cdna ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ Καρβέλης Φώτης Φώτο 1

Transcript

1 cdna ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ Καρβέλης Φώτης Φώτο 1

2 Λόγοι για τουσ οποίουσ αναγκαςτικαμε να δθμιουργιςουμε τθ cdna βιβλιοκικθ Σα γονίδια των ευκαρυωτικών είναι αςυνεχι. Οι περιοριςτικζσ ενδονουκλεάςεισ δεν κόβουν ςτθν αρχι και ςτο τζλοσ του κάκε γονιδίου που κζλουμε. Τπάρχουν αλλθλουχίεσ που δεν αναγνωρίηονται από κάποιο ζνηυμο. Σα κομμάτια DNA που προκφπτουν είναι πολφ μεγάλα.

3 Ποιο μόριο είναι αυτό που: Να περιζχει τισ πλθροφορίεσ του γονιδίου από τθν αρχι μζχρι το τζλοσ του; Να είναι απαλλαγμζνο από εςωτερικζσ αλλθλουχίεσ που δεν κωδικοποιοφν γενετικι πλθροφορία; (εςώνια) Να μπορεί να χρθςιμοποιθκεί ςε βακτιρια με ςκοπό τθ μαηικι παραγωγι διαφόρων πρωτεΐνών; Σο ώριμο mrna

4 Βιμα 1 ο : Απομόνωςθ του ςυνολικοφ ώριμου mrna από κφτταρα ςτα οποία γνωρίηουμε ότι εκφράηεται το γονίδιο που κζλουμε να κλωνοποιιςουμε. Κφτταρο οργανιςμοφ δότθ πυρινασ Ώριμο mrna

5 Βιμα 2 ο : Χορθγοφμε in vitro τα απαραίτθτα ςυςτατικά για να γίνει δυνατι θ διαδικαςία τθσ αντίςτροφθσ μεταγραφισ. Αντίςτροφθ μεταγραφάςθ Δεςοξυριβονουκλεοτίδια Ενζργεια αντίςτροφθ μεταγραφάςθ Μόρια ώριμου MRNA Τβριδικά μόρια

6 Βιμα 3 ο : Αυξάνουμε τθ κερμοκραςία ζτςι ώςτε να ςυμβεί αποδιάταξθ των μορίων. Αυτό ζχει ςαν αποτζλεςμα να δθμιουργθκοφν ςτο δ/μα μονόκλωνα mrna και οι ςυμπλθρωματικοί τουσ κλώνοι DNA. Αφξθςθ κερμοκραςίασ Τβριδικά μόρια μονόκλωνο RNA μονόκλωνο DNA

7 Βιμα 4 ο : Χορθγοφμε τα κατάλλθλα μόρια για να γίνει δυνατι θ αντιγραφι των μονόκλωνων μορίων DNA και ζτςι να γίνουν δίκλωνα μόρια. Δεςοξυριβονουκλεοτίδια DNA πολυμεράςθ Ριβονουκλεοτίδια Πριμοςώματα Ενζργεια Αντιγραφι Μονόκλωνα μόρια DNA Δίκλωνα μόρια DNA

8 Βιμα 5 ο : το ςθμείο αυτό πρζπει να ςκεφτοφμε πώσ κα γίνει ο αναςυνδυαςμόσ αυτών των μορίων με τουσ φορείσ κλωνοποίθςθσ. Σο πρόβλθμα εδώ είναι ότι τα μόρια αυτά δεν διακζτουν μονόκλωνα ςυμπλθρωματικά άκρα. Αυτό επιλφεται με τθ δράςθ ενηφμων τα οποία τοποκετοφν δεςοξυριβονουκλεοτίδια ςε κάκε κλώνο ςτο 3 άκρο. Σα ζνηυμα αυτά λζγονται ακραίεσ τρανςφεράςεσ και ςυνικωσ τοποκετοφν όλιγο-c ι όλιγο-g άκρα και το αντίςτροφο κάνουν ςτο φορζα κλωνοποίθςθσ. Δράςθ ακραίασ τρανςφεράςθσ Μονόκλωνο άκρο

9 Βιμα 6 ο : Προετοιμαςία των φορζων κλωνοποίθςθσ. Αφαιροφμε όλα τα πλαςμίδια από τα βακτιρια ξενιςτζσ που πρόκειται να χρθςιμοποιιςουμε. Αυτό επιτυγχάνεται κάνοντασ παροδικά διαπερατι τθν πλαςματικι μεμβράνθ του βακτθρίου. Βακτιριο πλαςμίδια Τποτονικό δ/μα Κυρίωσ DNA

10 Βιμα 7 ο : Ανάμιξθ των πλαςμιδίων με μία μόνο περιοριςτικι ενδονουκλεάςθ. Ζτςι δθμιουργοφνται μονόκλωνα άκρα. δράςθ περιοριςτικισ Μονόκλωνα άκρα ενδονουκλεάςθσ ΠΡΟΟΧΗ! Προςζχουμε τα άκρα που προςκζςαμε ςυνκετικά ςτο εργαςτιριο να είναι ςυμπλθρωματικά με αυτά που προκφπτουν ςτουσ φορείσ κλωνοποίθςθσ μετά τθ δράςθ τθσ περιοριςτικισ ενδονουκλεάςθσ.

