ΜΠΣ: «ΙΑΤΡΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ: Σχεδιασµός και Ανάπτυξη Φαρµακευτικών Προϊόντων»

Transcript

1 ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΚΑΙ ΕΚΦΡΑΣΗ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΤΜΗΜΑΤΩΝ ΤΟΥ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ ΜΕ ΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΤΩΝ ΒΑΚΙΛΟΙΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗΣ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΜΥΑΣΘΕΝΕΙΑ. ECD TM Ενδοκυτταρική περιοχή ΜΠΣ: «ΙΑΤΡΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ: Σχεδιασµός και Ανάπτυξη Φαρµακευτικών Προϊόντων» Γεωργακάκη ιονυσία Πάτρα

2 Tριµελής επιτροπή: Καθηγητής Σωκράτης Τζάρτος, Τµήµα Φαρµακευτικής Πανεπιστήµιο Πατρών Επίκουρος καθηγητής Γιώργος Πατρινός, Τµήµα Φαρµακευτικής Πανεπιστήµιο Πατρών Επίκουρος καθηγητής Κώστας Πουλάς, Τµήµα Φαρµακευτικής Πανεπιστήµιο Πατρών - 2 -

3 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Για την ολοκλήρωση της παρούσας διπλωµατικής εργασίας χρειάστηκε η στήριξη και η συµβολή αρκετών ανθρώπων στους οποίους οφείλω ένα µεγάλο ευχαριστώ. Πρώτα από όλα, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ.σ.τζάρτο που µου έδωσε την ευκαιρία να ασχοληθώ µε ένα τόσο ενδιαφέρον θέµα και µε δέχτηκε στην ερευνητική του οµάδα στο Eλληνικό Iνστιτούτο Παστέρ καθώς και τα µέλη της τριµελούς επιτροπής κ.κ. Πουλά και κ.γ. Πατρινό. Άνθρωποι µε χρόνια εµπειρίας στο εργαστήριο µου παρείχαν την βοήθεια και τις γνώσεις τους, γι άυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Μάριο Ζουριδάκη, τον Χρήστο Στεργίου, τον Νικόλαο Τράκα, τον Πέτρο Γκιάστα και την κα. Άννα Kόκλα. Επίσης την οµάδα των µεταπτυχιακών φοιτητών του εργαστηρίου για την ευχάριστη ατµόσφαιρα που διατηρούσαν και την στήριξη τους την Ματούλα Κουτρουµπή, την Παναγιώτα Ευαγγελάκου και τον Λευτέρη Ζαρκάδα. Την οικογένεια µου που πάντα µε εµψύχωνε και το ίδρυµα Μποδοσάκη που µου παρείχε την υποτροφία των µεταπτυχιακών σπουδών. Το τελευταίο και ίσως το µεγαλύτερο ευχαριστώ το οφείλω στον µεταδιδακτορικό ερευνητή και άµεσα επιβλέποντα µου στο εργαστήριο Κωνσταντίνο Λαζαρίδη, ο οποίος µου µετέδωσε την εµπειρία του και χωρίς την πολύτιµη βοήθεια του η ερευνητική αυτή εργασία δεν θα είχε ολοκληρωθεί

4 ΠΕΡΙΕΧOΜΕΝA: 1 ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΟΣ ΥΠΟ ΟΧΕΑΣ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ H ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΤΩΝ ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΩΝ ΥΠΟ ΟΧΕΩΝ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ Η ΟΜΗ ΤΩΝ ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΩΝ ΥΠΟ ΟΧΕΩΝ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ H ΣΤΟΙΧΕΙΟΜΕΤΡΙΑ ΤΩΝ ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΩΝ ΥΠΟ ΟΧΕΩΝ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ Ο ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΟΥ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΟΥ ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΟΥ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΝΕΥΡΙΚΩΝ ΥΠΟ ΟΧΕΩΝ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΟΥ ΜΥΪΚΟΥ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ ΑΛΛΟΣΤΕΡΙΚΕΣ ΚΑΤΑΣΤΑΣΕΙΣ ΤΟΥ ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΟΥ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ ΥΠΟΚΑΤΑΣΤΑΤΕΣ ΠΟΥ ΠΡΟΣ ΕΝΟΝΤΑΙ ΣΤΟΝ ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΟ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΕΣ ΚΑΤΑΣΤΑΣΕΙΣ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΟΝ ΜΥΪΚΟ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ 16 2 BΑΡΙΑ ΜΥΑΣΘΕΝΕΙΑ ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑ ΡΟΜΗ ΠΑΘΟΓΕΝΕΣΗ ΤΗΣ ΜΥΑΣΘΕΝΕΙΑΣ ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΜΥΑΣΘΕΝΕΙΑΣ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΕΣ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗ ΜΥΑΣΘΕΝΕΙΑ ΣΥΓΧΡΟΝΕΣ ΘΕΡΑΠΕΙΕΣ ΘΕΡΑΠΕΙΕΣ ΣΕ ΚΛΙΝΙΚΟ ΣΤΑ ΙΟ ΣΤΟΧΟΙ ΤΗΣ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΥΛΙΚΑ KAI MEΘΟ ΟΙ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ AΝΑΛΩΣΙΜΑ AΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΕΝΑΡΚΤΗΡΙΑ ΜΟΡΙΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ AΛΥΣΙ ΩΤΗ ΑΝΤΙ ΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR) ΥΠΟΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΙΚΛΩΝΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ DNA ΣΕ ΠΛΑΣΜΙ ΙΑΚΟ ΦΟΡΕΑ ΑΠΟΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΓΡΑΜΜΙΚΟΥ ΠΛΑΣΜΙ ΙΑΚΟΥ DNA ΑΝΤΙ ΡΑΣΗ ΣΥΝ ΕΣΗΣ ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ ΤΗΝ ΧΗΜΙΚΗ ΜΕΘΟ Ο ΤΟΥ CACL I. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΕΚΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ ΧΡΗΣΗ CACL ΙΙ. ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΕΠΙ ΕΚΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΥΓΡΕΣ ΚΑΙ ΣΤΕΡΕΕΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΠΛΑΣΜΙ ΙΑΚΟΥ DNA ΣΕ ΜΙΚΡΗ ΚΛΙΜΑΚΑ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟ Ο ΤΗΣ ΑΛΚΑΛΙΚΗΣ ΛΥΣΗΣ ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΚΑΙ ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΕΙΓΜΑΤΟΣ DNA ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΝΑΣΥΝ ΥΑΣΜΕΝΟΥ ΒΑΚΙΛΟΪΟΥ P PLAQUE ASSAY ΓΙΑ ΤΗΝ ΤΙΤΛΟ ΟΤΗΣΗ ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝ ΥΑΣΜΕΝΟΥ ΒΑΚΙΛΟΪΟΥ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΤΩΝ ΑΝΑΣΥΝ ΥΑΣΜΕΝΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΑΠΟ ΥΠΕΡΚΕΙΜΕΝΟ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΣΥΓΓΕΝΕΙΑΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΙΗΘΗΣΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΥΠΟ ΑΠΟ ΙΑΤΑΚΤΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ( SDS-PAGE)

5 ΑΝΟΣΟΑΠΟΤΥΠΩΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ (WESTERN BLOTTING) ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΚΕΣ ΜΕΘΟ ΟΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗ ΜΕΘΟ ΟΣ BRADFORD ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΠΡΟΣ ΕΣΗ 125 Ι-Α-BGT ΣΤΙΣ ΑΝΑΣΥΝ ΥΑΣΜΕΝΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΣΕ ΙΑΛΥΜΑ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΣΤΗΛΩΝ ΑΝΟΣΟΠΡΟΣΡΟΦΗΣΗΣ ΜΕ ΑΝΑΣΥΝ ΥΑΣΜΕΝΑ ΠΕΠΤΙ ΙΑ ΚΑΙ ΑΝΟΣΟΠΡΟΣΡΟΦΗΣΗ ΑΝΤΙ-ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΑΠΟ ΟΡΟΥΣ ΜΥΑΣΘΕΝΩΝ ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΣ ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΣ ΤΟΥ ΠΛΑΣΜΙ ΙΟΥ PTRIEX-Β ΕΚΠ(WILD TYPE) ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΣ ΤΟΥ PTRIEX Β ΕΚΠ(CYS-LOOP) ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΣ ΤΟΥ PTRIEX -ΕΚΠ Β-Α ΈΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΝΑΣΥΝ ΥΑΣΜΕΝΩΝ ΠΕΠΤΙ ΙΩΝ Α-ΕΚΠ, Β-ΕΚΠ ΚΑΙ ΤΟΥ ΣΥΓΚΑΤΑΜΕΡΟΥΣ EΚΠ Β-Α ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ SF9 ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΙΚΡΗΣ ΚΛΙΜΑΚΑΣ ΜΕ ΣΤΟΧΟ ΤΗΝ ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕ ΩΝ ΕΚΦΡΑΣΗΣ (ΤIME COURSE ΠΕΙΡΑΜΑ) ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΑΝΑΣΥΝ ΥΑΣΜΕΝΩΝ ΠΕΠΤΙ ΙΩΝ Α-ΕΚΠ, Β-ΕΚΠ ΚΑΙ ΤΟΥ ΣΥΓΚΑΤΑΜΕΡΟΥΣ ΕΚΠ Β-Α ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ SF9 ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕΓΑΛΗΣ ΚΛΙΜΑΚΑΣ ΜΕ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΜΟΡΙΑΚΟΥ ΑΠΟΚΛΕΙΣΜΟΥ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΑΝΑΣΥΝ ΥΑΣΜΕΝΩΝ ΠΕΠΤΙ ΙΩΝ Α-ΕΚΠ, Β-ΕΚΠ ΚΑΙ ΤΟΥ ΣΥΓΚΑΤΑΜΕΡΟΥΣ ΕΚΠ Β-Α ΜΕ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ (SDS-PAGE) 'ΈΛΕΓΧΟΣ ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΟΤΗΤΑΣ: ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΑΝΟΣΟΠΡΟΣΡΟΦΗΣΗΣ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΩΝΤΑΣ ΩΣ ΑΝΟΣΟΠΡΟΣΡΟΦΗΤΕΣ ΤΑ ΑΝΑΣΥΝ ΥΑΣΜΕΝΑ ΠΕΠΤΙ ΙΑ Α-ΕΚΠ, Β-ΕΚΠ ΚΑΙ ΤΟ ΣΥΓΚΑΤΑΜΕΡΕΣ ΕΚΠ Β- Α 64 5 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

6 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Ι - 6 -

7 1 ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΟΣ ΥΠΟ ΟΧΕΑΣ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ 1.1 H οικογένεια των νικοτινικών υποδοχέων της ακετυλοχολίνης Ο νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης ανήκει στην υπεροικογένεια των ιοντικών διαύλων ενεργοποιούµενων µέσω προσδέτη. Οι υποδοχείς αυτής της οικογένειας έχουν παρόµοια δοµικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά, γεγονός που υποδεικνύει την κοινή εξελικτική τους πορεία. Κοινό χαρακτηριστικό όλων των υποµονάδων των υποδοχέων είναι η ύπαρξη δύο αυστηρά συντηρηµένων καταλοίπων κυστεϊνης στο αµινοτελικό άκρο. Τα αµινοξικά κατάλοιπα ενώνονται µε δισουλφιδική γέφυρα σχηµατίζοντας µια θηλιά 13 αµινοξικών καταλοίπων, η οποία εµφανίζεται συντηρηµένη σε όλες τις υποµονάδες των υποδοχέων (Unwin et al., 2002, Unwin, 2005). Για το λόγο αυτό τα διάφορα µέλη της ονοµάζονται εναλλακτικά και Cys-loop υποδοχείς (Κarlin and Akabas, 1995). Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης είναι µεγάλες διαµεµβρανικές πρωτεΐνες που αποτελούνται από πέντε οµόλογες υποµονάδες σχηµατίζοντας ένα κεντρικό δίαυλο ιόντων (Lindstrom, 2000) και χωρίζονται σε δύο κατηγορίες τους νευρικούς και τους µυϊκούς. Κάθε υποµονάδα αποτελείται από µια αµινοτελική εξωκυττάρια περιοχή (ΕΚΠ), τέσσερις διαµεµβρανικές περιοχές (Μ1-Μ4) και µια κυτταροπλασµατική θηλιά η οποία σχηµατίζεται µεταξύ των ελίκων Μ3-Μ4 (Sine and Engel, 2006). Οι µυϊκού τύπου νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης εντοπίζονται στο µετασυναπτικό άκρο της νευροµυϊκής σύναψης και προσδένουν τον νευροδιαβιβαστή ακετυλοχολίνη, η οποία συντίθεται, αποθηκεύεται και εκκρίνεται από τους χολινεργικούς νευρώνες. Oι νευρικού τύπου υποδοχείς εκφράζονται κυρίως στο νευρικό σύστηµα στα περιφερειακά γαγγλία και σε συγκεκριµένα τµήµατα του εγκεφάλου, καθώς και σε µη-νευρικούς ιστούς όπως τα επιθηλιακά κύτταρα και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος. Ο βασικός ρόλος των νευρικών υποδοχέων είναι η διαβίβαση του νευρικού µηνύµατος στον ανθρώπινο εγκέφαλο και στα γαγγλία (Ζhang et al., 1996). H παρουσία τους και σε µη νευρικούς ιστούς, δείχνει πως οι υποδοχείς αυτοί έχουν περαιτέτω ρόλους και στην περιφέρεια - 7 -

8 Θέσεις πρόσδεσης της ΑCh ΕΚΠ Κεντρικός πόρος Τ α έλικα Ενδοκυτταρική περιοχή Εικόνα 1 Σχηµατική αναπαράσταση του nachr 1.2 Η δοµή των νικοτινικών υποδοχέων της ακετυλοχολίνης Οι πρώτες πληροφορίες για την δοµή των νικοτινικών υποδοχέων προήλθαν από το ηλεκτρικό όργανο του ψαριού Torpedo Marmorata. Οι µελέτες πραγµατοποιήθηκαν µε την βοήθεια της ηλεκτρονικής µικροσκοπίας και αποκάλυψαν τις διαστάσεις, το σχήµα καθώς και τις θέσεις πρόσδεσης των αγωνιστών και των ανταγωνιστών. Έτσι αποκαλύφθηκε ότι ο υποδοχέας έχει κυλινδρικό σχήµα, µε τις πέντε όµοιες σε διαστάσεις υποµονάδες να διατάσσονται γύρω από έναν άξονα ψευδοσυµµετρίας που διατρέχει τον ιοντικό δίαυλο (Μiyazawa et al.,1999, Unwin, 2003, Unwin 2005). Oι πρώτες υψηλής ανάλυσης πληροφορίες προήλθαν από δοµικές µελέτες µε τη µέθοδο της κρυσταλλογραφίας. Η λύση της δοµής της acetylcholine binding protein (AChBP) από το σαλιγκάρι Lymnaea stagnalis και ιοντικών διαύλων που προέρχονται από προκαρυωτικούς οργανισµούς όπως το βακτήριο Erwinia chrysanthemi (ELIC) παρείχαν σηµαντικές πληροφορίες όσον αφορά στη δοµή της υπέρ-οικογένειας των προσδετο-εξαρτώµενων ιοντικών διαύλων (Brejc et al.,2001, Hilf and Dutzler, 2008). Πιο συγκεκριµένα, η ΑChBP είναι µια διαλυτή πρωτεΐνη που σχηµατίζει σταθερά οµοπενταµερή και λόγω οµολογίας (20-24%) µε το εξωκυτταρικό τµήµα του υποδοχέα χρησιµοποιείται ως δοµικό µοντέλο. Πρόσφατα, η λύση της κρυσταλλικής δοµής του εξωκυτταρικού τµήµατος της α1 υποµονάδας από - 8 -

9 ποντίκι προσδεµένη µε α-µπουγκαροτοξίνη, έναν ειδικό ανταγωνιστή, έφερε στην επιφάνεια σηµαντικές πληροφορίες για την συντηρηµένη Cys-loop περιοχή, τη θέση γλυκοζυλίωσης και τα αµινοξικά κατάλοιπα τα οποία εµπλέκονται στην λειτουργία του ιοντικού καναλιού (Dellisanti et al.,2007). Αξίζει να σηµειωθεί ότι µέχρι πρότινος δεν έχουν δηµοσιευτεί πληροφορίες υψηλής ανάλυσης για τη δοµή του µορίου του ανθρώπινου υποδοχέα. 1.3 H στοιχειοµετρία των νικοτινικών υποδοχέων της ακετυλοχολίνης Οι νευρικού τύπου νικοτινικοί υποδοχείς απαρτίζονται από τις α2-α10 και β2-β4 υποµονάδες. Μπορεί να είναι είτε οµοπενταµερείς (όπως στην περίπτωση του α7), είτε ετεροπενταµερείς, αποτελούµενοι από µια τουλάχιστον α υποµονάδα και µία που δεν κατατάσσεται στις α τύπου υποµονάδες. Οι ετεροπενταµερείς νικοτινικοί υποδοχείς αποτελούνται συνήθως από δύο α και τρείς β υποµονάδες, ωστόσο εµφανίζονται και µε εναλλασσόµενες στοιχειοµετρίες, γεγονός που µπορεί να επηρεάσει τις φαρµακολογικές και λειτουργικές τους ιδιότητες. Yπάρχουν στοιχεία ότι οι νευρικοί υποδοχείς α4β2 εµφανίζουν δύο διαφορετικές στοιχειοµετρίες ((α4) 2 (β2) 3 και (α4) 3 (β2) 2, οι οποίες έχουν διαφορετικές ιδιότητες, όπως για παράδειγµα διαφορετική ευαισθησία σε αγωνιστές και ανταγωνιστές και διαφορετική διαπερατότητα σε κατιόντα ασβεστίου (Ζwart and Vijverberg, 1998, Nelson et al., 2003, Moroni et al., 2006). Κάποιες άλλες µελέτες παρείχαν πληροφορίες για τη στοιχειοµετρία πιο περίπλοκων ετεροπενταµερών νευρικών υποδοχέων, όπως για παράδειγµα ο υποδοχέας (α3) 2 β 3 (β4) 2 (Βoorman et al., 2000). Οι υποδοχείς οι οποίοι εκφράζονται στη νευροµυϊκή σύναψη των ενήλικων θηλαστικών έχουν σταθερή στοιχειοµετρία και αποτελούνται από δύο α1 υποµονάδες, µία β1, µία δ και µία ε υποµονάδα. Στους εµβρυικούς µύες, καθώς και στα ηλεκτρικά όργανα ορισµένων ψαριών, η ε υποµονάδα αντικαθίσταται από την γ υποµονάδα Η αντικατάσταση της γ- από την ε- υποµονάδα ξεκινά αµέσως µετά την γέννηση και ολοκληρώνεται µέσα στις δύο πρώτες εβδοµάδες µετά από αυτή (Μartinou and Merlie, 1991, Missias et al., 1996). Ωστόσο, ο εµβρυϊκού τύπου υποδοχέας παραµένει σε µερικούς µύες των ενηλίκων, όπως είναι τα µυοειδή κύτταρα στο θύµο αδένα και - 9 -

