Γενετικι Μθχανικι - Σεχνολογία Αναςυνδυαςμζνου DNA

Transcript

1 Γενετικι Μθχανικι - Σεχνολογία Αναςυνδυαςμζνου DNA Σόπακασ Ευάγγελοσ Επίκουροσ Κακθγθτισ ΕΜΠ χολι Χθμικϊν Μθχανικϊν, ΕΜΠ vtopakas@central.ntua.gr

2 Άδεια Χρήζης Το παπόν εκπαιδεςηικό ςλικό ςπόκειηαι ζε άδειερ σπήζηρ Creative Commons. Για εκπαιδεςηικό ςλικό, όπωρ εικόνερ, πος ςπόκειηαι ζε άδεια σπήζηρ άλλος ηύπος, αςηή ππέπει να αναθέπεηαι πηηώρ.

3 ΓΕΝΕΣΙΚΘ ΜΘΧΑΝΙΚΘ Η τεχνολογία που ςυνεπάγεται όλεσ τισ διεργαςίεσ που μεταβάλλουν το γενετικό υλικό ενόσ κυττάρου για να το κάνει ικανό να εκτελζςει τισ επικυμθτζσ λειτουργίεσ, όπωσ πχ τθν παραγωγι καινοτόμων ουςιών. 3

4 TΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΝΑΤΝΔΤΑΜΕΝΟΤ DNA Aπομόνωςθ DNA (PCR, περιοριςτικζσ ενδονουκλεάςεσ) Συνζνωςθ DNA οργανιςμοφ με DNA ενόσ φορζα π.χ. ενόσ πλαςμιδίου (DNA λιγάςθ) -> αναςυνδυαςμζνα πλαςμίδια Ειςαγωγι πλαςμιδίων (αναςυνδυαςμζνων ι μθ) ςε ζνα ξενιςτι (π.χ. βακτιριο, ηφμθ) Επιλογι ξενιςτών που περιζχουν αναςυνδυαςμζνα πλαςμίδια (π.χ. αντοχι ςε αντιβιοτικό) Ζκφραςθ του γονιδίου και παραγωγι τθσ επικυμθτισ πρωτεΐνθσ 4

5 ΣΡΑΣΘΓΙΚΘ 5

6 ΕΝΗΤΜΑ ΠΟΤ ΧΡΘΙΜΟΠΟΙΟΤΝΣΑΙ ΣΘΝ ΣΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΝΑΤΝΔΤΑΜΕΝΟΤ DNA Νουκλεάςεσ: αποικοδομοφν το DNA Λιγάςεσ: ενώνουν τμιματα DNA Πολυμεράςεσ: αντιγράφουν μόρια DNA Σροποποιθτικά ζνηυμα: προςκζτουν ι αφαιροφν χθμικζσ ομάδεσ (πχ φωςφατάςεσ, κινάςεσ) Σοποϊςομεράςεσ 6

7 ΕΝΗΤΜΑ ΠΟΤ ΧΡΘΙΜΟΠΟΙΟΤΝΣΑΙ ΣΘΝ ΣΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΝΑΤΝΔΤΑΜΕΝΟΤ DNA 7

8 ΝΟΤΚΛΕΑΕ Εξω-νουκλεάςεσ: διαςποφν φωςφοδιεςτερικοφσ δεςμοφσ ςτα άκρα τθσ αλυςίδασ DNA. Ενδο-νουκλεάςεσ: διαςποφν φωςφοδιεςτερικοφσ δεςμοφσ ςε εςωτερικά ςθμεία τθσ αλυςίδασ DNA. 8

9 ΝΟΤΚΛΕΑΕ 9

10 ΠΕΡΙΟΡΙΣΙΚΕ ΕΝΔΟΝΟΤΚΛΕΑΕ Τα ζνηυμα που κόβουν το DNA ςε ςυγκεκριμζνεσ αλλθλουχίεσ Ανακαλφφκθκαν ςτισ αρχζσ του 1950 Παράγοντασ προςταςίασ των βακτθρίων κατά των βακτθριοφάγων Ελεγχόμενθ υδρόλυςθ νουκλεοτιδίων Κυρίωσ βακτθριακισ προζλευςθσ Πάνω από 1200 χαρακτθριςμζνεσ 10

