ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥ ΩΝ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥ ΩΝ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΙN VIVO ΒΙΟΤΙΝΥΛΙΩΣΗ ΤΗΣ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗΣ ΒMP2 ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΓΙΑ ΝΑΝΟΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΚΑΡΑΤΖΑ ΑΓΓΕΛΙΚΗ,ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΥΠΕΥΘΥΝΗ: ΚΑΘ. Θ. ΧΟΛΗ ΠΑΠΑΔΟΠΟΥΛΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2013

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ A.ΕΙΣΑΓΩΓΗ Υπεροικογένεια TGF-β (Transforming Growth Factor Beta) πρωτεϊνών 5 BMPs (Bone morphogenetic proteins) 6 Ρόλος των BMPs κατά τη διάρκεια της πρώιµης ανάπτυξης των χορδωτών 9 Ο ρόλος των BMPs στην κυτταρική πολικότητα και µετανάστευση 10 ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ ΤΩΝ BMPs 12 Υποδοχείς των BMPs (BMPRs) 12 Συν-υποδοχείς 13 Προσδέτες ανταγωνιστές των BMPs 13 Smad πρωτεΐνες 14 ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΩΝ BMP/TGF-β ΣΗΜΑΤΟ ΟΤΙΚΩΝ ΜΟΝΟΠΑΤΙΩΝ 15 Αποικοδόµηση των Smad 15 Κατασταλτικοί µεταγραφικοί παράγοντες 15 ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΠΟΥ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΟΥΝ ΜΕ ΤΙΣ SMAD ΣΤΑ BMP ΣΗΜΑΤΟ ΟΤΙΚΑ ΜΟΝΟΠΑΤΙΑ 16 Κανονικό µονοπάτι σηµατοδότησης των BMPs 16 Μη κανονικό µονοπάτι σηµατοδότησης των BMPs 18 Bone morphogenetic protein-2 (BMP2) 18 Ανακάλυψη και ταυτοποίηση 17 οµή της BMP2 19 Μοριακή βάση για την ειδικότητα πρόσδεσης στους υποδοχείς 20 Γονίδια στόχοι των BMPs 22 BMP2 µοριακή σηµατοδότηση 23 Ρόλος των BMPs στην διαφοροποίηση των οστεοβλαστών και στην οστεογένεση 25 BMP-2 ΣΗΜΑΤΟ ΟΤΗΣΗ ΣΤΗΝ ΟΣΤΕΟΓΕΝΕΣΗ 27 Ρόλος των BMPs στην χονδρογένεση 28 Στόχοι των BMPs κατά τη διάρκεια της πρώιµης εµβρυογένεση 29 BMP ΣΗΜΑΤΟ ΟΤΗΣΗ ΣΤΗΝ ΧΟΝ ΡΟΓΕΝΕΣΗ 31 1

3 A. Κανονικό Smad µονοπάτι στην χονδρογένεση 31 Β. p38 σηµατοδοτικό µονοπάτι στην χονδρογένεση 32 Το εξωκυτταρικό στρώµα (ECM) και οι BMPs 32 Επιγενετική ρύθµιση 33 ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ BMPs ΚΑΙ ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ 34 ΥΛΙΚΑ- ΜΕΘΟ ΟΙ 36 Α.ΥΛΙΚΑ Αντιδραστήρια 37 2.Θρεπτικά υλικά 38 3.Πλασµιδιακοί φορείς ΜΕΘΟ ΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ-ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Μέθοδοι προσδιορισµού συγκέντρωσης πρωτεϊνών Φασµατοφωτοµετρική µέθοδος Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες ( SDS- PAGE) Στερέωση και χρώση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου Χρώση µε Coomassie Brilliant Blue (CBB) R Χρώση µε νιτρικό άργυρο 44 2 ΜΕΘΟ ΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR) Καθαρισµός τµηµάτων DNA µετά από PCR Ηλεκτροφόρηση DNA σε πηκτή αγαρόζης Καθαρισµός τµηµάτων DNA από πηκτή αγαρόζης Προσδιορισµός συγκέντρωσης DNA Φασµατοφωτοµετρική µέθοδος Κλωνοποίηση τµηµάτων DNA σε πλασµιδιακούς φορείς Πέψη µε ενδονουκλεάσες περιορισµού Αποφωσφορυλίωση πλασµιδίου Αντίδραση λιγάσης Προετοιµασία επιδεκτικών κυττάρων για µετασχηµατισµό( competent cells) Μέθοδος ψυχρών διαλυµάτων CaCl2 για άµεση χρήση των κυττάρων Εισαγωγή πλασµιδίου στα επιδεκτικά κύτταρα ( µετασχηµατισµός ) 54 2

4 2.9 Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA (mini prep) Υπερέκφραση γονιδίων στο σύστηµα pet Έκφραση και καθαρισµός πρωτεϊνών µε ουρά 6 ιστιδινών( His-tag) Έλεγχος βιοτινυλίωσης µε τη µέθοδο Dot- Blot Επαναδιάταξη δυο σταδίων πρωτεϊνών για τη δηµιουργία δισουλφιδικών δεσµών Καθαρισµός πρωτεϊνών µε χρήση στήλης αγχιστείας- ηπαρίνης Έλεγχος για τη βιολογική δραστικότητα της BMP2 62 ΣΚΟΠΟΣ 63 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 64 Υπερέκφραση της GFP πρωτεΐνης σε βακτηριακά στελέχη E.coli 65 Καθαρισµός της GFP πρωτεΐνης µε στήλη αγχιστείας νικελίου 66 Έλεγχος βιοτινυλίωσης της GFP µε τη µέθοδο dot blot 67 Κλωνοποίηση του γονιδίου της BMP2 68 Κλωνοποίηση του γονιδίου της BMP2 στο πλασµίδιο pan5 68 Κλωνοποίηση της BMP2 στον πλασµιδιακό φορέα pet29c 72 Υπερέκφραση BMP2 σε βακτηριακά στελέχη Ε.Coli 74 Επαναδιάταξη της BMP2 και αποµόνωση των διµερών µε στήλη ηπαρίνης 75 Έλεγχος βιοτινυλίωσης της BMP2 µε τη µέθοδο dot blot 77 Έλεγχος λειτουργικότητας της BMP2 µε τη µέθοδο της αλκαλικής φωσφατάσης 78 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 80 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 84 3

5 4 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

6 Υπεροικογένεια TGF-β (Transforming Growth Factor Beta) πρωτεϊνών Η υπεροικογένεια των TGF-β πρωτεϊνών, η οποία πήρε την ονοµασία της από το πρώτο µέλος της TGF-β1 που περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1983, αποτελεί µια γονιδιακά συντηρηµένη και αριθµητικά µεγάλη οικογένεια ρυθµιστικών πρωτεϊνών που παρουσιάζουν σηµαντική δοµική συγγένεια µεταξύ τους. Μέχρι σήµερα έχουν αναγνωριστεί και περιγραφεί πολλές πρωτεΐνες - µέλη της TGF-β σε διαφορετικά είδη και οργανισµούς οι οποίοι ανήκουν τόσο στα χορδωτά όσο και στα ασπόνδυλα. Οι πρωτεΐνες αυτές κωδικοποιούνται από 23 διακριτούς τύπους γονιδίων τα οποία κατατάσσονται σε 5 κύριες υποοικογένειες Την BMPs (Βone Morphogenetic Proteins) οικογένεια µε περισσότερα από 20 µέλη Την GDFs (Growth Differentiation Factors) οικογένεια µε τουλάχιστον 9 µέλη Την activin/inhibin οικογένεια που περιλαµβάνει τις activins A, AB, B, και inhibins A, B Την TGF-β οικογένεια στην οποία ανήκουν οι TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3 Την GDNF (Glial Cell-Derived Neurotrophic Factor ) οικογένεια που περιλαµβάνει τις πρωτεΐνες GDNF, artemin και neuturin Τα µέλη της TGF-β υπεροικογένειας παίζουν ένα θεµελιώδη ρόλο στη ρύθµιση διάφορων βιολογικών διεργασιών όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασµός, η ανάπτυξη, η διαφοροποίηση,η οµοιόσταση των ιστών, η απόπτωση, η σύνθεση και αποικοδόµηση στοιχείων του εξωκυτταρικού στρώµατος(ecm). 5

7 BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) Οι BMPs αποτελούν την µεγαλύτερη αριθµητικά υποοικογένεια των TGF-β πρωτεϊνών - αυξητικών παραγόντων καθώς περιλαµβάνει περισσότερα από 20 µέλη. Πρόκειται για διµερείς, διαλυτές και χαµηλού µοριακού βάρους διαµεµβρανικές πρωτεΐνες. Εξελικτικά είναι µια ευρέως συντηρηµένη οικογένεια πρωτεϊνών που συναντάται σε πλήθος οργανισµών από το φύλλο Cnidaria και τους σπόγγους µέχρι τον άνθρωπο. Προφανώς η συντήρησή τους εξελικτικά στα ανώτερα χορδωτά, υποδηλώνει την εξαιρετική σηµασία τους στη ρύθµιση θεµελιωδών βιολογικών διεργασιών (1). Οι BMPs παρουσιάζουν µία πλειοτροπική δράση στους διάφορους οργανισµούς καθώς ρυθµίζουν πολλαπλές λειτουργίες όπως τον πολλαπλασιασµό, την διαφοροποίηση, την κυτταρική µετάσταση, την απόπτωση, τη σύνθεση και την αποικοδόµηση στοιχείων του εξωκυτταρικού στρώµατος (ECM). Επιπροσθέτως οι BMPs έχουν σηµαντικό ρόλο στην εµβρυική ανάπτυξη και στην οµοιόσταση των ιστών στους ενήλικους οργανισµούς. Παραδείγµατα διεργασιών στις οποίες εµπλέκονται οι BMPs κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης είναι η διαµόρφωση του εµβρυικού άξονα, η ανάπτυξη των άκρων, ο σχεδιασµός του νευρικού συστήµατος και η ανάπτυξη των κρανιοµετωπικών δοµών. Επιπροσθέτως έχει παρατηρηθεί ότι µεταλλάξεις ή απώλεια συστατικών των µεταγωγικών µονοπατιών των BMPs στον άνθρωπο, έχουν ως αποτέλεσµα την εµφάνιση ασθενειών όπως η πνευµονική αρτηριακή υπέρταση, η συγγενής αιµορραγική τηλλαγγειεκτασία η εµφάνιση σκελετικών ανωµαλιών καθώς και ορισµένων τύπων καρκίνων(2-5). Για την ενορχήστρωση τόσο διαφορετικών βιολογικών διεργασιών κατά τη διάρκεια της εµβρυικής ανάπτυξης, η BMP- σηµατοδότηση είναι πολύ ρυθµισµένη µε µεγάλη ακρίβεια τόσο χωρικά όσο και χρονικά. Αυτή η ρύθµιση είναι µια δυναµική διαδικασία που έχει αποδειχτεί επιτυχώς µε την χρήση φθοριζουσών µαρτύρων οι οποίοι εκφράζονται ειδικά ως απόκριση των BMP σηµατοδοτικών µονοπατιών σε οργανισµούς µοντέλα όπως η Drosophila, και τα έµβρυα του zebrafish(6). Έχει παρατηρηθεί επίσης, ότι η BMP- σηµατοδότηση, λειτουργεί µε έναν τρόπο εξαρτώµενο από τη δόση, δηλαδή το τελικό αποτέλεσµα της επίδρασης των BMPs σε έναν ιστό είναι ανάλογο µε τα επίπεδα των BMPs- προσδετών και των µορίων που επηρεάζουν την BMP- σηµατοδότηση. 6

8 Συχνά οι BMPs αναφέρονται και ως παράγοντες ανάπτυξης και διαφοροποίησης GDFs (Growth Differentiation Factors) και σε πολλές περιπτώσεις οι όροι BMPs και GDFs είναι ταυτόσηµοι πχ η BMP-14 είναι γνωστή και ως GDF-5. Μέχρι σήµερα έχουν αναγνωριστεί περισσότερα από 30 µέλη των BMPs /GDFs. Στον άνθρωπο τα µέλη αυτά ανάλογα µε την οµολογία που παρουσιάζουν, µπορούν να καταταχθούν σε 4 υποκατηγορίες: Inhibin b, BMP2/4, BMP5/6/7/8/8b και CDMP1/2/3 (7,8). Είδη Υποκατηγορία Μέλη της οικογένειας BMP Θηλαστικά Drosophila Xenopus Αχινός GDNF Mullerian inhibiting substance Inhibin a Inhibin b Inhibin ba, Inhibin bb, Inhibin bc, Inhibin bd BMP2/4 BMP2, BMP4 BMP5/6/7/8/8b BMP5, BMP6, BMP7(OP1), BMP8(OP2), BMP8b(OP3) CDMP1/2/3 BMP12 (GDF7/CDMP3), BMP13 (GDF6/CDMP2), BMP14 (GDF5/CDMP1 BMP9/10 BMP9 (GDF2), BMP10 BMP3/3b BMP3, BMP3b (GDF10) BMP11/GDF8 BMP15/GDF9 BMP11 (GDF11), GDF8 BMP-15(GDF9b)/GDF9 GDF 3 GDF 1 Nodal Gbb Dpp Scw Vg1 Univin Πίνακας 1. Κατάταξη των µελών της οικογένειας των BMPs 7

9 Οι περισσότερες BMPs συντίθενται ως µεγάλες πρόδροµες πρωτεΐνες, οι οποίες είναι ανενεργές και µετά τον διµερισµό τους υπόκεινται µια πρωτεόλυση προκειµένου να παραχθούν οι βιολογικώς ενεργές διµερείς µορφές τους. Οι πρόδροµες µορφές των BMPs αποτελούνται συνήθως από αµινοξέα µε το Ν- τελικό άκρο του πεπτιδίου να αποτελεί ένα πεπτιδικό σήµα έκκρισης, µια πρόδροµο περιοχή η οποία είναι υπεύθυνη για τη σωστή διαµόρφωση της πρωτεΐνης και το C- τελικό άκρο που αποτελεί την ώριµη πρωτεΐνη(8-11). Η καρβοξυτελική ώριµη πρωτεΐνη είναι γνωστό ότι µετά το διµερισµό διαχωρίζεται πρωτεολυτικά από ενδοπρωτεάσες σερίνης οι οποίες είναι γνωστές µε την ονοµασία SPCs (Furin and/or Subtilisin/like Proprotein Convertases) από το υπόλοιπο µόριο. Η διαδικασία αυτή λαµβάνει χώρα στο σύµπλεγµα Golgi και συγκεκριµένα στο trans- Golgi, όπου οι ενδοπρωτεάσες αναγνωρίζουν µια Arg-X-X-Arg ακολουθία στη πρόδροµη πρωτεΐνη (12). Εικόνα 1. Απεικόνιση της πρόδροµης µορφής των BMPs. Η ώριµη πρωτεΐνη προκύπτει µετά από πρωτεόλυση στην ακολουθία Arg-X-X-Arg από ενδοπρωτεάσες σερίνης. Με τη βοήθεια της πεπτιδικής αλληλούχισης, της γονιδιακής κλωνοποίησης και κρυσταλλογραφικών µελετών αποκαλύφθηκε ότι οι BMPs έχουν εφτά χαρακτηριστικές χωροταξικά κυστεΐνες, από τις οποίες οι έξι αποκαλύφθηκε ότι συµµετέχουν στον σχηµατισµό τριών ενδοµοριακών δισουλφιδικών δεσµών, οι οποίοι είναι υπεύθυνοι για τη διαµόρφωση του πυρήνα του µονοµερούς ο οποίος ακολουθεί το µοτίβο θηλιά κυστεΐνης. Οι έξι αυτές κυστεΐνες που συµµετέχουν στην θηλιά κυστεΐνης, βρίσκονται στο C τελικό άκρο της του µονοµερούς και είναι σταθερές χωροταξικά σε όλες τις BMPs µε εξαίρεση την BMP-1 η οποία είναι µεταλλοπρωτεάση. Το µονοµερές των BMP αποτελείται από δύο ζεύγη αντιπαράλληλων β νηµάτων ( fingers) και από µία α- έλικα (wrist περιοχή) 8

10 δηµιουργώντας µια κοίλη και κυρτή επιφάνεια κατάλληλη για τις αλληλεπιδράσεις µε τους υποδοχείς. Οι BMPs δηµιουργούν οµοδιµερή ή ετεροδιµερή µέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων και ενός διαµοριακού δισουλφιδικού δεσµού στον οποίο συµµετέχει η έβδοµη κυστεΐνη του κάθε µονοµερούς. Η διαδικασία αυτή λαµβάνει χώρο πρωτίστως στο ενδοπλασµατικό δίκτυο και ολοκληρώνεται στο σύµπλεγµα Golgi όπου ακολουθεί η πρωτεόλυση µετά την οποία δηµιουργείται η ώριµη λειτουργική πρωτεΐνη. Ρόλος των BMPs κατά τη διάρκεια της πρώιµης ανάπτυξης των χορδωτών Ένα από τα θεµελιώδη γεγονότα που λαµβάνουν χώρα κατά την εµβρυογένεση των χορδωτών, είναι η δηµιουργία του ραχιαιοκοιλιακού άξονα. Οι Spemann και Mangold έδειξαν ότι προσδέτες εκκριµένοι από το ραχιαίο χείλος βλαστόπορου (γνωστό και ως οργανωτής Spemann) είναι απαραίτητοι για το σωστό εµβρυικό σχηµατισµό(13-14). Επίσης γενετικές µελέτες στους οργανισµούς Xenopus, Drosophila και Zebrafish έδειξαν ότι διαβαθµισµένες συγκεντρώσεις των BMPs επάγουν τη διαφοροποίηση των κυττάρων του εξωδέρµατος σε κύτταρα του κεντρικού νευρικού συστήµατος, της νευρικής ακρολοφίας και της επιδερµίδας. Έχει δειχθεί ότι στον Xenopus οι BMPs καθοδηγούν την διαφοροποιητική πορεία των κυττάρων στην κοιλιακή πλευρά ενώ στην Drosophila αυτό συµβαίνει για τα κύτταρα που βρίσκονται στη ραχιαία περιοχή. Στον Xenopus, η BMP4 και η BMP7 εκφράζονται και παραµένουν ενεργοποιηµένες σε όλο το βλαστόδερµα. Η διαφοροποίηση στη ραχιαία πλευρά απαιτεί την καταστολή των BMPs, ενώ κατά την γαστριδίωση οι BMPs περιορίζονται στην κοιλιακή πλευρά του βλαστοδέρµατος και στη µελλοντική γάστρουλα συγκεντρώνονται ανταγωνιστές των BMPs οι οποίοι έχουν την ικανότητα να προσδένονται στις BMPs και τις απενεργοποιούν. Οι ανταγωνιστές των BMPs δηλαδή µε την παρουσία τους δηµιουργούν µια διαβάθµιση συγκεντρώσεων µε µέγιστες συγκεντρώσεις στις ραχιαίες περιοχές, ρυθµίζοντας έτσι την δράση των BMPs και συµβάλλοντας στην διαφοροποιητική πορεία των κυττάρων του εµβρύου (15-17). 9

11 Στους ανταγωνιστές που συµµετέχουν στην αναστολή της δράσης των BMPs περιλαµβάνονται η Chordin, η Noggin κα. Η Chordin που είναι ένας εξωκυτταρικός ανταγωνιστής των BMPs και έχει δειχθεί ότι απελευθερώνεται από τον οργανωτή Spemann. Η Noggin είναι και αυτή εξωκυτταρικός ανταγωνιστής των BMPs, εκκρίνεται από τον οργανωτή Spemann και έχει ποικίλες επιδράσεις στην Chordin. Όπως περιγράφηκε οι BMPs είναι απαραίτητοι παράγοντες για τον σχηµατισµό των βλαστικών στοιβάδων κατά την εµβυονική ανάπτυξη. Συγκεκριµένα, σε ποντικούς µε απαλειµµένο το γονίδιο της BMP2, παρουσιάστηκαν σηµαντικές ανωµαλίες στην ανάπτυξη της καρδιάς, υπονοώντας ότι η BMP2 ρυθµίζει αλληλεπιδράσεις µεταξύ του εξωδέρµατος και του µεσοδέρµατος(18). Πειράµατα µε απαλειµµένο το γονίδιο της BMP4 έδειξαν ότι η BMP4 είναι απαραίτητη για την γαστριδιοποίηση και το σχηµατισµό του µεσοδέρµατος, την ανάπτυξη του κρυσταλλοειδούς χιτώνα των οφθαλµών κα(19). Πιο πρόσφατα πειράµατα σε ποντικούς αποκάλυψαν ότι η οργανογένεση εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό από τη συνεργιστική δράση των BMP2 και BMP4(20). Ο ρόλος των BMPs στην κυτταρική πολικότητα και µετανάστευση Η κυτταρική πολικότητα χαρακτηρίζεται από χωροχρονική ανακατανοµή των πρωτεϊνών, κατευθύνοντας τα κύτταρα προς µια γενική κατεύθυνση και είναι απαραίτητη για να δώσει το έναυσµα για την µετανάστευση ενός κυττάρου. Οι προεκτάσεις στο πρόσθιο µέρος ενός πολωµένου κυττάρου καλούνται προεκβολές. Οι τελευταίες σχηµατίζονται σαν ευρεία ελασµατοπόδια ή νηµατοπόδια τα οποία συνήθως σχηµατίζονται από τον πολυµερισµό της ακτίνης (21). Η κυτταρική µετανάστευση είναι µια διαδικασία η οποία ρυθµίζεται από χηµειοτακτικές κυτοκίνες και από την αλληλεπίδραση των κυττάρων µε το εξωκυττάριο στρώµα. Το χηµειοτακτικό δυναµικό των BMPs περιγράφηκε για πρώτη φορά από την οµάδα του Dr. Hari Reddi. Αυτοί έδειξαν ότι η ανασυνδυασµένη BMP2B δρα σαν παράγοντας χηµική προσέλκυσης για τα µονοκύτταρα in vitro. 10

