Αρχιμήδης ΙΙΙ Παραδοτέο ΠΕ 4.1. Αρχιμήδης ΙΙΙ

Transcript

1 Αρχιμήδης ΙΙΙ Ανάπτυξη μεθόδου ολικής αξιοποίησης αποβλήτων ελαιοτριβείου για παραγωγή βιο-δραστικών ουσιών υψηλής προστιθέμενης αξίας και αγρο-υλικών» α.α. «08» ΠΕ 4.1 Σύνοψη αποτελεσμάτων των πειραμάτων χρήσης απλών και ενκαψυλιωμένων πολυφαινολών ως αγροχημικών in-vitro Επιστημονικός Υπεύθυνος Κων/νος Πετρωτός Ανάδοχος έργου Στέφανος Λεοντόπουλος 1

2 1 ο ΚΕΦΑΛΑΙΟ Εισαγωγή Ανασκόπηση και Σημασία των Πολυφαινολών 1. Εισαγωγή Τα απόβλητα των ελαιοτριβείων είναι αποτέλεσμα της παραγωγικής διαδικασίας του ελαιολάδου με το 95% της παγκόσμιας παραγωγής ελαιόλαδου να παράγεται από μικρές, οικογενειακές επιχειρήσεις Μεσογειακών χωρών. Κατά την κατεργασία του ελαιοκάρπου στα ελαιοτριβεία, παράλληλα με το ελαιόλαδο παράγεται και μία σειρά αποβλήτων. Η γεωργική αυτή δραστηριότητα έχει ιδιαίτερη κοινωνική και οικονομική σημασία για το πληθυσμό των ελαιοπαραγωγικών χωρών, διότι τεράστιες ποσότητες αποβλήτων παράγονται κάθε ελαιοκομική περίοδο. Αυτά είναι ο ελαιοπυρήνας, που αποτελείται από τα αλεσμένα στερεά συστατικά του καρπού (κυρίως του κουκουτσιού), τα ελαιόφυλλα που έχουν μεταφερθεί με τον ελαιόκαρπο και μια σημαντική σε όγκο και οργανικό φορτίο ποσότητα υγρών αποβλήτων, που είναι γνωστά ως "λιοζούμι", "κατσίγαρος" ή "μούργα". Η παραγωγή αυτή των αποβλήτων των ελαιοτριβείων σε συνδυασμό με τα χαρακτηριστικά των παραγόμενων αποβλήτων (υψηλή συγκέντρωση σε οργανικό φορτίο και φαινολικές ενώσεις), καθιστούν τα υγρά απόβλητα ελαιοτριβείου ένα δυσεπίλυτο πρόβλημα εξαιτίας της επικινδυνότητας της απευθείας διάθεσής τους στο περιβάλλον. Αναλυτικότερα, ο κατσίγαρος συνίσταται από το υδατικό κλάσμα του χυμού του ελαιοκάρπου και από το νερό που χρησιμοποιείται στις διάφορες φάσεις παραγωγής του λαδιού στο ελαιουργείο. Ουσιαστικά πρόκειται για ένα υδατικό φυτικό εκχύλισμα, που περιέχει μία σειρά από ουσίες όπως σάκχαρα, αζωτούχες ενώσεις, οργανικά οξέα, πολυαλκοόλες, πολυφαινόλες και υπολείμματα ελαίου. Η άμεση επίπτωση του κατσίγαρου στο περιβάλλον είναι η αισθητική υποβάθμιση που προκαλεί και η οποία οφείλεται στην έντονη οσμή του και στο σκούρο χρώμα του. Παράλληλα, εξαιτίας του υψηλού οργανικού φορτίου που περιέχει, είναι πιθανόν να δημιουργήσει ευτροφικά φαινόμενα σε περιπτώσεις που καταλήγει σε αποδέκτες με 2

3 μικρή ανακυκλοφορία νερών (κλειστούς θαλάσσιους κόλπους, λίμνες κ.τ.λ). Από τα συστατικά που περιέχονται στον κατσίγαρο, οι πολυφαινόλες παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον διότι από τη μία πλευρά προσδίδουν στα απόβλητα τοξικές ιδιότητες έναντι των φυτών και αποδομούνται με βραδύ σχετικά ρυθμό από εξειδικευμένες ομάδες μικροοργανισμών, ενώ από την άλλη είναι υπεύθυνες για τη συντήρηση της ποιότητας του λαδιού στο χρόνο (χαμηλή οξύτητα) ως φυσικό συντηρητικό. Το υψηλό οργανικό φορτίο του κατσίγαρου σε συνάρτηση με την παρουσία των πολυφαινολών δεν επιτρέπει την απευθείας διάθεση του στο περιβάλλον, αλλά καθιστά αναγκαία την πρότερη επεξεργασία του. Για την επεξεργασία και διάθεση του κατσίγαρου έχουν δοκιμαστεί διάφορες μέθοδοι σε εργαστηριακή και πραγματική κλίμακα. Παρόλα αυτά, μέχρι σήμερα δεν έχει προταθεί μία ολοκληρωμένη λύση, αλλά έχουν εφαρμοστεί διάφορες τεχνικές κατά περίπτωση που παρουσιάζουν ορισμένα μειονεκτήματα τεχνικής ή οικονομικής φύσεως και δεν έχουν επιλύσει ικανοποιητικά το πρόβλημα. 1.1 Η καλλιέργεια της Ελιάς Το δέντρο της ελιάς Σύμφωνα με τις αρχαιολογικές έρευνες, η καλλιέργεια της ελιάς ξεκίνησε στη νοτιοανατολική περιοχή του Μεσογειακού στο 5ο π.χ. αιώνα. Ελαιόδεντρα μπορεί να έχουν καλλιεργηθεί ανεξάρτητα σε δύο μέρη, την Κρήτη και τη Συρία (Rackham et al., 2002). Πιστεύεται ότι τα ελαιόδεντρα από τη βόρεια Συρία εξαπλώθηκαν στην Κρήτη και τα υπόλοιπα Ελληνικά νησιά, ενώ στη συνέχεια η καλλιέργειά τους επεκτάθηκε στην ηπειρωτική Ελλάδα, στην Ιταλία και σε άλλα μέρη της Μεσογείου (Standish 1960) όπου μέχρι ακόμη και σήμερα λόγω των ιδιαίτερων κλιματολογικών συνθηκών η Μεσογειακή λεκάνη παραμένει η κυριότερη περιοχή καλλιέργειάς της. Σήμερα ελαιόδεντρα καλλιεργούνται για εμπορικούς σκοπούς επίσης στην Αυστραλία, την Καλιφόρνια και τη Νότια Αφρική παράγοντας όμως προϊόντα κατώτερης ποιότητας από αυτά των Μεσογειακών χωρών. Η οικογένεια Oleaceae αποτελείται από 22 γένη και περίπου 500 είδη, τα περισσότερα από αυτά ανήκει στην υποοικογένεια Oleoideae. Το γένος olea περιλαμβάνει περίπου 40 είδη και υποείδη τα οποία καλλιεργούνται κυρίως στην περιοχή της Μεσογείου (Tutin et al, 1972; Strid, 1997). Οι χώρες με τη μεγαλύτερη παραγωγή είναι η Ισπανία, η Ιταλία και η Ελλάδα που κατέχουν το 80% της 3

4 παγκόσμιας παραγωγής. Στην Ελλάδα η ελιά είχε από την αρχαιότητα ξεχωριστή θέση και είχε συνδεθεί με την διατροφή, τη θρησκεία, την υγεία και την τέχνη. Σήμερα είναι η πρώτη σε σπουδαιότητα δενδρώδης καλλιέργεια στη χώρα μας, αφού καταλαμβάνει σε έκταση το 15% περίπου της καλλιεργούμενης γης και το 75% των εκτάσεων που είναι φυτεμένες με δέντρα. Υπολογίζεται ότι υπάρχουν γύρω στα 130 εκατομμύρια ελαιόδεντρα, 2800 ελαιοτριβεία, 500 συσκευαστήρια ραφιναριστήριαπυρηνελαιουργεία και 80 εργοστάσια επεξεργασίας επιτραπέζιας ελιάς (Ποντίκης, Α.Κ., 2000, Manios, 2004; Award et al.,2006) Ο ελαιόκαρπος Ο καρπός της ελιάς είναι δρύπη, και αποτελείται από το περικάρπιο και το ενδοκάρπιο. Το περικάρπιο αποτελείται από δύο τμήματα, την επιδερμίδα και το μεσοκάρπιο το οποίο αποτελεί το 65-83% του νωπού βάρους του καρπού. Κατά την ωρίμανση του καρπού η επιδερμίδα μετατρέπεται από ανοιχτό πράσινο σε σκούρο μαύρο χρώμα. Η μέση σύσταση του ελαιοκάρπου είναι: 50% Νερό, 22% λάδι, 19% υδατάνθρακες, 1.6% πρωτεΐνες, καθώς και άλλα σημαντικά συστατικά όπως πηκτίνες, οργανικά οξέα, χρωστικές, πολυφαινόλες και ανόργανα συστατικά. Πολλά από αυτά τα συστατικά συναντώνται και στα απόβλητα που παράγονται κατά τη παραγωγική διαδικασία του ελαιολάδου. Ο καρπός περνάει διάφορες φάσεις έως ότου φτάσει ένα μέγιστο βάρος από τον Οκτώβριο μέχρι τα μέσα Νοέμβρη για τις περισσότερες ποικιλίες. Από εκεί και έπειτα ο καρπός αρχίζει να χάνει υγρασία με αποτέλεσμα την αύξηση της ελαιοπεριεκτικότητάς του. Το 96-98% του λαδιού στον ελαιόκαρπο συγκεντρώνεται στο περικάρπιο (Ποντίκης, Α.Κ., 2000). 1.2 Απόβλητα Ελαιοτριβείων Στην Ελλάδα παράγονται τόνοι ελαιόλαδο σε ετήσια βάση, δηλαδή το 12,5-15% της παγκόσμιας παραγωγής. Για την επεξεργασία του ελαιόκαρπου στα ελαιοτριβεία καταναλώνονται περίπου 20 εκατομμύρια τόνοι νερού ετησίως και παράγονται 30 εκατομμύρια τόνοι υγρών αποβλήτων. Οι ποσότητες υγρών αποβλήτων που παράγονται κατά την περίοδο λειτουργίας των ελαιοτριβείων είναι εξαιρετικά μεγάλες με μέση ημερήσια τιμή ανά ελαιοτριβείο τους τόνους. Αρκεί να σημειωθεί ότι για κάθε κιλό λαδιού παράγονται κατά μέσο όρο 5 κιλά υγρών αποβλήτων. 4

