ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ. Σχολή Επιστηµών Υγείας Τµήµα Φαρµακευτικής. Πειραµατική µυασθένεια και αυτοαντισώµατα έναντι του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ Σχολή Επιστηµών Υγείας Τµήµα Φαρµακευτικής Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας & Ανοσολογίας Πειραµατική µυασθένεια και αυτοαντισώµατα έναντι του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Μεταπτυχιακό ίπλωµα Ειδίκευσης Κόρδας Γρηγόριος Πάτρα 2007

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Σωκράτης Τζάρτος ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Γρηγόριος Σιβολαπένκο ΛΕΚΤΟΡΑΣ Κωνσταντίνος Πουλάς 2

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ 5 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 6 Α.1. Νευροµυϊκή σύναψη: η διαβίβαση των ώσεων από τα νεύρα στις ίνες των σκελετικών µυών. 7 Α.2. Ο νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης. 9 Α.2.1. οµή του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης 9 Α.2.2. Θέση πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης και α-τοξινών. 12 Α.2.3. Αντιγονικότητα του AChR και κύρια ανοσογόνος περιοχή. 13 Α.3. Μυασθένεια 14 Α.3.1. Κλινικά χαρακτηριστικά Επιδηµιολογικά δεδοµένα. 14 Α.3.2. Παθογένεση της βαριάς µυασθένειας. 15 Α.3.3. Μηχανισµοί δράσης των αντισωµάτων έναντι του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. 17 Α.3.4.Ετερογένεια των αντισωµάτων κατά του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. 19 Α.3.5. Πειραµατικά Μοντέλα Μυασθένειας. 20 Α.3.6. ιάγνωση και θεραπευτικές προσεγγίσεις της Μυασθένειας. 21 Α4. Επίκτητη ανοσία-ανοσιακή ανοχή και ανοσοκαταστολή. 22 Α.4.1. Ανοσοσφαιρίνες: δοµή και λειτουργία τους. 24 Α.4.2. Οι τάξεις των ανοσοσφαιρινών. 25 Α.4.3. οµή των IgG αντισωµάτων. 26 Α.4.4. Μονοκλωνικά αντισώµατα. 28 A.4.5 Ανοσιακή ανοχή-ανοσοκαταστολή 30 Α.5. Υποδοχείς των Fc περιοχών των IgG ανοσοσφαιρινών -Fcγ Ανοσο-υποδοχείς-. 31 Α.5.1. Λειτουργίες των Fc υποδοχέων. 32 Α.5.2. Ρύθµιση του κυτταρικού σήµατος µέσω των Fc υποδοχέων. 34 Σκοπός της παρούσας εργασίας ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 42 Α. ΥΛΙΚΑ 43 Α.1. Εργαστηριακός εξοπλισµός. 43 Α.2. Αντιδραστήρια 43 Α.3. Ραδιενεργά Αντιδραστήρια 44 Α.4. Αναλώσιµα 44 Α.5. Αντισώµατα 44 Α.6. Πλασµίδια και βακτηριακά στελέχη 45 Α.7. Πειραµατόζωα 48 Α.8. ιαλύµατα 48 Β. ΜΕΘΟ ΟΙ 52 B.1. Καθαρισµός µονοκλωνικών αντισωµάτων σε στήλη χρωµατογραφίας DEAE. 52 Β.2. Ανάλυση πρωτεϊνών σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου παρουσία SDS (SDS-PAGE). 53 Β.3. Αποµόνωση µικρών µεµβρανικών τµηµάτων πλόυσιων σε AChR υποδοχέα από το ηλεκτρικό όργανο του χονδριχθύος Τ. californica. 54 Β.4. ιαλυτοποίηση Topredo υποδοχέα από µικρά µεµβρανικά τµήµατα πλούσια σε AChR από το ηλεκτρικό όργανο του χονδριχθύος. 54 Β.5. Παρασκευή συµπλόκου Torpedo υποδοχέα και µονοκλώνικών αντισωµάτων 54 Β.6. Υγρή και στερεή καλλιέργεια βακτηρίων. 55 B.7. Μετασχηµατισµός βακτηρίων µε τη µέθοδο του χλωριούχου ασβεστίου 55 B.8. Έκφραση ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης (α και β ECDs) µε τη µορφή εγκλείστων σωµατίων (έκφραση των ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών σε βακτήρια BL21(DE3)pLysS µετασχηµατισµένα µε το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο pet-15b). 56 3

4 B.9. Καθαρισµός των ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών (6xHis-επισηµασµένων πρωτεϊνών) σε στήλη χρωµατογραφίας νικελίου. 57 Β.10. Ακινητοποίηση των ανασυνδυασµένων πεπτιδίων σε σφαιρίδια CNBr σεφαρόζης. 58 Β.11. Ανοσοπροσρόφηση και αποµόνωση αντισωµάτων έναντι του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης από πλάσµατα µυασθενικών ορών. 59 Β.12. RIA για έλεγχο ύπαρξης αντισωµάτων. 59 Β.13. Κατακρήµνιση IgG, IgA και IgΜ ανοσοσφαιρινών µε 40% κορεσµένο (NH4) 2 SO4. 60 Β.14. Aνοσοποίηση αρουραίων. 60 Β.15. Ποσοτικοποίηση υποδοχέων των µυών των οπίσθιων άκρων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 63 Α. Καταστολή ενεργητικής EAMG σε αρουραίους µε χορήγηση ανοσοσυµπλόκων. 64 Α.1. Καθαρισµός µονοκλωνικών αντισωµάτων 198 και 6 64 Α.2. Πειράµατα καταστολής ενεργητικής EAMG ος κύκλος 67 2 ος κύκλος 69 3 ος κύκλος 74 4 ος κύκλος 77 Β. Χαρακτηρισµός της δράσης των αντισωµάτων κατά διαφορετικών υποµονάδων του AChR, από ορούς µυασθενικών, µέσω της ικανότητάς τους να προκαλούν πειραµατική µυασθένεια σε αρουραίους. 81 Β.1. Έκφραση και καθαρισµός των 6xHis επισηµασµένων α- και β-ecds (φορέας έκφρασης pet- 15b) 81 Β.2. Ραδιοανοσολογικός προσδιορισµός αντισωµάτων των ορών µυασθενικών µε AChR αρουραίου. 82 Β.3. Ειδικότητες των αντί-achr αντισωµάτων έναντι των υποµονάδων των τριών πλασµάτων. _ 84 Β.4. Τίτλοι των ορών ως προς υποδοχέα ανθρώπου και αρουραίου. 85 Β.5. Παθητική µεταφορά πειραµατικής µυασθένειας σε αρουραίους ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ - ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 104 4

5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα εργασία πραγµατοποιήθηκε στο εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Ανοσολογίας του τµήµατος Φαρµακευτικής του Πανεπιστηµίου Πατρών σε συνεργασία µε το εργαστήριο Βιοχηµείας του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ. Από την παρούσα θέση θα ήθελα να εκφράσω την βαθιά µου ευγνωµοσύνη στον άσκαλό µου, Καθηγητή Σωκράτη Τζάρτο για την ανάθεση της εργασίας αυτής, την άρτια επιστηµονική του καθοδήγηση, αλλά και την ουσιαστική συµβολή του στην ολοκλήρωση και συγγραφή αυτής της εργασίας. Η συµβολή του ήταν αδιάκοπη και πολύπλευρη και αποτέλεσε για µένα γνώµονα για την περάτωσή της. Για την ολοκλήρωση της παρούσας εργασία θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω θερµά τον Λέκτορα του εργαστηρίου Κωνσταντίνο Πουλά, ο οποίος µε το ευρύ γνωστικό πεδίο του, την εµπειρία, και την καθοδήγηση του συνέβαλε καθοριστικά στην πραγµατοποίηση της παρούσας. Τον Αναπληρωτή Καθηγητή Γρηγόριο Σιβολαπένκο ευχαριστώ θερµά για την συµβολή του στη συγγραφή της εργασία. Οι παρατηρήσεις του και τα σχόλιά του ήταν πολύτιµα για την ολοκλήρωση της εργασίας. Ιδιαίτερες ευχαριστίες στους συνεργάτες και φίλους ρ. Γεώργιο Λαγουµιντζή και υποψήφιο διδάκτορα του τµήµατος Σωτήρη Σιδέρη για το ευχάριστο, φιλικό και εποικοδοµητικό κλίµα συνεργασίας που είχα µαζί τους κατά τη διάρκεια της ολοκλήρωσης της εργασίας, καθώς επίσης και στα υπόλοιπα µέλη του εργαστηρίου. Θερµές ευχαριστίες αξίζουν ακόµη στους συναδέλφους του εργαστηρίου Βιοχηµείας του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ Αννα Κόκλα και Νίκο Τράκα για την εξαιρετική τεχνική τους υποστήριξη και βοήθεια. Ξεχωριστά θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς µου και τα αδέλφια µου, οι οποίοι µε την αγάπη τους, καθώς και µε την συνεχή ηθική συµπαράστασή τους, µε βοήθησαν στην εκπλήρωση των στόχων µου. 5

6 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 6

7 Α.1. Νευροµυϊκή σύναψη: η διαβίβαση των ώσεων από τα νεύρα στις ίνες των σκελετικών µυών. Οι µυϊκές ίνες των σκελετικών µυών δέχονται νεύρωση από εµµύελες νευρικές ίνες. Η κάθε νευρική ίνα φυσιολογικά διακλαδίζεται πολλές φορές και διεγείρει από τρεις µέχρι και µερικές εκατοντάδες µυϊκές ίνες των σκελετικών µυών. Η νευρική απόληξη πραγµατοποιεί µια σύνδεση µε τη µυϊκή ίνα η οποία ονοµάζεται νευροµυϊκή σύναψη (εικόνα 1) και η οποία εντοπίζεται σε εγκόλπωµα της µυϊκής ίνας, χωρίς όµως να εισέρχεται µέσα από την πλασµατική µεµβράνη της. Ολόκληρη αυτή η κατασκευή ονοµάζεται τελική κινητική πλάκα (Siegelbaum and Kandel, 1991), ενώ το εγκόλπωµα καλείται συναπτική αύλακα. Καθώς ο κινητικός άξονας πλησιάζει την κινητική πλάκα, χάνει µέρος του µυελινικού του περιβλήµατος και χωρίζεται σε λεπτούς κλάδους πάχους 2 µm. Κάθε κλάδος σχηµατίζει στο τέλος του ελλειψοειδείς κιρσώδεις σχηµατισµούς, τα συναπτικά κοµβία, από τα οποία απελευθερώνεται ο νευροδιαβιβαστής (McMahan and Kuffler, 1971). Κάθε συναπτικό κοµβίο βρίσκεται πάνω από µία κοιλότητα της µυϊκής ίνας όπου η µεµβράνη παρουσιάζει βαθιές πτυχώσεις. Αυτές επιστρώνονται από τη βασική µεµβράνη, ένα δίκτυο συνδετικού ιστού που αποτελείται από κολλαγόνο και γλυκοπρωτεΐνες και καλύπτει την επιφάνεια όλης της µυϊκής ίνας. Τα συναπτικά κοµβία περιέχουν άφθονα µιτοχόνδρια, νευροϊνίδια και σφαιρικές ή ωοειδείς κύστεις σταθερής διαµέτρου (~400 Å), τα συναπτικά κυστίδια, που περιέχουν ακετυλοχολίνη (acetylcholine, ACh). Τόσο το προσυναπτικό άκρο όσο και η µυϊκή ίνα εκκρίνουν πρωτεΐνες στη βασική µεµβράνη (Blau and Webster, 1981). Μια από αυτές είναι το ένζυµο που υδρολύει και αδρανοποιεί την ακετυλοχολίνη, η ακετυλοχολινεστεράση. Η προσυναπτική µεµβράνη χωρίζεται από τη µετασυναπτική από σταθερού εύρους µεσοκυττάριο διάστηµα (περίπου 500 Å), τη συναπτική σχισµή. Στις ακρολοφίες των πτυχώσεων της µετασυναπτικής µεµβράνης βρίσκονται οι υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (acetylcholine receptors AChRs), σε συγκέντρωση υποδοχείς ανά µm 2 πλασµατικής µεµβράνης. Όταν ένα δυναµικό ενεργείας φτάσει στα συναπτικά κοµβία του νευράξονα προκαλεί διάνοιξη των καναλιών ασβεστίου (Ca +2 ) της προσυναπτικής µεµβράνης. Η διάνοιξη αυτή οδηγεί σε είσοδο ιόντων Ca +2 στο κύτταρο λόγω ηλεκτροχηµικής κλίσης. Η αύξηση της συγκέντρωσης των ιόντων Ca +2 οδηγεί σε µετακίνηση και σύντηξη των συναπτικών κυστιδίων µε την προσυναπτική µεµβράνη και απελευθέρωση της 7

8 ακετυλοχολίνης στη συναπτική σχισµή. Η διαχεόµενη στη συναπτική σχισµή ακετυλοχολίνη προσδένεται στους υποδοχείς της στη µετασυναπτική µεµβράνη του µυϊκού κυττάρου και προκαλεί µε τη σειρά της διάνοιξη των υποδοχέων της και είσοδο ιόντων νατρίου (Na + ) στο µυϊκό κύτταρο. Η αύξηση της συγκέντρωσης των ιόντων οδηγεί στη δηµιουργία ενός δυναµικού ενεργείας που µεταβιβάζεται καθ όλο το µήκος της ίνας µε τη δράση των τασεοεξαρτώµενων καναλίων Na +. Νευρικό κύτταρο Νευροµυϊκή σύναψη Μυϊκές ίνες Τελική κινητική πλάκα Προσυναπτική µεµβράνη Συναπτική σχισµή ACh Μετασυναπτική µεµβράνη AChR Συναπτική αύλακα Τασοεξαρτώµενα κανάλια Na+ υναµικό ενεργείας Εικόνα 1. Η Νευροµυϊκή σύναψη σε λεπτοµέρεια. ιακρίνεται η τελική κινητική πλάκα και το σηµείο επαφής µεταξύ της τελικής απόληξης του νευράξονα και της µεµβράνης της µυϊκής ίνας. Απεικονίζονται οι υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (AChR) στην πλασµατική µεµβράνη του µυικού κυττάρου και τα απελευθερούµενα µόρια της ακετυλοχολίνης (ACh) από τα συναπτικά κοµβία του νευρικού κυττάρου στη συναπτική σχισµή. J Clin Invest. 116, (2006). 8

9 Α.2. Ο νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης. Oι χολινεργικοί υποδοχείς, δηλαδή οι υποδοχείς που ενεργοποιούνται από την ακετυλοχολίνη, διακρίνονται σε νικοτινικούς και µουσκαρινικούς, ανάλογα µε την επίδραση που έχουν σε αυτούς τα αλκαλοειδή, νικοτίνη και µουσκαρίνη. Αντίστοιχα οι νικοτινικοί υποδοχείς, εκτός από το ότι προσδένουν την ακετυλοχολίνη, αναγνωρίζουν επίσης τη νικοτίνη, αλλά παρουσιάζουν µικρή συγγένεια για τη µουσκαρίνη, ένα αλκαλοειδές που βρίσκεται σε ορισµένα δηλητηριώδη µανιτάρια. Αντίθετα, οι µουσκαρινικοί υποδοχείς, εκτός από την ακετυλοχολίνη, προσδένουν τη µουσκαρίνη, αλλά όχι και τη νικοτίνη. Ο νικοτινικός υποδοχέας εντοπίζεται στο Κεντρικό Νευρικό Σύστηµα, στο µυελό των επινεφριδίων, στα γάγγλια του Aυτονόµου Νευρικού Συστήµατος και στη νευροµυϊκή σύναψη, σχηµατίζοντας κανάλι πού επιτρέπει την διέλευση συγκεκριµένων κατιόντων (Κ +, Να + ). Ο µουσκαρινικός υποδοχέας αντίθετα βρίσκεται κυρίως στα εκτελεστικά όργανα του Aυτονόµου Νευρικού Συστήµατος, δηλαδή την καρδιά, τους λείους µύες και τους εξωκρινείς αδένες. Ο νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης ανήκει στην υπερ-οικογένεια των ρυθµιζόµενων από το συνδεόµενο µόριο ιοντικών καναλιών, δηλαδή είναι πρωτεΐνες αποτελούµενες από πολλές υποµονάδες, όπου η πρόσδεση του αγωνιστή οδηγεί στο εκλεκτικό άνοιγµα του καναλιού των ιόντων. Οι AChR διακρίνονται σε δύο υποοικογένειες. Η πρώτη περιλαµβάνει τον AChR των ηλεκτρικών οργάνων µερικών ψαριών όπως του Τοrpedo και τον AChR της νευροµυϊκής σύναψης των σκελετικών µυών. Αποτελούνται από οµόλογες υποµονάδες α, β, δ και γ ή ε. Ο AChR στο ηλεκτρικό όργανο του ψαριού Τοrpedo βρίσκεται σε πυκνότητα περίπου 1000 φορές µεγαλύτερη από εκείνη των νευροµυϊκών συνάψεων του ανθρώπου και γι'αυτό το λόγο ο Τοrpedo AChR έχει µελετηθεί εκτενώς και αποτελεί µοντέλο υποδοχέα-ιοντικού καναλιού. H δεύτερη υπο-οικογένεια των AChR περιλαµβάνει τους υποδοχείς του νευρικού συστήµατος. Αυτοί αποτελούνται από δύο είδη υποµονάδων τις α και β, που είναι οµόλογες µε τις µυϊκές α και β. Υπάρχουν όµως οκτώ διαφορετικές µορφές α και τρεις β, οι οποίες συνδυαζόµενες σχηµατίζουν αρκετά λειτουργικά πενταµερή µόρια. Α.2.1. οµή του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Οι υποδοχείς της νευροµυϊκής σύναψης αντιπροσωπεύονται από τους υποδοχείς του ηλεκτρικού οργάνου του ιχθύος Torpedo californica µε του οποίους εµφανίζουν πολύ υψηλή οµολογία (Grutter and Changeux, 2001, Karlin, 2002). Ο Torpedo είναι πρώτος 9

10 AChR που αποµονώθηκε, χαρακτηρίστηκε και κλωνοποιήθηκε. Ο Torpedo AChR είναι ο µόνος υποδοχέας της οικογένειας που έχει χαρακτηριστεί και η σηµερινή γνώση για το µόριο των νικοτινικών υποδοχέων, έχει προκύψει από δοµικά δεδοµένα του Torpedo AChR (Unwin, 1993, 2005 Miyazawa et al., 1999) (εικόνα 2). οµικά δεδοµένα για την θέση πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης στο µόριο του AChR, έχουν προέλθει επίσης από το οµοπενταµερές µόριο της ACh-binding protein µιας πρωτεΐνης που αποµονώθηκε από γλοία κύτταρα του σαλιγκαριού Lymnaea stagnalis (Brejc et al., 2001, Sine, 2002) α β MIR εξωκυτταρική περιοχή MIR πλασµατική µεµβράνη κυτταρόπλασµα Εικόνα 2. ιαγραµµατική απεικόνιση του Torpedo υποδοχέα, όπως προέκυψε από µελέτη κρυσταλλογραφικής ανάλυσης 4 Å. Απεικόνιση του υποδοχέα όπως παρατηρείται (α) από τη συναπτική σχισµή και (β) παράλληλα προς την πλασµατική µεµβράνη. Απεικονίζονται οι υποµονάδες του υποδοχέα: α (κόκκινο χρώµα), β (πράσινο χρώµα), γ (βαθύ µπλε), δ (µπλε). J Mol Biol. 346, (2005). Οι µυϊκού τύπου AChRs (~290 kda) αποτελούνται από πέντε υποµονάδες που οργανώνονται κυκλικά σχηµατίζοντας το ιοντικό κανάλι (εικόνα 3). Η σειρά τοποθέτησης των υποµονάδων στο µόριο είναι α1, γ, α1, δ, β1 (Karlin, 2002). Στο µόριο σχηµατίζονται δύο θέσεις πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης στην έσω επιφάνεια των α1 υποµονάδων. Στη θέση πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης συνεισφέρουν επίσης οι γ και δ υποµονάδες. Η γ υποµονάδα επικρατεί στον εµβρυϊκό µυ και τον Torpedo, ενώ στον ενήλικο µυ αντικαθίσταται από την ε υποµονάδα. 10

11 Όλες οι υποµονάδες του υποδοχέα µοιράζονται ένα κοινό δοµικό πρότυπο (Lindstrom 2000). Η αµινοτελική περιοχή της κάθε υποµονάδας (210~221 αµινοξέα) σχηµατίζει την µεγάλη εξωκυττάρια περιοχή του, τα βασικά χαρακτηριστικά της οποίας πιθανόν, προσοµοιάζονται από τη δοµή της ACh-binding protein (Brejc et al., 2001). Χαρακτηριστικό των εξωκυτταρικών τµηµάτων των α υποµονάδων του υποδοχέα είναι η ύπαρξη µια θηλιάς που σχηµατίζεται από την δηµιουργία δισουλφιδικού δεσµού ανάµεσα στα αµινοξέα 128 και 142. Στη θηλιά αυτή συνήθως υπάρχει στο αµινοξύ 141 θέση γλυκοζυλίωσης ενώ και οι υπόλοιπες υποµονάδες είναι γλυκοζυλιωµένες σε διαφορετικές θέσεις. Σε όλες τις υποµονάδες το εξωκυτταρικό τµήµα ακολουθούν 4 διαµεµβρανικές περιοχές (Μ1, Μ2, Μ3, Μ4) που αποτελούνται από 90 περίπου συντηρηµένα αµινοξέα. Μεταξύ των περιοχών Μ3 και Μ4 εµφανίζεται µια µεγάλη µη συντηρηµένη κυτταροπλασµατική περιοχή αµινοξέων που συµµετέχει στην πρόσδεση της ραψίνης, της πρωτεΐνης που συνδέει τον υποδοχέα µε τον κυτταροσκελετό. Μετά την Μ4 περιοχή ακολουθεί ένα µικρό εξωκυτταρικό τµήµα (το καρβοξυτελικό άκρο) που αποτελείται από 3-27 αµινοξέα. Οι υποµονάδες του υποδοχέα µοιάζουν µε ράβδους τοποθετηµένες γύρω από το κεντρικό κατιονικό κανάλι σχηµατίζοντας το µόριο του υποδοχέα (Miyazawa, 1999). Ο AChR εκτείνεται περίπου 65 Å πάνω από την πλασµατική µεµβράνη, 40 Å µέσα σε αυτή και 35 Å κάτω από αυτή. Παρατηρώντας τον υποδοχέα από επάνω εµφανίζει συνολική διάµετρο 80 Å µε διάµετρο πόρου περίπου 30 Å. Οι δύο θέσεις σύνδεσης των ACh βρίσκεται σε ύψος περίπου 30 Å πάνω από την πλασµατική µεµβράνη. 11

12 α β Εικόνα 3. οµή του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. α. Το πρότυπο σχήµα των υποµονάδων διαµέσου της µεµβράνης. β. Σχηµατική αναπαράσταση της τεταρτοταγή δοµής του µορίου του AChR, παρουσιάζοντας την διευθέτηση των υποµονάδων, τις περιοχές σύνδεση της ACh και το κατιονικό κανάλι. Nat Rev Neurosci. 3, (2002). Α.2.2. Θέση πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης και α-τοξινών. Ο µυϊκού τύπου AChR εµφανίζει 2 περιοχές πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης, που σχηµατίζονται στην έσω πλευρά ανάµεσα στην α-υποµονάδα (θετική πλευρά) και στην πλευρά (αρνητική) των παρακείµενων υποµονάδων (γ και δ υποµονάδων) (Brejc et al., 2001, Grutter and Changeux, 2001, Karlin, 2002). Πειράµατα µεταλλαξιγένεσης σε AChRs και δοµικής ανάλυσης της ACh- binding protein αποκάλυψαν ότι η περιοχή της α-υποµονάδας αποτελεί την κύρια πλευρά που συνεισφέρει τρεις, µη συνεχείς περιοχές δοµής θηλειάς, ενώ η µη α-υποµονάδα καλείται συµπληρωµατική και συνεισφέρει τέσσερις µη συνεχείς περιοχές και αυτές µε χαρακτηριστική δοµή θηλειάς. Η συµµετοχή διαφορετικών µη α-υποµονάδων στο σχηµατισµό της περιοχής πρόσδεσης προκαλεί πρόσδεση αγωνιστών και ανταγωνιστών στις δύο περιοχές µε διαφορετική συγγένεια. Οι α-τοξίνες φιδιών προσδένονται στον AChR κοντά ή πάνω στη θέση πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης µε πολύ υψηλή συγγένεια, αναστέλλουν την λειτουργία του ιοντικού καναλιού και εµποδίζουν τη συναπτική διαβίβαση (Karlin et al., 1986, Revah et al., 1987). Έχουν χρησιµοποιηθεί ευρύτατα για την αποµόνωση του υποδοχέα, καθώς 12

13 επίσης στη µελέτη της δοµής, της λειτουργίας και της βιογέννεσης. Η πιο σηµαντική από αυτές είναι η α-µπουγγαροτοξίνη, ένα πολυπεπτίδιο 74 αµινοξέων και µοριακού βάρους 8000, η οποία παρουσιάζει υψηλή σταθερά σύνδεσης (Damle and Karlin 1980). H α-µπουγγαροτοξίνη βρέθηκε ότι προσδένεται και στην αποδιαταγµένη α-υποµονάδα µε µικρότερη όµως συγγένεια (Ηaggerty and Froehner, 1981), καθώς και σε πρωτεΐνη προερχόµενη από ανασυνδυασµένο DNA που κωδικοποιεί την α-υποµονάδα, µε ανάλογη συγγένεια µε αυτή που προσδένεται στον ανέπαφο AChR (Βlount and Merlie, 1988), γεγονός που οδήγησε στο συµπέρασµα, ότι η κύρια θέση πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης είναι στην α-υποµονάδα του υποδοχέα της. Α.2.3. Αντιγονικότητα του AChR και κύρια ανοσογόνος περιοχή. Έχει δειχθεί ότι µετά από χορήγηση ανέπαφου AChR ή τµηµάτων του σε πειραµατόζωα διαφόρων ειδών, αυτά αποκρίνονται µε την παραγωγή αντισωµάτων που κατευθύνονται σε διάφορες περιοχές του υποδοχέα. Ποσότητα ανθρώπινου AChR µικρότερη από 1 µg ανά αρουραίο είναι δυνατόν να διεγείρει την παραγωγή αντισωµάτων µε την πρώτη ένεση (Lindstrom et al., 1976a). Όταν το ανοσογόνο είναι ο ανέπαφος AChR, η πλειονότητα των παραγοµένων αντισωµάτων κατευθύνονται έναντι εξωκυτταρικών περιοχών του. Αντίθετα όταν χρησιµοποιείται µετουσιωµένος AChR, µετά από κατεργασία µε SDS, ή επιµέρους υποµονάδες του, ως ανοσογόνα, η ανοσοαπάντηση είναι κυρίως έναντι της κυτταροπλασµατικής περιοχής του µορίου (Froehner, 1986, Sargent et al., 1984). Τα δύο τρίτα των αντί-achr αντισωµάτων που προέρχονται από ζώα ανοσοποιηµένα µε ανέπαφο υποδοχέα, καθώς επίσης και τα αντισώµατα έναντι του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης από ορούς µυασθενικών ασθενών, προσδένονται στη λεγόµενη Κύρια Ανοσογόνο Περιοχή (Main Immunogenic Region, MIR) (Tzartos and Lindstrom, 1980, Tzartos et al., 1991). Η MIR βρίσκεται στην εξωκυτταρική πλευρά του υποδοχέα, στοιχείο που έχει αποδειχθεί µε πειράµατα πρόσδεσης διαφόρων αντί-mir µονοκλωνικών αντισωµάτων σε αποδιαταγµένες α-υποµονάδες (Tzartos and Lindstrom, 1980; Tzartos et al., 1981), καθώς και από την ικανότητά τους να προκαλούν µυασθένεια σε πειραµατόζωα. Η θέση της MIR στην εξωκυτταρική περιοχή του AChR έχει επίσης πιστοποιηθεί άµεσα σε µελέτες µε τη χρήση ηλεκτρονικής µικροσκοπίας ( Kubalek et al., 1987, Unwin, 1995, Beroukhim and Unwin, 1995). 13