12 H µυοσίνη Χ (Myo-X), µια πρωτεΐνη- κινητήρας του κυττάρου έχει δειχθεί ότι λειτουργεί σαν φορέας, καθοδηγώντας τον BRIb υποδοχέα προς τα νηµατοπόδια των ενδοθηλιακών κυττάρων µε µια διαδικασία που εξαρτάται από την BMP6 (22). Επιπλέον η BMP6 βρέθηκε ότι προκαλεί αύξηση στην έκφραση της µυοσίνης Χ. Η LIMK1( κινάση που εµπλέκεται στην ανάπτυξη του εγκεφάλου) φωσφορυλιώνει την Cofilin και προκαλεί αλλαγές στην ακτίνη του κυτταροσκελετού.προσφάτως βρέθηκε ότι η LIMK1και µικρές Rho-GTPάσες ότι συµµετέχουν στην BMP- εξαρτώµενη πρώιµη κυτταροσκελετική αναδιοργάνωση. Η οµάδα του Dr. F. Ventura βρήκε ότι η BMP2 ενεργοποιεί την LIMK1 µε PI3Kεξαρτώµενο τρόπο. Η επίδραση της BMP2 στη µετανάστευση των C2C12 µυοβλαστών των ποντικών απαιτεί την παράλληλη ενεργοποίηση της Cdc42 και της PI3K ισοµορφής p110a (23). Προηγουµένως η PI3K p110a είχε βρεθεί ότι παίζει σηµαντικό ρόλο στη µετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Τα πειραµατικά ευρήµατα έδειξαν ότι η επαγόµενη από την BMP2 κυτταροσκελετική αναδιοργάνωση δεν απαιτεί πρωτεϊνική σύνθεση. Αυτό δηλώνει ότι οι BMPs έχουν τη δυνατότητα να επάγουν µη-µεταγραφικές αποκρίσεις. Οι ιντεγκρίνες είναι απαραίτητα συστατικά του µονοπατιού κυτταρικής µετανάστευσης. Στους οστεοβλάστες και στα κύτταρα του χονδροσαρκώµατος, η έκφραση της ιντεγκρίνης β1 ενισχύεται ως απόκριση στην BMP2. Επιπλέον, τα κύτταρα στα οποία χορηγείται η BMP2, εξαπλώνονται γρηγορότερα, δηµιουργούν εστιακές προσκολλήσεις και η κινάση εστιακής προσκόλλησης είναι φωσφορυλιωµένη (Focal Adhesion Kinase,FAK)( 24,25). Άλλη µια ερευνητική οµάδα ανέφερε ότι η BMP- εξαρτώµενη κυτταρική µετανάστευση και ενισχυµένη µεταγραφική ικανότητα των β1 ιντεγκρινών στο χονδροσάρκωµα οφείλεται στην ενεργοποίηση του PI3K σηµατοδοτικού µονοπατιού, το οποίο µε τη σειρά του ενεργοποιεί το και NF-kB σηµατοδοτικό µονοπάτι(26). Αυτά τα στοιχεία δηλώνουν εµφανώς ότι οι BMPs εµπλέκονται στην κυτταρική πολικότητα και µετανάστευση και σε µεταγραφικό και σε µη- µεταγραφικό επίπεδο. 11

13 ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ ΤΩΝ BMPs Υποδοχείς των BMPs (BMPRs) Οι BMPs επάγουν τη µεταγωγή των σηµατοδοτικών µονοπατιών µε την πρόσδεσή τους σε πρωτεϊνικούς υποδοχείς που βρίσκονται στην επιφάνεια των κυττάρων. Οι υποδοχείς των BMPs είναι πρωτεϊνικές κινάσες µε ενεργότητα σερίνης/ θρεονίνης, που αποτελούνται από µία µικρή εξωκυτταρική επικράτεια µε κυστεΐνες, ένα διαµεµβρανικό τµήµα και την ενδοκυτταρική επικράτεια που έχει την ενεργότητα κινάσης. Είναι γνωστό ότι ένας περιορισµένος αριθµός διαφορετικών ειδών BMP υποδοχέων εξυπηρετεί µία µεγάλη ποικιλία BMP- προσδετών. Ωστόσο η ποικιλία συνδυασµών µεταξύ των δύο τύπων των υποδοχέων, αντιµετωπίζει αυτό το εκ πρώτης όψεως παράδοξο. Υπάρχουν δύο τύποι BMP υποδοχέων οι I και II. Στον τύπο I BMP υποδοχέα (BRI) ανήκουν οι ALK1 (Acvrl1), ALK2 (ActRI), ALK3 (BRIa), ALK4 (ActRIb) και ο ALK6 (BRIb) Στον τύπο II BMP υποδοχέα (BRII) ανήκουν οι BRII, ActRIIa, και ο ActRIIb Ο τύπου I υποδοχέας φέρει δύο πρόσθετα µοτίβα, µία περιοχή πλούσια σε γλυκίνες/ σερίνες που προηγείται της επικράτειας κινάσης (GS-box) και µια σύντοµη περιοχή 8 αµινοξέων η οποία ονοµάζεται βρόγχος L45 και βρίσκεται µέσα στην επικράτεια µε ενεργότητα κινάσης. Οι BMPs προσδένονται σε ετεροµερή συµπλέγµατα που δηµιουργούν οι τύπου I και II υποδοχείς. Η ενεργοποίηση του τύπου I υποδοχέα προϋποθέτει την πρόσδεση του προσδέτη, τον ολιγοµερισµό του προσδέτη- υποδοχέα και την trans- φωσφορυλίωση της GS-box περιοχής από τον τύπο II υποδοχέα. Οι BMP υποδοχείς, αν και παρουσιάζουν υψηλή οµολογία, επιτελούν διαφορετικές και εξαιρετικά ειδικές λειτουργίες τόσο κατά τη εµβρυογένεση όσο και κατά την ενήλικη ηλικία. Ο BRIb για παράδειγµα, πυροδοτεί την διαφοροποίηση των πρόδροµων µεσεγχυµατικών κυττάρων σε οστεοβλάστες, ενώ ο BRIa προάγει την λιπογένεση στον ίδιο κυτταρικό τύπο (27). 12

14 Συν-υποδοχείς Η BMP- σηµατοδότηση ρυθµίζεται από συν-υποδοχείς, οι οποίοι ανήκουν σε διάφορες πρωτεϊνικές οικογένειες. Στους συν-υποδοχείς αυτούς που διευκολύνουν την BMP- σηµατοδότηση περιλαµβάνονται οι RGM a και c (repulsive guidance molecules),ο Dragon (RGMb),ο receptor tyrosine kinase c-kit, και οι υποδοχείς Endoglin και Betaglycan. Αυτοί οι συν-υποδοχείς συνήθως προσδένουν τις BMPs µε έναν ή και µε τους δύο υποδοχείς προκειµένου να ενισχύσουν τη σηµατοδότηση µέσω των Smads σε συγκεκριµένους τύπους ιστών (29-31). Προσδέτες ανταγωνιστές των BMPs Έχουν βρεθεί µόρια που παρεµποδίζουν τη δράση των TGF-βs όπως η χορδίνη (Chordin) και η θυλακιοστατίνη (Follistatin) (32) και των BMPs όπως η νογκίνη (Noggin) (33). Η νογκίνη ένας ανταγωνιστής της BMP ρυθµίζει αρνητικά την δραστικότητα της κατά τη διάρκεια σκελετογένεσης στα σπονδυλωτά και γενικότερα στη κυτταρική διαφοροποίηση. Η νογκίνη προσδένεται στον τοµέα της BMP -7 ο οποίος είναι απαραίτητος έτσι ώστε να αλληλεπιδράσει µε τους υποδοχείς τύπου Ι και τύπου ΙΙ (34). ιαγονιδιακά ποντίκια στα οποία έγινε υπερέκφραση της νογκίνης στο οστό εµφάνισαν οστεοπενία και κατάγµατα και παρουσίασαν µειωµένο όγκο οστού και διαταραχή της οστεοβλαστικής λειτουργίας (35-36). Η καταστολή της νογκίνης µπορεί να αποτελέσει µια νέα στρατηγική για τη θεραπεία οστεολυτικών µεταστάσεων των οστών. 13

15 Smad πρωτεΐνες Οι Smads είναι ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες που συµµετέχουν στη µεταγωγή σηµάτων των TGF-β προσδετών στον πυρήνα όπου ενεργοποιούν την µεταγραφή των TGFβ γονιδίων. Έχουν αναγνωριστεί τρεις κατηγορίες Smads 1. Οι receptor-regulated Smads (R-Smads) που περιλαµβάνουν τις Smad1, Smad2, Smad3, Smad5 και Smad8/9 2. Οι common-mediator Smads (co-smads) που περιλαµβάνει µόνο την Smad4, η οποία αλληλεπιδρά µε τις R-Smads συµµετέχοντας µε αυτόν τον τρόπο στην σηµατοδότηση 3. Οι antagonistic or inhibitory Smads (I-Smads) που περιλαµβάνουν τις Smad6 και Smad7, οι οποίες µπλοκάρουν τις R-Smads και τις Co-Smads. Οι R-Smads και οι co-smads έχουν δύο εξαιρετικά συντηρηµένες περιοχές τις Μad homology domains 1 και 2 (MH1 και MH2) στα Ν και C τελικά άκρα των πρωτεϊνών αντίστοιχα. Ανάµεσα στα δύο αυτά άκρα, υπάρχει µια ενδιάµεση συνδετική περιοχή (linker region) που ποικίλει τόσο σε µήκος όσο και σε αµινοξική ακολουθία. Η MH1περιοχή των R- and Co-Smads είναι υπεύθυνη για την πρόσδεση σε συγκεκριµένες DNA ακολουθίες. Η MH2 περιοχή είναι υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση µε τους υποδοχείς, για τον σχηµατισµό ολιγοµερών µε τις άλλες Smad, για την αλληλεπίδραση µε διάφορες πρωτεΐνες που προσδένονται στο DNA και για την µεταγραφική ενεργοποίηση. Όταν οι υποδοχείς δεν είναι ενεργοποιηµένοι, οι MH1 και MH2 περιοχές προσδένονται µεταξύ τους καταστέλλοντας ταυτόχρονα η µια τη λειτουργία της άλλης (37-39). Η µεταγωγή του σήµατος διαµέσου των Smad πρωτεϊνών εξαρτάται από την ενεργοποίηση τους από τους υποδοχείς µετά την πρόσδεση του συνδέτη. Συνοπτικά, η ροή πληροφορίας από τη µεµβράνη ως τον πυρήνα έχει ως εξής: η σύνδεση συνδέτη -υποδοχέα τύπου ΙΙ ενεργοποιεί τον υποδοχέα τύπου Ι, ο οποίος µε τη σειρά του φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί το C-τελικό άκρο των Smad πρωτεϊνών. Ακολουθεί αποσύνδεση των ενεργοποιηµένων Smad από τον υποδοχέα, ο σχηµατισµός συµπλόκου µε την Smad4 και µετατόπιση στον πυρήνα, όπου και ασκούν τον µεταγραφικό τους ρόλο(40-42). 14

16 ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΩΝ BMP/TGF-β ΣΗΜΑΤΟ ΟΤΙΚΩΝ ΜΟΝΟΠΑΤΙΩΝ Αποικοδόµηση των Smad Οι Smurf1 και Smurf2 είναι Ε3 λιγάσες της ουβικιτίνης και έχουν την ικανότητα να καταστέλλουν την σηµατοδότηση των TGF-β και BMPs µέσω της αποικοδόµησης τόσο των υποδοχέων τους όσο και των Smad πρωτεϊνών (43). Η Smurf1 αλληλεπιδρά µε τις Smad1 και Smad5 και προκαλεί την αποικοδόµησή τους καθώς και του µεταγραφικού παράγοντα Runx2 (44). Η Smurf2 έχει βρεθεί πως σχηµατίζει σύµπλοκο µε τη Smad2 και στη συνέχεια στοχεύει στη SnoN για την αποικοδόµησή της(45). ιαγονιδιακά Smurf2 ποντίκια εµφάνισαν µειωµένο εµβαδό αρθρικού χόνδρου και υποχόνδρια σκλήρυνση (46). Επιπρόσθετα κάποιες πρωτεΐνες, όπως η CHIP ( carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein) αναστέλλουν τις δραστηριότητες της σηµατοδότησης των Smad1/5 µέσω της δέσµευσής τους στις Smad1/5 στο R-/Co-Smad σύµπλοκο και προωθώντας στη συνέχεια την ουβικιτινιλίωση και αποικοδόµηση των Smad1/5 (47). Άλλες πρωτεΐνες όπως οι κινάσες σερίνης/θρεονίνης, λειτουργούν µέσω συνεργασίας µε τη E3 λιγάση της Smurf και προκαλούν πρωτεόλυση του υποδοχέα της BMP (48). Κατασταλτικοί µεταγραφικοί παράγοντες Στον πυρήνα, µεταγραφικοί παράγοντες όπως οι Ski και SnoN µπορούν να λειτουργήσουν κατασταλτικά σε συνεργασία µε τις I-Smads, (49) και να διακόψουν τον σχηµατισµό του συµπλόκου Smad-DNA και έτσι να αναστείλουν την έκφραση του γονιδίου στόχου (50). Επειδή η δεσµευτική επιφάνεια της Smad4 που απαιτείται για την πρόσδεση στον παράγοντα Ski συµπίπτει µε αυτήν της φωσφορυλιωµένης ουράς της R-Smad, η πρόσδεση στον παράγοντα Ski ή SnoN διασπά το ενεργό ετεροµερές σύµπλοκο Smad4/R-Smad (51). Επίσης οι παράγοντες Ski και SnoN εµποδίζουν τις Smads στη πρόσδεση µε µεταγραφικούς συνενεργοποιητές όπως τον p300/cbp (52) οι οποίοι είναι απαραίτητοι στην σκελετογένεση. 15

17 ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΠΟΥ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΟΥΝ ΜΕ ΤΙΣ BMP ΣΗΜΑΤΟ ΟΤΙΚΑ ΜΟΝΟΠΑΤΙΑ SMAD ΣΤΑ Κανονικό µονοπάτι σηµατοδότησης των BMPs Μέχρι σήµερα έχουν ανακαλυφθεί και περιγραφεί τουλάχιστον δύο ξεχωριστοί οδοί µεταγωγής σήµατος των BMPs : το κανονικό διαµέσου Smad σηµατοδοτικό µονοπάτι και ένα διαµέσου MAPK ( mitogen- activated protein kinase) µονοπάτι. Σε αντίθεση µε τους TGF-β προσδέτες που προσδένονται µε µεγαλύτερη συχνότητα στους τύπου II υποδοχείς, οι περισσότερες BMPs παρουσιάζουν µεγαλύτερη συγγένεια για τους τύπου I υποδοχείς. Μετά την πρόσδεσή τους στους οµοδιµερείς τύπου I υποδοχείς, επιστρατεύονται στην περιοχή οι τύπου II υποδοχείς και σχηµατίζουν τετραµερή σύµπλοκα. Στη συνέχεια οι τύπου II υποδοχείς φωσφορυλιώνουν τους τύπου I υποδοχείς στις σερίνες/θρεονίνες που βρίσκονται στην GS-box περιοχή. Αυτή η φωσφορυλίωση επιτελεί ένα διττό ρόλο καθώς ενεργοποιεί την ενεργότητα κινάσης του τύπου I υποδοχέα και εκθέτει τη θέση πρόσδεσης του τύπου I υποδοχέα για τα κύρια υποστρώµατά του, τις Smad πρωτεΐνες. Οι R-Smads που ενεργοποιούνται ως απόκριση στην πρόσδεση των BMPs στους τύπου I υποδοχείς είναι οι Smad1,5 και 8 οι οποίες παρουσιάζουν υψηλή οµολογία µεταξύ τους. Ο τύπου I υποδοχέας φωσφορυλιώνει τις Smad1/5/8 σε ένα SSVS µοτίβο στο C-τελικό άκρο. Όταν φωσφορυλιωθούν οι Smad1,5 και 8 δηµιουργούν σύµπλοκα µε τις Smad4 µέσω των MH2 επικρατειών τους. Τα Smad σύµπλοκα στη συνέχεια συγκεντρώνονται στον πυρήνα του κυττάρου, όπου ρυθµίζουν άµεσα την έκφραση ορισµένων γονιδίων είτε θετικά είτε αρνητικά. Οι Smad πρωτεΐνες προσδένονται στο DNA µέσω των MH1 επικρατειών τους. Τα στοιχεία που αποκρίνονται στις BMP, συνήθως περιλαµβάνουν µία πλούσια σε GC ακολουθία µε επαναλαµβανόµενο GRCGNC (53-56). Παρά το γεγονός ότι οι περισσότερες BMPs (2, 4, 5, 6, 7, 8b, 9, 10, 12, 13, 14, και 15) ενεργοποιούν τις Smads 1, 5, and 8 λόγω της πρόσδεσής τους στον τύπου I υποδοχέα, ορισµένες BMPs (11 και 16) ενεργοποιούν τις Smad2 και 3 λόγω της πρόσδεσής τους στους τύπου II υποδοχείς (57-58). 16

18 Μη κανονικό µονοπάτι σηµατοδότησης των BMPs Έκτός από τα σηµατοδοτικά µονοπάτια στα οποία συµµετέχουν οι Smads, οι ενεργοποιηµένοι BRIa υποδοχείς είναι δυνατόν να πυροδοτήσουν και εναλλακτικά σηµατοδοτικά µονοπάτια στα οποία συµµετέχουν οι ΜAPKs (mitogen activated protein kinases) και συγκεκριµένα οι ERKs, η p38,οι JNKs και ο πυρηνικός παράγοντας NFkB που ρυθµίζει τη µετάφραση. Θεωρείται πιθανόν ότι το αυτό το µονοπάτι σηµατοδότησης ενεργοποιείται µέσω πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων του BRAM1 (Bone morphogenetic protein Receptor Associated Molecule 1) η του XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein), και µορίων όπως η TAK1 (TGF-beta activated kinase 1)και η TAB1(TAK1 binding protein) µε τον BRIa υποδοχέα (59-64). Η BRAM1συνδεέται άµεσα µε την κυτταροπλασµατική ουρά του BRIa υποδοχέα στην οποία συνδέει την TAB1 και στη συνέχεια ο XIAP επιστρατεύεται από τον BRIa υποδοχέα προκειµένου να συνδεθεί στο TAB1 TAK1 σύµπλοκο. Έχει αποδειχτεί ότι η αλληλεπίδραση µεταξύ των XIAP και TAB1 είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση της TAK1. Ωστόσο δεν έχει αποσαφηνιστεί εάν οι XIAP και TAB1 παίζουν κάποιο ρόλο σε άλλους ενεργοποιηµένους τύπου I υποδοχείς. Στη συνέχεια η TAK1 ενεργοποιεί τις ERKs, p38 και JNKs (64-67).. Εικόνα 2. ιαγραµµατική απεικόνιση των σηµατοδοτικών οδών που επάγουν οι ΒMPs Παρότι δεν έχει αποσαφηνιστεί ο ακριβής µηχανισµός, οι BMPs ενεργοποιούν τις ERKs, την PI3 Kinase,την Protein Kinase Α (PKA), την PKC και την PKD ρυθµίζοντας έτσι λειτουργίες όπως την κυτταρική επιβίωση, την απόπτωση, τη µετάσταση και τη διαφοροποίηση (68). 17

