είναι υπεύθυνα για την φυσιολογική ομοιόσταση του τριχοθυλακίου. Επίσης αυτά τα κύτταρα είναι δυνατόν να συμβάλλουν στο σχηματισμό της IFE (επιδερμίδα μεταξύ των 91

92 τριχοθυλακίων) και του σμηγματογόνου αδένα, αν και αυτό παρατηρείται σπάνια και τις περισσότερες περιπτώσεις τα κύτταρα της IFE έχουν άλλη προέλευση. Αυτό δείχνει ότι η IFE μπορεί να συντηρηθεί ανεξάρτητα από τα bulge stem κύτταρα κατά την ομοιόσταση. Τα bulge stem κύτταρα, τα οποία απεικονίζονται με πράσινο χρώμα, φεύγουν από την φωλεά τους και ενεργά πολλαπλασιάζονται δημιουργώντας κύτταρα τα οποία είναι απαραίτητα για την ανανέωση του τριχοθυλακίου. b) Μετά από τραυματισμό, τα bulge stem κύτταρα ενεργοποιούνται και μεταναστεύουν προς τα πάνω για να επιδιορθώσουν την IFE. c) Σχηματική απεικόνιση της επιδερμίδας με τα διαφορετικούς αυτόχθονους πληθυσμούς stem κυττάρων και προγονικών TACs. Τα bulge stem κύτταρα είναι πολυδύναμα, τοποθετημένα στο μόνιμο τμήμα του τριχοθύλακα. Τα stem κύτταρα μεταξύ των τριχοθυλακίων της επιδερμίδας βρίσκονται στη βασική στιβάδα της επιδερμίδας. Τα αυτόχθονα προγονικά κύτταρα του ισθμού της τρίχας και του σμηγματογόνου αδένα βρίσκονται στο εξωτερικό έλυτρο της τρίχας που είναι πάνω από την περιοχή bulge και κάτω από τον σμηγματογόνο αδένα. Δεν είναι ακόμα γνωστό εάν οι δύο αυτοί τύποι προγονικών κυττάρων είναι ισοδύναμοι [14]. Τα stem κύτταρα του τριχοθυλακίου εντοπίζονται σε ένα εξειδικευμένο μικροπεριβάλλον το οποίο καλείται bulge [14, 16]. Αυτά τα κύτταρα ανανεώνονται με βραδύ ρυθμό, όπως αποδείχθηκε από πειράματα με τη χρήση χρωστικής την οποία συγκρατούν για εβδομάδες [14-εντός]. Αν και σχετικά αδρανή, τα περισσότερα κύτταρα της περιοχής bulge διαιρούνται πολλαπλές φορές κατά την διάρκεια κάθε κύκλου της τρίχας. Τα κύτταρα αυτά φαίνεται να κληρονομούν το νεοσυντεθέμενο DNA στα θυγατρικό κύτταρα με τυχαίο τρόπο, παρατήρηση που έρχεται σε αντίθεση με την θεωρία της «αθάνατης» αλυσίδας DNA για τα stem κύτταρα. Παρουσιάζει ενδιαφέρον, ότι αυτή η φωλεά που ανανεώνεται με αργό ρυθμό και από την οποία αργότερα δημιουργείται η περιοχή bulge, σχηματίζεται πρώιμα κατά την ανάπτυξη του δέρματος. Η συμμετοχή της περιοχής bulge στην διατήρηση της ομοιόστασης του τριχοθυλακίου έχει τεκμηριωθεί με μια σειρά από πειράματα ανίχνευσης κυτταρικών σειρών με χρωστικές, που έγινε σε επίμυες [14-εντός] (εικόνα 48). Χρησιμοποιήθηκαν λοιπόν επίμυες στους οποίους είχε σημανθεί με χρωστική η ιστόνη H2B προκειμένου να αποδειχθεί ότι τα προγονικά κύτταρα του matrix του τριχοθυλακίου προέρχονται από τα κύτταρα της περιοχής bulge, τα οποία και πολλαπλασιάζονται καθώς εξέρχονται από την φωλεά τους. Σε άλλη πειραματική μελέτη χρησιμοποιήθηκαν διαγονιδιακοί επίμυες, που εκφράζουν μετά από επαγωγή το ένζυμο Cre recombinase, ώστε να γίνει η σήμανση της περιοχής του τριχοθυλακίου που περιλαμβάνει συγχρόνως την περιοχή bulge και την δευτερεύουσα hair germ περιοχή. Η 92

93 τελευταία σχηματίζεται από μια μικρή συστοιχία κυττάρων στη βάση της περιοχής bulge, η οποία γειτνιάζει άμεσα με την δερματική θηλή στο στατικό τμήμα του τριχοθυλακίου. Αυτές οι μελέτες λοιπόν, έδειξαν ότι η περιοχή bulge και πιθανόν η hair germ περιοχή έχουν πολυδύναμα stem κύτταρα του τριχοθυλακίου, που έχουν την δυνατότητα να διαφοροποιηθούν προς όλες τις κυτταρικές σειρές που απαρτίζουν την τριχοσμηγματογόνο μονάδα. Πρόσφατα παρόμοιες μελέτες, ιχνηλάτησαν τα προγονικά κύτταρα για αρκετούς μήνες και τεκμηρίωσαν την ικανότητα των κυττάρων της περιοχής bulge να συμβάλλουν μακροπρόθεσμα στην ομοιόσταση του τριχοθυλακίου [14-εντός] Αντίθετα, υπό φυσιολογικές συνθήκες ομοιόστασης, αυτά τα κύτταρα φαίνεται να συμβάλλουν ελάχιστα μόνο, αν όχι καθόλου, στη ομοιόσταση της επιδερμίδας μεταξύ των τριχοθυλακίων IFE. Αυτό υπογραμμίζει την ύπαρξη μιας διαφορετικής δεξαμενής stem κυττάρων στην IFE. Η σπουδαιότητα των κυττάρων της bulge περιοχής στην ανάπτυξη του δέρματος και στην ομοιόσταση έχει αποδειχθεί και με πειράματα εκλεκτικής απάλειψης του γονιδίου που κωδικοποιεί τον μεταγραφικό παράγοντα SOX9 από το δέρμα [14-εντός]. Όταν γίνεται λοιπόν εκλεκτική στόχευση του SOX9 στο αναπτυσσόμενο έμβρυο, χάνεται η έκφραση του επιφανειακού δείκτη CD34 των ώριμων κυττάρων της περιοχής bulge και το τριχοθυλάκιο αποτυγχάνει να ανανεωθεί, υποδεικνύοντας μια ελατωματική λειτουργία των stem κυττάρων. Όταν γίνεται απάλειψη δηλαδή του γονιδίου SOX9 στο έμβρυο, τα κύτταρα της περιοχής bulge αποτυγχάνουν να σχηματιστούν κατά την ανάπτυξη, η μορφογένεση του τριχοθυλακίου διακόπτεται και ο σχηματισμός του σμηγματογόνου αδένα σταματά εντελώς. Όλα αυτά τα δεδομένα αποτελούν αποδείξεις ότι η περιοχή bulge φιλοξενεί stem κύτταρα τα οποία είναι απαραίτητα όχι μόνο για την ομοιόσταση του τριχοθυλακίου αλλά και για τη μορφογένεση και ανάπτυξή του. Ένα από τα βασικά ερωτήματα που εγείρονται είναι το εξής: Ποιο είναι το σημείο της μη επιστροφής, στο οποίο ένα stem κύτταρο του δέρματος δεσμεύεται μη αντιστρεπτά για συγκεκριμένη διαφοροποίηση; Υπάρχουν ενδείξεις ότι τα πρώιμα προγονικά κύτταρα που έχουν φύγει από τη φωλεά τους μπορεί να αποκτήσουν ξανά ιδιότητες stem κυττάρων, τουλάχιστον σε καταστάσεις stress. Αντίθετα τα ταχέως διαιρούμενα TACs του matrix φαίνεται να είναι πιο δεσμευμένα προς τελική διαφοροποίηση. Όπως τεκμηριώνεται από πειράματα ιχνηλάτησης κυττάρων, το δυναμικό για διαφοροποίηση των κυττάρων του matrix οριοθετείται σε εφτά ομόκεντρες ζώνες του ώριμου τριχοθυλακίου με τα αντίστοιχα μονοδύναμα προγονικά κύτταρα [14-εντός]. 93

94 Εικόνα 48 Κατά τη διάρκεια της ομοιόστασης, τα stem κύτταρα της περιοχής bulge περιοδικά ενεργοποιούνται προκειμένου να σχηματιστεί ένα νέο τριχοθυλάκιο. Κατά την αναπτυξιακή φάση του κύκλου της τρίχας γνωστή και ως αναγενή τα προγονικά κύτταρα της bulge περιοχής αποικίζουν το κατώτερο εξωτερικό έλυτρο της τρίχας προς το matrix, έναν εξειδικευμένο πληθυσμό TAC κυττάρων με μεγάλο αναπτυξιακό δυναμικό που είναι υπεύθυνα για τον σχηματισμό της νέας τρίχας. Σε συνθήκες τραυματισμού, όπου η επιδερμίδα μεταξύ των τριχοθυλακίων IFE ή τα stem κύτταρα του σμηγματογόνου αδένα υφίστανται βλάβη, τα stem κύτταρα της bulge περιοχής του τριχοθυλακίου κινητοποιούνται, μεταναστεύουν και διαφοροποιούνται προς αυτές τις κυτταρικές σειρές. Τα προγονικά bulge κύτταρα μετακινούνται κατά μήκος του εξωτερικού ελύτρου προς τη βάση της τρίχας. Στη συνέχεια μεταπίπτουν σε matrix κύτταρα, τα οποία μετά τον πολλαπλασιασμό διαφοροποιούνται σε μία από τις 7 κυτταρικές σειρές της τρίχας όπως φαίνεται και στην εικόνα. Η στενή επαφή με τη δερματική θηλή είναι αναγκαία προκειμένου να διατηρηθεί το υψηλό δυναμικό για πολλαπλασιασμό του matrix και κατευθύνει επίσης την διαφοροποίηση. Πρόσφατα πειράματα με ανίχνευση της πορείας των κυττάρων, έδειξαν, ότι στο μέσο της μορφογένεσης του τριχοθυλακίου, αφού έχει σχηματισθεί η αρχική περιοχή bulge, τα προγονικά του κύτταρα σταδιακά αντικαθιστούν το αρχικά σχηματισμένο κατώτερο εξωτερικό έλυτρο της τρίχας όπως και το matrix. Μετά την ολοκλήρωση της μορφογένεσης, ολόκληρη η τριχοσμηγματογόνος μονάδα αποτελείται από κύτταρα σημασμένα για τον μεταγραφικό παράγοντα SOX9. Αυτά τα ευρήματα υποστήρίζουν την θεωρία που έχει διατυπωθεί τελευταία, σύμφωνα με την οποία τα κύτταρα που απαρτίζουν την περιοχή bulge περιοδικά απομακρύνονται από την φωλεά τους κατά την αναγενή φάση. Στη συνέχεια μεταναστεύουν κατά μήκος του τριχοθυλακίου, παράγοντας τα TAC κύτταρα του matrix, τα 94

95 οποία διαφοροποιούνται προς κύτταρα που σχηματίζουν το στέλεχος της τρίχας και το εσωτερικό έλυτρό της. Σε αναπτυσσόμενους επίμυες με έλλειψη του SOX9, το matrix που φυσιολογικά επεκτείνεται κατά την μορφογένεση, μειώνεται σε μέγεθος μέχρι ότου δεν παραμένουν καθόλου κύτταρα του matrix με αναπτυξιακό δυναμικό στη βάση του θύλακα της τρίχας [14]. Μετά από βλάβη, τα stem κύτταρα της περιοχής εισέρχονται ταχέως σε προγράμματα διαφοροποίησης, κάτι που δεν παρατηρείται υπό φυσιολογικές συνθήκες ομοιόστασης. Τα γενετικώς σημασμένα stem κύτταρα της bulge περιοχής μπορούν να κινητοποιηθούν και να επιδιορθώσουν την τραυματισμένη επιδερμίδα in vivo. Επιπλέον, η ροή των bulge κυττάρων προς τα ανώτερα στρώματα της επιδερμίδας φαίνεται να ρυθμίζεται αυστηρά, καθώς σταματά όταν το τραύμα επουλωθεί. Σχετικά πειράματα έδειξαν ότι η διαμεσολαβούμενη από την περιοχή bulge επιδιόρθωση της επιφάνειας του δέρματος είναι παροδική [14-εντός]. Παρουσιάζει ενδιαφέρον ότι τα stem κύτταρα στο αναπτυσσόμενο τριχοθυλάκιο του νεογέννητου έχουν περισσότερο μακροπρόθεσμη επιδιορθωτική δράση. Η αξιοσημείωτη ικανότητα των stem κυττάρων της επιδερμίδας να απομακρύνονται από τη φωλεά τους και να καλλιεργούνται για μακρές περιόδους χωρίς να χάνουν τη πολυδυναμία τους, αποκαλύφθηκε για πρώτη φορά από τον Green και συν., οι οποίοι μελέτησαν αυτή την ενδογενή ιδιότητα των ανθρώπινων stem κυττάρων της επιδερμίδας στην αντιμετώπιση εγκαυμάτων [14-εντός]. Τα σωματικά bulge stem κύτταρα, όταν καλλιεργηθούν και μεταμοσχευθούν στη ράχη ανοσοκατασταλμένων ποντικών, μπορούν να δημιουργήσουν όχι μόνο σμηγματογόνους αδένες και ανανεούμενα τριχοθυλάκια, αλλά επίσης και επιδερμίδα. Πάντως δεν είναι ξεκάθαρο ακόμα, εάν η πολυδυναμία είναι ένα χαρακτηριστικό των bulge stem κυττάρων που χάνεται με τη πάροδο της ηλικίας και ανακτάται ξανά όταν τα bulge κύτταρα καλλιεργούνται και μεταμοσχεύονται σε μια τραυματισμένη περιοχή. Ένας άλλος πληθυσμός δυνητικών stem κυττάρων έχει αναγνωρισθεί πρόσφατα σε μια περιοχή ανάμεσα στην περιοχή bulge και τον σμηγματογόνοο αδένα του τριχοθυλακίου. Γνωστός ως ο άνω ισθμός, τα κύτταρα σε αυτή τη περιοχή του τριχοθυλακίου χαρακτηρίζονται από την έκφραση του κυτταροπλασματικού δείκτη mts24 [14-εντός]. In vitro, τα mts24+ κύτταρα βρέθηκαν να έχουν μεγαλύτερο δυναμικό σχηματισμού κλώνων από τα mts24- κύτταρα. Επιπλέον η μεταμόσχευση αυτών των κυττάρων αναδημιούργησε όλες τις κυτταρικές σειρές της επιδερμίδας, δεδομένο που υποστηρίζει την πολυδυναμία τους, χρειάζονται όμως περαιτέρω πειράματα για να διευκρινιστεί η φύση αυτών των κυττάρων [14-εντός]. 95

96 Δημιουργία και ομοιόσταση των σμηγματογόνων αδένων Εκτός από τα stem κύτταρα της περιοχής bulge του τριχοθυλακίου και της επιδερμίδας μεταξύ των τριχοθυλακίων IFE, υπάρχουν ενδείξεις και για έναν ακόμη τύπο stem κυττάρων στο δέρμα. Πειράματα με μεταμοσχεύσεις γενετικά σημασμένων κυττάρων έχουν εδώ και καιρό τεκμηριώσει την παρουσία μονοδύναμων προγονικών κυττάρων για τον σμηγματογόνο αδένα. Πρόσφατες μελέτες ταυτοποίησαν λίγα αυτόχθονα κύτταρα στον σμηγματογόνο αδένα σημασμένα για την έκφραση του BLIMP1 (γνωστό και ως PRDM1) τα οποία και εντοπίζονται στο σημείο σύνδεσης του αδένα με το τριχοθυλάκιο [14-εντός]. Η περαιτέρω ιχνηλάτησή τους απέδειξε ότι πιθανότατα αυτά είναι προγονικά κύτταρα των σμηγματογόνων κυττάρων που μπορούν να δημιουργήσουν ολόκληρο τον αδένα. Αυτά τα ευρήματα προτείνουν ότι, όπως και στην επιδερμίδα IFE, η ομοιόσταση του σμηγματογόνου αδένα πραγματοποιείται από τα δικά του αυτόχθονα προγονικά κύτταρα. Το μόριο BLIMP1 είναι ένας μεταγραφικός καταστολέας του Myc, το οποίο εμπλέκεται στη μετατροπή των stem κυττάρων της επιδερμίδας σε δεσμευμένα προς συγκεκριμένη διαφοροποίηση TACs, τα οποία στη συνέχεια εισέρχονται σε τελική διαφοροποίηση. Έχει ενδιαφέρον ότι η απάλειψη του BLIMP1 προκαλεί υπερπλασία των σμηγματογόνων αδένων. Αυτό το χαρακτηριστικό, εν μέρει οφείλεται στην ενεργοποίηση του Myc που διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των αδενικών κυττάρων. Ωστόσο, φαίνεται ότι και τα bulge stem κύτταρα παρέχουν κύτταρα απαραίτητα για την ομοιόσταση, όταν η ανανέωση των κυττάρων στον αδένα πραγματοποιείται σε ασυνήθιστους ρυθμούς. Φαίνεται επομένως ότι τα αυτόχθονα προγονικά κύτταρα του σμηγματογόνου αδένα διασφαλίζουν την ομοιόσταση, αλλά όταν αυτά έχουν χαθεί ή υποστεί βλάβη, τα bulge stem κύτταρα είναι επίσης ικανά να δημιουργήσουν κύτταρα του σμηγματογόνου αδένα. 96

97 Σηματοδότηση στην ανάπτυξη και ομοιόσταση του δέρματος Η σηματοδότηση Wnt και BMP (Bone Morphogenetic Protein) είναι καθοριστικής σημασίας, μεταξύ των μοριακών σημάτων που κυριαρχούν στις πολύπλοκες επιθηλιο-μεσεγχυματικές διαντιδράσεις (εικόνα 49) [14, 16]. Διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην εξειδίκευση και ενεργοποίηση των stem κυττάρων του τριχοθυλακίου, κατά την μορφογένεση και ομοιόσταση της επιδερμίδας. Εικόνα 49 Οι μοριακοί μηχανισμοί που ελέγχουν τον πολλαπλασιαμό των stem κυττάρων του δέρματος και την διαφοροποίησή τους. 1) Τα stem κύτταρα της επιδερμίδας IFE μπορούν να δημιουργήσουν τα διαφοροποιημένα κύτταρα της ακανθωτής, κοκκιώδους και κεράτινης στιβάδα. Ο πολλαπλασιασμός τους ρυθμίζεται θετικά από την ιντεγρίνη και τον TGFa ενώ αρνητικά από την TGFb σηματοδότηση. Επιπλέον, οι μεταγραφικοί παράγοντες c Myc και p63 ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό της επιδερμίδας. Η Notch σηματοδότηση και οι μεταγραφικοί παράγοντες PPARa, AP2 α/γ και C/EBP α/β αντίστοιχα, ελέγχουν την διαφοροποίηση στα κύτταρα της επιδερμίδας. 2) Τα stem κύτταρα της περιοχής bulge του τριχοθυλακίου σχηματίζουν πολλαπλά προγονικά κύτταρα τα οποία τελικά παράγουν δύο διαφοροποιημένες κυτταρικές σειρές: το στέλεχος και το εσωτερικό έλυτρο της τρίχας. Ο πολλαπλασιασμός των bulge κυττάρων ελέγχεται αρνητικά από τη BMP σηματοδότηση και τους μεταγραφικούς παράγοντες NFATC1 και PTEN, ενώ θετικά από την Wnt σηματοδότηση. Η διαφοροποίηση του εσωτερικού ελύτρου της τρίχας είναι υπό τον έλεγχο την Notch και BMP σηματοδότησης και των μεταγραφικών παραγόντων CDP και GATA3. Η 97

98 διαφοροποίηση του στελέχους της τρίχας ρυθμίζεται από τη Wnt σηματοδότηση και τον μεταγραφικό παράγοντα Lef1. Τα κύτταρα του matrix ρυθμίζονται από τα Msx1/2, Ovo1, Foxn1 και Shh. 3) Τα μονοδύναμα stem κύτταρα του σμηγματογόνου αδένα ρυθμίζονται αρνητικά από τον μεταγραφικό παράγοντα Blimp1 και τη Wnt σηματοδότηση, ενώ θετικά από τη c Myc και Ηedgehog σηματοδότηση. Η διαφοροποίηση των σμηγματογόνων κυττάρων φαίνεται να ελέγχεται από την έκφραση του PPARγ [15. ]. Στο έμβρυο, η Wnt/β-κατενίνη σηματοδότηση είναι το πλέον πρώιμο μοριακό σήμα που απαιτείται ώστε τα επιθηλιακά κύτταρα να υιοθετήσουν φαινότυπο τριχοθυλακίου [14]. Τα placodes, τα οποία είναι εγκολπώσεις της επιδερμίδας στα σημεία με υποκείμενες συναθροίσεις μεσεγχυματικών κυττάρων στο χόριο, αποτυγχάνουν να σχηματισθούν όταν το γονίδιο που κωδικοποιεί τη β-κατενίνη είναι μεταλλαγμένο. Η β-κατενίνη είναι το μόριο που απαιτείται για την μεταγωγή του σήματος Wnt από την μεμβράνη στον πυρήνα. Παρόμοια αδυναμία στη μορφογένεση του τριχοθυλακίου προκύπτει και από υπερέκφραση της πρωτεΐνης DKK1. Αντίθετα, μια συνεχής σταθερή μορφή της β-κατενίνης, διεγείρει την de novo μορφογένεση τριχοθυλακίου σε διάφορες έκτοπες θέσεις, όπως είναι η επιδερμίδα IFE, ο σμηγματογόνος αδένας και το εξωτερικό έλυτρο της τρίχας [14]. Αυτά τα έκτοπα τριχοθυλάκια περιέχουν επίσης όλα τα μη-επιθηλιακά κύτταρα των τριχοθυλακίων, μεταξύ των οποίων τα μελανοκύτταρα. Σε ενήλικα τριχοθυλάκια, όταν αυξάνονται τα επίπεδα της σταθεροποιημένης μορφής της β- κατενίνης στα stem κύτταρα που βρίσκονται σε φάση ηρεμίας, ξεκινάει ένας νέος κύκλος ανάπτυξης της τρίχας. Η σηματοδότηση Wnt/β-κατενίνη έχει δράση επίσης και σε επόμενα στάδια του κύκλου ανάπτυξης της τρίχας, όταν τα κύτταρα του matrix διεγείρονται και διαφοροποιούνται ώστε να σχηματιστεί το στέλεχος της τρίχας. Σε σοβαρή βλάβη, Wntεξαρτώμενο σήμα είναι δυνατό να προκαλέσει τοπικό de novo σχηματισμό τριχοθυλακίων από την επιδερμίδα IFE. Όλα αυτά τα δεδομένα συνολικά υπογραμμίζουν την συμβολή της Wnt σηματοδότησης στην δέσμευση των προγονικών κυττάρων για το σχηματισμό του τριχοθυλακίου [14]. Αναδεικνύουν επίσης την πολυδυναμία των stem κυττάρων της επιδερμίδας μεταξύ των τριχοθυλακίων IFE. Τα τελευταία, με έναν άγνωστο μηχανισμό, μπορούν να υιοθετήσουν πρόγραμμα διαφοροποίησης προς τριχοθυλάκιο σε απάντηση Wnt σημάτων κατά τη διάρκεια φυσιολογικών ή παθολογικών καταστάσεων. Αν και οι μεταμεταφραστικοί ρυθμιστικοί μηχανισμοί που εμπλέκονται είναι πιθανόν αρκετά σύνθετοι, η σταθεροποιημένη μορφή της β-κατενίνης της επιτρέπει να λειτουργήσει ως πυρηνικός μεταγραφικός παράγοντας μαζί με τα μόρια LEF1/TCF [14]. 98