14 Α.3. Μυασθένεια Η Μυασθένεια είναι η πιο διεξοδικά µελετηµένη αυτοάνοση νόσος. Τα κλινικά χαρακτηριστικά της πρωτοαναγνωρίστηκαν πριν από 300 περίπου χρόνια από το φυσιολόγο της εποχής Thomas Willis, ενώ περιγράφηκε ως κλινική οντότητα στα τέλη του 19 ου αιώνα από τον Samuel Wilks (Hughes, 2005). Η σύνδεση της Μυασθένειας µε άλλες αυτοάνοσες ασθένειες, όπως η θυρεοειδίτιδα και η ρευµατοειδής αρθρίτιδα, καθώς και η εντόπιση ιστολογικών ανωµαλιών στο θύµο αδένα σε ένα µεγάλο ποσοστό των µυασθενικών, έδωσε ενδείξεις για την αυτοάνοση φύση της, γεγονός που επιβεβαιώθηκε το 1973 µε δύο σηµαντικές εργασίες. Η πρώτη έδειξε ότι χορήγηση AChR σε πειραµατόζωα προκαλεί πειραµατική Μυασθένεια (Patrick and Lindstrom, 1973) και η δεύτερη ότι οι µυασθενικοί έχουν ελαττωµένο αριθµό AChR στις νευροµυϊκές συνάψεις τους (Fambrough et al., 1973). Έτσι γρήγορα κατανοήθηκε ότι προκαλείται από αυτοάνοση αντίδραση έναντι του AChR στη νευροµυϊκή σύναψη (Drachman 1987 a, Lindstrom et al., 1988). Η Μυασθένεια αποτελεί µοντέλο για την κατανόηση των αυτοάνοσων ασθενειών εξαιτίας του πολύ καλά µελετηµένου αυτοαντιγόνου της, του AChR. H πρόοδος στην κατανόηση της Μυασθένειας συµβαδίζει µε την πρόοδο στη µελέτη του AChR. Οι µελέτες µε στόχο την κατανόηση της δοµής και της λειτουργίας του AChR οδηγούν σε πολύτιµα συµπεράσµατα σχετικά µε την παθοφυσιολογία της Μυασθένειας. Πράγµατι, η διαθεσιµότητα αποµονωµένου AChR οδήγησε στην ανακάλυψη ότι τα αντισώµατα έναντι του AChR προκαλούν συµπτώµατα Μυασθένειας (Patrick and Lindstrom, 1973). Επίσης η διαθεσιµότητα ενός µεγάλου αριθµού µονοκλωνικών αντισωµάτων αρουραίου, αποκάλυψε την ύπαρξη της κύριας ανοσογόνου περιοχής στην α-υποµονάδα του AChR (Tzartos and Lindstrom, 1980). Α.3.1. Κλινικά χαρακτηριστικά Επιδηµιολογικά δεδοµένα. H Μυασθένεια χαρακτηρίζεται από αδυναµία και εύκολη κόπωση των σκελετικών µυών και από ανάκτηση της µυϊκής δύναµης µε την ανάπαυση (Drachman, 1998a). Συχνότερη και ως πρώτη εκδήλωση, σύµπτωµα, είναι η συµµετρική ή µη προσβολή των οφθαλµικών µυών, που οδηγεί σε πτώση των βλεφάρων και παροδική διπλωπία. Στο 15% των περιπτώσεων η αδυναµία παραµένει εστιασµένη µόνο στους παραπάνω µύες (Grob et al., 1987). Στις περισσότερες περιπτώσεις όµως η αδυναµία επεκτείνεται και οι επόµενοι µύες που επηρεάζονται είναι οι προσωπικοί και οι περιοφθαλµικοί µύες. Στα 14

15 επόµενα στάδια της νόσου παρατηρείται γενικευµένη αδυναµία η οποία µπορεί να είναι ήπιας, ενδιάµεσης ή βαριάς µορφής. Στην περίπτωση αυτή επηρεάζονται σε µικρότερο ή µεγαλύτερο βαθµό οι µύες των άκρων του κορµού και πιθανώς εµφανίζεται δυσκολία στην αναπνοή. Γενικευµένη αδυναµία διαφόρων µορφών παρουσιάζει το 85% των ασθενών (Grob et al., 1987). Η βαριάς µορφής γενικευµένη αδυναµία µπορεί να οδηγήσει σε σοβαρές καταστάσεις κρίσης λόγω εκτεταµένης προσβολής των µυών του αναπνευστικού συστήµατος ( Oosterhius, 1984). Η βαριά µυασθένεια εµφανίζεται σε 200 περιπτώσεις ανά εκατοµµύριο πληθυσµού (Phillips, 2004). Η επίπτωση της νόσου παρόλο που είναι ιδία σε άνδρες και γυναίκες (Poulas et al., 2000), έχει δειχθεί ότι σχετίζεται µε την ηλικία και το φύλο παρουσιάζοντας 2 κορυφές: η πρώτη εµφανίζεται κατά την δεύτερη και τρίτη δεκαετία του βίου, όπου προσβάλλονται κυρίως γυναίκες, ενώ η δεύτερη κορυφή κατά την έκτη και έβδοµη δεκαετία όπου προσβάλλονται κυρίως άνδρες (Drachman, 1998b, Poulas et al., 2000). Α.3.2. Παθογένεση της βαριάς µυασθένειας. Η βασική ανωµαλία που παρατηρείται στη βαριά µυασθένεια είναι η µείωση του αριθµού των διαθέσιµων AChRs στις νευροµυϊκές συνάψεις. Η µείωση αυτή προκαλείται από τα αυτοαντισώµατα που παράγονται κατά του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. Αντισώµατα κατά του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης εντοπίζονται µε τη χρήση ραδιοανοσολογικής τεχνικής στο 85-90% περίπου των µυασθενικών (Lindstrom 1998). Στο υπόλοιπο 15% των ασθενών οι οποίοι εµφανίζουν συµπτώµατα ήπιας οφθαλµικής ή και γενικευµένης µορφής δεν ανιχνεύονται αντισώµατα κατά του AChR. Παρόλα αυτά µελέτες σε βιοψίες µυών που πραγµατοποιήθηκαν σε οροαρνητικούς ασθενείς έδειξαν ότι οι ασθενείς αυτοί διαθέτουν σηµαντικά µειωµένο αριθµό υποδοχέων της ακετυλοχολίνης ανά νευροµυϊκή σύναψη (Drachman et al., 1897b). Ένα ποσοστό αυτών των ασθενών εµφανίζει αντισώµατα έναντι της πρωτεΐνης MuSK (Muscle Specific Kinase) (Hoch et al., 2001), απαραίτητης για την οµαδοποίηση των υποδοχέων της ακετυλοχολίνης στη νευροµυϊκή σύναψη κατά την ανάπτυξη. Τα αντισώµατα αυτά ανιχνεύονται µε τη χρήση ευαίσθητης και υψηλά ειδικής ραδιοανοσολογικής τεχνικής (Matthews et al., 2004). Ένα από τα σηµαντικά προβλήµατα που παραµένουν άγνωστα τόσο στη βαριά µυασθένεια όσο και στις άλλες αυτοάνοσες νόσους είναι η αιτία που προκαλεί την 15

16 αυτοάνοση απόκριση. Τα αποτελέσµατα των ερευνών που έχουν πραγµατοποιηθεί µέχρι σήµερα έχουν συµβάλει στη διατύπωση διαφόρων υποθέσεων για την παθογένεση της βαριάς µυασθένειας. Σηµαντικό ρόλο φαίνεται να διαδραµατίζει ο θύµος αδένας καθώς το 75% των µυασθενικών εµφανίζει παθολογικές ανωµαλίες στο θύµο αδένα και η θυµεκτοµή έχει ως αποτέλεσµα τη βελτίωση ή και ακόµα την πλήρη υποχώρηση των συµπτωµάτων στην πλειοψηφία των ασθενών (Drachman, 1994). Έχει επίσης δειχθεί πως Τ- και Β- λεµφοκύτταρα που αποµονώνονται από το θύµο αδένα είναι πιο ώριµα και πιο ευαίσθητα σε απόκριση κατά του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, σε σχέση µε τα λεµφοκύτταρα που αποµονώνονται από το περιφερικό αίµα (Sommer et al., 1990). Επίσης στο θύµο υγιών και µυασθενικών ατόµων εντοπίζονται τα µυοειδή κύτταρα που εµφανίζουν βιοχηµικά και µορφολογικά χαρακτηριστικά παρόµοια µε εκείνα των σκελετικών µυϊκών κυττάρων και φέρουν στην επιφάνειά τους υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (Wekerle et al., 1975, Kao and Drachman, 1977a). Τα κύτταρα αυτά πιθανώς να αποτελούν πηγή του ανοσογόνου υποδοχέα για την έναρξη της αυτοάνοσης απόκρισης, καθώς περιβάλλονται από αντιγονονοπαρουσιαστικά κύτταρα και Τ- βοηθητικά λεµφοκύτταρα. Έτσι κάποια βλάβη στον ανοσοποιητικό µηχανισµό ή κάποια αλλοίωση στα µυοειδή κύτταρα ή στα λεµφοκύτταρα µπορεί να κάνει τα πρώτα ευάλωτα στην ανοσολογική επίθεση των λεµφοκυττάρων (Drachman, 1994) Μια άλλη υπόθεση που έχει αναφερθεί για την παθογένεση της βαριάς µυασθένειας υποστηρίζει ότι η έναρξη της ανοσοαπόκρισης είναι πιθανώς αποτέλεσµα µοριακού µιµιτισµού (Dieperink and Stefansson, 1989, Schwimmbeck et al., 1989). Σύµφωνα µε αυτή ένας µολυσµατικός παράγοντας διαθέτει έναν επίτοπο που µιµείται έναν επίτοπο του AChR και είναι δυνατό να προκαλέσει αυτοάνοση απόκριση. Στη βαριά µυασθένεια µια αλληλουχία της α-υποµονάδας του AChR παρουσιάζει µεγάλη οµολογία µε µια αλληλουχία του ιού του απλού έρπητα (Schwimmbeck et al., 1989). Παρόµοια αποτελέσµατα έχουν παρατηρηθεί και σε περιπτώσεις βακτηρίων όπου µονοκλωνικά αντισώµατα έναντι του υποδοχέα αντιδρούν διασταυρωτά µε επιτόπους από διάφορα στελέχη βακτηρίων (Stefansson et al., 1987). Γενετικοί παράγοντες που να έχουν στενή σχέση µε προδιάθεση ή ευαισθησία στην εµφάνιση της βαριάς µυασθένειας δεν είναι γνωστοί µέχρι σήµερα. 16

17 Α.3.3. Μηχανισµοί δράσης των αντισωµάτων έναντι του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. Τα αυτοαντισώµατα που παράγονται στη βαριά µυασθένεια προκαλούν µείωση των διαθέσιµων λειτουργικών υποδοχέων της ακετυλοχολίνης στις νευροµυϊκές συνάψεις µέσω των ακόλουθων µηχανισµών: Α. Επιταχυνόµενη ενδοκυττάρωση και αποικοδόµηση των AChR (αντιγονική τροποποίηση) (εικόνα 4β). Η ικανότητα των αυτοαντισωµάτων να επιταχύνουν το ρυθµό ενδοκυττάρωσης και αποικοδόµησης των υποδοχέων της ακετυλοχολίνης έχει αποδειχθεί σε καλλιέργειες µυϊκών κυττάρων (Kao and Drachman, 1977b, Appel et al., 1977, Bevan et al., 1977) και µε πειράµατα in vivo σε ανέπαφες νευροµυϊκές συνάψεις πειραµατοζώων (Stanley and Drachman, 1978). Η επιταχυνόµενη αποικοδόµηση των υποδοχέων από τα αυτοαντισώµατα, γνωστό και ως αντιγονική τροποποίηση, οφείλεται στη δυνατότητα που έχουν τα αντισώµατα να συνδέονται ταυτόχρονα σε δύο γειτονικά µόρια του υποδοχέα στη µεµβράνη του µυϊκού κυττάρου (Drachman et al., 1978). Οι υποδοχείς που διασυνδέονται από τα αυτοαντισώµατα δηµιουργούν σύµπλοκα στενά συνδεδεµένων µορίων, τα οποία ενδοκυτταρώνονται µε ταχύτερο ρυθµό από τους απλούς υποδοχείς (Pumplin and Drachman, 1983). Ακολούθως οι υποδοχείς αποδοµούνται στα λυσοσώµατα. B. Λύση της µετασυναπτικής µεµβράνης µέσω του συµπληρώµατος (εικόνα 4α). Οι πρωτεΐνες του συµπληρώµατος προσδένονται στα αυτοαντισώµατα που βρίσκονται συνδεδεµένα στους υποδοχείς της ακετυλοχολίνης και προκαλούν λύση της µετασυναπτικής µεµβράνης. Τα αποτελέσµατα µιας σειράς µελετών αποδεικνύουν τη συµµετοχή του συµπληρώµατος στη βαριά µυασθένεια: µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο µελετήθηκαν οι νευροµυϊκές συνάψεις των µυασθενικών και εντοπίστηκαν διάφορες µορφολογικές αλλοιώσεις στη µετασυναπτική µεµβράνη, οι οποίες αποδόθηκαν στη δράση του συµπληρώµατος (Engel et al., 1976). Με τη χρήση ανοσοιστοχηµικών τεχνικών ανιχνεύθηκαν άµεσα τα συστατικά του συµπληρώµατος στις νευροµυϊκές συνάψεις των µυασθενικών (Sahashi et al., 1980, Engel and Arahata, 1987). Σε πειράµατα παθητικής µεταφοράς της µυασθένειας σε ζώα αποδείχθηκε, ότι η παθογόνος δράση των αντισωµάτων ενισχύεται από την παρουσία του συµπληρώµατος και µειώνεται όταν το συµπλήρωµα αποµακρύνεται (Toyka et al., 1977). Σε παρόµοια πειράµατα φάνηκε ότι τα πειραµατόζωα προστατεύονται από την παθητική µεταφορά 17

18 της µυασθένειας µε τη χορήγηση µονοσθενούς αντισώµατος κατά του συστατικού C6 του συµπληρώµατος (Biesecker and Gomez, 1989). Γ. Άµεση παρεµπόδιση της λειτουργίας του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (εικόνα 4γ). Περίπου το 90% των µυασθενικών διαθέτουν αντισώµατα στον ορό τους, τα οποία παρεµποδίζουν την πρόσδεση της ακετυλοχολίνης στο µόριο του υποδοχέα και αναστέλλουν τη λειτουργία του ιοντικού καναλιού (Drachman et al., 1982, Bender et al., 1975, Pachner, 1989). Επειδή τα αντισώµατα έχουν µεγάλο µέγεθος, σε σχέση µε το µέγεθος της ακετυλοχολίνης, φαίνεται ότι µερικά από αυτά προσδένονται σε σηµεία κοντά (και όχι ακριβώς) προς τη θέση πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης και αναστέλλουν τη λειτουργία του υποδοχέα, λόγω στερεοχηµικής παρεµπόδισης. a. α Νευρικό κύτταρο MAC Αb Ενεργοποίηση συµπληρώµατος Καταστροφή µεµβράνης Μυϊκό κύτταρο b. β γ c. Αb ιασύνδεση AChR Ενδοκυττάρωση AChR Αποικοδόµηση AChR Λειτουργική παρεµπόδιση AChR Εικόνα 4. Μηχανισµοί δράσης των αντισωµάτων έναντι του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης α. Λύση της µετασυναπτικής µεµβράνης µέσω της δράσης του συµπληρώµατος. Αντισώµατα που προσδένονται στον AChR ενεργοποιούν τις πρωτεΐνες του συµπληρώµατος, σχηµατίζοντας το κύριο σύµπλοκο επίθεσης του συµπληρώµατος (MAC, Major Attack complex) µε τελικό αποτέλεσµα την καταστροφή της µετασυναπτικής µεµβράνης. β. αντιγονική τροποποίηση. γ. Άµεση παρεµπόδιση της λειτουργίας του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. J Clin Invest. 116, (2006). 18

19 Α.3.4.Ετερογένεια των αντισωµάτων κατά του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. Τα αντισώµατα που παράγονται κατά του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης στη βαριά µυασθένεια εµφανίζουν µεγάλη ετερογένεια, τόσο σε κάθε ασθενή, όσο και µεταξύ διαφορετικών ασθενών. Μελέτες σε πληθυσµούς µυασθενικών έδειξαν ότι υπάρχει µικρή συσχέτιση µεταξύ της βαρύτητας της νόσου και της συγκέντρωσης των αυτοαντισωµάτων στον ορό τους (Lindstrom et al., 1976b, Appel et al., 1977). Η διαπίστωση αυτή οδήγησε στην υπόθεση ότι τα αυτοαντισώµατα ποικίλουν ως προς την ικανότητά τους να προκαλούν µυϊκή αδυναµία. Για το λόγο αυτό ελέχθηκε η ικανότητα των αυτοαντισωµάτων από διαφορετικούς πληθυσµούς να προκαλούν µείωση του αριθµού των διαθέσιµων λειτουργικών υποδοχέων σε καλλιέργειες µυϊκών κυττάρων (Drachman et al., 1982). Τα πειράµατα αυτά έδειξαν ότι η κλινική κατάσταση των µυασθενικών εµφανίζει καλή συσχέτιση µε την ικανότητα που έχουν οι οροί των µυασθενικών να µειώνουν των αριθµό των υποδοχέων της ακετυλοχολίνης, ανεξάρτητα από την συγκέντρωση των αυτοαντισωµάτων. Στα ίδια πειράµατα φάνηκε ότι οι οροί µερικών µυασθενικών επιδρούν κυρίως µέσω του µηχανισµού της αντιγονικής τροποποίησης, ενώ άλλοι οροί προκαλούσαν απώλεια των υποδοχέων κυρίως µέσω της άµεσης παρεµπόδισης της λειτουργίας του ιοντικού καναλιού. Η διαφορετική ικανότητα που έχουν τα αυτοαντισώµατα να προκαλούν µείωση του αριθµού των υποδοχέων και κατά συνέπεια µυϊκή αδυναµία καθώς και οι διαφορετικοί µηχανισµοί δράσης των αυτοαντισωµάτων σχετίζονται άµεσα µε τις θέσεις πρόσδεσης των αυτοαντισωµάτων στο µόριο του AChR. Η ετερογένεια των αντισωµάτων κατά του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης επιβεβαιώνεται επιπλέον από µια σειρά ευρηµάτων: πειράµατα ανταγωνισµού µεταξύ ορών από διαφορετικούς µυασθενικούς και µονοκλωνικών αντισωµάτων µε γνωστούς επιτόπους στο µόριο του υποδοχέα έδειξαν ότι τα αυτοαντισώµατα προσδένονται σε διάφορες υποµονάδες του υποδοχέα και σε διαφορετικές θέσεις στην κάθε υποµονάδα (Lindstrom et al., 1988, Tzartos et al., 1982, 1991, Vincent et al., 1987). Άλλες µελέτες έδειξαν ότι τα αυτοαντισώµατα διασυνδέουν ενδοµοριακά ή διαµοριακά τους επιτόπους (Conti-Tronconi et al., 1981), προσδένονται µε διαφορετική συγγένεια στο µόριο του AChR (Bray and Drachman, 1982) και ανήκουν σε διαφορετικές υποτάξεις (Vincent and Newsom-Davis, 1982, Thompson and Krolick, 1992). Τέλος πειράµατα ισοηλεκτρικής εστίασης των αυτοαντισωµάτων έναντι του υποδοχέα της 19

20 ακετυλοχολίνης από τον ίδιο και από διαφορετικούς µυασθενικούς ασθενείς έδειξαν αξιοσηµείωτη ετερογένεια µεταξύ τους (Lefvert et al., 1978, Krolick et al., 1994). Τα αυτοαντισώµατα των µυασθενικών προσδένονται στην εξωκυτταρική περιοχή του υποδοχέα και η πλειονότητά τους κατευθύνεται στην α-υποµονάδα του υποδοχέα (Lindstrom et al., 1988). Ένα αρκετά µεγάλο ποσοστό των αυτοαντισωµάτων προσδένεται στην κύρια ανοσογόνο περιοχή (Main Immunogenic Region, MIR) της α- υποµονάδας (Tzartos and Lindstrom, 1980, Tzartos et al.,1982, 1991). Αν και η MIR περιοχή είναι εξαρτώµενη από τη διαµόρφωση του υποδοχέα, το κύριο τµήµα των επιτόπων των περισσοτέρων µονοκλωνικών αντισωµάτων κατά της MIR περιοχής εντοπίζεται σε µια µικρή αλληλουχία της α-υποµονάδας µεταξύ των καταλοίπων (Tzartos et al., 1981, 1983, 1988, 1991). Α.3.5. Πειραµατικά Μοντέλα Μυασθένειας. Στη µελέτη της Μυασθένειας σηµαντικά έχουν συµβάλλει τα πειραµατικά µοντέλα µυασθένειας. Η παρατήρηση των Patrick και Lindstrom το 1973 ότι η ανοσολογική απάντηση έναντι του AChR στη νευροµυϊκή σύναψη επάγει έναν πειραµατικό τύπο µυασθένειας, όπως αυτός των ανθρώπων, έδωσε ώθηση στις έρευνες και θεµελίωσε τον αυτοάνοσο χαρακτήρα της νόσου. Η πειραµατική Μυασθένεια έχει προκληθεί σε όλα τα είδη που εξετάσθηκαν (κοτόπουλα, αρουραίοι, ποντίκια, κουνέλια, πίθηκοι) µε την χορήγηση ανέπαφων AChR ή υποµονάδων τους. Ένα άλλο µοντέλο πειραµατικής Μυασθένειας είναι η παθητικά µεταφερόµενη, η οποία προκαλείται µε χορήγηση πολυκλωνικών ή µονοκλωνικών αντισωµάτων ικανών να αναγνωρίζουν τον AChR του πειραµατόζωου και να προσδένονται ισχυρά σε αυτόν (Vincent, 1988). Πειραµατική µυασθένεια µπορεί να προκληθεί σε ζώα µε χορήγηση ορών µυασθενικών (Toyka, 1975) µε την προυπόθεση πως τα ανθρώπινα αυτοαντισώµατα του ορού αντιδρούν διασταυρωτά µε τον υποδοχέα του πειραµατοζώου. Στα τρωκτικά µπορεί επίσης να επαχθεί πειραµατική µυασθένεια µε µεταµόσχευσή ιστού από θύµο αδένα µυασθενικών (Schonbeck et al., 1992) καθώς επίσης µε µεταµόσχευση περιφερικών λεµφικών κυττάρων (Wang et al., 1992). Σε όλες τις παραπάνω πειραµατικές µορφές Μυασθένειας τα κλινικά και ιστολογικά χαρακτηριστικά του ζώου είναι παρόµοια µε αυτά της ανθρώπινης ιδιοπαθούς Μυασθένειας. Η κλινική εικόνα περιλαµβάνει γενικευµένη µυϊκή αδυναµία, απώλεια βάρους και µείωση του αριθµού των διαθέσιµων AChR στις νευροµυϊκές συνάψεις. Σε 20

21 κάθε περίπτωση είναι ένα χρήσιµο σύστηµα µελέτης και ανάλυσης του τρόπου δράσης των αντί-achr αντισωµάτων, καθώς και δοκιµής νέων θεραπευτικών εφαρµογών. Θα πρέπει να σηµειωθεί ότι ιδιοπαθής αυτοάνοση Μυασθένεια προσβάλλει επίσης τους σκύλους (Shelton, 1998). H γενική εικόνα του συνόλου των αντισωµάτων έναντι του AChR στη Μυασθένεια των σκύλων έχει πολλές οµοιότητες µε εκείνη της ανθρώπινης Μυασθένειας (Shelton et al., 1988) και οδηγεί στην υπόθεση ότι ο µηχανισµός πρόκλησης Μυασθένειας είναι κοινός µεταξύ ανθρώπων και σκύλων. Α.3.6. ιάγνωση και θεραπευτικές προσεγγίσεις της Μυασθένειας. Η διάγνωση της Μυασθένειας γίνεται κλινικά, εκτιµώντας ο κλινικός ιατρός τα συµπτώµατα αδυναµίας και εύκολης κόπωσης των σκελετικών µυών, σε συνδυασµό µε την επαναφορά της µυϊκής ισχύος σε σχεδόν φυσιολογικά επίπεδα µετά από τη χορήγηση αντιχολινεστερασικών ουσιών ταχείας δράσης (Tensilon test). Ιδιαίτερης αξίας είναι η ανίχνευση αντί-achr αντισωµάτων στον ορό του ασθενούς η οποία θέτει και τη διάγνωση. Τα αντισώµατα αυτά εντοπίζονται µε τη χρήση σηµασµένου ανθρώπινου AChR µε 125 Ι-µπουγγαροτοξίνη και ραδιοανοσοχηµικό προσδιορισµό (RIA) (Lindstrom et al., 1976). Οι µέθοδοι θεραπείας που έχει διαθέσιµες σήµερα ένας ιατρός δεν είναι ιδανικές και απόλυτα αποτελεσµατικές. Βασικό χαρακτηριστικό τους είναι η έλλειψη ειδικότητας και το παροδικό του χαρακτήρα τους. Ριζική θεραπεία µπορεί να επιτευχθεί µόνο µε τη χειρουργική αφαίρεση του θύµου αδένα, που επιβάλλεται σε ασθενείς µε θύµωµα (κακοήθης εξαλλαγή του θύµου αδένα), αλλά και στους υπόλοιπους αφού συνεκτιµηθεί η κλινική εικόνα, η ηλικία και η γενική κατάσταση (Masaoka et al., 1996). Το ένα τρίτο των ασθενών που υφίσταται θυµεκτοµή παρουσιάζει άµεση σαφή βελτίωση έως ίαση, ενώ ένα άλλο µεγάλο ποσοστό εµφανίζει παροδική βελτίωση σε µερικούς µήνες ή και αργότερα (Bramis et al., 1997). Η χορήγηση φαρµάκων µε αντιχολινεστερασική δράση, όπως η νεοστιγµίνη και η πυριδοστιγµίνη (Mestinon), έχουν ως αποτέλεσµα τον περιορισµό της υδρόλυσης της ακετυλοχολίνης στη νευροµυϊκή σύναψη και την παράταση της επίδρασης του νευροδιαβιβαστή. Αποτελεί µια από τις πιο παλιές θεραπείες που εξακολουθεί να έχει πρωτεύοντα ρόλο στη στρατηγική αντιµετώπισης της νόσου (Drachman et al., 1993). H χορήγηση ανοσοκατασταλτικών φαρµάκων, όπως τα κορτικοστεροειδή και η αζαθειοπρίνη, χρησιµοποιούνται για τη µείωση των συµπτωµάτων, ελαττώνοντας την 21