10 κάποιοι εξωτερικοί οφθαλµικοί µύες (Horton et al., 1993, Missias et al., 1996, Gattenlohner et al., 2002). H αλλαγή στη σύνθεση των υποµονάδων του υποδοχέα µεταβάλλει τα ηλεκτροφυσιολογικά χαρακτηριστικά του, για παράδειγµα την αγωγιµότητα του ιοντικού διαύλου, καθώς επίσης και τα φαρµακολογικά και µεταβολικά χαρακτηριστικά του (Βouzat et al., 1994). O µυϊκού τύπου υποδοχέας της ακρτυλοχολίνης αποτελείται από 4 διαφορετικούς τύπους υποµονάδων, η συνάθροιση των οποίων σχηµατίζει το τελικό πενταµερές µόριο του υποδοχέα. Η συνάθροιση των υποµονάδων πραγµατοποιείται από την αναδίπλωση και επεξεργασία των µορίων στο ενδοπλασµατικό δίκτυο, όπου λαµβάνουν χώρα οι απαραίτητες µετα-µεταφραστικές τροποποιήσεις. Έπειτα, το τελικό πενταµερές µόριο του µυϊκού υποδοχέα µεταφέρεται στην κυτταρική µεµβρανή. Κατά την συνάθροιση των υποµονάδων για να σχηµατιστεί το πενταµερές µόριο του υποδοχέα, παράλληλα σχηµατίζονται και οι θέσεις πρόσδεσης των αγωνιστών, οι οποίες βρίσκονται στις διεπιφάνειες µεταξύ των υποµονάδων α1 και γ ή α1 και δ (Sine and Claudio, 1991). H παρουσία διαφορετικών υποµονάδων, οι οποίες συνεργάζονται µε την α1 υποµονάδα για να σχηµατίσουν τη θέση πρόσδεσης των αγωνιστών, προκαλεί διαφορετική συγγένεια για τους αγωνιστές στις δύο ξεχωριστές θέσεις πρόσδεσης (Αckermann and Taylor, 1997). Για παράδειγµα, η θέση πρόσδεσης µεταξύ των υποµονάδων α1 και γ είναι βιοχηµικά διαφορετική συγκριτικά µε αυτή µεταξύ των υποµονάδων α1 και δ, κρίνοντας από την υψηλότερη συγγένεια που έχει η πρώτη για τον ανταγωνιστή τουµποκουραρίνη (Sine at al., 1995). H πρόσδεση της ακετυλοχολίνης στις θέσεις πρόσδεσης µεταξύ των υποµονάδων α1 και γ, καθώς και α1 και δ, προκαλεί αλλαγές στη διαµόρφωση των υποµονάδων και κατά συνέπεια επιτυγχάνεται το άνοιγµα του καναλιού (Unwin et al., 2002)

11 Εµβρυϊκή εκδοχή Ενήλικη εκδοχή Θέσεις πρόσδεσης της ΑCh Kύρια Ανοσογόνος Περιοχή Εµβρυϊκός µυς Ενήλικοςς µυς Εικόνα 2 Σχηµατική αναπαράσταση της δοµής του nachr στην εµβρυϊκή και ενήλικη εκδοχή του 1.4 Ο µεταβολισµός του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Οι µονάδες του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης συντίθενται ως διακριτές πολυπεπτιδικές αλυσίδες στα ριβοσωµάτια του αδρού ενδοπλασµατικού δικτύου και ακολουθούν ένα ενδοκυτταρικό µονοπάτι, όπου και υφίστανται τις διάφορες µετά-µεταφραστικές τροποποιήσεις. Σε πρώτη φάση, αποµακρύνεται το πεπτίδιο οδηγός (Anderson et al., 1982), ακολουθεί ο σχηµατισµός των δισουλφιδικών δεσµών (Blount and Merlie 1990, Kao and Karlin 1986), η Ν-γλυκοζυλίωση, η φωσφορυλίωση (Green et al., 1991) µέχρι το τελικό στάδιο, όπου οι αλυσίδες αναδιπλώνονται συγκροτώντας το λειτουργικό µόριο του υποδοχέα. Στη συνέχεια, το πενταµερές µεταφέρεται στο σύµπλεγµα Golgi για τις περαιτέρω τροποποιήσεις. Τα διάφορα στάδια της διαδικασίας βιοσύνθεσης του µυϊκού νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης µελετήθηκαν µε τη χρήση ραδιοσηµασµένης α-µπουγκαροτοξίνης. Αναφορικά µε την συγκρότηση των υποµονάδων των υποδοχέων έχουν προταθεί δύο διαφορετικά µοντέλα. Σύµφωνα µε το πρώτο µοντέλο, αρχικά σχηµατίζονται ετεροδιµερή υποµονάδων αγ και αδ, τα οποία στη συνέχεια αλληλεπιδρούν µεταξύ τους όσο και µε τη β υποµονάδα προς σχηµατισµό του πλήρους πενταµερούς (Blount and Merlie 1990, Guet et al., 1991). Κατά το εναλλακτικό µοντέλο,

12 σχηµατίζεται αρχικά το τριµερές αβγ, οπότε και συγκροτείται η πρώτη θέση δέσµευσης της ακετυλοχολίνης µεταξύ της α και γ υποµονάδας. Στη συνέχεια, σε αυτό το τριµερές προστίθενται διαδοχικά η δ υποµονάδα και η δεύτερη α υποµονάδα, η οποία µαζί µε τη γειτονική της δ συγκροτούν και τη δεύτερη θέση πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης (Green and Claudio1993, Green and Wanamaker 1998). H εξειδικευµένη συνάθροιση των υποµονάδων κατά τα πρώιµα στάδια σχετίζεται µε σήµατα αναγνώρισης που περιέχουν οι Ν-τελικές περιοχές των υποµονάδων του υποδοχέα. Οι υποµονάδες που δεν συναθροίζονται µε τον κατάλληλο τρόπο ώστε να σχηµατιστούν λειτουργικοί υποδοχείς, αποδοµούνται µε την βοήθεια των πρωτεασωµάτων. Σηµαντικό ρόλο στη διαδικασία αυτή παίζει η πρωτεΐνη ουβικιτίνη. 1.5 Λειτουργία του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Λειτουργία των νευρικών υποδοχέων της ακετυλοχολίνης Οι νευρικοί υποδοχείς εκφράζονται κυρίως στο νευρικό σύστηµα στα περιφερειακά γάγγλια και σε συγκεκριµένα τµήµατα του εγκεφάλου, καθώς και σε µη-νευρικούς ιστούς, όπως είναι τα επιθηλιακά κύτταρα και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος (Kawashnima and Fujii, 2008). Σε αντίθεση µε τον µυϊκό υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, οι νευρικού τύπου υποδοχείς σχηµατίζονται από υποµονάδες τύπου α και β, χωρίς να εµφανίζουν την ίδια σταθερή σύσταση.ο βασικός ρόλος των νευρικών υποδοχέων είναι η διαβίβαση του νευρικού µηνύµατος στον ανθρώπινο εγκέφαλο και τα γάγγλια ( Ζhang et al., 1996, Ullian et al., 1997). Oι νευρικοί υποδοχείς απαντώνται ευρέως στον εγκέφαλο, σε προσυναπτικές, περισυναπτικές και µετασυναπτικές περιοχές (Lena and Changeux, 1993, Wonnacott, 1997). Oι προσυναπτικοί και περισυναπτικοί υποδοχείς ρυθµίζουν κυρίως την έκκριση διάφορων σηµαντικών νευροδιαβιβαστών όπως η ακετυλοχολίνη και η ντοπαµίνη.. Επιπρόσθετα, οι νευρικού τύπου υποδοχείς της ακετυλοχολίνης θεωρείται ότι εµπλέκονται και

13 στις διάφορες γνωστικές διεργασίες, όπως αυτές της µάθησης και µνήµης. Στην περιοχή του ιππόκαµπου στον εγκέφαλο, όπου λαµβάνει χώρα η κωδικοποίηση και ανάκληση πληροφοριών έχουν εντοπιστεί τρείς τουλάχιστον λειτουργικά διακριτοί υποδοχείς (α7, α4β2, α3β4) (Alkondon and Albuquerque 2004). Η έκφραση τους έχει πιστοποιηθεί και σε µη διεγέρσιµους κυτταρικούς τύπους, όπως είναι τα λεµφοκύτταρα, µονοκύτταρα, µακροφάγα, δενδριτικά κύτταρα, λιποκύτταρα, κερατινοκύτταρα, ενδοθηλιακά και επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου και των πνευµόνων (Gahring and Rogers 2005, Skok et al.,2006). Tέλος σηµαντικός είναι ο ρόλος µερικών υποδοχέων, και κυρίως του α7, στην ανάπτυξη των ενδοθηλιακών κυττάρων και στην αγγειογένεση, συµπεριλαµβανοµένης της αγγειογένεσης στους καρκινικούς όγκους (Croxen et al., 1999, Elgoyhen et al., 2001) Λειτουργία του µυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Ο µυϊκός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης εντοπίζεται στην τελική κινητική πλάκα. Αυτή αποτελείται από την απόληξη του κινητικού νευρώνα, τα κύτταρα Schwann και από τις εξειδικεύσεις της µεµβράνης του µετασυναπτικού µυϊκού κυττάρου. H νευρική ίνα διακλαδίζεται στο άκρο της και σχηµατίζει ένα σύµπλεγµα από διακλαδιζόµενες νευρικές απολήξεις, τοποθετηµένες απέναντι από πτυχώσεις της µυϊκής ίνας (τελική κινητική πλάκα). Ο χώρος που παρεµβάλλεται µεταξύ της νευρικής απόληξης και της µεµβράνης της µυϊκής ίνας ονοµάζεται συναπτική σχισµή. Στις ακρολοφίες των πτυχώσεων της µετασυναπτικής µεµβράνης εντοπίζονται οι µυϊκοί νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης. Τα µόρια της ακετυλοχολίνης σχηµατίζονται αρχικά στο κυτταρόπλασµα της απόληξης και έπειτα µεταφέρονται στο εσωτερικό των συναπτικών κυστιδίων. Κάθε συναπτικό κυστίδιο περιέχει συγκεκριµένη ποσότητα νευροδιαβιβαστή, περίπου 10 4 µόρια νευροδιαβιβαστή (Kuffler and Yoshikami 1975). Η άφιξη του δυναµικού ενέργειας στην απόληξη του προσυναπτικού νευρώνα ενεργοποιεί τα κανάλια ασβεστίου που υπάρχουν εκεί και τα ιόντα ασβεστίου εισέρχονται στη νευρική ίνα. Η αύξηση της συγκέντρωσης ιόντων ασβεστίου οδηγεί στην εξωκύττωση των

14 κυστιδίων που περιέχουν ακετυλοχολίνη (Heuser et al 1979). H ακετυλοχολίνη προσδένεται από τους µυϊκούς υποδοχείς της ακετυλοχολίνης στις µετασυναπτικές πτυχές της µυϊκής µεµβράνης, προκαλώντας το άνοιγµα του καναλιού του µυϊκού υποδοχέα και κατά συνέπεια την παθητική µεταφορά ιόντων µε κινητήρια δύναµη την επικρατούσα ηλεκτροχηµική κλίση, η οποία ευνοεί την εισροή ιόντων νατρίου. H εισροή ιόντων νατρίου προκαλεί την εκπόλωση της µεµβράνης και την ανάπτυξη του δυναµικού της τελικής κινητική πλάκας. Αυτό προκαλεί µε τη σειρά του ενεργοποίηση των εξαρτώµενων από το δυναµικό καναλιών νατρίου, περαιτέρω εισροή ιόντων και συνεπώς πιο εκτεταµένη εκπόλωση. Όταν το µετασυναπτικό δυναµικό ξεπεράσει το κατώφλι δυναµικού, δηµιορυγείται το δυναµικό ενέργειας και στη συνέχεια η ώση που οδηγεί στη µυϊκή συστολή µε την έκκριση ασβεστίου από το σαρκοπλασµατικό δίκτυο της µυϊκής ίνας και τη δέσµευσή του από την τροπονίνη (Vincet et al., 2000). Η ακετυλοχολίνη αµέσως µετά την ενεργοποίηση των υποδοχέων της µετασυναπτικής µεµβράνης, υδρολύεται από το ένζυµο ακετυλοχολινεστεράση που βρίσκεται στη συναπτική σχισµή σε οξικό οξύ και χολίνη. Το µόριο της χολίνης επαναπροσλαµβάνεται από τις προσυναπτικές νευρικές απολήξεις και ανακυκλώνεται µέσω της σύνδεσης του µε µόρια του ακετυλο-συνενζύµου Α για το σχηµατισµό νέων µορίων ακετυλοχολίνης

15 Νευράξονας Μυελίνη υναµικό Μυϊκές ίνες Νευρικές απολήξει Τελική κινητική πλάκα Κυστίδια Α Ch Κανάλι ιόντων Νa + Νευρική απόληξη Κανάλι ιόντων Ca 2+ υναµικό ενέργειας Πλασµατική µεµβράνη Θέσεις πρόσδεσης της ACh Aκετυλοχολινεστεράση Μυϊκή ίνα Eικόνα 3 Σχηµατική αναπαράσταση της νευροµυϊκής σύναψης και της µεταγωγής του κινητικού ερεθίσµατος Αλλοστερικές καταστάσεις του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Η λειτουργία του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης έγκειται στην συνεχή δέσµευσηαποδέσµευση της ακετυλοχολίνης µε επακόλουθο το άνοιγµα και κλείσιµο του πόρου του καναλιού και τη µεταβολή του δυναµικού της µετασυναπτικής µεµβράνης. Ο υποδοχέας είναι µια αλλοστερική πρωτεΐνη, η οποία µεταπίπτει σε διαφορετικές καταστάσεις (Karlin and Akabas 1995, Lena and Changeux 1993). Οι τρείς βασικές αλλοστερικές καταστάσεις, οι οποίες µπορούν να παρατηρηθούν υπό την επίδραση διαφόρων υποκαταστατών, διακρίνονται σε : α) Κατάσταση ηρεµίας. Το κανάλι είναι κλειστό, αλλά µπορεί να ενεργοποιηθεί µε τη δέσµευση δύο µορίων ακετυλοχολίνης. β) Ενεργή κατάσταση. Το κανάλι είναι ανοιχτό. Ο υποδοχέας είναι προσδεδεµένος µε δύο µόρια της ακετυλοχολίνης. Η µετάβαση στην ενεργή κατάσταση από την κατάσταση ηρεµίας είναι µία εξαιρετικά γρήγορη διαδικασία ( µς). γ) Απευαισθητοποιηµένη. Το κανάλι είναι κλειστό. Αν και στο νικοτινικό υποδοχέα είναι

16 προσδεδεµένα δύο µόρια ακετυλοχολίνης, αυτός δεν µπορεί να ενεργοποιηθεί. Η κατάσταση αυτή παρατηρείται µετά από παρατεταµένη έκθεση σε υψηλές συγκεντρώσεις υποκαταστάτη, χωρίς ωστόσο να έχει αποσαφηνιστεί ο φυσιολογικός της ρόλος Υποκαταστάτες που προσδένονται στον νικοτινικό υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Τα χηµικά µόρια που προσδένονται στο νικοτινικό υποδοχέα της ακετυλοχολίνης διακρίνονται σε αγωνιστές, ανταγωνιστές και αλλοστερικούς τροποποιητές, ανάλογα µε τη θέση πρόσδεσης και τον τρόπο που επηρεάζουν τη λειτουργία του ιοντικού καναλιού. α) Αγωνιστές: αλληλεπιδρούν µε τον υποδοχέα στην ίδια ή παραπλήσια θέση µε αυτή της πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης, επάγοντας την ενεργοποίηση του ιοντικού καναλιού. β) Ανταγωνιστές: αλληλεπιδρούν µε τον υποδοχέα, επίσης στην ίδια ή παραπλήσια θέση µε αυτή της πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης, αλλά παρεµποδίζουν την συναπτική διαβίβαση. γ) Αλλοστερικοί τροποποιητές: αλληλεπιδρούν µε τον υποδοχέα σε διαφορετικές περιοχές από τη θέση πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης και επάγουν ή αναστέλλουν τη λειτουργία του υποδοχέα. Αξίζει να σηµειωθεί ότι υπάρχουν µόρια όπως η κυτισίνη, τα οποία δρούν άλλοτε ως αγωνιστές και άλλοτε ως ανταγωνιστές. 1.6 Παθολογικές καταστάσεις που σχετίζονται µε τον µυϊκό υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Ο µυϊκός υποδοχέας ενέχεται σε πολλά κληρονοµικά και επίκτητα νοσήµατα, η πλειονότητα των οποίων οδηγεί σε διαταραχή της µεταγωγής του κινητικού ερεθίσµατος και σε µυϊκή αδυναµία. Το επίκτητο αυτοάνοσο νόσηµα µυασθένεια είναι το πιο κοινό και καλύτερα µελετηµένο, το οποίο προκαλείται στο 85% των περιπτώσεων από αυτοαντισώµατα έναντι του µυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (Lindstrom, 2000). Ωστόσο, υπάρχουν και µερικές σπάνιες κληρονοµικές ασθένειες, γνωστές ως συγγενή µυασθενικά σύνδροµα, οι οποίες εµπλέκονται µε διάφορες ανωµαλίες που επηρεάζουν την έκκριση της ακετυλοχολίνης, τη λειτουργία της