19 Bone morphogenetic protein-2 (BMP2) Ανακάλυψη και ταυτοποίηση Το 1965 ένας Αµερικανός ορθοπεδικός χειρούργος, ο Marshall Urist ανακάλυψε ότι ορισµένες αφαλατωµένες πρωτεΐνες της θεµελιώδους ουσίας του οστού είχαν τη δυνατότητα να επάγουν τη δηµιουργία έκτοπου οστού. Επίσης στη συνέχεια παρατήρησε ότι όταν αναµίγνυε οστά, µε τις ίδιες πρωτεΐνες αλλά µετουσιωµένες και αναστολείς των πρωτεϊνών αυτών, αυτό είχε ως αποτέλεσµα τον περιορισµό του νέου σχηµατισµού οστού. Ο Urist οδηγήθηκε στο συµπέρασµα ότι οι πρωτεΐνες αυτές ήταν σε θέση να επάγουν οστεογένεση σε έκτοπες θέσεις, πιθανότατα µέσω της στρατολόγησης και διαφοροποίησης τοπικών κυττάρων των ξενιστών (69-70). Το επόµενο βήµα για τον χαρακτηρισµό αυτών οστεοεπαγωγικών πρωτεϊνών ήταν η ανάπτυξη µιας βιολογικής δοκιµασίας που να προσδιορίζει την ικανότητα οστεογένεσης. Το 1983 οι Sampath και Reddi σχεδίασαν ένα βιολογικό τεστ κατά το οποίο πρόσθεταν την υπό δοκιµή πρωτεΐνη µε ένα µίγµα αδιάλυτων κλασµάτων κολλαγόνου και εµφύτευαν αυτό το µίγµα σε έκτοπες περιοχές ενήλικων επίµυων. Με αυτό το τεστ καθαρίστηκε και προσδιορίστηκε µερικώς η ακολουθία της πρώτης BMP της BMP-3,το Στη συνέχεια σχεδιάστηκαν µοριακοί ανιχνευτές για την αναγνώριση και άλλων BMPs. Η BMP-2 ήταν η πρώτη από τις BMP πρωτεΐνες που χρησιµοποιήθηκαν κλινικά. Οι BMP-7 και BMP-8 κλωνοποιήθηκαν το 1990 από τον Ozkaynak και τους συνεργάτες του. Η BMP-7, γνωστή και ως OP- 1, ήταν η δεύτερη BMP πρωτεΐνη που βρήκε ευρεία κλινική χρήση. 18

20 οµή της BMP2 Το ανοικτό αναγνωστικό πλαίσιο του cdna της BMP2 αποτελείται από 1191 ζεύγη βάσεων (bp), από το οποίο προκύπτει µια πρόδροµη πρωτεΐνη 396 αµινοξέων, η οποία γλυκοσυλιώνεται, κόβεται πρωτεολυτικά και διµερίζεται προκειµένου να πάρει την βιολογικώς ενεργή της µορφή. Το τελικό ώριµο οµοδιµερές της BMP2 αποτελείται από δύο µονοµερή που το καθένα αποτελείται από 114 αµινοξέα. Η πρόδροµη πρωτεΐνη αποτελείται από µία ακολουθία υπεύθυνη για την έκκριση της πρωτεΐνης µήκους 29 αµινοξέων, µια πρόδροµη ακολουθία 259 αµινοξέων και από την ώριµη πρωτεΐνη που βρίσκεται στο C-τελικό άκρο και έχει ως πρώτο αµινοξύ το γλουταµινικό οξύ στην θέση 283. Η πρόδροµη ακολουθία που βρίσκεται στο Ν- τελικό άκρο επάγει τη µεταφορά της πρωτεΐνης στην κοιλότητα του ενδοπλασµατικού δικτύου όπου διµερίζεται και στη συνέχεια γλυκοσυλιώνεται στο Ν-άκρο, όπου προστίθενται ολιγοσακχαρίτες όπως η µαννόζη σε κάθε ένα µονοµερές, και συγκεκριµένα σε µια Asn-X_Ser/ Thr περιοχή στο Ν56 (71, 72). Αµινοξική ακολουθία της πρόδροµης µορφής της ανθρώπινης BMP2(396 aa) MVAGTRCLLALLLPQVLLGGAAGLVPELGRRKFAAASSGRPSSQPSDEVLSEFELRLLSMFGLKQRPTPSRDAVV PPYMLDLYRRHSGQPGSPAPDHRLERAASRANTVRSFHHEESLEELPETSGKTTRRFFFNLSSIPTEEFITSAELQV FREQMQDALGNNSSFHHRINIYEIIKPATANSKFPVTRLLDTRLVNQNASRWESFDVTPAVMRWTAQGHANHGF VVEVAHLEEKQGVSKRHVRISRSLHQDEHSWSQIRPLLVTFGHDGKGHPLHKREKRQAKHKQRKRLKSSCKRH PLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYL DENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR Σηµ. : στη θέση 283 όπου βρίσκεται η γλουταµίνη ξεκινά η ώριµη µορφή της BMP Η BMP2 εκτός από οµοδιµερή σχηµατίζει και ετεροδιµερή µε την BMP7. Η ώριµη BMP2 του ανθρώπου παρουσιάζει 100% αµινοξική οµολογία µε τις αντίστοιχες BMP2 του ποντικού και του αρουραίου. Επίσης παρουσιάζει 85% αµινοξική οµολογία µε την ανθρώπινη BMP4 και λιγότερο από 51% οµολογία µε τις άλλες BMPs. 19

21 Η δευτεροταγής διαµόρφωση της BMP-2, αποκαλύπτει την ύπαρξη ενός µεγάλου επίτοπου που έχει τη µορφή καρπού ενός χεριού (wrist epitope) και αποτελεί το σηµείο πρόσδεσης µε τον BRIa υποδοχέα. Επίσης αποκαλύπτεται ένα δεύτερο επιτόπιο πρόσδεσης για τους BRIΙ υποδοχείς ο οποίος έχει τη µορφή γροθιάς και παρουσιάζει µικρότερη αγχιστεία από τον προηγούµενο επίτοπο. Οι δύο επίτοποι βρίσκονται σε µικρή απόσταση µεταξύ τους (73). Εικόνα 3. Απεικόνιση της δευτεροταγούς δοµής του µονοµερούς της BMP-2. Ένα τυπικό µονοµερές αποτελείται από τρεις ενδοµοριακούς δισουλφιδικούς δεσµούς, οι οποίοι διαµορφώνουν τον πυρήνα του κάθε µονοµερούς. Μοριακή βάση για την ειδικότητα πρόσδεσης στους υποδοχείς Καθώς η χωροθετική τοποθέτηση που παρουσιάζουν τα επιτόπια πρόσδεσης των BMPs/ GDFs είναι η ίδια, πρέπει να υπάρχουν άλλοι µηχανισµοί όπως διαφορετικά µοτίβα αµινοξέων, προκειµένου να εξασφαλιστεί η επιλεκτικότητα πρόσδεσης στον τύπου Ι ή τύπου ΙΙ υποδοχέα. Η BMP2 έχει βρεθεί ότι παρουσιάζει µια µεγαλύτερη αγχιστεία στον τύπου Ι υποδοχέα όπου και προσδένεται, ενώ η πρόσδεση αυτή έχει ως αποτέλεσµα την επιστράτευση και του τύπου ΙΙ υποδοχέα στο σύµπλοκο, και την έναρξη της σηµατοδότησης. Με τη βοήθεια πειραµάτων µε µεταλλάξεις διαπιστώθηκε ότι στο επιτόπιο της πρόσδεσης της BMP2 µε τους BMPR-II και ActR-II και γενικά µε του τύπου ΙΙ υποδοχείς, κυριαρχούν οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. Τα ευρήµατα επιβεβαιώθηκαν στην συνέχεια και µε κρυσταλλογραφικές µελέτες που ακολούθησαν (74). 20

22 Στα πειράµατα αυτά διαπιστώθηκε ότι από τις 24 περιοχές που σχηµατίζουν την επιφάνεια αλληλεπίδρασης της BMP2 µε τους υποδοχείς τύπου ΙΙ, µόνο 6 επηρεάζουν σηµαντικά την πρόσδεση µε τους τύπου ΙΙ υποδοχείς και µόνο µία θέση (η Leu90 στην BMP-2) είναι απολύτως συντηρηµένη σε όλους τους τύπου ΙΙ υποδοχείς ( 75). Το 1995 ο James Wells εισήγαγε την έννοια των θερµών σηµείων της πρόσδεσης ( hot spots of binding). Σύµφωνα µε αυτήν, οι περιοχές που βρίσκονται στο κέντρο µίας επιφάνειας αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης µε πρωτεΐνη συνεισφέρουν κατά το µέγιστο στην συνολική ενέργεια πρόσδεσης που απαιτείται για µια αλληλεπίδραση, ενώ οι περιβάλλουσες περιοχές παρέχουν προστασία και αποµόνωση από το εξωτερικό περιβάλλον (76). Έτσι τα κεντρικά αµινοξέα είναι συνήθως συντηρηµένα, ενώ τα περιφερικά αµινοξέα µπορεί να ποικίλουν µε την προϋπόθεση ότι διατηρούν τον προστατευτικό τους ρόλο. Στην BMP2 έχουν εντοπιστεί µέχρι στιγµής 2 θερµά σηµεία στην αλληλεπίδρασή της µε τους τύπου ΙΙ υποδοχείς. Το πρώτο σηµείο αποτελείται από 2 αµινοξέα την Leu90 και Leu100 που συνδιαµορφώνουν ένα υδρόφοβο µοτίβο και το δεύτερο σηµείο το οποίο περιλαµβάνει την Ser88 και είναι γειτονικό του πρώτου ρυθµίζεται από το σχηµατισµό ενός δεσµού υδρογόνου. Εικόνα 4. Απεικόνιση των θερµών σηµείων της αλληλεπίδρασης BMP-2 µε τον ActR-IIB υποδοχέα. Α) Με κόκκινο απεικονίζονται τα δύο αµινοξέα (Leu90 και Leu100) που διαµορφώνουν ένα υδρόφοβο µοτίβο και µε πράσινο το δεύτερο σηµείο που περιλαµβάνει την Ser88. B, C) το θερµό σηµείο µιας πρόσδεσης ενός επίτοπου αποτελείται από ένα δεσµό οι περισσότερους δεσµούς που βρίσκονται στο κέντρο (κόκκινο) και από περιβάλλουσες περιοχές που παρέχουν προστασία (γκρι) D) η Ser88 της BMP2 σχηµατίζει ένα δεσµό υδρογόνου µε την Leu61 του ActR-IIB υποδοχέα. 21

23 Όσον αφορά τα θερµά σηµεία της αλληλεπίδρασης της BMP2 µε τους τύπου Ι υποδοχείς, έχουν βρεθεί 2 αµινοξέα και συγκεκριµένα η Leu 51 και το Asp53 που σχετίζονται µε την πρόσδεσή της µε τον BRIA (77). Γονίδια στόχοι των BMPs Ένας σηµαντικός αριθµός γονιδίων- στόχων των BMPs έχει αναγνωριστεί µε αναλύσεις µικροσυστοιχιών oλιγονουκλεοτιδίων, σε διάφορους κυτταρικούς τύπους. Κατά τη διάρκεια της οστεοβλαστικής διαφοροποίησης των µεσεγχυµατικών κυττάρων όπως πχ. των C2C12, η BMP-2 επάγει διάφορα γονίδια τα οποία µπορεί να διακριθούν σε γονίδια άµεσης (2 ώρες µετά τη διέγερση µε BMP), ενδιάµεσης (6 ώρες) και αργής (24 ώρες) απόκρισης (78). Τα γονίδια τα οποία εµπλέκονται στην ΒΜP σηµατοδότηση περιλαµβάνουν τα Id1-3 (inhibitor of differentiation or inhibitor of DNA binding 1-3), OASIS, Prx2, TIEG και Snail, τα οποία αναγνωρίστηκαν ως γονίδια άµεσης απόκρισης. Στα γονίδια ενδιάµεσης απόκρισης ανήκουν τα Hey1 και Tcf7, τα οποία εµπλέκονται στις διαδικασίες διαφοροποίησης. Τα γονίδια Runx2 και Osterix που στα µεσεγχυµατικά κύτταρα εµπλέκονται στην διαφοροποίηση σε οστεοβλάστες όπως και το Pitx2 εκφράζονται 2 µέρες µετά την χορήγηση BMP (79). Από τα διάφορα γονίδια- στόχους των BMPs, τα Id γονίδια εκφράζονται σε διάφορους κυτταρικούς τύπους και είναι από τα πιο σηµαντικά γονίδια- στόχους των BMPs. Οι τέσσερις ισοµορφές των Id πρωτεϊνών (Id1 έως 4) επιδεικνύουν παρόµοιες αλλά όχι ταυτόσηµες βιολογικές δράσεις. Οι ΒΜPs επάγουν την έκφραση των Id πρωτεϊνών οι οποίες καταστέλλουν την µυογένεση (80). 22

24 BMP2 µοριακή σηµατοδότηση Οι BMPs όπως αναφέρθηκε προσδένονται στους υποδοχείς τύπου Ι και τύπου ΙΙ που βρίσκονται στην κυτταρική µεµβράνη, µε διαφορετικού βαθµού αγχιστεία. Η BMP2 και η BMP4 για παράδειγµα, παρουσιάζουν υψηλή αγχιστεία για τους τύπου Ι BRIa και BRIb υποδοχείς και µια συγκριτικά χαµηλή αγχιστεία για τους τύπου ΙΙ υποδοχείς (81,82). Η BMP7 ωστόσο συνδέεται στους τύπου II υποδοχείς ActRIIA και ActRIIB, ενώ η αγχιστεία που εµφανίζει για τους τύπου Ι υποδοχείς είναι µειωµένη. Αυτές οι διαφορές έχουν ως αποτέλεσµα, οι αποκρινόµενοι υποδοχείς να ολιγοµερίζονται µε συγκεκριµένο τρόπο που στη συνέχεια οδηγεί στην ενεργοποίηση συγκεκριµένων σηµατοδοτικών µονοπατιών (83,84). Ωστόσο ο ολιγοµερισµός προσδέτη- υποδοχέα δεν εξαρτάται µόνο από την αγχιστεία µεταξύ τους, αλλά και από τα επίπεδα έκφρασης των προσδετών, των υποδοχέων, των συµπαραγόντων, όπως επίσης και από την παρουσία ή απουσία στην επιφάνεια του κυττάρου, προσχηµατισµένων συµπλόκων τύπου Ι /τύπου ΙΙ υποδοχέων. Αυτά τα χαρακτηριστικά είναι που δηµιουργούν µια ποικιλία στη BMP σηµατοδότηση. Πολλές µελέτες αποδεικνύουν ότι οι BMPs µπορούν να ενεργοποιήσουν διακριτά σηµατοδοτικά µονοπάτια αλληλεπιδρώντας µε διαφορετικά σύµπλοκα υποδοχέων. Η σηµατοδότηση της BMP2 έχει περιγραφεί περισσότερο αναλυτικά και έχουν αποκαλυφθεί τουλάχιστον δύο διαφορετικοί τρόποι µε τους οποίους η BMP2 αντιδρά µε τους υποδοχείς και ενεργοποιεί διαφορετικά σηµατοδοτικά µονοπάτια. Η BMP2 µπορεί είτε να προσδεθεί στον BRIa υποδοχέα και στη συνέχεια να επιστρατευτεί και ο BRII στο σύµπλοκο, είτε να προσδεθεί σε προσχηµατισµένα σύµπλοκα (preformed complexes,pfcs) των BRIa και BRII υποδοχέων (85,86). Η πρώτη µέθοδος ολιγοµερισµού αποκαλείται BMP-επαγόµενο σύµπλοκο σηµατοδότησης ( BMP-induced signaling complex, BISC). 23

25 Αυτή οδηγεί στην ενδοκύτωση µέσω εγκολπώσεων της µεµβράνης και σχηµατισµού κυστιδίων- καβεολίνης και στην ενεργοποίηση χωρίς-smad σηµατοδοτικών µονοπατιών όπως η MAPK (mitogen-activated protein kinase) σηµατοδότηση. Η PFC ενεργοποίηση οδηγεί στην ενδοκύτωση µέσω κυστιδίωνκλαθρίνης και στην συνέχεια στην ενεργοποίηση Smad-εξαρτώµενων σηµατοδοτικών µονοπατιών. Εικόνα 4. Απεικόνιση της BMP2 σηµατοδότησης. Α) Η BMP2 προσδένεται στον BRIa υποδοχέα και στη συνέχεια επιστρατεύεται και ο BRII στο σύµπλοκο ενεργοποιώντας ΜΑPK σηµατοδοτικά µονοπάτια. Β) Η BMP2 προσδένεται σε προσχηµατισµένα σύµπλοκα τύπου Ι και ΙΙ υποδοχέων (PFCs) και ενεργοποιεί Smad εξαρτώµενα σηµατοδοτικά µονοπάτια. 24

26 Ρόλος των BMPs στην διαφοροποίηση των οστεοβλαστών και στην οστεογένεση Η οστεογένεση είναι µια περίπλοκη διαδικασία που περιλαµβάνει την επιστράτευση πρόδροµων οστεογενετικών κυττάρων, τον πολλαπλασιασµό τους, τη δηµιουργία και ωρίµανση εξωκυτταρικού στρώµατος (ECM) και στο τελικό στάδιο την ανοργανοποίηση του στρώµατος από τους διαφοροποιηµένους οστεοβλάστες. (87). Η δηµιουργία οστού περιλαµβάνει δύο διακριτές φάσεις: α)την ενδοχονδρική οστεοποίηση, κατά την οποία ένα πρόπλασµα χόνδρου αντικαθίσταται από οστό και β)την διαµεµβρανική οστεοποίηση κατά την οποία το οστό σχηµατίζεται απευθείας από την συµπύκνωση των µεσεγχυµατικών κυττάρων χωρίς το ενδιάµεσο στάδιο δηµιουργίας χόνδρου. Το οστό επανασχεδιάζεται καθ όλη τη διάρκεια της ζωής του και οποιαδήποτε ανισορροπία κατά τη διάρκεια αυτής της δυναµικής διαδικασίας µπορεί να οδηγήσει σε ασθένειες των οστών. Η ακεραιότητα και λειτουργικότητα του οστού συντηρούνται από µια λεπτή ισορροπία µεταξύ δύο οστικών κυτταρικών τύπων που συµµετέχουν στον επανασχεδιασµό της σύστασης του οστού- των οστεοβλαστών και των οστεοκλαστών. Οι οστεοβλάστες είναι υπεύθυνοι για τη δηµιουργία οστού, ενώ οι οστεοκλάστες για την οστική αναρρόφηση. Παρά το γεγονός ότι οι χωροχρονικές διεργασίες οι οποίες είναι υπεύθυνες για τη διαφοροποίηση των µεσεγχυµατικών βλαστικών κυττάρων σε οστεοβλάστες δεν έχουν αποσαφηνιστεί εξ ολοκλήρου, είναι γνωστό ότι ρυθµίζονται από διαλυτούς παράγοντες, ορµόνες, ιστο-ειδικούς µεταγραφικούς παράγοντες καθώς και από τι κυτταρικές αλληλεπιδράσεις και τις αλληλεπιδράσεις των κυττάρων µε το ECM. Η επαγωγή οστεογένεσης από τις BMPs έχει µελετηθεί εκτεταµένα (88). Όπως αναφέρθηκε, οι BMPs είναι αυξητικοί παράγοντες που έχουν την ικανότητα να επάγουν την δηµιουργία έκτοπου οστού καθώς και την χονδρογένεση. Έχει αποδειχτεί ότι οι BMPs και συγκεκριµένα οι BMP-2, 4, 5, 6, και 7 µπορούν να επάγουν την ενδοχονδρική δηµιουργία οστού δηλαδή, διεγείρουν τη διαφοροποίηση των µεσεγχυµατικών βλαστικών κυττάρων σε χόνδρο και στη δηµιουργία χόνδρου, το οποίο στη συνέχεια αντικαθίσταται από οστικό ιστό. Οι BMPs µπορούν επίσης να επάγουν άµεσα και τη ενδοµεµβρανική δηµιουργία οστού. 25

