artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο

Transcript

1 Οκτώβριος 2016 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 24 (Αρ.Καταλόγου ) Εκδοση 1 96 (Αρ.Καταλόγου ) Διαγνωστικό προïόν in vitro ποσοτικού προσδιορισμού Για τη χρήση με όργανα Rotor-Gene Q , R7 QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, Hilden, GERMANY EL Sample & Assay Technologies

2 Τεχνολογίες δείγματος και ανάλυσης της QIAGEN Η QIAGEN είναι ο πρωτεύων προμηθευτής εφευρετικών τεχνολογιών δειγμάτων και μεθόδων όσον αφορά την απομόνωση και ανάλυση κάθε βιολογικού δείγματος. Τα υψηλής ποιότητας προїόντα μας και η άριστη εξυπηρέτηση εξασφαλίζουν επιτυχία, από την προετοιμασία του δείγματος μέχρι το αποτέλεσμα. Η QIAGEN θέτει πρότυπα: στον καθαρισμό DNA, RNA και πρωτεϊνών στα συστήματα αναλύσεων νουκλεϊκών οξέων και πρωτεϊνών στην έρευνα microrna και RNAi στην αυτοματοποίηση τεχνολογιών δειγμάτων και αναλύσεων Αποστολή μας είναι η διασφάλιση των δικών σας επιτυχιών και επιτευγμάτων. Για περισσότερες πληροφορίες, επισκεφθείτε μας στην ιστοσελίδα

3 Περιεχόμενα Περιεχόμενα του κιτ 4 Σύμβολα 4 Αποθήκευση 5 Προβλεπόμενη χρήση 5 Περιορισμοί χρήσης του προϊόντος 5 Ποιοτικός έλεγχος 7 Εισαγωγή 7 Αρχή λειτουργίας 7 Πληροφορίες σχετικά με τους παθογόνους παράγοντες 8 Χαρακτηριστικά απόδοσης 8 Εξοπλισμός και αντιδραστήρια που παρέχονται στο χειριστή 19 Σημαντικές Σημειώσεις 20 Γενικές προφυλάξεις 20 Συλλογή, αποθήκευση και μεταφορά δειγμάτων 20 Απομόνωση DNA 23 Εσωτερικός μάρτυρας 30 Πρωτόκολλο: PCR και Ανάλυση Δεδομένων 32 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων 42 Πληροφορίες παραγγελίας 45 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016 3

4 Περιεχόμενα του κιτ artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit (24) (96) Αρ. καταλόγου Αριθμός αντιδράσεων Μπλε C. trachomatis Plus RG Master 2 x 12 αντιδράσεις 8 x 12 αντιδράσεις Κίτρινο Κόκκινο C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol* C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control 400 µl 400 µl 200 µl 200 µl Πράσινο C. trachomatis Plus RG IC 1000 µl 2 x 1000 µl Λευκό Water (PCR grade) 1000 µl 1000 µl artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Handbook (artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο) (Ελληνικά) 1 1 * Διάλυμα μαγνησίου. Εσωτερικός μάρτυρας. Σύμβολα <N> περιέχει αντιδραστήρια για <N> δοκιμασίες Ημερομηνία λήξης Διαγνωστικό ιατρικό προϊόν in-vitro Αριθμός καταλόγου Αριθμός παρτίδας Αριθμός υλικού Συστατικά 4 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

5 Περιεχόμενα Αριθμός Διεθνής κωδικός μονάδας εμπορίας Περιορισμοί θερμοκρασίας Νόμιμος κατασκευαστής Συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης Προσοχή Αποθήκευση Τα συστατικά του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit πρέπει να αποθηκεύονται στους 15 μέχρι 30 C και είναι διατηρήσιμα μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναφέρεται στην ετικέτα. Επαναληπτική απόψυξη και κατάψυξη (>2 x) θα πρέπει να αποφεύγεται, γιατί με τον τρόπο αυτό μειώνεται η ευαισθησία της ανάλυσης. Εάν τα αντιδραστήρια δεν χρησιμοποιούνται τακτικά, θα πρέπει να καταψύχονται αφού γίνει επιμερισμός τους. Η αποθήκευση στους 2 8 C δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τις πέντε ώρες. Προβλεπόμενη χρήση Το artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit είναι μια εξέταση ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων in vitro για την ανίχνευση του DNA του Chlamydia trachomatis σε δείγματα ανθρώπινων ούρων, επιχρισμάτων (οφθαλμού, τραχήλου μήτρας ή ουρήθρας) ή σπέρματος. Αυτό το κιτ διαγνωστικού ελέγχου χρησιμοποιεί την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και είναι διαμορφωμένο για χρήση με τα όργανα Rotor-Gene Q. Περιορισμοί χρήσης του προϊόντος Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να χρησιμοποιούνται αποκλειστικά για διαγνωστικούς σκοπούς in vitro. Η χρήση του προїόντος πρέπει να γίνεται μόνο από προσωπικό ειδικά εκπαιδευμένο και καταρτισμένο στις διαγνωστικές διαδικασίες in vitro. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016 5

6 Η ακριβής τήρηση του εγχειριδίου είναι απολύτως απαραίτητη, για την επίτευξη άριστων αποτελεσμάτων της PCR. Προσοχή στις ημερομηνίες λήξης που αναγράφονται στη συσκευασία και στις ετικέτες των συστατικών. Τα αντιδραστήρια των οποίων έχει παρέλθει η ημερομηνία λήξης, δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αν και σπάνιες, οι μεταλλάξεις εντός των υψηλά διατηρημένων περιοχών του βακτηριακού γονιδιώματος που καλύπτονται από τους εκκινητές και/ή τον ανιχνευτή του κιτ, μπορούν να έχουν ως αποτέλεσμα χαμηλότερες ποσοτικές τιμές ή αδυναμία ανίχνευσης της παρουσίας των βακτηρίων στις περιπτώσεις αυτές. Η εγκυρότητα και η απόδοση της σχεδίασης της ανάλυσης αναθεωρούνται ανά τακτά διαστήματα. Το artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit είναι ικανό να ανιχνεύει στελέχη που φέρουν το κρυπτικό πλασμίδιο και επίσης Σουηδικά νέα στελέχη-παραλλαγές που έχουν μια διαγραφή στο κρυπτικό πλασμίδιο. Το κιτ δεν ανιχνεύει ελεύθερες κρυπτικού πλασμιδίου παραλλαγές του C. trachomatis. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα δοκιμασίας δεν αποκλείει την πιθανότητα λοίμωξης, διότι τα αποτελέσματα της δοκιμασίας ενδέχεται να επηρεάζονται από ακατάλληλη συλλογή δείγματος, τεχνικό σφάλμα, σύγχυση δειγμάτων, ή τον αριθμό οργανισμών στο δείγμα ο οποίος μπορεί να βρίσκεται κάτω από την ευαισθησία της δοκιμασίας. Προειδοποιήσεις και Προφυλάξεις Όταν εργάζεστε με χημικές ουσίες θα πρέπει πάντοτε να φοράτε προστατευτική ποδιά εργαστηρίου, γάντια μίας χρήσης και προστατευτικά γυαλιά. Για περισσότερες πληροφορίες παρακαλείστε να ανατρέξετε στα σχετικά δελτία δεδομένων ασφαλείας υλικού (SDSs). Αυτά τα δελτία είναι διαθέσιμα στο διαδίκτυο σε εύχρηστη μορφή PDF στη διεύθυνση όπου και μπορείτε να βρείτε, να προβάλλετε και να εκτυπώσετε τα δελτία SDS για κάθε κιτ και συστατικό των κιτ της QIAGEN. Για πληροφορίες ασφαλείας για τη χρήση του κιτ καθαρισμού, βλέπε το σχετικό εγχειρίδιο του κιτ. Για πληροφορίες ασφαλείας σχετικές με τα όργανα, βλέπε το σχετικό εγχειρίδιο χρήσης του οργάνου. Απορρίψτε τα απόβλητα δειγμάτων και ανάλυσης σύμφωνα με τις εκάστοτε τοπικές διατάξεις ασφαλείας. 6 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

7 Ποιοτικός έλεγχος Σε συμμόρφωση με το πιστοποιημένο ISO Σύστημα Διαχείρισης Ποιότητας της QIAGEN, κάθε παρτίδα του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit ελέγχεται ως προς τις προκαθορισμένες προδιαγραφές για την διασφάλιση ομοιογενούς ποιότητας του προϊόντος. Εισαγωγή Το artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit αποτελεί ένα έτοιμο-για-χρήση σύστημα για την ανίχνευση του DNA του C. trachomatis με τη χρήση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) σε όργανα Rotor-Gene Q. Το C. trachomatis Plus RG Master περιέχει αντιδραστήρια και ένζυμα για την ειδική ενίσχυση μιας περιοχής 111 bp του κρυπτικού πλασμιδίου του C. trachomatis. Τα αντιδραστήρια επιτρέπουν επίσης την ειδική ανίχνευση του αμπλικονίου στο κανάλι φθορισμού Cycling Green του Rotor-Gene Q MDx, Rotor-Gene Q και Rotor-Gene 6000, ή Cycling A.FAM του Rotor-Gene Επιπλέον, το artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit περιέχει ένα δεύτερο ετερόλογο σύστημα ενίσχυσης, για την ανίχνευση μιας πιθανής αναστολής της PCR. Αυτή ανιχνεύεται ως εσωτερικός μάρτυρας (IC) στο κανάλι φθορισμού Cycling Yellow του Rotor-Gene Q MDx, Rotor-Gene Q, και Rotor-Gene 6000 ή στο κανάλι φθορισμού Cycling A.JOE του Rotor-Gene Το όριο ανίχνευσης της αναλυτικής PCR του C. trachomatis (βλέπε Αναλυτική ευαισθησία, σελίδα 8) δεν μειώνεται. Μαζί παρέχεται ένας εξωτερικός θετικός μάρτυρας (C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control). Αρχή λειτουργίας Η ανίχνευση παθογόνων μικροοργανισμών με την PCR βασίζεται στην ενίσχυση ειδικών περιοχών του γονιδιώματος του παθογόνου μικροοργανισμού. Στην PCR πραγματικού χρόνου, το προϊόν της ενίσχυσης ανιχνεύεται μέσω χρωστικών ουσιών φθορισμού. Αυτές είναι συνήθως συνδεδεμένες με ανιχνευτές ολιγονουκλεοτιδίων που προσδένονται ειδικά στο ενισχυμένο προϊόν. Η παρακολούθηση των εντάσεων φθορισμού κατά τη διάρκεια της εκτέλεσης της PCR (δηλ. σε πραγματικό χρόνο) επιτρέπει την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση του συσσωρευμένου προϊόντος χωρίς να χρειάζεται να ανοιχτούν ξανά τα σωληνάρια αντίδρασης μετά το πέρας της εκτέλεσης PCR.* * Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, 190. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016 7

8 Πληροφορίες σχετικά με τους παθογόνους παράγοντες Τα βακτήρια του γένους Chlamydia (C.) είναι μεγάλης επιδημιολογικής σημασίας. Το C. trachomatis (ορότυποι D L) ανήκει στους συνηθέστερους παθογόνους παράγοντες των σεξουαλικώς μεταδιδομένων λοιμώξεων (STI) παγκοσμίως. Οι 16 ορότυποι του C. trachomatis προκαλούν διάφορες ασθένειες. Οι ορότυποι A C είναι υπεύθυνοι για το τράχωμα, μια χρόνια υποτροπιάζουσα νόσο του επιπεφυκότος και του κερατοειδούς, διαδεδομένη στις τροπικές χώρες. Οι ορότυποι D - K προκαλούν σεξουαλικώς μεταδιδόμενες λοιμώξεις του ουροποιογεννητικού συστήματος και οφθαλμού καθώς και λοιμώξεις των νεογνών μετά από περιγεννητική μετάδοση. Οι ορότυποι LGV I - III προκαλούν το αφροδίσιο λεμφοκοκκίωμα, μία σεξουαλικώς μεταδιδόμενη νόσο, η οποία εμφανίζεται ως επί το πλείστον στις τροπικές χώρες. Το τράχωμα εμφανίζεται σχεδόν αποκλειστικά σε τροπικές χώρες με κακές συνθήκες υγιεινής. Είναι η πιο διαδεδομένη πάθηση των οφθαλμών στον κόσμο και μετά από τον καταρράκτη αποτελεί τη δεύτερη βασικότερη αιτία τύφλωσης. Υπολογίζεται ότι υπάρχουν περίπου 150 εκατομμύρια άτομα που έχουν μολυνθεί. Γύρω στα έξι εκατομμύρια από αυτά έχουν ήδη τυφλωθεί. Στις βιομηχανικές χώρες, τα χλαμύδια αποτελούν τους συχνότερους παθογόνους παράγοντες που προκαλούν λοιμώξεις του ουροποιογεννητικού συστήματος. Στη Γερμανία, ο ετήσιος αριθμός των νέων λοιμώξεων των γεννητικών οργάνων υπολογίζεται σε περίπου. Η συχνότητα εμφάνισης του αφροδίσιου λεμφοκοκκιώματος (βουβωνικό λεμφοκοκκίωμα, νόσος Durand- Nicolas-Favre) παρουσιάζει μείωση σε όλο τον κόσμο. Ωστόσο, αυτή η σεξουαλικώς μεταδιδόμενη νόσος είναι ακόμη ενδημική στην Ασία, την Αφρική και τη Νότια Αμερική και σε περιοχές της Καραϊβικής. Χαρακτηριστικά απόδοσης Αναλυτική ευαισθησία Για το artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit αξιολογήθηκαν το αναλυτικό όριο ανίχνευσης καθώς και το αναλυτικό όριο ανίχνευσης λαμβάνοντας υπόψη τον καθαρισμό (όρια ευαισθησίας). Το αναλυτικό όριο ανίχνευσης λαμβάνοντας υπόψη τον καθαρισμό καθορίστηκε με τη βοήθεια κλινικών θετικών στο C. trachomatis δειγμάτων σε συνδυασμό με μία συγκεκριμένη μέθοδο εκχύλισης. Σε αντίθεση, το αναλυτικό όριο ανίχνευσης προσδιορίστηκε ανεξάρτητα από την επιλεγμένη μέθοδο εκχύλισης, χρησιμοποιώντας ορότυπους γνωστής συγκέντρωσης. Για τον προσδιορισμό της αναλυτικής ευαισθησίας του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit, εκτελέσθηκε μία σειρά αραιώσεων οροτύπου Ε του C. trachomatis από 10 μέχρι 0,003 και από 6,6 ως την ονομαστική τιμή 0,0006 ισοδυνάμων βακτηριακών γονιδιωμάτων/µl του C. trachomatis (be/µl) και αναλύθηκαν στο Rotor-Gene 6000 και Rotor-Gene 3000 αντίστοιχα, σε συνδυασμό με το artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. Οι έλεγχοι 8 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