22 ανοσολογική απόκριση και συνεπώς τον τίτλο των κυκλοφορούντων αντισωµάτων (Palace et al., 1998). Βασικό µειονέκτηµά τους είναι η έλλειψη ειδικότητας και οι παρενέργειες που εµφανίζονται µετά από παρατεταµένη χορήγηση (Kupersmith et al., 1996, Bromberg et al., 1997). Ιδιαίτερη θέση στη θεραπευτική στρατηγική έχει η εφαρµογή της πλασµαφαίρεσης (Bartges, 1997, Cornelio et al., 1998, Kuks and Das, 1998) και η ενδοφλέβια χορήγηση µεγάλων δόσεων ανθρώπινων ανοσοσφαιρινών (Dalakas, 1997, 1999, Gajdos, 1997). Πρόκειται για θεραπείες που εφαρµόζονται κυρίως σε µυασθενικές κρίσεις και στοχεύουν στην παροδική, πλην σωτήρια, αποµάκρυνση των κυκλοφορούντων αντισωµάτων από τον ορό του ασθενούς. Οι έρευνες σήµερα ολοένα και περισσότερο στρέφονται σε ειδικές ανοσοθεραπείες που θα αποδειχθούν πιο αποτελεσµατικές και θα περιορίσουν τις παρενέργειες των ήδη υπαρχόντων θεραπευτικών σχηµάτων (Yi and Lefvert, 1997, Drachman, 1999). Χαρακτηριστική περίπτωση αποτελεί η πειραµατική ανάπτυξη ειδικής αντιγονοειδικής θεραπείας για εκλεκτική αποµάκρυνση των αντισωµάτων έναντι του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης από τον ορό ασθενών µε τη χρήση ανοσοπροσροφητικών στηλών. Οι στήλες αυτές, αποτελούµενες από ανθρώπινα ανασυνδυασµένα εξωκυτταρικά τµήµατα του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, θα συµβάλλουν στην αντικατάσταση της µη ειδικής πλασµαφαίρεσης, µε µια υψηλής ειδίκευσης, κατά την οποία οι οροί µυασθενικών θα απαλλάσσονται από τα παθογόνα αυτοαντισώµατα και όχι από τα ολικά όπως γίνεται µέχρι σήµερα (Tzartos et al., 2002). Α4. Επίκτητη ανοσία-ανοσιακή ανοχή και ανοσοκαταστολή. [Immunobiology: The Immune system in health and disease" (Janeway, Travers, Walport, Capra) 4 th Edition, 1999, Basic immunology: Functions and disorders of the immune system" (Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman) 1 st edition]. Τα ανοσοποιητικό σύστηµα του ξενιστή περιλαµβάνει τη φυσική ανοσία που µεσολαβεί στην αρχική φάση προστασίας απέναντι στις λοιµώξεις και την επίκτητη ανοσία που αναπτύσσεται πιο αργά και µεσολαβεί στο όψιµο και πιο αποτελεσµατικό στάδιο της άµυνας απέναντι στα µικρόβια. Η φυσική ανοσία περιλαµβάνει τους επιθηλιακούς φραγµούς, φυσικά αντιβιοτικά που υπάρχουν στα επιθήλια, τα φαγοκύτταρα, τα φυσικά κυτταροκτόνα κύτταρα (NK, Natural Killer) και διάφορες 22

23 πρωτεΐνες του πλάσµατος συµπεριλαµβανοµένων των πρωτεϊνών του συστήµατος του συµπληρώµατος. Το επίκτητο ανοσοποιητικό σύστηµα αποτελείται από τα λεµφοκύτταρα και τα προϊόντα τους, όπως τα αντισώµατα. Υπάρχουν δύο τύποι επίκτητης ανοσίας, η χυµική ανοσία και η κυτταρική ανοσία. Στη χηµική ανοσία µεσολαβούν πρωτεΐνες που ονοµάζονται αντισώµατα, οι οποίες παράγονται από κύτταρα που ονοµάζονται Β- λεµφοκύτταρα. Τα αντισώµατα εκκρίνονται στην κυκλοφορία και στα υγρά των βλεννογόνων, όπου εξουδετερώνουν και αποµακρύνουν τους µικροοργανισµούς και τις τοξίνες τους. Τα αντισώµατα δεν µπορούν όµως να φτάσουν σε µικροοργανισµούς που ζουν και πολλαπλασιάζονται µέσα σε µολυσµένα κύτταρα. Η άµυνα κατά τέτοιων ενδοκυττάριων µικροοργανισµών ονοµάζεται κυτταρική ανοσία επειδή µεσολαβούν κύτταρα, τα Τ-λεµφοκύτταρα. Ορισµένα Τ-λεµφοκύτταρα ενεργοποιούν τα φαγοκύτταρα ώστε να καταστρέψουν τους µικροοργανισµούς που έχουν εγκλωβιστεί από τα φαγοκύτταρα µέσα στα φαγοκυτταρικά κυστίδια. Άλλα Τ-λεµφοκύτταρα µπορούν να φονεύσουν κάθε τύπο κυττάρου του ξενιστή που φιλοξενεί λοιµώδεις µικροοργανισµούς στο κυτταρόπλασµά του. Η πλειονότητα των Τ-λεµφοκυττάρων αναγνωρίζει πεπτιδικά αντιγόνα που είναι συνδεδεµένα µε το κύριο σύµπλεγµα ιστοσυµβατότητας (MHC) των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων και παρουσιάζονται από αυτά. Το MHC είναι ένας γενετικός τόπος του οποίου τα κύρια προϊόντα λειτουργούν ως µόρια παρουσίασης πεπτιδίων του ανοσοποιητικού συστήµατος. Σε όλα τα είδη ο τόπος MHC περιέχει δύο οµάδες εξαιρετικά πολυµορφικών γονιδίων, τα γονίδια του MHC τάξης Ι και τα γονίδια του MHC τάξης ΙΙ. Τα µόρια τάξης Ι εκφράζονται σε όλα τα εµπύρηνα κύτταρα, ενώ τα τάξης ΙΙ εκφράζονται κυρίως στα δενδριτικά, στα µακροφάγα και στα Β-λεµφοκύτταρα. Τα Τ-λεµφοκύτταρα χρησιµοποιούν τους αντιγονικούς υποδοχείς τους (TCR, T-cell receptor) για να αναγνωρίσουν τα πεπτιδικά αντιγόνα που παρουσιάζονται από τα MHC µόρια των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων. Στην αναγνώριση των πεπτιδίων συµµετέχουν και δύο συνυποδοχείς των Τ-λεµφοκυττάρων που ονοµάζονται CD4 και CD8. Τα Τ-λεµφοκύτταρα που φέρουν των CD4 συνυποδοχέα αναγνωρίζουν πεπτίδια που παρουσιάζονται από µόρια του MHC τάξης ΙΙ. Τα πεπτίδια αυτά προέρχονται από αντιγόνα του εξωκυτταρικού περιβάλλοντος, τα οποία προσλαµβάνονται από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, εισέρχονται σε ενδοκυττάρια κυστίδια, επεξεργάζονται-πρωτεολύονται και παρουσιάζονται από τα µόρια MHC τάξης ΙΙ της 23

24 πλασµατικής µεµβράνης των κυττάρων στα CD4 T-λεµφοκύτταρα. Πεπτίδια που προέρχονται από αντιγόνα του κυτοσολίου (από ενδοκυτταρικούς µικροοργανισµούς που έχουν προσβάλει τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα) των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων παρουσιάζονται από MHC τάξης Ι µόρια και ενεργοποιούν τα Τ-λεµφοκύτταρα που φέρουν των συνυποδοχέα CD8. Τα ενεργοποιηµένα CD8 Τ-λεµφοκύτταρα διαφοροποιούνται σε κυτταροτοξικά Τ- λεµφοκύτταρα που φονέυουν τα µολυσµένα κύτταρα. Τα ενεργοποιηµένα CD4 κύτταρα που καλούνται και βοηθητικά µπορούν να διαφοροποιηθούν σε δύο υποοµάδες δραστικών κυττάρων, οι οποίες παράγουν συγκεκριµένες οµάδες κυτταροκινών και επιτελούν διαφορετικές λειτουργίες. Τα T H 1 (T-Helper) κύτταρα ενεργοποιούν τα µακροφάγα ώστε να εξαλείψουν τους φαγοκυτταροµένους µικροοργανισµούς και διεγείρουν την παραγωγή αντισωµάτων µε ικανότητα οψωνινοποίησης των µικροοργανισµών και ενεργοποίησης του συµπληρώµατος. Τα T H 2 κύτταρα διεγείρουν την παραγωγή IgE αντισωµάτων και ενεργοποιούν τα ηωσινόφιλα κύτταρα που χρησιµεύουν στην άµυνα κυρίως κατά έλµινθων. Α.4.1. Ανοσοσφαιρίνες: δοµή και λειτουργία τους. Το ανοσοποιητικό σύστηµα περιλαµβάνει πλήθος µορίων και κυττάρων µε βασικό ρόλο τη διάκριση µεταξύ εαυτού και ξένου. Τα τρία χαρακτηριστικά γνωρίσµατά του είναι η εξειδίκευση, η προσαρµογή και η µνήµη. Για την επίτευξη του στόχου αυτού χρησιµοποιεί δύο διαφορετικές στρατηγικές: Στη χυµική ανοσολογική απάντηση τα στοιχεία αναγνώρισης είναι ειδικές πρωτεΐνες, που ονοµάζονται αντισώµατα, και παράγονται από τα πλασµατοκύτταρα, ενώ στην κυτταρική ανοσολογική απάντηση τα Τ- λεµφοκύτταρα θανατώνουν κύτταρα που φέρουν ξένες ουσίες, ενεργοποιούν τα φαγοκύτταρα, ώστε να καταστρέψουν τους µικροοργανισµούς που έχουν εγκλωβιστεί από τα φαγοκύτταρα στα φαγοκυτταρικά κυστίδια και διεγείρουν τη χυµική απόκριση συνδράµοντας τα Β-λεµφοκύτταρα, δηλαδή τα πρόδροµα των πλασµατοκυττάρων. Τα αντισώµατα ή ανοσοσφαιρίνες, είναι πρωτεΐνες συντιθέµενες από τον οργανισµό εξαιτίας της παρουσίας µιας ξένης ουσίας µέσα σε αυτόν. Αντιγόνο καλείται οποιοδήποτε ξένο µακροµόριο ικανό να προκαλέσει το σχηµατισµό του αντισώµατος. Το αντίσωµα διαθέτει ειδική συγγένεια για το αντιγόνο, προσκολλώµενο σε µια συγκεκριµένη θέση του που καλείται αντιγονικός προσδιοριστής ή επίτοπος. 24

25 Ο µηχανισµός σχηµατισµού των αντισωµάτων απασχόλησε αρκετά τους επιστήµονες. Τη δεκαετία του 1950 διατυπώθηκε η θεωρία της κλωνικής επιλογής η οποία σήµερα προβάλλει ως ένα καταξιωµένο πρότυπο. Σύµφωνα µε αυτή κάθε κύτταρο παραγωγής αντισώµατος συνθέτει αντίσωµα ενός και µόνο είδους, ενώ διαθέτει µια χαρακτηριστική αλληλουχία βάσεων στο DNA η οποία κωδικοποιεί µια δεδοµένη αλληλουχία αµινοξέων από την αλληλουχία της ανοσοσφαιρίνης, γεγονός που σηµαίνει ότι η ειδικότητα κάθε αντισώµατος αποτυπώνεται στην πρωτοταγή δοµή του. Κάθε Β-κύτταρο φέρει στην επιφάνειά του µικρό αριθµό αντισωµάτων, τα οποία παίζουν ρόλο υποδοχέων συγκεκριµένης εξειδίκευσης. Με αυτά τα µόρια τα Β- λεµφοκύτταρα αναγνωρίζουν τα αντιγόνα. Κατά την ανοσολογική απόκριση η έκθεση του ξενιστή στο ξένο µόριο ενεργοποιεί τα Β-κύτταρα και αρχίζουν να πολλαπλασιάζονται µε αλλεπάλληλες µιτώσεις και παράγουν κλώνους. Κατόπιν οι κλώνοι διαφοροποιούνται σε πλασµατοκύτταρα, τα οποία εκκρίνουν τα ειδικά αντισώµατα, και σε Β-κύτταρα µνήµης που εξασφαλίζουν γρήγορη ανοσολογική απάντηση στο µέλλον. Α.4.2. Οι τάξεις των ανοσοσφαιρινών. Tα αντισώµατα είναι ένα σύνολο γλυκοπρωτεϊνών που βρίσκονται στον ορό του αίµατος όλων των θηλαστικών. Τα µόρια των αντισωµάτων, που έχουν κοινή εξειδίκευση για ένα αντιγόνο, συνήθως χαρακτηρίζονται από ετερογένεια γιατί αποτελούν προϊόντα πολλών πλασµατοκυττάρων. Χαρακτηρίζονται από σηµαντικές φυσικοχηµικές διαφορές, όπως στο µέγεθος, στο φορτίο, στη διαλυτότητα, διαφορές ως προς τη σύνθεση των αµινοξέων και το περιεχόµενο σε υδατάνθρακες. Στον ανθρώπινο οργανισµό υπάρχουν πέντε διακριτές τάξεις ανοσοσφαιρινών: IgA, IgD, IgE, IgG και IgM. Οι IgA αντιπροσωπεύουν το 15-20% του ποσού των ανοσοσφαιρινών του ανθρώπινου ορού και εµφανίζονται κυρίως ως µονοµερείς. Χωρίζονται σε υποτάξεις ή υπότυπους, τους IgA 1 και IgA 2. Γενικά οι IgA είναι οι κυρίως ανοσοσφαιρίνες στο σάλιο, το γάλα, και τις τραχειοβρογχικές και ουρογεννητικές εκκρίσεις. Οι IgD αποτελούν το 1% της ολικής ποσότητας των αντισωµάτων, αλλά υπάρχει σε µεγάλη ποσότητα στη µεµβράνη πολλών Β-κυττάρων. Η ακριβής λειτουργία της τάξης αυτής δεν έχει διευκρινισθεί. 25

26 Οι IgE βρίσκονται στην επιφάνεια της κυτταρικής µεµβράνης των βασεόφιλων και σιτευτικών κυττάρων. Πιθανόν διαδραµατίζουν κάποιο ρόλο στην ανοσία έναντι παρασίτων, καθώς και σε εµφάνιση αλλεργιών, όπως το άσθµα και ο πυρετός από χόρτο. Οι IgG ανοσοσφαιρίνες είναι οι κύριες ανοσοσφαιρίνες στον ορό υγιούς ανθρώπου (70-75% επί του συνόλου). Χωρίζονται στις υποτάξεις IgG 1 IgG 2 IgG 3 και IgG 4, ανάλογα µε τον αριθµό των εσωτερικών δισουλφιδικών δεσµών µεταξύ των πρωτεϊνικών αλυσίδων (ελαφριάς-βαριάς και βαριάς-βαριάς), εµφανίζονται ως µονοµερείς και κατανέµονται ισότιµα µεταξύ των ενδαγγειακών και εξαγγειακών αποθεµάτων. Αποτελούν το κύριο αντίσωµα στις δευτερογενείς ανοσοποιητικές απαντήσεις. Οι IgM αντιπροσωπεύουν το 10% των ανοσοσφαιρινών µε χαρακτηριστική ακτινωτή πενταµερή δοµή µοριακού βάρους 970 kd. Περιορίζονται στην ενδαγγειακή δεξαµενή και αποτελούν το πρώιµο αντίσωµα που παρατηρείται συχνά στις ανοσοποιητικές απαντήσεις έναντι πολύπλοκων µικροοργανισµών. Α.4.3. οµή των IgG αντισωµάτων. Ένα µόριο αντισώµατος αποτελείται από δύο πανοµοιότυπες βαριές αλυσίδες (Η) και δύο πανοµοιότυπες ελαφριές αλυσίδες (L) µε κάθε µια να περιέχει µία µεταβλητή και µία σταθερή περιοχή (εικόνα 5). Οι τέσσερις αλυσίδες συνδέονται έτσι ώστε να σχηµατίζουν ένα µόριο µε µορφή Υ. Κάθε ελαφριά αλυσίδα συνδέεται µε µια βαριά και οι δύο βαριές αλυσίδες συνδέονται µεταξύ τους µε δισουλφιδικούς δεσµούς. Η κάθε ελαφριά αλυσίδα αποτελείται από µία µεταβλητή και µια σταθερή περιοχή, ενώ η κάθε βαριά αλυσίδα αποτελείται από µία µεταβλητή και τρεις ή τέσσερις σταθερές περιοχές. Η κάθε περιοχή αναδιπλώνεται παίρνοντας µια χαρακτηριστική τρισδιάστατη µορφή που ονοµάζεται περιοχή ανοσοσφαιρίνης (Ig, immunoglobulins domain). Οι περιοχές ανοσοσφαιρίνης υπάρχουν και σε πολλές άλλες πρωτεΐνες του ανοσοποιητικού και µη συστήµατος. Όλες αυτές οι πρωτεΐνες θεωρούνται µέλη της υπεροικογένειας των ανοσοσφαιρινών και πιθανών να έχουν εξελιχθεί από κοινό προγονικό γονίδιο. Κάθε µεταβλητή αλυσίδα της βαριάς αλυσίδας (V H ) ή της ελαφριάς αλυσίδας(v L ) περιέχει τρεις υπερµεταβλητές περιοχές (CDRs). Από τις τρεις περιοχές αυτές η µεγαλύτερη µεταβλητότητα συγκεντρώνεται στην CDR3, που βρίσκεται στο σηµείο σύνδεσης C και V. Η είναι η περιοχή που συνεισφέρει περισσότερο στην πρόσδεση του αντιγόνου. Τα τµήµατα των µορίων των αντισωµάτων συχνά ονοµάζονται µε βάση τις ιδιότητες των 26

27 πρωτεολυτικών κλασµάτων των ανοσοσφαιρινών. Το κλάσµα ενός αντισώµατος που περιέχει µια ολόκληρη ελαφριά αλυσίδα συνδεδεµένη µε την περιοχή V και την πρώτη περιοχή C της βαριάς αλυσίδας είναι αυτό που περιέχει το τµήµα του αντισώµατος που απαιτείται για την αναγνώριση του αντιγόνου και ονοµάζεται Fab (Fragment antigen binding, κλάσµα πρόσδεσης αντιγόνου). Οι υπόλοιπες C περιοχές αποτελούν την Fc περιοχή ή κρυσταλλικό κλάσµα (Fragment crystalline) επειδή τείνει να σχηµατίζει κρυστάλλους όταν βρίσκεται σε διάλυµα. Σε κάθε µόριο ανοσοσφαιρίνης υπάρχουν δύο µόρια Fab που προσδένονται µε το αντιγόνο και ένα τµήµα Fc που είναι υπεύθυνο για τις περισσότερες δραστικές λειτουργίες των αντισωµάτων. Μεταξύ των περιοχών Fab και Fc υπάρχει ένα ευλύγιστο τµήµα που καλείται περιοχή άρθρωσης (hinge region). Το καρβοξυτελικό άκρο της βαριάς αλυσίδας µπορεί να αγκυροβολεί στην κυταροπλασµατική µεµβράνη ή να έχει ένα τελικό τµήµα που στερείται αυτής της άγκυρας µε αποτέλεσµα το αντίσωµα να παράγεται στην µορφή εκκρινόµενης πρωτεΐνης. Οι ελαφριές αλυσίδες δεν συνδέονται µε την µεµβράνη. Υπάρχουν δύο τύποι ελαφριών αλυσίδων οι κ και οι λ οι οποίες διαφέρουν στις σταθερές περιοχές τους αλλά δεν διαφέρουν στις λειτουργίες τους. Υπάρχουν πέντε τύποι βαριών αλυσίδων που ονοµάζονται µ, γ, δ, ε και α που διαφέρουν επίσης στις σταθερές τους περιοχές. Κάθε τύπος ελαφριάς αλυσίδας µπορεί να ενώνεται µε οποιοδήποτε τύπο βαριάς αλυσίδας για να σχηµατισθεί το µόριο του αντισώµατος. Τα αντισώµατα που περιέχουν διαφορετικές βαριές αλυσίδες ανήκουν σε διαφορετικούς ισοτύπους ή τάξεις και ονοµάζονται ανάλογα µε τις βαριές αλυσίδες τους δηλαδή IgM, IgG, IgD, IgE και IgA ανεξάρτητα µε το είδος της ελαφριάς αλυσίδας. 27

28 Fab ελαφριές αλυσίδες Fab Μεταβλητή περιοχή περιοχή άρθρωσης βαριά αλυσίδα Fc Περιοχή Ig Εικόνα 5. Σχηµατική απεικόνιση της δοµής των αντισωµάτων και της περιοχής ανοσοσφαιρίνης (Ig). Α.4.4. Μονοκλωνικά αντισώµατα. Η ανοσοποίηση ενός ζώου µε συγκεκριµένο αντιγόνο επάγει την παραγωγή ενός εξαιρετικά ανοµοιογενούς µίγµατος αντισωµάτων. Αυτό συµβαίνει επειδή τα µόρια αντισωµάτων κοινής εξειδίκευσης είναι συνήθως ετερογενή καθώς προέρχονται από πολλά διαφορετικά πλασµατοκύτταρα. Για αρκετά χρόνια η παραγωγή σηµαντικών ποσοτήτων οµοιογενών αντισωµάτων ήταν ανέφικτη, ώσπου το 1975 οι Kohler και Milstein ανακάλυψαν ότι η παραγωγή µεγάλων ποσοτήτων αντισώµατος οποιασδήποτε εξειδίκευσης είναι δυνατή. Η εργασία τους βασίστηκε στην τεχνική της κυτταρικής σύντηξης (εικόνα 6). Χρησιµοποίησαν ένα Β-λεµφοκύτταρο που παράγει αντισώµατα και ένα καρκινικό κύτταρο από µυέλωµα. Τα κύτταρα του µυελώµατος είναι µετασχηµατισµένα λεµφοκύτταρα που πολλαπλασιάζονται απεριόριστα σε καλλιέργεια αλλά δεν παράγουν κανένα ειδικό αντίσωµα. Αντίθετα τα Β-λεµφοκύτταρα από ένα ανοσοποιηµένο ζώο παράγουν ειδικό αντίσωµα αλλά δεν έχουν την ικανότητα να 28

29 πολλαπλασιάζονται στην καλλιέργεια. Μέσω της σύντηξης αυτής τα βραχύβια κύτταρα που παράγουν αντισώµατα µετατρέπονται σε αθάνατα. Τα υβριδικά κύτταρα που προκύπτουν ονοµάζονται υβριδώµατα και έχουν την ιδιότητα να πολλαπλασιάζονται σε καλλιέργειες απεριόριστα. Αφού κάθε υβριδωµατική κυτταρική σειρά παράγει δεδοµένο αντίσωµα που προέρχεται από ένα και µόνο Β-κύτταρο, το λαµβανόµενο αντίσωµα καλείται µονοκλωνικό. Τα µονοκλωνικά αντισώµατα υπερτερούν έναντι του ορού ως προς την οµοιογένεια και τη διαθεσιµότητα σε καθαρή µορφή και απεριόριστη ποσότητα. Ιδιαίτερη προσοχή απαιτούν η ανοσοποίηση του ζώου, η επιλογή της µυελωµατικής σειράς, η µέθοδος σύντηξης και η µέθοδος κλωνοποίησης. Η διαδικασία παραγωγής τους συνοπτικά είναι η ακόλουθη: Στην αρχή γίνεται στο ποντίκι χορήγηση του αντιγόνου που µας ενδιαφέρει. Το αντιγόνο επάγει τον πολλαπλασιασµό των ειδικών κυττάρων που παράγουν τα αντισώµατα. Ακολουθούν αναµνηστικές ενέσεις σε διαστήµατα µερικών εβδοµάδων και ακολούθως αφαιρείται η σπλήνα του ζώου και παρασκευάζεται ένα αναιώρηµα από Β-λεµφοκύτταρα. Πολλά από αυτά παράγουν αντισώµατα, ωστόσο δε ζουν απεριόριστα. Για αυτό το λόγω συντήκονται µε κύτταρα του µυελώµατος. Για τη µεγαλύτερη ευκολία επιλογής των υβριδίων, χρησιµοποιείται µία µεταλλαγµένη µυελωµατική σειρά που δεν έχει το ένζυµο φοσφωριβοζυλο-µεταφοράση της υποξανθίνης και γουανοσίνης (HGPRT). Το ένζυµο αυτό καταλύει τη σύνθεση του ινοσικού στην πορεία διάσωσης του DNA. Τα κύτταρα µεγαλώνουν σε θρεπτικό υλικό που περιέχει υποξανθίνη, αµινοπτερίνη και θυµιδίνη. Τα κύτταρα που µεγαλώνουν σε θρεπτικό υλικό που περιέχει υποξανθίνη, αµινοπτερίνη και θυµιδίνη (ονοµάζεται HAT από τα τρία αρχικά των ουσιών στα αγγλικά) για να σκοτωθούν τα µη συντηχθέντα µυελωµατικά κύτταρα. Ο ρόλος της αµινοπτερίνης στο θρεπτικό υλικό είναι να εµποδίσει την εκ νέου σύνθεση νουκλεοτιδίων. Η υποξανθίνη δεν µπορεί να χρησιµοποιηθεί από τα µη συντηχθέντα µυελωµατικά κύτταρα γιατί τους λείπει το ένζυµο HGPRT. Τα σπληνοκύτταρα έχουν αυτό το ένζυµο, όµως πεθαίνουν σε κυτταροκαλλιέργειες επειδή δεν έχουν τη δυνατότητα να πολλαπλασιάζονται in vitro, χωρίς κάποιο άλλο ερέθισµα. Αντίθετα υβριδώµατα επιβιώνουν επειδή έχουν το νεοπλαστικό χαρακτήρα των γονικών µυελωµάτων και περιέχουν τα γονίδια για το ένζυµο HGPRT από τα γονικά σπληνοκύτταρα. Μόνο τα υβριδικά κύτταρα αναπτύσσονται πολύ γρήγορα και φτιάχνουν µεγάλες και ευδιάκριτες αποικίες. Κάθε µία από αυτές εξετάζεται για το αν 29