99 Στην αδρανή περιοχή bulge, στην οποία η πυρηνική β-κατενίνη βρίσκεται σε χαμηλά επίπεδα ή απουσιάζει εντελώς, ο TCF3 φαίνεται να λειτουργεί ως μεταγραφικός καταστολέας γονιδίων τα οποία ελέγχουν και τα τρία προγράμματα τελικής διαφοροποίησης των αντίστοιχων stem κυττάρων [14]. Αντιθέτως, καθώς η β-κατενίνη σταθεροποιείται και συσσωρεύεται στον πυρήνα στην ενεργοποιημένοη hair germ περιοχή, προκύπτουν μια σειρά από αλλαγές σε μεταγραφικό επίπεδο [14]]. Μεταξύ άλλων περιλαμβάνουν την ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, την αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας ουσίας και την δέσμευση για διαφοροποίηση προς τριχοθυλάκιο. Τα κύτταρα του matrix διαφέρουν από τα κύτταρα της περιοχής bulge ως προς ότι εκφράζουν το μόριο LEF1 αντί για TCF3. Επιπλέον, ανταποκρίνονται στη Wnt/β-κατενίνη σηματοδότηση με ενεργοποίηση γονιδίων της ειδικής για τρίχα κερατίνης και στη συνέχεια εισέρχονται προς τελική διαφοροποίηση. Παρά την σημασία της εν λόγω σηματοδότησης στην ενεργοποίηση των stem κυττάρων των τριχοθυλακίων και τον έλεγχο της διαφοροποίησής τους, παρατηρείται πειραματικά μία σχετική αντίσταση των bulge stem κυττάρων σε υψηλά επίπεδα της β-κατενίνης [14]. Το αποτέλεσμα είναι να μην επηρρεάζεται ο χαμηλός ρυθμός ανανέωσής τους, να διατηρείται σταθερός ο αριθμός τους και να είναι σπάνιο φαινόμενο ο de novo σχηματισμός τριχοθυλακίων με προέλευση αυτά τα κύτταρα. Φαίνεται λοιπόν ότι και επιπρόσθετοι παράγοντες απαιτούνται για την επιτυχή ενεργοποίηση των γονιδίων-στόχων της Wnt σηματοδότησης σε αυτά τα κύτταρα. Η BMP σηματοδότηση ρυθμίζει την κατάσταση ηρεμίας των stem κυττάρων [14]. Υπάρχουν αυξημένα στοιχεία ότι η ισορροπία μεταξύ των εκκρινόμενων μορίων BMPs και των αναστολέων τους, για παράδειγμα τα μόρια Noggin και gremlin, έχει ιδιαίτερη σημασία όχι μόνο στη μορφογένεση του τριχοθυλακίου, αλλά και στην ενεργοποίηση των αντίστοιχων stem κυττάρων κατά την ομοιόσταση. Τα BMP2 και BMP4 εκφράζονται από το εμβρυϊκό μεσέγχυμα και το Noggin εκφράζεται στη εμβρυϊκή δερματική θηλή. Απώλεια λειτουργίας του Noggin έχει ως αποτέλεσμα μια δραματική μείωση στην εξειδίκευση και στο αναπτυξιακό δυναμικό των τριχοθυλακίων κατά την εμβρυογένεση [14]. Η μορφογενετική δράση του Noggin διαμεσολαβείται εν μέρει ενισχύοντας την έκφραση του LEF1, επομένως επιτρέποντας στα κύτταρα να ανταποκριθούν στη Wnt/β-κατενίνη σηματοδότηση και να προσαρμόσουν κατάλληλα το γονιδιακό πρόγραμμά τους προκειμένου να επιτευχθεί η μορφογένεση του τριχοθυλακίου. 99

100 Η φάση ηρεμίας του κύκλου της τρίχας μπορεί να διαιρεθεί σε δύο στάδια, κατά τη διάρκεια των οποίων τα bulge stem κύτταρα είναι είτε ευαίσθητα είτε ανθεκτικά σε ενεργοποίηση. Αξιοσημείωτα, η κυκλική έκφραση των μορίων BMP2 και BMP4 στο χόριο φαίνεται να υπαγορεύει την ικανότητα των bulge stem κυττάρων για ενεργοποίηση και αναγέννηση των τριχοθυλακίων. Στο στάδιο αυξημένης ανθεκτικότητας της τελογενούς φάσης, τα BMPs εκφράζονται σε υψηλό βαθμό από μια ποικιλία κυττάρων του χορίου, μεταξύ των οποίων ινοβλάστες και λιποκύτταρα.. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την πυρηνική εντόπιση της φωσφορυλιωμένης μορφής των SMAD1, 5 και 8 τα οποία αποτελούν μεταγραφικούς διαμεσολαβητές της BMP σηματοδότησης στα bulge stem κύτταρα του τριχοθυλακίου. Πρόσφατες μελέτες προτείνουν ότι η κατάσταση ηρεμίας των bulge stem κυττάρων που ελέγχεται από το μόριο BMP, ελέγχεται εν μέρει από την ικανότητά του να ρυθμίζει τον μεταγραφικό αναστολέα των ενεργοποιημένων Τ κυττάρων NFATc1 [14-εντός]. Τα BMP σήματα στο χόριο προοδευτικά ελαττώνονται κατά την τελογενή φάση της τρίχας. Αυτό προάγει τον διακόπτη των bulge stem κυττάρων από την φάση ηρεμίας στην ενεργοποίηση. Η πυρηνική εντόπιση του NFATc1 χάνεται με την ενεργοποίησή τους και συμπίπτει χρονικά με την ενεργοποίηση γονιδίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, όπως η κυκλινο-εξαρτώμενη κινάση 4 (Cdk4) που προωθεί τον κυτταρικό κύκλο στη φάση σύνθεσης του DNA. Έχει ενδιαφέρον ότι η Cdk4 αποτελεί άμεσο στόχο του NFATc1 στην ευρισκόμενη σε ηρεμία περιοχή bulge. Αυτές οι μελέτες παρέχουν νέα στοιχεία για τον τρόπο που τα μόρια BMPs ρυθμίζουν τα bulge stem κύτταρα που βρίσκονται σε ηρεμία. Η BMP σηματοδότηση υποστηρίζει την ικανότητα της δερματικής θηλής να επάγει τη δημιουργία νέων τριχών [14]. Επιπλέον, τα κύτταρα της δερματικής θηλής, σε απάντηση των BMP σημάτων, ενεργοποιούν έναν μηχανισμό ανάδρασης (feedback) που έχει ως αποτέλεσμα την αυξημένη έκφραση των BMP αναστολέων. Εάν ο συγχρονισμός είναι σωστός, αυτός ο μηχανισμός μπορεί να οδηγήσει σε περαιτέρω περιορισμό της BMP σηματοδότησης στο στάδιο ευαισθησίας της τελογενούς φάσης και να διεγείρει την ενεργοποίηση των bulge stem κυττάρων και την αναγέννηση της τρίχας. Είναι αξιοσημείωτο ότι η κυκλική έκφραση του BMP στο χόριο δεν έχει συγχρονισμό με την κυκλική έκφραση του Wnt/β-κατενίνης στα stem κύτταρα του τριχοθυλακίου. Από τη στιγμή που ενεργοποιούνται τα bulge stem κύτταρα απαιτούνται ενδοκυττάρια σήματα για να διατηρηθεί η ανάπτυξη και η φάση διαφοροποίησης του κύκλου της τρίχας. Το μόριο SHH (Sonic Hedgehog) είναι γνωστό ότι συμμετέχει σε ένα ρυθμιστικό μονοπάτικλειδί που ελέγχει σε κάποιο βαθμό το Wnt μονοπάτι και είναι απαραίτητο για τη συντήρηση 100

101 της αναπτυξιακής φάσης της τρίχας [14]. Ωστόσο, το Notch μονοπάτι έχει ως λειτουργία την προώθηση των αρχικών σταδίων διαφοροποίησης του τριχοθυλακίου, όπως γίνεται και με την επιδερμίδα [14]. Τελικώς, όπως το Wnt, έτσι και το BMP επίσης αποκτά ξανά ιδιαίτερη σημασία σε μεταγενέστερα στάδια του κύκλου της τρίχας, όπου επηρεάζει την δέσμευση για διαφοροποίηση των κυττάρων του matrix είτε προς στέλεχος της τρίχας είτε προς εσωτερικό έλυτρο της τρίχας. Τα μόρια Wnt δρουν μέσω του LEF1 προκειμένου να διεγείρουν τα κύτταρα του matrix για να σχηματίσουν το στέλεχος της τρίχας, ενώ τα μόρια BMP τα διεγείρουν για διαφοροποίηση και σχηματισμό του εσωτερικού ελύτρου της τρίχας με παράλληλη έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα GATA3 [14]. Εικόνα 50 Παρόμοιοι μηχανισμοί ρυθμίζουν την μορφογένεση στο έμβρυο και την ομοιόσταση στον ενήλικα. Λειτουργικές μελέτες σε επίμυες αποκάλυψαν τις διαφορετικές λειτουργίες της σηματοδότησης Wnt/β κατενίνη και BMP κατά την μορφογένεση και την ομοιόσταση του δέρματος. Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του τριχοθυλακίου η σηματοδότηση Wnt/β κατενίνη απαιτείται για να καθοριστεί η μοίρα του τριχοθυλακίου στην αδιαφοροποίητη βασική στιβάδα της επιδερμίδας. Κατά τη διάρκεια της ανανέωσης της τρίχας σε ενήλικες, η αυξημένη Wnt σηματοδότηση προωθεί την ενεργοποίηση των stem κυττάρων προκειμένου να αναπτυχθεί μια νέα τρίχα κατά την μετάβαση από την ηρεμία στη φάση ανάπτυξης. Μια ακόμα μεγαλύτερη ανταπόκριση σε αυτή τη σηματοδότηση παρατηρείται αργότερα, καθώς τα κύτταρα του matrix δεσμεύονται για συγκεκριμένη τελική διαφοροποίηση. Τα BMP σήματα μεταβιβάζονται από το υποκείμενο μεσέγχυμα στην επιδερμίδα. Καθώς σχηματίζονται τα εξαρτήματα του δέρματος, η αναπτυσσόμενη δερματική θηλή εκφράζει τον αναστολέα του BMP, Νoggin. Ο Νoggin είναι απαραίτητος για την φυσιολογική ανάπτυξη του τριχοθυλακίου και διεγείρει την έκφραση του LEF1 και τη Wnt σηματοδότηση. Κατά τη διάρκεια του κύκλου της τρίχας, η ενεργός BMP σηματοδότηση προωθεί την 101

102 σίγαση των bulge stem κυττάρων κατά την φάση ηρεμίας. Κατά την μετάπτωση από την φάση ηρεμίας στην φάση ανάπτυξης της τρίχας, τα επίπεδα στο χόριο του BMP και των αναστολέων του μεταβάλλονται, με αποτέλεσμα αναστολή στη BMP σηματοδότηση και ενεργοποίηση των stem κυττάρων. Καθώς το νέο τριχοθυλάκιο ωριμάζει, η ενεργοποίηση του BMP υποδοχέα είναι απαραίτητη για τη διαφοροποίηση των TACs κυττάρων του matrix ώστε να σχηματιστεί το στέλεχος της τρίχας [14]. H ρύθμιση της μετάβασης από τη βασική στην ακανθωτή στιβάδα της επιδερμίδας [72] Η εναλλαγή στην έκφραση μεταξύ των κερατινών του κυτταροσκελετού K5/K14 είναι ένας αξιόπιστος δείκτης ότι ένα κύτταρο της επιδερμίδας άφησε τη βασική στιβάδα και δεσμεύτηκε για τελική διαφοροποίηση. Ένα από τα βασικά σήματα που ρυθμίζουν αυτή τη μετάβαση είναι το Notch: τα μόρια συνδέτες του μονοπατιού βρίσκονται στη βασική στιβάδα ενώ οι υποδοχείς του Notch εκφράζονται από τα ακανθωτά κύτταρα (εικόνες 51, 52). Η υπερβολική δραστηριότητα του μονοπατιού προάγει την διαφοροποίηση προς ακανθωτά κύτταρα που εκφράζουν στις κερατίνες K1/K10, ενώ μικρή δραστηριότητα έχει ως αποτέλεσμα τη καταστολή αυτής της διαφοροποιημένης κατάστασης. Ένα από τα κλασσικά γονίδια στόχους του Notch κωδικοποιεί τον μεταγραφικό αναστολέα Hes1, που πρόσφατα φάνηκε ότι έχει σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση του ακανθωτού κυττάρου στο αναπτυσσόμενο έμβρυο. Εικόνα 51 Ο αναμενόμενος ρόλος του Notch στις τρεις διαφορετικές κυτταρικές σειρές στο δέρμα. Α) Διάγραμμα. Στο δέρμα, τα μόρια Notch προέρχονται συχνά από τα κύτταρα της βασικής στιβάδας, ενώ οι υποδοχείς βρίσκονται συνήθως στα κύτταρα πάνω από τη βασική στιβάδα. Η Notch 102

103 σηματοδότηση έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση του ενδοκυττάριου τμήματος του Notch, το οποίο με τη σειρά του δρα ως μεταγραφικός παράγοντας για την DNA συνδεόμενη πρωτεΐνη RBPj. Οι στόχοι αυτού του συμπλόκου περιλαμβάνουν τα μόρια Hes1 και Hey1, τα οποία συνδέονται με το DNA και συχνά λειτουργούν ως καταστολείς της έκφρασης των γονιδίων. Στις κυτταρικές σειρές του δέρματος, η σηματοδότηση Notch, όπως αυτή επισημαίνεται από την έκφραση του ενδοκυττάριου τμήματος του Notch ή των γονιδίων στόχων Hes1 και Hey1 ή με λειτουργικές μελέτες, είναι ιδιαίτερα εμφανής στη μετάβαση των κυττάρων από κατάσταση πολλαπλασιασμού σε διαφοροποίηση. Τα βέλη δείχνουν τα μοριακά βήματα στη πορεία καθεμίας από τις τρεις βασικές κυτταρικές σειρές του δέρματος. Τα σημασμένα βέλη με κόκκινο είναι τα στάδια όπου και έχει δράση o Notch. Β) Ανοσοφθορισμός. Χρησιμοποιήθηκαν τεχνικές ανοσοφθορισμού σε δείγματα επίμυων στην E15 εβδομάδα κύησης (από επιδερμίδα) και στη 28 μέρα μεταγεννητικά (από βολβό τρίχας) για την εντόπιση των Notch3, Hes1 και Hey1. Σε όλα τα δείγματα οι πυρήνες απεικονίζονται με μπλε χρώμα. Επίσης χρησιμοποιήθηκαν αντισώματα για την ιντεγρίνη 4 για την απεικόνιση της χοριοεπιδερμιδικής συμβολής και για την κερατίνη 14, ώστε να απεικονιστεί η βασική στιβάδα του εξωτερικού ελύτρου της τρίχας. Οι δύο πάνω εικόνες απεικονίζουν συγχρόνως την έκφραση του Notch3 και του Hes1, που είναι ιδιαίτερα εμφανής στο σημείο μετάβασης από τη βασική στην ακανθωτή στιβάδα. Οι δύο κάτω εικόνες δείχνουν ότι το Hes1 εκφράζεται πιο έντονα στα κύτταρα του εσωτερικού ελύτρου της τρίχας που διαφοροποιούνται (αριστερά), ενώ το hey1 εκφράζεται έντονα και στο εσωτερικό έλυτρο της τρίχας [17]. H μετάβαση από τη βασική στην ακανθωτή στιβάδα ελέγχεται επίσης και από επιγενετικές τροποποιήσεις. Για παράδειγμα, οι Frye και Watt παρατήρησαν ότι τα κύτταρα που είναι πλούσια σε β1 ιντεγρίνη σχετίζονται με ελαττωμένα επίπεδα ακετυλίωσης της ιστόνης H4 [16-εντός]. Η ακετυλίωση των ιστονών συνδέεται γενικώς με την έκφραση ενεργών γονιδίων και του c-myc πιο ειδικά. Αυτό το πρότυπο παρατηρείται επίσης και για την επιδρεμίδα μεταξύ των τριχοθυλακίων IFE και για τα τριχοθυλάκια στους επίμυες, προτείνοντας ανταγωνιστικούς ρόλους μεταξύ της H4 ακετυλίωσης και του φαινότυπου κυττάρου βασικής στιβάδας. Σε προηγούμενες μελέτες, ο Watt και συν. [16-εντός] πρότειναν ότι το γονίδιο c- Myc διαδραματίζει κάποιο ρόλο στο να επάγει τα stem κύτταρα σε TAC (Transit Amplifying Cell) κατάσταση. Πιο συγκεκριμένα βρήκαν ότι τα αυξημένα επίπεδα c-myc στα κύτταρα της βασικής στιβάδας έχει ως αποτέλεσμα να επεκταθεί περαιτέρω η H4 ακετυλίωση όπως επιπρόσθετα και οι H4 τροποποιήσεις στη λυσίνη 20. Αυτά τα δεδομένα οδήγησαν στην άποψη ότι η ενεργοποιημένη μορφή του c-myc πιθανόν να επάγει μια κατάσταση της χρωματίνης τέτοια, που να επιτρέπει την διαφοροποίηση της επιδερμίδας [16]. 103

104 Οι Sen και Khavari [16-εντός] έδειξαν σε καλλιέργειες ανθρώπινων κερατινοκυττάρων ότι υπό συνθήκες ανάπτυξης, το 10% των υποκινητών των γονιδίων που εξετάστηκαν ήταν θετικοί στον επιγενετικό δείκτη H3K27me3. Αντιθέτως υπό συνθήκες ευνοϊκές για διαφοροποίηση, οι υποκινητές 10% περίπου των γονιδίων που εμφάνισαν αύξηση στην έκφρασή τους εμφάνισαν μείωση στη μεθυλίωση H3K27me3. Μια πιθανή λειτουργική ερμηνεία αυτών των αντίθετων αποτελεσμάτων στην τροποποίηση της ιστόνης δόθηκε με την εκλεκτική σίγαση μέσω sirna της JMJD3, μιας απομεθυλάσης που πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνη για την απομάκρυνση της επισήμανσης H3K27me3. Ελάττωση στην απομεθυλάση συνδέθηκαν με καταστολή της διαφοροποίησης της επιδερμίδας, ενώ η υπερέκφραση του JMJD3 ενίσχυσε την διαφοροποίηση. Εκτός από τα σηματοδοτικά μόρια που διαχέονται κατά μήκος της συμβολής της βασικής με την ακανθωτή στιβάδα, η βασική στιβάδα δέχεται ρυθμιστικό έλεγχο και από κάτω. Ό βασικός υμένας παρέχει μια μεγάλη ποικιλία ερεθισμάτων για πολλαπλασιασμό για τα κύτταρα της βασικής στιβάδας. Μεταξύ αυτών είναι το μόριο λαμινίνη 5, που προάγει την αγκυροβόληση, τη σηματοδότηση και τη μετανάστευση, συνδεόμενη με τα ημιδεσμοσώματα. Επίσης, ανθρώπινα επιδερμικά κύτταρα σε καλλιέργεια, με υψηλότερα επίπεδα β1 ιντεγρίνης, εμφανίζουν μεγαλύτερο δυναμικό πολλαπλασιασμού από άλλα κύτταρα στον ίδιο πληθυσμό. Η βασική μεμβράνη είναι επίσης πλούσια σε πρωτεογλυκάνες και άλλες πρωτεΐνες δημιουργώντας ένα μοριακό δίκτυ για τους αυξητικούς ρυθμιστικούς παράγοντες. Ο TGFβ περιορίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων της επιδερμίδας, ενώ τα μόρια TGFα, EGFs και IGFs ενισχύουν τον πολλαπλασιασμό. Όταν διαταράσσεται η σηματοδότηση του TGFβ υποδοχέα, διατηρείται η ομοιόσταση αλλά η κανονικότητα που παρατηρείται είναι φαινομενική καθώς η επούλωση των τραυμάτων επιταχύνεται, ο αυξημένος πολλαπλασιασμός των βλαστικών κυττάρων εξισορροπείται από την αυξημένη κυτταρική απόπτωση ενώ αρκεί μία μόνο ογκογόνος μετάλλαξη για την εμφάνιση καρκινώματος εκ πλακωδών κυττάρων. Είναι επίσης γνωστό ότι το υποκείμενο χόριο βρίσκεται σε συνεχή διαντίδραση και επικοινωνία με τα κύτταρα της βασικής στιβάδας της επιδερμίδας συμβάλλοντας στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού τους και της μετακίνησής τους προς ανώτερες στιβάδες [14-17]. 104

105 Εικόνα 52 Η αρχιτεκτονική της μετάβασης από τη βασική στην ακανθωτή στιβάδα της επιδερμίδας. Τα κύτταρα της βασικής στιβάδας είναι προσκολλημένα στην υποκείμενη βασική μεμβράνη που διαχωρίζει το χόριο από την επιδερμίδα και διαφοροποιούνται προς κύτταρα της ακανθωτής στιβάδας. Σημαντικό ρόλο στη λειτουργία αυτού του διακόπτη διαδραματίζουν οι επιγενετικές αλλαγές στη χρωματίνη και η ενεργός σηματοδότηση Notch, που παρατηρούνται στα κύτταρα της ακανθωτής στιβάδας. Ο Notch πιστεύεται ότι είναι υπό καταστολή στα βλαστικά κύτταρα μέσω διαφορετικών μηχανισμών, όπως το κατασταλτικό μόριο Numb που κληρονομείται με ασύμμετρο τρόπο στα θυγατρικά κύτταρα όταν πραγματοποιείται μια ασύμμετρη διαίρεση. Με τη σειρά του, το μόριο Notch καταστέλλει την έκφραση των γονιδίων ιντεγρίνης και p53, και σε συνεργασία με το AP2 ενεργοποιεί την έκφραση του γονιδίου C/EBP. Απεικονίζονται μοντέλα ασύμμετρης κυτταρικής διαίρεσης και πώς μπορούν να προωθήσουν τη μετάβαση από τη βασική στην ακανθωτή στιβάδα [16]. Ομοιόσταση του μελανοκυττάρου και ρύθμιση από τα κερατινοκύτταρα [80] Στη βασική στιβάδα της επιδερμίδας η αναλογία μελανοκύτταρα προς κερατινοκύτταρα είναι 1 προς 5. Ο πολλαπλασιασμός των μελανοκυττάρων είναι κυρίως υπό τον έλεγχο των κερατινοκυττάρων. Είναι πλέον γνωστό ότι οι διαντιδράσεις με τα κερατινοκύτταρα είναι 105

