artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο

Transcript

1 Απρίλιος 2009 artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο Εκδοση 1 24 (Αρ.Καταλόγου ) 96 (Αρ.Καταλόγου ) Διαγνωστικό προïόν in vitro ποσοτικού προσδιορισμού Για τη χρήση με όργανα Rotor-Gene Q , EL QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden R EL Sample & Assay Technologies

2 Τεχνολογίες δείγματος και ανάλυσης της QIAGEN Η QIAGEN είναι ο πρωτεύων προμηθευτής τεχνολογιών δειγμάτων και εξετάσεων όσον αφορά την απομόνωση και ανάλυση κάθε βιολογικού δείγματος. Τα υψηλής ποιότητας προϊόντα μας και η άριστη εξυπηρέτηση εξασφαλίζουν επιτυχία από την προετοιμασία του δείγματος μέχρι τα αποτελέσματα. Η QIAGEN θέτει πρότυπα για: Απομόνωση του DNA, RNA και πρωτεϊνών Συστήματα εξετάσεων για νουκλεϊνικά οξέα και πρωτεΐνες Ερευνα microrna και RNAi Αυτοματοποίηση τεχνολογίας δειγμάτων και εξετάσεων Σκοπός μας είναι να σας δοθεί η δυνατότητα να έχετε έξοχες επιτυχίες και σημαντικές ανακαλύψεις. Για περισσότερες πληροφορίες επισκευθείτε την ιστοσελίδα

3 Περιεχόμενα Περιεχόμενα του κιτ 4 Σύμβολα 4 Αποθήκευση 5 Προοριζόμενη χρήση 5 Περιορισμοί χρήσης προїόντος 5 Τεχνική εξυπηρέτηση 6 Ποιοτικός έλεγχος 6 Πληροφορίες ασφαλείας 6 Εισαγωγή 7 Αρχή 7 Πληροφορίες σχετικά με τους παθογόνους παράγοντες 7 Ειδικά χαρακτηριστικά 8 Παρεχόμενος εξοπλισμόςκαι αντιδραστήρια 16 Σημαντικές σημειώσεις 17 Γενικά μέτρα ασφαλείας 17 Συλλογή, φύλαξη και μεταφορά δειγμάτων 17 Απομόνωση DNA 18 Πρότυπο εσωτερικού ελεγχου 19 Ποσοτικοποίηση 20 Πρωτόκολλο: PCR και Αξιολόγηση 21 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων 30 Παραπομπές 33 Πληροφορίες παραγγελιών 34 artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 3

4 Περιεχόμενα του κιτ artus HBV RG PCR Kit (24) (96) Αρ. καταλόγου Αριθμός αντιδράσεων Μπλε HBV RG/TM Master 2 x 12 αντιδράσεις 8 x 12 αντιδράσεις Κόκκινο HBV RG/TM QS 1* (1 x 10 5 IU /µl) 2 x 12 αντιδράσεις 8 x 12 αντιδράσεις Κόκκινο HBV RG/TM QS 2* (1 x 10 4 IU /µl) 200 µl 200 µl Κόκκινο HBV RG/TM QS 3* (1 x 10 3 IU/µl) 200 µl 200 µl Κόκκινο HBV RG/TM QS 4* (1 x 10 2 IU/µl) 200 µl 200 µl Κόκκινο HBV RG/TM QS 5* (1 x 10 1 IU/µl) 200 µl 200 µl Πράσινο HBV RG/TM IC 1000 µl 2 x 1000 µl Λευκό Water (PCR grade) 1000 µl 1000 µl Εγχειρίδιο 1 1 * Πρότυπο ποσοτικοποίησης. Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου. Σύμβολα <N> Το περιεχόμενο επαρκεί για <N> τεστ Ημερομηνία λήξης Διαγνωστικό ιατρικό προϊόν in-vitro Αριθμός καταλόγου Αριθμός παρτίδας Αριθμός υλικού Συστατικά 4 artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

5 Περιεχόμενα Αριθμός Περιορισμοί θερμοκρασίας Νόμιμος κατασκευαστής Παραπομπή στις πληροφορίες που δίνονται στο εγχειρίδιο Σημαντικές οδηγίες Αποθήκευση Τα υλικά του artus HBV RG PCR Kit αποθηκεύονται στους -20 C και διατηρούνται μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναφέρεται στην ετικέττα. Επαναληπτική απόψυξη/ψύξη (>2x) θα πρέπει να αποφεύγεται, γιατί με τον τρόπο αυτό μειώνεται η ευαισθησία. Εάν τα αντιδραστήρια δεν χρησιμοποιούνται τακτικά, θα πρέπει να γίνεται επιμερισμός τους. Αποθήκευση στους 2 8 C δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τις πέντε ώρες. Προοριζόμενη χρήση Το artus HBV RG PCR Kit ένα σύστημα πολλαπλασιασμού νουκλεϊνικών οξέων in vitro για τον ποσοτικό προσδιορισμό του DNA του ιού της ηπατίτιδας Β (HBV) σε πλάσμα ανθρώπου. Το διαγνωστικό αυτό κιτ εξέτασης χρησιμοποιεί την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και είναι διαμορφωμένο για τη χρήση με τα όργανα Rotor-Gene Q. Περιορισμοί χρήσης προїόντος Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να χρησιμοποιούνται αποκλειστικά για διαγνωστικούς σκοπούς in vitro. Η χρήση πρέπει να γίνεται από ειδικά εκπαιδευμένο και καταρτισμένο προσωπικό στις διαγνωστικές διαδικασίες in vitro (EN375). Η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου είναι απολύτως απαραίτητη, για την επίτευξη άριστων αποτελεσμάτων της PCR. Προσοχή στις ημερομηνίες λήξης που αναγράφονται στη συσκευασία και στις ετικέττες των επιμέρους στοιχείων. Τα αντιδραστήρια των οποίων έχει παρέλθει η ημερομηνία λήξης δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται. artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 5

6 Τεχνική εξυπηρέτηση Στη QIAGEN είμαστε υπερήφανοι για την ποιότητα και την διαθεσιμότητα της τεχνικής μας εξυπηρέτησης. Το τμήμα της τεχνικής μας εξυπηρέτησης είναι πλαισιωμένο με έμπειρους επιστήμονες με ευρεία πρακτική και θεωριτική γνώση στις τεχνολογίες δείγματος και μεθόδου και τη χρήση προїόντων της QIAGEN. Εάν έχετε γενικά ερωτήσεις που αφορούν το artus HBV RG PCR Kit ή προїόντα της QIAGEN, μην καθυστερείτε να έρθετε σε επαφή μαζί μας. Οι πελάτες της QIAGEN αποτελούν μια μεγάλη πηγή πληροφοριών όσον αφορά την προώθηση και τις ειδικές χρήσεις των προїόντων μας. Οι πληροφορίες αυτές είναι χρήσιμες για άλλους επιστήμονες καθώς και τους ερευνητές της QIAGEN. Για το λόγο αυτό λάβετε το θάρρος να επικοινωνήστε με μας εάν έχετε οποιεσδήποτε προτάσεις που αφορούν την παρουσίαση των προїόντων ή καινούργιες εφαρμογές και τεχνικές. Για τεχνική εξυπηρέτηση και περισσότερες πληροφορίες παρακαλούμε επισκευθείτε το κέντρο τεχνικής υποστήριξής μας στην ιστοσελίδα ή τηλεφωνήστε μια από τις τεχνικές υπηρεσίες της QIAGEN ή τους τοπικούς αντιπροσώπους (βλέπε το πίσω εξώφυλλο ή επισκευθείτε την ιστοσελίδα Ποιοτικός έλεγχος Σύμφωνα με το σύστημα πιστοποιητικού ποιοτικής διαχείρησης ISO της QIAGEN, ελέγχεται κάθε παρτίδα του artus HBV RG PCR Kit υπό καθορισμένα κριτήρια ελέγχου, για την εξασφάλιση μιας ομοιόμορφης ποιότητας του προϊόντος. Πληροφορίες ασφαλείας Κατά την επαφή σας με χημικές ουσίες, φορέστε πάντα ποδιά εργαστηρίου, γάντια και γυαλιά ασφαλείας. Περαιτέρω πληροφορίες μπορείτε να βρείτε στα φυλλάδια δεδομένων ασφαλείας (MSDSs). Στην επιγραμμική συλλογή μας των φυλλαδίων δεδομένων ασφαλείας, στην ιστοσελίδα μπορείτε να βρείτε για κάθε κιτ και κάθε περιεχόμενο του κιτ το εκάστοτε MSDS ως PDF αρχείο, το οποίο μπορείτε να διαβάζετε και να εκτυπώνετε. Καταστρέψτε τα απορρίματα δειγμάτων και ανάλυσης σύμφωνα με τους κανονισμούς σας ασφαλείας. Κλήση κινδύνου σε 24ωρη βάση Σε περίπτωση κινδύνου μπορείτε να πάρετε ιατρικές πληροφορίες όλο το 24ωρο στην αγγλική, γαλλική και γερμανική γλώσσα: Κέντρο πληροφοριών δηλητηριάσεων στο Mainz, Γερμανία Tel: artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