30 παράγει ή όχι το αντιγόνο που µας ενδιαφέρει. Όταν διαπιστωθεί αυτό, τα υβριδικά κύτταρα κλωνοποιούνται, δηλαδή αποµονώνονται και στη συνέχεια είναι δυνατόν να επανακαλλιεργηθούν ώστε να δώσουν ολόκληρη καλλιέργεια που να παράγει το επιθυµητό αντίσωµα και το οποίο αναγνωρίζει µια µόνο περιοχή του αντιγόνου. Εικόνα 6. Σχηµατική απεικόνιση του τρόπου παραγωγής µονοκλωνικών αντισωµάτων σε τρωκτικά. Από βιβλίο βιοχηµείας Lubert Stryer. A.4.5 Ανοσιακή ανοχή-ανοσοκαταστολή Ένα από τα αξιοσηµείωτα χαρακτηριστικά του φυσιολογικού ανοσοποιητικού συστήµατος είναι η ικανότητά του να αντιδρά σε µια τεράστια ποικιλία 30

31 µικροοργανισµών αλλά να µην αντιδρά στα (εαυτά) αντιγόνα του ατόµου. Αυτή η έλλειψη αντίδρασης στα εαυτά αντιγόνα ονοµάζεται ανοσιακή ανοχή, διατηρείται παρά το γεγονός ότι οι µηχανισµοί µε τους οποίους εκφράζονται οι υποδοχείς των λεµφοκυττάρων δεν εµφανίζουν την εγγενή τάση να παράγουν αποκλειστικά υποδοχείς για ξένα αντιγόνα. Επιπλέον το ανοσοποιητικό σύστηµα έχει πρόσβαση σε πολλά εαυτά αντιγόνα, έτσι που η έλλειψη αντίδρασης σε αυτά να µην µπορεί να διατηρηθεί µε την απλή απόκρυψη των αντιγόνων αυτών από τα λεµφοκύτταρα. Όταν λεµφοκύτταρα µε υποδοχείς για ένα αντιγόνο εκτίθονται στο αντιγόνο αυτό, οι πιθανές εκβάσεις είναι τρεις. Το λεµφοκύτταρο µπορεί να ενεργοποιηθεί οδηγώντας σε µια ανοσοαπόκριση. Τα λεµφοκύτταρα µπορεί να αδρανοποιηθούν λειτουργικά ή να φονευθούν οδηγώντας σε ανοχή. Στην περίπτωση της ανοχής συµπεριλαµβάνεται η ανεργία, η λειτουργική αδυναµία ανοσοαπόκρισης στο αντιγόνο και η απόπτωση, ο προγραµµατισµένος δηλαδή κυτταρικός θάνατος. Η τρίτη πιθανή αντίδραση του λεµφοκυττάρου µετά από έκθεση σε αντιγόνο είναι η άγνοια, µε αποτέλεσµα να µην υπάρχει καµία απόκριση. Και στα Τ-λεµφοκύτταρα και στα Β-λεµφοκύτταρα η ανοσιακή ανοχή διακρίνεται σε κεντρική ανοχή που λαµβάνει χώρα στο θύµο αδένα και στο µυελό των οστών αντίστοιχα και σε περιφερική ανοσιακή ανοχή που παρατηρείται στους περιφερικούς λεµφικούς ιστούς. Μετά την επαφή τους µε τα εαυτά αντιγόνα, ορισµένα αυτοδραστικά Τ-κύτταρα µπορούν να εξελιχθούν σε κατασταλτικά-ρυθµιστικά κύτταρα, τα οποία προσλαµβάνουν ή αναστέλλουν την ενεργοποίηση άλλων, δυνητικά βλαπτικών, αυτοδραστικών κυττάρων. Τα κατασταλτικά αυτά κύττταρα µπορεί να παράγουν κυτταροκίνες, όπως ο TGF-β και η IL-10 των οποίων οι κύριες δράσεις είναι η αναστολή της ενεργοποίησης των λεµφοκυττάρων, των µακροφάγων και άλλων κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήµατος. Τα κατασταλτικά κύτταρα µπορούν επίσης να αναστείλουν ανοσοαπαντήσεις και µε µηχανισµούς που δεν περιλαµβάνουν γνωστές κυτταροκίνες. Α.5. Υποδοχείς των Fc περιοχών των IgG ανοσοσφαιρινών -Fcγ Ανοσο-υποδοχείς-. Το ανοσοποιητικό σύστηµα των θηλαστικών έχει εξελιχθεί κατά τρόπο που να προασπίζει τον οργανισµό ενάντια στα παθογενή µικρόβια, στηρίζοντας την ειδικότητα της επίκτητης απόκρισης στην πρώιµη άµυνα της φυσικής ανοσίας. Αυτή η πολυπλοκότητα εξασφαλίζει διάκριση µεταξύ εαυτού και ξένου, έλεγχο της 31

32 ανοσοαπάντησης και αποφυγή της αυτοτοξικότητας και της ανεξέλεγκτης φλεγµονής. Πολλαπλά σηµεία ελέγχου έχουν αναγνωρισθεί, δρώντας κατά τέτοιο τρόπο, ώστε να εξασφαλίζεται η φυσιολογική ανοσοαπόκριση µέσα στα πλαίσια διατήρησης της ισορροπίας µεταξύ ενεργοποίησης και καταστολής. Βασικό ρόλο στην διατήρηση της παραπάνω ισορροπίας διαδραµατίζουν τα ανοσοσυµπλέγµατα από IgG αντισώµατα, δρώντας ως ισχυροί ανοσορυθµιστικοί παράγοντες µεταξύ ισχυρής αντισωµικής απόκρισης και πλήρους καταστολής της, επιπλέον του ρόλου τους ως δραστικά µόρια έναντι ξένων αντιγόνων. Αυτή η διακριτή και αντίθετη δράση των IgG αντισωµάτων οφείλεται στους ειδικούς Fc υποδοχείς σε συγκεκριµένα είδη κυττάρων εξυπηρετώντας τις δύο παραπάνω διαδικασίες. Στα µέχρι σήµερα µελετηθέντα θηλαστικά τέσσερις διαφορετικές κλάσεις Fc υποδοχέων έχουν αναγνωρισθεί: FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16), και FcγRIV. Ο FcγRI υποδοχέας εµφανίζει υψηλή συγγένεια πρόσδεσης της σταθερής περιοχής των αντισωµάτων και ισοτυπική ειδικότητα, ενώ οι FcγRII και FcγRIII χαµηλή συγγένεια και εκτεταµένο ισοτυπικό πρότυπο πρόσδεσης (Ravetch and Kinet, 1991, Hulett and Hogarth, 1994). Ο υποδοχέας FcγRIV (πρόσφατα αναγνωρισµένος) είναι συντηρηµένος στα είδη των θηλαστικών και εµφανίζει ενδιάµεση συγγένεια και περιορισµένη ειδικότητα ως προς τις υποκλάσεις των αντισωµάτων (Mechetina et al., 2002, Davis et al., 2002, Nimmerjahn et al., 2005). Λειτουργικά οι υποδοχείς χωρίζονται σε δύο κατηγορίες: στους ενεργοποιητικούς και στους κατασταλτικούς που µεταβιβάζουν τα σήµατά τους µέσω αλληλουχιών ενεργοποίησης των ανοσουποδοχέων βασισµένων στην τυροσίνη (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs, ITAM) ή µέσω αλληλουχιών καταστολής των ανοσουποδοχέων βασισµένων στην τυροσίνη (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs, ITIM) αντίστοιχα (Ravetch and Lanier, 2000). Η ύπαρξη των ενεργοποιητικών και των κατασταλτικών υποδοχέων στο ίδιο κύτταρο αποτελεί το κλειδί της ύπαρξης ισορροπίας στις άνοσες απαντήσεις. Α.5.1. Λειτουργίες των Fc υποδοχέων. Η πλέον χαρακτηριστική λειτουργία των Fc υποδοχέων είναι η θετική και αρνητική ρύθµιση ανοσοκυτταρικών αντιδράσεων, όπως ο πολλαπλασιασµός των Β- λεµφοκυττάρων, η φαγοκύτωση από τα µακροφάγα και η αποκοκκίωση των ιστικών 32

33 κυττάρων (εικόνα 7α). Συνάθροιση ενεργοποιητικού τύπου Fc υποδοχέων πυροδοτεί αρκετές βιολογικές λειτουργίες, όπως φαγοκύτωση, κυτόλυση, αποκοκκίωση, µεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων που κωδικοποιούν κυτταροκίνες που συµµετέχουν στο φαινόµενο της φλεγµονής. Αντίστοιχα συνάθροιση του µοναδικού κατασταλτικού Fc υποδοχέα, FcγRIIB συµβάλλει στην καταστολή των παραπάνω λειτουργιών. Οι περισσότεροι από τους ενεργοποιητικούς υποδοχείς σχετίζονται µε την κοινή γ αλυσίδα των Fc υποδοχέων (Fc receptor common γ chain) που περιέχει την ITAM περιοχή (εικόνα 7α). Σε αντίθεση ο FcγRIIB αποτελείται από µία αλυσίδα που περιέχει αντίστοιχα την αλληλουχία ITIM στην κυτταροπλασµατική του περιοχή και εκφράζεται στην επιφάνεια κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήµατος Β-λεµφοκύτταρα, µακροφάγα, ιστικά κύτταρα-αναστέλοντας διάφορες κυτταρικές λειτουργίες, όπως ενεργοποίηση και πολλαπλασιασµός των Β-λεµφοκυττάρων και αποκοκκίωση των ιστικών κυττάρων. Αυτά τα ζεύγη ITAM-ITIM αναγνωρίζονται πλέον ως τυπικά εργαλεία του ανοσοποιητικού συστήµατος. Η δεύτερη σηµαντική λειτουργία των Fc υποδοχέων είναι η ενδοκυττάρωση ανοσοσυµπλεγµάτων (εικόνα 7β) γεγονός που οδηγεί στην αποδόµηση των συµπλόκων αντιγόνου αντισώµατος καθώς και στην καθοδήγηση αντιγονικών πεπτιδίων προς τα µονοπάτια του κυρίου συµπλόκου ιστοσυµβατότητα Ι και ΙΙ (Amigorena and Bonnerot, 1999). Τα µακροφάγα ενδοκυτταρώνουν και αποδοµούν τα ανοσοσυµπλέγµατα ενώ τα δενδριτικά κύτταρα είναι κυρίως εξειδικευµένα προς την ανιγονοπαρουσίαση των συµπλόκων. Τρίτη λειτουργία είναι αυτή των νεογνικών Fc υποδοχέων ( FcRn) και των πολυµερικών-ανοσοσφαιρινικών υποδοχέων (poly-igr) που µπορούν να µεταφέρουν αντισώµατα διαµέσου κυττάρων. Αυτοί οι υποδοχείς είναι σηµαντικοί για τη µεταφορά µητρικών IgG αντισωµάτων διαµέσου του πλακούντα στο έµβρυο και τη µεταφορά IgΑ αντισωµάτων στις βλεννογόνες επιφάνειες αντίστοιχα. 33

34 α. Ενεργοποίηση ή καταστολή β. καθαρισµός ανοσοσυµπλεγµάτων συνδεδεµένος κυτταρικού σήµατος µε αντιγονική παρουσίαση. Εικόνα 7. α. Θετική και αρνητική ρύθµιση κυτταρικού σήµατος. Fc υποδοχείς εκφράζονται σε αρκετά κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος, εµφανίζοντας κεντρικό ρόλο στη ρύθµιση των ανοσοαπαντήσεων, µετά από αλληλεπίδραση ανοσοσυµπλεγµάτων. ράση των ενεργοποιητικών υποδοχέων οδηγεί σε φαγοκύττωση, αντισωµοεξαρτώµενη κυτταρική κυτταροτοξικότητα, παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου, παραγωγή και απελευθέρωση κυτταροκινών. Αντίθετα ο FcγRIIB µέσω της ITIM περιοχής συµµετέχει στην καταστολή των ενεργητικών υποδοχέων µέσω συσσωµάτωσης του µε αυτούς. β. Καθαρισµός ανοσοσυµπλόκων και παρουσίασή τους από το κύριο σύµπλοκο ιστοσυµβατότητας (MHC) τάξης Ι και ΙΙ. Nat Rev Immunol. 2, (2002). Α.5.2. Ρύθµιση του κυτταρικού σήµατος µέσω των Fc υποδοχέων. Α Eνεργοποιητική σηµατοδότηση µέσω ΙΤΑΜ-Fc υποδοχέων. Οι µοριακοί µηχανισµοί µέσω των οποίων η συνάθροιση των υποδοχέων ενεργοποιούν ή καταστέλλουν κυτταρικές λειτουργίες είναι σηµαντικές για την άµυνα έναντι ΙgG 34

35 συµπλεγµάτων αντιγόνων και για την ανάπτυξη αυτοάνοσων ασθενειών (Ravetch and Bolland, 2001). Ενδοκυτταρικές κινάσες τυροσίνης της οικογένειας src ενεργοποιούνται από την συνάθροιση των ενεργοποιητικών υποδοχέων και φωσφορυλιώνουν κατάλοιπα τυροσίνης στην ΙΤΑΜ περιοχή. Η φωσφορυλιωµένη περιοχή δρα ακολούθως ως περιοχή αγκυροβόλισης της SH2 (src-homology 2) περιοχής της κυτοσολικής κινάσης SYK (εικόνα 8α). Επακόλουθα γεγονότα της ενεργοποίησης της πρωτεΐνης SYK είναι η υπεροξυγόνωση του κυττάρου, απελευθέρωση κυτταροκινών, φαγοκύττωση από τα µακροφάγα, αντισωµοεξαρτώµενηκυτταρική κυτταροτοξικότητα από τα ΝΚ κύτταρα και αποκοκκίωση των ιστικών κυττάρων. Η έναρξη φλεγµονωδών-λανθασµένων αντιδράσεων από τα παραπάνω δραστικά κύτταρα θεωρείται βασική για την ανάπτυξη και παθογένεση αυτοάνοσων καταστάσεων. Α Κατασταλτική σηµατοδότηση µέσω ΙΤΙΜ- FcγRIIB. Ο FcγRIIB δρα φυσιολογικά σαν αρνητικός ρυθµιστής της επαγώµενης από τα ανοσοσυµπλέγµατα ενεργοποίησης και ενδεχοµένως να δρα in vivo κατασταλτικά ως προς την εκδήλωση αυτοάνοσης κατάστασης, ρυθµίζοντας τόσο την δράση των Β- λεµφοκυττάρων όσο και αυτή των δραστικών κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήµατος. Η κατασταλτική δράση του υποδοχέα FcγRIIB έχει καλύτερα χαρακτηριστεί στα Β-λεµφοκύτταρα (εικόνα 8β-δ). Κατά τη διάρκεια της τελευταίας δράσης µιας ανοσοαπόκρισης, ανοσοσυµπλέγµατα αποτελούµενα από IgG αντισώµατα και αντιγόνο, προσδένονται στους BCR και FcγRIIB υποδοχείς που συνεκφράζονται στην επιφάνεια των Β-λεµφοκυττάρων. Η διασύνδεση του BCR και FcγRIIB, µέσω των ανοσυµπλεγµάτων καταστέλει την ενδοκυτταρική σηµατοδότηση του BCR, παρεµποδίζοντας έτσι την λειτουργία του Β-λεµφοκυττάρου, όπως ενεργοποίησή του, ικανότητα αντιγονοπαρουσίασης, πολλαπλασιασµό και παραγωγή αντισωµάτων. O FcγRIIB ανήκει µαζί µε άλλους υποδοχείς όπως οι PIR-B, KIRs, CTLA-4, PD-1CD5 και CD22 στην οικογένεια των ανοσοκατασταλτικών υποδοχέων και απαντά στα Β- λεµφοκύτταρα, στα µακροφάγα, στα ουδετερόφιλα και στα σιτευτικά κύτταρα απουσιάζοντας µόνο από τα Τ και τα ΝΚ κύτταρα. Η οικογένεια αυτών των υποδοχέων χαρακτηρίζεται από την ύπαρξη µιας αλληλουχίας αµινοξέων (ΙTIM) στην κυτταροπλασµατική τους περιοχή. Η πρωτότυπη αλληλουχία των έξι αµινοξέων αποτελείται από (Ile/Val/Leu/Ser)-X-Tyr-X-X-(Leu/Val), όπου το Χ υποδηλώνει οποιοδήποτε αµινοξύ. Συνάθροιση του υποδοχέα µε έναν υποδοχέα που περιέχει µία 35

36 ITΑM περιοχή οδηγεί στη φωσφορυλίωση της τυροσίνης του ITIM από την κινάση Lyn (οικογένεια src κινασών) (Muta et al., 1994), γεγονός που οδηγεί στη συστράτευση φωσφατασών µε SH-2 δοµές µε κυρίαρχες τις φωσφατάσες SHP-1 (SH2-domaincontaining protein tyrosine phosphatase 1), SHP-2 και SHIP (SH2-domain-containing inositol polyphosphate 5 phosphatase) (Muta et al., 1994, D'Ambrosio et al., 1995, Damen et al., 1996, Ono et al., 1996). H SHIP είναι το πρώιµο δραστικό µόριο της ανασταλτικής λειτουργίας του FcγRIIB (Clynes and Ravetch, 1995), αποφωσφορυλιώνει φωσφατίδιλο ινοσιτόλες και ινοσιτολ-φωσφατάσες, µε κυρίαρχη την 3,4,5-τριφωσφορική φωσφατίδιλο ινοσιτόλη [PtdIns(3,4,5)P 3 ]. Περαιτέρω η µεταγωγή σήµατος µπορεί να υποδιαιρεθεί σε τρία διακριτά και αλληλοεπιδρώµενα µηνυµατοφόρα µονοπάτια. Πρώτον η διαµεσολαβούµενη από τη SHIP υδρόλυση της PdtIns(3,4,5)P 3 οδηγεί στην λανθασµένη ενδοκυτταρική µετατόπιση µηνυµατοφόρων µορίων όπως η κινάση τυροσίνης Bruton s (BTK) και η φωσφολιπάση-cγ (PLCγ), (Scharenberg et al., 1998, Fluckiger et al., 1998), (εικόνα 8β). Η BTK είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση της PLCγ και την υδρόλυση της 4,5 διφωσφορικής φωσφατίδιλο -ινοσιτόλης [PdtIns(4,5)P 2 ], οπότε και σχηµατίζεται 1,4,5 τριφωσφορική ινοσιτόλη [ Ins(1,4,5)P 3 ] και διάκυλογλυκερόλη (DAG). Έτσι η SHIP αναστέλει την παραγωγή δευτερευόντων µορίων -Ins(1,4,5)P 3 και DAG- που διαµεσολαβούν στην κινητικότητα του ασβεστίου και στην ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC) που επάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό αντίστοιχα. εύτερον η ενεργοποίηση της κινάσης MAP (mitogen activating protein) και η συστράτευση της αποπτωτικής κινάσης ΑΚΤ καταστέλονται από τη συνάθροιση του FcγRIIB µε τον BCR γεγονός που οδηγεί στην αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασµού και επιβίωσης (Liu et al., 1998), (εικόνα 8γ). Μάλιστα Β- λεµφοκύτταρα που δεν παράγουν την πρωτεΐνη SHIP εµφανίζουν αυξηµένη συχνότητα πολλαπλασιασµού αποτέλεσµα της διέγερσης του BCR, γεγονός που οφείλεται στη φωσφορυλίωση (ενεργοποίηση) τόσο της MAP κινάσης (Helgason et al., 2000) όσο και της ΑΚΤ (Ono et al., 1997). Τρίτον η SHIP δρα ως πρωτεΐνη πρoσαρµογέας που προσδένει SHC (Tridandapani et al., 1997) και p62dok (Tamir et al., 2000), (εικόνα 8δ). Η πρόσδεση της SHIP στον υποδοχέα FcγRIIB αναστέλλει την ενεργοποίηση της RAS. Έχει προταθεί πως η SHIP ανταγωνίζεται το GRB2-SOS σύµπλεγµα για δέσιµο της SHC γεγονός που οδηγεί σε 36

37 µειωµένη πρόσδεση του GTP στη RAS. Έτσι το κύτταρο οδηγείται σε λανθασµένη ενεργοποίηση των MAP κινασών γεγονός που οδηγεί σε παύση του κυτταρικού πολλαπλασιασµού. α β γ δ Εικόνα 8. α. Eνεργοποιητικά σήµατα από ΙΤΑΜ Fc υποδοχείς στα µακροφάγα. Κατάλοιπα τυροσίνης στην περιοχή ΙΤΑΜ των υποδοχέων φωσφορυλιώνονται από πρωτεϊνικές κινάσες της οικογένειας src κινασών, όπως η SRC, FYN,FGR,HCK και LYN µετά από διασύνδεση των επιφανειακών υποδοχέων από ανοσοσυµπλέγµατα IgG. Tα επακόλουθα γεγονότα της ενεργοποίησης της SYK περιλαµβάνουν ενεργοποίηση των φωσφολιπάσης Cγ (PLCγ), 3 φωσφατίδυλο ινοσιτόλ-κινάση (PI3K), κυτταροσκελετική πρωτεΐνη paxillin, ERK (MAPK κινάση) και GTPασες των RAC και RHO οικογενειών που συµµετέχουν στην αναδιοργάνωση της ακτίνης του κυτταροσκελετού. β. Αναστολή του BTK και της PLCγ µονοπατιού στα Β- κύτταρα µετά από διασύνδεση του BCR µε τον FcRγIIB. H ενεργοποίηση της SHIP προκαλεί υδρόλυση της τριφωσφορικής φωσφατίδιλο ινοσιτόλη -PtdIns(3,4,5)P 3 - σε PtdIns(3,4,)P 2. Η PtdIns(3,4,5)P 3 αποτελεί περιοχή δέσµευσης των πρωτεϊνών BTK και PLCγ και κατά συνέπεια η µη συστράτευσή τους στην µεµβρανική PtdIns(3,4,5)P 3 παρεµποδίζει την είσοδο Ca 2+ στο κύτταρο και την ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC) γ. Tο βιοχηµικό µονοπάτι της AKT. Η αποπτωτική κινάση AKT δεν µπορεί να συστρατευτεί στην PtdIns(3,4,5)P 3 παρουσία της ενεργοποιηµένης SHIP. Η AKT (κινάση σερίνης-θρεονίνης) 37

38 συστρατεύεται στην µεµβράνη, γεγονός που οδηγεί σε µια διαµορφωτική αλλαγή στο µόριο, που οδηγεί σε φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση της PDK1. Η AKT ενεργοποιείται από τον BCR µέσω του µορίου PI3K. Μια πρωτεΐνη προσαρµογέας η BCAP έχει αναγνωριστεί πως προσδένεται στην PI3K και η απαλοιφή της προκαλεί µειωµένη αντίδραση των Β- λεµφοκυττάρων στη διασύνδεση του υποδοχέα. δ. Moνοπάτι RAS-MAP κινασών. H φωσφορυλιωµένη SHIP δηµιουργεί µια περιοχή πρόσδεσης των πρωτεϊνών DOK και SHC οδηγώντας τα µόρια αυτά στην πλασµατική µεµβράνη. Η DOK φωσφορυλιώνεται και συστρατεύει τη RAS-GAP που καταλύει τη µετατροπή της RAS-GTP RAS-GDP µε επακόλουθο την αναστολή του ERK-MAP µονοπατιού. ADCC: antibody-dependet cellular cytotoxicity (αντισωµο-εξαρτώµενη κυτταρική κυτταροτοξικότητα) DG: Diacylglycerol (διάκυλογλυκερόλη) GRB2: Growth-factor-receptor-bound protein (πρωτεΐνη δέσµευσης στον υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα) IC: immune complexes (ανοσοσυµπλέγµατα). Nat Rev Immunol. 2, (2002). Α FcγRIIB και απόπτωση. Κατά τη διάρκεια της ωρίµανσή τους στα βλαστικά κέντρα, τα Β-λεµφοκύτταρα που εκφράζουν υψηλής συγγένειας BCR υπόκεινται σε θετική επιλογή λόγω της ικανότητα τους να προσδένουν ισχυρά αντιγόνα. Απουσία αυτών των µηνυµάτων ευαισθητοποίησης τα κύτταρα που εκφράζουν χαµηλής συγγένειας BCR οδηγούνται σε αποπτωτικό θάνατο (Ashman et al., 1996). In vitro συνάθροιση των FcγRIIB υποδοχέων στην επιφάνεια των Β-λεµφοκυττάρων οδηγεί σε αποπτωτικά σήµατα, ανεξάρτητα από τη συνάθροισή τους µε τον BCR (Pearse et al., 1999). Η απόκριση αυτή είναι ανεξάρτητη από την ITIM αλληλουχία και συµµετέχει η διαµεµβρανική περιοχή. Συνεπώς ο FcγRIIB υποδοχέας µπορεί να συµµετέχει ενεργά στη διαδικασία της αρνητικής επιλογής των Β-λεµφοκυττάρων που εκφράζουν χαµηλής συγγένειας BCR. υσλειτουργία στην αρνητική επιλογη των Β-λεµφοκυττάρων µπορεί να λειτουργήσει ως παράγοντας πρόκλησης αυτοανοσίας. 38