5 1.2.1 Χαρακτηριστικά υγρών αποβλήτων ελαιοτριβείου Τα φρούτα και τα λαχανικά, όπως ελιές και τα σταφύλια, εκτίθεται συνεχώς σε περιβαλλοντικό στρες, συμπεριλαμβανομένης της σχετικώς υψηλές θερμοκρασίες και την υπεριώδη ακτινοβολία, και ως εκ τούτου χρειάζονται μια ποικιλία ενώσεων, όπως για παράδειγμα τα αντιοξειδωτικά, για να διατηρήσουν την ακεραιότητά τους (Soleas et al 1997, Toguri et al 1993). Είναι γνωστό ότι το ελαιόλαδο λαμβάνεται από ολόκληρο τον καρπό με φυσική πίεση και χωρίς την χρήση χημικών ουσιών σε αντίθεση με τα περισσότερα φυτικά έλαια τα οποία εξάγονται από τους σπόρους τους με τη χρήση διαλυτων. Ως εκ τούτου τα λιπόφιλα συστατικά του καρπού της ελιάς μεταφέρονται στο έλαιο, το οποίο με τη σειρά του διατηρεί τις οργανοληπτικές ιδιότητες του καρπού της ελιάς. Επίσης, οι φαινολικές ενώσεις των φύλλων της ελιάς είναι σημαντικοί παράγοντες που επιδρούν στην αξιολόγηση της ποιότητας του ελαιόλαδου, επειδή είναι εν μέρει υπεύθυνες για τη σταθερότητα της αυτοοξείδωσης (Vazqueez 1975, Perrin 1992) και τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του (Vazqueez 1978). Επιπλέον, αυτά τα μόρια έχουν φαρμακολογικές ιδιότητες (Maestro-Duran 1994), δρουν ως φυσικά αντιοξειδωτικά (Chimi 1991, Le Tutor 1992) και αναστέλλουν την ανάπτυξη και τη δράση των θετικών κατά Gram βακτηρίων που εμπλέκονται σε διαδικασίες ζύμωσης του ελαιολάδου (Brenes 1992, Brenes 1995). Αυτές οι ιδιότητες των φύλλων ελιάς υφίστανται λόγω των iridoids και ιδιαίτερα της ολεουροπεΐνη η οποία είναι υπεύθυνη για την πικρή γεύση του ώριμου καρπού της ελιάς αλλά και της υδροξυτυροσόλη (Le Tutour και Guedon, 1992, Ghisalberti 1998). Τα υγρά απόβλητα των ελαιοτριβείων αποτελούν σημαντικό παράγοντα ρύπανσης και δυσεπίλυτο πρόβλημα στο χώρο των γεωργικών βιομηχανιών. Χαρακτηρίζονται από ιδιότητες όπως: Σκούρο καφέ χρώμα. Χαρακτηριστική δυσάρεστη οσμή. Υψηλό οργανικό φορτίο. Όξινο ph. Υψηλή περιεκτικότητα πολυφαινολών. Υψηλή περιεκτικότητα σε στερεό υλικό. 5

6 Αυτά τα χαρακτηριστικά καθιστούν τη διαχείριση τους εξαιρετικά δύσκολη με αποτέλεσμα να συγκαταλέγονται στα πιο ρυπογόνα απόβλητα του αγροτοβιομηχανικού τομέα. Το ποσό των φαινολικών ενώσεων του ελαιολάδου εξαρτάται από διάφορους παράγοντες, όπως η ποικιλία, ο βαθμός ωρίμανσης, η πιθανή μόλυνση από τον δάκος, και το κλίμα (Μπόσκου et al, 2000). Αντιθέτως, η ποσότητα αυτή συνήθως μειώνεται όταν οι καρποί έχουν υπερωριμάσει, αν και υπάρχουν ορισμένες εξαιρέσεις σε αυτόν τον κανόνα: για παράδειγμα, ελιές που καλλιεργούνται σε θερμότερα κλίματα, παρά την ταχύτερη ωρίμανση, η απόδοση των ελαίων τους σε φαινόλες είναι πλούσια. Επίσης ελιές οι οποίες έχουν συγκομιστεί την κατάλληλη στιγμή (όταν αλλάζει το χρώμα της σάρκας από ανοιχτό πράσινο σε σκούρο καφέ) με το χέρι και επομένως η σάρκα τους παραμένει ακέραιη χωρίς χτυπήματα και οι οποίες μεταφέρονται αμέσως στο ελαιοτριβείο για επεξεργασία σε συνθήκες σύνθλιψης και συμπίεσης με θερμοκρασίες χαμηλότερες από o C, η απόδοση τους είναι επίσης πλούσια τόσο σε παραγωγή ποιοτικού λαδιού όσο και σε φαινολικά συστατικά. Όσον αφορά τις συνθήκες επεξεργασίας έχει παρατηρηθεί ότι οι έλαια που έχουν ληφθεί με φυγοκέντρηση έχουν χαμηλότερη περιεκτικότητα σε φαινόλες (Di Giovacchino et al., 1994) πιθανώς επειδή σε αυτή τη διαδικασία χρησιμοποιούνται μεγάλες ποσότητες θερμού νερού, οι οποίες διαβρέχουν την πάστα ελιάς συνεχώς κατά τη διάρκεια της άλεσης. Το παχύρευστο αυτό υποπροϊόν είναι γνωστό ως απόβλητα ελαιοτριβείου (OMWV) και παράγεται σε εξαιρετικά μεγάλες ποσότητες. Το ελαιόλαδο ως τελικό προιόν περιέχει μόνο 2% ( μg / g) του συνόλου των πολυφαινολών που περιέχονται στον καρπό της ελιάς, ενώ το υπόλοιπο 98% μεταφέρεται στα υγρά απόβλητα. Έτσι η σύνθεση των αποβλήτων ελαιοτριβείου δεν είναι σταθερή και σύμφωνα με τους Niaounnakis και Halvadakis (2006) εξαρτάται από: i. Τη σύσταση των αποβλήτων, η οποία ποικίλει σύμφωνα με: Την ποικιλία της ελιάς. Την ωριμότητα του καρπού. Την ώρα συγκομιδής του καρπού. Τη περιεκτικότητα του καρπού σε νερό. Τις εδαφοκλιματικές συνθήκες. Την παρουσία φυτοπροστατευτικών προϊόντων και λιπασμάτων. 6

7 ii. Τη μέθοδος εξαγωγής ελαιολάδου. Κάθε τύπος ελαιοτριβείου, έχει και διαφορετικές απαιτήσεις σε επιπλέον νερό κατά τη διεργασία. Σαν αποτέλεσμα αυτού, τα φυτικά υγρά που παράγονται από τα ελαιοτριβεία τριών φάσεων, όπου και χρησιμοποιούνται μεγαλύτερες ποσότητες νερού, να υφίστανται κάποια αραίωση. iii. Το χρόνο αποθήκευσης. Η αποθήκευση μπορεί να αλλάξει τα βιολογικά και φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του αποβλήτου, καθώς παρατηρείτε έντονη βιολογική δραστηριότητα (αύξηση της οξύτητας), καθώς επίσης και φυσικοχημικές μεταβολές όπως η καθίζηση των στερεών Σύσταση των αποβλήτων Τα απόβλητα ελαιοοτριβείων, συγκαταλέγονται στα κατ εξοχήν βεβαρημένα από πλευράς ρυπαντικού φορτίου γεωργικά βιομηχανικά απόβλητα. Συγκεκριμένα, έχει υπολογιστεί ότι ένα μεσαίου μεγέθους ελαιοτριβείο παράγει περίπου tn απόβλητα ανά περίοδο συγκομιδής ελαιοκάρπου με οργανικό φορτίο το οποίο ισοδυναμεί με τα ετήσια απόβλητα μιας πόλης κατοίκων. Από τα συστατικά του κατσίγαρου, ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι φαινόλες, οι οποίες ως αντιοξειδωτικές ουσίες εμποδίζουν τη διάσπαση των γλυκεριδίων προς λιπαρά οξέα και βοηθούν στη διατήρηση του λαδιού (Tsimidou et al., 1992 Ryan και Robards, 1998). Είναι όμως και η κύρια ρυπαντική παράμετρος, η οποία ευθύνεται για τις σημαντικότατες περιβαλλοντικές επιπτώσεις των υγρών αποβλήτων των ελαιοτριβείων. Σχετικά με τη σύσταση και την παραγωγή του κατσίγαρου έχουν γίνει μελέτες σε διαφορετικές περιοχές και συνθήκες λειτουργίας. Οι μελέτες αυτές συμφωνούν ως προς τα γενικά χαρακτηριστικά, όπως την υψηλή τοξικότητα και το οργανικό φορτίο, τις εμπεριεχόμενες ουσίες και το μέγεθος της παραγωγής. Παρουσιάζουν όμως κάποιες διαφορές όσον αφορά τα ποσοτικά αποτελέσματα. Οι διαφορές αυτές μπορούν να οφείλονται στους εναλλακτικούς τρόπους επεξεργασίας του ελαιοκάρπου (π.χ. κλασσικό ή φυγοκεντρικό ελαιοτριβείο). Επιπλέον, η σύστασή τους ποικίλει ανάλογα με τις εδαφοκλιματολογικές συνθήκες, την ποικιλία των ελαιοκάρπων, το στάδιο ωρίμανσης 7