9 εκτελέστηκαν σε τρεις διαφορετικές ημέρες με τη μορφή οκταπλών επαναληπτικών προσδιορισμών. Τα αποτελέσματα προσδιορίσθηκαν με τη βοήθεια ανάλυσης probit. Μία γραφική παράσταση της ανάλυσης probit στο Rotor-Gene 6000 εμφανίζεται στην Εικόνα 1. Το αναλυτικό όριο ανίχνευσης του artus C. trachomatis RG PCR Kit σε συνδυασμό με το Rotor-Gene Q MDx/Q/6000 και το Rotor-Gene 3000 είναι 0,04 be/µl (p = 0,05) και 0,2 be/µl (p = 0,05), αντίστοιχα. Αυτό σημαίνει ότι με πιθανότητα 95% μπορούν να ανιχνευθούν 0,04 be/µl ή 0,2 be/µl. 95% ~ 0.04 be/µl (95%) ( be/µl) Proportions log (dose) Εικόνα 1. Ανάλυση probit: C. trachomatis (Rotor-Gene 6000). Αναλυτική ευαισθησία του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit στο Rotor-Gene Η αναλυτική ευαισθησία λαμβάνοντας υπόψη τον καθαρισμό (QIAamp DNA Mini Kit, QIAGEN) του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit στα Οργανα Rotor-Gene, προσδιορίσθηκε με τη χρήση μιας σειρά αραιώσεων οροτύπου Ε του C. trachomatis από 6,6 ως την ονομαστική τιμή 0,0006 be/μl του C. trachomatis σε κλινικά δείγματα επιχρίσματος. Αυτά υποβλήθηκαν σε εκχύλιση του DNA χρησιμοποιώντας το QIAamp DNA Mini Kit (όγκος εκχύλισης: 200 µl, όγκος έκλουσης: 100 µl). Κάθε μία από τις οκτώ αραιώσεις αναλύθηκε με το artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit σε τρεις διαφορετικές ημέρες με τη μορφή οκταπλών επαναληπτικών προσδιορισμών. Τα αποτελέσματα προσδιορίσθηκαν με τη βοήθεια ανάλυσης probit. Μία γραφική παράσταση της ανάλυσης probit στο Rotor-Gene 6000 εμφανίζεται στην Εικόνα 2. Το αναλυτικό όριο ανίχνευσης λαμβάνοντας υπόψη τον καθαρισμό του artus C. trachomatis RG Plus PCR Kit σε συνδυασμό με το Rotor-Gene 3000, είναι 300 be/ml (p = 0,05). Αυτό σημαίνει ότι με πιθανότητα 95% μπορούν να ανιχνευθούν 300 be/ml. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016 9

10 1 95% ~ 300 be/ml (95%) QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) 0.8 Proportions log (dose) 0 Εικόνα 2. Ανάλυση probit: C. trachomatis (Rotor-Gene Αναλυτική ευαισθησία λαμβάνοντας υπόψη τον καθαρισμό (QIAamp DNA Mini Kit, QIAGEN) του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit στο Rotor-Gene Για την αναλυτική ευαισθησία λαμβάνοντας υπόψη τον καθαρισμό με το QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit στα Οργανα Rotor-Gene, μπορεί να γίνει αποδεκτή μία συγκρίσιμη ευαισθησία, όπως επιτεύγχθηκε με το QIAamp DNA Mini Kit, αφού οι μέσες απώλειες μετά τον καθαρισμό των δύο μεθόδων εκχύλισης που χρησιμοποιήθηκαν κυμαίνονται μεταξύ 0,3 και 1,8 %. Ειδικότητα Η ειδικότητα του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit εξασφαλίζεται, κατά πρώτο και κύριο λόγο, με την επιλογή των εκκινητών και των ανιχνευτών καθώς και με την επιλογή αυστηρών συνθηκών αντίδρασης. Οι εκκινητές και οι ανιχνευτές ελέγχθηκαν για τυχόν ομολογίες με όλες τις αλληλουχίες που έχουν δημοσιευθεί σε τράπεζες γονιδίων, με βάση την ανάλυση της σύγκρισης αλληλουχιών. Η ανιχνευσιμότητα όλων των σχετικών οροτύπων κατά συνέπεια διασφαλίστηκε μέσω στοίχισης με τράπεζα δεδομένων και με μία εκτέλεση PCR στα Οργανα Rotor-Gene με τους ακόλουθους ορότυπους (βλέπε Πίνακα 1). Επιπλέον, η ειδικότητα αξιολογήθηκε με τη χρήση 30 διαφορετικών δειγμάτων ούρων, 100 δειγμάτων επιχρίσματος και 30 σπέρματος, όλα αρνητικά στo C. trachomatis. Αυτά δεν εμφάνισαν κανένα σήμα με τους ειδικούς εκκινητές και ανιχνευτές του C. trachomatis που περιέχονται στο C. trachomatis Plus RG Master. 10 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

11 Πίνακας 1. Ελεγχος ειδικότητας σχετικών οροτύπων Chlamydia Ορότυποι Προμηθευτής C. trachomatis C. trachomatis C. trachomatis C. trachomatis C. trachomatis C. trachomatis C. trachomatis C. trachomatis C. trachomatis C. trachomatis C. trachomatis C. trachomatis A B Ba C D E F G H I J K ATCC* (VR-571B) ATCC (VR-573) ATCC (VR-347, prep 1) ATCC (VR-572) ATCC (VR-885) ATCC (VR-348B) ATCC (VR-346) ATCC (VR-878) ATCC (VR-879) ATCC (VR-880) ATCC (VR-886) ATCC (VR-887) C. trachomatis (Cycling Green ή A.FAM) Εσωτερικός μάρτυρας (Cycling Yellow ή A.JOE)) * American Type Culture Collection. Ο Πίνακας συνεχίζεται στην επόμενη σελίδα artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/

12 Πίνακας 1. Συνέχεια Chlamydia Ορότυποι Προμηθευτής C. trachomatis LGV I C. trachomatis LGV II C. trachomatis LGV II C. trachomatis LGV III ATCC (VR-901B) ATCC (VR-902B) ATCC (VR-577) ATCC (VR-903) C. trachomatis (Cycling Green ή A.FAM) Εσωτερικός μάρτυρας (Cycling Yellow ή A.JOE)) Μία πιθανή διασταυρωμένη αντίδραση του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit ελέγχθηκε με χρήση της ομάδας ελέγχου που παρατίθεται στον Πίνακα 2. Κανένας από τους εξεταζόμενους παθογόνους παράγοντες δεν προκάλεσε αντίδραση. Πίνακας 2. Ελεγχος της ειδικότητας του κιτ με πιθανούς διασταυρωμένης αντίδρασης παθογόνους παράγοντες Ομάδα ελέγχου C. trachomatis (Cycling Green ή Cycling A.FAM) Εσωτερικός μάρτυρας (Cycling Yellow ή Cycling A.JOE)) Acinetobacter spp. + Bordetella pertussis + Candida albicans + Candida glabrata + Chlamydia pneumoniae + Chlamydia psittaci + Enterobacter cloacea + Enterococus faecalis + Ο Πίνακας συνεχίζεται στην επόμενη σελίδα 12 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

13 Πίνακας 2. Συνέχεια Ομάδα ελέγχου C. trachomatis (Cycling Green ή Cycling A.FAM) Εσωτερικός μάρτυρας (Cycling Yellow ή Cycling A.JOE)) Escherichia coli + Gardnerella vaginalis + Haemophilus parainfluenzae + Klebsiella pneumoniae + Neisseria gonorrhoeae + Proteus mirabilis + Proteus vulgaris + Salmonella enteritides + Salmonella typhimurium + Staphylococcus aureus + Streptococcus pneumoniae + Streptococcus pyogenes + Herpes simplex virus 1 και 2 + Ακρίβεια Τα δεδομένα ακριβείας του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit έχουν συλλεχθεί με τη χρήση Οργάνων Rotor-Gene και επιτρέπουν τον προσδιορισμό της ολικής διακύμανσης της ανάλυσης. Η ολική διακύμανση συνίσταται από την μεταβλητότητα εντός της ανάλυσης (intra-assay), (μεταβλητότητα πολλαπλών αποτελεσμάτων δειγμάτων της ίδιας συγκέντρωσης, στα πλαίσια ενός πειράματος), την μεταβλητότητα μεταξύ διαφορετικών αναλύσεων (inter-assay), (μεταβλητότητα πολλαπλών αποτελεσμάτων της ανάλυσης που παράγονται σε δάφορα όργανα του ίδιου τύπου, από διάφορους χειριστές, εντός του ίδιου εργαστηρίου) και την μεταβλητότητα μεταξύ των παρτίδων (inter-batch), (μεταβλητότητα πολλαπλών αποτελεσμάτων της ανάλυσης με τη χρήση διαφορετικών παρτίδων). Τα ληφθέντα δεδομένα χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της τυπικής απόκλισης, της διακύμανσης και του συντελεστή μεταβλητότητας ειδικά για τον παθογόνο παράγοντα και για το εσωτερικό μάρτυρα της PCR. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/

14 Τα δεδομένα ακριβείας του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit έχουν συλλεχθεί με τη χρήση του οροτύπου Ε του C. trachomatis σε συγκέντρωση που βρίσκεται πλησίον της τριπλάσιας τιμής cut-off (2,1 be/µl λαμβάνοντας υπόψη τον καθαρισμό, 0,66 be/µl μη λαμβάνοντας υπόψη τον καθαρισμό). Ο έλεγχος πραγματοποιήθηκε με οκταπλούς θυγατρικούς κλώνους. Τα δεδομένα ακριβείας αξιολογήθηκαν βάσει των τιμών C T των καμπύλων ενίσχυσης (C T : threshold cycle, βλέπε Πίνακα 3). Βάσει αυτών των αποτελεσμάτων, η ολική στατιστική διασπορά ενός τυχαίου δείγματος της αναφερομένης συγκέντρωσης είναι 2,45% (C T ) και 1,87% (C T ) λαμβάνοντας υπόψη τον καθαρισμό (QIAamp DNA Mini Kit, Πίνακας 4) και 3,34% (C T ) και 2,13% (C T ) λαμβάνοντας υπόψη τον καθαρισμό (QIAamp DNA Mini Kit) για την ανίχνευση του εσωτερικού μάρτυρα. Οι τιμές αυτές βασίζονται στο σύνολο των επιμέρους τιμών των προσδιορισμένων μεταβλητοτήτων. Πίνακας 3. Δεδομένα ακριβείας βάσει των τιμών C T Μεταβλητότητα Intra-assay: C. trachomatis ορότυπος E (0,66 be/µl) Μεταβλητότητα Intra-assay: Εσωτερικός μάρτυρας Μεταβλητότητα Inter-assay: C. trachomatis ορότυπος E (0,66 be/µl) Μεταβλητότητα Inter-assay: Εσωτερικός μάρτυρας Μεταβλητότητα Inter-batch: C. trachomatis ορότυπος E (0,66 be/µl) Μεταβλητότητα Inter-batch: Εσωτερικός μάρτυρας Ολική διακύμανση: C. trachomatis ορότυπος E (0,66 be/µl) Ολική διακύμανση: Εσωτερικός μάρτυρας Τυπική απόκλιση Διακύμανση Συντελεστής μεταβλητότητας (%) 0,38 0,14 1,23 0,05 0,01 0,36 0,58 0,33 1,90 1,08 1,18 4,80 0,46 0,21 1,47 0,39 0,15 1,74 0,64 0,41 2,45 0,85 0,72 3,34 14 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