17 ακετυλοχολινεστεράσης, καθώς επίσης και τη λειτουργία ή τον αριθµό των µυϊκών υποδοχέων στη νευροµυϊκή σύναψη. Η µυασθένεια είναι ένα ετερογενές αυτοάνοσο νόσηµα, το οποίο δεν είναι κληρονοµικό, και συνήθως χαρακτηρίζεται από αυτοαντισώµατα, τα οποία προσδένονται στους υποδοχείς και τους καταστρέφουν. Τα κύρια συµπτώµατα είναι η µυϊκή κόπωση και η µυϊκή αδυναµία. Η µυασθένεια µπορεί να περιορίζεται στους οφθαλµικούς µύες (οφθαλµική µυασθένεια), ή µπορεί να διαχέεται σε διάφορους σκελετικούς µύες (γενικευµένη µυασθένεια). Ο µυϊκός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης αποτελεί το κύριο αντιγόνο για την µυασθένεια. To µεγαλύτερο µέρος των αντισωµάτων κατά του µυϊκού υποδοχέα στοχεύουν στο εξωκυτταρικό τµήµα του υποδοχέα και ειδικότερα σε µία συγκεκριµένη περιοχή της α1 υποµονάδας, η οποία ονοµάστηκε κύρια ανοσογόνος περιοχή (main immunogenic region - MIR) µεταξύ των αµινοξικών καταλοίπων (Tzartos et al., 1988, Tzartos and Lindstrom, 1980). Mελέτες µε κατασκευή χιµαιρών υπέδειξαν ότι η κύρια ανοσογόνος περιοχή δεν αποτελεί ένα απλό επίτοπο, αλλά συνίσταται από µια οµάδα γειτονικών και επικαλυπτόµενων επιτόπων (Lindstrom et al., 2008)

18 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΙΙ

19 2 Bαριά µυασθένεια 2.1 Ιστορική αναδροµή Η βαριά µυασθένεια ( myasthenia gravis) περιγράφτηκε για πρώτη φορά το 1672 από τον Άγγλο ανατόµο ιατρό Thomas Willis, o oποίος παρατήρησε στην περίπτωση µιας ασθενούς µια κατάσταση αδυναµίας στους σκελετικούς µυς των άκρων, δυσκολίες στην οµιλία και µια γενικότερη κόπωση και µυϊκή αδυναµία. Το 1985 ο Jolly περιέγραψε δύο περιπτώσεις ασθενών µε παρόµοια κλινικά συµπτώµατα και έδωσε το όνοµα στη νόσο αυτή, Myasthenia gravis pseudoparalytica. Η ανακάλυψη των Dale και Feldberg της ακετυλοχολίνης ως νευροδιαβιβαστή στην τελική κινητική πλάκα άνοιξε τον δρόµο για την κατανόηση της παθογένεσης (Dale and Feldberg, 1934). Για πρώτη φορά το 1960 προτάθηκε ότι η µυασθένεια ανήκει στην κατηγορία των αυτοάνοσων (Thanvi and Lo., 2004) και το 1973 έγινε σαφής ο ρόλος των αυτοαντισωµάτων στην πρόκληση της µυασθένειας, καθώς επίσης και το ότι ο µυϊκός υποδοχέας είναι το κύριο αυτοαντιγόνο στη βαριά µυασθένεια (Vincet et al., 2001). 2.2 Παθογένεση της µυασθένειας Μέχρι σήµερα έχουν διατυπωθεί διάφορες υποθέσεις σχετικά µε την παθογένεση της µυασθένειας και υπάρχουν σηµαντικά στοιχεία που υποστηρίζουν τη σηµασία της γενετικής προδιάθεσης για την εκδήλωση της νόσου, ενώ είναι πιθανόν να εµπλέκονται και περιβαλλοντικοί παράγοντες. Σηµαντικό ρόλο στην εκδήλωση και την διατήρηση της χρόνιας κατάστασης της µυασθένειας παίζει ο θύµος αδένας. Συχνά παρατηρείται συνύπαρξη της µυασθένειας και ανωµαλιών στο θύµο αδένα. Πιο συγκεκριµένα 50-60% των µυασθενών παρουσιάζουν υπερπλασία του θύµου και 10% των µυασθενών θύµωµα. Στο παραπάνω γεγονός στηρίζεται η άποψη ότι η θυµεκτοµή έχει ευεργετικά αποτελέσµατα στην κλινική εικόνα των ασθενών ( Sanders et al., 2008). Τα Τ κα Β λεµφοκύτταρα που αποµονώνονται από τον θύµο αδένα µυασθενών, είναι πιο ευαίσθητα σε

20 απόκριση κατά του µυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, σε σχέση µε λεµφοκύτταρα που αποµονώνονται από το περιφερικό αίµα (Sommer et al., 1990). Περαιτέρω µελέτες έδειξαν ότι ο θύµος αδένας των µυασθενών φέρει σηµαντικό αριθµό Β λεµφοκυττάρων και παρουσιάζει παραγωγή αντισωµάτων κατά του µυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (Scadding et al., 1981). Eπιπρόσθετα, ο θύµος αδένας φέρει τα µυοειδή κύτταρα, τα οποία έχουν µορφολογικά χαρακτηριστικά παρόµοια µε εκείνα των σκελετικών µυϊκών κυττάρων και διαθέτουν στην επιφάνεια τους υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (Kao and Drachman, 1977). Αυτοάνοση απόκριση κατά του µυϊκού υποδοχέα της ACh Παρουσία ανωµαλιών στο θύµο αδένα Μυοειδή κύτταρα στο θύµο αδένα Eικόνα 4 Ο ρόλος του θύµου αδένα στην αυτοάνοση απόκριση Μια άλλη αιτία που θεωρείται πιθανή για την παθογένεση της µυασθένειας είναι η µοριακή µίµηση. Είναι πιθανόν ένας εξωτερικός µολυσµατικός παράγοντας που διαθέτει κάποια αντιγονική δοµή παρόµοια µε τη δοµή του υποδοχέα, να ενεργοποιεί την ανοσολογική αντίδραση κατά του υποδοχέα, όταν εισέλθει στον οργανισµό. Μελέτες έχουν δείξει ότι µια αλληλουχία αµινοξέων του απλού έρπητα εµφανίζει σηµαντικό ποσοστό οµολογίας µε αλληλουχία της α1 υποµονάδας του υποδοχέα (Dieperink and Stefanson, 1989, Schwimmbeck et al., 1989). Aξίζει να σηµειωθεί ότι

21 µονοκλωνικά αντισώµατα κατά του µυϊκού υποδοχέα, αντιδρούν µε επιτόπους από διάφορα βακτηριακά στελέχη (Stefansson et al., 1985). Αλληλουχία αµινοξέων του απλού έρπητα εµφανίζει σηµαντικό ποσοστό οµολογίας µε αλληλουχία της α1 υποµονάδας του υποδοχέα Ιός του έρπητα Εξωτερικός µολυσµατικός παράγοντας Ανοσολογική απόκριση Ιός Μυϊκού τύπου υποδοχέας της ACh Εικόνα 5 Το φαινόµενο της µοριακής µίµησης στην παθογένεση της βαριάς µυασθένειας 2.3 Παθοφυσιολογία της µυασθένειας Η βαριά µυασθένεια είναι ένα αυτοάνοσο νόσηµα µε κύριο αντιγόνο στόχο τον µυϊκό υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. Σε ένα µεγάλο ποσοστό ασθενών (85%) ανιχνεύονται αντισώµατα έναντι του υποδοχέα, τα οποία απουσιάζουν υπό φυσιολογικές συνθήκες. Έχει διαπιστωθεί ότι η πλειοψηφία των αντισωµάτων στοχεύει στην κύρια ανοσογόνο περιοχή (MIR), η οποία εντοπίζεται στο εξωκυτταρικό τµήµα της α1 υποµονάδας. Στο υπόλοιπο 15% των µυασθενικών απουσιάζουν τα αντισώµατα έναντι του µυϊκού υποδοχέα, παρόλο που έχει αποδειχτεί ότι ο ορός τους προκαλεί συµπτώµατα µυασθένειας όταν χορηγηθεί σε πειραµατόζωα. Στον ορό του αίµατος ενός µικρού ποσοστού µυασθενών (6%) έχουν ανιχνευθεί αυτοαντισώµατα έναντι της ειδικής µυϊκής κινάσης MuSK, η οποία εντοπίζεται στη µεµβράνη του µετασυναπτικού κυττάρου. Τα αντί-musk αντισώµατα συνοδεύουν σοβαρές περιπτώσεις µυασθένειας κυρίως οφθαλµικού τύπου, ενώ

22 απουσιάζουν από τον ορό ασθενών µε αυτοαντισώµατα έναντι του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (Vincet et al., 2004). Τα αυτοαντισώµατα που παράγονται στη µυασθένεια προκαλούν µείωση των διαθέσιµων υποδοχέων στις νευροµυϊκές συνάψεις µέσω των παρακάτω µηχανισµών: Α) Αντιγονική τροποποίηση. Έγκειται στην ικανότητα των αυτοαντισωµάτων να συνδέονται ταυτόχρονα σε δύο γειτονικά µόρια του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης µε τελικό αποτέλεσµα την ενδοκυττάρωση του σχηµατιζόµενου συµπλόκου. Έχει δειχτεί ότι οι οροί των µυασθενικών επιταχύνουν το ρυθµό ενδοκυττάρωσης του υποδοχέα (Κao and Drachman 1977, Loutrari et al., 1992). Πρόσφατα δείχθηκε ότι καθαρά αντισώµατα που αποµονώθηκαν από ορούς µυασθενικών και στοχεύουν διαφορετικές υποµονάδες του νικοτινικού υποδοχέα προκαλούν δοσοεξαρτώµενη απώλεια υποδοχέων κατά την προσθήκη τους σε κυτταροκαλλιέγειες (Sideris et al., 2007). Β) Λύση της µετασυναπτικής µεµβράνης µέσω της δράσης του συµπληρώµατος. Η δράση του συµπληρώµατος έχει πιστοποιηθεί µε την βοήθεια της ηλεκτρονικής µικροσκοπίας. Πιο συγκεκριµένα, έχουν εντοπιστεί µορφολογικές αλλοιώσεις στη µετασυναπτική µεµβράνη της νευροµυϊκής σύναψης µυασθενών (Engel et al., 1976). Με χρήση τεχνικών ανοσοιστοχηµείας ανιχνεύθηκαν συστατικά του συµπληρώµατος στις νευροµυϊκές συνάψεις (Εngel et al., 1979, Engel and Arahata 1987). Γ) Άµεση παρεµπόδιση της λειτουργίας του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. Μικρό ποσοστό µυασθενών διαθέτουν στον ορό τους αντισώµατα τα οποία παρεµποδίζουν την πρόσδεση της ακετυλοχολίνης λόγω στερεοχηµικής παρεµπόδισης. Επιπρόσθετα, τα αντί-musk αντισώµατα φαίνεται να παρεµποδίζουν τη συνάθροιση µορίων υποδοχέα (Vincet at al., 2003), δεδοµένου ότι η MuSK ευθύνεται για τη συνάθροιση των µορίων του νικοτινικού υποδοχέα στη µετασυναπτική µεµβράνη

23 1 3 2 Eικόνα 6 Σχηµατική αναπαράσταση της αυτοάνοσης απόκρισης στην βαριά µυασθένεια

24 2.4 Θεραπευτικές προσεγγίσεις για τη µυασθένεια Σύγχρονες θεραπείες Α) Αντιχολινεστερικά φάρµακα: Τα φάρµακα αυτής της κατηγορίας αναστέλλουν τη δράση της ακετυλοχολινεστεράσης, αυξάνοντας τη συγκέντρωση της διαθέσιµης ακετυλοχολίνης και ενισχύοντας κατά αυτό το τρόπο τη νευροµυϊκή διαβίβαση. Η πυριδοστιγµίνη και η νεοστιγµίνη είναι τα πιο διαδοµένα φάρµακα αυτής της κατηγορίας τα οποία χορηγούνται στα αρχικά στάδια της µυασθένειας. Εικόνα 7 Σχηµατική αναπαράσταση της δράσης της ακετυλοχολινεστεράσης Β) Θυµεκτοµή: Η αφαίρεση του θύµου αδένα θεωρείται ότι οδηγεί στην πλήρη υποχώρηση των συµπτωµάτων της νόσου στο 35% των ασθενών. Η θεραπευτική αξία της µεθόδου αυτής πιθανόν να έγκειται είτε στην αποµάκρυνση των Β λεµφοκυττάρων που εκκρίνουν τα αυτοαντισώµατα έναντι του υποδοχέα είτε στην αποµάκρυνση των µυοειδών κυττάρων του θύµου αδένα (Kao and Drachman, 1977, Drachman et al., 1998). O ρόλος του θύµου στην παθογένεση της µυασθένειας δεν έχει διασαφηνιστεί πλήρως και η ευεργετική δράση της θυµεκτοµής είναι εµφανής µετά το

25 πέρας του πρώτου χρόνου. Συστήνεται σε ασθενείς µε θύµωµα ή ασθενείς µε πρώιµη εκδήλωση της νόσου. Γ) Ανοσοκατασταλτικά φάρµακα: Τα φάρµακα αυτά χορηγούνται σε ασθενείς µε ενδιάµεση ή βαριάς µορφής µυασθένεια, όταν δεν ανταποκρίνονται στις παραπάνω θεραπείες. Προκαλούν σοβαρές παρενέργειες και συνίσταται στενή ιατρική παρακολούθηση κατά την χρήση τους. ιακρίνονται σε κορτικοστεροειδή και σε µη στεροειδή ανοσοκατασταλτικά. Ι. Κορτικοστεροειδή: Η δράση αυτών των φαρµάκων έγκειται στη µείωση παραγωγής φλεγµονωδών κυτταροκινών και της κυκλοφορίας φλεγµονωδών κυττάρων ( Richman and Agius, 2003). Τα κορτικοστεροειδή προκαλούν ελάττωση των αυτοαντισωµάτων έναντι του µυϊκού υποδοχέα και µείωση των περιφερικών λεµφοκυττάρων έναντι του υποδοχέα ( Tindall, 1980). ΙΙ. Μη στεροειδή ανοσοκατασταλτικά: Η αζαθιοπρίνη, η κυκλοσπορίνη Α και η κυκλοφοσφαµίδη είναι ουσίες που χρησιµοποιούνται συχνά και ανήκουν σε αυτή την κατηγορία. H αζαθιοπρίνη αναστέλλει τη σύνθεση πουρίνης και κατά συνέπεια τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό (Μertens et al., 1969, Elion, 1972). To γεγονός αυτό επηρεάζει τους κυτταρικούς πληθυσµούς που διαιρούνται σε σύντοµα χρονικά διαστήµατα, όπως είναι τα λεµφοκύτταρα, και παρουσιάζουν λιγότερες παρενέργειες από τα κορτικοστεροειδή. Το κύριο πρόβληµα που σχετίζεται µε τη χορήγηση αζαθιοπρίνης είναι η καθυστέρηση της βελτίωσης των κλινικών συµπτωµάτων των ασθενών. Στην περίπτωση που απαιτείται ανοσοκατασταλτική θεραπεία επί µακρόν, συνίσταται η χορήγηση στεροειδών σε συνδυασµό µε αζαθιοπρίνη (Vincet et al., 2001, Skeie et al., 2006). H κυκλοσπορίνη Α έχει ισχυρή ανοσοκατασταλτική δράση και αναστέλλει την παραγωγή της ΙL-2 από τα βοηθητικά Τα λεµφοκύτταρα (Drachman et al., 1998). H κυκλοφοσφαµίδη είναι ένα δυνατό ανοσοκατασταλτικό και δρα στο DNA αναστέλλοντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό, επιδρώντας κυρίως στα Β και όχι στα Τα λεµφοκύτταρα. Το φάρµακο αυτό είναι το ίδιο αποτελεσµατικό µε τα κορτικοστεροείδη, ωστόσο οι παρενέργειες είναι πιο σοβαρές (Perez et al., 1981, Niakan et al., 1986)

26 ) Πλασµαφαίρεση: H πλασµαφαίρεση αποτελεί θεραπεία η οποία εφαρµόζεται κυρίως σε σοβαρές καταστάσεις, όπως είναι η µυασθενική κρίση, και αποτελεί αποτελεσµατική αλλά παροδική θεραπεία. Η διαδικασία της πλασµαφαίρεσης αφορά στην αποµάκρυνση του πλάσµατος του µυασθενούς και τροφοδότηση µε συστατικά του πλάσµατος που έχουν αφαιρεθεί. Με την πλασµαφαίρεση πραγµατοποιείται άµεση αποµάκρυνση των αντισωµάτων από την κυκλοφορία, µε αποτέλεσµα την γρήγορη αλλά παροδική βελτίωση της κλινικής εικόνας των µυασθενών. Ωστόσο, έχει το µειονέκτηµα ότι αφαιρεί ανεξαιρέτως όλες τις πρωτεΐνες του πλάσµατος και η αντικατάσταση αυτών, εκτός του ότι αυξάνει το κόστος της θεραπείας, µπορεί να προκαλέσει αλλεργικές αντιδράσεις, ενεργοποίηση του συµπληρώµατος και λοιµώξεις κατά την µετάγγιση (Kuks and Skallebaek, 1998). Ε) Ενδοφλέβιες ανοσοσφαιρίνες (IVIg): Οι ενδοφλέβιες ανοσοσφαιρίνες συνιστούν επίσης µία παροδική θεραπεία, µε αποτελέσµατα παρόµοια µε την πλασµαφαίρεση. Ο µηχανισµός δράσης τους δεν είναι πλήρως κατανοητός. Έχουν λιγότερες παρενέργειες από την πλασµαφαίρεση, ωστόσο είναι µία θεραπεία µε µεγάλο κόστος και η παραγωγή τους είναι µία χρονοβόρα διαδικασία Θεραπείες σε κλινικό στάδιο Ενδεικτικά αναφέρονται κάποιες από τις ερευνητικές προσπάθειες που επικεντρώνονται σε περισσότερο ειδικές θεραπείες, οι οποίες θα είναι αποτελεσµατικότερες και παράλληλα θα παρουσιάζουν λιγότερες παρενέργειες. Ορισµένα βιοτεχνολογικά φάρµακα, τα οποία είναι αποτελεσµατικά στη θεραπεία άλλων αυτοάνοσων νόσων, ελέγχονται µε κλινικές µελέτες για την αποτελεσµατικότητα τους στη µυασθένεια. Για παράδειγµα, το rituximab, το οποίο είναι ένα αντί-cd20 µονοκλωνικό αντίσωµα και επάγει την κυτταροτοξικότητα έναντι των CD20 Β-λεµφοκυττάρων, έχει χρησιµοποιηθεί για την θεραπεία της µυασθένειας (Wylam et al., 2003). To ανοσοκατασταλτικό mitoxantrone κατευθύνεται στα Β λεµφοκύτταρα, αναστέλλει τη