11 ΕΝΔΟΝΟΤΚΛΕΑΕ ΠΕΡΙΟΡΙΜΟΤ Τρεισ τφποι με τον τφπο II ςθμαντικό για τθ Γενετικι Μθχανικι λόγο εξειδίκευςθσ υποςτρώματοσ Στόχευςθ κυρίωσ παλινδρομικϊν αλλθλουχιών Αναγνωρίηουν ακολουκίεσ 4, 6 ι 8 νουκλεοτιδίων 11

12 ΕΝΔΟΝΟΤΚΛΕΑΕ ΠΕΡΙΟΡΙΜΟΤ Τυφλά άκρα (blunt ends) 12

13 ΕΝΔΟΝΟΤΚΛΕΑΕ ΠΕΡΙΟΡΙΜΟΤ Κολλώδη άκρα (sticky ends) 13

14 ΕΝΔΟΝΟΤΚΛΕΑΕ ΠΕΡΙΟΡΙΜΟΤ Ονομαςία βάςθ του μικροοργανιςμοφ π.χ. EcoRI = Escherichia (E) coli (co) ςτζλεχοσ R (R). Το I αναφζρεται ςτο 1 ο ζνηυμο που απομονώκθκε από το μικροοργανιςμό Γιατί τα βακτθριακά αυτά ζνηυμα δεν αποικοδομοφν το δικό τουσ DNA? Τα βακτιρια παράγουν τισ αντίςτοιχεσ μεκυλάςεσ του DNA οι οποίεσ αναγνωρίηουν τισ ίδιεσ ακολουκίεσ νουκλεοτιδίων όπωσ τα ζνηυμα περιοριςμοφ. Οι μεκυλάςεσ ςτοχεφουν τθν ακολουκία DNA κάνοντάσ τθ ανκεκτικι ςτα ζνηυμα περιοριςμοφ 14

15 ΕΝΔΟΝΟΤΚΛΕΑΕ ΠΕΡΙΟΡΙΜΟΤ ΚΑΙ ΜΕΘΤΛΑΕ ΣΟΤ DNA Ξζνο DNA GAATTC CTTAAG EcoRI G AATTC CTTAA G DNA Ξενιςτι GAATTC CTTAAG CH 3 GAATTC CTTAAG DNA μεθσλάζη CH 3 EcoRI CH 3 GAATTC CTTAAG CH 3 15

16 ΘΛΕΚΣΡΟΦΟΡΘΘ Ε ΠΘΚΣΘ Μζκοδοσ διαχωριςμοφ κλαςμάτων DNA 16

17 ΛΙΓΑΕ Διορκώνουν αςυνζχειεσ ςε αλλθλουχίεσ DNA Ενώνουν δφο μόρια DNA 17

18 DNA-ΠΟΛΤΜΕΡΑΕ Συνκζτουν ζνα νζο κλώνο DNA ομόλογο μίασ υπάρχουςασ μιτρασ DNA. Εκκινθτισ (primer): ζναρξθ πολυμεριςμοφ. Βαςικι δράςθ: ςφνκεςθ 5 3 Διορκωτικι δράςθ: 3 5 (εξωνουκλεάςθ Proofreading) Ποια θ διαφορά με τισ λιγάςεσ ςτθν ενζργεια; 18

19 Θ DNA ΠΟΛΤΜΕΡΑΘ ΕΛΕΓΧΕΙ ΣΘΝ ΠΙΣΟΣΘΣΑ ΣΘ ΑΝΣΙΓΡΑΦΘ Proofreading «διόρκωςθ δοκιμίων» υχνότθτα λακϊν: 1:10 7 βάςεισ 19