15 Πίνακας 4. Δεδομένα ακριβείας βάσει των τιμών C T λαμβάνοντας υπόψη τον καθαρισμό με το QIAamp DNA Mini Kit Μεταβλητότητα Intra-assay: C. trachomatis ορότυπος E (2,1 be/µl) Μεταβλητότητα Intra-assay: Εσωτερικός μάρτυρας Μεταβλητότητα Inter-assay: C. trachomatis ορότυπος E (2,1 be/µl) Μεταβλητότητα Inter-assay: Εσωτερικός μάρτυρας Μεταβλητότητα Inter-batch: C. trachomatis ορότυπος E (2,1 be/µl) Μεταβλητότητα Inter-batch: Εσωτερικός μάρτυρας Ολική διακύμανση: C. trachomatis ορότυπος E (2,1 be/µl) Ολική διακύμανση: Εσωτερικός μάρτυρας Τυπική απόκλιση Διακύμανση Συντελεστής μεταβλητότητας (%) 0,33 0,11 1,06 0,27 0,07 1,12 0,49 0,11 1,09 0,49 0,24 2,07 0,58 0,34 1,83 0,31 0,09 1,33 0,58 0,34 1,87 0,50 0,25 2,13 Ανθεκτικότητα Η επιβεβαίωση της ανθεκτικότητας επιτρέπει τον προσδιορισμό του συνολικού ποσοστού αποτυχίας του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. 100 δείγματα επιχρισμάτων, 30 δείγματα ούρων και 30 δείγματα σπέρματος όλα αρνητικά στo C. trachomatis αναμείχθηκαν το καθένα με 2,1 be/µl όγκου έκλουσης του μάρτυρα DNA του C. trachomatis (περίπου τριπλή συγκέντρωση του αναλυτικού ορίου ευαισθησίας). Μετά την εκχύλιση με τη χρήση του QIAamp DNA Mini Kit (δείγματα σπέρματος και επιχρίσματος) και του QIAamp Viral RNA Mini Kit (δείγματα ούρων), τα δείγματα αυτά αναλύθηκαν με το artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. Για όλα τα δείγματα του C. trachomatis το ποσοστό αποτυχίας ήταν 0%. Επιπλέον, η ανθεκτικότητα του εσωτερικού μάρτυρα αξιολογήθηκε με τον καθαρισμό και ανάλυση 100 δειγμάτων επιχρισμάτων, 30 δειγμάτων ούρων και 30 δειγμάτων σπέρματος αρνητικών artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/

16 στo C. trachomatis. Το συνολικό ποσοστό αποτυχίας ήταν 0%. Δεν παρατηρήθηκαν αναστολές. Κατά συνέπεια, η ανθεκτικότητα του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit είναι 99%. Αναπαραγωγιμότητα Τα δεδομένα της αναπαραγωγιμότητας επιτρέπουν μία κανονική αξιολόγηση της επίδοσης του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit καθώς και μία αποτελεσματική σύγκριση με άλλα προϊόντα. Τα δεδομένα αυτά αποκτώνται με τη συμμετοχή σε τεκµηριωµένα προγράμματα. Διαγνωστική αξιολόγηση Το artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit αξιολογήθηκε σε τέσσερεις μελέτες. Διαγνωστική αξιολόγηση 1: Σύγκριση δειγμάτων επιχρισμάτων και ούρων με τη COBAS Amplicor CT/NG Assay Για τη σύγκριση του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit με τη COBAS Amplicor CT/NG Assay, εξετάστηκαν 107 αναδρομικά δείγματα επιχρισμάτων και ούρων. Στη μελέτη αυτή, η διαγνωστική ευαισθησία του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit ήταν 98%. Δεν παρατηρήθηκαν αναστολές. Η διαγνωστική ειδικότητα του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit ήταν 100%. Το αποκλίνων δείγμα (Πίνακας 5) ελέγχθηκε θετικό από δύο συστήματα διάγνωσης του C. trachomatis σε προηγούμενες εξετάσεις, μία φορά σε εξέταση που εκτελέσθηκε στο Οργανο LightCycler 2.0 και μία φορά με τη COBAS Amplicor CT/NG Assay (artus versus COBAS Amplicor). Η απώλεια συγκέντρωσης των δειγμάτων που οφείλεται στην αποθήκευση οδηγεί σε μία μετατόπιση του ορίου ανίχνευσης και των δύο μεθόδων ανάλυσης. Συνεπώς τα αποκλίνοντα αποτελέσματα των δύο δειγμάτων δεν συμβαίνουν λόγω απροσδιόριστων ενισχύσεων ή ανιχνεύσεων (ούτε για τα artus PCR κιτ ούτε για τη COBAS Amplicor ανάλυση). Πίνακας 5. Αποτελέσματα της 1 ης συγκριτικής μελέτης επικύρωσης COBAS Amplicor CT/NG Assay + Σύνολο artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

17 Διαγνωστική αξιολόγηση 2: Σύγκριση δειγμάτων σπέρματος με τη Cobas Amplicor CT/NG Assay Για τη σύγκριση του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit με τη COBAS Amplicor CT/NG Assay, εξετάστηκαν 65 αναδρομικά δείγματα σπέρματος. Για τα 65 εξετασθέντα αναδρομικά δείγματα σπέρματος, υπήρχε μία 100% αντιστοιχία του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit σε σύγκριση με τη COBAS Amplicor Assay. Το ποσοστό αναστολής ήταν 0%. Η διαγνωστική ευαισθησία ήταν 100%. Η διαγνωστική ειδικότητα του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit ήταν 100% (Πίνακας 6). Πίνακας 6. Αποτελέσματα της 2 ης συγκριτικής μελέτης επικύρωσης COBAS Amplicor CT/NG Assay + Σύνολο artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Διαγνωστική αξιολόγηση 3: Σύγκριση δειγμάτων επιχρισμάτων και ούρων με τη LCx και Aptima Combo 2 Assay Για τη σύγκριση του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit με τη LCR (αλυσιδωτή αντίδραση λιγάσης, LCx CT Assay) και με μία TMA [transcription mediated amplification (μεταγραφή μεσολαβούμενης ενίσχυσης), APTIMA Combo 2 Assay], εξετάστηκαν 234 αναδρομικά δείγματα επιχρισμάτων και ούρων. Στη μελέτη αυτή, η αντιστοιχία της LCR (LCx CT Assay) και της Aptima Combo 2 Assay με το artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit ήταν 98% για αναδρομικά δείγματα επιχρισμάτων και ούρων. Η διαγνωστική ειδικότητα του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit ήταν 99% (Πίνακας 7). Πίνακας 7. Αποτελέσματα της 3 ης συγκριτικής μελέτης επικύρωσης LCx/Aptima Combo 2 + Σύνολο artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/

18 Διαγνωστική αξιολόγηση 4: Εξέταση κλινικών εποχρισμάτων οφθαλμού 100 επιχρίσματα οφθαλμού που είχαν προηγουμένως εξεταστεί, εξετάστηκαν αναδρομικά με το artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. Για τα 100 εξετασθέντα αναδρομικά δείγματα επιχρίσματος οφθαλμού η διαγνωστική ευαισθησία του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit ήταν 100%. Η διαγνωστική ειδικότητα του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit ήταν100% (Πίνακας 8). Πίνακας 8. Αποτελέσματα της 4 ης συγκριτικής μελέτης επικύρωσης Αναμενόμενο αποτέλεσμα + Σύνολο artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

19 Εξοπλισμός και αντιδραστήρια που παρέχονται στο χειριστή Κατά την επαφή σας με χημικές ουσίες, φορέστε πάντα ποδιά εργαστηρίου, γάντια και γυαλιά ασφαλείας. Περαιτέρω πληροφορίες μπορείτε να βρείτε στα κατάλληλα φυλλάδια δεδομένων ασφαλείας (SDSs) που διατίθενται από τους προμηθευτές προїόντων. Κιτ απομόνωσης DNA (βλέπε Απομόνωση DNA, σελίδα 23) Πιπέτες (ρυθμιζόμενες)* Στείρα ρύγχη πιπετών με φίλτρο Αναδευτήρας Vortex * Επιτραπέζιος φυγόκεντρος* με κεφαλή για σωληνάρια 2 ml Οργανα Rotor-Gene Q MDx, Rotor-Gene Q ή Rotor-Gene* με κανάλια φθορισμού για Cycling Green και Cycling Yellow ή με κανάλια φθορισμού για Cycling A.FAM και Cycling A.JOE Rotor-Gene Q MDx/Rotor-Gene Q λογισμική έκδοση ή νεότερη (Rotor-Gene 6000 λογισμική έκδοση , , ; Rotor-Gene 3000 λογισμική έκδοση ) Ταινίες σωληναρίων και πωμάτων, 0,1 ml, για τη χρήση με κεφαλή 72 υποδοχών (αριθ.κατ ή ) Το artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit δεν επικυρώθηκε για τη χρήση με το the Rotor-Gene με κεφαλή 36 υποδοχών. Μπλοκ ψύξης (Μπλοκ φόρτισης 72 x 0,1 ml σωληναρίων, αριθ.κατ ή Μπλοκ φόρτισης 96 x 0,2 ml σωληναρίων, αριθ.κατ ) * Σιγουρευτείτε ότι τα όργανα έχουν ελεγχθεί, συντηρηθεί και βαθμονομηθεί τακτικά σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/

20 Σημαντικές Σημειώσεις Γενικές προφυλάξεις Ο χειριστής πρέπει πάντοτε να λαμβάνει υπόψη του τα ακόλουθα σημεία: Χρησιμοποίηση στείρων ρυγχών πιπέτας με φίλτρο. Η αποθήκευση και η εκχύλιση θετικού υλικού (δείγματα, θετικοί μάρτυρες και αμπλικόνια) να γίνονται χωριστά από όλα τα άλλα αντιδραστήρια και να προστίθενται στο μείγμα αντίδρασης σε εγκατάσταση ξεχωριστού χώρου. Πλήρη απόψυξη όλων των υλικών σε θερμοκρασία δωματίου (15 25 C), πριν από την έναρξη μιας ανάλυσης. Μετά την απόψυξη,να γίνεται ανάμιξη των υλικών (με επαναληπτική αναρρόφηση με πιπέτα ή με γρήγορο στροβιλισμό) και σύντομη φυγοκέντρηση. H εργασία πρέπει να γίνεται μεθοδικά και γρήγορα, σε πάγο ή μπλοκ ψύξης (μπλοκ φόρτισης 72/96 υποδοχών). Συλλογή, αποθήκευση και μεταφορά δειγμάτων Σημείωση: Όλα τα δείγματα να χειρίζονται ως δυνητικώς μολυσματικά. Επιτρέπονται μόνο τα ακόλουθα υλικά δειγμάτων, για τα οποία πρέπει να λαμβάνονται οπωσδήποτε υπόψη αυστηρά οι ακόλουθοι κανόνες και συγκεκριμένες οδηγίες όσον αφορά τη συλλογή, αποθήκευση και μεταφορά τους. Ούρα Επιχρίσματα οφθαλμών, τραχήλου μήτρας και ουρήθρας Δείγματα σπέρματος Για να εξασφαλιστεί η υψηλή ποιότητα των δειγμάτων, θα πρέπει η μεταφορά τους να γίνεται όσο το δυνατό πιο γρήγορα. Τα δείγματα πρέπει να μεταφέρονται σύμφωνα με τις υποδεικνυόμενες συνθήκες θερμοκρασίας. Δείγματα ούρων Σημείωση: Ο ασθενής θα πρέπει να ενημερώνεται ώστε να μην ουρήσει τουλάχιστον δύο ώρες πριν από τη συλλογή του δείγματος. Συλλέξτε 5-30 ml από τα αρχικά ούρα σε ένα καθαρό δοχείο από πολυπροπυλένιο χωρίς συντηρητικά. Κλείστε τα δοχεία με τα δείγματα και βάλτε τους ετικέτα. Σημείωση: Μη χρησιμοποιείτε δείγματα ούρων που συλλέχθηκαν σε δοχεία με συντηρητικά. 20 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