39 Σκοπός της παρούσας εργασίας Η παρούσα εργασία απαρτίζεται από δύο ανεξάρτητες ενότητες, ο σκοπός των οποίων αναλύεται παρακάτω. Α. Στο παρόν Ερευνητικό Έργο προσπαθήσαµε να διερευνήσουµε την ύπαρξη και τη σηµασία ενός µηχανισµού αντιγόνο-ειδικής παρεµπόδισης της ενεργοποίησης των Β- λεµφοκυττάρων κατά του υποδοχέα ακετυλοχολίνης στην πειραµατική βαριά µυασθένεια. Η κατιούσα ρύθµιση των Β-λεµφοκυττάρων µπορεί να διαµεσολαβείται από τον υποδοχέα FcγRIIΒ των Β-κυττάρων (Ashman et al., 1996). Μετά από έκθεση σε αντιγόνο τα Β-λεµφοκύτταρα διαφοροποιούνται σε κύτταρα που εκκρίνουν αντισώµατα και σε κύτταρα µνήµης. Τα περισσότερα από τα ενεργοποιηµένα Β- λεµφοκύτταρα πεθαίνουν, πιθανώς µέσω µιας διαδικασίας προγραµµατισµένου θανάτου. Η σταδιακή απώλεια των ενεργοποιηµένων Β-κυττάρων συνεισφέρει στη φυσιολογική εξασθένηση των χυµικών απαντήσεων. Τα Β-λεµφοκύτταρα χρησιµοποιούν επιπλέον έναν ειδικό µηχανισµό για να διακόπτουν την παραγωγή αντισωµάτων. Καθώς το IgG αντίσωµα παράγεται και εισέρχεται στο αίµα, το αντίσωµα προσδένεται στο αντιγόνο που είναι ακόµα διαθέσιµο στο αίµα, σχηµατίζοντας ανοσοσυµπλέγµατα. Τα Β-κύτταρα που είναι ειδικά για το αντιγόνο µπορούν να προσδένονται στο αντιγονικό τµήµα του ανοσοσυµπλέγµατος µέσω των υποδοχέων Ig που έχουν. Ταυτόχρονα η «ουρά» Fc του προσδεδεµένου IgG αντισώµατος µπορεί να αναγνωρισθεί από τον υποδοχέα FcγRIIΒ των Β-κυττάρων. Όταν ο κύριος υποδοχέας των Β κυττάρων (BCR) προσδέσει αντιγόνο το οποίο φέρει προσδεµένο επάνω του ένα άλλο αντίσωµα, ο υποδοχέας FcγRIIb προσδένει το Fc τµήµα αυτού του αντισώµατος και µεταδίδει κατασταλτικό σήµα στο εσωτερικό του κυττάρου τερµατίζοντας έτσι τις Β κυτταρικές απαντήσεις. Η διαδικασία αυτή, στην οποία το αντίσωµα που προσδένεται στο αντιγόνο αναστέλλει την περαιτέρω παραγωγή αντισώµατος καλείται αντισωµική ανάδραση. Η ανίχνευση και µελέτη αυτού του µηχανισµού στη µυασθένεια, θα µπορούσε µελλοντικά να οδηγήσει στην ανάπτυξη µιας ειδικής θεραπείας για την ασθένεια. Στόχος στην συγκεκριµένη εργασία είναι ο εξής: ανοσοποίηση αρουραίων µε αντιγόνο, το οποίο είναι ο υποδοχέας της ακετυλοχολίνης αποµονωµένος από τα ηλεκτρικά όργανα του ψαριού Torpedo. Η ανοσοποίηση µε Torpedo υποδοχέα θα προκαλέσει την παραγωγή από το 39

40 ανοσοποιητικό σύστηµα των πειραµατοζώων αντισωµάτων έναντι του Torpedo υποδοχέα, κάποια από τα οποία θα αντιδρούν διασταυρωτά και θα προσδένονται και στους υποδοχείς τις ακετυλοχολίνης των µυών των πειραµατοζώων. Κατόπιν θα χορηγηθεί σύµπλοκο στο ζώο που θα αποτελείται από το αντιγόνο (Torpedo AChR) και που θα φέρει προσδεδεµένα µονοκλωνικά αντισώµατα έναντι του Torpedo, µε σκοπό να προκαλέσει αντισωµική ανάδραση στα ενεργοποιηµένα Β-λεµφοκύτταρα. Για την επίτευξη του στόχου µας πραγµατοποιήθηκαν τα κάτωθι στάδια: 1. Ανοσοποίηση αρουραίων µε AChR. Οι αρουραίοι Lewis παρέχουν το καλύτερο µοντέλο πειραµατικής µυασθένειας, γι αυτό χρησιµοποιήθηκαν στο παρόν έργο. Ο φυσικός AChR προέρχεται από τα ηλεκτρικά όργανα του ψαριού Torpedo, τα οποία είναι πολύ πλούσια σε AChR. Έλαβαν χώρα δυο ανοσοποιήσεις, η αρχική (ηµέρα 0) και µία αναµνηστική (µετά την πάροδο περίπου τεσσάρων εβδοµάδων) παρουσία ανοσοενισχυτικού. 2. Παρασκευή συµπλόκων αντιγόνου (Torpedo AChR)-µονοκλωνικών αντισωµάτων, που χορηγήθηκαν για να προκαλέσουν αντισωµική ανάδραση στα ανοσοποιηµένα πειραµατόζωα. Παρασκευάστηκαν δύο οµάδες συµπλόκων: α. Μη τροποποιηµένο αντιγόνο (άθικτος, ολόκληρος Torpedo AChR) µε προσδεµένα µονοκλωνικά αντισώµατα, έναντι αυτού, ισχυρής συγγένειας. Η ισχυρή συγγένεια κρίνεται απαραίτητη, ώστε να αποφευχθεί η διάσταση του συµπλόκου που χορηγήθηκε, γεγονός που θα ενίσχυε περαιτέρω την ανοσοποίηση. β. Τροποποιηµένο αντιγόνο µέσω χηµικής σταυροσύνδεσης (cross-linking) µε γλουταραλδεϋδη (ώστε να µειωθεί/εξαφανιστεί η ανοσογονικότητά του λόγω παρεµπόδισης της επεξεργασίας του και της παρουσίασής του στα Τ κύτταρα) µε προσδεµένα µονοκλωνικά αντισώµατα ισχυρής συγγένειας. Το σύµπλοκο στην περίπτωση αυτή αποτελείται από Torpedo AChR και µονοκλωνικά αντισώµατα που φέρει προσδεδεµένα. Το σύµπλοκο (Torpedo AChR και µονοκλωνικά αντισώµατα) µπορεί να προσληφθεί από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος των πειραµατοζώων, και να πρωτεολυθεί-καταστραφεί από αυτά. Για το λόγο αυτό προστίθεται στο σύµπλοκο γλουταραλδεϋδη που διασυνδέει τον υποδοχέα Torpedo και τα µονοκλωνικά αντισώµατα που φέρει. Το σύµπλοκο µε την γλουταραλδεϋδη προσλαµβάνεται από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, δεν µπορεί όµως να προτεολυθεί από αυτά και αποβάλλεται στην κυκλοφορία. 40

41 3. Τα παραπάνω παραχθέντα σύµπλοκα που αποτελούνταν από Torpedo υποδοχέα- µονοκλωνικών αντισωµάτων χορηγήθηκαν σε πειραµατόζωα σε διάφορα στάδια της ανοσοποίησης µετά την πρώτη χορήγηση του ανοσογόνου, καθώς και σε µη ανοσοποιηµένα ζώα. 4. Παρακολούθηση της ανοσοαπόκρισης και πειραµατικής µυασθένειας στα παραπάνω πειραµατόζωα. Σε τακτά χρονικά διαστήµατα γίνονταν αιµοληψίες, αποµόνωση των ορών και κατόπιν έλεγχος του τίτλου των αντισωµάτων τους µε ραδιοανοσολογικό προσδιορισµό (RIA). Σε ένα κύκλο πειραµάτων τα πειραµατόζωα θυσιάστηκαν στο τέλος του πειράµατος, αποµονώθηκαν οι σκελετικοί µύες των κάτω άκρων τους και ελέχθηκε το ποσοστό των µη κατεστραµµένων υποδοχέων µε RIA. Β. Η βαριά µυασθένεια προκαλείται κυρίως από αντισώµατα που παράγει ο οργανισµός και κατευθύνονται έναντι των υποδοχέων της ακετυλοχολίνης στη νευροµυϊκή σύναψη. Έχει δειχθεί ότι τα αντί-achr αυτοαντισώµατα εµφανίζουν µεγάλη ετερογένεια και κατευθύνονται έναντι διαφόρων επιτόπων της κάθε υποµονάδας του υποδοχέα, αλλά και διαφορετικών υποµονάδων του AChR (Lindstrom et al., 1988, Tzartos et al., 1982, 1991, Vincent et al., 1987). Ωστόσο το µεγαλύτερο κλάσµα των αυτοαντισωµάτων κατευθύνεται κυρίως έναντι της α-υποµονάδας του υποδοχέα και συγκεκριµένα έναντι της MIR περιοχής, όπως έχουν δείξει πειράµατα ανταγωνισµού µε µονοκλωνικά αντισώµατα. Λαµβάνοντας υπ όψιν την µη συσχέτιση του τίτλου των αντισωµάτων µε τη βαρύτητα της κλινικής εικόνας των ασθενών και τη µεγάλη ετερογένεια των αυτοαντισωµάτων ως προς την πρόσδεση σε διαφορετικούς επιτόπους, διερευνήσαµε την παθογένεια των αντισωµάτων έναντι των α- και β-υποµονάδων του AChR από ορούς µυασθενικών µέσω της ικανότητάς τους να προκαλούν πειραµατική µυασθένεια όταν χορηγούνται σε πειραµατόζωα (αρουραίοι), καθώς επίσης και των ορών από τους οποίους αποµονώθηκαν και τον ορών που προκύπτουν όταν αφαιρούνται τα ειδικά έναντι των υποµονάδων αυτοαντισώµατα. Σηµαντικός παράγοντας για την επίτευξή του στόχου µας είναι η αποµόνωση των αυτοαντισωµάτων που επιτεύχθηκε µε τη χρήση ανασυνδυασµένων εξωκυτταρικών τµηµάτων των α-και β-υποµονάδων του υποδοχέα εκφρασµένα σε βακτηριακές καλλιέργειες E. coli. 41

42 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 42

43 Α. ΥΛΙΚΑ Α.1. Εργαστηριακός εξοπλισµός. Για την εκτέλεση της παρούσας µελέτης χρησιµοποιήθηκαν οι συσκευές και τα όργανα που αναφέρονται παρακάτω: Συσκευή κάθετης ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών Μini-Protein II BIORAD. Φασµατοφωτόµετρο JENWAY Μετρητής γ-ακτινοβολίας WALLAC Μικροφυγόκεντρος Eppendorf 5410 και επιτραπέζια φυγόκεντρος SORVALL RT 6000B. Φυγόκεντροι SORVALL RC5C (κεφαλές GS3 και SS34) SORVALL RC 28C (κεφαλή F-28/50). Συλλέκτης κλασµάτων FRAC-100 PHARMACIA. Γυάλινος οµογενοποιητής ιστών χειρός WHEATON. Συσκευή παραγωγής ddh 2 O Direct Q MILLIPORE. Συσκευή διαβάθµισης άλατος. Υδατόλουτρο PRECISTERM. Α.2. Αντιδραστήρια Χηµικά αντιδραστήρια αναλυτικού βαθµού από SIGMA, MERCK, FLUKA, CHEMICALS, ALDRICH και BIORAD. Απορρυπαντικά Sodium Cholate και Triton x-100 από SIGMA. Αλβουµίνη από ορό βοδιού από SIGMA. Μεµβράνες ηλεκτρικού οργάνου του χονδριχθύος Torpedo californica από PACIFIC BIOMARINE VENICE, CA. Mάρτυρες µοριακών µεγεθών πρωτεϊνών από FERMENTAS. a- bgtx από SIGMA. Οροί µυασθενικών ασθενών και φυσιολογικών ατόµων από Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ. Φυσιολογικός ορός αρουραίου από Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ. Γλουταραλδεϋδη από SIGMA Ανοσοενισχυτικό Freud complete και incomplete από SIGMA. Σφαιρίδια σεφαρόζης από PHARMACIA. 43

44 Υλικό πλήρωσης στήλης χρωµατογραφίας DEAE από PHARMACIA. Α.3. Ραδιενεργά Αντιδραστήρια 125 Ι για την σήµανση της α-bgtx Α.4. Αναλώσιµα Πλαστικές κυψελίδες µιας χρήσης από SARTEDT Φίλτρα διαµέτρου πόρων 0,2 και 0,45 µm από GELMAN. Μεµβράνες διαπίδυσης από SPECTRUM. Πλαστικά ακρορύγχια, πιππέτες, πλαστικοί σωλήνες των 1,5 ml, 15 ml και 50 ml από GBO. Πλαστικά ακρορύγχια για επαναληπτική πιππέτα από EPPENDORF. Σύριγγες του 1 ml και 2,5 ml από NORM-JECT. Α.5. Αντισώµατα Στην παρούσα µελέτη χρησιµοποιήθηκαν τα εξής αντισώµατα: Ι) Μονοκλωνικά αντισώµατα κατά του Τοpedo υποδοχέα τα χαρακτηριστικά των οποίων παρουσιάζονται στον πίνακα 1. Τα µονοκλωνικά αυτά αντισώµατα χρησιµοποιήθηκαν για την παραγωγή του συµπλόκου στη µελέτη του υποδοχέα FcγRIIB καθώς επίσης ως θετικοί και αρνητικοί µάρτυρες στο ραδιοανοσολογικό προσδιορισµό. ΙΙ) Πολυκλωνικά αντισώµατα κουνελιού κατά ανοσοσφαιρινών αρουραίου. ΙΙΙ) Πολυκλωνικά αντισώµατα αιγός κατά ανοσοσφαιρινών ανθρώπου. 44

45 mab Τάξη Ig 124 IgG1 35 IgG1 198 IgG2α Υποµονάδα, περιοχή και αλληλουχία ειδικότητας β, κυτταροπλασµατική περιοχή (β ) α, MIR περιοχή (α67-76) α, MIR περιοχή (α67-76) 25 IgG2b εν εµφανίζει 64 IgG2α 6 IgG1 195 IgG1 α, εξωκυτταρική περιοχή, όχι MIR α, MIR περιοχή (α67-76) α, MIR περιοχή (α67-76) Προέλευση Αρουραίος ανοσοποιηµένος µε αποδιαταγµένο AChR από Torpedo Αρουραίος ανοσοποιηµένος µε AChR από Electrophorus Αρουραίος ανοσοποιηµένος µε AChR από ανθρώπινο µυ Αρουραίος ανοσοποιηµένος µε AChR από Electrophorus Αρουραίος ανοσοποιηµένος µε εµβρυϊκό AChR µόσχου Αρουραίος ανοσοποιηµένος µε AChR απόtorpedo Αρουραίος ανοσοποιηµένος µε AChR από ανθρώπινο ιασταυρωτή αντίδραση AChR από Electrophorus, µοσχάρι, άνθρωπο, αρουραίο, ποντίκι AChR από Torpedo, µοσχάρι, άνθρωπο, αρουραίο, ποντικό AChR από Torpedo, µοσχάρι καµµία AChR από άνθρωπο, αρουραίο, ποντίκι AChR από Torpedo, µοσχάρι, άνθρωπο, αρουραίο, ποντικό AChR από µοσχάρι, άνθρωπο, αρουραίο, ποντίκι µυ Πίνακας 1. Χαρακτηριστικά των µονοκλωνικών αντισωµάτων που χρησιµοποιήθηκαν στην παρούσα µελέτη. Α.6. Πλασµίδια και βακτηριακά στελέχη Ο πλασµιδιακός φορέας έκφρασης pet-15b (Novagen) χρησιµοποιήθηκε για την παραγωγή των ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών (α και β ECDs) σε µεγάλες ποσότητες και µε τη µορφή εγκλείστων σωµατίων (inclusion bodies) στο βακτηριακό στέλεχος BL21 (DE3)pLysS. Τα βακτήρια BL21 (DE3)pLysS περιέχουν ενσωµατωµένο στο γονιδίωµά τους το DNA του βακτηριοφάγου DE3 (παράγωγο του φάγου λ) και επίσης διαθέτουν το πλασµίδιο plyss (Studier and Moffatt, 1986, Moffatt and Studier, 1987) (εικόνα 9). Το DNA του φάγου DE3 περιέχει τον υποκινητή lacuv5 και το γονίδιο που κωδικοποιεί την RNA πολυµεράση του βακτηριοφάγου Τ7 (RNA πολυµεράση Τ7). Η έκφραση των ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών µε τα πλασµίδια τη σειράς pet πραγµατοποιείται µε τη βοήθεια της RNA πολυµεράσης Τ7, καθώς τα πλασµίδια διαθέτουν µπροστά από την περιοχή κλωνοποίησης τον υποκινητή Τ7. Οι υποκινητές lacuv5 και Τ7 βρίσκονται κάτω από τον έλεγχο του καταστολέα lac, ο οποίος προσδένεται στο χειριστή lac και εµποδίζει την µεταγραφή. Η προσθήκη β- 45

46 ισοπρόπυλο-dθειογαλακτοζιδίου (IPTG) στο υλικό της καλλιέργειας, επάγει τον υποκινητή lacuv5 για την παραγωγή της RNA πολυµεράσης Τ7, η οποία µε τη σειρά της προσδένεται στον υποκινητή Τ7 του πλασµιδίου pet και µεταγράφει το γονίδιοστόχο. Το παραπάνω σύστηµα περιγράφεται ως σύστηµα έκφρασης Τ7 και χρησιµοποιείται για την υπερέκφραση πρωτεϊνών, καθώς η RNA πολυµεράση Τ7 επιµηκύνει αλυσίδες mrna µε ρυθµό πέντε φορές µεγαλύτερο από εκείνο της RNA πολυµεράσης της E. Coli (Chamberlin and Rind, 1973, Golomb and Chaberlin, 1974) Εικόνα. 9. Στοιχεία ελέγχου του συστήµατος Τ7 (Αναπαράσταση βακτηριακού κυττάρου BL21(DE3)pLysS, µετασχηµατισµένου µε πλασµίδιο της σειράς pet, στο οποίο έχει κλωνοποιηθεί το γονίδιο στόχος) Τα βασικά επίπεδα µεταγραφής του γονιδίου της RNA πολυµεράσης Τ7, πριν την επαγωγή του υποκινητή lacuv5 από το IPTG οδηγούν στην παραγωγή µικρών ποσοτήτων της ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης. Σε περιπτώσεις όπου τα προϊόντα των κλωνοποιηµένων γονιδίων είναι τοξικά για τα κύτταρα, η βασική αυτή έκφραση εµποδίζει τον πολλαπλασιασµό των BL21 (DE3) βακτηρίων µέχρι το σηµείο της επαγωγής. Για να µειωθούν στο ελάχιστο τα επίπεδα της RNA πολυµεράσης Τ7 πριν την επαγωγή, έχει εισαχθεί στα βακτήρια BL21 (DE3) το πλασµίδιο plyss το οποίο 46

47 είναι υπεύθυνο για την παραγωγή µικρών ποσοτήτων της λυσοζύµης Τ7 (Moffatt and Studier, 1987). Η λυσοζύµη Τ7 έχει ως ρόλο µεταξύ άλλων τη δέσµευση και αδρανοποίηση της RNA πολυµεράσης Τ7. Έτσι τα βακτήρια BL21 (DE3)pLysS πολλαπλασιάζονται κανονικά µέχρι το σηµείο της επαγωγής, όπου στη συνέχεια η παραγωγή µεγάλων ποσοτήτων RNA πολυµεράσης Τ7 επάγει την υπερέκφραση της ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης. Με το σύστηµα έκφρασης Τ7 του πλασµιδίου pet-15b οι ανασυνδυασµένες πρωτεΐνες παράγονται σε αδιάλυτη µη λειτουργική µορφή συσσωµατοµάτων και σχηµατίζουν έγκλειστα σωµάτια (inclusion bodies) µέσα στο βακτηριακό κύτταρο. Το πλασµίδιο pet-15b διαθέτει επίσης µια αλληλουχία DNA πριν από την περιοχή του πολυσυνδέτη που κωδικοποιεί έξι κατάλοιπα ιστιδίνης στο Ν-τελικό άκρο της ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης. Η αλληλουχία αυτή χρησιµοποιείται για τον καθαρισµό της πρωτεΐνης µε χρωµατογραφία συγγένειας σε στήλη νικελίου (Ni +2 -NTAagarose, Qiagen Inc.) Τα χαρακτηριστικά του πλασµιδίου pet-15b παρουσιάζονται στην εικόνα

48 A B Εικόνα.10. A. Χάρτης του πλασµιδίου pet-15b. ιακρίνονται: (1) το γονίδιο που προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό αµπικιλλίνη (Ap), (2) το σηµείο έναρξης της αντιγραφής (ori), (3) η περιοχή κλωνοποίησης/έκφρασης Τ7 (µαύρο βέλος), η οποία πρέπει να σηµειωθεί ότι εµφανίζεται ανεστραµένη στον κυκκλικό χάρτη και (4) το γονίδιο laci που κωδικοποιεί τον καταστολέα lac. Β. Περιοχή κλωνοποίησης/έκφρασης του πλασµιδίου pet-15b, όπου διακρίνονται: (1) η αλληλουχία του υποκινητή Τ7 (T7 promoter), (2) η αλληλουχία του χειριστή lac (lac operator), (3) η αλληλουχία των έξι ιστιδινών (His tag), (4) η θέση αναγνώρισης από τη θροµβίνη (thrombin), (5) η θέση αναγνώρισης από τη περιοριστική ενδονουκλεάση XhoI και (6) τα σηµεία υβριδοποίησης των ενακτήριων µορίων Τ7 promoter primer και terminator primer Α.7. Πειραµατόζωα Χρησιµοποιήθηκαν θηλυκοί και αρσενικοί αρουραίοι του υποείδους Lewis ηλικίας 4-8 εβδοµάδων στα οποία επάχθηκε µέσω ενεργητικής ανοσοποίησης πειραµατική µυασθένεια για µελέτη του υποδοχέα FcγRIIB, ενώ για την παθητική µεταφορά ανθρώπινων ανοσοσφαιρινών και µελέτη των επιµέρους αυτοαντισωµάτων έναντι των α- και β- υποµονάδων χρησιµοποιήθηκαν αρουραίοι Lewis ηλικίας 3-4 εβδοµάδων. Α.8. ιαλύµατα Για την παρασκευή όλων των διαλυµάτων χρησιµοποιήθηκε δις- απεσταγµένο και απιονισµένο νερό (ddh 2 O) 48

49 ιαλύµατα 10x PBS, ph7,4 (1 Lt) NaCl 80 g Na 2 HPO 4 6,1 g KCl 2 g KH 2 PO 4 2 g Κορεσµένο διάλυµα (NH 4 ) 2 SO4 ph 7 (NH 4 ) 2 SO g διαλύονται σε 1lt νερού 15 mm Tris-HCl, ph8,8 (1lt) Tris-base 1,82 g ρύθµιση του ph µε HCl 0,1 M Tris-HCl, 0,5 M NaCl ph 8 (1 lt) Tris-base 12,1g NaCl 29,2g ρύθµιση του ph µε HCl 0,1 Μ NaHCO 3, 0,5 M NaCl ph 8,3 (1 lt) NaHCO 3 8,4 g NaCl 29,2 g 0,1 M CH3COONa, 0,5 M NaCl ph 4 (1 lt) CH3COONa 8,23 g NaCl 29,2 g PBS-Bsa 0,2% κ.β Bsa 0,2 g σε 100 ml PBS 49

50 PBS-Triton x0,5 % κ.ο Triton x 0, 5 ml σε 100 ml PBS PBS-cholate 2% κ.β 2 g cholate σε 100 ml PBS ιαλύµατα ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών ιάλυµα ακρυλαµιδίου 30% (100 ml) Ακρυλαµίδιο 29,2 g Ν,Ν-µεθυλεν-δισακρυλαµίδιο 0,8 g Πήκτωµα διαχωρισµού 15% (10 ml) H 2 O 2,3 ml ιάλυµα ακρυλαµιδίου 30% 5 ml 1,5 M Tris-HCl ph 8,8 2,5 ml SDS-10% 100 µl Υπερθειϊκό αµµώνιο (APS) 10% 100 µl TEMED 5 µl Πήκτωµα συµπύκνωσης 5% (4 ml) H 2 O 2,64 ml ιάλυµα ακρυλαµιδίου 30% 0,66 ml 1 M Tris-HCl ph 6,8 0,63 ml SDS-10% 50 µl Υπερθειϊκό αµµώνιο (APS) 10% 50 µl TEMED 2,5 µl 6x διάλυµα φόρτωσης δείγµατος πρωτεϊνών (loading buffer) (10 ml) 4x Tris-HCl/SDS ph 6,8 4,5 ml [4x Tris-HCl/SDS ph 6,8 (0,5 M Tris, 0,4% SDS): 6,05 g Tris σε 100 ml νερό, ρύθµιση του ph 6,8 και κατόπιν προσθήκη 0,4 g SDS] Γλυκερόλη 3,8 g ( Sigma d=1,25 g/ml, προσθήκη 3,04 ml) SDS 1g 50

51 Χρωστική κυανού της βρωµοφαινόλης 12 mg Β-µερκαπτοαιθανόλη 2,5 ml 10x ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης (1 lt) Tris base 30 g Γλυκίνη 144 g SDS 10 g ιάλυµα χρωµατισµού Χρωστική κυανούν του Coomassie R % κ.β Μεθανόλη 40% κ.ο Οξικό οξύ 10% κ.ο ιάλυµα αποχρωµατισµού Μεθανόλη 40% κ.ο Οξικό οξύ 10% κ.ο 51

52 Β. ΜΕΘΟ ΟΙ B.1. Καθαρισµός µονοκλωνικών αντισωµάτων σε στήλη χρωµατογραφίας DEAE. O καθαρισµός των µονοκλωνικών αντισωµάτων έγινε µε τη βοήθεια στήλης χρωµατογραφίας DEAE. Το υλικό πλήρωσης της χρωµατογραφική στήλης είναι ένας ασθενής ανιονικός ανταλλάκτης µε εξαιρετικές ικανότητες ροής και υψηλή ανταλλακτική χωρητικότητα για πρωτεΐνες µε ποικίλες τιµές ρι. Η ανιοανταλλακτική οµάδα είναι το διαιθυλαµινοαιθύλιο που παραµένει φορτισµένο και διατηρεί συνεχώς αυξηµένη ανταλλακτική χωρητικότητα στο ευρύ φάσµα ph 3-9. O κλώνος του υβριδώµατος καλλιεργείται σε θρεπτικό υλικό DMEM χωρίς ορό και το υπερκείµενο της καλλιέργειας συµπυκνώνεται σε µεµβράνες διαπίδυσης και υφίσταται διαπίδυση σε ρυθµιστικό διάλυµα 15 mm Tris-HCl, ph 8,8. Το υλικό DEAE που είναι πακεταρισµένο στη γυάλινη στήλη χρωµατογραφίας εξισορροπείται µε 3 όγκους στήλης του ιδίου ρυθµιστικού διαλύµατος, δηλαδή 15 mm Tris-HCl, ph 8,8. Το µονοκλωνικό αντίσωµα φορτώνεται στη στήλη και συλλέγονται κλάσµατα των 2 ml µε τη χρήση ρυθµιστικού διαλύµατος 15 mm Tris-HCl, ph 8,8. Ακολούθως εφαρµόζεται στη στήλη διαβάθµιση συγκέντρωσης άλατος ΝαCl στο ρυθµιστικό διάλυµα της στήλης, από συγκέντρωση 0 εώς 1 Μ µε τη βοήθεια συσκευής διαβάθµισης άλατος. Συγκεκριµένα περνούν από τη στήλη 10 όγκοι στήλης ρυθµιστικού διαλύµατος 15 mm Tris-HCl, ph 8,8 από 0 έως 1 Μ, ΝαCl οπότε και εκλούεται το αντίσωµα σε µια συγκεκριµένη συγκέντρωση ΝαCl. Τέλος περνά από τη στήλη και 1 όγκος στήλης 15 mm Tris-HCl, ph 8,8, 1 Μ ΝαCl για να εκλουσθούν και οι τελευταίες πρωτεΐνες που υπάρχουν σε αυτή. Ακολουθεί µέτρηση των κλασµάτων σε µήκος κύµατος 280 nm (ΟD=1,4 αντιστοιχεί σε συγκέντρωση 1 mg αντισώµατος/ml διαλύµατος) και τοποθέτηση των κλασµάτων που περιέχουν το µονοκλωνικό αντίσωµα σε µεµβράνη διαπίδυσης. Το διάλυµα του αντισώµατος υφίσταται εκτεταµένη διαπίδυση σε ρυθµιστικό διάλυµα PBS. Η απόδοση του καθαρισµού ελέγχεται µε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE, η δραστικότητα του αντισώµατος µε ραδιοανοσολογικό προσδιορισµό (RIA) και η συγκέντρωση στο παρασκεύασµα υπολογίζεται µε µέτρηση της οπτικής απορρόφησης στα 280 nm. 52