106 πολύ σημαντικές στην ομοιόσταση των μελανοκυττάρων. Τα στάδια για τον πολλαπλασιασμό των μελανοκυττάρων περιγράφονται στην εικόνα 53 και είναι τα εξής: (1) αποσύνδεση από τη βασική μεμβράνη και τα κερατινοκύτταρα, (2) πολλαπλασιασμός, (3) μετανάστευση και επανατοποθέτηση στη βασική μεμβράνη και (4) κυτταρική εξάπλωση με ανάπτυξη δενδριτών και επανασύνδεση με τα κερατινοκύτταρα. Εικόνα 53 Πολλαπλασιασμός του μελανοκυττάρου στο ανθρώπινο δέρμα. Αποσύνδεση από τη βασική μεμβράνη: η έκκριση ET 1 (endothelin 1) από τα κερατινοκύτταρα και του HGF (hepatocyte growth factor) από τους ινοβλάστες έχει ως αποτέλεσμα την καταστολή της έκφρασης της Ε καντχερίνης. Διαίρεση: o πολλαπλασιασμός επάγεται από παράγοντες όπως ο SCF (stem cell factor) που εκκρίνονται από κερατινοκύτταρα και ινοβλάστες, bfgf (basic fibroblast growth factor) από τα κερατινοκύτταρα και ET 3 από ινοβλάστες. Μετανάστευση: Είναι απαραίτητη η έκφραση των πρωτεϊνών CCN3 και DDR1 για το σωστό προσανατολισμό στη βασική μεμβράνη. Επανασύνδεση σε βασική μεμβράνη: Αυξάνεται η έκφραση της E καντχερίνη και επανασύνδεση με κερατινοκύτταρα [80]. Τα κερατινοκύτταρα ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό των μελανοκυττάρων μέσω των διακυτταρικών συνδέσεων και την έκκριση αυξητικών παραγόντων και σηματοδοτικών μορίων (εικόνα 54). 106

107 Εικόνα 54 Το μικροπεριβάλλον του μελανοκυττάρου. Τα κερατινοκύτταρα εκκρίνουν παράγοντες που προωθούν τον πολλαπλασιασμό των μελανοκυττάρων και την παραγωγή μελανίνης, μεταξύ των οποίων τα μόρια SCF (stem cell factor), ET 1 (endothelin 1), GM CSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor, ACTH (adreno corticotrophic hormone) και a MSH (a melanocyte stimulating hormone). Οι ινοβλάστες επίσης συμβάλλουν στη ρύθμιση των μελανοκυττάρων με την έκκριση του bfgf (fibroblast growth factor), SCF και HGF (hepatocyte growth factor). Τα μελανοκύτταρα διατηρούν τον προσανατολισμό τους στο χώρο, συνδεόμενα με τις πρωτεΐνες λαμινίνης και κολλαγόνου της βασικής μεμβράνης, ενώ πιθανό ρόλο μπορεί να διαδραματίζουν τα μόρια CCN3 και DDR1 [80]. Τα μελανοκύτταρα που καλλιεργούνται χωρίς την παρουσία των κερατινοκυττάρων εμφανίζουν φαινότυπο παρόμοιο με μελάνωμα. Η πρόσθεση σε δεύτερο χρόνο κερατινοκυττάρων στη καλλιέργεια έχει ως αποτέλεσμα την επαναφορά σε φαινότυπο μελανοκυττάρου. Τα κερατινοκύτταρα ανακτούν τον έλεγχο του πολλαπλασιασμού των μελανοκυττάρων ενώ η έκφραση των δεικτών που χαρακτηρίζουν το μελάνωμα χάνεται σε 3-4 μέρες. Ενδιαφέρον παρουσιάζει μια πρόσφατη μελέτη με διαγονιδιακά ποντίκια στα οποία έγινε απάλειψη του RXRa (retinoid X receptor a) από τα κερατινοκύτταρα [80-εντός]. Τα πειραματόζωα εμφάνισαν μεγάλο αριθμό μελανοκυτταρικών σπίλων μερικοί από τους οποίους προχώρησαν σε όγκους παρόμοιους με το ανθρώπινο κακόηθες μελάνωμα. 107

108 ΚΑΡΚΙΝΙΚΑ STEM ΚΥΤΤΑΡΑ (CSCs) Πρόσφατα, δεδομένα εισηγούνται ότι ο καρκίνος αναπτύσσεται από ένα μικρό υποσύνολο καρκινικών κυττάρων που εμφανίζει τις χαρακτηριστικές ιδιότητες των φυσιολογικών stem κυττάρων. Έχουν δηλαδή την ικανότητα απεριόριστης αυτο-ανανέωσης και την δυναμική για διαφοροποίηση προς διαφορετικούς τύπους κυττάρων-πολυδυναμία. Τα κύτταρα αυτά αποκαλούνται καρκινικά stem κύτταρα (CSCs) [10, 11]. Με άλλα λόγια, κύτταρα με ιδιότητες stem κυττάρων συνιστούν αναπόσπαστο στοιχείο της ανάπτυξης και εξέλιξης των καρκίνων. Το μοντέλο/υπόθεση των καρκινικών stem κυττάρων υποστηρίζει ότι τα καρκινικά stem κύτταρα [10]: Είναι ένας μειοψηφικός πληθυσμός αυτo-ανανεούμενων καρκινικών κυττάρων τα οποία : Εγκαινιάζουν και συντηρούν την ανάπτυξη και εξέλιξη του όγκου. Συνιστούν την πηγή της κυτταρικής ετερογένειας των καρκινικών κυττάρων του όγκου. Είναι υπεύθυνα για τις μεταστάσεις. Παραμένουν στους ασθενείς μετά την συμπλήρωση των συμβατικών θεραπευτικών σχημάτων (drug resistance). Στο σημείο αυτό μπορεί να γίνει μια σύγκριση του νέου μοντέλου για την δημιουργία και ανάπτυξη του καρκίνου με τo παλαιό, σε άμεση συνάρτηση με τη θεωρία των καρκινικών stem κυττάρων. Έτσι: Παλαιό μοντέλο: 1. Όλα τα καρκινικά κύτταρα είναι ικανά να σχηματίσουν νέους όγκους και γι αυτό θεωρείται ότι είναι το ίδιο ογκογόνα. 2. Η μη ελεγχόμενη ανάπτυξη και εξέλιξη του όγκου οφείλεται σε μια σειρά επίκτητων γενετικών γεγονότων που οδηγούν στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό με παράλληλη σίγαση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων και της κυτταρικής απόπτωσης. 3. Ο καρκίνος είναι μια ασθένεια κυτταρικού πολλαπλασιασμού. 108

109 Νέο μοντέλο 1. Μόνο μια μικρή ομάδα κυττάρων είναι ικανή να σχηματίσει νέους όγκους (καρκινικά stem κύτταρα). 2. Η μη ελεγχόμενη ανάπτυξη και εξέλιξη του όγκου οφείλεται στη απορύθμιση των ρυθμιστικών μηχανισμών που διέπουν την αυτο-ανανέωση των stem κυττάρων. 3. Τα καρκινικά stem κύτταρα είναι ένας μικρός υποπληθυσμός καρκινικών κυττάρων με χαρακτηριστικά stem κυττάρων (αυτο-ανανέωση, πολυδυναμία). Αναγνώριση και απομόνωση των καρκινικών stem κυττάρων Πρόσφατα έχουν αναγνωρισθεί πιθανοί δείκτες των καρκινικών stem κυττάρων, μεταξύ των οποίων το CD133 και CD44 [81]. Αξιοσημείωτο είναι ότι ο δείκτης CD133 εκφράζεται από πολλούς τύπους φυσιολογικών stem κυττάρων, όπως τα νευρικά και αιμοποιητικά stem κύτταρα. Ο CD44 είναι ένας επιφανειακός κυτταρικός υποδοχέας για το υαλουρονικό οξύ, και εμπλέκεται στην κυτταρική μετανάστευση και προσκόλληση όταν αλληλεπιδρά με άλλους γνωστούς συνδέτες, όπως είναι η οστεοποντίνη (OPN), κολλαγόνο και μεταλλοπρωτεινάσες (MMPs). Επιπλέον, o CD44 συμμετέχει στην διαδικασία της μετάστασης [82], υποστηρίζοντας έτσι την υπόθεση ότι τα καρκινικά stem κύτταρα είναι υπεύθυνα για τις μεταστάσεις. Ωστόσο, λόγω της ετερογένειας και της αστάθειας του γενωμικού υλικού που χαρακτηρίζει τους συμπαγείς καρκίνους, χρειάζεται ιδιαίτερη προσοχή όταν η αναγνώριση των καρκινικών stem κυττάρων στηρίζεται αποκλειστικά και μόνο σε αυτούς δείκτες [11, 82]. Επομένως, χρήσιμα εργαλεία σε αυτή τη κατεύθυνση, μπορεί να αποδειχθούν κάποιες λειτουργικές δοκιμασίες και να αξιοποιηθούν σε συνδυασμό με τους επιφανειακούς δείκτες για την ταυτοποίησή των CSCs. Ένα παράδειγμα είναι η λειτουργική δοκιμασία που αναγνωρίζει το υποσύνολο των κυττάρων από ένα πληθυσμό, το οποίο μπορεί με μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα να απομακρύνει από το κυτταρόπλασμα χρωστικές ή φάρμακα [83, 84]. Τα φυσιολογικά stem κύτταρα χαρακτηρίζονται από την αυξημένη ικανότητά τους να απομακρύνουν φάρμακα και χρωστικές, λόγω της αυξημένης έκφρασης των πρωτεϊνών-μεταφορέων ABC, οι οποίοι ενεργά διοχετεύουν τα φάρμακα έξω από το κύτταρο [85]. Οι Hirschman-Jax και συν. 109

110 διεπίστωσαν ότι υπάρχει ένα μικρός υποπληθυσμός στο νευροβλάστωμα, όπως επίσης και σε κυτταρικές σειρές από καρκίνο του μαστού, πνευμόνων και από γλειοβλάστωμα, ο οποίος απομακρύνει την χρωστική Hoechst από το εσωτερικό του κυττάρου με έναν ρυθμό συγκρίσιμο με τα φυσιολογικά stem κύτταρα [84]. Η μέτρηση της ενεργότητας της ALDH (aldehyde dehydrogenase), ενός ενζύμου που σχετίζεται με αντοχή στα φάρμακα, είναι μια ακόμα λειτουργική δοκιμασία που έχει χρησημοποιηθεί για την αναγνώριση των φυσιολογικών αλλά και των καρκινικών stem κυττάρων [85]. Άλλες δυνητικά χρήσιμες λειτουργικές δοκιμασίες για την αναγνώριση των καρκινικών stem κυττάρων περιλαμβάνουν τις δοκιμασίες σχηματισμού αποικιών CFU (colony-forming unit). Ανεξάρτητα από τη προσέγγιση που χρησιμοποιείται για την απομόνωση των stem κυττάρων, η gold standard μέθοδος είναι μια in vivo δοκιμασία, η μεταμόσχευση σε ανοσοκατασταλμένα ζώα. Στα πειράματα που διεξάγονται για τον καρκίνο, είναι κοινή τακτική να μεταμοσχεύονται σε πειραματόζωα τα υπό μελέτη καρκινικά κύτταρα με στόχο τη δημιουργία πανομοιότυπου όγκου. Στη συνέχεια η εξέλιξη της ασθένειας παρακολουθείται στο χρόνο, και νέα φάρμακα μπορούν να δοκιμαστούν για την ικανότητά τους να την αναχαιτήσουν. Ωστόσο, για να είναι επιτυχημένος ο σχηματισμός νέων όγκων απαιτείται η μεταμόσχευση χιλιάδων ή δεκάδων χιλιάδων κυττάρων. Κλασσικά, αυτό είχε αποδοθεί στη μεθοδολογία (π.χ. καρκινικά κύτταρα χάνονται-πεθαίνουν κατά τη μεταφορά) ή στην επίδραση του μικροπεριβάλλοντος. Οι υπέρμαχοι της θεωρίας των καρκινικών stem κυττάρων υποστηρίζουν ότι μόνο ένα μικρός υποπληθυσμός των κυττάρων υπό μεταμόσχευση, τα καρκινικά stem κύτταρα, έχουν τη δυναμική να δημιουργήσουν όγκο. Στη Οξεία Μυελογενή Λευχαιμία στον άνθρωπο η συχνότητα αυτών των κυττάρων είναι μικρότερη από 1 προς [81]. Η πρώτη πειστική απόδειξη για την ύπαρξη των καρκινικών stem κυττάρων δημοσιεύτηκε το 1997 στο Nature Medicine. Οι Βonnet και Dick [86] απομόνωσαν έναν υποπληθυσμό λευχαιμικών κυττάρων που εκφράζει έναν συγκεκριμένο επιφανειακό δείκτη, το CD34, αλλά όχι τον δείκτη CD38. Οι ερευνητές απέδειξαν πειραματικά ότι ο υποπληθυσμός CD34 + /CD38 - είναι ικανός να προκαλέσει όγκο σε ανοσοκατασταλμένα NOD/SCID ποντίκια που είναι ιστολογικά πανoμοιότυπος με του δότη. Περαιτέρω στοιχεία προέρχονται από την ιστολογική ανάλυση των όγκων. Πολλοί όγκοι είναι ετερογενείς και περιέχουν πολλαπλούς τύπους κυττάρων. Αυτή η ετερογένεια σε 110

111 γενικές γραμμές διατηρείται και στις μεταστάσεις. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι το κύτταρο που προκάλεσε τον όγκο έχει την δυνατότητα να παράγει πολλαπλούς κυτταρικούς τύπους. Με άλλα λόγια, έχει τη δυναμική για διαφοροποίηση, ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των stem κυττάρων [87]. Αυτό το αρχικό κύτταρο που δημιουργεί τον όγκο, και οι ιδιότητες του, είναι σε θέση να εξηγήσουν την γνωστή κυτταρική ετερογένεια που χαρακτηρίζει τον καρκίνο του μαστού όπως φαίνεται και στην εικόνα 55 αλλά και σε άλλα καρκινώματα. Ωστόσο, οι πιο πολλοί όγκοι αποτελούνται σε μεγάλο βαθμό από κύτταρα με κάποιου βαθμού διαφοροποίηση, και με βάση αυτή είναι δυνατόν να προσδιορισθεί ο ιστός προέλευσης, ακόμα και σε απομακρυσμένες μεταστάσεις. Εικόνα 55 Υποθετικό μοντέλο καρκινικών stem κυττάρων συμπαγών όγκων, με παράδειγμα τον καρκίνο του μαστού. Στη μέση είναι ένα πιθανό μονοπάτι διαφοροποίησης για τα φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του μαστού. Stem δι δύναμα κύτταρα δίνουν γένεση σε προγονικά δι δύναμα κύτταρα τα οποία μπορούν να δεσμευτούν προς προγονικά μυοεπιθηλιακά κύτταρα ή επιθηλιακά αδενικά κύτταρα, τα οποία με τη σειρά τους διαφοροποιούνται αντίστοιχα προς ώριμα μυοεπιθηλιακά και αδενικά επιθηλιακά κύτταρα αντίστοιχα. Κατά την διαφοροποίηση η ικανότητα για αυτο ανανέωση των κυττάρων σταδιακά ελαττώνεται. Τα καρκινικά stem κύτταρα μπορεί να προέρχονται από τα δι δύναμα stem κύτταρα ή από πιο διαφοροποιημένα κύτταρα που αποκτούν την ικανότητα για αυτο ανανέωση. Τα καρκινικά stem κύτταρα ωστόσο έχουν περιορισμένο εύρος διαφοροποίησης, και μπορούν μόνο να δημιουργήσουν όγκους με χαρακτηριστικά συγκεκριμένης κυτταρικής σειράς [88]. 111

112 Η ικανότητα ενός μόνο καρκινικού κυττάρου να δημιουργεί έναν πανομοιότυπο όγκο, έχει αποδειχθεί στη λευχαιμία με τη χρησιμοποίηση πειραματόζωων πολύ πριν γίνει εφικτή η χρήση αντισωμάτων και των μηχανών FACS [89]. Τα φυσιολογικά ανθρώπινα αιμοποιητικά stem κύτταρα είναι επίσης γνωστό ότι αποκαθιστούν την φυσιολογική αιμοποίηση, όταν μεταμοσχεύονται σε ανοσοκοκατασταλμένα ποντίκια. Η αναγνώριση καρκινικών stem κυττάρων σε λευχαιμίες παρότρυνε περαιτέρω έρευνα και σε άλλους τύπους καρκίνου. Καρκινικά stem κύτταρα έχουν πρόσφατα αναγνωρισθεί σε αρκετούς συμπαγείς όγκους [88], μεταξύ των οποίων : εγκέφαλο, μαστός, έντερο, ωοθήκες, πάγκρεας, προστάτης, ήπαρ, μελάνωμα,καρκίνωμα εκ πλακωδών κυττάρων. Ο πίνακας 3 συνοψίζει τους γνωστούς δείκτες καρκινικών stem κυττάρων σε καρκίνους στον άνθρωπο. Πίνακας 3 Φαινότυπος δείκτες καρκινικών stem κυττάρων που έχουν ταυτοποιηθεί σε ανθρώπινους συμπαγείς καρκίνους. Προέλευση των καρκινικών stem κυττάρων Η προέλευση των καρκινικών stem κυττάρων αποτελεί πεδίο έντονης έρευνας. Εντός της επιστημονικής κοινότητας υπάρχουν διαφορετικές απόψεις και είναι πιθανόν διάφορες απαντήσεις να είναι σωστές, ανάλογα με τον τύπο του όγκου και τον εκάστοτε φαινότυπο. Ένας περιοριστικός παράγοντας πάντως είναι το γεγονός ότι τα καρκινικά stem κύτταρα απομονώνονται συνήθως από τελικού σταδίου όγκους. Διάφορες θεωρίες λοιπόν έχουν διατυπωθεί σχετικά με την προέλευση των καρκινικών stem κυττάρων. Τα καρκινικά stem κύτταρα προκύπτουν [81] (εικόνα 56): 112

113 1. Εικ 1. μέσω μετάλλαξης φυσιολογικών, ειδικών των ιστών σωματικών stem ή προγονικών κυττάρων ή 2. κύτταρα υψηλότερης διαφοροποίησης αποκτούν μέσω πολλαπλών μεταλλάξεων, τις ιδιότητες της αυτο-ανανέωσης, πολυδυναμίας και αθανασίας που χαρακτηρίζουν τα τυπικά καρκινικά stem κύτταρα. Εικόνα 56 Προέλευση των καρκινικών stem κυττάρων. Οι δύο βασικοί πιθανοί μηχανισμοί είναι: (1) μετάλλαξη φυσιολογικών σωματικών stem ή προγονικών κυττάρων και (2) αποδιαφοροποίηση κυττάρων υψηλότερης διαφοροποίησης [10]. Η προέλευση των καρκινικών stem κυττάρων έχει ιδιαίτερη σημασία και διάφορα ερωτήματα εγείρονται [11, 81]. Εάν τα καρκινικά stem κύτταρα προέρχονται από φυσιολογικά stem κύτταρα, συνεπάγεται ότι είναι ικανά να επιστρατεύουν τα ρυθμιστικά μονοπάτια τους για την αυτο-ανανέωση. Από την άλλη μεριά, εάν προέρχονται από ώριμα, διαφοροποιημένα κύτταρα, απαιτείται μια σειρά από ογκογόνες μεταλλάξεις ώστε να απο-διαφοροποιηθούν και να αποκτήσουν την ικανότητα για αυτο-ανανέωση. Επειδή τα διαφοροποιημένα σωματικά κύτταρα έχουν περιορισμένο χρόνο ζωής, είναι σχετικά απίθανο να προκύψουν όλες οι απαραίτητες μεταλλάξεις στο σύντομο αυτό χρονικό διάστημα. Σε αντίθεση, το απεριόριστο δυναμικό αυτο-ανανέωσης των φυσιολογικών stem κυττάρων παρέχει αρκετό χρόνο και ίσως 113

114 αυτά να είναι τα μοναδικά κύτταρα στα οποία είναι δυνατόν να συσσωρευτούν οι αναγκαίες μεταλλάξεις [81]. Γι αυτό το λόγο αρκετοί ερευνητές υποστηρίζουν ότι αυτά είναι τα αρχικά κύτταρα προέλευσης των καρκινικών stem κυττάρων γιατί αντίθετα, είναι πολύ πιο δύσκολο για ένα ώριμο διαφοροποιημένο κύτταρο να αποκτήσει ξανά την δυνατότητα για αυτοανανέωση μέσω μεταλλάξεων. Επειδή όμως η παρουσία των stem κυττάρων σε ενήλικες ιστούς είναι εξαιρετικά σπάνια, είναι πιθανό τα προγονικά κύτταρα που διατηρούν εν μέρει τις χαρακτηριστικές τους ιδιότητες και είναι πιο συχνά να αποτελούν τελικά τα κύτταρα προέλευσής τους [81]. Η πιθανότητα τα καρκινικά stem κύτταρα να προκύπτουν με αποδιαφοροποίηση σωματικών διαφοροποιημένων κυττάρων υποστηρίζεται και από τις πρόσφατες μελέτες των Takahashi και συν. [6, 7]. Τα αποτελέσματά των ερευνών αυτών έδειξαν, όπως έχει αναφερθεί, ότι αρκεί η εξαναγκασμένη έκφραση λίγων μόνο μεταγραφικών παραγόντων, μεταξύ των οποίων ο Oct-4, c-myc, Sox2 και klf4, για να δημιουργηθεί ένα πολυδύναμο stem κύτταρο από ένα διαφοροποιημένο σωματικό ινοβλάστη ανθρώπου ή επίμυος. Αντίσταση των CSCs στις θεραπευτικές παρεμβάσεις Η αντίσταση στην απόπτωση είναι μια ιδιότητα-κλειδί που μοιράζονται εξίσου τα φυσιολογικά stem κύτταρα και τα πολύ επιθετικά καρκινικά κύτταρα. Τα stem κύτταρα έχουν αναπτύξει μια σειρά από μηχανισμούς που εξασφαλίζουν αυξημένη αντοχή στην απόπτωση, μεταξύ των οποίων η σηματοδότηση TGF-b ή η ενεργοποίηση του μονοπατιού Hedgehog (HH) [90]. Επιπρόσθετα, τα stem κύτταρα εκφράζουν σε υψηλότερα επίπεδα αντιαποπτωτικές πρωτείνες από ότι τα διαφοροποιημένα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων μελών της οικογένειας Bcl-2 [91]. Τα stem κύτταρα επίσης, προκειμένου να διατηρηθεί ο αριθμός τους, αποφεύγουν να μπουν σε κυτταρική αδράνεια, μια διαδικασία που διευκολύνεται από την έκφραση του μορίου Bmp-1. Παρουσιάζει ενδιαφέρον λοιπόν ότι αυτά τα μόρια, δηλαδή τα μόρια Bmp-1, Bcl-2, TGF-β και το μονοπάτι HH εκφράζονται σε υψηλότερο επίπεδο από το συνηθισμένο στα καρκινικά κύτταρα [81]. Παρά το απεριόριστο δυναμικό για αυτο-ανανέωση, τα φυσιολογικά stem κύτταρα είναι σχετικά αδρανή, και διαιρούνται σποραδικά εκτός αν ενεργοποιηθούν [92, 93]. Παρομοίως, τα καρκινικά stem κύτταρα μπορεί να περάσουν μεγάλες περιόδους αδράνειας και μικρές, σύντομες εξάρσεις έντονου πολλαπλασιασμού. Φαίνεται λογικό επομένως, ότι από τη στιγμή 114