21 Εάν η εξέταση των δειγμάτων ούρων μπορεί να ολοκληρωθεί εντός 24 ωρών, τα δείγματα μπορούν να φυλαχθούν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (15 έως 25 C). Για αποθήκευση μεγαλύτερης διάρκειας εάν η εξέταση γίνει εντός 7 ημερών, τα δείγματα πρέπει να φυλάσσονται στο ψυγείο στους 2 έως 8 C. Εάν τα δείγματα ούρων δεν μπορούν να εξεταστούν εντός 7 ημερών, πρέπει να φυλάσσονται σε θερμοκρασία 15 έως 30 C ή χαμηλότερη για όχι περισσότερο από 30 ημέρες. Τα δείγματα ούρων πρέπει να φυλάσσονται μέχρι την αποστολή τους στους 2 έως 8 C εντός ψυγείου και πρέπει να μεταφέρονται σύμφωνα με τις ισχύουσες τοπικές και κρατικές οδηγίες σχετικά με τη μεταφορά παθογόνου υλικού.* Δείγματα επιχρισμάτων Σημείωση: Για τη συλλογή και μεταφορά επιχρισμάτων οφθαλμών, τραχήλου μήτρας και ουρήθρας χρησιμοποιείτε τα ακόλουθα υλικά. Σημείωση: Χρησιμοποιείτε μόνο στειλεό επιχρίσματος με κεφαλή από Dacron, τεχνητό μετάξι ή αλγινικό ασβέστιο και λαβή από συνθετική ύλη. Μη χρησιμοποιείτε στειλεό επιχρίσματος με λαβή από αλουμίνιο ή ξύλο. Δείγματα επιχρίσματος οφθαλμών, τραχήλου μήτρας και ουρήθρας μπορούν να συλλεχθούν και να μεταφερθούν σε 1-3 ml των ακολούθων υλικών. digene Female Swab Specimen Collection Kit (QIAGEN, αρ. κατ ) digene Cervical Sampler (QIAGEN, αρ. κατ ) AMPLICOR STM (Μέσο μεταφοράς δειγμάτων, Roche, Inc.) STD Swab Specimen Collection και Transport Kit (Roche, Inc.) M4 CTM (MicroTest, Thermo Fisher Scientific) 2SP CTM (Bartels, Inc.) Bartels ChlamTrans CTM (Bartels, Trinity Biotech) Mastazyme Chlamydia Swab Set (MAST DIAGNOSTICA) Mastazyme Chlamydia Transport Medium (MAST DIAGNOSTICA) IDEIA Chlamydia Specimen Collection Kit (DakoCytomation) MicroTrak II Chlamydia EIA Specimen Collection Kit (Trinity Biotech) Αφήστε το επίχρισμα εντός του υλικού καλλιέργειας του μέσου μεταφοράς. Κλείστε τα δοχεία με τα δείγματα και βάλτε τους ετικέτα. Ακολουθήστε προσεκτικά τις οδηγίες που δίνονται για τη φύλαξη και μεταφορά. Τα δείγματα πρέπει να φυλάσσονται στους 2 8 C. (Οταν τα δείγματα επιχρίσματος στέλνονται σε ερευνητικό εργαστήριο, η μεταφορά τους πρέπει * International Air Transport Association (IATA). Dangerous Goods Regulations. Biosafety in Microbiological Laboratories Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 4th Edition. HHS Publication Number (CDC) artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/

22 να γίνει όσο το δυνατόν συντομότερα μετά τη λήψη, σύμφωνα με τις προδιαγραφές του εργαστηρίου για μεταφορά των δειγμάτων χλαμυδίων). Εάν τα δείγματα επιχρίσματος δεν εξετάζονται αμέσως μετά την άφιξή τους στο εργαστήριο, πρέπει να αποθηκεύονται στους 2 8 C και πρέπει να επεξεργάζονται εντός επτά ημερών. Εάν τα δείγματα δεν μπορούν να επεξεργασθούν εντός επτά ημερών, πρέπει να αποθηκεύονται στους 15 μέχρι 30 C ή και χαμηλότερη θερμοκρασία όχι περισσότερο από 30 ημέρες και να εξετάζονται μέσα σε 30 ημέρες μετά τη συλλογή τους. Δείγματα επιχρίσματος πρέπει να μεταφέρονται υπό ψύξη. Δείγματα επιχρίσματος θα πρέπει να αποστέλλονται σε ερευνητικό εργαστήριο όσο το δυνατό συντομότερα μετά τη συλλογή τους, ακολουθώντας τις οδηγίες του εργαστηρίου για μεταφορά υπό ψύξη. Τα δείγματα πρέπει να μεταφέρονται σύμφωνα με τις ισχύουσες τοπικές και κρατικές προδιαγραφές, σχετικά με τη μεταφορά παθογόνου υλικού.* Δείγματα σπέρματος Σημείωση: Η λήψη δείγματος πρέπει να γίνεται δύο μέχρι τρείς ημέρες μετά την τελευταία εκσπερμάτωση. Σημείωση: Το δείγμα του σπέρματος πρέπει να λαμβάνεται την ίδια ημέρα που θα σταλεί στο ερευνητικό εργαστήριο. Η λήψη του δείγματος του σπέρματος μπορεί να γίνει με ένα από τους ακόλουθους τρόπους, με τη χρήση τυποποιημένων εργαστηριακών διαδικασιών και πρακτικής. Με αυνανισμό κατευθείαν σε ένα αποστειρωμένο, καθαρό και στεγνό δοχείο. Σιγουρευτείτε ότι όλο το δείγμα συλλέγεται κατευθείαν στο δοχείο. Εάν μία ποσότητα του δείγματος χαθεί κατά τη συλλογή, αυτό πρέπει να σημειωθεί στο πρωτόκολλο λήψης δείγματος. Με αυνανισμό με τη χρήση προφυλακτικού. Μετά την εκσπερμάτωση αφαιρέστε το προφυλακτικό και ασφαλίστε το με περιστροφικό δέσιμο στο επάνω μέρος για τη διαφύλαξη του σπέρματος εντός του προφυλακτικού. Τοποθετείστε το προφυλακτικό σε μία σακούλα μεταφοράς. Σημείωση: Χρησιμοποιείτε μόνο δοχεία χωρίς συντηρητικά και προφυλακτικά χωρίς σπερματοκτόνες ή τεχνητές ουσίες (όπως χρωστικές ουσίες). Διατηρήστε τα δείγματα σπέρματος σε σκοτεινό μέρος για 30 έως 45 λεπτά (π.χ. σε ένα συρτάρι ή ένα ντουλάπι), μέχρι να ρευστοποιηθούν. Καταψύξτε τα δείγματα σπέρματος αμέσως μετά τη ρευστοποίηση μέσα σε φιαλίδια κατάψυξης στους -15 έως -30 C ή σε χαμηλότερες θερμοκρασίες. Εάν ένα δείγμα σπέρματος δεν εξετάζεται αμέσως μετά την άφιξή του στο εργαστήριο, πρέπει να αποθηκεύεται στους -15 έως -30 C ή σε χαμηλότερες θερμοκρασίες και να εξετάζεται μέσα σε 30 ημέρες μετά τη συλλογή του. * International Air Transport Association (IATA). Dangerous Goods Regulations. 22 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

23 Εάν τα δείγματα σπέρματος πρέπει να αποσταλλούν σε ερευνητικό εργαστήριο, η μεταφορά τους πρέπει να γίνει όσο το δυνατόν συντομότερα μετά τη συλλογή τους, σύμφωνα με τις προδιαγραφές του εργαστηρίου για μεταφορά των δειγμάτων χλαμυδίων. Επιπλέον, τα δείγματα σπέρματος πρέπει να μεταφέρονται υπό ψύξη. Τα δείγματα πρέπει να μεταφέρονται σύμφωνα με τις ισχύουσες τοπικές και κρατικές προδιαγραφές, σχετικά με τη μεταφορά παθογόνου υλικού.* Απομόνωση DNA Τα κιτ της Qiagen που παρουσιάζονται στον Πίνακα 9 έχουν επικυρωθεί για τον καθαρισμό του DNA από τους υποδεικνυόμενους τύπους δείγματος ανθρώπου για χρήση με το artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. Πραγματοποιήστε τον καθαρισμό DNA σύμφωνα με τις παρακάτω οδηγίες οι οποίες, σε ορισμένες περιπτώσεις, διαφέρουν από τα πρωτόκολλα των εγχειριδίων του κιτ. Πίνακας 9. Κιτ καθαρισμού επικυρωμένα για τη χρήση με το artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Υλικό δείγματος Ούρα Σπέρμα, επιχρίσματα Κιτ απομόνωσης νουκλεϊκού οξέος QIAamp Viral RNA Mini Kit (50) Αρ. καταλόγου (QIAGEN) QIAamp DNA Mini Kit (50) Φορέας RNA περιέχεται Δεν περιέχεται Σημείωση: Το artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit δεν πρέπει να χρησιμοποιείται με μεθόδους απομόνωσης που βασίζονται στη φαινόλη. Χρήση του QIAamp Viral RNA Mini Kit για δείγματα ούρων Σημείωση: Η χρήση του φορέα RNA έχει κριτική σημασία για την αποδοτικότητα της εκχύλισης και, κατά συνέπεια, για την απόδοση του DNA/RNA. Προσθέστε την ενδεδειγμένη ποσότητα του φορέα RNA σε κάθε εκχύλιση ακολουθώντας τις οδηγίες του QIAamp Viral RNA Mini Εγχειριδίου. Σημείωση: Ο εσωτερικός μάρτυρας του the artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit μπορεί να χρησιμοποιηθεί κατευθείαν στη διαδικασία απομόνωσης (βλέπε Εσωτερικός μάρτυρας, σελίδα 30). Το ρυθμιστικό διάλυμα AVL, που χρησιμοποιείται στη διαδικασία του QIAamp Viral RNA Mini, αδρανοποιεί τους πολυάριθμους μη ταυτοποιημένους αναστολείς της PCR που υπάρχουν στα ούρα. Για την απομόνωση του * International Air Transport Association (IATA). Dangerous Goods Regulations. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/

24 κυτταρικού, βακτηριακού και ιικού DΝΑ από τα ούρα, συνιστάται το Πρωτόκολλο QIAamp Viral RNA Mini Spin. Αφήσετε τα δείγματα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (15 25 C). Τα ούρα περιέχουν συχνά πολύ μικρό αριθμό βακτηρίων. Για το λόγο αυτό είναι χρήσιμη η συμπύκνωση των δειγμάτων. Συμπυκνώστε τα δείγματα (5 30 ml το καθένα) με φυγοκέντρηση το πολύ στα x g για λεπτά (εναλλακτικά 3000 x g για 30 λεπτά). Το υπερκείμενο υγρό πρέπει να απορρίπτεται προσεκτικά. Κατόπιν το ίζημα θα πρέπει να επανααιωρείται σε 1200 µl PBS (1x) πλήρως με ανάδευση ώστε να διαλυθεί και να διασπαρεί το δείγμα. Το βήμα αυτό θα πρέπει να εκτελείται με παλμική ανάδευση για λεπτά. Για την εκχύχιση του DNA χρησιμοποιήστε 140 µl από τα προετοιμασμένα δείγματα. Ακολουθήστε από την αρχή τις τις οδηγίες του Πρωτοκόλλου QIAamp Viral RNA Mini Spin (QIAamp Viral RNA Mini Εγχειρίδιο, Εκδοση Τρίτη, Απρίλιος 2010, σελίδα 23). Σημείωση: Συνιστούμε οπωσδήποτε την εκτέλεση του προτεινόμενου βήματος φυγοκέντρησης 10 του πρωτοκόλλου για την απομάκρυνση οποιουδήποτε κατάλοιπου αιθανόλης. Συνιστούμε επίσης την αύξηση του χρόνου αυτού του βήματος φυγοκέντρησης στα 3 λεπτά. Προτείνουμε τη χρήση όγκου έκλουσης 60 µl. Χρήση του QIAamp Viral RNA Mini Kit για δείγματα επιχρίσματος και σπέρματος Σημείωση: Η χρήση του φορέα RNA έχει κριτική σημασία για την αποδοτικότητα της εκχύλισης και, κατά συνέπεια, για την απόδοση του DNA/RNA. Παρακαλούμε λάβετε υπόψη ότι η προσθήκη του φορέα (RNA Homopolymer Poly[rA],* δεν συμπεριλαμβάνεται στο QIAamp DNA Mini Kit) συνιστάται επιτακτικά για την εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων από σωματικά υγρά ελεύθερα κυττάρων και υλικών με μικρές περιεκτικότητες σε DNA και RNA. Στις περιπτώσεις αυτές, προετοιμάστε τον φορέα RNA ως ακολούθως. Επανααιωρήστε το λυοφιλοποιημένο φορέα RNA (RNA Homopolymer Poly[rA], δεν συμπεριλαμβάνεται στο QIAamp DNA Mini Kit) χρησιμοποιώντας το ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης (μη χρησιμοποιείτε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης) του κιτ εκχύλισης (Ρυθμιστικό διάλυμα AE του QIAamp DNA Mini Kit) και παρασκευάστε μία αραίωση με συγκέντρωση 1 µg/µl. Διαμοιράστε το διάλυμα αυτό του φορέα RNA στον ανάλογο αριθμό ποσοτήτων που αντιστοιχεί στις ανάγκες σας και φυλάξτε αυτές * Όταν εργάζεστε με χημικές ουσίες θα πρέπει πάντοτε να φοράτε προστατευτική ποδιά εργαστηρίου, γάντια μίας χρήσης και προστατευτικά γυαλιά. Για περισσότερες πληροφορίες παρακαλήστε να ανατρέξετε στα σχετικά δελτία δεδομένων ασφαλείας υλικού (SDSs) που διατίθενται από τον προμηθευτή του προϊόντος. 24 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