27 Οι BMPs έχει δειχθεί ότι ρυθµίζουν την διαφοροποίηση των οστεοβλαστών. Μέχρι σήµερα έχουν διεξαχθεί αρκετά πειράµατα σε ποντικούς µε knockout BMPs προκειµένου να διερευνηθεί ο ρόλος τους στην δηµιουργία και ανάπτυξη του οστού. Επίσης µε knockout πειράµατα και πειράµατα σε ζώα που φέρουν φυσιολογικά µεταλλάξεις σε BMPs και σχετικά γονίδια, αποδείχτηκε ότι οι BMPs παίζουν καθοριστικό ρόλο στο σχηµατισµό του µεσοδέρµατος, στην ανάπτυξη της καρδιάς και του χόνδρου καθώς και στο σχηµατισµό οστού µετά την εµβρυική ηλικία. Κλινικές έρευνες έχουν δείξει ότι, η BMP-2 και η BMP-7 βρίσκουν εφαρµογή στη θεραπεία πολλών ασθενειών όπως διάφορες οστικές ανωµαλίες, η οστεοπόρωση, η ατελής οστεογένεση κα. Οι BMPs χρησιµοποιούνται ήδη σε θεραπείες αναγεννητικής ιατρικής στον άνθρωπο( οστικά εµφυτεύµατα, θεραπείες µε µεσεγχυµατικά βλαστικά κύτταρα κα.) Επιπλέον έχει βρεθεί ότι τα γονίδια- µάρτυρες των οστεοβλαστών παρουσιάζουν µια υπερέκφραση µετά από χορήγηση BMP-2 σε καλλιέργειες µεσεγχυµατικών βλαστικών κυττάρων. Αυτές οι ενδείξεις υποδεικνύουν ότι οι BMPs παίζουν σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση συγκεκριµένων σηµατοδοτικών οδών διαφοροποίησης αδιαφοροποίητων κυτταρικών σειρών. Οι οστεοβλάστες και άλλες σειρές µεσεγχυµατικών κυττάρων όπως τα χονδροκύτταρα, οι µυοβλάστες και τα κύτταρα του στρώµατος του µυελού των οστών έχουν κοινό πρόγονο. Η αλκαλική φωσφατάση (ALP) και η οστεοκαλσίνη αποτελούν ευρέως αποδεκτούς οστικούς µάρτυρες. Η αγωγή με BMP-2 µπορεί να επάγει την έκφραση της ALP ενεργοποιώντας τους BMP υποδοχείς, τις R-Smads (συγκεκριµένα τις Smad 1 και 5) και την έκφραση των Dlx5, Dlx3, Runx2, Msx2, και Osterix (Osx) (89). 26

28 BMP-2 σηµατοδότηση στην οστεογένεση Όπως αναφέρθηκε, οι BMPs και συγκεκριµένα οι BMP-2, 4, 5, 6, και 7 επάγουν σε µεγάλο βαθµό την οστεογένεση. Η προσθήκη της BMP-2 έχει δειχτεί ότι αυξάνει σε µεγάλο βαθµό την οστεοκαλσίνη ακόµα και µια µικρής διάρκειας έκφραση της BMP-2 είναι απαραίτητη και επαρκής για να επάγει τη δηµιουργία οστού. Τόσο η απώλεια της BMP-2 όσο και της BMP-4 οδηγεί σε σοβαρές βλάβες στην οστεογένεση (90,91). Σε ποντικούς οι οποίοι έχουν απωλέσει την ικανότητα να παράγουν BMP-2 στα οστά των άκρων, εµφανίστηκαν αυθόρµητα κατάγµατα, τα οποία δεν θεραπεύτηκαν µε την πάροδο του χρόνου και κανένα άλλο οστεογεννητικό ερέθισµα δεν µπόρεσε να αντισταθµίσει την απώλεια της BMP-2 (92). Από τους BMP υποδοχείς οι BMPR-II, ActR-IIB και ο BMPR-IA έχουν ικανότητα πρόσδεσης µε την BMP-2. Η πρόσδεση αυτή ενεργοποιεί τόσο το κανονικό (διαµέσου των 1/5/8 Smads) όσο και το µη κανονικό σηµατοδοτικό µονοπάτι µε τελικό στόχο την ενεργοποίηση του Runx2 µεταγραφικού παράγοντα και την έκφραση του Osterix (Osx) γονιδίου το οποίο είναι απαραίτητο για την διαφοροποίηση των προ-οστεοβλαστών σε ώριµους οστεοβλάστες (93,94). Η επαγωγή της έκφρασης του Osx από την BMP-2 αναστέλλεται πλήρως από την καταστολή του Dlx5,γεγονός που δηλώνει ότι η επαγωγή της έκφρασης του Osx από την BMP-2 ρυθµίζεται κυρίως από τον Dlx5, το οποίο µπορεί να έρχεται σε άµεση επαφή και να αντιδρά µε το Osx. (95). Η FGF σηµατοδότηση έχει αναφερθεί ότι αλληλεπιδρά µε την BMP σηµατοδότηση στο σχηµατισµό οστού. Ο FGF-2 και η BMP-2 παρουσιάζουν συνεργιστική δράση κατά την επούλωση καταγµάτων. Ο FGF-2 παίζει κύριο ρόλο στα πρώτα στάδια ενώ η BMP-2 προάγει την οστεοποίηση στα τελικά στάδια (96). Ο Runx2 είναι ένας σηµαντικός ρυθµιστής της έκφρασης της BMP-2 ως απόκριση στη FGF διέγερση κατά την ανάπτυξη του κρανιακού οστού (97). Η συνεργιστική δράση των FGF και BMP µπορεί να ρυθµίζεται µέσω της ενεργοποίησης του Runx2. Παρόµοια συνεργιστική δράση έχει βρεθεί και στο crosstalk µεταξύ Notch και BMP σηµατοδότησης. Η Notch σηµατοδότηση ενισχύει την επαγόµενη από την BMP δραστικότητα της αλκαλικής φωσφατάσης και οστεοποίηση in vitro. (98). 27

29 Ρόλος των BMPs στην χονδρογένεση Η χονδρογένεση είναι µια αυστηρά ρυθµιζόµενη και καλά οργανωµένη διαδικασία µε πολλά στάδια τα οποία περιλαµβάνουν την επιστράτευση και µετανάστευση µεσεγχυµατικών κυττάρων, την προχονδρογεννητική συµπύκνωση των µεσεγχυµατικών, την δέσµευση στην χονδρογεννητική οδό και την διαφοροποίηση σε χονδροκύτταρα (99,100). Η προχονδρογεννητική συµπύκνωση η οποία δηµιουργεί ένα χονδρικό εκµαγείο για τον µελλοντικό σκελετό, είναι ένα κρίσιµο στάδιο για την έναρξη της χονδρογεννητικής διαφοροποίησης. Αυτή εξαρτάται από την Ν-καδερίνη (Ncadherin) που είναι µια εξαρτώµενη από το Ca + πρωτεΐνη κυτταρικής προσκόλλησης, και µόρια του ECM όπως η φιµπρονεκτίνη, οι πρωτεογλυκάνες και τα κολλαγόνα. Τα µόρια του ECM αντιδρούν µε τα µόρια κυτταρικής προσκόλλησης όπως η εστιακή κινάση προσκόλλησης (focal adhesion kinase). Αυτό επάγει την µετάβαση των πρόδροµων χονδροκυττάρων σε ώριµα χονδροκύτταρα (101). Ο ρόλος των BMPs στην χονδρογένεση αποτέλεσε το αντικείµενο έντονης διερεύνησης τις τελευταίες δύο δεκαετίες. Στις µελέτες που έγιναν αποδείχτηκε ότι οι BMPs ρυθµίζουν άµεσα την έκφραση αρκετών γονιδίων τα οποία σχετίζονται µε τον χονδρογεννητικό φαινότυπο. Συγκεκριµένα αρκετά µέλη της οικογένειας των Sox µεταγραφικών παραγόντων είναι απαραίτητα για τη ρύθµιση της δέσµευσης στην χονδρογεννητική οδό και της διαφοροποίησης και υπάρχει µια σύνδεση µεταξύ της BMP σηµατοδότησης και της έκφρασης των Sox γονιδίων ( 102). In vitro έρευνες έχουν υποδείξει τον ρόλο των BMPs στα πρώιµα στάδια της χονδρογένεση: τη δέσµευση στην χονδρογεννητική οδό και την συµπύκνωση. Ένας πιθανός µηχανισµός µέσω του οποίου οι BMPs επάγουν την χονδρογένεση, είναι µέσω της αύξησης της έκφρασης και λειτουργικότητας της Ν- καδερίνης, δηλώνοντας ότι ένας από πρώιµους ρόλος των BMPs είναι να προάγουν τις αλληλεπιδράσεις ανάµεσα στα κύτταρα (cell- cell interactions). 28

30 Στόχοι των BMPs κατά τη διάρκεια της πρώιµης εµβρυογένεσης Η ταυτοποίηση των κυτταρικών µορίων που καθορίζουν την ικανότητα των BMPs να συντηρούν το χονδρογεννητικό πρόγραµµα αποτελεί µια περιοχή έντονου ερευνητικού ενδιαφέροντος. Σηµαντικές ενδείξεις προέρχονται από µελέτες που εξετάζουν τη σχέση µεταξύ BMP σηµατοδότησης και έκφρασης και λειτουργίας των Sox µεταγραφικών παραγόντων. Οι Sox πρωτεΐνες αποτελούν µια οµάδα µεταγραφικών παραγόντων που χαρακτηρίζονται από την παρουσία του SRY box, ένα µοτίβο 79 αµινοξέων που κωδικοποιεί για µια περιοχή πρόσδεσης στο DNA του τύπου HMG (high motility group, οµάδα υψηλής κινητικότητας). Πιο συγκεκριµένα το γονίδιο Sox9 είναι από τα πρώτα που αναγνωρίστηκαν για τον βασικό ρόλο που κατέχουν στη διαφοροποίηση των κυττάρων κατά τη χονδρογένεση. Ο Sox9 είναι ο πιο πρώιµος µάρτυρας για κύτταρα τα οποία είναι δεσµευµένα στην χονδρογεννητική οδό ενώ γενετικές µελέτες έχουν αποδείξει τον απαραίτητο ρόλο του στη χονδρογένεση. Σε µεταλλάξεις του Sox9 έχει παρατηρηθεί ότι οι χονδρογεννητικοί σύνδεσµοι δε σχηµατίζονται ούτε τα γονίδια- µάρτυρες της χονδρογέννεσης παράγονται. Ο Sox9 εκφράζεται συνεχώς στα χονδροκύτταρα έως το υπερτροφικό στάδιο και είναι απαραίτητος για τη διατήρηση του χονδροκυτταρικού φαινοτύπου. Τα L-sox5 και Sox6 εκφράζονται στα χονδροκύτταρα και έχουν επικαλυπτόµενες λειτουργίες (102). Έχουν γίνει πολλές µελέτες που διερευνούν τη σχέση µεταξύ των BMP και της έκφρασης των L-Sox5, Sox 6 και Sox 9. Έχει δειχθεί ότι οι BMPs προάγουν την έκφραση του Sox9 σε C3H10T1/2 κυτταρικές καλλιέργειες. Επίσης έχει δειχθεί ότι η έκφραση του Sox9 είναι απαραίτητη για την επαγωγή χονδρογένεσης µέσω των BMPs, καθώς η αναστολή του Sox9 µπλοκάρει την δυνατότητα των BMPs να επάγουν την έκφραση του κολλαγόνου τύπου ΙΙ. Επίσης η εµφύτευση της BMP2 σε συµπυκνωµένο κολλαγόνο οδήγησε σε αύξηση της έκφρασης των Sox πρωτεϊνών, ενώ η αντίστοιχα εµφύτευση της Noggin (αναστολέας των BMPs) οδήγησε σε µείωση της έκφρασης αυτών των πρωτεϊνών (103, 104). 29

31 Εικόνα 5. A,B,C: Oι BMPs εµπλέκονται στην έκφραση της Ν-καδερίνης κατά την προχονδρογεννητική συµπύκνωση και των Sox πρωτεϊνών κατά τη χονδρογεννητική διαφοροποίηση. D: Oι BMPs εµπλέκονται στις διάφορες ζώνες ανάπτυξης και υπερτροφικής διαφοροποίησης των χονδροκυττάρων. Αυτή η ρύθµιση από τις BMPs είναι χρονοεξαρτώµενη: ο Sox 9 επάγεται µέσα σε µία ώρα από τη χορήγηση BMPs, ενώ οι L-Sox5 και Sox6 επάγονται αργότερα. Αυτό το µοτίβο έκφρασης ενδεχοµένως δείχνει ότι οι BMPs ρυθµίζουν άµεσα το Sox9, πυροδοτώντας την χονδρογένεση, και οδηγούν στη συνέχεια στην έκφραση των L-Sox5 και Sox 6. 30

32 BMP ΣΗΜΑΤΟ ΟΤΗΣΗ ΣΤΗΝ ΧΟΝ ΡΟΓΕΝΕΣΗ Παρά το γεγονός ότι η σηµασία του κανονικού Smad1/5/8 και του p38 σηµατοδοτικού µονοπατιού είναι ευρέως αποδεκτή, οι ρόλοι που διαδραµατίζουν αυτά τα µονοπάτια στη ρύθµιση διαφόρων σταδίων της χονδρογένεσης παραµένουν αδιευκρίνιστοι. A. Κανονικό Smad µονοπάτι στην χονδρογένεση Έχει βρεθεί ότι οι φωσφορυλιωµένες (ενεργοποιηµένες) Smad1/5/8 πρωτεΐνες είναι άφθονες στις πρώιµες προχονδρικές συµπυκνώσεις, ενώ απουσιάζουν όταν οι BMP υποδοχείς έχουν αφαιρεθεί ( 105). Μερικές από τις πιο ισχυρές ενδείξεις για την εµπλοκή του κανονικού BMP- Smad µονοπατιού σε διάφορες πτυχές της διαφοροποίησης σε χονδροκύτταρα προέρχονται από αναλύσεις που έγιναν στον προαγωγέα του κολλαγόνου τύπου Χ (106). Το κολλαγόνο τύπου Χ εκφράζεται στα προ- υπερτροφικά και στα υπερτροφικά χονδροκύτταρα και είναι απαραίτητο συστατικό του στρώµατος στην περιοχή της διαφοροποίησης. Επίσης τα Runx2 και Runx3 γονίδια των αντίστοιχων µεταγραφικών παραγόντων εκφράζονται επίσης στα προ- υπερτροφικά και υπερτροφικά χονδροκύτταρα. Ο Runx2 (ένας µεταγραφικός συνεργός των Smads)και η Smad1 προσδένονται απευθείας στον προαγωγέα του κολλαγόνου τύπου X και οι συνεργιστικές τους δράσεις είναι απαραίτητες για την έκφρασή του( 107, 108). Τέλος το Ihh γονίδιο αποτελεί έναν δεύτερο πιθανό στόχο των BMP Smad µονοπατιών στην διαφοροποίηση των χονδροκυττάρων. Το Ihh εκφράζεται στα υπερτροφικά χονδροκύτταρα και ρυθµίζει τα τελικά στάδια της διαφοροποίησης ελέγχοντας τα επίπεδα της PTHrP (Parathyroid Hormone-related Protein). Έχει δειχθεί ότι ο Runx2 προσδένεται άµεσα στον προαγωγέα του Ihh. Επίσης έχει δειχθεί ότι το Ihh γονίδιο αποτελεί άµεσο στόχο των BMPs και η περιοχή του προαγωγέα περιέχει πολλαπλά µοτίβα πρόσδεσης µε την Smad4 ( 109). 31

33 Β. p38 σηµατοδοτικό µονοπάτι στην χονδρογένεση Εκτός από το κανονικό Smad σηµατοδοτικό µονοπάτι υπάρχουν και εναλλακτικά µονοπάτια που εµπλέκονται στην χονδρογένεση. Στα χονδροκύτταρα το πιο ευρέως µελετηµένο είναι το p38 µονοπάτι. Οι BMPs έχουν τη δυνατότητα να επηρεάζουν τα χονδροκύτταρα ενεργοποιώντας την p38 MAPK, διαµέσου της TAK1(TGF β-activated kinase). Η χορήγηση BMPs σε ATDC5 κύτταρα οδηγεί σε διατηρήσιµη φωσφορυλίωση της p38, ενώ οι p38 αναστολείς καταστέλλουν την επαγωγή του κολλαγόνου τύπου ΙΙ και της διαφοροποίησης. Επιπλέον έχει προταθεί εµπλοκή της p38 στην επαγόµενη από τις BMPs έκφραση του γονιδίου του κολλαγόνου τύπου Χ. Υπάρχουν ενδείξεις ότι η p38 επάγει την δραστικότητα δρώντας συνεργιστικά µαζί µε τις Smad στον προαγωγέα του ColX γονιδίου (110). Η BMP2 έχει δειχθεί ότι προάγει την χονδρογένεση ενεργοποιώντας την p38 η οποία ρυθµίζει αρνητικά το Wnt-7a/b-catenin µονοπάτι το οποίο ευθύνεται για την πρωτεασωµική αποικοδόµηση του Sox9 µεταγραφικού παράγοντα (111). Παρά το γεγονός ότι αρκετές µελέτες υποστηρίζουν τον απαραίτητο ρόλο της p38 στη χονδρογένεση και στη εµπλοκή των BMP µηχανισµών, µέχρι στιγµής παραµένει αδιευκρίνιστο το αν η p38 δρα παράλληλα ή υπάρχει κάποια συνοµιλία µε το Smad µονοπάτι. Το εξωκυτταρικό στρώµα (ECM) και οι BMPs Το ECM σύµφωνα µε τα βιβλιογραφικά δεδοµένα, εµπλέκεται στη ρύθµιση της BMP σηµατοδότησης. Συγκεκριµένα οι πρωτεογλυκάνες αλάτων ηπαρίνης (heparin sulfate proteoglycans-hspgs) όπως η syndecan-3, µπορούν να επηρεάσουν αρνητικά την επαγόµενη από τις BMPs χονδρογένεση, πιθανώς επειδή δεσµεύουν προσδέτες όπως η BMP2 και έτσι περιορίζουν την διάχυσή τους και την διαθεσιµότητά τους στους υποδοχείς (112). 32

34 Σε αντίθεση µε τα προηγούµενα ευρήµατα, άλλες έρευνες έχουν δείξει ότι στα πρώιµα στάδια της συµπύκνωσης και κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης των οστεοβλαστών, οι HSPGs µπορεί να ενισχύσουν τη BMP σηµατοδότηση. Άλλες µελέτες έχουν δείξει ότι οι φιµπριλίνες επηρεάζουν τα TGF-β και BMP σηµατοδοτικά µονοπάτια. Οι φιµπριλίνες είναι ένα κυρίαρχο δοµικό συστατικό των µικροϊνιδίων που είναι αρχιτεκτονικά στοιχεία των συνδετικών ιστών (113). Επιπρόσθετη ανάµειξη του ECM διαφαίνεται και από τη δηµιουργία αλληλεπιδράσεων µεταξύ υαλουρονικού οξέος κυττάρων οι οποίες ρυθµίζονται από τον CD44 κυτταρικό υποδοχέα. Μια µελέτη έδειξε ότι η Smad1 φωσφορυλίωση που επάγεται από την BMP7 εξαρτάται από αλληλεπιδράσεις µεταξύ των Smad1 και της κυτταροπλασµατικής επικράτειας του CD44. Αναστολή αυτής της αλληλεπίδρασης µείωσε την φωσφορυλίωση της Smad1 και της πυρηνικής της µετατόπισης (114). Επιγενετική ρύθµιση Η επιγενετική ρύθµιση αποτελεί έναν ουσιώδη µηχανισµό για τον έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης και των θεµελιωδών κυτταρικών διεργασιών. Η µεθυλίωση του DNA είναι σηµαντική στη ρύθµιση της έκφρασης της ALPL µέσω της µετάβασης των οστεοβλαστών σε οστεοκύτταρα (115). Η επαγόµενη µεταγραφή µέσω της Smad2 απαιτεί την ιστόνη της ακυλοτρανσφεράσης p300, η οποία είναι απαραίτητη για να είναι η Smad2 ικανή να µεσολαβήσει στη σηµατοδότηση του TGF-β (116). Μετάλλαξη της λυσίνης στις θέσεις Lys-19, Lys-20, Lys-39 καταργούν την ακετυλίωση in vivo της Smad2 και εµποδίζουν τη πυρηνική συσσώρευση της Smad2 και τις µετέπειτα αποκρίσεις της ακτιβίνης και του TGF-β (117). Η Smad7 αλληλεπιδρά µε συγκεκριµένες ιστόνες αποακετυλίωσης ( HDACs), οι οποίες είναι ικανές να αποακετυλιώσουν τη Smad7 (118). Αυτό είναι σηµαντικό δεδοµένου ότι η ακετυλίωση της Smad7 την προστατεύει από την ουβικιτινυλίωση και την αποικοδόµηση από την λιγάση της ουβικιτίνης Smurf1 (119). 33