8 του καρπού, τη χρήση παρασιτοκτόνων και λιπασμάτων, τον τρόπο συγκομιδής και αποθήκευσης του (Cabrera et al., 1996). Επίσης, οι μετρούμενες διαφορές ίσως να οφείλονται στις διαφορετικές συνθήκες δειγματοληψίας του κατσίγαρου, π.χ. αμέσως μετά την παραγωγή ή αφού περάσουν κάποιες ημέρες, από ανοιχτή ή κλειστή δεξαμενή απόθεσης, δείγμα επιφανειακό ή βάθους. Στους ακόλουθους Πίνακες παρουσιάζονται τα γενικά χαρακτηριστικά των υγρών αποβλήτων των ελαιοτριβείων τριών φάσεων. Πίνακας 1: Γενικά χαρακτηριστικά υγρών αποβλήτων ελαιοτριβείου (Sierra et al., 2001). Παράμετροι Τιμές PH Βιοχημικά απαιτούμενο οξυγόνο, (ΒOD 5 g/l) Χημικά απαιτούμενο οξυγόνο, (COD g/l) Ολικός οργανικός άνθρακας, (TOC g/l) Λίπη (g/l) Ανόργανα στοιχεία (g/l) 5-14 Πολυφαινόλες (g/l) 3-24 N (g/l) 5-15 P (g/l) K (g/l) Ca (g/l) Mg (g/l) Na (g/l) Στερεά % Πίνακας 2: Μέση σύσταση των αποβλήτων ελαιοτριβείων. Παράμετρος Τιμή Οργανικές ουσίες Τιμή Ανόργανα στοιχεία Τιμή ph Ολικά σάκχαρα 1 % P 96 ppm ΒOD (Βιοχημικά απαιτούμενο οξυγόνο) COD (Χημικά απαιτούμενο οξυγόνο) ppm ppm Στερεά αιωρούμενα 0.9 Στερεά ολικά 4.0 % Αζωτούχες ενώσεις 0.28 % K 1200 ppm Οργανικά οξέα 0.3 % Ca 120 ppm Πολυαλκοόλες Πολυπηκτίνες, τανίνες κλπ 1.1 % Mg 48 ppm 1.37 % Na 245 ppm Στερεά οργανικά 3.5 % Πολυφαινόλες 0.5 % Fe 16 ppm Στερεά ανόργανα 0.5 % 8

9 Πίνακας 3: Κύρια φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των αποβλήτων ελιοτριβείου (Fiestas και Borja, 1992, Hamdi και Ellouz, 1992). Παράμετρος Όρια τιμών Νερό % Οργανικά συστατικά % 4-16 Ανόργανα συστατικά % 1-2 Πυκνότητα (g/cm 3 ) 1,024 Αγωγιμότητα (μs/ cm) ph 4,5-6,5 Βιολογικά απαιτούμενα οξυγόνο (BOD 5 ) mg/l Χημικά απαιτούμενα οξυγόνο (COD) mg/l Πίνακας 4: Κύρια συστατικά των αποβλήτων ελιοτριβείου (Zervakis και Balis 1996). Συστατικό Συγκέντρωση(%) Κύρια συστατικά Νερό Λίπη 0,03-1,00 Υπολείμματα ελαίου Αζωτούχες ουσίες 1,2-2,4 Σάκχαρα 2,0-8,0 Οργανικά οξέα 0,5-1,5 Γλουταμίνη, Γλυκίνη, Αργινίνη, Ιστιδίνη, Προλίνη,Τυροσίνη, Φαινυλαλανίνη, Λυσίνη, Μεθειονίνη, Γλυκοζαμίνη κ.ά. Ραφινόζη, Μανόζη, Σακχαρόζη, Γλυκόζη, Αραβινόζη, Ραμνόζη, Γαλακτόζη, Ξυλόζη, Γαλακτικό, Μηλικό, Μηλονικό, Οξαλικό, Τρυγικό, Φουμαρικό Πολυαλκοόλες 0,5-1,5 Γλυκερίνη, Μανιτόλη Πηκτίνες, Ταννίνες 0,4-1,5 Φαινολικές ενώσεις 0,3-0,8 Ανόργανα συστατικά 0,4-1,5 Φλαβονοειδή: Απεγινίνη, Λουτεολίνη, Κερσετίνη,Λουτεολίνη. Φαινόλες: Καφεϊικό, Κινναμικό, 2,6- διυδροξυβενζοϊκό, π- υδροηυβενζοϊκό, Συρινγγικό, Φερουλικό, π-κουμαρικό, Βανιλλικό, Βερατρικό, Πρωτοκατεχικό, Υδροξυτυροσολή, Τυροσόλη, Πυροκατεχικό. Ελαιοευρωπαϊνη K, P, Na, Ca, Mg, Fe, Mn, Zn, Cu, Cl, S 9

10 Πίνακας 5: Σύγκριση κυρίων χαρακτηριστικών των αποβλήτων ελαιοτριβείου από κλασσικά και φυγοκεντρικά ελαιοτριβεία (Fiestas και Borja 1992, Μπαλατσούρας 1997). Χαρακτηριστικά Κλασσικό Τύπος Ελαιοτριβείου Φυγοκεντρικό Αλατότητα (mmhos /cm) ph Ρυπογόνο Δυναμικό COD (kg/m3) BOD 5 (kg/m3) Αιωρούμενα στερεά (g/l) 1 9 Ολικά στερεά(g/l) Στερεά οργανικά (g/l) 15 5 Πτητικά στερεά (g/l) Λίπη(g/l) Γενικά οι οργανικές ουσίες των αποβλήτων του ελαιοτριβείου μπορούν να διαχωριστούν σε ενώσεις άμεσα διασπούμενες (π.χ. σάκχαρα, οργανικά οξέα, αμινοξέα), βιοαποδομήσιμα πολυμερή (πρωτεΐνες, ημικυταρρίνες) και δύσκολα διασπώμενα συστατικά όπως μεγαλομοριακές λιπαρές ουσίες και φαινολικές ενώσεις (Οιχαλιώτης και Ζερβάκης, 2000). Παρά το ότι το πιο σημαντικό από ποσοτική άποψη τμήμα του οργανικού κλάσματος καταλαμβάνουν τα σάκχαρα από ποιοτική άποψη οι πολυφαινόλες και οι λιπαρές ουσίες είναι τα πιο σημαντικά συστατικά, διότι προσδίδουν στα απόβλητα ελαιοτριβείου ανεπιθύμητες ιδιότητες (χρώμα, φυτοτοξοκότητα, εμμονή στο περιβάλλον). Στα φαινολικά που έχουν ανιχνευθεί θα πρέπει να προστεθούν επίσης πολυμερείς ουσίες καστανόμαυρου χρώματος που παράγονται δευτερογενώς μέσω ενζυμικών αντιδράσεων που αρχίζουν αμέσως μετά την έκθλιψη του ελαιοκάρπου (Saiz-Jimenez et al., 1986). Επιπρόσθετα, αναφορικά με τις ιδιότητες των αποβλήτων ο Visioli et al., (1995) έχει αναφέρει ότι τα εκχυλίσματα των αποβλήτων ελαιοτριβείου διαθέτουν ισχυρή αντιοξειδωτική δράση και θα μπορούσαν να αποτελέσουν μια φθηνή πηγή φυσικών αντιοξειδωτικών. Τα ανόργανα συστατικά των αποβλήτων του ελαιοτριβείου όπως το Κάλιο, ο Φώσφορος, το Μαγνήσιο καθώς και πολλά ιχνοστοιχεία παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον λόγω της μεγάλης λιπαντικής τους αξίας. Τέλος, η συγκέντρωση μικροοργανισμών στα απόβλητα του ελαιοτριβείου είναι της τάξης των 10 5 cfu/ml πιο κοινοί είναι βακτήρια του γένους Pseudomonas ή 10

11 μικροοργανισμοί που χαρακτηρίζονται από την ικανότητα τους να μετασχηματίζουν δύσκολα διασπώμενα συστατικά, όπως μεγαλομοριακές λιπαρές ουσίες, και φαινολικά συστατικά. Επίσης συναντάμε ζύμες του γένους Saccharomyces και μύκητες Penicillium και Aspegillus. Άλλοι μικροοργανισμοί που έχουν απομονωθεί από ελαιόκαρπο είναι στελέχη μυκήτων και βακτηρίων από τα γένη Aerobacter, Escherichia, Bacillus, Rhizopus, Alternaria, Fusarium (Fiestas και Borja, 1992) Περιεχόμενες πολυφαινόλες στα απόβλητα ελαιοτριβείου Γενικά Με τον όρο πολυφαινόλες χαρακτηρίζεται μια μεγάλη ετερογενής ομάδα ενώσεων με κοινό χαρακτηριστικό ότι φέρουν ένα ή περισσότερα υδροξύλια συνδεδεμένα απευθείας σε ένα ή περισσότερους αρωματικούς ή και ετεροκυκλικούς πυρήνες. Σήμερα είναι γνωστές περισσότερες από 8000 πολυφαινόλες ενώ στα φυτά έχουν βρεθεί περισσότερες από 4000 διαφορετικές φαινολικές ενώσεις (Χριστοφορίδου, Οι πολυφαινόλες παράγονται ως προϊόντα δευτερογενούς μεταβολισμού των φυτών. Συνήθως συναντώνται στη φύση συνδεδεμένες με υδατάνθρακες μέσω των υδροξυλίων τους. Τα συζευγμένα σάκχαρα μπορεί να είναι μονοσακχαρίτες, δισακχαρίτες ή και ολιγοσακχαρίτες. Το πιο κοινό σάκχαρο που απαντάται είναι η γλυκόζη ενώ άλλα σάκχαρα είναι που συναντώνται είναι η γαλακτόζη, η ξυλόζη, η ραμνόζη, η, τα γλυκουρονικά οξέα κ.α. Οι φαινόλες είναι γνωστές στη βιβλιογραφία και σαν πολυφαινόλες ή πολυφαινολικές ενώσεις. Είναι ένα από τα κύρια συστατικά του κατσίγαρου και ενοχοποιούνται για τη δύσκολη επεξεργασία του, αφού είναι συστατικά που αποικοδομούνται δύσκολα αλλά ταυτόχρονα παρουσιάζουν αντιμικροβιακές και φυτοτοξικές ιδιότητες (Σπαρτάλη, 2005). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η συγκέντρωση των πολυφαινολικών ενώσεων στο ελαιόλαδο κυμαίνεται 50 έως μg / g ελαίου, ανάλογα με την ποικιλία ελιάς και του συστήματος εκχύλισης και ότι αυτή η ποσότητα των αντιοξειδωτικών στο ελαιόλαδο είναι μόνο το 1-2% (Rodis et al., 2002). Το υπόλοιπο χάνεται είτε ως λύματα (περίπου 53%) είτε βρίσκεται στον ελαιοπυρήνα (περίπου 45%). ο οποίος αποτελεί και αυτός απόβλητο. 11

