Αυτοανανέωση. Αυτοανανέωση. Διαφοροποίηση. Διαφοροποίηση

Transcript

1 Βλαστικό κύτταρο: Έχει την ικανότητα να αναπαράγει τον εαυτό του ή άλλα βλαστικά κύτταρα (Αυτοανανέωση) καθώς και διάφορους κυτταρικούς τύπους (Διαφοροποίηση) Αυτοανανέωση Αυτοανανέωση Διαφοροποίηση Διαφοροποίηση

2 Ο όρος Βλαστικά κύτταρα περιλαμβάνει κυτταρα με διαφορετικές ιδιότητες: Πολυδύναμα (Pluripotent)Pluripotent) Embryonic Stem Cells (Εμβρυονικά Βλαστικά κύτταρα), ips Ολιγοδύναμα/ Πλειοδύναμα (Multipotent) Βλαστικά κύτταρα (ώριμων/εμβρυικών) Ιστών Adult Stem Cells Totipotent Ολοδύναμα/Παντοδύναμα Ζυγωτό Βλαστομερή μέχρι και το στάδιο των τεσσάρων κυττάρων

3 ΒΛΑΣΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΙΣΤΩΝ ΕΝΗΛΙΚΩΝ (ADULT/SOMATIC STEM CELLS) ΠΛΕΙΟΔΥΝΑΜΑ - MULTIPOTENT

4 ΠΛΕΙΟΔΥΝΑΜΑ Βλαστικά Κύτταρα υπάρχουν στους ιστούς ενήλικα ASCs

5 Τα βλαστικά κύτταρα ενός ιστού βρίσκονται σε καθορισμένες θέσεις Θώκος (Pluripotent)niche)

6 Παράγοντες του Θώκου Κύτταρα του ανοσοποιητικού Ενδοθήλιο, νευρώνες και γλία Κύτταρα του υποστρώματος ( οστεοβλάστες, μυϊκά κύτταρα, Paneth κλπ Μεσεγχυματικα κύτταρα (ινοβλάστες, κύτταρα λιπωδους ιστού, Σύνδεσμοι πρόσφυσης (Adherens Junctions) Εστιακές προσφύσεις (Focal Adhesions) Πρωτεϊνες της εξωκυττάριας μήτρας Σηματοδοτικοί υποδοχείς - Αυξητικοί παράγοντες, κυττοκίνες, χημοκίνες κλπ Μικρά ιόντα

7 Τυπικά παραδείγματα θώκου σε ιστούς Τριχοθυλάκιο Κρύπτη εντέρου Μυελός Οστών

8 Θώκος και διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων του Αιμοποιητικού (Pluripotent)HSCs)

9 Ο θώκος των βλαστικών κυττάρων του εντέρου

10 VIDEO Clevers - The intestinal Crypt

11 ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ

12 Δομές που δημιουργούνται μετά απόο διαφοροποίηση βλαστικών κυττάρων σε συνθήκες in vitro EMBRYOIDS Πολυδύναμα κύτταρα GASTROULOIDS Έμβρυα -??? (Pluripotent)ESCs)+βλαστικά κύτταρα τροφοβλάστης (Pluripotent)TSCs)+ ΒΚ πρωτογενούς ενδοδέρματος (Pluripotent)PESCs) (Pluripotent)2016) Πολυδύναμα κύτταρα (Pluripotent)2018) ORGANOIDS Πολυδύναμα και Πλειοδύναμα κύτταρα --

13 Διαφοροποίηση Πολυδύναμων Βλαστικών Κυττάρων

14 Συστήματα διαφοροποίησης των πολυδύναμων ESC κυττάρων α) δημιουργία εμβρυοειδών σωματίων (Pluripotent)Embryoid Bodies) Τρισδιάστατες καλλιέργειες β) έκπτυξη των ESC πάνω σε κύτταρα στρώματος γ) αυθόρμητη διαφοροποίηση ESC που αναπτύσσονται πάνω σε πρωτεΐνες του εξωκυττάριου πλέγματος β) και γ) είναι καλλιέργειες δυο διαστάσεων

15 Εμβρυοειδή Σωμάτια (Pluripotent)Embryoid Bodies)