25 στους 15 μέχρι 30 C. Αποφύγετε την επαναληπτική απόψυξη (>2 x) των επιμερισμένων ποσοτήτων του φορέα RNA. Χρησιμοποιήστε 1 µg φορέα RNA ανά 100 µl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης. Για παράδειγμα, εάν το το πρωτόκολλο εκχύλισης χρησιμοποιεί 200 µl ρυθμιστικού διαλύματος, προσθέστε 2 µl φορέα RNA (1 µg/µl) κατευθείαν στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (Ρυθμιστικό διάλυμα AL του QIAamp DNA Mini Kit). Πριν από την έναρξη της διαδικασίας εκχύλισης, πρέπει να παρασκευασθεί ένα πρόσφατο μείγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και φορέα RNA (εσωτερικού μάρτυρα, ανάλογα με την περίπτωση, βλέπε Εσωτερικός μάρτυρας, σελίδα 30) σύμφωνα με το σχήμα επεξεργασίας με πιπέτα στον Πίνακα 10. Πίνακας 10. Πιπετικό σχήμα για τη χρήση με το QIAamp DNA Mini Kit Αριθμός δειγμάτων 1 12 Ρυθμιστικό διάλυμα AL (ρυθμιστικό διάλυμα λύσης)* π.χ., 200 µl π.χ., 2400 µl Φορέας RNA (1 µg/µl) 2 µl 24 µl Συνολικός όγκος 202 µl 2424 µl Ογκος ανά εκχύλιση 200 µl 200 µl κάθε ένα * Περιέχει υδροχλωρική γουανιδίνη: Βλέπε στο εγχειρίδιο του κιτ για πληροφορίες ασφαλείας. Σημείωση: Για την εκχύλιση, χρησιμοποιείτε το πρόσφατα παρασκευασμένο μείγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και φορέα RNA αμέσως. Αποθήκευση του μείγματος δεν είναι δυνατή. Σημείωση: Ο εσωτερικός μάρτυρας του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit μπορεί να εισαχθεί κατευθείαν στη διαδικασία απομόνωσης (βλέπε Εσωτερικός μάρτυρας, σελίδα 30). Εκτελέστε τον καθαρισμό με το QIAamp DNA Mini Kit σύμφωνα με τα ακόλουθα βήματα, τα οποία διαφοροποιούνται από τα πρωτόκολλα των QIAamp DNA Mini και Blood Mini Εγχειριδίων. Αφήσετε τα δείγματα να αποκτήσουν θερμοκρασία περιβάλλοντος (15 έως 25 C). Για τα δείγματα επιχρίσματος που περιέχουν στειλεό στο μέσο μεταφοράς καλλιέργειας, αυτά πρέπει να αναμιχθούν με στροβιλισμό. Τα καπάκια από τα σωληνάρια δειγμάτων πρέπει να ανοίγονται προσεκτικά. Προσέξτε να μη μολυνθούν τα γάντια. Μολυσμένα γάντια artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/

26 πρέπει να αντικατασταθούν με καινούργια, πριν από την επεξεργασία του επομένου δείγματος. Πιέστε το επίχρισμα κατά του τοιχώματος του σωληναρίου για να εξέλθει το υγρό. Τη στιγμή αυτή τυχόν περίσσεια βλέννα πρέπει να αφαιρεθεί με συλλογή της από το επίχρισμα. Μετά, τυχόν υπόλοιπο υγρού από τη βλέννα και το επίχρισμα πρέπει να εξαχθεί πιέζοντας το επίχρισμα κατά του τοιχώματος του σωληναρίου. Στο τέλος το επίχρισμα και η βλέννα πρέπει να απομακρύνονται και να απορρίπτονται. Προσθέστε με πιπέτα 180 µl Ρυθμιστικού διαλύματος ATL και 200 µl του μέσου μεταφοράς σε σωληνάριο μικροφυγοκέντρησης 1,5 ml και αναδεύστε καλά. Τοποθετήστε ξηρά επιχρίσματα κατευθείαν εντός σωληναρίου μικροφυγοκέντρησης 1,5 ml. Προσθέστε 180 µl Ρυθμιστικού διαλύματος ATL και αναδεύστε για δευτερόλεπτα. Eναλλακτικά, προσθέστε 200 µl Ρυθμιστικού διαλύματος ATL στο σωληνάριο μεταφοράς και αναμείξτε το επίχρισμα για δευτερόλεπτα εντός του σωληναρίου. Στη συνέχεια μεταφέρετε 180 µl σε ένα σωληνάριο μικροφυγοκέντρησης 1,5 ml. Βεβαιωθείτε ότι το υγρό από το επίχρισμα εξάγεται πιέζοντας το επίχρισμα κατά του τοιχώματος του σωληναρίου. Μετά, απομακρύνετε και απορρίψετε το επίχρισμα. Για την εκχύλιση του DNA από δείγματα σπέρματος, αραιώστε 60 µl του υλικού δείγματος με 140 µl PBS (1x) σε ένα σωληνάριο μικροφυγοκέντρησης 1,5 ml και αναμείξτε με ανάδευση. Μεταφέρετε με την πιπέτα 100 µl του διαλύματος και 180 µl ρυθμιστικού διαλύματος ATL εντός ενός νέου σωληναρίου μικροφυγοκέντρησης 1,5 ml και αναμείξτε με παλμική ανάδευση για δευτερόλεπτα. Προσθέστε 20 µl πρωτεïνάσης K, αναμείξτε με παλμική ανάδευση και επωάσετε στους 56 C για 15 λεπτά (επιχρίσματα) ή 1 12 ώρες (δείγματα σπέρματος). Αναδεύσετε κατά διαστήματα κατά την διάρκεια της επωάσεως για τη διασπορά του δείγματος ή τοποθετήστε σε θερμομίξερ. Σημείωση: Πρέπει να χρησιμοποιηθεί πρωτεïνάση K. Η πρωτεάση QIAGEN παρουσιάζει μειωμένη δραστικότητα υπό την παρουσία του ρυθμιστικού διαλύματος ATL. Φυγοκεντρήστε τα σωληνάρια μικροφυγοκέντρισης 1,5 ml για μικρό χρονικό διάστημα για να αποφύγετε κατά το άνοιγμα των σωληναρίων διασταυρωμένες επιμολύνσεις, μέσω των σταγονιδίων του υγρού δείγματος στο εσωτερικό του καλύμματος. Προσθέστε στο δείγμα 200 µl Ρυθμιστικού διαλύματος AL (με φορέα RNA και, προαιρετικά, εσωτερικό μάρτυρα. Βλέπε παραπάνω και Εσωτερικός μάρτυρας, σελίδα 30. Αναμείξτε με παλμική ανάδευση για 15 δευτερόλεπτα και επωάστε στους 70 C για 10 λεπτά. Φυγοκεντρήστε τα σωληνάρια μικροφυγοκέντρισης 1,5 ml για μικρό χρονικό διάστημα για να αποφύγετε κατά το άνοιγμα των σωληναρίων διασταυρωμένες 26 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

27 επιμολύνσεις, μέσω των σταγονιδίων του υγρού δείγματος στο εσωτερικό του καλύμματος. Η πλήρης ανάμιξη του δείγματος με το Ρυθμιστικό διάλυμα AL είναι πολύ σημαντική, για την παρασκευή ενός ομοιογενούς διαλύματος. Προσθέστε στο δείγμα 200 µl αιθανόλης (96 100%) και αναμείξτε με παλμική ανάδευση για 15 δευτερόλεπτα. Φυγοκεντρήστε τα σωληνάρια μικροφυγοκέντρισης για μικρό χρονικό διάστημα για να αποφύγετε διασταυρωμένες επιμολύνσεις. Προσθέστε προσεκτικά 500 µl του μείγματος (συμπεριλαμβανομένου και του ιζήματος) στη στήλη QIAamp Mini spin (σε ένα σωληνάριο συλλογής 2 ml) χωρίς να βρέξετε το χείλος. Κλείστε προσεκτικά το κάλλυμα και φυγοκεντρήστε σε 6000 x g (8000 στρ./λεπτό) για ένα λεπτό. Τοποθετήστε την στήλη QIAamp Mini spin σε ένα καθαρό σωληνάριο συλλογής 2 ml και απορρίψετε το σωληνάριο συλλογής που περιέχει το διήθημα.* Κλείστε καλά όλες τις στήλες για την αποφυγή κατά την φυγοκέντρηση σχηματισμού αερολυμάτων. Επαναλάβετε το τελευταίο βήμα μεταφέροντας όλο το υπόλοιπο μείγμα στη στήλη QIAamp Mini spin. Ανοίξτε προσεκτικά τη στήλη QIAamp Mini spin και προσθέστε 500 µl Ρυθμιστικού διαλύματος AW1 χωρίς να βρέξετε το χείλος. Κλείστε προσεκτικά το κάλλυμα και φυγοκεντρήστε σε 6000 x g (8000 στρ./λεπτό) για ένα λεπτό. Τοποθετήστε την στήλη QIAamp Mini spin σε ένα καθαρό σωληνάριο συλλογής 2 ml και απορρίψετε το σωληνάριο συλλογής που περιέχει το διήθημα. Ανοίξτε προσεκτικά τη στήλη QIAamp Mini spin και προσθέστε 500 µl Ρυθμιστικού διαλύματος AW2 χωρίς να βρέξετε το χείλος. Κλείστε προσεκτικά το κάλλυμα και φυγοκεντρήστε στη μέγιστη ταχύτητα (π.χ., στρ./λεπτό) για 3 λεπτά. Απορρίψετε το σωληνάριο συλλογής που περιέχει το διήθημα. Τοποθετήστε την στήλη QIAamp Mini spin σε ένα καθαρό σωληνάριο συλλογής 2 ml και φυγοκεντρήστε στη μέγιστη ταχύτητα (π.χ., στρ./λεπτό) για 3 λεπτά. Τοποθετήστε την στήλη QIAamp Mini spin σε ένα καθαρό σωληνάριο συλλογής 1,5 ml και απορρίψετε το σωληνάριο συλλογής που περιέχει το διήθημα. Ανοίξτε προσεκτικά τη στήλη QIAamp Mini spin και προσθέστε 50 µl Ρυθμιστικού διαλύματος AE. Επωάστε τη στήλη σε θερμοκρασία δωματίου (15 25 C) για ένα λεπτό και μετά φυγοκεντρήστετη στήλη QIAamp Mini spin σε 6000 x g (8000 στρ./λεπτό) για ένα λεπτό. * Το διήθημα περιέχει Ρυθμιστικό διάλυμα AL ή Ρυθμιστικό διάλυμα AW1 και για το λόγο αυτό δεν είναι συμβατό με λευκαντικό. Βλέπε το QIAamp DNA Mini and Blood Mini Εγχειρίδιο για πληροφορίες ασφαλείας. Το διήθημα περιέχει Ρυθμιστικό διάλυμα AL ή Ρυθμιστικό διάλυμα AW1 και για το λόγο αυτό δεν είναι συμβατό με λευκαντικό. Βλέπε το QIAamp DNA Mini and Blood Mini Εγχειρίδιο για πληροφορίες ασφαλείας. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/

28 Χρήση του QIAamp DNA Mini Kit για λυοφιλοποιημένα δείγματα Σημείωση: Η χρήση του φορέα RNA έχει κριτική σημασία για την αποδοτικότητα της εκχύλισης και, κατά συνέπεια, για την απόδοση του DNA/RNA. Παρακαλούμε λάβετε υπόψη ότι η προσθήκη του φορέα (RNA Homopolymer Poly[rA], δεν συμπεριλαμβάνεται στο QIAamp DNA Mini Kit) συνιστάται επιτακτικά για την εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων από σωματικά υγρά ελεύθερα κυττάρων και υλικών με μικρές περιεκτικότητες σε DNA και RNA. Στις περιπτώσεις αυτές, προετοιμάστε τον φορέα RNA ως ακολούθως. Επανααιωρήστε το λυοφιλοποιημένο φορέα RNA (RNA Homopolymer Poly[rA], δεν συμπεριλαμβάνεται στο QIAamp DNA Mini Kit) χρησιμοποιώντας το ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης (μη χρησιμοποιείτε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης) του κιτ εκχύλισης (Ρυθμιστικό διάλυμα AE του QIAamp DNA Mini Kit) και παρασκευάστε μία αραίωση με συγκέντρωση 1 µg/µl. Διαμοιράστε το διάλυμα αυτό του φορέα RNA στον ανάλογο αριθμό ποσοτήτων που αντιστοιχεί στις ανάγκες σας και φυλάξτε αυτές στους 15 μέχρι 30 C. Αποφύγετε την επαναληπτική απόψυξη (>2 x) των επιμερισμένων ποσοτήτων του φορέα RNA. Χρησιμοποιήστε 1 µg φορέα RNA ανά 100 µl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης. Για παράδειγμα, εάν το το πρωτόκολλο εκχύλισης χρησιμοποιεί 200 µl ρυθμιστικού διαλύματος, προσθέστε 2 µl φορέα RNA (1 µg/µl) κατευθείαν στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (Ρυθμιστικό διάλυμα AL του QIAamp DNA Mini Kit). Πριν από την έναρξη της διαδικασίας εκχύλισης, πρέπει να παρασκευασθεί ένα πρόσφατο μείγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και φορέα RNA (εσωτερικού μάρτυρα, ανάλογα με την περίπτωση, βλέπε Εσωτερικός μάρτυρας, σελίδα 30) σύμφωνα με το σχήμα επεξεργασίας με πιπέτα στον Πίνακα 11. Πίνακας 11. Πιπετικό σχήμα για τη χρήση με το QIAamp DNA Mini Kit Αριθμός δειγμάτων 1 12 Ρυθμιστικό διάλυμα AL (ρυθμιστικό διάλυμα λύσης)* π.χ., 200 µl π.χ., 2400 µl Φορέας RNA (1 µg/µl) 2 µl 24 µl Συνολικός όγκος 202 µl 2424 µl Ογκος ανά εκχύλιση 200 µl 200 µl κάθε ένα * Περιέχει υδροχλωρική γουανιδίνη: Βλέπε στο εγχειρίδιο του κιτ για πληροφορίες ασφαλείας. Σημείωση: Για την εκχύλιση, χρησιμοποιείτε το πρόσφατα παρασκευασμένο μείγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και φορέα RNA αμέσως. Αποθήκευση του μείγματος δεν είναι δυνατή. 28 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