35 ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ BMPs ΚΑΙ ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ Η οστική αποκατάσταση οστικών ατελειών παραµένει µια σηµαντική πρόκληση στους τοµείς της ορθοπεδικής, της γναθοχειρουργικής και της οδοντικής εµφυτευµατολογίας. Σύµφωνα µε την µέχρι στιγµής ευρέως διαδεδοµένη διαδικασία χρησιµοποιούνται ειδικά υλικά για την συµπλήρωση των οστικών ελλείψεων και αυτόλογα οστικά εµφυτεύµατα τα οποία παρουσιάζουν υψηλή οστική αγωγιµότητα και επαγωγή. Ωστόσο, αυτές οι προσεγγίσεις παρουσιάζουν σηµαντικά µειονεκτήµατα (ανεπαρκής ποσότητα και ενσωµάτωση, νοσηρότητα κτλ.) και αναζητούνται άλλες πιο αποτελεσµατικές στρατηγικές ( ). Μια αποτελεσµατική προσέγγιση σε αυτά τα προβλήµατα είναι η χρήση των BMPs σε συνδυασµό µε ειδικούς φορείς. Μέχρι στιγµής, δύο BMP παρασκευάσµατα έχουν εγκριθεί από τον Παγκόσµιο Οργανισµό Υγείας για κλινικές εφαρµογές και συγκεκριµένα στην επούλωση καταγµάτων των άκρων και βελτίωση της αναγέννησης των µεσοσπονδύλιων δίσκων. Σε αυτές τις περιπτώσεις ικριώµατα κολλαγόνου µαζί µε την BMP2 (Medtronic) ή την BMP7 (Stryker Biotech) εγχέονται στο σηµείο του κατάγµατος (124). Η BMP7 σε συνδυασµό µε µεταµόσχευση οστού έχει δειχτεί ότι δεν παρουσιάζει µετεγχειρητικές επιπλοκές στους ασθενείς (125). Η εφαρµογή της BMP7 σε ένα σύνολο 19 διαφορετικών τύπων συντήξεων οστών ( ποδοκνηµική άρθρωση, λαγόνιο, ηβικό κτλ) είχε ως θετικό αποτέλεσµα στους ρυθµούς επούλωσης στο 70% των περιπτώσεων (126). Ωστόσο, στο στάδιο των κλινικών δοκιµών έχει αποδειχτεί ότι οι αποτελεσµατικές δοσολογίες των BMPs για την επαγωγή της οστεογένεσης είναι εξαιρετικά υψηλές ( µέχρι mg).(127) Το γεγονός αυτό εκτός από το σηµαντικό κόστος θεραπείας για τους ασθενείς, έχει και άλλες παρενέργειες όπως η υπερδιέγερση της δραστικότητας των οστεοκλαστών και η έκτοπη δηµιουργία οστού σε µη επιθυµητές περιοχές (128,129). Επίσης η καθαρή µορφή των BMPs είναι υδρόφοβη και εποµένως αναποτελεσµατική και δεύτερον ότι η οστεοεπαγωγική δράση των BMPs είναι ανάλογη της τοπικής της µόνο συγκέντρωσης (130). Η γρήγορη τοπική και συστηµατική διάσπαση των BMPs επιβάλλουν η δοσολογία της τοπικής εφαρµογής τους να ξεπεράσει ένα συγκεκριµένο όριο, πέρα από το οποίο αποκτούν την 34

36 επιθυµητή οστεοεπαγωγική δράση. Μικρότερη συγκέντρωση οδηγεί σε ανεπαρκή παραγωγή οστού, ενώ µεγαλύτερη οδηγεί σε ανεξέλεγκτη οστεογένεση και τη µετατροπή από τη µια πλευρά της επιθυµητής ενδοχονδρικής οστεογένεσης σε ενδοµεµβρανώδη και από την άλλη πλευρά την έναρξη τοπικής οστεολυσίας µε την κινητοποίηση οστεοκλαστικής δραστηριότητας µέσω των µηχανισµών της οστικής οµοιόστασης και επαναδιαµόρφωσης (remodeling) (131). Μια προσέγγιση για να λυθεί αυτό το πρόβληµα είναι να δηµιουργηθούν BMPs µε µεγαλύτερη οστεογεννητική ικανότητα προκειµένου να µπορούν να χορηγηθούν σε µικρότερες δόσεις. Οι ετεροδιµερείς BMPs ( BMP2/7 και BMP2/6 ) επιδεικνύουν σηµαντικά υψηλότερη οστεογεννητική ικανότητα τόσο σε in vivo όσο και σε ex vivo δοκιµές ( ). και αποτελούν ένα ελκυστικό για εφαρµογές στον τοµέα της δηµιουργίας ιστών. Επίσης πρόσφατες µελέτες έδειξαν και άλλες πιθανές θεραπευτικές εφαρµογές των BMPs εκτός από τις σκελετικές διαταραχές. Η BMP7 θεωρείται ως ένα ισχυρός υποψήφιος για την κλινική θεραπεία της χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας (CKD) (136). Η χρήση της BMP-7 έχει δειχθεί ότι εµποδίζει την ανάπτυξη αδύναµων οστών σε προκλινικό στάδιο της νόσου (137). Πρόσφατες εφαρµογές στην θεραπεία µε BMPs περιλαµβάνουν την καθήλωση σε πολυµερικές επιφάνειες πεπτιδίων τα οποία περιλαµβάνουν τα πιθανά αµινοξέα που εµπλέκονται στην σύνδεση των BMPs µε τους υποδοχείς και την έναρξη του BMP σηµατοδοτικού µονοπατιού. Τα πεπτίδια αυτά µιµούνται την δράση τω BMPs και ενισχύουν την διαφοροποίηση των µεσεγχυµατικών σε οστεοβλάστες (138). 35

37 36 ΥΛΙΚΑ- ΜΕΘΟ ΟΙ

38 A ΥΛΙΚΑ 1. Αντιδραστήρια Acetic Acid (glacial) Acrylamide 2X Agar Agarose Ammonium acetate Ampicillin 5-Bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranoside (Χ-Gal) Coomassie brilliant blue Deoxynucleotides (dntps) DNA Ladder RTU 1kb Ethanol Ethylendiaminetetra-acetic acid (EDTA) Glycerol Glycine (SERVA) Hydrochloride 37% (MERCK) Imidazole Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) (SERVA) Magnesium chloride, hexahydrate Magnesium sulfate, heptahydrate Methanol Nickel nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) Potassium chloride Ribonucleotides triphosphates Silver nitrate Sodium chloride Sodium dodecyl sulfate (SDS) (ICN) N, N, N, N Tetramethylethylendiamine (TEMED) Tris hydroxylmethylaminomethane Tryptone Urea Yeast extract 37

39 2. Θρεπτικά υλικά Τα στελέχη E.coli αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υλικό LB( Luria-Bertani) (Sambrook et al. 1989), του οποίου ή σύσταση είναι η παρακάτω Θρεπτικό µέσο LΒ( ph=7,2) Αντιδραστήριο Τυπική αναλογία(g/l) Τρυπτόνη 10.0 Εκχύλισµα ζύµης 5 ΝaCl 10 NaOH Για ρύθµιση του ph 7.2 Θρεπτικό υλικό dyt Αντιδραστήριο Τυπική αναλογία(g/l) Τρυπτόνη 16 Εκχύλισµα ζύµης 10 ΝaCl 5 Η αποστείρωση του θρεπτικού υλικού γίνεται στους 120 C υπό πίεση 1.2 atm για 20 min. O εµβολιασµός γίνεται µε stock κυττάρων σε γλυκερόλη σε αναλογία 1:1000.Η ανάπτυξη των κυττάρων γίνεται στους 37 C για ώρες, µε έντονη ανάδευση, παρουσία του κατάλληλου αντιβιοτικού επιλογής για κάθε περίπτωση. 3.Πλασµιδιακοί φορείς Πρόκειται για πλασµιδιακό φορέα ο οποίος διαθέτει το γονίδιο που προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό αµπικιλλίνη (Εικόνα 2). Χρησιµοποιείται για την κλωνοποίηση και έκφραση γονιδίων µέσω της Τ7 RNA πολυµεράσης. Στο πλασµίδιο pet-29c µετά τον προαγωγέα της Τ7 RNA πολυµεράσης υπάρχει ο πολυσυνδέτης (polylinker), όπου βρίσκονται όλες οι θέσεις αναγνώρισης και κοπής από τα ένζυµα περιορισµού. Έτσι, µε τη χρήση των κατάλληλων ενζύµων είναι δυνατή η εισαγωγή του επιθυµητού γονιδίου, όπως είναι στη συγκεκριµένη περίπτωση το γονίδιο bmp2 στο εσωτερικό του polylinker και στη συνέχεια, η επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου αυτού µετά 38

40 από την πρόσδεση της Τ7 RNA πολυµεράσης στον προαγωγέα της. Το κωδικόνιο λήξης της µεταγραφής του bmp2 έχει απαλειφθεί, µε αποτέλεσµα να προστίθενται έξι τριάδες νουκλεοτιδίων που κωδικοποιούν έξι ιστιδίνες στο τέλος της αµινοξικής αλληλουχίας της bmp2. Η µεταγραφή σταµατά από ένα κωδικόνιο λήξης αµέσως µετά τα νουκλεοτίδια που κωδικοποιούν τις έξι ιστιδίνες. Πλασµιδιακός φορέας pet-29c Εικόνα 6 Ο προαγωγέας της Τ7 RNA πολυµεράσης και ο πολυσυνδέτης (polylinker) του φορέα pet-29c. Μετά τον πολυσυνδέτη διακρίνεται το His-Tag. 39

41 Β.ΜΕΘΟ ΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ-ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ 1.1 Μέθοδοι προσδιορισµού συγκέντρωσης πρωτεϊνών Φασµατοφωτοµετρική µέθοδος Τα πρωτεϊνικά διαλύµατα έχουν την ιδιότητα να απορροφούν το φως στην υπεριώδη περιοχή µε µέγιστο στα 280 nm. Η απορρόφηση αυτή οφείλεται στην ύπαρξη τριών αµινοξέων µε αρωµατικό δακτύλιο, της τυροσίνης, της τρυπτοφάνης και της φαινυλαλανίνης, µε την τελευταία να συµβάλει σε πολύ µικρότερο ποσοστό στο φάσµα απορρόφησης. ιάλυµα πρωτεΐνης µε συγκέντρωσης 1 mg/ml δίνει απορρόφηση στα 280 nm ίση µε την µονάδα. Τα πλεονεκτήµατα της µεθόδου είναι η ταχύτητα εκτέλεσης της,η ευκολία και η δυνατότητα επαναχρησιµοποίησης του δείγµατος. Το µειονέκτηµα της είναι ότι δεν παρουσιάζει υψηλή ακρίβεια λόγω της διαφορετικής αµινοξικής σύστασης των πρωτεϊνών, καθώς και της συνύπαρξης άλλων ουσιών που απορροφούν στο υπεριώδες-όπως τα νουκλεϊικά οξέα. 1.2.Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες ( SDS- PAGE) Οι πρωτεΐνες ως φορτισµένα σωµατίδια, έχουν την ιδιότητα να διαχωρίζονται καθώς κινούνται διαµέσου των πόρων µιας πηκτής, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Το πολυακρυλαµίδιο, που χρησιµοποιείται συνήθως για τις ηλεκτροφορήσεις πρωτεϊνών, παρουσιάζει αρκετά πλεονεκτήµατα, όπως είναι η χηµική αδράνεια, η αντοχή σε υψηλή θερµοκρασία, και η επαναληψιµότητα των αποτελεσµάτων. Η δηµιουργία των πηκτών πολυακρυλαµιδίου επιτυγχάνεται µε τον πολυµερισµό του πολυακρυλαµιδίου, και του Ν,Ν-µεθυλενο-δις-ακρυλαµιδίου, (bis-ακρυλαµιδίου) σε αναλογία 30:0,8 w/w. Το bis-ακρυλαµίδιο, συντελεί στον σχηµατισµό γεφυρών µεταξύ των αλυσίδων των πολυµερών του ακρυλαµιδίου. Κατά αυτόν τον τρόπο δηµιουργείται ένα τρισδιάστατο πολυµερές πλέγµα, το µέγεθος των πόρων του οποίου εξαρτάται από τον βαθµό πολυµερισµού και είναι αντιστρόφως ανάλογο της συγκέντρωσης των µονοµερών του ακρυλαµιδίου. Ο πολυµερισµός πραγµατοποιείται 40

42 µε µηχανισµό ελευθέρων ριζών. Ως καταλύτης έναρξης σχηµατισµού των ελεύθερων ριζών χρησιµοποιείται το υπερθειϊκό αµµώνιο, ( Ammonium PerSulfate, ΑPS ). Στη συνέχεια προστίθεται ο φωτοχηµικός καταλύτης, ο Ν,Ν, τετραµεθυλοεθυλενοδιαµίνη, (Tetra Methyl Ethylene Diamine, 2- TEMED ), ο οποίος αποσυνθέτει το υπερθειϊκό ιόν και δίνει ελεύθερες ρίζες, (S SO - 4 ), που διαδίδονται σε άλλα µόρια ακρυλαµιδίου προς σχηµατισµό του πολυµερούς Κατά την ηλεκτροφόρηση κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες( SDS-PoluAcrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE) οι πρωτεΐνες µετουσιώνονται και λαµβάνουν τυχαία διαµόρφωση, ενώ διαχωρίζονται µε βάση το µοριακό τους βάρος, λόγω της παρουσίας του ανιονικού απορρυπαντικού SDS ( Sodium Dodecyl Sulfate ). Το αρνητικά φορτισµένο SDS δεσµεύεται στις υδρόφοβες περιοχές των πρωτεϊνών, οι οποίες αποδιατάσσονται και δηµιουργούνται επιµήκη µόρια µε αρνητικό φορτίο. Το ποσό του SDS που δεσµεύεται ανά µονάδα βάρους πρωτεΐνης είναι σταθερό( 1.4 gr SDS/ gr πρωτεΐνης). Έτσι, το φορτίο του συµπλόκου SDS- πρωτεΐνης είναι συνάρτηση του µεγέθους της πρωτεΐνης και η ηλεκτροφορητική της κινητικότητα εξαρτάται αποκλειστικά από το µοριακό της µέγεθος. Η παραδοχή αυτή δεν ισχύει απόλυτα στις περιπτώσεις πρωτεϊνών που είναι πολύ βασικές ή πολύ όξινες, καθώς και πρωτεϊνών που παρουσιάζουν µεγάλο ποσοστό γλυκοσυλίωσης. Οι πρωτεΐνες αυτές, δεσµεύουν µικρότερα ποσά SDS ανά µονάδα βάρους και έτσι κινούνται πιο αργά στην πηκτή πολυακρυλαµιδίου µε αποτέλεσµα να παρουσιάζουν φαινόµενο µοριακό βάρος υψηλότερο του πραγµατικού Το σύστηµα ηλεκτροφόρησης µπορεί να είναι συνεχές ή ασυνεχές. Στο ασυνεχές σύστηµα, που είναι πιο συνηθισµένο, χρησιµοποιούνται δύο διαφορετικές πηκτές: Η πηκτή επιστοίβαξης ( stacking gel ) όπου γίνεται συµπύκνωση των πρωτεϊνών του δείγµατος σε µία λεπτή στιβάδα, ( χαµηλή συγκέντρωση ακρυλαµιδίου, pη 7), και η πηκτή διαχωρισµού ( separating gel ), όπου οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται σε λεπτές ζώνες, ανάλογα µε το µοριακό τους µέγεθος( υψηλή συγκέντρωση ακρυλαµιδίου, ph 9) (Laemmli 1970; Okajima et al.1993). Οι θέσεις εισαγωγής του κάθε δείγµατος δηµιουργούνται µε τη βοήθεια πλαστικής οδοντωτής µήτρας, η οποία αφαιρείται προσεκτικά, αφού ολοκληρωθεί ο πολυµερισµός της πηκτής επιστοίβαξης. Η σύσταση των πηκτών διαχωρισµού και επιστοίβαξης είναι η ακόλουθη: Πηκτή επιστοίβαξης 41

43 ακρυλαµίδιο 4% w/v bis- ακρυλαµίδιο 0,1% w/v SDS 0, 1 w/v Tris-HCl ph=6, M APS 0,05 % w/v TEMED 0, 1 v/v Πηκτή διαχωρισµού ακρυλαµίδιο 2 0 % w/v bis- ακρυλαµίδιο 0,5 % w/v SDS 0, 1 w/v Tris-HCl ph=8, M APS 0,03 % w/v TEMED 0, 06 v/v Το ρυθµιστικό διάλυµα των ηλεκτροδίων ( running buffer) προστίθεται στους δύο θαλάµους ( chambers) των ηλεκτροδίων της συσκευής ηλεκτροφόρησης. Η σύσταση του είναι η παρακάτω: ιάλυµα ηλεκτροδίων Tris 25 mμ Γλυκίνη 192 mμ SDS 0,1 % w/v Στα δείγµατα πριν την ηλεκτροφόρηση προστίθεται το διάλυµα δειγµάτων ( loading buffer). To διάλυµα παρασκευάζεται 5 φορές πιο πυκνό. Tα δείγµατα θερµαίνονται για 5 min στους 100 C για να αποδιαταχθούν πλήρως οι πρωτεΐνες και για να δηµιουργηθεί το σύµπλοκο SDS- πρωτεΐνης. Η β-µερκαπτοαιθανόλη ανάγει τους δισουλφιδικούς δεσµούς και αποδιατάσσει τις πρωτεΐνες. Η σύσταση του διαλύµατος δειγµάτων είναι η παρακάτω ιάλυµα δειγµάτων(1x) SDS 0,4 % w/v Tris-HCl ph=6,8 β-µερκαπτοαιθανόλη Γλυκερόλη Κυανούν της βρωµοθυµόλης 42

44 Αφού εισαχθούν τα δείγµατα, η συσκευή ηλεκτροφόρησης συνδέεται µε τροφοδοτικό και εφαρµόζεται σταθερή τάση V µέχρι το τέλος της ηλεκτροφόρησης. 1.3 Στερέωση και χρώση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου Χρώση µε Coomassie Brilliant Blue (CBB) R-250 Για την εµφάνιση των πρωτεϊνικών ζωνών στην πηκτή του πολυακρυλαµιδίου ή πηκτή υποβάλλεται σε µα κατεργασία χρώσης, µε την χρωστική CBB R-250. Η µέθοδος αυτή στηρίζεται στη δηµιουργία συµπλόκου κυανού χρώµατος µεταξύ των πρωτεϊνών και της χρωστικής. Με τη µέθοδο αυτή είναι δυνατή η ανίχνευση µέχρι και 0.1 µ πρωτεΐνης. Μετά την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών η πηκτή εµβαπτίζεται στο διάλυµα χρώσης που στην ουσία είναι το διάλυµα της στερέωσης συν την χρωστική. Έτσι, η στερέωση και η χρώση γίνονται ταυτόχρονα. Η χρώση γίνεται για µία ώρα µε ήπια ανάδευση και έπειτα αφαιρείται µε το διάλυµα αποχρωµατισµού. Η σύσταση των διαλυµάτων είναι η εξής: ιάλυµα χρώσης CBB R % w/v Αιθανόλη Οξικό οξύ 25 % w/v 10 % % w/v ιάλυµα αποχρωµατισµού Οξικό οξύ Μεθανόλη 10 % w/v 12 % w/v 43

45 1.3.2 Χρώση µε νιτρικό άργυρο Η χρώση των πρωτεϊνών µε νιτρικό άργυρο (Blum et al., 1987) είναι φορές περισσότερο ευαίσθητη από τη χρώση µε CBB και βασίζεται στην ιδιότητα των ιόντων αργύρου να αντιδρούν µε τις πρωτεΐνες και κυρίως µε τις ελεύθερες αµινοµάδες και θειούχες οµάδες τους. Στη συνέχεια τα ιόντα του αργύρου ανάγονται σε µεταλλικό άργυρο, συνήθως µε φορµαλδεΰδη και εµφανίζεται η χρώση. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής: Μετά τη στερέωση των πρωτεϊνών αποµακρύνεται το οξικό οξύ µε δύο πλύσεις των 20 min µε 50% v/v αιθανόλης και µια πλύση µε 30% v/v αιθανόλης για 30 min. Ακολουθεί πλύση της πηκτής σε δις απιονισµένο H 2 O για 1 min και επώασή της σε διάλυµα 0,02% w/v θειοθειικού νατρίου. Το θειοθειικό νάτριο αποµακρύνεται µε τρεις πλύσεις της πηκτής µε δις H 2 O των 20 sec η κάθε µια. Στη συνέχεια η πηκτή εµβαπτίζεται σε διάλυµα νιτρικού αργύρου 0,2% w/v, στο οποίο έχει προστεθεί 0,075% v/v φορµαλδεΰδη. Η επώαση στο διάλυµα του νιτρικού αργύρου διαρκεί για 20 min, ενώ ακολουθεί ξέπλυµα 20 sec της πηκτής δύο φορές µε νερό και εµφάνιση των ζωνών µε διάλυµα 6% w/v Na 2 CO 3 και 0,05% v/v φορµαλδεΰδης, στο οποίο προστέθηκε 0,02% w/v θειοθειικό νάτριο. Μετά την εµφάνιση των ζωνών η πηκτή ξεπλένεται µε δις H 2 O και η αντίδραση της χρώσης σταµατά µε επώαση της πηκτής σε διάλυµα µεθανόλης 50% v/v και οξικού οξέος 12% v/v, για 10 min. Σε όλα τα στάδια της χρώσης η πηκτή ανακινείται. 44