7 Εισαγωγή To artus HBV RG PCR Kit είναι ένα σύστημα έτοιμο προς χρήση για την ανίχνευση του DNA του HBV μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) στα όργανα Rotor-Gene Q. To HBV RG/TM Master περιέχει αντιδραστήρια και ένζυμα για τον ειδικό πολλαπλασιασμό ενός τμήματος μεγέθους 134 bp, του γονιδιώματος του HBV καθώς και για την άμεση ανίχνευση του προϊόντος πολλαπλασιασμού στο κανάλι φθορισμού Cycling Green του Rotor-Gene Q ή του Rotor-Gene 6000 ή στο κανάλι φθορισμού Cycling A.FAM του Rotor-Gene Πέραν αυτού, το artus HBV RG PCR Kit περιέχει, για την ανίχνευση μιας πιθανής αναστολής της PCR, ένα δεύτερο ετερόλογο σύστημα πολλαπλασιασμού. Αυτό ανιχνεύεται ως πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (IC) στο κανάλι φθορισμού Cycling Yellow του Rotor-Gene Q ή του Rotor-Gene 6000 ή στο κανάλι φθορισμού Cycling A.JOE του Rotor-Gene Το όριο ανίχνευσης της αναλυτικής PCR του HBV δεν επηρεάζεται αρνητικά (βλέπε Αναλυτική ευαισθησία, σελίδα 8). Μαζί παρέχονται εξωτερικά θετικά πρότυπα ελέγχου (HBV RG/TM QS 1-5), με τη βοήθεια των οποίων μπορεί να πραγματοποιηθεί προσδιορισμός της ποσότητας του του DNA του ιού. Ανατρέξτε σχετικά στην ενότητα Ποσοτικοποίηση, σελίδα 20. Αρχή Η διάγνωση παθογόνων οργανισμών με τη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) βασίζεται στον πολλαπλασιασμό συγκεκριμένων περιοχών του γονιδιώματος του παθογόνου παράγοντα. Στην αντίδραση PCR πραγματικού χρόνου η ανίχνευση γίνεται με τη βοήθεια φθορίζουσων χρωστικών ουσιών. Οι ουσίες αυτές είναι συνήθως συνδεδεμένες σε ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές, οι οποίοι προσκολλώνται ειδικά στο προϊόν του πολλαπλασιασμού της PCR. Η μέτρηση των εντάσεων φθορισμού, κατά την εξέλιξη της PCR (που σημαίνει πραγματικού χρόνου), επιτρέπει την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση των προϊόντων, χωρίς να χρειάζεται να ανοιχθούν και πάλι τα σωληνάρια των δειγμάτων μετά την πραγματοποίηση της αντίδρασης PCR. * Πληροφορίες σχετικά με τους παθογόνους παράγοντες Ο ιός της ηπατίτιδας Β (HBV) μεταδίδεται κυρίως με το αίμα και τα παράγωγα του αίματος. Ωστόσο, είναι πιθανή και η μόλυνση μέσω της σεξουαλικής επαφής, καθώς και από το στόμα ή περιγεννητικά. Μετά από γενικό αίσθημα αδιαθεσίας που εκδηλώνεται με ανορεξία, εμετό και κοιλιακές διαταραχές, το 10-20% των ατόμων που έχουν προσβληθεί παρουσιάζουν πυρετό, εξανθήματα και ρευματοειδείς ενοχλήσεις στις αρθρώσεις και τους μύες ημέρες αργότερα εμφανίζεται ίκτερος, που ενδέχεται να συνδυάζεται με κνησμό. Ένα ποσοστό 1 % του συνόλου των ατόμων που έχουν προσβληθεί εμφανίζει αιφνίδια οξεία ηπατίτιδα, η οποία καταλήγει συχνά στο θάνατο. Στο 5-10 % του συνόλου των ασθενών εκδηλώνεται χρόνια ηπατική φλεγμονή, η οποία ενδέχεται να οδηγήσει σε παρουσίαση κίρρωσης του ήπατος ή πρωτοπαθούς ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. * Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, 190. artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 7

8 Ειδικά χαρακτηριστικά Αναλυτική ευαισθησία Τόσο το αναλυτικό όριο ανίχνευσης όσο και το αναλυτικό όριο ανίχνευσης λαμβάνοντας υπόψη την απομόνωση (όρια ευαισθησίας) υπολογίσθηκαν για το artus HBV RG PCR Kit.Το αναλυτικό όριο ανίχνευσης λαμβάνοντας υπόψη την απομόνωση καθορίστηκε με τη βοήθεια κλινικών θετικών στον HBV δειγμάτων σε συνδυασμό με την ειδική μέθοδο εκχύλισης. Απεναντίας, το αναλυτικό όριο ανίχνευσης προσδιορίστηκε χωρίς κλινικά δείγματα και ανεξάρτητα από τη μέθοδο απομόνωσης με τη βοήθεια ενός προτύπου γνωστής συγκέντρωσης. Για τον προσδιορισμό της αναλυτικής ευαισθησίας του artus HBV RG PCR Kit δημιουργήθηκε μία πρότυπη σειρά αραιώσεων από 10 ως την ονομαστική τιμή 0,0003 IU/µl του HBV και αναλύθηκε με το artus HBV RG PCR Kit στα όργανα Rotor- Gene. Οι έλεγχοι εκτελέστηκαν σε τρεις διαφορετικές ημέρες με τη μορφή οκταπλών προσδιορισμών. Η εξαγωγή του αποτελέσματος έγινε με τη βοήθεια ανάλυσης probit. Tο αναλυτικό όριο ανίχνευσης του artus HBV RG PCR Kit σε συνδυασμό με το Rotor- Gene 3000 βρίσκεται στις 0,02 IU/µl (p = 0,05). Αυτό σημαίνει ότι 0,02 IU/µl μπορούν να ανιχνευθούν με πιθανότητα 95 %. Ισοδυναμία μεταξύ του Rotor-Gene 3000 και των Rotor-Gene Q/6000 αποδείχθηκε βάσει των τεχνικών προδιαγραφών που επιβεβαιώθηκαν με σύγκριση αναλυτικών εκτελέσεων. Αναλύσεις probit εκτελέσθηκαν παράλληλα και στα δύο συστήματα. Το αναλυτικό όριο ανίχνευσης στα Rotor-Gene Q/6000 βρίσκεται εντός των ορίων εμπιστοσύνης του Rotor-Gene Κατά συνέπεια το artus HBV RG PCR Kit μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση του DNA του HBV στο Rotor-Gene Q/6000 με παρόμοια ευαισθησία. Η αναλυτική ευαισθησία, λαμβάνοντας υπόψη την απομόνωση (QIAamp DSP Virus Kit) του artus HBV RG PCR Kit, καθορίστηκε με μία σειρά αραιώσεων του 1st International HBV standard (WHO) από 158 ως την ονομαστική τιμή 0,4 ΙU/ml του HIV σε κλινικά δείγματα πλάσματος. Αυτά υποβλήθηκαν σε εκχύλιση DNA με τη χρήση του QIAamp DSP Virus Kit (όγκος εκχύλισης: 0,5 ml, όγκος εκλούματος: 26 μl). Κάθε μία από τις επτά αραιώσεις αναλύθηκε με το artus HBV RG PCR Kit σε τρεις διαφορετικές ημέρες, με τη μορφή οκταπλών προσδιορισμών. Η εξαγωγή του αποτελέσματος έγινε με τη βοήθεια ανάλυσης probit. Η γραφική της αξιολόγηση εμφανίζεται στην Εικόνα 1. Tο αναλυτικό όριο ανίχνευσης, λαμβάνοντας υπόψη την απομόνωση του artus HBV RG PCR Kit σε συνδυασμό με το Rotor-Gene 3000, βρίσκεται κατά συνέπεια στις 3,8 IU/ml (p = 0,05). Αυτό σημαίνει ότι 3,8 IU/ml μπορούν να ανιχνευθούν με πιθανότητα 95 %. 8 artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

9 Εικόνα 1. Ανάλυση probit: HBV (Rotor-Gene 3000). Αναλυτική ευαισθησία, λαμβάνοντας υπόψη την απομόνωση (QIAamp DSP Virus Kit, QIAGEN), του artus HBV RG PCR Kit σε συνδυασμό με το Rotor-Gene Ειδικότητα Η ειδικότητα του artus HBV RG PCR Kit εξασφαλίζεται κατά κύριο λόγο με την επιλογή των εκκινητών και των ανιχνευτών καθώς και με την επιλογή αυστηρών συνθηκών αντίδρασης. Οι εκκινητές και οι ανιχνευτές έχουν ελεγχθεί με βάση την ανάλυση σύγκρισης αλληλουχίας, όσον αφορά τυχόν ομολογίες με άλλες αλληλουχίες αναφερόμενες σε τράπεζες γονιδίων. Η ανιχνευσιμότητα όλων των σχετικών γονοτύπων διασφαλίστηκε τόσο μέσω διάταξης με μία τράπεζα δεδομένων, όσο και μέσω μιας PCR στα όργανα Rotor-Gene με τους ακόλουθους γονοτύπους (Πίνακας 1). artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 9