12 Εκτός από την τυροσόλη και την υδροξυτυροσόλη που βρίσκονται σε μεγάλο βαθμό στο ελαιόλαδο, περιέχεται και ένα πλήθος από άλλα φαινολικά συστατικά, κάποια από αυτά σε πολύ μικρές ποσότητες, που είναι πιθανόν να επηρεάζουν σε μεγάλο βαθμό την αντιοξειδωτική ικανότητα του ελαιολάδου. (Tsimidou et al., 1992). Επίσης, μια σειρά πειραμάτων που εκτελέστηκαν από τον Visioli et al., (1995), (1999), έδειξαν ότι τα εκχυλίσματα αυτά των αποβλήτων των ελαιοτριβείων έχουν ισχυρή αντιοξειδωτική δράση και μπορεί, επομένως, να ανακτηθεί και να χρησιμοποιηθεί στη χημεία ως φθηνή πηγή συντηρητικού στα τρόφιμα και ως πηγή φυσικών αντιοξειδωτικών λύνοντας ταυτόχρονα το πρόβλημα της διάθεσης των αποβλήτων των ελαιοτριβείων. Η αντιοξειδωτική ικανότητα των φαινολών εκτός των άλλων προσδίδει και προστατευτικές ιδιότητες έναντι ασθενειών που πλήττουν τον άνθρωπο. Από επιδημιολογικές μελέτες γνωρίζουμε ότι η Μεσογειακή δίαιτα, πλούσια σε κατανάλωση λαδιού συμβάλει στη μείωση καρδιαγγειακών παθήσεων και την εμφάνιση συγκεκριμένων μορφών καρκίνου οι οποίες είναι αυξημένες στις βόρειες Ευρωπαϊκές χώρες σε σχέση με τις νότιες Μεσογειακές (Briante et al., 2003). Ωστόσο, πέρα από τις προστατευτικές ιδιότητες των φαινολών μπορούν να δημιουργήσουν και σοβαρά προβλήματα στην υγεία. Μετά από κατάποση έχουν αναφερθεί παθήσεις όπως γαστροεντερικές ενοχλήσεις, προβλήματα στο συκώτι και τα νεφρά, νευρικοί σπασμοί, αρρυθμίες στην καρδιά, καρδιαγγειακό κλονισμό ακόμα και θάνατο. Η χαμηλότερη αναφερόμενη δόση με συνέπεια το θάνατο ήταν 4,8 g από κατάποση μέσα σε 10 λεπτά. Έχουν γίνει μελέτες ακόμη για καρκινογένεση σε ποντίκια αλλά αποτελέσματα για τους ανθρώπους δεν υπάρχουν μέχρι στιγμής. Προβλήματα μπορούν να δημιουργηθούν ακόμη και όταν έρθει σε επαφή με το δέρμα όπως ερεθισμός, εγκαύματα ακόμη και νέκρωση ιστών. Όρια για δερμική έκθεση δεν υπάρχουν. Οι φαινολικές ενώσεις στο λάδι δεν περιέχουν στο μόριο τους περισσότερες από 1-2 υδροξυλομάδες. Οι φαινόλες που υπάρχουν στο ελαιόλαδο προέρχονται από τον καρπό και τα φύλλα της ελιάς και ανήκουν στο πολικό τμήμα του ελαιολάδου το οποίο λαμβάνεται με εκχύλιση με μείγμα μεθανόλης-νερού (Tsimidou et al., 1992). Η ποσότητα τους στο ελαιόλαδο ποικίλει και εξαρτάται από αρκετούς παράγοντες όπως 12

13 το υψόμετρο της περιοχής καλλιέργειας του ελαιόδεντρου, τις κλιματολογικές συνθήκες (ύψος βροχοπτώσεων, θερμοκρασία), τις εργασίες κατά την καλλιέργεια, το βαθμό ωριμότητας του ελαιόκαρπου και τον τύπο του ελαιουργείου που χρησιμοποιείται για την εξαγωγή του ελαιολάδου (Ryan και Robards, 1998). Η διάλυση των κολλοειδών ουσιών (πρωτεϊνών και πολυσακχαριτών) οι οποίες είναι υδατοδιαλυτές και συνυπάρχουν με τις φαινολικές συντελεί και στη μερική διάλυση των φαινολικών ουσιών κατά την επεξεργασία του ελαιόκαρπου στο ελαιουργείο. Η διάλυση αυτή έχει σαν συνέπεια ένα μεγάλο μέρος των φαινολικών ενώσεων που περιέχονται στη σάρκα του καρπού, να απομακρύνονται με τα απόνερα. Στους διάφορους τύπους ελαιολάδου έχουν βρεθεί περισσότερες από 20 πολυφαινόλες. Σε μεγάλες ποσότητες βρίσκονται η τυροσόλη και η υδρόξυτυροσόλη. Επίσης υπάρχουν παράγωγα του κινναμικού οξέος (ο-κουμαρικό οξύ, p- κουμαρικό οξύ, φερουλικό οξύ, καφεϊκό οξύ, συναπικό οξύ, 3- υδροξυ-4- μεθοξυκιναμικό οξύ), παράγωγα του βενζοϊκού οξέος (p-υδροξυβενζοϊκό οξύ, βανιλλικό οξύ, πρωτοκατεχικό οξύ, γαλλικό οξύ, συριγγικό οξύ, γεντιστικό οξύ), φαινολικές αλκοόλες (τυροσόλη, υδροξυτυροσόλη), σικιμικό οξύ, παράγωγα του φαινολικού οξέος (p-φαινυλοξικό), και οι ενώσεις θυμόλη, καρβακρόλη και οι φλαβονοειδείς ενώσεις καμφερόλη, απιγενίνη και κερκετίνη (Χριστοφορίδου, 2001). Οι τρεις όμως φαινολικές ενώσεις με την υψηλότερη συγκέντρωση στο ελαιόλαδο είναι ο γλυκοζίτης ολεουροπεΐνη, υδροξυτυροσόλη (3,4-διϋδροξυφαινυλ αιθανόλη) και τυροσόλη. Αυτές οι τρεις ενώσεις σχετίζονται δομικά. Η Υδροξυτυροσόλη και η τυροσόλη είναι δομικά όμοιες εκτός από το ότι υδροξυτυροσόλη κατέχει μία επιπλέον υδροξυ ομάδα στην μέτα θέση. Η Ολεουροπεΐνη, ανακαλύφθηκε το 1908 από τον Bourquelot και Vintilesco (Esti 1998, Panizzi 1990). Είναι ένας εστέρας που αποτελείται από υδροξυτυροσόλη και elenolic οξέος. Η Ελευρωπαΐνη είναι η κύρια φαινολική ένωση στην ελιά, η οποία μπορεί να φτάσει μέχρι και το 14% στους αποξηραμένους καρπούς. Η υδροξυτυροσόλη είναι το κύριο φαινολικό συστατικό στο ελαιόλαδο (Amiot et al., 1996). Είναι μια φυσική ένωση με φαρμακευτικές, αντιοξειδωτικές (Visioli et al., 2001), αντιμικροβιακές και φυτοτοξικές ιδιότητες (Visioli et al., 1999). Καθώς ο 13

14 καρπός της ελιάς ωριμάζει η συγκέντρωση Ελαιοροπαΐνης μειώνεται ενώ η υδροξυτυροσόλη, ένα προϊόν υδρόλυσης της ολεουροπεΐνης, αυξάνεται (Cimato et al., 1990; Ryan et al., 1999). Από οικονομική άποψη, θα πρέπει να σημειωθεί ότι το κόστος αγοράς 1 γρ. καθαρής υδροξυτυροσόλης ανέρχεται περίπου στα 1400 ευρώ (EXTRASYNTHESE, Γαλλία). Ένα λίτρο αποβλήτων ελιαοτριβείου περιέχει περίπου 130 mg υδροξυτυροσόλης και εάν θεωρήσουμε ότι ελαιοτριβεία μπορούν να παράγουν 30 εκατομμύρια τόνους αποβλήτων γίνεται κατανοητό ότι πρόκειται για μία εξαιρετική και ανεκμετάλλευτη πηγή φυσικών αντιοξειδωτικών. Σύμφωνα με τον Hamdi, 1992 οι φαινολικές ενώσεις που υπάρχουν στα απόβλητα ελαιοτριβείου διακρίνονται, α) στις απλές φαινολικές ενώσεις, που περιλαμβάνουν τανίνες μικρού μοριακού βάρους και φλαβονοειδή και β) στις πολυφαινόλες οι οποίες περιλαμβάνουν σκούρου χρώματος πολυμερή και προκύπτουν σαν αποτέλεσμα του πολυμερισμού και της οξείδωσης των απλών φαινολικών ενώσεων (Hamdi, 1992). Σύμφωνα με τους Fiestas et al., 1994; Knup et al., 1996; Juarez-Jimenez και Garcia- Pareja, 1996 οι κυριότερες φαινολικές ενώσεις είναι οι ακόλουθες: Σχήμα 1: Φαινολικές ενώσεις που συναντώνται στον κατσίγαρο 14

15 Ακολούθως, στα απόβλητα ελαιοτριβείου έχουν ανιχνευτεί πάνω από τριάντα φαινολικές ενώσεις με τις κυριότερες να παρουσιάζονται στο ακόλουθο σχήμα. Σχήμα 2: Οι Κυριότερες φαινολικές ενώσεις που συναντώνται στα απόβλητα ελαιοτριβείων (Niaounnakis και Halvadakis, 2006). Συμπερασματικά, η παρουσία των φαινολικών ενώσεων στα απόβλητα ελαιοτριβείου είναι ίσως το σημαντικότερο εμπόδιο για την αποτοξικοποίηση του αποβλήτου εξαιτίας της υψηλής συγκέντρωσης της οργανικής ύλης (ο δείκτης BOD κυμαίνεται μεταξύ 15x103-50x103 mg / l και ο δείκτης COD φθάνει περίπου τα 220 g / l), είναι, από την άλλη πλευρά μια πολύ πλούσια πηγή φαινολικών ενώσεων με αντιοξειδωτικές και αντιμικροβιακές ιδιότητες (Visioli et al.,1995b), αποδεικνύοντας την χρησιμότητα αυτών των ενώσεων στην ανθρώπινη υγεία αλλά και στη φαρμακευτική, τη βιομηχανία τροφίμων και καλλυντικών (Vermerris και Nickolson, 2006; Shahidi και Naczk, 2004). 15