46 2 ΜΕΘΟ ΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2.1 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (Polymerase chain Reaction, PCR) χρησιµοποιείται για τον πολλαπλασιασµό ενός τµήµατος DNA, καθώς και για τον πολλαπλασιασµό ενός τµήµατος DNA εισάγοντας παράλληλα σε αυτό θέσεις για πέψη µε ενδονουκλεάσες περιορισµού, προκειµένου να κλωνοποιηθεί σε κατάλληλους πλασµιδιακούς φορείς. Επίσης, χρησιµοποιείται για την εισαγωγή µεταλλάξεων, καθώς και για τη ραδιοισοεπισήµανση µιας συγκεκριµένης ακολουθίας νουκλεοτιδίων, προκειµένου να πραγµατοποιηθεί νουκλεοτιδική ανάλυση, ( sequencing). Η τεχνική αυτή µπορεί να θεωρηθεί ανάλογη της διαδικασίας αντιγραφής του DNA, διαδικασία που γίνεται στα κύτταρα αφού το αποτέλεσµα είναι το ίδιο, η παραγωγή δηλαδή συµπληρωµατικών κλώνων DNA από κάποιον ήδη υπάρχοντα κλώνο. Η αρχή της µεθόδου στηρίζεται στη χρήση µίας θερµοάντοχης DNA πολυµεράσης, η οποία χρησιµοποιεί µονόκλωνο DNA ως εκµαγείο, για τη σύνθεση ενός νέου συµπληρωµατικού κλώνου. Προκειµένου να δράσει η πολυµεράση είναι απαραίτητη η ύπαρξη ενός µικρού τµήµατος δίκλωνου DNA. Για το σκοπό αυτό σχεδιάζονται κατάλληλα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια (εκκινητές), τα οποία είναι συµπληρωµατικά µιας περιοχής της επιθυµητής ακολουθίας. Η τεχνική της PCR γίνεται σε τρία στάδια: Στάδιο 1 ο : Αποδιάταξη Το δίκλωνο µόριο του DNA αποδιατάσσεται µε θέρµανση στους C. Με αυτόν τον τρόπο δηµιουργούµε δύο µονόκλωνες αλυσίδες και το τµήµα που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί µπορεί πλέον να χρησιµοποιηθεί για τα επόµενα στάδια. Στάδιο 2 ο : Υβριδισµός Η θερµοκρασία στο στάδιο αυτό µειώνεται στους C και τα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια (εκκινητές), υβριδίζονται µε το εκµαγείο συµπληρωµατικά, µε δεσµούς υδρογόνου. Η επιλογή της θερµοκρασίας υβριδισµού είναι πολύ σηµαντική και εξαρτάται από τη σύσταση καθώς και από το µήκος των εκκινητών. όσο υψηλότερη είναι η θερµοκρασία τόσο µειωµένη είναι η πιθανότητα λανθασµένων υβριδισµών. Οι εκκινητές επιλέγονται έτσι ώστε να περικλείουν το τµήµα του DNA, του οποίου ο πολλαπλασιασµός είναι επιθυµητός και µπορούν να σχεδιαστούν ώστε 45

47 στα άκρα τους νε περιέχουν θέσεις αναγνώρισης από ενδονουκλεάσες περιορισµού µε σκοπό την κλωνοποίηση του νεοσυντιθέµενου τµήµατος του DNA σε ένα πλασµίδιο. Αν η επιλεγµένη θερµοκρασία δεν είναι η σωστή, είναι δυνατόν να µην παραχθούν προϊόντα ή να παραχθούν παραπροϊόντα. Στάδιο 3 ο : Πολυµερισµός Το στάδιο αυτό γίνεται σε θερµοκρασία περίπου 72 C. Η DNA πολυµεράση χρησιµοποιώντας ως εκµαγείο την µονόκλωνη αλυσίδα και αναγνωρίζοντας την ελεύθερη-οη οµάδα, συνθέτει τη συµπληρωµατική αλυσίδα προσθέτοντας νουκλεοτίδια στο 3 άκρο του εκκινητή. Η σύνθεση του DNA συνεχίζεται έως ότου οι δύο νεοσυντιθέµενες αλυσίδες επιµηκυνθούν τόσο ώστε να περιέχουν περισσότερα νουκλεοτίδια από το επιθυµητό τµήµα του DNA. Η διάρκεια του πολυµερισµού εξαρτάται από το µήκος της πολλαπλασιαζόµενης ακολουθίας. Η πολυµεράση που χρησιµοποιείται είναι θερµοανθεκτική, ώστε να είναι λειτουργική στις υψηλές θερµοκρασίες των σταδίων. Τα τρία αυτά στάδια επαναλαµβάνονται για n κύκλους και παράγονται 2 n µόρια DNA, που έχουν ως άκρα τους δύο εκκινητές. Στο τέλος των κύκλων, το µίγµα της αντίδρασης παραµένει στους 72 C για 5 λεπτά, ώστε να συνεχιστεί ο πολυµερισµός. Το µίγµα της αντίδρασης φαίνεται παρακάτω: Μίγµα αντίδρασης PCR (50 µl) DNA εκµαγείο 2-10 ng Εκκινητής 5 100pmoles Εκκινητής 3 100pmoles Μίγµα dntps 200µΜ Ρυθµιστικό διάλυµα πολυµεράσης 5x 1x DNA πολυµεράση (Phusion) 1 unit 1 unit Η DNA πολυµεράση Phusion συνθέτει DNA µε µεγάλη ακρίβεια και µεγάλη ταχύτητα. Για αυτό το λόγο, ο χρόνος κάθε σταδίου είναι αρκετά σύντοµος. Ο υβριδισµός και ο πολυµερισµός πραγµατοποιούνται στην ίδια θερµοκρασία, οπότε στην ουσία αποτελούν ένα στάδιο. Οι συνθήκες της αντίδρασης PCR περιγράφονται παρακάτω: 46

48 Συνθήκες PCR: 98 C 30 s Προσθήκη DNA πολυµεράσης Phusion 98 C 10 s 45 κύκλοι 72 C 30 s 72 C 5 min 4 C άπειρο 2.2 Καθαρισµός τµηµάτων DNA µετά από PCR Μετά από το τέλος της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (PCR) ή µετά από πέψη µε ένζυµα περιορισµού, το τµήµα του DNA που έχει υποστεί τη κατεργασία πρέπει να διαχωρισθεί από τους εκκινητές, τα νουκλεοτίδια, και τα άλατα και την πολυµεράση για να χρησιµοποιηθεί καθαρό πλέον σε άλλες αντιδράσεις. Αυτό γίνεται µε το σύστηµα Qiaquick PCR Purification Kit της Qiagen. Η διαδιακασία έχει ως εξής: Προσθήκη 5 όγκων διαλύµατος PB, που περιέχει χαοτροπικό παράγοντα, στο PCR προϊόν και ανάµειξη. ιαβίβαση διαλύµατος από µια στήλη Qiaquick. Φυγοκέντρηση για 1 min στα g ώστε να συγκρατηθεί το DNA στη στήλη και να διέλθουν τα υπόλοιπα συστατικά. Πλύση της στήλης µε αιθανολικό διάλυµα PE (0.1M NaCl, 10 mm Tris-HCl, 1mM EDTA, ph 7,5). Φυγοκέντρηση για 1 min g. Έκλουση του DNA µε 30 µl αποστειρωµένου νερού η ενός ελαφρώς βασικού διαλύµατος ΑΕ( 5 mm Tris-HCl ph 8,5). Με αυτόν τον τρόπο παραλαµβάνεται καθαρό το DNA (Qiaquick Spin Handbook, Qiagen 2002). 47

49 2.3 Ηλεκτροφόρηση DNA σε πηκτή αγαρόζης Η ηλεκτροφόρηση DNA σε πηκτή αγαρόζης βασίζεται στην µετακίνηση των αρνητικά φορτισµένων µορίων προς την άνοδο. Η ταχύτητα µετακίνησης των µορίων εξαρτάται από το µέγεθος τους ( για γραµµικά δίκλωνα µόρια η ταχύτητα είναι αντιστρόφως ανάλογη του δεκαδικού λογαρίθµου του αριθµού των βάσεων τους), από τη διαµόρφωση τους( υπερελικωµένα, κυκλικά ή γραµµικά), τη συγκέντρωση της αγαρόζης, το δυναµικό που εφαρµόζεται, καθώς επίσης και από τη σύσταση του ρυθµιστικού διαλύµατος που χρησιµοποιείται. Η αγαρόζη είναι ένας πολυσακχαρίτης υψηλού µοριακού µεγέθους. Πρόκειται για ένα γραµµικό πολυµερές, µε βασική µονάδα τη D-γαλακτοζυλο-3,6-ανυδρο-L-γαλακτόζη. Η τήξη της αγαρόζης επιτυγχάνεται µε θέρµανση, παρουσία του ρυθµιστικού διαλύµατος ηλεκτροφόρησης TAE. Στη συγκεκριµένη εργασία χρησιµοποιήθηκαν πηκτές αγαρόζης συγκέντρωσης από 1-2 % w/v και τα εξής διαλύµατα: Ρυθµιστικό διάλυµα TAE Tris-acetate 40 mm EDTA, ph mm ιάλυµα δειγµάτων DNA Σουκρόζη 5% v/v Κυανούν της βρωµοθυµόλης % v/v ιάλυµα δειγµάτων για RNA Φορµαµίδιο 95 % v/v SDS % w/v Κυανούν της βρωµοθυµόλης % w/v Κυανούν του ξυλενίου % w/v Βρωµιούχο Αιθίδιο % w/v EDTA 0.5 Mm 48

50 Αρχικά, γίνεται διάλυση της αγαρόζης στο ρυθµιστικό διάλυµα TAE µε θέρµανση στους 100 C, ακολουθεί ελάττωση της θερµοκρασίας, (µέχρι τους 60 C περίπου ), προσθήκη του βρωµιούχου αιθιδίου,(etbr), σε συγκέντρωση 0.5µg/ml και απόχυση στην ειδική συσκευή. Το διάλυµα της ηλεκτροφόρησης είναι το TAE. Το βρωµιούχο αιθίδιο είναι µια φθορίζουσα ένωση, η οποία παρεµβάλλεται µεταξύ των βάσεων του DNA ή του RNA και έχει την ιδιότητα να απορροφά την υπεριώδη ακτινοβολία στα 302 nm και 366nm και να την επανεκπέµπει στην περιοχή του κόκκινου ορατού φάσµατος. Η ένταση της ακτινοβολίας είναι ανάλογη της ποσότητας του DNA ή RNA και είναι δυνατή η ανίχνευση µικρών ποσοτήτων DNA ή RNA. 2.4 Καθαρισµός τµηµάτων DNA από πηκτή αγαρόζης Η µέθοδος χρησιµοποιείται για καθαρισµό του DNA έπειτα από πέψη µε ενδονουκλεάσες περιορισµού ή έπειτα από PCR. Χρησιµοποιείται το σύστηµα καθαρισµού Qiaquick Gel Extraction Kit της Qiagen. Αυτό περιέχει µικρές στήλες µε µεµβράνη από silica gel στην οποία δεσµεύεται το διέρχονται από τη στήλη. Η διαδικασία έχει ως εξής: DNA ενώ οι προσµίξεις Εντοπισµός της ζώνης του DNA που πρόκειται να εκχυλιστεί από την πηκτή της αγαρόζης, προσεκτική κοπή και τοποθέτηση σε ένα σωλήνα µικροφυγοκεντρικής (eppendorf). Προσθήκη700ml διαλύµατος QX1, που είναι το διάλυµα αλατοποίησης της αγαρόζης και θέρµανση στους 50 C για πλήρη διάλυση της αγαρόζης. ιαβίβαση του διαλύµατος σε στήλη Qiaquick και δέσµευση του DNA µε φυγοκέντρηση στα rpm για 1 min σε επιτραπέζια φυγόκεντρο. Πλύση της στήλης ξανά µε 700 ml διαλύµατος QX1 για αποµάκρυνση των τελευταίων ιχνών αγαρόζης Πλύση της στήλης 2 φορές µε 700 ml αιθανολικού διαλύµατος PE (0.1 M NaCl, 10 mm Tris-HCl, 1mM EDTA, ph 7.5) Έκλουση του DNA µε διάλυµα ΑΕ ( 5 mm Tris-HCl, ph 8.5). Έπειτα από αυτή τη µέθοδο το DNA παραλαµβάνεται σε καθαρή µορφή. Η ανάκτηση της µεθόδου φτάνει στα 80% και µπορεί να χρησιµοποιηθεί από 100 bp έως 10kb ( Qiaquick Spin Handbook, Qiagen 2002). 49

51 2.5 Προσδιορισµός συγκέντρωσης DNA Φασµατοφωτοµετρική µέθοδος Ο φασµατοφωτοµετρικός προσδιορισµός του DNA ή του RNA σε υδατικά τους διαλύµατα στηρίζεται στο γεγονός ότι όλες οι βάσεις πουρίνης και πυριµιδίνης απορροφούν ισχυρά στην υπεριώδη περιοχή του φάσµατος µε µέγιστο στα 260 nm Απορρόφηση στα 260 nm ίση µε 1 (A 260 =1) αντιστοιχεί σε συγκέντρωση 50 µg/ml δίκλωνου DNA, σε 40µg/ml µονόκλωνου DNA και RNA και σε ~20 µg/ml µονόκλωνων ολιγουνουκλεοτιδίων. Ο έλεγχος της καθαρότητας του διαλύµατος των νουκλεινικών οξέων δίνεται από τον λόγο A 260 /A 280. Για καθαρά διαλύµατα DNA και RNA χωρίς προσµίξεις από πρωτεΐνες ή φαινόλη ο λόγος αυτός είναι 1.8 και 2, αντίστοιχα. (Sambrook et al. 1989) 2.6 Κλωνοποίηση τµηµάτων DNA σε πλασµιδιακούς φορείς Κατά τη κλωνοποίηση γίνεται εισαγωγή ενός τµήµατος DNA στο γονιδίωµα ενός αυτόνοµα πολλαπλασιαζόµενου γενετικού στοιχείου, ιού ή πλασµιδίου. Οι πλασµιδιακοί φορείς που χρησιµοποιούνται για την κλωνοποίηση είναι µικρά κυκλικά µόρια δίκλωνου DNA που µπορούν να αναπτύσσονται αυτόνοµα σε βακτήρια και φέρουν γονίδια που τους προσδίδουν αντίσταση σε συγκεκριµένα αντιβιοτικά. Τόσο ο πλασµιδιακός φορέας, όσο και το ξένο τµήµα του DNA που πρόκειται να εισαχθεί σε αυτόν επωάζονται µε τις ίδιες ενδονουκλεάσες περιορισµού και στη συνέχεια επανακυκλοποιούνται συνδεόµενα οµοιοπολικά στα άκρα τους µε τη δηµιουργία φωσφοδιεστερικού δεσµού, αντίδραση που καταλύεται από µια DNA λιγάση Πέψη µε ενδονουκλεάσες περιορισµού Οι ενδονουκλεάσες περιορισµού είναι ένζυµα, τα οποία έχουν την ικανότητα να διασπούν το DNA σε αυστηρά καθορισµένες θέσεις, που καθορίζονται από τη δοµή των νουκλεοτιδίων που περιβάλλουν το σηµείο υδρόλυσης του DNA. Τα περισσότερα ένζυµα περιορισµού υδρολύουν το DNA σε τµήµατα που περιέχουν 50

52 άκρα που χαρακτηρίζονται ως µονόκλωνα και έχουν συµπληρωµατική δοµή. Επειδή το κοµµάτι του DNA µπορεί να εισαχθεί στο πλασµίδιο και αντίστροφα αν επωαστεί µε ένα ένζυµο περιορισµού, ώστε να υπάρχει µόνο µία πιθανή εισαγωγή. Προκειµένου να γίνει πέψη µε ένζυµα περιορισµού, το µίγµα της αντίδρασης περιλαµβάνει: DNA, (πλασµιδιακός φορέας, ή το τµήµα του DNA που πρόκειται να κλωνοποιηθεί), το κατάλληλο ρυθµιστικό διάλυµα στο οποίο τα ένζυµα περιορισµού εµφανίζουν βέλτιστη δράση, τα ένζυµα περιορισµού και σε ορισµένες περιπτώσεις, όταν αυτό απαιτείται, αλβουµίνη. Ο συνολικός όγκος του µίγµατος κυµαίνεται από 20µl έως 50 µl. Η αντίδραση πραγµατοποιείται συνήθως στους 37 С, εκτός από πολύ λίγες εξαιρέσεις. Η ποσότητα των ενζύµων που χρησιµοποιήθηκαν δεν πρέπει να ξεπερνά το 10% v/v του συνολικού όγκου της αντίδρασης, διαφορετικά, υπάρχει περίπτωση να γίνει µη εξειδικευµένη πέψη, εξαιτίας της υψηλής συγκέντρωσης των ενζύµων ή της υψηλής συγκέντρωσης γλυκερόλης στο µίγµα της αντίδρασης. Ο χρόνος επώασης είναι συνήθως δύο ώρες. Μερικές φορές όµως, για τα τµήµατα του DNA που προέρχονται από PCR και πρόκειται να κλωνοποιηθούν, απαιτείται µεγαλύτερος χρόνος επώασης, γιατί οι θέσεις αναγνώρισης από τα ένζυµα περιορισµού είναι πολύ κοντά στα άκρα, µε αποτέλεσµα να δυσχεραίνεται η πέψη. Μετά την επώαση το µίγµα ηλεκτροφορείται σε πηκτή αγαρόζης και οι επιθυµητές ζώνες κόβονται και καθαρίζονται Αποφωσφορυλίωση πλασµιδίου Αφού γίνει η πέψη του πλασµιδίου µε τα κατάλληλα ένζυµα περιορισµού και πριν την προσθήκη της DNA λιγάσης, η οποία θα συνδέσει το επιθυµητό τµήµα DNA µε το πλασµίδιο, συνήθως γίνεται αποφωσφορυλίωση της 5 φωσφορικής οµάδας του πλασµιδίου. Με αυτόν τον τρόπο, το πλασµίδιο δεν µπορεί να κλείσει από µόνο του κατά την αντίδραση λιγάσης, χωρίς δηλαδή να εισαχθεί το τµήµα του DNA. Για αποφωσφορυλίωση απαιτείται µια φωσφατάση, ένα ένζυµο το οποίο αφαιρεί τα 5 φωσφορυλιωµένα άκρα µορίων DNA και RNA. Στην προκειµένη εργασία, χρησιµοποιήθηκε η αλκαλική φωσφατάση από έντερο µοσχαριού(calf Intestine Alkaline Phosphatase, CIAP). Μετά την πέψη µε τα ένζυµα περιορισµού, προστίθενται 3 µl φωσφατάσης στα 50 µl του µίγµατος της πέψης. Η επώαση συνεχίζεται για 1 ώρα στους 37 С και άλλη 1 51

53 ώρα στους 50 С. Μετά την επώαση το µίγµα ηλεκτροφορείται σε πηκτή αγαρόζης και η ζώνη του πλασµιδίου κόβεται και καθαρίζεται Αντίδραση λιγάσης Η ενσωµάτωση του τµήµατος DNA που µας ενδιαφέρει στον πλασµιδιακό φορέα γίνεται µε τη βοήθεια µιας λιγάσης. Με την Τ4 DNA λιγάση δηµιουργούνται φωσφοδιεστερικοί δεσµοί ανάµεσα από τα 5 ή τα 3 άκρα του πλασµιδίου µε τα 3 ή 5 άκρα του DNA που πρόκειται να εισαχθεί στο πλασµίδιο. Το πλασµίδιο µε το κοµµάτι του DNA βρίσκονται σε κάποια αναλογία moles ώστε να είναι περίπου οι ίδιες ποσότητες σε ng και το ρυθµιστικό διάλυµα της λιγάσης είναι 10 φορές πιο πυκνό (10x). Χρησιµοποιήθηκε η Τ4 DNA λιγάση της Fermentas Προστίθενται σε eppendorf : DNA insert (περίπου 2 µl) Πλασµίδιο (περίπου 0,5 µl) Λιγάση (1 µl) Buffer λιγάσης (2 µl) ddh2o (Υπόλοιπος όγκος µέχρι 20 µl) Και η αντίδραση παραµένει στους 16 C overnight. 52