115 που οι περισσότεροι χημειοθεραπευτικοί παράγοντες έχουν σχεδιασθεί να στοχεύουν ταχέως αναπτυσσόμενα κύτταρα, αυτός να είναι μηχανισμός μέσω του οποίου τα καρκινικά stem κύτταρα είναι ανθεκτικά στην τοξικότητά τους. Από μια εξελικτική σκοπιά, τα φυσιολογικά stem κύτταρα έχουν μια σειρά από μοναδικές ιδιότητες που τα βοηθούν να προστατεύονται από κυτταρικές επιθέσεις και εξασφαλίζουν μεγάλη διάρκεια ζωής. Για παράδειγμα, τα φυσιολογικά stem κύτταρα εκφράζουν υψηλά επίπεδα των πρωτεινών ABC μεταφορέων (transporters) που διευκολύνουν την γρήγορη έξοδο από το κυτταρόλασμα τοξινών και φαρμάκων, αλλά αυτά τα γονίδια απενεργοποιούνται στους δεσμευμένους απογόνους των stem κυττάρων και στα ώριμα διαφοροποιημένα κύτταρα [92]. Μαζί με το ABCC1, τα ABCB1 και ABCG2 αντιπροσωπεύουν τα τρία κυρίαρχα γονίδια ανθεκτικότητα σε πολλαπλά φάρμακα MDR (multi-drug resistance) τα οποία και υπερεκφράζονται στα κύτταρα του όγκου [81]. Αυτή η αντοχή στα φάρμακα είναι ιδιότητα και των καρκινικών stem κυττάρων και πιθανόν να μπορεί να εξηγήσει την ανθεκτικότητα των μεταστατικών εστιών στις συμβατικές θεραπευτικές παρεμβάσεις [92]. Τα stem κύτταρα θεωρείται ότι είναι πιο ανθεκτικά σε παράγοντες που είναι επιβλαβείς για το DNA σε σχέση με τα διαφοροποιημένα κύτταρα, λόγω της ιδιότητά τους να υφίστανται εκλεκτική διαίρεση των αλυσίδων DNA και της αυξημένης ικανότητάς τους για επιδιόρθωση του DNA. Όπως έχει αναφερθεί, σύμφωνα με την υπόθεση της «αθάνατης αλυσίδας DNA», η μητρική αθάνατη αλυσίδα DNA πάντα τοποθετείται στο νέο stem κύτταρο απόγονο που προκύπτει, και όχι στο πιο διαφοροποιημένο δεσμευμένο απόγονο, και έτσι προστατεύεται ο πληθυσμός των stem κυττάρων από βλάβες στο DNA [81]. Παρομοίως, τα καρκινικά stem κύτταρα θεωρείται ότι εμφανίζουν αντοχή στην ακτινοθεραπεία μέσω των αυξημένων δυνατοτήτων μηχανισμών επιδιόρθωσης του DNA έτσι ώστε να αποφεύγουν τον κυτταρικό θάνατο από βλάβες στο γενετικό υλικό [94, 95]. Μελέτες έχουν δείξει ότι η εφαρμογή ακτινοθεραπείας στον καρκίνο έχει ως αποτέλεσμα να μειώνεται ο πληθυσμός των μη stem καρκινικών κυττάρων, ενώ αυξάνεται ο πληθυσμός των καρκινικών stem κυττάρων κατά 3-5 φορές, μετατρέποντας έτσι τον όγκο πιο επιθετικό και ανθεκτικό στην ακτινοθεραπεία [95]. Είναι επίσης πιθανό τα καρκινικά stem κύτταρα να τείνουν να εντοπίζονται σε υποξικές περιοχές των όγκων, κάτι που μπορεί να επηρεάσει την ευαισθησία στην ακτινοθεραπεία [96]. 115

116 ΜΕΤΑΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ STEM ΚΥΤΤΑΡΩΝ Η μετάσταση είναι μια διαδικασία με πολλαπλά διαδοχικά στάδια, κατά την οποία τα καρκινικά κύτταρα πρέπει να δραπετεύσουν από τον πρωτογενή όγκο, να εισέλθουν στο αγγειακό δίκτυο ή στα λεμφαγγεία, να ταξιδέψουν στο ανθρώπινο σώμα, να εξαγγειωθούν από την κυκλοφορία, να προσκολληθούν σε μια δευτερογενή εστία και στην δευτερογενή εστία να δημιουργήσουν μικρομεταστάσεις, να αναπτύξουν υποστηρικτικό αγγειακό δίκτυο και τελικώς να σχηματίσουν μακροσκοπικές κλινικά σημαντικές μεταστάσεις [97, 98]. Η διασπορά των καρκινικών κυττάρων από τον πρωτογενή όγκο στις μεταστατικές εστίες, έχει παραδοσιακά θεωρηθεί ως ένα γεγονός προχωρημένου σταδίου στην εξέλιξη του όγκου. Ωστόσο, αρκετά δεδομένα υποστηρίζουν πλέον ότι η έναρξη της μετάστασης πιθανόν να ξεκινά νωρίτερα. Προχωρημένες ανοσοστοϊχημικές και μοριακές τεχνικές ικανές να ανιχνεύουν ακόμα και μεμονωμένα καρκινικά κύτταρα, έδειξαν ότι κύτταρα του όγκου είναι συχνά παρόντα στην αιματική κυκλοφορία και στον μυελό των οστών σε ασθενείς με καρκίνο πριν την εμφάνιση κλινικής ή ιστοπαθολογικής μετάστασης [99]. Μεταστατική ανεπάρκεια Λόγω της πολυπλοκότητας της μεταστατικής διαδικασίας, φαίνεται σχετικά απίθανο να μπορέσουν όλα τα καρκινικά κύτταρα να ολοκληρώσουν με επιτυχία όλα τα απαραίτητα στάδια που απαιτούνται για να σχηματίσουν μακρο-μεταστάσεις (εικόνα 57). Είναι γνωστό ότι η διαδικασία της μετάστασης είναι μια ανεπαρκής διαδικασία [97, 98]. Προηγούμενες μελέτες από τον Luzzi και συνεργάτες έδειξαν ότι όλα τα καρκινικά κύτταρα ήταν ικανά στο να εισέλθουν εντός του αγγείου, να ταξιδέψουν μέσω της αιματικής ή λεμφαγγειακής κυκλοφορίας, να εξαγγειωθούν και να προσκολληθούν στο μεταστατική εστία. Στη πραγματικότητα, σχεδόν το 90% των μεταστατικών κυττάρων μπορούν με επιτυχία να ολοκληρώσουν αυτά τα αρχικά στάδια στην μεταστατική διαδικασία. Ωστόσο μόνο το 2% περίπου αυτών των κυττάρων καταφέρνουν τελικά να δημιουργήσουν μικρομεταστάσεις και μόνο το 0,02% σχηματίζουν μακρομεταστάσεις με πλούσιο αγγειακό υποστηρικτικό δίκτυο [100]. 116

117 Εικόνα 57 Για να ολοκληρωθεί με επιτυχία η μετάσταση ενός καρκινικού κυττάρου είναι απαραίτητο να διεκπεραιώσει μια σειρά από διαδοχικά βήματα προκειμένου να προκαλέσει κλινικά σημαντικές μεταστατικές εστίες. Είναι γνωστό ότι η διαδικασία της μετάστασης είναι μια ανεπαρκής διαδικασία ενώ δεν είναι όλα τα στάδια εξίσου ανεπαρκή. Τα στάδια που κυρίως περιορίζουν την επιτυχία της διαδικασίας είναι το (5) έναρξη ανάπτυξης μέσα στην εστία μικρομετάστασης και (6) διατήρηση της ανάπτυξης εντός της μακρο μετάστασης, καθώς λιγότερο από 2% των κυττάρων καταφέρνουν να ολοκληρώσουν το στάδιο (5) και λιγότερο από 0.02% το στάδιο (6) [81]. 117

118 Εικόνα 58 Βασικά στάδια της μετάστασης και τα γονίδια που συμμετέχουν. Τα βασικά στάδια της μετάστασης περιλαμβάνουν την εξέλιξη της πρωτογενούς εστίας προς διηθητικό καρκίνωμα και διασπορά των καρκινικών μέσω των αιμοφόρων αγγείων ή των λεμφαγγείων. Τα κυκλοφορούντα κύτταρα του όγκου που επιβιώνουν μπορούν να διεισδύσουν σε απομακρυσμένα όργανα. Αυτά τα κύτταρα στο νέο μικροπεριβάλλον μπορούν να προχωρήσουν προς δημιουργία μετάστασης με ή χωρίς την παραμβολή μιας λανθάνουσας περιόδου. Αυτά τα στάδια υποστηρίζονται από λειτουργίες των ίδιων των καρκινικών κυττάρων ή του καρκινικού μικροπεριβάλλοντος. Επιπλέον, η μετάσταση απαιτεί προκειμένου να ολοκληρωθεί, την πλήρη λειτουργικότητα δαιφορετικών ομάδων γονιδίων τα οποία παρέχουν τις απαραίτητες λειτουργίες για την έναρξη και εξέλιξή της. Αυτές οι λειτουργίες είναι δυνατό να αποκτηθούν μέσω γενετικών ή επιγενετικών τροποποιήσεων, και μπορούν συνολικά να ενισχύσουν τα κυκλοφορούντα κύτταρα του όγκου με τις απαραίτητες ικανότητες για διήθηση, επιβίωση στη λανθάνουσα φάση και τον αποικισμό απομακρυσμένων οργάνων [101]. Η εφαρμογή της θεωρίας των καρκινικών stem κυττάρων, υποθέτει ότι αυτό το μικρό υποσύνολο κυττάρων μέσα στον πρωτογενή όγκο που είναι ικανό να σχηματίσει μεταστάσεις σε απομακρυσμένες εστίες, είναι στη πραγματικότητα καρκινικά stem κύτταρα. Προτείνει επίσης, ότι η ανεπάρκεια της μεταστατικής διαδικασίας οφείλεται αμφότερα στην σπανιότητα των καρκινικών stem κυττάρων και στο μη κατάλληλο μικροπεριβάλλον. Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται από το γεγονός ότι τα μεταστατικά κύτταρα και τα stem κύτταρα έχουν ορισμένες κοινές ιδιότητες, μεταξύ των οποίων απεριόριστη ικανότητα για αυτο-ανανέωση, την ανάγκη για ύπαρξη συγκεκριμένου κατάλληλου κάθε φορά μικροπεριβάλλοντος ή φωλεάς για να αναπτυχθούν, την χρήση του άξονα SDF-1/CXCR4 για μετάσταση καθώς και αυξημένη αντοχή σε φάρμακα [81]. 118

119 Ο ρόλος του άξονα SDF-1/CXCR4 Τα μεταστατικά καρκινικά stem κύτταρα χρησιμοποιούν χημειοκίνες για την μετανάστευση. Η χημειοκίνη SDF-1 πιστεύεται ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην μετανάστευση του stem κυττάρου σε συνδυασμό με τον υποδοχέα της CXCR4. Το μόριο SDF-1 είναι ένας ιδανικός υποψήφιος για την υποστήριξη της μετάστασης, και αυτό επειδή ο βιολογικός του ρόλος σχετίζεται με την ικανότητά του να προάγει την κινητικότητα, την προσκόλληση, την ανταπόκριση στα χημειοτακτικά ερεθίσματα, την έκκριση των μεταλλοπρωτεϊνασών (MMPs) καθώς και αγγειογενετικών παραγόντων όπως ο VEGF, στα κύτταρα που εκφράζουν τον υποδοχέα CXCR4 [102]. O SDF-1 επίσης αυξάνει την προσκόλληση των κυττάρων στο VCAM-1, την ινωδονεκτίνη (fibronectin) και το ινωδογόνο (fibrinogen) μέσω της ενεργοποίησης- τροποποίησης της λειτουργίας ορισμένων ιντεγρινών [103]. Κατά την ανάπτυξη του καρκίνου, η έκκριση του SDF-1 από τους ινοβλάστες και η παρουσία του CXCR4 στα κύτταρα του όγκου, συχνά αυξάνεται στις υποξικές περιοχές του όγκου, με επακόλουθο την διέγερση της ανάπτυξης του όγκου, της κινητικότητας και της διηθητικότητας. Επιπλέον πολλά CXCR4 + μεταστατικά κύτταρα χρησιμοποιούν τον άξονα SDF-1/CXCR4 για να μεταναστεύσουν στο σώμα σύμφωνα με την κλίση της συγκέντρωσης του SDF-1 [103, 104]. Την υπόθεση αυτή υποστηρίζει μελέτη με κύτταρα καρκίνου του μαστού, στα οποία χορηγήθηκε αναστολέας του CXCR4, με αποτέλεσμα να εμφανίζουν σημαντικά μειωμένο μεταστατικό δυναμικό [105]. Αντίστοιχα αποτελέσματα διαπιστώθηκαν σε γλοιοβλαστώματα [106]. Αυτός ο άξονας πιθανόν εξηγεί εν μέρει την οργανο-ειδική φύση της μεταστατικής ανάπτυξης, αφού τα καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν το CXCR4 μπορούν να εγκατασταθούν σε όργανα με υψηλα επίπεδα έκφρασης του SDF-1. Για παράδειγμα, ο καρκίνος του μαστού βρέθηκε πειραματικά να μεταναστεύει σύμφωνα με αυτόν τον άξονα, με τα μαστικά καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν το CXCR4 να μεταναστεύουν κατά προτίμηση σε όργανα που εκφράζουν το SDF-1, όπως οι λεμφαδένες, το ήπαρ και τα οστά [97, 98]. Πολλοί καρκίνοι είναι θετικοί για την έκφραση του CXCR4 [103, 104] και φαίνεται τουλάχιστον για τον καρκίνο του μαστού, ότι η έκφραση του CXCR4 σχετίζεται με την αναλογία σε καρκινικά stem κύτταρα και επομένως με την επιθετικότητα των καρκινικών 119

120 κυτταρικών σειρών. Σαν παράδειγμα, συγκριτικά με τα μη μεταστατικά μαστικά καρκινικά κύτταρα MCF-7, τα υψηλού μεταστατικού δυναμικού MDA-MB-231 κύτταρα έχουν μεγαλύτερη αναλογία σε καρκινικά stem κύτταρα και εκφράζουν σε υψηλότερα επίπεδα το CXCR4 [104]. Οργανο-ειδική μετάσταση Η ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης στην μεταστατική εστία διαφέρει ανάλογα με το όργανο που φιλοξενεί την μεταστατική εστία, ενώ πολλοί καρκίνοι δείχνουν προτίμηση προς συγκεκριμένα όργανα-στόχους για να δώσουν μετάσταση (εικόνα 58). Για παράδειγμα ο καρκίνος του παχέος εντέρου δίνει μετάσταση συνήθως στο ήπαρ, ο καρκίνος του προστάτη στα οστά και ο καρκίνος του μαστού μεθίσταται κυρίως στους επιχώριους λεμφαδένες, οστά, ήπαρ, εγκέφαλο και πνεύμονες [97, 98]. Αρχικά υπήρχε η εντύπωση ότι η εντόπιση των μεταστάσεων θα μπορούσε να εξηγηθεί με βάση την ροή της αιματικής ή λεμφαγγειακής κυκλοφορίας [100]. Σύμφωνα με αυτό το μηχανικό μοντέλο, τα καρκινικά κύτταρα που είναι αρκετά μεγαλύτερα σε μέγεθος από τα ερυθροκύτταρα παγιδεύονται στο τριχοειδικό δίκτυο του πρώτου οργάνου που έρχεται σε επαφή μέσω της κυκλοφορίας και έτσι οι μεταστάσεις γίνονται στα σημεία αυτά [97]. Ωστόσο, αρκετές θεωρίες αμφισβητούν το μοντέλο αυτό προτείνοντας ότι υπάρχουν επιπρόσθετοι μηχανισμοί σε μοριακό επίπεδο οι οποίοι είναι σε θέση να εξηγήσουν πως και γιατί τα καρκινικά κύτταρα δείχνουν προτίμηση σε συγκεκριμένες μεταστατικές εστίες κάθε φορά. Μια από αυτές είναι η θεωρία the seed and soil η οποία διατυπώθηκε για πρώτη φορά το 1889 από τον Stephen Paget [107]. Ο Paget πρόβλεψε ότι τα καρκινικά κύτταρα (the seed) μπορούν να επιβιώσουν και να πολλαπλασιαστούν μόνο σε δευτερογενείς εστίες (the soil), όπου παράγονται οι κατάλληλοι αυξητικοί παράγοντες για τον κάθε τύπο κυττάρου και αυτή η θεωρία έχει αντέξει στη πάροδο του χρόνου σε μεγάλο βαθμό. Μία άλλη θεωρία, γνωστή και ως homing theory, προτείνει ότι διαφορετικά όργανα παράγουν χημειοτακτικούς παράγοντες [πχ χημειοκίνες όπως το μόριο SDF-1(cell-derived factor 1)] οι οποίοι προσελκύουν συγκεκριμένους τύπους καρκινικών κυττάρων για εγκατάσταση σε συγκεκριμένο όργανο-στόχο [102, 103]. Είναι πιθανό αυτές οι υποθέσεις να είναι σωστές ταυτόχρονα. Από τη στιγμή δηλαδή που η μετάσταση είναι μια τόσο ανεπαρκής διαδικασία, με βασικές αιτίες την αδυναμία ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων στη 120

121 μεταστατική εστία, είναι πιθανό η αρχική διασπορά των καρκινικών κυττάρων να είναι μηχανική σύμφωνα με το πρότυπο της αιματικής κυκλοφορίας. Το εάν θα αναπτυχθεί όμως ή όχι η μεταστατική εστία, εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το μικροπεριβάλλον και την δυνατότητα της δευτερογενούς εστίας να υποστηρίξει την ανάπτυξη του όγκου. Εικόνα 58 Οργανο ειδικοί φραγμοί για την μεταστατική διείσδυση. Οι δυνητικοί φραγμοί στη μετάσταση σε διαφορετικά μέρη, μπορεί να περιγραφεί με το παράδειγμα του καρκίνου του μαστού και την ανατομία του τριχοειδικού δικτύου σε διαφορετικά όργανα στόχους. Τα καρκινικά κύτταρα του μαστού που εισέρχονται στην κυκλοφορία μπορούν να διηθήσουν ένα απομακρυσμένο όργανο εάν διαθέτουν τις απαραίτητες λειτουργίες για την εξαγγείωση. Η θυριδωτή δομή των τριχοειδικών δικτύων του μυελού των οστών επιτρέπει σε μεγαλύτερο βαθμό την διείσδυση του καρκινικού κυττάρου σε σχέση με τη συνεχή χωρίς διάκενα δομή του πνευμονικού τριχοειδικού δικτύου. Τα τριχοειδή του εγκεφάλου είναι λιγότερο διαπερατά χάρη στην μοναδική φύση του αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Η διήθηση μέσω αυτών των φραγμών επιτυγχάνεται για εκείνα τα καρκινικά κύτταρα που διαθέτουν τις απαραίτητες λειτουργίες και ιδιότητες για την εξαγγείωση. Αυτές οι λειτουργίες ελέγχονται από γονίδια, των οποίων η έκφραση, παρέχει ένα συγκριτικό αναπτυξιακό πλεονέκτημα στους πρωτογενείς όγκους (όπως το remodellimg των αγγείων) ή από γονίδια, των οποίων η έκφραση, δεν παρέχει κάποιο πλεονέκτημα στους πρωτογενείς όγκους αλλά είναι το αποτέλεσμα σημάτων από το μικροπεριβάλλον [101]. 121

122 ΚΑΡΚΙΝΙΚΑ STEM ΚΥΤΤΑΡΑ ΚΑΙ ΕΞΕΙΔΙΚΕΥΜΕΝΟ ΜΙΚΡΟΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ (ΦΩΛΕΑ) To μικροπεριβάλλον της πρωτογενούς εστίας έχει περιγραφεί καλύτερα από τις μεταστατικές εστίες (εικόνα 59). Αυτή η φωλεά αποτελείται από υποστηρικτικά κύτταρα του στρώματος, διαλυτούς παράγοντες, αγγειακό δίκτυο, θρεπτικά συστατικά και εξωκυττάρια ουσία με την συγκεκριμένη αρχιτεκτονική δομή της [81]. Απαιτείται επίσης ανοσολογικό και φλεγμονώδες μικροπεριβάλλον που να επιτρέπει την ανάπτυξη του όγκου [108] (πίνακας 4). Εικόνα 59 Το μικροπεριβάλλον της πρωτογενούς εστίας a) Τα καρκινικά κύτταρα στις πρωτοπαθείς εστίες περιβάλλονται από ένα σύνθετο μικροπεριβάλλον που αποτελείται από πληθώρα κυττάρων μεταξύ των οποίων ενδοθηλιακά κύτταρα της αιματικής και της λεμφαγγειακής κυκλοφορίας, ινοβλάστες του στρώματος και μια ποικιλία από κύτταρα προερχόμενα από το μυελό των οστών όπως μακροφάγα, κατασταλτικά κύτταρα (MDSCs), μονοκύτταρα που εκφράζουν το TIE2 (TEMs) και μεσεγχυματικά stem κύτταρα (MSCs). b) Διηθητικό καρκίνος του μαστού με χρώση αιματοξυλίνηςηωσίνης, στον οποίο είναι εμφανής διήθηση από λευκοκύτταρα (λευκά βέλη) στο όριο διήθησης. c) Μακροφάγα στο όριο διήθησης καρκίνου παγκρέατος εκφράζουν cathepsin B (πράσινο) που συνδέεται με την απώλεια της επιθηλιακής καντχερίνης (κόκκινο) στα γειτονικά καρκινικά κύτταρα. Οι πυρήνες των κυττάρων είναι ορατοί με DAPI (μπλε) [12]. 122

123 Η παρακρινής σηματοδότηση μεταξύ των επιθηλιακών και των κυττάρων του μικροπεριβάλλοντος (στρώματος) είναι πολύ σημαντική για την ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων καθώς και των δυνατοτήτων τους για διήθηση, μετάσταση και δημιουργία αγγειακού υποστηρικτικού δικτύου [12]. Πίνακας 4 Σημαντικά μόρια στον μυελό των οστών και τις μεταστατικές περιφερικές φωλεές [109]. 123