10 Πίνακας 1. Ειδικός έλεγχος σχετικών γονοτύπων Ιός Γονότυποι Προμηθευτής HBV (Cycling Green ή A.FAM) Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (Cycling Yellow ή A.JOE)) HBV A (HΠΑ) Teragenix* + + HBV B (Ινδονησία) Teragenix + + HBV C (Ινδονησία) Teragenix + + HBV C (Βενεζουέλα) Teragenix + + HBV D (ΗΠΑ) Teragenix + + HBV E (Ακτή Teragenix + + Ελεφαντοστού) HBV F (Βενεζουέλα) Teragenix + + HBV G (ΗΠΑ) Teragenix + + HBV H (Νικαράγουα) Teragenix + + *Teragenix Corporation, Florida, USA. Για περαιτέρω ειδικό έλεγχο χρησιμοποιήθηκαν στελέχη του HBV για τα οποία είναι γνωστές διαφορές αλληλουχίας στην περιοχή του γονιδιώματος του pre-core-region (HBV Pre-Core Mutant Panel, Teragenix, Florida, USA). Ολα τα εννέα pre-core μεταλλαγμένα στελέχη της ομάδας ανιχνεύθηκαν με το artus HBV RG PCR Kit. Επιπλέον,η ειδικότητα αξιολογήθηκε με τη χρήση 100 διαφορετικών δειγμάτων πλάσματος, τα οποία ήταν αρνητικά στον HBV. Αυτά δεν εμφάνισαν κανένα σήμα με τους ειδικούς για HBV εκκινητές και ανιχνευτές που περιέχονται στο HBV RG/TM Master. Μία ενδεχόμενη διασταυρωμένη αντίδραση του artus HBV RG PCR Kit, εξετάστηκε με τη χρήση της ομάδας ελέγχου που αναφέρεται στον Πίνακας 2 (σελίδα 11). Κανένας απο τους εξεταζόμενους παθογόνους παράγοντες δεν προκάλεσε αντίδραση. Καμμία διασταυρωμένη αντίδραση δεν εμφανίστηκε με μικτές λοιμώξεις. Γραμμικό εύρος Το γραμμικό εύρος (αναλυτική μέτρηση) του artus HBV RG PCR Kit προσδιορίστηκε μέσω της ανάλυσης μιας σειράς αραιώσεων των προτύπων ποσοτικοποίησης του HBV, από 1 x 10 8 IU/µl μέχρι 1 x 10-2 IU/µl. Προηγουμένως έγινε βαθμονόμηση της σειράς αραιώσεων έναντι του WHO 1 st International HBV DNA Standard. Κάθε αραίωση εξετάσθηκε πολλαπλώς (n = 8 για συγκεντρώσεις 1 x 10 0 IU/µl; n = 16 για συγκεντρώσεις < 1 x 10 0 IU/µl) με τη χρήση του artus HBV RG PCR Kit στα όργανα Rotor-Gene. 10 artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

11 Πίνακας 2. Ειδικός έλεγχος του κιτ με δυνητικά διασταυρωμένης αντίδρασης παθογόνους παράγοντες Ομάδα ελέγχου Ανθρώπινος ιός έρπητα1 (Ιός απλού έρπητα 1) Ανθρώπινος ιός έρπητα 2 (Ιός απλού έρπητα 2) Ανθρώπινος ιός έρπητα 3 (Ιός ανεμοβλογιάς-έρπητα ζωστήρα) Ανθρώπινος ιός έρπητα 4 (Ιός Epstein-Barr) Ανθρώπινος ιός έρπητα 5 (Κυτταρομεγαλοϊός) HBV (Cycling Green ή Cycling A.FAM)) Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (Cycling Yellow ή Cycling A.JOE)) Ανθρώπινος ιός έρπητα 6 + Ανθρώπινος μη ανασοποιητικός ιός 1 + Ιός ηπατίτιδας Α Ιός ηπατίτιδας C Παρβοϊός B19 Ιός κίτρινου πυρετού Ανθρώπινος ιός Τ-κυτταρικής λευχαιμίας τύπος 1 και τύπος 2 Ιός Coxsackie B3 Ιός του δαγγείου 1-4 Escherichia coli Το γραμμικό εύρος της ποσοτικοποίησης του artus HBV RG PCR Kit καλύπτει επομένως συγκεντρώσεις από 0,02 IU/µl μέχρι τουλάχιστον 1 x 10 8 IU/µl (βλέπε Εικόνα 2). artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

12 Με την προϋπόθεση ότι το QIAamp DSP Virus Kit χρησιμοποιείται για την εκχύλιση του DNA, το artus HBV RG PCR Kit μπορεί να καλύψει ένα γραμμικό εύρος από 1,1 IU/ml μέχρι τουλάχιστον 4 x 10 9 IU/ml. Εικόνα 2. Γραμμικό εύρος του artus HBV RG PCR Kit. Υπολογισμός του γραμμικού εύρους. Η ευθεία καθορίστηκε μέσω μιας γραμμικής παλινδρόμησης των λογ 10 υπολογισθέντων συγκεντρώσεων με τις λογ 10 ονομαστικές συγκεντρώσεις. Η εξίσωση της ευθείας παλινδρόμησης περιέχεται στην εικόνα. Ακρίβεια Τα δεδομένα ακριβείας, για το artus HBV RG PCR Kit, επιτρέπουν την εξακρίβωση της ολικής διακύμανσης της ανάλυσης. H ολική διακύμανση προέρχεται από την μεταβλητότητα intra-assay (διασπορά δειγμάτων της ίδιας συγκέντρωσης μέσα σε ένα πείραμα), την μεταβλητότητα inter-assay (διασπορά λόγω της χρήσης διαφόρων συσκευών του ίδιου τύπου από διάφορα άτομα εντός ενός εργαστηρίου) και την μεταβλητότητα inter-batch (διασπορά μέσω της χρήσης διαφορετικών παρτίδων). Συγχρόνως υπολογίζεται κάθε φορά η τυπική απόκλιση, η διακύμανση και ο συντελεστής μεταβλητότητας για την PCR του συγκεκριμένου παθογόνου παράγοντα και προτύπου εσωτερικού ελέγχου. Τα δεδομένα αυτά συνελέχθηκαν, για το artus HBV RG PCR Kit, βάσει του προτύπου ποσοτικοποίησης με τη χαμηλότερη συγκέντρωση (QS 5: 10 IU /µl). Οι έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν με τη μορφή οκταπλών προσδιορισμών. Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων έγινε βάσει των τιμών Ct των καμπύλων πολλαπλασιασμού. (C T : threshold cycle, Πίνακας 3, σελίδα 13). Επιπλέον, τα δεδομένα της ακριβείας για ποσοτικά αποτελέσματα σε IU/µl προσδιορίσθηκαν με τη χρήση των αντίστοιχων τιμών C T (Πίνακας 4). Βάσει των αποτελεσμάτων αυτών η ολική διασπορά ενός τυχαίου δείγματος της αναφερομένης συγκέντρωσης ανέρχεται στο 1,29% (C T ) και 1,87% (συγκέντρωση), για την ανίχνευση του προτύπου εσωτερικού ελέγχου. Οι τιμές αυτές βασίζονται στο σύνολο των επιμέρους τιμών των εξεταζομένων μεταβλητοτήτων. 12 artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

13 Πίνακας 3 : Αποτελέσματα ακριβείας βάσει των τιμών C T Intra-assay μεταβλητότητα: HBV RG/TM QS 5 Intra-assay μεταβλητότητα: Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου Inter-assay μεταβλητότητα: HBV RG/TM QS 5 Inter-assay μεταβλητότητα: Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου Inter-batch μεταβλητότητα: HBV RG/TM QS 5 Inter-batch μεταβλητότητα: Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου Ολική διακύμανση: HBV RG/TM QS 5 Ολική διακύμανση: Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου Τυπική απόκλιση Διακύμανση Συντελεστής μεταβλητότητας (%) 0,09 0,01 0,32 0,10 0,01 1,06 0,14 0,02 0,49 0,29 0,08 1,00 0,38 0,15 1,39 0,62 0,39 2,23 0,36 0,13 1,29 0,52 0,27 1,87 Πίνακας 4. Αποτελέσματα ακριβείας βάσει των ποσοτικών τιμών (σε IU/µl) Intra-assay μεταβλητότητα: HBV RG/TM QS 5 Inter-assay μεταβλητότητα: HBV RG/TM QS 5 Inter-batch μεταβλητότητα: HBV RG/TM QS 5 Ολική διακύμανση: HBV RG/TM QS 5 Τυπική απόκλιση Διακύμανση Συντελεστής μεταβλητότητας (%) 0,93 0,87 9,28 0,79 0,63 7,92 1,03 1,05 10,21 0,90 0,81 8,99 artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