16 Διαφοροποίηση ESCs με τη μέθοδο «κρεμάμμενης σταγόνας»

17 Διαφοροποίηση ESCs με τη μέθοδο «κρεμάμμενης σταγόνας»

18 Gastruloids: Καλλιέργεια ανθρώπινου εμβρύου μέχρι το στάδιο σχηματισμού της αρχέγονης αύλακας σε συνθήκες in vitro (Pluripotent)2016)

19 Ο κανόνας των 14 ημερών (Pluripotent)1977) Δεν επιτρέπεται η in vitro καλλιέργεια ανθρώπινων εμβρύων πέρα από το όριο των 14 ημερών 5-6 ημέρες: Εμφύτευση 14 ημέρες: Σχηματισμός πρωτογενούς λωρίδας-έναρξη Γαστριδίωσης

20 ΟΡΓΑΝΟΕΙΔΗ (Pluripotent)ORGANOIDS) Ως οργανοειδή συστήματα ή οργανοειδή ορίζονται τρισδιάστατες (3D) κυτταρικές καλλιέργειες D) κυτταρικές καλλιέργειες που διαθέτουν μερικά από τα βασικά χαρακτηριστικά του οργάνου για το οποίο έχουν σχεδιαστεί. Βασίζονται στις ιδιότητες αυθόρμητης (ή αυτο-) οργάνωσης που έχουν τα βλαστικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης. Σαν αποτέλεσμα σχηματίζονται τεχνητά μινι-όργανα που αναπαριστούν πιστά την in vivo αρχιτεκτονική όπως και τη λειτουργικότητα και γενετική υπογραφή των πρωτότυπων ιστών. Τα οργανοειδή μπορούν να προέρχονται από δύο τύπους βλαστικών κυττάρων: (Pluripotent)i) τα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα (Pluripotent)Pluripotent Stem Cells - PSC), με άλλα λόγια είτε εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα (Embryonic Stem Cells - ESC) είτε επαγόμενα πολυδύναμα κύτταρα (induced Pluripotent Stem Cells - ipscs), και (ii) βλαστικά κύτταρα ενηλίκου (Pluripotent)Adult Stem Cells - ASC), που είναι ειδικά για κάθε ιστό.

21 ORGANOIDS Χρήσεις: Ενώ δεν έχει επιτευχθεί ακόμα πλήρης ομοιότητα/λειτουργικότητα με τα αντίστοιχα όργανα Τα οργανοειδή παρέχουν μοναδική ευκαιρία για την Μελέτη αναπτυξιακών μηχανισμών των ανθρώπινων οργάνων σε συνθήκες in vitro παρόμοια με την ανάπτυξη των οργάνων αυτών in vivo. οργανειδή προερχόμενα από κύτταρα του ίδιου του ασθενούς μπορεί να χρησιμοποιηθούν ως απόλυτα συμβατά μοσχεύματα. Μοντελοποίηση ασθενειών

22 ORGANOIDS: Προέλευση Α) Τμήματα ιστών απευθείας Β) Κύτταρα καλλιεργειών Γ) Απομονωμένα Βλαστικά κύτταρα: πλειοδύναμα ή πολυδύναμα Για το σχηματισμό οργανοειδών Σε κάθε περίπτωση απαιτείται η Ανεύρεση των ιδανικών ΣΥΝΘΗΚΩΝ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣ

23 Έχουν δημιουργηθεί Οργανοειδή: Εγκεφαλου Μαστού Πνεύμονα Νεφρού Ουροδόχου κύστεως Προστάτη Οφθαλμικά Οισοφάγου Στόμαχου Έντερου Ωοθήκών Ήπατος Ωρισμένα από PSCs, άλλα από ASCs

24 Το πρώτο Οργανοειδές Τεχνητό δέρμα από ανθρώπινα κύτταρα δέρματος

25 Organoids από πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα (Pluripotent)2014- ) Εντερικά/Στομαχικά/Ηπατικά Νεφρικά Εγκεφαλικά/Αμφιβληστοειδούς

26 Εναρξη κλινικών μελετών με κύτταρα ips Σεπτέμβριος 2014: Ξεκινά στην Ιαπωνία η πρώτη κλινική μελέτη με χρήση επιθηλιακών κυττάρων του μελάγχρου αμφιβληστροειδούς που προέρχονται από διαφοροποίηση αυτόλογων ipscs σε ασθενείς που παρουσίαζαν εκφύλιση της ωχράς κηλίδας λόγω γήρανσης