27 ενεργοποίηση των Τ βοηθητικών κυττάρων και ορισµένων κυτταροκινών. Η ουσία αυτή αποτελεί ένα ελπιδοφόρο υποψήφιο για τη θεραπεία της µυασθένειας (Dalakas, 2006). Mία ακόµα θεραπευτική προσέγγιση αποτελεί η ανάπτυξη ανοσιακής αντοχής µε τη χορήγηση από τους βλεννογόνους (στόµατος ή οσφρητικό βλεννογόνο) αντιγόνων που αντιστοιχούν σε τµήµατα του µυϊκού υποδοχέα ( Μa et al., 1995). H χρήση τµηµάτων µονοκλωνικών αντισωµάτων (Sοphanios and Tzartos, 1989) και ανθρωποποιηµένων µονοκλωνικών αντισωµάτων (Papanastasiou et al., 2005) φέρεται να προστατεύει το µυϊκό υποδοχέα από τα παθογόνα αντισώµατα. Τα µη παθογόνα αντισώµατα πρέπει να είναι µονοσθενή, ώστε να µην προκαλούν αποδόµηση των υποδοχέων µέσω αντιγονικής τροποποίησης και επιπλέον να απουσιάζει η θέση πρόσδεσης του συµπληρώµατος, ώστε να µην προκαλούν την ενεργοποίησή του. Μια άλλη θεραπευτική προσέγγιση είναι η δηµιουργία γενετικά τροποποιηµένων αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων, τα οποία αλληλεπιδρώντας µε Τ-λεµφοκύτταρα, δραστικά έναντι του µυϊκού υποδοχέα, να τα εξωθούν στην καταστροφή µέσω πυροδότησης της αποπτωτικής οδού ( Drachman et al., 2003). Πρόσφατες µελέτες παρουσίασαν την παρεµπόδιση της έκφρασης της ακετυλοχολινεστεράσης µε τη χρήση αντινοηµατικών νουκλεοτιδίων, µέσω αποσιώπησης της έκφρασης του σχετικού γονιδίου. Τα αποτελέσµατα από την εφαρµογή της µεθόδου σε πειραµατόζωα είναι ενθαρρυντικά (Βοneva et al., 2006). Μια νέα προσέγγιση στηρίζεται στην ειδική αφαίρεση των αντισωµάτων από τον ορό των µυασθενών (ανοσοπροσρόφηση). Στη γενικότερή της µορφή η µέθοδος χρησιµοποιεί στήλες που προσδένουν όλα τα IgG αντισώµατα του ασθενούς, έχει εποµένως πολύ περιορισµένη ειδικότητα. Πρόσφατα γίνονται προσπάθειες για πιο ειδική αφαίρεση των αυτοαντισωµάτων µόνο, χρησιµοποιώντας ανοσοπροσροφητικές στήλες που φέρουν ακινητοποιηµένο το αντιγόνο-στόχο σε σταθερό υπόστρωµα. Η εφαρµογή της τεχνικής αυτής συναντά δυσκολίες λόγω της περιορισµένης

28 διαθέσιµης ποσότητας του υποδοχέα. Η ετερόλογη έκφραση ανθρώπινων υποµονάδων του µυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης σε διαλυτή γλυκοζυλιωµένη µορφή, τα οποία αναγνωρίζονται από αυτοαντισώµατα έναντι του µυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης από τον ορό µυασθενών, συνιστά µια εναλλακτική προσέγγιση. Οι προσπάθειες ανάπτυξης αντιγονοειδικής θεραπείας εστιάζουν στην βελτίωση της δοµής, της διαλυτότητας και των επιπέδων έκφρασης των υποµονάδων του µυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, έτσι ώστε να είναι εφικτή η χρήση τους ως ανοσοπροσροφητές

29 2.5 Στόχοι της διπλωµατικής εργασίας Ο νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης είναι ο σηµαντικότερος αντιγονικός στόχος στην αυτοάνοση νόσο βαριά µυασθένεια. Στο µεγαλύτερο ποσοστό των ασθενών (85%) ανιχνεύονται αντισώµατα έναντι του µυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, τα οποία µπορούν να οδηγήσουν στην ελάττωση λειτουργικά διαθέσιµων υποδοχέων στην νευροµυϊκή σύναψη µέσω λειτουργικής παρεµπόδισης, αντιγονικής τροποποίησης ή δράση του συµπληρώµατος και κατά συνέπεια σε διαταραχή της µεταγωγής του κινητικού ερεθίσµατος. Οι σύγχρονες θεραπείες για τη µυασθένεια είναι αρκετά αποτελεσµατικές, ωστόσο έχουν πολλές παρενέργειες εξαιτίας της περιορισµένης ειδικότητάς τους. Οι ερευνητικές προσπάθειες σήµερα επικεντρώνονται σε περισσότερο ειδικές θεραπείες, οι οποίες θα είναι αποτελεσµατικότερες, και παράλληλα θα παρουσιάζουν λιγότερες παρενέργειες. Η προσέγγιση αυτή είναι πλέον εφικτή, καθώς το αντιγόνο που είναι υπέυθυνο για τη µυασθένεια είναι καλά χαρακτηρισµένο. Μια νέα αντιγονοειδική προσέγγιση στηρίζεται στην ειδική αφαίρεση των αυτοαντισωµάτων από τον ορό των µυασθενών, χρησιµοποιώντας ανοσοπροσροφητικές στήλες που κατακρατούν ειδικά, µόνο τα αυτοαντισώµατα αυτά. Ωστόσο, η εφαρµογή της τεχνικής αυτής συναντά δυσκολίες λόγω της περιορισµένης ποσότητας φυσικού ανθρώπινου υποδοχέα. Μια ελκυστική εναλλακτική λύση είναι η χρήση ανασυνδυασµένων τµηµάτων του υποδοχέα µέσω ετερόλογης έκφρασης, µε παρόµοια διαµόρφωση µε αυτή του φυσικού υποδοχέα. Είναι γνωστό ότι το µεγαλύτερο µέρος των αντισωµάτων κατά του µυϊκού υποδοχέα κατευθύνεται στο εξωκυτταρικό τµήµα του υποδοχέα και πιο συγκεκριµένα στοχεύουν σε µία συγκεκριµένη περιοχή της α1 υποµονάδας η οποία ονοµάστηκε κύρια ανοσογόνος περιοχή (MIR) ( Tzartos et al., 1988, Tzartos and Lindstrom, 1980). H λύση της τρισδιάστατης δοµής της α1 υποµονάδας από ποντίκι και οι µελέτες ηλεκτρονικής µικροσκοπίας σε κρυστάλλους του µυϊκού τύπου υποδοχέα από το ψάρι Torpedo (Βerouklin and Unwin, 1995, Dellisanti et al., 2007) υπέδειξαν ότι η κύρια ανοσογόνος περιοχή εντοπίζεται στην εξωτερική επιφάνεια του υποδοχέα αποτελώντας εύκολο στόχο για τα αυτοαντισώµατα

30 Τέτοιες στήλες κατασκευάστηκαν χρησιµοποιώντας ως ανοσοπροσροφητή ένα συνθετικό πεπτίδιο, το οποίο αντιστοιχούσε σε τµήµα της α1 υποµονάδας από το ψάρι Torpedo marmorata (Takamori and Maruta, 2001). Ωστόσο, τα αποτελέσµατα ανοσοπροσρόφησης µε τη χρήση των στηλών αυτών ήταν ανεπαρκή, προφανώς γιατί οι στήλες έφεραν µικρά και όχι ανθρώπινα, συνθετικά πεπτίδια, ενώ η πλειονότητα των αυτοαντισωµάτων κατά του µυϊκού υποδοχέα στους ορούς των µυασθενών εξαρτάται από τη διαµόρφωση του υποδοχέα. Στις προηγούµενες µελέτες του εργαστηρίου έχει προηγηθεί έκφραση στο σύστηµα P. pastoris των ανασυνδυασµένων εξωκυτταρικών τµηµάτων των α1, β1, γ, δ και ε υποµονάδων του ανθρώπινου µυϊκού υποδοχέα για την κατασκευή στηλών ανοσοπροσρόφησης. Μελέτες ανοσοπροσρόφησης µε τις στήλες αυτές έδειξαν ότι τα ποσοστά αφαίρεσης των αυτοαντισωµάτων από ορούς µυασθενών ήταν 35% όταν ως ανοσοπροσροφητής χρησιµοποιούταν η α1 υποµονάδα, 22% στην περίπτωση της β1 υποµονάδας, και 21% και 18%, για τη γ και ε υποµονάδα αντίστοιχα. Η δ υποµονάδα δεν παρουσίαζε αντιγονικότητα (Psaridi-Linardaki et al., 2005, Kostelidou e al., 2006, Kostelidou et al., 2007). Στη συνέχεια ανταλλάσοντας την Cys-loop θηλιά των υποµονάδων µε αυτή της οµόλογης AChBP, που είναι πιο υδρόφιλη βελτιώθηκε τόσο η διαλυτότητα των πρωτεϊνών όσο και η αντιγονικότητά τους (Bitzopoulou et al., 2008, και µη δηµοσιευµενα αποτελέσµατα). Για όλες τις µεταγενέστερες προσπάθειες έχουν χρησιµοποιηθεί αυτές οι χιµαιρικές πρωτεΐνες. H παρούσα ερευνητική εργασία στόχο έχει σε πρώτη φάση την κατασκευή και έκφραση των χιµαιρικών εξωκυτταρικών περιοχών των υποµονάδων α και β του ανθρώπινου µυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης σε κύτταρα εντόµων µετά από επιµόλυνση µε βακιλοϊό. Το σύστηµα αυτό ετερόλογης έκφρασης συνιστά ένα ανώτερο σύστηµα έκφρασης σε σχέση µε το P. pastoris µε πιο συγγενή χαρακτηριστικά ως προς το ανθρώπινο. Έχει τα πλεονεκτήµατα των ανώτερων ευκαρυωτικών συστηµάτων, παρέχοντας την δυνατότητα παραγωγής διαλυτών πρωτεϊνών, οι οποίες έχουν υποστεί όλες τις µετά-µεταφραστικές τροποποιήσεις που απαιτούνται για την λειτουργικότητα τους (γλυκοζυλίωση, φωσφορυλίωση, δηµιουργία δισουλφιδικών δεσµών)

31 Επιπλέον πραγµατοποιήθηκε η σύνδεση των ΕΚΠ των υποµονάδων α και β του ανθρώπινου µυϊκού υποδοχέα µε πεπτιδικό συνδέτη 24 αµινοξέων για την δηµιουργία του συγκαταµερούς ΕΚΠ β-α. Στη βιβλιογραφία απαντώνται πολλές επιτυχηµένες προσπάθειες σύνδεσης των υποµονάδων ετερόλογων πρωτεϊνών ανάλογων του µυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. Για παράδειγµα η σύνδεση και των πέντε υποµονάδων του νευρικού υποδοχέα α3β4 κατέληξε στην κατασκευή ενός λειτουργικού µορίου (Groot-Kormelink et al., 2006). Επιπλέον, συγκαταµερή έχουν κατασκευαστεί χρησιµοποιώντας τις νευρικές υποµονάδες α4 και β2, σχηµατίζοντας λειτουργικούς νευρικούς υποδοχείς της ακετυλοχολίνης ( Zhou et al., 2003). Η έκφραση των συγκαταµερών στοχεύει στην δηµιουργία των διεπιφανειών µεταξύ γειτονικών υποµονάδων και κατά συνέπεια στην διαµόρφωση πιθανών επιτόπων (Fostieri et al., 2005). Ο τελικός σκοπός ήταν η µελέτη των επιπέδων έκφρασης και ο χαρακτηρισµός των παραγόµενων πεπτιδίων α ΕΚΠ, β ΕΚΠ και του συγκαταµερούς ΕΚΠ β-α στα κύτταρα εντόµων και ο έλεγχος της αντιγονικότητάς τους για τη χρήση τους ως πιθανούς ανοσοπροσροφητές στην θεραπεία της βαριάς µυασθένειας

32 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΙΙΙ

33 3 ΥΛΙΚΑ KAI MEΘΟ ΟΙ 3.1 Εργαστηριακός εξοπλισµός Για την εκπόνηση της παρούσας διπλωµατικής οι συσκευές και τα όργανα που χρησιµοποιήθηκαν είναι οι εξής: Συσκευή PCR MJ Research PTC-200 Eπωαστήρας για καλλιέργειες βακτηρίων υπό ανάδευση GALLENKAMP Φασµατοφωτόµετρο ορατού/υπεριώδους PERKIN ELMER Lambda Bio10 Φυγόκεντρος Sorvall RC5C Μικροφυγόκεντρος Eppendorf 5410 Ψυχόµενη µικροφυγόκεντρος Eppendorf 5415 R Επιτραπέζια φυγόκεντρος Juan CR422 Συσκευές οριζόντιας ηλεκτροφόρησης αγαρόζης Υδατόλουτρα Memmert και Digiterm Συσκευή FPLC ACTA purifier 90 της Αmersham Biosciences Aναλώσιµα Τρυβλία για στερεές καλλιέργειες βακτηρίων από Vive οκιµαστικοί σωλήνες πολυπροπυλενίου µιας χρήσης 15 και 50 ml από Falcon Πλαστικές αποστειρωµένες πιπέτες 1, 2, 5, 10 και 25 ml από Costar Πλαστικά ακρορύγχια (tips) Πλαστικές κυψελίδες µιας χρήσης από SARSTEDT Κυψελίδες χαλαζία οπτικής διαδροµής 0,25 cm, για µέτρηση οπτικής απορρόφησης διαλύµατος στην περιοχή του υπεριώδους Φίλτρα µε διάµετρο πόρου 0,22 και 0,45 µm από Μillipore Mεµβράνες νιτροκυτταρίνης Hybond C-extra από Amersham Biosciences

34 3.1.2 Aντιδραστήρια Αγαρόζη από Sigma Taq DNA πολυµεράση από Minotech dntps από Promega Περιοριστικές ενδονουκλεάσες από Roche, Fermentas και Νew England Biolabs Μάρτυρας µοριακών µεγεθών DNA 1 Kb από Fermentas T4 DNA λιγάση από Fermentas Αλκαλική φωσφατάση από Gibco BRL Aµπικιλλίνη από Βristol Mayers Squib Έγχρωµος µάρτυρας πρωτεϊνών µοριακών µεγεθών από KDa από Fermentas Πακεταρισµένη στήλη Superose 12 από Αmersham Biosciences α-µπουγκαροτοξίνη από Sigma Εναρκτήρια µόρια Οι αλληλουχίες των εναρκτήριων µορίων που χρησιµοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία για την κατασκευή του πλασµιδίου ptriex-β (αγρίου τύπου) µε αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης, ώστε να ανακτηθεί το ένθεµα ΝcoI-SP-β EΚΠ-NotI χρησιµοποιώντας ως εκµαγείο το cdna ολόκληρης της ανθρώπινης β1 υποµονάδας, είναι οι εξής: 5 - ATATATCCATGGAGCCAGGGGCTCTGC 5 - ATA GTT TAGCGGCCGC TCA ATGGTGATGGTGATGGTGCTTGCGGCGGA Αντισώµατα Στην παρούσα µελέτη χρησιµοποιήθηκαν τα παρακάτω µονοκλωνικά αντισώµατα: Μονοκλωνικό αντίσωµα mab198 έναντι της α1 υποµονάδας του ανθρώπινου µυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης

35 Μονοκλωνικό αντίσωµα mab73 έναντι της β1 υποµονάδας του ανθρώπινου µυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Aλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR) Kατά την αντίδραση PCR, ενισχύεται µια νουκλεοτιδική αλληλουχία µεταξύ δύο περιοχών µιας µήτρας DNA γνωστής αλληλουχίας. Οι συνθετικές αντιδράσεις πραγµατοποιούνται µε τη βοήθεια δύο ολιγονουκλεοτιδίων, που χρησιµοποιούνται ως εναρκτήρια µόρια (primers) για τον πολυµερισµό συµπληρωµατικών προς τη µήτρα DNA αλυσίδων και µιας ανθεκτικής σε υψηλές θερµοκρασίες DNA πολυµεράσης, η οποία καταλύει τη σύνθεση παρουσία δεοξυριβονουκλεοτιδίων (Μullis and Faloona, 1986). Kάθε ολιγονουκλεοτίδιο είναι συµπληρωµατικό µε µια διαφορετική αλυσίδα της µήτρας DNA και το ελεύθερο υδροξύλιο χρησιµοποιείται για τη δηµιουργία φωσφοδιεστερικού δεσµού µε τα ελέυθερα νουκλεοτίδια. Με αυτό τον τρόπο, η αλυσίδα συντίθεται από το 5'- στο 3' άκρο. Η αντίδραση λαµβάνει χώρα παρουσία µοριακής περίσσειας των δύο εναρκτήριων µορίων και των τεσσάρων dntps. Aρχικά, πραγµατοποιείται αποδιάταξη της µήτρας του δίκλωνου DNA µε θέρµανση, ώστε να παραχθούν µονόκλωνα µόρια DNA. Aκολουθεί ψύξη του µίγµατος της αντίδρασης σε θερµοκρασία που επιτρέπει την υβριδοποίηση των εναρκτήριων µορίων µε τις συµπληρωµατικές αλυσίδες της µήτρας DNA και τέλος, πραγµατοποιείται επιµήκυνση των νέων αλυσίδων DΝA από την DNA πολυµεράση. Ο κύκλος των αντιδράσεων αποδιάταξη-υβριδοποίησηεπιµήκυνση επαναλαµβάνεται πολλές φορές και τα προϊόντα κάθε κύκλου ενίσχυσης χρησιµοποιούνται ως µήτρα DNA στον επόµενο κύκλο. Έτσι, σε κάθε κύκλο θεωρητικά διπλασιάζεται η ποσότητα του επιθυµητού προϊόντος DNA, ώστε στο τέλος ν κύκλων, το διάλυµα της αντίδρασης περιέχει θεωρητικά 2 ν µόρια