124 Η ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΣΤΑΣΗΣ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΑΠΟ ΤΗ ΦΩΛΕΑ Το μικροπεριβάλλον του όγκου έχει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση και τον έλεγχο των καρκινικών stem κυττάρων [12] (εικόνα 60). Εικόνα 60 Τα Cancer Stem Cells (CSCs) διαντιδρούν με στοιχεία του μικροπεριβάλλοντος του όγκου, τα οποία συγκροτούν την φωλεά των καρκινικών stem κυττάρων. Τα κύτταρα της φωλεάς εκκρίνουν παράγοντες οι οποίοι υποστηρίζουν την αυτο ανανέωση των CSC. Tα CSCs διατηρούν την δυναμική διαφοροποίησης και παράγουν κύτταρα του όγκου που στερούνται της ικανότητας αυτοανανέωσης, συνιστούν όμως την κύρια μάζα του νεοπλάσματος και συμβάλλουν στην ετερογένεια του όγκου. Τα CSCs μπορεί να είναι ανθεκτικά στην χημειοθεραπεία και/ή ακτινοθεραπεία και μπορεί να εκφράζουν CSC ειδικά αντιγόνα. Η τρέχουσα έρευνα εστιάζει στην ταυτοποίηση των μοριακών μηχανισμών που ρυθμίζουν τις ιδιότητες αυτές των καρκινικών stem κυττάρων και του μικροπεριβάλλοντός τους (φωλεά), αφού αποτελούν εν δυνάμει επί μέρους στόχους επιλεκτικής θεραπείας [110]. Τα μεσεγχυματικά stem κύτταρα μπορούν να διαφοροποιηθούν σε διάφορους κυτταρικούς τύπους και επιστρατεύονται στους πρωτοπαθείς όγκους όπου και ενισχύουν την μετάσταση. Τα κύτταρα του όγκου προστατεύονται κατά τη διάρκεια του «ταξιδιού τους» στην αιματική 124

125 κυκλοφορία και ιδιαίτερα από τα αιμοπετάλια. Τα αιμοπετάλια, σε συνδυασμό με τα καρκινικά κύτταρα, ενεργοποιούν το σύστημα πήξης με αποτέλεσμα να δημιουργούνται μικροθρόμβοι, οι οποίοι βοηθούν τα καρκινικά κύτταρα να ενσωματωθούν στα όργαναστόχους [12]. Όπως έχει αναφερθεί, ο σχηματισμός των μεταστάσεων έχει πολλά στάδια που περιορίζουν την επιτυχημένη ολοκλήρωσή του και τα οποία πρέπει να υπερκεραστούν. Σε όλα αυτά τα στάδια είναι απαραίτητα στοιχεία από το μικροπεριβάλλον ενώ πολύ σημαντική είναι η επιστράτευση ποικίλλων κυττάρων από το μυελό των οστών (εικόνα 61). Εικόνα 61 Η μοίρα των καρκινικών κυττάρων στο μεταστατικό μικροπεριβάλλον. Μετά την είσοδο στην κυκλοφορία των καρκινικών κυττάρων, μια σειρά από περιοριστικά στάδια επηρεάζουν την ικανότητά τους να δημιουργήσουν δευτερογενείς όγκους στην μεταστατική εστία. Σε κάθε στάδιο, τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να έχουν διαφορετικές τύχες (θάνατος, επιβίωση ή αδράνεια), που ρυθμίζονται από παράγοντες του μικροπεριβάλλοντος όπως είναι οι συναθροίσεις αιμοπεταλίων στην κυκλοφορία, η ενεργοποίηση των αυτόχθονων στρωματικών κυττάρων και η επιστράτευση και διαφοροποίηση των κυττάρων από τον μυελό των οστών [12]. Η μεταστατική φωλεά: προσαρμόζοντας το ξένο έδαφοs Υπάρχουν πλέον στοιχεία που στηρίζουν την αντίληψη ότι το μικροπεριβάλλον του όγκου έχει έναν πιο ενεργό ρόλο στην ανάπτυξη του και στη δημιουργία μεταστάσεων, και ότι μη καρκινικά stem κύτταρα συμβάλλουν επίσης στον σχηματισμό της φωλεάς [13] (εικόνα 62). Το μοντέλο της μεταστατικής φωλεάς προβλέπει ότι ένα κατάλληλο μικροπεριβάλλον (προμεταστατική φωλέα) πρέπει να αναπτυχθεί προκειμένου τα κύτταρα του όγκου να είναι ικανά 125

126 να προσκολληθούν και να αναπτυχθούν σε δευτερεύουσες εστίες (μεταστατική φωλεά) με τον σχηματισμό μικρο- και τελικά μακρο-μεταστάσεων [13]. Εικόνα 62 Σύγκριση των φωλεών των stem κυττάρων υπό φυσιολογικές και υπό καρκινικές συνθήκες. Η φωλεά σε φυσιολογικές συνθήκες παρέχει ένα μικροπεριβάλλον που κυρίως αναστέλλει και τον πολλαπλασιασμό και την διαφοροποίηση. Ωστόσο, ένα παροδικό σήμα για πολλαπλασιασμό απαιτείται για να υποστηρίξει την συνεχιζόμενη αναγέννηση του ιστού (ομοιόσταση). Στον καρκίνο ή στους όγκους, εξαιτίας εσωτερικών μεταλλάξεων, τα καρκινικά stem κύτταρα μετατρέπονται σε αυτόνομα και αρχίζουν να πολλαπλασιάζονται ανεξέλεγκτα και/ή η φωλεά μετατρέπεται σε ένα μικροπεριβάλλον παρέχοντας σήματα που κυρίως ευνοούν τον πολλαπλασιασμό και ανάπτυξη των κυττάρων. Σε ορισμένες περιπτώσεις, απαιτείται συνδυασμός και των δύο καταστάσεων. Επιπρόσθετα, ο ανεξέλεγκτος πολλαπλασιασμός των stem/προγονικών κυττάρων οδηγεί σε επέκταση της δεξαμενής των προγονικών κυττάρων, γεγονός που ευνοεί την συσσώρευση μεταλλάξεων σε αυτά [111]. Αυτές οι φωλεές σχηματίζονται σαν αποτέλεσμα της έκκρισης διάφορων παραγόντων από τον όγκο, και μπορεί να είναι είτε εντελώς καινούριες ή να σχηματίζονται σε έδαφος προυπάρχουσας φυσιολογικής φωλεάς. Τα δεδομένα που στηρίζουν την εν λόγω υπόθεση, προέρχονται κυρίως από πειράματα με επίμυες, ενώ εστιάζουν κυρίως στον πνεύμονα σαν όγανο-στόχο, αν και άλλα όργανα όπως το ήπαρ, ο εγκέφαλος και τα οστά έχουν επίσης μελετηθεί [13]. Παραμένει άγνωστο ωστόσο εάν το συγκεκριμένο μοντέλο αφορά όλους 126

127 τους συμπαγείς όγκους ή ορισμένους μόνο τύπους. Επιπλέον, αν και υπάρχει πληθώρα στοιχείων που περιγράφουν την μεταστατική φωλεά, η ιδέα της προ-μεταστατικής φωλεάς είναι σχετικά καινούργια και χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση. Το παρέγχυμα των οργάνων στόχων για μετάσταση θεωρείται ότι προσαρμόζεται πριν την άφιξη των πρώτων κυττάρων του όγκου, ως αποτέλεσμα συστηματικών επιδράσων των παραγόντων που εκκρίνονται από τον αρχικό όγκο. Είναι επίσης πιθανό τα καρκινικά κύτταρα να προσαρμόζουν το δικό τους μεταστατικό μικροπεριβάλλον με παρακρινή τρόπο. Παρά την μεγάλο πρόδο στην κατανόηση της μεταστατικής διαδικασίας, οι καρκινικές μεταστάσεις παραμένουν η βασική αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας στον καρκίνο. Είναι προφανές ότι η επιτυχία του μοντέλου της μετασταστικής φωλεάς δημιουργεί νέα δεδομένα για καλύτερη πρόγνωση και πρώιμες θεραπευτικές παρεμβάσεις [13]. Η προ-μεταστατική φωλεά Η αρχική διανομή των κυττάρων από τον αρχικό όγκο προς τις μεταστατικές εστίες γίνεται μηχανικά μέσω του αγγειακού δικτύου [112]. Η ανατομία των αγγείων που αρδεύουν τον όγκο, η διάμετρος του αυλού των αγγείων, η αιματική ροή και πίεση καθώς και τα φυσικά χαρακτηριστικά των κυττάρων του όγκου επηρεάζουν και καθορίζουν την περιοχή που πιθανόν θα σταματήσουν καθώς διέρχονται από το αγγεικό δίκτυο. Πρόσφατα, έχουν προκύψει δεδομένα που υποστηρίζουν την έκκριση μορίων από τον αρχικό όγκο και τα οποία προετοιμάζουν ορισμένους ιστούς για προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων [113, 114, 115] (εικόνα 63). Σε απάντηση αυτών των διαλυτών παραγόντων, τα κύτταρα που σχετίζονται με τον όγκο, όπως τα αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα και μακροφάγα, ενσωματώνονται στην προ-μεταστατική φωλεά δημιουργώντας ένα περιβάλλον που θα καθοδηγήσει την προσκόλληση και διήθηση των καρκινικών κυττάρων [113, 114]. Έτσι συγκεκριμένες περιοχές εντός των οργάνων που έχουν καθορισθεί με αυτόν τον τρόπο, θεωρούνται ως προ-μεταστατικές φωλεές. Αυτές εξελίσσονται σε μεταστατικές φωλεές μετά και την ενσωμάτωση των κυττάρων του όγκου [12, 114]. 127

128 Εικόνα 63 Μοντέλο για την ανάπτυξη της μεταστατικής φωλεάς. Η εικόνα αυτή δείχει την μετάβαση από την προ μεταστατική εστία στην μικρο και τελικά στη μακρο μετάσταση. a) Σε απάντηση στην έκκριση αυξητικών παραγόντων από τον πρωτογενή όγκο, όπως ο VEGFA, PIGF και ο TGF β, αυξάνεται η έκφραση των φλεγμονωδών χημειοκινών S100 και των πρωτεϊνών SAA3 στις προμεταστατικές θέσεις, οδηγώντας στην συνάθροιση των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων (HPCs) με προέλευση τον μυελό των οστών. Ο εκκρινόμενος από τα αιμοπετάλια αυξητικός παράγοντας SDF 1, είναι επίσης χημειοτακτικός για τα CXCR4 + HPCs και τα μεταστατικά κύτταρα του όγκου (MTCs). Τα HPCs εκκρίνουν ένα πλήθος προ μεταστατικών παραγόντων μεταξύ των οποίων ο TNF a, ο TGF β και MMP9. Οι ενεργοποιημένοι ινοβλάστες, με πιθανή προέλευση τα μεσεγχυματικά stem κύτταρα, εκκρίνουν ινωδονεκτίνη, μια σημαντική πρωτεΐνη προσκόλλησης στη φωλεά ενώ αυξάνεται η έκφραση του μορίου LOX, τροποποιώντας την τοπική εξωκυττάρια ουσία. b) Τα MTCs ενσωματώνονται στη φωλεά και εποικίζουν την μικρομετάσταση. Η οργανο ειδική έκφραση των ιντεγρινών προσκόλλησης στα ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα όπως η P σελεκτίνη και η E σελεκτίνη μπορεί να επηρεάσουν την προσκόλληση των MTCs και την εξαγγείωση σε αυτές τις θέσεις. Οι διαντιδράσεις κυττάρου κυττάρου,όπως η σύνδεση CD44 στη μεταστατική φωλεά,μπορεί να ενισχύσει την επιβίωση των MTCs καθώς και τον πολλαπλασιασμό. c) Η στρατολόγηση των ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων στην πρώιμη μεταστατική φωλεά διαμεσολαβεί την αγγειογένεση και επιτρέπει την εξέλιξη σε μακρομετάσταση [ 13]. 128

129 Φαίνεται ότι αυτές οι φωλεές αναπτύσονται κατά προτίμηση σε ορισμένες περιοχές εντός ενός οργάνου, όπως γύρω από τα τελικά βρογχιόλια και τις φλέβες τους στους πνεύμονες [113], αν και αυτό δεν έχει οριστικά αποδειχθεί. Αξιοσημείωτα, η σπουδαιότητα των διαλυτών παραγόντων που εκκρίνονται από τον αρχικό όγκο και πώς αυτοί επηρεάζουν την κατανομή των μεταστάσεων, φάνηκε σε μια σειρά πειραμάτων όπου έγινε ενδοπεριτοναϊκή έγχυση κυττάρων που είχαν καλλιεργηθεί μαζί με B16 κύτταρα μελανώματος σε επίμυες με καρκίνο του πνεύμονος [13]. Τα αποτελέματα έδειξαν ότι, η μετάσταση έγινε σε όργανα χαρακτηριστικά των μελανωμάτων, που παρατηρούνται σπάνια όμως σε μεταστάσεις καρκίνων του πνεύμονα, όπως είναι ο σπλήνας, το έντερο, οι νεφροί και οι σάλπιγγες. Εναρξη της προ-μεταστατικής φωλεάς Ο καρκίνος, έχει πολύ καιρό τώρα συσχετισθεί με την μεγάλης κλίμακας κινητοποίηση φλεγμονωδών κυττάρων στο αίμα και στα αιμοποιητικά όργανα [114]. Πρόσφατα, παρατηρήθηκε ότι αιμοποιητικά κύτταρα με προέλευση τον μυελό των οστών που εκφράζουν τον υποδοχέα 1 του παράγοντα VEGF (VEGFR1) εντοπίζονται σε προ-μεταστατικές θέσεις πριν την άφιξη των καρκινικών κυττάρων [113]. Αυτά είναι κύτταρα της μυελοειδούς σειράς, διατηρούν την έκφραση των επιφανειακών δεικτών CD34, CD116, KIT και SCA1 μέσα στο ιστικό παρέγχυμα και θεωρείται ότι διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στον σχηματισμό της προ-μεταστατικής φωλεάς. Τα VEGFR1 + κύτταρα εκφράζουν επίσης τον υποδοχέα της ινωδονεκτίνης V1A4 (γνωστό και ως ιντεγρίνη α4β1), ενώ παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης της ινωδονεκτίνης σ αυτές τις θέσεις. Τα VEGFR1 + HPCs (μαζί με το μόριο ινωδονεκτίνη) τροποποιούν το τοπικό μικροπεριβάλλον, με επακόλουθη ενεργοποίηση των ιντεγρινών και χημειοκινών ( όπως το SDF-1) που προωθούν την προσκόλληση, επιβίωση και ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου. Όταν χρησιμοποιήθηκε αντι-vegfr1 + αντίσωμα, τα υποστηρικτικά συσσωματώματα κυττάρων που παρατηρήθηκαν αρχικά εξαφανίστηκαν, και απετράπη η μετάσταση του όγκου, υποδηλώνοντας ότι αυτά τα συσσωματώματα πολύ πιθανόν να διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της μετάστασης [99, 113, 116, 117]. Η εκλεκτική αύξηση της έκφρασης των παραγόντων που σχετίζονται με την ρύθμιση της μετάστασης σε ορισμένα όργανα, μπορεί να συμβάλλει στην οργανο-ειδική φύση της μετάστασης. Η κινητοποίηση των VEGFR1 + μυελοειδών κυττάρων από τον μυελό των οστών και η επιστράτευσή τους σε προ-μεταστατικές θέσεις, θεωρήθηκε αρχικά ότι ήταν το 129

130 αποτέλεσμα κυτταροκινών με αγγειοκινητική δράση όπως οι VEGFΑ και P1GF (μέλος της οικογένειας VEGF που συνδέεται ειδικά με τον υποδοχέα VEGFR1) οι οποίες εκκρίνονται από τους πρωτογενείς όγκους [113]. Πρόσφατα, αποδείχθηκε ότι και φλεγμονώδεις κυτταροκίνες είναι ικανές να στρατολογούν αιμοποιητικά και καρκινικά κύτταρα σε προ-μεταστατικές θέσεις [114]. Η εξέταση προμεταστατικού πνεύμονα επίμυος με επαγόμενο πειραματικά B16 μελάνωμα από τον Hiratsuka και συν. [114], έδειξε ότι τα μόρια VEGFA, TGF-β και TNF-α που εκκρίνονται από τον πρωτογενή όγκο, επάγουν την έκφραση των φλεγμονωδών πρωτεϊνών S100A8 και S100A9 ειδικά στο παρέγχυμα του πνεύμονα (όργανο-στόχος της μετάστασης) και όχι σε άλλα όργανα όπως το ήπαρ ή ο νεφρός. Αυτό είχε σαν αποτέλεσμα την διήθηση από μυελοειδή κύτταρα που εκφράζουν τα επιφανειακά αντιγόνα ιντεγρίνη am (γνωστή και ως MAC1) ή CD11b [114]. Στην πρωτογενή εστία του όγκου, η διατάραξη της ακεραιότητας των αγγείων επιτρέπει την εξαγγείωση εξωκυτταρικών πρωτεϊνών και φλεγμονωδών κυττάρων [114], και είναι ζωτικής σημασίας για την ολοκλήρωση της μετάστασης [ ]. Προ-μεταστική φωλεά: στόχος για την μετάσταση του όγκου Στη προ-μεταστατική φωλεά, τα στρατολογημένα μυελοειδή κύτταρα συνεργάζονται με άλλους τύπους κυττάρων μεταξύ των οποίων κύτταρα στρώματος και ενδοθηλιακά κύτταρα του παρεγχύματος. Μαζί, αυτά τα κύτταρα παρέχουν μια δεξαμενή από αυξητικούς παράγοντες, χημειοκίνες, ένζυμα διάσπασης της εξωκυττάριας ουσίας και μόρια προσκόλλησης, επιταχύνοντας τον σχηματισμό της μεταστατικής εστίας. Αρκετές φλεγμονώδεις κυτταροκίνες όπως η IL-1, η IL-6, η rankl και η TNF-a είναι γνωστό ότι προωθούν την μετάσταση [108, 13]. Η TNF-a παράγεται από τα μυελοειδή κύτταρα και επηρεάζει αρκετά στάδια της μεταστατικής διαδικασίας και πιο συγκεκριμένα αυξάνονοντας τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, την διαπερατότητα των αγγείων και την επιστράτευση και άλλων κυττάρων [123]. Η ανακατασκευή του τοπικού ιστού είναι απαραίτητη προκειμένου να παραγματοποιηθεί η διήθηση του καρκινικού κυττάρου και η μετάσταση, ενώ αυξάνεται και η έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών (MMPs) στην προ-μεταστατική φωλεά [113]. Οι MMPs είναι εργαλεία στην αποδόμηση συστατικών 130

131 της εξωκυττάριας ουσίας κατά την διάρκεια της φλεγμονής και της επιδιόρθωσης του ιστού αλλά και κατά την ανάπτυξη του πρωτογενούς όγκου [124]. Πιθανολογείται ότι μια βασική λειτουργία των μυελοειδών κυττάρων που σχετίζονται με τον όγκο στην πρωτογενή εστία, είναι η ενορχήστρωση άλλων κυττάρων του ανοσοποιητικού προκαλώντας ανοσοκαταστολή και αντιφλεγμονώδη φαινότυπο, και επιτρέποντας στον όγκο να αποφύγει την ανίχνευσή του από το ανοσοποιητικό σύστημα [125]. Είναι επίσης πιθανόν, και τα μυελοειδή κύτταρα που εντοπίζονται στη προ-μεταστατική φωλεά να έχουν παρόμοια λειτουργία και να διευκολύνουν την επιβίωση των καρκινικών μεταστατικών κυττάρων. Η έκφραση της οστεοποντίνης από αυτά τα κύτταρα, μιας πρωτεΐνης που συμμετέχει στην προσκόλληση του καρκινικού κυττάρου και την επιβίωσή του με την ρύθμιση της έκφρασης των MMPs, επίσης καταστέλλει την άμυνα του ανοσοποιητικού συστήματος [126]. Ωστόσο ο μοριακός και λειτουργικός φαινότυπος των μυελοειδών κυττάρων που στρατολογούνται στις προ-μεταστατικές θέσεις δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί. Πειραματικά αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα VEGF1 + κύτταρα είναι τα πρώτα που στρατολογούνται και ότι αυτά τα κύτταρα παράγουν στη συνέχεια παράγοντες που στρατολογούν ή διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό άλλων μυελοειδών κυττάρων [127]. Εκτός από τα μυελοειδή, και άλλα κύτταρα επίσης συμμετέχουν ενεργά στην δημιουργία της προμεταστατικής φωλεάς. Για παράδειγμα, η στρατολόγηση των VEGF1 + αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων [που εκφράζουν επίσης τον υποδοχέα 4 της χημειοκίνης CXC (CXCR4)] σε ισχαιμικούς ιστούς ή σε εξελισσόμενους όγκους με έντονη αγγειογένεση, εξαρτάται από την απελευθέρωση του SDF1 από τα αιμοπετάλια [128]. Αν και ο ρόλος των αιμοπεταλίων στην προ-μεταστατική φωλεά δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί είναι πιθανό να παράγουν χημειοκίνες και αγγειογενετικούς ρυθμιστικούς παράγοντες [129]. Άλλα αυτόχθονα κύτταρα της προ-μεταστατικής φωλεάς όπως ινοβλάστες και ενδοθηλιακά κύτταρα μπορεί παρομοίως να εκφράζουν χημειοκίνες και πρωτεΐνες προσκόλλησης τα οποία και προσελκύουν τα κυκλοφορούντα κύτταρα του όγκου να συνδεθούν σε αυτές τις θέσεις [13]. Η μετάλλαξη των τοπικών ινοβλαστών είναι σημαντικό γεγονός κατά την εξέλιξη της μετάστασης (βλέπε πιο κάτω). Οι ινοβλάστες που σχετίζονται με τον όγκο (CAFs) είναι συνεχώς διεγερμένοι, πολλαπλασιαζόμενοι ταχύτερα και παράγοντας μεγαλύτερα ποσά εξωκυττάριας ουσίας από τους φυσιολογικούς ινοβλάστες [130]. Τα CAFs έχουν σημαντικό ρόλο και στην έναρξη της ογκογένεσης και στην εξέλιξη της κακοήθειας, διευκολύνοντας τον 131