20 ΔΟΜΘ DNA-ΠΟΛΤΜΕΡΑΘ Ενεργό Κζντρο Πολυμεριςμοφ Ενεργό Κζντρο Εξωνουκλεάςθσ DNA Polymerases: Structural Diversity and Common Mechanisms (1999) The Journal of Biological Chemistry, 274,

21 Αποκοπι τθσ μονάδασ εξωνουκλεάςθσ 3 ->5 με πρωτεάςεσ 24 21

22 22

23 ΛΘΨΘ ΕΠΙΘΤΜΘΣΟΤ ΓΟΝΙΔΙΟΤ ΑΠΟ ΣΟΝ ΔΟΣΘ Κλωνοποίθςθ τυφλισ ςτόχευςθσ: τυχαίοσ τεμαχιςμόσ DNA. Εντοπιςμόσ με χριςθ ιχνθκζτθαπαιτείται μερικι γνώςθ τθσ αλλθλουχίασ του επικυμθτοφ γονιδίου Oλοκλθρωτικι χθμικι ςφνκεςθ γονιδίου: τεχνθτό γονίδιο: απαιτείται θ γνώςθ τθσ ςειράσ των αμινοξζων τθσ επικυμθτισ πρωτεΐνθσ Ενίςχυςθ γονιδίου από γενωμικό DNA: χριςθ τεχνικισ αλυςιδωτισ αντίδραςθσ πολυμεράςθσ (PCR) Απομόνωςθ m-rnα: απομόνωςθ m-rna από το δότθ-ςφνκεςθ μορίου DNA που αντιςτοιχεί ςτο επικυμθτό γονίδιο (αντίςτροφθ μεταγραφάςθ) 23

24 Σι πρζπει να προςζξουμε για τθ λιψθ του επικυμθτοφ γονιδίου μζςω mrna; Πότε είναι αναγκαία θ χριςθ τθσ 2 θσ μεκόδου; 24

25 ΑΛΤΙΔΩΣΘ ΑΝΣΙΔΡΑΘ ΠΟΛΤΜΕΡΑΘ (PCR) Ενιςχφει DNA δεδομζνων αλλθλουχιών Διάγνωςθ Εντοπιςμόσ τθσ παρουςίασ κάποιου γονιδίου Εντοπιςμόσ τθσ παρουςίασ κάποιασ μετάλλαξθσ Εντοπιςμόσ γονιδιακισ ζκφραςθσ Ενιςχφει DNA από αρχαία ι ςπάνια δείγματα για αναλφςεισ Μασ δίνει τθ δυνατότθτα να μεταβάλλουμε τθν αλλθλουχία του DNA Kary B. Mullis βραβείο Nobel Χθμείασ

26 ΑΛΤΙΔΩΣΘ ΑΝΣΙΔΡΑΘ Ενίςχυςθ του DNA χρθςιμοποιώντασ τα παρακάτω: Θερμοςτακερι DNA πολυμεράςθ π.χ πολυμεράςθ Taq απομονωμζνθ από Thermus aquaticus DNA ςτόχοσ Νουκλεοτίδια Εκκινθτζσ ΠΟΛΤΜΕΡΑΘ (PCR) Ορίηουν τθν περιοχι του DNA που ενιςχφεται Συςκευι (Thermocycler, μεταβάλει γριγορα τθ κερμοκραςία τθσ αντίδραςθσ) Click on the link to watch a video for a PCR 26

27 ΠΡΟΪΟΝΣΑ ΚΑΣΑ ΣΘ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΣΘ PCR 3οσ 4οσ 5οσ 6οσ Η ενίςχυςθ είναι εκκετικι αφοφ τα ςχθματιηόμενα μετάγραφα δρουν ωσ νζα εκμαγεία. Οι αντιδράςεισ PCRs ςυνικωσ τρζχουν για 30 κφκλουσ όπου παράγονται περίπου 2 28 μόρια ι Το αρχικό ποςό του DNA εκμαγείου μπορεί να είναι ελάχιςτα χιλιάδεσ μόρια (femto moles). Μία από τισ πιο ευαίςκθτεσ αντιδράςεισ ςτθ Μοριακι Βιολογία. 27