53 Β.2. Ανάλυση πρωτεϊνών σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου παρουσία SDS (SDS-PAGE). Ο διαχωρισµός και η ταυτοποίηση των πρωτεϊνών έγινε µε βάση το µοριακό τους βάρος µε ηλεκτροφόρηση σε κάθετο πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου παρουσία δωδεκακυλικού θεϊκού νατριού (SDS) (Laemmli, 1970). Σύµφωνα µε τη µέθοδο αυτή τα πρωτεϊνικά µόρια αποκτούν αρνητικό φορτίο, καθώς εκτίθενται στο αρνητικά φορτισµένο απορρυπαντικό SDS (ένα περίπου µόριο απορρυπαντικού δεσµεύεται σε κάθε αµινοξύ της πρωτεΐνης καθιστώντας όλο το µόριο αρνητικά φορτισµένο) και µετακινούνται προς το θετικό πόλο µε ταχύτητα αντιστρόφως ανάλογη προς το µέγεθός τους. Κατά την ηλεκτροφόρηση οι πρωτεΐνες τοποθετούνται αρχικά σε πήκτωµα χαµηλής περιεκτικότητας σε ακρυλαµίδιο (πήκτωµα συµπύκνωσης) και στη συνέχεια εισέρχονται και διαχωρίζονται σε πήκτωµα υψηλής συγκέντρωσης σε ακρυλαµίδιο (πήκτωµα διαχωρισµού). Το πήκτωµα διαχωρισµού που χρησιµοποιήθηκε είχε συγκέντρωση ακρυλαµιδίου 15% κ.β ενώ το πήκτωµα συµπύκνωσης 5% κ.β. Τα προς ανάλυση δείγµατα αραιώνονταν κατάλληλα σε διάλυµα φόρτωσης δείγµατος (loading buffer), που περιείχε SDS και β-µερκαπτοαιθανόλη και επωάζονται σε υδατόλουτρο στους C για 3 min. Οι συνθήκες αυτές είναι αποδιατακτικές για τις πρωτεΐνες καθώς ο βρασµός και η παρουσία του SDS καταστρέφουν τους ασθενείς δεσµούς (υδρογόνου, ιοντικούς, υδρόφοβους και van der Vaals), ενώ η παρουσία της β- µερκαπτοαιθανόλης (αναγωγικό µέσο) έχει ως αποτέλεσµα την αναγωγή των ισχυρών οµοιοπολικών δισουλφιδικών δεσµών. Παράλληλα µε τα προς εξέταση δείγµατα γίνεται ανάλυση µείγµατος πρωτεϊνών γνωστού µοριακού βάρους που χρησιµοποιούντα ως µάρτυρες. Η ηλεκτροφόρηση πραγµατοποιείται σε ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών µε ρεύµα σταθερής τάσης 150 V σε θερµοκρασία δωµατίου. Οι ζώνες των πρωτεϊνών εµφανίζονται µετά από χρώση του πηκτώµατος και αποχρωµατισµό του. Η χρώση του πηκτώµατος πραγµατοποιείται µε ήπια ανάδευση σε διάλυµα χρωµατισµού για 1 h περίπου στους 37 0 C. Ο αποχρωµατισµός του πηκτώµατος γίνεται µε επανειληµµένες πλύσεις σε διάλυµα αποχρωµατισµού ώστε να αποµακρυνθεί η περίσσεια της χρωστικής. 53

54 Β.3. Αποµόνωση µικρών µεµβρανικών τµηµάτων πλόυσιων σε AChR υποδοχέα από το ηλεκτρικό όργανο του χονδριχθύος Τ. californica. 50 g του ηλεκτρικού οργάνου τεµαχίστηκαν σε οµογενοποιητή ιστών παρουσία υγρού αζώτου και σε αυτά προστέθηκαν 100 ml διαλύµατος Tris 20 mm, 3 mm EDTA, 1 mm EGTA 0,1 mm PMSF 5 mm ιοδοακεταµίδιο, 5 µονάδες/µlt απροτινίνη, 5 µg/ml πεπστατίνη και 0,001% NaN3 σε ph 7,4. Το δείγµα φυγοκεντρήθηκε για 7 min. στα g (Sorvall, κεφαλή ss34) και το συλλεχθέν υπερκείµενο φυγοκεντρήθηκε για 60 min. στα g (Sorvall, κεφαλή ss34). Το ίζηµα που σχηµατίστηκε αραιώθηκε σε 23 ml του ιδίου διαλύµατος µε προσθήκη 32% σουκρόζης, οµογενοποιήθηκε και προστέθηκε σε διάλυµα 41,5% σουκρόζης. Ακολούθησε υπερφυγοκέντρηση για 4 ώρες στα g (Beckman, κεφαλή sw28). Με το πέρας της υπερφυγοκέντρησης σχηµατίσθηκαν 2 φάσεις σουκρόζης ανάµεσα στις οποίες σχηµατίστηκε µία τρίτη που περιείχε τα τµήµατα των µεµβρανών πλούσια σε AChR υποδοχέα. Η στιβάδα αυτή αποµονώθηκε και αραιώθηκε στο αρχικό διάλυµα και ακολούθως φυγοκεντρήθηκε στα g για 30 min. Το σχηµατισθέν ίζηµα αραιώθηκε σε 5 ml διαλύµατος και έπειτα από προσθήκη 5% γλυκερόλης αποθηκεύθηκε στους -80 ο C. Β.4. ιαλυτοποίηση Topredo υποδοχέα από µικρά µεµβρανικά τµήµατα πλούσια σε AChR από το ηλεκτρικό όργανο του χονδριχθύος. Η διαλυτοποίηση του Torpedo υποδοχέα από τις µεµβράνες για σχηµατισµό του προς χορήγηση συµπλόκου έγινε µε τη βοήθεια του ιονικού απορρυπαντικού sodium cholate. Σε συγκεκριµένη ποσότητα µεµβρανών προστέθηκε διάλυµα PBS-sodium cholate 2% και ακολούθησε ήπια ανάδευση για 24 h στους 4 0 C. Την εποµένη ηµέρα ακολούθησε φυγοκέντρηση του δέιγµατος στις rpm για 15 min. και συλλέχθηκε το υπερκείµενο που περιείχε τον διαλυτοποιηµένο υποδοχέα. Η αποµάκρυνση του sodium cholate πραγµατοποιήθηκε µε µεµβράνη διαπίδυσης σε διάλυµα PBS. Β.5. Παρασκευή συµπλόκου Torpedo υποδοχέα και µονοκλώνικών αντισωµάτων Μετά τη διαλυτοποίηση του υποδοχέα από τις µεµβράνες προστέθηκαν τα µονοκλωνικά αντισώµατα και αφέθηκαν για επώαση περίπου 16 h στους 4 0 C. Στο δείγµα προστέθηκε γλουταραλδεϋδη σε τελική συγκέντρωση 0,2%, ώστε να πραγµατοποιηθεί η διασύνδεση (cross-linking) του υποδοχέα µε τα µονοκλωνικά 54

55 αντισώµατα. Η αντίδραση τερµατίστηκε µετά από 30 min. µε προσθήκη γλυκίνης 50 mm. Το δείγµα συµπυκνώθηκε και ακολούθησε διαπίδυση σε διάλυµα PBS. Ο καθαρισµός των συµπλόκων από ενδεχόµενα µη προσδεδεµένα αντισώµατα πραγµατοποιήθηκε µε χρήση φίλτρων που επιτρέπουν την διέλευση πρωτεϊνών µοριακού βάρους µικρότερου των 300 kdα. Β.6. Υγρή και στερεή καλλιέργεια βακτηρίων. Η καλλιέργεια των βακτηριακών στελεχών BL21(DE3)pLysS πραγµατοποιήθηκε στο θρεπτικό µέσο M9ZB. Οι υγρές καλλιέργειες των βακτηρίων πραγµατοποιήθηκαν σε κωνικές φλάσκες των 1000 ml, µε συνεχή ανάδευση σε επωαστικό θάλαµο, στους 37 0 C για 16 h επώασης. Οι στερεές καλλιέργειες πραγµατοποιήθηκαν σε τρυβλία Petri µε το ίδιο θρεπτικό υλικό που περιείχε 1,5% κ.β. άγαρ σε επωαστικό θάλαµο, στις ίδιες συνθήκες. B.7. Μετασχηµατισµός βακτηρίων µε τη µέθοδο του χλωριούχου ασβεστίου Η ικανότητα µετασχµατισµού των βακτηρίων που έχουν γίνει επιδεκτικά µε τη χρήση CaCl 2 (Cohen et al., 1972) είναι περίπου 0,5-2x10 7 βακτήρια/µg υπερελικωµένου πλασµιδιακού DNA, η οποία είναι ικανοποιητική για τις συνήθεις περιπτώσεις κλωνοποίησης σε πλασµίδια α. Προετοιµασία επιδεκτικών κυττάρων µε τη χρήση χλωριούχου ασβεστίου (CaCl 2 ). Εµβολιασµός 10 ml θρεπτικού υλικού LB µε µία βακτηριακή αποικία και επώαση µε ανάδευση στους 37 0 C για περίπου 16h. Εµβολιασµός 100 ml θρεπτικού υλικού µε 0,5 ml της παραπάνω καλλιέργειας και επώαση µε ανάδευση στους 37 0 C µέχρι O.D 600 =0,5 (~3,5 h). Τοποθέτηση της καλλιέργειας στον πάγο για 10 min. Φυγοκέντρηση της καλλιέργειας στις 4000 rpm για 10 min στους 4 0 C. Αναδιάλυση του ιζήµατος των βακτηρίων σε 20 ml στείρου παγωµένου διαλύµατος 0,1 M CaCl 2 Φυγοκέντρηση στις 4000 rpm για 10 min στους 4 0 C και αναδιάλυση του ιζήµατος των βακτηρίων σε 4 ml στείρου παγωµένου διαλύµατος 0,1M CaCl 2. Προσθήκη αποστειρωµένης γλυκερόλης σε τελική συγκέντρωση 20% κ.ο. και καλή ανάδευση ώστε το εναιώρηµα να γίνει οµογενές. 55

56 Το βακτηριακό εναιώρηµα µοιράζεται και παγώνεται ανά 200 µl σε σωλήνες που βρίσκονται τοποθετηµένοι σε λουτρό αιθανόλης-ξηρού πάγου. Τα επιδεκτικά κύτταρα διατηρούνται στους C για διάστηµα 6 µηνών. β. Μετασχηµατισµός βακτηρίων Τα επιδεκτικά βακτήρια ξεπαγώνουν αργά σε πάγο. Ανάµειξη 50 µl βακτηριακού εναιωρήµατος και 1-2 µl από την αντίδραση της λιγάσης σε προψυγµένο σωλήνα και επώαση στον πάγο για 30 min. Μεταφορά στους 42 0 C σε υδατόλουτρο και επώαση αυστηρά για 90 sec. Άµεση τοποθέτηση στον πάγο και επώαση για 1-2 min. Προσθήκη 1 ml θρεπτικού υλικού και επώαση στους 37 0 C για 1h. Μετά την επώαση τα βακτήρια επιστρώνονται σε στερεό θρεπτικό µέσο σε τρυβλία. B.8. Έκφραση ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης (α και β ECDs) µε τη µορφή εγκλείστων σωµατίων (έκφραση των ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών σε βακτήρια BL21(DE3)pLysS µετασχηµατισµένα µε το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο pet-15b). Τα βακτήρια BL21(DE3)pLysS περιέχουν στο γενετικό τους υλικό το γονίδιο της Τ7 RNA πολυµεράσης (πολυµεράση του βακτηριοφάγου Τ7). Η έκφραση της ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης µε τον πλασµιδιακό φορέα pet-15b βρίσκεται κάτω από τον έλεγχο της Τ7 RNA πολυµεράσης, καθώς το πλασµίδιο διαθέτει έναν Τ7 υποκινητή µπροστά από την περιοχή του πολυσυνδέτη. Η προσθήκη IPTG στο υλικό της καλλιέργειας επάγει την σύνθεση της Τ7 RNA πολυµεράσης, η οποία µε τη σειρά της µεταγράφει την αλληλουχία-στόχο που έχει κλωνοποιηθεί στο πλασµίδιο. Εµβολιασµός 10 ml θρεπτικού υλικού που περιέχει 100 µg/ml αµπικιλλίνη και 50 µg/ml χλωραµφενικόλη, µε µια αποικία µετασχηµατισµένων βακτηρίων BL21(DE3)pLysS και επώαση µε ανάδευση στους 37 0 C για περίπου 16 h. Εµβολιασµός 1 lt θρεπτικού υλικού Μ9ΖΒ, που περιέχει που περιέχει 100 µg/ml αµπικιλλίνη και 50 µg/ml χλωραµφενικόλη, µε 1 ml από την παραπάνω καλλιέργεια και επώαση µε ανάδευση στους 37 0 C µέχρι η O.D 600nm να γίνει 0,4. Προσθήκη IPTG σε τελική συγκέντρωση 1 mm και επώαση της καλλιέργειας στους 37 0 C για 3 h. Φυγοκέντρηση της καλλιέργειας στις rpm για 15 min στους 4 0 C και αποµάκρυνση του υπερκειµένου. Η ανασυνδυασµένη πρωτεΐνη βρίσκεται µε τη µορφή εγκλείστων σωµατίων στο εσωτερικό των βακτηριακών κυττάρων. ιαλυτοποίηση του 56

57 ιζήµατος των βακτηρίων µε 100 ml αποδιατακτικού διαλύµατος 6 M υδροχλωρικής γουανιδίνης (GuHCl), 50 mm NaH 2 PO 4, ph 8 και επώαση µε ήπια ανάδευση σε θερµοκρασία δωµατίου για 16-24h. Συλλογή του υπερκειµένου που περιέχει το σύνολο των βακτηριακών πρωτεϊνών (µαζί και την ανασυνδυασµένη πρωτεΐνη) σε αποδιαταγµένη µορφή και φύλαξή του σε θερµοκρασία δωµατίου µέχρι τη διαδικασία καθαρισµού της πρωτεΐνης (οι πρωτεΐνες δεν κινδυνεύουν από τη δράση πρωτεασών, καθώς βρίσκονται σε ισχυρά αποδιατακτικό περιβάλλον και επιπλέον υπάρχει ο κίνδυνος κρυστάλλωσης και ιζηµατοποίησης της GuHCl στους 4 0 C. B.9. Καθαρισµός των ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών (6xHis-επισηµασµένων πρωτεϊνών) σε στήλη χρωµατογραφίας νικελίου. Ο ανασυνδυασµένες πρωτεΐνες (α και β ECDs) που εκφράστηκαν µε το πλασµίδιο pet-15b διαθέτουν στο Ν-τελικό τους άκρο µία αλληλουχία από έξι κατάλοιπα ιστιδίνης (6xHis tag). Η αλληλουχία αυτή επιτρέπει τον καθαρισµό τους µε χρωµατογραφία συγγένειας σε στήλη νικελίου (Ni 2+ -NTA-αγαρόζη, Qiagen Inc). Οι πρωτεΐνες προσδένονται µε υψηλή συγγένεια στη στήλη σε ph 8, καθώς στη τιµή αυτή τα κατάλοιπα ιστιδίνης φορτίζονται αρνητικά και σχηµατίζουν ένα δακτύλιο γύρω από το κατιόν νικελίου (Hochuli et al., 1987). Η ικανότητα της στήλης νικελίου να προσδένει 6xHis-επισηµασµένες πρωτεΐνες είναι 5-10 mg πρωτεΐνης/ml στήλης. Ο καθαρισµός πραγµατοποιείται σε ισχυρά αποδιατακτικές συνθήκες (6 M GuHCl). Φυγοκέντρηση 6 ml διαλύµατος στήλης νικελίου που περιέχει 50% σφαιρίδια Ni 2+ - NTA-αγαρόζης στις 500 rpm για 5 min και αποµάκρυνση των 3 ml υπερκειµένου. Εξισορρόπηση της Ni 2+ -NTA-αγαρόζης (3 ml) µε περίσσεια αποδιατακτικού διαλύµατος 6 Μ GuHCl, 50 mm NaH 2 PO 4, ph 8. Στο ίδιο διάλυµα βρίσκονται αποδιαταγµένες οι βακτηριακές πρωτεΐνες µετά την επαγωγή και λύση των βακτηρίων BL21(DE3)pLysS (βακτηριακό λύµα) Φυγοκέντρηση στις 500 rpm για 5 min σε θερµοκρασία δωµατίου και αποµάκρυνση του υπερκειµένου. Ανάµιξη των 3 ml Ni 2+ -NTA-αγαρόζης µε 100 ml βακτηριακού λύµατος (προέρχεται από 1 lt βακτηριακής καλλιέργειας) και επώαση µε ήπια ανάδευση για 1 h σε θερµοκρασία δωµατίου. Στο στάδιο αυτό πραγµατοποιείται η πρόσδεση της 6xHisεπισηµασµένης πρωτεΐνης στα σφαιρίδια της αγαρόζης. 57

58 Πακετάρισµα των σφαιριδίων Ni 2+ -NTA-αγαρόζης σε γυάλινη στήλη χρωµατογραφίας. Πλύση της στήλης µε 5 όγκους διαλύµατος 6 Μ GuHCl, 50 mm NaH 2 PO 4, ph 8. Στο στάδιο αυτό αποµακρύνονται οι βακτηριακές πρωτεΐνες που δεν προσδένονται στη στήλη νικελίου. Πλύση της στήλης µε 20 όγκους διαλύµατος 6 Μ GuHCl, 50 mm NaH 2 PO 4, ph 6,3 και 20 όγκους διαλύµατος διαλύµατος 6 Μ GuHCl, 50 mm NaH 2 PO 4, ph 5,9. Στο στάδιο αυτό αποµακρύνονται οι βακτηριακές πρωτεΐνες που προσδένονται µη ειδικά στη στήλη νικελίου. Στις πλύσεις µε ph 6,3 και 5,9 µπορεί να παρατηρηθεί µερική έκλουση της 6xHis-επισηµασµένης πρωτεΐνης. Έκλουση της 6xHis-επισηµασµένης πρωτεΐνης µε 3 ml διαλύµατος 6 Μ GuHCl, 50 mm NaH 2 PO 4, ph 4,5. Η απόδοση του καθαρισµού ελέγχεται µε SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση και η συγκέντρωση της 6xHis-επισηµασµένης πρωτεΐνης προσδιορίζεται µε µέτρηση της οπτικής απορρόφησης στα 280 nm (1,4 O.D 280nm = 1 mg πρωτεΐνης/ml διαλύµατος). Β.10. Ακινητοποίηση των ανασυνδυασµένων πεπτιδίων σε σφαιρίδια CNBr σεφαρόζης. Τα καθαρισµένα ECDs (α και β) χρησιµοποιήθηκαν για την παρασκευή στηλών CNBrενεργοποιηµένης σεφαρόζης 4B (Pharmacia-Biotech) και κάθε µία από τις στήλες έφερε είτε το α είτε το β ECD. 0,2 g ξηρών σφαιριδίων ξεπλένονται αρχικά µε 60 ml διαλύµατος 1 mm HCl για χρονικό διάστηµα 10 λεπτών. Ακολουθεί ξέπλυµα µε άφθονο διάλυµα πρόσδεσης ~100 ml (coupling buffer) και κατόπιν ξεπλένονται µε 2 όγκους διαλύµατος 6 Μ GuHCl, 50 mm NaH 2 PO 4, ph 8,3. Προστίθενται τα ECDs (0,8~1,2 mg) και αφού ρυθµιστεί το ph στο 8,3 αφήνονται 12 h για επώαση στους 4 0 C. Με την ολοκλήρωση της πρόσδεσης των ECDs η στήλη ξεπλένεται µε 5x όγκους αυτής, µε 6 Μ GuHCl, 50 mm NaH 2 PO 4, ph 8. Οι εναποµείναντες ενεργές οµάδες των σφαιριδίων µπλοκάρονται µε 30 ml 0,1M Tris-HCl ph 8 για 2 h στους 4 0 C. Ακολουθούν 3 κύκλοι εναλλακτικού ph ξεπλύµατος της στήλης µε 5x όγκους της στήλης από τα κάτωθι ρυθµιστικά διαλύµατα: 1) 0,1 Μ οξικό νάτριο ph 4 και 2) 0,5 Μ Tris-HCl ph 8. Οι στήλες ξεπλένονται µε 2 όγκους µε 6 Μ GuHCl, 50 mm NaH 2 PO 4, ph 8 και αποθηκεύονται στους 4 0 C. 58

59 Β.11. Ανοσοπροσρόφηση και αποµόνωση αντισωµάτων έναντι του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης από πλάσµατα µυασθενικών ορών. Τα πειράµατα ανοσοπροσρόφησης πραγµατοποιήθηκαν µε επώαση συγκεκριµένης ποσότητας ορού µε σφαιρίδια ECDs-σεφαρόζης ικανών να δεσµεύσουν όλα τα ειδικά έναντι των υποµονάδων των σφαιριδίων αντισώµατα. Η επώαση έλαβε χώρα για χρονικό διάστηµα 18~24 h στους 4 0 C. Τα δεσµευµένα αντισώµατα απελευθερώθηκαν από τις στήλες µε διάλυµα γλυκίνης 0,2 Μ ph 2,8 και το ph εξισορροπήθηκε µε διάλυµα φωσφορικών ιόντων 0,2 Μ ph 7,4. Ακολούθησε διαπίδυση των καθαρών αντισωµάτων σε διάλυµα PBS και έλεγχος της δραστικότητας των αντισωµάτων µε RIA. Β.12. RIA για έλεγχο ύπαρξης αντισωµάτων. Β RIA για έλεγχο ύπαρξης αντισωµάτων έναντι ανθρώπινου AChR. 14 fmoles ανθρώπινου υποδοχέα διαλυτοποιηµένου από µεµβράνες της κυτταρικής σειράς CN21 (υποδοχέα τόσο µε την ε όσο και την γ υποµονάδα), σηµάνθηκαν ραδιενεργά µε 125 I-α-bgtx ( cpm). Μετά την προσθήκη των υπό εξέταση µυασθενικών ορών ή των καθαρών αντισωµάτων τα δείγµατα επωάσθηκαν για h στους 4 0 C. Tα σχηµατισθέντα ανοσοσυµπλέγµατα κατακρηµνίστηκαν µε επώαση για 2 h στους 4 0 C µε αντί-ανθρώπινο ορό γ-σφαιρινών και µετά από 2 πλύσεις µε διάλυµα PBS, 0.5% Triton x, ph 7,4 (2,500 g για 15 min) τα δείγµατα µετρήθηκαν σε µετρητή γ-ακτινοβολίας. Ως θετικός µάρτυρας χρησιµοποιήθηκε ένας υψηλότιτλος µυασθενικός ορός και ως αρνητικός µάρτυρας φυσιολογικός ανθρώπινος ορός. Ο τίτλος των αντισωµάτων για τον ανθρώπινο υποδοχέα υπολογίσθηκε βάσει της σχέσης ( cpm δείγµατος / cpm θετικού µάρτυρα) * 14 fmoles/όγκο δείγµατος). Θετικοί µυασθενικοί οροί χαρακτηρίζονται αυτοί στους οποίους, ο τίτλος εµφανίζεται 1 nm ενώ ως αρνητικοί αυτοί µε τίτλο 0,6 nm. Β RIA για έλεγχο ύπαρξης αντισωµάτων έναντι AChR αρουραίου. 30 fmoles εκχυλισµένου υποδοχέα από µύες των πίσω άκρων αρουραίων σηµάνθηκαν ραδιενεργά µε 125 I-α-bgtx ( cpm). Προστέθηκαν ακολούθως οι ανθρώπινοι οροί και αντισώµατα και επωάσθηκαν για h. Ακολουθεί ηπειραµατική διαδικασία που περιγράφεται στην παράγραφο Β Ως θετικός µάρτυρας χρησιµοποιήθηκε ένας υψηλότιτλος µυασθενικός ορός µε ισχυρή συγγένεια δέσµευσης των αντισωµάτων του έναντι του υποδοχέα αρουραίου και ως αρνητικός µάρτυρας φυσιολογικός ανθρώπινος 59

60 ορός. Ο τίτλος των αντισωµάτων για τον ανθρώπινο υποδοχέα υπολογίσθηκε βάσει της σχέσης ( cpm δείγµατος / cpm θετικού µάρτυρα) * 30 fmoles/ όγκο του δείγµατος ). Β RIA για έλεγχο ύπαρξης αντισωµάτων έναντι Torpedo AChR. Οι οροί των ανοσοποιηµένων αρουραίων και η δραστικότητα των µονοκλωνικών αντισωµάτων έναντι του Torpedo υποδοχέα ελέγθησαν, χρησιµοποιώντας 0,5 fmoles διαλυτοποιηµένο Torpedo υποδοχέα από µεµβράνες του ηλεκτρικού οργάνου του χονδριχθύος σηµασµένα ραδιενεργά µε 125 I-α-bgtx ( cpm). Έπειτα από επώαση h στους 4 0 C, στα υπό εξέταση δείγµατα, τα ανοσοσυµπλέγµατα κατακρηµνίστηκαν µε αντί-αρουραιίσιο ορό γ-σφαιρινών και µετά από 2 πλύσεις µε διάλυµα PBS, 0.5% Triton x, ph 7,4. (2,500 g για 15 min) τα δείγµατα µετρήθηκαν σε µετρητή γ-ακτινοβολίας. Ως θετικός µάρτυρας χρησιµοποιήθηκε ένα µονοκλωνικό αντίσωµα έναντι του υποδοχέα αρουραίου και ως αρνητικός µάρτυρας φυσιολογικός ορός αρουραίου. Ο τίτλος των αντισωµάτων έναντι του Torpedo υποδοχέα εκφράστηκε σε moles προσδεµένης 125 I-α-bgtx στο σχηµατισθέν ίζηµα ανά λίτρο ορού και υπολογίσθηκε βάσει της σχέσης ( cpm δείγµατος/ cpm θετικού µάρτυρα) * 0,5 fmoles/όγκο του δείγµατος ). Β.13. Κατακρήµνιση IgG, IgA και IgΜ ανοσοσφαιρινών µε 40% κορεσµένο (NH4) 2 SO4. Το δείγµα του ορού που προορίζεται για καθίζηση αραιώνεται σε ίσο όγκο (V) PBS µε αργή µαγνητική ανάδευση σε θρυµµατισµένο πάγο. Συγκεκριµένος όγκος διαλύµατος (x) του κορεσµένου (NH4) 2 SO 4 προστίθεται σταδιακά στον αραιωµένο ορό που βρίσκεται σε συνεχή ανάδευση µε βάση την εξίσωση: x/x+2v=40/100. Το διάλυµα παραµένει για 10 min. στους 4 0 C και φυγοκεντρείται για min. σε g στους 4 0 C. Το σχηµατισθέν ίζηµα επαναδιαλύεται σε όγκο V 40% (NH4) 2 SO 4. Φυγοκεντρείται όπως προηγουµένως. Το ίζηµα επαναδιαλύεται σε PBS, όγκου ίσου προς το ¼ του αρχικού όγκου V. Τοποθετείται σε µεµβράνη διαπίδυσης σε PBS και εάν ο όγκος ξεπερνά τα 2,5 ml ακολουθεί συµπύκνωση µε πολυαιθυλογλυκόλη Β.14. Aνοσοποίηση αρουραίων. Β Ενεργητική ανοσοποίηση αρουραίων µε Torpedo californica. 60