16 1.2.5 Οι βιολογικές ιδιότητες των φύλλων της ελιάς Η πρώτη επίσημη έκθεση σχετικά με τη χρήση των φύλλων της ελιάς στην ιατρική χρονολογείται από το 1854, όταν ο Hanbury ανέφερε μια απλή συνταγή για τη χρήση του υδατικού εκχυλίσματος των φύλλων της ελιάς ως αντιπυρετικό. Από τις αρχές του 20ου αιώνα υπάρχου πολλές βιβλιογραφικές αναφορές σχετικά με τις ιδιότητες των φύλλων ελιάς. Ενδεικτικά αναφέρονται εκείνες των Le Tutour και Guedon, (1992); του Ghisalberti, (1998); του Owen et al., (2000), για την αντιοξειδωτική δράση τους, των Walter et al., (1973); του Ghisalberti, 1998 για την αντιμικροβιακή δράση, των Visioli και Galli, (1994); του Ziyyat et al., (1997) για την αντιϋπερτασική δράση των Ghisalberti, (1998); του Visioli και Galli, (1998), για την αγγειοδιασταλτική δράση, του (Pieroni et al., (1996.) και του Gonzalez et al., (1992) για την υπογλυκαιμική δράση Επίσης, μελέτες του Samuelsson, (1951) κατέδειξαν την ευεργετική δράση των φύλλων τα ελιάς όσον αφορά την ικανότητά τους να μειώνουν την αρτηριακή πίεση αλλά και την αγγειοδιασταλτική δράση, την αύξηση της ροής του αίματος δηλαδή στις στεφανιαίες αρτηρίες, (Zarzuelo, 1991). Επίσης, εκχύλισμα από φύλλα ελιάς και ιδιαίτερα η ολεουροπεΐνη έχει βρεθεί ότι παρουσιάζει ισχυρή αντιμικροβιακή δράση έναντι των μυκήτων, βακτήριων, ιών και άλλων παρασίτων [Walter et al., (1973); Ghisalberti, (1998); Aziz et al., (1998); Juven et al., (1972); Koutsoumanis et al., (1998); Tassou et al., (1995)]. Ειδικότερα, εκχύλισμα από φύλλα ελιάς βρέθηκε να είναι δραστικό σε in vitro δοκιμές εναντίον πολλών μικροοργανισμών, όπως ο Staphylococcus aureus, ο Vibrio cholerae, ο Vibrio parahaemolyticus, ο Haemophylus influenza, η Salmonella spp., ο Bacillus cereus (αναστέλλει τη βλάστηση των σπορίων) κ.α. Ενδεικτικά, όσον αφορά τη δράση εναντίον του Staphylococcus aureus παρατηρήθηκε ότι ανεξάρτητα από την συγκέντρωση αναστέλλεται η παραγωγή εντεροτοξίνης Β, σε χαμηλές συγκεντρώσεις βρέθηκε να μειώνει το ρυθμό ανάπτυξης, ενώ σε υψηλότερες συγκεντρώσεις βρέθηκε να αναστέλλει την ανάπτυξη του παθογόνου. Η oλευρωπαΐνη έχει επίσης αναφερθεί ως ανασταλτικό ή κατασταλτικό του ρυθμού ανάπτυξης βακτηρίων και μυκήτων [Aziz et al., (1998); Tassou et al., (1995); (1969); Juven et al., (1972); Ruiz-Barba et al., (1990); Νychas et al., (1990); Capasso et al., (1995); Bisignano et al., (1999), Tranter et al., (1993); Carluccio et al., (2003)] έτσι ώστε θα μπορούσε να είναι χρήσιμη και ως εναλλακτική λύση πρόσθετου τροφίμων [Tassou et al.,(1995); Nychas et al., (1990); Tranter et al., (1993)]. 16

17 Μελέτες των έξι μεγάλων φαινολικών ενώσεων που περιέχονται σε εκχυλίσματα οξικού αιθυλεστέρα από πράσινες ελιές έχουν δείξει ότι και αυτές έχουν αντιμικροβιακές ιδιότητες (Fleming, 1969). Επιπλέον μικροοργανισμοί όπως ο Lactobacillus plantarum, ο Staphylococcus carnosus, ο Enterococcus faecalis, η Salmonella enteridis, η Pseudomonas fragi, καθώς και διάφοροι μύκητες αναστάλθηκαν από την ολεουροπεΐνη και την αγλυκόνη της [Aziz et al.,(1998) Tassou et al., (1995); (1969); Fleming, (1969); Ruiz-Barba et al., (1990); Tassoou, (1991); Bisignano et al., (1999)]. Η αντιβακτηριακή αποτελεσματικότητα της ολεουροπεΐνης, πιθανώς να οφείλεται σε φαινολικές ουσίες οι οποίες παρουσιάζουν ιδιότητες που επηρεάζουν τον σχηματισμό του κυτταρικού τοιχώματος με επακόλουθη διαρροή των κυτταρικών συστατικών του. Ωστόσο, δεν έχει αποδειχθεί επαρκώς η ίn νίνο αποτελεσματικότητα των εκχυλισμάτων από φύλλα ελιάς τα οποία περιέχουν ολεουροπεΐνη. Αξίζει να αναφερθεί ότι ήδη στην αγορά των ΗΠΑ, αλλά και στο διαδίκτυο διάφορες εταιρείες πωλούν εκχυλίσματα φύλλων ελιάς ως συμπληρώματα διατροφής σε μορφή ταμπλέτας με συνιστώμενη χρήση ως μέσο αναστολής της χρόνιας κόπωσης αλλά και ως αντιμικροβιακό σε μυκητιασικές και ιογενείς λοιμώξεις όπως η γρίπη και ο έρπης, ενισχύοντας το ανοσοποιητικό σύστημα Η χρησιμότητα των αποβλήτων των ελαιοτριβείων ως οικολογικά φυτοπροστατευτικά προϊόντα Τα φυτά προσβάλλονται από πλήθος παράσιτων και παθογόνων οργανισμών. Για την φυσική τους προστασία μπορούν να παράγουν μεταβολίτες οι οποίοι επιδρούν στους μικροοργανισμούς αυτούς. Μεταξύ των φυσικών αυτών μεταβολιτών με τα παραπάνω χαρακτηριστικά είναι και οι πολυφαινόλες. Πολλές φαινολικές ενώσεις, ελεύθερα λιπαρά οξέα και αρωματικές ενώσεις έχουν ανιχνευθεί (Ethaliotis et al., 1999; Ramos-Comenzana et al., 1995) σε κατάλοιπα της παραγωγικής διαδικασίας του ελαιόλαδου. Αυτές οι ουσίες συνδέονται με φυτοτοξικές και αντιμικροβιακές ιδιότητες (Obied et al., 2005). Αρκετοί ερευνητές ανέφεραν ότι η αναστολή της μικροβιακής ανάπτυξη και η τοξική δραστικότητα των αποβλήτων των ελαιοτριβείων προκαλούνται από διαφορετικές χημικές ενώσεις των ελαιοπυρήνων (Aziz et al., 1998; Bisignano et al., 2006; Ethaliotis et al., 1999). Φαινολικές ενώσεις μικρού μοριακού βάρους φαίνεται να είναι οι κύριοι προσδιοριστικοί παράγοντες της αντι- 17

18 μικροβιακής δράσης των ελαιοπυρήνων (D Annibale et al., 2004; Fiorentino et al., 2003), ενώ η πολυφαινόλες υψηλής μοριακής μάζας, οργανικά οξέα, λιπίδια, ολιγοσακχαρίτες και γλυκοπρωτεΐνες μπορούν να συμβάλουν στην φυτοτοξική επίδραση των αποβλήτων όταν αυτά εφαρμόζονται σε υψηλές συγκεντρώσεις στα φυτά (Capasso et al., 2002). Σήμερα είναι γνωστό ότι οι φαινολικές ενώσεις που παράγονται από τα φυτικά είδη μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως οικολογικό μέσο φυτοπροστασίας μιας και εμφανίζουν αντιμικροβιακή δράση (Xia et al., 2010) για τον έλεγχο των προσβολών από βακτήρια (Baydar et al., 2006; Ani et al., 2006), μύκητες (Bruno και Sparapano, 2007) και ιούς (Chavez et al., 2006). Επίσης, είναι γνωστό ότι τα απόβλητα των ελαιοτριβείων περιέχουν σημαντικό αριθμό βιολογικώς δραστικών ουσιών ικανών να αναστέλλουν την ανάπτυξη των μικροοργανισμών (Ramos-Comenzana et al., 1995), ακόμη και φυτών δρώντας ως ζιζανιοκτόνα (Martin et al., 2002). Επιπρόσθετα, σύμφωνα με τον Vagela et al., (2009) τα υπολείμματα των ελαιοτριβείων φαίνεται να έχουν αποτελεσματική αντιμυκητιακή δράση έναντι εδαφογενών φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών. Η χρήση των αποβλήτων του ελαιοτριβείου ως μέσο προστασίας των φρούτων και των λαχανικών τόσο κατά την καλλιεργητική περίοδο όσο και μετά τη συγκομιδή τους κατά την αποθήκευση είναι μια πολλά υποσχόμενη λύση για την πρόληψη ζημιών των φρούτων και των λαχανικών από μετασυλλεκτικές προσβολές όπως αυτές από το μύκητα Botrytis cinerea. Παρόμοια αποτελέσματα έχουν αναφερθεί και από άλλους ερευνητές (Bonanomi et al., 2006) στα οποία η χρήση των αποβλήτων ελαιοτριβείου μπορεί να επηρεάσει την ανάπτυξη σαπροφυτικών μυκήτων, την συχνότητα εμφάνισης νόσων φυλλώματος, τα εδαφογενή φυτοπαθογόνα πριν και μετά τη συγκομιδή. Για αυτό το λόγο και τα τελευταία χρόνια διακρίνεται αυξανόμενο ενδιαφέρον για την απομόνωση, την εξέταση και την αξιοποίηση των γεωργικών αποβλήτων ή άλλων πηγών φυτικών ιστών πλούσιων σε πολυφαινόλες, όπως είναι οι φυτικοί ιστοί των ειδών Olea europaea, Prunus amygdalus, Stevia rebaudiana κ.α. καθώς και των αποβλήτων τους, όπως τα ύδατα των αποβλήτων ελαιοτριβείων. Συνεπώς, η χρήση υποπροϊόντων τα οποία προέρχονται από την επεξεργασία φυτικών ιστών μπορούν να προσφέρουν νέα προϊόντα υψηλής προστιθέμενης αξίας αλλά ταυτόχρονα να 18