28 ΑΛΤΙΔΩΣΘ ΑΝΣΙΔΡΑΘ DNA ΠΟΛΤΜΕΡΑΘ PCR 28

29 ΑΛΤΙΔΩΣΘ ΑΝΣΙΔΡΑΘ DNA ΠΟΛΤΜΕΡΑΘ PCR 29

30 ΘΕΡΜΟΦΙΛΕ DNA ΠΟΛΤΜΕΡΑΕ Απομονώνονται από βακτιρια κερμών πθγών Η Taq χρθςιμοποιείται για αναλυτικοφσ κυρίωσ ςκοποφσ (μεγάλθ ςυχνότθτα λακών, αδενίνθ ςτα άκρα αλλά φκθνι) 30

31 ΚΛΩΝΟΠΟΙΘΘ ΣΟΤ cdna cdna: ςυμπλθρωματικό ι αντίγραφο DNA Προζρχεται από το mrna Διπλισ ζλικασ DNA με τον ζνα κλώνο του ίδιασ αλλθλουχίασ με το mrna Γιατί να κλωνοποιοφμε cdna; Απαραίτθτο για τθν ζκφραςθ ευκαρυωτικών πρωτεϊνών ςε βακτιρια Τα ιντρόνια ΔΕΝ απομακρφνονται ςτα βακτιρια Οπότε δεν παράγεται πρωτεΐνθ 31

32 Ευκαρυωτικόσ οργανιςμόσ Βακτιρια Ιντρόνιο Ιντρόνιο Μεταγραφι RNA Splicing mrna Μετάφραςθ Μετάφραςθ Μθ λειτουργικι πρωτεΐνθ Λειτουργικι πρωτεΐνθ 32

33 Βακτιρια cdna Μεταγραφι mrna Μετάφραςθ Μθ λειτουργικι όταν είναι αναγκαίεσ μετα-μεταφραςτικζσ τροποποιιςεισ (πχ Ν- γλυκοηυλίωςθ) Λειτουργικι πρωτεΐνθ 33

34 ΚΛΩΝΟΠΟΙΘΘ ΕΝΙΧΤΜΕΝΩΝ DNA ΜΕ PCR Ενίςχυςθ μίασ περιοχισ DNA αλλά υπάρχει θ ανάγκθ για τθ κλωνοποίθςθ ςε ζναν φορζα Τι χρειαηόμαςτε ςτα άκρα; - Περιοχζσ ενηφμων περιοριςμοφ Πωσ τισ δθμιουργοφμε; - Ενςωμάτωςθ περιοχών περιοριςμοφ ςτουσ εκκινθτζσ 34

35 ΕΚΚΙΝΘΣΕ PCR ΓΙΑ ΚΛΩΝΟΠΟΙΘΕΙ Εκκινθτισ 1 Περιοχι ενδονουκλεάςθσ περιοριςμοφ Συμπλθρωματικι περιοχι για τθ ςτόχευςθ περιοχισ του DNA Εκκινθτισ 2 Περιοχι ενδονουκλεάςθσ περιοριςμοφ Συμπλθρωματικι περιοχι για τθ ςτόχευςθ περιοχισ του DNA 35

36 ΕΚΚΙΝΘΣΕ PCR ΓΙΑ ΚΛΩΝΟΠΟΙΘΕΙ Περιοχι για ενίςχυςθ 30 κφκλοι PCR Σο ενιςχυμζνο DNA περιζχει περιοχζσ περιοριςμοφ 36

37 ΕΚΚΙΝΘΣΕ PCR ΓΙΑ ΑΝΑΛΤΘ Περιοχι για ενίςχυςθ 30 κφκλοι PCR Σο ενιςχυμζνο DNA δεν περιζχει περιοχζσ περιοριςμοφ 37