14 Ανθεκτικότητα Ο έλεγχος της ανθεκτικότητας επιτρέπει τον προσδιορισμό του συνολικού ποσοστού αποτυχίας του artus HBV RG PCR Kit. Για την επαλήθευση της ανθεκτικότητας αναμίχθηκαν 100 αρνητικά στον HBV δείγματα πλάσματος με 0,05 IU/µl όγκου έκλουσης του προτύπου DNA του HBV (περίπου τριπλή συγκέντρωση των αναλυτικών ορίων ευαισθησίας). Μετά την εκχύλιση, με τη χρήση του QIAamp DSP Virus Kit (βλέπε Απομόνωση DNA, σελίδα 18) τα δείγματα αυτά αναλύθηκαν με το artus HBV RG PCR Kit. Το ποσοστό αποτυχίας, για το σύνολο των δειγμάτων του HBV,ήταν 0 %. Επιπλέον,η ανθεκτικότητα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου ελέγχθηκε μέσω της απομόνωσης και της ανάλυσης 100 αρνητικών στον HBV δειγμάτων πλάσματος. Το συνολικό ποσοστό αποτυχίας ήταν 0 %. Δεν παρατηρήθηκαν αναστολές. Έτσι η ανθεκτικότητα του artus HBV RG PCR Kit ανέρχεται στο 99 %. Επαναληψιμότητα Τα δεδομένα της επαναληψιμότητας, επιτρέπουν μια τακτική αξιολόγηση της απόδοσης του artus HBV RG PCR Kit καθώς και σύγκριση της απόδοσής του με άλλα προϊόντα. Τα δεδομένα αυτά αποκτώνται με τη συμμετοχή σε καθιερωμένα ειδικά προγράμματα. Διαγνωστική αξιολόγηση Σε μία μελέτη από δύο ανεξάρτητα εργαστηριακά κέντρα το artus HBV RG PCR Kit συγκρίθηκε με το COBAS TaqMan HBV Assay. Για το σκοπό αυτό, εξετάσθηκαν 287 αρχικά και αναδρομικά δείγματα πλάσματος. Το DNA του HBV για τον έλεγχο του artus HBV RG PCR Kit απομονώθηκε με τη χρήση του QIAamp DSP Virus Kit και αναλύθηκε στο όργανο Rotor-Gene Για συγκριτική εξέταση με το COBAS TaqMan HBV Assay, το DNA του HBV απομονώθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή εντός της συσκευασίας.τα αποτελέσματα που αποκτήθηκαν με τη χρήση του artus HBV RG PCR Kit συγκρίθηκαν με εκείνα του COBAS TaqMan HBV Assay. Σε σύγριση με τα αποτελέσματα που συλλέχθηκαν με το COBAS TaqMan HBV Assay ως αναφορά, διαπιστώθηκε διαγνωστική ευαισθησία 100% και διαγνωστική ειδικότητα 97% του artus HBV RG PCR Kit για το σύνολο των δειγμάτων πλάσματος. Τα αποτελέσματα αυτά παρουσιάζονται στον πίνακα 5. Πίνακας 5. Αποτελέσματα της συγκριτικής έγκυρης μελέτης COBAS TaqMan HBV Assay + Αθροισμα artus HBV RG PCR Kit artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

15 Περαιτέρω εξέταση των τριών δειγμάτων που παρουσίασαν απόκλιση επιβεβαίωσαν τα αποτελέσματα του artus HBV RG PCR Kit. Ετσι μπορεί να εξαχθεί ως αποτέλεσμα ότι η απόκλιση αυτή βασίζεται στην υψηλότερη ευαισθησία του artus HBV RG PCR Kit. Η συσχέτιση των ποσοτικών αποτελεσμάτων και των δύο συστημάτων ανάλυσης έγινε με τη βοήθεια γραμμικής παλινδρόμησης. Τα αποτελέσματα και των δύο κιτ παρουσιάζονται σε αντιπαράθεση στην εικόνα 3. Εικόνα 3. Σύγκριση του COBAS TaqMan HBV Assay (Roche, HBV; με καθαρισμό δείγματος με τη χρήση του High Pure system) με το artus HBV RG PCR Kit (QIAGEN, HBV; με καθαρισμό δείγματος με τη χρήση του QIAamp DSP Virus Kit). Ο συσχετισμός των ποσοτικών αποτελεσμάτων από τα δύο συστήματα ανάλυσης έγινε με τη βοήθεια γραμμικής παλινδρόμησης. Τα αποτελέσματα των δύο κιτ παρουσιάζονται σε XY διάγραμμα (διασποράς) με log log βαθμονόμηση. artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

16 Παρεχόμενος εξοπλισμόςκαι αντιδραστήρια Κατά την επαφή σας με χημικές ουσίες, φορέστε πάντα ποδιά εργαστηρίου, γάντια και γυαλιά ασφαλείας. Περαιτέρω πληροφορίες μπορείτε να βρείτε στα φυλλάδια δεδομένων ασφαλείας (MSDSs) που διατίθενται από τους προμηθευτές προїόντων. Κιτ απομόνωσης DNA (βλέπε Απομόνωση DNA, σελίδα 18) Πιπέτες (ρυθμιζόμενες)* Στείρα ρύγχη πιπετών με φίλτρο Αναδευτήρας Vortex* Επιτραπέζια φυγόκεντρος* με κεφαλή για σωληνάρια 2 ml Οργανο Rotor-Gene Q ή Rotor-Gene* με κανάλια φθορισμού για Cycling Green και και Cycling Yellow ή με κανάλια φθορισμού για Cycling A.FAM και Cycling A.JOE Rotor-Gene Q software version (Rotor-Gene 6000 software version , , ; Rotor-Gene 3000 software version ) Σειρές σωληναρίων και καλλυμάτων, 0,1 ml, για τη χρήση με κεφαλή 72 υποδοχών (αριθ.κατ ή ) Προαιρετικά: Σωληνάρια PCR, 0,2 ml, for για τη χρήση με κεφαλή 36 υποδοχών (αριθ.κατ ή ) Μονάδα ψύξης (Loading Block 72 x 0,1 ml σωληναρίων, αριθ.κατ ή Loading Block 96 x 0,2 ml σωληναρίων, αριθ.κατ ) * Σιγουρευτείτε ότι τα όργανα ελέγχονται, συντηρούνται και βαθμονομούνται τακτικά σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή. 16 artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

17 Σημαντικές σημειώσεις Γενικά μέτρα ασφαλείας Ο χρήστης πρέπει πάντοτε να λαμβάνει υπόψη του τα ακόλουθα σημεία: Χρησιμοποίηση στείρων ρυγχών πιπέτας με φίλτρο. Το θετικό υλικό (δείγματα, πρότυπα ελέγχου, προϊόντα πολλαπλασιασμού) πρέπει να καθαρίζεται, αποθηκεύεται και να προστίθεται στην αντίδραση σε διαφορετικό χώρο από τα υπόλοιπα αντιδραστήρια. Πλήρη απόψυξη όλων των υλικών σε θερμοκρασία δωματίου(15 25 C), πριν αρχίσετε μια διαδικασία. Μετά την απόψυξη, ανάμιξη των υλικών (με επαναληπτική αναρρόφηση με πιπέτα ή με γρήγορο στροβιλισμό) και σύντομη φυγοκέντρηση. H εργασία πρέπει να γίνεται μεθοδικά και γρήγορα, σε πάγο ή μονάδα ψύξης (72/96 well loading block). Συλλογή, φύλαξη και μεταφορά δειγμάτων Όλα τα δείγματα πρέπει να χειρίζονται ως δυνητικώς μολυσματικά. Πρόσφατες μελέτες αναφέρουν ότι το EDTA ή κιτρικό πλάσμα ως το καταλληλότερο υλικό δείγματος για την ανίχνευση του HBV. Για αυτό το λόγο συνιστούμε τη χρήση των υλικών αυτών με το artus HBV RG PCR Kit. Η εγκυρότητα του artus HBV RG PCR Kit έγινε με τη χρήση δειγμάτων EDTAπλάσματος ανθρώπου. Δείγματα άλλων υλικών δεν ενδεικνύονται. Χρησιμοποιήστε μόνο το προτεινόμενο κιτ απομόνωσης νουκλεϊνικού οξέος (βλέπε Απομόνωση DNA, σελίδα 18) για την προετοιμασία των δειγμάτων. Για την ασφαλή χρήση υλικών δειγμάτων πρέπει να ακολουθούνται αυστηρά ειδικές οδηγίες που αφορούν τη συλλογή, φύλαξη και τη μεταφορά των δειγμάτων. Δειγματοληψία Κάθε αιματοληψία έχει σαν αποτέλεσμα τον τραυματισμό αιματοφόρων αγγείων (αρτηρίες, φλέβες, τριχοειδή αγγεία). Επιτρέπεται μόνο η χρήση άψογου και αποστειρωμένου υλικού. Για τη λήψη αίματος διατίθενται υλικά μιας χρήσης. Κατά την παρακέντηση των φλεβών δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται πολύ λεπτές βελόνες. Η φλεβική αιματοληψία πρέπει να γίνεται σε κατάλληλα σημεία της περιοχής του εσωτερικού του αγκώνα, του αντιβραχίου ή του μετακαρπίου. Το αίμα παραλαμβάνεται με τυποποιημένα σωληνάρια (κόκκινο κάλυμμα, Sarstedt ή ομοιότυπα σωληνάρια άλλου κατασκευαστή). Πρέπει να παραλαμβάνονται 5-10 ml μίγματος EDTA-αίματος. Τα σωληνάρια πρέπει, αμέσως μετά την παραλαβή του αίματος, να αναμειγνύονται με αναστροφή πολλές φορές (8 x, όχι ανατάραξη). Δείγματα από άτομα που λαμβάνουν ηπαρίνη δεν πρέπει να ελέγχονται (βλέπε Ανεπιθύμητες ουσίες, παρακάτω). artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