19 μειώσουν τους περιβαλλοντικούς κινδύνους και τα επίπεδα μόλυνσης εάν αυτά απορριπτόταν στο περιβάλλον. Επιπλέον, η αλόγιστη χρήση συνθετικών φυτοφαρμάκων και μυκητοκτόνων στη σύγχρονη γεωργία δεν έχει μόνο οδηγήσει στην ανάπτυξη ανθεκτικών στελεχών από πλευράς παθογόνων οργανισμών, αλλά έχουν ως αποτέλεσμα και την παρουσία τοξικών καταλοίπων στις καλλιέργειες και κατά συνέπεια και στο περιβάλλον με αποτέλεσμα την δυσμενή επίδραση στην ανθρώπινη υγεία αλλά και στην ποιότητα του περιβάλλοντος. Ως εκ τούτου, εναλλακτικά, φιλικά προς το περιβάλλον, μέσα καταπολέμησης εχθρών και ασθενειών των φυτών απαιτούνται (Abd-El-Kareem, 2007) με σκοπό τη μείωση των επιπτώσεων των χημικών σκευασμάτων στην ανθρώπινη υγεία και το περιβάλλον. Σήμερα, αν και έχουν αρκετές προσπάθειες για την επίλυση του περιβαλλοντικού προβλήματος της απόρριψης των αποβλήτων των ελαιοτριβείων η εξάλειψη τους παραμένει ένα από τα κύρια περιβαλλοντικά προβλήματα που σχετίζονται με το τομέα του ελαιολάδου στις χώρες της Μεσογείου, όπου η Ελλάδα, η Ισπανία και η Ιταλία είναι οι μεγαλύτεροι παραγωγοί (Paredes et al., 1999). Οι συμβατικές προσεγγίσεις της αερόβιας και αναερόβιας επεξεργασίας έχουν αποτύχει να παράσχουν μια βιώσιμη λύση για το πρόβλημα λόγω των ιδιαιτεροτήτων της σύνθεσης των αποβλήτων των ελαιοτριβείων και την παρουσία των πολυφαινολών, οι οποίες αναστέλλουν τους μικροοργανισμούς αποσύνθεσης να δράσουν Σκοπός της έρευνας Πρόσφατα διαφαίνεται το αυξανόμενο ενδιαφέρον στις επιδράσεις των πολυφαινολών που προέρχονται από απόβλητα ελαιοτριβείων έναντι σημαντικών φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών και ειδικότερα μυκήτων. Η εκτίμηση διαφορετικών συγκεντρώσεων και μορφών (ελεύθερες και ενκαψιλιωμένες πολυφαινόλες) ως φυτοπροστατευτικών υλικών με in vitro δοκιμές για την καταπολέμηση οικονομικά σημαντικών φυτοπαθογόνων μυκήτων είναι το κύριο ερευνητικό πεδίο αυτού του πακέτου εργασίας. Ειδικότερα, η in vitro αντιμικροβιακή δραστικότητα των πολυφαινολών εκτιμήθηκε σε μια σειρά φυτοπαθογόνων μυκήτων όπως είναι ο μύκητας Ascochyta lentis ο οποίος προσβάλει τα όσπρια, ο Gaeumanomyces graminis ο οποίος προσβάλει τις ρίζες και το στέλεχος των σιτηρών προκαλώντας σήψεις ριζών και τήξεις φυταρίων, ο Aspergillus fluvus σημαντικό παθογόνο το οποίο παράγει μυκοτοξίνες, η Monillia 19

20 laxa, η Monillia fructigena και η Eutypa lata φυτοπαθογόνα είδη που προκαλούν σήψεις στους καρπούς και σε πράσινους ιστούς δενδρωδών ειδών, ο Armillaria mellea σημαντικός βασιδιομύκητας που προσβάλει πολλά δασικά και δενδρώδη είδη, 2 είδη του Verticcillium dahliae εκ των οποίων το ένα προκαλεί αδρομυκώση στην τομάτα και το άλλο στην ελιά, ο μύκητας Sclerotinia sclerotiorum ο οποίος ως εδαφογενές παθογόνο προσβάλει πλήθος φυτικών ειδών, το Penicillium italicum, το Penicillium expansum και ο Aspergillus niger οι οποίοι προκαλούν μετασυλλεκτικές προσβολές σε αποθηκευμένους καρπούς, ο Botrytis cinerea ένα καλά μελετημένο ως τώρα φυτοπαθογόνο είδος το οποίο προσβάλει τα άνθη, τα φύλλα και κυρίως τους καρπούς των φυτών προκαλώντας μετασυλλεκτικές σήψεις σε φυτά όπως η φράουλα, η τομάτα κ.α., το Pythium ultimum και το είδος Rhizoctonia solani τα οποία ως εδαφογενή παθογόνα προκαλούν σήψεις ριζών, η Cercospora beticola σημαντικό φυτοπαθογόνο φυλλώματος των ζαχαρότευτλων, η Phytopthora nicotiana η οποία θεωρείται σημαντικό φυτοπαθογόνο είδος του φυλλώματος του καπνού, η Alternaria alternata η οποία προσβάλει το φύλλωμα αλλά και τις ρίζες πλήθους φυτικών ειδών ως παράσιτο αδυναμίας και το Fusarium oxysporum το οποίο προκαλεί αδρομυκώσεις σε πλήθος φυτικών ειδών. Όλα τα περιγραφέντα είδη των μυκήτων που εξετάστηκαν προέρχονται από συλλογή η οποία αποκτήθηκε από το Μπενάκειο Φυτοπαθολογικό Ινστιτούτο. Οι κωδικοί των προς εξέταση ειδών περιγράφονται στο κεφάλαιο με τα υλικά και τις μεθόδους. Στο πρώτο στάδιο της πειραματικής διαδικασίας, εφαρμόστηκε η μέθοδος μέτρησης ζωνών αναστολής σε mm, με την μέθοδο των «χάρτινων δίσκων» ( disk diffusion assay ), και με τη μέθοδο των «πηγαδιών» ( well diffusion assay ). Στο δεύτερο στάδιο αξιολόγησης, η μέθοδος που εφαρμόστηκε ήταν ο προσδιορισμός της ελάχιστης ανασταλτικής / μικροβιοκτόνου συγκέντρωσης (MIC/MFC) έναντι 14 μικροοργανισμών. 20

21 2 ο ΚΕΦΑΛΑΙΟ Υλικά και Μέθοδοι 2. Υλικά και Μέθοδοι Για την εξέταση της αντιμικροβιακής δράσης των παραγόμενων πολυφαινολών εναντίων σημαντικών φυτοπαθογόνων ειδών εφαρμόστηκαν οι ακόλουθες τεχνικές: Μέτρηση ζωνών αναστολής (Well diffusion assay) Μέτρηση ζωνών αναστολής (Paper disk diffusion assay) Ο ρυθμός εξάπλωσης του μυκηλίου σε τριβλεία Petri Με σκοπό τον προσδιορισμό της ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (Minimum Inhibitory Concentration-MIC) και της ελάχιστης μικρoβιοκτόνου συγκέντρωσης (Minimum Fungicidal Concentration (MFC). Η πλειονότητα των μικροοργανισμών που χρησιμοποιήθηκαν αποκτήθηκαν από το Μπενάκειο Φυτοπαθολογικό Ινστιτούτο (Μπ.Φ.Ι.) σε θρεπτικό υπόστρωμα PDA σε τριβλεία Petri, ενώ ο Aspergillus fluvus δόθηκε από το εργαστήριο μικροβιολογίας του τήματος Τεχνολογίας Τροφίμων του ΤΕΙ Θεσσαλίας, παράρτημα Καρδίτσας. Τα φυτοπαθογόνα, ο κωδικός τους καθώς και η προέλευση αναφέρονται στον ακόλουθο Πίνακα 6: 21