38 ΑΝΑΤΝΔΤΑΜΟ DNA ΔΟΣΘ ΚΑΙ Σι χρειαηόμαςτε ΦΟΡΕΑ Πλαςμίδια: «οχιματα μεταφοράσ» γονιδίων ςτα κφτταρα του δζκτθ (φορείσ κλωνοποίθςθσ) Περιοριςτικζσ ενδονουκλεάςεσ: τζμνουν το DNA του φορζα ςε ςυγκεκριμζνεσ κζςεισ- Κολλώδθ άκρα. Λιγάςεσ: Ενώνουν τα ςυμπλθρωματικά κολλώδθ άκρα. 38

39 39

40 Πλαςμιδιακό DNA 40

41 Ζνηυμο περιοριςμοφ EcoRI 41

42 Ζνηυμο περιοριςμοφ EcoRI 42

43 43

44 Ζνκεμα DNA 44

45 Ζνκεμα DNA Ζνηυμο περιοριςμοφ EcoRI 45

46 46

47 47

48 Λιγάςθ 48

49 ΑΝΑΤΝΔΤΑΜΟ DNA ΔΟΣΘ ΚΑΙ ΦΟΡΕΑ 49

50 ΑΝΑΤΝΔΤΑΜΟ DNA ΔΟΣΘ ΚΑΙ ΦΟΡΕΑ Κατευκυνόμενθ ι μθ κλωνοποίθςθ 50

51 Ξενιςτζσ: Βακτιρια, ηφμεσ, κφτταρα κθλαςτικών, κφτταρα εντόμων 51

52 ΣΟΠΟΘΕΣΘΘ ΣΟΤ ΑΝΑΤΝΔΤΑΜΕΝΟΤ DNA ΣΟ ΚΤΣΣΑΡΟ ΣΟΤ ΔΕΚΣΘ Ειςαγωγι πλαςμιδίου ςτα κφτταρα του φορζα Μεταςχθματιςμόσ Άγνωστος μηχανισμός!! 52

53 53

54 ΕΠΙΛΟΓΘ ΜΕΣΑΧΘΜΑΣΙΜΕΝΩΝ Γονίδιο για προςταςία ενάντια ςε αντιβιοτικά Αναςυνδυαςμζνο DNA ΚΤΣΣΑΡΩΝ Κολλ ϊδθ άκρα Ξζνο DNA Περιοχι ενδιαφζροντοσ Υπάρχουν άλλεσ δυνατότθτεσ ςτο ςτάδιο τθσ λιγάςθσ με αρνθτικό αποτζλεςμα; Σρυβλίο με αντιβιοτικό Ανάπτυξθ μόνο αναςυνδυαςμζνων κυττάρων Κλωνοποίθςθ ςε φορζα 54

55 Υπάρχει όμωσ και θ περίπτωςθ αποικιών χωρίσ ενκζματα! Υπάρχει όμωσ και θ περίπτωςθ αποικιών με λάκοσ ενκζματα! 55

56 ΕΝΣΟΠΙΜΟ ΜΘ ΑΝΑΤΝΔΤΑΜΕΝΩΝ ΠΛΑΜΙΔΙΩΝ HindIII EcoRI BamHI Τα κφτταρα τα οποία περιζχουν το πλαςμίδιο pbluescript εμφανίηουν αντίςταςθ ςτθν αμπικιλλίνθ και παίρνουν μπλε χρώμα ςε τρυβλία X-Gal puc18 Αφετθρία αντιγραφισ LacZ κωδικοποιεί τθ -γαλακτοηιδάςθ Amp r προςδίδει αντίςταςθ ςτθν αμπικιλλίνθ 56

57 ΕΝΣΟΠΙΜΟ ΜΘ ΑΝΑΤΝΔΤΑΜΕΝΩΝ ΠΛΑΜΙΔΙΩΝ 57

58 ΕΝΕΡΓΟΣΘΣΑ β-γαλακσοηιδαθ Ε ΣΡΤΒΛΙΑ Bromo-chloro-indoyl- galactopyranosidase ι X-Gal (Κακαρό) -γαλακτοηιδάςθ Bromo-chloro-indoyl (Βακφ μπλε αδιάλυτο) 58