36 Υποκλωνοποίηση δίκλωνου τµήµατος DNA σε πλασµιδιακό φορέα Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες είναι ένζυµα αποµονωµένα από φυσικές πηγές (βακτήρια), τα οποία αναγνωρίζουν µικρές αλληλουχίες DNA, πέπτοντας το δίκλωνο DNA σε συγκεκριµένες θέσεις εντός της αλληλουχίας αναγνώρισης ή σε γειτονικό της σηµείο. Για την αποτελεσµατικότερη δράση των ενζύµων, απαιτούνται καθαρά δείγµατα DNA, απαλλαγµένα από προσµίξεις. Μια µονάδα (1 U ) περιοριστικής ενδονουκλεάσης ορίζεται ως η ποσότητα του ενζύµου που απαιτείται για την πλήρη πέψη 1µg καθαρού DNA. Επειδή πολλές φορές το DNA που χρησιµοποιείται για πέψη µε περιοριστικά ένζυµα είναι µερικώς καθαρισµένο, απαιτείται συνήθως µεγαλύτερη ποσότητα ενζύµου ή/και µεγαλύτερος χρόνος επώασης. Γενικά η σχέση που χρησιµοποιήθηκε ήταν 2-3U περιοριστικού ενζύµου /1 µg DNA / 20 µl. Οι συνθήκες της αντίδρασης είναι ειδικές για κάθε περιοριστική ενδονουκλεάση. Τα ένζυµα προστέθηκαν σε όγκο που αντιστοιχούσε στο 1/10 του όγκου και η ποσότητα του πλασµιδιακού DNA ή η ποσότητα του προϊόντος της PCR δεν ξεπερνά το ¼ του τελικού όγκου. Ο έλεγχος των αντιδράσεων πέψης έγινε µε ηλεκτροφόρηση δείγµατος από το διάλυµα της αντίδρασης σε πήκτωµα αγαρόζης 1% κ.β Αποφωσφορύλιωση γραµµικού πλασµιδιακού DNA Σε ορισµένες κλωνοποιήσεις, όπου το µόριο του πλασµιδιακού DNA έχει κοπεί µε ένα περιοριστικό ένζυµο που δηµιουργεί συµπληρωµατικά κολλώδη άκρα ή ισοτελή άκρα, υπάρχει η πιθανότητα κατά την αντίδραση σύνδεσης µε το προς κλωνοποίηση τµήµα DNA, τα άκρα αυτά να επανασυνδέσουν, αποκλείοντας έτσι την κλωνοποίηση. Σε αυτή την περίπτωση, προηγείται της αντίδρασης, αποφωσφορυλίωση του γραµµικού µορίου DNA µε χρήση του ενζύµου της αλκαλικής φωσφατάσης, το οποίο αποσφωρυλιώνει τα 5 -άκρα του γραµµικού πλασµιδιακού DNA. Το προς κλωνοποίηση µόριο DNA µπορεί και συνδέεται µε το αποφωσφορυλιωµένο πλασµίδιο, σχηµατίζοντας σε κάθε άκρο φωσφοδιεστερικό δεσµό στη µία από τις δύο αλυσίδες. Στη συνέχεια το βακτήριο Ε.coli επιδιορθώνει τα αποφωσφορυλιωµένα άκρα, οπότε δηµιουργούνται οι δεσµοί και στις δύο αλυσίδες και το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο διπλασιάζεται πλέον κανονικά. Η πορεία της αποφωσφορύλιωσης γραµµικού πλασµιδιακού DNA είναι η εξής :

37 Γίνεται ανάµειξη 50λ διαλύµατος 10mM Tris-HCL, ph 8,3 περιέχοντος 10 µg καθαρού (καθαρισµένου από στήλη QIAquick) γραµµικού πλασµιδιακού DNA µε 10 µl ρυθµιστικού διαλύµατος αποφωσφορυλίωσης. Στη συνέχεια προστίθενται 5µL (0,5U) διαλύµατος φωσφατάσης και 35µL ddh 2 0 και το µίγµα επωάζεται στους 37 C, για 60 min. Ακολουθεί επώαση στους 65 C για 10 min, ώστε να σταµατήσει η αντίδραση, και καθαρισµός µε στήλη QIAquick. Το DNA εκλούεται µε προσθήκη στη στήλη 40 µl ρυθµιστικού διαλύµατος 10mM Tris-HCL ph 8,0 και φυγοκέντρηση στις rpm για 1min σε θερµοκρασία δωµατίου Αντίδραση σύνδεσης Η αντίδραση σύνδεσης των προς κλωνοποίηση µορίων DNA µε µόρια πλασµιδιακού DNA πραγµατοποιείται µε τη χρήση ποσότητας 100 ng από το καθένα από τα δύο αυτά αντιδρώντα και µε την προσθήκη 2 µl T4 λιγάσης σε τελικό όγκο 22 µl ρυθµιστικού διαλύµατος. Ακολουθεί επώαση των δειγµάτων σε θερµοκρασία δωµατίου για 1h. Tα προϊόντα των αντιδράσεων σύνδεσης χρησιµοποιούνται άµεσα για το µετασχηµατισµό βακτηρίων TOP10F. Σε περίπτωση που το προς κλωνοποίηση µόριο DNA και το πλασµίδιο διαθέτουν συµπληρωµατικά άκρα που έχουν προκύψει από πέψη µε το ίδιο περιοριστικό ένζυµο, η σύνδεση πραγµατοποιείται µε την ίδια πιθανότητα και µε τους δύο προσανατολισµούς. Η εύρεση του σωστού προσανατολισµού σύνδεσης γίνεται µε τη χρήση περιοριστικών ενζύµων που κόβουν ασύµµετρα µέσα στο κλωνοποιηµένο τµήµα Μετασχηµατισµός βακτηριακών κυττάρων µε την χηµική µέθοδο του CaCl 2 Τα ανασυνδυασµένα πλασµίδια που προκύπτουν από την αντίδραση σύνδεσης χρησιµοποιούνται για το µετασχηµατισµό βακτηρίων, ώστε να ακολουθήσει η παραγωγή τους σε µεγάλες ποσότητες. Η χηµική µέθοδος µετασχηµατισµού βακτηριακών κυττάρων στηρίζεται στην απόδοση θετικού φορτίου στο τοίχωµα τους µετά από έκθεση τους σε CaCl 2, έτσι ώστε να πραγµατοποιείται η έλξη των αρνητικά φορτισµένων οµάδων του ανασυνδυασµένου DNA (Sambrook et al., 1989) και να διευκολύνεται µε αυτό το τρόπο η είσοδος τους στο βακτηριακό κύτταρο. Τα µετασχηµατισµένα

38 κύτταρα αποµονώνονται σε θρεπτικό υλικό επιλογής (µε το κατάλληλο αντιβιοτικό). Η ικανότητα µετασχηµατισµού µε τη µέθοδο αυτή είναι περίπου 0,5-2,0 x 10 7 βακτήρια/µg υπερελικωµένου DNA. I. Προετοιµασία δεκτικών κυττάρων µε χρήση CaCl 2 Γίνεται εµβολιασµός µίας αποικίας βακτηρίων TOP10F σε 10ml LB και ακολουθεί επώαση υπό ανάδευση, στους 37 C για περίπου 16 h. Στη συνέχεια χρησιµοποιούνται 2 ml από αυτή την καλλιέργεια για εµβολιασµό 100 ml LB, τα οποία επωάζονται υπό ανάδευση στους 37 C, µέχρις ότου Ο.D. 600 =0,6-0,9 (~2h). Ακολουθεί µεταφορά της υάλινης φιάλης, µέσα στην οποία βρίσκεται η καλλιέργεια, σε πάγο (0 C), όπου παραµένει για 30min. 'Eπειτα γίνεται µεταφορά της καλλιέργειας σε δύο στείρους προψυγµένους σωλήνες των 50 ml και φυγοκέντρηση σε επιτραπέζια φυγόκεντρο Juan (4.000 rpm, 10 min, 4 C). To ίζηµα των βακτηρίων αναδιαλύεται σε 25 ml στείρου παγωµένου διαλύµατος 50 mm CaCl 2. Το εναιώρηµα φυγοκεντρείται ξανά στις ίδιες συνθήκες και το ίζηµα των βακτηρίων αναδιαλύεται σε 5 ml στείρου παγωµένου διαλύµατος 50mM CaCl 2.Στη συνέχεια, το εναιώρηµα τοποθετείται στον πάγο για 2-3 h. Έπειτα, είτε ακολουθεί άµεσα ο µετασχηµατισµός των δεκτικών κυττάρων είτε µπορούν να καταψυχθούν ανά 100 µl στους -80 C παρουσία 20% γλυκερόλης για µελλοντική χρήση. ΙΙ. Μετασχηµατισµός επιδεκτικών κυττάρων βακτηρίων Το εναιώρηµα των επιδεκτικών βακτηριακών κυττάρων αφήνεται να ξεπαγώσει αργά σε πάγο, όταν χρησιµοποιούνται επιδεκτικά κύτταρα από -80 C. Στη συνέχεια γίνεται ανάµειξη 2 µl κατάλληλα αραιωµένου µε ddh 2 O ανασυνδυασµένου πλασµιδιακού DNA από τα προϊόντα της αντίδρασης σύνδεσης µε 100 µl. Ακολουθεί επώαση του µείγµατος σε πάγο για 45 min και στη συνέχεια ακολουθεί επώαση σε 42 C αυστηρά για 1 min. To µείγµα τοποθετείται άµεσα σε πάγο και επωάζεται για 2-5 min. Γίνεται εν συνεχεία, προσθήκη στο µείγµα 1 ml LB και επώαση, υπό ανάδευση στους 37 C για 1 h. 'Eπειτα, τα βακτήρια επιστρώνονται σε στερεό θρεπτικό µέσο, µέσα σε τρυβλίο Petri, παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού (100 µg/ml αµπικιλλίνη) και επωάζονται για ~16 h στους 37 C, οπότε και εµφανίζονται αποικίες επιτυχώς µόνο µετασχηµατισµένων

39 βακτηρίων Υγρές και στερεές καλλιέργειες βακτηρίων Χρησιµοποιήθηκαν στελέχη TOP10F της Ε.coli, τα οποία καλλιεργήθηκαν σε υγρό ή στερεό θρεπτικό µέσο LB παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού (100 µg/ml αµπικιλλίνη). Η ανάπτυξη τους πραγµατοποιήθηκε στους 37 C, σε επωαστικούς θαλάµους. Για τις υγρές καλλιέργειες, η επώαση πραγµατοποιήθηκε υπό ανάδευση (200 rpm) σε αποστειρωµένους πλαστικούς σωλήνες µιας χρήσης των 15 ml ή σε υάλινες κωνικές φιάλες των 2 L (καλλιέργειες σε µεγάλη κλίµακα). Για όλες τις καλλιέργειες πραγµατοποιήθηκε επώαση για χρόνο 16 h. Τα µετασχηµατισµένα και µη µετασχηµατισµένα βακτήρια διατηρούνται για µεγάλα χρονικά διαστήµατα στους -80 C στο κατάλληλο θρεπτικό µέσο παρουσία 20% γλυκερόλης Παρασκευή πλασµιδιακού DNA σε µικρή κλίµακα µε τη µέθοδο της αλκαλικής λύσης Με τη µέθοδο αυτή αποµονώνεται µικρή ποσότητα µερικώς καθαρισµένου πλασµιδιακού DNA ελέγχεται στην συνέχεια µε πέψη από περιοριστικές ενδονουκλεάσες, για τον εντοπισµό των κλώνων που φέρουν το επιθυµητό ανασυνδυασµένο πλασµίδιο. Η διαδικασία έχει ως εξής: Γίνεται εµβολιασµός κυττάρων µιας αποικίας µετασχηµατισµένων βακτηρίων σε 5 ml θρεπτικού υλικού LB περιέχων το κατάλληλο αντιβιοτικό και ακολουθεί επώαση υπό ανάδευση, στους 37 C, για 16h. Από την παραπάνω καλλιέργεια, φυγοκεντρείται ποσότητα 3 ml στις rpm, για 1 min, σε θερµοκρασία δωµατίου. Το ίζηµα των βακτηριακών κυττάρων αναδιαλύεται σε 100 µl ρυθµιστικού διαλύµατος (50 mm γλυκόζης, 25 mm Tris-HCl, ph 8,0, 10 mm EDTA) υπό ανάδευση και το εναιώρηµα τοποθετείται στον πάγο για 10 min. Στη συνέχεια 0,2 Μ NaOH, 1% κ.β. SDS, υπό ανάδευση, και το µίγµα επωάζεται στον πάγο για 10 min. Στη συνέχεια, προστίθεται 200 µl πρόσφατα παρασκευασµένου διαλύµατος 0,2 Μ ΝaOH 1%κ.β.SDS, υπό ανάδευση, και το µίγµα επωάζεται στον πάγο για 10 min. Στη συνέχεια, προστίθενται 150 µl 3M ρυθµιστικού διαλύµατος οξικών, ph 5,5 και το µίγµα επωάζεται στον πάγο για 10 min έπειτα από ανάδευση. Το

40 ίζηµα των κυτταρικών υπολειµµάτων (µεµβρανικά θραύσµατα, πρωτεΐνες, χρωµοσωµικό DNA και RNA) αποµακρύνεται µε φυγοκέντρηση στις rpm, για 10 min, σε ψυχοµένη φυγόκεντρο eppendorf. Στο υπερκείµενο προστίθεται ισοπροπανόλη ποσότητας ίσης προς 0,6xV διαλύµατος για την κατακρήµνιση του πλασµιδιακού DNA και του RNA. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις rpm για 10 min και αποµάκρυνση του υπερκειµένου. Το ίζηµα ξεπλένεται µε αιθανόλη 70% κ.ο. και έπειτα από την πλήρη εξάτµιση της ακολουθεί αναδιάλυση σε 50 µl διαλύµατος ΤΕ-RNAάσης. Στη συνέχεια γίνεται πέψη 10 µλ διαλύµατος του πλασµιδιακού DNA µε περιοριστικές ενδονουκλεάσες και ανάλυση των προϊόντων της πέψης µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης Ποσοτική και ποιοτική ανάλυση του δείγµατος DNA Ι. Ποσοτική ανάλυση H συγκέντρωση διαλύµατος δίκλωνου DNA προσδιορίζεται φωτοµετρικά µε µέτρηση της απορρόφησης του διαλύµατος στα 260nm (Α 260 ), όπου απορροφούν οι αζωτούχες βάσεις του DNA (Κοzutsumi et al., 1989) και µε τη χρήση της εξίσωσης: C DNA ( µg/µλ)= ( Α 260 x 50 x παράγοντας αραίωσης)/1000. Η καθαρότητα του DNA στο παρασκεύασµα προσδιορίζεται από το λόγο Α 260 /Α 280, ο οποίος για καθαρά παρασκευάσµατα είναι ίσος προς 1,8. Τέλος, η ποιότητα του DNA ελέγχεται µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης. ΙΙ. Ποιοτική ανάλυση Τα µόρια DNA είναι οµοιόµορφα αρνητικά φορτισµένα, λόγω του ιονισµού των φωσφορικών τους οµάδων. Έτσι, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου τα µόρια DNA µετακινούνται προς το θετικό πόλο σε οριζόντιο πήκτωµα αγαρόζης µε ταχύτητα ανάλογη προς το µέγεθος τους. Η θέση µετανάστευσης κάθε µορίου DNA προσδιορίζεται κατά την έκθεση του πηκτώµατος σε υπεριώδη ακτινοβολία ( nm), λόγω της ενσωµάτωσης φθορίζουσας χρωστικής (βρωµιούχο αιθίδιο) ανάµεσα στις αζωτούχες βάσεις της διπλής έλικας του DNA. Η µέθοδος παρέχει υψηλή ανάλυση και χρησιµοποιείται για την ταυτοποίηση, το διαχωρισµό και την αποµόνωση µορίων DNA µε βάση το µέγεθος τους

41 Παραγωγή ανασυνδυασµένου βακιλοϊού P0 Αρχικά αναµιγνύεται το DNA του βακιλoϊού (FlashBackGold, Oxford Expression Technologies) µε το DNA του φορέα έκφρασης (ptriex) όπου έχει υποκλωνοποιηθεί το γονίδιο προς έκφραση σε γυάλινα tubes και Lipofectin, τα οποία αφήνονται σε ηρεµία σε θερµοκρασία δωµατίου για 30 min, ώστε να δηµιουργηθούν λιποσώµατα. Παράλληλα χρησιµοποιείται ως control µόνο Lipofectin για έλεγχο της βιωσιµότητας των κυττάρων. Τα αντιδραστήρια τα οποία χρησιµοποιούνται είναι τα εξής: 1ml Θρεπτικού υλικού SF900II XΩΡΙΣ FBS. 5λ Lipofectin. 500ngr DNA ptriex. 5λ DNA Baculovirus Σε στάδιο προεργασίας έχουν επιστρωθεί σε 6-well πλάκες 1,5χ10Ε6 κύτταρα/ml, αποµακρύνεται λοιπόν το υλικό µε πιπέτα Pasteur και ξεπλένονται µε θρεπτικό υλικό τα κύτταρα, ώστε να ακολουθήσει η προσθήκη του DNA του ανασυνδυασµένου βακιλοϊού πάνω στα κύτταρα κατά σταγόνες. Μετά την προσθήκη τοποθετούνται για 16 h στον επωαστήρα και µετά το πέρας της επώασης προστίθεται 1ml θρεπτικού υλικού SF900II+10% FBS κατά σταγόνες. Η επώαση διαρκεί συνολικά 7 µέρες στον επωαστήρα µέχρι την συλλογή του ιού. Συλλέγεται το υγρό επίστρωµα και φυγοκεντρείται στα 4000rpm για 5 min. Μεταφέρεται το υπερκείµενο σε νέο falcon και φυλάσσεται µε αλουµινόχαρτο στους 4 C (διότι ο ιός είναι φωτοευαίσθητος) έως 6 µήνες, ή στους -80 C για µεγαλύτερο χρονικό διάστηµα Plaque assay για την τιτλοδότηση του ανασυνδυασµένου βακιλοϊού Τα κύτταρα που θα χρησιµοποιηθούν για Plaque assay δεν είναι απαραίτητο να είναι 100% confluent. Προετοιµάζονται 6-well πλάκες στις οποίες επιστρώνεται κατάλληλος αριθµός κυττάρων 1,5x10Ε6 κύτταρα και αφήνονται σε κατάσταση ηρεµίας σε θερµοκρασία δωµατίου για 1h, ώστε να καλύψουν την επιφάνεια της πλάκας. Παράλληλα πραγµατοποιούνται διαδοχικές αραιώσεις του