22 Πίνακας 6: Είδη μυκήτων που χρησιμοποιήθηκαν στις βιο-δοκιμές Παθογόνο Κωδικός Προέλευση Ascochyta lentis Μπ.Φ.Ι. Gaeumanomyces graminis Μπ.Φ.Ι. Aspergillus flavus Εργαστήριο μικροβιολογίας τμήματος Τεχνολογία Τροφίμων Monillia laxa Μπ.Φ.Ι. Armillaria mellea Μπ.Φ.Ι. Verticillium dahliae (τοματα) Μπ.Φ.Ι. Sclerotinia sclerotiorum Μπ.Φ.Ι. Penicillium italicum Μπ.Φ.Ι. Aspergillus niger Botrytis cinerea Μπ.Φ.Ι. Phythium ultimum Μπ.Φ.Ι. Cercospora beticola Μπ.Φ.Ι. Peniccilium expansum Μπ.Φ.Ι. Eutypa lata Μπ.Φ.Ι. Rhizoctonia solani Μπ.Φ.Ι. Phytopthora nicotiana Μπ.Φ.Ι. Monillia fructigena Μπ.Φ.Ι. Alternaria alternata Μπ.Φ.Ι. Verticillium dahliae (Ελιά) Μπ.Φ.Ι. Fusarium oxysporum Μπ.Φ.Ι. Τμήμα των μυκηλιακών υφών από το αρχικό μέσο (τριβλεία με PDA) τοποθετήθηκε σε δοκιμαστικούς σωλήνες οι οποίοι περιείχαν κεκλιμένο θρεπτικό υπόστρωμα PDA και οδηγήθηκαν στο ψυγείο στους 3 C για να συντηρηθούν για περισσότερο χρονικό διάστημα. Η διεξαγωγή των πειραμάτων και η αξιολόγηση της δραστικότητας των προς εξέταση δειγμάτων πολυφαινολών που προέρχονται από επεξεργασία αποβλήτων ελαιοτριβείων, διενεργήθηκε με χρήση τμημάτων και σπορίων των μυκήτων από αυτό το υλικό. Τα αρχικά τριβλεία οδηγήθηκαν και αυτά στο ψυγείο όπου και όποτε κρινόταν σκόπιμο διενεργούνταν ανακαλλιέργειά τους σε νέο τριβλείο Petri το οποίο περιείχε φρέσκο θρεπτικό υπόστρωμα PDA. Οι μορφές πολυφαινόλης που προέρχονται από απόβλητα ελαιοτριβείων που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι ακόλουθες: Υγρή πολυφαινόλη Πολυφαινόλη ενθυλακωμένη σε πρωτεΐνη Πολυφαινόλη ενθυλακωμένη σε μαλτοδεξτρίνη Πολυφαινόλη ενθυλακωμένη σε πρωτεΐνη και μαλτοδεξτρίνη 22

23 Τα χαρακτηριστικά των δειγμάτων των πολυφαινολών ήταν τα ακόλουθα: Πίνακας 7: Χαρακτηριστικά πολυφαινόλης (μέσο ενθυλάκωσης-συνθήκες) Πρωτεΐνη Πρωτεΐνη + Μαλτοδεξτρίνη Μαλτοδεξτρίνη Υγρή πολυφαινόλη Intel 120 C 120 C 120 C ΔΥ Aspirator 100% 100% 100% ΔΥ Pump 5% 5% 5% ΔΥ Μπίλια ΔΥ outlet 73 C 81 C 80 C ΔΥ Για την ανάπτυξη των φυτοπαθογόνων μυκήτων χρησιμοποιήθηκε θρεπτικό υπόστρωμα MRD και PDA του οποίου η παρασκευή έγινε ως ακολούθως: Σε φιάλη των 500ml τοποθετήθηκαν 500 ml απιονισμένο νερό και 19,5 gr σκόνης PDA. Το περιεχόμενο ανακατεύτηκε για 30 περίπου λεπτά ώστε να διαλυθεί η σκόνη PDA στο απιονισμένο νερό. Στη συνέχεια το διάλυμα τοποθετήθηκε στον κλίβανο αποστείρωσης όπου και αποστειρώθηκε στους 121 C για 20 λεπτά. Το διάλυμα τοποθετείται σε τρυβλία Petri κάτω από ασηπτικές συνθήκες σε θάλαμο νηματικής ροής. Το υλικό των τρυβλίων Petri (περίπου 20 ml) αφήνεται στο θάλαμο νηματικής ροής να σταθεροποιηθεί. Παρασκευή MRD: Σε φιάλη των 1000ml τοποθετήθηκαν 1000 ml απιονισμένο νερό, 1gr Bacteriological Peptone και 8,5 gr αλάτι. Το περιεχόμενο της φιάλης αναδεύτηκε σε θερμαινόμενο μάτι έτσι ώστε όλα τα υλικά να ομογενοποιηθούν με τη βοήθεια μαγνητικών αναδευτληρων. Στη συνέχεια ακολούθησε αποστείρωση του θρεπτικού διαλύματος στον κλίβανο αποστείρωσης στους 121 C για 20 λεπτά. Τα υλικά και ο εξοπλισμός τα οποία χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα αυτού του Παραδοτέου έργου ήταν τα εξής: Κλίβανος αποστείρωσης Raypa AM-9 75λίτρων Εργαστηριακό ψυγείο Fiocchetti Κλίβανοι επώασης Binder Ηλεκτρονικός ζυγός ακριβείας 2 δεκαδικών 23

24 Συσκευή ανάδευσης Vortex Φούρνος μικροκυμάτων Οι μέθοδοι οι οποίες εφαρμόστηκαν για την μελέτη της αντιμικροβιακής δράσης των πολυφαινολών αποβλήτων ελαιοτριβείων ήταν οι ακόλουθες: 1. Μέθοδος μέτρησης αριθμών αποικιών 2. Μέθοδος μέτρησης ζωνών αναστολής σε mm (disk και well diffusion assay) 3. Ρυθμός εξάπλωσης του μυκηλίου σε τριβλεία Petri 4. Μέθοδος προσδιορισμού της ελάχιστης ανασταλτικής / μικροβιοκτόνου συγκέντρωσης (MIC/MBC) Η κάθε μέθοδος ξεχωριστά έχει ως στόχο την μελέτη της αντιμικροβιακής δράσης των πολυφαινολών αποβλήτων των ελαιοτριβείων έναντι φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών. Από το σύνολο των αποτελεσμάτων αυτών των μεθόδων παρατηρήθηκε η δραστικότητα των διάφορων μορφών και συγκεντρώσεων των προς εξέταση πολυφαινολών από απόβλητα ελαιοτριβείων (ενθυλακωμένες, υγρή), εναντίον σημαντικών φυτοπαθογόνων μυκήτων. Επίσης αξιολογήθηκε και βρέθηκε η μεγαλύτερη επίδραση στην παρεμπόδιση της ανάπτυξης, η ανασταλτική δράση και η μυκητοκτόνος συγκέντρωση τους προς εξέταση αποβλήτου ελαιοτριβείου. Ωστόσο, αυτές οι μέθοδοι διαφέρουν τόσο ως προς τα αποτελέσματα τους όσο και ως προς τον τρόπο εφαρμογής τους καθώς, στην μέθοδο μέτρησης ζωνών αναστολής σε mm οι συγκεντρώσεις των μορφών πολυφαινολών που μελετήθηκαν ήταν 10%, 20%, 30%, στη μέθοδο προσδιορισμού της ελάχιστης ανασταλτικής / μικροβιοκτόνου συγκέντρωσης MIC/MFC εφαρμόστηκαν διαφορετικές συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 3%, 5%, 10%,15%, 20%, 25%, 30%, 35%,40% και 50%. 24

25 2.2 Περιγραφή Πειραμάτων Μέθοδος μέτρησης αριθμών αποικιών Η μέθοδος αυτή εφαρμόστηκε με σκοπό τη σύγκριση της αντιμικροβιακής δράσης των διάφορων μορφών ενθυλάκωσης και συγκεντρώσεων πολυφαινολών αποβλήτων ελαιοτριβείων. Για την παρασκευή των προς εξέταση πολυφαινολών χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες μεταχειρίσεις: 1. Πολυφαινόλη υγρή 2. Πολυφαινόλη ενθυλακωμένη σε πρωτεΐνη 3. Πολυφαινόλη ενθυλακωμένη σε μαλτοδεξτρίνη 4. Πολυφαινόλη ενθυλακωμένη σε πρωτεΐνη και μαλτοδεξτρίνη 5. Μάρτυρας (απουσία πολυφαινόλης-ανάπτυξη μυκήτων) Οι μεταχειρίσεις είχαν από 3 επαναλήψεις και το όλο πείραμα επαναλήφθηκε 2 φορές. Στις μεταχειρίσεις 2, 3 και 4, οι προς εξέταση ενθυλακωμένες πολυφαινόλες ήταν σε μορφή σκόνης. Για την διενέργεια των πειραμάτων, αυτές αραιώθηκαν σε αποστειρωμένο νερό για την δημιουργία όμοιου όγκου συγκέντρωσης. Για αυτό το λόγο 56,3gr σκόνης πολυφαινόλης ενθυλακωμένης σε πρωτεΐνη (μεταχείριση 2) διαλύθηκαν σε 500 ml αποστειρωμένο νερό. Ακολούθως, 40 gr σκόνης πολυφαινόλης ενθυλακωμένης σε μαλτοδεξτρίνη (μεταχείριση 3) διαλύθηκαν σε 500 ml αποστειρωμένο νερό και 40,7 gr σκόνης πολυφαινόλης ενθυλακωμένης σε μαλτοδεξτρινη και πρωτεΐνη (μεταχείριση 4) διαλύθηκαν σε επίσης 500 ml αποστειρωμένο νερό. Το δείγμα της υγρής πολυφαινόλης (μεταχείριση 1) χρησιμοποιήθηκε ως έχει. Στους δοκιμαστικούς σωλήνες οι οποίοι περιείχαν ο κάθε ένας και ένα φυτοπαθογόνο είδος, τοποθετήθηκαν 5ml MRD. Ακολούθησε ανάδευση του διαλύματος το οποίο περιείχε μυκηλιακές υφές και σπόρια του μύκητα με τη χρήση vortex. Η ποσότητα αυτή (5 ml) απορροφήθηκε με τη χρήση πιπέτας και εκχύθηκε εκ νέου σε αποστειρωμένο γυάλινο μπουκάλι το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως μέσο αποθήκευσης 25