29 Σημείωση: Ο εσωτερικός μάρτυρας του artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit μπορεί να εισαχθεί κατευθείαν στη διαδικασία απομόνωσης (βλέπε Εσωτερικός μάρτυρας, σελίδα 30). Εκτελέστε τον καθαρισμό με το QIAamp DNA Mini Kit σύμφωνα με τα ακόλουθα βήματα, τα οποία διαφοροποιούνται από τα πρωτόκολλα των QIAamp DNA Mini και Blood Mini Εγχειριδίων. Αφήσετε τα δείγματα να αποκτήσουν θερμοκρασία περιβάλλοντος (15 έως 25 C). Ανασυστήστε πλήρως το λυοφιλοποιημένο δείγμα σε 500 µl PBS (1x) με προσεκτικές κινήσεις με το χέρι. Ακολούθως, επωάστε τα δείγματα τουλάχιστον για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (15 25 C), εάν είναι δυνατό σε ένα αναδευτήρα (π.χ., θερμομίξερ). Εισάγετε με πιπέτα 200 µl του ανασυσταμένου δείγματος και 360 µl Ρυθμιστικού διαλύματος ATL σε ένα σωληνάριο μικροφυγοκέντρησης 1,5 ml και αναδεύστε πλήρως. Προσθέστε 20 µl πρωτεïνάση K, αναμείξτε με παλμική ανάδευση και επωάσετε στους 56 C για 1 12 ώρες (δείγματα σπέρματος). Αναδεύσετε κατά διαστήματα κατά την διάρκεια της επωάσεως για τη διασπορά του δείγματος ή τοποθετήστε σε θερμομίξερ. Σημείωση: Πρέπει να χρησιμοποιηθεί πρωτεïνάση K. Η πρωτεάση QIAGEN παρουσιάζει μειωμένη δραστικότητα υπό την παρουσία του ρυθμιστικού διαλύματος ATL. Φυγοκεντρήστε τα σωληνάρια μικροφυγοκέντρισης 1,5 ml για μικρό χρονικό διάστημα για να αποφύγετε κατά το άνοιγμα των σωληναρίων διασταυρωμένες επιμολύνσεις, για την απομάκρυνση σταγονιδίων από το εσωτερικό του καλύμματος. Προσθέστε 400 µl Ρυθμιστικού διαλύματος AL (με φορέα RNA και, προαιρετικά, εσωτερικό μάρτυρα. Βλέπε παραπάνω και Εσωτερικός μάρτυρας, σελίδα 30). Αναμείξτε με παλμική ανάδευση για15 δευτερόλεπτα και επωάστε στους 70 C για10 λεπτά. Προσθέστε στο δείγμα 400 µl αιθανόλης (96 100%) και αναμείξτε με παλμική ανάδευση για 15 δευτερόλεπτα. Προσθέστε προσεκτικά 700 µl του μείγματος στη στήλη QIAamp Mini spin χωρίς να βρέξετε το χείλος. Κλείστε το κάλλυμα και φυγοκεντρήστε σε 6000 x g (8000 rpm) για ένα λεπτό. Τοποθετήστε την στήλη QIAamp Mini spin σε ένα καθαρό σωληνάριο συλλογής 2 ml και απορρίψτε το σωληνάριο συλλογής που περιέχει το διήθημα.* * Το διήθημα περιέχει Ρυθμιστικό διάλυμα AL ή Ρυθμιστικό διάλυμα AW1 και για το λόγο αυτό δεν είναι συμβατό με λευκαντικό. Βλέπε το QIAamp DNA Mini and Blood Mini Εγχειρίδιο για πληροφορίες ασφαλείας. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/

30 Επαναλάβετε το τελευταίο βήμα μεταφέροντας όλο το υπόλοιπο μείγμα στη στήλη QIAamp Mini spin. Ακολουθήστε το πρωτόκολλο για ιστούς (QIAamp DNA Mini and Blood Mini Εγχειρίδιο, Εκδοση Τρίτη, Ιούνιος 2012, σελίδα 32) αρχίζοντας με τη προσθήκη του Ρυθμιστικού διαλύματος AW1 στο βήμα 8. Σημείωση: Συνιστούμε οπωσδήποτε την εκτέλεση του προτεινόμενου βήματος φυγοκέντρησης 10 του πρωτοκόλλου για την απομάκρυνση οποιοδήποτε κατάλοιπου αιθανόλης. Συνιστούμε την αύξηση του χρόνου φυγοκέντρησης στα 3 λεπτά. Συνιστούμε όγκο έκλουσης 50 µl του Ρυθμιστικού διαλύματος AE. Εσωτερικός μάρτυρας Παρέχεται ένας εσωτερικός μάρτυρας (C. trachomatis Plus RG IC). Αυτό επιτρέπει στο χειριστή να ελέγξει τόσο τη διαδικασία απομόνωσης του DNA, όσο και τον έλεγχο ενδεχομένης αναστολής της PCR. Για την εφαρμογή αυτή, προσθέστε τον εσωτερικό μάρτυρα στην απομόνωση σε αναλογία 0,1 µl ανά 1 µl όγκου έκλουσης. Για παράδειγμα, χρησιμοποιώντας το QIAamp DNA Mini Kit, το DNA εκλούεται σε 200 µl Ρυθμιστικού διαλύματος AE. Αρα, πρέπει να προστεθούν αρχικά 20 µl του εσωτερικού μάρτυρα. Εάν η έκλουση γίνεται, για παράδειγμα, σε 100 µl, τότε χρησιμοποιήστε την αντίστοιχη ποσότητα των 10 µl. Η ποσότητα του προστιθεμένου πρoτύπου εσωτερικού ελέγχου εξαρτάται μόνο από τον όγκο έκλουσης. Σημείωση: Ο εσωτερικός μάρτυρας και ο φορέας RNA (βλέπε Απομόνωση DNA, παραπάνω) πρέπει να προστίθεται μόνο στο μείγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και υλικού δείγματος ή κατευθείαν στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Ο εσωτερικός μάρτυρας δεν πρέπει να προστίθεται απευθείας στο υλικό δείγματος. Εάν προστεθεί στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, παρακαλούμε προσέξτε ότι το μείγμα εσωτερικού μάρτυρα και ρυθμιστικού διαλύματος λύσης φορέα RNA πρέπει να παρασκευάζεται φρέσκο και να χρησιμοποιείται αμέσως (αποθήκευση του μείγματος για λίγες μόνο ώρες σε θερμοκρασία δωματίου ή στο ψυγείο, μπορεί να οδηγήσει σε αποτυχία του εσωτερικού μάρτυρα και μείωση της απόδοσης της εκχύλισης). Σημείωση: Μην εισάγετε τον εσωτερικό μάρτυρα και το φορέα RNA απευθείας στο υλικό δείγματος. Για να θεωρηθεί ένας καθαρισμός επιτυχής, η τιμή C T του εσωτερικού μάρτυρα σε ένα αρνητικό δείγμα που έχει υποστεί επεξεργασία κατά τη διάρκεια του καθαρισμού (QIAamp DNA Mini Kit ή QIAamp Viral RNA Mini Kit) πρέπει να φθάσει την τιμή C T = 24 ± 3 (τιμή κατωφλίου: 0,02) με τη χρήση Οργάνων Rotor-Gene Q. Η δηλωμένη απόκλιση μέχρι 3 C T τιμές βασίζεται στη διακύμανση του οργάνου και του καθαρισμού. Μια υψηλότερη απόκλιση υποδεικνύει την παρουσία προβλήματος κατά τον καθαρισμό. Σε αυτή την 30 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

31 περίπτωση, ο καθαρισμός πρέπει να ελεγχθεί και εάν είναι απαραίτητο να επικυρωθεί για δεύτερη φορά. Εάν έχετε τυχόν περαιτέρω ερωτήσεις ή εάν συναντήσετε προβλήματα, παρακαλούμε επικοινωνήστε με τη Τεχνική Εξυπηρέτηση της QIAGEN. Ο εσωτερικός μάρτυρας μπορεί προαιρετικά να χρησιμοποιηθεί αποκλειστικά για τον έλεγχο μιας πιθανής αναστολής της PCR. Για την εφαρμογή αυτή, προσθέστε τον εσωτερικό μάρτυρα κατευθείαν στο C. trachomatis Plus RG Master και C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol, όπως περιγράφεται στο βήμα 2b του πρωτοκόλλου (σελίδα 33). artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/

32 Πρωτόκολλο: PCR και Ανάλυση Δεδομένων Σημαντικές υποδείξεις πριν από την έναρξη Πριν αρχίσετε τη διαδικασία, διαβάστε Σημαντικές Σημειώσεις, σελίδες Βρείτε χρόνο για να εξοικειωθείτε με το Οργανο Rotor-Gene Q πριν ξεκινήσετε το πρωτόκολλο. Δείτε το εγχειρίδιο του οργάνου. Σιγουρευτείτε ότι σε κάθε εκτέλεση PCR συμπεριλαμβάνονται τουλάχιστον ένας θετικός μάρτυρας καθώς και ένας αρνητικός μάρτυρας (Water, PCR grade). Τι πρέπει να γίνει πριν από την έναρξη Βεβαιωθείτε ότι το μπλοκ ψύξης (εξάρτημα του Οργάνου Rotor-Gene Q) έχει προψυχθεί στους 2 8 C. Πριν από κάθε χρήση, όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να αποψύχονται πλήρως, να αναμειγνύονται (με επαναληπτική αναρρόφηση και έκχυση με πιπέτα ή με γρήγορη ανάμειξη ) και να φυγοκεντρούνται σύντομα. Διαδικασία 1. Τοποθετήστε τον επιθυμιτό αριθμό σωληναρίων PCR στις υποδοχές της μονάδας ψύξης. 2. Εάν χρησιμοποιείτε τον εσωτερικό μάρτυρα για την παρακολούθηση της διαδικασίας απομόνωσης του DNA και τον έλεγχο πιθανής αναστολής της PCR,ακολουθήστε το βήμα 2a. Εάν χρησιμοποιείτε τον εσωτερικό μάρτυρα αποκλειστικά για τον έλεγχο αναστολής της PCR, ακολουθήστε το βήμα 2b. 2a. Ο εσωτερικός μάρτυρας έχει ήδη προστεθεί στην απομόνωση (βλέπε Εσωτερικός μάρτυρας, σελίδα 30). Στην περίπτωση αυτή παρασκευάστε ένα κύριο μείγμα σύμφωνα με τον Πίνακα 12. Το μείγμα αντίδρασης περιέχει τυπικά όλα τα συστατικά που χρειάζονται για την PCR εκτός από το δείγμα. 32 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

33 Πίνακας 12. Παρασκευή κυρίου μείγματος (χρήση του εσωτερικού μάρτυρα για την παρακολούθηση της διαδικασίας απομόνωσης του DNA και τον έλεγχο πιθανής αναστολής της PCR) Αριθμός δειγμάτων 1 12 C. trachomatis Plus RG Master 13 µl 156 µl C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol 2 µl 24 µl C. trachomatis Plus RG IC 0 µl 0 µl Συνολικός όγκος 15 µl 180 µl 2b. Ο εσωτερικός μάρτυρας πρέπει να προστεθεί απευθείας στο μείγμα του C. trachomatis Plus RG Master και C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol. Στην περίπτωση αυτή παρασκευάστε ένα κύριο μείγμα σύμφωνα με τον Πίνακα 13. Το μείγμα αντίδρασης περιέχει τυπικά όλα τα συστατικά που χρειάζονται για την PCR εκτός από το δείγμα. Πίνακας 13. Παρασκευή κυρίου μείγματος (χρήση του εσωτερικού μάρτυρα αποκλειστικά για τον έλεγχο αναστολής της PCR) Αριθμός δειγμάτων 1 12 C. trachomatis Plus RG Master 13 µl 156 µl C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol 2 µl 24 µl C. trachomatis Plus RG IC 1 µl 12 µl Συνολικός όγκος 16 µl* 192 µl* * Η αύξηση του όγκου που προκαλείται με τη προσθήκη του εσωτερικού μάρτυρα, κατά την προετοιμασία της ανάλυσης PCR, είναι αμελητέα. Η ευαισθησία του συστήματος ανίχνευσης δεν επηρεάζεται. 3. Εισάγετε με πιπέτα 15 µl του κυρίου μείγματος σε κάθε σωληνάριο PCR. Στη συνέχεια εισάγετε 10 µl από το έκλουσμα του DNA του δείγματος (βλέπε Πίνακα 14). Αντίστοιχα, πρέπει να χρησιμοποιηθούν 10 µl του C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control ως θετικός μάρτυρας και 10 µl νερού (Water, PCR grade) ως αρνητικός μάρτυρας. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/