132 πολλαπλασιασμό, την διήθηση και την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων ενώ αποτελούν και μια πηγή MMPs για την αποδόμηση της εξωκυττάριας ουσίας [13]. Υπάρχουν επίσης δεδομένα ότι οι ινοβλάστες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στον σχηματισμό της προ-μεταστατικής φωλεάς. Οι ενεργοποιημένοι ινοβλάστες επάγουν επίσης το remodeling του στρώματος, το οποίο απαιτείται για την ανάπτυξη μετάστασης στο ήπαρ σε ένα πειραματικό μοντέλο μελανώματος σε ποντίκι [13]. Η εξωκυττάρια ουσία στη προ-μεταστατική φωλεά Όπως περιγράφηκε νωρίτερα, τα μυελοειδή κύτταρα και οι ενεργοποιημένοι ινοβλάστες εκκρίνουν ουσίες όπως οι MMPs που τροποποιούν την εξωκυττάρια ουσία. Επιπρόσθετα, μη κυτταρικά στοιχεία όπως τα τοπικά επίπεδα O 2 έχουν κάποιο ρόλο. Η ιστική υποξία άλλωστε έχει συσχετισθεί με αρκετές παραμέτρους της ανάπτυξης της κακοήθειας συμπεριλαμβανόμενης και της μετάστασης [132]. Η έκφραση του ενζύμου LOX (lysyl oxidase) το οποίο συνδέει το κολλαγόνο με την ελαστίνη στην εξωκυττάρια ουσία, είναι αυξημένη, καθώς εκκρίνεται από τα υποξικά κύτταρα του όγκου [132]. Η έκκριση του LOX έχει δειχθεί ότι αυξάνει σημαντικά την διηθητική ικανότητα κυττάρων καρκίνου του μαστού σε in vitro και in vivo μελέτες με επίμυες. Είναι πιθανόν επίσης, η έκκριση του LOX να είναι εξίσου σημαντική και στον σχηματισμό της προ-μεταστατικής φωλεάς στα όργαναστόχους [131]. Πιο συγκεκριμένα, η έκκρισή του από υποξικά κύτταρα καρκίνου του μαστού τροποποιεί την εξωκυττάρια ουσία με πιο στενή διασύνδεση των ινών κολλαγόνου, κάνοντάς την πιο δεκτική στην διήθηση από μυελοειδή κύτταρα. Επιπλέον, η αναστολή της σύνθεσής του σε κύτταρα από καρκίνο του μαστού στον άνθρωπο, προκάλεσε ελάττωση στην συνάθροιση των CD11Bb + μυελοειδών κυττάρων στα προ-μεταστατικά όργανα επίμυων και απέτρεψε την μετάσταση [131]. Η ινωδονεκτίνη, μια γλυκοπρωτεΐνη της εξωκυττάριας ουσίας που συμμετέχει σε πλήθος κυτταρικών διαδικασιών, επίσης εμφανίζεται να είναι σημαντικό συστατικό, της προμεταστατικής φωλεάς [133]. Η τοπική έκφραση της ινωδονεκτίνης έχει παρατηρηθεί γύρω από τα τελικά βρογχιόλια και τις φλέβες των βρογχιολίων στον πνεύμονα, τα οποία και αποτελούν συνήθεις εστίες για μεταστατικές φωλεές [113, 131]. Δεν είναι ξεκάθαρο όμως εάν αυτή η ινωδονεκτίνη προέρχεται από τα κύτταρα του στρώματος της φωλεάς ή από καρκινικά κύτταρα. 132

133 Οι μηχανικές ιδιότητες της εξωκυττάριας ουσίας, όπως η ελαστικότητα και η ακαμψία του ιστού, έχουν επίσης άμεση επίδραση στην ογκογένεση, ειδικά στον μαστό [134]. Η ανάπτυξη του μεταστατικού όγκου Τα κύτταρα του όγκου εμφανίζονται να ενσωματώνονται κατά προτίμηση στα συσσωματώματα (clusters) των μυελοειδών κυττάρων, της ινωδονεκτίνης, των αυξητικών παραγόντων και των πρωτεϊνών αναδιαμόρφωσης της εξωκυττάριας ουσίας που συνιστούν την προ-μεταστατική φωλεά [113, 133, 135] (εικόνες 64, 65). Παρόλα αυτά, δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί τα μόρια που διαμεσολαβούν την αρχική ενσωμάτωση των καρκινικών κυττάρων στα σημεία αυτά. Μετά την εξαγγείωση και την διήθηση στην δευτερογενή εστία, η επιβίωση και ο πολλαπλασιασμός του καρκινικού κυττάρου στη μεταστατική φωλεά εξαρτάται από τις διαντιδράσεις μεταξύ κυττάρων αλλά και κυττάρων-μικροπεριβάλλοντος. Για να καταφέρει ένα καρκινικό κύτταρο μετά τη διασπορά του να δημιουργήσει μια μεταστατική βλάβη, πρέπει να αποφύγει πλήθος σημάτων που οδηγούν στον κυτταρικό θάνατο, τα οποία εμφανίζονται λόγω της απώλειας της φυσικής επαφής με τα παρακείμενα κύτταρα και την εξωκυττάρια ουσία. Ο υποδοχέας του υαλουρονικού οξέος CD44 έχει φανεί ότι είναι ιδιαίτερα σημαντικός, καθώς επιτρέπει στα κύτταρα του όγκου να αποφεύγουν την απόπτωση κατά τον σχηματισμό της μικρο-ματάστασης [136]. Εκτός από το υαλουρονικό οξύ υπάρχουν και άλλοι συνδέτες για το CD44 όπως η ινωδονεκτίνη, το κολλαγόνο τύπου 1, η οστεοποντίνη και η λαμινίνη με πιθανή συμμετοχή στην αποφυγή του κυτταρικού θανάτου στη μεταστατική εστία. Η μεταστατική φωλεά μπορεί επίσης να αποτελέσει μια πλούσια πηγή αυξητικών παραγόντων και κυτταροκινών, πολλοί από τους οποίους μπορούν άμεσα να ρυθμίσουν τον πολλαπλασιασμό του καρκινικού κυττάρου επιπρόσθετα με την επιβίωσή του. Οι επιμέρους πολλαπλασιασμοί των κυττάρων του όγκου στη μεταστατική φωλεά συνιστούν τις μικρομεταστάσεις. Σαν επακόλουθο απαιτείται η δημιουργία ενός λειτουργικού αγγειακού δικτύου που να επιτρέπει την περαιτέρω κυτταρική ανάπτυξη και εξέλιξη των μικρομεταστάσεων [13]. Σύμφωνα με έρευνες, τα ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα ΕPCs (Endothelial Progenitor Cells) είναι βασικοί ρυθμιστές αυτής της διαδικασίας [113, 137]. Ο ID1 μεταγραφικός παράγοντας, με αποδεδειγμένη συμμετοχή στην αγγειογένεση στον 133

134 πρωτογενή όγκο [138], φαίνεται να διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην κινητοποίηση και στρατολόγηση των EPCs στις μικρομεταστάσεις. H αναστολή της έκφρασης του ID1 δεν προκάλεσε αλλαγές στην αρχική μετάσταση στον πνεύμονα από τα κύτταρα του όγκου, ωστόσο δεν πραγματοποιήθηκε η αγγειογένεση και η εξέλιξη σε μακρομετάσταση [137]. Εκτός από τα EPCs, τα αιμοποιητικά και τα μεσεγχυματικά κύτταρα συντελούν επίσης στην εξέλιξη της μακρομετάστασης (εικόνα 65). Εικόνα 64 Επιστράτευση των κυττάρων του όγκου στη πρωτογενή και στην μεταστατική εστία. (αριστερά) Αρχικά στάδια επιστράτευσης κυττάρων του στρώματος στην πρωτογενή εστία που περιλαμβάνει κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος όπως τα TEMs (Tie 2 expressing monocytes), TAMs (Τumor Associated Macrophages), BMDCs [HPCs (Hematopoietic progenitor cell) και EPCs (Endothelial Progenitor Cell)], MDSC cells και επιστρατευμένα CAFs (Carcinoma associated Fibroblasts). (μέση) Η παραγωγή πρωτεασών και έκκριση χημειοτακτικών παραγόντων προωθεί την ανάπτυξη των ενδοθηλιακών κυττάρων και την χημειοταξία. Η ωρίμανση των αιμοφόρων αγγείων διεκπεραιώνεται με την επένδυσή τους από περικύτταρα αν και στο στάδιο αυτό τα αγγεία παραμένουν μη σχηματισμένα πλήρως. (δεξιά) Η είσοδος των κυττάρων του όγκου στη κυκλοφορία, όπως επίσης και η διείσδυση στους περιβάλλοντες ιστούς διαμεσολαβείται από παρακρινή σηματοδότηση μεταξύ των ινοβλαστών, μακροφάγων και των κυττάρων του όγκου [139]. 134

135 Εικόνα 65 Επιστράτευση των κυττάρων του όγκου στη πρωτογενή και στην μεταστατική εστία. (αριστερά) Οι διαφοροποιήσεις των κυττάρων του στρώματος στα απομακρυσμένα όργανα που θα φιλοξενήσουν την μεταστατική εστία περιλαμβάνουν την ενεργοποίηση των ινοβλαστών και την επιστράτευση των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων HPCs (hematopoietic progenitor cell) και την επιστράτευση προγονικών κυττάρων του μυελού. (μέση) Η έκκριση φλεγμονωδών χημειοκινών και ενζύμων αποδόμησης της θεμέλιας ουσίας έχει ως αποτέλεσμα την προσκόλληση και τον πολλαπλασιαμό των καρκινικών κυττάρων σε αυτές τις θέσεις. (δεξιά) Τελικά η παροχή αιματικής ροής που επιτυγχάνεται με την επιστράτευση ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων EPCs (endothelial progenitor cell) και ενδοθηλιακών κυττάρων επιτρέπει την εξέλιξη και ανάπτυξη μικρο και μακρο μεταστάσεων [139]. ΜΕΤΑΝΑΣΤΕΥΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΟΓΚΟΥ ΚΑΙ ΤΟΥ ΜΥΕΛΟΥ ΤΩΝ ΟΣΤΩΝ ΑΠΟ ΦΩΛΕΑ ΣΕ ΦΩΛΕΑ Η διακίνηση των κυττάρων του όγκου και του μυελού των οστών από τις αντίστοιχες φωλεές είναι ένα μονοπάτι με πολλαπλές κατευθύνσεις. Τα αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα κινητοποιούνται από την φωλεά τους στο μυελό των οστών, ως αποτέλεσμα της έκκρισης χημειοκινών από τον όγκο, και στη συνέχεια κατευθύνονται τόσο στην πρωτογενή εστία του όγκου όσο και στις περιφερικές φωλεές. Τα κύτταρα που προέρχονται από τον μυελό των οστών και κατευθύνονται προς την φωλεά της πρωτογενούς εστίας του όγκου, μπορεί να παραμείνουν σε μια αδιαφοροποίητη κατάσταση με τη μορφή αιμοποητικών προγονικών κυττάρων HPCs, επιθηλιακών προγονικών κυττάρων EPCs, μεσεγχυματικών stem κυττάρων MSCs ή GR-1 + CD11b + MDSCs ή να 135

136 διαφοροποιηθούν σε πιο εξειδικευμένους κυτταρικούς τύπους μεταξύ των οποίων και τα TAMs (tumor associated macrophages) [139]. Σε δεύτερο χρόνο, τα μεταστατικά καρκινικά κύτταρα κατευθύνονται προς τις περιφερικές φωλεές όπου έχουν προηγουμένως εγκατασταθεί τα κύτταρα του μυελού (εικόνα 66). Εικόνα 66 Μετανάστευση κυττάρων του όγκου και του μυελού των οστών από φωλεά σε φωλεά [139]. Ο ρόλος των μεσεγχυματικών stem κυττάρων (MSCs) Ορισμένες μελέτες υποδηλώνουν την πιθανότητα τα μεσεγχυματικά stem κύτταρα, που είναι πολύ ικανά στο να «μεταμορφώνονται», να αποτελούν τα πρόδρομα κύτταρα των ινοβλαστών CAFs (carcinoma- or tumor-associated fibroblasts). Πιο συγκεκριμένα, προτείνεται ότι ένα υποσύνολο των CAFs στο καρκινικό μικροπεριβάλλον, προέρχεται από τους ινοβλάστες της κυκλοφορίας που προέρχονται από κύτταρα του μυελού των οστών, τα οποία είναι πιθανώς τα μεσεγχυματικά stem κύτταρα [140, 141] (εικόνα 67). Ορισμένες ιδιότητες των μεσεγχυματικών stem κυττάρων υποστηρίζουν την υπόθεση αυτή και ιδιαίτερα η ικανότητά τους να διαφοροποιούνται προς μυοϊνοβλάστες, εκφράζοντας συγκεκριμένους επιφανειακούς δείκτες. Ένα παράδειγμα είναι η αυξημένη έκφραση της a-smooth muscle ακτίνης λόγω του TGF-β, ενός παράγοντα που εκκρίνεται συχνά από τα κύτταρα του όγκου [142]. Τα προγονικά κύτταρα του μυελού των οστών θεωρούνται επίσης ως πιθανή πηγή των μυοϊνοβλαστών που παρατηρούνται στα σημεία επούλωσης των τραυμάτων. 136

137 Μία μελέτη από τον Karnoub και συν. [143], έδειξε ότι η υποδόρια συνχορήγηση μεσεγχυματικών stem κυτάρων μαζί με κυτταρική σειρά από καρκίνο του μαστού με χαμηλό δυναμικό για μετάσταση, την MDA-MB-231 (MDA), είχε ως αποτέλεσμα να αυξηθεί το μεταστατικό δυναμικό μετά από μεταμόσχευση σε ανοσοκατασταλμένα ζώα. Αυτή η μελέτη έδειξε επίσης, ότι όταν τα μεσεγχυματικά stem κύτταρα έρχονται σε επαφή με τα κύτταρα του όγκου, εκκρίνουν την χημειοκίνη CCL5 (γνωστή επίσης και ως RANTES). H χημειοκίνη αυτή με τη δράση της, προκαλεί αύξηση στην κινητικότητα και την δυνατότητα για μετάσταση των κυττάρων MDA. Η αναστολή της έκκρισης της CCL5 έχει ως αποτέλεσμα την αντιστραφή του μεταστατικού φαινότυπου. Επομένως οι επαγόμενες από το μόριο CCL5 φαινοτυπικές αλλαγές των καρκινικών κυττάρων είναι αναστρέψιμες αλλά και εξαρτώμενες από την σηματοδότηση μέσω του υποδοχέα του CCL5. Εικόνα 67 Τα μεσεγχυματικά stem κύτταρα υποστηρίζουν την ανάπτυξη του όγκου και την μετάσταση. Τα μεσεγχυματικά stem κύτταρα είναι σωματικά πολυδύναμα stem κύτταρα με την ικανότητα να μεταναστεύουν προς την εστία της βλάβης και να επιδιορθώνουν ή να αντικαθιστούν τον τραυματισμένο συνδετικό ιστό. Ανάλογα με τον τύπο του ιστού, τα μεσεγχυματικά stem κύτταρα μπορούν να επιδιορθώσουν τους τραυματισμένους ιστούς με το να διαφοροποιούνται σε μια ποικιλία κυτταρικών τύπων, όπως οστεοκύτταρα (οστά), χονδροκύτταρα (χόνδρος), λιποκύτταρα (λίπος), μυικά κύτταρα (μυς) και β παγκρεατικά κύτταρα. Πρόσφατα, αποδείχθηκε ότι σε απάντηση 137

138 παράγοντων που εκκρίνονται από τον πρωτογενή όγκο, τα μεσεγχυματικά stem κύτταρα επιστρατεύονται στις καρκινικές εστίες. (Α) Όταν βρίσκονται στην εστία του όγκου, εκκρίνουν παράγοντες με ανασταλτική δράση στην ανάπτυξη του όγκου. (Β) Ωστόσο, μετά από μακρά έκθεση σε παράγοντες εκκρινόμενους από τον όγκο, τα μεσεγχυματικά stem κύτταρα αναγκάζονται από τα κύτταρα του όγκου (C) να μετατραπούν σε ινοβλάστες σχετιζόμενους με τον καρκίνο CAFs καθώς και να υποστηρίξουν την ανάπτυξη του όγκου (D). Τα CAFs εκκρίνουν μόρια, όπως τα SDF 1 και CCL5, τα οποία «εκπαιδεύουν» τα καρκινικά κύτταρα να γίνουν πιο επιθετικά και μεταστατικά (Ε). Η ικανότητα των μεσεγχυματικών stem κυττάρων να υποστηρίξουν την ανάπτυξη και επέκταση των όγκων αντιπροσωπεύει ένα ακόμα χαρακτηριστικό παράδειγμα της μεγάλης επίδρασης του μικροπεριβάλλοντος στον όγκο. CAF: Carcinoma or tumor associated fibroblast; CCL5: CC chemokine ligand 5; MSC: Mesenchymal stem cell; SDF 1: Stromal derived factor 1 [144]. Αξίζει να αναφερθεί ακόμη, ότι τα μεσεγχυματικά stem κύτταρα επηρεάζουν την ανάπτυξη του όγκου μέσω αλληλεπιδράσεων με το ανοσοποιητικό σύστημα. In vitro μελέτες έχουν ξεκάθαρα δείξει ότι τα μεσεγχυματικά stem κύτταρα έχουν ανοσοκατασταλτικές ιδιότητες και στο κυτταρικό και στο χυμικό σκέλος του ανοσοποιητικού [146]. Αυτά τα πειραματικά δεδομένα υπογραμμίζουν την συμβολή των μεσεγχυματικών stem κυττάρων στην εξέλιξη των όγκων και είναι ένα ακόμα παράδειγμα της μεγάλης σημασίας και επιροής του μικροπεριβάλλοντος στην ογκογένεση (εικόνα 68). Αν και χρειάζεται περαιτέρων διαρεύνηση των διαντιδράσεων και των παραγόντων-μορίων που συμμετέχουν σε αυτές τις διαδικασίες, ήδη προβάλλουν νέεες προοπτικές και προσεγγίσεις στην θεραπεία του καρκίνου. 138

139 Εικόνα 68 Ο ρόλος των MSCs στη μετάσταση του καρκίνου. (1) Τα αρχικά κύτταρα του όγκου στέλνουν σήματα στο μυελό των οστών κινητοποιώντας τα μεσεγχυματικά stem κύτταρα με προέλευση τον μυελό των οστών BMD MSCs (bone marrow derived mesenchymal stem cells). (2) Τα BMD MSCs στρατολογούνται στον πρωτογενή όγκο (2a), ενώ επίσης κατευθύνονται και σε άλλα όργανα όπως οι πνεύμονες (2b), δημιουργώντας μια προ μεταστατική φωλεά πριν τη διασπορά των καρκινικών κυττάρων (3) Η διαντίδραση των καρκινικών κυττάρων με τα BMD MSCs στον πρωτογενή όγκο ενισχύει την κινητικότητα, διηθητικότητα και την ικανότητα για μετάσταση των κυττάρων του όγκου μέσω παρακρινών αλληλεπιδράσεων (πχ CCL5 CCR5). Επιπρόσθετα, τα BMD MSCs μπορούν να διαφοροποιηθούν σε μυοινοβλάστες καθώς και άλλα κύτταρα του στρώματος, που υποστηρίζουν περαιτέρω την ανάπτυξη και εξέλιξη του όγκου. Τα καρκινικά κύτταρα, όταν διασπείρονται προτιμούν να αναπτυχθούν σε περιοχές που προηγουμένως έχουν εγκατασταθεί BMD MSCs και να σχηματίσουν μετάσταση [145]. O Hiroshi Kubo και συν. [147] ταυτοποίησαν 148 γονίδια χαρακτηριστικά των ανθρώπινων MSCs, μεταξύ των οποίων 9 γονίδια μεταγραφικών παραγόντων, χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες DNA και αναλύσεις real-time RT-PCR. Τα περισσότερα από τα γονίδια αυτά εμφάνισαν μειωμένη έκφραση 24 ώρες μετά την ενεργοποίηση της οστεογένεσης, χονδρογένεσης ή λιπογένεσης, ή ώρες μετά την αναστολή των 9 μεταγραφικών παραγόντων. Επιπρόσθετα, η εκλεκτική αναστολή των ETV1, ETV5, FOXP1, GATA6, HMGA2, SIM2 ή SOX11 κατέστειλε την αυτο-ανανεωτική ικανότητα των μεσεγχυματικών stem κυττάρων, ενώ η αναστολή των SOX11, ETV1, SIM2 ή PRDM16 μείωσε το δυναμικό για οστεογένεση ή/και λιπογένεση. Επίσης, η ανοσοϊστοχημεία με αντισώματα εναντίον χαρακτηριστικών για τα MSCs μόρια, όπως τα GATA6, TRPC4, FLG και TGM2, έδειξε παρουσία κυττάρων με χαρακτηριστικά MSCs κοντά στο ενδόστεο (endosteum) και στο εσωτερικό του μυελού των οστών σε ενήλικους επίμυες. 139

140 Πίνακας 5 Γονίδια που εκφράζονται εκλεκτικά στα MSCs (n=3) συγκριτικά με ινοβλάστες, οστεοβλάστες, χονδροκύτταρα και λιποκύτταρα. Το κριτήριο της επιλογής ήταν η υψηλότερη έκφραση κατά 2 φορές στα MSCs από τους άλλους τύπους κυττάρων [147]. Το συμπέρασμα αυτής της μελέτης ήταν ότι η μοριακή υπογραφή του μεσεγχυματικού stem κυττάρου του μυελού των οστών, καθορίζεται από μεταγραφικούς παράγοντες που εκφράζονται εκλεκτικά στα κύτταρα αυτά. Επίσης, ορισμένοι από αυτούς τους μεταγραφικούς παράγοντες προφανώς εμπλέκονται στη ρύθμιση του stemness των MSCs. Η αναγνώριση MSC-like κυττάρων στο μυελό των οστών, υποδηλώνει ότι αυτά τα κύτταρα φυσιολογικά συμμετέχουν στην ανάπτυξη και εξέλιξη του οστού, καθώς και ότι ο μυελός των οστών σε ενήλικα είναι μια καλή πηγή αυτόχθονων MSCs. Αντισώματα για ορισμένα από αυτά τα μόρια, που είναι χαρακτηριστικά των MSCs, πιθανόν να είναι χρήσιμα για την αναγνώριση και ταυτοποίηση του μικροπεριβάλλοντος-φωλεάς των MSCs. ΕΠΙΘΗΛΙΟ-ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΗ ΜΕΤΑΒΑΣΗ (EMT) Μία άλλη θεωρία που κερδίζει συνεχώς έδαφος τα τελευταία χρόνια υποστηρίζει ότι η επιθήλιο-μεσεγχυματική μετάβαση (EMT) συμβάλλει στη μεταστατική διαδικασία. Η EMT που αρχικά αναγνωρίσθηκε στην εμβρυϊκή ανάπτυξη, περιλαμβάνει μετάβαση των επιθηλιακών κυττάρων σε ένα φαινότυπο μεσεγχυματικού κυττάρου, μέσω απώλειας της πολικότητας, των διακυτταρικών συνδέσεων και εκτενούς αναδιοργάνωσης του κυτταροσκελετού [148]. Τα κύτταρα που υφίστανται EMT εκφράζουν επίσης πρωτεΐνες 140

141 χαρακτηριστικές των μεσεγχυματικών κυττάρων και αποκτούν αυξημένες ικανότητες για μετανάστευση συμβάλλοντας έτσι στην κατανομή των κυττάρων στο έμβρυο και στην εμβρυϊκή ανάπτυξη (εικόνα 69). Εικόνα 69 Η μετάβαση φαινότυπου επιθηλιακού κυττάρου σε μεσεγχυματικό κύτταρο χαρακτηρίζεται από: απώλεια της πολικότητας, λύση των διακυτταρικών συνδέσεων, αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, αυξημένη κινητικότητα και σύνθεση εξωκυττάριας ουσίας. [149]. Στον καρκίνο, είναι πιθανό τα επιθηλιακά κύτταρα του όγκου να είναι σε θέση να ενεργοποιήσουν αυτό το αρχέγονο αναπτυξιακό πρόγραμμα και να μετατρέπονται έτσι τα διαφοροποιημένα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα σε αποδιαφοροποιημένα κύτταρα με χαρακτηριστικά μεσεγχυματικού κυττάρου [150]. Ο φαινότυπος ΕΜΤ στον καρκίνο σχετίζεται με μειωμένη αύξηση του όγκου, αυξημένη αντίσταση στην απόπτωση, αυξημένη κινητικότητα και διηθητικότητα και ενισχυμένη ικανότητα για μετάσταση [151]. Αυτές οι φαινοτυπικές μετατροπές είναι αναστρέψιμες και θεωρείται ότι όταν τα καρκινικά κύτταρα εγκατασταθούν στην μεταστατική εστία υιοθετούν ξανά φαινότυπο επιθηλιακών κυττάρων για να διευκολυνθεί η ανάπτυξη του όγκου [152] (εικόνα 70). 141