59 ΠΡΟΘΘΚΘ ΧΡΩΜΟΩΜΙΚΟΤ DNA Ε Φορζασ GAATTC CTTAAG ΕΝΑ ΦΟΡΕΑ GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG Χρωμόςωμα GAATTC CTTAAG Κοπι με EcoRI και προςκικθ DNA λιγάςθσ GAATTC CTTAAG Αναςυνδυαςμζνοσ φορζασ Αντίςταςθ ςε αμπικιλλίνθ, Αρνθτικό ςε -γαλακτοηιδάςθ (Λευκζσ αποικίεσ ςε X-Gal) Το LacZ γονίδιο κωδικοποιεί τθ -γαλακτοηιδάςθ Γονίδιο αντίςταςθσ αμπικιλλίνθσ 59

60 ΜΘ ΑΝΑΤΝΔΤΑΜΕΝΟ ΦΟΡΕΑ GAATTC CTTAAG Ανηίζηαζη ζε αμπικιλλίνη, Θεηικό ζε -γαλακηοζιδάζη (Μπλε αποικίες ζε X-Gal) Το LacZ γονίδιο κωδικοποιεί τθ -γαλακτοηιδάςθ Γονίδιο αντίςταςθσ αμπικιλλίνθσ 60

61 Χωρίσ ζνκεμα Με ζνκεμα Μετασχηματισμός E. coli ευαίσθητο ςε αμπικιλλίνθ Αντίςταςθ ςε αμπικιλλίνθ, Θετικό ςε -γαλακτοηιδάςθ (Μπλε αποικίεσ ςε X-Gal) Αντίςταςθ ςε αμπικιλλίνθ, Αρνθτικό ςε -γαλακτοηιδάςθ (Λευκζσ αποικίεσ ςε X-Gal) 61

62 Σα βακτιρια μετά τθ λιγάςθ αναπτφςςονται ςε τρυβλία με αμπικιλλίνθ και X-Gal Περιζχουν το μθ αναςυνδυαςμζνο πλαςμίδιο Περιζχουν το αναςυνδυαςμζνο πλαςμίδιο 62

63 Σα βακτιρια μετά τθ λιγάςθ αναπτφςςονται ςε τρυβλία με αμπικιλλίνθ και X-Gal Περιζχουν το μθ αναςυνδυαςμζνο πλαςμίδιο Περιζχουν το αναςυνδυαςμζνο πλαςμίδιο 63

64 Το ccdb γονίδιο εκφράηει μια πρωτεΐνθ που αποτελεί παρεμποδιςτι τθσ DNA γυράςθσ ςτο E. coli ςκοτώνοντασ ζτςι το κφτταρο 64

65 65

66 ΕΣΕΡΟΛΟΓΘ ΕΚΦΡΑΘ ΜΙΑ ΠΡΩΣΕΪΝΘ Αφξθςθ και ζκφραςθ πρωτεΐνθσ Αφξθςθ κανονικοφ βακτθρίου Ζκφραςθ ξζνθσ πρωτεΐνθσ Αφξθςθ του τροποποιθμζνου βακτθρίου Χρόνοσ (ώρεσ) 66

67 ΣΡΑΣΘΓΙΚΘ ΕΣΕΡΟΛΟΓΘ ΕΚΦΡΑΘ ΜΙΑ ΠΡΩΣΕΪΝΘ Εάν θ ζκφραςθ μιασ ξζνθσ πρωτεΐνθσ λαμβάνει χώρα κατά τθ διάρκεια τθσ εκκετικισ φάςθσ του βακτθρίου Η ανάπτυξθ κα είναι αργι και φτωχι Παρόλο που το 40 % του βακτθρίου μπορεί να είναι θ αναςυνδυαςμζνθ πρωτεΐνθ, κα ζχουμε χαμθλι απόδοςθ εξαιτίασ τθσ χαμθλισ βιομάηασ Επιπλζον μικρι απόδοςθ εξαιτίασ τθσ επιλογισ μεταλλαγμζνων ςτελεχών που δεν εκφράηουν τθν αναςυνδυαςμζνθ πρωτεΐνθ. 67