26 των απαιτούμενων ποσοτήτων μυκηλιακών υφών και σπορίων του προς εξέταση μύκητα. Ο αριθμός των γυάλινων μπουκαλιών ήταν όσος και ο αριθμός των εξεταζόμενων φυτοπαθογόνων μυκήτων. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται έως ότου μαζευτούν τα 20 ml εναιωρήματος σπορίων και μυκηλιακών υφών που απαιτούνται για την διεξαγωγή του πειράματος. Από αυτό το εναιώρημα σπορίων και μυκηλιακών υφών εφαρμόζεται με τη χρήση γυάλινης αποστειρωμένης με θερμότητα λαβίδας, για την αποφυγή επιμολύνσεων, κάθε φορά 0,1 ml στην επιφάνεια του τριβλείου το οποίο περιέχει θρεπτικό υπόστρωμα PDA. Από τις μεταχειρίσεις 1,2,3 και 4, ποσότητα 0,1 ml από τον τελικό όγκο συγκέντρωσης πολυφαινολών, εφαρμόστηκε στο κέντρο ενός τριβλείου Petri με τη χρήση πιπέτας. Το τριβλείο Petri είχε πρωτίστως επιστρωθεί με το μύκητα όπως περιγράφεται στην προηγούμενη παράγραφο. Για την εξέταση του αριθμού των αποικιών των μυκήτων το διάλυμα των μυκηλιακών υφών και των σπορίων (20ml) το οποίο περιέχονταν στα γυάλινα μπουκαλάκια αραιώθηκε διαδοχικά. Ο μάρτυρας περιείχε μόνο ποσότητα από εναιώρημα σπορίων-μυκηλιακών υφών σε μία από τις ακόλουθες συγκεντρώσεις των 10 4, ή 10 5, ή Τα τριβλεία Petri αποθηκεύτηκαν σε θάλαμο επώασης στους 25 C για 7 ημέρες. Με την παρέλευση 7 ημερών ακολούθησε μέτρηση του αριθμού των αποικιών που αναπτύχθηκαν και τα οποία περιγράφονται στο επόμενο κεφάλαιο «Αποτελέσματα» καθώς και διάμετρός της αποικίας τους σε mm με τη βοήθεια μετρικού χάρακα. 26

27 2.2.2 Μέθοδος μέτρησης ζωνών αναστολής σε mm (Disk diffusion assay) Η μέθοδος αυτή εφαρμόστηκε με σκοπό τη σύγκριση της αντιμικροβιακής δράσης των διαφόρων μορφών ενθυλάκωσης και συγκενρώσεων της πολυφαινόλης σε 20 φυτοπαθογόνους μύκητες. Χρησιμοποιήθηκαν αποστειρωμένα τρυβλία, τα οποία γέμισαν με 20 ml θρεπτικό υπόστρωμα για τους είκοσι (20) φυτοπαθογόνους μύκητες αντίστοιχα. Εξετάστηκαν τρεις συγκεντρώσεις από κάθε είδος μεταχείρισης (ενθυλακωμένα και μη) των αποβλήτων των ελαιοτριβείων. Οι συγκεντρώσεις αυτές ήταν οι ακόλουθες: 10%. 20% και 30%. Οι μεταχειρίσεις αφορούσαν: Υγρή πολυφαινόλη σε συγκέντρωση 10, 20 και 30% από τον αρχικό όγκο. Πολυφαινόλη ενθυλακωμένη σε πρωτεΐνη σε συγκέντρωση 10, και 20% από τον αρχικό όγκο. Πολυφαινόλη ενθυλακωμένη σε μαλτοδεξτρίνη σε συγκέντρωση 10% από τον αρχικό όγκο. Πολυφαινόλη ενθυλακωμένη σε μαλτοδεξτρίνη και πρωτεΐνη σε συγκέντρωση 10 και 20% από τον αρχικό όγκο. Μάρτυρας (απουσία πολυφαινολών, παρουσία μόνο μυκήτων). Μετά την σταθεροποίηση των θρεπτικών υποστρωμάτων ακολουθεί επίστρωση με 0,5 ml εμβολίου με τα είκοσι (20) φυτοπαθογόνα είδη μυκήτων. Έπειτα, έγινε εμβάπτιση χάρτινων αποστειρωμένων δίσκων διαμέτρου 5 mm στην προς εξέταση συγκέντρωση διαλύματος πολυφαινολών, αποβλήτων ελαιοτριβείου για περίπου ένα λεπτό κοντά στον λύχνο Bunsen, για την αποφυγή επιμολύνσεων. Στη συνέχεια με μια αποστειρωμένη λαβίδα απομακρύνονται οι χάρτινοι δίσκοι από το διάλυμα της πολυφαινόλης και τοποθετούνται κοντά στη φλόγα έτσι ώστε να στραγγίξουν καλά. Ακολούθησε μεταφορά των χάρτινων δίσκων στο κέντρο των τρυβλίων στα οποία έχει γίνει η επίστρωση και στη συνέχεια έγινε επώαση τους στους 28 o C για χρονικό διάστημα έως 7 ημέρες. Ο αριθμός των επαναλήψεων ανά μεταχείριση ήταν 4. Μετρήσεις πάρθηκαν την τελευταία μέρα της επώασης (7 η ) με την βοήθεια αριθμημένου χάρακα όπου και πραγματοποιήθηκε μέτρηση των ζωνών αναστολής που σχηματίστηκαν γύρω από την περιοχή των χάρτινων δίσκων κατά τη διάρκεια της επώασης των τρυβλίων έως την 7 η ημέρα. 27

28 2.2.3 Μέθοδος μέτρησης ζωνών αναστολής σε mm (Well diffusion assay) Η μέθοδος αυτή εφαρμόστηκε με σκοπό τη σύγκριση της αντιμικροβιακής δράσης των διαφόρων μορφών ενθυλάκωσης και συγκενρώσεων της πολυφαινόλης σε 20 φυτοπαθογόνους μύκητες. Πιο συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκαν αποστειρωμένα τρυβλία, τα οποία γέμισαν με 20 ml θρεπτικό υπόστρωμα για τους είκοσι (20) φυτοπαθογόνους μύκητες αντίστοιχα. Εξετάστηκαν τρεις συγκεντρώσεις από κάθε είδος μεταχείρισης (ενθυλακωμένα και μη) των αποβλήτων των ελαιοτριβείων. Οι συγκεντρώσεις αυτές ήταν οι ακόλουθες: 10%. 20% και 30%. Οι μεταχειρίσεις αφορούσαν: Υγρή πολυφαινόλη σε συγκέντρωση 10, 20 και 30% από τον αρχικό όγκο. Πολυφαινόλη ενθυλακωμένη σε πρωτεΐνη σε συγκέντρωση 10, και 20% από τον αρχικό όγκο. Πολυφαινόλη ενθυλακωμένη σε μαλτοδεξτρίνη σε συγκέντρωση 10% από τον αρχικό όγκο. Πολυφαινόλη ενθυλακωμένη σε μαλτοδεξτρίνη και πρωτεΐνη σε συγκέντρωση 10 και 20% από τον αρχικό όγκο. Μάρτυρας (απουσία πολυφαινολών, παρουσία μόνο μυκήτων). Μετά την σταθεροποίηση των θρεπτικών υποστρωμάτων ακολουθεί επίστρωση με 0,5 ml εμβολίου με τα είκοσι (20) φυτοπαθογόνα είδη μυκήτων. Ακολούθησε η δημιουργία μικρής οπής (σαν πηγάδι) στο κέντρο του τριβλείου με το στεροποιημένο θρεπτικό υπόστρωμα στην οποία εκχύθηκαν 10 μl από την κάθε δείγμα (διαφορετική συγκέντρωση, μέσο ενθυλάκωσης) της εξεταζόμενης πολυφαινόλης. Στη συνέχεια τα τριβλεία επωάστηκαν στους 28 o C για 7 ημέρες σε κλίβανο επώασης και στο τέλος γίνεται η καταμέτρηση των ζωνών αναστολής ε την βοήθεια αριθμημένου χάρακα γύρω από την περιοχή της οπής (πηγαδιού). 28

29 2.2.4 Μέθοδος προσδιορισμού της ελάχιστης ανασταλτικής / μικροβιοκτόνου συγκέντρωσης (MIC/MFC) Στη συγκεκριμένη μέθοδο παρασκευάστηκαν αποστειρωμένοι δοκιμαστικοί σωλήνες που περιείχαν ο καθένας 10 ml υπόστρωμα Malt Extract (ΜΕ). Ακολούθησε θέρμανση των δοκιμαστικών σωλήνων στους 60 o C μέχρις ότου να ρευστοποιηθεί το υπόστρωμα που περιείχαν. Στη συνέχεια στα ρευστοποιημένα υποστρώματα προστέθηκαν οι ακόλουθες ποσότητες της υγρής και μόνο πολυφαινόλης (ΠΦ) των αποβλήτων ελαιοτριβείων. Για την επίτευξη του τελικού όγκου των διαφορετικών συγκεντρώσεων εφαρμόστηκαν ακολούθως οι παρακάτω ποσότητες πολυφαινόλης (ΠΦ) έως τη συμπλήρωση των 10 ml του δοκιμαστικού σωλήνα. 0% 1% 5% 10% 20% 30% 40% 50% 0,05 ml 0,26 ml 0,55 ml 1,25 ml 2,14 ml 3,33 ml 5 ml (ΠΦ) (ΠΦ) (ΠΦ) (ΠΦ) (ΠΦ) (ΠΦ) (ΠΦ) Στη συνέχεια οι ποσότητες αυτές τοποθετήθηκαν σε ανάδευση στο Vortex ώστε να ομογενοποιηθεί καλά το διάλυμα της υγρής πολυφαινόλης με το υπόστρωμα. Ακολούθησε εμβολιασμός των δοκιμαστικών σωλήνων με streak των 20 φυτοπαθογόνων μυκήτων, ξεχωριστά για τον κάθε δοκιμαστικό σωλήνα. Οι δοκιμαστικοί σωλήνες με τους φυτοπαθογόνους μύκητες επωάστηκαν στους 27 o C για ώρες στον κλίβανο επώασης Binder σε αερόβιες συνθήκες. Μετά την ολοκλήρωση της επώασης έγινε καταγραφή των αποτελεσμάτων τα οποία αφορούν την ύπαρξη ανάπτυξης με τη μορφή μικυλίου εντός του διαλύματος (στην επιφάνεια ή στον πάτο του δοκιμαστικού σωλήνα. Οι δοκιμαστικοί σωλήνες στους οποίους είχε αναπτυχθεί μυκήλιο του παθογόνου μύκητα έδειξαν ότι η ποσότητα της υγρής πολυφαινόλης δεν ήταν αρκετή ώστε να αναστείλει την ανάπτυξη των μικροοργανισμών, για αυτό το λόγο χαρακτηρίστηκαν ως <<θετικοί>>. Ενώ οι δοκιμαστικοί σωλήνες στους οποίους δεν παρουσιάστηκε η οποιαδήποτε ανάπτυξη μυκηλίου του εξεταζόμενου φυτοπαθογόνου μύκητα θεωρήθηκε ότι παρουσίασαν αναστολή της ανάπτυξης του («αρνητικοί»). 29