142 Εικόνα 70 Μεταβάσεις μεταξύ επιθηλιακών και μεσεγχυματικών καταστάσεων κατά την εξέλιξη του καρκίνου. Στους πρωτοπαθείς όγκους, οι επιθηλιο μεσεγχυματικές καθώς και οι μεσεγχυματοεπιθηλιακές μεταβάσεις (EMTs και METs) συμβάλλουν στην ετερογένεια του όγκου, που μπορεί να επηρεάσει την ευαισθησία στις θεραπευτικές παρεμβάσεις και την ικανότητα για μετάσταση. Οι διαντιδράσεις με τα κύτταρα του μικροπεριβάλλοντος, συμπεριλαμβανομένων των λευκοκυττάρων και των CAFs (cancer associated fibroblasts), είναι πιθανόν να επάγουν τις EMTs και επίσης εκλεκτικά να προάγουν την ανάπτυξη και εξέλιξη των καρκινικών κυττάρων με μεσεγχυματικό φαινότυπο (μεταξύ των οποίων τα καρκινικά stem κύτταρα). Τα καρκινικά stem κύτταρα είναι πιο πιθανό από τα υπόλοιπα κύτταρα να μεταναστεύσουν, και ανιχνεύονται πιο συχνά στην κυκλοφορία και στις μικρομεταστάσεις. Ωστόσο, οι μακροσκοπικές μακρινές μεταστάσεις πιο συχνά αποτελούνται από πιο διαφοροποιημένα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα. Αυτό μπορεί να εξηγηθεί από την αντιστροφή της EMT προς MET μετά την ανάπτυξη της μικρομετάστασης. Παρόλα αυτά δεν μπορεί να αποκλεισθεί η πιθανότητα μιας λειτουργικής συνεργασίας μεταξύ μεσεγχυματικών και πιο διαφοροποιημένων επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων κατά την διάρκεια της μεταστατικής εξάπλωσης [153]. Η ΕΜΤ χαρακτηρίζεται από την έκφραση πολλών παραγόντων, που είναι υπεύθυνοι για την ολοκλήρωση αυτής της πολύπλοκης διαδικασίας, σε μοριακό επίπεδο (εικόνα 71). Ο αυξητικός παράγοντας TGF-β φαίνεται να προάγει την αναστρέψιμη ΕΜΤ μαζί με τις πρωτείνες του μονοπατιού Wnt (κυρίως οι κατενίνες), τα μόρια Notch και τα Hedgehog μεταγραφικά μονοπάτια τα οποία συχνά δρουν με διαδοχικό τρόπο προάγοντας την ΕΜΤ [81]. Επιπλέον μεταγραφικοί παράγοντες όπως ο Snail και ο NF-kB φαίνεται να προσδίδουν αντίσταση την απόπτωση που χαρακτηρίζει τα κύτταρα αυτά [81]. Ο παράγοντας Snail, αυξάνει επίσης την διηθητική ικανότητα του κυττάρου και την ικανότητα για μετάσταση. Πρόσφατη μελέτη [154] έδειξε ότι ο παράγοντας αυτός επιταχύνει την μετάσταση, όχι μόνο 142

143 μέσω της διηθητικότητας αλλά και προκαλώντας ανοσοκαταστολή με πολλαπλούς μηχανισμούς. Με δεδομένη την εμπλοκή της EMT στη ανάπτυξη του εμβρύου δεν προκαλεί εντύπωση η πιθανότητα πολλοί από τους παράγοντες αυτούς να εμπλέκονται και στην διατήρηση του stemness των κυττάρων [150]. Πράγματι τα μεταστατικά κύτταρα έχουν κοινά πολλά μοριακά και κυτταρικά στοιχεία που χαρακτηρίζουν κύτταρα που είναι σημαντικά στην αναπτυξιακή διαδικασία. Εικόνα 71 Μια απλοποιημένη επισκόπηση των σηματοδοτικών μονοπατιών που ρυθμίζουν την EMT. Οι μεταγραφικοί παράγοντες RTKS (Recptor Tyrosine Kinases), TGF β, Notch, ETAR (Endothelin A receptor), Wnt όπως επίσης τα μόρια ιντεγρίνες, οι μεταλλοπρωτεϊνάσες, η εξωκυττάρια ουσία και η υποξία μπορούν να επάγουν την EMT. Ο ακριβής ρόλος είναι σχετικός, καθώς καθορίζεται και από το εκάστοτε κυτταρικό μικροπεριβάλλον. Αυτά τα σήματα μπορούν να προκαλέσουν λύση των δεσμοσωμάτων και των στενών συνάψεων, μέσω της φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών (παράδειγμα η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης PAR6A μέσω της TGF β σηματοδότησης) ή με καταστολή των επιπέδων τους στο κύτταρο (παράδειγμα η καταστολή των επιπέδων της πρωτεΐνης plakophilin 3 από τον παράγοντα ZEB1). H ΕΜΤ συμβάλλει επίσης στην αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού όπως επίσης και της εξωκυττάριας ουσίας (ECM) με αύξηση των επιπέδων πρωτεϊνών της ECM όπως η ινωδονεκτίνη, το κολλαγόνο, οι μεταλλοπρωτεάσες και άλλα ένζυμα (π.χ LOX). H υποξία, η 143

144 ενεργοποίηση του RAC1B και η ενεργοποίηση ορισμένων μονοπατιών κινασών όπως η Akt μπορούν να επάγουν αύξηση στην παραγωγή αντιδραστικών ριζών οξυγόνου (ROS) από τα μιτοχόνδρια με ποικίλλα αποτελέσματα μεταξύ των οποίων η ενεργοποίηση των παραγόντων HIF1a (Hypoxiainducible factor 1a) και NF kb (Nuclear factor kb), η σηματοδότηση και απενεργοποίηση του ενζύμου GSK3β (Glycogen Synthase kinase 3β). Εκτός από την διαντίδραση μεταξύ των σηματοδοτικών μονοπατιών, παρατηρείται και διαντίδραση μεταξύ των παραγόντων που επάγουν την EMT και mi RNAs που έχουν ρυθμιστική δράση [153]. ΛΑΝΘΑΝΟΥΣΑ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ (DORMANCY) ΤΩΝ ΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Τα καρκινικά κύτταρα όταν βρεθούν σε μη ευνοϊκό μικροπεριβάλλον, εισέρχονται σε λανθάνουσα κατάσταση (dormancy) [155, 156] Στη κατάσταση αυτή, τα καρκινικά κύτταρα δεν είναι επιβλαβή για τον οργανισμό, συνεχίζουν όμως να έχουν το δυναμικό για ανάπτυξη και επέκταση του όγκου. Οι μηχανισμοί που συμμετέχουν είναι πολύπλοκοι, ενώ η παθοφυσιολογία του φαινομένου αποτελεί αντικείμενο έρευνας (εικόνες 72α, 72β). Εικόνα 72α Απεικονίζονται οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στον έλεγχο της λανθάνουσας κατάστασης των καρκινικών κυττάρων [156]. 144

145 Εικόνα 72β Διαφορετικοί μηχανισμοί μπορούν να υποχρεώσουν τα καρκινικά κύτταρα να εισέλθουν σε λανθάνουσα κατάσταση. Η έξοδος από τον κυτταρικό κύκλο παρέχει τη δυνατότητα στα καρκινικά κύτταρα να διαφύγουν από τον έλεγχο του ανοσοποιητικού συστήματος και συμβάλλει στην επιβίωσή τους. Η ισορροπία μεταξύ αγγειογενετικών, αντιαγγειακών παραγόντων καθώς και η ανοσοεπιτήρηση είναι επίσης σημαντικοί παράγοντες στον έλεγχο και ρύθμιση της λανθάνουσας κατάστασης [155]. Τα διεσπαρμένα καρκινικά κύτταρα μετά από άγνωστο χρονικό διάστημα, διαφεύγουν των αρνητικών επιδράσεων του μικροπεριβάλλοντος και δημιουργούν υποτροπές και μεταστάσεις. Η ιδιότητά τους αυτή, έχει ιδιαίτερη σημασία στη κλινική πράξη, καθώς η πλειοψηφία των συμπαγών καρκίνων και των καρκίνων του αιμοποιητικού συστήματος εισέρχονται σε αυτή τη λανθάνουσα φάση (εικόνα 73). 145

146 Εικόνα 73 Τα κύτταρα του μικροπεριβάλλοντος μπορούν να κρατήσουν τα καρκινικά κύτταρα σε λανθάνουσα κατάσταση στις μικρομεταστατικές εστίες [155]. Φαίνεται επίσης, ότι και τα καρκινικά stem κύτταρα εισέρχονται σε λανθάνουσα κατάσταση, όταν στο μικροπεριβάλλον της πωτογενούς ή μεταστατικής εστίας δεν υπάρχουν τα κατάλληλα σήματα για την ενεργοποίησή τους (εικόνα 74). 146

147 Εικόνα 74 Διαφυγή από τη λανθάνουσα κατάσταση με ρύθμιση της δράσης του ανοσοποιητικού συστήματος και της αγγειογένεσης οδηγεί στην εξέλιξη κλινικά μη εμφανών μεταστατικών εναποθέσεων και σε ανάπτυξη κλινικά εμφανών μεταστατικών εστιών, αρκετά χρόνια μετά την αρχική θεραπεία του όγκου [155]. 147

148 ΚΑΡΚΙΝΙΚΑ STEM ΚΥΤΤΑΡΑ ΚΑΙ ΚΑΚΟΗΘΗ ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΑ ΤΟΥ ΔΕΡΜΑΤΟΣ Το δέρμα υπόκειται σε συνεχή ερεθίσματα από το περιβάλλον. Σαν αποτέλεσμα αρκετά κύτταρα του καλυπτήριου συστήματος αποκτούν δυνητικά ογκογόνες μεταλλάξεις. Τα πιο πολλά από αυτά αποπίπτουν από την επιδερμίδα σε μικρό χρονικό διάστημα. Τα stem κύτταρα όμως του δέρματος παραμένουν περισσότερο χρόνο με αποτέλεσμα να είναι δυνατή η συσσώρευση όλων των απαραίτητων μεταλλάξεων για την εμφάνιση νεοπλασμάτων [157]. Όπως έχει ήδη αναφερθεί πολύ σημαντικός είναι ο ρόλος του μικροπεριβάλλοντος (εικόνα 75). Εικόνα 75 Σύνδεση μεταξύ stem κυττάρων του δέρματος, καρκινικών stem κυττάρων και του μικροπεριβάλλοντος. Υπάρχουν πειραματικά δεδομένα ότι τα stem κύτταρα του δέρματος με χαμηλό ρυθμό αυτο ανανέωσης και μεγάλη διάρκεια ζωής, εξαρτώνται από στοιχεία του μικροπεριβάλλοντος, που απαρτίζουν τη φωλεά. Τα καρκινικά stem κύτταρα του δέρματος θεωρούνται ότι έχουν υψηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού και δεν εξαρτώνται από τη ρυθμιστική 148

149 δράση του μικροπεριβάλλοντος. Διατηρούν ωστόσο την ικανότητα για διαφοροποίηση στις διαφορετικές κυτταρικές σειρές της επιδερμίδας. Νέα δεδομένα υποστηρίζουν ότι σε επίμυες, τα καρκινικά stem κύτταρα σχετίζονται με έκφραση του αντιγόνου της κυτταρικής μεμβράνης CD34 και άθικτη Wnt/β κατενίνη σηματοδότηση. Επίσης, έρευνες υποστηρίζουν ότι ρόλο επίσης διαδραματίζουν και τα δίκτυα p63 και c Myc. Τα ανθρώπινα καρκινικά stem κύτταρα πιστεύεται ότι εκφράζουν σε υψηλά επίπεδα τον δείκτη CD44 της κυτταρικής μεμβράνης. Εμφανίζουν όμως ελαττωμένα επίπεδα των Lrig1 και MAP4, πρωτεϊνών που συμμετέχουν στην κατάσταση ηρεμίας των φυσιολογικών ανθρώπινων stem κυττάρων [157]. Έκφραση δεικτών των φυσιολογικών stem κυττάρων σε όγκους του δέρματος Υπάρχουν ενδείξεις, από την έρευνα σε όγκους του δέρματος, που υποδηλώνουν ότι οι διαφορετικοί πληθυσμοί stem κυττάρων στην επιδερμίδα, αποτελούν στόχο της καρκινογένεσης. Στον πίνακα 6 που ακολουθεί απεικονίζονται ορισμένες από τις μεταλλάξεις που έχουν συσχετισθεί με νεοπλάσματα του δέρματος, ενώ στη συνέχεια θα γίνει ιδιαίτερη αναφορά σε ορισμένα νεοπλάσματα, όπως το καρκίνωμα εκ πλακωδών κυττάρων (SCC), το βασικοκυτταρικό καρκίνωμα (BCC) και το κακόηθες μελάνωμα. Πίνακας 6 Μεταλλάξεις και νεοπλάσματα του δέρματος [159]. 149

150 Εκτός από τους όγκους του αιμοποιητικού συστήματος και αρκετούς συμπαγείς όγκους, υπάρχουν έρευνες που υποστηρίζουν ότι τα καρκινώματα εκ πλακωδών κυττάρων (SCCs), επίσης ξεκινούν και συντηρούνται από έναν υποπληθυσμό καρκινικών κυττάρων με ιδιότητες stem κυττάρων [159, 160]. Ο Jensen και συν. [161] έδειξαν ότι τα χαμηλής βαθμίδος διαφοροποίησης καρκινώματα εκ πλακωδών κυττάρων στον άνθρωπο, καθώς και σε αθανατοποιημένες SCCs κυτταρικές σειρές, εκφράζουν πολλούς από τους δείκτες που είναι χαρακτηριστικοί για τα stem κύτταρα του δέρματος όπως τα μόρια MCSP και FREM4D. Συγχρόνως όμως, αυτά τα καρκινικά stem κύτταρα εμφανίζουν και ελαττωμένη έκφραση άλλων πρωτεϊνών που φυσιολογικά υπάρχουν στα stem κύτταρα και εμπλέκονται στην κατάσταση αδράνειας όπως τα Lrig1 και MAP4. Φαίνεται δηλαδή, ότι τα SCC κύτταρα υιοθετούν ορισμένα χαρακτηριστικά των φυσιολογικών stem κυττάρων του δέρματος, αλλά συγχρόνως ρυθμίζουν προς τα κάτω τα μονοπάτια που εμπλέκονται στην κατάσταση αδράνειας των stem κυττάρων. Ο Malanchi και συν. [162] σε πειραματικά μοντέλα σε επίμυες με επαγώμενη ογκογένεση, αναγνώρισαν έναν πληθυσμό καρκινικών κυττάρων με ιδιότητες stem κυττάρων, των οποίων η λειτουργία είναι εξαρτώμενη από τη φυσιολογική σηματοδότηση β-κατενίνης. Οι όγκοι αυτοί εμφάνισαν μια αύξηση 9 φορές στον αριθμό των CD34+ καρκινικών κυττάρων με προέλευση τα κερατινοκύτταρα. Επίσης, υπήρχε έκφραση και άλλων δεικτών των stem κυττάρων της περιοχής bulge όπως τα Gas6, EphrinA4, Sox9, Runx1, Tcf3 και Tenascin C. Επιπλέον όταν έγινε μεταμόσχευση απομονωμένων CD34+ καρκινικών κυττάρων, σε προσπάθεια ανάπλασης του δέρματος, αυτά δημιούργησαν δευτερογενείς καρκινικές εστίες [162]. Η πυρηνική β-κατενίνη, χαρακτηριστικό της ενεργούς σηματοδότησης Wnt/β-κατενίνης, έχει ανιχνευθεί σε CD34+ καρκινικά κύτταρα. Η επιλεκτική απάλειψη του γονιδίου της β- κατενίνης είχε ως αποτέλεσμα την ολοκληρωτική υποχώρηση των εγκατεστημένων όγκων. Επίσης, χάθηκε σε μεγάλο βαθμό η έκφραση του δείκτη επιφανείας CD34, ενώ τα κύτταρα στα οποία παρέμεινε η έκφρασή του δεν ήταν πλέον ικανά να δημιουργήσουν δευτερογενείς όγκους. Αντίστοιχα με ότι παρατηρείται στους επίμυες, τα SCC κύτταρα στον άνθρωπο εμφανίζουν ενεργό σηματοδότηση β-κατενίνης ενώ και η απάλειψή της έχει ως αποτέλεσμα μειωμένη ανάπτυξη των SCC κυττάρων σε πειράματα μετά από μεταμόσχευση [162]. Η ομάδα του Trempus και συν. [163] ερεύνησε τις συνέπειες της γενετικής απάλειψης του CD34 στη καρκινογένεση του δέρματος. Οι επίμυες λοιπόν με απάλειψη του CD34 απέτυχαν να δημιουργήσουν θηλώματα παρά μόνο με την αύξηση της δόσης του καρκινογόνου 150

151 χημικού παράγοντα TPA που χρησιμοποιείται σε τέτοια πειράματα σε δόση 400 nm. Ακόμα και υπό τις συνθήκες αυτές η εμφάνιση του όγκου έγινε με καθυστέρηση, ενώ και ο αριθμός των θηλωμάτων ήταν μικρότερος από τους control επίμυες. Το συμπέρασμα των ερευνητών ήταν ότι το μόριο διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση των stem κυττάρων μετά την εφαρμογή της ουσίας TPA στα πειραματόζωα. Παραμένει ωστόσο να αποδειχθεί εάν στα πειραματικά αυτά μοντέλα συμβάλλουν στη καταστολή της καρκινογένεσης και κύτταρα που εκφράζουν το CD34 χωρίς όμως να είναι κερατινοκύτταρα. Υπάρχουν αρκετά δεδομένα που υποστηρίζουν ότι η δραστικότητα της β-κατενίνης συνδέεται με την ανάπτυξη καρκινωμάτων εκ πλακωδών κυττάρων [162, 164, 165]. Στην εικόνα 76 απεικονίζεται το φυσιολογικό Wnt/β-κατενίνη σηματοδοτικό μονοπάτι. Εικόνα 76 Το Wnt/β κατενίνη σηματοδοτικό μονοπάτι. Όταν το μόριο Wnt συνδέεται με τον υποδοχέα Frizzled, μεταβιβάζεται σήμα για την καταστολή του ενζύμου GSK3b (Glycogen Synthetase Kinase 3b). Aυτό αποτρέπει τη φωσφορυλίωση και αποδόμηση του συμπλόκου β κατενίνης με αποτέλεσμα η β κατενίνη να συσσωρεύεται στο πυρήνα, να συνδέεται με τον μεταγραφικό παράγοντα LEF και να ενεργοποιεί τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων [228]. Επίσης, η ιντεγρίνη α6β4 έχει σημαντικό ρόλο στη καρκινογένεση του δέρματος. Υψηλά επίπεδά της και εντόπιση εξωτερικά της βασικής στιβάδας έχουν συσχετισθεί με δυσμενή 151

152 πρόγνωση SCCs στον άνθρωπο και σε πειραματόζωα. Ο Owens και συν. [166] έδειξαν ότι η έκφραση της α6β4 ιντεγρίνης σε κύτταρα πάνω από την βασική στιβάδα σε επιδερμίδα ποντικών έχει ως αποτέλεσμα αυξημένη ευαισθησία στην επαγόμενη με χημικές ουσίες καρκινογένεση. Αυτό το αποτέλεσμα φαίνεται να διαμεσολαβείται από διαταραγμένη TGFβ σηματοδότηση. Πρόσφατα, ο Raymond και συν. [167] εξέτασαν τη συμμετοχή της α6β4 ιντεγρίνης στην έναρξη της ογκογένεσης με τη δημιουργία αθανατοποιημένων (με απάλειψη του p53) κερατινοκυττάρων ποντικών. Το συμπέρασμα αυτής της μελέτης όπως και των υπολοίπων είναι ότι η δράση της α6β4 ιντεγρίνης φαίνεται να είναι εξαρτώμενη από τις ογκογόνες μεταλλάξεις που υπάρχουν ή όχι στα κύτταρα της επιδερμίδας, για παράδειγμα μεταλλάξεις στον μεταγραφικό παράγοντα Ras. Ένα πολύ σημαντικό βήμα για την ταυτοποίηση των SCC καρκινικών stem κυττάρων έγινε από τον Prince και συν. [160] με τη μεταμόσχευση SCC κυττάρων από ανθρώπους ασθενείς σε επίμυες και τη περαιτέρω επεξεργασία τους με τεχνικές κυτταρομετρίας ροής. Το ποσοστό των κυττάρων με θετικό το δείκτη-αντιγόνο της κυτταροπλασματικής μεμβράνης CD44 σε σχέση με τα υπόλοιπα κύτταρα των όγκων εμφάνιζε μια διακύμανση 5-35% μεταξύ των πειραματόζωων. Παρουσιάζει ενδιαφέρον, ότι ογκογόνο δυναμικό εμφάνιζαν σχεδόν αποκλειστικά οι CD44+ κυτταρικοί πληθυσμοί. Επιπλέον σε καλά διαφοροποιημένους όγκους, τα CD44+ κύτταρα ήταν διπλά θετικά για την κερατίνη 5 και κερατίνη 14 ενώ διατηρούσαν φαινότυπο παρόμοιο με τα κύτταρα της βασικής στιβάδας της επιδερμίδας. Το συμπέρασμα από μελέτες με μεταμόσχευση κυττάρων του όγκου αλλά και άλλες in vitro μελέτες (ανοσοϊστοχημεία, FACS) είναι ότι τα SCC καρκινικά stem κύτταρα χαρακτηρίζονται από την αυξημένη έκφραση του αντιγόνου της κυτταρικής μεβράνης CD44. Αυτή η θεώρηση συνδυάζεται με πρόσφατες μελέτες, που δείχνουν ότι το μόριο CD44 χαρακτηρίζει τα καρκινικά stem κύτταρα και σε άλλα καρκινώματα όπως σε καρκίνο μαστού [168], παγκρέατος [169] και παχέος εντέρου [170]. Είναι πιθανό ότι η αναγνώριση του CD44 είναι μόνο ένα αρχικό βήμα για τη ξεκάθαρη ταυτοποίηση και χαρακτηρισμό των SCC καρκινικών stem κυττάρων. Για παράδειγμα, τα CD44+ παγκρεατικά καρκινικά stem κύτταρα έχουν μεγαλύτερο ογκογόνο δυναμικό, καθώς για τη δημιουργία πανομοιότυπων όγκων μετά από μεταμόσχευση χρειάζονται περίπου 100 τέτοια κύτταρα μόνο [169]. Αντίθετα, η πιο μικρή ποσότητα CD44+ SCC κυττάρων με ογκογόνο δυναμικό είναι περίπου 5000 [160]. Πιθανόν αυτή η διαφορά να οφείλεται στο γεγονός ότι για τη ταυτοποίηση καρκινκών stem κυττάρων σε άλλους όγκους γίνεται ένας συνδυασμός από δύο ή τρεις κυτταροπλασματικούς δείκτες. Έτσι τα παγκρεατικά καρκινικά stem κύτταρα ταυτοποιήθηκαν με τους δείκτες CD44, CD24 και ESA, ενώ για τα αντίστοιχα κύτταρα προστάτη χρησιμοποιήθηκε η έκφραση των δεικτών CD133 και α2β1 ιντεγρίνη. Ο SCC 152