34 Πίνακας 14. Προετοιμασία ανάλυσης PCR Αριθμός δειγμάτων 1 12 Κύριο μείγμα 15 µl 15 µl για κάθε ένα Δείγμα 10 µl 10 µl για κάθε ένα Συνολικός όγκος 25 µl 25 µl για κάθε ένα 4. Κλείστε τα σωληνάρια PCR. Βεβαιωθείτε ότι ο δακτύλιος ασφαλείας (εξάρτημα του Οργάνου Rotor-Gene) τοποθετείται στο επάνω μέρος της κεφαλής 72 βοθρίων για να αποτραπεί τυχαίο άνοιγμα των σωληναρίων κατά τη διάρκεια της εκτέλεσης. 5. Για την ανίχνευση του DNA του C. trachomatis, δημιουργήστε ένα προφίλ θερμοκρασίας σύμφωνα με τα ακόλουθα βήματα. Ρύθμιση των γενικών παραμέτρων ανάλυσης Εικόνες 3, 4, 5 Αρχική ενεργοποίηση του ενζύμου hot-start Εικόνα 6 Πολλαπλασιασμός του DNA Εικόνα 7 Ρύθμιση της ευαισθησίας των καναλιών φθορισμού Εικόνα 8 Εναρξη της εκτέλεσης Εικόνα 9 Ολες οι προδιαγραφές αναφέρονται στα Rotor-Gene Q MDx/Rotor-Gene Q έκδοση λογισμικού , Rotor-Gene 6000 εκδόσεις λογισμικού , , και Rotor-Gene 3000 έκδοση λογισμικού Περαιτέρω πληροφορίες για τον προγραμματισμό των Οργάνων Rotor-Gene βρείτε στο εγχειρίδιο του οργάνου. Στις απεικονίσεις αυτές οι ρυθμίσεις πλαισιώνονται με έντονο μαύρο. Για τα Οργανα Rotor-Gene Q περιλαμβάνονται απεικονίσεις. Οπου απαιτούνται διαφορετικές τιμές για το Rotor-Gene 3000, οι διαφορές αυτές περιγράφονται στο κείμενο. 34 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

35 6. Αρχικά, ανοίξτε το παράθυρο διαλόγου New Run Wizard (Εικόνα 3). Ελέγξτε το παράθυρο Locking Ring Attached και πατήστε Next. Εικόνα 3. Παράθυρο διαλόγου New Run Wizard. 7. Επιλέξτε 25 για τον όγκο αντίδρασης PCR και πατήστε Next (Εικόνα 4). Εικόνα 4. Ρύθμιση γενικών παραμέτρων ανάλυσης. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/

36 8. Πατήστε το κουμπί Edit Profile στο επόμενο παράθυρο διαλόγου New Run Wizard (Εικόνα 5) και προγραμματίστε το προφίλ θερμοκρασίας όπως δείχνεται στις Εικόνες 5 7). Εικόνα 5. Επεξεργασία του προφίλ. Εικόνα 6. Αρχική ενεργοποίηση του ενζύμου hot-start. 36 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

37 Εικόνα 7. Πολλαπλασιασμός του DNA. Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, το λογισμικό καθορίζει τις χρωστικές ουσίες φθορισμού όπως FAM/Sybr, JOE. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/

38 9. Το εύρος ανίχνευσης των καναλιών φθορισμού πρέπει να καθορίζεται σύμφωνα με τις εντάσεις φθορισμού στα σωληνάρια της PCR. Πατήστε Gain Optimisation στο παράθυρο διαλόγου New Run Wizard (βλέπε Εικόνα 5) για να ανοίξετε το παράθυρο διαλόγου Auto-Gain Optimisation Setup. Ορίστε τη βαθμονόμηση θερμοκρασίας στους 60 για τον συνδυασμό της θερμοκρασίας υβριδισμού στο πρόγραμμα πολλαπλασιασμού (Εικόνα 8). Εικόνα 8. Ρύθμιση της ευαισθησίας του καναλιού φθορισμού. Σημειώστε ότι στο Rotor- Gene 3000, το λογισμικό καθορίζει τις χρωστικές ουσίες φθορισμού όπως FAM/Sybr και JOE. 38 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

39 10. Οι τιμές απολαβής που καθορίζονται από τη βαθμονόμηση του καναλιού αποθηκεύονται αυτόματα και παρατίθενται στο τελευταίο παράθυρο μενού της διαδικασίας προγραμματισμού (Εικόνα 9). Επιλέξτε Start Run. Εικόνα 9. Εκκίνηση της εκτέλεσης. Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, το λογισμικό καθορίζει τις χρωστικές ουσίες φθορισμού όπως FAM/Sybr και JOE. 11. Μετά το τέλος της εκτέλεσης, αναλύστε τα δεδομένα. Τα ακόλουθα αποτελέσματα (11a, 11b και 11c) είναι πιθανά. Παραδείγματα θετικών και αρνητικών αντιδράσεων PCR δίνονται στην Εικόνα 10 και Εικόνα a.Ανιχνεύεται ένα σήμα στο κανάλι φθορισμού Cycling Green. Το αποτέλεσμα της ανάλυσης είναι θετικό: το δείγμα περιέχει DNA του C. trachomatis. Στη περίπτωση αυτή, η ανίχνευση ενός σήματος στο κανάλι Cycling Yellow είναι επουσιώδης, αφού υψηλές αρχικές συγκεντρώσεις DNA του C. trachomatis (θετικό σήμα στο κανάλι Cycling Green) μπορεί να οδηγήσουν σε μείωση ή απουσία σήματος φθορισμού του εσωτερικού μάρτυρα στο κανάλι Cycling Yellow (ανταγωνισμός). Σημείωση: Στο Rotor-Gene 3000, τα σχετικά κανάλια είναι Cycling A.FAM για το θετικό σήμα και Cycling A.JOE για τον εσωτερικό μάρτυρα. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/

40 11b.Στο κανάλι φθορισμού Cycling Green δεν ανιχνεύεται κανένα σήμα. Την ίδια στιγμή, εμφανίζεται ένα σήμα του εσωτερικού μάρτυρα στο κανάλι Cycling Yellow. Στο δείγμα δεν ανιχνεύεται DNA του C. trachomatis. Αυτό μπορεί να θεωρηθεί αρνητικό. Στη περίπτωση αρνητικής PCR του C. trachomatis, το ανιχνευόμενο σήμα του εσωτερικού ελέγχου αποκλείει την πιθανότητα αναστολής της PCR. Σημείωση: Στο Rotor-Gene 3000, τα σχετικά κανάλια είναι Cycling A.JOE για τον εσωτερικό μάρτυρα και έλλειψη σήματος για το Cycling A.FAM. 11c.Δεν ανιχνεύεται σήμα στα κανάλια Cycling Green ή Cycling Yellow. Δεν υπάρχει δυνατότητα διαγνωστικής αξιολόγησης. Πληροφορίες σχετικά με τις πηγές σφαλμάτων και τη λύση τους μπορούν να βρεθούν στο Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων, σελίδα 42. Σημείωση: Στο Rotor-Gene 3000, τα σχετικά κανάλια είναι Cycling A.FAM και Cycling A.JOE. Εικόνα 10. Ανίχνευση του θετικού μάρτυρα (C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control) στο κανάλι φθορισμού Cycling Green. NTC: No template control (αρνητικός μάρτυρας). 40 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

41 Εικόνα11.Ανίχνευση του εσωτερικού μάρτυρα (IC) στο κανάλι φθορισμού Cycling Yellow με ταυτόχρονη ενίσχυση του θετικού μάρτυρα (C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control). NTC: No template control (αρνητικός μάρτυρας). artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/

42 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων Αυτός ο οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων μπορεί να σας βοηθήσει στην επίλυση τυχόν προβλημάτων που μπορεί να εμφανισθούν. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στη σελίδα Frequently Asked Questions (Συχνές Υποβαλλόμενες Ερωτήσεις) του Κέντρου Τεχνικής Υποστήριξης της εταιρείας μας: Οι επιστήμονες των Τεχνικών Υπηρεσιών της QIAGEN είναι πάντα πρόθυμοι να απαντήσουν οποιεσδήποτε ερωτήσεις σχετικά είτε με τις πληροφορίες και τα πρωτόκολλα του εγχειριδίου αυτού είτε με τις τεχνολογίες δείγματος και ανάλυσης (για πληροφορίες επικοινωνίας, βλέπε οπίσθιο εξώφυλλο ή επισκεφθείτε μας στην ιστοσελίδα Παρατηρήσεις και προτάσεις Κανένε σήμα με το θετικό μάρτυρα (C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control) στο κανάλι φθορισμού Cycling Green ή Cycling A.FAM a) Το επιλεγμένο κανάλι φθορισμού για την ανάλυση δεδομένων της PCR δεν είναι σύμφωνο με το πρωτόκολλο b) Εσφαλμένος προγραμματισμός του προφίλ θερμοκρασίας στο Οργανο Rotor-Gene c) Εσφαλμένη ρύθμιση της PCR Για την ανάλυση δεδομένων επιλέξτε το κανάλι φθορισμού Cycling Green ή Cycling A.FAM για την αναλυτική PCR του C. trachomatis και το κανάλι φθορισμού Cycling Yellow ή Cycling A.JOE για την PCR του εσωτερικού μάρτυρα. Συγκρίνετε το προφίλ θερμοκρασίας με το πρωτόκολλο. Βλέπε Πρωτόκολλο: PCR και Ανάλυση Δεδομένων, σελίδα 32. Ελέγξτε τα βήματα εργασίας σας μέσω του πιπετικού σχήματος και επαναλάβετε την PCR, εάν είναι απαραίτητο. Βλέπε Πρωτόκολλο: PCR και Ανάλυση Δεδομένων, σελίδα 32. d) Οι συνθήκες αποθήκευσης για ένα ή περισσότερα συστατικά του κιτ δεν συμφωνούν με τις οδηγίες που δίνονται στην Αποθήκευση (σελίδα 5) e) Το artus C. trachomtis Plus RG PCR Kit έχει λήξει Ελέγξτε τις συνθήκες αποθήκευσης και την ημερομηνία λήξης (βλέπε την ετικέτα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. Ελέγξτε τις συνθήκες αποθήκευσης και την ημερομηνία λήξης (βλέπε την ετικέτα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. 42 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

43 Παρατηρήσεις και προτάσεις Ασθενές ή κανένα σήμα του εσωτερικού μάρτυρα σε αρνητικό δείγμα υποβαλλόμενο σε καθαρισμό (C T = 24 ± 3; Τιμή κατωφλίου, 0,02) στο κανάλι φθορισμού Cycling Yellow ή Cycling A.JOE και ταυτόχρομνη απουσία σήματος στο κανάλι Cycling Green ή Cycling A.FAM a) Οι συνθήκες της PCR δεν συμφωνούν με το πρωτόκολλο b) Εγινε αναστολή της PCR c) Απώλεια DNA κατά τη διάρκεια της εκχύλισης d) Οι συνθήκες αποθήκευσης για ένα ή περισσότερα συστατικά του κιτ δεν συμφωνούν με τις οδηγίες που δίνονται στην Αποθήκευση (σελίδα 5) Ελέγξτε τις συνθήκες της PCR (βλέπε παραπάνω) και επαναλάβετε την PCR με σωστές ρυθμίσεις, εάν είναι απαραίτητο. Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιείτε τη μέθοδο απομόνωσης που συνιστάται (βλέπε Απομόνωση DNA, σελίδα 23) και ακολουθήστε πιστά τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εάν ο εσωτερικός μάρτυρας έχει προστεθεί στην εκχύλιση, η απουσία σήματος του εσωτερικού μάρτυρα μπορεί να υποδεικνύει την απώλεια DNA κατά τη διάρκεια της εκχύλισης. Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιείτε τη μέθοδο απομόνωσης που συνιστάται (βλέπε Απομόνωση DNA, σελίδα 23) ) και ακολουθήστε πιστά τις οδηγίες του κατασκευαστή. Βεβαιωθείτε ότι κατά τη διάρκεια της απομόνωσης του DNA το προτεινόμενο βήμα φυγοκέντρησης έχει εκτελεστεί πριν από την έκλουση για την απομάκρυνση τυχόν καταλοίπων αιθανόλης (βλέπε Απομόνωση DNA, σελίδα 23). Ελέγξτε τις συνθήκες αποθήκευσης και την ημερομηνία λήξης (βλέπε την ετικέτα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. e) Το artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit έχει λήξει Ελέγξτε τις συνθήκες αποθήκευσης και την ημερομηνία λήξης (βλέπε την ετικέτα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/