42 ιού σε eppendorfs ξεκινώντας µε 450λ θρεπτικού υλικού και 50λ ιού. Αφαιρείται από τις πλάκες το θρεπτικό υλικό µε πιπέτα Pasteur και προστίθενται 200λ ιού από κάθε αραίωση κατά σταγόνες. Συνήθως πραγµατοποιούνται duplicates σε αυτό το στάδιο και ως µάρτυρα προστίθενται 200λ θρεπτικό υλικό (control). Στη συνέχεια οι πλάκες αφήνονται σε κατάσταση ηρεµίας σε θερµοκρασία δωµατίου για 1h, ώστε να προσκολληθεί ο ιός. Ο χρόνος επώασης δεν πρέπει να ξεπεράσει την 1h. Πριν ολοκληρωθεί η επώαση, τήκεται η αγαρόζη, η οποία διατηρείται σε υδατόλουτρο (45 C) µέχρι να χρησιµοποιηθεί. Μετά την λήξη της επώασης προστίθενται 2ml από διάλυµα αγαρόζης θρεπτικού 1:1 ακουµπώντας στην άκρη της πλάκας, αφού αφαιρεθεί πρώτα το υγρό υπερκείµενο (ιός), ακολουθεί επώαση σε θερµοκρασία δωµατίου µέχρι να πήξει η αγαρόζη και προστίθεται επιπλέον 1ml θρεπτικού υλικού. Στη συνέχεια τοποθετούνται στον επωαστήρα για 3-4 µέρες µέχρι να καλύψουν την επιφάνεια της πλάκας. Τότε, αφαιρείται το υγρό επίστρωµα και προστίθεται 1ml χρωστικής Νeutral Red (1:20 αραίωση). ιατηρούνται στο σκοτάδι για 3-4h και στο τελικό στάδιο αφαιρείται η χρωστική µε πιπέτα Pasteur. Όταν ολοκληρωθεί η διαδικασία παρατηρούνται διαυγείς πλάκες σε κάθε αραίωση και υπολογίζεται ο τίτλος ως εξής: Tίτλος βακιλοϊού (pfu ml)= Mέσος όρος πλακών παράγοντας αραίωσης Αποµόνωση των ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών από υπερκείµενο καλλιέργειας Ι. Μικροδιήθηση Το υπερκείµενο της καλλιέργειας µεταφέρεται σε µεταλλικό αποστειρωµένο καζάνι, το οποίο κλείνει. Εν συνεχεία, γίνεται σύνδεση του καζανιού αυτού µε φιάλη παροχής αζώτου, υπό πίεση, µέσω ενός λάστιχου το οποίο εφαρµόζει σε ειδική οπή του άνωθεν µέρους του µεταλλικού καζανιού. Από µία άλλη αντιδιαµετρική οπή γίνεται σύνδεση, επίσης µέσω λάστιχου, µε το άνωθεν τµήµα µίας µεταλλικής συσκευής µικροδιήθησης, µέσα στην οποία έχουν τοποθετηθεί, σε οριζόντια διάταξη και από πάνω προς τα κάτω, διηθητικό χαρτί Watmann 3 MM, γάζα, φίλτρο µε διάµετρο πόρου 0,45 µm, γάζα και φίλτρο µε διάµετρο πόρου 0,2 µm. Σε µια οπή στο κάτω µέρος της

43 συσκευής αυτής συνδέεται επίσης ένα λάστιχο, το οποίο καταλήγει σε µια µεγάλη κωνική φιάλη, προκειµένου να γίνει η συλλογή του φιλτραρισµένου πλέον υπερκείµενου των καλλιεργειών (µέσα στο οποίο βρίσκονται οι εκκρινόµενες ανασυνδυασµένες πρωτεΐνες), έπειτα από την διοχέτευση αερίου αζώτου υπό πίεση ~ 1 Atm στο αρχικό τµήµα συνδεσµολογίας του συστήµατος. ΙΙ. Υπερδιήθηση Μετά το φιλτράρισµα του υπερκειµένου των καλλιεργειών, ακολουθεί η συµπύκνωση του µέσω συσκευής εφαπτόµενης συνεχούς ροής της Millipore, στο εσωτερικό της οποίας υπάρχει µεµβράνη µε συγκεκριµένη διάµετρο, ώστε να αποκλείεται η διέλευση µορίων > 10 kda. H µεµβράνη συγκρατεί µόρια µεγαλύτερα από τη διάµετρο των πόρων της, ενώ τα µικρότερα µόρια διαφεύγουν της µεµβράνης µαζί µε το διάλυµα. Η συσκευή ξεπλένεται µε 2 L ddh 2 O πριν τη χρήση χωρίς ανακύκλωση, ώστε να αποµακρυνθεί το διάλυµα 0,2 Μ NaOH αποθήκευσης της συσκευής. Στη συνέχεια, πραγµατοποιείται η ροή του πρωτεϊνικού ρυθµιστικού διαλύµατος διαµέσου της συσκευής υπερδιήθησης µε ανακύκλωση, µέσω περισταλτικής αντλίας ρυθµιζόµενης ογκοµετρικής παροχής. Στο τέλος της διαδικασίας συµπύκνωσης του αρχικού διαλύµατος, πραγµατοποιείται διαπίδυση έναντι 2 L ρυθµιστικού διαλύµατος για κάθε 1 L αρχικού υπερκείµενου και εκ νέου συµπύκνωση. Ακολουθεί έκπλυση της συσκευής πρώτα µε 2 L ddh20 και στη συνέχεια µε 2 L 0,2 M NaOH και αποθήκευση της µέχρι την επόµενη χρήση της στους 4 C Χρωµατογραφία συγγένειας Το πρώτο στάδιο καθαρισµού των ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών στηρίζεται στην ύπαρξη 8 συνεχόµενων καταλοίπων ιστιδίνης στο καρβοξυ-τελικό άκρο τους. Σε αλκαλικό περιβάλλον, οι ανασυνδυασµένες αυτές πρωτεΐνες προσδένονται µε υψηλή συγγένεια σε στήλη ρητίνης συζευγµένη µε ιόντα νικελίου (Ni 2+ -NTA), λόγω των αρνητικά φορτισµένων δακτυλίων ιµιδαζολίου των ιστιδινών. Η έκλουση των προσδεδεµένων στη στήλη Ni 2+ -NTA, πρωτεϊνών, πραγµατοποιείται µε χρήση αυξανόµενων συγκεντρώσεων ιµιδαζολίου, το οποίο ανταγωνίζεται τα ιµιδαζόλια των ιστιδινών της πρωτεΐνης για πρόσδεση στα ιόντα νικελίου της στήλης. Η πορεία

44 είναι η εξής: Kατάλληλος όγκος εναιωρήµατος µέσα σε πλαστικούς δοκιµαστικούς σωλήνες 50 ml που περιέχει 50% κ.ο. σφαιρίδια Νi 2+ -ΝΤΑ αγαρόζης, ώστε να τηρείται αναλογία 1 ml καθαρών σφαιριδίων / 1 L αρχικής καλλιέργειας, φυγοκεντρείται σε επιτραπέζια φυγόκεντρο Juan (1000 rpm, 5 min, 4 C). Aκολουθεί προσεκτική αποµάκρυνση του υπερκειµένου και εξισορρόπηση του ιζήµατος µε 50 mm PB, ph 8,0, 300 mm NaCl, υπό ήπια ανάδευση διάρκειας ~ 10 min. Aκολουθούν τρεις πλύσεις των σφαιριδίων µε το παραπάνω διάλυµα µε φυγοκέντρηση στις rpm, 5 min, 4 C. Mετά την τελευταία φυγοκέντρηση γίνεται αναδιάλυση του ιζήµατος σε κατάλληλο όγκο 50 mm PB, ph 8,0, 300mM NaCl. Στη συνέχεια γίνεται προσθήκη της κατάλληλης ποσότητας αναδιαλυµένων σφαιριδίων Νi 2+ -ΝΤΑ αγαρόζης µέσα σε πλαστικό σωλήνα 250 ml, στον οποίο βρίσκεται ήδη τοποθετηµένο το διάλυµα του υπερκειµένου των καλλιεργειών µετά την διαδικασία υπερδιήθησης (1 ml καθαρών σφαιριδίων/ L αρχικής καλλιέργειας) και ακολουθεί επώαση υπό ανάδευση σε 4 C κατά τη διάρκεια της νύχτας, προκειµένου να επιτευχθεί η πρόσδεση των πρωτεϊνών στα σφαιρίδια Νi 2+ -ΝΤΑ αγαρόζης. Την εποµένη ακολουθεί διακοπή της επώασης και φυγοκέντρηση του διαλύµατος σε επιτραπέζια φυγόκεντρο Juan (1000 rpm, 5 min, 4 C). To υπερκείµενο αποµακρύνεται και φυλάσσεται στους 4 C, ενώ το ίζηµα αναδιαλύεται σε δεκαπλάσιο όγκο διαλύµατος πλύσης (50 mm PB, ph 8,0, 300 mm NaCl, 10 mm ιµιδαζόλιο). Ακολουθεί η απόχυση αυτού σε υάλινη στήλη χρωµατογραφίας, οπότε µε το πέρας του διαλύµατος πλύσης αφενός αποµακρύνονται οι ασθενώς µη ειδικά προσδεδεµένες προσµίξεις και αφετέρου επιτυγχάνεται το πακετάρισµα της στήλης των σφαιριδίων. Στη συνέχεια πραγµατοποιούνται δύο επιπλέον πλύσεις µε τη χρήση δύο όγκων στήλης για καθένα από τα διαλύµατα 50 mm PB, ph 8,0, 300 mm NaCl που περιέχουν αντίστοιχα 30 mm και 50 mm ιµιδαζολίου. Η έκλουση πραγµατοποιείται µε διάλυµα 50 mm PB, ph 8,0, 300 mm NaCl που περιέχει 150 mm ιµιδαζολίου για την ΕΚΠ της β1 υποµονάδας, καθώς και το συγκαταµερές β-α και 250 mm ιµιδαζολίου για την ΕΚΠ της α1 υποµονάδας. Η παρουσία των ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών στα διαλύµατα έκλουσης πιστοποιείται µε SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση και µε πειράµατα πρόσδεσης σηµασµένης α-µπουγκαροτοξίνης

45 Χρωµατογραφία µοριακής διήθησης Το δεύτερο στάδιο καθαρισµού πραγµατοποιείται µε χρωµατογραφία µοριακής διήθησης σε σύστηµα υγρής χρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης (FPLC). O διαχωρισµός από άλλα µόριαπροσµίξεις που βρίσκονται στα δείγµατα έκλουσης από τη στήλη Νi 2+ -ΝΤΑ αγαρόζης επιτυγχάνεται βάσει του διαφορετικού µεγέθους και σχήµατος κατά τη διέλευση τους από υλικό µε συγκεκριµένη διάµετρο πόρων. Η στήλη µοριακού αποκλεισµού που χρησιµοποιήθηκε ήταν η Superose 12, όγκου 24 ml και µε διάµετρο πόρων 10 kda. Αρχικά πραγµατοποιείται συµπύκνωση, έτσι γίνεται και αλλαγή του διαλύµατος της πρωτεΐνης µετά το πέρας τριών διαδοχικών φυγoκεντρήσεων σε επιτραπέζια φυγόκεντρο Eppendorf (2.500 rpm, 10 min, 4 C). Στη συνέχεια έγινε το φιλτράρισµα του δείγµατος αυτού µέσω φίλτρου διαµέτρου πόρων 0,2 µm και ακολούθησε η ένεση του µε κατάλληλη σύριγγα του 1 ml στο σύστηµα FPLC, στο οποίο είχε τοποθετηθεί και εξισορροπηθεί µε το ίδιο διάλυµα (φιλτραρισµένο µέσω φίλτρων 0,2 µm και απαερωµένο µε χρήση λουτρού υπερήχων) στη στήλη Superose 12. Aκολούθησε χρωµατογραφία µοριακής διήθησης µε ροή διαλύµατος χρωµατογραφίας µοριακού αποκλεισµού ίση µε 0,5 ml/min και συλλογή κλασµάτων 0,5 ml έκαστο. Η ανίχνευση της εκλουόµενης πρωτεΐνης στα διάφορα εκλούσµατα της στήλης πραγµατοποιήθηκε µε πειράµατα πρόσδεσης ραδιενεργώς σηµασµένης α-µπουγκαροτοξίνης και µε την µέθοδο ανίχνευσης κατά Western, ενώ ο καθαρισµός της επιβεβαιώθηκε µε SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών υπό αποδιατακτικές συνθήκες ( SDS- PAGE) Ο διαχωρισµός και η ταυτοποίηση των πρωτεϊνών µε βάση το µοριακό τους βάρος γίνεται µε ηλεκτροφόρηση σε κάθετο πήκτωµα πολυακρυλαµίδιου, παρουσία θειικού δωδεκυλικού νατρίου SDS. Oι πρωτεΐνες κατά την έκθεση στο αρνητικά φορτισµένο SDS αποκτούν αρνητικό φορτίο (σε κάθε αµινοξύ µιας πρωτεΐνης δεσµεύεται περίπου ένα µόριο SDS) και µετακινούνται προς το

46 θετικό πόλο µε ταχύτητα αντιστρόφως ανάλογη προς το µέγεθος τους. Κατά τη µέθοδο της κάθετης ηλεκτροφόρησης, οι πρωτεΐνες τοποθετούνται αρχικά σε πήκτωµα χαµηλής περιεκτικότητας σε ακρυλαµίδιο (πήκτωµα συµπύκνωσης), ενώ ο διαχωρισµός πραγµατοποιείται, αφού οι πρωτεΐνες περάσουν σε πήκτωµα υψηλής περιεκτικότητας σε ακρυλαµίδιο (πήκτωµα διαχωρισµού). Το πήκτωµα συµπύκνωσης (stacking gel) περιέχει 0,125 Μ Tris-ΗCL, ph 0,8, 0,1 % κ.β. SDS και 4% κ.β. ακρυλαµίδιο. To πήκτωµα διαχωρισµού περιέχει 0,375 Μ Tris-ΗCL, ph 6,8, 0,1 % κ.β. SDS και 12,5% κ.β. ακρυλαµίδιο. Ο πολυµερισµός των πηκτωµάτων πραγµατοποιείται µε προσθήκη 1% κ.β. ΑPS και 0,04% κ.ο. ΤΕΜΕD ως καταλύτη πολυµερισµού του ακρυλαµιδίου. Τα δείγµατα επωάζονται για 3 min στους 95 C. Οι συνθήκες είναι αποδιατακτικές για τις πρωτεΐνες, καθώς τα δείγµατα αναµειγνύονται µε διάλυµα φόρτωσης πρωτεϊνών, που περιέχει SDS και β-µερκαπτοαιθανόλη. Ο βρασµός παρουσία SDS έχει ως αποτέλεσµα τη διάσπαση δεσµών (υδρογόνου, ιοντικών, υδρόφοβων και Van der Waals αλληλεπιδράσεων), ενώ η β- µερκαπτοαιθανόλη την αναγωγή των οµοιοπολικών δισουλφιδικών δεσµών. Παράλληλα µε τα προς εξέταση δείγµατα, γίνεται ανάλυση µείγµατος πρωτεϊνών γνωστού µοριακού βάρους. H ηλεκτροφόρηση πραγµατοποιείται υπό σταθερή τάση 120 V σε ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών (25 mm Tris-base, 200 mm γλυκίνη, 1% κ.β. SDS, ph 8,5), το οποίο περιέχει 0,1 κ.β. SDS. Oι ζώνες των πρωτεϊνών εµφανίζονται µετά από χρώση του πηκτώµατος µε ήπια ανάδευση σε διάλυµα χρωµατισµού ( 0,1% κ.β. Coomasie R-250, 40% κ.ο. µεθανόλη, 10% κ.ο. CH 3 COOH) για 30 min στους 37 C και µετέπειτα αποχρωµατισµό µε συνεχείς πλύσεις σε διάλυµα αποχρωµατισµού (40% κ.ο. µεθανόλη, 10% κ.ο. CH 3 COOH) και σε θερµοκρασία δωµατίου, έως ότου αποµακρυνθεί η περίσσεια χρωστικής