18 Φύλαξη δειγμάτων Το ολικό αίμα θα πρέπει να διαχωρισθεί στο πλάσμα και τα κυτταρικά του στοιχεία μέσα σε διάστημα έξι ωρών, με φυγοκέντρηση στους x g για 20 λεπτά. Το διαχωρισμένο πλάσμα πρέπει να μεταφερθεί σε αποστειρωμένα σωληνάρια πολυπροπυλενίου. Η ευαισθησία της εξέτασης μπορεί να μειωθεί μέσω επαναληπτικής κατάψυξης ή μακροχρόνιας φύλαξης των δειγμάτων. Το DNA που περιέχεται στον ιό διατηρείται σταθερό στους +4 C για ημέρες, στους -20 C για εβδομάδες και στους -70 C για μήνες ή χρόνια. * Μεταφορά δειγμάτων Το υλικό των δειγμάτων θα πρέπει βασικά να αποστέλλεται σε μη εύθραυστα δοχεία, για να αποφεύγεται μία πιθανή μόλυνση από διαρροή του δείγματος. Τα δείγματα πρέπει να αποστέλλονται σύμφωνα με τις ισχύουσες τοπικές και κρατικές προδιαγραφές, σχετικά με τη μεταφορά παθογόνου υλικού. Ο χρόνος μεταφοράς δεν πρέπει να υπερβεί τις έξι ώρες. Δεν συνιστάται αποθήκευση των δειγμάτων στον τόπο λήψης τους. Ταχυδρομική αποστολή είναι δυνατή. Στο σημείο αυτό πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι νομικές υποδείξεις. Συνιστούμε την μεταφορά των δειγμάτων με υπηρεσία courier. Τα δείγματα αίματος πρέπει να αποστέλλονται υπό ψύξη (+2 C μέχρι +8 C) και του πλάσματος υπό κατάψυξη (-15 C μέχρι 30 C). Ανεπιθύμητες ουσίες Υψηλές τιμές χολερυθρίνης ( 15 mg/dl) και λιπιδίων ( 800 mg/dl) καθώς και αιμολυτικά δείγματα δεν επηρεάζουν καθόλου το αναλυτικό σύστημα. Η ηπαρίνη ( 10 IU/ml) επηρεάζει την PCR. Δείγματα, τα οποία συλλέχθηκαν σε σωληνάρια που περιείχαν ηπαρίνη ως αντιπηκτικό, δεν ενδείκνυνται. Επίσης δείγματα από πρόσωπα που λαμβάνουν ηπαρίνη δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Απομόνωση DNA Το QIAamp DSP Virus Kit (QIAGEN, αριθ.κατ ) είναι επικυρωμένο για τον καθαρισμό ιικού DNA από πλάσμα ανθρώπου για τη χρήση με το artus HBV RG PCR Kit. Εκτελέστε τον καθαρισμό του ιικού DNA σύμφωνα με τις οδηγίες του QIAamp DSP Virus Kit Handbook. Η προσθήκη του φορέα RNA έχει μεγάλη σημασία για την αποτελεσματικότητα της εκχύλισης και επομένως για την απόδοση του DNA/RNA. Για να επιτύχουμε υψηλότερη σταθερότητα του φορέα RNA, ο οποίος παρέχεται μαζί με το QIAamp DSP Virus Kit, ακολουθήστε τις οδηγίες για την νέα παρασκευή και αποθήκευση του φορέα RNA που περιέχονται στο σχετικό εγχειρίδιο ( Preparing reagents and buffers ). * Arbeitskreis Blut, V17 ( ), Bundesgesundheitsblatt 11/1997, p International Air Transport Association (IATA). Dangerous Goods Regulations. 18 artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

19 Το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου του artus HBV RG PCR Kit μπορεί να εισαχθεί κατευθείαν στη διαδικασία απομόνωσης (βλέπε Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου, παρακάτω). Βεβαιωθείτε ότι ένα αρνητικό δείγμα πλάσματος περιλαμβάνεται στη διαδικασία απομόνωσης. Το σήμα του εντός αυτού περιεχομένου προτύπου εσωτερικού ελέγχου αποτελεί τη βάση για την αξιολόγηση της απομόνωσης. Πρότυπο εσωτερικού ελεγχου Μαζί παραδίδεται και ένα πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (HBV RG/TM IC). Με αυτό έχετε τη δυνατότητα να ελέγξετε τόσο την απομόνωση του DNA, όσο και μία ενδεχομένη αναστολή της PCR. Για την εφαρμογή αυτή, προσθέστε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου στη διαδικασία απομόνωσης σε αναλογία 0,1 µl ανά 1 µl όγκου έκλουσης. Για παράδειγμα, χρησιμοποιώντας το QIAamp DSP Virus Kit το DNA εκλούεται σε 60 µl ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης (AVE). Κατά συνέπεια πρέπει αρχικά να προστεθεί 6µl του προτύπου εσωτερικού ελέγχου. Η ποσότητα του προστιθέμενου προτύπου εσωτερικού ελέγχου εξαρτάται μόνο από τον όγκο έκλουσης. Το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου και εάν είναι απαραίτητο ο φορέας RNA (βλέπε Απομόνωση DNA, σελίδα 18) επιτρέπεται να προστεθούν μόνο στο μίγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και υλικού δείγματος ή κατευθείαν στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου δεν επιτρέπεται να προστεθεί απευθείας στο υλικό δείγματος. Κατά την προσθήκη στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης λάβετε υπόψη ότι το μίγμα προτύπου εσωτερικού ελέγχου και ρυθμιστικού διαλύματος λύσης/φορέα RNA πρέπει να χρησιμοποιείται αμέσως μετά την παρασκευή του (αποθήκευση του μίγματος σε θερμοκρασία δωματίου ή στο ψυγείο μπορεί να οδηγήσει, μετά από μερικές ώρες, σε απώλεια του προτύπου εσωτερικού ελέγχου και μείωση της αποτελεσματικότητας της απομόνωσης). Μην εισάγετε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου και το φορέα RNA με την πιπέτα απευθείας στο υλικό δείγματος. Για να εκτιμηθεί μία απομόνωση ως επιτυχής πρέπει η τιμή Ct του προτύπου εσωτερικού ελέγχου ενός αρνητικού δείγματος πλάσματος που περιλαμβάνεται στη διαδικασία της απομόνωσης (QIAamp DSP Virus Kit) με τη χρήση των οργάνων Rotor-Gene Q, να κυμαίνεται στους Ct = 29 ± 3 (threshold: 0,03). Η αναφερόμενη διασπορά οφείλεται σε διακύμανση μεταξύ μηχανημάτων και της απομόνωσης. Μία υψηλότερη απόκλιση υποδεικνύει την παρουσία προβλημάτων κατά την απομόνωση. Σε αυτή την περίπτωση, η απομόνωση πρέπει να ελεγχθεί και εάν είναι απαραίτητο να επικυρωθεί εκ νέου. Στην περίπτωση που προκύψουν άλλα ερωτήματα ή προβλήματα, παρακαλούμε επικοινωνήστε με την τεχνική εξυπηρέτηση της QIAGEN. Προαιρετικά, το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποκλειστικά για τον έλεγχο μιας ενδεχομένης αναστολής της PCR. Για το σκοπό αυτό, προσθέστε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου κατευθείαν στο HBV RG/TM Master, όπως περιγράφεται στο βήμα 2b του πρωτοκόλλου (σελίδα 22). artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

20 Ποσοτικοποίηση Τα παρεχόμενα πρότυπα ποσοτικοποίησης (HBV RG/TM QS 1 5) χρησιμοποιούνται όπως τα δείγματα που έχουν ήδη υποστεί καθαρισμό και εισάγονται στον ίδιο όγκο (20 µl). Για τη δημιουργία μιας πρότυπης καμπύλης στα όργανα Rotor-Gene Q, πρέπει να χρησιμοποιηθούν και τα πέντε παρεχόμενα πρότυπα ποσοτικοποίησης και να ορισθούν ως πρότυπα στο στο πλαίσιο διαλόγου Edit Samples με τις καθορισμένες συγκεντρώσεις (βλέπε το εγχειρίδιο του χρήστη του οργάνου). Τα πρότυπα ποσοτικοποίησης ορίζονται ως IU/µl. * Για τη μετατροπή των τιμών που έχουν καθοριστεί με βάση την πρότυπη καμπύλη σε IU/µl/ml υλικού δείγματος πρέπει να εφαρμόζεται ο ακόλουθος τύπος: Αποτέλεσμα (IU/ml) = Αποτέλεσμα IU/µl) x Όγκος έκλουσης (µl) Όγκος δείγματος (ml) Παρακαλούμε προσέξτε ότι στον παραπάνω αναφερόμενο τύπο, κατά κανόνα, τοποθετείται ο αρχικός όγκος δείγματος. Αυτό λαμβάνεται υπόψη όταν ο όγκος δείγματος μεταβάλλεται πριν την απομόνωση των νουκλεϊκών οξέων (π.χ. μείωση λόγω φυγοκέντρησης ή αύξηση λόγω συμπληρώματος για τον απαιτούμενο όγκο προς απομόνωση). Σχετικές οδηγίες για την ποσοτική ανάλυση παθογόνων στα ανιχνευτικά συστήματα στο Rotor-Gene διατίθενται από την τεχνική εξυπηρέτηση της QIAGEN ( Technical Note for quantitation on Rotor-Gene Instruments ). * Τοπρότυπο βαθμονομήθηκε με τη χρήση του 1st International HBV standard (WHO). 20 artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