68 ΣΡΑΣΘΓΙΚΘ ΕΣΕΡΟΛΟΓΘ ΕΚΦΡΑΘ ΜΙΑ ΠΡΩΣΕΪΝΘ Αφξθςθ και ζκφραςθ πρωτεΐνθσ Αφξθςθ κανονικοφ βακτθρίου Ζκφραςθ τθσ ξζνθσ πρωτεΐνθσ Επαγωγι ζκφραςθσ τθσ ξζνθσ πρωτεΐνθσ Χρόνοσ (ώρεσ) 68

69 ΣΡΑΣΘΓΙΚΘ ΕΣΕΡΟΛΟΓΘ ΕΚΦΡΑΘ ΜΙΑ ΠΡΩΣΕΪΝΘ Για τθν παραγωγι ςε μεγάλεσ ποςότθτεσ ξζνθσ πρωτεΐνθσ: Ζλεγχοσ ζκφραςθσ τθσ ξζνθσ πρωτεΐνθσ Αφξθςθ του βακτθρίου μεταξφ μζςθσ και τζλουσ τθσ εκκετικισ φάςθσ ανάπτυξθσ Επαγωγι ζκφραςθσ Ανάγκθ για ρυκμιηόμενουσ φορείσ ζκφραςθσ Χριςθ επαγόμενου υποκινθτι ςτο φορζα ζκφραςθσ για τον ζλεγχο τθσ μεταγραφισ 69

70 ΦΟΡΕΑ ΕΚΦΡΑΘ εφοδιάηει τθ κωδικοποιοφςα περιοχι του cdna με ζναν υποκινθτι και ζνα RBS Ρυκμιηόμενοσ υποκινθτισ RBS (Ribosome Binding Site) RES (restriction enzyme site) Αφετθρία αντιγραφισ Ap r γονίδιο Φορζασ ζκφραςθσ 70

71 ΕΠΑΓΩΓΙΜΟΙ ΤΠΟΚΙΝΘΣΕ Ε ΦΟΡΕΙ ΕΚΦΡΑΘ Πλθκώρα ρυκμιηόμενων υποκινθτών Περιςςότεροι ελζγχονται από το χειριςτι laco (lac operator) π.χ. υποκινθτζσ που επάγονται από τθ λακτόηθ ι ανάλογα αυτισ απενεργοποιώντασ τον lac καταςτολζα Ανάλογο λακτόηθσ: isopropylthio- -D-galactopyranoside (IPTG) Δε μεταβολίηεται οπότε είναι ζνασ ιςχυρόσ επαγωγζασ για τθν ζκφραςθ γονιδίων 71

72 Αφξθςθ και ζκφραςθ πρωτεΐνθσ Αφξθςθ κανονικοφ βακτθρίου Ζκφραςθ τθσ ξζνθσ πρωτεΐνθσ Επαγωγι ζκφραςθσ τθσ ξζνθσ πρωτεΐνθσ με τθ προςκικθ IPTG Χρόνοσ (ώρεσ) 72

73 ΕΠΑΓΩΓΙΜΟΙ ΤΠΟΚΙΝΘΣΕ Ε ΦΟΡΕΙ ΕΚΦΡΑΘ Ο περιςςότερο κοινόσ φορζασ ζκφραςθσ είναι ο pet Ο υποκινθτισ ςτο φορζα ζκφραςθσ αναγνωρίηεται από τθ T7 RNA πολυμεράςθ Ο υποκινθτισ αυτόσ δεν αναγνωρίηεται από τθ RNA πολυμεράςθ του E. coli Το γονίδιο που κωδικοποιεί τθν T7 RNA πολυμεράςθ θ οποία ρυκμίηεται από το laco ζχει ειςαχκεί ςτο γονιδίωμα του E. coli. Ο υποκινθτισ του φορζα ζκφραςθσ επίςθσ ρυκμίηεται από το laco Οπότε το IPTG επάγει τθν ζκφραςθ τθσ T7 RNA πολυμεράςθσ Του ξζνου γονιδίου ι cdna Δφο επίπεδα ελζγχου 73