61 Θηλυκοί αρουραίοι του υποείδους Lewis 6-8 εβδοµάδων ανοσοποιήθηκαν µε µg Torpedo υποδοχέα τα οποία είχαν αναµιχθεί µε πλήρες ανοσοενισχυτικό (complete Freud adjuvant) µε σκοπό την επαγωγή πειραµατικής µυασθένειας. Η ανοσοποίηση έλαβε χώρα υποδορίως και µε την πάροδο 30 ηµερών έγινε επαναληπτική ανοσοποίηση µε µg αναµιγµένα µε µη πλήρες ανοσοενισχυτικό (incomplete Freud adjuvant). Β Aνοσοποίηση αρουραίων, µέσω παθητικής µεταφοράς ανθρώπινων αντισωµάτων. Οροί 3 µυασθενικών ασθενών, κεκαθαρµένοι οροί αυτών των ασθενών (τους είχαν αφαιρεθεί τα αντισώµατα έναντι διαφόρων υποµονάδων του AChR) και διάλυµα καθαρών αντισωµάτων (έναντι των διαφόρων υποµονάδων του AChR), χορηγήθηκαν ενδοπεριτοναϊκά σε αρουραίους 3-4 εβδοµάδων για επαγωγή EAMG και µελέτη της δράσης τους. Οι χορηγούµενοι όγκοι των ορών όταν ξεπερνούσαν τα 2,5 ml oι σφαιρίνες κατακρηµνίζονταν και συµπυκνώνονταν µε 40% κορεσµένο (NH 4 ) 2 SO 4. Περεταίρω συµπύκνωση, όπου απαιτείτο, των κατακρηµνισµένων σφαιρινών ελάµβανε χώρα σε µεµβράνη διαπίδυσης µε τη χρήση πολυαίθυλογλυκόλης. Η εκτίµηση της δράσης των ορών και των παραγώγων τους στα ζώα έγινε µε βάση τη µεταβολή του βάρους τους στις 24 h και 48 h µετά την χορήγηση και µε βάση την κλινική τους εικόνα. Η κλινική εικόνα των ζώων εκτιµήθηκε ως προς την ικανότητά τους να στηρίζονται, να κρέµονται και να κινούνται σε µεταλλική σχάρα σύµφωνα µε την παρακάτω κλίµακα: 0, κανένα κλινικό σύµπτωµα 1, πρώτα σηµάδια µειωµένης στήριξης, µετά από λίγες δοκιµές 2, µερική παράλυση πίσω άκρων 3, ετοιµοθάνατο 4, νεκρό. Β.15. Ποσοτικοποίηση υποδοχέων των µυών των οπίσθιων άκρων. Μετά την θανάτωση των ζώων, τόσο στα πειράµατα ενεργητικής, όσο και στα πειράµατα παθητικής ανοσοποίησης, οι µύες των πίσω άκρων αφαιρέθηκαν, µετρήθηκε το βάρος τους και κονιορτοποιήθηκαν. Ακολούθως ξεπλύθηκαν δύο φορές σε διπλάσιο όγκο (ml) σε σχέση µε το βάρος τους (gr) σε διάλυµα: 0,1 Μ NaCl - 0,01 M Na 2 HPO 4-0,01 M EDTA - 0,01 M EGTA - 0,001 M PMSF - 0,01 M ιοδοακεταµίδιο - 0,05% NaN 3 5 U/ml απροτινίνη και 0,5 mg/ml πεπστατίνη pη 7,4 και το σχηµατιθέν ίζηµα διαλυτοποιήθηκε σε ίσο όγκο (ml) σε σχέση µε το βάρος τους (g) σε PBS Triton x-100 2% pη 7,4 και επωάστηκε για 24 h στους 4 0 C. Με το πέρας των 24 h τα δείγµατα 61

62 φυγοκεντρήθηκαν (sorvall, ss34, rpm, 30 min, 4 0 C) για αποµάκρυνση των αδιαλυτοποίητων συστατικών των µυών. Η συγκέντρωση του υποδοχέα υπολογίσθηκε, εν συντοµία ως εξής: 10 µl από τους διαλυτοποιηµένους µύες σηµάνθηκαν ραδιενεργά µε περίσσια 125 I-α-bgtx ( cpm) και κατακρηµνίστηκαν µε περίσσια µείγµατος µονοκλωνικών αντισωµάτων 192, 198, 195. Ως αρνητικός µάρτυρας χρησιµοποιήθηκε το µονοκλωνικό αντίσωµα 25 το οποίο δεν προσδένεται στον υποδοχέα αρουραίου. Η συγκέντρωση των υποδοχέων σε κάθε µυ, του κάθε ζώου εκφράστηκε ως ποσοστό, των κρούσεων ανά λεπτό που µετρήθηκαν στα 10 µl εκχυλίσµατος, προς τις κρούσεις ανά λεπτό που µετρήθηκαν στα 10 µl διαλυτοποιήµατος από µύες µη ανοσοποιηµένων ζώων επί 100%. 62

63 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 63

64 Α. Καταστολή ενεργητικής EAMG σε αρουραίους µε χορήγηση ανοσοσυµπλόκων. Στα πλαίσια της παρούσης εργασίας έλαβαν χώρα 4 κύκλοι πειραµάτων. Σκοπός των πειραµάτων αυτών είναι η εξακρίβωση της δυνατότητας των συµπλόκων αποτελούµενα από Torpedo AChR και µονοκλωνικά αντισώµατα έναντι του υποδοχέα Torpedo να καταστέλουν την πειραµατική µυασθένεια που επάγεται σε αρουραίους µε ανοσοποίηση AChR Torpedo. Η πειραµατική µυασθένεια στους αρουραίους, που επάγεται µετά από ανοσοποίηση µε AChR Torpedo εµφανίζει µια οξεία φάση συνήθως µία εβδοµάδα µετά την αρχική ανοσοποίηση και µία χρόνια φάση της ασθένειας σε χρονικό διάστηµα τεσσάρων εβδοµάδων µετά την αρχική ανοσοποίηση και αφού έχει προηγηθεί µία ακόµη επαναληπτική ανοσοποίηση. Η χορήγηση των συµπλόκων αρχικά έγινε µε δύο τρόπους (ενδοφλεβίως και υποδορίως) για να εξακριβωθεί ο βέλτιστος τρόπος δράσης των συµπλόκων. Το σύµπλοκο αποτελείτο, είτε από ολόκληρο Torpedo AChR και διάφορα µονοκλωνικά αντισώµατα, έναντι αυτού, είτε από το παραπάνω σύµπλοκο διασυνδεµένο διασταυρωτά µε γλουταραλδεϋδη ώστε να αποφευχθεί η επεξεργασία του από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα του οργανισµού του αρουραίου. Στους τέσσερις πειραµατικούς κύκλους που πραγµατοποιήθηκαν, αρουραίοι 6-8 εβδοµάδων ανοσοποιήθηκαν µε Τorpedo AChR και τους χορηγήθηκε σύµπλοκο Τorpedo AChR µε συγκεκριµένα mabs έναντι αυτού, σε συγκεκριµένα χρονικά διαστήµατα, όπως παρουσιάζεται στo κεφάλαιο Α2 των αποτελεσµάτων. Ο έλεγχος της δράσης των συµπλόκων έγινε µέσω µέτρηση του τίτλου των κυκλοφορούντων αντισωµάτων έναντι του Τorpedo AChR στο αίµα των πειραµατοζώων µε RIA. Στον 2 ο κύκλο πειραµάτων αποµονώθηκαν οι µύες των οπίσθιων άκρων των ζώων και ελέχθηκε το ποσοστό των λειτουργικών υποδοχέων, ως δείκτης της ασθένειας. Κατά τα πειράµατα ενεργητικής EAMG τα ζώα δεν εµφάνισαν παθολογικά συµπτώµατα ορατά σε παρατηρητή, για το λόγο αυτό η εκτίµηση της δράσης των ανοσοσυµπλόκων στηρίχθηκε αποκλειστικά στον τίτλο των κυκλοφορούντων αντισωµάτων έναντι του Τorpedo AChR. Α.1. Καθαρισµός µονοκλωνικών αντισωµάτων 198 και 6 ύο από τα µονοκλωνικά αντισώµατα (mab198 και mab6) που χρησιµοποιήθηκαν για την παρασκευή του συµπλόκου για καταστολή της πειραµατικής µυασθένειας στους αρουραίους αποµονώθηκαν µε τη βοήθεια στήλης χρωµατογραφίας DEAE (βλέπε Μέθοδοι) από το θρεπτικό υλικό στο οποίο λαµβάνονται, από τις 64

65 καλλιέργειες των υβριδωµάτων. Στις εικόνες 11 και 12 φαίνεται η ανάλυση δειγµάτων των mab198 και mab6 που χρησιµοποιήθηκαν για το σχηµατισµό του συµπλόκου µετά τον καθαρισµό σε SDS-PAGE 15% κατά βάρος ακρυλαµιδίου. Το mab198 όπως φαίνεται και από το πήκτωµα ακρυλαµιδίου δεν έχει προσδεθεί στη στήλη και έχει εκλουσθεί στο Flow through, ενώ το mab6 εκλούσθηκε σε διαδοχικά κλάσµατα του διαλύµατος συγκέντρωσης άλατος (Gradient). Για να επιβεβαιωθεί το γεγονός αυτό τα κλάσµατα που εκλούσθηκαν από τη στήλη καθαρισµού του mab198 ελέγθηκαν µε RIA και πιστοποιήθηκε η ύπαρξή τους στο Flow through (τα δεδοµένα δεν παρουσιάζονται). Η συγκέντρωση των µονοκλωνικών αντισωµάτων mab198 και mab6 µε βάση το πήκτωµα και την οπτική τους απορρόφηση στα 280 nm και βρέθηκε 0,56 mg/ml και 10 mg/ml αντίστοιχα. M mab 198 M 55kDa 24kDa Flow through Gradient Εικόνα 11. Ανάλυση σε SDS-PAGE των προϊόντων του καθαρισµού του mab198 µετά από καθαρισµό σε στήλη χρωµατογραφίας DEAE. Στην πηκτή παρατηρούµε τις βαριές και ελαφριές αλυσίδες του mab198 που εντοπίζονται σε µοριακά βάρη 50kDa και 25kDa αντίστοιχα. Μ: πρωτεϊνικοί µάρτυρες. 65

66 M m A b 6 M 55kDa 24kDa Gradient Εικόνα 12. Ανάλυση σε SDS-PAGE των προϊόντων του καθαρισµού του mab6 µε στήλη χρωµατογραφίας DEAE. Μ: πρωτεϊνικοί µάρτυρες.. 66

67 Α.2. Πειράµατα καταστολής ενεργητικής EAMG. 1 ος κύκλος Ο πρώτος κύκλος πειραµάτων περιλαµβάνει πέντε οµάδες αρουραίων που παρουσιάζονται παρακάτω. Οµάδα Ι: Αρνητικοί µάρτυρες (2 ζώα) Οι αρουραίοι της οµάδος αυτής ανοσοποιήθηκαν µε διάλυµα PBS και ανοσοενισχυτικό complete Freud adjuvant και έγινε αναµνηστική ανοσοπoίηση µε διάλυµα PBS και ανοσοενισχυτικό incomplete Freud adjuvant. Οµάδα ΙΙ: Θετικοί µάρτυρες (3 ζώα) Οι αρουραίοι της οµάδας αυτής ανοσοποιήθηκαν µε 25 µg υποδοχέα Torpedo παρουσία ανοσοενισχυτικού complete Freud adjuvant και έγινε αναµνηστική ανοσοπόιηση µε 17,5 µg υποδοχέα Torpedo και ανοσοενισχυτικό incomplete Freud adjuvant. Οµάδα ΙΙΙ: (4 ζώα) Μη ανοσοποιηµένοι αρουραίοι στους οποίους χορηγήθηκε το σύµπλοκο, διασυνδεµένο διασταυρωτά µε γλουταραλδεϋδη, ενδοφλέβια για έλεγχο της ανοσογονικότητάς του. Οµάδα ΙV: (3 ζώα) Οι αρουραίοι της οµάδας αυτής ανοσοποιήθηκαν µε 25 µg υποδοχέα Torpedo παρουσία ανοσοενισχυτικού complete Freud adjuvant και τους χορηγήθηκε το σύµπλοκο, διασυνδεµένο διασταυρωτά µε γλουταραλδεϋδη, υποδορίως σε συγκεκριµένα χρονικά διαστήµατα. Στην οµάδα αυτή έγινε αναµνηστική ανοσοπόιηση µε 17,5 µg υποδοχέα Torpedo παρουσία ανοσοενισχυτικού incomplete Freud adjuvant. Οµάδα V: (3 ζώα) Οι αρουραίοι της οµάδας αυτής ανοσοποιήθηκαν µε 25µg υποδοχέα Torpedo παρουσία ανοσοενισχυτικού complete Freud adjuvant και τους χορηγήθηκε το σύµπλοκο, διασυνδεµένο διασταυρωτά µε γλουταραλδεϋδη, ενδοφλεβίως σε συγκεκριµένα χρονικά διαστήµατα. Στην οµάδα αυτή έγινε αναµνηστική ανοσοπόιηση µε 17,5 µg υποδοχέα Torpedo παρουσία ανοσοενισχυτικού incomplete Freud adjuvant. 67

68 Τα χορηγηθέντα σύµπλοκα ανά ζώο αποτελούνταν από 40 µg υποδοχέα Torpedo και 80 µg των mabs 198, 124 και 35 σε ίσες ποσότητες µεταξύ τους. Τα χρονικά διαστήµατα στα οποία έλαβαν χώρα οι ανοσοποιήσεις, οι χορηγήσεις των συµπλόκων και οι αιµοληψίες παρουσιάζονται στον πίνακα 2. Ηµέρα 0 Hµέρα 7 Οµάδα Ι Οµάδα ΙΙ Οµάδα ΙΙΙ Ανοσοποίηση PBS µε υποδοχέα Torpedo Χορήγηση συµπλόκων Αιµοληψία Ι Αιµοληψία Ι Αιµοληψία Ι Οµάδα ΙV Ανοσοποίηση µε υποδοχέα Torpedo Χορήγηση συµπλόκων Αιµοληψία Ι Οµάδα V Ανοσοποίηση µε υποδοχέα Torpedo Χορήγηση συµπλόκων Αιµοληψία Ι Hµέρα 21 Αιµοληψία ΙΙ Αιµοληψία ΙΙ Αιµοληψία ΙΙ Αιµοληψία ΙΙ Αιµοληψία ΙΙ Ηµέρα 28 Αιµοληψία ΙΙΙ Αιµοληψία ΙΙΙ Αιµοληψία ΙΙΙ Αιµοληψία ΙΙΙ Αιµοληψία ΙΙΙ Ηµέρα 29 Χορήγηση συµπλόκων Χορήγηση συµπλόκων Χορήγηση συµπλόκων Ηµέρα 33 Αναµνηστική ανοσοποίηση µε PBS Αναµνηστική ανοσοποίηση µε υποδοχέα Torpedo Αναµνηστική ανοσοποίηση µε υποδοχέα Torpedo Αναµνηστική ανοσοποίηση µε υποδοχέα Torpedo Ηµέρα 35 Αιµοληψία ΙV Αιµοληψία ΙV Αιµοληψία ΙV Αιµοληψία ΙV Αιµοληψία ΙV Ηµέρα 42 Αιµοληψία V Αιµοληψία V Αιµοληψία V Αιµοληψία V Αιµοληψία V Ηµέρα 49 Αιµοληψία VI Αιµοληψία VI Αιµοληψία VI Αιµοληψία VI Αιµοληψία VI Πίνακας 2. Ανοσοποιήσεις, χορηγήσεις των συµπλόκων και αιµοληψίες στις οµάδες των αρουραίων του 1 ου κύκλου πειραµάτων. Η χορήγηση των συµπλόκων έγινε την ηµέρα 7 στην οποία ξεκινά η οξεία φάση των συµπτωµάτων των ζώων και την 4 εβδοµάδα από την αρχική ανοσοποίηση στην οποία συνήθως αρχίζει η χρόνια φάση της ασθένειας. Η συλλογή των ορών από τα πειραµατόζωα έγινε όπως φαίνεται στον πίνακα 2 ανά εβδοµάδα. Οι συλεγχθέντες οροί των έξι αιµοληψιών ελεγχθήκαν µε ραδιοανοσολογικό προσδιορισµό και οι τίτλοι των αντισωµάτων τους έναντι του υποδοχέα Torpedo παρουσιάζονται στην εικόνα 13. Τα επίπεδα αντισωµάτων έναντι του υποδοχέα Torpedo στις ανοσοποιηµένες οµάδες που χορηγήθηκε το σύµπλοκο κυµαίνονται σε παραπλήσια επίπεδα µε αυτά της οµάδας των 68

69 θετικών µαρτύρων (οµάδα ΙΙ). Μετά από στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων, δεν προκύπτει στατιστικά σηµαντική διαφορά στον τίτλο των αντισωµάτων των οµάδων ΙΙΙ, ΙV και V (stundent-t test, p>0,05), γεγονός που υποδηλώνει ότι στις συνθήκες αυτού του κύκλου το σύµπλοκο δεν δρά κατασταλτικά στα πειραµατόζωα. Η οµάδα ΙΙΙ (µη ανοσοποιηµένα ζώα που τους χορηγήθηκε το σύµπλοκο) εµφανίζει πολύ µικρό τίτλο αντισωµάτων έναντι του υποδοχέα Torpedo, γεγονός που οδηγεί στο συµπέρασµα ότι το σύµπλοκο δεν ανοσοποιεί τα ζώα. 500 Τίτλος αντισω µάτω ν (nm ) οµάδα ΙV οµάδα ΙI οµάδα V Ηµέρες οµάδα III Εικόνα 13. Μέσες τιµές του τίτλου των αντισωµάτων των ορών των διαφόρων οµάδων του 1 ου κύκλου πειραµάτων εκφρασµένες σε nmoles/lt προσδεδεµένης 125 I-α-bgtx, ελεγµένοι µε Torpedo AChR. Η οµάδα Ι δεν εµφανίζει αντισώµατα ως προς τον υποδοχέα και δεν παρουσιάζεται στο γράφηµα. Στην εικόνα παρουσιάζεται και το τυπικό σφάλµα του µέσου όρου των οµάδων II, IV, V. 2 ος κύκλος Ο 2ος κύκλος πειραµάτων περιλάµβανε πέντε οµάδες αρουραίων που παρουσιάζονται παρακάτω. Οµάδα Ι: Αρνητικοί µάρτυρες (2 ζώα) Οι αρουραίοι της οµάδος αυτής ανοσοποιήθηκαν µε διάλυµα PBS και ανοσοενισχυτικό complete Freud adjuvant και έγινε αναµνηστική ανοσοπόιηση µε διάλυµα PBS και ανοσοενισχυτικό incomplete Freud adjuvant. Οµάδα ΙΙ: Θετικοί µάρτυρες (4 ζώα) 69

70 Οι αρουραίοι της οµάδας αυτής ανοσοποιήθηκαν µε 30 µg υποδοχέα Torpedo παρουσία ανοσοενισχυτικού complete Freud adjuvant και έγινε αναµνηστική ανοσοπόιηση µε 30 µg υποδοχέα Torpedo και ανοσοενισχυτικό incomplete Freud adjuvant. Οµάδα ΙΙΙ: (3 ζώα) Μη ανοσοποιηµένοι αρουραίοι στους οποίους χορηγήθηκε το σύµπλοκο, διασυνδεµένο διασταυρωτά µε γλουταραλδεϋδη, ενδοφλέβια για έλεγχο της ανοσογονικότητάς του. Οµάδα ΙV: (4 ζώα) Οι αρουραίοι της οµάδας αυτής ανοσοποιήθηκαν µε 30 µg υποδοχέα Torpedo παρουσία ανοσοενισχυτικού complete Freud adjuvant και τους χορηγήθηκε το σύµπλοκο διασυνδεµένο διασταυρωτά µε γλουταραλδεϋδη, ενδοφλέβια σε συγκεκριµένα χρονικά διαστήµατα. Στην οµάδα αυτή έγινε αναµνηστική ανοσοπόιηση µε 30 µg υποδοχέα Torpedo σε ανοσοενισχυτικό incomplete Freud adjuvant. Οµάδα V: (4 ζώα) Οι αρουραίοι της οµάδας αυτής ανοσοποιήθηκαν µε 30 µg υποδοχέα Torpedo παρουσία ανοσοενισχυτικού complete Freud adjuvant και τους χορηγήθηκε το σύµπλοκο, διασυνδεµένο διασταυρωτά µε γλουταραλδεϋδη, ενδοφλεβίως σε συγκεκριµένα χρονικά διαστήµατα διαφορετικά της οµάδος ΙV. Στην οµάδα αυτή έγινε αναµνηστική ανοσοπόιηση µε 30 µg υποδοχέα Torpedo σε ανοσοενισχυτικό incomplete Freud adjuvant. Οι οµάδες των αρουραίων ανοσοποιήθηκαν την ηµέρα 0 µε 30 µg υποδοχέα Torpedo και ανοσοενισχυτικό complete Freud adjuvant και η επαναληπτική ανοσοποίηση έλαβε χώρα την ηµέρα 27 µε 30 µg πάλι υποδοχέα Torpedo µε ανοσοενισχυτικό incomplete Freud adjuvant, λόγω του γεγονότος ότι η αρχική ανοσοποίηση δεν προκάλεσε την παραγωγή αυξηµένης ποσότητας αντισωµάτων από τα Β-λεµφοκύτταρα των ζώων. Στο τέλος του κύκλου έγινε αποµόνωση των µυών των οπίσθιων άκρων των ζώων, εκχύλιση των υποδοχέων τους και έλεγχος της λειτουργικότητάς τους µε RIA. Οι χρονικές στιγµές ανοσοποίησης, χορήγησης των συµπλόκων, αιµοληψίας και αποµόνωσης των οπίσθιων άκρων των αρουραίων παρουσιάζονται στον πίνακα 3. Το χορηγηθέν σύµπλοκο ανά ζώο αποτελείτο από 40 µg υποδοχέα Torpedo και 80 µg των mabs 198, 70

71 124 και 64 σε ίσες ποσότητες µεταξύ τους. Στην οµάδα IV έγινε χορήγηση του συµπλόκου αρχικά την ηµέρα 3 πριν την οξεία φάση της ασθένειας, ενώ στην οµάδα V την ηµέρα 7 στην οποία αρχίζει η οξεία φάση της ασθένειας. Ακολούθησε χορήγηση συµπλόκου στη οµάδα IV την ηµέρα 10 κατά την οποία τα ζώα βρίσκονται στην οξεία φάση και ακολούθησε χορήγηση µετά από 2 εβδοµάδες. Η τελευταία χορήγηση έγινε την ηµέρα 42, την 2 η δηλαδή εβδοµάδα µετά την είσοδο των ζώων στη χρόνια φάση της ασθένειας (ηµέρα 30). Ηµέρα 0 Hµέρα 3 Οµάδα Ι Οµάδα ΙΙ Οµάδα ΙΙΙ Ανοσοποίηση Ανοσοποίηση µε υποδοχέα µε PBS Torpedo Χορήγηση συµπλόκων Οµάδα ΙV Ανοσοποίηση µε υποδοχέα Torpedo Χορήγηση συµπλόκων Οµάδα V Ανοσοποίηση µε υποδοχέα Torpedo Hµέρα 5 Αιµοληψία Ι Αιµοληψία Ι Αιµοληψία Ι Αιµοληψία Ι Αιµοληψία Ι Hµέρα 7 Χορήγηση συµπλόκων Hµέρα 10 Χορήγηση συµπλόκων Χορήγηση συµπλόκων Ηµέρα 11 Αιµοληψία ΙΙ Αιµοληψία ΙΙ Αιµοληψία ΙΙ Αιµοληψία ΙΙ Αιµοληψία ΙΙ Ηµέρα 19 Αιµοληψία ΙΙΙ Αιµοληψία ΙΙΙ Αιµοληψία ΙΙΙ Αιµοληψία ΙΙΙ Αιµοληψία ΙΙΙ Ηµέρα 21 Χορήγηση συµπλόκων Ηµέρα 24 Χορήγηση συµπλόκων Χορήγηση συµπλόκων Ηµέρα 27 Αναµνηστική ανοσοποίηση µε PBS, Αιµοληψία IV Αναµνηστική ανοσοποίηση µε υποδοχέα Torpedo, Αιµοληψία IV Αναµνηστική ανοσοποίηση µε υποδοχέα Torpedo, Αιµοληψία IV Αναµνηστική ανοσοποίηση µε υποδοχέα Torpedo, Αιµοληψία IV Ηµέρα 33 Αιµοληψία V Αιµοληψία V Αιµοληψία V Αιµοληψία V Αιµοληψία V Ηµέρα 40 Αιµοληψία VI Αιµοληψία VI Αιµοληψία VI Αιµοληψία VI Αιµοληψία VI Ηµέρα 42 Χορήγηση συµπλόκων Χορήγηση συµπλόκων Ηµέρα Χορήγηση 71