21 Πρωτόκολλο: PCR και Αξιολόγηση Σημαντικές υποδείξεις πριν από την εκκίνηση Πριν αρχίσετε τη διαδικασία, διαβάστε Σημαντικές σημειώσεις, σελίδες Εξοικονομήστε χρόνο για να εξοικειωθείτε με το Rotor-Gene Q πριν αρχίσετε με το πρωτόκολλο. Βλέπε το εγχειρίδιο του χρήστη του οργάνου. Σιγουρευτείτε ότι σε κάθε ανάλυση PCR συμπεριλαμβάνεται τουλάχιστον ένα πρότυπο ποσοτικοποίησης καθώς και ένα αρνητικό πρότυπο ελέγχου (Water, PCR grade). Για τη δημιουργία μιας πρότυπης καμπύλης, χρησιμοποιήστε και τα πέντε πρότυπα ποσοτικοποίησης που παρέχονται για κάθε ανάλυση PCR (HBV RG/TM QS 1 5). Τι πρέπει να γίνει πριν από την εκκίνηση Βεβαιωθείτε ότι η μονάδα ψύξης (εξάρτημα του Rotor-Gene Q) έχει προψυχθεί περίπου στους 2 8 C. Πριν από κάθε χρήση, όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να αποψύχονται πλήρως πριν από την έναρξη της εξέτασης, να αναμιγνύονται καλά (με επαναληπτική αναρρόφηση και έγχυση με πιπέτα ή με σύντομο στροβιλισμό) και τελικά να φυγοκεντρούνται για σύντομο χρονικό διάστημα. Εκτέλεση 1. Τοποθετήστε τον αριθμό σωληναρίων PCR στις υποδοχές της μονάδας ψύξης. 2. Εάν χρησιμοποιείτε το εσωτερικό πρότυπο ελέγχου για την επιτήρηση της διαδικασίας απομόνωσης του DNA και τον έλεγχο πιθανής αναστολής της PCR, ακολουθήστε το βήμα 2a. Εάν χρησιμοποιείτε το εσωτερικό πρότυπο ελέγχου επιλεκτικά για τον έλεγχο αναστολής της PCR, ακολουθήστε το βήμα 2b. 2a. Το εσωτερικό πρότυπο ελέγχου έχει ήδη προστεθεί στην απομόνωση (βλέπε Πρότυπο εσωτερικού ελεγχου, σελίδα 18). Στην περίπτωση αυτή ετοιμάστε ένα master mix σύμφωνα με τον πίνακα 6. Το μίγμα αντίδρασης περιέχει τυπικά όλα τα συστατικά που χρειάζονται για την PCR εκτός από το δείγμα. artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

22 Πίνακας 6. Παρασκευή του master mix (χρήση του εσωτερικού προτύπου ελέγχου για την επιτήρηση της απομόνωσης του DNA και τον έλεγχο πιθανής αναστολής της PCR) Αριθμός δειγμάτων 1 12 HBV RG/TM Master 30 µl 360 µl HBV RG/TM IC 0 µl 0 µl για για κάθε ένα Συνολικός όγκος 30 µl 360 µl για για κάθε ένα 2b. Το εσωτερικό πρότυπο ελέγχου πρέπει αυτό να προστεθεί απευθείας στο μίγμα του HBV RG/TM Master. Στην περίπτωση αυτή ετοιμάστε ένα master mix σύμφωνα με τον πίνακα 7. Το μίγμα αντίδρασης περιέχει τυπικά όλα τα συστατικά που χρειάζονται για την PCR εκτός από το δείγμα. Πίνακας 7. Παρασκευή του master mix (χρήση του εσωτερικού προτύπου ελέγχου αποκλειστικά για τον έλεγχο πιθανής αναστολής της PCR) Αριθμός δειγμάτων 1 12 HBV RG/TM Master 30 µl 360 µl HBV RG/TM IC 2 µl 24 µl Συνολικός όγκος 32 µl* 384 µl* * Η αύξηση του όγκου μέσω της προσθήκης του προτύπου εσωτερικού ελέγχου, κατά την προετοιμασία της αντίδρασης PCR, είναι αμελητέα. Η ευαισθησία του συστήματος ανίχνευσης δεν επηρεάζεται. 3. Εισάγετε με πιπέτα σε κάθε σωληνάριο PCR 30 μl του master mix. Στη συνέχεια εισάγετε 20 µl από το έκλουμα του απομονωμένου DNA του δείγματος (βλέπε Πίνακα 8). Αντίστοιχα πρέπει να προστεθούν ως θετικό πρότυπο ελέγχου 20 µl από ένα τουλάχιστον πρότυπο ποσοτικοποίησης (HBV RG/TM QS 1-5) και ως αρνητικό πρότυπο ελέγχου 20 µl νερό (Water, PCR grade). Πίνακας 8. Παρασκευή αντίδρασης PCR Αριθμός δειγμάτων 1 12 Master mix 30µl 30 µl για κάθε ένα Δείγμα 20µl 20 µl για κάθε ένα Συνολικός όγκος 50 µl 50 µl για κάθε ένα 22 artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

23 4. Κλείστε τα σωληνάρια PCR. Λάβετε υπόψη ότι στην κεφαλή θα πρέπει να τοποθετείται ένας δακτύλιος ασφαλείας (εξάρτημα του Rotor-Gene), για να εμποδίζεται το τυχαίο άνοιγμα των σωληναρίων κατά τη διάρκεια της διαδικασίας. 5. Για την ανίχνευση του DNA του HBV δημιουργήστε ένα προφίλ θερμοκρασίας σύμφωνα με τα ακόλουθα βήματα εργασίας. Ρύθμιση γενικών παραμέτρων PCR Εικόνα 4, 5, 6 Αρχική ενεργοποίηση του ενζύμου hot-start Εικόνα 7 Πολλαπλασιασμός του DNA Εικόνα 8 Ρύθμιση της ευαισθησίας των καναλιών φθορισμού Εικόνα 9 Εκκίνηση της διαδικασίας Εικόνα 10 Ολες οι τεχνικές προδιαγραφές αναφέρονται στο λογισμικό του Rotor-Gene Q έκδοση και στο λογισμικό του Rotor-Gene 6000 εκδόσεις , και Παακαλούμε βρείτε περαιτέρω πληροφορίες πάνω στον προγραμματισμό των οργάνων Rotor-Gene στο εγχειρίδιο του χρήστη του οργάνου. Στις απεικονίσεις αυτές οι ρυθμίσεις πλαισιόνονται με έντονο μαύρο. Για τα όργανα Rotor-Gene Q περιλαμβάνονται απεικονίσεις. Οπου απαιτούνται διαφορετικές τιμές για το Rotor-Gene 3000, οι διαφορές αυτές περιγράφονται στο κείμενο. 6. Αρχικά, ανοίξτε το πλαίσιο διαλόγου New Run Wizard (Εικόνα 4). Ελέγξτε το πλαίσιο Locking Ring Attached και πατήστε Next. Εικόνα 4. Πλαίσιο διαλόγου New Run Wizard. artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

24 7. Επιλέξτε 50 για τον όγκο αντίδρασης της PCR και πατήστε Next (Εικόνα 5). Εικόνα 5. Ρύθμιση γενικών παραμέτρων PCR. 8. Πατήστε το κουμπί Edit Profile στο επόμενο πλαίσιο διαλόγου New Run Wizard (Εικόνα 6), και προγραμματείστε το προφίλ θερμοκρασίας όπως φαίνεται στις εικόνες 6 8. Εικόνα 6. Επεξεργασία του προφίλ. 24 artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

25 Εικόνα 7. Αρχική ενεργοποίηση του ενζύμου hot-start. Εικόνα 8. Πολλαπλασιασμός του DNA. Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, το λογισμικό καθορίζει τις φθορίζουσες χρωστικές ουσίες ως FAM/Sybr, JOE. artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

26 9. Η περιοχή ανίχνευσης των καναλιών φθορισμού πρέπει να καθορίζεται σύμφωνα με τις εντάσεις φθορισμού στα σωληνάρια της PCR. Πατήστε Gain Optimisation στο πλαίσιο διαλόγου New Run Wizard (βλέπε Εικόνα 6) για να ανοίξετε το πλαίσιο διαλόγου Auto-Gain Optimisation Setup. Ορίστε τη θερμοκρασία ένδειξης στους 55 για να αντιπαραθέσετε τη θερμοκρασία υβριδισμού στο πρόγραμμα πολλαπλασιασμού (Εικόνα 9). Εικόνα 9. Ρύθμιση της ευαισθησίας των καναλιών φθορισμού. Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, το λογισμικό καθορίζει τις φθορίζουσες χρωστικές ουσίες ως FAM/Sybr, JOE. 26 artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