47 Ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών (Western blotting) α)μεταφορά πρωτεϊνών Oι πρωτεΐνες µετά τον διαχωρισµό τους σε πήκτωµα πολυκαρυλαµιδίου, µεταφέρονται σε σταθερό µεµβρανικό υπόστρωµα, που βρίσκεται σε επαφή µε το πήκτωµα. Για τη µεταφορά των πρωτεϊνών από το πήκτωµα στη µεµβράνη, χρησιµοποιείται κατάλληλο ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροµεταφοράς µε ph 8,5. Σε αυτή την τιµή του ph οι πρωτεΐνες αποκτούν αρνητικό φορτίο και µετακινούνται µέσα στο ηλεκτρικό πεδίο προς το θετικό πόλο. Ένα κοµµάτι µεµβράνης (Hypond-P, Amersham) και δύο κοµµάτια απορροφητικό χαρτί Whatman 3MM κόβονται σε µέγεθος λίγο µεγαλύτερο από αυτό του πηκτώµατος και εµβαπτίζονται στο ρυθµιστικό διάλυµα µεταφοράς. Στην πλευρά της συσκευής, που θα εφαρµοστεί ο αρνητικός πόλος, τοποθετούνται κατά σειρά: ένα απορροφητικό χαρτί Whatman 3MM, το πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου, η νιτροκυτταρίνη, ένα απορροφητικό χαρτί Whatman 3MM και τέλος, η πλάκα της συσκευής που θα εφαρµοσθεί ο θετικός πόλος. Η µεταφορά των πρωτεϊνών πραγµατοποιείται µε διαβίβαση ρεύµατος σταθερής έντασης 300 ma. για 1 h. Εάν χρησιµοποιούνται έγχρωµοι µάρτυρες µοριακών βαρών, µεταφορά από το πήκτωµα στη µεµβράνη µπορεί να ελεγχθεί έµµεσα εξαιτίας της παρουσίας της χρωστικής. β) Ανοσοενζυµική ανίχνευση των πρωτεϊνών Η µεµβράνη της νιτροκυτταρίνης επωάζεται µε διάλυµα 5% w/v λυοφιλιωµένου γάλακτος σε PBS, υπό ανάδευση, για 40 min, σε θερµοκρασία δωµατίου. Με τη διαδικασία αυτή, γίνεται δέσµευση πάνω στη µεµβράνη των ελεύθερων θέσεων, στις οποίες δεν έχουν µεταφερθεί, οπότε παρεµποδίζεται η µη ειδική πρόσδεση των αντισωµάτων στις θέσεις αυτές. Ακολουθεί επώαση της µεµβράνης µε το πρώτο αντίσωµα, αραιωµένο σε διάλυµα 3% w/v λυοφιλιωµένου γάλακτος σε PBS για 2 h. Μετά την επώαση µε το πρώτο αντίσωµα, πραγµατοποιούνται τρεις διαδοχικές πλύσεις µε PBS διάρκειας 10 min η κάθε µια. Ακολουθεί επώαση της µεµβράνης µε το δέυτεροσυζευγµένο µε υπεροξειδάση της ραπάνιδος (HRP) αντίσωµα για 2 h σε θερµοκρασία δωµατίου υπό συνεχή ανάδευση. Στη συνέχεια, πραγµατοποιούνται τρείς διαδοχικές πλύσεις µε PBS

48 Ακολουθεί επώαση της µεµβράνης σε ρυθµιστικό διάλυµα εµφάνισης µε υπόστρωµα DAB (0,03% κ.β. DAB, 0,03% κ.β. NiCl 2 ). H 3,3'-διαµινοβενζιδίνη (DAB) δρα ως υπόστρωµα για το ένζυµο της υπεροξειδάσης, και παρουσία Η 2 Ο 2, οξειδώνεται προς σκούρο καφέ ίζηµα. Η αντίδραση πραγµατοποιείται παρουσία ιόντων νικελίου. Οι ζώνες των πρωτεϊνών εµφανίζονται άµεσα µετά την εµβάπτιση της νιτροκυτταρίνης στο ρυθµιστικό διάλυµα εµφάνισης. Η αντίδραση διακόπτεται µε εµβάπτιση της µεµβράνης σε ddh 2 O, oπότε αποφεύγεται περαιτέρω µη ειδική χρώση της µεµβράνης Φασµατοσκοπικές µέθοδοι για την ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνών Η συγκέντρωση µιας πρωτεΐνης σε ένα διάλυµα προσδιορίζεται βάσει εµπειρικών τύπων που αποδίδουν την απορρόφηση του πρωτεϊνικού διαλύµατος, στην περιοχή του υπεριώδους του ηλεκτροµαγνητικού φάσµατος, όπου και απορροφούν τα αρωµατικά αµινοξέα των πρωτεϊνών. Μετριέται η απορρόφηση του δείγµατος στα 280 nm και η συγκέντρωση του προσδιορίζεται από το τύπο : Molarity = (O.D. 280Nm Χ βαθµό αραίωσης)/(5500 Νw+4910 Nγ+125 Νs-s) ο οποίος λαµβάνει υπόψη την περιεκτικότητα σε κατάλοιπα τρυπτοφάνης και τυροσίνης στη µετρούµενη πρωτεΐνη και Νs-s ο αριθµός των δισουλφιδικών δεσµών Χρωµατογραφική µέθοδος Bradford για την ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών Η χρωστική Coomasie Briliant blue προσδένεται στα µόρια των πρωτεϊνών και ειδικότερα στα κατάλοιπα λυσίνης παράγοντας έγχρωµο προϊόν. Η ένταση του χρώµατος εξαρτάται από τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης στο διάλυµα. Για να γίνει η ποσοτικοποίηση µιας πρωτεΐνης σε ένα διάλυµα, αρχικά κατασκευάζεται µια πρότυπη καµπύλη βαθµονόµησης η οποία δηµιουργείται µε προσδιορισµό BSA σε διάφορες συγκεντρώσεις. Έτσι, για την καµπύλη βαθµονόµησης

49 παρασκευάζεται 100µl διαλυµάτων 0,125,0,250,0,500,1 και 1,5µg/µl BSA σε 50 mm PB ph 8, 150mM NaCl. Σε 20µl των παραπάνω αραιώσεων προστίθενται από 1ml διαλύµατος Biorad protein assay αραιωµένο πέντε φορές µε ddh 2 0 και µετράται η απορρόφηση των διαλυµάτων στα 595 nm. Παράλληλα, ακολουθεί η ίδια διαδικασία και για το άγνωστο δείγµα. Από την πρότυπη καµπύλη αναφοράς, η οποία σχεδιάζεται µε βάση την απορρόφηση των διαλυµάτων της BSA, υπολογίζεται η συγκέντρωση του άγνωστου δείγµατος σε µg/µl. H εξίσωση ευθείας η οποία προκύπτει, είναι της µορφής Ο.D. 595nm =0,0597C+0,0488, µε R=0,9862 όπου Ο.D. 595nm αντιπροσωπεύει την οπτική απορρόφηση στα 595 nm, C είναι η ποσότητα πρωτεΐνης στο δείγµα και R είναι ο συντελεστής προσαρµοστικότητας, ο οποίος αποτελεί δείκτη για την ποιότητα της ευθείας η οποία έχει δηµιουργηθεί. Λύνοντας την παραπάνω εξίσωση και διαιρώντας το αποτέλεσµα αυτής µε τον όγκο της πρωτεΐνης που περιέχεται στο δείγµα, είναι δυνατό να υπολογίζουµε περιεκτικότητες πρωτεϊνικών διαλυµάτων και συνεπώς και τη τελική ποσότητα της πρωτεΐνης την οποία αποµονώνουµε Πρόσδεση 125 Ι-α-Bgt στις ανασυνδυασµένες πρωτεΐνες σε διάλυµα Η σηµασµένη α-µπουγκαροτοξίνη µε ιώδιο-125 προσδένεται ειδικά στην εξωκυταρική περιοχή της α1 υποµονάδας και το σύµπλοκο 125 Ι-α-Bgt-α1-ΕΚΠ διαχωρίζεται από την ελεύθερη τοξίνη µε διήθηση υπό κενό από ανιοανταλλακτικά φίλτρα. Ποσότητα που αντιστοιχεί σε cpm 125 Ι-α- Bgt επωάζεται µε την πρωτεΐνη σε ρυθµιστικό διάλυµα PBS-0,2% BSA, τελικού όγκου 50 µl, στους 4 C, για το χρονικό διάστηµα που απαιτείται για επίτευξη ισορροπίας. Aκολουθεί προσρόφηση του συµπλόκου της σηµασµένης τοξίνης µε την πρωτεΐνη σε φίλτρο, υπό κενό, το οποίο έχει διαβραχεί µε 1 ml ρυθµιστικού διαλύµατος 20 mm Tris-HCl ph 7,5, 0,05% κ.ο. Triton X-100. Ακολουθούν 3 εκπλύσεις των προσδεδεµένων στα φίλτρα συµπλόκων µε 1 ml ρυθµιστικού διαλύµατος 20 mm Tris-HCl ph 7,5, 0,05% κ.ο. Triton X-100 κάθε φορά και τελικά η προσδεµένη στην πρωτεΐνη τοξίνη, προσδιορίζεται µε µέτρηση γ-ακτινοβολίας της ραδιενέργειας που έχει προσροφηθεί στα

50 φίλτρα. Για τον προσδιορισµό της ενέργειας υποβάθρου, πραγµατοποιείται παράλληλα µια αντίδραση, στην οποία δεν έχει προστεθεί πρωτεΐνη. Η µέτρηση γ-ακτινοβολίας για την αρνητική αντίδραση-µάρτυρα, αφαιρείται από τις µετρήσεις για τα δείγµατα Παρασκευή στηλών ανοσοπροσρόφησης µε ανασυνδυασµένα πεπτίδια και ανοσοπροσρόφηση αντι-υποδοχέα αντισωµάτων από ορούς µυασθενών Για την παραγωγή των στηλών ανοσοπροσρόφησης µε σεφαρόζη χρησιµοποιήθηκαν 0,1 mg ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης, η οποία αναµείχθηκε µε 0,9 mg ΒSA και προσδέθηκαν σε 0,1 g σφαιριδίων ενεργοποιηµένης CNBr-σεφαρόζης. Τα σφαιρίδια που φέρουν την ανασυνδυασµένη πρωτεΐνη επαναδιαλύονται σε ρυθµιστικό διάλυµα PBS, ph 7,4, σε συνολικό όγκο 12 ml. Aντίστοιχη στήλη παρασκευάστηκε και µε 1 mg BSA σε 0,1 g σφαιριδίων ενεργοποιηµένης CNBrσεφαρόζης. Αυτή η στήλη χρησιµοποιείται ως αρνητικός ανοσοπροσροφητής και κατά συνέπεια ως θετικός έλεγχος για τα πειράµατα ραδιοανοσοπροσδιορισµού κάθε ορού. Για τα πειράµατα ανοσοπροσρόφησης, χρησιµοποιούνται οροί µυασθενών µε γνωστή συγκέντρωση αυτοαντισωµάτων (τίτλος), οι οποίοι αραιώνονται σε ρυθµιστικό διάλυµα PBS-0,2% BSA και στους οποίους προστίθεται ανθρώπινος φυσιολογικός ορός για να δώσει τελική αραίωση ορού 1:10. Οι αραιώσεις των ορών διαφέρουν ανάλογα µε τη συγκέντρωση των αντι-υποδοχέα αντισωµάτων σε κάθε ορό. Επωάζονται λοιπόν, 20 fmoles αντι-υποδοχέα αντισωµάτων (τα οποία βρίσκονται σε τελικό όγκο 40µl) µε 1 µg ακινητοποιηµένης EKΠ πρωτεΐνης σε στήλη σεφαρόζης (η οποία βρίσκεται σε τελικό όγκο 120 µl), για 2 h στους 4 C, υπό ανάδευση. Παράλληλα, επωάζεται η ίδια ποσότητα αντισωµάτων µε 1 µg BSA σε στήλη σεφαρόζης. Στη συνέχεια το µίγµα φυγοκεντρείται και το υπερκείµενο που περιέχει τα αντι-υποδοχέα αντισώµατα που δεν προσδέθηκαν στη στήλη χρησιµοποιείται σε πειράµατα ραδιοανοσοπροσδιορισµού (RIA), όπου ανθρώπινος υποδοχέας σεσηµασµένος µε 125 Ι επωάζεται µε µια ποσότητα από το παραπάνω υπερκείµενο. Τα πειράµατα γίνονται χρησιµοποιώντας το ΑChRAb RIA kit (RSR Ltd) σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αναλυτικότερα, 50 µl σεσηµασµένου µυϊκού υποδοχέα επωάζονται για 2 h σε θερµοκρασία δωµατίου µε 40 µl υπερκείµενου ανοσοπροσρόφησης. Στη συνέχεια, προστίθενται

51 50λ αντι-ανθρώπινου ΙgG και το µίγµα επωάζεται στους 4 C. Ακολουθεί προσθήκη 1 ml διαλύµατος έκπλυσης και φυγοκέντρηση για 20 min, στους 4 C, στα 1500g. Έπειτα γίνεται και δεύτερη έκπλυση του ιζήµατος που δηµιουργείται µετά τη φυγοκέντρηση (ανοσοκατακρήµνιση) µε το παραπάνω διάλυµα και η µέτρηση της ραδιενέργειας που δεσµεύτηκε στο ίζηµα µετριέται σε µετρητή γ-ακτινοβολίας. Η εκατοστιαία µείωση σε αντι-υποδοχέα αντισώµατα µεταξύ του δείγµατος που επωάζεται µε τη στήλη που περιέχει την ανασυνδυασµένη πρωτεΐνη και της στήλης BSA ορίζεται ως ανοσοπροσρόφηση. Η σχέση που χρησιµοποιείται για να προσδιοριστεί η ανοσοπροσρόφηση είναι η εξής: 100 x [( cpm ιζήµατος µετά από επώαση µε σεφαρόζη-bsa) - ( cpm ιζήµατος µετά από επώαση µε σεφαρόζη-ανασυνδυασµένη πρωτεΐνη)] / ( cpm ιζήµατος µετά από επώαση µε σεφαρόζη-bsa)

52 ΚΕΦΑΛΑΙΟ IV

53 4 Μοριακός σχεδιασµός Η κατασκευή και έκφραση των ανασυνδυασµένων πεπτιδίων απαιτεί µια σειρά υποκλωνοποιήσεων και προϋποθέτει τον σχεδιασµό τους. Ως φορέας έκφρασης για τα κύτταρα εντόµων Sf9 χρησιµοποιήθηκε το πλασµίδιο ptriex. H παρούσα ερευνητική εργασία στόχο είχε σε πρώτη φάση την κατασκευή και έκφραση των εξωκυτταρικών περιοχών των ΕΚΠ των υποµονάδων α και β του ανθρώπινου µυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης σε κύτταρα εντόµων µετά από επιµόλυνση µε βακιλοϊό. Επιπλέον, στα πλαίσια της παρούσας ερευνητικής εργασίας πραγµατοποιήθηκε η σύνδεση των υποµονάδων α και β του ανθρώπινου µυϊκού υποδοχέα µε πεπτιδικό συνδέτη 24 αµινοξέων για την δηµιουργία του συγκαταµερούς ΕΚΠ β-α. Στην προσπάθεια έκφρασης των µεµονοµένων υποµονάδων και των συγκαταµερών απαραίτητο βήµα ήταν η εισαγωγή ενός κατάλληλου σινιάλου έκφρασης (signal peptide, SP) στον φορέα έκφρασης. Το σινιάλο έκφρασης χρειάζεται για να ακολουθήσουν τα εκφρασµένα πεπτίδια το ενδοκυτταρικό µονοπάτι (Golgi, ενδοπλασµατικό δίκτυο) και να υποστούν τις απαραίτητες µετα-µεταφραστικές τροποποιήσεις µέχρι να καταλήξουν στην µεµβράνη. Αποφασίστηκε να χρησιµοποιηθεί το σινιάλο έκφρασης των υποµονάδων καθώς είναι συµβατό και αναγνωρίσιµο από τα κύτταρα εντόµων (Εικόνα 1). Ο απώτερος στόχος ήταν η µελέτη των επιπέδων έκφρασης, ο χαρακτηρισµός των παραγόµενων πεπτιδίων α ΕΚΠ, β ΕΚΠ και του συγκαταµερούς ΕΚΠ β-α και ο έλεγχος της αντιγονικότητάς τους για τη χρήση τους ως πιθανούς ανοσοπροσροφητές στην θεραπεία της βαριάς µυασθένειας. ΕΚΠ 8 His-tag ΕΚΠ 8 His-tag 8 His-tag ΕΚΠ Συνδέτης ΕΚΠ Εικόνα 1 Σχηµατική αναπαράσταση των ανασυνδυασµένων πλασµιδίων

54 4.1 Σχεδιασµός του πλασµιδίου ptriex-β ΕΚΠ(wild type) Για να πραγµατοποιηθεί η κατασκευή των ανασυνδυασµένων πλασµιδίων σε πρώτη φάση πρέπει να εισαχθούν στον φορέα έκφρασης ptriex για το ετερόλο σύστηµα έκφρασης Sf9 τα ανάλογα ενθέµατα. Τα ενθέµατα αυτά υπήρχαν σε διαφορετικά πλασµίδια οπότε χρειάστηκε µια προεργασία σε µοριακό επίπεδο για να προκύψουν τα τελικά ανασυνδυασµένα πλασµίδια. Για την κατασκευή του πλασµιδίου ptriex-β ΕΚΠ(αγρίου τύπου) αρχικά πραγµατοποιήθηκε αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης µε κατάλληλους εκκινητές, ώστε να ανακτηθεί το ένθεµα ΝcoI-SP-β EΚΠ-NotI χρησιµοποιώντας ως εκµαγείο το cdna ολόκληρης της ανθρώπινης β1 υποµονάδας και διπλή πέψη µε τα περιοριστικά ένζυµα ΝcoI/NotI τόσο του προϊόντος της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης όσο και του φορέα έκφρασης ptriex (Εικόνα 2). Στη συνέχεια, έγινε η αντίδραση λιγάσης και την επόµενη µέρα επιλέχθηκαν αποικίες για την έναρξη καλλιεργειών µικρής κλίµακας και την αποµόνωση του πλασµιδιακού DNA. Ακολούθησαν διαγνωστικές πέψεις µε τις ενδονουκλεάσες ΧhoI/XbaI και τα δείγµατα στάλθηκαν για αλληλούχιση. 'Eνθεµα ΝcoI SP β ΕΚΠ Not I NcoI NotI Φορέας έκφρασης ptriex Εικόνα 2 Σχεδιασµός του ptriex SP-β ΕΚΠ (αγρίου τύπου)