54 2.7 Προετοιµασία επιδεκτικών κυττάρων για µετασχηµατισµό (competent cells ) Μέθοδος ψυχρών διαλυµάτων CaCl 2 για άµεση χρήση των κυττάρων Τα βακτήρια, έπειτα από κατεργασία µε ψυχρά διαλύµατα CaCl 2, είναι ικανά να προσλάβουν DNA προερχόµενο από διάφορες πηγές ( Mandel and Higa 1970 ). H συγκεκριµένη τεχνική αναλυτικά έχει ως εξής: Εµβολιασµός 4 µl θρεπτικού υλικού LB ή dyt, που περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό, µε κύτταρα και επώαση στους 37 C για ώρες µε ανάδευση. Εµβολιασµός 10 ml θρεπτικού υλικού LB ή dyt, που περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό, µε 100 µl (1 % v/v) από την προηγούµενη καλλιέργεια και επώαση της νέας καλλιέργειας στους 37 C µέχρι η απορρόφηση στα 600 nm να γίνει περίπου ίση µε 0.3 ( αρχή λογαριθµικής φάσης). Παραµονή καλλιέργειας στον πάγο για 10 min για να σταµατήσει η ανάπτυξη των κυττάρων. Φυγοκέντρηση στα 9000 g για 10 min και συλλογή κυττάρων. Αιώρηση κυττάρων σε 5ml (1/2 του αρχικού όγκου) CaCl mm. Παραµονή στον πάγο για 20 min. Φυγοκέντρηση στα 9000 g για 10 min για αποµάκρυνση τυχόν υπολειµµάτων θρεπτικού υλικού. Αιώρηση κυττάρων σε 1ml ( 1/10 του αρχικού όγκου) CaCl 2 50mM. Παραµονή στον πάγο για 45 min Τα κύτταρα είναι πλέον ικανά να δεχτούν το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο. Για κάθε δείγµα DNA χρησιµοποιούνται 200 µl επιδεκτικών κυττάρων. Τα κύτταρα χρησιµοποιούνται άµεσα και δεν µπορούν να αποθηκευτούν. 53

55 2.8 Εισαγωγή πλασµιδίου στα επιδεκτικά κύτταρα( µετασχηµατισµός ) Τα επιδεκτικά κύτταρα µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την εισαγωγή σε αυτά πλασµιδιακού DNA ( καθαρού ή προϊόντος κλωνοποίησης). Transformation σε TOP10 από αντίδραση λιγάσης Προστίθενται 10 µl από το µείγµα αντίδρασης λιγάσης σε επιδεκτικά κύτταρα TOP10 και παραµένουν στον πάγο για 30 λεπτά. Έπειτα τοποθετούνται στους 42 C για 1 λεπτό και κατευθείαν στον πάγογια 1 λεπτό. Γίνεται spin down. Προστίθενται 800 µl θρεπτικού υλικού TYM και τοποθετούνται στους 37 C µε ανάδευση για µία ώρα. Στη συνέχεια φυγοκεντρούνται στις rpm για 1 λεπτό και αφαιρείται το υπερκείµενο. Το ίζηµα ανασυστήνεται σε 100 µl ΤΥΜ και το µείγµα κυττάρων Eπιστρώνεται σε τρυβλίο µε LB άγαρ και το κατάλληλο αντιβιοτικό. Τα πλασµίδια προσδίδουν στα κύτταρα ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό, µε αποτέλεσµα οι αποικίες που εµφανίζονται στα τρυβλία να αποτελούνται µόνο από κύτταρα που περιέχουν τον πλασµιδιακό φορέα, ( µόνο του ή ανασυνδυασµένο). Τα κύτταρα στα οποία δεν εισήλθε το πλασµίδιο δεν παρουσιάζουν ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό και εποµένως δεν αναπτύσσονται. 2.9 Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA (mini prep) Η αποµόνωση του πλασµιδιακού DNA (mini-prep) έγινε µε τη χρήση του Plasmid DNA Purification kit της Macherey. Η διαδικασία έχει ως εξής (Plasmid DNA Purification User Manual, Macherey-Nagel 2005). Εµβολιασµός 3 ml θρεπτικού υλικού LB, παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού, µε µία αποικία µετασχηµατισµένων κυττάρων. Η καλλιέργεια αναδεύεται στους 37 C µέχρι την επόµενη µέρα. Η διαδικασία αυτή γίνεται για πολλές αποικίες ώστε να ελεγχθεί ποια περιέχει το πλασµίδιο µε το DNA insert που επιθυµούµε. (Περίπου 20 αποικίες). Την επόµενη µέρα τοποθετείται 1.5 ml από κάθε υγρή καλλιέργεια σε eppendorfs και γίνεται spin down για 1 λεπτό. 54

56 Αφαιρείται το υπερκείµενο και προστίθενται στο ίζηµα 50 µl διαλύµατος Α1(50 mmtris/10mm EDTA ph 8). Γίνεται ένα σύντοµο vortex. Λύση των κυττάρων µε προσθήκη 100 µl διαλύµατος Α2( 0.2Μ NaOH, 1% SDS) και ήπια ανάδευση. Το µείγµα µε ανάδευση και παραµένει για 5 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Εξουδετέρωση της βάσης µε προσθήκη 100 µl διαλύµατος Α3 ( 3Μ KoAc, ph=5.5 ) και ήπια ανάδευση. Γίνεται φυγοκέντρηση για 1-2 και λαµβάνεται µε προσοχή το υπερκείµενο. Στο υπερκείµενο προστίθεται 100% EtOH και τοποθετείται στους 20 C για 5 λεπτά περίπου ώστε να κατακρηµνιστεί το DNA. Γίνεται φυγοκέντρηση και στη συνέχεια αφαιρείται το υπερκείµενο που περιλαµβάνει την αιθανόλη. Στεγνώνει το ίζηµα και προστίθενται 20 µl ddh 2 O για να γίνει ανασύσταση του ιζήµατος. Γίνεται έλεγχος των δειγµάτων σε gel αγαρόζης Υπερέκφραση γονιδίων στο σύστηµα pet Το σύστηµα pet της Novagen αποτελεί ένα από τα καλύτερα συστήµατα για την κλωνοποίηση και την έκφραση ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών στα E.coli, εξασφαλίζοντας υψηλά επίπεδα έκφρασης και αυστηρό έλεγχο στο βασικό επίπεδο της µετάφρασης. Το γονίδιο στόχος κλωνοποιείται στο πλασµίδιο pet κάτω από τον έλεγχο του προαγωγέα από τον Τ7 βακτηριοφάγο, ενώ η επαγωγή της έκφρασης γίνεται από την Τ7 RNA πολυµεράση, η οποία είναι τόσο επιλεκτική και δραστική ώστε το σύνολο σχεδόν των αποθεµάτων του κυττάρου να µετατρέπονται σε προϊόν έκφρασης του γονιδίου στόχου. 55

57 Σύστηµα έκφρασης pet Αρχικά τα ανασυνδυασµένα πλασµίδια µετασχηµατίζονται σε κύτταρα ξενιστές που δεν περιέχουν το γονίδιο της T7 πολυµεράσης (XL1 ή TOP10), έτσι ώστε το γονίδιο στόχος να είναι ανενεργό και εποµένως να µην προκαλέσει αστάθεια του πλασµιδίου λόγω της παραγωγής πρωτεϊνών, τοξικών για το κύτταρο. Στη συνέχεια γίνεται µεταφορά του ανασυνδυασµένου πλασµιδίου σε βακτηριακά στελέχη τα οποία περιέχουν στο χρωµόσωµα τους ένα αντίγραφο του γονιδίου της Τ7 RNA πολυµεράσης (λde3 λυσογόνο), το οποίο βρίσκεται κάτω από τον έλεγχο του lacuv5 προαγωγέα και έκφραση του επάγεται µε την προσθήκη του ισοπρόπυλ-β-d-1- θείογαλακτοπυραζονιδίου ( IsoPropyl-β-D-1-ThioGalactopyranoside, IPTG ) Στην περίπτωση των λde3 λυσογόνων, λόγω της ύπαρξης του lacuv5 προαγωγέα, µπορεί να επιτευχθεί µεταγραφή του γονιδίου της Τ7 RNA πολυµεράσης και η έκφραση γονιδίων που τα προϊόντα τους δεν είναι τοξικά για την ανάπτυξη των κυττάρων, χωρίς την προσθήκη του IPTG. Όταν όµως απαιτείται αυστηρότερος έλεγχος, τότε χρησιµοποιούνται κύτταρα ξενιστές που περιέχουν το πλασµίδιο plyss ή plyse. Τα πλασµίδια αυτά παράγουν σε µικρά και µεγάλα ποσά την Τ7 λυσοζύµη η οποία είναι φυσικός καταστολέας της Τ7 RNA πολυµεράσης. Ακόµη αυστηρότερος έλεγχος της µεταγραφής από την Τ7 RNA πολυµεράση επιτυγχάνεται µε τη χρησιµοποίηση του Τ7 lac προαγωγέα ο οποίος περιλαµβάνει µια ακολουθία 25 bp του lac χειριστή µετά από την περιοχή των 17 bp του T7 προαγωγέα. Ο lac καταστολέας δεσµεύεται στην περιοχή του χειριστή ελαττώνοντας σηµαντικά τη µεταγραφή από την T7 RNA πολυµεράση. Με τη προσθήκη του IPTG επάγεται τόσο η έκφραση του γονιδίου της T7 RNA πολυµεράσης, όσο και η έκφραση του κλωνοποιηµένου στο pet γονιδίου. 56

58 2.11 Έκφραση και καθαρισµός πρωτεϊνών µε ουρά 6 ιστιδινών( His-tag) Η έκφραση πρωτεϊνών µε ουρά 6 ιστιδινών (His-tag) έχει το πλεονέκτηµα της εύκολης αποµόνωσης και καθαρισµού των πρωτεϊνών µε στήλες αγχιστείας. Το Histag µπορεί στη συνέχει να αποµακρυνθεί, κόβοντας ειδικά µε κάποια πρωτεϊνάση, αν και συνήθως δεν υπάρχει λόγος, καθώς δεν παρεµποδίζει τη δοµή και τη λειτουργία των πρωτεϊνών. Η στήλη αγχιστείας που χρησιµοποιείται από σφαιρίδια Ni-ΝΤΑ (Νickel-NitriloTriAcetic acid), δηλαδή σφαιρίδια που φέρουν στο πλέγµα τους παγιδευµένα ιόντα νικελίου. Τα ιόντα αυτά δεσµεύουν τις πρωτεΐνες µε His-tag σχηµατίζοντας ενώσεις συναρµογής. Η έκφραση των πρωτεϊνών γίνεται στο σύστηµα pet ( Παράγραφος 4.10 ) µε χρήση του πλασµιδίου pet29c. Η διαδικασία της έκφρασης και του καθαρισµού αναλυτικά έχει ως εξής: Βακτηριακά κύτταρα BL21(DE3), που έχουν µετασχηµατιστεί µε το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο pet29c, απλώνονται σε τρυβλία µε θρεπτικό υλικό dyt/ άγαρ που περιέχει καναµυκίνη (50µg/ml ) και επωάζονται για 16 ώρες στους 37 C. Εµβολιασµός 50 ml υγρού θρεπτικού υλικού dyt, που περιέχει καναµυκίνη, µε µια αποικία η οποία επιλέγεται από το τρυβλίο. Επώαση της καλλιέργειας υπό ανάδευση στις 16 ώρες στους 37 C. Εµβολιασµός 1,5 lt θρεπτικού υλικού dyt, που περιέχει καναµυκίνη, µε 10 ml από την προηγούµενη καλλιέργεια. Ανάπτυξη της καλλιέργειας µε ισχυρή ανάδευση στους 37 C µέχρις ότου η απορρόφηση του αιωρήµατος των κυττάρων στα 600 nm φτάσει στο 0.6. Προσθήκη 1 mm IPTG και συνέχεια της επώασης στους 37 C για 3 ώρες Συλλογή κυττάρων µε φυγοκέντρηση στα 6000 rpm ( 4500 g ) για 20 min σε κεφαλή Beckman JA Ακολουθεί ο καθαρισµός της πρωτεΐνης µε το His-tag.Τα διαλύµατα που χρησιµοποιούνται φαίνονται παρακάτω: 57

59 ιάλυµα λύσης κυττάρων Tris-HCl, ph=8 50mM NaCl 600mM Iµιδαζόλιο 2.5mM ιάλυµα πλύσης Tris-HCl, ph=8 NaCl ιµιδαζόλιο 50mM 600mM 5mM ιάλυµα έκλουσης Tris-HCl, ph=8 NaCl ιµιδαζόλιο 50mM 600mM 250mM Αιώρηση των κυττάρων σε διάλυµα λύσης. Λύση των κυττάρων µε υπερήχους, 6 φορές των 20 s, ενώ ενδιάµεσα µεσολαβεί µια παύση 40 s σε παγόλουτρο ώστε να αποφεύγεται η υπερθέρµανση Φυγοκέντρηση στα rpm για 20 min και λήψη του υπερκείµενου εκχυλίσµατος των πρωτεϊνών. Εξισορρόπηση στήλης Ni-NTA µε το διάλυµα λύσης. ανάµειξη του εκχυλίσµατος των πρωτεϊνών µε την εξισορροπηµένη στήλη. Ανάδευση για 2 ώρες στους 4 C ώστε να επιτευχθεί η δέσµευση της πρωτεΐνης µε το His-tag στη στήλη. Φυγοκέντρηση στα rpm για 1 min, ώστε να κατακαθίσουν τα σφαιρίδια και λήψη του υπερκείµενου( πρωτεΐνες που δεσµεύθηκαν) Πλύση της στήλης 3-5 φορές µε διάλυµα πλύσης για 10 min η κάθε µία, στους 4 C υπό ανάδευση. Φυγοκέντρηση στα rpm για 1 min και λήψη του υπερκείµενου ( πρωτεΐνες χαλαρά δεσµευµένες στη στήλη) Έκλουση των δεσµευµένων πρωτεϊνών 2-3 φορές µε διάλυµα έκλουσης για 10 min η κάθε µία, στους 4 C υπό ανάδευση. 58

60 2.12 Έλεγχος βιοτινυλίωσης µε τη µέθοδο Dot- Blot Η διαδικασία που ακολουθείται για τον έλεγχο της βιοτινυλίωσης είναι η εξής: Επίσταξη δείγµατος πρωτεϊνών αρνητικού και θετικού control σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης. Συνήθεις απαιτούµενες διαστάσεις της µεµβράνης είναι 7cm X 2cm. Για θετικό control χρησιµοποιούµε 10 µl κάποιας βιοτυνιλιωµένης πρωτεΐνης. Επώαση σε 10 ml διαλύµατος κορεσµού( blocking solution), 10% w/v σκόνη γάλακτος σε TBS για µια ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. Τρεις πλύσεις ενός λεπτού σε θερµοκρασία δωµατίου µε περίπου 10 ml TBS- T η καθεµία. Επώαση µε «αντίσωµα» (στρεπταβιδίνη συζευγµένη µε αλκαλική φωσφατάση) αραιωµένο σε διάλυµα 5% w/v σκόνη γάλακτος σε TBS, περίπου 1:2000, για 2-2,5 ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου. Τρεις πλύσεις των 5 λεπτών θερµοκρασία δωµατίου µε 10 ml TBS-T η καθεµία. Γρήγορο ξέπλυµα µε διάλυµα αλκαλικής φωσφατάσης. Επώαση µε 10 ml διάλυµα αλκαλικής φωσφατάσης και 30 µl BCIP/ 30 µl ΝΒΤ Για να σταµατήσει η χρωµοαντίδραση η µεµβράνη ξεπλένεται µε δις απεσταγµένο νερό και φυλάσσεται σε σκοτεινό χώρο. 59

61 2.13 Επαναδιάταξη δυο σταδίων πρωτεϊνών για τη δηµιουργία δισουλφιδικών δεσµών Προετοιµασία και διαλυτοποίηση των έγκλειστων σωµατίων (inclusion bodies) Τα κύτταρα λύθηκαν µε την βοήθεια υπερήχων σε διάλυµα λύσης που περιείχε 4 M urea, 0.1 M NaCl, 0.02 M tris-hcl, ph 8.0, 5 mm EDTA και φυγοκεντρήθηκαν στις στροφές στουw 4 C 0 για 20 λεπτά. Στη συνέχεια αποχύθηκε το υπερκείµενο και στο ίζηµα επαναλήφθηκε η διαδικασία λύσης άλλες τρεις φόρες. Τέλος το ίζηµα επωάστηκε στους 4 C 0 για περίπου 12 ώρες σε διάλυµα λύσης 4 M urea, 0.1 M NaCl, 0.02 M tris-hcl, ph 8.0, 5 mm EDTA 5 mm dithiothreitol και συλλέχτηκε µόνο το υπερκείµενο που περιείχε διαλυµένη την πρωτεΐνη. Επαναδιάταξη δύο σταδίων 1 0 στάδιο σχηµατισµού δισουλφιδικών των µονοµερών Οι πρωτεΐνη µετά τη διαλυτοποίηση τοποθετείται για 24 ώρες στο πρώτο διάλυµα επαναδιάταξης το οποίο περιέχει 100mM Tris/HCL 5 mm EDTA 1M L-arginine ph µμ GSSG 100 µμ GSH 200 µg/ml BMP2 60

62 Στη συνέχεια ακολουθεί διαπίδυση για 12 ώρες σε διάλυµα Tris/HCL ph 8.3 µε σκοπό την αποµάκρυνση του οξειδοαναγωγικού ζεύγους (GSSG/GSH) 2 0 στάδιο σχηµατισµού δισουλφιδικών των διµερών Σε αυτό το στάδιο χωρίζουµε το διάλυµα µε την πρωτεΐνη µας σε δύο µέρη και το στο πρώτο προσθέτουµε 5 mm EDTA 1M L-arginine 25 µμ GSSG και το αφήνουµε στην ανάδευση για 3 ώρες. Στη συνέχεια ακολουθεί διαπίδυση για 30 ώρες σε διάλυµα Tris/HCL ph 8.3. Μετά τις 30 ώρες προσθέτουµε και το δεύτερο ήµισυ που είχαµε κρατήσει στην αρχή και τα επωάζουµε για µία ώρα µε τελικό σκοπό το σχηµατισµό διµερών. Εικόνα 7 ιαγραµµατική απεικόνιση της διαδικασίας επαναδιάταξης δυο σταδίων 61

63 2.14 Καθαρισµός πρωτεϊνών µε χρήση στήλης αγχιστείας- ηπαρίνης Προκειµένου να χρησιµοποιήσουµε τη στήλη ηπαρίνης ζυγίζουµε τόση στήλη ώστε η χωρητικότητα ( ικανότητα πρόσδεσης) να υπερβαίνει τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης που θέλουµε να καθαρίσουµε. Συγκεκριµένα για την στήλη Heparin Sepharose CL- 6B 1 g ξηράς µορφής όταν ενυδατωθεί οδηγεί στη παραγωγή 4-5 ml gel στήλης. Επίσης η συγκέντρωση της ηπαρίνης είναι περίπου 10 mg/ml gel και η ικανότητα πρόσδεσης για την BMP2 περίπου 3mg/ml gel. Οπότε τα βήµατα που ακολουθούµε είναι τα εξής: Ζυγίζουµε την επιθυµητή ποσότητα ηπαρίνης (ξηρή µορφή) Την ενυδατώνουµε µε αποσταγµένο νερό και αφήνουµε το gel να φουσκώσει (-4 C 0 ) Όταν το gel φουσκώσει είναι έτοιµο να τοποθετηθεί στην στήλη διήθησης Εξισορροπούµε τρεις φορές την στήλη µε το διάλυµα που βρίσκεται διαλυµένη η πρωτεΐνη µας (π.χ Tris-HCl p.h 8.3) Φορτώνουµε την πρωτεΐνη στην στήλη Ακολουθεί έκλουση της πρωτεΐνης µε διάλυµα αυξανόµενης συγκέντρωσης (gradient) κάποιου ανταγωνιστικού παράγοντα όπως NaCl, KCl, (NH 4 ) 2 SO Έλεγχος για τη βιολογική δραστικότητα της BMP2 Ο έλεγχος της δραστικότητας της BMP2 αναλύθηκε από την επαγωγή της αλκαλικής φωσφατάσης (AP) σε οδοντικά µεσεγχυµατικά κύτταρα (Dental pulp stem cells DPSCs). Τα DPSCs αναπτύχθηκαν σε DMEM (1Χ) και 10% FBS στους 37 C 0 και 5% CO2 για µια νύχτα. Μετά την προσκόλληση των κυττάρων αντικαθίσταται το θρεπτικό υλικό µε αντίστοιχο που περιέχει την BMP2(1µg/ml). Το θρεπτικό υλικό αντικαθίσταται κάθε 2-3 ηµέρες. Μετά από τουλάχιστον 14 ηµέρες αποµακρύνουµε το θρεπτικό και κάνουµε πλύσεις µε PBS. Στη συνέχεια στερεώνουµε τα κύτταρα µε 4% παραφορµαλδεϋδη διαλυµένη σε PBS για 5-10 λεπτά. Στη συνέχεια κάνουµε τρεις πλύσεις µε PBS. Έπειτα προσθέτουµε τα NBT σε διάλυµα (100 mm Tris ph 8.5, 100 mm NaCl, 50 mm MgCl 2 ) και τα προσθέτουµε στα κύτταρα 30 λεπτά έως 12 ώρες σε σκοτεινό µέρος. 62