11 Βιμα 8ο: Ανάμιξθ των φορζων κλωνοποίθςθσ με τα μόρια DNA που ζχουμε φτιάξει in vitro. Α Ν Α Τ Ν Δ Τ Α Μ Ο το ςτάδιο αυτό χρθςιμοποιοφμε δεςμάςθ για να αναπτυχκοφ φ.δ μεταξφ νουκλεοτιδίων που ανικουν ςε διαφορετικά μόρια.

12 Βιμα 9 ο : Ειςαγωγι των αναςυνδυαςμζνων μορίων ςτα βακτιρια ξενιςτζσ. Μ Ε Σ Α Χ Η Μ Α Σ Ι Μ Ο

13 Βιμα 10 ο : Ειςαγωγι των μεταςχθματιςμζνων βακτθρίων ςε καλλιζργεια που περιζχει κρεπτικό υλικό. Σο κάκε βακτιριο κα πολλαπλαςιάηεται και ςυγχρόνωσ κα αντιγράφονται τα πλαςμίδιά του. Θα δθμιουργθκοφν κλώνοι βακτθρίων όπου ςτον κάκε ζνα κλώνο κα υπάρχει ςυγκεκριμζνο γονίδιο. Χρθςιμοποιώντασ κατάλλθλο ανιχνευτι μποροφμε να βροφμε που βρίςκεται το γονίδιο που μασ ενδιαφζρει. ΠΡΟΟΧΗ! Και ςτθν cdna κάνουμε χριςθ αντιβιοτικοφ για να δοφμε ποφ πζτυχε ο μεταςχθματιςμόσ και ποφ όχι.

14 cdna Βιβλιοκικθ

15 Διαφορζσ cdna - Γονιδιωματικισ Γονιδιωματικι Βιβλιοκικθ 1. Απομονώνουμε το ςυνολικό DNA ενόσ κυττάρου του οργανιςμοφ δότθ. 2. Σα ζνηυμα που χρθςιμοποιοφμε είναι οι περιοριςτικζσ ενδονουκλεάςεσ και θ DNA δεςμάςθ. 3. Κλωνοποιείται όλο το γονιδίωμα του οργανιςμοφ δότθ. 4. Μποροφμε να μελετιςουμε οποιαδιποτε αλλθλουχία του DNA του δότθ (π.χ εςώνια, υποκινθτζσ, περιοχζσ χωρίσ πλθροφορίεσ). cdna Βιβλιοκικθ 1. Απομονώνουμε το ολικό (ώριμο) mrna από ςυγκεκριμζνο κυτταρικό τφπο του οργανιςμοφ δότθ. 2. Χρθςιμοποιοφνται επιπλζον θ αντίςτροφθ μεταγραφάςθ και θ DNA πολυμεράςθ. 3. Πολυμεροφνται μόνο τα εξώνια και οι 5 και 3 αμετάφραςτεσ περιοχζσ των γονιδίων που εκφράηονται ςτο ςυγκεκριμζνο κυτταρικό τφπο από τον οποίο απομονώκθκε το mrna. 4. Δεν ζχουν κλωνοποιθκεί όλεσ οι περιοχζσ του γονιδιώματοσ, παρά ζνα πολφ μικρό ποςοςτό (εξώνια και οι 5 και 3 αμετάφραςτεσ περιοχζσ ενεργών γονιδίων), άρα μόνο αυτζσ μποροφν να μελετθκοφν.

16 Διαφορζσ cdna - Γονιδιωματικισ Γονιδιωματικι Βιβλιοκικθ 5. Δεν είναι κατάλλθλθ για τθ ςφνκεςθ πρωτεΐνών του οργανιςμοφ δότθ, αν θ βιβλιοκικθ γίνεται ςε βακτιρια. Ο λόγοσ είναι ότι τα γονίδια του δότθ (ευκαρυωτικοφ) περιζχουν εςώνια (τα βακτιρια δεν διακζτουν μθχανιςμοφσ ωρίμανςθσ του πρόδρομου mrna) και επιπλζον μπορεί κάποια γονίδια να μθν είναι ολόκλθρα, εφόςον μπορεί να ζχουν τεμαχιςτεί από τθν περιοριςτικι ενδονουκλεάςθ, εάν περιζχουν τθν αλλθλουχία αναγνώριςθσ ςτο εςωτερικό τουσ. 6. Φυςιολογικά θ γονιδιωματικι βιβλιοκικθ δε διαφζρει από κφτταρο ςε κφτταρο του ίδιου οργανιςμοφ(αν χρθςιμοποιθκεί θ ίδια περιοριςτικι ενδονουκλεάςθ). cdna 5. Παράγονται πρωτεΐνεσ του δότθ, αφοφ ξεκινάμε με ώριμο mrna, με μόνθ διαφορά το ότι τα βακτιρια δεν τροποποιοφν με τον ίδιο τρόπο τισ πρωτεΐνεσ μετά τθ μετάφραςθ, με τα ευκαρυωτικά. 6. Κάκε κυτταρικόσ τφποσ ενόσ πολυκφτταρου οργανιςμοφ ζχει τθ δικι του cdna βιβλιοκικθ (προκφπτουν ςυμπεράςματα γφρω από τθν κυτταρικι διαφοροποίθςθ).

17 Γονιδιωματικι Vs cdna

18 Σο ςφνολο των βακτθριακών κλώνων που περιζχουν το ςυνολικό mrna ενόσ κυττάρου ονομάηεται cdna βιβλιοκικθ.