27 10. Οι τιμές gain που εξάγονται από τη βαθμονόμηση του καναλιού αποθηκεύονται αυτόματα και εμφανίζονται στο τελευταίο παράθυρο μενού του προγραμματισμού (βλέπε Εικόνα 10). Πατήστε Start Run. Εικόνα 10. Εκκίνηση της διαδικασίας. Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, το λογισμικό καθορίζει τις φθορίζουσες χρωστικές ουσίες ως FAM/Sybr, JOE. 11. Μετά το τέλος της διαδικασίας, αναλύστε τα δεδομένα. Ενδέχεται να προκύψουν τα εξής αποτελέσματα (11a, 11b και 11c). Παραδείγματα για θετικές και αρνητικές αντιδράσεις PCR εμφανίζονται στις εικόνες 11 και a. Στο κανάλι φθορισμού Cycling Green ανιχνεύεται ένα σήμα. Το αποτέλεσμα της ανάλυσης είναι θετικό: Το δείγμα περιέχει DNA του HBV. Στην περίπτωση αυτή η ανίχνευση ενός σήματος στο κανάλι Cycling Yellow είναι άνευ σημασίας, δεδομένου ότι οι υψηλές συγκεντρώσεις εκκίνησης του DNA του HBV (θετικό σήμα στο κανάλι Cycling Green) ενδέχεται να οδηγούν σε μειωμένο έως ανύπαρκτο σήμα φθορισμού του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο κανάλι Cycling Yellow (Ανταγωνισμός). Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, τα σχετικά κανάλια είναι Cycling A.FAM για θετικό σήμα και Cycling A.JOE για το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου. 11b. Στο κανάλι φθορισμού Cycling Green δεν ανιχνεύεται κανένα σήμα. Παράλληλα εμφανίζεται ένα σήμα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο κανάλι Cycling Yellow). Στο δείγμα δεν υπάρχει ανιχνεύσιμο DNA του HBV. Συνεπώς, το δείγμα μπορεί να θεωρηθεί αρνητικό. Όταν η PCR του HBV είναι αρνητική, το ανιχνευμένο σήμα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου αποκλείει την πιθανότητα αναστολής της PCR. artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

28 Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, τα σχετικά κανάλια είναι Cycling A.JOE για το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου και έλλειψη σήματος για Cycling A.FAM. 11c. Δεν ανιχνεύεται σήμα σε κανένα από τα κανάλια Cycling Green ή Cycling Yellow. Δεν υπάρχει δυνατότητα διαγνωστικής αξιολόγησης. Υποδείξεις σχετικά με τις πηγές σφαλμάτων και την εξάλειψή τους παρατίθενται στο κεφάλαιο Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων, σελίδα 30. Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, τα σχετικά κανάλια είναι Cycling A.FAM και Cycling A.JOE. Εικόνα 11. Ανίχνευση των προτύπων ποσοτικοποίησης (HBV RG/TM QS 1-5) στο κανάλι φθορισμού Cycling Green. NTC: No template control (αρνητικό πρότυπο). 28 artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

29 Εικόνα 12. Ανίχνευση του προτύπου εσωτερικού ελέγχου (IC) στο κανάλι φθορισμού Cycling Yellow με ταυτόχρονο πολλαπλασιασμό των προτύπων ποσοτικοποίησης (HBV RG/TM QS 1-5). NTC: No template control (αρνητικό πρότυπο). artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

30 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων Στον οδηγό αυτό αντιμετώπισης προβλημάτων θα βρείτε χρήσιμες υποδείξεις οι οποίες μπορούν να σας βοηθήσουν στην επίλυση τυχόν προβλημάτων που μπορούν να εμφανισθούν. Για περισσότερες πληροφορίες βλέπε επίσης τη σελίδα συχνών ερωτήσεων στο κέντρο τεχνικής σας υποστήριξης: επιστήμονες της τεχνικής εξυπηρέτησης της QIAGEN απαντά ευχαρίστως στις ερωτήσεις σας σχετικά με το περιεχόμενο και τα πρωτόκολλα του εγχειριδίου αυτού ή τεχνολογίες δείγματος και μεθόδου (πληροφορίες επαφής, βλέπε οπίσθιο εξώφυλλο ή επισκευθείτε την ιστοσελίδα Παρατηρήσεις και προτάσεις Κανένα σήμα με θετικά πρότυπα ελέγχου (HBV RG/TM QS 1-5) στο κανάλι φθορισμού Cycling Green ή Cycling A.FAM a) Το κανάλι φθορισμού που επιλέξατε για την ανάλυση των δεδομένων της PCR, δεν ανταποκρίνεται στα περιεχόμενα του πρωτοκόλλου. Για την ανάλυση των δεδομένων διαλέξτε το κανάλι φθορισμού Cycling Green ή Cycling A.FAM για την αναλυτική PCR του HBV και το κανάλι φθορισμού Cycling Yellow ή Cycling A.JOE για την PCR του προτύπου εσωτερικού ελέγχου. b) O προγραμματισμός του προφίλ θερμοκρασίας του οργάνου Rotor-Gene είναι εσφαλμένος c) Εσφαλμένη διάταξη της αντίδρασης της PCR d) Οι συνθήκες αποθήκευσης, για ένα ή περισσότερα υλικά του κιτ, δεν συμφωνούν με τις αναφερόμενες οδηγίες του κεφαλαίου Αποθήκευση (σελίδα 5) e) Το artus HBV RG PCR Kit έχει λήξει Συγκρίνετε το προφίλ θερμοκρασίας με τα περιεχόμενα του πρωτοκόλλου (βλέπε Πρωτόκολλο: PCR και Αξιολόγηση, σελίδα 21). Ελέγξτε τα στάδια εργασίας σας με τη βοήθεια του σχήματος επεξεργασίας με πιπέτα (βλέπε Πρωτόκολλο: PCR και Αξιολόγηση, σελίδα 21) και επαναλάβετε την PCR, εάν είναι απαραίτητο. Ελέγξτε τόσο τις συνθήκες αποθήκευσης όσο και την ημερομηνία λήξης (βλέπε ετικέττα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. Ελέγξτε τόσο τις συνθήκες αποθήκευσης όσο και την ημερομηνία λήξης (βλέπε ετικέττα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. 30 artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

31 Παρατηρήσεις και προτάσεις Ασθενές ή ανύπαρκτο σήμα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου ενός αρνητικού δείγματος πλάσματος που υποβλήθηκε σε καθαρισμό με τη χρήση του QIAamp DSP Virus Kit (C T = 29 ± 3; threshold, 0,03) στο κανάλι φθορισμού Cycling Yellow ή Cycling A.JOE με ταυτόχρονη απουσία ενός σήματος στο κανάλι Cycling Green ή Cycling A.FAM: a) Οι συνθήκες της PCR δεν συμφωνούν με το πρωτόκολλο Ελέγξτε τις συνθήκες της PCR (βλέπε ανωτέρω) και επαναλάβετε την PCR με διορθωμένες ρυθμίσεις, εάν είναι απαραίτητο. b) Έγινε αναστολή της PCR c) Υφίσταται απώλεια DNA κατά την εκχύλιση d) Οι συνθήκες αποθήκευσης, για ένα ή περισσότερα υλικά του κιτ, δεν συμφωνούν με τις αναφερόμενες οδηγίες του κεφαλαίου Αποθήκευση (σελίδα 5) e) Το artus HBV RG PCR Kit έχει λήξει Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιείτε τη διαδικασία απομόνωσης που συνιστάται από εμάς και τηρείτε πιστά τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Εάν το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου έχει προστεθεί στην απομόνωση, μπορεί η απουσία του σήματος του προτύπου εσωτερικού ελέγχου να σημαίνει απώλειες DNA κατά την εκχύλιση. Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιείτε μία διαδικασία απομόνωσης που συνιστάται από εμάς (βλέπε Απομόνωση DNA, σελίδα 18) και τηρείτε πιστά τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Ελέγξτε τόσο τις συνθήκες αποθήκευσης όσο και την ημερομηνία λήξης (βλέπε ετικέττα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. Ελέγξτε τόσο τις συνθήκες αποθήκευσης όσο και την ημερομηνία λήξης (βλέπε ετικέττα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

32 Παρατηρήσεις και προτάσεις Σήματα με τα αρνητικά πρότυπα ελέγχου στο κανάλι φθορισμού Cycling Green ή Cycling A.FAM της αναλυτικής PCR a) Υφίσταται μία επιμόλυνση κατά την προετοιμασία της PCR Επαναλάβετε την PCR με νέα αντιδραστήρια κατ επανάληψη. Εάν είναι δυνατόν, κλείστε τα σωληνάρια της PCR αμέσως μετά την προσθήκη του δείγματος που είναι προς εξέταση. Εισάγετε με πιπέτα τα θετικά πρότυπα ελέγχου κατά κανόνα στο τέλος. Βεβαιωθείτε ότι οι χώροι εργασίας και τα μηχανήματα απολυμαίνονται συχνά. b) Υφίσταται μία επιμόλυνση κατά την εκχύλιση Επαναλάβετε την εκχύλιση και την PCR των εξεταζόμενων δειγμάτων με τη χρησιμοποίηση νέων αντιδραστηρίων. Βεβαιωθείτε ότι οι χώροι εργασίας και τα μηχανήματα απολυμαίνονται συχνά. 32 artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