44 Παρατηρήσεις και προτάσεις Σήματα με τους αρνητικούς μάρτυρες στο κανάλι φθορισμού Cycling Green ή Cycling A.FAM της αναλυτικής PCR a) Υφίσταται επιμόλυνση κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας της PCR b) Υφίσταται επιμόλυνση κατά τη διάρκεια της εκχύλισης Επαναλάβετε την PCR με νέα αντιδραστήρια κατ επανάληψη. Εάν είναι δυνατόν, κλείστε τα σωληνάρια της PCR αμέσως μετά τη προσθήκη του δείγματος που είναι προς εξέταση. Βεβαιωθείτε ότι εισάγετε με πιπέτα τους θετικούς μάρτυρες, τελευταία. Βεβαιωθείτε ότι ο χώρος εργασίας και τα μηχανήματα απολυμένονται σε τακτικά χρονικά διαστήματα. Επαναλαμβάνετε την εκχύλιση και την PCR του εξεταζόμενου δείγματος με τη χρήση νέων αντιδραστηρίων. Βεβαιωθείτε ότι ο χώρος εργασίας και τα μηχανήματα απολυμένονται σε τακτικά χρονικά διαστήματα. 44 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

45 Πληροφορίες παραγγελίας Προϊόν Περιεχόμενα Αρ. Κατ. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit (24) artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit (96) Για 24 αντιδράσεις: Κύριο μείγμα, Διάλυμα Mg, Θετικός Μάρτυρας, Αρνητικός Μάρτυρας, Νερό (βαθμού PCR) Για 96 αντιδράσεις: Κύριο μείγμα, Διάλυμα Mg, Θετικός Μάρτυρας, Αρνητικός Μάρτυρας, Νερό (βαθμού PCR) digene Cervical Sampler και digene Female Swab Specimen Collection Kit για τη συλλογή δειγμάτων τραχήλου μήτρας digene Cervical Sampler digene Female Swab Specimen Collection Kit 50 πινέλα τραχήλου μήτρας και Μέσο Μεταφοράς Δειγμάτων για τη συλλογή δειγμάτων τραχήλου μήτρας 50 Dacron επιχρίσματα και Μέσο Μεταφοράς Δειγμάτων για τη συλλογή δειγμάτων τραχήλου μήτρας QIAamp Viral RNA Mini Kit για την απομόνωση ιικού RNA από σωματικά υγρά ελεύθερα κυττάρων QIAamp Viral RNA Mini Kit (50) For 50 προετοιμασίες: 50 Στήλες QIAamp Mini Spin, Φορέας RNA, Σωληνάρια Συλλογής (2 ml), Ρυθμιστικά διαλύματα ελεύθερα RNάσης QIAamp DNA Mini Kit για την απομόνωση γονιδιακού, μιτοχονδριακού, βακτηριακού, παρασιτικού ή ιικού DNA QIAamp DNA Mini Kit (50) Για 50 DNA προετοιμασίες: 50 ΣτήλεςQIAamp Mini Spin, QIAGEN Πρωτεϊνάση K, Αντιδραστήρια, Ρυθμιστικά διαλύματα, Σωληνάρια Συλλογής (2 ml) artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/

46 Προϊόν Περιεχόμενα Αρ. Κατ. Rotor-Gene Q MDx και εξαρτήματα Πλατφόρμα Rotor- Gene Q MDx 5plex Σύστημα Rotor-Gene Q MDx 5plex Πλατφόρμα Rotor- Gene Q MDx 5plex HRM Κυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο), φορητός υπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα: περιλαμβάνει εγγύηση 1 έτους για ανταλλακτικά και εργαστηριακά είδη, δεν περιλαμβάνεται εγκατάσταση και εκπαίδευση Κυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο), φορητός υπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα: περιλαμβάνει εγγύηση 1 έτους για ανταλλακτικά και εργαστηριακά είδη, εγκατάσταση και εκπαίδευση Κυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και αναλυτής Τήξης Υψηλής Ανάλυσης με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο) συν κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα: περιλαμβάνει εγγύηση 1 έτους για ανταλλακτικά και εργαστηριακά είδη, δεν περιλαμβάνεται εγκατάσταση και εκπαίδευση artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

47 Προϊόν Περιεχόμενα Αρ. Κατ. Σύστημα Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Πλατφόρμα Rotor- Gene Q MDx 6plex Σύστημα Rotor-Gene Q MDx 6plex Πλατφόρμα Rotor- Gene Q MDx 2plex Σύστημα Rotor-Gene Q MDx 2plex Κυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και αναλυτής Τήξης Υψηλής Ανάλυσης με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο) συν κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα: περιλαμβάνει εγγύηση 1 έτους για ανταλλακτικά και εργαστηριακά είδη, εγκατάσταση και εκπαίδευση Οργανο PCR πραγματικού χρόνου με 6 κανάλια (μπλε, πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο), φορητός υπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα: περιλαμβάνει εγγύηση 1 έτους για ανταλλακτικά και εργαστηριακά είδη, δεν περιλαμβάνεται εγκατάσταση και εκπαίδευση Οργανο PCR πραγματικού χρόνου με 6 κανάλια (μπλε, πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο), φορητός υπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα: περιλαμβάνει εγγύηση 1 έτους για ανταλλακτικά και εργαστηριακά είδη, εγκατάσταση και εκπαίδευση Κυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου με 2 κανάλια (πράσινο, κίτρινο), φορητός υπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα: περιλαμβάνει εγγύηση 1 έτους για ανταλλακτικά και εργαστηριακά είδη, δεν περιλαμβάνεται εγκατάσταση και εκπαίδευση Κυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου με 2 κανάλια (πράσινο, κίτρινο), φορητός υπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα: περιλαμβάνει εγγύηση 1 έτους για ανταλλακτικά και εργαστηριακά είδη, εγκατάσταση και εκπαίδευση artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/

48 Προϊόν Περιεχόμενα Αρ. Κατ. Πλατφόρμα Rotor- Gene Q MDx 2plex HRM Σύστημα Rotor-Gene Q MDx 2plex HRM Μπλοκ φόρτισης 72 x 0,1 ml Σωληνάρια Μπλοκ φόρτισης 96 x 0,2 ml Σωληνάρια Ταινίες Σωληναρίων και Πωμάτων, 0,1 ml (250) Ταινίες Σωληναρίων και Πωμάτων, 0,1 ml (2500) Κυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και Αναλυτής τήξης υψηλής ανάλυσης με 2 κανάλια (πράσινο, κίτρινο) συν κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα: περιλαμβάνει εγγύηση 1 έτους για ανταλλακτικά και εργαστηριακά είδη, δεν περιλαμβάνεται εγκατάσταση και εκπαίδευση Κυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και Αναλυτής τήξης υψηλής ανάλυσης με 2 κανάλια (πράσινο, κίτρινο) συν κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα: περιλαμβάνει εγγύηση 1 έτους για ανταλλακτικά και εργαστηριακά είδη, εγκατάσταση και εκπαίδευση Εξάρτημα από αλουμίνιο για εγκατάσταση αντίδρασης με το χέρια με πιπέτα ενός καναλιού σε 72 x 0,1 ml σωληνάρια Εξάρτημα από αλουμίνιο για εγκατάσταση αντίδρασης με το χέρια σε μία πρότυπη σειρά 8 x 12 με τη χρήση 96 x 0,2 ml σωληναρίων 250 ταινίες 4 σωληναρίων και πωμάτων για 1000 αντιδράσεις 10 x 250 ταινίες 4 σωληναρίων και πωμάτων αντιδράσεις Για τρέχουσες πληροφορίες αδείας χρήσης και αποποιήσεις σχετικά με συγκεκριμένα προϊόντα, ανατρέξτε στο σχετικό εγχειρίδιο ή οδηγίες χρήσης του κιτ QIAGEN. Τα εγχειρίδια ή οι οδηγίες χρήσης των κιτ QIAGEN είναι διαθέσιμα στη διεύθυνση Μπορείτε επίσης να τα ζητήσετε από το Τμήμα Τεχνικής Εξυπηρέτησης της QIAGEN ή τον τοπικό σας αντιπρόσωπο. 48 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

49 Αυτή η σελίδα έχει παραμείνει σκοπίμως κενή artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/

50 Αυτή η σελίδα έχει παραμείνει σκοπίμως κενή 50 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 10/2016

51 Η αγορά αυτού του προϊόντος παρέχει στον αγοραστή τη δυνατότητα της χρήσης του για την εκτέλεση διαγνωστικών υπηρεσιών για in vitro διάγνωση σε ανθρώπους. Με τον παρόν δεν παρέχεται κανένα γενικό δικαίωμα ευρεσιτεχνίας ή άλλη άδεια οποιουδήποτε είδους, εκτός από το παρόν, συγκεκριμένο δικαίωμα χρήσης από την αγορά. Εμπορικά σήματα: QIAGEN, QIAamp, artus, digene Rotor-Gene (QIAGEN Group); AMPLICOR, COBAS (Roche Group), LightCycler (Roche Group); Aptima, Combo 2 (Gen-Probe, Inc.); ClamTrans, MicroTrak (Trinity Biotech); DACRON (Invista North America S.A.R.L.); FAM, JOE, SYBR (Life Technologies); IDEIA (DakoCytomation); LCx (Abbott Laboratories); Mastazyme (MAST DIAGNOSTICA); MicroTest (Thermo Fisher Scientific). Συμφωνία περιορισμένης αδείας χρήσης για το artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Η χρήση του προϊόντος αυτού ισοδυναμεί με την αποδοχή των εξής όρων από πλευράς οποιουδήποτε αγοραστή ή χειριστή του προϊόντος: 1. Το προϊόν μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποκλειστικά σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που παρέχονται με το προϊόν και με το εγχειρίδιο αυτό και για τη χρήση μόνο με τα αντιδραστήρια που περιέχονται στο κιτ. Η QIAGEN δεν παρέχει άδεια χρήσης υπό οποιαδήποτε πνευματική ιδιοκτησία της για τη χρήση ή ενσωμάτωση των παρεχόμενων συστατικών αυτού του κιτ σε οποιαδήποτε συστατικά που δεν περιλαμβάνονται σε αυτά τα κιτ εκτός όπως περιγράφεται στα πρωτόκολλα που παρέχονται με το προϊόν, το εγχειρίδιο αυτό και πρόσθετα πρωτόκολλα διαθέσιμα στην ιστοσελίδα Μερικά από τα πρόσθετα αυτά πρωτόκολλα έχουν παρασχεθεί από χρήστες της QIAGEN για χρήστες QIAGEN. Τα πρωτόκολλα αυτά δενέχουν δοκιμαστεί ή βελτιωθεί πλήρως από την QIAGEN. Η QIAGEN δεν υπόσχεται ούτε εγγυάται ότι αυτά δεν παραβιάζουν τα δικαιώματα τρίτων. 2. Με την εξαίρεση των ρητά αναφερόμενων αδειών, η QIAGEN δεν εγγυάται πως αυτό το κιτ και/ή η χρήση/-εις του δεν παραβιάζουν τα δικαιώματα τρίτων. 3. Αυτό το κιτ και τα συστατικά του φέρουν άδεια χρήσης για μια μόνο χρήση και δεν επιτρέπεται η επανάχρηση, η εκ νέου επεξεργασία ή η μεταπώλησή τους. 4. Η QIAGEN αποποιείται ειδικά οποιεσδήποτε άλλες άδειες, ρητές ή έμμεσες εκτός από αυτές που αναφέρονται ρητά. 5. Ο αγοραστής και ο χειριστής του κιτ συμφωνεί να μην λάβει ή να μην επιτρέψει σε κανέναν να λάβει μέτρα που θα μπορούσαν να οδηγήσουν ή να διευκολύνουν τις ενέργειες που απαγορεύονται σύμφωνα με τα προαναφερθέντα. Η QIAGEN διατηρεί το δικαίωμα να επιβάλλει τις απαγορεύσεις της παρούσας Αδείας Περιορισμένης Χρήσης σε οποιοδήποτε δικαστήριο και θα αποζημιωθεί για όλες τις δαπάνες ανάκρισης και δικαστηρίου, συμπεριλαμβανομένων των δαπανών υπεράσπισης στο πλαίσιο οποιασδήποτε ενέργειας για την επιβολή αυτής της Άδειας περιορισμένης χρήσης ή οποιουδήποτε των πνευματικών δικαιωμάτων της σχετικά με το κιτ και/ή τα συστατικά του. Για ενημερωμένους όρους της αδείας, βλέπε QIAGEN, όλα τα δικαιώματα κατωχυρωμένα.

52 Australia Austria Belgium Brazil Canada China Denmark Finland France Germany Hong Kong India Ireland Italy Japan Korea (South) Luxembourg Mexico The Netherlands Norway Singapore Sweden Switzerland UK USA EL Sample & Assay Technologies