55 2000 bp 1500 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp L Εικόνα 3 Ανάλυση της διπλής πέψης µε ΧhoI/XbaI των minipreps από αποικίες του ptriex β ΕΚΠ σε πήκτωµα αγαρόζης Οι κλώνοι 1-7 και είναι θετικοί διότι τα παραπάνω ενζυµα αν έκοβαν πλασµίδιο χωρίς ένθεµα θα έδιναν ένα προϊόν πέψης 400bp (κλώνος 8) και τον υπόλοιπο φορέα, ενώ αυτοί που φέρουν το ένθεµα (770bp) θα δώσουν ένα προϊόν πέψης 1100bp (Εικόνα 3). ίπλα σε κάθε κοµµένο πλασµίδιο υπάρχει και το αντίστοιχο άκοπο Control. 4.2 Σχεδιασµός του ptriex β ΕΚΠ(cys-loop) Για την κατασκευή του πλασµιδίου ptriex-β ΕΚΠ (cys-loop), που σε αντίθεση µε το αγρίου τύπου η β ΕΚΠ φέρει την Cys-loop περιοχή της AChBP, ακολουθήθηκαν τα ακόλουθα βήµατα: Σε πρώτη φάση πραγµατοποιήθηκε διπλή πέψη µε NotI/SmaI του πλασµδίου ptriex-β ΕΚΠ (αγρίου τύπου) και αποσφωρυλίωσή του. Παράλληλα, πραγµατοποιήθηκε µε τα ίδια περιοριστικά ένζυµα πέψη του πλασµιδίου ppicz-β ΕΚΠ (cys-loop), και αποµονώθηκε το ένθεµα (Εικόνα 4). Στη συνέχεια, έγινε η αντίδραση λιγάσης, µετασχηµατισµός των προϊόντων σε TOP10F και την επόµενη µέρα επιλέχθηκαν αποικίες για την έναρξη καλλιεργειών µικρής κλίµακας και την αποµόνωση του πλασµιδιακού DNA. Ακολούθησαν διαγνωστικές πέψεις και τα θετικά δείγµατα στάλθηκαν για αλληλούχιση

56 SmaI NotI SmaI NotI ptriex β EΚΠ(wt) ppicz β ΕΚΠ Φορέας έκφρασης Ένθεµα Εικόνα 4 Σχεδιασµός του ptriex β 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp L Εικόνα 5 Ανάλυση της διπλής πέψης µε ΝcoI/NotI των minipreps από αποικίες του ptriex β ΕΚΠ σε πήκτωµα αγαρόζης Βρέθηκαν θετικοί όλοι οι κλώνοι για το ptriex SP- β ΕΚΠ (cys loop), αφού περιέχουν το ένθεµα µε το αναµενόµενο µοριακό βάρος των 770 bp (Εικόνα 5)

57 4.3 Σχεδιασµός του ptriex -ΕΚΠ β-α Για την κατασκευή του πλασµιδίου ptriex- ΕΚΠ β-α χρειάστηκαν δυο διαχοχικές αντιδράσεις σύνδεσης. Σε πρώτη φάση πραγµατοποιήθηκε διπλή πέψη µε NcoI και SmaI του πλασµδίου ptriex-α ΕΚΠ (το οποίο υπήρχε ήδη), αποµόνωση και αποσφωρυλίωση του φορέα. Παράλληλα, πραγµατοποιήθηκε µε τα ίδια περιοριστικά ένζυµα πέψη του πλασµιδίου ptriex-β ΕΚΠ (αγρίου τύπου) και αποµόνωση του ενθέµατος (Εικόνα 6). Στη συνέχεια, έγινε η αντίδραση λιγάσης, µετασχηµατισµός των προϊόντων σε TOP10F και την επόµενη µέρα επιλέχθηκαν αποικίες για την έναρξη καλλιεργειών µικρής κλίµακας και την αποµόνωση του πλασµιδιακού DNA. Ακολούθησαν διαγνωστικές πέψεις µε τις ενδονουκλεάσες ΧhoI/XbaI και ClaI και τα δείγµατα στάλθηκαν για αλληλούχιση. Αντίδραση λιγάσης Ι ΝcoI SmaI NcoI SmaI ptriex α ΕΚΠ ptriex β EΚΠ (wt) Φορέας έκφρασης Ένθεµα Eικόνα 6 Σχεδιασµός ptriex-εκπ β-α φάση

58 Σε δεύτερο στάδιο πραγµατοποιήθηκε πέψη µε SmaI του πλασµίδιου ptriex β-smai-α για να ανοίξει ο φορέας και παράλληλα πέψη µε το ίδιο περιοριστικό ένζυµο του πλασµιδίου ppicz β-α για να ανακτηθεί το ένθεµα SmaI-β-linker-α-SmaI (Εικόνα 7). Ουσιαστικά, στόχος του δεύτερου σταδίου είναι η εισαγωγή του δεύτερου τµήµατος της β ΕΚΠ (κατόπιν της αλληλουχίας SmaI), του συνδέτη και του αρχικού τµήµατος της α ΕΚΠ (προ της αλληλουχίας SmaI). Αντίδραση λιγάσης ΙΙ SmaI SmaI SmaI ptriex β-smai-α EKΠ ppicz ΕΚΠ β-α Φορέας έκφρασης Ένθεµα Εικόνα 7 Σχεδιασµός του ptriex -ΕΚΠ β-α φάση ΙI

59 2000 bp 1500 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp L Εικόνα 8 Ανάλυση της διπλής πέψης XhoI/XbaI των minipreps από αποικίες του ptriex ΕΚΠ β-α σε πήκτωµα αγαρόζης 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp L Εικόνα 9 Ανάλυση της διπλής πέψης ΒglII/XhoI από αποικίες του ptriex ΕΚΠ β -α σε πήκτωµα αγαρόζης Στη περίπτωση της κατασκευής του συγκαταµερούς ΕΚΠ β-α το προς κλωνοποίηση µόριο DNA και το πλασµίδιο διαθέτουν συµπληρωµατικά άκρα που έχουν προκύψει από πέψη µε το ίδιο περιοριστικό ένζυµο (SmaI), η σύνδεση πραγµατοποιείται µε την ίδια πιθανότητα και µε τους δύο προσανατολισµούς. Η εύρεση του σωστού προσανατολισµού σύνδεσης γίνεται µε τη χρήση των περιοριστικών ενζύµων ΒglII/XhoI που κόβουν ασύµµετρα µέσα στο κλωνοποιηµένο τµήµα. Έτσι λοιπόν, επιλέχθηκαν από την πέψη XhoI/XbaI οι εξής θετικοί κλώνοι :1-5,7-10,12,13,15,16,18, ώστε να ελεγχθεί η κατεύθυνση ένθεσης (Εικόνα 8). Όπως διαπιστώθηκε µε την πέψη ΒglII/XhoI το 50% των κλώνων έχει την σωστή φορά (Εικόνα 9)

60 4.4 Έκφραση των ανασυνδυασµένων πεπτιδίων α-εκπ, β-εκπ και του συγκαταµερούς EΚΠ β-α σε καλλιέργεια Sf9 κυττάρων µικρής κλίµακας µε στόχο την βελτιστοποίηση των επιπέδων έκφρασης (Τime course πείραµα) Η έκφραση των πεπτιδίων προϋποθέτει καλλιέργεια Sf9 κυττάρων για την παραγωγή των ανασυνδυασµένων βακιλοϊών αρχικά πρώτης γενιάς και εν συνεχεία την τιτλοδότηση τους. Ο τελικός στόχος είναι η παραγωγή βακιλοϊού τρίτης γενιάς και η επιµόλυνση Sf9 κυττάρων µε το βέλτιστο multiplicity of infection (m.o.i.) για την παραγωγή της αντίστοιχης πρωτεϊνης. Το m.o.i. είναι η αναλογία των µολυσµατικών παραγόντων (στην περίπτωση µας των βακιλοϊών) προς τον στόχο για επιµόλυση (στην περίπτωση µας τα Sf9 κυττάρα). Στα πλαίσια της βελτιστοποίησης των επιπέδων έκφρασης πραγµατοποιήθηκε το εξής πείραµα: έγινε επίστρωση 2x 10 Ε 6 Sf9 κύτταρων σε 6 well-plates (χωρητικότητας 2 ml) και εν συνεχεία επιµόλυνση µε τον ιό α-εκπ χρησιµοποιώντας διαφορετικές ποσότητες. Η επιµόλυνση διήρκεσε τρεις µέρες, ενώ κατά την διάρκεια τους έγινε συλλογή δειγµάτων (υπερκείµενου καλλιέργειας) για έλεγχο της έκφρασης των πρωτεϊνών. To παραπάνω πείραµα είναι µια παραγωγή µικρής κλίµακας που οδηγεί σε κάποια χρήσιµα συµπεράσµατα ως προς τις συνθήκες καλλιέργειας και το χρόνο µέγιστης έκφρασης, τα οποία µπορούν να αναχθούν και σε παραγωγή µεγάλης κλίµακας φλάσκας. Στα δείγµατα που συλλέχθηκαν, έγινε προσδιορισµός φίλτρου, τα αποτελέσµατα του οποίου παρουσιάζονται στον πίνακα 1. Η παραπάνω µέθοδος βασίζεται στη ιδιότητα της σηµασµένης µε ιώδιο-125 να α-µπουγκαροτοξίνης να προσδένεται στην εξωκυτταρική περιοχή της α1 υποµονάδας και να σχηµατίζει το σύµπλοκο 125 Ι-α-Βgt-α1-ΕΚΠ. Στην περίπτωση µας η εκάστοτε προσδεµένη στην πρωτεΐνη τοξίνη διαχωρίζεται από την ελεύθερη τοξίνη µε διήθηση υπό κενό από αντιοανταλλακτικά φίλτρα και προσδιορίζεται µε µέτρηση γ-ακτινοβολίας της ραδιενέργειας που έχει προσροφηθεί σε αυτά. Για τον προσδιορισµό της ενέργειας υποβάθρου, πραγµατοποιείται παράλληλα µια αντίδραση, στην οποία δεν έχει προστεθεί πρωτεΐνη. Η µέτρηση γ-ακτινοβολίας για την αρνητική αντίδραση-µάρτυρα, αφαιρείται από τις µετρήσεις για τα δείγµατα και εκφράζεται ως cpm

61 Πίνακας 1 Προσδιορισµός φίλτρου ( cpm) σε υπερκείµενο καλλιέργειας α Cys-loop µικρής κλιµακας Xρόνος /m.o.i 1 2, ώρες ώρες Συµπερασµατικά η συλλογή της πρωτεΐνης ιδανικά πρέπει να γίνεται µεταξύ 2 ης και 3 ης µέρας και το m.o.i. να κυµαίνεται µεταξύ 2,5 και 5. Είναι εµφανές ότι σε µεγάλες ποσότητες ιού τα κύτταρα δεν εµφανίζουν σηµαντική αύξηση στην παραγωγή της πρωτεΐνης την 3 η ηµέρα διότι έχουν ήδη επιβαρυνθεί. Στα ίδια πλαίσια πραγµατοποιήθηκε και προσδιορισµός φίλτρου µε υπερκείµενο καλλιέργειας από Sf9 υπό ανάδευση, τα αποτελέσµατα του οποίου παρουσιάζονται στον πίνακα 2. Παράλληλα, ελέγχθηκε η καθαρότητα των αποµονωµένων πεπτιδίων µε SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση την 2 η και 3 η µέρα. Στα πειράµατα µεγάλης κλίµακας, το m.o.i κυµάνθηκε µεταξύ 2 και 3 και η συλλογή των ανασυνδυασµένων πεπτιδίων πραγµατοποιήθηκε µεταξύ 2 ης και 3 ης µέρας, ώστε να τις έχουµε σε όσο το δυνατόν καθαρότερη µορφή. Πίνακας 2 Προσδιορισµός φίλτρου ( cpm) σε υπερκείµενοκαλλιέργειας α Cys-loop µικρής κλίµακας Χρόνος/m.o.i 1 2, ώρες ώρες

62 4.5 Αποµόνωση και καθαρισµός των ανασυνδυασµένων πεπτιδίων α-εκπ, β- ΕΚΠ και του συγκαταµερούς ΕΚΠ β-α σε καλλιέργεια Sf9 κυττάρων µεγάλης κλίµακας µε χρωµατογραφία µοριακού αποκλεισµού Σύµφωνα µε τα χρωµατογραφήµατα µοριακής διήθησης ένα µεγάλο µέρος των πεπτιδίων εκλούεται στα αναµενόµενα µοριακά βάρη. Ωστόσο η εµφάνιση κορυφών σε µεγαλύτερα µοριακά βάρη συνιστά ένδειξη ύπαρξης ολιγοµερών και συσσωµατωµάτων (Εικόνα 10). Περαιτέρω µελέτη απαιτείται για την βελτιστοποίηση των επιπέδων έκφρασης µε παράλληλη µείωση του ποσοστού συσσωµατωµάτων. Στην εικόνα 6 απεικονίζεται µε κόκκινο χρώµα η πρόσδεση της σηµασµένης µε 125 Ι α-µπουγκαροτοξίνης, η οποία προσδένεται στην εξωκυτταρική περιοχή της α1 υποµονάδας. α ΕΚΠ β ΕΚΠ ΟD280 cpm 66KDa 158KDa 158KDa 158KDa 66KDa 66KDa Εικόνα 10 Χρωµατογραφία µοριακού αποκλεισµού για τα ανασυνδυασµένα πεπτίδια α-εκπ, β-εκπ και το συγκαταµερές β-α και πειράµατα πρόσδεσης α-µπουγκαροτοξίνης για το α-εκπ και το συγκαταµερές ΕΚΠ β-α

63 4.6 Χαρακτηρισµός των ανασυνδυασµένων πεπτιδίων α-εκπ, β-εκπ και του συγκαταµερούς ΕΚΠ β-α µε ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών (SDS-PAGE) ΕΚΠ β-α β- ΕΚΠ α- ΕΚΠ Εικόνα 11 Ηλεκτροφόρηση των πεπτιδίων α-εκπ, β-εκπ και του συγκαταµερούς ΕΚΠ β-α υπό αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) Μετά τον καθαρισµό από στήλη µοριακής διήθησης, δείγµατα από τα κλάσµατα που αντιστοιχούν στις κορυφές των χρωµατογραφηµάτων των ΕΚΠ των υποµονάδων α, β και του συγκαταµερούς ΕΚΠ β-α διαχωρίστηκαν µε SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της SDS- PAGE ηλεκτροφόρηση, τόσο οι εξωκυτταρικές περιοχές των υποµονάδων α και β όσο και το συγκαταµερές ΕΚΠ β-α παρουσίασαν το αναµενόµενο µοριακό βάρος, γεγονός που σηµαίνει ότι ο συνδέτης δεν πρωτεολύεται και συγκρατεί τις ΕΚΠ των υποµονάδων ενωµένες (Εικόνα 11). Συµπερασµατικά. τα ανασυνδυασµένα πεπτίδια αποµονώθηκαν σε διαλυτή και γλυκοζυλιωµένη µορφή, µε επίπεδα έκφρασης για τις ΕΚΠ των υποµονάδων α, β και το συγκαταµερές ΕΚΠ β-α, 4 mg/l, 0.9 mg/l και 0,7 mg/l αντίστοιχα (Πίνακας 3). Τέλος από το SDS-PAGE φαίνεται ότι βρίσκονται σε καθαρή µορφή. Αξίζει να σηµειωθεί ότι η κάθε υποµονάδα φέρει και το αντίστοιχο σινιάλο έκφρασης µε εξαίρεση το συγκαταµερές ΕΚΠ β-α που φέρει της β υποµονάδας. Τα αποτελέσµατα υποδεικνύουν ότι τα χαµηλά επίπεδα έκφρασης του συγκαταµερούς ΕΚΠ β-α και της ΕΚΠ της υποµονάδας β συγκριτικά µε την α υποµονάδα, ίσως οφείλεται στο σινιάλο έκφρασης και πιθανόν αυτή η πληροφορία να αξιοποιηθεί µελλοντικά στην κατασκευή και έκφραση νέων πρωτεϊνών

64 Πίνακας 3: Τα επίπεδα έκφρασης των ανασυνδυασµένων πεπτιδίων α-εκπ, β-εκπ και του συγκαταµερούς ΕΚΠ β-α χρησιµοποιοώντας ως ετερόλογο σύστηµα έκφρασης Sf9 κύτταρα. α1-εκπ β1-εκπ ΕΚΠ β1-α1 Επίπεδα έκφρασης 4 mg/l 0.9 mg/l 0.7 mg/l 4.7 'Έλεγχος αντιγονικότητας: Πειράµατα ανοσοπροσρόφησης χρησιµοποιώντας ως ανοσοπροσροφητές τα ανασυνδυασµένα πεπτίδια α-εκπ, β-εκπ και το συγκαταµερές ΕΚΠ β-α Α ν ο σ ο π ρ ο σ ρ ό φ η σ η ΕΚΠ ΕΚΠ (%) Οροί µυασθενών Εικόνα 12 Ποσοστά ανοσοπροσρόφησης χρησιµοποιώντας ως ανοσοπροσροφητές συγκαταµερές ΕΚΠ β-α ή τις ΕΚΠ των µεµονωµένων υποµονάδων α και β.το συγκαταµερές ΕΚΠ β-α παρουσιάζει τα ίδια ποσοστά ανοσοπροσρόφησης έως και 95% µε το άθροισµα των µεµονωµένων υποµονάδων. Για τα πειράµατα ανοσοπροσρόφησης, χρησιµοποιούνται οροί µυασθενών µε γνωστή συγκέντρωση αυτοαντισωµάτων. Επωάζονται 20 fmoles αντι-υποδοχέα αντισωµάτων µε 1 µg ακινητοποιηµένης πρωτεΐνης σε στήλη σεφαρόζης. Παράλληλα, επωάζεται η ίδια ποσότητα αντισωµάτων µε 1 µg BSA σε στήλη σεφαρόζης. Στη συνέχεια το µίγµα φυγοκεντρείται και το υπερκείµενο που περιέχει τα αντι-υποδοχέα αντισώµατα που δεν προσδέθηκαν στη στήλη χρησιµοποιείται σε πειράµατα ραδιοανοσοπροσδιορισµού (RIA), όπου σηµασµένος µε 125 Ι ανθρώπινος υποδοχέας επωάζεται µε µια ποσότητα από το παραπάνω υπερκείµενο. Η ανοσοπροσρόφηση εκφράζεται ως εκατοστιαία