74 ΘΜΕΙΑΚΕ ΜΕΣΑΛΛΑΞΕΙ ΜΕ PCR Η τεχνικι PCR χρθςιμοποιείται για τθν αλλαγι τθσ αμινοξικισ αλλθλουχίασ με κακοριςμζνο τρόπο Μεταβολι ςτθ αλλθλουχία βάςεων του DNA προξενεί μεταβολι ςτθν αλλθλουχία αμινοξζων Καταςκευι εκκινθτών που δεςμζυονται ςτο γονίδιο αλλά μεταφζρουν τθν επικυμθτι μετάλλαξθ ATG TTT AAA TGG GAG CGC MET PHE LYS TRP GLU ARG Μεηάλλαξη ATG TTT AAA GGG GAG CGC MET PHE LYS GLY GLU ARG 74

75 ΘΕΘ-ΚΑΣΕΤΘΤΝΟΜΕΝΘ ΜΕΣΑΛΛΑΞΙΓΕΝΕΘ 75

76 ΘΜΕΙΑΚΕ ΜΕΣΑΛΛΑΞΕΙ ΜΕ PCR T A 76

77 ΘΜΕΙΑΚΕ ΜΕΣΑΛΛΑΞΕΙ ΜΕ PCR T A 77

78 ΘΜΕΙΑΚΕ ΜΕΣΑΛΛΑΞΕΙ ΜΕ PCR T T A A 78

79 ΘΜΕΙΑΚΕ ΜΕΣΑΛΛΑΞΕΙ ΜΕ PCR G T C A 79

80 ΘΜΕΙΑΚΕ ΜΕΣΑΛΛΑΞΕΙ ΜΕ PCR G T C A Προςκικθ DpnI αποικοδόμθςθ του μθτρικοφ κλϊνου λόγω αναγνϊριςθσ μεκυλιωμζνου DNA 80

81 ΘΜΕΙΑΚΕ ΜΕΣΑΛΛΑΞΕΙ ΜΕ PCR G C 81

82 ΚΛΩΝΟΠΟΙΘΘ - PCR Για τθν απομόνωςθ ενόσ άγνωςτου γονιδίου βάςθ τθσ αμινοξικισ του ακολουκίασ Καταςκευι εκκινθτών με βάςθ τθν αλλθλουχία των αμινοξζων Χριςθ PCR και παραλαβι προϊόντοσ Met-Lys-Trp-Met ATGAA(A/G)TGGATG Lys-Met-Phe-Trp AA(A/G)ATGTT(T/C)TGG 82

83 ΓΕΝΕΣΙΚΟ ΚΩΔΙΚΑ 83

84 Χρημαηοδόηηζη Το παπόν εκπαιδεςηικό ςλικό έσει αναπηςσθεί ζηα πλαίζια ηος εκπαιδεςηικού έπγος ηος διδάζκονηα. Το έπγο «Ανοικηά Ακαδημαϊκά Μαθήμαηα Ε.Μ.Π.» έσει σπημαηοδοηήζει μόνο ηη αναδιαμόπθωζη ηος εκπαιδεςηικού ςλικού. Το έπγο ςλοποιείηαι ζηο πλαίζιο ηος Επισειπηζιακού Ππογπάμμαηορ «Εκπαίδεςζη και Δια Βίος Μάθηζη» και ζςγσπημαηοδοηείηαι από ηην Εςπωπαϊκή Ένωζη (Εςπωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούρ πόποςρ.