33 Παραπομπές Η QIAGEN διατηρεί μία μεγάλη ενημερωμένη επιγραμμική βάση δεδομένων επιστημονικών δημοσιευμάτων σχετικά με τη χρήση των προїόντων της QIAGEN. Επιλεκτικές αναλυτικές αναζητήσεις σας επιτρέπουν να βρείτε το άρθρο που χρειάζεστε είτε κατά την αναζήτηση με μία απλή κωδική λέξη είτε ειδικότερα βάσει της εφαρμογής, ερευνητικού πεδίου, τίτλου, κ.τ.λ. Για μία πλήρη λίστα παραπομπών, επισκευθείτε την QIAGEN Reference Database στο διαδίκτυο στην ιστοσελίδα ή ελάτε σε επαφή με την τεχνική υπηρεσία της QIAGEN ή τον τοπικό σας αντιπρόσωπο. artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

34 Πληροφορίες παραγγελιών Προϊόν Περιεχόμενα Αριθ. Κατ. artus HBV RG PCR Kit (24) artus HBV RG PCR Kit (96) Για 24 αντιδράσεις: Master, διάλυμα Mg, 5 πρότυπα ποσοτικοποίησης, πρότυπο εσωτερικού ελέγχου, νερό (PCR grade) Για 96 αντιδράσεις : Master, διάλυμα Mg, 5 πρότυπα ποσοτικοποίησης, πρότυπο εσωτερικού ελέγχου, νερό (PCR grade) QIAamp DSP Virus Kit για τον καθαρισμό νουκλεϊνικών οξέων του ιού από πλάσμα ανθρώπου για διαγνωστικούς σκοπούς in vitro QIAamp DSP Virus Kit Για 50 αντιδράσεις: QIAamp MinElute Spin Columns, ρυθμιστικά διαλύματα, αντιδραστήρια, σωληνάρια, επεκτάσεις στήλης και VacConnectors Rotor-Gene Q και εξαρτήματα Rotor-Gene Q 5plex Real-time PCR cycler με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο), φορητός μικροϋπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για επιμέρους και εργαστηριακά είδη Ζητείστε πληροφορίες Rotor-Gene Q 5plex HRM Rotor-Gene Q 6plex Rotor-Gene Q 2plex Real-time PCR cycler και αναλυτή High Resolution Melt με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο), συν κανάλι HRM, φορητός μικροϋπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για επιμέρους και εργαστηριακά είδη Real-time PCR όργανο με 6 κανάλια (μπλέ πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο) φορητός μικροϋπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για επιμέρους και εργαστηριακά είδη Real-time PCR cycler με 2 κανάλια (πράσινο, κίτρινο), φορητός μικροϋπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για επιμέρους και εργαστηριακά είδη Ζητείστε πληροφορίες Ζητείστε πληροφορίες Ζητείστε πληροφορίες 34 artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

35 Προϊόν Περιεχόμενα Αριθ. Κατ. Rotor-Gene Q 2plex HRM Loading Block 72 x 0,1 ml Tubes Real-time PCR cycler και αναλυτή High Resolution Melt με 2 κανάλια (πράσινο, κίτρινο) συν κανάλι HRM, φορητός μικροϋπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για επιμέρους και εργαστηριακά είδη Εξάρτημα από αλουμίνιο για εγκατάσταση με το χέρια αντίδρασης με πιπέτα ενός καναλιού σε 72 x 0,1 ml σωληνάρια Ζητείστε πληροφορίες Loading Block 96 x 0,2 ml Tubes Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (2500) PCR Tubes, 0,2 ml (1000) PCR Tubes, 0,2 ml (10000) Εξάρτημα από αλουμίνιο για εγκατάσταση με το χέρια αντίδρασης σε μία πρότυπη σειρά 8 x 12 με τη χρήση 96 x 0,2 ml σωληναρίων 250 σειρές με 4 σωληνάρια και πώματα για 1000 αντιδράσεις 10 x 250 σειρές με 4 σωληνάρια και πώματα για αντιδράσεις 1000 λεπτά σωληνάρια για 1000 αντιδράσεις 10 x 1000 λεπτά σωληνάρια για αντιδράσεις Για πρόσφατες πληροφορίες αδείας χρήσης και ειδικές αποποιήσεις προϊόντων, ανατρέξτε στο αντίστοιχο εγχειρίδιο του QIAGEN kit ή του χρήστη. Αυτά είναι διαθέσιμα στην ιστοσελίδα ή μπορούν να ζητηθούν από την τεχνική εξυπηρέτηση της QIAGEN ή τον τοπικό σας αντιπρόσωπο. artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

36 Η σελίδα αυτή παραμένει σκόπιμα κενή 36 artus HBV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

37 Η αγορά του προϊόντος αυτού επιτρέπει στον αγοραστή τη χρήση του για την εκτέλεση διαγνωστικών εξετάσεων του ανθρώπου στη διαγνωστική in-vitro. Καμμιά γενική πατέντα ή άλλη άδεια κάθε είδους δεν παρέχεται επί τουπαρόντος εκτός αυτής του ειδικού δικαιώματος της χρήσης από τον αγοραστή. Εμπορικές ονομασίες: QIAGEN, QIAamp, artus, MinElute (QIAGEN Group); COBAS, TaqMan (Roche Group); FAM, JOE (Applera Corporation or its subsidiaries); Rotor-Gene (Corbett Research); SYBR (Molecular Probes, Inc.). Το artus HBV RG PCR Kit και το QIAamp DSP Virus Kit είναι σημασμένα CE διαγνωστικά κιτ σύμφωνα με τον ευρωπαïκό κανονισμό 98/79/EC σχετικό με τη διαγνωστική in vitro. Δεν είναι διαθέσιμα σε όλες τις χώρες. Συμφωνία περιορισμένης αδείας Η χρήση του προїόντος αυτού σημαίνει ότι κάθε αγοραστής ή χρήστης του artus HBV RG PCR Kit συμφωνεί με τους ακόλουθους όρους: 1. Το artus HBV RG PCR Kit μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο σύμφωνα με το εγχειρίδιο artus HBV RG PCR Kit και μόνο με τα αντιδραστήρια που περιέχονται στο κιτ. Η QIAGEN δεν παραχωρεί καμμία άδεια υπό την πνευματική της ιδιοκτησία για τη χρήση ή συσσωμάτωση των περιεχομένων στο κιτ αυτό αντιδραστηρίων με αντιδραστήρια που δεν συμπεριλαμβάνονται εντός του ίδιου κιτ εκτός εάν αναφέρεται στο εγχειρίδιο του artus HBV RG PCR Kit και στα περιλαμβανόμενα πρωτόκολλα διαθέσιμα στην ιστοσελίδα 2. Διαφορετικά από τις κατηγορηματικές κρατικές άδειες, η QIAGEN δεν παρέχει καμμία εγγύηση ότι αυτό το κιτ και/ή η χρήση του δεν παραβιάζει τα δικαιώματα τρίτων προσώπων. 3. Το κιτ αυτό και τα αντιδραστήριά του διατίθενται για μία χρήση και δεν μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν, ανακαινισθούν ή μεταπωληθούν. 4. Ειδικότερα η QIAGEN αποποιεί οποιαδήποτε άλλες άδειες, που διατυπώνουν ή υπονοούν οτιδήποτε άλλο από τις σαφείς αυτές συνθήκες. 5. Ο αγοραστής και ο χρήστης του κιτ συμφωνεί να μην επιτρέπει σε κανένα άλλο να λαμβάνει οποιαδήποτε μέτρα που θα μπορούσαν να οδηγήσουν ή να διευκολύνουν πράξεις που απαγορεύονται παραπάνω. Η QIAGEN μπορεί να επιβάλλει τις απαγορεύσεις αυτής της συμφωνίας περιορισμένης αδείας σε οποιοδήποτε δικαστήριο και να ανακτήσει όλα της τα προανακριτικά και του δικαστηρίου έξοδα συμπεριλαμβανομένων και των δικηγορικών αμοιβών, σε κάθε πράξη που επιβάλλει αυτή η συμφωνία περιορισμένης αδείας ή οτιδήποτε από τα δικαιώματα της πνευματικής της ιδιοκτησίας που έχουν σχέση με το κιτ και/ή τα αντιδραστήριά του. Για νεότερη ενημέρωση που αφορούν τους όρους αδείας, μπορείτε να δείτε στην ιστοσελίδα QIAGEN, όλα τα δικαιώματα είναι κατωχυρωμένα.

38 Australia Orders Fax Technical Austria Orders 0800/ Fax 0800/ Technical 0800/ Belgium Orders Fax Technical Brazil Orders Fax Technical Canada Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) China Orders Fax Technical Denmark Orders Fax Technical Finland Orders Fax Technical France Orders Fax Technical Offers Germany Orders Fax Technical Hong Kong Orders Fax Technical Ireland Orders Fax Technical Italy Orders Fax Technical Japan Telephone Fax Technical Korea (South) Orders Fax Technical Luxembourg Orders Fax Technical Mexico Orders Fax Technical The Netherlands Orders Fax Technical Norway Orders Fax Technical Singapore Orders Fax Technical Spain Orders Fax Technical Sweden Orders Fax Technical Switzerland Orders Fax Technical UK Orders Fax Technical USA Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) EL Sample & Assay Technologies