72 50 συµπλόκων Ηµέρα 53 Αιµοληψία VII Αιµοληψία VII Αιµοληψία VII Αιµοληψία VII Αιµοληψία VII Ηµέρα 62 Αιµοληψία VIII Ηµέρα 103 Αιµοληψία IX, Αποµόνωση µυών Αιµοληψία VIII Αιµοληψία IX, Αποµόνωση µυών Αιµοληψία VIII Αιµοληψία VIII Αιµοληψία VIII Αιµοληψία IX, Αποµόνωση µυών Αιµοληψία IX, Αποµόνωση µυών Αιµοληψία IX, Αποµόνωση µυών Πίνακας 3. Ανοσοποιήσεις, χορηγήσεις των συµπλόκων και αιµοληψίες στις οµάδες των αρουραίων του 2 ου κύκλου πειραµάτων. Οι οροί που συλλέχθηκαν στις εννέα αιµοληψίες αυτού του κύκλου, ελέχθηκαν ως προς τον τίτλο των αντισωµάτων τους έναντι του υποδοχέα Torpedo µε RIA. Τα αποτελέσµατα παρουσιάζονται στην εικόνα Τίτλος αντισω µάτω ν (nm ) οµάδα ΙI οµάδα V οµάδα ΙV οµάδα III Ηµέρες Εικόνα 14. Μέσες τιµές του τίτλου των αντισωµάτων των ορών των διαφόρων οµάδων του 2 ου κύκλου πειραµάτων εκφρασµένες σε nmoles/lt προσδεδεµένης 125 I-α-bgtx, ελεγµένοι µε υποδοχέα Torpedo. Η οµάδα Ι δεν εµφανίζει αντισώµατα ως προς τον υποδοχέα και δεν παρουσιάζεται στο γράφηµα. Στην εικόνα παρουσιάζεται και το τυπικό σφάλµα του µέσου όρου των οµάδων II, IV, V. Η οµάδα των θετικών µαρτύρων (οµάδα ΙΙ) την ηµέρα 103 που θανατώθηκαν τα ζώα εµφανίζει υψηλότερο τίτλο αντισωµάτων, µε στατιστικά σηµαντική διαφορά (stundent-t test, p>0,05) σε σχέση µε τις υπό εξέταση οµάδες (οµάδες ΙV, V). Χαρακτηριστικά, ο τίτλος των οµάδων ΙV, V έιναι αντίστοιχα 302 nm και 363 nm µε το τίτλο των 72

73 αντισωµάτων της οµάδας των θετικών µαρτύρων να είναι 747 nm. Η οµάδα ΙΙΙ ανοσοποιεί των οργανισµό γεγονός που δηλώνει ότι το σύµπλοκο στον κύκλο αυτό είναι ανοσογόνο για τον οργανισµό των αρουραίων. Με τη θανάτωση των ζώων, όπως φαίνεται και από τον πίνακα έγινε αποµόνωση των µυών των οπίσθιων άκρων των ζώων των οµάδων και εκχύλιση των υποδοχέων τους. Οι λειτουργικοί υποδοχείς των µυών ελέχθησαν µε RIA (βλέπε µεθόδους). Στην εικόνα 15 παρουσιάζονται οι µέσες τιµές των λειτουργικών υποδοχέων των µυών των αρουραίων κάθε οµάδας ως ποσοστό % των λειτουργικών υποδοχέων των µυών της οµάδας Ι (φυσιολογικού αρουραίοι). 100 % ποσοστό λειτουργικών υποδοχέων οµάδα Ι οµάδα ΙΙ οµάδα ΙΙΙ οµάδα ΙV οµάδα V Εικόνα 15. Μέση τιµή αριθµού λειτουργικών υποδοχέων των µυών των αρουραίων της κάθε οµάδας, εκφρασµένα ως ποσοστό % των λειτουργικών υποδοχέων της οµάδας Ι. Στην εικόνα παρουσιάζεται και το τυπικό σφάλµα του µέσου όρου των οµάδων. Οι οµάδες ΙV και V εµφανίζουν µεγαλύτερο αριθµό λειτουργικών υποδοχέων στους µύες των οπίσθιων άκρων (43,6% και 41,6% αντίστοιχα) από την οµάδα των θετικών µαρτύρων (οµάδα ΙΙ- 34%), χωρίς όµως η διαφορά να είναι στατιστικά σηµαντική. Η οµάδα ΙΙΙ εµφανίζει και αυτή µείωση των υποδοχέων σε ποσοστό περίπου 55,5%, λόγω του ότι στα ζώα της οµάδας έχουν παραχθεί αντισώµατα έναντι του υποδοχέα Torpedo ποσοστό των οποίων προσδένεται στους υποδοχεις των ζώων προκαλώντας την καταστροφή τους. 73

74 3 ος κύκλος Ο κύκλος αυτός περιλαµβάνει έξι οµάδες αρουραίων που παρουσιάζονται παρακάτω. Στον κύκλο αυτό υπάρχουν δύο οµάδες στις οποίες έγινε χορήγηση του συµπλόκου σε διαφορετικούς χρόνους µεταξύ των 2 οµάδων και µία επιπλέον οµάδα στην οποία χορηγήθηκε ίδια ποσότητα του Torpedo υποδοχέα χωρίς mabs. Στόχος, στην τελευταία οµάδα, είναι στο χορηγηθέν σύµπλοκο να προσδεθούν in vivo τα αντισώµατα που θα παραχθούν από τα Β-λεµφοκύτταρα των ζώων έναντι του υποδοχέα Torpedo. Το σύµπλοκο αυτό αποτελείται από 40 µg Torpedo συνδεδεµένου σταυρωτά µε γλουταραλδεϋδη 2%. Οι οµάδες του κύκλου αυτού είναι: Οµάδα Ι: Αρνητικοί µάρτυρες (2 ζώα) Οι αρουραίοι της οµάδος αυτής ανοσοποιήθηκαν µε διάλυµα PBS και ανοσοενισχυτικό complete Freud adjuvant και έγινε αναµνηστική ανοσοπόιηση µε διάλυµα PBS και ανοσοενισχυτικό incomplete Freud adjuvant. Οµάδα ΙΙ: Θετικοί µάρτυρες (5 ζώα) Οι αρουραίοι της οµάδας αυτής ανοσοποιήθηκαν µε 30 µg υποδοχέα Torpedo παρουσία ανοσοενισχυτικού complete Freud adjuvant και έγινε αναµνηστική ανοσοπόιηση µε 15 µg υποδοχέα Torpedo σε ανοσοενισχυτικό incomplete Freud adjuvant. Οµάδα ΙΙΙ: (5 ζώα) Μη ανοσοποιηµένοι αρουραίοι στους οποίους χορηγήθηκε το σύµπλοκο ενδοφλέβια, διασυνδεµένο διασταυρωτά µε γλουταραλδεϋδη, για έλεγχο της ανοσογονικότητάς του. Οµάδα ΙV: (4 ζώα) Οι αρουραίοι της οµάδας αυτής ανοσοποιήθηκαν µε 30 µg υποδοχέα Torpedo παρουσία ανοσοενισχυτικού complete Freud adjuvant και τους χορηγήθηκε το σύµπλοκο, χωρίς mabs, ενδοφλέβια σε συγκεκριµένα χρονικά διαστήµατα. Στην οµάδα αυτή έγινε αναµνηστική ανοσοπόιηση µε 15 µg υποδοχέα Torpedo σε ανοσοενισχυτικό incomplete Freud adjuvant. Οµάδα V: (4 ζώα) Οι αρουραίοι της οµάδας αυτής ανοσοποιήθηκαν µε 30 µg υποδοχέα Torpedo παρουσία ανοσοενισχυτικού complete Freud adjuvant και τους χορηγήθηκε το σύµπλοκο 74

75 διασυνδεµένο διασταυρωτά µε γλουταραλδεϋδη, ενδοφλέβια σε συγκεκριµένα χρονικά διαστήµατα. Στην οµάδα αυτή έγινε αναµνηστική ανοσοπόιηση µε 15 µgr υποδοχέα Torpedo σε ανοσοενισχυτικό incomplete Freud adjuvant. Οµάδα VΙ: (4 ζώα) Οι αρουραίοι της οµάδας αυτής ανοσοποιήθηκαν µε 30 µg υποδοχέα Torpedo παρουσία ανοσοενισχυτικού complete Freud adjuvant και του χορηγήθηκε το σύµπλοκο ενδοφλεβίως σε συγκεκριµένα χρονικά διαστήµατα διαφορετικά από της οµάδος ΙV. Συγκεκριµένα στην οµάδα αυτή χορηγήθηκε το σύµπλοκο διασυνδεµένο διασταυρωτά µε γλουταραλδεϋδη, πριν την αρχική ανοσοποίηση την ηµέρα -3. Στην οµάδα αυτή έγινε επίσης αναµνηστική ανοσοπόιηση µε 15 µg υποδοχέα Torpedo και ανοσοενισχυτικό incomplete Freud adjuvant. Τα χορηγηθέντα σύµπλοκα ανά ζώο αποτελούνταν από 40 µg υποδοχέα Torpedo και 80 µg των mabs 198, 124 και 64 σε ίσες ποσότητες µεταξύ τους, εκτός από την οµάδα IV στην οποία το σύµπλοκο δεν περιείχε mab. Τα χρονικά διαστήµατα στα οποία έλαβαν χώρα οι ανοσοποιήσεις, οι χορηγήσεις των συµπλόκων και οι αιµοληψίες παρουσιάζονται στον πίνακα 4. 75

76 Ηµέρα -3 Οµάδα Ι Οµάδα ΙΙ Οµάδα ΙΙΙ Οµάδα ΙV Οµάδα V Χορήγηση συµπλόκων Οµάδα VI Hµέρα 0 PBS Ανοσοπ. µε υποδοχέα Torpedo Ανοσοπ. µε υποδοχέα Torpedo Ανοσοπ. µε υποδοχέα Torpedo Ανοσοπ. µε υποδοχέα Torpedo Hµέρα 3 Χορήγηση συµπλόκων Χορήγηση συµπλόκων Χορήγηση συµπλόκων Χορήγηση συµπλόκων Ηµέρα 8 Αιµοληψία Ι Αιµοληψία Ι Αιµοληψία Ι Αιµοληψία Ι Αιµοληψία Ι Αιµοληψία Ι Ηµέρα 9 Χορήγηση συµπλόκων Χορήγηση συµπλόκων Χορήγηση συµπλόκων Χορήγηση συµπλόκων Ηµέρα 16 Αιµοληψία ΙΙ Αιµοληψία ΙΙ Αιµοληψία ΙΙ Αιµοληψία ΙΙ Αιµοληψία ΙΙ Αιµοληψία ΙΙ Ηµέρα 24 Χορήγηση συµπλόκων Χορήγηση συµπλόκων Χορήγηση συµπλόκων Χορήγηση συµπλόκων Ηµέρα 30 Αιµοληψία III Αιµοληψία III Αιµοληψία III Αιµοληψία III Αιµοληψία III Αιµοληψία III Ηµέρα 31 Αναµνηστικ ανοσοπ. Αναµνηστικ ανοσοπ. Αναµνηστικ ανοσοπ. Αναµνηστικ ανοσοπ. Ηµέρα 36 Αιµοληψία ΙV Αιµοληψία ΙV Αιµοληψία ΙV Αιµοληψία ΙV Αιµοληψία ΙV Αιµοληψία ΙV Πίνακας 4. Ανοσοποιήσεις, χορηγήσεις των συµπλόκων και αιµοληψίες στις οµάδες των αρουραίων του 3 ου κύκλου πειραµάτων. Στους ορούς που συλλέχθηκαν έγινε έλεγχος της ύπαρξής αντισωµάτων έναντι του υποδοχέα Torpedo µε RIA. Ο τίτλος των αντισωµάτων παρουσιάζεται στην εικόνα

77 Τ ίτλο ς α ντισ ω µ ά τω ν (n M ) οµάδα ΙV οµάδα ΙI οµάδα VI οµάδα V οµάδα III Ηµέρες Εικόνα 16. Μέσες τιµές του τίτλου των αντισωµάτων των ορών των διαφόρων οµάδων του 3 ου κύκλου πειραµάτων εκφρασµένες σε nmoles/lt προσδεδεµένης 125 Ι-α-bgtx, ελεγµένοι µε υποδοχέα Torpedo. Η οµάδα Ι δεν εµφανίζει αντισώµατα ως προς τον υποδοχέα και δεν παρουσιάζεται στο γράφηµα. Στην εικόνα παρουσιάζεται και το τυπικό σφάλµα του µέσου όρου των οµάδων II, IV, V. Στα αποτελέσµατα αυτού του κύκλου η οµάδα των θετικών µαρτύρων (οµάδα ΙΙ) εµφανίζει αισθητά µικρότερο τίτλο αντισωµάτων συγκριτικά µε τις οµάδες στις οποίες χορηγήθηκε το σύµπλοκο. Το σύµπλοκο στα πειραµατόζωα αυτού και αυτού του κύκλου δεν δρα ενισχυτικά αν και η ανοσοποίηση στα ζώα, όπως πιστοποιείται από τους τίτλους των ζώων, δεν έχει πετύχει. Για το λόγο αυτό ο κύκλος διεκόπει την 36 η ηµέρα. 4 ος κύκλος Ο κύκλος αυτός πειραµάτων περιλαµβάνει πέντε οµάδες αρουραίων που παρουσιάζονται παρακάτω. Στον κύκλο αυτό υπάρχουν δύο νέες οµάδες (οµάδες IV,V) στις οποίες χορηγήθηκε στην µεν οµάδα IV το σύµπλοκο χωρίς σταυρωτή διασύνδεση µε γλουταραλδεϋδη, στη δε οµάδα V χορηγήθηκε συσσωµάτωµα mabs χωρίς το αντιγόνο, χωρίς δηλαδή υποδοχέα Torpedo. Συγκεκριµένα τα συσσωµάτωµα που αποτελούνταν από τα mabs 198, 124 και 6 σε ίσες ποσότητες το καθένα (20 µg το καθένα), θερµάνθηκαν σε θερµοκρασία 56 0 C για 30 λεπτά. Στη θερµοκρασία αυτή τα 77

78 αντισώµατα συσσωµατώνονται και τα σχηµατιθέντα συσσωµατώµατα χορηγήθηκαν κατόπιν στα ζώα της οµάδος V. Στόχος είναι τα συσσωµατώµατα αυτά να προκαλέσουν διασύνδεση των FcγRIIB υποδοχέων των ενεργοποιηµένων Β-λεµφοκυττάρων από την ανοσοποίηση των ζώων και να προκαλέσουν απόπτωση στα κύτταρα. Κάθε αρουραίος των οµάδων αυτού του κύκλου ανοσοποιήθηκε µε 30 µg υποδοχέα Torpedo παρουσία ανοσοενισχυτικού complete Freud adjuvant και έγινε αναµνηστική ανοσοποίηση µε 20 µg υποδοχέα Torpedo µε ανοσοενισχυτικό incomplete Freud adjuvant. Τα χορηγηθέντα σύµπλοκα Torpedo- mabs ανά ζώο αποτελούνταν από 40 µg υποδοχέα Torpedo και 60 µg mabs 198, 124 και 6. Οι οµάδες που περιλαµβάνονται σε αυτόν τον κύκλο παρουσιάζονται παρακάτω: Οµάδα Ι: Αρνητικοί µάρτυρες (2 ζώα) Οι αρουραίοι της οµάδος αυτής ανοσοποιήθηκαν µε διάλυµα PBS και ανοσοενισχυτικό complete Freud adjuvant και έγινε αναµνηστική ανοσοπόιηση µε διάλυµα PBS και ανοσοενισχυτικό incomplete Freud adjuvant. Οµάδα ΙΙ: Θετικοί µάρτυρες (4 ζώα) Οι αρουραίοι της οµάδας αυτής ανοσοποιήθηκαν µε 30 µg υποδοχέα Torpedo παρουσία ανοσοενισχυτικού complete Freud adjuvant και έγινε αναµνηστική ανοσοπόιηση µε 20 µg υποδοχέα Torpedo σε ανοσοενισχυτικό incomplete Freud adjuvant. Οµάδα ΙΙΙ: (3 ζώα) Οι αρουραίοι της οµάδας αυτής ανοσοποιήθηκαν µε 30 µgr υποδοχέα Torpedo παρουσία ανοσοενισχυτικού complete Freud adjuvant και τους χορηγήθηκε το σύµπλοκο ενδοφλέβια, διασυνδεµένο διασταυρωτά µε γλουταραλδεϋδη, σε συγκεκριµένα χρονικά διαστήµατα. Στην οµάδα αυτή έγινε αναµνηστική ανοσοπόιηση µε 20 µg υποδοχέα Torpedo σε ανοσοενισχυτικό incomplete Freud adjuvant. Οµάδα ΙV: (3 ζώα) Οι αρουραίοι της οµάδας αυτής ανοσοποιήθηκαν µε 30 µg υποδοχέα Torpedo παρουσία ανοσοενισχυτικού complete Freud adjuvant και τους χορηγήθηκε το σύµπλοκο, χωρίς γλουταραλδεϋδη, ενδοφλέβια σε συγκεκριµένα χρονικά διαστήµατα. Στην οµάδα αυτή 78

79 έγινε αναµνηστική ανοσοπόιηση µε 20 µg υποδοχέα Torpedo σε ανοσοενισχυτικό incomplete Freud adjuvant. Οµάδα V: (4 ζώα) Οι αρουραίοι της οµάδας αυτής ανοσοποιήθηκαν µε 30 µg υποδοχέα Torpedo παρουσία ανοσοενισχυτικού incomplete Freud adjuvant και του χορηγήθηκε το συσσωµάτωµα mabs ενδοφλέβια σε συγκεκριµένα χρονικά διαστήµατα. Στην οµάδα αυτή έγινε αναµνηστική ανοσοπόιηση µε 20 µg υποδοχέα Torpedo σε ανοσοενισχυτικό incomplete Freud adjuvant. Οι χρόνοι των ανοσοποιήσεων, των χορηγήσεων και των αιµοληψιών παρουσιάζονται στον πίνακα 5. Οµάδα Ι Οµάδα ΙΙ Οµάδα ΙΙΙ Οµάδα ΙV Οµάδα V Hµέρα 0 PBS Ανοσοποίηση µε υποδοχέα Torpedo Ανοσοποίηση µε υποδοχέα Torpedo Ανοσοποίηση µε υποδοχέα Torpedo Ανοσοποίηση µε υποδοχέα Torpedo Ηµέρα 7 Χορήγηση συµπλόκων Χορήγηση συµπλόκων Χορήγηση mabs Ηµέρα 13 Αιµοληψία Ι Αιµοληψία Ι Αιµοληψία Ι Αιµοληψία Ι Αιµοληψία Ι Ηµέρα 16 Χορήγηση συµπλόκων Χορήγηση συµπλόκων Χορήγηση mabs Ηµέρα 23 Αιµοληψία ΙI Αιµοληψία ΙΙ Αιµοληψία ΙΙ Αιµοληψία ΙΙ Αιµοληψία ΙΙ Ηµέρα 33 Χορήγηση συµπλόκων Χορήγηση συµπλόκων Χορήγηση mabs Ηµέρα 35 Αναµνηστικ ανοσοπ. Αναµνηστικ ανοσοπ. Αναµνηστικ ανοσοπ. Αναµνηστικ ανοσοπ. Ηµέρα 39 Αιµοληψία ΙII Αιµοληψία ΙII Αιµοληψία ΙII Αιµοληψία ΙII Αιµοληψία ΙII Ηµέρα 53 Αιµοληψία ΙV Αιµοληψία ΙV Αιµοληψία ΙV Αιµοληψία ΙV Αιµοληψία ΙV Πίνακας 5. Ανοσοποιήσεις, χορηγήσεις των συµπλόκων και αιµοληψίες στις οµάδες των αρουραίων του 4 ου κύκλου πειραµάτων. 79

80 Οι χορηγήσεις έγινα την ηµέρα 7 (έναρξη της οξείας φάσης της ασθένειας), η 2 η χορήγηση µία εβδοµάδα µετά και η 3 η χορήγηση την ηµέρα 33, στην αρχή της χρόνια φάση της πειραµατικής µυασθένειας. Στους ορούς που συλλέχθηκαν έγινε έλεγχος της ύπαρξής αντισωµάτων έναντι του υποδοχέα Torpedo µε RIA. Ο τίτλος των αντισωµάτων παρουσιάζεται στη εικόνα Τίτλος αντισω µάτω ν (nm ) οµάδα ΙI οµάδα III οµάδα ΙV οµάδα V Ηµέρες Εικόνα 17. Μέσες τιµες του τίτλου των αντισωµάτων των ορών των διαφόρων οµάδων του 3 ου κύκλου πειραµάτων εκφρασµένες σε nmoles/lt προσδεδεµένης 125 Ι-α-bgtx, ελεγµένοι µε υποδοχέα Torpedo. Η οµάδα Ι δεν εµφανίζει αντισώµατα ως προς τον υποδοχέα και δεν παρουσιάζεται στο γράφηµα. Στην εικόνα παρουσιάζεται και το τυπικό σφάλµα του µέσου όρου των οµάδων II, III, IV και V. Στην εικόνα 17 οι υπό εξέταση οµάδες ΙΙΙ, ΙV και V εµφανίζουν µειωµένο τίτλο αντισωµάτων κυρίως µετα την αναµνηστική ανοσοποίηση, κυρίως την ηµέρα 53 σε σχέση µε την οµάδα ΙΙ. Παρόλα ταύτα στατιστικά σηµαντική διαφορά υπάρχει µεταξύ της οµάδας IV και της οµάδας των θετικών µαρτύρων (οµάδα ΙΙ). Στην οµάδα αυτή χορηγήθηκε το σύµπλοκο υποδοχέα Τorpedo µε µονοκλώνικά αντισώµατα χωρίς να έχει τροποποιηθεί χηµικά µε γλουταραλδεϋδη, γεγονός που δηλώνει µη καταστροφήενδοκυττάρωση του συµπλόκου από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύυταρα των πειραµατοζώων. 80

81 Β. Χαρακτηρισµός της δράσης των αντισωµάτων κατά διαφορετικών υποµονάδων του AChR, από ορούς µυασθενικών, µέσω της ικανότητάς τους να προκαλούν πειραµατική µυασθένεια σε αρουραίους. Τα αντισώµατα που παράγονται κατά του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης στη βαριά µυασθένεια εµφανίζουν µεγάλη ετερογένεια, τόσο σε κάθε µεµονωµένο ασθένη, όσο και µεταξύ των ασθενών. Μελέτες σε πληθυσµούς µυασθενικών έδειξαν ότι υπάρχει µικρή συσχέτιση µεταξύ της βαρύτητας της νόσου και της συγκέντρωσης των αυτοαντισωµάτων στον ορό τους. Η διαπίστωση αυτή οδήγησε στην υπόθεση ότι τα αυτοαντισώµατα ποικίλουν ως προς την ικανότητά τους να προκαλούν µυϊκή αδυναµία. Η αυτοάνοση φύση της ασθένειας έχει πιστοποιηθεί µε έµµεσους τρόπους, όπως µέσω ενεργητικής ανοσοποίησης τρωκτικών και µη, µε ΑChR και επαγωγή των συµπτωµάτων της ασθένειας στα πειραµατόζωα, καθώς επίσης και µε µονοκλωνικά αντισώµατα έναντι του ΑChR. Τέλος έχει επιτευχθεί επαγωγή της νόσου σε πειραµατόζωα µέσω παθητικής µεταφοράς ανθρώπινων ορών. Στη συγκεκριµένη πειραµατική εργασία διερευνήσαµε τη δράση των αποµονωµένων αντισωµάτων έναντι της α-υποµονάδας του ΑChR, από δύο ορούς µυασθενικών καθώς επίσης και τη δράση των ορών αυτών όταν αφαιρέσαµε τα αντί-α αντισώµατα από αυτούς, µέσω της ικανότητάς τους να προκαλούν πειραµατική µυασθένεια, όταν χορηγούνται σε ζώα. Επίσης διερευνήσαµε τη δράση αποµονωµένων αντισωµάτων έναντι της β-υποµονάδας του ΑChR, σε ζώα από έναν τρίτο ορό, καθώς και τον ορό αυτόν όταν αφαιρέσαµε τα αντί-β αντισώµατα. Η αποµόνωση των αντί-α και αντί-β αντισωµάτων πραγµατοποιήθηκε µε τη βοήθεια στηλών χρωµατογραφίας συγγένειας στην οποία η στερεά φάση περιείχε ανασυνδυασµένα τµήµατα των εξωκυτταρικών τµηµάτων του υποδοχέα εκφρασµένα στο βακτήριο E. coli σε ικανοποιητικές ποσότητες. Τα πρωτεϊνικά αυτά τµήµατα προσοµοιάζουν τη φυσική διαµόρφωση του AChR και προσδένουν µονοκλωνικά αντισώµατα µε γραµµικούς και διαµορφωτικούς επιτόπους. Β.1. Έκφραση και καθαρισµός των 6xHis επισηµασµένων α- και β-ecds (φορέας έκφρασης pet-15b) Η επαγωγή των BL21(DE3)pLysS βακτηριακών κυττάρων για την έκφραση των 6xHis επισηµασµένων α- και β-ecds πραγµατοποιήθηκε παρουσία 1 mm IPTG στους 37 0 C για 3 h. Μετά την επαγωγή της βακτηριακής καλλιέργειας (1lt) τα κύτταρα 81

82 διαλυτοποιήθηκαν µε 100 ml αποδιατακτικού διαλύµατος 6Μ υδροχλωρικής γουνιδίνης (GuHCl) 50 mm NaH 2 PO 4, ph 8 και ακολούθησε φυγοκέντρηση του βακτηριακού λύµατος και συλλλογή του υπερκειµένου. Ακολούθως τα 6xHis-ECDs καθαρίστηκαν µε χρωµατογραφίας συγγένειας σε στήλη νικελίου (Ni 2+ -NTA-αγαρόζη). 15 µl από το τελικό προϊόν του καθαρισµού του α- και β-ecd ηλεκτροφορήθηκαν σε SDS-PAGE 15%, όπου ανιχνεύθηκε η έκφραση των πρωτεϊνών (εικόνα 18). M α-ecd β-ecd 32,5kDa 25kDa Εικόνα 18. Ανάλυση σε SDS-PAGE 15% κ.β ακρυλαµιδίου της έκφρασης των 6xHisεπισηµασµένων α- (~29 kda) και β-ecds (~31 kda), µετά τον καθαρισµό µε στήλη νικελίου. Β.2. Ραδιοανοσολογικός προσδιορισµός αντισωµάτων των ορών µυασθενικών µε AChR αρουραίου. Η παθητική χορήγηση ορού µυασθενικού ασθενούς σε πειραµατόζωα και η πρόκληση πειραµατικής µυασθένειας, απαιτεί τα αντισώµατα του ορού του ασθενούς να αντιδρούν διασταυρωτά µε τον υποδοχέα του πειραµατόζωου. Είναι προϋπόθεση να προσδένονται σε επιτόπους του AChR του πειραµατοζώου που είναι ταυτόσηµοι µε αντίστοιχους επιτόπους ανθρώπινου AChR και να προκαλούν καταστροφή ή λειτουργική παρεµπόδιση των υποδοχέων του ζώου στις νευροµυικές συνάψεις. Για το λόγο αυτό ελέγξαµε µε RIA στην οποία το αντιγόνο ήταν ανέπαφος (ολόκληρος) υποδοχέας αρουραίου που είχε εκχυλιστεί από µύες ζώων, ορούς µυασθενικών (115) µε υψηλό τίτλο ως προς τον ανθρώπινο υποδοχέα. Τα αποτελέσµατα της RIA παρουσιάζονται στην εικόνα