64 ΣΚΟΠΟΣ Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η διαδικασία προσθήκης ενός µορίου βιοτίνης στην ανθρώπινη πρωτεΐνη BMP2 µε τελικό σκοπό την πρόσδεσή της τελευταίας σε νανοεπιφάνειες για εφαρµογές στο πεδίο της Μηχανικής των Ιστών (tissue enginnering). Η βιοτίνη παρέχει ισχυρά πλεονεκτήµατα που την καθιστούν ελκυστικό υποψήφιο για σήµανση των πρωτεϊνών. Καταρχάς το µικρό µοριακό της βάρος (MW = ) δεν παρεµποδίζει τις χηµικές και βιολογικές λειτουργίες των πρωτεϊνών και επιπλέον η βιοτίνη συνδέεται ισχυρά και µεγάλη επιλεκτικότητα µε την στρεπταβιδίνη γεγονός που µας προσφέρει πολλά πλεονεκτήµατα στον εντοπισµό αλλά και την προσκόλληση της βιοτινυλιωµένης πρωτεΐνης σε επιφάνειες µε καλυµµένες µε στρεπταβιδίνη. 63

65 64 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

66 Υπερέκφραση της GFP πρωτεΐνης σε βακτηριακά στελέχη E.coli Αρχικά προκειµένου να βελτιστοποιήσουµε τη διαδικασία της βιοτινυλίωσης εργαστήκαµε µε την βιοτυνιλίωση της GFP(Green Fluorescence Protein) πρωτεΐνης η οποία χρησιµοποιείται σαν µάρτυρας σε διάφορες βιοτεχνολογικές εφαρµογές. Το γονίδιο της GFP το οποίο ήταν κλωνοποιηµένο στον πλασµιδιακό φορέα pan5 εισήχθει σε βακτηριακά βακτηριακά στελέχη E.coli AV101 και E.coli BL21. Στη συνέχεια ακολούθησε υπερέκφραση µε την χρήση IPTG σε υγρές καλλιέργειες (επαγωγέας της έκφρασης του γονιδίου της Τ7RNA πολυµεράσης) στους 37 C για 3 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν, λύθηκαν µε τη βοήθεια υπερήχων και εξετάστηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου. E.coli AV E.coli BL GFP 29 kda GFP 29 kda Εικόνα 8. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου. 1 : πρωτεΐνες πριν την υπερέκφραση. 2: πρωτεΐνες µετά την υπερέκφραση 65

67 Καθαρισµός της GFP πρωτεΐνης µε στήλη αγχιστείας νικελίου Στο επόµενο στάδιο ακολούθησε καθαρισµός και αποµόνωση της GFP µε χρήση στήλης αγχιστείας νικελίου και τα αποτελέσµατα εξετάστηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου GFP 29 kda Εικόνα 9 Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου. 1 : πρωτεϊνικοί µάρτυρες. 2: πρωτεΐνες που δε δεσµεύτηκαν στη στήλη (flowthrough).3: GFP πρωτεΐνη. 66

68 Έλεγχος βιοτινυλίωσης της GFP µε τη µέθοδο dot blot Στη συνέχεια ο έλεγχος βιοτυνιλίωση έγινε µε τη µέθοδο του dot blot µε επίσταξη σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης θετικού control ( βιοτινυλιωµένη GFP), αρνητικού control (µη βιοτινυλιωµένη πρωτεΐνη SRPK)και της δικής µας GFP. Τα αποτελέσµατα έδειξαν µια σηµαντική αύξηση στα επίπεδα της βιοτινυλίωσης µε την χρήση των BL21 κυττάρων. GFP πρωτεΐνη σε E.coli AV101 βακτηριακά στελέχη Θετικό control Αρνητικό control Βιοτινυλιωµένη GFP GFP πρωτεΐνη σε E.coli BL21 βακτηριακά στελέχη Θετικό control Αρνητικό control Βιοτινυλιωµένη GFP 67

69 Κλωνοποίηση του γονιδίου της BMP2 Κλωνοποίηση του γονιδίου της BMP2 στο πλασµίδιο pan5 Προκειµένου να ενισχύσουµε το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη BMP2, πραγµατοποιήθηκε αλυσιδωτή αντίδρασης πολυµεράσης (PCR). Ως εκµαγείο χρησιµοποιήθηκε το cdna του γονιδίου της BMP2 κλωνοποιηµένο στο πλασµίδιο pentr221 (ARIZONA STATE UNIVERSITY). Χρησιµοποιήθηκαν εξειδικευµένοι εκκινητές, µε αποτέλεσµα να προκύψει το επιθυµητό προϊόν (bmp2 γονίδιο) το οποίο διαθέτει στα άκρα του τις αλληλουχίες που αναγνωρίζουν τα περιοριστικά ένζυµα Xhol (5 άκρο) και HindIII(3 άκρο). Συγκεκριµένα οι εκκινητές που χρησιµοποιήθηκαν είναι οι ακόλουθοι Εκκινητής up 5 -CCCGC C-TC GAG CAA GCC AAA CAC AAA CAG CGG AAA CG- 3 Xhol Εκκινητής low 5 -CCGC A-AG CTT CTA GCG ACA CCC ACA ACC CTC C-3 HindIII Με κόκκινο χρώµα φαίνεται η θέση αναγνώρισης της Xhol ενώ µε πράσινο της Hind Τα βέλη υποδεικνύουν τη θέση κοπής.το προϊόν που προέκυψε από την αλυσιδωτή αντίδρασης πολυµεράσης διαχωρίστηκε µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης (1%).Τα αποτελέσµατα της ηλεκτροφόρησης έγιναν ορατά σε υπεριώδη ακτινοβολία (UV) 68

70 Η εικόνα της ηλεκτροφόρησης έδειξε την ενίσχυση ενός προϊόντος το οποίο αντιστοιχεί στην ευδιάκριτη ζώνη των 350 bp, η οποία συµπίπτει µε την αναµενόµενη ζώνη του bmp2 γονιδίου bp 350 bp BMP2 Εικόνα 10: Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1%. διαδροµή 1: DNA µάρτυρας, διαδροµή 2: αρνητικό control,διαδροµή 3: PCR προϊόν( Bmp2 γονίδιο). Στη συνέχεια το αυτό το επιθυµητό τµήµα εκχυλίστηκε από την αγαρόζη ακολουθώντας το πρωτόκολλο καθαρισµού του Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen. Τα προϊόντα που εξήχθησαν από την πηκτή, χρησιµοποιήθηκαν για την πραγµατοποίηση της ενσωµάτωσης του γονιδίου στον πλασµιδιακό φορέα pan5.το προϊόν της αντίδρασης PCR( γονίδιο της Bmp2),µετά το καθαρισµό του από την πηκτή αγαρόζης, επωάστηκε µε τα ένζυµα περιορισµού Xhol και HindIII, οι θέσεις αναγνώρισης των οποίων βρίσκονταν στα δύο άκρα του γονιδίου. Η επώαση έγινε στους 37 C για 3 ώρες και ο καθαρισµός από τα ένζυµα και τα άλατα της αντίδρασης έγινε µε τη χρήση του Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen. 69

71 Ταυτόχρονα το πλασµίδιο pan5 επωάστηκε µε τα ίδια ένζυµα περιορισµού, Xhol και HindIII, προκειµένου να σχηµατιστούν συµπληρωµατικά άκρα. Η επώαση έγινε στους 37 C για 3 ώρες και προέκυψε γραµµικό κοµµάτι, το οποίο καθαρίστηκε µε το σύστηµα Qiaquick Gel Extraction Kit της Qiagen.Έπειτα έγινε εισαγωγή του αποµονωµένου γονιδίου της Bmp2 στον πλασµιδιακό φορέα pan5. Ο πλασµιδιακός φορέας pan5 προσφέρει την ικανότητα να εισάγει την στο Ν- τελικό άκρο της πρωτεΐνης στόχου (BMP2) το 14-µερές πεπτίδιο, απαραίτητο για την αναγνώριση από το ένζυµο λιγάση της βιοτίνης και την in vivo βιοτυνιλίωση. Για τη κλωνοποίηση του γονιδίου της Βmp2 στο πλασµίδιο pan5 χρησιµοποιήθηκε η Τ4 DNA λιγάση. Από το µίγµα της αντίδρασης λιγάσης χρησιµοποιήθηκαν 10 µl για µετασχηµατισµό βακτηριακών κυττάρων E.coli (TOP10).Για την ανάπτυξη των µετασχηµατισµένων κυττάρων πραγµατοποιήθηκε επίστρωση και επώαση στους 37 C σε τρυβλία LB άγαρ µε το αντιβιοτικό αµπικιλλίνη σε τελική συγκέντρωση 0,1 mg/ml. Εφόσον το πλασµίδιο pan5 προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό αµπικιλλίνη, οι αποικίες που θα αναπτυχθούν παρουσία αυτού του αντιβιοτικού θα είναι αποκλειστικά εκείνες που έχουν προσλάβει το επιθυµητό πλασµίδιο. Στη συνέχεια, από 20 τυχαίες αποικίες που επιλέχθηκαν από το τρυβλίο πραγµατοποιήθηκε αποµόνωση του πλασµιδιακού DNA σε µικρή κλίµακα (minipreps) Για να επιβεβαιωθεί η ύπαρξη του γονιδίου της BMP2 στο πλασµίδιο pan5 (θετικοί κλώνοι) ακολούθησε επώαση του πλασµιδιακού DNA που πρόεκυψε από τις 20 αποικίες µε τα ένζυµα περιορισµού Xhol και HindIII για µία ώρα στους 37 C. Μετά την ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της πέψης και έκθεση της πηκτής σε υπεριώδη ακτινοβολία, σε 2 από τις 20 τυχαία επιλεγµένες αποικίες, προέκυψε µία ζώνη µεγέθους περίπου 4,2 kb που αντιστοιχεί στον πλασµιδιακό φορέα pan5 και µία ζώνη µεγέθους περίπου 350 bp, που αντιστοιχεί στο γονίδιο bmp2 µε το δεκατετραπεπτίδιο που σηµαίνει ότι το γονίδιο της BMP2 κλωνοποιήθηκε επιτυχώς στο pan5 σε αυτές τις αποικίες. 70

72 bp pan5 350 bp BMP2 Εικόνα 11:Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1%. 1: DNA µάρτυρας., 2,3,4,5,6: προϊόντα πέψης. Από τις παραπάνω αποικίες θετικές είναι µόνο οι αποικίες στις διαδροµές 5 και 6. 71

73 Κλωνοποίηση της BMP2 στον πλασµιδιακό φορέα pet29c Στη συνέχεια ακολούθησε η διαδικασία κλωνοποίησης του bmp2 γονιδίου µαζί µε το 14- µερες πεπτίδιο στον πλασµιδιακό φορέα pet29c. Ο πλασµιδιακός φορέας pet29c παρέχει το πλεονέκτηµα ότι αντιγράφεται µε µεγαλύτερο ρυθµό (high copy) σε σχέση µε τον pan5 ( low copy πλασµίδιο) οπότε θα εξασφαλίσουµε µεγαλύτερη ποσότητα BMP2 πρωτεΐνης. Γι αυτό το σκοπό ακολούθησε αλυσιδωτή αντίδρασης πολυµεράσης µε ειδικούς εκκινητές για την ενίσχυση του bmp2 γονιδίου ενωµένου µε το την αλληλουχία που αντιστοιχεί στο 14 µερές πεπτίδιο µε εκµαγείο το πλασµίδιο pan5στο οποίο είχε κλωνοποιηθεί επιτυχώς το bmp2 γονίδιο. Οι εκκινητές που χρησιµοποιήθηκαν για αυτόν τον σκοπό είναι οι ακόλουθοι: Εκκινητής up 5 CCGC CAT ATG TCC GGC CTG AAC GAC ATC TTC G-3 Ndel site Εκκινητής low 5 - CCGC GGA TCC CTA GTG ATG GTG ATG GTG ATG GCG ACA CCC ACA ACC CTC C -3 BamHI site His-tag Stop codon BMP2+ 14pt 400 bp Εικόνα 12: Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1%. 1: DNA µάρτυρας. 2 : αρνητικό control,διαδροµή,3: PCR προϊόν. Με το βέλος σηµειώνεται το προϊόν που αντιστοιχεί στο γονίδιο της Bmp2 µαζί µε το 14-µερές πεπτίδιο και τις αλληλουχίες που αναγνωρίζουν τα περιοριστικά ένζυµα Ndel και BamHI. 72

74 Στη συνέχεια ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία όπως και στο pan5 για την κλωνοποίηση στον πλασµ µιδιακό φορέα pet29c. Στο τελικό στάδιο πάλι από 20 τυχαίες αποικίες που επιλέχθηκαν από το τρυβλίο πραγµατοποιήθηκε αποµόνωση του πλασµιδιακού DNA σε µικρή κλίµακα (minipreps), κοπές µε τα περιοριστικά ένζυµα Ndel και BamHI και ηλεκροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1%. Μετά την ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της πέψης και έκθεση της πηκτής σε υπεριώδη ακτινοβολία, σε 2 από τις 20 τυχαία επιλεγµένες αποικίες, προέκυψε µία ζώνη µεγέθους περίπου 5,3kb που αντιστοιχεί στον πλασµιδιακό φορέα pετ29c και µία ζώνη µεγέθους περίπου 400 bp, που αντιστοιχεί στο γονίδιο bmp2 µε το δεκατετραπεπτίδιο που σηµαίνει ότι το γονίδιο της BMP2 κλωνοποιήθηκε επιτυχώς στο pan5 σε αυτές τις αποικίες bp pet29c 400 bp BMP2 Εικόνα 12:Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1%. 1: DNA µάρτυρας. 2,3,4,5: προϊόντα πέψης. Από τις παραπάνω αποικίες θετικές είναι µόνο οι αποικίες στις διαδροµές 2 και 4. 73

75 Υπερέκφραση της BMP2 πρωτεΐνης σε βακτηριακά στελέχη Ε.Coli Η υπερέκφραση της BMP2 πρωτεΐνης πραγµατοποιήθηκε σε κύτταρα BL21.Σε αυτά εισήχθη το πλασµίδιο pet29c που περιείχε το επιθυµητό γονίδιο καθώς και το πλασµίδιο pbiracm που παράγει το ένζυµο λιγάση της βιοτίνης. Τα κύτταρα παρουσιάζουν ανθεκτικότητα στη χλωροαµφαινικόλη λόγω του πλασµιδίου pbiracm που περιέχουν και µε την εισαγωγή του πλασµιδίου pet29c αποκτούν ανθεκτικότητα και στην καναµυκίνη. Έτσι απλώθηκαν σε τρυβλία µε θρεπτικό υλικό dyt και άγαρ παρουσία των αντιβιοτικών καναµυκίνη (100µg/ml) και χλωροαµφαινικόλη (10µg/ml) και επωάστηκαν στους 37 C για ώρες. Στη συνέχεια ακολούθησε υπερέκφραση µε την χρήση IPTG σε υγρές καλλιέργειες BL21 (επαγωγέας της έκφρασης του γονιδίου της Τ7RNA πολυµεράσης) στους 37 C για 3 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν, λύθηκαν µε τη βοήθεια υπερήχων και εξετάστηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου KD (διµερήή ΒMP2) 12 KD (µονοµ µερή BMP2) Εικόνα 14: Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου. 1: πρωτεϊνικοί µάρτυρες. 2,4 : πρωτεΐνες πριν την υπερέκφραση. 3,5: πρωτεΐνες µετά την υπερέκφραση 74

76 Επαναδιάταξη της BMP2 και αποµόνωση των διµερών µε στήλη ηπαρίνης Στο επόµενο στάδιο ακολούθησε διαδικασία επαναδιάταξης και δηµιουργίας των δισουλφιδικών δεσµών µε τελικό στόχο τη δηµιουργία του τελικού λειτουργικού διµερούς της BMP2. Στη συνέχεια έγινε αποµόνωση των διµερών της BMP2 µε στήλη ηπαρίνης η οποία παρουσιάζει αγχιστεία για την BMP2 και ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου KD (διµερή ΒMP2) 35KD (διµερή ΒMP2) Εικόνα 13. Ννν 12 KD (µονοµερή BMP2) Εικόνα 14. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου. 1: πρωτεϊνικοί µάρτυρες. 2: BMP2 µετά την επαναδιάταξη. 3,4,5 : BMP2 µετά τον καθαρισµό µε στήλη ηπαρίνης. 75

77 Στη συνέχεια ακολούθησε προσέγγιση της ποσοτικοποίηση των αποτελεσµάτων µε την χρήση του λογισµικού προγράµµατος GelPro3 και η σχηµατική απεικόνισή τους σε διάγραµµα. Όπως παρατηρήθηκε ο λόγος διµερών/µονοµερών πριν την επαναδιάταξη ήταν περίπου 2/5 ενώ µετά την επαναδιάταξη διαµορφώθηκε περίπου στο 3/2. Έτσι η επαναδιάταξη βοήθησε στη δηµιουργία των λειτουργικών διµερών µορίων της BMP Διμερή BMP2 πριν την αναδιάταξη Μονομερή BMP2 πριν αναδιάταξη 2 Διμερή BMP2 μετά την αναδιάταξη Μονομερή BMP2 μετά την αναδιάταξη Πίνακας 2. ιαγραµµατική απεικόνιση της ποσότητας των διµερών και µονοµερών της πρωτεΐνης BMP2, πριν και µετά τη διαδικασία της επαναδιάταξης. 76

78 Έλεγχος βιοτινυλίωσης της BMP2 µε τη µέθοδο dot blot Ο έλεγχος της βιοτινυλίωσης της BMP2 έγινε µε τη µέθοδο του dot blot µε επίσταξη σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης θετικού control ( βιοτινυλιωµένη GFP), αρνητικού control (µη βιοτινυλιωµένη πρωτεΐνη SRPK)και της BMP2. Μετά ακολούθησε επώαση µε αντίσωµα στρεπταβιδίνης (συνδέεται µε την βιοτίνη) συζευγµένης µε αλκαλική φωσφατάση. Στη συνέχεια ακολούθησε επώαση µε διάλυµα αλκαλικής φωσφατάσης και BCIP/NBT. Το αποτέλεσµα της χρωµοαντίδρασης που ακολούθησε έδειξε επιτυχία στην διαδικασία της βιοτινυλίωσης της BMP2. Θετικό control Αρνητικό control Βιοτινυλιωµένη BMP2 Εικόνα 14. Έλεγχος βιοτινυλίωσης µε τη µέθοδο dot blot. Για θετικό control χρησιµοποιήθηκε βιοτινυλιωµένη πρωτεΐνη GFP και για αρνητικό η SRPK πρωτεΐνη.. 77

79 Έλεγχος λειτουργικότητας της BMP2 µε τη µέθοδο της αλκαλικής φωσφατάσης Τέλος o έλεγχος της λειτουργικότητας της BMP2 έγινε µε τη µέθοδο της αλκαλικής φωσφατάσης. ηλαδή ελέγχτηκε η δυνατότητα της BMP2 να επάγει την παραγωγή αλκαλικής φωσφατάσης σε µεσεγχυµατικά κύτταρα οδοντικού πολφού. Όντως µετά από 14 ηµέρες επώασης µε BMP2 (1µg/ ml ) παρατηρήθηκε στα κύτταρα το χαρακτηριστικό µωβ χρώµα µετά από επώαση µε BCIP/NBT για λεπτά. Γενικά όσο πιο έντονο είναι το µωβ χρώµα τόσο µεγαλύτερη είναι η δραστικότητα της αλκαλικής φωσφατάσης και της λειτουργικότητας της πρωτεΐνης. A B C D Εικόνα 15.Έλεγχος αλκαλικής φωσφατάσης. A, C: Μεσεγχυµατικά κύτταρα µετά από 14 µέρες A)Αρνητικό control 10X µεγέθυνση C)Αρνητικό control 40Χ µεγέθυνση. Μεσεγχυµατικά κύτταρα µετά από 14 µέρες µε προσθήκη BMP2. B) 10X µεγέθυνση D) 40Χ µεγέθυνση. Το µωβ χρώµα είναι ενδεικτικό της παραγωγής της αλκαλικής φωσφατάσης και κατ επέκταση της δραστικότητας της BMP2 πρωτεΐνης. 78

80 Μετά από σύγκριση των αποτελεσµάτων της υπό έλεγχο BMP2 µε κύτταρα χωρίς χορήγηση BMP2 (αρνητικό αρνητικό control) και θετικό control (από από βιβλιογραφία) βιβλιογραφί επιβεβαιώθηκε η λειτουργικότητα της παραχθείσας βιοτινυλιωµένης BMP2 πρωτεΐνης. A B C Έντονη παρουσία αλκαλικής φωσφατάσης Εικόνα 16.Έλεγχος Έλεγχος λειτουργικότητας της BMP2 µε τη µέθοδο της αλκαλικής φωσφατάσης. φωσφατάσης A) Aρνητικό control (χωρίς προσθήκη BMP2). BMP B) Θετικό control (βιβλιογραφικό δεδοµένο). C) Με προσθήκη της υπό εξέτασης BMP2 79