27 Κύτταρα ips Διαφοροποίηση προς επιθηλιακά κύτταρα Μελάγχρου αμφιβληστροειδούς Ιστός προς μεταμόσχευση

28 Το μικροπεριβάλλον μιας καλλιέργειας οργανοειδών Ανάπτυξη σε υποστηρικτικά Υλικά Εξωκυττάριας Ύλης Matrigel Φυσική προιόν από Engelbreth-HolmSwarm σάρκωμα μυός Εντερικά, εγκεφαλικά, γαστρικά, μαστικού αδένα Κολλαγόνο τύπου Ι Εντερικά, μαστικού αδένα Ύδρογέλες καθωρισμένης χημικής σύστασης

29 Τρισδιάστατες καλλιέργειες οργανοειδών σε εναιωρήματα οφθαλμού, εγκεφαλικά, παρεγκεφαλικά και ιπποκάμπου

30 Νεφρικά οργανοειδή με τη μέθοδο διεπαφής μεταξύ αέριας και υγρής επιφάνειας

31 Η προέλευση των βλαστικών κυττάρων καθορίζει το βαθμό ωρίμανσης του οργανοειδούς Όταν ξεκινάμε με βλαστικά κύτταρα ενήλικα είναι ευκολότερο να οδηγηθούμε σε οργανοειδή που έχουν παρόμοιες ιδιότητες με αυτές του αντίστοιχου ωριμου οργάνου Πολυδύναμα ΒΚ οδηγούν σε οργανοειδή με ιδιότητες που ομοιάζουν περισσότερο με αυτές εμβρυικών ιστών

32 ΟΡΓΑΝΟΕΙΔΗ ΕΝΤΕΡΟΥ Τα πρώτα τρισδιάστατα οργανοειδή παράχθηκαν από τη διαφοροποίηση ενήλικων βλαστικών κυττάρων προερχόμενα από έντερο ποντικού θετικά στην έκφραση της πρωτείνης Lgr5, που αποτελεί δείκτη βλαστικών κυττάρων εντέρου. Με τη μίμηση του εξειδικευμένου μικροπεριβάλλοντος in vivo, αναπτύχθηκαν ολοένα και μεγαλύτερα 3D) κυτταρικές καλλιέργειες D οργανοειδή που μοιάζουν με τη δομή και τη λειτουργικότητα του πρωτότυπου εντέρου. Αυτά περιλαμβάνουν εντερικά βλαστικά κύτταρα και εντερικές κρύπτες. Για το σχηματισμό των οργανοειδών χρησιμοποιήθηκαν εκτός από τα Lgr5+ κύτταρα: Α) Matrigel (μια εξωκυτταρική μήτρα υποστήριξης) και Β) ένα καθορισμένο μίγμα εξειδικευμένων παραγόντων (EGF, Wnt-3D) κυτταρικές καλλιέργειες, R-σπονδίνη, Noggin)

33 Στάδια σχηματισμού εντερικών οργανοειδών Απόκτηση τμήματος εντερικού ιστου με βιοψία Τεμαχισμός του ιστού σε μικρά τμήματα Απομόνωση είτε μικρών τμημάτων ιστού που περιέχουν τις ρύπτες του εντέρου είτε κυττάρων μετά από ενζυματική πέψη με θρυψίνη (θρυψινοποίηση) Ενοφθαλμισμός των ιστών ή κυττάρων σε εξωκυττάρια ύλη (Matrigel) Επώαση για 2-3D) κυτταρικές καλλιέργειες ημέρες σε θρεπτικά μέσα κατάλληλα για να διατηρηθούν τα λειτουργικά χαρακτηριστικά του οργάνου

34 Μορφολογία εντερικού οργανοειδούς

35 VIDEOS 1. Εντερικα Οργ 2. Mini-brains

36

37 Mini-Νεφρός

38 Βιοτράπεζες Οργανοειδών για μοντελοποίηση ασθενειών

39 Οργανοειδή στην Αναγεννητική Ιατρική Γονιδιακή Θεραπεία