153 κυτταρικός πληθυσμός που εκφράζει συνδυαστικά τα μόρια CD44 και CD133 είναι κλωνογόνος, αλλά είναι πολύ μικρός και δεν έχει ακόμα χαρακτηρισθεί πλήρως λειτουργικά [171]. Επομένως ο CD44+ SCC κυτταρικός πληθυσμός είναι ετερογενής και χρειάζεται περαιτέρω χαρακτηρισμός του πιθανόν με συνδυασμό δεικτών. Ένα άλλο θέμα, που περιπλέκει την κατάσταση, είναι οι διαφορετικές ισομορφές του CD44 που προκύπτουν από το εναλλακτικό μάτισμα. Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται ανιχνεύουν όλες τις ισομορφές του μορίου, ωστόσο υπάρχει διακριτή έκφραση των διαφορετικών ισομορφών μεταξύ της φυσιολογικής επιδερμίδας και των SCC κυττάρων. Στη φυσιολογική επιδερμίδα και στα κερατινοκύτταρα υπό καλλιέργεια, ο δείκτης CD44 είναι παρών τόσο στα αδιαφοροποίητα κύτταρα της βασικής στιβάδας όσο και στα πιο διαφοροποιημένα κερατινοκύτταρα των εξωτερικών στιβάδων. Το αποτέλεσμα είναι ότι τα περισσότερα αντισώματα που χρησιμοποιούνται βάφουν όλη τη επιδερμίδα και δεν μπορούν να αξιοποιηθούν για την αναγνώριση των stem κυττάρων στο υγιές δέρμα [157]. Ωστόσο η καταστολή της έκφρασης της ισομορφής CV44v9 συνδέεται με δυσμενή πρόγνωση και μεταστατικό δυναμικό [157]. Είναι πιθανό μελλοντικά η χρήση αντισωμάτων ειδικών για κάθε ισομορφή του CD44 να επιτρέψει καλύτερη αναγνώριση των ογκογόνων SCC κυτταρικών πληθυσμών. Πρόσφατα, η ποδοπλανίνη αναγνωρίσθηκε ως ένας άλλος δυνητικός δείκτης για τα κύτταρα που είναι υπεύθυνα για τη δημιουργία του όγκου σε μια SCC κυτταρική σειρά, A431 [172]. Tα ποδοπλανίνη+ κύτταρα επίσης εκφράζουν το CD44, και είχαν υψηλότερο δυναμικό σχηματισμού κλώνων-αποικιών in vitro και εγκαινίαζαν πιο γρήγορα όγκους από τα ποδοπλανίνη- κύτταρα. Σε προγενέστερη μελέτη έχει αποδειχθεί ότι η ποδοπλανίνη συμβάλλει στη καρκινογένεση με τη προώθηση της EMT [157]. Παρόλα αυτά, ο δείκτης αυτός όπως και ο CD44 χαρακτηρίζει αδρά τα SCC καρκινικά stem κύτταρα, καθότι απαιτείται η μεταμόσχευση τουλάχιστον κυττάρων για τη δημιουργία πανομοιότυπου όγκου στο δέκτη. Επομένως, απαιτείται η αναγνώριση επιπλέον δεικτών για την απομόνωση και χαρακτηρισμό των καρκινικών stem κυττάρων. Αναπτυξιακά μεταγραφικά μονοπάτια και όγκοι του δέρματος Τα σηματοδοτικά μονοπάτια Notch, Hedgehog, c-myc και β-κατενίνης αποτελούν σημαντικούς ρυθμιστές των stem κυττάρων του δέρματος, σύμφωνα με πρόσφατα στοιχεία όμως, συμμετέχουν και στην καρκινογένεση. Όπως αναφέρθηκε νωρίτερα, η μη φυσιολογική 153

154 Wnt/β-κατενίνη σηματοδότηση προκαλεί υποχώρηση σε όγκους επαγόμενους με χημικές ουσίες σε πειραματικά μοντέλα με επίμυες [162]. Αρκετές έρευνες συνδέουν την δημιουργία βασικοκυτταρικών καρκινωμάτων BCCs με το Hedgehog σηματοδοτικό μονοπάτι, η φυσιολογική λειτουργία του οποίου περιγράφεται στην εικόνα 77 [173, 174, 175]. Εκτιμάται ότι το 50-60% όλων των πρωτογενών ανθρώπινων βασικοκυτταρικών καρκινωμάτων εμφανίζουν μεταλλάξεις στο μεταγραφικό παράγοντα PTCH1 του Hedgehog μονοπατιού. Αυτές οι μεταλλάξεις συνδέονται και με την οικογενή μορφή των BCCs [174, 175]. Εικόνα 77 Το σηματοδοτικό μονοπάτι Sonic Hedgehog. H οικογένεια των εξωκυττάριων συνδετών του μονοπατιού στα θηλαστικά περιλαμβάνει τα μόρια Shh (Sonic hedgehog), Ihh (Indian hedgehog) και Dhh (Desert hedgehog) που συνδέονται με τον υποδοχέα PTCH1. Έτσι διακόπτεται η καταστολή του Smo από το PTCH1 με συνέπεια το Smo να μεταδίδει το σήμα με μια σειρά από μεταγραφικούς παράγοντες. Τελικά ενεργοποιούνται οι μεταγραφικοί παράγοντες GLI1, GLI2 και GLI3 [228]. Τα βασικοκυτταρικά καρκινώματα θεωρείται ότι έχουν προέλευση από κύτταρα του τριχοθυλακίου. Έχει προταθεί επίσης, ότι η δημιουργία τους έχει ομοιότητες με την ανάπτυξη του τριχοθυλακίου, μια διαδικασία που είναι εξαρτώμενη από τον παράγοντα Shh. Παρότι πιστεύεται ότι το μονοπάτι Hedgehog εξαρτάται από τη σηματοδότηση Wnt/β-κατενίνη κατά την ανάπτυξη του τριχοθυλακίου, μια έρευνα με βασικοκυτταρικά καρκινώματα σε επίμυες έδειξε ότι μπορεί να έχει ανεξάρτητη δράση στη δημιουργία των νεοπλασμάτων [176]. 154

155 Η πρωτεΐνη p63 έχει παρόμοια δομή με το μόριο p53 που έχει ογκοκατασταλτική δράση, παρόλα αυτά, σύμφωνα με έρευνες, έχει σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό νεοπλασμάτων της επιδερμίδας [177]. Επίμυες όπου απουσιάζει το λειτουργικό μόριο p63 εμφανίζουν αντοχή στη καρκινογένεση του δέρματος [177]. Επίσης, η απάλειψη του ογκογόνου μεταγραφικού παράγοντα c-myc από την επιδερμίδα έχει ως αποτέλεσμα εμφάνιση αντοχής στον σχηματισμό όγκων [178]. Αντίθετα, έχουν αναφερθεί πρωτοπαθείς όγκοι του δέρματος σε επίμυες που υπερεκφράζουν το c-myc [179]. Αντίθετα από τα μονοπάτια Wnt/β-κατενίνη, Hedgehog, p63 και c-myc, ο μεταγραφικός παράγοντας Notch εμφανίζει ογκοκατασταλτική δράση. Επίμυες με μη φυσιολογική Notch σηματοδότηση λόγω γενετικής απάλειψης του γονιδίου Notch1, εμφανίζουν πρωτοπαθή καρκινώματα εκ πλακωδών κυττάρων [180, 181, 182]. Ταυτόχρονα αυτοί οι όγκοι εμφάνισαν ενεργό Shh και Wnt/β-κατενίνη σηματοδότηση [180, 182]. Η απάλειψη του Notch είχε ως αποτέλεσμα αυξημένη ευαισθησία στη επαγώμενη από χημικές ουσίες αλλά και λόγω του ενεργοποιημένου παράγοντα Ras καρκινογένεση [180, 183]. Σε μια μελέτη, ο Notch αναφέρεται ως στόχος της ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης p53 στη επιδερμίδα [183]. Έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων SOX9 και OCT4 σε όγκους του δέρματος Σε μια μελέτη με ανοσοφθορισμό [184], μελετήθηκε ο ρόλος του SOX9 στα βασικοκυτταρικά καρκινώματα, καθώς και η έκφρασή του σε άλλους όγκους του δέρματος. Ο SOX9 είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που διεκπεραιώνει πολλές λειτουργίες κατά τη ανάπτυξη. Πρόσφατα δεδομένα υποστηρίζουν ότι ο SOX9 είναι στόχος του Hedgehog σηματοδοτικού μονοπατιού, η ενεργοποίηση του οποίου όπως αναφέρθηκε είναι βασικός παράγοντας στη παθογένεια των BCC. Το αποτέλεσμα της έρευνας έδειξε ότι η έκφραση του SOX9 είναι ένα γενικό χαρακτηριστικό των BCC και των νεοπλασμάτων των εξαρτημάτων του δέρματος, πιθανολογώντας συμμετοχή αυτού του μεταγραφικού παράγοντα στη παθογένεια των όγκων. Ο OCT4, ως γνωστόν, είναι ένας δείκτης πολυδυναμίας και είναι παρών στα εμβρυικά stem κύτταρα, τα προγονικά γεννητικά κύτταρα και σε αρκετές νεοπλασίες μεταξύ των οποίων το σεμίνωμα, εμβρυικά καρκινώματα (embryonal carcinoma) και το δυσγερμίνωμα (dysgerminoma). Στις πειραματικές μελέτες των Tai και συν. [185] και Yu και συν [187] 155

156 έγινε ανίχνευση με τεχνικές ανοσοϊστοχημείας της έκφρασης της πρωτεΐνης OCT4 στα κύτταρα της βασικής στιβάδας της φυσιολογικής επιδερμίδας στον άνθρωπο. Ο Katona και συν. [187] εξέτασαν μια σειρά από βασικοκυτταρικά καρκινώματα καθώς και όγκους των εξαρτημάτων του δέρματος με σχετιζόμενη ιστολογική και εμβρυολογική προέλευση σε μια προσπάθεια να επιβεβαιώσουν τα παραπάνω ευρήματα και να επεξεργαστούν την έκφραση του OCT4 στους καρκίνους του καλυπτήριου συστήματος. Έτσι, έγινε ανάλυση της έκφρασης της πρωτεΐνης OCT4 σε 115 δερματικές βιοψίες, μεταξύ των οποίων 26 βασικοκυτταρικά καρκινώματα, 12 καλοήθεις θυλακιώδεις όγκους, 12 σμηγματορροικές υπερπλαστικές βλάβες, 10 σμηγματορροικά αδενώματα, 8 καρκινώματα εκ πλακωδών κυττάρων, 8 συμπαγείς μελανοκυτταρικούς σπίλους κ.α. Και τα 115 δείγματα που εξετάστηκαν ήταν αρνητικά για έκφραση του OCT4, μεταξύ των οποίων και 31 δείγματα από το τριχωτό δέρμα της κεφαλής. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η έκφραση του OCT4 δεν διατηρείται στα νεοπλάσματα του δέρματος με προέλευση τη βασική στιβάδα της επιδερμίδας ή άλλους συναφείς όγκους εξαρτημάτων του δέρματος. Από τις έρευνες αυτές φαίνεται ότι ο μεταγραφικός παράγοντας OCT4 εκφράζεται στα φυσιολογικά stem κύτταρα της επιδερμίδας, όταν όμως αυτά σύμφωνα με τη θεωρία των καρκινικών stem κυττάρων δημιουργήσουν νεοπλάσματα χάνουν το stemness (πολυδυναμία) τους μαζί και την έκφραση του OCT4. Έκφραση χαρακτηριστικών μεταγραφικών παραγόντων των stem κυττάρων σε καρκίνους στον άνθρωπο Οι μεταγραφικοί παράγοντες Oct4 και Sox2, όπως αναφέρθηκε, εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα στα εμβρυϊκά stem κύτταρα. Σε συνδυασμό με τους μεταγραφικούς παράγοντες Klf4 και c-myc, η έκφρασή τους μπορεί να επάγει την πολυδυναμία σε σωματικά διαφοροποιημένα κύτταρα ποντικού και ανθρώπου. Ο Matthieu Schoenhals και συν. [227] πραγματοποίησαν μια μελέτη στην οποία έγινε σύγκριση της έκφρασης αυτών των 4 μεταγραφικών παραγόντων σε 40 ανθρώπινους καρκίνους (4 αιματολογικές κακοήθειες και 36 συμπαγείς καρκίνους) σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό προέλευσής τους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τουλάχιστον ένα γονίδιο που κωδικοποιεί έναν από τους παράγοντες αυτούς- Oct4, Sox2, Klf4 και c-myc- υπερεκφράζεται στους 18 από τους 40 τύπους καρκίνου που εξετάστηκαν. Επιπλέον, σε δεδομένο καρκίνο, η έκφραση αυτών των γονιδίων σχετίζεται με την εξέλιξη του όγκου ή δυσμενή πρόγνωση όπως φαίνεται πιο αναλυτικά στους πίνακες Χ. Η ενεργοποίηση επομένως ενός μεταγραφικού προγράμματος 156

157 των εμβρυικών stem κυττάρων σε διαφοροποιημένα σωματικά κύτταρα είναι δυνατό να επάγει χαρακτηριστικά των καρκινικών stem κυττάρων. Πίνακας 7 Υπερέκφραση των Sox2,Oct4, Klf4 και c Myc σε ανθρώπινους καρκίνους σε σχέση με τον φυσιολογικό ιστό προέλευσης [227]. Πίνακας 8 Συσχέτιση Sox2, Oct4, Klf4 και c Myc με το στάδιο του όγκου [227]. 157

158 Πίνακας 9 Συσχέτιση των Sox2, Oct4, Klf4 και c Myc με την πρόγνωση του καρκίνου [227]. Καρκινικά stem κύτταρα και κακόηθες μελάνωμα Το ανθρώπινο κακόηθες δερματικό μελάνωμα ΔΜ αποτελεί ένα πολύ επιθετικό, με υψηλό μεταστατικό δυναμικό, κακόηθες νεόπλασμα. Εμφανίζονται περίπου 10 νέες περιπτώσεις της νόσου ανά πληθυσμού ανά έτος στην Ευρώπη και στις Η.Π.Α. ενώ η μεγαλύτερη επίπτωση στον κόσμο σημειώνεται στην Αυστραλία, στη Νέα Ζηλανδία και στη Βόρεια Αμερική. Η συχνότητα εμφάνισης του ΔΜ εξακολουθεί να αυξάνεται, με συνοδό αύξηση της θνησιμότητας, δεδομένης της ανθεκτικότητας του όγκου στις αντικαρκινικές θεραπείες. Η νόσος είναι συχνότερη στη λευκή φυλή. Υπό εξέλιξη βρίσκεται η γενετική έρευνα για τη νόσο, καθώς το κακόηθες ΔΜ θεωρείται ότι προέρχεται από διαδοχική συσσώρευση γενετικών μεταβολών στα φυσιολογικά μελανινοκύτταρα και το 5% των ΔΜ είναι οικογενή. Ιστολογικά διακρίνονται πέντε στάδια στην εξέλιξη του μελανώματος: καλοήθης σπίλος με δυσπλαστικές αλλαγές, δυσπλαστικός σπίλος, φάσης ακτινικής-οριζόντιας επέκτασης (RPG), φάση κάθετης επέκτασης (VGP) και μεταστατικό μελάνωμα [111]. Αρκετές έρευνες υποστηρίζουν την ύπαρξη και συμμετοχή των καρκινικών stem κυττάρων μελανώματος ΜΜSCs (malignant melanoma stem cells) τα οποία εγκαινιάζουν και συντηρούν την ανάπτυξη και εξέλιξη του κακοήθους μελανώματος στον άνθρωπο, όπως επίσης και την αντοχή που εμφανίζει στις θεραπευτικές παρεμβάσεις [188, 193]. Η πιθανή προέλευση των stem κυττάρων μελανώματος MΜSCs απεικονίζεται στην εικόνα 79 που ακολουθεί. 158

159 Εικόνα 78 Τα MMSCs μπορούν να εμφανιστούν λόγω μεταλλάξεων στα stem κύτταρα που είναι δεσμευμένα για διαφοροποίηση προς μελανοκύτταρα (MSCs) ή σε προγονικά κύτταρα. Πιθανόν όμως να είναι το αποτέλεσμα της αποδιαφοροποίησης σε τελικώς διαφοροποιημένα κύτταρα. Είναι υπεύθυνα για τη ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση [194]. Όπως και οι φυσιολογικοί ιστοί, τα μελανώματα απαρτίζονται από φαινοτυπικά ετερογενείς κυτταρικούς ιστούς [188, 189]. Τα πολύ επιθετικά κύτταρα μελανώματος παρουσιάζουν χαρακτηριστικά παρόμοια με αυτά των πολυδύναμων αδιαφοροποίητων stem κυττάρων. Πράγματι, εμφανίζουν ομοιότητες όπως το απεριόριστο δυναμικό πολλαπλασιασμού, κυτταρικής πλαστικότητας (συνδυασμός φαινοτύπων) καθώς και την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στη διατήρηση της πολυδυναμίας (πίνακας 10) [195]. 159

160 Πίνακας 10 Σύγκριση της έκφρασης επιλεγμένων δεικτών των ανθρώπινων εμβρυϊκών stem κυττάρων σε σχέση με κύτταρα επιθετικού μελανώματος. Απεικονίζεται η σχετική έκφραση των αντίστοιχων γονιδίων με ανάλυση real time PCR [195]. Επίσης, έχουν ανιχνευθεί σε μελανώματα πρωτεΐνες που σχετίζονται με stem και προγονικά κύτταρα όπως το BMP (Bone Morphogenetic Protein) [196], οι υποδοχείς Notch [197], οι Wnt [198], ABCB5, CD133, CD166, CD34, nestin και c-kit [189, 199]. Ένα υποθετικό μοντέλο της σχέσης μεταξύ των stem κυττάρων MSCs και των καρκινικών stem κυττάρων κακοήθους μελανώματος (MMSCs) καθώς και η επίδραση του μικροπεριβάλλοντος απεικονίζεται στις εικόνες 79 και 80. Η πρώτη φορά που αναγνωρίσθηκαν MSCs (melanocyte stem cells) ήταν σε μια πειραματική μελέτη του Nishimura και συν. το 2002 με διαγονιδιακούς επίμυες [200]. Αναγνωρίσθηκαν ως κύτταρα με χαμηλό ρυθμό αυτο-ανανέωσης και δυνατότητα διαφοροποίησης σε προγονικά κύτταρα ικανά για παραγωγή μελανίνης. Τα MSCs εντοπίζονται στη περιοχή bulge του τριχοθυλακίου, στο εξωτερικό έλυτρο της τρίχας [201]. Εικόνα 79 Σχηματική απεικόνιση της σχέσης μεταξύ των δεσμευμένων stem κυττάρων για διαφοροποίηση προς μελανοκύτταρα (MSCs), των κακοήθων stem κυττάρων μελανώματος (MMSC) και η επίδραση του μικροπεριβάλλοντος. A) Τα φυσιολογικά MSCs χαρακτηρίζονται από την έκφραση των Pax3, Sox10 και Mitf, φαινότυπο δηλαδή που συνάδει με αδιαφοροποίητη κατάσταση και αδράνεια. Η ισορροπία μεταξύ αυτο ανανέωσης, διαφοροποίησης και πολλαπλασιασμού των MSCs ρυθμίζεται περαιτέρω με τη δράση των μεταγραφικών παραγόντων Notch και/ή Wnt. Πιστεύεται ότι η ομοιόσταση των MSCs ρυθμίζεται σε μεγάλο βαθμό μέσω της 160

161 διαντίδρασης με το μικροπεριβάλλον και κυρίως με τα κερατινοκύτταρα που εκφράζουν Ε καντχερίνη. Οι επιφανεικοί δείκτες της κυτταροπλασματικής μεμβράνης που έχουν συσχετισθεί με τα MMSCs περιλαμβάνουν μεταξύ άλλων τα μόρια ABCB5, CD133 και CD20. Επιπλέον, παράγοντες όπως ο Nodal και ο BMP4 μπορεί να εκκρίνονται από πληθυσμούς MMSCs. Εκτός από τις μεταλλάξεις που συσσωρεύονται στα MSCs, οι αλλαγές του μικροπεριβάλλοντος συμβάλλουν επίσης στην εμφάνιση των MMSCs. Ένα τέτοιο μικροπεριβάλλον χαρακτηρίζεται από τη παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων αυξητικών παραγόντων, όπως οι bfgf, HIF, IGF 1, TGF b και VEGF. Αυτοί οι παρακρινείς διαμεσολαβητές που παράγονται κυρίως από τα N καντχερίνη+ ενδοθηλιακά κύτταρα ή τους περιβάλλοντες ινοβλάστες, μπορούν να προκαλέσουν τον πολλαπλασιασμό των MMSCs και την εξέλιξη του μελανώματος. Είναι πιθανό όμως και τα ίδια τα MMSCs εκκρίνοντας παράγοντες (π.χ. Nodal, BMP4) να διαταράσσουν και να διαμορφώνουν το μικροπεριβάλλον τους ώστε να υποστηρίζεται η ανάπτυξη και εξέλιξη του όγκου [210]. Εικόνα 80 Συμμετοχή των MMSCs στην έναρξη, ανάπτυξη και αντίσταση στην θεραπεία του μελανώματος. Τα MMSCs χαρακτηρίζονται από την ικανότητα για αυτο ανανέωση, διαφοροποίηση προς διαφορετικούς τύπους κυττάρων αλλά και για την δημιουργία όγκων in vivo. Tα ρυθμιστικά σηματοδοτικά μονοπάτια των φυσιολογικών stem κυττάρων όπως το BMP, Mitf, Notch, Shh και Wnt, εμφανίζονται να δυσλειτουργούν στο κακόηθες μελάνωμα και να διαταράσσεται έτσι η ισορροπία μεταξύ της αυτο ανανέωσης και της διαφοροποίησης των MMSCs. Μόρια που έχουν συσχετισθεί με τα κακοήθη μελανώματα είναι τα Nodal και MTf. Οι μηχανισμοί με τους οποίους τα φυσιολογικά stem κύτταρα τείνουν να είναι πιο ανθεκτικά στη θεραπεία από τα σωματικά κύτταρα περιλαμβάνουν την έκφραση των μεταφορέων ABC, τον σχετικά χαμηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού, διαταραχή του ανοσοποιητικού συστήματος ή της απόπτωσης. Αυτοί οι μηχανισμοί πιθανό να αξιοποιούνται και από τα MMSCs. Υποψήφιοι παράγοντες όπως τα μόρια CD166, CXCR4 ή NEDD9 161